3 5 ~ HARALD Se~6~ und EDITH STEIDL: Das Verhalten der Serumtransaminase-Aktivit/~t Kl[nisehe Wochensehrift

Tabelle 2

Anzahl Material GesamteiweiB 1%ur amins~ure in mg-% a a ~ in rag-% a a~z Gesamteiwei~ : Neuramins~iure

16 Liquor 30,9* =k 7,96 -4-1,99 0,274 ±0,055 ~0,014 100:(0,928-4-0,0547) 80 Serum 7000** ~- 700 48,69 -4- 7,42 -4- 0,83 100 : (0,677 ! 0,0115)*** * In der Literatur werden f~ir das Gesamteiweil~ des normalen Liquors Werte zwisehen 15 und 45 rag-% angegeben (KAFKA~I,~-~), DEM1HE ~,~3,

STAlkY, SOYSAL und ANHEGGER ~4, ~ERI~IT und FRElgONT-SMITK "~, [BAUER nund ANG:E:SST:EIN ~, I~EYER~). Der gro~e Sehwankungsbereich erkl/~rt sieh dutch die unterschiedliehe Methodik und den verschiedenen Eiweil]gehalt des Yentrikel-, Cisternen- und Lumbaniquors.

** Der Wert wurde den ,,Wissenschaftliehen Tabellen Geigy (1955)" entnommen. In der hiesigen Klinik gilt als Schwankungsbreite fiir das GesamteiweiB im Serum bei Gesunden 6,8--7,8 g-%.

*** Da die Serumeiweil]werte nicht einzeln erfal~t wurden, ist die Streuung der Verh/~ltniswerte Eiweig:Neuraminsiiure im Serum eventuell hSher oder niedriger als bier erreehaet, nieht jedoch der i~ittelwert. FOr eine 33 Signifikanz reicht der Untersehted der Mittelwerte abet auch bei h6herer Streuung der Verh$1tniswerte aus.

Zusammen/assung. Unte r suehungen fiber die pro- te ingebundene Neuraminsaure des Liquor eerebrospi- na]is haben ergeben, dab in allen Liquores Neuramin- saure nachweisbar ist. Bei einer Gruppe yon Gesunden wurde ein Mitt~lwert yon 0,274 mg- % 4- 0,055 Neur- aminsaure best immt. Es besteht im norma]en u n d pathologischen Liquor eine enge Beziehung zwisehen dem Neuraminsauregehal t u n d dem Gesamteiweil]- geha]t. Dagegen konnte keine Beziehung zum Liquor- zucker und zur Zellzahl des Liquors festgeste]lt werden. Bei entzfindlichen E r k r a n k u n g e n des Nervensystems u n d bei spina]en T u m o r e n fanden sieh Neuraminsaure u n d Gesamteiwei[] in etwa gleichem Verha]tnis erhSht. Die Werte erreiehten in einzelnen Fal len das 20--30- fache der Norm. Bei degenerat iven E r k r a n k u n g e n und bei K r a n k e n mit cerebralen Anfallsleiden war der Neuraminsauregehal t n u t gering verander t . Es gelang bisher nieht , Veranderungen des Neuraminsauregehal- tes im Liquor bes t immten Krankhe i t sb i ide rn zu- zuordnen.

Die Arbeit wurde durch Mittel der Deutschen Forsehungs- gemeinschaft unterstiitzt.

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DAS VERHALTEN DER SERUMTRANSAMINASE-AKTIVIT~T (GLUTAMIN S.~URE- OXALE S SIGSAURE-TRANSAMINA SE)

BEI DER ALLYLALKOHOLNEKROSE DER RATTENLEBER V o n

H ~ A L D SCHSN und EDITH STEIDL

Aus der Medizinisehen Universit~tsklinik Erlangen (Direktor: Prof. Dr. N. HENNING)

Die Prfifung yon Organextrakten, Aminosauren u n d Vi taminen auf ihre Leberschutzwirkung ist n ieht n u t ein Anliegen der kl inisehen Forschung. Wegen der klinisch oft nu r sehwierig nachweisbaren Wirkung haben manehe Substanzen, wie z. B. Cho]in, Methio- nin, Vi tamin E und die Leberextrakte , ihren E ingang in die Therapie fiber das Tierexperiment gefunden. AuBer der diatet isehen Lebernekrose oder Leberver- i e t tung bedient m a n sich versehiedener toxiseher Stoffe (Tetraehlorkohlenstoff, Chloroform, Brombenzol , Ben- zol, Phosphor und Allylalkohol), u m den p raven t iven oder ku ra t iven Effekt bes t immter Subs tanzen zu testen. Zur Kontrol le werden einmal histologische und makroskopiseh-anatomisehe Kr i te r ien herangezogen oder aber auch die Bes t immung des Leberfettgehaltes, Weder die eine noch die andere Methode k a n n fiber die zugrunde liegende StoffwechselstSrung AufsehluB geben. Die Tetraehlorkohlenstoff- Intoxikat ion ist hin- sichtlieh ihrer biochemischen Veranderungen offenbar

am besten un te rsuch t 1. Auch die Brombenzol-Nekrose finder durch die Un te r suchungen KOcH-W~s~Rs 2 eine interessante Erk]arung. Die Allylalkoho]-Intoxi- ka t ion wurde yon EPPIZqG~ als Modell zur Erzeugung der ,,serSsen En tz f indung" angewendet 3.

I n letzter Zeit wurde gerade an der Allylalkohol- nekrose der I~attenleber eine l~eihe yon Subs tanzen auf ihre ,,nekrotrope" Wirkung getestet t. Da die Aus- wer tung naeh histologischen oder makroskopischen Be- funden erfolgt war, interessierte uns das Verhal ten der Serum- Glu taminsaure - Oxalessigsaure - Transaminase- Akt iv i t a t (SGOT). Denn, wie die Unte r suehungen von W~OBLEWSKI 5 gezeigt haben, ist die SGOT-Aktivi - t a t ein guter Anha] t ffir das AusmaB einer Zellsehadi- gung im Organismus. Leber, Herz, Niere u n d Musku- la tur s tehen auf Grund ihres hohen Transaminase- Gehaltes im Vordergrund der diagnostisehen MSglieh- keiten. Vor allem lassen sieh erhShte SGOT-Wer te bei einer Hepat i t is oder einem Herzinfarkt finden. Die

Jg. 35, IIeft 7 HAROLD SC~5N und Em:T~ STEIDL: DI~S Verhalten der Serumtransaminase-Aktivit/~t 355 1. April 1957

HShe der Akt iv i tg t lgl~t augerdem gewisse Aussagen fiber die Ausdehnung der Zetlschgdigung zu, auch die MSgliehkeit einer Verlaufskontrolle is~ gegeben%

Die vorliegenden Untersuehungen ha t ten das Ziel, die Brauchbarkei t der S GOT-Best imlnung im Serum am Modell der Allylalkoholnekrose der Rat tenleber zu fiberpriifen, nnd gldehzeit ig sollte die veil E ~ ~ berichtete pr//ventive ~Virkung bes t immter Antibiotica auf die Zellnekrosen naeh Allylalkoholgaben verfolgt werden.

Material und Methodik Verwendet wurden insgesamt 45 weibliche Ratten eines

Inzuehtstammes yon 200--300g Gewiebt, davon dienten 8 Tiere als Leerkontrolle (Gruppe 1). Die Tiere der Gruppen 2, 3 und 4 erhielten jeweils 0,25 cm ~ einer 2%igen Altylalkohol- 15sung (v/v) je 100 g KSrpergewicht per Schlundsonde. Die Tiere der Gruppe 2 dienten als Versuehskontrolle (14 Tiere), w~hrend den Tieren der Gruppe 3 (13Tiere) 10mg/100g KSrpergewicbt Aureomycin mittels Schlundsonde 1 Std ,/or der AllyMkoholgabe einverleibt wurde. Die Tiere der Gruppe ¢ (10 Tiere) erhielten 2mat 50000 E Penicillin, 30 rain vor und 1 Sgd naeh der Allylalkoholgabe subcutan injiziert. Die Tie~.e wurden in leiehter ~thernarkose durch Dekapitation getStet, nachdem 8--12 Std seit der Allylalkoholg~be vergangen waren.

Fermentbestimmung im Serum: N~ch dem Abzentri- fugieren des Serums wurde die Serum-Oxalessigs~ure-Glut- amins~ure-Transaminase-Aktivit~t (SGOT) wie folgt bestimmt: 0,5 ml hgmolysefreies Serum werden mit 1,65 ml PufferlSsung versetzt und 0,5ml Asparagins/~ure und 0,I ml DPN-K (reduziertes DiphosphopyridinnuMeotid) untergemischt, schlieglieh werden noeh 0,05 ml AeDtt (~pfelsaure-dehydro- genase) zugegeben, Das Untermisehen erfolgt mit einem unten abgeflachten Glasstab direkt in der 1 em-Cuvette. Die Messung erfolgt gegen einen Leerwert yon 0,5 ml Serum und 2ml Phosphor-Puffer im Spektralphotometer (Zeiss) bei einer Wellentange yon 340 oder 366 m,u bei Zimmertemperatur.

Der Extinktionsabfa.lI, d. h. die DPN-H-0xydation, wfl~d jede 2. rain fiber 10--15 rain verfolgt. Nach Ablauf dieser unspezifiscben, DPN-H verbrauehenden geaktion, erfolgt die eigentliche Transaminasen-Aktivit.i~tsbestimmung entspre- chend dem Reaktionsablauf:

Transaminase 1.Asparagins~ure + e-Ketoglutars~ure > Glut- amins~ure + Oxalessigs/iure

2. Oxalessigsgure + DPN-tt + ici + AeDtt ~pfels/iure + DPN +.

Dazu werden dem Bes~immungsansatz 0,2 ml Keto- gtutars~ure zugemischt und der weitere Abfall der Exginktion 10min lang beobachtet. InnerMlb dieser Zeit wird jede Minute die Extinktion abgelesen. (Die seruln-eigene ~-Keto- glu~,rs~ure karm bei diesem Test vernaehlgssigt werden.)

l~eagentien: 1. Phospbatpuffer p~ 7,4 (0,272g KHePO~ und 1,393g K~IIPO~ .ad 100mI aufgekocktes Aqua dest.) (aueh Merck Puffer-Titrisol, Nr. 9871/72 Na~HPO~ und KtI:PO, verwendbar); 2. 0,2m Asparagin@iurelSsung in Phosph~tpuffer Pn 7,4; 3.0,1 mg-%ige LSsung yon DPN-tt in Aqua bidest.; 4. 24pfels/~uredehydrogenase Boehringer mit 1 mg Enzymprotein je M~lliliter; 5.0,1 m c~-Ketoglutars~ure. 15sung in Aqua bidest.

Die DPN-H-L5sung ist im geirorenen Zustznd (ira Kiibl- lach des Kiihlsehrankes) l~nger haltbar. Es ist ratsa.m, sich eine L5sung yon 10 mg DPN-i~ in 10 ml Aqua bidest, herzu- stellen und in i mLPortionen aufzuheben. Das Pipettieren erfolgt am besten mit Stangenpipetten yon 0,2 und 0,I ml Fassungsverm5gen, die zwei Eiehmarken tragen. Um die Reaktion besser verfolgen zu kSnnen, sehien es uns ratsamer, die unspezifisehe Reaktion bei Zimmertemperatur im Photo- meter ablaufen zu lassen, Ms unbeobachtet im temperatur- konstanten ~¥asserbad.

Be~'echnung Nach der Definition yon LADVE, W~OBL~WSKI und

KA~m~N 6 ist eine Einheit die Transaminase-Menge in i ml Serum, die bei 250 im 3 ml-Ansatz die DPN-tI-Extinktion bei 340 m/~ in 1 rain um 0,001 ~ndet~s. Fiir die Messung bei 366 m# ist entspreehend umzureehnen, und zwar mit 1,8 zu muttiplizierem Bei Einsatz yon 0,5ml Serum folgt darius:

AE/min 366 ml~ × 3600 = Transami~ase-E./ml Serum. Aus den abgeIeseneu AE-Werten wird der Migtelwert gebfldet., yon dem aber noch der durch Transamina, se-Spuren im AeDt-I- Pri~parat bedingte Extinktionsabfalt abzuziehen ist. (Diese Blindwert-Messung erfolgt naeh derselben Methode unter Verwendung yon Aqua bidest, start Serum.)

Ergebnisse und Diskussion

~Vie die Tabelle zeigt, liegt der Normalbereich der SGOT flit die verwendeten I~atten bei 55 E. Nach Allylalkoholgabe k o m m t es zu makroskopiseh sieht- baren Nekrosen der Leber mit einer deutliehen Er- hShung der SGOT. Weder Aureomycin noeh Peni- c i l l in / indern an diesem Geschehen etwas.

Tabelle 1 Normaltiere ............ 55 ± 20 SGOT-E Allylalkoholintoxika.tion ...... 205 ~ 60 SGOT-E Allylalkoholintoxikation q- Aureomycin 215 ± 70 SGOT-E Allylalkoholintoxik~tion + Penicillin 213 =k 70 SGOT-E

Wir haben schon frtiher darauf hingewiesen 7, dab gerade bei der Auswertung yon pr/iventiven oder kura t iven Versuchen an der Allylalkoholnekrose der Leber einJge Vorsicht geboten ist. Denn erst die Fermente des KSrpers lassen dureh Oxydat ion des nicht kSrperver t rauten Alkohols die wirklich toxische Substanz entstehen, ob es sich dabei um den Aldehyd (Akrolein) oder die Sgure (Ak13ilsgure) handelt , 1/~gt sieh zun-~chst wegen der Unbest/ indigkeit des Aldehyds nicht kl£ren (s. GMehung).

CI-~ Alkohol- IICH2 Aldelhyd- CH2

i I cfoo~ CR~Ott HC = O (Ob man ffir die Intoxikation Allylalkohol oder den

Allylalkohol-Ameisens/~vre-Ester (AllyKormiat) Yer- wendet, diirfte belanglos sein; denn der Ester wird hydrolysiert.)

Die Lebersehutzwirkung einer Testsubstanz kann nun leicht dadureh vorget//uscht werden, dab die Oxydation des Alkohols gebremst wird. Die Nekrose wfirde so verhindert, ohne jede spezifisch ,,nekro- t ropen" Effekte der Testsubstanz aufzuzeigen.

Unsere fermentchemisehen Ungersuchungen zeigen keine Ubereins t immung mit den yon E e ~ a erhobencn Befunden an der Rattenleber. Das Ausmag des Leber- schadens ist sowohl mater Aureomycin- als anch Penieiltingaben offenbar unver~;ndert geblieben. Es zeigt sich also, dab die alleinige histologische Unter- suchung oder makroskopisch-anatomische Kontrol le nicht ausreieht, um fiber den Effekt dieser Subs tanzen etwas aussagen zu k6maen.

Die 5iethodik der SGOT-Bes t immung ist im Ver- gleich mi t anderen ehemisehen Methoden des Klinik- laborator iums relativ einfaeh auszuffihren. Man muB sieh nu t an den Umgang mit den relativ tabilen Fer- menten, Co-Fermenten und Subst ra ten gewThnen. Die SGOT ist, wie schon %VgommwsKi s erw£hnt, reeht stabil. Wi t konnten nach 10~i~gigem Aufbewahren bei 0 ° b is - I -40 kehaen met3baren Akt.ivit/itsverlust fest- stellen. Inwieweit sieh allerdings diese relativ kost- spieligen enzymatischen Untersuehungsverfahren auch zur ])iagnostik der Leber- und Herzerkrankungen durehsetzen werden, bleibt abzuwarten. Solange die Ana ly t ik noeh an das Vorhandensein relativ teurer Pho tome te r gebunden ist, wird eine breitere Anwen- dung nicht mSglieh sein.

24*

356 c . J . MULLE:a und W. G. Z~JLS¢~A: Zur spektrophotometrischen Methgmoglobinbestimmung X~in~sche Wochenschrif~

Zusaramen/assung. Mittels der Bestimmung der Serum- G]utaminsgure - Oxalessigs/~nre - Transminase- Aktivit/~t wird an der Allylalkoholnekrose der Rattan- leber die Brauchbarkeit dieser Mcthode fiir die Er- kennung yon Zellschaden yon SGOT-reichen Organen aufgezeigt. Eine erprobte Methode wird mitgeteilt. Die Befnnde yon EGEI~ fiber den ,,nekrotropen" Effekt yon Aureomycin und Penicillin konnten nicht be- st~tigt werden.

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WEITERE U~TERSUCHUNGEN ZUR SPEKTROPHOTO~ETRISCHEN 1)IETHXM 0 GL 0 BINB E STIMMUS~ fl

Von

C. J. M~LE~ und W. G. ZU~S~A

Aus dem Laboratorium fiir physiologische Ohemie der l~eichsuniversit~it Oroningen (Direktor: Prof. ~. B~K~AN)

Zur spektrophotometrischen Bestimmung yon Meth/~mogtobin ist yon HANDEL~ und ZIJ~ST!aA eine Methode entwicke]t worden bei dem, nach nngef~hr 200facher Verdfinnung des Blutes mit einer 0,1%igen NI-Is-LSsung , die Extinktion bei 540 und 525m/~ gemessen wird h~ einer Schichtdicke yon 1.000 em2, ~. Dos Zweikomponentengemiseh HiOH/HbOs wird also dutch Extinktionsmessung bei 2 Wellenl~ngen be- stimmt. Da einer dieser Wel]enl~ngen (525 m6t) ein isobestischer Punkt der Komponenten HiOH und Hb02 ist, gilt eine einfache Gleichung mit der die partielle Meth/~moglobinkonzentration zu berechnen ist:

[Hi] D s~° SM -- [total Hb] - - a - b ~ - - b. (1)

In dieser Gleichung ist: [Hi] = Konzentrat ion des Meth//moglobins [total Hb] = t t£moglobintotalkonzentration D ~a° = Extinktion bei 540 m# D ~ =- Extinktion bei 525 m#, a u n d b sind Konstanten.

Zur Bereehnung dieser Konstanten wurde eine Reihe yon 10 Messungen des Quotienten D~°/DS~S bei 100% t I iOH und 8 Messungen desselben Quo- tienten bei 100% HbOs ausgeffihrt. Die 10Be- stimmungen yon [DSa°/D s~s] HiOH ergaben einen Mittelwert von 1,091 mit einer Standard-Deviation von 0,023. Die 8 Bcstimmungen yon [DSt°/D ~ ] HbO~ ergaben als Mittelwert 1,753 mit einer Standard- Deviation yon 0,005. Auf Grund dieser Zahlen wurde der Wert yon a u n d b berechnet; a = - 1,511 und b = - - 2,649.

Durch Substitution von 1,753 ~ 0,005 und 1,091 4- 0,023 in die Gleichung

SM(% ) -= (2,649 - - 1,511 D~°/DS~) • 100 (2)

erhielt man einen Eindruck der Genauigkeit der Methode:

1,753 4- 0,005 gibt S ~ ~- 0 4- 0,8 % 1,091 q- 0,023 gibt S M = 100 4- 3,5%.

Die grol~e Streuung des Wertes yon [DS~°/D s~s] H i0 t I , yon der die Ungenauigkeit der Methode bei hohen Meth~moglobinkonzentrationen verursacht wird, veran]aftte uns zu einer weiteren Untersuchung. Es gait die Ursuche dieser gTol~en Strenung ansfindig zu machen nnd die Methode so abzu/~ndern, daI~ ouch

bei hSheren Methgmoglobinkonzentrationen eine aus- reiehende Genatfigkeit zu erhalten ist.

AUSTII~- und DRABKIN :t fanden, dab es bei PH- Werten fiber 10,1 eine langsame Verwandlung von Methgmoglobin in alkalisehes H/~matLn gibt. Da bei der oben besehriebenen Methode eine 200roche Ver- dfinnung des Blutes mit 0,1%iger NHs-LSsung vor- genommen wird, ist dos PH der bei der Best immung des Quotienten [DS*°/D 525] HiOH benutzten LSsung ungef£hr 11,0. Die grol~e Streuung kSnnte also yon der Bildung wechselnder Mengen alkalischen Hgmatins best immt sein. Urn zu untersuchen ob bier tats~.chlieh eine StSrung durch alkalisches H/~matin vorl~ge, wurden gleiehkonzentrierte Meth~moglobinlSsungen in 0,16, 0,016 und 0,0016% N H s (90, 9 und 0,9 m.aeq/I) bereitet. Dos p~ dieser LSsungen war l l , l , 10,6 und 10,I. Dos Absorptionsspektrum dieser LSsungen wurde mit gleichen Zeitintcrvallcn einige Male ge- messen. Es stellte sieh heraus, dal~ dos Absorptions- spektrnm der LSsung von p~ 11,1 sich schnell, dos der LSsung yon p~ 10,6 sich langsam und dos der Lgsung yon p~ 10,1 sich fast nicht mit der Zeit ~nderte. Wenn man eine alkalische Meth~moglobinlTsung mi t etwas Nadithionit (Na2S~O4) versetzt, wird dos HiOH in Hb, dos eventuell anwesende alkalisehe Hgmat in in H/ira verwandelt, dos sich mit dem denaturierten Globin zu H~mochrom verbindet 3. Dos I-Iamochrom hat ein sehr charakteristisches Absorptionsspektrum mit Maxima bei 558 und 530 mtt. Mittels dieser Me- rhode konnte in unseren MethgmoglobinlSsungen alkalisches H~matin naehgewiesen werden. Bei Ge- braueh yon 0,9 m.aeq NHa/1 war die Bildung dee alkalischen H/~matins, ouch naeh 24 Std, noch sehr gering.

Es wurde nun auf Grund dieser Erfahrungen eine neue l~eihe Messungen der Quotienten [D54°/D ~25] HiOH und [DS4°/D 5ss] I-Ib02 durchgefiihrt, start 0,1% N H s wurde nun aber stets eine weiter verdfinnte N H s- LSsnng verwendet (dos p g dieser NI-Is-LSsung war 10,1 ; die Konzen~ration 0,9 m.ae%/1).

8 Bestimmungen yon [DS~°/D s~s] HbO 2 ergaben 1,802 4- 0,008.

11 Bestimmnngen yon [DS4°/D 525] H i O g ergaben 1,253 =]= 0,008.

Aus diesen Zahlen ist eine neue GIeichung zur Berech- hung der partiellen Meth~mogtobinkonzentration abzu- leiten

S~u (%) = (3,283 - - 1,822 D~°/DS~5) - 100. (3)