Der Effekt von Interferon alpha auf Thrombozyten und ... · GPT Glutamat-Pyruvat-Transaminase, Synonym: Alanin-Amino-Transferase (ALT) Hb Hämoglobin HCV Hepatitis-C-Virus HLA Human

Aus der Abteilung für Gastroenterologie und Hepatologie

des Knappschafts-Krankenhauses Bochum-Langendreer

- Universitätsklinik -

der Ruhr-Universität Bochum

Direktor: Prof. Dr. med. W. Schmiegel

Der Effekt von Interferon alpha auf Thrombozyten und

Thrombopoietin

in Abhängigkeit vom Fibrosegrad

bei Patienten mit chronischer Hepatitis C

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer

Hohen Medizinischen Fakultät

der Ruhr-Universität Bochum

Vorgelegt von

Stefanie Rose

aus Hagen

2004

Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr

Referent: Prof. Dr. med. W. Schmiegel

Korreferent: Prof. Dr. med. S. Petrasch

Tag der mündlichen Prüfung: 14.04.2005

M e i n e n E l t e r n i n D a n k b a r k e i t g e w i d m e t

I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung......................................................................... 1

1.1 Thrombozytopoese und Thrombopoietin.................................. 2

1.1.1 Entdeckung von Thrombopoietin................................. 3

1.1.2 Struktur von Thrombopoietin....................................... 3

1.1.3 Aufgaben von TPO und Regulation der

TPO-Produktion........................................................... 4

1.2 Therapie der chronischen Hepatitis C...................................... 8

1.3 Richtlinien zur Therapiekontrolle.............................................. 10

1.4 Fragestellung............................................................................ 11

2 Patienten, Material und Methoden................................. 12

2.1 Patientengruppe..................................................................... 12

2.2 Kontrollgruppe........................................................................ 12

2.3 Blutprobengewinnung............................................................ 13

2.3.1 Gewinnung von Blutserum.......................................... 13

2.3.2 Blutbild......................................................................... 13

2.3.3 Bestimmung von Glutamat-Pyruvat-Dehydrogenase/

-Transaminase (GPT) [entspricht Alanin-Amino-

Transferase (ALT)] und Glutamat-Oxalacetat-

Transaminase (GOT) [entspricht Aspartat-Amino-

Transferase (AST)]...................................................... 14

2.3.4 Messung von Albumin................................................. 14

2.3.5 Messung des Quickwertes (Thromboplastinzeit)......... 14

2.4 Bestimmung der HCV-RNA.................................................... 15

2.5 Bestimmung von Thrombopoietin.......................................... 16

2.5.1 Prinzip des Thrombopoietin-ELISA............................. 17

2.5.2 Ablauf des Thrombopoietin-ELISA.............................. 19

2.6 Einteilung des Fibrosegrades................................................ 21

2.7 Bestimmung der Milzgröße.................................................... 21

2.8 Statistische Methoden........................................................... 22

II

3 Ergebnisse............................................................ 24

3.1 Thrombopoetin-Konzentration und Thrombozytenzahl der

gesunden Probanden............................................................. 25

3.2 Ausgangssituation: Thrombopoietin-Serumkonzentration und

Thrombozytenzahl vor Therapiebeginn unter Beachtung des

Einflusses des Fibrosegrades................................................ 27

3.3 Kinetik der Thrombopoietin-Spiegel und der Thrombozyten-

zahl während und nach der Therapie.................................... 28

3.4 Kinetik der Thrombopoietinkonzentration und

Thrombozytenzahl in Abhängigkeit vom Fibrosegrad............ 31

3.5 Varianzanalyse: Modell mit Messwiederholung..................... 34

3.5.1 Thrombopoietinkonzentration...................................... 34

3.5.2 Thrombozytenzahl....................................................... 34

3.6 Einstichproben-t-Test angewandt auf die Differenzen

der verbundenen Stichproben................................................ 35

3.6.1 Auswertung der Ergebnisse der Thrombopoietin-

Serumkonzentration in Abhängigkeit vom

Fibrosegrad und von der Zeit...................................... 35

3.6.2 Auswertung der Ergebnisse der Thrombozytenzahl

in Abhängigkeit vom Fibrosegrad und von der Zeit..... 35

3.7 Auswirkung der Interferon-Therapie auf weitere Parameter

des Blutbildes......................................................................... 37

3.7.1 Kinetik der Leukozyten................................................ 37

3.7.2 Kinetik des Hämoglobinwertes.................................... 39

3.7.3 Kinetik von GOT und GPT........................................... 40

3.7.4 Kinetik von Albumin..................................................... 43

3.7.5 Kinetik des Quickwertes.............................................. 44

3.7.6 Einfluss der Milzgröße................................................. 45

III

4 Diskussion....................................................................... 47

4.1 Fibrosegrad, Thrombozytenzahl und Thrombopoietin........... 48

4.2 Einfluss von Interferon........................................................... 53

4.3 Thrombozyten und Thrombopoietin nach Abschluss der

Interferon-Therapie................................................................ 57

4.4 GOT und GPT........................................................................ 59

4.5 Leber-Synthese-Parameter Albumin und Quick.................... 59

4.5.1 Albumin....................................................................... 59

4.5.2 Quick........................................................................... 59

4.6 Hämoglobin............................................................................ 60

4.7 Fazit....................................................................................... 61

5 Zusammenfassung......................................................... 62

6 Literaturverzeichnis........................................................ 65

7 Anhang: Erhebungsbogen............................................. 82

8 Danksagung..................................................................... 83

9 Lebenslauf....................................................................... 84

IV

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Regelkreis der Thrombozytopoese.............................. 6

Abbildung 2: Prinzip des Sandwich-ELISA....................................... 18

Abbildung 3: Thrombopoietin-Konzentrationen der 20 gesunden

Probanden, gemessen mit dem ELISA

Quantikine® human Tpo, R&D Systems

(Absolutwerte dargestellt)............................................ 25

Abbildung 4: Thrombopoietin-Konzentrationen der 20 gesunden

Probanden, dargestellt als Box-and-Whiskers-Plot.... 26

Abbildung 5: Thrombozytenzahlen der 20 gesunden Probanden,

dargestellt als Box-and-Whiskers-Plot......................... 26

Abbildung 6: Thrombozytenzahl und TPO-Konzentration der 45

Patienten mit chronischer Hepatitis C zum Zeitpunkt

vor Beginn der Therapie (Darstellung der Mediane)... 27


Patienten mit chronischer Hepatitis C nach zwei

Monaten Kombinationstherapie (Darstellung der

Mediane)...................................................................... 28


Patienten mit chronischer Hepatitis C nach vier


Mediane)..................................................................... 29


Patienten mit chronischer Hepatitis C nach sechs


Mediane)...................................................................... 30

Abbildung 10: Thrombozytenzahl und TPO- Konzentration der 45

Patienten mit chronischer Hepatitis C nach der

Kombinationstherapie (Nachbeobachtungszeitraum:

zwei bis maximal sechs Monate nach

Therapiebeendigung).................................................. 30

V

Abbildung 11: Darstellung der Thrombozytenzahl und

Thrombopoietinkonzentration (Mediane) vor,

während und nach der antiviralen Kombinations-

therapie bei Patienten mit chronischer Hepatitis C

und ohne bzw. mit sehr leichter Fibrose

(Fibrosegrad 0 nach Metavir)...................................... 31





und mittelschwerer Fibrose (Fibrosegrad 1+2 nach

Metavir)....................................................................... 32





und ausgeprägter Fibrose (Fibrosegrad 3+4 nach

Metavir)....................................................................... 33

Abbildung 14: Leukozytenwerte der Patienten mit chronischer

Hepatitis C während des Beobachtungszeitraumes

(vor, während und nach Interferon-Ribavirin-Therapie)

in Abhängigkeit von dem bestehenden

Fibrosegrad (Darstellung der Mediane)....................... 37

Abbildung 15: Hämoglobinwerte der Patienten mit chronischer



in Abhängigkeit von dem bestehenden

Fibrosegrad (Darstellung der Mediane)....................... 39

Abbildung 16: Transaminasen (hier beispielhaft dargestellt für GPT)

der Patienten mit chronischer Hepatitis C während

des Beobachtungszeitraumes (vor, während und

nach Interferon-Ribavirin-Therapie) in Abhängigkeit

von dem bestehenden Fibrosegrad (Darstellung der

Mediane)...................................................................... 40

VI

Abbildung 17: Therapie-Responder (55% des Patientenkollektivs)

und die Höhe ihrer Transaminasen (hier beispielhaft

dargestellt für GPT) vor und nach der Therapie in

Abhängigkeit von ihrem Fibrosegrad (Darstellung der

Mediane)...................................................................... 41

Abbildung 18: Therapie-Non-Responder (45% des Patienten-

kollektivs) und die Höhe ihrer Transaminasen

(hier beispielhaft dargestellt für GPT) vor und nach

der Therapie in Abhängigkeit von ihrem Fibrosegrad

(Darstellung der Mediane)........................................... 42

Abbildung 19: Albuminwerte der Patienten mit chronischer



in Abhängigkeit von dem bestehenden Fibrosegrad


Abbildung 20: Quickwerte der Patienten mit chronischer



in Abhängigkeit von dem bestehenden Fibrosegrad


Abbildung 21: Größe der Milz der 45 Patienten mit chronischer

Hepatitis C in Abhängigkeit von dem bestehenden

Fibrosegrad................................................................. 45

Abbildung 22: Verteilung der Thrombozytenzahl (Mediane) der

Patienten mit mäßiger und schwerer Fibrose in

Abhängigkeit von der Milzgröße.................................. 46

Abbildung 23: Autoregulation der Thrombozytopoese und

der Einflussfaktor Milz................................................. 52

Abbildung 24: Darstellung der Einflüsse der Interferon-Therapie und

der Milz auf Thrombopoietin und Thrombozyten......... 55

VII

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 Patienten-Charakteristika (Mittelwerte ±

Standardabweichung; [Median]).................................. .......... 24

Abkürzungsverzeichnis

Alb Albumin

c-Mpl cellular murine myeloproliferative leukemia virus

DNA/DNS Desoxyribonucleic acid / Desoxyribonukleinsäure

ELISA Enzyme-linked Immuno-sorbent-assay

GOT Glutamat-Oxalacetat-Transaminase, Synonym: Aspartat-

Amino-Transferase (AST)

GPT Glutamat-Pyruvat-Transaminase, Synonym: Alanin-Amino-

Transferase (ALT)

Hb Hämoglobin

HCV Hepatitis-C-Virus

HLA Human Leucocyte Antigen

IFN Interferon

INR International Normalized Ratio

ITP Idiopathische thrombozytopenische Purpura

JAK Januskinase

KDa Kilo-Dalton, atomare Masseneinheit

MDS Myelodysplastisches Syndrom

MHC Major Histocompatibility Complex

Mpl murine myeloproliferative leukemia virus

NDDIC National Digestive Diseases Information Clearinghouse

NIDDK National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney

Diseases

NIH National Institute of Health

VIII

PCR Polymerase-Chain-Reaction

RKI Robert-Koch-Institut

RNA/RNS ribonucleic acid / Ribonukleinsäure

RT-PCR Reverse-Transkriptase-PCR

STAT Signal Transduction and Activators of Transcription

TA Transaminasen

TPO Thrombopoietin

TSH Thyroidea-Stimulating-Hormon

TYK Tyrosinkinase

TZ Thrombozytenzahl

v-Mpl viral murine myeloproliferative leukemia virus

WBC White Blood Cells

WHO World Health Organization

1 Einleitung

1

1 Einleitung

Die Leber spielt eine zentrale Rolle im menschlichen Stoffwechsel. Sie erfüllt

zahlreiche Synthese-, Exkretions- und Entgiftungs-Funktionen, zu denen

beispielhaft die Synthese der Gerinnungsfaktoren, Lipide, Kohlenhydrate und

des Albumins, die Bildung und Exkretion von Gallensäuren, sowie die

Entgiftung endo- und exogener toxischer Stoffe gezählt werden.

Die gemeinsame Endstrecke einer Vielzahl chronischer Lebererkrankungen

ist die Leberzirrhose.

Neben der alkoholtoxischen Hepatopathie stellt die chronische Virushepatitis,

in der westlichen Welt die Infektion mit dem Hepatitis C-Virus, die häufigste

Ursache der Leberzirrhose dar. Heute ist die Hepatitis C-assoziierte

Leberzirrhose die häufigste Indikation für eine Lebertransplantation (NIDDK,

2003; Lauer and Walker, 2001; Fishman et al., 1996; Detre et al., 1996).

Nach Angaben der WHO sind etwa 170 Millionen Menschen, d.h. 3% der

Weltbevölkerung, mit dem Hepatitis C-Virus infiziert; in Deutschland wird die

Zahl chronisch infizierter Hepatitis-C-Virusträger auf 800.000 geschätzt

(Reiser et al., 2003; Schreier and Höhne, 2001).

Die chronische Entzündungsreaktion im Rahmen der Hepatitis führt zur

Bindegewebsvermehrung (Fibrose), die letztlich in einem irreparablen

Umbau des Leberparenchyms mit Zerstörung der Architektur mündet. Dies

führt zum Ausfall essentieller Leberfunktionen mit Entwicklung zahlreicher

Komplikationen wie Ikterus, Koagulopathie, Hypoalbuminämie, Aszites und

Enzephalopathie.

Der Schweregrad einer Zirrhose wird mit Hilfe des Child-Pugh-Scores

angegeben, der aus den Serumwerten für Albumin, Bilirubin und Quickwert

sowie dem Ausmaß von Aszites und hepatischer Enzephalopathie ermittelt

wird und eine Prognoseeinschätzung erlaubt.

Regelhaft wird die Leberzirrhose von einer Leukozytopenie und

Thrombozytopenie begleitet (Goulis et al., 1999). Die Thrombozytopenie ist

eine schwerwiegende Komplikation, die eine Koagulopathie verstärken und

1 Einleitung

2

zu ausgedehnten Blutungen führen kann (Peck-Radosavljevic et al., 1997

u.1998; Bartley et al., 1994).

Eine wesentliche Ursache für die zirrhoseassoziierte Thrombozytopenie wird

in einer vermehrten Sequestration der Thrombozyten in der Milz gesehen.

Hiermit übereinstimmend zeigen mehrere Studien zur Thrombozytopenie bei

chronischen Lebererkrankungen, dass der vergrößerte Thrombozyten-

milzpool und die beschleunigte Zerstörung wichtige Mechanismen der

Thrombozytopenie sind (Aster, 1966; Harker and Finch, 1969; Toghill et al.,

1977; Peck-Radosavljevic et al., 1997; Adinolfi et al., 2001).

1.1 Thrombozytopoese und Thrombopoietin

Die Bildung und Entwicklung der Thrombozyten (Thrombozytopoese) findet

im Knochenmark statt. Aus Knochenmarkstammzellen entstehen durch

Differenzierung erst Megakaryoblasten, dann durch mitotische Teilung

Promegakaryozyten und schließlich die reifen Megakaryozyten. Diese geben

durch Cytoplasmaabschnürung in den Knochenmarksinus Thrombozyten an

das Blut ab. Die Thrombozytopoese wird durch den Einfluss verschiedener

stimulierender Faktoren geregelt.

Eine wichtige Rolle in der Regulation der Thrombozyto- und

Megakaryozytopoese spielt das Thrombopoietin (TPO) (Kaushansky, 2003;

Kaushansky, 1995).

Erst mit der Entdeckung von TPO im Jahre 1994 und der Identifizierung der

Hepatozyten als den hauptsächlichen TPO-Produktionsorten kam der Leber

eine zentrale Stellung in der Thrombozytopoese und Thrombozytenregulation

zu (De Sauvage et al., 1994; Lok et al., 1994; Bartley et al., 1994; Kuter and

Rosenberg, 1994; Kuter et al., 1994; Sohma et al., 1994; Broudy and

Kaushansky, 1998).

1 Einleitung

3

1.1.1 Entdeckung von Thrombopoietin

Im Jahre 1958 wurde der Ausdruck „Thrombopoietin“ zum ersten Mal

gebraucht, um einen Faktor zu beschreiben, der nach dem Einsetzen einer

Thrombozytopenie für das Ansteigen der Thrombozyten-Produktion

verantwortlich zu sein schien (Kelemen et al., 1958).

Viele Versuche in den 70er und 80er Jahren, Thrombopoietin (TPO) genauer

zu charakterisieren, blieben aufgrund der hohen biochemischen Komplexität

des Moleküls erfolglos.

Erst im Jahre 1992 eröffnete die Beschreibung des viralen Proto-Onkogens

v-Mpl und des dazu homologen zellulären Onkogens c-Mpl (murine

myeloproliferative leukemia virus) neue Perspektiven in der Suche nach TPO

(Vigon et al., 1992).

Eine detaillierte Studie des c-Mpl Genes ergab, dass es einen bisher nicht

beachteten hämatopoietischen Zytokin-Rezeptor kodierte.

Mehrere Gruppen (De Sauvage et al., 1994; Lok et al., 1994; Bartley et al.,

1994; Kuter et al., 1994; Kuter and Rosenberg, 1994; Sohma et al., 1994)

hatten schließlich Erfolg, das Protein zu isolieren und die cDNA für

Thrombopoietin zu klonieren.

1.1.2 Struktur von Thrombopoietin

Thrombopoietin (TPO) ist ein 60-70 kDa schweres Polypeptid aus 353

Aminosäuren. Es lassen sich zwei Domänen unterscheiden, die auf der

Ähnlichkeit mit der Primärstruktur von Erythropoietin (EPO) basieren (Gurney

et al., 1994; De Sauvage et al., 1994; Lok et al., 1994; Metcalf, 1994).

Der Amino-N-terminale Abschnitt des Peptids (155 Aminosäuren) hat große

Ähnlichkeit mit Erythropoietin: 21% der Aminosäuren sind identisch und es ist

strukturell zu 46% analog aufgebaut wie EPO, was die beiden Hormone zu

den am meisten miteinander verwandten aller hämatopoietischen

Wachstumsfaktoren macht (Kaushansky, 1998a; Broudy and Kaushansky,

1998). Außerdem enthält diese Region einen großen Cystein-Anteil und

1 Einleitung

4

diese ist für die Bindung an den spezifischen Rezeptor (c-Mpl) und somit für

die thrombopoetische Wirkung verantwortlich (Bartley et al., 1994).

Im Gegensatz dazu ist der C-terminale Abschnitt des Moleküls (die zweite

178 Aminosäuren enthaltende Domäne) mit keinem anderen Protein

verwandt. Dieser ist charakterisiert durch einen hohen Prozentsatz von

Serin- und Prolin-Resten und enthält viele glykosylierte Seitenketten und

scheint für die Stabilität des Moleküls eine Rolle zu spielen (Kaushansky,

1998a; Broudy and Kaushansky,1998).

1.1.3 Aufgaben von TPO und Regulation der TPO-Produktion

Thrombopoietin ist der hauptsächliche Regulator der Megakaryozyto- und

Thrombozytopoese. Es steigert die Menge an Megakaryozyten-

Vorläuferzellen, stimuliert die Proliferation und Maturation der

Megakaryozyten und lässt die Plättchen- und Megakaryozyten-Anzahl und -

Größe anwachsen (Kaushansky et al., 1994; Kaushansky, 1995; Wendling et

al., 1994; Zucker-Franklin and Kaushansky, 1996).

In verschiedenen Versuchen an Mäusen, Affen und Menschen wurde

gezeigt, dass bei Gabe von TPO die peripheren Thrombozytenzahlen

innerhalb von 3-5 Tagen auf das 5-10fache der Normalwerte ansteigen (Lok

et al., 1994).

Andere Zytokine wie Interleukin 3 und 11, Erythropoietin und Steel Factor,

wirken synergistisch, indem sie das Megakaryozyten-Wachstum positiv

beeinflussen und das Überleben aller hämatopoetischen Stammzellen und

Blutzellvorläufern verlängern (Broudy et al., 1995; Kaushansky et al., 1995;

Kobayashi et al., 1996; Kaushansky et al., 1996; Kaushansky, 1998b;

Kaushansky, 1999b).

TPO unterstützt darüber hinaus Erythropoietin bei der Entwicklung von

Erythrozyten-Vorläuferzellen (Kaushansky et al., 1996).

Kaushansky konnte 1997 in einer seiner Arbeiten zeigen, dass bei

genetischer Elimination von TPO oder des TPO-Rezeptors die Spiegel der

1 Einleitung

5

Vorläuferzellen aller Zelllinien reduziert sind und die Thrombozyten-

Produktion stark beeinträchtigt ist (Kaushansky, 1997).

Diese Befunde bestätigen die Stellung von TPO als hauptverantwortlichem

Faktor für die Thrombozytopoese und als nicht zelllinienspezifischer

Wachstumsfaktor aller hämatopoietischen Vorläuferzellen (Kaushansky,

2003 u. 1999a; Geddis et al., 2002).

Außerdem sensibilisiert Thrombopoietin die Thrombozyten für Faktoren

(Thrombin, Kollagen), die für die Plättchen-Aggregation verantwortlich sind

(Kaushansky, 1998a+b; Alexander et al., 1996; Chen et al., 1995).

Thrombopoietin wird in verschiedenen Organen (in den Nieren, im glatten

Muskel, in Knochenmarkstromazellen) gebildet; der größte Anteil wird jedoch

in der Leber durch die Hepatozyten produziert (De Sauvage et al., 1994 ; Lok

et al., 1994; Shimada et al., 1995; Guerriero et al., 1997; Qian et al., 1998;

Broudy and Kaushansky, 1998; Kaushansky, 1998a).

TPO entfaltet seine Wirkung durch die Bindung an seinen Zell-

Oberflächenrezeptor, c-Mpl (Bartley et al., 1994; Gurney et al., 1994). Der

TPO-Rezeptor (c-Mpl) gehört zu der hämatopoetischen Zytokin-Rezeptor-

Familie Typ I, die ihre biologischen Effekte über die Aktivierung der

Januskinase (JAK) ausübt. Durch Bindung des Liganden TPO an den

Rezeptor c-Mpl wird eine Signalkaskade ausgelöst: Es kommt zur Rezeptor-

Oligomerisation und -Konformationsänderung, wodurch die JAK

phosphoryliert und in der Folge die TAK (Tyrosinkinase), STAT (Signal

transduction and activators of transcription) und weitere kritische

intrazelluläre Substanzen aktiviert werden (Wang et al., 2000; Drachman et

al., 1999; Miyakawa et al., 1996; Drachman et al., 1995; Tortolani et al.,

1995; Gurney et al., 1995; Miyakawa et al., 1995; Sattler et al., 1995; Morella

et al., 1995; Ihle et al., 1994).

Die zirkulierende Menge an Thrombopoietin unterliegt einem komplexen

Regelkreis (Abb. 1). Mehrere Studien haben gezeigt, dass Megakaryozyten

und Thrombozyten hoch-affine Thrombopoietin-Rezeptoren haben, mittels

derer sie das Zytokin binden und wieder aus dem Blutkreislauf entfernen (Li

et al., 1999; Sato et al., 1998; Fielder et al., 1997; Folman et al., 1997;

Broudy et al., 1997; Nagata et al., 1997; Fielder et al., 1996; Kuter and

1 Einleitung

6

Rosenberg, 1995). Wenn die Thrombozytenzahlen normal hoch sind,

zirkuliert deshalb nur wenig Thrombopoietin. In thrombozytopenischen

Zuständen kann von den weniger vorhandenen Plättchen und Mpl-

Rezeptoren nur eine geringe Menge des freigesetzten Thrombopoietins aus

der Zirkulation entfernt werden. Deswegen steigt die Konzentration von

löslichem TPO an. Der daraus resultierende hohe Thrombopoietin-Spiegel

stimuliert das Knochenmark. Auf diese Weise wird das Knochenmark zur

erneuten Megakaryo- und Thrombozytopoese angeregt. Wenn die

Thrombozytenzahl wieder steigt, entfernen die Thrombozyten mittels ihrer

Rezeptoren den größten Anteil des Thrombopoietins aus dem Plasma, der

Thrombopoietin-Spiegel sinkt daraufhin wieder ab und die Knochenmark-

Ausschüttung von Thrombozyten kommt fast zum Erliegen (Geddis et al.,

2002; Kaushansky, 1998a; Kuter and Rosenberg, 1995).

Betrachtet man nur diesen Regelkreis, dann resultiert ein umgekehrt

proportionales Verhältnis von Thrombozyten und Thrombopoietin zueinander

(Jelkmann, 2001; Espanol et al., 2000; Peck-Radosavljevic et al., 1997; Kuter

and Rosenberg, 1995).

Autoregulation von Thrombozyten und

Thrombopoietin

Megakaryozyten

im Knochenmark

TPO-mRNA

TPO im SerumTPO im Serum

Thrombozyten binden TPO

mit Mpl-Rezeptoren

Fördernder Einfluss

Hemmender Einfluss

Leber

Abbildung 1: Regelkreis der Thrombozytopoese (angelehnt an Geddis et al., 2002)

1 Einleitung

7

In der Tat konnten Folman et al. in ihrer Studie (Folman et al., 2001) zeigen,

dass thrombozytopenische Patienten einen hohen Thrombopoietin-Spiegel

hatten, der nach Thrombozyten-Transfusion zunächst abfiel, mit erneut

sinkender Thrombozyten-Zahl jedoch wieder anstieg. Ebenfalls zeigten

Moller et al., dass nach Thrombozyten-Transfusionen signifikante Senkungen

in der mittleren TPO-Konzentration eintraten (Moller et al., 2000).

Die hepatische Thrombopoietinproduktion scheint dagegen keiner

transkriptionellen oder posttranskriptionellen Regulation zu unterliegen und

wird daher als konstant (konstitutiv) angesehen (Geddis et al., 2002; Cardier

and Dempsey, 1998; Stoffel et al., 1996). Auch Jelkmann kam zu dem

Schluss, dass die Leber gleichbleibend und wenig beeinflusst von äußeren

Umständen, wie z.B. dem Thrombozyten-Spiegel im Blut, konstante Mengen

an Thrombopoietin produziert (Jelkmann, 2001).

Bei gesunden Erwachsenen mit normaler Thrombozytenzahl liegen die TPO-

Plasmaspiegel unter 200 pg/ml und damit in einem niedrigen Bereich

(Jelkmann, 2001; Emmons et al.,1996; Chang et al., 1996; Tahara et al.,

1996).

Die Studiengruppen um Hou und Stockelberg (Hou et al., 1998; Stockelberg

et al., 1999) fanden bei ihren Untersuchungen von gesunden Probanden

Mittelwerte für Thrombopoietin von 50 ± 14 pg/ml.

1 Einleitung

8

1.2 Therapie der chronischen Hepatitis C

Die Therapie der Wahl der chronischen Hepatitis C besteht in einer

Kombinationstherapie mit Interferon alpha und Ribavirin (Konsensus der

DGVS/Hep-Net, 2003; Reiser et al., 2003; Tran and Martin, 2001; Reiser and

Schmiegel, 1999; Peck-Radosavljevic et al., 1998; Hoofnagle and di

Bisceglie, 1997; Poynard et al., 1995).

Interferone sind Bestandteile eines Zytokinnetzwerkes, welches im Rahmen

einer Virusinfektion für die Regulation zellulärer Funktionen, der Replikation

und der Immunantwort verantwortlich ist.

Interferon alpha gehört zu den Klasse-I-Interferonen und wird von

Makrophagen produziert. Die Genstruktur der Alpha-Interferone ist komplex

und umfasst mehr als 20 Gene. Für die Therapie wurden verschiedene

Typen von rekombinantem Interferon alpha entwickelt, die unterschiedliche

antiproliferative und immunmodulatorische Eigenschaften besitzen.

Durch Hemmung der Viruspenetration und Virusreplikation wirkt Interferon

alpha direkt antiviral auf DNA- und RNA-Viren. Dabei wird sowohl zelluläre

als auch virale RNA abgebaut. Die Aktivierung einer Proteinkinase führt zur

weiteren Inhibition der Proteinsynthese, wodurch die Entwicklung weiterer

Viruspartikel behindert wird.

Interferon moduliert weiterhin die zelluläre Immunantwort durch vermehrte

Expression von MHC-I-Antigen. Es fördert somit die Präsentation viraler

Antigene durch HLA-Klasse-I-Moleküle auf der Hepatozytenoberfläche und

begünstigt damit die Zerstörung infizierter Leberzellen durch zytotoxische T-

Zellen. Hierdurch wird neben der direkten Wirkung auf zytotoxische T-Zellen

und natürliche Killerzellen die spezifische T-Zell-vermittelte (zytotoxische und

Suppressor-T-Zellen) Immunantwort verstärkt (Gutterman, 1994).

Eine Hauptnebenwirkung unter Interferon-Therapie ist die Thrombozytopenie

(Fried, 2002; Peck-Radosavljevic et al., 1998; Hoofnagle and di Bisceglie,

1997; Poynard et al., 1995).

Verschiedene Formen von Interferon stehen heute zur Verfügung: Die

Standard-Interferone alpha-2a und -2b, sowie das nicht natürlich

1 Einleitung

9

vorkommende (synthetische) Consensus-Interferon. Sie werden dreimal pro

Woche subkutan appliziert. Die pegylierten Interferone alpha-2a und -2b

stellen eine Weiterentwicklung der Standardinterferone dar. Sie bestehen

aus Interferon alpha, das durch Zufügen von Polyethylen-Glycol „retardiert“

wurde; das Ergebnis ist ein lang-wirksames Interferon, das nur einmal pro

Woche gegeben werden muss (Konsensus der DGVS/Hep-Net, 2003;

NIDDK, 2003; Tran and Martin, 2001; Manns et al., 2001; Zeuzem et al.,

2000; McHutchison et al., 1998).

Ribavirin ist ein antivirales (virostatisch wirkendes) Agens, das zweimal am

Tag in einer körpergewichtsabhängigen Gesamt-Dosis von 800 mg bis

1200 mg oral eingenommen wird (Konsensus der DGVS/Hep-Net, 2003;

Lauer and Walker, 2001). Ribavirin hat keinen Einfluss auf die

Thrombozytopoese und auf die Höhe der zirkulierenden

Thrombozytenzahlen.

Die Kombinationstherapie mit Interferon und Ribavirin erzielt höhere Raten

einer anhaltenden Therapieantwort als die Interferon-Monotherapie.

Das primäre Therapieziel in der Behandlung der chronischen Hepatitis C

besteht in der dauerhaften Elimination des HC-Virus, welche durch einen

negativen Serum-HCV-RNA-Nachweis 6 Monate nach Beendigung der

Therapie definiert wird (anhaltende Therapieantwort).

Zu den sekundären Therapiezielen zählen die Verzögerung der

Krankheitsprogression, die Verbesserung der Leber-Histologie, die

Minderung der Infektiösität und die Reduktion des Risikos für das Auftreten

eines hepatozellulären Karzinoms (Tran and Martin, 2001; Gramenzi et al.,

2001; Di Bisceglie, 1998; Hoofnagle and di Bisceglie, 1997).

Der Erfolg der Therapie mit Interferon und Ribavirin ist sowohl von

Virusfaktoren (Genotyp, Viruslast) als auch von Wirtsfaktoren

(Fibrosestadium, Alter, Körpergewicht) abhängig. Die Chance einer

anhaltenden Therapieantwort (normale Transaminasen und fehlender HCV-

RNA-Nachweis im Serum 6 Monate nach Ende der Therapie) liegt bei

ungünstiger Konstellation (lange Krankheitsdauer, fortgeschrittenes

Fibrosestadium, hoher Viruslast) um 40%, bei günstiger Konstellation ist sie

1 Einleitung

10

größer 80% (Poynard et al., 2001; Reiser et al., 2003; Reiser and Schmiegel,

1999).

1.3 Richtlinien zur Therapiekontrolle

Alle 4 Wochen sollte eine klinische Untersuchung (im ersten Monat alle 2

Wochen), sowie eine Laborkontrolle von Transaminasen, Blutbild mit

Thrombozyten, Leukozyten und Hämoglobin und ggf. der

Nierenretentionswerte (Kreatinin) und der Glukose erfolgen. TSH-Messungen

sollten in 12-wöchigen Abständen erfolgen, um frühzeitig eine

Schilddrüsendysfunktion zu erkennen und ggf. zu therapieren.

Eine Bestimmung der HCV-RNA mittels PCR (quantitativ und qualitativ) wird

vor Beginn der Therapie, sowie 12 und 24 Wochen nach Therapiebeginn

empfohlen.

Nach Beendigung der Therapie sollten die Patienten für mindestens weitere

24 Wochen überwacht werden. Nach dieser Zeit ist eine erneute Prüfung auf

Vorhandensein und Menge von HCV-RNA vorzunehmen.

Als Kontraindikation gegen eine Therapie mit Interferon gilt eine

Thrombozytenzahl unter 50.000/µl. Weitere Gegenanzeigen einer Therapie

mit Interferon sind schwere psychische Erkrankungen, Alkohol- oder

Drogenabusus, oder eine bestehende oder geplante Schwangerschaft

(Konsensus der DGVS/Hep-Net, 2003; NIDDK, 2003).

1 Einleitung

11

1.4 Fragestellung

Aus den vorherigen Ausführungen ist erkennbar, dass die Thrombozytenzahl

einer komplexen Regulation unterliegt. Die Sequestration und Zerstörung der

Thrombozyten in der Milz sowie die Produktion der Thrombozyten im

Knochenmark stellen kritische Grössen in der Balance des

Thrombozytenhaushaltes dar. Die Leber, als Hauptproduktionsort für TPO,

und ihre Funktion ist ein weiterer sensibler Parameter im Regelkreis der

Thrombozytopoese.

Eine Thrombozytopenie tritt häufig als Komplikation bei chronischen

Lebererkrankungen auf und exazerbiert oftmals unter Therapie mit Interferon

und Ribavirin.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den Einfluss des Leberfibrosegrades

sowie den Effekt einer Interferon-Ribavirin-Kombinationstherapie auf die

TPO-Serumkonzentration und Thrombozytenzahl bei Patienten mit

chronischer Hepatitis C zu untersuchen.

Hierzu sollten folgende Fragen beantwortet werden:

1. Wie verhält sich die TPO-Serumkonzentration bei verschiedenen

Fibrosegraden und welche Beziehung besteht zur Thrombozytenzahl?

2. Welche Auswirkung hat die Interferon-Therapie auf die TPO-Spiegel?

3. Ist der Einfluss der Interferontherapie auf die TPO-Spiegel vom

Fibrosegrad abhängig?

2 Patienten, Material und Methoden

12


2.1 Patientengruppe

In der Medizinischen Universitätsklinik des Knappschaftskrankenhauses

Bochum-Langendreer wurde in der Zeit von Januar 1997 bis Januar 2002

das Blut von mehr als 300 Patienten mit chronischer HCV-Infektion

untersucht.

Vom untersuchten Patientenkollektiv lag bei 45 Patienten ein adäquater

Serumsatz (Serumproben zum Zeitpunkt vor Beginn, zu den

Untersuchungszeitpunkten zwei, vier und sechs Monate während und

mindestens zwei Monate nach Beendigung der Interferon-Ribavirin-Therapie)

zur Aufnahme in diese Studie vor. Bei den übrigen Patienten waren keine

ausreichenden klinischen Daten bzw. zu wenig Probenmaterial zur

Bestimmung der TPO-Konzentration vorhanden.

Aus den vorliegenden Patientenakten wurden ermittelt:

♦ Alter und Geschlecht der Probanden

♦ Genotyp des HC-Virus

♦ der Zeitpunkt der Erstdiagnose

♦ der mögliche Infektionszeitpunkt und Infektionsweg

♦ die Histologie der Leber (Einteilung nach Metavir)

♦ Leber- und Milzgröße

♦ die zu den jeweiligen Untersuchungszeitpunkten bestimmten

Blutbilder

♦ PCR-Daten

♦ stattgefundene bzw. angewandte Therapien

Die klinisch relevanten Daten der einzelnen Patienten wurden in einem

Erhebungsbogen (s. Anhang) zusammengestellt.

2.2 Kontrollgruppe

Eine aus 20 gesunden Personen bestehende Kontrollgruppe wurde im Juli

2002 auf ihre Thrombopoietin- und Thrombozyten-Spiegel untersucht.


13

2.3 Blutprobengewinnung

Für diese Studie wurden nur routinemäßig angefallene Patientenblutproben

der internistischen Stationen, die vom Zentrallabor des

Knappschaftskrankenhauses Bochum-Langendreer analysiert worden waren,

genutzt. Zusätzliche Blutentnahmen an den Patienten waren nicht

erforderlich. Die Blutentnahmen wurden durch Mitarbeiter der

entsprechenden Stationen mit Vacutainer® der Firma BD Vacutainer

Systems, Plymouth, UK, vorgenommen.

Die 20 gesunden Probanden stellten sich freiwillig zur Blutentnahme

(ebenfalls mittels Vacutainer-System) im Rahmen dieser Studie zur

Verfügung.

2.3.1 Gewinnung von Blutserum1

Zur Herstellung von Serum wurden 5 ml des durch einen

Gerinnungsaktivator gerinnenden Blutes 10 Minuten bei 3500 Umdrehungen

pro Minute bei Raumtemperatur zentrifugiert (Zentrifuge Rotanta 96 RSC,

Hettich). Das entstandene Serum konnte nun abgesert und bei -80º C

eingefroren werden.

Diese Serumproben wurden zur Bestimmung der Thrombopoietin-

Konzentrationen herangezogen.

2.3.2 Blutbild1

Das Blutbild wurde mit dem Gerät Cell-Dyn 4000 der Firma Abbott, welches

nach dem Widerstandsmessprinzip arbeitet, erstellt.


14

2.3.3 Bestimmung von Glutamat-Pyruvat-Dehydrogenase/-

Transaminase (GPT) [entspricht Alanin-Amino-Transferase (ALT)]

und Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) [entspricht

Aspartat-Amino-Transferase (AST)]1

Die oben genannten Transaminasen wurden mit dem Gerät Roche/Hitachi

917 nach dem Prinzip der Photometrie automatisch bestimmt.

2.3.4 Messung von Albumin1

Der Albuminwert wurde mit dem Analyse-Automaten Roche/Hitachi 912

ermittelt.

Das Messprinzip beruht auf der Turbidimetrie (Trübungsmessung): Albumin-

Antikörper (Tina-quant Albumin, Roche) reagieren mit dem Antigen aus

der Probe unter der Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes. Die

Trübung, die vom Gehalt an suspendierten Ag-AK-Konglomeraten abhängig

ist, wird in einem Turbidimeter gemessen und durch den dekadischen

Logarithmus von einfallender zu durchgelassener Lichtintensität definiert.

2.3.5 Messung des Quickwertes (Thromboplastinzeit)1

Der Quickwert wurde mit dem STA-Gerinnungsanalyzer der Firma Roche

(ehemals Boehringer-Mannheim) automatisch bestimmt.

Testprinzip: Die Probe wird mit STA Hepato Quick-Reagenz versetzt und

das Gemisch bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von Calcium-Ionen wird die

Gerinnungskaskade in Gang gesetzt. Gemessen wird die Zeit von der

Zugabe der CaCl2-Lösung bis zum Auftreten eines Fibringerinnsels.


15

2.4 Bestimmung der HCV-RNA1

HCV-RNA wurde aus den Serumproben des untersuchten Patientenkollektivs

mittels QIAamp Viral RNA mini Kit der Firma Qiagen isoliert. Anschließend

erfolgte die Umschreibung von RNA in DNA sowie die Durchführung des

qualitativen Nachweises von HCV-RNA mit einer hauseigenen RT-PCR,

welche durch regelmäßige Ringversuche des RKI validiert wird.

1 Sämtliche verwendeten Geräte und Analyseautomaten zur Erstellung des Blutbildes und Messung

der verschiedenen oben genannten Laborparameter wurden durch das Personal des Zentrallabors des

Knappschaftskrankenhauses Bochum-Langendreer bedient.


16

2.5 Bestimmung von Thrombopoietin

Zur Messung der Thrombopoietin-Konzentration wurde ein gebrauchsfertiges

ELISA-Kit eingesetzt (Quantikine human Tpo, R&D Systems, Minneapolis,

Minnesota, USA).

In diesem Kit waren folgende Reagenzien und Materialien enthalten:

1) 12 Mikrotiterstreifen mit je 8 Vertiefungen, beschichtet mit einem

spezifischen monoklonalen Antikörper gegen Thrombopoietin

2) 1 Fläschchen TPO-Konjugat, 21 ml, enthält monoklonale Thrombopoietin-

Antikörper, gekoppelt an „horseradish peroxidase“, und ein

Konservierungsmittel

3) 3 Fläschchen TPO Standard-Lyophilisate (2ng/Fläschen), enthalten

Thrombopoietin in proteinhaltigem Puffer und Konservierungsmittel

4) Assay-Diluent RD 1-20: 6 ml eines proteinhaltigen Puffers mit einem

Konservierungsmittel (Enthält ein Präzipitat.)

5) Calibrator Diluent RD5R: 21 ml eines proteinhaltigen Puffers mit

Konservierungsmittel, für Zellkulturüberstände geeignet (Die Substanz

wurde in dieser Studie nicht verwendet.)

6) Calibrator Diluent RD6P: 21 ml eines tierischen Serums mit

Konservierungsmittel, für Serum- und Plasmaproben geeignet

7) 21 ml Waschpuffer-Konzentrat, eine 25-fach konzentrierte gepufferte

Lösung mit Konservierungsmittel

8) 12,5 ml Color reagent A, stabilisiertes Hydrogen-Peroxid

9) 12,5 ml Color reagent B, stabilisiertes Chromogen (Tetramethylbenzidin)

10) Stopp-Lösung, 6 ml Schwefelsäure (2 N)

11) Vier selbstklebende Folien zum Abdecken der Mikrotiterplatte


17

2.5.1 Prinzip des Thrombopoietin-ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) lautet die Bezeichnung für ein

sowohl immunchemisches als auch enzymatisches, sehr sensitives

Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von Substanzen geringer

Konzentration.

Grundlage des Verfahrens ist die Antigen-Antikörper-Reaktion, d.h. die

Bindungsfähigkeit einer zu bestimmenden Substanz (Antigen) an spezifische

Antikörper.

Der hier verwendete Thrombopoietin-ELISA ist ein sog. Sandwich-

Immunoassay zur direkten quantitativen Bestimmung von Thrombopoietin in

humanem Serum, Plasma und in Zellkulturen.

Bei diesem Sandwich-ELISA wurde bereits durch den Hersteller ein für

Thrombopoietin-spezifischer monoklonaler Antikörper auf einer Mikroplatte

(Polystyrol) fixiert. Nach Zugabe von Standard- und Serum-Proben bindet

das vorhandene Thrombopoietin an den immobilisierten Antikörper. Die

ungebundenen Substanzen werden abgewaschen und ein spezifischer

enzymgekoppelter monoklonaler Antiköper wird hinzugegeben, welcher sich

an die gebildeten Immunkomplexe anlagert (sog. Sandwichmethode, s. Abb.

2). Durch den nächsten Waschschritt wird die überschüssige Reagenzlösung

entfernt. Im Anschluss daran werden sämtliche Vertiefungen mit einer

Farblösung beschickt. Dadurch färben sich die Vertiefungen proportional zu

dem im ersten Schritt gebundenen Thrombopoietin.

Danach wird die Reaktion mit der sog. Stopplösung (hier Schwefelsäure)

angehalten und die Farbintensität mit einem Photometer (hier: Labsystems

Multiscan Plus) gemessen und mittels einer Standardreihe in die

entsprechenden Thrombopoietin-Konzentrationen umgerechnet.


18

Antikörper an

die

Mikrotiterplatte

gebunden

Antigen-

haltige Probe

wird dazu

gegeben

Antigen bindet an

feststehenden

Antikörper

Der zweite

Enzym-

gekoppelte

(Horseradish-

Peroxidase) AK

wird zugefügt

Nach Substratzugabe

wird die

Konzentration des

entstandenen

farbigen Produktes

bestimmt

Abbildung 2: Prinzip des Sandwich-ELISA


19

2.5.2 Ablauf des Thrombopoietin-ELISA

Die Beschichtung der für diesen ELISA verwendeten Polystyrol-Platten mit

einem spezifischen monoklonalen Antikörper gegen Thrombopoietin erfolgte

bereits durch den Hersteller.

Im ersten Arbeitsgang wurden die Testreagenzien durch Anpassung an die

Raumtemperatur vorbereitet. Allein die Konjugat-Lösung musste bis zu ihrem

Gebrauch zu einem späteren Zeitpunkt weiterhin bei 2-8°C gelagert werden.

Durch Verdünnung von 20 ml des Wasch-Puffer-Konzentrats mit 480 ml

Aqua dest. entstanden 500 ml Waschpuffer.

Zur Herstellung eines Standards von 2000 pg TPO/ml wurde ein Fläschchen

des gefriergetrockneten TPO-Standard´s in 1 ml Calibrator-Diluent RD6P (für

Serum und Plasma-Proben) gelöst und unter leichtem Schütteln 15 Minuten

vermischt.

Zur Erzeugung der Standard-Verdünnungsreihe wurden jeweils 500 µl der

Calibratorlösung RD6P in sieben Eppendorfgefäße pipettiert. Aus dem zuvor

hergestellten höchsten Standard von 2000 pg TPO/ml wurden 500 µl in das

erste Eppendorfgefäß überführt, dieses gut gemischt und aus diesem

wiederum 500 µl in das nächste gegeben usw., so dass eine

Verdünnungsreihe von 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,2 und 0 pg/ml

(bestehend aus der unverdünnten Calibrator-Lösung RD6P) entstand.

Anschließend wurde jede Vertiefung der Mikrotiterplatte mit 50 µl der Assay

Diluent RD1-20 abgesättigt.

Im nächsten Schritt wurden jeweils 200 µl der Standard- und Serum-Proben

in die Vertiefungen pipettiert.

Dann wurde die Platte für 3 Stunden bei 2-8°C inkubiert.

Das in der Probe vorhandene Thrombopoietin hatte sich während dieser Zeit

an den immobilisierten Antikörper gebunden.

Im Anschluss an die Inkubationszeit wurden die Gruben der Mikrotiterplatte

4 mal für jeweils 30 Sekunden mit 400 µl Waschpuffer gewaschen und nach

dem letzten Waschgang gut ausgeklopft, so dass in den Vertiefungen kein

Waschpuffer mehr zurückbleiben konnte. Durch diesen Vorgang wurden alle

ungebundenen Substanzen entfernt.


20

Die Platten wurden mit 200 µl Thrombopoietin Konjugat, dem für

Thrombopoietin-spezifischen monoklonalen Antikörper, welcher an das

Enzym „horseradish“- Peroxidase gebunden ist, pro Vertiefung versetzt. Es

folgte nochmals eine Inkubationszeit von einer Stunde bei 2-8°C.

Anschließend wurden die Platten erneut 4 mal mit dem Waschpuffer

gewaschen, um jede ungebundene Antikörper-Enzym-Reagenz zu entfernen.

Durch die Mischung der Color Reagenzien A und B, maximal 15 Minuten vor

Gebrauch, entstand eine Farblösung, mit der die Mikrotiterplatte - mit jeweils

200 µl pro Grube - im nächsten Arbeitsgang beschickt wurde. Die Farbe

entwickelte sich direkt proportional zu der Menge des im ersten Schritt

gebundenen Thrombopoietins (Antigen) während der nächsten 30 Minuten

Inkubationszeit im Dunklen bei Raumtemperatur.

Danach wurde die Reaktion mit jeweils 50 µl der Stopplösung

(Schwefelsäure) pro Vertiefung angehalten.

Nun wurde die Farbintensität (optische Dichte) jeder Vertiefung durch

Gebrauch eines Mikroplatten-Lesers (hier: Synelisa, Labsystems Multiscan

Plus) bei 450 nm innerhalb der folgenden 30 Minuten bestimmt.

Die Quantifizierung erfolgte mittels Standardreihen.

Alle Proben wurden in Doppelbestimmung gemessen.

Die Durchführung des ELISAs erfolgte nach Angaben des Herstellers.


21

2.6 Einteilung des Fibrosegrades

Die Bestimmung der entzündlichen Aktivität (Grading) und des

Fibrosegrades (Staging) eines jeden Patienten erfolgte durch eine

Leberbiopsie vor Beginn der Therapie. Die Einteilung in die verschiedenen

Schweregrade nach Metavir wurde durch die Referenz-Pathologie für

Virushepatitis, Prof. H. P. Dienes, Institut für Pathologie der Universität zu

Köln, vorgenommen. Metavir bewertet den Fibrosegrad in einer 5-Punkte-

Skala (F0 = keine Fibrose, F1 = periportal begrenzte Fibrose, F2 = vereinzelt

bindegewebige Septen, F3 = viele bindegewebige Septen, F4 = Leber-

Zirrhose) und den Aktivitätsgrad in einer 4-Punkte-Skala (A0 = keine

Entzündungsaktivität bis zu A3 = starke Aktivität) (Poynard et al., 1997;

Bedossa and Poynard, 1996).

2.7 Bestimmung der Milzgröße

Die Größe der Milz der untersuchten Probanden wurde sonographisch durch

das betreuende Ärzteteam ermittelt. Zur Unterscheidung zwischen normal

großer Milz und Splenomegalie wurde als Grenze ein axialer

Längsdurchmesser größer 12 cm festgelegt.


22

2.8 Statistische Methoden

Die zu Beginn aus den einzelnen Krankenakten erfassten Patientendaten

wurden in einem Erhebungsbogen gesammelt, verschlüsselt und statistisch

ausgewertet.

Die Auswertung der erfassten Daten und der Messergebnisse wurde mit den

Statistikprogrammen SPSS (SPSS für Windows 11.0) und Microsoft Excel

(Excel für Windows 98, Firma Microsoft) durchgeführt.

Die statistische Bearbeitung fand in Zusammenarbeit mit dem Institut für

Medizinische Informatik, Biometrie und Epidemiologie der Ruhr-Universität

Bochum statt.

Angewendet wurden verschiedene biomathematische Methoden:

• Mittelwert (arithmetisches Mittel) x = n

1 ∑

=

n

i

ix

1

= n

xxx n+++ ...21

• Median (Zentralwert) ~

x : wenn n ungerade ⇒ )(2

1+nx =

~

x

wenn n gerade ⇒ 2

)()(2

2

2

++

nnxx

=~

x

n =Anzahl

• Standardabweichung s = ∑=

−−

n

i

ixx

n 1

2)(1

1

• t-Test für zwei verbundene Stichproben bzw. Einstichproben-t-Test:

Der t-Test ist eine auf normalverteilten Grundgesamtheiten basierende

Methode. Mit diesem Test werden Hypothesen über den

Erwartungswert einer Normalverteilung geprüft.

Der Zweistichproben-t-Test für verbundene Stichproben ist

rechnerisch identisch mit dem Einstichproben-t-Test angewandt auf

die Differenzen aus den verbundenen Stichproben.

Mit dem t-Test für verbundene Stichproben wurde geprüft, ob die

Behandlung (IFN+Ribavirin) in Abhängigkeit vom Fibrosegrad die


23

Thrombopoietin-Konzentration bzw. die Thrombozytenzahl während

der Therapie und nach Beendigung der Therapie beeinflusst hat.

Die Null- und Alternativhypothese für die zweiseitige Fragestellung in

der für den t-Test angemessenen Form lautet:

H0: µd = 0

H1: µd ≠ 0 (µd ist der Erwartungswert der Differenzen)

Die Irrtumswahrscheinlichkeit wurde mit α= 0,05 angenommen. Die

Berechnung der Prüfgröße erfolgte nach der folgenden Formel:

ns

dt

d

•=

t = Prüfgröße

d = Mittelwert der Differenz d

sd = Standardabweichung der Differenz d

n = Anzahl der Werte

Getestet wird, ob der Erwartungswert µd mit Null übereinstimmt.

Das Statistikprogramm liefert dazu einen p-Wert. Dieser Wert

quantifiziert die Wahrscheinlichkeit, dass das gefundene Testergebnis

zustande kommt, wenn in Wirklichkeit die Nullhypothese richtig ist.

Wenn p kleiner ist als das festgelegte Signifikanzniveau α, wird die

Alternativhypothese angenommen und das Testergebnis gilt als

signifikant.

• ANOVA-Varianzanalyse:

Die Varianzanalyse ersetzt den t-Test bei mehr als zwei Stichproben.

Auch bei diesem Verfahren werden normalverteilte Daten

vorausgesetzt.

Modell mit Messwiederholung:

In diesem Modell werden alle vorliegenden Messungen und Daten

berücksichtigt. Zudem wird einbezogen, dass es sich um

Messwiederholungen an einzelnen Personen handelt. Innerhalb der

Personen wird eine bestimmte Kovarianzstruktur angenommen,

zwischen den Personen soll Unabhängigkeit herrschen.

3 Ergebnisse

24

3 Ergebnisse

Um den Einfluss der Interferontherapie und des Fibrosegrades auf die

Thrombopoietin - Serumkonzentration und Thrombozytenzahl zu

untersuchen, wurden Blutseren von Patienten mit chronischer Hepatitis C

(n = 45) (Tab. 1) und einer gesunden Kontrollgruppe (n = 20) (Abb. 3-5)

untersucht.

Zur Verlaufsbeurteilung der Thrombopoietin-Konzentration wurden zum

Zeitpunkt vor Therapiebeginn, nach zwei, vier und sechs Monaten unter

Interferon-Ribavirin-Kombinationstherapie und nach Abschluss der Therapie

Bestimmungen vorgenommen.

Tabelle 1: Patienten-Charakteristika (Mittelwerte ±±±± Standardabweichung; [Median])

Alle Keine bis milde

Fibrose

(Fibrosegrad 0)

Mäßige Fibrose

(Fibrosegr. 1/2)

Ausgeprägte

Fibrose

(Fibrosegr. 3/4)

Anzahl (m/f) 45 (32/13) 9 (5/4) 18 (12/6) 18 (15/3)

Alter (Jahren) 43,3± 12,4 [44] 36,8± 13,2 [32] 41,1± 13,2 [40] 48,8 ± 9,1 [49]

Albumin (g/dl) 44,4 ± 5,4

[46,5]

47,5 ± 2,6

[47,9]

44,3 ± 5,9

[46,4]

43,2 ± 5,6

[45,5]

GOT (U/l) 32 ± 21,6 [26] 21 ± 11,2 [18] 28 ± 17,0 [24] 42 ± 25,4 [37]

GPT (U/l) 64 ± 43,6 [48] 55 ± 40,5 [38] 66 ± 48,4 [46] 67 ± 41,9 [54]

Quick (%) 92 ± 0,12 [97] 94 ± 0.06 [93] 98 ± 0,03 [99] 88 ± 0,15 [91]

Leukozyten

(10e3/µl)

6,6 ± 2,35 [6,2] 6,1 ± 2,08 [5,5] 7,0 ± 2,69 [7,2] 6,5 ± 2,17 [5,9]

Thrombozyten

(10e3/µl)

186,8 ± 66,3

[188,5]

212,7 ± 65,7

[192,5]

209,1 ± 58,4

[216,5]

149,4 ± 62,4

[120]

Hämoglobin

(g/dl)

15,0 ± 1,33

[15,1]

14,5 ± 1,23

[14,8]

15,0 ± 1,41

[14,9]

15,2 ± 1,3

[15,2]

Vergrößerung

von Leber und

Milz

11/45 0/9 3/18 8/18

Genotyp

(1/2/3/4)

31/3/10/1 7/0/1/1 11/0/7/0 13/3/2/0

3 Ergebnisse

25

3.1 Thrombopoietin-Konzentration und Thrombozytenzahl der

gesunden Probanden

TPO-Konzentrationen der gesunden Probanden

0

20

40

60

80

100

120

140

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Anzahl der Probanden (1-20)

TP

O-S

eru

mw

ert

e (

pg

/ml)

TPO-Serumwert

Abbildung 3: Thrombopoietin-Konzentrationen der 20 gesunden Probanden, gemessen mit dem ELISA Quantikine® human Tpo, R&D Systems (Absolutwerte dargestellt).

Die Thrombopoietin-Konzentrationen der gesunden Probanden lagen alle

unter 120 pg/ml. Der Median betrug 47 pg/ml und der Mittelwert

51,55 ± 31,78 pg/ml. Aus den Abbildungen ist ersichtlich, dass die

Thrombopoietinwerte der gesunden Probanden mit einem Range von

3-118 pg/ml stark differierten.

3 Ergebnisse

26

Abbildung 4: Thrombopoietin-Konzentrationen der 20 gesunden Probanden, dargestellt als Box-and-Whiskers-Plot.

Die Thrombozytenzahl lag bei allen Probanden im Normalbereich

(150-400.000/µl). Der Mittelwert betrug 270.000 ± 87,98 /µl und der Median

lautete 256.000 Thrombozyten/µl.

Abbildung 5: Thrombozytenzahlen der 20 gesunden Probanden, dargestellt als Box-and-Whiskers-Plot.

20 N =

Thrombopoietinkonzentrationen

der gesunden Probanden

gesunde Probanden

140

120

100

80

60

40

20

0

20 N =

Thrombozytenzahlen

der gesunden Probanden

gesunde Probanden (n=20)

500

400

300

200

100

Thrombozyten (10e3/µl)

Thrombo-poietin (pg/ml)

3 Ergebnisse

27

3.2 Ausgangssituation: Thrombopoietin-Serumkonzentration und

Thrombozytenzahl vor Therapiebeginn unter Beachtung des

Einflusses des Fibrosegrades

In der Analyse der Anfangsdaten zeigte sich ein signifikanter Unterschied der

Thrombozytenzahl in Abhängigkeit vom Fibrosegrad (p=0,0109), wobei nur

die Thrombozytenzahl der Patienten mit fortgeschrittener Leberfibrose

niedriger waren als die Normalwerte (Median von 120.000/µl, Normalwert:

150.000-400.000 Thrombozyten/µl) (Abb. 6). Aus den Berechnungen ergab

sich: Je höher der Fibrosegrad, desto niedriger die Thrombozytenzahl (TZ).

Die Thrombopoietin-Spiegel (TPO) lagen vor Therapiebeginn bei den

Patienten mit geringer Fibrose (Grad 0) bei 140 pg/ml (Median), bei den

Patienten mit mäßiger Fibrose bei 74,5 pg/ml (Median) und bei den Patienten

mit weit fortgeschrittener Fibrose bei 44,5 pg/ml (Median) (Abb. 6). Je stärker

der Grad der Leberfibrose ausgeprägt war, desto weniger TPO konnte im

Serum nachgewiesen werden.

Diese Unterschiede zwischen den Thrombopoietin-Ausgangswerten der

verschiedenen Fibrosegrade erreichten jedoch keine statistische Signifikanz

(p=0,1673). Sämtliche TPO-Werte lagen im Normalbereich (unter 200 pg/ml).

Thrombozyten und Thrombopoietin vor Therapiebeginn

0

50

100

150

200

250

Grad 0 Grad 1+2 Grad 3+4

Fibrosegrade (nach Metavir)

Th

rom

bo

zy

ten

(1

0e

3/µ

l) /

TP

O (

pg

/ml)

TZ

TPO

Abbildung 6: Thrombozytenzahl und TPO-Konzentration der 45 Patienten mit chronischer Hepatitis C zum Zeitpunkt vor Beginn der Therapie (Darstellung der Mediane).

3 Ergebnisse

28

3.3 Kinetik der Thrombopoietin-Spiegel und der Thrombozytenzahl

während und nach der Therapie

Nach zwei Monaten Therapie mit Interferon und Ribavirin blieben die Spiegel

der Thrombozyten normal bei den Patienten mit keiner bis mäßiger Fibrose,

allerdings sanken sie bei den Patienten mit fortgeschrittener Fibrose weiter

ab (Median von 93.000/µl) (Abb. 7).

Nach zwei Monaten Therapiedauer lagen die Thrombopoietinspiegel bei den

Patienten mit milder Fibrose bei 50 pg/ml (Median), bei den Patienten mit

mäßiger Fibrose betrugen die TPO-Werte im Median 77,5 pg/ml und bei den

Patienten mit ausgeprägter Fibrose im Median 91,5 pg/ml (Abb. 7).

Thrombopoietin und Thrombozyten verhielten sich demnach gegensätzlich:

Während die Thrombozytenzahl mit zunehmender Fibroseschwere absank,

stieg die TPO-Konzentration mit zunehmender Fibroseschwere an.

Thrombozyten und Thrombopoietin nach zwei Monaten

Therapie

0

50

100

150

200

250



Th

rom

bo

zy

ten

(1

0e

3/µ

l)

/ T

PO

(p

g/m

l)

TZ

TPO

Abbildung 7: Thrombozytenzahl und TPO-Konzentration der 45 Patienten mit chronischer Hepatitis C nach zwei Monaten Kombinationstherapie (Darstellung der Mediane).

3 Ergebnisse

29

Auch nach weiteren zwei und vier Monaten Therapiedauer und nach

Beendigung der Therapie blieb die Thrombozytenzahl bei den Patienten mit

keiner bis mäßiger Fibrose normal (Median von ~200.000/µl); die

Thrombozytenzahl bei den Patienten mit fortgeschrittener Fibrose blieb

konstant zu niedrig (Median von ~100.000/µl) (Abb. 8-10).

Vier und sechs Monate nach Therapiebeginn blieben die medianen TPO-

Spiegel bei allen drei Fibrosegraden ungefähr gleich zwischen 85 bis

100 pg/ml (Abb. 8, 9).

Nach Beendigung der antiviralen Therapie betrug die

Thrombopoietinkonzentration der Patienten mit milder Fibrose (Grad 0 nach

Metavir) 48 pg/ml, der Patienten mit mäßig ausgeprägter Fibrose 97 pg/ml

und derjenigen mit schwerer Fibrose 150 pg/ml im Median (Abb.10). Hier

zeigte sich ebenfalls: Je schwerer die Leberschädigung fortgeschritten war,

desto höher war auch der Thrombopoietinspiegel.

Thrombozyten und Thrombopoietin nach vier Monaten

Therapie

0

50

100

150

200



Th

rom

bo

zy

ten

(1

0e

3/µ

l) /

TP

O (

pg

/ml)

TZ

TPO

Abbildung 8: Thrombozytenzahl und TPO-Konzentration der 45 Patienten mit chronischer Hepatitis C nach vier Monaten Kombinationstherapie (Darstellung der Mediane).

3 Ergebnisse

30

Thrombozyten und Thrombopoietin nach sechs

Monaten Therapie

0

50

100

150

200

250



Th

rom

bo

zy

ten

(1

0e

3/µ

l)

/ T

PO

(p

g/m

l)

TZ

TPO

Abbildung 9: Thrombozytenzahl und TPO-Konzentration der 45 Patienten mit chronischer Hepatitis C nach sechs Monaten Kombinationstherapie (Darstellung der Mediane).

Thrombozyten und Thrombopoietin nach der Therapie

(zwei- max. sechs Monate nach Therapieende)

0

50

100

150

200

250



Th

rom

bo

zy

ten

(1

0e

3/µ

l)

/ T

PO

(p

g/m

l)

TZ

TPO

Abbildung 10: Thrombozytenzahl und TPO-Konzentration der 45 Patienten mit chronischer Hepatitis C nach der Kombinationstherapie (Darstellung der Mediane) (Nachbeobachtungszeitraum: zwei bis max. sechs Monate nach Therapiebeendigung).

3 Ergebnisse

31

3.4 Kinetik der Thrombopoietinkonzentration und Thrombozytenzahl

in Abhängigkeit vom Fibrosegrad

Bei Patienten mit nicht vorhandener bis sehr leichter Fibrose (Grad 0 nach

Metavir) (Abb. 11) blieb die Thrombozytenzahl über die Zeit konstant

(Median: 175-210.000/µl; Mittelwert: 190-215.000 ± 60.000/µl).

Die Thrombopoietinkonzentration lag ohne Therapie im hoch-normalen

Bereich (Median: 140 pg/ml), fiel im zweiten Monat nach Therapiebeginn auf

50 pg/ml (Median) ab, stieg im vierten und im sechsten Monat auf ~ 85 pg/ml

(Median) und sank anschließend wieder auf 50 pg/ml (Median).

Thrombozyten und Thrombopoietin bei Patienten ohne

Fibrose (Fibrosegrad 0 nach Metavir)

0

50

100

150

200

250

vorTherapie

2 Mon.Ther.

4 Mon.Ther.

6 Mon.Ther.

nachTherapie

Therapiezeitraum (Monate)

Th

rom

bo

zyte

n (

10e3/µ

l) /

TP

O (

pg

/ml)

TZ

TPO

Abbildung 11: Darstellung der Thrombozytenzahl und Thrombopoietinkonzentration (Mediane) vor, während und nach der antiviralen Kombinationstherapie bei Patienten mit chronischer Hepatitis C und ohne bzw. mit sehr leichter Fibrose (Fibrosegrad 0 nach Metavir).

3 Ergebnisse

32

Die Patienten mit chronischer Hepatitis C und mittelschwerer Fibrose (Grad

1+2 nach Metavir) (Abb. 12) zeigten während und nach der

Kombinationstherapie stabile Thrombozytenzahlen zwischen 190.000 und

220.000 Thrombozyten/µl im Median, lediglich nach vier Monaten Therapie

ergab sich eine geringere Thrombozytenzahl von 170.000/µl im Median.

Die Thrombopoietin-Spiegel verhielten sich tendenziell leicht ansteigend: Sie

nahmen von 75 pg/ml (Median) vor Therapiebeginn auf 100 pg/ml (Median)

nach Therapieabschluss zu.

Thrombozyten und Thrombopoietin bei Patienten mit

mäßiger Fibrose (Fibrosegrade 1+2 nach Metavir)

0

50

100

150

200

250

vorTherapie

2 Mon.Ther.

4 Mon.Ther.

6 Mon.Ther.

nachTherapie


Tro

mb

ozyte

n (

10e3/µ

l) /

TP

O (

pg

/ml)

TZ

TPO

Abbildung 12: Darstellung der Thrombozytenzahl und Thrombopoietinkonzentration (Mediane) vor, während und nach der antiviralen Kombinationstherapie bei Patienten mit chronischer Hepatitis C und mittelschwerer Fibrose (Fibrosegrad 1+2 nach Metavir).

3 Ergebnisse

33

Die Patienten mit chronischer Hepatitis C und stark ausgeprägter

Leberfibrose (Grad 3+4 nach Metavir) (Abb. 13) wiesen eine ohnehin sehr

niedrige Thrombozytenzahl auf, sie schwankte zwischen 90.000 und 110.000

Thrombozyten/µl. Lediglich vor der Interferon-Ribavirin-Therapie und danach

kam es zu einer leichten Erholung der Thrombozytenzahl auf Werte von

120.000/µl und 150.000/µl.

Thrombopoietin startete in dieser Patientengruppe mit einem niedrig-

normalen Spiegel von 40 pg/ml, erreichte während der Therapie einen

Spiegel um 100 pg/ml, um dann nach der Therapie auf einen Spiegel von

150 pg/ml anzusteigen. (Hier sind jeweils die Mediane angegeben.)

Thrombozyten und Thrombopoietin bei Patienten mit

ausgeprägter Fibrose (Fibrosegrade 3+4 nach Metavir)

020406080

100120140160

vorTherapie

2 Mon.Ther.

4 Mon.Ther.

6 Mon.Ther.

nachTherapie


Th

rom

bo

zyte

n (

10e3/µ

l) /

TP

O (

pg

/ml)

TZ

TPO

Abbildung 13: Darstellung der Thrombozytenzahl und Thrombopoietinkonzentration (Mediane) vor, während und nach der antiviralen Kombinationstherapie bei Patienten mit chronischer Hepatitis C und ausgeprägter Fibrose (Fibrosegrad 3+4 nach Metavir).

3 Ergebnisse

34

3.5 Varianzanalyse: Modell mit Messwiederholung

3.5.1 Thrombopoietinkonzentration

Bei Betrachtung der Thrombopoietinkonzentration nach dem Modell mit

Messwiederholung (in der Varianzanalyse ANOVA) ergab sich zwischen den

einzelnen Messzeitpunkten (vor der Therapie, zwei, vier, sechs, acht, zwölf,

sechzehn und dreiundzwanzig Monate nach Therapiebeginn) kein Hinweis

auf einen signifikanten Unterschied (p=0,2496).

Der Fibrosegrad übte einen signifikanten Einfluss auf die

Thrombopoietinkonzentration aus (p=0,0265). Dieser Effekt war allerdings

nur im Vergleich von Fibrosegrad 1 mit Fibrosegrad 0 signifikant (p=0,0395)

und könnte aufgrund der geringen Stichprobenzahl zufällig entstanden sein,

da bei den anderen Fibrosegraden kein signifikanter Unterschied (p > 0,05)

festgestellt wurde.

Des Weiteren gibt es keinen Hinweis auf eine Wechselwirkung zwischen

Fibrosegrad und Zeit auf die Thrombopoietinkonzentration (p=0,7274).

3.5.2 Thrombozytenzahl

Es zeigte sich ein statistisch signifikanter Einfluss sowohl der Zeit (p=0,0101)

als auch des Fibrosegrades (p=0,0001) auf die Thrombozytenzahl.

Von Fibrosegrad Null bis hin zum Fibrosegrad Vier zeigte sich eine statistisch

signifikante Reduktion der Thrombozytenzahl von 189.000/µl (Mittel: 210.000

± 62.470/µl) auf 112.000/µl (Mittel: 122.000 ± 49.190/µl) im Median.

Die Thrombozytenzahl reagierte in Abhängigkeit von der Therapiezeit mit

einem wellenförmigen Verlauf: Zunächst fiel sie während der Therapie stark

ab (von 200.000/µl auf 170.000/µl), nach Beendigung der Therapie (d.h.

spätestens 12 Monate nach Therapiebeginn) stieg sie wieder auf einen

Median von 191.000/µl an.

Auch bei der Thrombozytenzahl ergab sich ebenso wie bei dem

Thrombopoietinspiegel kein Hinweis auf einen signifikanten

Wechselwirkungseffekt (p=0,4860) zwischen Messzeitpunkt und Fibrosegrad

auf die Thrombozytenzahl, daraus folgte, dass der Fibrosegrad den zeitlichen

Verlauf nicht beeinflusst hat.

3 Ergebnisse

35

3.6 Einstichproben-t-Test angewandt auf die Differenzen der

verbundenen Stichproben

3.6.1 Auswertung der Ergebnisse der Thrombopoietin-

Serumkonzentration in Abhängigkeit vom Fibrosegrad und von

der Zeit

Die Berechnungen für die Thrombopoietinkonzentration, gemessen mit Hilfe

eines ELISAs zu den Zeitpunkten zwei, vier und sechs Monate nach

Therapiebeginn sowie nach Therapieabschluss, ergaben weder in der

Patientengruppe mit leichter Fibrose (Grad 0 nach Metavir) noch in der mit

mäßiger Fibrose (Grad 1+2) signifikante Veränderungen während dieser Zeit

(Fibrosegrad 0: p2Mon=0,637, n=3, p4Mon=0,979, n=6, p6Mon=0,778, n=5 bzw.

bei Fibrosegrad 1+2: p2Mon=0,215, n=11, p4Mon=0,253, n=11, p6Mon=0,165, n=

12, pnachTher.=0,281, n=5).

Daraus folgte, dass sich die Thrombopoietinkonzentration in diesen

einzelnen Gruppen über die Therapiedauer nicht veränderte.

In der Patientengruppe mit stark ausgeprägter Fibrose (Grad 3+4) konnte

eine signifikant erhöhte TPO-Konzentration für die Zeitpunkte zwei Monate

nach Therapiebeginn (p2Mon=0,006, n=13), sechs Monate nach

Therapiebeginn (p6Mon=0,045, n=8) und acht Monate nach Therapiebeginn

(pnachTher.=0,016, n=5) im Vergleich zum Zeitpunkt vor der Therapie

festgestellt werden.

3.6.2 Auswertung der Ergebnisse der Thrombozytenzahl in

Abhängigkeit vom Fibrosegrad und von der Zeit

Die statistische Auswertung bei den Patienten mit leichter Leberschädigung

(Fibrosegrad 0 nach Metavir) ergab zu allen untersuchten Zeitpunkten keine

signifikante Veränderung der Thrombozytenkonzentration (p2Mon.=0,409, n=6,

p4Mon.=0,116, n=9, p6Mon.=0,784, n=8, p8Mon.=0,094, n=6, p12Mon.=0,499, n=5).

Im Gegensatz dazu, zeigten sich bei den von Leberfibrose stärker

betroffenen Patientengruppen (Fibrosegrade 1-4 nach Metavir) bis

einschließlich sechs Monate nach Therapiebeginn signifikante

3 Ergebnisse

36

Veränderungen der Thrombozytenkonzentration über die Zeit (Fibrosegrad

1+2: p2Mon.=0,016, n= 17, p4Mon.=0,000, n=17, p6Mon.=0,002, n=16;

Fibrosegrad 3+4: p2Mon.=0,001, n=15, p4Mon.=0,000, n= 16, p6Mon.=0,011, n=

17).

Danach konnte keine signifikante Veränderung mehr verzeichnet werden,

weder bei den Zeitpunkten acht Monate nach Therapiebeginn (Grad 1+2:

p8Mon= 0,091, n=11; Grad 3+4: p8Mon=0,158, n=10) noch zwölf Monate nach

Therapiebeginn (Grad 1+2: p12Mon=0,186, n=5; Grad 3+4: p12Mon=0,712, n=3).

Der Zeitpunkt zwölf Monate nach Therapiebeginn war aufgrund des geringen

Stichprobenumfangs nicht mehr als präzise anzusehen.

Spätestens nach zwölf Monaten gab es keine statistisch signifikante

Veränderung mehr.

3 Ergebnisse

37

3.7 Auswirkung der Interferon-Therapie auf weitere Parameter des

Blutbildes

3.7.1 Kinetik der Leukozyten

Leukozytenspiegel in Abhängigkeit von der

Schwere der Leberfibrose

0

1

2

3

4

5

6

7

8

vor Therapie 2 Monate 4 Monate 6 Monate nach Therapie


Leu

ko

zyte

n (

10e3/µ

l)

Fibrosegrad 0

Fibrosegrad 1+2

Fibrosegrad 3+4

Abbildung 14: Leukozytenwerte der Patienten mit chronischer Hepatitis C während des Beobachtungszeitraumes (vor, während und nach Interferon-Ribavirin-Therapie) in Abhängigkeit von dem bestehenden Fibrosegrad (Darstellung der Mediane).

Die Mediane der Leukozytenspiegel zum Zeitpunkt vor der Therapie zeigten

bei allen Fibrosegraden normale Werte (Median: 6.200/µl, Mittelwert: 6.600 ±

2350/µl). Nach zwei und vier Monaten Therapie fielen alle Leukozytenspiegel

unter die Normalwerte unabhängig vom Fibrosegrad (Median gesamt: 4.000/µl,

Mittelwert: 4100 ± 1600/µl). Der stärkste Rückgang der Leukozytenzahlen

fand allerdings bei den Patienten mit Fibrosegrad 3+4 statt (Median2Monate:

3200/µl, Median4Monate: 3350/µl). Nach sechs Monaten Therapie kam es

wieder zu einem leichten Anstieg der Leukozytenwerte (Mediangesamt:

4200/µl, Mittelwertgesamt:4400 ± 1900/µl). Nach Beendigung der Interferon-

Ribavirin-Kombinationstherapie (Nachbeobachtungszeitraum: zwei bis

maximal sechs Monate nach Therapieende) hatten sich die

Leukozytenzahlen der Patienten mit Fibrosegrad 3+4 (Median: 5200/µl) und

1+2 (Median: 6500/µl) wieder vollständig erholt, während die

Leukozytenwerte der Patienten mit geringer bis nicht vorhandener Fibrose

3 Ergebnisse

38

(Grad 0) weiterhin geringfügig unterhalb des Normalspiegels lagen (Median:

4500/µl) (Abb. 14).

3 Ergebnisse

39

3.7.2 Kinetik des Hämoglobin-Wertes

Hämoglobin in Abhängigkeit von der


0

2

4

6

8

10

12

14

16



Häm

og

lob

in (

g/d

l)

Fibrosegrad 0

Fibrosegrad 1+2

Fibrosegrad 3+4

Abbildung 15: Hämoglobinwerte der Patienten mit chronischer Hepatitis C während des Beobachtungszeitraumes (vor, während und nach Interferon-Ribavirin-Therapie) in Abhängigkeit von dem bestehenden Fibrosegrad (Darstellung der Mediane).

Die Mediane der Hämoglobinwerte waren vor Therapiebeginn unabhängig

vom Schweregrad der Leberschädigung normal (Mediangesamt: 15,1g/dl).

Nach zwei Monaten Kombinations-Therapie war eine Abnahme der

Hämoglobinwerte zu verzeichnen. Die stärkste Verminderung betraf den

Fibrosegrad 0 mit Werten geringfügig unter dem Normalbereich (Median:

11,7g/dl; Mittelwert: 11,8 ± 0,96 g/dl). Dieser Trend blieb während der

restlichen Therapiedauer bestehen. Erst nach Therapieabschluss erholten

sich die Hämoglobinwerte aller Patienten unabhängig vom Grad der

Leberschädigung. Dabei erreichten die Hämoglobinwerte der

Patientengruppe mit schwerer Fibrose (Grad 3+4) ihre Ausgangswerte

vollständig (Medianvorher: 15,1g/dl, Mediandanach: 15,1g/dl; Mittelwertvorher:

15,2 ± 1,3 g/dl, Mittelwertdanach: 14,9 ± 1,6 g/dl). Die Hämoglobin-Werte der

Patientengruppe mit milder Fibrose (Grad 0) blieben stark (Medianvorher:

14,8g/dl, Median danach:12,5g/dl) und die Hb-Werte der Patienten mit

mittelschwerer Fibrose (Grad 1+2) mäßig (Medianvorher: 14,95 g/dl, Median

danach: 13,8 g/dl) unter ihren Ausgangswerten (Abb. 15).

3 Ergebnisse

40

3.7.3 Kinetik von GOT und GPT

GPT in Abhängigkeit von der Schwere der Leberfibrose

0

10

20

30

40

50

60



GP

T (

U/l)

Fibrosegrad 0

Fibrosegrad 1+2

Fibrosegrad 3+4

Abbildung 16: Transaminasen (hier beispielhaft dargestellt für GPT) der Patienten mit chronischer Hepatitis C während des Beobachtungszeitraums (vor, während und nach Interferon-Ribavirin-Therapie) in Abhängigkeit von dem bestehenden Fibrosegrad (Darstellung der Mediane).

Die Höhe der Transaminasen-Ausgangswerte (Abb. 16) differierte in

Abhängigkeit von dem Schweregrad der Fibrose: Die am stärksten erhöhten

Transaminasen wiesen die Patienten mit stark ausgeprägter Fibrose

(Fibrosegrad 3+4) (Median: GOT 37 U/l, GPT 54 U/l) auf; mäßig erhöhte

Werte (Median: GOT 23,5 U/l, GPT 46 U/l) zeigten die Patienten mit

mittelgradigem Leberschaden (Fibrosegrad 1+2) und gering erhöhte

Transaminasen (Median: GOT 18 U/l; GPT 38 U/l) kennzeichneten die

Patienten ohne Fibrose bzw. mit nur milder Fibroseausprägung

(Fibrosegrad 0). Dieser Trend blieb über den gesamten

Beobachtungszeitraum erhalten. Allerdings nahmen die Absolut-Werte

therapiebedingt während des Beobachtungszeitraumes stark ab, so dass

nach Therapieabschluss (maximal 3 Monate nach Therapiebeendigung) die

Transaminasen aller Fibrosegrade im Normalbereich lagen

(Mediannach Therapie: GOT: Grad 0: 8,5 U/l, Grad 1+2: 11 U/l Grad 3+4: 15 U/l;

GPT: Grad 0: 7,5 U/l, Grad 1+2: 15 U/l; Grad 3+4: 30 U/l) (Abb. 16).

3 Ergebnisse

41

Responder GPT-Mediane

0

10

20

30

40

50

60

70


Fibrosegrade

U/lvor Therapie

nach Therapie

Abbildung 17: Therapie-Responder (55% des Patientenkollektivs) und die Höhe ihrer Transaminasen (hier beispielhaft dargestellt für GPT) vor und nach der Therapie in Abhängigkeit von ihrem Fibrosegrad (Darstellung der Mediane).

Die Patienten mit chronischer Hepatitis C, die auf die antivirale Interferon-

Ribavirin-Kombinationstherapie angesprochen hatten (Responder, 55% der

untersuchten Patienten) (Abb. 17), reagierten, unabhängig von ihrem

Fibrosegrad, mit einem Rückgang der Transaminasen in den Normalbereich.

3 Ergebnisse

42

Non-Responder GPT-Mediane

0

10

20

30

40

50

60

70

80


Fibrosegrade

U/lvor Therapie

nach Therapie

Abbildung 18: Therapie-Non-Responder (45% des Patientenkollektivs) und die Höhe ihrer Transaminasen (hier beispielhaft dargestellt für GPT) vor und nach der Therapie in Abhängigkeit von ihrem Fibrosegrad (Darstellung der Mediane).

Die Patienten mit chronischer Hepatitis C, die auf die antivirale Interferon-

Ribavirin-Kombinationstherapie nicht ansprachen (Non-Responder, 45 % der

untersuchten Patienten) (Abb. 18), zeigten ein unterschiedliches Verhalten

ihrer Transaminasenspiegel in Abhängigkeit von der Schwere ihres

Leberschadens. Patienten ohne/mit milder Fibrose (Fibrosegrad 0) wiesen

nach Beendigung der antiviralen Therapie einen Rückgang in der Höhe ihrer

Transaminasen-Konzentration auf. Die Patienten mit chronischer Hepatitis C

und einem höhergradigen Leberschaden zeigten eine höhere

Transaminasen-Konzentration als vor dem Therapiebeginn (Fibrosegrad

1+2: 1,2-fach höhere Transaminasen, Fibrosegrad 3+4: 1,4-fach höhere

Transaminasen).

3 Ergebnisse

43

3.7.4 Kinetik von Albumin

Albumin in Abhängigkeit von der


38

40

42

4446

48

50

52

vorTherapie

2 Monate 4 Monate 6 Monate

Albumin (g/l)

Ze

it (

Mo

na

te)

Fibrosegrad 0

Fibrosegrad 1+2

Fibrosegrad 3+4

Abbildung 19: Albuminwerte der Patienten mit chronischer Hepatitis C während des Beobachtungszeitraumes (vor, während und nach Interferon-Ribavirin-Therapie) in Abhängigkeit von dem bestehenden Fibrosegrad (Darstellung der Mediane).

Die Albuminwerte lagen zu allen Zeitpunkten und bei allen Fibrosestadien im

Normalbereich (35-52 g/l) (Abb. 19). Zum Zeitpunkt vor Therapiebeginn

bestand eine deutliche Staffelung der Albuminwerte, abnehmend von

Fibrosegrad 0 (Median von 47,8 g/l) bis zum Fibrosegrad 3+4 (schwerste

Leberfibrose) (Median: 45,5 g/l). Nach zwei Monaten Therapie mit Interferon

und Ribavirin war die Albuminkonzentration insgesamt zurückgegangen, sie

befand sich noch im Normalbereich, war aber nicht mehr eindeutig nach dem

Fibrosegrad gestaffelt. Nach vier Monaten Therapie war der Albuminwert der

Patienten mit leichter Fibrose stark angestiegen (Median: 50,6 g/l), während

die Albuminkonzentration der Patienten mit mäßiger (Grad 1+2) (Median:

44,8 g/l) und schwerer Fibrose (Grad 3+4) (Median: 44,4 g/l) annähernd

konstant blieb. Nach sechs Monaten war der Albuminwert der Fibrosegrade

1+2 (Median: 42,4 g/l) und des Grades 0 (Median: 47,3 g/l) noch etwas

gesunken, während die Konzentration der Grade 3+4 stabil blieb (Median:

43,9 g/l).

3 Ergebnisse

44

3.7.5 Kinetik des Quickwertes

Quickwert in Abhängigkeit von der


0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%


Therapiezeit (Monate)

Qu

ickw

ert

(%

)

Fibrosegrad 0

Fibrosegrad 1+2

Fibrosegrad 3+4

Abbildung 20: Quickwerte der Patienten mit chronischer Hepatitis C während des Beobachtungszeitraumes (vor, während und nach der Interferon-Ribavirin-Therapie) in Abhängigkeit von dem bestehenden Fibrosegrad (Darstellung der Mediane).

Die Mediane der Quickwerte aller Fibrosegrade blieben während des

gesamten Therapiezeitraums relativ konstant im Normalbereich (Abb. 20).

Alle starteten bei Werten um 90%-95%. Die Quickwerte der Patienten mit

den Fibrosegraden 0 und 3+4 sanken während der Therapie auf einen

Median-Quickwert von ca. 75%. Die Patienten mit chronischer Hepatitis C

und dem Fibrosegrad 1+2 wiesen (im Median) einen gleichbleibend hohen

Quick-Wert auf. Nach Beendigung der Interferon-Ribavirin-

Kombinationstherapie stiegen die Quickwerte sämtlicher Fibrosegrade

wieder an und erreichten ihre Ausgangswerte.

3 Ergebnisse

45

3.7.6 Einfluss der Milzgröße

Anteil der Splenomegalie in den verschiedenen Fibroseschweregraden

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Fibrosegrad 0 Fibrosegrad 1+2 Fibrosegrad 3+4


An

zah

l d

er

betr

off

en

en

Pati

en

ten

Splenomegalie

normale Milzgröße

Abbildung 21: Größe der Milz der 45 Patienten mit chronischer Hepatitis C in Abhängigkeit von dem bestehenden Fibrosegrad.

Auf dieser Graphik (Abb. 21) zeigt sich ein Zusammenhang zwischen dem

Schweregrad der Fibrose und der Milzgröße. Bei den Patienten mit

chronischer Hepatitis C und ohne Fibrose (Fibrosegrad 0) wies kein Patient

eine Vergrößerung der Milz auf. Bei den Patienten mit mäßiger Fibrose

(Fibrosegrad 1+2) wurde ein Anteil von 17 % mit vergrößerter Milz

festgestellt, und bei den Patienten mit stark ausgeprägter Fibrose

(Fibrosegrad 3+4) hatten 42 % eine Splenomegalie.

3 Ergebnisse

46

Thrombozyten-Verteilung (Mediane) in Abhängigkeit von

vorliegender Splenomegalie

0

50

100

150

200

250

Fibrosegrad 1+2 Fibrosegrad 3+4 gesamt

Fibrosegrade (1-4 nach Metavir)

Th

rom

bo

zyte

n (

10e3/µ

l) (

Med

ian

e)

Patienten mit Splenomegalie

Patienten mit normaler Milzgröße

Abbildung 22: Verteilung der Thrombozytenzahl (Mediane) der Patienten mit mäßiger und schwerer Fibrose in Abhängigkeit von der Milzgröße (Patienten ohne Fibrose wurden hier nicht aufgeführt, weil sie keine Splenomegalie aufwiesen).

Der Einfluss der Milzgröße auf die Höhe der Thrombozytenzahl stellt sich in

Abbildung 22 dar: Bei vergrößerter Milz war die Thrombozytenzahl im

Vergleich zu Patienten mit chronischer Hepatitis C und normaler Milzgröße

stark erniedrigt. Milzgröße und Thrombozytenzahl verhielten sich umgekehrt

proportional zueinander. In dieser Studie wurde festgestellt, dass bei

Patienten ohne Milzvergrößerung der Grad der Leberschädigung die Höhe

der Thrombozytenzahl beeinflusst.

4 Diskussion

47

4 Diskussion

Nach Angaben der WHO sind ca. 170 Millionen Menschen (3% der

Weltbevölkerung) mit dem Hepatitis-C-Virus infiziert und laufen damit

potentiell Gefahr, an einer Leberzirrhose und/oder einem Leberzellkarzinom

zu erkranken.

Da davon ausgegangen werden muss, dass eine große Zahl infizierter

Personen bisher nicht untersucht wurde, jedoch im Laufe der nächsten 10

Jahre mehr Infektionen durch verbesserte Screening-Strategien

diagnostiziert werden, muss mit einer deutlichen Zunahme der Zahl

chronisch HCV-infizierter Patienten bis 2015 gerechnet werden.

Eine typische Komplikation der fortschreitenden Leberfibrose stellt die

Thrombozytopenie dar. Interferon alpha, in der Therapie der chronischen

Hepatitis C etabliert, kann eine Thrombozytopenie auslösen oder verstärken

und somit therapielimitierend sein. Ursächlich werden hierbei ein vermehrter

Abbau und eine verminderte Synthese von Thrombozyten diskutiert.

Thrombopoietin (TPO), der 1994 identifizierte Thrombozyten-

wachstumsfaktor, nimmt eine zentrale Stellung im Gleichgewicht des

Thrombozytenhaushaltes ein (De Sauvage et al., 1994; Lok et al., 1994;

Bartley et al., 1994; Sohma et al., 1994; Kuter et al., 1994).

In der vorliegenden Arbeit wurden die Zusammenhänge zwischen

Fibrosegrad und TPO-Serumkonzentration, sowie der Einfluss der antiviralen

Therapie mit Interferon und Ribavirin untersucht.

4 Diskussion

48

4.1 Fibrosegrad, Thrombozytenzahl und Thrombopoietin

Bei den Patienten mit chronischer Hepatitis C, jedoch ohne Leberfibrose

(Fibrosestadium 0 nach Metavir), wurden vor Beginn der Therapie normale

Thrombozytenzahlen gemessen (Referenzbereich: 150-400.000

Thrombozyten/µl).

Patienten mit einer mäßig ausgeprägten Leberfibrose (Fibrosegrad 1+2)

wiesen ebenfalls eine normale Thrombozytenzahl (TZ) auf.

Im Gegensatz dazu wurden bei Patienten mit fortgeschrittener Fibrose

(Fibrosegrad 3+4) erniedrigte Thrombozytenzahlen gemessen. Hier zeigte

sich deutlich die Abhängigkeit der Thrombozytenzahl vom Fibrosegrad.

Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit Untersuchungen von Adinolfi und

Giannini, die ebenfalls eine abfallende Thrombozytenzahl mit steigendem

Fibrosegrad beobachteten (Adinolfi et al., 2001; Giannini et al., 2002).

In der vorliegenden Arbeit fanden sich bei gesunden Probanden mit normaler

Thrombozytenzahl TPO-Serumspiegel von im Mittel 51,6 ± 31,8 pg/ml

(Median: 47 pg/ml); dabei war die Streuung mit einem Range von

3-118 pg/ml außerordentlich breit. Übereinstimmend mit den Mittelwerten des

in dieser Studie verwendeten Probandenkollektivs fanden Hou sowie

Stockelberg „Normalwerte“ für TPO von 52 ± 12 pg/ml resp. 50 ± 14 pg/ml

(Hou et al., 1998; Stockelberg et al., 1999).

In mehreren vorangegangenen Studien (Jelkmann, 2001; Emmons et al.,

1996; Chang et al., 1996; Tahara et al., 1996) wurde ein normaler TPO-

Spiegel unter 200 pg/ml postuliert. In unserer Studie lagen ebenfalls

sämtliche TPO-Serumspiegel der gesunden Probanden unter 200 pg/ml. In

dieser Studie konnte somit eine weitere Bestätigung für den diskutierten

Normalbereich der anderen Studien gefunden werden.

Sämtliche TPO-Konzentrationen der hier untersuchten Hepatitis C-Patienten

lagen vor Beginn der Therapie im erwarteten Normalbereich unter 200 pg/ml.

Allerdings waren dabei die Thrombopoietinspiegel der Patienten mit

fortgeschrittener Fibrose 67 % niedriger als bei den Patienten ohne bzw. mit

milder Fibrose.

4 Diskussion

49

Diese Ergebnisse weisen auf eine Korrelationskette zwischen

Fibrosestadium, TPO-Serumkonzentration und Thrombozytenzahl hin:

Patienten ohne bzw. mit milder Fibrose (Grad 0, 1+2 nach Metavir) haben

normale Thrombopoietin-Konzentrationen und normale Thrombozyten-

zahlen, während Patienten mit ausgeprägter Fibrose (Grad 3+4) stark

erniedrigte (aber noch im Normalbereich liegende) TPO-Spiegel und niedrige

Thrombozytenzahlen aufweisen. TPO und Thrombozyten sind bei diesem

Schädigungsgrad der Leber also gleichsinnig verändert. Übereinstimmend

mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit fanden auch Adinolfi

sowie Giannini bei Patienten mit schwerer Fibrose und niedrigen

Thrombozytenzahlen erniedrigte TPO-Spiegel (Adinolfi et al., 2001; Giannini

et al., 2002).

Diese gleichsinnige Veränderung von Thrombozyten-Zahl und TPO-

Serumspiegel widerspricht zunächst der von Geddis, Broudy und Fielder

(Geddis et al., 2002; Broudy et al., 1997; Fielder et al., 1996) postulierten

Theorie des autoregulatorischen Regelkreises der Thrombopoese mit

umgekehrt proportionalen Verhältnis von Thrombozyten und Thrombopoietin,

erklärt durch die Bindung von TPO an die Thrombozyten (s. Abb. 1).

Das heißt, der erwartete Anstieg der TPO-Serumspiegel als Antwort auf eine

fallende Thrombozytenzahl blieb bei diesen Patienten mit Hepatitis C

assoziierter fortgeschrittener Fibrose aus.

Zur Erklärung dieser Befunde stellten wir folgende Überlegungen an:

1. Aufgrund der fortgeschrittenen Leberschädigung wird die intrahepatische

TPO-Expression im Sinne einer Lebersynthesestörung eingeschränkt, die

TPO-Serumspiegel sinken und verursachen daraufhin niedrige

Thrombozytenzahlen.

2. Die vermehrte Sequestration von Thrombozyten in einer vergrösserten

Milz geht obligat mit einem vermehrten Abbau von gebundenem TPO

einher.

4 Diskussion

50

zu 1.

Zum Zeitpunkt vor Beginn der antiviralen Therapie zeigte sich bei der

Prüfung der Syntheseparameter Albumin und Quick: Eine fortgeschrittene

Leberschädigung geht mit abfallenden Syntheseparametern, d.h. mit einer

nachlassenden Leberproduktionsfähigkeit, einher.

Giannini et al. entdeckten 2002, dass niedrige TPO-Spiegel mit einer

Verschlechterung der Leberfunktion (gemessen mit dem [(13)C]-Aminopyrin-

Atem-Test) assoziiert sind. Die von ihnen 2003 durchgeführten

Untersuchungen und die Studien von Vyzantiadis, Espanol, Okubo und

Shimodaira (Giannini et al., 2003; Vyzantiadis et al., 2002; Espanol et al.,

2000; Okubo et al., 2000; Shimodaira et al., 1996) bestätigten: Die

niedrigeren TPO-Spiegel bei fortgeschrittener Leberschädigung entstehen

durch die weniger vorhandene funktionsfähige Lebermasse.

Aus diesen und unseren Ergebnissen folgt: Erniedrigte TPO-Serumspiegel

sind mit einem funktionellem Unvermögen der Leber und mit dem

Schädigungsgrad der Leberfibrose korreliert. Daraus folgt: Thrombopoietin

könnte einen frühen und sehr sensitiven Parameter zur Beurteilung der

Lebersyntheseleistung darstellen.

zu 2.

Die Milzgröße der untersuchten Patienten zeigte eine positive Korrelation mit

dem Fibrosestadium. Die sonographische Größenbestimmung der Milz ergab

bei Patienten ohne Fibrose keine Splenomegalie. Bei 17 % der Patienten mit

mäßiger Fibrose wurde eine Vergrößerung der Milz nachgewiesen. Patienten

mit fortgeschrittener Fibrose hatten einen Splenomegalie-Anteil von 42%.

In dieser Studie konnte eine negative Korrelation zwischen Milzgröße und

Thrombozytenzahl nachgewiesen werden: Patienten mit Splenomegalie

hatten weitaus geringere Thrombozytenzahlen als Patienten mit normal

großer Milz.

Peck-Radosavljevic, Aster, Harker und Toghill sahen eine vermehrte

Sequestration der Thrombozyten in der Milz bei Hypersplenismus als

Hauptursache der Thrombozytopenie an (Peck-Radosavljevic et al., 1997;

Aster, 1966; Harker and Finch, 1969; Toghill et al., 1977).

4 Diskussion

51

Vyzantiadis sowie Schoffski, Adinolfi, Faeh und Goulis stellten fest, dass bei

thrombozytopenischen Patienten mit chronischer Hepatitis C das

Vorhandensein einer Splenomegalie eine Rolle spielt: Patienten mit

Splenomegalie hatten geringere Thrombozytenzahlen als Hepatitis-Patienten

mit normal großer Milz (Vyzantiadis et al., 2002; Schoffski et al., 2002;

Adinolfi et al., 2001; Faeh et al., 2001; Goulis et al., 1999).

In verschiedenen Studien konnte ein Wiederanstieg der Thrombozytenzahl

nach Splenektomie bei anderer Grunderkrankung mit Splenomegalie (ITP,

MDS) nachgewiesen werden (Steensma et al., 2003; Bourgeois et al., 2003;

Kumar et al., 2002; Kraemer et al., 2002). (In diesen Studien fanden leider

keine Untersuchungen zum Verhalten von TPO statt.)

Schlussfolgerung:

Da nach den Erkenntnissen von Vyzantiadis (Vyzantiadis et al., 2002) keine

Korrelation zwischen der zirkulierenden TPO-Menge und der Milzgröße

existiert, ist nach unseren Überlegungen am ehesten folgende Erklärung für

die gefundenen Ergebnisse wahrscheinlich: Die gesteigerte Thrombozyten-

Sequestration in der vergrößerten Milz (Hypothese 2) führt zur

Thrombozytopenie. Die daraufhin - in einem normal funktionierenden

Regelkreis - stattfindende verstärkte Synthese und Freisetzung von TPO wird

durch die ausgeprägte Leberschädigung (Hypothese 1) verhindert (Abb. 23).

4 Diskussion

52

TPO im Serum

Megakaryozyten

im Knochenmark

Thrombozyten

TPO-mRNA

Leber

Milz

Positiver/

fördernder Einfluss

Negativer/

hemmender Einfluss

Abbildung 23: Autoregulation der Thrombozytopoese und der Einflussfaktor Milz: Bei Splenomegalie kommt es zu einem vermehrten Abbau von Thrombozyten (TZ) und gebundenem TPO. Eine gesunde Leber kann auf einen TZ- und TPO-Verlust mit verstärkter TPO-Synthese reagieren, bei ausgeprägter Leberschädigung ist dies nicht möglich.

4 Diskussion

53

4.2 Einfluss von Interferon

Zur weiteren Klärung dieser Annahmen schloss sich die Untersuchung des

Einflusses von Interferon als Thrombozyten-Produktionshemmer an. Dabei

wurde davon ausgegangen, dass Interferon keine Auswirkungen auf die

TPO-Synthese in der Leber hat, sondern einen direkt myelosuppressiven

Effekt ausübt (NIDDK, 2003; Lauer and Walker, 2001; Tran and Martin, 2001;

di Bisceglie, 1998). Eine Hemmung der Thrombozytenproduktion im

Knochenmark sollte zu einem Anstieg von Thrombopoietin führen, da erstens

weniger Thrombozyten zur Bindung von TPO zur Verfügung stehen und

zweitens die Synthese und Freisetzung von TPO durch eine

Thrombozytopenie stimuliert wird (s. Regelkreis Abb.1).

Zwei Monate nach Therapiebeginn wurden erste Auswirkungen des

Interferons auf Thrombozyten und Thrombopoietin deutlich: Die

Thrombozytenzahl der Patienten mit schwerer Fibrose (Grade 3+4) sank

unter den Wert der Ausgangsposition, während die Thrombopoietin-

Konzentration anstieg. Nach weiteren zwei bzw. vier Behandlungsmonaten

blieb dieser Trend erhalten: Die Thrombopoietinspiegel waren - im Vergleich

zu den Ausgangswerten - höher (überstiegen jedoch zu keinen Zeitpunkt den

normalen Referenzbereich) und die Thrombozytenzahlen weiterhin

erniedrigt.

Die hier festgestellte Thrombozytopenie und die erhöhten

Thrombopoietinspiegel können durch folgende Mechanismen erklärt werden:

1. Interferon führt durch seine myelosuppressive Nebenwirkung zu

Thrombozytopenie, als Reaktion steigt Thrombopoietin an (Abb. 24).

Diesen Befund stellten ebenfalls Peck-Radosavljevic und Shiota in

ihren Studien fest (Peck-Radosavljevic et al., 2002; Shiota et al.,

1997).

Diese myelosuppressive Wirkung konnte durch den Rückgang der

Leukozyten (Leukopenie) während der Therapie (Abb. 14) bestätigt

werden.

4 Diskussion

54

Die Leber scheint hier auf die (durch Interferon verstärkte)

Thrombozytopenie mit einem TPO-Anstieg – entsprechend dem

bereits vorgestellten Regelkreis (Abb. 1) – reagieren zu können. Damit

wird die von Stoffel, Cardier, Jelkmann und Geddis (Stoffel et al.,

1996; Cardier and Dempsey, 1998; Jelkmann, 2001; Geddis et al.,

2002) aufgestellte Theorie, TPO würde unbeeinflusst von äußeren

Umständen konstitutiv produziert, widerlegt.

2. Die in dieser Patientengruppe häufig vorliegende Splenomegalie löst

über die verstärkte Thrombozyten-Sequestration eine

Thrombozytopenie aus, daraufhin steigt Thrombopoietin an.

Hier zeigt sich ein Widerspruch zum Verhalten von TPO vor der

Interferon-Therapie: Da sich an der Splenomegalie während der

Therapie nichts ändert, hätten die TPO-Konzentrationen auch bereits

vor dem Einsatz von Interferon auf eine Thrombozytopenie reagieren

müssen.

Daher erscheint diese Annahme als eher unwahrscheinlich. Es

bestätigt sich dagegen die Vermutung von Vyzantiadis (Vyzantiadis et

al., 2002): Die Synthese und Freisetzung von TPO wird durch die

Größe der Milz nicht beeinflusst.

3. Es existiert eine „TPO-Resistenz“ des Knochenmarkes.

Unter Interferon-Therapie kommt es zu einem relativen Mehrbedarf an

TPO, um die Thrombozytenzahl stabil zu halten.

4. Durch die Interferon-Therapie kommt es zu einer Verbesserung der

Lebersyntheseleistung: Die Thrombopoietin-Konzentrationen steigen.

Eine gesteigerte hepatische TPO-Synthese - durch die antifibrotische

Wirkung des Interferons - ist zu diesem Zeitpunkt aufgrund eines zu

kurzen Therapiezeitraumes noch nicht zu erwarten. Hinweise dafür

lassen sich auch an dem Verhalten der Syntheseparameter Albumin

und Quick erkennen: Sie zeigen - während des gesamten

Therapiezeitraumes - keine signifikante Veränderung.

4 Diskussion

55

Andererseits könnte auch hier erneut ein Hinweis dafür vorliegen,

dass es sich bei TPO um einen sehr sensitiven

Leberfunktionsparameter handelt. Dieser könnte eventuell den Beginn

einer verbesserten Syntheseleistung der Leber sehr frühzeitig

anzeigen, wenn die anderen Leberfunktions-Parameter noch keine

Veränderung zeigen (Abb. 24).

TPO im Serum

Megakaryozyten

im Knochenmark

Thrombozyten

TPO-mRNA

Leber

Milz

Interferon

Positiver/

fördernder

Einfluss

Negativer/hemmender

Einfluss

Abbildung 24: Darstellung der Einflüsse der Interferon-Therapie und der Milz auf Thrombopoietin und Thrombozyten. Der Einfluss von Interferon und Milz führt zu einem Absinken der Thrombozytenzahl. Interferon verbessert die Lebersyntheseleistung, es kommt zu einem Anstieg von TPO.

4 Diskussion

56

Im Gegensatz zu den Ergebnissen bei Patienten mit fortgeschrittener Fibrose

befanden sich sowohl Thrombozyten als auch Thrombopoietin bei den

Patienten ohne bzw. mit mäßiger Fibrose (Grade 0,1+2 nach Metavir) -

während der Interferon-Ribavirin-Kombinationstherapie - im Normalbereich.

Die nur gering geschädigte Leber dieser Patienten scheint genug Reserven

zu haben, um ausreichende Mengen von TPO zu synthetisieren. Der

komplexe Regelkreis zwischen Thrombozyten und Thrombopoietin (Abb. 1)

wird deshalb nicht gestört. Darüber hinaus wiesen nur 17% der Patienten mit

milder Fibrose eine Splenomegalie auf, so dass sich eine vermehrte

Sequestration von Thrombozyten nicht auswirken konnte.

Daraus folgt: Patienten mit chronischer Hepatitis C, aber mit gesunder oder

nur leicht geschädigter Leber, sind auch bei äußerer Störung (hier:

Interferon-Ribavirin-Therapie) in der Lage, das komplexe Zusammenspiel

von Thrombopoietin und Thrombozyten aufrecht zu erhalten. Damit wird die

Vermutung von Stoffel, Cardier, Jelkmann und Geddis (Stoffel et al., 1996;

Cardier and Dempsey, 1998; Jelkmann, 2001; Geddis et al., 2002)

unterstützt, dass die Leber konstant und unbeeinflusst von äußeren Faktoren

TPO produzieren kann. Dies gilt aber nur für die Patienten mit leichtem

Leberschaden.

4 Diskussion

57

4.3 Thrombozyten und Thrombopoietin nach Abschluss der

Interferon-Therapie

Nach Beendigung der Therapie lagen die Thrombopoietinkonzentrationen

aller Patienten immer noch im „normalen“ Referenzbereich. Dabei ergab sich

eine Staffelung der TPO-Spiegel von niedrig, Fibrosegrad 0, nach hoch,

Fibrosegrad 3+4.

Die Patienten mit schwerer Fibrose (Fibrosegrad 3+4) wiesen den

deutlichsten TPO-Anstieg aller Patientengruppen auf.

Möglicherweise ist hier erneut der Therapieeffekt des Interferons zu

erkennen: Interferon führt zu einer Stagnation in der Fibroseprogression und

sogar zu einem Rückgang der Fibrose. Die Leber ist dadurch in der Lage,

wieder vermehrt resp. normale Mengen Thrombopoietin zu produzieren und

damit adäquat auf eine Thrombozytopenie zu reagieren.

Anhand der klassischen Syntheseparameter Quick und Albumin ist ein

Rückgang der Fibrose bzw. eine Verbesserung in der Syntheseleistung nicht

eindeutig zu erkennen; allerdings ist der Trend zu einem diskreten Anstieg

der Quickwerte zu beobachten. Hier kann also erneut ein Hinweis auf TPO

als ein früher und sensitiver Leberfunktionswert gefunden werden.

Nach Beendigung der Therapie kam es durch den Wegfall des

myelosuppressiven IFN-Effektes zu einem Anstieg der Thrombozytenzahlen

auf fast normale Werte (Median: 150.000/µl). Die erhöhten TPO-Spiegel

tragen durch Stimulation der Thrombozytopoese zu diesem Anstieg der

Thrombozytenzahl bei. Diese Befunde stimmen mit den von Peck-

Radosavljevic gefundenen Ergebnissen überein (Peck-Radosavljevic et al.,

2002). Bei den Untersuchungen von Rajan und Garcia-Suarez (Rajan and

Liebman, 2001; Garcia-Suarez et al., 2000) wurden ebenfalls erhöhte

Thrombozytenzahlen nach Interferon-alpha-Therapie von HCV-assoziierter

Thrombozytopenie festgestellt. Der Einfluss von Thrombopoietin wurde in

diesen Arbeiten nicht berücksichtigt.

Bei den Patienten mit milder Fibrose waren die Thrombozytenzahlen auch

nach Therapiebeendigung normal konstant (Mediane: 184.500/µl,

223.000/µl). Die Thrombopoietinkonzentrationen lagen ebenfalls immer noch

im Referenzbereich.

4 Diskussion

58

Durch den Wegfall von Interferon kam es nicht zu Störungen im komplexen

Thrombozyten-Thrombopoietin-Regelkreis.

Dies bestätigt erneut die auch von Stoffel, Cardier, Jelkmann und Geddis

aufgestellte Theorie: Bei Patienten mit gesunder bzw. sehr gering

geschädigter Leber wird TPO konstitutiv und unabhängig von äußeren

Faktoren produziert (Stoffel et al., 1996; Cardier and Dempsey, 1998;

Jelkmann, 2001; Geddis et al., 2002). Der Regelkreis von Thrombozyten und

TPO funktioniert.

4 Diskussion

59

4.4 GOT und GPT

Die vor Beginn der antiviralen Interferon-Ribavirin-Kombinationstherapie in

Abhängigkeit vom Schweregrad der jeweils vorliegenden Leberfibrose

erhöhten Transaminasen GOT und GPT gingen unter der Therapie zurück

und belegten mit dieser nachlassenden Leberentzündungsaktivität

(reduzierter Zelluntergang) die therapeutische Wirksamkeit von Interferon

und Ribavirin, wie es auch schon von den Autoren Lauer, Gramenzi, di

Bisceglie und Hoofnagle übereinstimmend beschrieben worden war (Lauer

and Walker, 2001; Gramenzi et al., 2001; di Bisceglie, 1998; Hoofnagle and

di Bisceglie, 1997).

Die Reaktion der Transaminasen richtete sich nach der HCV-RNA-Response

der einzelnen Patienten. Während die Transaminasen der Patienten mit

chronischer Hepatitis C und anhaltendem Therapieerfolg (mindestens 6

Monate nach Therapieende fehlender HCV-RNA-Nachweis) therapiebedingt

erwartungsgemäß stark zurückgingen, zeigten die Transaminasen der

Patienten ohne anhaltende Therapieantwort (Non-Responder) keine

Reaktion oder sogar eine leichte Zunahme.

4.5 Leber-Synthese-Parameter Albumin und Quick

4.5.1 Albumin:

Sämtliche gemessenen Albuminwerte lagen im Normalbereich (35-52 g/l).

.

4.5.2 Quick:

Bei der Untersuchung der Quickwerte der Patienten wurden zu allen

Untersuchungszeitpunkten normale Ergebnisse (70-130 % der Norm)

festgestellt.

4 Diskussion

60

4.6 Hämoglobin

Während der Interferon-Ribavirin-Kombinationstherapie kam es zu einem

leichten Rückgang der Hämoglobinwerte, die sich nach Absetzen der

Therapie sofort wieder erholten. Es bestand keine Abhängigkeit von dem

jeweils vorliegenden Fibroseschweregrad. Dieser Effekt ist am

wahrscheinlichsten durch die Wirkung des Ribavirins bedingt, da die rote

Zellreihe im Knochenmark nicht von der Interferon-Wikung beeinflusst wird.

4 Diskussion

61

4.7 Fazit

Insgesamt zeigt diese Studie, dass die bei Patienten mit chronischer

Hepatitis C oft vorhandene Thrombozytopenie durch ein kompliziertes

Zusammenspiel aus Thrombozyten-Sequestration in der Milz, Bindung von

TPO an Thrombozyten-Rezeptoren und Leberinsuffizienz entsteht (Abb. 1 u.

Abb. 23).

Dabei lässt sich ein Unterschied zwischen Patienten mit schwerem

Leberschaden und nahezu gesunden Patienten feststellen:

Die Patienten mit massivem Leberschaden werden durch die Interferon-

Therapie folgendermaßen beeinflusst: Ohne Therapie weisen sie erniedrigte

TPO-Konzentrationen und Thrombozytenzahlen auf. Während der Therapie

kommt es zu einem Anstieg von TPO, die Thrombozytenzahl bleibt niedrig.

Nach der Interferon-Ribavirin-Therapie steigen die TPO-Serumspiegel enorm

an, die Thrombozytenzahlen nehmen ebenfalls zu.

Damit ist belegt:

� Interferon führt zu einer Verbesserung der Lebersyntheseleistung

(Abb. 24).

� Nach einer Interferon-Therapie kann der TPO-Thrombozyten-

Regelkreis wieder funktionieren.

� TPO kann als ein früher und sensitiver Parameter für die

Leberfunktion angesehen werden.

Die Patienten mit einer nahezu gesunden Leber (Fibrosegrad 0, 1+2) werden

durch die Interferon-Therapie in ihrem Zusammenspiel von TPO und

Thrombozyten nicht gestört. Thrombozytenzahlen und TPO-Serumspiegel

weisen während des gesamten Beobachtungszeitraumes ausschließlich

Normalwerte auf.

Daraus folgt:

� TPO wird in einer nahezu gesunden Leber konstitutiv und

unbeeinflusst von äußeren Faktoren synthetisiert.

� Der komplexe Thrombopoietin-Thrombozyten-Regelkreis kann

ungestört funktionieren.

5 Zusammenfassung

62

5 Zusammenfassung

Die Thrombozytopenie ist eine häufige Begleiterscheinung bei chronischen

Lebererkrankungen - insbesondere bei chronischer Hepatitis C - und wird

durch die antivirale Therapie mit Interferon und Ribavirin häufig noch

verschlimmert.

Die Regulation der Thrombozytenzahl ist komplex und beinhaltet die

Sequestration und Metabolisierung von Thrombozyten in der Milz sowie das

Zusammenspiel mit dem Zytokin Thrombopoietin.

Thrombopoietin (TPO), der hauptsächliche Regulator der Megakaryozyto-

und Thrombozytopoese, wird hauptsächlich von der Leber produziert.

In dieser Studie wurde der Zusammenhang zwischen Fibrosegrad und TPO-

Serumkonzentration sowie der Einfluss der antiviralen Therapie mit Interferon

und Ribavirin untersucht.

Methode:

Bei 45 Patienten mit chronischer Hepatitis C wurden vor Beginn, während (zu

den Zeitpunkten zwei, vier und sechs Monate Therapie) und nach Abschluss

der antiviralen Therapie die Thrombozytenzahlen (TZ) und die TPO-

Serumspiegel mittels einem ELISA (Quantikine human Tpo, R&D Systems,

USA) bestimmt.

Bei jedem Patienten wurde vor Therapiebeginn eine Leber-Biopsie

durchgeführt und der Fibrosegrad wurde nach Metavir eingeteilt: Grad 0 –

keine Fibrose (n = 9), Grad 1-2 – mäßige Fibrose (n = 18), Grad 3-4 –

ausgeprägte Fibrose (n = 18) vorhanden.

Ergebnisse:

Vor Beginn der antiviralen Therapie zeigte sich ein signifikanter Unterschied

der Thrombozytenzahl in Abhängigkeit der verschiedenen Fibrosegrade

(p=0,0109). Daraus folgte: Je höher der Fibrosegrad, desto niedriger die

Thrombozytenzahl. Für die Thrombopoietinkonzentrationen konnte vor

Therapiebeginn kein signifikanter Unterschied in Abhängigkeit von dem

Fibrosegrad gefunden werden (p=0,1673); es wurde jedoch ein Trend

5 Zusammenfassung

63

erkennbar: Je stärker die Leberfibrose ausgeprägt war, desto weniger TPO

konnte im Serum nachgewiesen werden.

Während der Therapie konnten bei den Patienten mit geringer Fibrose (Grad

0,1+2) keine statistisch signifikanten Veränderungen der

Thrombopoietinserumspiegel in Abhängigkeit von der Therapiedauer

gefunden werden (p>0,05). Bei den Patienten mit ausgeprägter Fibrose

hingegen, ist ein statistisch signifikanter TPO-Anstieg feststellbar (p<0,05).

Statistisch signifikante Veränderungen der Thrombozytenzahlen in

Abhängigkeit von der Therapiedauer konnten während der Therapie bei den

Patienten ohne Fibrose nicht gefunden werden (p>0,05). Im Gegensatz dazu

konnten sie jedoch bei den Patienten mit mittelschwerer und stark

ausgeprägter Leberschädigung festgestellt werden (p<0,05).

In der Varianzanalyse zeigte sich ein statistisch signifikanter Einfluss sowohl

der Zeit (p=0,0101) als auch des Fibrosestadiums (p=0,0001) auf die

Thrombozytenzahl.

Durch diese Ergebnisse und verschiedene Überlegungen konnten in dieser

Studie folgende Schlussfolgerungen gezogen werden:

Bei Patienten mit ausgeprägter Fibrose (Grad 3+4) führt die antivirale

Kombinationstherapie zu einer verbesserten Lebersyntheseleistung. Diese

wird durch den Anstieg von Thrombopoietin deutlich. Dadurch wird das

geordnete Zusammenspiel von Thrombozyten und Thrombopoietin wieder

möglich. TPO kann als ein frühzeitig auftretender und sensitiver Parameter

für die Lebersyntheseleistung angesehen werden. Anhand der klassischen

Syntheseparameter Quick und Albumin ist diese Verbesserung der

Syntheseleistung der Leber noch nicht eindeutig zu erkennen; es zeigt sich

ein Trend zu einem diskreten Anstieg der Quickwerte.

Bei Patienten ohne bzw. mit nur gering ausgeprägter Leberfibrose (Grad

0,1+2) nimmt die Interferon-Ribavirin-Therapie keinen großen Einfluss auf

die Höhe der Thrombozytenzahl oder Thrombopoietinkonzentration. Diese

Werte befinden sich während des gesamten Beobachtungszeitraumes im

Normalbereich. Dies spricht dafür, dass in einer gesunden Leber die TPO-

Produktion unabhängig von äußeren Faktoren, und das komplizierte

Zusammenspiel von Thrombozyten und Thrombopoietin ungestört stattfinden

kann.

5 Zusammenfassung

64

Fazit:

Thrombopoietin spielt eine wichtige Rolle in der Autoregulation der

Thrombozytopoese und kann als ein sehr sensitiver Parameter zur

Beurteilung der Lebersyntheseleistung angesehen werden.

6 Literaturverzeichnis

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7 Anhang: Erhebungsbogen

82

Erhebungsbogen

Name: Vorname:

Geb.datum:

Patienten-Nummer:

Erstvorstellung:

Erstdiagnose:

Möglicher Infektionszeitpunkt/-weg:

Genotyp: (1a/ 1b/ 2/ 3/ 4)

Leber-Histologie:

Biopsie vom: Aktivitätsgrad: (0-3 nach Metavir)

Fibrosegrad: (0-4 nach Metavir)

Milzgröße (sonographisch ermittelt):

Querdurchmesser:

Längsdurchmesser:

Labor: Datum:Hb (g/dl):WBC (10e3/µl):PLT (10e3/µl):PCR (+/-):GOT (U/l):GPT (U/l):Albumin (g/l):Quick (%):

Therapie: Interferon: (MIU, 3x/Woche)

Ribavirin: (mg/d)

Therapiezeitraum: (Wochen)

Therapieansprechen: (Responder = R)

(Non-Responder = NR)

8 Danksagung

83

Danksagung

Meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. med. W. Schmiegel, danke ich für die

Überlassung des Themas.

Für die Studienleitung danke ich Herrn Dr. med. U. Graeven.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. med. M. Reiser für die freundliche

Beratung und immer anregende Betreuung bei der Durchführung meiner

Promotionsarbeit.

In meinen Dank einschließen möchte ich Frau Anika Hüsing für die

Unterstützung bei der statistischen Auswertung meiner Ergebnisse sowie

Frau Sonja Karpinski und Frau Sabine Plambeck für die Hilfe bei der

Durchführung des ELISAs.

9 Lebenslauf

84

Lebenslauf

Name: Stefanie Rose

Geburtstag und -ort: 11. August 1977 in Hagen, Westf.

Familienstand: ledig

Konfession: evangelisch

Nationalität: deutsch

Eltern: Dipl.-Ing. Horst Rose und

Inge Rose, geb. Steinweg

Anschrift: Erbenstr. 21

44309 Dortmund

Schulbildung

1984 – 1985 Vincke-Grundschule, Hagen-Boele

1985 – 1988 Reichshof-Grundschule, Dortmund-Brackel

1988 – 1997 Stadtgymnasium Dortmund (Abitur)

Studium

1997 – 2004 Studium der Humanmedizin, Ruhr-Universität

Bochum

1999 Ärztliche Vorprüfung (Physikum)

2000 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

2003 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

2003 – 2004 Praktisches Jahr: Innere Medizin, Chirurgie und

Wahlfach Orthopädie, Allgemeines Krankenhaus

Hagen

27.04.2004 Abschluss des Studiums mit Bestehen des dritten

Abschnittes der Ärztlichen Prüfung

Berufliche Tätigkeit

seit 15. Juni 2004 Ärztin im Praktikum

im Allgemeinen Krankenhaus Hagen,

Medizinische Klinik

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Der Effekt von Interferon alpha auf Thrombozyten und ... · GPT Glutamat-Pyruvat-Transaminase, Synonym: Alanin-Amino-Transferase (ALT) Hb Hämoglobin HCV Hepatitis-C-Virus HLA Human