Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Path. u. Pharmak. 247, 93--99 (1964)

Aus dem Pharmakologisohen Institut der Universit~t Tiibingen

Der Einflu~ yon Hemicholinium Nr. 3 auf die Acetylcholin-Bildung in Lactobacillus arabinosus*

Von

F. LEMBECK u n d E. SCHRAVEN

Mit 4 Textabbildungen

(Eingegangen am 20. Dezember 1963)

Hemichol in ium Nr. 3 (HC-3), c¢,~'-Dimethylamino~ithanol-4,4'-bi- acetophenon, bewirkt eine ganglion~re und neuromuskul~re I~emmung (MACINTOSH u.a . 1956, 1961; REITZEL U. LONG 1959). Diese Wirkung wurde auf verschiedene Weise erkl£rt :

MACINTOSH (1956, 1961) nahm eine Hemmung der Cholinacetylase an, da HC-3 die Acctylcholinbildung und -abgabe hemmt, wenn es der DurehstrSmungsfliissig- keit des isolierten Ganglion cervicale superius der Katze in einer Konzentration yon 2 .10 -5 M zugesetzt wird. Bei ei~.er HC-3-Konzentration yon 10 -~ M wurde die Aeetylcholin-Synthese im M~usehirnbrei zu 75 °/0, bei 10 -~ M in acetongetrocknetem Rattenhirnhomogenat zu 50°/0 gehemmt. Da zwisehen der Wirkung yon HC-3 auf das isolierte Fermentsystem einerseits und auf intakte Neuronen und Zellen anderer- seits eine so grol~e Diskrepanz besteht, wurde yon MACINTOSH (1961) aul3erdem ebm Hemmung des Cholintransportes diskutiert, der mSglicherweise an ein Carrier- System gebunden sein kbnnte. Cholin hebt die t{emmung der Acetylcholin-Synthese durch HC-3 auf (REITZEL U. LONG 1959; GKRDINER 1961). Bei hSheren HC-3-Kon- zentrationen nimmt die Empfindlichkcit der motorischen Endplatte auf Acetyl- cholin ab, so daf~ neben der pr~isynaptischen Wirkung yon HC-3 ein postsynapti- scher, curareartiger Block anzunehmen ist (THIES u. BROOKS 1961; MXRTI~r u. ORKAND 1961). BENTLEY U. SABIbTE (1963) fanden, dab auch der elektrisch dirckt gercizte glatte Muskel durch HC-3 (100 #g/ml) zu einem gewissen Grad gehemmt wird.

U m zu untersuchen, ob HC-3 einen Einflul] auf die Acetylcholhl- Bi ldung durch das bakterielle E n z y m hat, un te rsuch ten wir an Lacto- bacillus arabinosus, e inem in Anwesenheit von Cholin Acetylcholin-bilden- den Bakter iens tamm, folgendes:

1. den Einfluf~ von ~C-3 auf die Acetylchol in-Bildung yon wachsen- dem L. arabinosus,

2. den EinfluB yon HC-3 auf die aus L. arabinosus extrahier te Cholin- acetylase und

3. die Wi rkung yon ItC-3 auf das Wachs tum yon L. arabinosus.

* Mit Unterstfitzung der Deutschen Forschungsgemeinschaft. .-~aunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Path. Phar mak., Bd. 247 7

94 F. LEMBECK und E. Scm~AvE~:

Methodik Hemicholinium Nr. 3 wurde nach der Vorschrift yon Long u. SCHU:ELER (1954)

synthetisiert. Acetylcholin wurde am Froschrectus nach der Methode von C•A•¢ u. GADDUI~

(1933) bestimmt. Bei allen Untersuchungen wurde der Bakterienstamm Lactobacfllus arabinosus

17-5 (National Collection of Type Cultures London) verwendet 1.

Acetylcholin-Bildung in wachsenden Bakterien Die Acetylcholin-Bildung wachsender Bakterien wurde in einem abgei~nderten

Medium nach Gmvrs u. STEVV.NSO~ (1954) untersucht, das folgendermaBen her- gestellt wurde:

L6sung A: 1. Pepton aus Casein (Merck) 1,65 g 2. Glucose 1,00 g 3. m Natriumacetat 0,50 ml 4. Salzl6sung 5,00 ml

[KH~PO 4 0,15 g; MgS04 • 71530 0,1 g; (NH4)2ttPO4 0,6 g; FeS04 • 7H20 1,5 mg; CuSO 4 • 5H20 125 #g; MnSO~ • H20 76 ~tg; ZnSO, • 1530 125/~g; auffiillen mit Wasser auf 100 ml]

auffiillen mit Wasser auf 75 ml und 20 rain bei 120 ° autoklavieren. L6sun9 B: 1. Yeast extract (Difco) 300 mg

2. Cysteinhydrochlorid 20 mg 16sen in 25 ml Wasser und steril filtrieren.

A und B werden vereinigt und je 6 ml in Kapsenberg-R6hrehen pipettiert. Nach Zusatz von Cholin und HC-3 in verschiedenen Konzentrationen wurde dann mit L. arabinosus angeimpft, 16 Std bei 30 ° bebriitet, die Bakterien abzentrifugiert und das Kulturmedium am Froschrectus getestet.

Isolierung und Extraktion der Bakterien Zur Isolierung der Bakterien wurden je 201 Peptonized Milk (Difco) mit L. ara-

binosus iiberimpft und 72 Std bei 30 ° bebriitet, zentrifugiert und der Riickstand lyophilisiert.

Auf diese Weise erhielt man je Ansatz 2- -3 g Bakterien-Trockenpulver. Dieses wurde nach GIRVrN u. ST~V~CSON (1954) mit Glaspulver homogenisiert, mit n-Butanol und ansehliel3end mit Aceton behandelt. Die Extraktion des Ferment- systems erfolgte mit 0,9°/0iger NaC1/L-Cysteinhydrochlorid (3,15 mg/ml, neutrali- siert). Die so erhaltene L6sung wurde bei 10000 • g zentrifugiert und mit K2HPO 4- Puffer ( 7 p Mol/ml), KC1 (2,02 mg/ml), MgC1, ( 1,01 mg/ml, Natriumacetat (1,36 mg/ml), L-Cysteinhydrochlorid (3,15 mg/ml), Eserinsulfat (0,16 mg/ml), ATP (0,91 mg/ml) und Coenzym A (0,1 mg/ml) 20 min bei 37 ° bebrfitet, dann mit Cholin und HC-3 in verschiedenen Konzentrationen versetzt und 1 Std bei 37 ° inkubiert.

Wachstumsversuche Je 6 ml des Mediums nach GIRVI~ U. STEVENSON wurden in Kapsenberg-RShr-

chen pipettiert, Cholin und 15C-3 in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt, mit L. arabinosus fiberimpft, bei 30 ° bebriitet und das Wachstum mit 15ilfe yon Trii- bungsmessungen im Lange-Colorimeter verfolgt,

1 Herrn Doz. Dr. F. LI~GENS danken wir fiir die ]~berlassung der Bakterien- kultur.

I-Iemicholinium auf bakterietle Acetylcholin-Bildung 95

Ergebnisse Bei der Acetylchohn-Bestimmung am Froschrectus fiel auf, daI~ I-IC-3

bereits in einer Konzentration yon 5 #g/ml ( = 10 -5 M) die Kontraktion des Frosehrectus auf Zugabe vor~ I fig Acetylcholin um ca. 5 °/0 hemmt (Abb. 1). Wit konnten daher HC-3 nut in Mengen verwenden, die ohne

+200 ".50 ~NC-3

Abb. 1. Frosehrectus. Bad 10 ml. Das Kymographion wurde jeweils 2 rain nach Zugabe yon Acetyl- cholin fiir einige Sekunden angestellt. Intervalle nach dem Auswaschen jeweils 5 rain

0 100 0 100

lhplp fl/00 0

lllllll /~gg p.g,h~L Chol/n :oo ~Iml, //C-s

Abb. 2. Acetylcholin-Bildung in wachsendem L. arabinosus in Gegenwart yon Cholin und I-IC-3

EinfluB auf den Test waren. Aus diesem Grund beschr/~nkten wit uns darauf, HC-3 dem Medium nur in tier Konzentration yon 100 #g/ml zuzusetzen, variierten daffir aber die Cholinkonzentrationen yon 14--1400/~g/ml. Zur Kontrolle wurden auBerdem bei der Acetylehohn-Bestimmung am Frosehrectus den zum Vergleieh verwendeten L6sungen yon Aeetyl- eholin HC-3 in den entsprechenden Konzentrationen zugesetzt. Da in bestimmten Ans/~tzen eine hohe Cholinkonzentration vorhanden war,

7*

96 F. LEMBECK und E. SCrraXVEN:

mul~te auch dies bei der Testung am Froschrectus beriicksichtigt werden; in den maximal zum Bad zugesetzten 0,2 ml TestlSsung waren maximal 0,28 mg Cholin enthalten. Aber selbst Mengen von 0,4 mg Cholin verur- sachten noch keine Kontraktion des Rectus.

~> 3

0 /0O 0 ZOO

1400 0

1~00 9gl~t Cko#n

A b b . 3 . Acetylcholin-Synthese extrahiertcr Cholinacetylase aus L. arabinosus in Gegenwart yon Cholin und t I C - 3

/ / /

/ /

/ f /

o o e 0 2 f g 8 10 12 1~ N 18 20 22~fd.2g

Abb.4. Waehstum y o n L . arabinosus ill Gegenwart yon Cholin und HC-3 . ~ - - - ~ 0,7 mg CholLu/ml M e d i u m ; a - - - o 0,7 mg Chol in + 0,1 mg H C - 3 / m l M e d i u m ; v - - - v 0,7 mg Chol in + 0,5 mg H C - 3 h n l M e d i u m ; o - - - o 0,5 mg l~C-3/ in ! M e d i u m ; o - - - o Medium ohne Zusatz yon Cholin und

t I C - 3

Die Acetylcholin-Bfldung dutch L. arabinosus ist yon der Cholinkon- zentration im Kulturmedium abh/~ngig (Abb. 2). Bei Zusatz yon 14/~g/ml Cholin zum Kulturmedium fanden wit nach 16 Std Bebrfiten bei 30 ° eine kaum meBbare Aeetyleholin-Bildung (etwa 0,1 #g/ml), w~hrend bei einer Cholinkonzentration yon ]400 Hg/ml etwa 3,3/~g/ml Aeetyleholin gebfl- det wurden. Auch in Anwesenheit yon 100 #g/ml tIC-3 wurde eine Acetyl-

. cholin-Bildung im gleichen AusmaB gefunden.

Hemicholinium auf bakterielle Acetylcholin-Bildung 97

Aus L. arabinosus nach Grown u. STEVENSON (1954) extrahierte Cholinacetylase bildete in 1 Std in Anwesenheit yon 14/tg/ml Cholin etwa 0,1 mg Acetylcholin, in Anwesenheit yon 1400/~g/ml etwa 3 mg Acetylcholin pro Gramm Bakterien-Troekensubstanz (Abb.3). Die gleichen Mengen Aeetylcholin wurden auch produziert, wenn man dem Ansatz 100/zg/ml ItC-3 zusetzte. Daraus geht hervor, daft die Acetyl- cholin-Bildung dureh tIC-3 in diesen Konzentrationen nicht gehemmt wird.

Durch Triibungsmessungen des mit L. arabinosus angeimpften und bebriiteten Mediums lieB sich feststellen, dal3 das Bakterienwachstum weder durch Zugabe yon Cholin oder HC-3, noch durch gleichzeitigen Zusatz beider Substanzen beeinflul3t wird (Abb. 4).

Diskussion Lactobacillus arabinosus hat zwar die F/ihigkeit, Cholin zu acetylieren,

doch ist die Bedeutung dieser Umsetzung unklar; jedenfalls ist das Wachstum der Kultur unabhiingig yon der Anwesenheit yon Cholin. Die Cholinacetylase des L. arabinosus unterscheidet sich yon der tierischen Cholinacetylase dadurch, dab sie durch NaF gehemmt wird und nut nach Butanolbehandlung des Bakterienhomogenates in aktiver Form extra- hiert werden kann. Die Einwirkung yon HC-3 auf das Wachstum der Bakterien, auf ihre Aeetyleholin-Bfldung und auf das isolierte Enzym- system hat demnach diese Unterschiede zu berficksichtigen, bot aber die M6glichkeit yon Aussagen fiber die Einwirkung yon HC-3 auf Stoff- wechselvorg/inge auflerhalb der Aeetyleholin-Bfldung, soweit sie am Bakterienwachstum ersichtlieh wurden, fiber Beeinflussung des Cholin- transportes aus dem Medium zur intracellul/iren Bakterien-Cholinacety- lase und fiber Einwirkung auf das isolierte Enzymsystem. GARDINER (1961) konnte zeigen, dal3 durch Einwirkung yon I-IC-3 auf intakte Zell- fragmente (Itirnbrei) die Acetylcholin-Synthese gehemmt wird, w/~hrend bei t t irnhomogenaten nur dann eine I~emmung erzielt wurde, wenn das molare Verh~ltnis yon I-IC-3 zu zugegebenem Cholin gr613er als 1 und aul~erdem das ]:[omogenat nicht mit organischen L6sungsmitteln behan- delt war. Am isolierten Cholinacetylase-System aus Bakterien war im Rahmen der vorhandenen experimenteUen ~¢[6glichkeiten eine I temmung durch HC-3 ebenfalls nicht nachweisbar. Mit Rficksicht auf die Testung am Froschrectus und die Acetylcholinausbeute konnte die Relation l-IC-3/Cholin nur sehr begrenzt erh6ht werden (siehe unten). Dies galt ebenso ffir Versuche an wachsenden Bakterien.

Die Acetyleholin-Bfldung in wachsenden Bakterien erfolgte tinter HC-3 ebenfalls unbeeinflu~t, d.h. es konnte auch keine l~emmung des Cholintransportes durch die Membran vorliegen. Dies kann bei Bakterien- membranen anders sein a]s bei tierischen Zellgrenzfliichen, an denen ¢ine

98 F. LEMBECK und E. Scm~AVE~:

Hemmung des Cholintransportes zu beobachten war, wie MACINTOS~ U. a. (1958) am Tubulus der Vogelniere zeigten.

Bei der Wirkung yon t{C-3 ist die Relation der Cholin zur I-IC-3-Kon- zentration zn berficksichtigen, da Cholin manche HC-3-Wirkungen anf- hebt (SCHUELER 1955; RmTZV.L U. LONG 1959; GA~I)INER 1961). Dieser Relation waren in den vorliegenden Versuchen aber Grenzen gesetzt. Cholin in der Menge yon < 14 #g/ml in den Ans~tzen h~tte eine Acetyl- cholin-Bildung ergeben, die kaum mehr nachweisbar gewesen wi~re ; HC-3 in Mengen > 100 #g/ml h£tte den Test am Froschrectus zu sehr beein- fluBt. Also muBte ein doppelter molarer UberschuB des I{C-3 fiber das Cholin als oberste Grenze angesehen werden, die experimentell mSglich war. Es konnte also nicht ermittelt werden, ob ein grbBerer UberschuB yon HC-3 fiber Cholin zu einer Hemmung der Acetylchohn-Synthese in beiden Versuchsanordnungen ffihren wfirde.

SchheBhch zeigten die Wachstumsversuche, dab auch hierbei I{C-3 ohne Wirkung ist, somit eine Beeinflussung wesentlicher anderer Lebens- vorgiinge in L. arabinosus auszusehlieBen ist. Daher konuten die Ver- suche, wenn fiberhaupt, nur Schlfisse per exclusionem auf dieWirkung yon HC-3 am Tier erlauben.

Die fehlende Wirksamkeit yon HC-3 auf die Acetylcholin-Synthese in L. arabinosus weist auf Befunde yon LEWARTOWSKI U. BIEL~CKI (1963) bin, die annehmen, dab das Acetylcholin des Herzens in drei Fraktionen vorliegt. Eine sehr kleine Fraktion, die in Nervenendigungen enthalten ist, fungiert als Ubertr~gerstoff. Eine andere Fraktion (50--600/0) ist im Herzmuskel lokalisiert und wird auf Nervenimpulse bin freigesetzt. Eine dritte Fraktion (30--50 °/0 ) kann nicht freigcsetzt werden. LEW~TOWSXI u. BI]~LECKI nehmen an, dal~ der Gehalt der ersten und der dritten Frak- tion durch I{C-3 nicht beeinfluBt wird und nur die Acetylcholin-Synthese in der zweiten Frakt ion dutch HC-3 gehemmt wird. Es ergibt sich aus diesen Befunden, dab ~hnlich wie in L. arabinosus auch die Aeetylcholin- Synthese best immter , ,Fraktionen" im tierischen Organismus ffir I~C-3 nicht zug~nghch ist.

Die als Nebenbefund bei der Acetylcholin-Testung am Froschrectus beobachtete Hemmwirkung yon I{C-3 ist durch die curareartige, durch Cholin nieht beeinfluBbare Wirkung yon I{C-3 zu erkli~ren, die hinsicht- lich yon Acetylcholin-Bestimmungen in HC-3-haltigen LSsungen y o n Bedeutung ist.

Summary The effect of tIC-3 on the rate of acetyl choline synthesis in growing

Lactobacillus arabinosus 17-5 and on the activity of the isolated bacterial choline acetylase has been investigated.

I-IC-3 in molar concentrations up to twice the choline concentration in the medium was without an effect in both systems. There was also no

Hemicholinium auf bakterielle Acetylcholin-Bildung 99

influence on the rate of growth. The concentra t ion of I-IC-3 used was l imited by the fact t ha t higher amoun t s interfered with the es t imat ion of acetyl choline on the frog rectus preparat ion.

I t is concluded tha t in Lactobacil lus arabinosus nei ther the choline acetylase nor the choline t ransfer through the bacterial membrane is inhib i ted by HC-3.

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Prof. Dr. F. LEMBECK, Pharmakologisches Institut der Universit~t,

74 Tiibingen, Wilhelmstra6e 56