Der Einfluss von pdHGF auf die Wundheilung Von der ...darwin.bth.rwth-aachen.de/opus3/volltexte/2012/4292/pdf/4292.pdf · Aqua destillata (lat. = destilliertes Wasser) Arg Arginin

Der Einfluss von pdHGF auf die Wundheilung

Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen

zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Medizin genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Britta Anna Kühlmann

aus

Kandel

Berichter: Herr Universitätsprofessor Dr. med. Dr. univ. med. Prof. h.c. mult. Norbert Pallua

Herr Professor

Dr. rer. nat. Christoph Suschek Tag der mündlichen Prüfung: 10. September 2012 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfüg-

bar.

Meinen Eltern

und

Simon Frank

...in Liebe und Dankbarkeit...

I

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................ I

Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................ IV

Abbildungsverzeichnis ................................................................................................. VI

Tabellenverzeichnis ................................................................................................... VIII

1 Einleitung ................................................................................................................... 1

1.1 Chronische Wunden ...................................................................................................... 1 1.2 Physiologische und pathologische Wundheilung ........................................................ 2 1.3 Überblick der Therapie chronischer Wunden ............................................................ 3 1.4 Wachstumsfaktoren in der kutanen Wundheilung .................................................... 5 1.5 Hepatocyte Growth Factor ............................................................................................ 8 1.6 Zielsetzung .................................................................................................................... 13

2 Material und Methoden .......................................................................................... 14

2.1 Tierversuche ................................................................................................................. 14 2.1.1 Wachstumsfaktor und Vergleichsgruppe ................................................................ 14 2.1.2 Versuchstiere .......................................................................................................... 14 2.1.3 Tierhaltung .............................................................................................................. 15

2.2 Operative Interventionen ............................................................................................ 15 2.2.1 Anästhesie ............................................................................................................... 16

2.3 Versuchsablauf ............................................................................................................. 16 2.3.1 Herstellen der HGF-Lösungen ................................................................................ 16 2.3.2 Versuch 1: Wundheilung unter Einfluss von pdHGF und rHGF ........................... 17 2.3.3 Versuch 2: Haarwachstum unter Einfluss von pdHGF und rHGF ......................... 20

2.4 Untersuchungstechniken ............................................................................................. 23 2.4.1 Blutentnahme mittels Herzpunktion ....................................................................... 23 2.4.2 Gewebeentnahme und Gewebefixierung ................................................................ 24

2.5 Histologische Färbungen ............................................................................................. 24 2.5.1 Anfertigung der histologischen Präparate .............................................................. 24 2.5.2 Hämalaun-Eosin-Übersichtsfärbung (HE-Färbung) ............................................... 25 2.5.3 Sirius Red-Färbung ................................................................................................. 26

2.6 Lichtmikroskopie ......................................................................................................... 26 2.7 Bestimmung der HGF-Konzentration mittels ELISA .............................................. 27

2.7.1 Prinzip der Methode ............................................................................................... 28

II

2.8 Statistik ......................................................................................................................... 29 2.8.1 Auswertung ............................................................................................................. 29 2.8.2 Statistische Verfahren ............................................................................................. 29

3 Ergebnisse ................................................................................................................ 30

3.1 Ergebnisse der Gruppe Wundheilung ....................................................................... 30 3.1.1 Allgemeines ............................................................................................................ 30 3.1.2 Wundfläche ............................................................................................................. 31 3.1.3 Wundhöhe ............................................................................................................... 35 3.1.4 Wundbreite ............................................................................................................. 37 3.1.5 Makroskopische Beurteilung der Zielparameter der Gruppe Wundheilung .......... 39

3.2 Histologische Auswertungen der Gruppe Wundheilung .......................................... 41 3.2.1 Mikroskopische Betrachtung der Histologien ........................................................ 41

3.3 Ergebnisse der Gruppe Haarwachstum ..................................................................... 44 3.3.1 Allgemeines ............................................................................................................ 44 3.3.2 Nachwachsendes Haarkleid .................................................................................... 44 3.3.3 Makroskopische Beurteilung der Zielparameter der Gruppe Haarwachstum ........ 47

3.4 Histologische Auswertungen der Gruppe Haarwachstum ....................................... 50 3.4.1 Mikroskopische Betrachtung der Histologien ........................................................ 50 3.4.2 Statistische Auswertung der mikroskopischen Betrachtung der Histologien -

Kapillarneubildung ............................................................................................................. 52 3.4.3 Statistische Auswertung der mikroskopischen Betrachtung der Histologien –

Haarfollikel ......................................................................................................................... 54 3.5 ELISA-Auswertungen der Gruppe Haarwachstum ................................................. 55

4 Diskussion ................................................................................................................ 57

4.1 Allgemeines ................................................................................................................... 57 4.2 Validierung der Versuchsmodelle .............................................................................. 58 4.3 Wirkung von HGF in der Gruppe Wundheilung ..................................................... 63

4.3.1 HGF in der kutanen Wundheilung - Auswirkung auf die Wundgröße ................... 63 4.3.2 Makroskopische Veränderungen der Haut der Gruppe Wundheilung ................... 67 4.3.3 Histologisch sichtbare Veränderungen der Gruppe Wundheilung ......................... 68

4.4 Wirkung von HGF in der Gruppe Haarwachstum .................................................. 70 4.4.1 ELISA ..................................................................................................................... 70 4.4.2 Auswirkung von HGF auf das nachwachsende Haarkleid ..................................... 72 4.4.3 Histologisch sichtbare Veränderungen der Gruppe Haarwachstum ....................... 74

4.5 Ausblick ........................................................................................................................ 79 4.6 Therapeutische Perspektive ........................................................................................ 79

III

5 Zusammenfassung ................................................................................................... 82

Literaturverzeichnis ...................................................................................................... 84

Anhang ........................................................................................................................... 99

Danksagung ................................................................................................................. 105

Erklärung § 5 Abs. 1 zur Datenaufbewahrung ........................................................ 106

Lebenslauf .................................................................................................................... 107

IV

Abkürzungsverzeichnis

α Alpha

Aai Aqua ad injectionem (lat. = Wasser für Injektionszwecke)

ad libitum lat., nach Belieben

A. dest . Aqua destillata (lat. = destilliertes Wasser)

Arg Arginin

β Beta

Beob. Beobachtungen

bFGF basic Fibroblast Growth Factor

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

ca. circa

Ca2+ Calcium

cm Zentimeter

cm2 Quadratzentimeter

Co. KG Compagnie Kommanditgesellschaft

et al. et alii (lat. = und andere)

d Tag

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EGF Epidermal Growth Factor

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Fa. Firma

FGF Fibroblast Growth Factor

G Gauge

g Gramm

GF Gesichtsfeld

GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung

h Stunde

H2O2 Wasserstoffperoxid

HCl Chlorwasserstoff (=Wasserstoffchlorid)

HE Hämalaun und Eosin

HGF Hepatocyte Growth Factor

HRP Meerrettich-Peroxidase

V

IL-2 Interleukin-2

kDa Kilodalton

Min. Minute

ml Milliliter

MMPs Matrix Metalloproteinasen

µl Mikroliter

MW Mittelwert

N Normalität

NaCl Natriumchlorid (=Kochsalz)

n. Chr. nach Christus

ng Nanogramm

nm Nanometer

NRW Nordrhein-Westfalen

PBS Phosphate-Buffer-Solution (engl. = Phosphat-Puffer-Lösung)

PDGF Platelet Derived Growth Factor

pdHGF patient derived HGF (=Hepatocyte Growth Factor)

PF-4 Platelet Factor-4

pg Pikogramm

rF relative Luftfeuchtigkeit

rHGF rekombinantes HGF

rhPDGF-BB recombinant human Platelet Derived Growth Factor Isoform BB

SD Standardabweichung

TGF-β Transforming Growth Factor-β

TIMPs tissue inhibitor of metalloproteinases

TMB Tetramethylbenzidin

TNF-α Tumornekrosefaktor-α

U/min Umdrehungen pro Minute

Val Valin

v. Chr. vor Christus

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor

z. B. zum Beispiel

% Prozent

VI

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Struktur und biologische Funktion des reifen HGFs .................................. 8

Abbildung 2: Allschichtige Wunden auf dem Mausrücken mit semiokklusiver Folie

abgedichtet, links: mit pdHGF behandelte Wunden, rechts: mit NaCl behandelte

Wunden ................................................................................................................... 20

Abbildung 3: Allschichtige Wunden auf dem Mausrücken mit semiokklusiver Folie

abgedichtet, links: mit rHGF behandelte Wunden, rechts: mit NaCl behandelte

Wunden ................................................................................................................... 20

Abbildung 4: Areal (1cm2) auf dem rasierten Mausrücken zur Markierung der

Injektionsstelle ........................................................................................................ 23

Abbildung 5: MW mit SD der Gruppe Wundheilung für die Zielvariable Wundfläche,

aufgeschlüsselt nach Behandlungen und Perioden, * stat. Signifikanz (p<0.05) .... 32

Abbildung 6: Mittelwerte der Gruppe Wundheilung für die Zielvariable Wundfläche,

aufgeschlüsselt nach Behandlungen und Perioden ................................................. 33

Abbildung 7: Vergleich der Verteilungen der Wundflächen in den drei

Behandlungsgruppen über den zeitlichen Verlauf .................................................. 35

Abbildung 8: MW und SD der Gruppe Wundheilung für die Zielvariable Wundhöhe,


Abbildung 9: MW und SD der Gruppe Wundheilung für die Zielvariable Wundbreite,


Abbildung 10: Vergleich des Wundschlusses der Gruppe Wundheilung (Maßstab 1cm)

................................................................................................................................. 41

Abbildung 11: Histologie der mit pdHGF behandelten Gruppe mit lockeren, kurzen

Kollagenfasern und elastischer Dermis: Sirius Red-Färbung, 20fache

Vergrößerung .......................................................................................................... 42

Abbildung 12: Histologie der mit rHGF behandelten Gruppe mit plumpen, starren

Kollagenfasern und kompakter Dermis: Sirius Red-Färbung, 20fache

Vergrößerung .......................................................................................................... 43

Abbildung 13: Histologie der mit NaCl behandelten Gruppe mit lockeren, normal

langen Kollagenfasern und regelrechter Dermis: Sirius Red-Färbung, 20fache

Vergrößerung .......................................................................................................... 43

Abbildung 14: MW mit SD der Gruppe Haarwachstum, ermittelt aus Scoringverfahren,


VII

Abbildung 15: Mittelwerte der Gruppe Haarwachstum ermittelt aus Scoringverfahren

zur Messung des nachwachsenden Haarkleides, aufgeschlüsselt nach

Behandlungen und Perioden ................................................................................... 46

Abbildung 16: Vergleich des Haarwachstums der drei Behandlungsgruppen über den

zeitlichen Verlauf, Maßstab entspricht 1cm ............................................................ 49

Abbildung 17: Histologie der mit pdHGF behandelten Gruppe mit weiter

auseinanderliegenden Haarfollikeln und atrophem Follikelepithel: HE Färbung,

20fache Vergrößerung ............................................................................................. 51

Abbildung 18: Histologie der mit rHGF behandelten Gruppe mit dicht

aneinanderliegenden Haarfollikeln und proliferationsaktivem Follikelepithel: HE

Färbung, 20fache Vergrößerung ............................................................................. 51

Abbildung 19: Histologie der mit NaCl behandelten Gruppe mit nah

aneinanderliegenden Haarfollikeln und proliferationsaktivem Follikelepithel: HE

Färbung, 20fache Vergrößerung ............................................................................. 52

Abbildung 20: MW und SD der Gruppe Haarwachstum für die Zielvariable

Kapillarneubildung an Tag 19, * stat. Signifikanz (p<0.05) ................................... 53

Abbildung 21: MW und SD der Gruppe Haarwachstum für die Zielvariable

nachgewachsene Haarfollikel an Tag 19 ................................................................. 55

Abbildung 22: MW und SD der HGF-Konzentrationen der Gruppe Haarwachstum im

Serum der Behandlungsgruppen an Tag 19, * stat. Signifikanz (p<0.05) .............. 56

VIII

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Versuchsablauf - Gruppe Wundheilung ......................................................... 17

Tabelle 2: Zielgrößen für die Gruppe Wundheilung ....................................................... 19

Tabelle 3: Versuchsablauf - Gruppe Haarwachstum ...................................................... 20

Tabelle 4: Zielgrößen für die Gruppe Haarwachstum ..................................................... 22

Tabelle 5: Dehydrierung mittels aufsteigender Alkoholreihe ......................................... 25

Tabelle 6: Entparaffinierung mittels absteigender Alkoholreihe .................................... 25

Tabelle 7: Dehydrierung mittels aufsteigender Alkoholreihe – HE-Färbung ................. 26

Tabelle 8: Dehydrierung mittels aufsteigender Alkoholreihe – Sirius Red-Färbung ..... 26

Tabelle 9: Periodeneinteilung ......................................................................................... 31

Tabelle 10: Scoringverfahren zur Einteilung des nachwachsenden Haarkleides ............ 44

Tabelle 11: p-Werte der Behandlungen der Gruppe Haarwachstum für Periode 3 bis

Periode 5 .................................................................................................................. 47

Tabelle 12: Scoringverfahren nachwachsendes Haarkleid an Tag 19 ............................ 48

Tabelle 13: Anzahl der neugebildeten Kapillare der Gruppe Haarwachstum ................. 52

Tabelle 14: Anzahl der nachgewachsenen Haarfollikel der Gruppe Haarwachstum ...... 54

Tabelle 15: Periodeneinteilung inklusive Wundheilungsphasen .................................... 61

Tabelle 16: Studienvergleich in Bezug auf Beschleunigung der Wundheilung ............. 65

Tabelle 17: Studienvergleich in Bezug auf kompletten Wundschluss ............................ 65

Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Chronische Wunden

Chronische, schlecht heilende Wunden stellen weltweit ein immer größer werdendes

Problem dar, das überwiegend bei älteren Patienten vorkommt.

Im Zuge des demografischen Wandels steigt die Lebenserwartung der Bevölkerung

kontinuierlich an, wodurch auch die Anzahl immer älter werdender Patienten stetig zu-

nimmt. Nach Schätzungen des Statistischen Bundesamtes (2009) ist davon auszugehen,

dass im Jahre 2060 jeder dritte Einwohner Deutschlands älter als 65 Jahre und jeder

siebte Einwohner 80 Jahre und älter sein wird224.

Diese zunehmende Alterung der Gesellschaft hat direkte Auswirkungen auf die Häufig-

keit chronischer Grunderkrankungen. Infolgedessen ist auch mit einem verstärkten An-

stieg chronischer Wunden zu rechnen193,19.

Schon heutzutage führt dieses Krankheitsbild zu extrem hoher Morbidität und verur-

sacht nicht nur erhebliche Beeinträchtigungen in der Lebensqualität der betroffenen

Patienten, sondern zudem enorme sozioökonomische Kosten für das Gesundheitssys-

tem19,14.

Unterschiedlichen Schätzungen zufolge leiden allein in Deutschland ca. drei bis fünf

Millionen Menschen unter chronischen, schlecht heilenden Wunden26,112. Zudem ist

eine gravierende Zunahme der Inzidenz chronischer Wunden zu erwarten, da die Le-

benserwartung der deutschen Bevölkerung weiter ansteigt45. Die Inzidenz chronischer

Wunden in den westlichen Industrienationen beträgt gegenwärtig 1% bis 2%, jenseits

des 80. Lebensjahres verdoppelt sich diese Zahl sogar auf 4% bis 5%143,74.

Die jährlichen Gesamtkosten für die Therapie dieser Wunden betragen ungefähr zwi-

schen 2,15 und 3,25 Milliarden Euro190, was eine starke Belastung für das Gesund-

heitswesen bedeutet.

Dabei ist die Ätiologie gestörter Wundheilung vielfältig, zumeist jedoch eine Folge von

bereits bestehenden, chronischen Grunderkrankungen, vorrangig verursacht durch Dia-

betes mellitus, aber auch durch Gefäßerkrankungen wie chronisch venöse Insuffizienz

oder periphere arterielle Verschlusskrankheit35,221,157. Bei diesen Krankheitsbildern ist

das Wundmilieu durch eine Stoffwechseldysregulation und Schädigung von Mikro- und

Makrozirkulation gegenüber gesunden Patienten so verändert, dass es zu einer erhöhten

Infektanfälligkeit und einer verlangsamten Heilung kommt53.

Einleitung

2

Allein in Deutschland gibt es inzwischen ungefähr acht Millionen Menschen, die an

Diabetes mellitus erkrankt sind86, wovon etwa zwei bis zehn Prozent an einer chroni-

schen Wunde, wie beispielsweise dem diabetischen Fußsyndrom, leiden. Die Inzidenz

dieser Wundform liegt jährlich bei 2,2% bis 5,9%26 und auch hier steigt ihre Häufigkeit

kontinuierlich an23.

Vor dem Hintergrund der Krankheitsschwere und Morbidität schlecht heilender Wun-

den, der Komplexität ihrer Behandlung ebenso wie der demografisch bedingten Zunah-

me altersspezifischer Grundkrankheiten wird deutlich, dass die Forschungen zur Hei-

lung chronischer Wunden intensiviert werden müssen.

1.2 Physiologische und pathologische Wundheilung

Die physiologische Wundheilung ist ein komplexer Vorgang, der geregelten Abläufen

unterliegt und in den verschiedene zelluläre und extrazelluläre Bestandteile integriert

sind221,75,85. Der Wiederherstellungsprozess ist dabei abhängig von einem komplizierten

Zusammenspiel unterschiedlicher Zelltypen, wie beispielsweise Keratinozyten, Epithel-

zellen und Entzündungszellen. Dieser Prozess ist essentiell, um die Intaktheit des nor-

malen Gewebes wiederherzustellen131. Ihre Interaktion wird erheblich durch Wachs-

tumsfaktoren, Enzyme und Zytokine gesteuert, deren Signale unbedingt notwendig für

die Entzündungsreaktion sind133.

Bei der physiologischen Wundheilung unterscheidet man im Wesentlichen zwischen

Exsudations-, Proliferations- und Regenerationsphase, wobei die einzelnen Phasen zeit-

lich überlappend oder chronologisch geordnet in einer Wunde ablaufen können197,66,52.

Werden diese Heilungsvorgänge gestört oder unterbrochen, resultiert eine chronische,

schlecht heilende Wunde. Zugrunde liegt häufig eine multifaktorielle Ätiologie, für die

immer noch kein vollständiges Verständnis ihrer molekularen Mechanismen

besteht22,197,49.

Gesichert ist, dass bei schlecht heilenden Wunden eine beeinträchtigte Wundheilung

vorliegt, in der die Interaktion zwischen den einzelnen biologischen Prozessen gestört

ist145. Häufig ist ein pathologisches Wundmilieu, in dem das molekulare Gleichgewicht

zugunsten heilungshemmender Faktoren verschoben ist, kennzeichnend220,125. Als Folge

läuft der Heilungsprozess verzögert ab oder stagniert gänzlich49,52,221.

Definitionsgemäß wird zudem von einer chronischen Wunde ausgegangen, wenn diese

innerhalb eines bestimmten Zeitraums, meist innerhalb von vier bis zwölf Wochen, trotz

fachgerechter, konsequenter Therapie keine Heilungstendenzen aufzeigt74,46,244,37.

Einleitung

3

Zusätzlich zu den bereits genannten chronischen Grunderkrankungen haben auch lokale

Faktoren wie Ischämie156, erhöhter Gewebedruck24 oder Infektionen22 einen grundle-

genden Einfluss bei der Pathogenese schlecht heilender Wunden. Es entsteht ein avitaler

Wundgrund mit einem fibrotisch veränderten Wundrand, womit es an lokalen Voraus-

setzungen für eine ungestörte Wundheilung mangelt253,126.

In der Folge kommt es zu einer Einwanderung von inflammatorischen Zellen, vor allem

von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen. Diese wiederum setzen eine konstant

andauernde Entzündungsreaktion in Gang, indem sie die Induktion proinflammatori-

scher Zytokine (z. B. IL-2, TNF-α) einleiten50,212. Im Exsudat schlecht heilender Wun-

den sind häufig die wachstums- und heilungsfördernden Eigenschaften verschiedener

Faktoren vermindert. Zusätzlich finden sich dort nachweislich höhere Konzentrationen

an gewebeabbauenden Matrix Metalloproteinasen (MMPs) als in akuten

Hautdefekten88,241. Normalerweise dienen MMPs in der Wundheilung dem Abbau be-

schädigter extrazellulärer Bestandteile und veranlassen somit ein Auto-Débridement,

sprich eine Reinigung der Wunde.

In chronischen Wunden herrscht allerdings eine pathologische Überexpression an

MMPs258. Durch ihre erhöhte proteolytische Aktivität wirken sie beim Abbau von Mat-

rixproteinen mit und führen zu einer Abnahme der Wirkung von Wachstumsfaktoren.

Zusätzlich lassen sich erniedrigte Konzentrationen an Inhibitoren der Metalloproteina-

sen, beispielsweise von TIMPs, finden92,89,235. Der vermehrte Abbau von Wachstums-

faktoren mit dem einhergehenden Verlust ihrer Aktivität sowie das Ungleichgewicht

zwischen MMPs und TIMPs sind kennzeichnend für chronische Wunden. Als Konse-

quenz wird die Wundheilung gehemmt.

Die veränderten Konzentrationen und das resultierende Ungleichgewicht tragen wesent-

lich zur Chronifizierung der Wunde bei. Somit entsteht trotz Therapie der Grunderkran-

kung ein Wundmilieu, in dem keine strukturierte Re-Epithelialisierung und keine Aus-

bildung von Granulationsgewebe möglich sind. Aus diesem Grund ist die Entwicklung

neuartiger Therapiemaßnahmen zur Behandlung chronischer Wunden von immenser

Bedeutung.

1.3 Überblick der Therapie chronischer Wunden

Die Heilung von Wunden mit gestörtem Heilungsverlauf stellt ein Forschungsthema in

der Medizin dar. Bis heute ist es nicht gänzlich gelungen, ein ausreichendes Therapie-

Einleitung

4

konzept zu entwickeln. Oft resultiert eine langwierige und gelegentlich schmerzhafte

Behandlung, die häufig auch keine vollständige Heilung der Wunden herbeiführt.

Es existieren vielfältige Ansätze zur Beschleunigung der Wundheilung. Primäres Ziel

einer jeden Wundbehandlung ist die Schaffung eines optimalen Wundmilieus35.

Dabei reichen die Versuche, die Wundheilung zu verbessern, zeitlich weit zurück. Die

altägyptischen Dokumente Papyrus Edwin Smith (ca. 1700 v. Chr.) und Papyrus Ebers

(ca. 1500 v. Chr.) stellen die bisher ältesten bekannten Aufzeichnungen zur Wundbe-

handlung dar87. In dem Papyrus Ebers finden sich detaillierte Anweisungen zur topi-

schen Applikation von Honig, Fett und Wachs zur Behandlung von äußeren

Wunden208,180. Im antiken Griechenland hoben Hippokrates von Kos (ca. 460-377 v.

Chr.) und seine Anhänger erstmals den Unterschied zwischen einer akuten und einer

chronischen Wunde hervor, womit auch die Therapie dieser Wunden unterschiedlich

angegangen wurde58. Später beschrieb der Arzt Claudius Galenus (ca. 129-199 n. Chr.),

der in Rom als Wundarzt der Gladiatoren arbeitete, in seinem Werk „Ars medica“ den

Wundheilungsprozess, womit er damals einen großen Beitrag zur Wundversorgung leis-

tete211. Über die Jahrhunderte hinweg gewann die Erforschung neuer Behandlungsfor-

men immer mehr an Bedeutung. Entsprechend den historischen Erkenntnissen der grie-

chischen und römischen Gelehrten wurde versucht, chronische Wunden mit trockenen

Wundverbänden zu behandeln. Dieses Vorgehen gilt jedoch spätestens seit den Arbeiten

des Engländers George Winter als obsolet255 und ist dem modernen Konzept einer pha-

senadaptierten Therapie mit Schaffung eines feuchten Wundmilieus gewichen256,44.

Gemäß den unterschiedlichen Heilungsphasen werden heutzutage verschiedene Wund-

auflagen zur Versorgung chronischer Wunden eingesetzt.

Um das Wundgebiet sanieren zu können, wird versucht, die chronische Wunde in eine

frische Wunde zu überführen und zu reinigen. Des Weiteren erfolgt eine Konditionie-

rung des Wundgrundes, um Keimfreiheit zu ermöglichen und anschließend einen

Wundverschluss erzielen zu können.

Dabei stellt das chirurgische Débridement mit Entfernung von Nekrosen, Zelldetritus

und Bakterien eine effiziente Möglichkeit der Wundreinigung dar. Es existieren vieler-

lei Formen der Wundreinigung, wobei das radikale chirurgische Débridement die er-

folgreichste Therapie darstellt. Dieses fördert nachweislich die Wundheilung bei Ulzera

diabetischer Genese194,227.

Die Manipulation des Wundmilieus und seiner Inhaltsstoffe spielt ebenfalls eine we-

sentliche Rolle bei der Behandlung chronischer Wunden22. Beispielsweise hilft eine

Einleitung

5

Vakuumversiegelungstherapie bei der Entfernung von Wundsekret und fördert die

Durchblutung im Wundgebiet98.

Auch besteht die Möglichkeit der Defektdeckung größerer Wunden mit Hauttransplan-

taten oder mit Spalthaut.

Unterschiedliche Wundauflagen tragen zur Modulation des Milieus bei und entfernen

überschüssige Wundbestandteile. Diverse Studien der letzten Jahren haben zu einer zu-

nehmenden Differenzierung der lokalen Behandlungsmöglichkeiten beigetragen, bei-

spielsweise durch die Zugabe von Proteinaseinhibitoren240. Diese „aktiven“ Wundaufla-

gen führen zu einer Veränderung der Wundparameter und helfen das Mikromilieu der

Wunde zu verbessern. Ein weiterer Gegenstand der Forschung ist das „Tissue Enginee-

ring“, bei dem autolog gezüchtete Zellkulturen auf oder in die Wunde appliziert wer-

den130,263.

Trotz intensiver Bemühungen in der Erforschung neuer Behandlungsformen zur Thera-

pie chronischer Wundheilungsstörungen liefern diese bis dato teilweise unbefriedigende

Ergebnisse. Die Betreuung dieser Wunden bedarf immer noch aufwändiger Pflege und

stellt ein kostenintensives Problem dar.

Daher wird große Hoffnung auf die Applikation von Wachstumsfaktoren gelegt, da die-

se die Wundheilung durch Initiierung und Modulation verschiedener Prozesse positiv

beeinflussen können60,34,67.

1.4 Wachstumsfaktoren in der kutanen Wundheilung

Wachstumsfaktoren sind körpereigene, lösliche Polypeptide, die unterschiedliche Zell-

arten und Zielorgane auf verschiedenste Weise beeinflussen.

Sie tragen erheblich zur Differenzierung, Proliferation und Migration von Zellen bei

und sind somit bedeutsam für den Heilungsprozess102.

Es wurde eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren entdeckt, die einen erheblichen Beitrag

zur kutanen Wundheilung leisten. Dieser vielfältige Prozess, der sowohl molekulare als

auch zelluläre Vorgänge miteinander verbindet, wird zu einem großen Teil von Wachs-

tumsfaktoren gesteuert106,67. Als Antwort auf einen Reiz in der Wunde gebildet und

freigesetzt, sind endogene Wachstumsfaktoren ein wesentlicher Bestandteil bei der Ab-

folge der physiologischen Wundheilung83,118,113.

Hauptsächlich während der Exsudationsphase werden Wachstumsfaktoren sezerniert,

die chemotaktische Reize ausüben und die Zellproliferation steuern. Sie üben regenera-

Einleitung

6

tive Reize aus und tragen zur Re-Epithelialisierung sowie zur Angiogenese und zum

Aufbau von Granulationsgewebe während der Wundheilung bei251,213,36.

Aufgrund dieser möglichen positiven Auswirkungen auf die Wundheilung werden gro-

ße Erwartungen in die Therapie mit Wachstumsfaktoren gelegt. Die Erprobung einzel-

ner Wachstumsfaktoren zur Förderung von Wundheilung spielt hierbei eine essentielle

Rolle und könnte eine wirksame Ergänzung zur bisherigen Wundversorgung bedeuten.

Bedingt durch einen vermehrten enzymatischen Abbau von Wachstumsfaktoren mit

einhergehendem Funktionsverlust in chronischen Wunden, stellt die Applikation exo-

gener Wachstumsfaktoren ein wesentliches Forschungsthema dar215.

Zahlreiche experimentelle Untersuchungen wurden bereits initiiert und abgeschlossen,

die den Einfluss verschiedener Wachstumsfaktoren auf die Entwicklung chronischer

Wunden erforscht haben68,225.

Experimentell ließ sich belegen, dass Wachstumsfaktoren einen starken Wundheilungs-

impuls abgeben. In vitro Versuche an Fibroblasten zeigten, dass sich EGF, PDGF und

TGF-β positiv auf die Zellproliferation auswirken68,121. Die Beteiligung des Wachs-

tumsfaktors HGF an der Wundheilung wurde weitergehend untersucht, nachdem

Matsumoto et al. im Jahre 1991 beobachteten, dass dieser Wachstumsfaktor das Wachs-

tum und die Migration von Keratinozyten in vitro stimuliert136. Entdeckt wurde HGF

allerdings bereits schon 1984 bei Forschungsarbeiten von Nakamura et al. bezüglich

Leberregeneration163. Untersuchungen ergaben, dass die Proliferation von Zellen in

menschlichen Hautexplantaten durch eine Behandlung mit diversen Wachstumsfaktoren

gesteigert werden konnte13.

Exogen verabreichtes VEGF, ein potenter Regulator der Angiogenese, zeigte im diabe-

tischen Tiermodell eine Beschleunigung der Wundheilung in vivo64.

Da chronische Wunden diabetischer Genese ein bedeutendes Problem darstellen, exis-

tieren eine Vielzahl von klinischen Studien zur Behandlung dieser Wunden mit unter-

schiedlichen Wachstumsfaktoren. Beispielsweise konnten Untersuchungen an Patienten

den positiven Einfluss von topisch aufgetragenem PDGF auf chronische Wunden diabe-

tischer Genese belegen225,109. Bei Patienten mit chronisch diabetischen Fußulzera wurde

eine signifikante Verbesserung der Wundheilung durch das Applizieren des Wachs-

tumsfaktors EGF herbeigeführt236,195.

Der erste Wachstumsfaktor, der klinisch zugelassen wurde und als Medikament erhält-

lich ist, ist PDGF, ein thrombozytärer Wachstumsfaktor226,222. Er ist der einzige Wachs-

tumsfaktor, der in Deutschland eine Marktzulassung erhalten hat. Sein Wirkstoff ist

Becaplermin, ein rekombinanter humaner thrombozytärer Wachstumsfaktor-BB

Einleitung

7

(rhPDGF-BB), der zur Förderung der Wundheilung von diabetischen Ulzera in Europa

und den USA zugelassen und als Gel erhältlich ist192,12,70. Das Präparat ist unter dem

Handelsnamen Regranex® erhältlich. Die topische Applikation dieses Wirkstoffes auf

chronisch diabetische Wunden zusammen mit optimaler Wundbehandlung weist gute

Ergebnisse auf159,191.

Des Weiteren wurde in Deutschland unter dem Handelsnamen eurokinin® eine Mi-

schung aus Wachstumsfaktoren vertrieben. Die Wachstumsfaktoren wurden autolog aus

Patientenblut hergestellt und somit nicht rekombinant gewonnen. Dabei handelte es sich

um PDGF, TGF-β, bFGF, EGF und PF-4, die alle zur Familie der thrombozytären

Wachstumsfaktoren gehören. In Form einer wässrigen Lösung direkt auf chronische

Wunde gebracht, ließ sich nachweislich eine verbesserte Abheilung erzielen und die

Produktion von Granulationsgewebe wurde gefördert76. Jedoch wurde die Herstellung

eingestellt, da laut Hersteller die Hürden zur Zulassung des Produktes zu hoch gewesen

seien.

In den USA erlangte im Jahre 2001 der rekombinant hergestellte Wachstumsfaktor

bFGF eine klinische Zulassung als Spray für die Therapie verschiedener chronischer

Ulzera.

2005 wurde der rekombinante humane epidermale Wachstumsfaktor rhEGF eingeführt.

Unter dem Namen Regen-D™ ist das Präparat in Indien, Kenia, Thailand und der Ukra-

ine erhältlich, bis dato fehlt jedoch eine Zulassung für Europa. Als Gel auf diabetische

Fußulzera appliziert, zeigte sich in Untersuchungen eine Verbesserung der Wundhei-

lung153.

Obwohl in Studien erste Erfolge mit Wachstumsfaktoren erzielt werden konnten, ist ihr

klinischer Einsatz zur Verbesserung der pathologischen Wundheilung bisher eher ge-

ring.

Aktuelle Studien, welche die Erprobung einzelner Wachstumsfaktoren, aber auch die

kombinierte Applikation mehrerer Wachstumsfaktoren zur Verbesserung der Wundhei-

lung tiefergehend untersuchen, zeigen vielversprechende Resultate.

Dabei lieferte der Wachstumsfaktor HGF aussichtsreiche Ergebnisse bei der Förderung

der Wundheilung in experimentellen Versuchen und rechtfertigt eindringlicherer Unter-

suchungen.

Einleitung

8

1.5 Hepatocyte Growth Factor

Hepatocyte Growth Factor (=HGF) ist ein multipotenter, pleiotroper Wachstumsfaktor,

der einzigartige strukturelle Eigenschaften167,139,150 besitzt und über ein breites Wirk-

spektrum auf verschiedene Zelltypen verfügt27,178,161.

Erstmalig entdeckten Nakamura et al. im Jahre 1984 den Wachstumsfaktor HGF als

potentes Mitogen für reife Hepatozyten, als sie Studien zur Leberregeneration durch-

führten206,232. Nachdem an Ratten experimentell eine partielle Hepatektomie durchge-

führt worden war, bei der 2/3 der Leber reseziert wurden, ließen sich erhöhte Serum-

spiegel an HGF nachweisen163,165,164,189. Der Wachstumsfaktor konnte somit erstmals

isoliert und charakterisiert werden. Weitere experimentelle Untersuchungen schlossen

sich an, bei denen HGF aus dem Plasma von Ratten164, Hasen267 sowie aus menschli-

chem Plasma77 isoliert werden konnte.

HGF unterscheidet sich strukturell erheblich von anderen bisher bekannten Wachstums-

faktoren (siehe Abbildung 1).

Abbildung 1: Struktur und biologische Funktion des reifen HGFs (Quelle: modifiziert nach Nakamura T., Mizuna S.: The discovery of Hepatocyte Growth Factor (HGF) and its significance for cell biology, life sciences and clinical medicine, 2010162)

Einleitung

9

Von Mesenchymzellen zunächst als inaktive 90 kDa monomere Vorstufe produziert und

sezerniert271,204, wird HGF durch proteolytische Spaltung (an der Stelle zwischen

Arg494 und Val495) in seine biologisch wirksame Form überführt231,90,151. Letztere ist

ein heterodimeres Glykoprotein bestehend aus einer (55-69 kDa) α-Kette und einer (32-

36 kDa) β-Kette, die über eine Disulfidbrücke miteinander verknüpft sind174,72,250,94. Die

α-Kette enthält eine N-terminale Haarnadelschleife sowie vier Kringle-Domänen, wo-

hingegen die β-Kette stark einer Serinprotease ähnelt94,71. HGF gehört zu der Familie

der plasminogenähnlichen Wachstumsfaktoren, da seine Struktur der von Plasminogen

ähnelt152. Lokalisiert ist das heparinbindende Polypeptid HGF auf dem langen Arm des

menschlichen Chromosoms 7 (7q21.1)65,62,269,152.

Seine facettenreiche biologische Wirkung vermittelt das HGF-Polypeptid über die Bin-

dung an den membranständigen Tryosinkinaserezeptor Met2,16,181. Dieser Rezeptor wird

von Epithelzellen synthetisiert und konnte als Produkt des Protoonkogens c-met identi-

fiziert werden21,169,170. Somit kommt dem HGF-Met-Signalweg eine entscheidende Be-

deutung bei der epithelial-mesenschymalen Kommunikation zu, was einen zentralen

regulatorischen Mechanismus bei der Ausübung seiner Funktionen darstellt243.

Im Zusammenspiel mit dem transmembranen Rezeptor Met kann HGF seine umfang-

reichen Wirkungen entfalten und verschiedene biologische Prozesse miteinander ver-

netzen167,20,268. Als multifunktioneller Wachstumsfaktor übt HGF dabei Einfluss auf ein

großes Spektrum unterschiedlicher Zellen aus. Beispielsweise gehören neben Hepatozy-

ten vor allem Zellen epithelialen und endothelialen Ursprungs zu seinen Zielzellen15.

So wirkt HGF mitogen durch Stimulation des Zellwachstums39,161, motogen durch För-

derung der Zellmotilität28,248,229 sowie morphogen durch die Induktion der Ausbildung

dreidimensionaler, gewebeartiger Strukturen100,271,63.

Seine multiplen biologischen Funktionen sind für die Entstehung, Ausbildung und Rei-

fung parenchymatöser Organe erforderlich. Der Wachstumsfaktor HGF übernimmt eine

entscheidende Aufgabe während der Embryogenese, aber auch während der späteren

Entwicklung vieler verschiedener Organe223,247. Experimentelle Untersuchungen zeig-

ten, dass HGF relevanten Einfluss auf die Entwicklung des zentralen und des peripheren

Nervensystems ausübt129,230. Während der Embryogenese bewegt HGF Myoblasten zur

Migration, was vor allem wichtig für die Ausbildung der Muskulatur der Extremitäten

und des Zwerchfells ist17. Daneben wirkt HGF protektiv auf epitheliale sowie auf nicht-

epitheliale Organe, einschließlich Herz und Gehirn, durch die Induktion anti-

apoptotischer und anti-inflammatorischer Signale162,120,148. Durch die Interaktion mit

seinem Rezeptor Met kann HGF in der Zielzelle eine Hemmung der Apoptose bewir-

Einleitung

10

ken103,160,260,182. Seine Funktionen erstrecken sich zudem auf die Fähigkeit, Angiogene-

se48,203,134 ebenso wie Neovaskularisation von Gefäßen zu induzieren81,234,259.

Überdies hinaus zeigt sich, dass HGF nicht nur Auswirkungen auf die Reparatur von

Geweben und Organen, sondern auch auf die maligne Progression von Tumorzellen

haben kann242,138,99,205.

Zahlreiche Studien unterstreichen die vielschichtigen Eigenschaften von HGF. Klini-

sche Untersuchungen belegen, dass nach Verletzungen verschiedener Organe, wie z. B.

der Leber137,78, Niere105, Lunge261 oder des Herzens110 die HGF-Konzentrationen im

Patientenserum deutlich ansteigen und seine Produktion hochreguliert wird. Diese Tat-

sache verdeutlicht die Bedeutsamkeit von endogenem HGF für die Regeneration unter-

schiedlicher Organe.

Andere Studien weisen darauf hin, dass HGF die Funktion von Immunzellen reguliert,

beispielsweise von dendritischen Zellen und einer Reihe von T-Zellen207,183. Dieser Ef-

fekt könnte teilweise den zugrundeliegenden Mechanismus erklären, durch den HGF

seinen therapeutischen Einfluss auf Entzündungen ausübt.

Tierversuchsmodelle stellten die schwerwiegenden Folgen einer Neutralisation des

Wachstumsfaktors HGF dar und bestätigten abermals die Wichtigkeit des HGF-Met-

Signalweges in der Entwicklung und Differenzierung von Organsystemen. So bewirkt

die gezielte Deletion von HGF in der fetalen Entwicklung von Knockoutmäusen tief-

greifende Defekte der Leber, Plazenta und Skelettmuskulatur mit einhergehender Hy-

poplasie dieser Organe214,239,128.

Weiterführend wurde im Mausmodell belegt, dass ein kompletter Verlust von HGF und

seinem Rezeptor Met letal endet32.

Ferner wurde der Einfluss des Wachstumsfaktors HGF auf die Wundheilung der Haut

untersucht. Experimentelle Studien bewiesen zunächst, dass HGF die Migration und

Proliferation von Keratinozyten und Melanozyten in vitro stimuliert115,142,111,104. Über-

dies hinaus fördert HGF den Katabolismus extrazellulärer Matrixbestandteile, indem es

verschiedene Plasminogenaktivatoren in Keratinozyten aktiviert209. Es konnte belegt

werden, dass HGF als essentieller Faktor bei der physiologischen Regeneration der

menschlichen Haut wesentlich an der kutanen Wundheilung beteiligt ist174. Im Tierver-

suchsmodell zeigte sich in der Epidermis von Ratten eine gesteigerte Expression von

HGF und Met in epidermalen Keratinozyten während des Heilungsprozesses41. In vitro

Untersuchungen von Nayeri et al. (2007) an einer Epithelzelllinie der murinen Haut

zeigten, dass rHGF in der Lage ist, die Motilität der Epithelzellen und damit die Wund-

heilung zu beschleunigen173. Zuvor beobachteten Nusrat et al. (1994) in vitro an intesti-

Einleitung

11

nalen Epithelzellen, dass HGF den Wundschluss positiv fördert, indem es die Migration

verschiedener Zellen beeinflusst181. Nakanishi et al. (2002) zeigten an Hautwunden von

Ratten, dass ein Gentransfer von HGF die Neovaskularisation und Re-Epithelialisierung

während der Wundheilung unterstützt168.

Diese Ergebnisse gaben Anlass zu weiteren, tiefgreifenderen Untersuchungen über die

Auswirkungen des HGF-Met-Signalweges auf Wunden.

So ließen sich in mehreren Studien erhöhte Konzentrationen von endogenem HGF in

akuten, aber auch in chronischen Wunden nachweisen. Es konnte belegt werden, dass

HGF und sein Rezeptor Met als Antwort auf chronische Hautwunden verstärkt im Se-

rum sowie in der Wundflüssigkeit exprimiert werden40,175. Trotz vermehrter Expression

von HGF zeigen chronische Wunden hingegen eine fehlende Aktivierung des Met-

Rezeptors, weshalb die Wundheilung stagniert. Ursächlich hierfür sind nachweislich

erhöhte Konzentrationen an Proteinasen in chronischen Wunden, die zur Proteolyse und

damit zur Inaktivierung von HGF führen27.

Weiterhin konnte die unverzichtbare Rolle des HGF-Met-Signalweges in der Reparatur

von Wunden durch definierte Neutralisation von HGF und seinem Rezeptor Met expe-

rimentell belegt werden. Als Antwort auf Hautwunden zeigten Mäuse, bei denen in Ke-

ratinozyten gezielt das Gen für c-Met ausgeschaltet wurde, eine stark verzögerte Re-

Epithelialisierung32. Dabei schlossen ihre Wunden meist gar nicht oder erst verspätet.

Überdies hinaus kam es zu einer verminderten kutanen Wundheilung und Geweberege-

neration mit reduzierter Ausbildung von Granulationsgewebe265. Zwar ist bekannt, dass

auch andere Wachstumsfaktoren die Re-Epithelialisierung unterstützen, aber das

Mausmodell zeigte, dass diese den Verlust des HGF-Met-Signalweges nicht kompensie-

ren können32,85. Im Gegensatz dazu ist bei transgenen Mäusen, die eine Überexpression

an HGF und Met aufweisen, die Bildung von Granulationsgewebe und die Angiogenese

während der Wundheilung beschleunigt234.

Erste Versuche zur Erprobung des Einflusses von exogen appliziertem HGF auf chroni-

sche Wunden wurden bereits am Mausmodell sowie in klinischen Studien durchgeführt.

Topische Applikation von exogenem HGF auf durchblutungsgestörte Wunden be-

schleunigte die Bildung von Granulationsgewebe, die Angiogenese sowie die Re-

Epithelialisierung und induzierte die Neovaskularisation11,81,155.

In einem diabetischen Mausmodell ließ sich nachweisen, dass HGF die Migration und

Proliferation von Monozyten, Keratinozyten und Endothelzellen in die Wunde be-

schleunigt11. Gefördert wurde die Wundreparatur dabei durch die Applikation von re-

kombinant hergestelltem HGF. Diese Behandlung beeinflusste die Wundheilung vor-

Einleitung

12

teilhaft und zeigt abermals, dass HGF eine Schlüsselfunktion während der Regeneration

chronischer Wunden zukommt.

Weiterführende Untersuchungen am diabetischen Tiermodell, welche die Auswirkun-

gen von rekombinant hergestelltem HGF auf die Wundheilung betrachteten, belegten

die bereits oben genannten Ergebnisse11,264.

Im Jahre 2002 wurde die erste klinische Studie mit rekombinant hergestelltem HGF

durchgeführt, um den physiologischen und therapeutischen Einfluss von HGF auf chro-

nische Wunden nachzuweisen. Hierfür wurde in einer Pilotstudie HGF lokal in Gelform

auf nicht heilende Ulzera von 11 älteren Patienten appliziert176. Es ließ sich eine verbes-

serte Perfusion der Mikrozirkulation finden, was die Heilung der Wunden beschleunig-

te. Jedoch fehlte bei dieser Studie eine Placebo-kontrollierte Gruppe zum Vergleich. In

einer späteren Untersuchung konnten diese Ergebnisse nicht ausreichend wiederholt

werden172.

Eine Phase-I/II Studie zur topischen Applikation von rekombinant hergestelltem, huma-

nem HGF zur Behandlung von chronisch venösen Beinulzera befindet sich derzeit in

Gang114,167. Diverse Studien unterstreichen die einzigartigen, multiplen Funktionen des

Wachstumsfaktors HGF ebenso wie seinen essentiellen Beitrag zur Wundheilung. Die

folgenschweren Konsequenzen seines Fehlens und seine multiplen Auswirkungen auf

verschiedene Zielzellen signalisieren, dass der HGF-Met-Signalweg unabdinglich für

das Überleben, das Wachstum und die Regeneration von Zellen und Organen ist.

Einleitung

13

1.6 Zielsetzung

Trotz zahlreicher aktueller Studien zur Verbesserung der Wundheilung chronischer auf

Wunden ist es bis dato immer noch nicht gelungen diese vollständig zu heilen. Daher

sind weiterführende Experimente auf diesem Gebiet von enormer Relevanz. Möglich-

erweise nehmen dabei Analysen zum Einfluss des Wachstumsfaktors HGF auf die ku-

tane Wundheilung großen Stellenwert ein.

Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen kommen zwei verschiedene Formen des

Wachstumsfaktors HGF zur Anwendung. Zum einen wurde für die Versuchsgruppe

patient derived HGF benutzt, also aus Patientenserum gewonnenes HGF (pdHGF). Zum

anderen diente rekombinant hergestelltes rHGF als Positivkontrolle. Die Mäuse der

Vergleichsgruppe wurden mit NaCl behandelt. Auf der Grundlage des derzeitigen Wis-

sensstandes, einschließlich klinischer Erkenntnisse, konnte bereits belegt werden, dass

rHGF eine positive Auswirkung auf die Wundheilung besitzt264. Jedoch fehlen immer

noch Untersuchungen, die den Einfluss von pdHGF auf die Wundheilung in vivo be-

trachten.

Beide Zustandsformen des Wachstumsfaktors unterscheiden sich in der Art ihrer Gly-

kosylierung und in ihrem Gewicht, wobei pdHGF das schwerere Molekulargewicht

aufweist, was auf seine Bindung mit heparinsulfatartigen Molekülen zurückzuführen

ist262. Diese Tatsachen sind insofern von Bedeutung, da sie die Stabilität des Wachs-

tumsfaktors beeinflussen. Es ist anzunehmen, dass pdHGF als natürlich gewonnene

Form des Wachstumsfaktors beständiger und widerstandsfähiger als rHGF ist.

Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, nachzuweisen, inwiefern pdHGF einen positiven

Effekt auf die kutane Wundheilung ausübt. Zu diesem Zweck wird die Wirksamkeit des

pdHGFs in zwei Versuchsmodellen untersucht. Der Einfluss auf den Wundschluss wird

an einem diabetischen Mausmodell als zentrales Beurteilungskriterium für die Zellrege-

neration bestimmt. In einer weiteren Untersuchung dient das vollständige Nachwachsen

des Haarkleides der Versuchstiere als Parameter für die geförderte Zellproliferation. Als

Positivkontrolle wird dabei rHGF herangezogen, da seine Wirkung bereits belegt ist264.

Gelingt in den Untersuchungen zu pdHGF eine positive Beeinflussung der Wundhei-

lung und der Geweberegeneration, können die Ergebnisse dazu weiterverwendet wer-

den, um bei einer Vielzahl von Patienten mit chronischen Wunden eine Reduktion von

Morbidität und Schmerzen herbeizuführen.

Material und Methoden

14

2 Material und Methoden

2.1 Tierversuche

2.1.1 Wachstumsfaktor und Vergleichsgruppe

Um den Einfluss des Wachstumsfaktors HGF in vivo auf die Wundheilung sowie auf

das Haarwachstum zu untersuchen, wurden zwei verschiedene Versuchsmodelle ver-

wendet. Es wurde der Einfluss des aus Patientenserum gewonnenen pdHGFs (patient

derived HGF) gegen die Wirkung des rekombinant hergestellten Wachstumsfaktors

rHGF untersucht. Dabei diente rHGF als Positivkontrolle, da seine Wirksamkeit in Un-

tersuchungen bereits nachgewiesen wurde264. Als Negativkontrolle diente NaCl (Natri-

umchlorid). Die Mäuse, die mit NaCl behandelt wurden, dienten als Vergleichsgruppe,

im Sinne einer Sham-Gruppe.

Der Wachstumsfaktor pdHGF wurde von der Firma Octapharma GmbH, Langenfeld,

Deutschland zur Verfügung gestellt, rHGF wurde von der Firma PeproTech, London,

England geliefert. Der rekombinant hergestellte Wachstumsfaktor wurde dabei aus In-

sektenzellen gewonnen ((BTI-Tn-5B1-4) High-5 Insect Cells).

Humanes HGF und murines HGF sind kreuzreaktiv. Ihre Rezeptorbindungsstellen äh-

neln sich sehr, weshalb sie sich in ihrer biophysiologischen Wirkung auf verschiedene

Spezies gleichen. Ihre Aminosäuresequenzen ähneln sich jeweils zu 91% bis 98%119,124.

In der Literatur findet sich eine Vielzahl von Studien, welche die Auswirkungen von

humanem HGF auf Mauszellen beschreiben245,51,29. Diese Grundlagen ermöglichen den

Transfer auf menschliche Zellen und lassen weiterführende Untersuchungen im Bereich

des Wachstumsfaktors HGF zu.

2.1.2 Versuchstiere

Für die Versuche standen zwei verschiedene Mausstämme zur Verfügung. Die Auswir-

kungen des Wachstumsfaktors auf die Wundheilung wurden mit Hilfe eines diabeti-

schen Mausmodells getestet. Hierfür wurden sechs Wochen alte, weibliche Mäuse des

Stammes C57BL/KS (=BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J) der Harlan Winkelmann GmbH

(Borchen, Deutschland) als Versuchstiere herangezogen. Diese Tiere dienten als Modell


15

für die Stoffwechselerkrankung Diabetes Mellitus Typ II und weisen eine belegte Be-

einträchtigung ihrer Wundheilung auf238. Dabei ist die Verwendung diabetischer Mäuse

für die Erforschung eines Wundheilungsmodells besonderes vorteilhaft, da viele Patien-

ten mit chronischen Wunden ebenfalls an einer Stoffwechselstörung, wie beispielsweise

Diabetes mellitus, leiden. Durch den Einsatz eines diabetischen Mausmodells konnten

die spezifischen Effekte des Wirkstoffes HGF in seinem Indikationsgebiet erforscht

werden.

In einem weiteren Versuchsmodell wurde der Einfluss des Wachstumsfaktors HGF auf

das Haarwachstum als Ausdruck der Regeneration und Proliferation analysiert. Diese

Untersuchungen erfolgten an sechs Wochen alten, weiblichen C57BL/6 Mäusen

(Charles River Labors, Sulzfeld, Deutschland).

Alle Mäuse beider Versuchsreihen hatten ein Körpergewicht von ca. 18g bis 20g.

2.1.3 Tierhaltung

Die Tiere wurden in Gruppen von fünf Mäusen in je einem Makrolonkäfig des Typs II

oder III mit Filterhauben gehalten. Als Einstreu wurde entkeimtes, entstaubtes Weich-

holzgranulat (Lignocell [¾ S], Fa. J. Rettenmeier & Söhne, Rosenberg, Deutschland)

verwendet, welches einmal wöchentlich gewechselt wurde. Futter (Haltungsfutter:

V1534-300, autoklavierbar, Ratte/Maus-Haltungsfutter, 10mm Pellets, Fa. ssniff, Soest,

Deutschland) sowie Wasser (keimarm durch: Aktivkohlefilterung, Ozonisierung, UV-

Bestrahlung und Ansäuerung auf pH 4, aus Makrolon-Trinkflaschen) standen ad libitum

zur Verfügung.

Die Versuchstiere wurden geregelten zwölfstündigen Hell-Dunkel-Zyklen mit einer

Lichtphase von 7.00h bis 19.00h in der S1-Tierhaltung ausgesetzt. Die Tierkäfige stan-

den in abgeschlossenen Räumen bei einer Umgebungstemperatur von 21 ± 2°C, einer

Luftfeuchtigkeit von 55 ± 10% rF sowie einem 8-15fachen Luftwechsel pro Tag. Alle

Versuche wurden vom Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW

genehmigt und unter dem Aktenzeichen: 8.87-50.10.35.08.289 durchgeführt.

2.2 Operative Interventionen

Sämtliche operative Interventionen erfolgten im Institut für Versuchstierkunde sowie

Zentrallaboratorium für Versuchstiere der RWTH Aachen.


16

2.2.1 Anästhesie

Vor Beginn der Versuchsdurchführung wurde jede Maus zunächst in einer Äther-

Kurznarkose mit dem Inhalationsanästhetikum Isofluran (Forene®, Abott GmbH & Co.

KG, Wiesbaden, Deutschland) betäubt.

Zur weiteren Narkosevertiefung diente eine Kombinationsnarkose aus 0,4ml Ketamin

(Ketamin® 10%, CEVA Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Deutschland) und 0,1ml

Xylazin (Xylazin 2% Bernburg, Medistar Arzneimittel-Vertrieb GmbH, Holzwickede,

Deutschland) mit 3,5ml isotoner Natriumchlorid-Lösung (Isotonische Natriumchlorid-

Lösung, DeltaSelect GmbH, Dreieich, Deutschland). Von dieser Stammlösung wurde

jeder Maus 0,2ml (200µl) intraperitoneal injiziert. Anschließend wurde den Tieren an

ihrer Schwanzspitze ein definierter Schmerzreiz mittels einer armierten Adson-Pinzette

gesetzt. Dieses Vorgehen stellte sicher, dass bei den Mäusen eine vollständige Analge-

sie sowie Anästhesie eingetreten war.

Um dem Hypothermierisiko der narkotisierten Tiere entgegenzuwirken, wurden diese

während des Eingriffes auf eine Wärmeplatte gelegt. Diese Platte ermöglichte die Kon-

stanthaltung der Körpertemperatur zwischen 36°C und 37°C über den gesamten Ver-

suchszeitraum.

2.3 Versuchsablauf

2.3.1 Herstellen der HGF-Lösungen

Um zu untersuchen, ob pdHGF und rHGF verschiedene Auswirkungen auf die Wund-

heilung sowie auf das Haarwachstum haben, wurde eine pdHGF-Lösung in der Kon-

zentration 5ng/ml sowie ebenfalls eine rHGF-Lösung in gleicher Konzentration herge-

stellt.

In beiden Versuchen wurden einheitlich 5ng/ml verwendet, da sich in Vorversuchen des

Herstellers herausgestellt hatte, dass diese Mengenangabe die optimale Konzentration

zur Durchführung der Versuche darstellte.

Das aus menschlichem Patientenserum gewonnene pdHGF wurde vom Hersteller so-

wohl als Lyophilisat als auch als Nanofiltrat zur Verfügung gestellt. Dabei lag das Lyo-

philisat als gefriergetrocknetes, festes Produkt vor, welches vor Gebrauch in Aqua ad

injectionem (Aai) gelöst werden musste. Beim Nanofiltrat befand sich pdHGF bereits in

gelöster Form. Da zwischen Lyophilisat und Nanofiltrat kein Unterschied in der Wir-


17

kung bestand, war es unwesentlich, welche Zubereitungsform zur Herstellung der

pdHGF-Lösung verwendet wurde.

Zur Herstellung der rHGF-Lösung lag rHGF während der gesamten Versuche lediglich

als Lyophilisat einer einzelnen Charge vor.

2.3.2 Versuch 1: Wundheilung unter Einfluss von pdHGF und rHGF

Tabelle 1: Versuchsablauf - Gruppe Wundheilung

Versuchsablauf - Gruppe Wundheilung Behandlung Anzahl

Beob. Versuchstage

d1 d2 - d6 d7 - d19

NaCl Vergleichsgruppe 19

• Anästhesie • Rasur • Wundsetzung • Injektion von

NaCl • Wundverschluss • Dokumentation

• Anästhesie • Injektion von

NaCl • Wundverschluss • Dokumentation

• Dokumentation jeden zweiten Tag

pdHGF Versuchsgruppe 10


pdHGF • Wundverschluss • Dokumentation


pdHGF • Wundverschluss • Dokumentation


rHGF Positivkontrolle 9


rHGF • Wundverschluss • Dokumentation


rHGF • Wundverschluss • Dokumentation


Tabelle 1 zeigt übersichtlich die Durchführung des 19-tägigen Versuches für die Gruppe

Wundheilung. Für diesen ersten Versuch, der den Wundverschluss unter Einfluss des

Wachstumsfaktors HGF erforschte, erfolgte nach vollständiger Anästhesie der Tiere die

Rasur ihres Rückens mit Hilfe eines Elektrorasierers (AESCULAP® Favorita II, Aescu-

lap AG & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland) auf einer Wärmeplatte. Der nackte Rücken

wurde wiederholt mit Octenisept® (Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt, Deutschland)

desinfiziert und die Maus in Bauchlage auf den Operationstisch gelegt.


18

Für das Studiendesign wurde zur Gewinnung statistisch auswertbarer Daten eine Grup-

pengröße von insgesamt 20 diabetischen Mäusen herangezogen. Um den Einfluss von

pdHGF und rHGF zu testen und vergleichend darstellen zu können, wurden die Ver-

suchstiere in zwei Gruppen unterteilt. Dabei bestand jede Gruppe aus insgesamt zehn

Mäusen, wobei die eine Gruppe mit pdHGF und NaCl, die andere mit rHGF und NaCl

behandelt wurde. Im Verlauf der Studie verstarb eine mit rHGF behandelte Maus. Diese

wurde nicht mit in die folgenden statistischen Auswertungen einbezogen.

Im Rahmen des Studienablaufs wurden bei allen Tieren aus beiden Untersuchungsgrup-

pen zunächst sechs allschichtige Wunden auf dem Rücken angebracht. Diese Wunden

umfassten die Epidermis, die Dermis sowie das subkutane Fettgewebe der Mäuse. Diese

Art der Wundsetzung entsprach dabei dem Modell der „full-thickness wounds“, das in

diversen anderen Studien erfolgreich zur Überprüfung des Wundschlusses herangezo-

gen wird42,264,10. Aufgrund der Hautspannungslinien der murinen Haut, verzogen sich

die Wunden leicht, weshalb sich die Wundgrößen teilweise geringfügig voneinander

unterschieden. Abbildung 2 und Abbildung 3 zeigen beispielhaft das Resultat der

Wundsetzung.

Jeder Maus der ersten Gruppe wurden auf je drei parallel untereinander liegende Haut-

wunden 0,2ml der 5ng/ml pdHGF-Lösung infiltriert, auf die verbleibenden Wunden

wurde NaCl als Negativkontrolle gegeben. Analog dazu wurde bei den Tieren der zwei-

ten Gruppe verfahren, hierbei wurden jedoch 0,2ml der 5ng/ml rHGF-Lösung als Posi-

tivkontrolle auf drei untereinander liegende Hautwunden aufgetragen, auf die übrigen

Wunden wurde NaCl appliziert. Somit konnten die Wirkstoffe direkt auf den Rücken

der Mäuse miteinander verglichen werden. Um eine Wundinfektion sowie Wunddehis-

zenz zu vermeiden, wurden die Wunden zunächst mit selbstklebendem, durchsichtigem

Verbandsmaterial (Opsite Flexifix®, Fa. smith&nephew, England) verschlossen, wel-

ches täglich gewechselt und nach sechs Tagen völlig weggelassen wurde. Nach Beendi-

gung des Versuches wurden die Mäuse in vorbereitete Käfige überführt.

Für den Versuch der Gruppe Wundheilung wurden zur Überprüfung der aufgestellten

Hypothese, dass pdHGF die Wundheilung beschleunigt, zunächst verschiedene Zielgrö-

ßen definiert. Zum einen wurden die Wunden danach begutachtet, mit welcher Ge-

schwindigkeitsrate sie eine komplette Re-Epithelialisierung erreichten. Diesbezüglich

stellte das kontinuierliche Ausmessen der Wunden einen hilfreichen Parameter dar.

Zum anderen war die Zeitdauer bis ein vollständiger Wundverschluss erreicht worden

war von relevanter Bedeutung. Zudem wurden am letzten Versuchstag Hautproben ent-


19

nommen, welche unter histomorphologischen Gesichtspunkten auf strukturelle Verän-

derungen begutachtet wurden (siehe Tabelle 2).

Tabelle 2: Zielgrößen für die Gruppe Wundheilung Zielgröße 1 Geschwindigkeitsrate der Re-Epithelialisierung

Zielgröße 2 Zeitdauer bis zum vollständigen Wundverschluss

Zielgröße 3 Histologische Veränderungen der Hautstruktur am Versuchsende (d19)

Bei allen Versuchsgruppen erfolgte eine regelmäßige Ausmessung der Wunden mit

Hilfe eines Millimeterlineals sowie eine Dokumentation der Wunden mittels standardi-

sierter Fotografie. Alle Wunden wurden sowohl in einer Übersichtsaufnahme als auch

jede der sechs Wunden separat und aus standardisiertem Abstand fotografiert. Diese

Fotografien wurden anschließend mit dem Bildbearbeitungsprogramm Adobe PhotoS-

hop CS3® (Adobe Systems Incorporated, USA) am Computer hinsichtlich der Zielpa-

rameter Wundfläche, Wundhöhe und Wundbreite morphometrisch ausgemessen. Die

erhobenen Daten dienten im weiteren Verlauf den statistischen Auswertungen. Dieses

Verfahren wurde über den gesamten 19-tägigen Versuchszeitraum angewandt.

Die Applikation des Wachstumsfaktors und der Negativkontrolle erfolgte weiterführend

an insgesamt sechs aufeinanderfolgenden Tagen. Danach wurde der Wundverschluss

regelmäßig durch Vermessung der Wundgröße und mittels Fotografie dokumentiert.

Dieser Versuch endete nach 19 Tagen durch Tötung der Versuchstiere mittels einer

Überdosis Ketamin/Xylazin. Anschließend wurde das gesamte Areal der zu Versuchs-

beginn gesetzten Wundfläche exzidiert. Von dieser Hautbiopsie wurde nachfolgend ein

repräsentativer Streifen entnommen, welcher zur histologischen Auswertung mit HE

und Sirius Red gefärbt wurde.


20

Abbildung 2: Allschichtige Wunden auf dem Mausrücken mit semiokklusiver Folie abgedichtet, links: mit pdHGF behandelte Wunden, rechts: mit NaCl behandelte Wunden

Abbildung 3: Allschichtige Wunden auf dem Mausrücken mit semiokklusiver Folie abgedichtet, links: mit rHGF behandelte Wunden, rechts: mit NaCl behandelte Wunden

2.3.3 Versuch 2: Haarwachstum unter Einfluss von pdHGF und rHGF

Tabelle 3: Versuchsablauf - Gruppe Haarwachstum

Versuchsablauf - Gruppe Haarwachstum Behand-lung

An-zahl Beob.

Versuchstage d1 d2 - d6 d7 - d19

NaCl Vergleichs-

gruppe 19

• Anästhesie • Rasur • Injektion von

NaCl • Dokumentation


NaCl • Dokumentation


pdHGF Versuchs-

gruppe 10


pdHGF


pdHGF • Dokumentation



21

• Dokumentation

rHGF Positivkon-

trolle 9


rHGF • Dokumentation


rHGF • Dokumentation


Tabelle 3 gibt den Versuchsablauf für die Gruppe Haarwachstum wieder. In diesem

zweiten Versuch wurde die Haarwachstumsrate nach Injektion des Wachstumsfaktors

als Beurteilungskriterium für die geförderte Zellregeneration und Proliferation festge-

halten.

Die Versuchstiere der Gruppe zur Untersuchung des Haarwachstums wurden ebenfalls

nach dem gleichen Narkoseschema wie bei der Gruppe Wundheilung anästhesiert. Im

Anschluss an die Narkose, wurde im Rahmen des Studienablaufs das Fell der Mäuse im

Rückenbereich mit Hilfe eines Elektrorasierers (AESCULAP® Favorita II, Aesculap

AG & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland) entfernt. Um die Versuchstiere während dieses

Arbeitsschrittes vor Auskühlung zu schützen, wurden sie unverzüglich nach Rasur auf

eine Wärmeplatte gelegt. Somit wurde eine konstante Körpertemperatur gewährleistet.

Das nackte Hautareal wurde mit dem Antiseptikum Octenisept® (Schülke & Mayr

GmbH, Norderstedt, Deutschland) mehrfach desinfiziert und die Maus in Bauchlage auf

einen Operationstisch gelegt. Mit Hilfe eines Hautmarkierungsstiftes (Squeeze-Mark®,

Porex Surgical, Inc., Newnan, USA) wurde auf dem Rücken der Maus ein ca. 1cm2 gro-

ßes Quadrat eingezeichnet. Dieses Areal diente als Markierungshilfe für die nachfol-

genden Injektionen.

Um nun den unterschiedlichen Einfluss von pdHGF, rHGF sowie von NaCl auf die

Haarwachstumsrate zu beurteilen, wurden die Mäuse in drei verschiedene Untersu-

chungsgruppen eingeteilt. Das Studiendesign sah eine Gruppengröße von insgesamt 30

Versuchstieren zur Versuchsdurchführung vor, sodass statistisch relevante Aussagen

getroffen werden konnten. Dabei bestand jede Gruppe aus einer Anzahl von jeweils

zehn Mäusen. Die Wahl der Gruppengröße erfolgte nach Durchsicht der gängigen Lite-

ratur sowie nach Vorgabe des Instituts für Medizinische Statistik der RWTH Aachen.

Da während der Versuchsdurchführung in allen drei Behandlungsgruppen jeweils eine

Maus verstarb, wurde in den statistischen Auswertungen von einer Gruppengröße von

insgesamt neun Versuchstieren pro Gruppe ausgegangen. Zunächst wurden jeder Maus

der pdHGF-Gruppe 0,2ml einer 5ng/ml pdHGF-Lösung subkutan in das Versuchsareal

injiziert. Der zweiten Positivkontrollgruppe wurden 0,2ml einer 5ng/ml rHGF-Lösung


22

subkutan in das vormarkierte Hautareal gespritzt. Das bedeutete, dass jedem Versuchs-

tier täglich 1ng HGF subkutan injiziert wurde.

Bei den Mäusen der Negativkontrollgruppe bestand ein analoges Vorgehen. Diese Tiere

wurden jedoch mit 0,2ml 0,9%igem NaCl behandelt. Danach erfolgte bei allen Ver-

suchsgruppen eine Fotodokumentation des 1cm2 großen Areals und die Überführung in

vorbereitete, frische Makrolonkäfige. Abbildung 4 zeigt am Beispiel einer Maus die

eingezeichnete quadratische Fläche auf dem rasierten Mausrücken.

Diese Prozedur wurde an insgesamt sechs aufeinanderfolgenden Tagen wiederholt.

Um bei der Gruppe Haarwachstum zu kontrollieren, ob der Wachstumsfaktor pdHGF

das Haarwachstum beschleunigt, wurden zunächst verschiedene Zielgrößen definiert.

Sowohl die Geschwindigkeitsrate des nachwachsenden Haarkleides als auch die gesam-

te Zeitdauer bis zum vollständig nachgewachsenen Haarkleid waren dabei von Interes-

se. Am letzten Versuchstag entnommene Hautbiopsien dienten als Grundlage für histo-

morphologische Untersuchungen. Zusätzlich wurde am letzten Versuchstag eine Herz-

punktion zur Blutgewinnung durchgeführt, um aus dem Serum der Mäuse mit Hilfe

einer sich anschließenden ELISA-Testung HGF-Konzentrationen zu bestimmen (siehe

Tabelle 4).

Tabelle 4: Zielgrößen für die Gruppe Haarwachstum Zielgröße 1 Geschwindigkeitsrate des nachwachsenden Haarkleides

Zielgröße 2 Zeitdauer bis zum vollständig nachgewachsenen Haarkleid

Zielgröße 3 Histologische Veränderungen der Haarstruktur am Versuchsende (d19)

Zielgröße 4 HGF-Konzentration im Blut mittels ELISA am Versuchsende (d19)

Um die Messung des nachwachsenden Haarkleides exakt bestimmen zu können, wurde

das Haar in standardisiertem Abstand und unter Zuhilfenahme eines danebenliegenden

Maßstabs zur Größendokumentation fotografiert. Nach dem sechsten Versuchstag war

die Behandlung mit dem Wachstumsfaktor abgeschossen und es erfolgte in regelmäßi-

gen Zeitabständen eine Fotodokumentation zur Beurteilung der nachwachsenden Haar-

länge.

Die Betreuung der Tiere erfolgte über einen Beobachtungszeitraum von insgesamt 19

Tagen. Nach Ablauf dieses Zeitraums wurden alle Versuchstiere mit einer Überdosis

der Kombinationsnarkose aus Ketamin/Xylazin getötet.


23

Abbildung 4: Areal (1cm2) auf dem rasierten Mausrücken zur Markierung der Injektionsstelle

2.4 Untersuchungstechniken

2.4.1 Blutentnahme mittels Herzpunktion

Nach der Tötung aller Versuchstiere erfolgte die Entnahme des murinen Serums mittels

Herzpunktion. Diese Serumproben wurden im weiteren Verlauf mit Hilfe eines nicht-

kompetitiven, heterogenen ELISA-Tests untersucht. Dabei diente der ELISA zur quanti-

tativen Bestimmung der gebildeten murinen HGF-Konzentrationen.

Eine derartige Analyse wurde ausschließlich bei den Tieren der Versuchsgruppe Haar-

wachstum durchgeführt, da hier der Wachstumsfaktor und die Negativkontrolle sub-

kutan injiziert worden waren und mit einer Aufnahme des Wirkstoffes in die Blutbahn

der Versuchstiere zu rechnen war.

Für die Herzpunktion wurden die Mäuse in überstreckter Rückenlage auf einer steril

abgedeckten Korkplatte fixiert. Anschließend wurde eine 21 G-Kanüle (BD Microlance

Kanüle 21 G, Becton Dickinson GmbH, Deutschland) in der Medianlinie unmittelbar

hinter dem Xiphoid des Sternums eingeführt und das Herz punktiert. Mittels dieser Me-

thode konnten ca. 0,8ml bis 1ml Vollblut pro Maus entnommen und in Ca2+-EDTA-

beschichteten Röhrchen asserviert werden. Diese Blutproben wurden sofort nach Ent-

nahme für 10 Minuten bei einer Temperatur von 5°C bei 4044 U/min zentrifugiert

(Sigma Laboratory Centrifuges, Osterode am Harz, Deutschland), der Überstand wurde


24

abpipettiert und bis zur Durchführung biochemischer Analysen bei -80°C eingefroren.

Die Ergebnissicherung aller Proben erfolgte im experimentellen Labor für Plastische

Chirurgie, Hand- und Verbrennungschirurgie des Universitätsklinikums der RWTH

Aachen.

2.4.2 Gewebeentnahme und Gewebefixierung

Nach Versuchsbeendigung an Tag 19 erfolgte im Anschluss an die Tötung aller Mäuse

sowohl der Gruppe Wundheilung als auch der Gruppe Haarwachstum die Entnahme

eines Gewebestückes aus der Vollhaut des Mäuserückens.

Diese Hautbiopsate wurden auf Styroporplatten aufgespannt und mit einem sterilen

Skalpell zum Einmalgebrauch (Feather® Disposable Scalpel No. 11, Fa. Feather Safety

Razor Co., LTD., Osaka, Japan) in Hautstreifen geschnitten.

Dabei wurde bei den Mäusen der Gruppe Wundheilung darauf geachtet, dass die ge-

wonnenen Biopsate Teile der verbleibenden Wunde zusammen mit dem angrenzenden

unbehandelten Epithel enthielten. Die Hautstreifen der Mäuse der Gruppe Haarwachs-

tum mussten vor allem das Areal mitsamt Korium enthalten, an dem sich nach der In-

jektion des Wachstumsfaktors neues Haarkleid gebildet hatte.

Für die sich anschließenden histologischen Färbungen wurden die gewonnenen Haut-

streifen beider Versuchsgruppen auf Einbettkassetten (Histosette II, Fa. Simport, Cana-

da) platziert und für einen Zeitraum von ein bis zwei Tagen in 4%igem gepufferten

Formalin fixiert.

2.5 Histologische Färbungen

2.5.1 Anfertigung der histologischen Präparate

Um die Hautpräparate der Versuchstiere später mikroskopisch beurteilen zu können,

wurden diese unmittelbar post mortem histologisch aufgearbeitet. Nachdem die Fixie-

rung der Präparate abgeschlossen war, folgten das Auswaschen des Fixans unter flie-

ßendem Leitungswasser sowie die Entwässerung der Präparate in einer aufsteigenden

Alkoholpassage bis hin zum Einbetten in Paraplast (siehe Tabelle 5).


25

Tabelle 5: Dehydrierung mittels aufsteigender Alkoholreihe

Substanz 60% Ethanol

90% Ethanol

100% Ethanol I

100% Ethanol II

100% Ethanol III

Paraplast-Ethanol-Gemisch (1+1)

Para-plast I

Para-plast II

Dauer 1h 1h 1h 1h 1h 1h über Nacht

bis zum Einbetten

Es schloss sich die Einbettung der Präparate an, indem man diese in Metallformen legte,

mit flüssigem Paraplast übergoss und aushärten ließ. Hieraus konnten anschließend

Feinschnitte von 2µm Schnittdicke mit einem Schlittenmikrotom (HISTOSLIDE 2000,

Fa. Reichert&Jung, Deutschland) angefertigt werden, die daraufhin in einem Wasserbad

auf Glasobjektträger aufgezogen wurden. Abschließend wurden diese über Nacht bei ca.

65°C inkubiert, wodurch überschüssiges Paraplast ablaufen konnte. Letzte Paraplastres-

te wurden in einer Entparaffinierungsreihe mittels absteigender Alkoholreihe entfernt

und zur Rehydrierung der Präparate mit Aqua destillata gespült (siehe Tabelle 6). Im

Anschluss konnten die histologischen Färbungen dieser Dünnschnitte erfolgen. Tabelle 6: Entparaffinierung mittels absteigender Alkoholreihe

Substanz Xylol I, II, III

100% Ethanol I, II, III

96% Ethanol I, II

80% Ethanol I, II

70% Ethanol I, II

A. dest.

Dauer jeweils 10 Min.

jeweils 2 Min.

jeweils 1 Min. spülen spülen spülen

2.5.2 Hämalaun-Eosin-Übersichtsfärbung (HE-Färbung)

Die HE-Färbung diente als Übersichtsfärbung zur morphologischen Beurteilung der

Gewebeproben. Mit Hilfe dieser Standardfärbung lassen sich Zellkerne und extrazellu-

läre Matrix darstellen und unterschiedlich anfärben.

Die Kernfärbung der Dünnschnitte erfolgte für fünf bis zehn Minuten in frisch filtrier-

tem Hämalaun (Hämalaun nach Mayer, Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland).

Dieser basische Farbstoff stellt negativ geladene, basophile Strukturen, wie beispiels-

weise Zellkerne, blau dar. 10 Minuten langes Nachbläuen unter warmem Leitungswas-

ser beendete diesen Färbungsschritt. Abschließend wurden die Präparate für fünf Minu-

ten in einer 0,3%igen wässrigen Eosinlösung (Eosin G, Fa. Merck KGaA, Darmstadt,

Deutschland) inkubiert. Eosin ermöglicht die Darstellung positiv geladener, azidophiler

Gewebestrukturen, wie Zytoplasma und extrazelluläre Matrix, in einem rot-rosa Farb-

ton.

Zur Dehydrierung der Objektträger durchliefen diese eine aufsteigende Alkoholreihe


26

und wurden in Xylol getaucht (siehe Tabelle 7). In einem letzten Schritt erfolgte das

Eindecken der Präparate mit Vitro-Clud® (Fa. R. Langenbrinck, Emmendingen,

Deutschland) und Deckgläschen.

Tabelle 7: Dehydrierung mittels aufsteigender Alkoholreihe – HE-Färbung

Substanz 80% Ethanol 96% Ethanol 100% Ethanol Xylol Dauer 10 Min. 10 Min. 10 Min. 5-10 Min.

2.5.3 Sirius Red-Färbung

Mit Hilfe der Sirius Red-Färbung lassen sich vor allem Kollagenfasern besonders gut

darstellen. Diese erscheinen in rotem Ton, wobei sich große Fibrillen gelb-orange, klei-

nere grün färben.

Hierfür wurde der stark anionische Farbstoff Sirius Red (Siriusrot F3B, Fa. Waldeck

GmbH&Co. KG, Münster, Deutschland) verwendet, der zunächst in wässriger, kalter

Pikrinsäure (hergestellt von der Apotheke des Uniklinikums Aachen) gelöst und auf

einen pH-Wert von 2,0 eingestellt wurde. Um eine optimale Haftung der Schnitte bei

dieser aggressiven Färblösung zu garantieren, wurden silanisierte Glasobjektträger ver-

wendet.

Zu Beginn der Färbung wurden die Objektträger ungefähr eine Stunde lang in die Sirius

Red-Lösung gelegt und im Anschluss für zwei Minuten in 0,01M HCl differenziert.

Nachdem sie mit Wasser gespült wurden, kam es zur Dehydrierung der Präparate mit

Hilfe einer aufsteigenden Alkoholreihe sowie anschließender Einstellung in Xylol (sie-

he Tabelle 8). Das abschließende Eindecken der gefärbten Schnitte wurde mit Vitro-

Clud® (Fa. R. Langenbrinck, Emmendingen, Deutschland) durchgeführt.

Tabelle 8: Dehydrierung mittels aufsteigender Alkoholreihe – Sirius Red-Färbung

Substanz 70% Ethanol 80% Ethanol 96% Ethanol 100% Ethanol Xylol

Dauer 5 Min. 5 Min. 5 Min. 5 Min. 5-10 Min.

2.6 Lichtmikroskopie

Sowohl die HE-gefärbten als auch die Sirius Red-gefärbten Präparate wurden lichtmik-

roskopisch begutachtet. Die in Kapitel 3 folgenden Auswertungen der histologisch

sichtbaren Ergebnisse gelten für beide Färbungen aller Präparate.


27

Um die mit HE- sowie mit Sirius Red-angefertigten Präparate qualitativ und quantitativ

auszuwerten, erfolgte ihre Begutachtung an einem Fluoreszenzmikroskop, Leica

DMRX der Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH (Wetzlar, Deutschland) mit dem Foto-

analyseprogramm Diskus, Technisches Büro Hilgers, Königswinter (Deutschland). Die

Präparatbeurteilung beider Behandlungsgruppen erfolgte unter morphologischen Ge-

schichtspunkten. Dafür wurden alle histologisch angefertigten Präparate mit den Ver-

größerungen 5, 10, 20 und 25 betrachtet und analysiert.

Speziell bei der Gruppe Haarwachstum lag der Fokus der Präparatbegutachtung vor

allem auf der Betrachtung der Anzahl und Struktur neu einsprossender Kapillare als

Ausdruck der Angiogenese und Neovaskularisation. Zusätzlich erfolgte eine genauere

Analyse der Anzahl neu gewachsener Haarfollikel und Struktur neu gewachsener Haar-

follikel. Um die Anzahl neuer Kapillare sowie neuer Haarfollikel exakter auszuwerten,

wurden die Histologien der Gruppe Haarwachstum zur Objektivierung in einer 10er

Vergrößerung in je drei Gesichtsfelder (GF) eingeteilt und daraufhin genauer bewertet.

Bei der Gruppe Wundheilung wurde von einer derartigen Begutachtung abgesehen, da

bei diesen Versuchstieren der Wachstumsfaktor HGF sowie die Negativkontrolle NaCl

oberflächlich auf die Wunde aufgetragen wurden. Jedoch erfolgte bei dieser Gruppe,

ebenso wie bei der Gruppe Haarwachstum, eine eingehendere lichtmikroskopische Be-

gutachtung der Hautstruktur der histologisch angefertigten Präparate.

2.7 Bestimmung der HGF-Konzentration mittels ELISA

Um die murinen HGF-Konzentrationen im Blut nachweisen und bestimmen zu können,

wurde ein ELISA-Test zur Detektion von rekombinant sowie natürlich gebildetem

murinen HGF (mouse HGF Duo Set® ELISA Development System, Fa. R&D Sys-

tems®, Minneapolis, MN, USA) verwendet. Dafür standen Serumproben aller Ver-

suchstiere der Gruppe Haarwachstum zur Verfügung.

Dieser nicht-kompetitive, heterogene ELISA bediente sich der quantitativen „Sand-

wich“-Enzymimmunoassay-Technik und basierte auf einer spezifischen Antikörper-

Antigen-Reaktion. Da sich nach jedem Arbeitsschritt gründliche Waschvorgänge zur

Entfernung möglicher freier Bindungen anschlossen, galt der ELISA als heterogen.

Es wurden zwei Antikörper verwendet, die beide spezifisch an das nachzuweisende

Antigen, also an den Wachstumsfaktor HGF, banden.


28

2.7.1 Prinzip der Methode

Zu Beginn wurden je 100µl eines sogenannten „capture“-Antikörpers gegen das gesuch-

te Antigen, sprich gegen den Wachstumsfaktor HGF, auf den Vertiefungen (Wells) ei-

ner 96-Well-Mikrotiterplatte (Nunc-Immuno™Plates, Fa. Thermo Fisher Scientific,

Schwerte, Deutschland) gebunden und über Nacht inkubiert. Dieser monoklonale Anti-

körper wurde zuvor nach Angaben des Herstellers in einer Phosphat-Puffer-Lösung

(PBS) verdünnt (144µg/ml Antikörper/1ml PBS).

Anschließend wurde die Platte mit einer Waschpufferlösung dreimalig gewaschen und

mit „reagent diluent“ für 1½ Stunden geblockt, worauf sich der Waschvorgang abermals

anschloss.

Nun konnten jeweils 100µl der jeweiligen murinen Serumprobe der beiden HGF-

Wirkformen sowie der Negativkontrolle in die einzelnen Vertiefungen der Platte pipet-

tiert werden, wodurch der gebundene monoklonale Antikörper das anwesende HGF

binden konnte. Diese Proben wurden zuvor in einer 1:5-Verdünnung mit „reagent di-

luent“ verdünnt. Parallel dazu wurde auf der Platte eine Standardreihe angesetzt, wobei

der höchste Standard bei einer Konzentration von 10.000pg/ml lag. Nach Ablauf der

zweistündigen Inkubationszeit wurde die Platte erneut abgesaugt und mehrmals gewa-

schen, um die ungebundenen Bestandteile der Proben zu entfernen. Dadurch wurde ge-

währleistet, dass ausschließlich am „capture“-Antikörper gebundenes HGF vorliegen

konnte.

In einem nächsten Schritt folgte pro Well die Zugabe von je 100µl eines „detection“-

Antikörpers, der nach Herstellerangaben verdünnt wurde (36µg/ml Antikörper/1ml rea-

gent diluent). Dieser polyklonale Antikörper diente als biotinylierter Zweitantikörper,

der durch ein Streptavidin-HRP-Konjugat detektiert wurde. Anschließend wurde die

Platte für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem Waschen der

Platte erfolgte die Zugabe von 100µl Streptavidin-HRP (Meerrettich-Peroxidase) in

vorgeschriebener Verdünnung je Well. Die Platte wurde dann 20 Minuten lang bei

Dunkelheit inkubiert. Auf diesen Vorgang schloss sich ein letzter dreimaliger Wasch-

vorgang zur Entfernung aller ungebundenen Antikörper-Enzym-Reagenzien an. In ei-

nem letzten Schritt erfolgte in jedes Well die Zugabe von 100µl einer spezifischen,

chromogenen Substratlösung, die als Farbindikator diente. Diese Lösung bestand aus

5,5ml H2O2 sowie 5,5ml Tetramethylbenzidin (TMB). Dadurch resultierte ein Farbum-

schlag, dessen Farbintensität mit der Menge der vorhandenen murinen HGF-

Konzentration der Proben korrelierte.


29

Das Hinzufügen einer 2N Schwefelsäurelösung nach 20 Minuten stoppte die Farbreak-

tion. Diesem Vorgang schloss sich die photometrische Messung der Absorption bei ei-

ner Wellenlänge von 450nm mit Hilfe eines Spektrometers (FLUOstar OPTIMA, Fa.

BMG labtech GmbH, Offenburg, Deutschland) an. Somit konnte der Anteil der in den

Serumproben vorhandenen HGF-Konzentration quantitativ bestimmt werden. Diese

Messwerte wurden anschließend mit einer Standardkurve verglichen. Die Ergebnisse

werden in Kapitel 3 gezeigt.

2.8 Statistik

Die Erstellung aller statistischen Berechnungen sowie deren Auswertungen erfolgte

nach Empfehlung des Institutes für Medizinische Statistik der RWTH Aachen (Direk-

tor: Prof. Dr. rer. nat. Ralf-Dieter Hilgers).

2.8.1 Auswertung

Alle Auswertungen wurden explorativ vorgenommen. Im Vorfeld wurde keine primäre

Hypothese formuliert.

2.8.2 Statistische Verfahren

Die gewonnenen Daten wurden deskriptiv und mittels Varianzanalysen statistisch ana-

lysiert. Dabei wurden stets Mittelwerte (MW) sowie Standardabweichungen (SD) be-

rechnet und angegeben. Zum Nachweis von Behandlungsunterschieden diente vor allem

eine ANOVA-Berechnung, bei der sowohl ein- als auch zweifaktorielle Varianzanaly-

sen, teilweise unter Berücksichtigung von Messwiederholungen (zeitliche und lokale

Mehrfachmessungen an einer Maus), verwendet wurden. Sofern die ANOVA einen

signifikanten Einflussfaktor identifizierte, wurden an Hand von Post Hoc-Tests spezifi-

sche Unterschiede der einzelnen Faktorstufen analysiert. Das Signifikanzniveau lag bei

α = 0.05.

Ergebnisse

30

3 Ergebnisse

Untersuchung des Einflusses der 19-tägigen Therapie mit dem Wachstumsfaktor

pdHGF und rHGF auf die Wundheilung sowie auf die Haarwachstumsrate im Vergleich

mit der Negativkontrolle NaCl beim Versuchstier Maus. Dabei stellt pdHGF am Ver-

suchsende die wirksamste Behandlung zur Beschleunigung des Heilungsprozesses dar,

zeigt jedoch keine signifikante Verbesserung der Geschwindigkeit an nachwachsendem

Haarkleid über den gesamten zeitlichen Verlauf.

3.1 Ergebnisse der Gruppe Wundheilung

3.1.1 Allgemeines

Die 19 Versuchstage wurden zunächst in fünf Zeitperioden eingeteilt. In Periode 1 wur-

den die Tage d1 bis d4, in Periode 2 d5 bis d8, in Periode 3 d9 bis d12, in Periode 4 d13

bis d16 und in Periode 5 d17 bis d19 betrachtet (siehe Tabelle 9). Die Periodeneintei-

lung blieb dabei für alle drei Behandlungsgruppen gleich. Diese Stratifizierung bietet

einen übersichtlichen Anhalt für die einzelnen Wundheilungsphasen und ermöglicht

durch die Aufteilung der Wundheilungsphasen über den zeitlichen Verlauf eine bessere

Vergleichbarkeit. Um den Fortschritt der Wundheilung exakt beurteilen zu können,

wurde vor allem die Wundfläche jeder einzelnen Wunde über den gesamten Versuchs-

ablauf ausgemessen. Ergänzende Aussagen über das Wundverhalten wurden getroffen,

indem zusätzlich zur Wundfläche die Wundhöhe sowie Wundbreite über den zeitlichen

Verlauf ermittelt wurden. Zu diesem Zweck wurden die Zielvariablen immer an exakt

gleicher Stelle gemessen und planimetriert.

Es wurden Daten von jeweils neun mit rHGF und NaCl behandelten Mäuse sowie zehn

mit pdHGF und NaCl behandelten Mäuse herangezogen.

Ergebnisse

31

Tabelle 9: Periodeneinteilung

Periode Tage 1 1 – 4 2 5 – 8 3 9 – 12 4 13 - 16 5 17 - 19

3.1.2 Wundfläche

Um die Größe der einzelnen Wundflächen untereinander vergleichend darzustellen,

wurden die erhobenen Daten zunächst mit Hilfe der deskriptiven Statistik ausgewertet.

Dabei wurden für alle Wunden jeder Behandlungsgruppe Mittelwerte, Standardabwei-

chungen sowie Minimum und Maximum der Wundflächen über die fünf Perioden er-

mittelt (siehe auch Daten im Anhang).

Ergebnisse

32

Abbildung 5: MW mit SD der Gruppe Wundheilung für die Zielvariable Wundfläche, aufgeschlüsselt nach Behandlungen und Perioden, * stat. Signifikanz (p<0.05) Abbildung 5 stellt die berechneten Parameter Mittelwerte und Standardabweichung für

die drei Behandlungsgruppen über den zeitlichen Verlauf dar und weist auf statistisch

relevante Unterschiede hin. Auffällig ist, dass die Mittelwerte zu Beginn der Versuche

geringfügige Unterschiede aufzeigen. Diese Differenzen sind durch den Einfluss der

Hautspannungslinien der Mäuse bei der Wundsetzung zu erklären. Dabei verfügten die

mit pdHGF behandelten Wunden der Versuchsgruppe in Periode 1 mit einem Mittelwert

von 0.162cm2 (SD= 0.036cm2) über die kleinste Wundfläche, wohingegen die Wunden

der rHGF-Gruppe am größten ausfielen (MW= 0.184cm2, SD= 0.048cm2). Dennoch

kann von annähernd gleich großen Wundflächen bei allen drei Behandlungsgruppen zu

Beginn der Untersuchung gesprochen werden. Alle Gruppen zeigten eine klare Tendenz

zur Wundheilung, da sich ihre Wundflächen über den zeitlichen Verlauf zunehmend

verringerten.

Ergebnisse

33

Abbildung 6: Mittelwerte der Gruppe Wundheilung für die Zielvariable Wundfläche, aufgeschlüsselt nach Behandlungen und Perioden

In Abbildung 6 werden ausschließlich die Mittelwerte der Wundflächen für die einzel-

nen Behandlungsgruppen über den zeitlichen Verlauf grafisch dargestellt. Von Periode

1 auf die nachfolgende Periode schrumpfte der Mittelwert der mit rHGF behandelten

Wunden mit einer Rate von 24.89% am stärksten, während die Standardabweichung um

12.59% abnahm. Bei den mit pdHGF behandelten Wunden verringerte sich die Wund-

größe um 24.25% (SD= 3.57%). In dieser Periode wiesen die Wundflächen, die mit

NaCl versorgt worden waren, mit einer mittleren Schrumpfungsrate von 23.28% (SD=

20.34%) die geringste Verkleinerung auf. Da diese Werte insgesamt aber sehr nah anei-

nanderlagen, konnte für jede Behandlungsgruppe von einer annähernd gleichen Ge-

schwindigkeit der Wundabnahme ausgegangen werden.

Betrachtete man die Rate der Abnahme der Wundflächen vor allem über die Perioden 3

bis einschließlich Periode 4, wurde ein deutlicher Unterschied zwischen den drei Grup-

Ergebnisse

34

pen auffällig. So zeigte sich von Tag 9 auf Tag 16 eine deutliche Beschleunigung der

Wundheilung für die mit rHGF und pdHGF behandelten Wunden. Besaßen alle drei

Behandlungen in den vorherigen Perioden noch eine annähernd gleich starke Tendenz

zur Wundabnahme, ließ ab Periode 3 besonders die Abnahme der mit NaCl behandelten

Wundflächen deutlich nach und verkleinerte sich nicht in gleicher Intensität wie bei den

anderen beiden Behandlungsgruppen. Dabei wies die pdHGF-Gruppe von Periode 3 auf

Periode 4 mit 80.23% (SD= 64.09%) die schnellste Wundheilung auf, die Wundflächen

der rHGF-Gruppe schlossen sich mit 75.68% (SD= 61.76%) an. Auch hier bildete die

mit NaCl behandelte Vergleichsgruppe mit einer Verkleinerungsrate von 61.30% (SD=

28.22%) das Schlusslicht.

Des Weiteren konnte ebenso in Periode 4, also nach 13 bis 16 Tagen, gezeigt werden,

dass die mittleren Differenzen der Wundflächen zwischen den einzelnen Behandlungen

stärker voneinander abwichen. ANOVA-Berechnungen bestätigten, dass die Behand-

lungen in Periode 4 einen signifikanten Einfluss auf den Wundschluss hatten. Die mit

pdHGF behandelten Wunden waren im Mittel 0.017cm2 kleiner als die Wunden der

Vergleichsgruppe (p= 0.0064). Dieser Unterschied zeigte sich im Post Hoc-Test als

signifikant. Ähnlich verhielt sich der Vergleich der Wundflächen zwischen den mit

rHGF und NaCl behandelten Versuchstieren. Hier bestand eine signifikante Differenz

von 0.013cm2 (p= 0.0388). Dagegen fiel die mittlere Differenz der mit pdHGF sowie

mit rHGF behandelten Gruppen mit 0.004cm2 wesentlich geringer aus und blieb ohne

statistische Signifikanz (p= 0.5278). Folglich fiel die mittlere Differenz zwischen den

mit pdHGF und den mit NaCl behandelten Wundflächen in Periode 4 am größten aus.

Somit konnte eine Beschleunigung der Wundheilung für die mit pdHGF sowie rHGF

behandelten Gruppen im Vergleich mit der Negativkontrollgruppe belegt werden.

Zusätzlich ließen die mit pdHGF behandelten Wunden auch in dieser Zeitspanne erneut

die schnellste Abnahme ihrer Wundflächen erkennen.

Insgesamt wurde deutlich, dass die mit der Positivkontrolle rHGF behandelte Gruppe

über den gesamten Versuchsverlauf, sprich von Tag 1 bis Tag 19, mit einer Verkleine-

rungsrate von 99% (SD= 95%) die größte Abnahme ihrer Wundfläche aufwies. Ähnlich

stark zeigten sich mit einer Rate von 98% (SD= 90%) die mit pdHGF versorgten Wun-

den, gefolgt von den Wundflächen der NaCl-Vergleichsgruppe. Zwar wiesen die Wun-

den der Negativkontrollgruppe mit 96% (SD= 81%) die geringste Verkleinerungsrate

über den zeitlichen Versuchsablauf auf, dennoch konnte am Ende der Untersuchung ein

annähernd vollständiger Wundschluss bei allen Wunden aller Behandlungen beobachtet

werden.

Ergebnisse

35

Abbildung 7: Vergleich der Verteilungen der Wundflächen in den drei Behandlungsgruppen über den zeitlichen Verlauf

Abbildung 7 stellt die Verteilung der Werte in vergleichenden Boxplots grafisch dar.

Hierbei wird anschaulich, dass für die mit rHGF behandelten Wunden in den Perioden 1

bis 4 immer ein Ausreißer nach oben vorlag. In dieser Gruppe existierte also eine Wun-

de, die im Vergleich zu den übrigen Wunden eine größere Fläche aufwies. Durch diesen

Ausreißer war die mit 0.184cm2 größte mittlere Wundfläche der rHGF-Gruppe zu Be-

ginn der Behandlungen zu erklären.

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Wunden aller Behandlungsgruppen am

Ende der Untersuchung einen annähernd gleichen vollständigen Wundschluss aufwie-

sen. Jedoch hatten die Wunden der Vergleichsgruppe mit NaCl dabei die größten ver-

bleibenden Wundflächen inne (MW= 0.006cm2, SD= 0.008cm2). Siehe auch Daten im

Anhang.

3.1.3 Wundhöhe

Zusätzliche Aussagen über den gesamten Verlauf der Wundheilung wurden durch

Ausmessung der Wundhöhen getroffen. Auch hierfür erfolgte die bereits erwähnte Ein-

teilung der 19 Versuchstage in fünf Zeitperioden, über die für alle drei Behandlungs-

gruppen die mittleren Wundhöhen bestimmt wurden.

Ergebnisse

36

Abbildung 8: MW und SD der Gruppe Wundheilung für die Zielvariable Wundhöhe, aufgeschlüsselt nach Behandlungen und Perioden, * stat. Signifikanz (p<0.05)

Abbildung 8 zeigt für die einzelnen Behandlungsgruppen die berechneten Mittelwerte

und Standardabweichung über den zeitlichen Verlauf dar und weist auf statistisch rele-

vante Unterschiede hin. Es wird deutlich, dass Periode 1 bis Periode 3 eine annähernd

gleichmäßige Abnahme der mittleren Wundhöhe aufzeigten. Periode 4 jedoch wies ei-

nen statistisch signifikanten Unterschied zwischen allen drei Behandlungsgruppen auf

(p= 0.023). Hier zeigte sich eine Beschleunigung der Wundheilung hinsichtlich der

Wundhöhe vor allem bei den Versuchstieren, die mit pdHGF behandelt wurden sowie

bei den mit rHGF behandelten Mäusen.

Dieser Unterschied machte eine genauere Betrachtung der Behandlungen mit pdHGF,

rHGF und NaCl für Periode 4, sprich für die Zeitspanne von Tag 13 bis Tag 16, sinn-

voll. Dabei wurde deutlich, dass ein signifikanter Unterschied der Wundhöhe zwischen

den mit NaCl (MW= 0.137cm, SD= 0.052cm) und den mit pdHGF behandelten Mäusen

Ergebnisse

37

(MW= 0.097cm, SD= 0.042cm) bei einem p-Wert von 0.0230 vorlag. Auch zwischen

den Behandlungen der NaCl-Vergleichsgruppe und den mit rHGF behandelten Ver-

suchstieren (MW= 0.103cm, SD= 0.037cm) bestand eine statistisch signifikante Diffe-

renz (p= 0.0369). Jedoch ließ sich keine statistische Signifikanz zwischen den mit rHGF

und den mit pdHGF behandelten Mäusen nachweisen (p= 0.9164). In Periode 5 wiesen

nur noch manche Wunden vereinzelt Wundverhalten auf. Die wenig verbliebenen Wun-

den unterschieden sich nur marginal in den einzelnen Behandlungsgruppen, was ohne

statistische Relevanz war (siehe auch Daten im Anhang).

3.1.4 Wundbreite

Die Veränderungen der Wundbreiten wurden in den einzelnen Behandlungsgruppen

über den zeitlichen Verlauf betrachtet. Dabei wurde über jede Periode für jede der drei

Behandlungsgruppen die mittlere Wundbreite gebildet. Abbildung 9 stellt für die Be-

handlungsgruppen die Mittelwerte und Standardabweichungen für die Zielvariable

Wundbreite über den zeitlichen Verlauf dar, wobei statistisch signifikante Unterschiede

hervorgehoben werden.

Ergebnisse

38

Abbildung 9: MW und SD der Gruppe Wundheilung für die Zielvariable Wundbreite, aufgeschlüsselt nach Behandlungen und Perioden, * stat. Signifikanz (p<0.05)

Aus Abbildung 9 wird ersichtlich, dass von Periode 1 bis Periode 3 bei allen Behand-

lungsgruppen die Breite der Wunde kontinuierlich leicht abnahm.

In Periode 4 konnte jedoch eine stärkere Beschleunigung der Wundheilung für den Pa-

rameter Wundbreite aufgezeigt werden, vergleichbar mit der signifikanten Beschleuni-

gung bei der Zielvariablen Wundhöhe. Beim Vergleich der Einzelbehandlungen in die-

ser Periode 4 zeigten sich statistisch signifikante Unterschiede zwischen der Ver-

gleichsgruppe NaCl (MW= 0.099cm, SD= 0.034cm) und den mit pdHGF behandelten

Versuchstieren (MW= 0.069cm, SD= 0.033cm) bei einem p-Wert von 0.0161. Ebenso

lag zwischen der Behandlung mit NaCl und derjenigen mit rHGF (MW= 0.069cm, SD=

0.028cm) eine statistisch signifikante Differenz vor (p= 0.0168). Vergleichbar mit der

Betrachtung des Beurteilungskriteriums Wundhöhe, zeigte sich in Periode 4 für die

Wundbreite keine statistische Signifikanz zwischen den mit pdHGF und den mit rHGF

Ergebnisse

39

behandelten Mäusen (p= 0.9431). Für Periode 5 zeigte sich kein wesentlicher Unter-

schied zwischen den einzelnen Behandlungen. Es wurde nur deutlich, dass am Ende der

Versuche alle drei Behandlungsgruppen Wundschluss aufwiesen und eine Narbe gebil-

det hatten, wobei die Wundbreite sich bei allen drei Gruppen kaum unterschied (siehe

auch Daten im Anhang).

Zusammenfassend zeigte sich, dass für die Zielparameter Wundfläche, -höhe, -breite

der einzelnen Behandlungen gleiche Signifikanzen und gleiche Entwicklungen bestan-

den.

3.1.5 Makroskopische Beurteilung der Zielparameter der Gruppe Wund-

heilung

Neben einer mikroskopischen Begutachtung der gefärbten Gewebepräparate wurde zu-

sätzlich das Verhalten der Wundheilung über den zeitlichen Verlauf in jeder Behand-

lungsgruppe begutachtet. Dabei bestätigten die makroskopisch sichtbaren Resultate die

Ergebnisse der bereits genannten statistischen Auswertungen der Zielparameter.

Der Wundheilungsverlauf der unterschiedlichen Behandlungsgruppen ähnelte sich mak-

roskopisch untereinander. So zeigte jede der drei Behandlungsgruppen eine vergleich-

bare Abnahme ihrer Wundheilung im zeitlichen Verlauf. Im Rahmen des Heilungspro-

zesses zeigten alle Wunden eine makroskopisch sichtbare Ausbildung von Granulati-

onsgewebe. Dieses Gewebe erschien zu Beginn der Behandlung in einem rötlichen

Farbton und wies eine unebene, leicht höckerige Oberfläche auf. Über die zeitliche

Dauer des Versuches nahm die Intensität dieser Farbe der Wunden aller Behandlungs-

gruppen kontinuierlich ab. Am Ende des Versuches waren die Wunden aller Behand-

lungsgruppen nahezu vollständig verschlossen und abgeblasst.

In Periode 4 konnte für die Behandlung mit pdHGF sowie mit rHGF eine Beschleuni-

gung der Wundheilung im Vergleich zu den Wunden, die mit NaCl behandelt wurden,

beobachtet werden. Es ließ sich erkennen, dass die Wunden der Vergleichsgruppe etwas

größer waren als die Wunden der beiden HGF-Wirkstoffe.

In Periode 5 war nahezu jede Wunde aller drei Behandlungsgruppen verheilt, in ihrem

Umfang deutlich verkleinert und wies narbige Strukturen auf. Besonders die Wunden,

die mit rHGF oder mit pdHGF behandelt worden waren, glichen sich äußerlich stark.

Wie bereits erwähnt, erfolgte bei ihnen der Wundschluss früher als bei den Wunden der

Vergleichsgruppe (NaCl). Auch die Narbenbildung und die Abblassung der Wunden

setzten bei ihnen vorzeitiger ein.

Ergebnisse

40

Am letzten Tag der Behandlung (Tag 19) wiesen lediglich einige wenige Wunden, die

mit NaCl behandelt worden waren, eine noch verbleibende rötliche Wundfläche auf.

Jedoch waren auch diese Wunden in ihrem Umfang deutlich verkleinert und ebenso

reizlos wie die Wunden beider HGF-Wirkstoffe. Alle Wunden, die entweder mit

pdHGF oder mit rHGF behandelt worden waren, zeigten am letzten Versuchstag einen

fast kompletten Wundschluss. Darüber hinaus ließ sich feststellen, dass bei den Grup-

pen, die mit pdHGF oder rHGF behandelt worden waren, an Tag 19 die Farbe der ver-

bliebenen Wundnarben geringfügig blasser erschien als bei der Vergleichsgruppe.

Abbildung 10 zeigt den zeitlichen Verlauf der makroskopisch sichtbaren Wundheilung

am Beispiel von zwei Mäusen, die entweder mit pdHGF oder mit rHGF behandelt wur-

den. Dabei wurde auf der linken Rückenhälfte immer jeweils eine Wirkform des HGFs

und auf der rechten Rückenhälfte NaCl appliziert.

Periode pdHGF + NaCl rHGF + NaCl

1

(d1)

2

(d6)

Ergebnisse

41

3

(d11)

4

(d15)

5

(d19)

Abbildung 10: Vergleich des Wundschlusses der Gruppe Wundheilung (Maßstab 1cm)

3.2 Histologische Auswertungen der Gruppe Wundheilung

Für die Gruppe Wundheilung erfolgte eine Begutachtung der mit HE- sowie der mit

Sirius Red-gefärbten Präparate nach morphologischen Gesichtspunkten.

3.2.1 Mikroskopische Betrachtung der Histologien

In den mit HE- und Sirius Red-gefärbten Präparaten der Behandlungen mit pdHGF,

rHGF sowie mit NaCl für die Gruppe Wundheilung zeigten sich deutliche Unterschiede

in der Struktur sowie in der Beschaffenheit des Koriums der Mäuse.

Die Vergleichsgruppe, die mit NaCl behandelt wurde, wies nach Abschluss der Behand-

lung an Tag 19 ein regelrechtes Korium auf. Das kollagene Faserwerk innerhalb der

Ergebnisse

42

korialen Schicht dieser Mäuse zeigte sich locker. Die gesamte Struktur des Koriums war

gleichmäßig entwickelt und glich normalem Ausgangsgewebe.

Dagegen verfügten die mit rekombinant hergestelltem rHGF behandelten Mäuse über

ein sehr dichtes Korium mit plumpem, fast starrem, kollagenen Faserwerk. Ihre Dermis

war wesentlich kompakter als in den beiden anderen Versuchsgruppen.

Die Kollagenfasern der Gruppe, die mit dem Wachstumsfaktor pdHGF behandelt wur-

den, erschienen weniger plump und eher beweglich als die Fasern der mit rHGF behan-

delten Gruppe. Die Struktur ihres korialen Gewebes ähnelte somit dem Aufbau der mit

NaCl behandelten Kontrollgruppe. Allerdings waren die einzelnen kollagenen Fasern

der pdHGF-Gruppe etwas kürzer und plumper als die der Vergleichsgruppe (NaCl). Ihre

Haut zeigte sich beweglicher und elastischer.

Abbildung 11 bis Abbildung 13 zeigen beispielhaft jeweils einen Ausschnitt aus 20fach

vergrößerten histologischen Präparaten der drei Behandlungsgruppen.

Abbildung 11: Histologie der mit pdHGF behandelten Gruppe mit lockeren, kurzen Kollagenfasern und elastischer Dermis: Sirius Red-Färbung, 20fache Vergrößerung

Ergebnisse

43

Abbildung 12: Histologie der mit rHGF behandelten Gruppe mit plumpen, starren Kollagenfasern und kompakter Dermis: Sirius Red-Färbung, 20fache Vergrößerung

Abbildung 13: Histologie der mit NaCl behandelten Gruppe mit lockeren, normal langen Kollagenfasern und regelrechter Dermis: Sirius Red-Färbung, 20fache Vergrößerung

Ergebnisse

44

3.3 Ergebnisse der Gruppe Haarwachstum

3.3.1 Allgemeines

Um eine äquidistante Einteilung zu gewährleisten, wurde auch bei der Versuchsreihe

der Gruppe Haarwachstum bezüglich des nachwachsenden Haarkleides dieselbe Perio-

deneinteilung der 19 Versuchstage wie bei der Wundheilung vorgenommen (siehe Ka-

pitel 3.1.1). Die Periodeneinteilung blieb dabei für alle drei Behandlungsgruppen gleich.

Um die Stärke des nachwachsenden Haarkleides makroskopisch detaillierter einteilen

zu können, wurde zunächst ein Scoringverfahren entwickelt. Hierbei wurden Zahlen-

werte (Scores) von 0 bis 4 vergeben. Diesen Werten wurden bestimmte Stadien des

Haarwachstums zugewiesen (siehe Tabelle 10). Es wurden Daten von jeweils neun Ver-

suchstieren pro Behandlungsgruppe ausgewertet.

Tabelle 10: Scoringverfahren zur Einteilung des nachwachsenden Haarkleides Score 0 1 2 3 4

Bedeutung Kein Wenig Mittel Fast voll Voll

3.3.2 Nachwachsendes Haarkleid

Anhand der gewonnenen Daten erfolgte zunächst für jede Behandlungsgruppe eine Be-

rechnung der Mittelwerte, Standardabweichungen sowie Minimum und Maximum des

nachwachsenden Haarkleides über die fünf Perioden (siehe auch Daten im Anhang).

Dabei wurden diese Werte anhand des oben beschriebenen Scoringverfahrens ermittelt.

Ergebnisse

45

Abbildung 14: MW mit SD der Gruppe Haarwachstum, ermittelt aus Scoringverfahren, aufgeschlüsselt nach Behandlungen und Perioden, * stat. Signifikanz (p<0.05)

Abbildung 14 stellt die Mittelwerte und Standardabweichungen für die drei Behand-

lungsgruppen über den zeitlichen Verlauf dar und hebt statistisch signifikante Unter-

schiede hervor. Generell zeigte sich, dass bei fast allen Mäusen am Ende des Versuches

das Haarkleid vollständig nachgewachsen war. Da die einzelnen Versuchstage bei die-

ser Betrachtung in fünf Perioden zusammengefasst wurden, ergab sich in Periode 5,

dass die mit rHGF behandelten Versuchstiere das farblich intensivste und am vollstän-

digsten nachgewachsene Haarkleid besaßen (MW= 4, SD= 0). Auch die Mittelwerte der

Gruppen, die mit pdHGF und NaCl behandelt wurden, zeigten, dass ihr Fell fast gänz-

lich nachgewachsen war. Dabei ergab sich in dieser Periode für die pdHGF-Gruppe ein

MW von 3.389 (SD= 0.220), für die mit NaCl behandelten Versuchstiere ergab sich ein

Mittelwert von 3.889 (SD= 0.333).

Ergebnisse

46

Abbildung 15: Mittelwerte der Gruppe Haarwachstum ermittelt aus Scoringverfahren zur Messung des nachwachsenden Haarkleides, aufgeschlüsselt nach Behandlungen und Perioden

Nachdem in einer ANOVA-Berechnung für globale Effekte signifikante Wechselwir-

kungen aufgezeigt werden konnten, folgte eine Subgruppenanalyse für die einzelnen

Perioden.

Abbildung 15 verdeutlicht vergleichend die anhand des Scoringverfahrens ermittelten

Mittelwerte des nachwachsenden Haarkleides für die einzelnen Behandlungsgruppen

über den zeitlichen Verlauf. Bei dieser Periodeneinteilung fiel für die Perioden 3, 4 und

5 auf, dass statistisch signifikante Unterschiede zwischen der mit NaCl und der mit

pdHGF sowie zwischen der mit rHGF und der mit pdHGF behandelten Gruppe vorla-

gen. Es ließen sich jedoch keine statistischen Signifikanzen von Periode 3 bis ein-

schließlich Periode 5 zwischen den Behandlungen mit NaCl und rHGF untereinander

verzeichnen. Tabelle 11 zeigt den Vergleich der einzelnen p-Werte der Behandlungen

untereinander für die Periode 3 bis einschließlich Periode 5.

Ergebnisse

47

Tabelle 11: p-Werte der Behandlungen der Gruppe Haarwachstum für Periode 3 bis Periode 5 Nachwachsendes Haarkleid - Gruppe Haarwachstum Behandlungen Periode p-Wert NaCl + pdHGF 3 0.0077 NaCl + rHGF 3 0.5664 pdHGF + rHGF 3 0.0288 NaCl + pdHGF 4 <0.0001 NaCl + rHGF 4 0.1418 pdHGF + rHGF 4 <0.0001 NaCl + pdHGF 5 0.0001 NaCl + rHGF 5 0.3172 pdHGF + rHGF 5 <0.0001

Generell ergab sich, dass die Behandlung mit rHGF in den Perioden 4 und 5 das vollste

Haarwachstum aufwies und die Rate an nachwachsendem Haarkleid am stärksten be-

schleunigte. Das Haarwachstum der pdHGF-Gruppe hingegen war über alle Perioden

leicht verlangsamt und zeigte das kleinste Ausmaß an nachgewachsenem Haarkleid

(siehe auch Daten im Anhang).

3.3.3 Makroskopische Beurteilung der Zielparameter der Gruppe Haar-

wachstum

Die Ergebnisse der statistischen Auswertungen konnten durch makroskopische Be-

obachtungen des sichtbar nachwachsenden Haarkleides bestätigt werden.

In Periode 4 zeigte die Gruppe, die mit der Positivkontrolle rHGF behandelt wurde, die

größte Zunahme an nachwachsendem Haar, gefolgt von dem Haarkleid der mit NaCl

behandelten Vergleichsgruppe.

Zu Abschluss der Versuche glichen sich die Haare aller drei Behandlungsgruppen äu-

ßerlich sichtbar in ihrer Struktur und Farbe.

Die Zusammenfassung der Tage 17 bis 19 in die Periode 5 zeigte insgesamt ein leicht

verzögert nachwachsendes Haarwachstum für die mit pdHGF behandelten Versuchstie-

re.

Lohnenswert erscheint allerdings die Betrachtung des letzten Versuchstags 19 für die

drei Behandlungen mit pdHGF, rHGF und NaCl und der Vergleich mit dem aufgestell-

ten Scoringverfahren. Dabei fiel auf, dass die mit beiden Formen des HGFs behandelten

Tiere vollständig nachgewachsenes Haarkleid besaßen, bei der NaCl-Vergleichsgruppe

jedoch hatten zwei Mäuse lediglich die Punktzahl 3 erreicht. Am letzten Tag des Be-

trachtungszeitraums zeigte sich also, dass bei allen Mäusen, die sowohl mit rHGF als

Ergebnisse

48

auch mit pdHGF behandelt wurden, dass Haarkleid wieder vollständig und gänzlich

ausgeprägt vorhanden war. Bei den mit NaCl behandelten Versuchstieren zeigten sieben

Mäuse eine komplette Regeneration des Haarkleides (siehe Tabelle 12).

Tabelle 12: Scoringverfahren nachwachsendes Haarkleid an Tag 19 Maus MW

pdHGF 4.0000

rHGF 4.0000

NaCl 3.7778

Abbildung 16 zeigt für alle drei Behandlungsgruppen vergleichend das makroskopisch

sichtbar nachwachsende Haarkleid über den zeitlichen Verlauf.

Ergebnisse

49

Periode pdHGF rHGF NaCl

1

(d1)

2

(d5)

3

(d11)

4

(d17)

5

(d19)

Abbildung 16: Vergleich des Haarwachstums der drei Behandlungsgruppen über den zeitlichen Verlauf, Maßstab entspricht 1cm

Ergebnisse

50

3.4 Histologische Auswertungen der Gruppe Haarwachstum

Die Begutachtung der mit HE- und Sirius Red-gefärbten Präparate der Gruppe Haar-

wachstum erfolgte unter morphologischer Beurteilung.

3.4.1 Mikroskopische Betrachtung der Histologien

Für die Präparate der einzelnen Behandlungen mit pdHGF, rHGF und NaCl ließen sich

histologisch sichtbare Unterschiede bezüglich der Struktur ihrer Haarfollikel ausma-

chen.

Bei eingehender Betrachtung der Histologien der mit NaCl behandelten Vergleichs-

gruppe ließ sich eine fast regelrechte Verteilung der Haarfollikel nachweisen. Dabei

lagen die Haarbulbi bevorzugt in der Subkutis vor, daneben ließen sich jedoch auch

einige Bulbi im Korium ausmachen. Das Follikelepithel dieser Gruppe erschien prolife-

rationsaktiv und ihre Follikelarchitektur war geordnet.

Ein ähnliches Bild zeigte sich für die Präparate der mit rHGF behandelten Gruppe. Hier

fiel auf, dass ihr Follikelepithel ebenfalls eine geordnete, solide Struktur aufwies und

somit histologisch dem der mit NaCl behandelten Vergleichsgruppe entsprach. Bei der

Positivkontrolle (rHGF) konnte eine große Anzahl an Haarfollikeln gefunden werden,

die dicht gedrängt nebeneinander lagen. Eine gute Festigkeit der Haare konnte für diese

Gruppe nachgewiesen werden, jedoch erschien diese im Vergleich mit den Behandlun-

gen mit NaCl geringfügig reduzierter zu sein.

Im Vergleich mit der rHGF-Gruppe ließen sich mikroskopisch bei der mit pdHGF be-

handelten Versuchsgruppe anzahlmäßig etwas weniger Haarfollikel ausmachen. Zudem

zeigten sich ihre Haarfollikel nicht so eng zusammenliegend wie bei den mit rHGF be-

handelten Tieren. Stattdessen lagen sie in einiger Entfernung zueinander. Des Weiteren

war auffällig, dass ihr Follikelepithel wesentlich atropher erschien als das Epithel der

anderen beiden Behandlungsgruppen.

Abbildung 17 bis Abbildung 19 zeigen 20fache Vergrößerungen der Histologien der

einzelnen Behandlungsgruppen.

Ergebnisse

51

Abbildung 17: Histologie der mit pdHGF behandelten Gruppe mit weiter auseinanderliegenden Haarfol-likeln und atrophem Follikelepithel: HE Färbung, 20fache Vergrößerung

Abbildung 18: Histologie der mit rHGF behandelten Gruppe mit dicht aneinanderliegenden Haarfollikeln und proliferationsaktivem Follikelepithel: HE Färbung, 20fache Vergrößerung

Ergebnisse

52

Abbildung 19: Histologie der mit NaCl behandelten Gruppe mit nah aneinanderliegenden Haarfollikeln und proliferationsaktivem Follikelepithel: HE Färbung, 20fache Vergrößerung

3.4.2 Statistische Auswertung der mikroskopischen Betrachtung der Histo-

logien - Kapillarneubildung

Alle histologischen Präparate wurden am Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Bei

10facher Vergrößerung erfolgte eine Einteilung in je drei Gesichtsfelder. Mit Hilfe die-

ser Festlegung konnte die Anzahl der neugebildeten Kapillare ausgewertet werden.

Nachdem die Präparate aller Behandlungsgruppen sorgfältig gesichtet wurden, wurde

die Anzahl neu einsprossender Kapillare in drei unterschiedlichen Gesichtsfeldern (GF)

gezählt. Zunächst wurden darüber für die mit pdHGF, rHGF sowie mit NaCl behandel-

ten Gruppen Mittelwerte gebildet (siehe Tabelle 13).

Tabelle 13: Anzahl der neugebildeten Kapillare der Gruppe Haarwachstum Behandlung Anzahl

Beob. MW SD Minimum Maximum

pdHGF 9 13.26 4.83 7.00 23.33 rHGF 9 9.41 2.57 4.33 12.33 NaCl 9 1.56 1.29 0.00 4.00

Daraus ergab sich, dass die mit pdHGF behandelten Mäuse die größte Anzahl an neu-

gebildeten Kapillaren aufwiesen. Dies deutete darauf hin, dass die Angiogenese bei die-

ser Gruppe am stärksten ausgeprägt war. Auch die Versuchstiere, bei denen der Wachs-

Ergebnisse

53

tumsfaktor rHGF appliziert wurde, zeigten eine starke Neubildung von Kapillaren. Die-

se war jedoch geringer als bei der pdHGF-Gruppe (siehe Tabelle 13).

Das geringste Angiogeneseverhalten dagegen zeigten die Mäuse, die mit NaCl behan-

delt wurden. Bei ihnen konnte nur eine geringe Kapillarneubildung festgestellt werden.

Eine einfaktorielle Varianzanalyse zeigte, dass die Behandlungen einen signifikanten

Einfluss (p= <.0001) auf die Anzahl der Kapillaren hatten (siehe auch Daten im An-

hang).

Abbildung 20: MW und SD der Gruppe Haarwachstum für die Zielvariable Kapillarneubildung an Tag 19, * stat. Signifikanz (p<0.05)

Abbildung 20 stellt übersichtlich die Mittelwerte und Standardabweichungen für die

Zielvariable Kapillarneubildung der drei Behandlungsgruppen am Versuchsende dar

und weist auf statistisch signifikante Unterschiede in den Behandlungen hin. So wird

deutlich, dass sich die mittlere Anzahl der Kapillare in allen drei Behandlungsgruppen

signifikant unterschied. Spezifisch ließen sich statistische Signifikanzen zwischen den

Behandlungen mit pdHGF und NaCl (p= <.0001) sowie zwischen rHGF und NaCl (p=

<.0001) ausmachen. Zudem bestand auch zwischen den beiden HGF-Wirkformen

pdHGF und rHGF untereinander ein statistisch signifikanter Unterschied (p= 0.0189).

Ergebnisse

54

3.4.3 Statistische Auswertung der mikroskopischen Betrachtung der Histo-

logien – Haarfollikel

In den an Tag 19 entnommenen und anschließend mit HE- und Sirius Red-gefärbten

Gewebepräparaten zeigten alle drei Behandlungsgruppen eine Vermehrung neugebilde-

ter Haarfollikel. Vor allem die Präparate der mit rHGF behandelten Versuchstiere wie-

sen eine deutliche Zunahme nachwachsender Haarfollikel auf. Der Mittelwert dieser

Gruppe betrug 73.63, bei einer Standardabweichung von 13.98. Eine ähnlich starke

Wachstumstendenz der Haarfollikelspitzen zeigten auch die Mäuse, bei denen der

Wachstumsfaktor pdHGF injiziert wurde. Hier ergab sich ein Mittelwert von 62.00

(SD= 15.65). Die geringste Zahl wurde bei der Vergleichsgruppe (NaCl) gezählt. Im

Mittel betrug ihre Anzahl neuer Haarfollikel 55.78 mit einer Standardabweichung von

18.93 (siehe Tabelle 14).

Tabelle 14: Anzahl der nachgewachsenen Haarfollikel der Gruppe Haarwachstum Behandlung Anzahl


rHGF 9 73.63 13.98 50.00 96.67 pdHGF 9 62.00 15.65 43.67 83.67 NaCl 9 55.78 18.93 19.33 75.33

Somit ließ sich das stärkste Haarwachstum bei rHGF nachweisen, das geringste Aus-

maß an nachwachsenden Haarfollikeln war bei NaCl zu erkennen (siehe auch Daten im

Anhang).

Allerdings ließen sich keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den einzel-

nen Behandlungsgruppen feststellen.

Ergebnisse

55

Abbildung 21: MW und SD der Gruppe Haarwachstum für die Zielvariable nachgewachsene Haarfollikel an Tag 19

Abbildung 21 zeigt die Mittelwerte und Standardabweichungen für die Zielvariable

nachwachsender Haarfollikel der drei Behandlungen der Gruppe Haarwachstum am

letzten Versuchstag.

3.5 ELISA-Auswertungen der Gruppe Haarwachstum

Die ELISA-Auswertungen zeigten statistisch signifikante Unterschiede zwischen den

Seren der pdHGF-Gruppe und der rHGF-Gruppe (p= 0.0281). Dabei standen jeweils

sieben Blutseren der rHGF-Gruppe sowie sieben Seren der pdHGF-Gruppe und acht

Seren der NaCl-Gruppe zur Auswertung zur Verfügung. Bei den übrigen Herzpunktio-

nen waren die gewonnen Menge an Serum zu gering, sodass diese nicht weiter verwer-

tet werden konnten.

Die HGF-Konzentration der mit rHGF behandelten Gruppe betrug im Mittel

3385.35pg/ml, bei einer Standardabweichung von 2059.69pg/ml. Bei den mit pdHGF

behandelten Versuchstieren ergab sich mit 1030.27pg/ml (SD= 634.10pg/ml) der

kleinste Mittelwert der gemessenen HGF-Konzentration. Für die Vergleichsgruppe

(NaCl) ergab sich ein mittlerer Wert für die HGF-Konzentration von 2970.99pg/ml,

Ergebnisse

56

wobei die Standardabweichung bei 1446.84pg/ml lag (siehe Abbildung 22).

Abbildung 22: MW und SD der HGF-Konzentrationen der Gruppe Haarwachstum im Serum der Behand-lungsgruppen an Tag 19, * stat. Signifikanz (p<0.05)

Anhand dieser Mittelwerte konnte ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den

drei Behandlungsgruppen in der HGF-Konzentration nachgewiesen werden. Eine an-

schließende statistische Analyse der spezifischen Unterschiede lieferte das Ergebnis,

dass in den Konzentrationen der pdHGF-Gruppe sowie der rHGF-Gruppe (p= 0.0281)

statistisch signifikante Unterschiede vorlagen. Es konnten keine statistischen Signifi-

kanzen zwischen den Mäusen der Vergleichsgruppe NaCl und rHGF nachgewiesen

werden (p= 0.8675). Ebenso ließen sich keine statistisch relevanten Unterschiede zwi-

schen den Konzentrationen der Behandlungen mit NaCl und pdHGF ausmachen (p=

0.0663). Siehe auch Daten im Anhang.

Diskussion

57

4 Diskussion

4.1 Allgemeines

Die zentrale Frage dieser Arbeit bestand darin, herauszufinden, inwieweit patient deri-

ved HGF, sprich der aus Patientenserum gewonnene Wachstumsfaktor (pdHGF), die

kutane Wundheilung beschleunigt.

Bei Verletzungen der Haut stellen vor allem chronische, schlecht heilende Wunden ein

großes medizinisches Problem in der Behandlung dar. So führen unterschiedliche pa-

thophysiologische Abläufe zu einer Beeinträchtigung der Heilung dieser Wundformen

mit dem Resultat des gestörten Zusammenspiels und anhaltenden Mangels an Wachs-

tumsfaktoren199. Daher wurde eine Vielzahl von Versuchen unternommen, um effektive

Therapien zu entwickeln. Seit längerer Zeit richtet die Forschung daher verstärktes Au-

genmerk auf den Einsatz exogener Wachstumsfaktoren3,198. So gehören Greenhalgh et

al. (1990) mit zu den ersten Forschungsgruppen, die den Gebrauch von Wachstumsfak-

toren in der Wundheilung diskutierten und diesbezüglich vielversprechende Ergebnisse

mit Hilfe eines diabetischen Mausmodells lieferten82.

Eine Reihe von experimentellen Untersuchungen bestätigen, dass sich der Einsatz von

rekombinant hergestellten Wachstumsfaktoren positiv auf die Therapie chronischer

Wunden auwirkt200,147. Dabei wird in der vorliegenden Literatur HGF eine wesentliche

Rolle für die kutane Wundheilung in vitro und in vivo zugeschrieben. Eine Vielzahl von

Wundheilungsexperimenten demonstriert eindrucksvoll, dass HGF starke Eigenschaften

zur Förderung der Regeneration verschiedener Gewebe besitzt. Durch diese Fähigkeiten

spielt HGF eine maßgebliche Rolle in der Heilung von Hautwunden174 und begünstigt

die Rekrutierung von Mastzellen, Monozyten und neutrophilen Granulozyten in das

Wundmilieu8,138. Yoshida et al. (2003) zeigten, dass der Heilungsprozess von Wunden

durch eine Inaktivierung von HGF und seinem Rezeptor Met mittels neutralisierender

Antikörper im Wundexsudat deutlich protrahiert wird und erst verzögert einsetzt265.

Demgegenüber hat eine Überexpression von HGF und seinem Rezeptor Met bei trans-

genen Mäusen deutlichen Einfluss auf die Wundheilung und führt zu einer signifikanten

Verkürzung in der Dauer der Heilung. Diese Studien lassen den Schluss zu, dass HGF

wesentlich an der Neovaskularisation sowie der Ausbildung von Granulationsgewebe

während der Wundheilung in vivo beteiligt ist und dadurch erheblich zu einer Beschleu-

nigung des kutanen Heilungsprozesses beiträgt234,184. Darüber hinaus existieren Studien

Diskussion

58

zur topischen Applikation von HGF am Tiermodell, die aussichtsreiche Ergebnisse be-

züglich einer positiven Beeinflussung von HGF auf gestörte kutane Wundheilung lie-

fern175,264. Jedoch sind hierfür bisher nur Daten für rekombinant hergestelltes HGF

(rHGF) vorhanden. Studien, die den Einfluss von pdHGF auf die Wundheilung in vivo

untersuchen, fehlen bislang.

Daher lag der Schwerpunkt dieser Arbeit darin, systematisch die Wirkung von pdHGF

auf die Wundheilung in vivo zu analysieren und die gewonnenen Ergebnisse verglei-

chend zu rHGF, das als Positivkontrolle diente, darzustellen.

Wie bereits erwähnt, unterscheidet sich das aus Patientenserum gewonnene pdHGF von

der rekombinanten Form des Wachstumsfaktors HGF dadurch, dass es ein schwereres

Molekulargewicht aufweist262. Diese Eigenschaft beeinflusst die Stabilität von pdHGF,

wobei angenommen wird, dass diese natürliche Form des Wachstumsfaktors HGF eine

stabilere Form als rHGF darstellt. Die Versuche in der vorliegenden Arbeit wurden mit

rHGF vorgenommen, welches in Insektenzellen hergestellt wurde. Dabei sind sowohl

pdHGF als auch rHGF beide glykosyliert. Jedoch unterscheiden sich bei rHGF die an-

gehängten Zuckerreste aufgrund der evolutionären Entfernung der Insektenspezies zum

Menschen leicht. Durch Bioassays ist allerdings belegt, dass auch rHGF auf Zellen ak-

tiv ist. Folglich besitzt rHGF zwar eine ebenso aktive Wirkung auf Zielzellen wie

pdHGF, jedoch hat die Bindung unterschiedlicher Zuckermoleküle Auswirkungen auf

die Stabilität und Aktivität der beiden Formen der Wachstumsfaktoren.

4.2 Validierung der Versuchsmodelle

Zur Überprüfung der Hypothese, ob pdHGF die Wundheilung signifikant beeinflusst,

wurden zwei Versuchsmodelle herangezogen. Dabei ermöglichen die Versuchsabläufe

beider Modelle Rückschlüsse hinsichtlich der Regeneration und Reparation von Gewe-

be während der Wundheilung in vivo.

Als Grundlage für die Durchführung der Wundheilungsversuche dienten die Versuche

von Yoshida et al., die 2004 in der Zeitschrift Growth Factors mit dem Titel „Recombi-

nant hepatocyte growth factor accelerates cutaneous wound healing in a diabetic mouse

model“ veröffentlicht wurden264. In dieser Studie wurde an einem diabetischen Maus-

modell beobachtet, dass rHGF die Fähigkeit besitzt, kutane Wundheilung signifikant zu

beschleunigen. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit der Effekt von pdHGF auch an

dem gleichen diabetischen Mausmodell überprüft. Die Untersuchungen erfolgten dabei

an Mäusen des Stammes C57BL/KS (=BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J), da ihr Hei-

Diskussion

59

lungsprozess bedingt durch ihre diabetische Stoffwechsellage, in Analogie zur chroni-

schen Wunde beim Menschen, ebenfalls verzögert ist33,59,54,79. Ferner dient dieser Mäu-

sestamm als Modell für eine eingeschränkte und retardierte Wundheilung bei der Über-

prüfung der Wirksamkeit weiterer Wachstumsfaktoren82,6,237. Somit können diabetische

Mäuse als Beispiel herangezogen werden, um die Vorgänge eines gestörten physiologi-

schen Heilungsprozesses zu untersuchen. Viele Patienten mit chronischen Wunden lei-

den unter Stoffwechselstörungen, wie beispielsweise Diabetes mellitus. Der Einsatz von

diabetischen Mäusen hilft, die spezifischen Effekte des Wachstumsfaktors HGF in sei-

nem Indikationsgebiet genauer zu erforschen.

Ein geringfügiger Unterschied dieser Studie zu dem Modell von Yoshida et al. (2004)

liegt im Behandlungsprotokoll. Wählten Yoshida et al. (2004) eine fünftägige Applika-

tion des Wachstumsfaktors als optimalen Behandlungszeitraum, wurde in den beiden

vorliegenden Modellen HGF insgesamt an sechs aufeinanderfolgenden Tagen verab-

reicht. Diese Änderung erfolgte in Absprache mit der Firma Octapharma GmbH, Lan-

genfeld, Deutschland und erwies sich ebenfalls durch unsere Vorversuche als sinnvoller

Zeitraum.

Auch die Art der Wundsetzung und Applikation des Wachstumsfaktors geschah nach

Durchsicht der Literatur und unter Berücksichtigung vergleichbarer Modelle. Eine ähn-

liche Herangehensweise findet sich bei Brown et al. (1994), die mit Hilfe ihrer Versu-

che belegten, dass PDGF und TGF-β synergistisch die Wundheilung unterstützen25.

Analog gingen Greenhalgh et al. (1990) vor, um den Einfluss von PDGF und FGF auf

die Wundheilung darzustellen82. Allerdings erfolgte bei beiden Untersuchungen die

Applikation der Negativkontrolle nicht parallel zur Positivkontrolle an derselben Maus.

Yoshida et al. (2004) und Bevan et al. (2004) jedoch verwendeten diese Technik bei der

Erforschung des Einflusses von HGF auf die Wundheilung. Dieses Verfahren erleichtert

den direkten, makroskopisch sichtbaren Vergleich, weshalb die Versuche der vorliegen-

den Studie ebenso durchgeführt wurden.

In einem zweiten Versuchsmodell dieser Arbeit wurde auf dem Rücken von C57BL/6

Mäusen eine definiert große Fellstelle rasiert und diese mit pdHGF behandelt. Um die

Auswirkungen des Wachstumsfaktors HGF auf die Wundheilung festzustellen, diente

das vollständige Nachwachsen des Haarkleides als zentrales Beurteilungskriterium für

die Zellregeneration und Proliferation und wurde als Index für den Heilungsprozess

betrachtet. Ein ähnliches Vorgehen findet sich bei den Versuchen von Nayeri et al.

(2007), wobei das nachwachsende Haar ebenfalls als Parameter für den Ablauf der

Wundheilung genommen wurde173. Zwar existieren eine Vielzahl von experimentellen

Diskussion

60

Studien, welche die Effekte von Wachstumsfaktoren auf das Haarwachstum an rasierten

Mäusen untersuchen186,246, allerdings ohne dabei ihre direkten Auswirkung auf die

Wundheilung zu betrachten.

Darüber hinaus findet der C57BL/6-Mäusestamm auch in der Haarforschung zur Analy-

se verschiedener Haarerkrankungen Verwendung und ist ein etabliertes Versuchsmo-

dell188,228,31. Für den vorliegenden Versuch wurden C57BL/6 Mäuse verwendet, um für

die physiologische Wundheilung in vivo ein vergleichbares Modell zu generieren. Diese

Mauslinie ist der meistverwendete Inzuchtstamm zur Züchtung transgener Mäuse, die

beständig als Vorlage menschlicher Erkrankungen genutzt werden249,7. Zudem existie-

ren experimentelle Untersuchungen, in welchen die Auswirkungen von rHGF, ebenso

wie von anderen Wachstumsfaktoren, an dem C57BL/6 Mausmodell ermittelt

wurden187,196.

Da für rHGF bereits belegt ist, dass es die Wundheilung und Zellregeneration günstig

beeinflusst264,11, diente diese Form des Wachstumsfaktors in allen Versuchen als Posi-

tivkontrolle. Als Negativkontrolle kam für die Vergleichsgruppe NaCl zur Anwendung.

Als Gruppengröße wurden nach den Vorgaben des Institutes für Medizinische Statistik

der RWTH Aachen für beide Versuche jeweils zehn Mäuse pro Behandlungsgruppe

gewählt. Diese Anzahl ergab sich zudem in Anlehnung an ähnliche Modelle zur Erfor-

schung des Einflusses von Wachstumsfaktoren auf die Wundheilung237,252,30.

Für die Versuche der gegenwärtigen Arbeit wurden HGF-Lösungen in einer Konzentra-

tion von 5ng/ml hergestellt. Zuvor durchgeführte in vitro Versuche an Kulturen von

Keratinozyten und Fibroblasten unterstützten die Wahl dieser Dosierung. Hierbei er-

reichte der Effekt von HGF auf die Proliferation von Keratinozyten und Fibroblasten

bei 5ng/ml sein Maximum.

Als zeitlicher Rahmen wurde für beide Versuche ein Beobachtungszeitraum von 19

Tagen bestimmt. Diese Festlegung erfolgte, nachdem sich in Vorversuchen herausge-

stellt hatte, dass die Wundheilung sowie das Haarwachstum und somit die Regeneration

und Reparation des Gewebes innerhalb einer Zeitspanne von 14 Tagen im Wesentlichen

abgeschlossen waren (siehe auch Tabelle 15). In der vorliegenden Studie wurde ein Be-

obachtungszeitraum von 19 Tagen gewählt, um die Wahrscheinlichkeit eines vollstän-

digen Wundschlusses zu erhöhen.

Diskussion

61

Tabelle 15: Periodeneinteilung inklusive Wundheilungsphasen

Periode Tage Wundheilungsphase 1 1 - 4 Exsudationsphase 2 5 - 8 Proliferationsphase 3 9 - 12 frühe Regenerationsphase 4 13 - 16 späte Regenerationsphase 5 17 - 19 Narbenbildung

Dabei konnten die physiologischen Wundheilungsphasen mit der in dieser Arbeit vor-

genommenen Einteilung in fünf Perioden gleich gesetzt werden. In dem ersten Ver-

suchsmodell wurde primär der Wundschluss über den zeitlich festgelegten Rahmen von

insgesamt 19 Tagen begutachtet und ausgemessen (siehe auch Tabelle 2). Der Wund-

schluss stellt einen klinisch relevanten Parameter zur makroskopischen Feststellung der

unterschiedlichen Wundheilungsphasen bis hin zur vollständig abgeschlossenen Wund-

heilung dar. Daher wurde von einer reinen Begutachtung der Re-Epithelialisierung der

Wunden abgesehen. Ein wesentlicher Aspekt lag folglich in der kontinuierlichen

Vermessung der Größenreduktion der einzelnen Wundflächen über den zeitlichen Ver-

lauf, wodurch valide Aussagen über die Wundheilung getroffen werden konnten.

In dem zweiten Versuch erfolgte vor allem eine Bewertung des nachwachsenden Haar-

kleides (siehe auch Tabelle 4).

Nach Abschluss der Versuche wurden den Versuchstieren aller Gruppen Hautproben

entnommen, welche histologisch aufgearbeitet und begutachtet wurden. Dabei lag spe-

ziell in der Gruppe Haarwachstum der Fokus in der Auszählung neugebildeter Haarfol-

likel sowie neuentstandener Kapillare, weil HGF erwiesenermaßen starke angiogeneti-

sche Fähigkeiten besitzt270,28. Da die Angiogenese mit der Ausbildung von Granulati-

onsgewebe verbunden ist, galt diese Begutachtung als Hinweis für eine verbesserte

Wundheilung264. Zusätzlich wurde bei der Gruppe Haarwachstum die Höhe der gebilde-

ten HGF-Konzentration im murinen Blut mit Hilfe einer ELISA-Messung quantifiziert.

Bei der Gruppe Wundheilung wurde von einer derartigen Vorgehensweise abgesehen,

da hier der Wachstumsfaktor lediglich oberflächlich auf die Wunden appliziert worden

war. Bei dieser Gruppe lag der Schwerpunkt vor allem auf der planimetrischen Ausmes-

sung der Wundgröße über den zeitlichen Verlauf sowie auf der histologischen Begut-

achtung der Kollagenfasern und der Struktur des Koriums.

Da sich die murine Haut in ihrem Aufbau nur unwesentlich von der des Menschen un-

terscheidet, können die gewonnen Erkenntnisse unserer Studie weitestgehend auf die

humane Haut übertragen werden149.

Diskussion

62

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen die Resultate aus vorherigen Unter-

suchungen und belegen somit die Validität der beiden Versuchsmodelle.

Diskussion

63

4.3 Wirkung von HGF in der Gruppe Wundheilung

4.3.1 HGF in der kutanen Wundheilung - Auswirkung auf die Wundgröße

Zahlreiche Untersuchungen belegen, dass einer Vielzahl von unterschiedlichen Wachs-

tumsfaktoren eine essentielle Rolle bei der Wundheilung zukommt. Für den Wachs-

tumsfaktor HGF ist bekannt, dass er wesentlich an der Wundheilung beteiligt ist265.

Präklinische Studien belegen, dass die äußere Applikation von Wachstumsfaktoren zu

einer verbesserten Heilung von chronischen Wunden führen kann144,158,84.

Yoshida et al. demonstrierten im Jahre 2004 an einem diabetischen Mausmodell erst-

mals, dass die Applikation von rekombinantem HGF die kutane Wundheilung signifi-

kant unterstützt, indem es die Ausbildung von Granulationsgewebe, die Angiogenese

sowie die Re-Epithelialisierung fördert264. Zudem zeigten ihre Untersuchungen, dass

HGF den Heilungsprozess durch Unterstützung des Wundschlusses beschleunigt. Diese

Ergebnisse konnten anhand von weiteren in vivo Studien von Bevan et al. (2004) wie-

derholt werden11.

Da bis zum heutigen Zeitpunkt Daten über den Einfluss von aus Patientenserum ge-

wonnenem pdHGF fehlen, liegt der Fokus dieser Arbeit auf der Analyse von pdHGF.

Um das vorliegende Modell zu validieren, dient rekombinant hergestelltes HGF als Po-

sitivkontrolle. Die aktuelle Literatur belegt, dass rHGF zuverlässig eine biologische

Aktivität aufweist.

Das erste Versuchsmodell der vorliegenden Untersuchung zeigte sowohl für pdHGF als

auch für rHGF eine statistisch signifikante und makroskopisch sichtbare Beschleuni-

gung der Wundheilung besonders in Periode 4, also im Zeitraum von Tag 13 bis Tag

16. Hierbei zeigten die Behandlungen mit pdHGF und rHGF im Vergleich mit der Ne-

gativkontrolle NaCl signifikant positive Auswirkungen auf den Wundschluss. Die mit

beiden Formen des Wachstumsfaktors HGF versorgten Wunden zeigten in Periode 4

einen schnelleren Wundschluss als die mit NaCl (MW= 0.031cm2, SD= 0.0173cm2)

behandelten Wunden. Hierbei lag im Vergleich der größte Abstand zwischen den

Wundflächen bei den Wunden der pdHGF-Versuchsgruppe und denen der NaCl-

Vergleichsgruppe vor. Dies bedeutet, dass pdHGF (MW= 0.014cm2, SD= 0.010cm2) im

Zeitraum von Tag 13 bis Tag 16 die beste Wundheilung aufweisen konnte. Auch die mit

rHGF behandelten Wunden (MW= 0.018cm2, SD= 0.014cm2) zeigten hier eine signifi-

kante Differenz zu den Wunden der Vergleichsgruppe. Diese Ergebnisse für die Wund-

Diskussion

64

heilung wurden zusätzlich durch die Ausmessung definierter Abstände der Wundhöhe

und Wundbreite bestätigt. Auch für diese beiden Zielparameter ergab sich in Periode 4

eine signifikante Abnahme der Wundhöhe sowie der Wundbreite der mit pdHGF und

rHGF behandelten Wunden im Gegensatz zu den Wunden, die mit NaCl behandelt wur-

den. Zwar unterschieden sich die Behandlungen beider HGF-Wirkformen nur marginal

voneinander, aber beide standen in deutlicher Differenz zur Vergleichsgruppe. Somit

verdeutlichen die Untersuchungen der vorliegenden Studie, dass HGF in Periode 4 ei-

nen ausschlaggebenden Einfluss auf die Wundheilung nimmt. Während dieser Zeit-

spanne wurde für die Behandlungen mit pdHGF der größte Einfluss festgestellt, dicht

gefolgt von den mit rHGF behandelten Wunden. Die Wunden der mit NaCl behandelten

Mäuse zeigten in Periode 4 noch deutlich größere Wundflächen. Bei ihnen erfolgte eine

vollständige Wundheilung zeitlich verzögert in Periode 5.

Zusätzlich fällt auch schon eine beschleunigte Wundheilung der Wundflächen im Zeit-

raum von Periode 3 bis einschließlich Periode 4 für die mit pdHGF und rHGF behandel-

ten Wunden auf. Hierfür zeigt die Behandlung mit pdHGF ebenfalls die schnellste Rate

in der Verkleinerung der Wundflächen. Ab dieser Zeitspanne begann sich die Heilung

für die Wunden der NaCl-Gruppe zu verzögern.

Diese erhobenen Daten decken sich größtenteils mit den Ergebnissen der Studien zu

rHGF von Yoshida et al. (2004) sowie von Bevan et al. (2004).

Allerdings setzt bei Bevan et al. (2004) ein signifikanter Unterschied im Verschluss der

mit rHGF behandelten Wunden zeitlich früher ein. Dort findet ab dem zehnten Tag nach

der Wundsetzung eine signifikante Beschleunigung des Wundschlusses der mit rHGF

behandelten Wunden im Gegensatz zur Vergleichsgruppe statt und setzt somit etwas

früher ein. Die Beschleunigung ab dem zehnten Versuchstag entspricht zeitlich der Ein-

teilung in Periode 3, wie sie bei der vorliegenden Studie vorgenommen wurde. In der

gegenwärtigen Arbeit zeigt sich eine signifikante Veränderung ab dem 13. Tag nach

Wundsetzung, sprich direkt zu Beginn von Periode 4. Die Diskrepanz der Daten kann

möglicherweise dadurch begründet werden, dass bei Bevan et al. (2004) mit 2000ng

HGF/d eine deutlich höhere täglich applizierte HGF-Konzentration zum Einsatz kam.

Tabelle 16 zeigt übersichtlich den Vergleich der Ergebnisse der Studie von Bevan et al.

(2004) mit den Befunden der vorliegenden Studie bezüglich des zeitlichen Eintretens

einer beschleunigten Wundheilung.

Diskussion

65

Tabelle 16: Studienvergleich in Bezug auf Beschleunigung der Wundheilung Vergleich der Studien bezüglich beschleunigter Wundheilung

Studie Input: rHGF-Konzentration/Wunde/Tag [ng/ml]

Output: Zeitpunkt signifi-kanter Beschleunigung des Wundschlusses [d]

Bevan et al. (2004) 2.000 10 Vorliegende Studie (2011) 1 13

Bei den Versuchen von Yoshida et al. (2004) schlossen die mit rHGF behandelten

Wunden nach 14 Tagen vollständig. Nach der Einteilung, die in der gegenwärtigen Stu-

die vorgenommen wurde, entspricht dies zeitlich der Periode 4. Die Wunden, die von

der Forschungsgruppe von Yoshida et al. (2004) mit der Negativkontrolle NaCl behan-

delt worden waren, schlossen erst nach 21 Tagen. Da in unseren Untersuchungen der

Wundschluss insgesamt an nur 19 aufeinanderfolgenden Tagen beobachtet wurde, kann

hierfür keine äquivalente Einteilung aufgestellt werden. Ein Wundschluss nach 21 Ta-

gen würde zeitlich gesehen eine weiterführende Einteilung in sechs Perioden notwendig

machen. Allerdings lässt sich feststellen, dass die Ergebnisse von Yoshida et al. (2004)

den Befunden der vorliegenden Studie ähneln. Zwar besteht im Vergleich eine leichte

zeitliche Differenz für den vollständigen Wundschluss, jedoch zeigen die mit HGF be-

handelten Wunden in der vorliegenden Arbeit ein ähnliches Heilungsverhalten. In Peri-

ode 5, also ab Tag 17, kann für alle Wunden der gegenwärtigen Studie, die mit HGF

behandelt worden waren, ein fast vollständiger Wundschluss verzeichnet werden und es

ist kein Wundgeschehen mehr nachzuweisen.

Tabelle 17 stellt diese Ergebnisse für rHGF im Vergleich zu den Befunden von Yoshida

et al. (2004) vereinfacht dar.

Tabelle 17: Studienvergleich in Bezug auf kompletten Wundschluss

Vergleich der Studien bezüglich kompletten Wundschlusses Studie Input: rHGF-

Konzentration/Wunde/Tag [ng/ml]

Output: Zeitpunkt des kompletten Wundschlusses [d]

Yoshida et al. (2004) 10.000 14 Vorliegende Studie (2011) 1 17

Allerdings ist insgesamt festzuhalten, dass für alle Behandlungsgruppen ein fast voll-

ständiger Wundschluss am Ende der Versuchsdurchführung, sprich an Tag 19, nachzu-

weisen ist. Dass bei Yoshida et al. (2004) der Wundschluss der mit rHGF behandelten

Wunden früher einsetzt als bei den Wunden der vorliegenden Untersuchung liegt sehr

Diskussion

66

wahrscheinlich daran, dass Yoshida et al. an fünf aufeinanderfolgenden Tagen täglich

10.000ng HGF auf die Wunden applizierten (siehe Tabelle 17).

Bei den Forschungsgruppen von Yoshida et al. (2004) sowie von Bevan et al. (2004)

kommen in beiden Fällen wesentlich höhere Konzentration des rekombinanten HGFs

zur Anwendung als bei den gegenwärtigen Versuchen, in denen täglich lediglich

1ng/1ml HGF pro Wunde appliziert wurden. Trotzdem reichen die in der vorliegenden

Studie verwendeten Konzentrationen aus, um in der Behandlung mit pdHGF signifikan-

te Erfolge zu verzeichnen.

Darüber hinaus weichen sowohl das Heilungsverhalten als auch die Geschwindigkeit

des Wundschlusses in den vorliegenden Versuchen nur unerheblich von den Daten von

Yoshida et al. (2004) und Bevan et al. (2004) ab. Diese Ergebnisse führen demnach zu

der Annahme, dass auch niedrigere HGF-Konzentrationen zu einer erfolgreichen Beein-

flussung der Wundheilung führen können. Dementsprechend könnten für therapeutische

Zwecke auch wesentlich geringere Konzentrationen an HGF genutzt werden als aus

bisherigen Versuchen bekannt ist.

Bestätigt sich in weiterführenden Untersuchungen, dass geringere HGF-

Konzentrationen ebenso zu einer Beschleunigung und Verbesserung der Wundheilung

führen, wäre dies auch aus ökonomischer Sicht von enormer Bedeutung, da es eine er-

hebliche Reduktion der Anwendungskosten zur Folge hätte und zu einer effizienteren

Nutzung von HGF führen könnte. Die Ergebnisse unserer Studie lassen diesbezüglich

erste Vermutungen zu und sollten zukünftig weiter verfolgt werden.

Die gewonnenen Daten dieser Studie weisen darauf hin, dass beide Formen des Wachs-

tumsfaktors HGF in der Lage sind die Wundheilung zu beschleunigen. Durch die Er-

gebnisse dieser Arbeit kann das Fazit gezogen werden, dass es sich lohnt, die einzelnen

Perioden der Wundheilung im Hinblick auf die Behandlung mit dem Wachstumsfaktor

HGF detaillierter zu betrachten.

Beweise für die physiologische Rolle und den positiven Einfluss von HGF in der Hei-

lung von Hautwunden werden von vielen Studien geliefert265,41. Unsere Ergebnisse ver-

deutlichen zudem, dass die Behandlung mit HGF, sei es die aus Patientenserum gewon-

nene oder die rekombinante Form des Wachstumsfaktors, vor allem im Zeitraum zwi-

schen Tag 13 bis Tag 16 eine signifikante Einflussgröße auf den Wundschluss darstellt.

Für zukünftige Studien bedeutet dies, dass auf diese Periode verstärktes Augenmerk in

der Behandlung chronischer Wunden mit dem Wachstumsfaktor gelegt werden sollte.

Diskussion

67

4.3.2 Makroskopische Veränderungen der Haut der Gruppe Wundheilung

Die in dieser Studie statistisch gewonnenen Erkenntnisse bezüglich des Zielparameters

Wundgröße decken sich mit den makroskopisch sichtbaren Veränderungen der Wunden

aller Behandlungsgruppen über den zeitlichen Verlauf. Äußerlich sichtbar war, dass der

Wundschluss der Wunden, die sowohl mit pdHGF als auch mit rHGF versorgt wurden,

zeitlich etwas früher einsetzte und auch eher abgeschlossen war als bei den mit NaCl

behandelten Wunden.

In vivo Untersuchungen von Nakanishi et al. (2002) legten nahe, dass der Gentransfer

von HGF auf kutane Wunden von Ratten nicht nur die Re-Epithelialisierung und Neo-

vaskularisation begünstigt, sondern auch die Ausbildung von Narbengewebe vermin-

dert168. Ähnliche Versuche von Yoshida et al. (2003, 2004) zeigten, dass die Applikati-

on von HGF auf murine Hautwunden die Narbenbildung reduziert, da es den Wund-

schluss unterstützt ohne eine Überexpression an Granulationsgewebe

hervorzurufen265,264.

Ausgehend von diesen Beobachtungen wurden die Wunden in der vorliegenden Studie

zudem auf das Aussehen und die Beschaffenheit ihrer Narbenstruktur begutachtet.

Hinsichtlich der definierten Zielparameter für die Gruppe Wundheilung wurde diesbe-

züglich für die drei Behandlungen statistisch kein Vorteil gesehen, jedoch zeigt sich

subjektiv bei den Wunden, die mit pdHGF oder rHGF behandelt wurden, dass die Nar-

benbildung zeitlich etwas früher einsetzte als bei den Wunden der Vergleichsgruppe

(NaCl). Beim Vergleich der beiden HGF-Wirkformen untereinander konnte dabei mak-

roskopisch kein wesentlicher Unterschied im Aussehen oder der Struktur ihrer Wunden

festgestellt werden. Am letzten Tag der Behandlung waren alle Wunden beider HGF-

Wirkformen fast gänzlich verschlossen und verkleinert, wobei die Farbe der verbliebe-

nen Narben vereinzelter Wunden geringfügig blasser erschien als bei denen der Ver-

gleichsgruppe. Einige wenige Wunden, die mit NaCl behandelt worden waren, wiesen

zum Abschluss der Versuche noch leicht rötliches Narbengewebe auf. Jedoch waren

diese Wunden ebenfalls in ihrem Umfang deutlich verkleinert und reizlos, sodass insge-

samt gesehen auch bei den Wunden der mit NaCl behandelten Vergleichsgruppe eine

Abnahme der Farbintensität zu erkennen war.

Aus makroskopischer Sicht ähneln diese Ergebnisse den Resultaten vorausgegangener

Studien265,264. Unsere Studie lässt für die mit beiden Formen des HGFs behandelten

Wunden eine etwas früher einsetzende Abblassung und Abheilung der narbigen Struk-

turen erkennen. Allerdings waren diese Effekte im Vergleich mit NaCl nicht signifikant

nachweisbar, sodass in zukünftigen Studien das Interesse verstärkt auf den Einfluss von

Diskussion

68

pdHGF auf die Abheilung von Narbengewebe gelegt werden sollte.

Somit vermitteln die sichtbaren Ergebnisse unserer Arbeit rein subjektiv gesehen den

Anschein, dass sich sowohl pdHGF als auch rHGF in gleicher Weise begünstigend auf

die Ausbildung und das Aussehen von Narbenstrukturen auswirken. Diese Überlegung

sollte in weiterführenden Untersuchungen eingehender beobachtet werden. So könnte es

auch für den Aspekt der Narbenbildung sinnvoll sein, diesen fokussierter für die Perio-

de 4 zu studieren. Eine weitere Applikation des Wachstumsfaktors HGF in dieser Zeit-

spanne könnte somit möglicherweise positiv das Aussehen und die Struktur des Nar-

bengewebes beeinflussen.

4.3.3 Histologisch sichtbare Veränderungen der Gruppe Wundheilung

Die Begutachtung der histologisch gefärbten Präparate der Hautbiopsien, die am Ende

der Versuchsdurchführung entnommenen wurden, erfolgte unter histomorphologischen

Gesichtspunkten. Dabei wurden die Präparate mit den klassischen histologischen Fär-

bungen HE und Sirius Red angefertigt. Diese gängigen Färbungen werden in vielen

Studien zur orientierenden Darstellung von Gewebeschnitten benutzt, um Wundheilung

mikroskopisch sichtbar zu machen179,185,168. Da die Bildung von Granulationsgewebe

auch mit der Ausbildung kollagener Strukturen korreliert, wurden die histologischen

Hautbiopsien der Gruppe Wundheilung diesbezüglich eingehend betrachtet. Diese Me-

thode deckt sich mit dem Vorgehen etablierter Versuche zur histologischen Auswertung

der Wundheilung264.

In der vorliegenden Studie zeigte das Korium der mit NaCl behandelten Wunden eine

ordnungsgemäße Struktur und ähnelte stark der regelhaften Epithelialisierung des muri-

nen Ausgangsgewebes. Der regelmäßige Aufbau der murinen Haut sprach dafür, dass

sich die Haut im Bereich der gesetzten Wunden wieder vollständig regeneriert hatte.

Zudem lagen die Kollagenfasern der mit NaCl behandelten Hautwunden locker im ge-

samten Korium verteilt. Zusammengefasst zeigte der Großteil der Wunden der Ver-

gleichsgruppe (NaCl) an Tag 19 eine histologisch sichtbare Wundheilung. Diese Ergeb-

nisse decken sich mit dem natürlichen Aufbau des Ausgangsgewebes und belegen die

ordnungsgemäße Durchführung des Versuches. Da im Allgemeinen nach zehn bis 14

Tagen bereits eine Re-Epithelialisierung und Bildung von Granulationsgewebe einsetzt,

ist es nicht verwunderlich, dass die Wunden der Vergleichsgruppe eine regelrechte An-

ordnung ihrer Hautstrukturen aufwiesen.

Diskussion

69

Dagegen erschien das Korium der Hautbiopsien der Wunden, die mit rHGF behandelt

wurden, wesentlich kompakter. Die Struktur ihrer Dermis war im Vergleich zu den Ge-

webeproben der Vergleichsgruppe insgesamt dichter. Die Kollagenfasern lagen enger

aneinander angeordnet und ihr Faserwerk wirkte starrer. Diese Ergebnisse lassen den

Schluss zu, dass die kollagenen Fasern der rHGF-Gruppe in ihrer Elastizität verringert

waren, was eine Abnahme der elastischen Fähigkeit dieser Fasern bedeutet. Dieses Re-

sultat korreliert mit den histologischen Befunden von Narbengewebe, da auch hier die

gebildeten Kollagenfasern weniger elastisch sind als in der normalen Haut. Eine Über-

expansion von Granulationsgewebe ließ sich für die rHGF-Gruppe nicht finden.

Im Vergleich zu den Hautbiopsien der mit rHGF behandelten Wunden erschienen die

Kollagenfasern der pdHGF-Gruppe weniger plump. Das Korium glich in Struktur und

Aufbau dem der NaCl-Vergleichsgruppe, jedoch waren die Kollagenfasern der mit

pdHGF behandelten Hautbiopsien kürzer. Ihre Haut erschien insgesamt beweglicher

und auch elastischer als bei der rHGF-Gruppe. Daraus ergibt sich die Folgerung, dass

die Haut der pdHGF-Gruppe weniger eine Sollbruchstelle darstellt. Auch diese Gruppe

zeigte keine übermäßige Bildung von Granulationsgewebe. Im Vergleich mit den mit

rHGF behandelten Wunden, stellt sich die Behandlung mit pdHGF als vorteilhafter dar,

da ihre Hautstruktur zu Versuchsende eine höhere Elastizität aufwies und zugleich dem

physiologischen Aufbau der Dermis ähnelte.

Alle Hautbiopsien der Wunden, die mit rHGF oder pdHGF behandelt wurden, schlossen

akkurat ohne überschießendes Granulationsgewebe zu zeigen. Diese Feststellung deckt

sich mit den Befunden anderer Forschungsgruppen264. Interessant ist, dass die Applika-

tion anderer Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise TGF-β und bFGF, eine andauernde

subkutane Fibrose hervorruft, was die Anfälligkeit gegenüber Narbenbildung

erhöht4,154,219. Studien von Wu et al. (2004) demonstrieren jedoch ein anderes Bild für

den Wachstumsfaktor HGF. So verdeutlichen sie, dass eine Gentransfektion von HGF

das Krankheitsbild der dermalen Sklerose positiv beeinflusst257. Kishimoto et al. (2010,

2009) zeigten, dass die Injektion von HGF in verletzte Stimmlippen die Ausbildung von

Narbengewebe vermindern kann107,108. In unserer Studie konnte anhand der histologi-

schen Auswertungen zwar keine statistisch signifikante Reduktion der Narbenbildung

gefunden werden, jedoch ließ sich erkennen, dass kein überschießendes Wachstum so-

wohl von Granulations- als auch von Narbengewebe vorlag.

Bei der Durchführung dieses Versuchsmodells ist allerdings anzumerken, dass nur zum

Versuchsende Biopsien für histologische Auswertungen entnommen wurden. Zukünfti-

ge Studien sollten von allen drei Behandlungsgruppen zu mehreren unterschiedlichen

Diskussion

70

Zeitpunkten Gewebeproben entnehmen, damit Unterschiede im zeitlichen Heilungsver-

lauf detaillierter dokumentiert werden können. Eine Vielzahl anderer Untersuchungen

bezüglich des Einflusses von Wachstumsfaktoren auf die Wundheilung bedient sich

dieser Verfahrensweise11,33. In der vorliegenden Studie wurde das Aussehen der Biop-

sien am Ende der Versuche bewertet.

4.4 Wirkung von HGF in der Gruppe Haarwachstum

4.4.1 ELISA

Die Durchführung einer Herzpunktion bei Mäusen ist eine etablierte Methode zur an-

schließenden Konzentrationsbestimmung bestimmter Faktoren im Serum mit Hilfe ei-

nes ELISA-Tests. ELISA gehören zu den gängigen immunologischen Nachweisverfah-

ren in der Bioanalytik. In der vorliegenden Studie diente ein kommerziell erhältliches

ELISA als zuverlässige Methode, um murine HGF-Konzentrationen im Serum der Ver-

suchstiere nach 19 Tagen nachzuweisen.

Für die Versuchstiere, bei denen rHGF subkutan injiziert worden war, ergab sich mit

3385.35pg/ml im Mittel die höchste HGF-Konzentration. Für die Gruppe, die mit

pdHGF behandelt wurde, war der Mittelwert mit 1030.27pg/ml wesentlich niedriger.

Für die Vergleichsgruppe (NaCl) wurde im Mittel eine HGF-Konzentration von

2970.99pg/ml ermittelt. Für den Vergleich der Konzentrationen der Gruppen, die ent-

weder mit pdHGF oder rHGF behandelt wurden, ließ sich somit ein statistisch signifi-

kanter Unterschied feststellen.

Da pdHGF aus Serum gewonnen wird, ist seine Struktur identisch mit dem von natürli-

chem HGF, weshalb es eine hohe biophysiologische Ähnlichkeit zu diesem be-

sitzt262,254. Ebenso wie natürliches HGF durchläuft auch pdHGF das Endoplasmatische

Retikulum und den Golgi-Apparat233.

Das in diesem Modell verwendete rHGF wurde in Insektenzellen hergestellt. Zwar ist

dieses rHGF auch glykosyliert, allerdings hängen Insektenzellen andere Zuckermolekü-

le an das HGF, was die Stabilität und die Aktivität des rekombinanten HGFs beein-

flusst218. Somit ähnelt rHGF zwar der natürlichen Form des Wachstumsfaktors HGF,

gleicht dieser aber nicht mehr exakt218. Diese Tatsache legt die Vermutung nahe, dass

der murine Organismus pdHGF als natürliches, körpereigenes HGF anerkennt und in

seine individuelle Produktion mit einbezieht. Dieser Umstand könnte des Weiteren dazu

Diskussion

71

führen, dass die Produktion von pdHGF, im Sinne eines negativen Feedbackmechanis-

muses, herunter reguliert wird, weil dem Organismus signalisiert wird, dass eine ausrei-

chende Menge an HGF zur Verfügung steht. Rekombinant hergestelltes HGF hingegen

ähnelt natürlichem HGF zwar, jedoch zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass es die

murine HGF-Produktion nicht tangiert. Daraus folgt, dass die Produktion von endoge-

nem HGF nicht unterbrochen wird, weil der murine Organismus rekombinantes HGF

nicht als körpereigen anerkennt. Deshalb wird es nicht mit in die körpereigene Produk-

tion integriert. Die gewonnenen Befunde unserer Versuche bekräftigen diese Hypothe-

se. Zuletzt könnte die HGF-Konzentration aus dem Serum der Mäuse, die als Ver-

gleichsgruppe NaCl erhielten, der natürlich vorkommenden Höhe an HGF im Organis-

mus entsprechen.

Die vorliegenden Erklärungsversuche für die unterschiedlichen Konzentrationen an

HGF könnten in weiterführenden Studien dazu genutzt werden, den mannigfachen Ein-

fluss auf die Konzentration im Serum zu erforschen und therapeutisch zu nutzen. In

Fällen, in denen sich eine zu hohe körpereigene HGF-Produktion negativ auf den Orga-

nismus auswirkt, könnte die exogene Gabe von pdHGF vorteilhaft sein. Es ist belegt,

dass eine zu hohe HGF-Konzentration die Tumorinvasion und Metastasierung begüns-

tigen kann135,140,141. Unsere Ergebnisse geben Hinweise darauf, dass eine Behandlung

mit pdHGF eventuell körpereigene HGF-Level senken könnte. Jedoch muss die Bedeu-

tung der systematischen Reduzierung der HGF-Level im Körper noch weiter erforscht

werden. Es liegen bereits einige Studien vor, die durch Inhibierung des HGF-Met-

Signalweges versuchen, eine Anti-Tumor-Wirkung zu erzeugen. Der Fokus solcher

Versuche liegt aber eher darauf, die molekulare Struktur des Wachstumsfaktors HGF

genetisch zu verändern oder Inhibitoren des HGF-Met-Signalweges zu

verabreichen166,38,210,43. Bis dato ist keine Studie bekannt, welche die in dieser Studie

beschriebenen Überlegungen zur Auswirkung von pdHGF auf die Tumorinvasion be-

leuchtet.

Demgegenüber wäre die Anwendung von rHGF dort von Vorteil, wo sich hohe HGF-

Konzentrationen positiv auswirken, wie beispielsweise in der Heilung chronischer

Wunden. Dabei sollten vor allem Unterschiede zwischen einer lokalen oder einer sys-

temischen Applikation betrachtet werden. Diese Option wird von den Ergebnissen ande-

rer Forschungsgruppen bereits diskutiert und stützt die vorliegende Vermutung264,176.

In beiden Fällen erscheint es lohnenswert, die oben genannten Überlegungen in zukünf-

tigen Forschungen ausführlicher zu diskutieren und in weitere Versuchsmodelle zu in-

tegrieren. Sinnvoll wäre, der Frage intensiver nachzugehen, ob und in welchem Rahmen

Diskussion

72

sowohl pdHGF als auch rHGF unterstützend gegeben werden sollten. Dabei müsste

auch geprüft werden, wie man diese Effekte am erfolgversprechendsten regulieren

kann. Allerdings muss für die Durchführung unseres Versuches kritisch angemerkt wer-

den, dass auf eine Abnahme der HGF-Konzentration zu Beginn der Versuchsdurchfüh-

rung verzichtet wurde. Dieses Vorgehen wäre für zukünftige Studien sinnvoll, da somit

der Ausgangswert der HGF-Konzentration bekannt wäre und als Vergleichswert für

anschließende Messungen herangezogen werden könnte.

4.4.2 Auswirkung von HGF auf das nachwachsende Haarkleid

Die Tatsache, dass Haarfollikel nach kutanen Verletzungen verschiedene Zellen zur Re-

Epithelialisierung beisteuern96,97, dient in der vorliegenden Arbeit als Grundlage für die

Durchführung des Wundheilungsversuches an C57/BL6 Mäusen. Haarfollikel bestehen

in ihrem unteren Ende aus der dermalen Papille, weiter oberhalb befindet sich der Haar-

bulbus. Während die dermale Papille für die Versorgung des Haarfollikels zuständig ist,

werden im Haarbulbus regelmäßig neue Zellen produziert202,5,201. Ungefähr 25% der

Zellen, die an der Re-Epithelialisierung von Wunden beteiligt sind, stammen aus Haar-

follikeln96,122. Neben HGF werden zudem verschiedene andere Wachstumsfaktoren von

den Zellen der dermalen Papille produziert217,93,116, die ebenfalls nach Verletzungen der

Haut angeregt werden. Daher können Versuche an Haarfollikeln nicht nur für die Haar-

forschung genutzt werden, sondern überdies hinaus als hilfreiche Modelle zur Erfor-

schung der Rolle von HGF in epithelial-mesenchymalen Systemen während der Wund-

heilung dienen.

Haarfollikel stellen unter anderem Keratinozyten zur Verfügung, welche während der

Wundheilung von den Haarfollikeln ausgehend zur Wunde migrieren1,47. Langton et al.

(2008) belegten anhand eines transgenen Mausmodells, dass Haarfollikeln eine wichtige

Rolle während des Heilungsprozesses zukommt117. Diese Ergebnisse decken sich mit

Beobachtungen vergleichbarer Studien, die nahe legen, dass eine optimale Wundheilung

unter anderem auch von intakten Haarfollikeln abhängig ist132. Fujie et al. (2001) beleg-

ten, dass HGF die Proliferation von Keratinozyten des Haarfollikels stimuliert und

überdies hinaus auch chemotaktische Wirkung auf diese Zellen besitzt61.

Nayeri et al. (2007) betrachteten in einem in vivo Modell an Mäusen die Auswirkungen

des Wachstumsfaktors rHGF auf die Wundheilung. Dabei galt das Nachwachsen des

Haarkleides als Zeichen für eine bestehende Wundheilung173. Die Forschungsgruppe

konnte nachweisen, dass die subkutane Gabe des Wachstumsfaktors rHGF signifikant

Diskussion

73

das nachwachsende Haarwachstum in diesem Wundheilungsmodell beschleunigt. So

zeigten die mit rHGF behandelten Versuchstiere im Mittel nach 11 Tagen ein voll nach-

gewachsenes Haarkleid. Dagegen war bei den Tieren der Vergleichsgruppe, die mit

NaCl therapiert worden waren, das Haar im Mittel erst nach ca. 21,5 Tagen voll nach-

gewachsen.

In der gegenwärtigen Studie wurde das nachwachsende Haarkleid mit Hilfe eines Sco-

ringverfahrens (siehe Tabelle 10) über die gesamte zeitliche Dauer des Versuches be-

wertet. Dabei ergaben sich von Periode 3 bis einschließlich Periode 5 für diesen Para-

meter signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen mit NaCl und pdHGF

sowie mit rHGF und pdHGF. Die Mäuse, denen rHGF subkutan injiziert worden war,

zeigten besonders in Periode 4 und 5 eine deutliche Zunahme des Haarwachstums und

zugleich den stärksten Anteil an nachgewachsenem Haarkleid. In Periode 3 erreichte die

mit rHGF behandelte Gruppe einen MW von 1.611 (SD= 0.417), in Periode 4 stieg die-

ser MW stark auf 3.333 (SD= 0.250) an und in Periode 5 betrug die Intensität des nach-

gewachsenen Haares im Mittel 4.000 (SD= 0). Somit führte die Behandlung mit rHGF

ab Tag 17 bis einschließlich Tag 19 dazu, dass das Haar bei allen Versuchstieren voll

nachgewachsen war. Demgegenüber zeigte die Versuchsgruppe, die mit pdHGF behan-

delt worden war, ein schwächeres Ausmaß in Bezug auf ihr wiederkehrendes Haarkleid.

So ergab sich anhand des Scoringverfahrens für diese Gruppe in Periode 3 ein MW von

1.167 (SD= 0.250), in Periode 4 ein MW von 2.111 (SD= 0.333) und in der letzten Pe-

riode ein MW von 3.389 (SD= 0.220). Die Vergleichsgruppe (NaCl) ließ sich vom

Ausmaß ihrer Haarwachstumsrate zwischen die beiden anderen Gruppen einordnen und

besaß für die oben genannten Perioden ein etwas schnelleres Haarwachstum als bei den

Tieren, denen pdHGF injiziert wurde (siehe Abbildung 14). Folglich zeigte das Haar-

wachstum der mit pdHGF behandelten Mäuse im Vergleich mit den anderen beiden

Behandlungen in den Perioden 3 bis 5 die langsamste Geschwindigkeit.

Werden diese Ergebnisse mit den Feststellungen von Nayeri et al. (2007) verglichen,

zeigen sich Übereinstimmungen für die Behandlung mit rekombinant hergestelltem

HGF. Ihre Studie belegte, dass rHGF eine signifikante Bedeutung für die Beschleuni-

gung des Haarwachstums zukommt. Die vorliegende Studie kommt bezüglich einer

Behandlung mit rHGF zu ähnlichen Resultaten wie in der zuvor genannten Arbeit. Al-

lerdings präsentierten die mit rHGF behandelten Tiere bei Nayeri et al. (2007) im Mittel

ein vollständig wiederkehrendes Haarkleid an Tag 11. Zwar erwies sich rHGF in unse-

rer Untersuchung ebenfalls als beste Behandlung, um ein schnelles Nachwachsen der

Haare zu garantieren. Jedoch zeigten sie erst ab Beginn der fünften Periode, also ab Tag

Diskussion

74

17, ein vollständig nachgewachsenes Haarkleid. Die Diskrepanz dieser Ergebnisse lässt

sich wahrscheinlich damit begründen, dass den Versuchstieren der Studie von Nayeri et

al. (2007) täglich 1000ng HGF/1ml über einen Zeitraum von fünf Tagen subkutan ap-

pliziert wurde173. Demgegenüber wurde den Tieren unserer Studie täglich 1ng/1ml HGF

verabreicht.

Zu pdHGF existieren bis dato keine vergleichbaren Studien. In unserer Arbeit zeigte

pdHGF gegenüber rHGF keine Verbesserung der Beschleunigung des Haarwachstums

über den zeitlichen Verlauf.

Andererseits lohnt sich der Hinweis auf den Vergleich der drei Behandlungen am letz-

ten Versuchstag. Bezieht man also zusätzlich die makroskopisch sichtbare Regenerati-

onsrate am Ende der Versuchsdurchführung mit ein, wird nur für Tag 19 deutlich, dass

sowohl die Behandlungen mit pdHGF als auch die mit rHGF bei allen Versuchstieren

zu einer kompletten Regeneration des Haarkleides geführt hatten. Betrachtet man für

den letzten Versuchstag das Haarwachstum der Mäuse, die mit NaCl behandelt wurden,

erreichten zwei Mäuse kein vollständig nachgewachsenes Haarkleid. Damit lässt sich

ein Trend für einen positiven Effekt auf das Haarwachstum für beide Wirkformen des

HGFs an Tag 19 erkennen, jedoch sind hierfür keine statistischen Unterschiede festzu-

stellen. Dieser Beobachtung sollte in zukünftigen Studien ausführlicher nachgegangen

werden.

Insgesamt zeigte in unserer Untersuchung die Positivkontrolle rHGF die beste Rate an

nachwachsendem Haarkleid, was ebenfalls von Nayeri et al. (2007) belegt wurde.

4.4.3 Histologisch sichtbare Veränderungen der Gruppe Haarwachstum

Die histologischen Auswertungen der gefärbten Gewebepräparate der Gruppe Haar-

wachstum wurden vor allem unter zwei morphologischen Aspekten begutachtet.

Zum einen sollte die Frage geklärt werden, inwiefern sich die einzelnen Behandlungen

auf die Struktur und die Anzahl neuer Haarfollikel auswirken. Zum anderen lag die In-

duktion der Angiogenese im Fokus der Betrachtung.

Die Gewebeschnitte der Vergleichsgruppe (NaCl) zeigten, dass ihre Haarfollikel in

Form und Aufbau den Haarfollikeln unbehandelter Versuchsmäuse glichen. Ihre Archi-

tektur wies keinerlei Unregelmäßigkeiten auf und besaß eine gute Festigkeit. Diese Er-

gebnisse belegen, dass die physiologisch geregelte Entwicklung des nachwachsenden

Haarkleides durch eine zusätzliche Behandlung mit NaCl nicht beeinflusst wird. In der

mikroskopischen Untersuchung erschien das Follikelepithel dieser Gruppe proliferati-

Diskussion

75

onsaktiv, was zusätzlich unterstreicht, dass hier ein ungestörtes Wachstum stattgefunden

hatte.

Die Analyse der Haarfollikel der Positivkontrolle, bei denen rHGF subkutan injiziert

worden war, zeigte einen vergleichbaren Aufbau wie bei der Vergleichsgruppe. Die

Haarfollikel der rHGF-Gruppe lagen in geordneter Struktur vor. Allerdings ließen sich

bei der histologischen Begutachtung mehr dicht aneinander liegende Haarfollikel aus-

machen als bei der Vergleichsgruppe. Dieses Bild wurde mit Hilfe der sich anschlie-

ßenden Auszählung der Haarfollikel in den Gesichtsfeldern bestätigt. Hier zeigten die

ausgewerteten Präparate mit einem Mittelwert von 73.63 die größte Anzahl an nachge-

wachsenen Haarfollikeln. Bekräftigt werden unsere Resultate durch das makroskopisch

sichtbare Erscheinungsbild des Haarkleides der rHGF-Gruppe (vergleiche Kapitel

4.4.2). Untersuchungen von Lindner et al. (2000) an C57/BL6 Mäusen belegten bereits,

dass HGF und sein Rezeptor Met eine wichtige Rolle bei der Morphogenese von Haar-

follikeln spielen123. Die Forschungsgruppe von Jindo et al. (1998) wies nach, dass re-

kombinant hergestelltes HGF nicht nur den Rückgang von Haarfollikeln verzögert, son-

dern zudem auch das Wachstum des Haarkleides in vivo verbessert101. Diese Resultate

für rHGF konnten in der vorliegenden Studie bestätigt werden und validieren unser

Versuchsmodell. Von den drei Behandlungen erwies sich rHGF als potentester Ein-

flussfaktor auf die Bildung von Haarfollikeln, was sich sowohl makroskopisch als auch

mikroskopisch belegen ließ.

Dabei fokussiert unsere Untersuchung erstmals auch die Auswirkung von pdHGF auf

die Morphogenese von Haarfollikeln. Zwar waren mit einem Mittelwert von 62.00 we-

niger Haarfollikel in den histologisch gefärbten Präparaten dieser Gruppe zu finden als

bei den mit rHGF behandelten Mäusen, allerdings zeigten die mit NaCl behandelten

Versuchstiere das geringste Ausmaß an Haarfollikeln (MW=55.78). Diese Befunde las-

sen den Schluss zu, dass auch pdHGF in der Lage ist, Haarwachstum zu unterstützen.

Zwar ließ sich durch die Begutachtung der Anzahl an nachgewachsenen Haarfollikeln

ein Trend für positive Effekte von rHGF und pdHGF nachweisen, jedoch waren keine

statistisch signifikanten Unterschiede festzustellen.

Daneben zeigte die mikroskopische Begutachtung der pdHGF-Gruppe, dass die Haar-

follikel dieser Mäuse etwas weiter auseinander lagen. Im Gegensatz zu den anderen

Behandlungen war das Aussehen ihres Follikelepithels atropher und die Struktur er-

schien in ihrer Festigkeit etwas reduziert zu sein. Diese Feststellung lässt vermuten,

dass die Haare der mit pdHGF behandelten Mäuse weniger strapazierfähig waren. In

diesem Zusammenhang kann auch diskutiert werden, dass die Stabilität ihrer Haare brü-

Diskussion

76

chiger erschien und von geringerer Festigkeit war als bei den Haaren der Versuchstiere

der anderen beiden Behandlungen.

Die Anzahl neugebildeter Haarfollikel im Rahmen der histologischen Auswertungen

belegt, dass sowohl rHGF als auch pdHGF in der Lage sind, die Synthese von Haarfol-

likeln zu beschleunigen. In der gegenwärtigen Studie erweist sich rHGF als potentester

Einflussfaktor auf die Neubildung von Haarfollikeln, aber auch für pdHGF kann eine

ähnliche Wirkung gezeigt werden.

Jedoch muss festgehalten werden, dass die Gabe von rHGF die Wachstumsgeschwin-

digkeit der Haare zeitlich früher positiv beeinflusst als eine Behandlung mit pdHGF.

Dieser Trend konnte für die Versuchsgruppe (pdHGF) nicht nachgewiesen werden, da

über den zeitlichen Verlauf makroskopisch gesehen kein verstärktes Haarwachstum

beobachtet werden konnte. Allerdings muss auch hier festgehalten werden, dass sowohl

die Behandlungen mit rHGF als auch jene mit pdHGF am letzten Versuchstag 19 voll-

ständig nachgewachsene Haarfollikel zeigten. Diese Tatsache korreliert mit der höheren

Anzahl an neugebildeten Haarfollikeln in diesen Gruppen und kann als Begründung für

das vollständig nachgewachsene Haarkleid an Tag 19 dienen. Die vorliegenden Befunde

belegen, dass rHGF das Haarwachstum schneller beeinflusst als pdHGF. Jedoch besitzt

pdHGF die Fähigkeit seinen Rückstand bis zum 19. Versuchstag aufzuholen und eben-

falls zu vollständig nachgewachsenem Haarkleid zu führen. Da die Bildung von Haar-

follikeln zudem als valides Modell für die Regeneration von Zellen während des Hei-

lungsprozesses gesehen werden kann173, liefern unsere Ergebnisse einen weiteren Hin-

weis dafür, dass nicht nur rHGF sondern auch pdHGF einen Einfluss auf die Wundhei-

lung ausübt.

Neben der Fähigkeit neue Haarfollikel zu bilden, diente auch die Anzahl an neugebilde-

ten Kapillaren als Ausdruck für eine zelluläre Regeneration. So konnte unsere Untersu-

chung einen signifikanten Einfluss aller drei Behandlungen auf die Kapillarneubildung,

also auf die Angiogenese, aufzeigen. Hierbei erwies sich die Anwendung von pdHGF

als bestes Verfahren, da für diese Gruppe im Mittel die größte Anzahl an neugebildeten

Kapillaren ausgezählt wurde (MW= 13.26/GF). Die Behandlungen mit rHGF schlossen

sich mit einem Mittelwert von 9.41/GF an, das Schlusslicht in der Bildung neuer Kapil-

lare bildete der Einsatz der Vergleichsgruppe NaCl (MW= 1.56/GF). Daraus wird deut-

lich, dass NaCl kaum eine Wirkung auf die Angiogenese ausüben konnte, wohingegen

vor allem für pdHGF ein relevanter Einfluss verzeichnet wurde. Diese Befunde wurden

dadurch unterstrichen, dass sich für die beiden anderen Behandlungen im Vergleich mit

der mit NaCl behandelten Gruppe statistisch signifikante Unterschiede ergaben. Auch

Diskussion

77

zwischen rHGF und pdHGF konnte ein statistisch signifikanter Unterschied festgestellt

werden, wobei die Gabe von pdHGF die Tendenz zur Kapillarbildung am stärksten be-

einflusste. Dieses Resultat konnte erstmals durch die Beobachtungen der vorliegenden

Studie nachgewiesen werden, da zu pdHGF diesbezüglich keine Untersuchungen vor-

liegen. Rosen et al. (1993) zeigten, dass HGF ein potenter Angiogenesefaktor in vivo ist,

dem eine entscheidende Rolle für die Ausbildung und Reparatur von Blutgefäßen zu-

kommt203. Ebenso wurde die angiogenetische Wirkung von HGF auf eine Vielzahl ver-

schiedener Gewebe in einigen anderen Versuchen bestätigt95,28,81,266. VEGF zählt zu den

potentesten Wachstumsfaktoren, welche die Angiogenese regulieren56,55,177. Galiano et

al. (2004) belegten im diabetischen Mausmodell, dass die Applikation von VEGF auf

Wunden durch eine gesteigerte Induktion der Angiogenese zu einer verbesserten Hei-

lung führen kann64. Weiterführende Studien fanden zunächst heraus, dass HGF die Syn-

these von VEGF und dadurch die Bildung von Kapillaren anregt73,242,69. Im Jahre 2003

belegten Untersuchungen von Sengupta et al., dass HGF auch unabhängig von der In-

duktion des Wachstumsfaktors VEGF in der Lage ist, die Angiogenese zu fördern216.

Somit ist für HGF belegt, dass es die Kapillarbildung in vivo und in vitro fördert und

ihm eine bedeutende Rolle bei der Wundheilung zukommt. Die Befunde unserer Studie

führen ebenso zu diesem Ergebnis und verdeutlichen, dass sowohl für pdHGF als auch

für rHGF ein angiogenetisches Potential vorliegt.

Die vorliegenden Befunde unserer Arbeit lassen den Schluss zu, dass pdHGF die Angi-

ogenese stärker fördert als rekombinantes HGF. In weiterführenden Versuchen sollte

der genaue biophysiologische Wirkmechanismus von pdHGF auf die Ausbildung von

Kapillaren eingehender untersucht werden.

Unsere Studie kam zu dem Ergebnis, dass die subkutane Injektion von pdHGF zu einer

etwas geringeren Haarfollikelbildung führt als die Gabe von rHGF. Möglicherweise

lässt sich diesbezüglich ein Zusammenhang zwischen pdHGF und der erniedrigten

HGF-Konzentration im murinen Serum herstellen. So könnte die herunterregulierte

pdHGF-Konzentration direkte Auswirkungen auf die Genese der Haarfollikel haben.

Die vorliegenden Befunde zeigen allerdings, dass dieser Bezug nur für die Haarfollikel-

bildung und nicht für die Angiogenese hergestellt werden konnte. Bei der Betrachtung

neugebildeter Kapillare vermittelte die subkutane Gabe von pdHGF den stärksten Im-

puls. Dies lässt einen größeren Einfluss von pdHGF auf die Angiogenese und damit auf

die Modulation von Kapillaren vermuten, der weniger stark ausgeprägt ist in Bezug auf

einen Effekt auf die Genese von Haarfollikeln. Auf Letzteres scheint rHGF ein potente-

res Wirkspektrum zu besitzen. Die geringe pdHGF-Konzentration im Serum der Ver-

Diskussion

78

suchstiere könnte möglicherweise die Bildung von Haarfollikeln beeinflussen, nicht

jedoch die Angiogenese. Für eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren ist bekannt, dass sie

in unterschiedlicher Intensität multiplen Einfluss auf verschiedene Zellen besitzen. Neu

ist allerdings, dass die unterschiedlichen Wirkformen des Wachstumsfaktors HGF ver-

schiedene Vorgänge im Organismus möglicherweise ungleich beeinflussen können.

Die in der vorliegenden Untersuchung dargelegte retardierte Bildung von Haarfollikeln

bei der Behandlung mit pdHGF muss also nicht im Widerspruch mit seiner Fähigkeit

zur Angiogenese stehen. Zwar wurde in früheren Studien bereits dargelegt, dass HGF

sowohl an der Angiogenese als auch an der Ausbildung von Haarfollikeln beteiligt ist.

Jedoch ist dieser Effekt nicht spezifisch im Hinblick auf eine unterschiedliche Wir-

kungsweise von pdHGF und rHGF erforscht worden.

Es existieren Studien, die den wechselseitigen Einfluss verschiedener Substrate auf An-

giogenese und Haarwachstum untersuchen. So ist für den Wirkstoff Minoxidil, der als

blutdrucksenkendes Reservemedikament zum Einsatz kommt, als Nebeneffekt eine

haarwachstumsfördernde Komponente bekannt18,9. Diese Wirkung wird dadurch vermit-

telt, dass topisch auf die Kopfhaut aufgetragenes Minoxidil die Durchblutung der der-

malen Papille verbessert und somit das Wachstum der Haarfollikel anregt146. Aus die-

sem Grund wird Minoxidil therapeutisch zur Behandlung der anlagebedingten, andro-

genetischen Alopezie angewandt. Ähnliche Ergebnisse liegen für eine Therapie mit

Koffein vor57. So wird für beide Wirkstoffe pharmakologisch nahe gelegt, dass eine

verbesserte Durchblutung der Zellen zu einem verbesserten Haarwachstum führt. Diese

Überlegung kann durch die Ergebnisse unserer Studie nur für rHGF bestätigt werden.

pdHGF andererseits zeigt sich in unserer Studie als bester Regulator in der Neubildung

von Kapillaren, bleibt aber in der Neubildung von Haarfollikeln sowie im makrosko-

pisch sichtbaren Haarwachstum hinter rHGF. Die vorliegende Studie weist erstmals

daraufhin, dass sich pdHGF und rHGF in ihrer Wirkung leicht unterscheiden. Basierend

auf diesen Untersuchungsbefunden sollte daher zukünftig diskutiert werden, ob die bei-

den Wirkformen für verschiedene Therapiezwecke oder synergistisch in Kombination

zur Therapieoptimierung genutzt werden könnten. Daher erscheinen zukünftig Überle-

gungen sinnvoll, ob und zu welchem Zeitpunkt entweder pdHGF, rHGF oder eine

Kombination beider Wirkstoffe unterstützend gegeben werden sollten. Zudem sollte

diskutiert werden, ob unterschiedliche Applikationsformen von pdHGF und rHGF un-

terschiedliche Auswirkungen auf die Zielzellen haben können.

Diskussion

79

4.5 Ausblick

Die vorliegende Studie liefert Ergebnisse, die für zukünftige weiterführende Untersu-

chungen im Hinblick auf einen therapeutischen Gebrauch von pdHGF als auch rHGF

genutzt werden können.

Es stellte sich heraus, dass es auch für die Gruppe Wundheilung sinnvoll wäre, die

HGF-Konzentrationen im Blut der Mäuse zu bestimmen. Dadurch könnte ein noch de-

taillierter Einblick in Bezug auf die Auswirkungen unterschiedlicher Applikationsfor-

men des HGFs auf den Organismus gewonnen werden. Die topische Gabe des Wachs-

tumsfaktors stellt dabei kein Ausschlusskriterium für die Messung der murinen HGF-

Konzentrationen dar. Dies würde jedoch bedeuten, dass exponentiell mehr Versuchstie-

re für die Studiendurchführung beansprucht werden müssten.

Es könnten auch Überlegungen angestellt werden, den Versuchstieren der Gruppe

Wundheilung sowohl pdHGF als auch rHGF subkutan zu injizieren und diesbezüglich

anhand einer ELISA-Auswertung HGF-Konzentrationen nachzuweisen.

Für beide Gruppen könnte die Bestimmung der Konzentrationen des Wachstumsfaktors

HGF im murinen Serum zu verschiedenen Zeitpunkten während der Versuchsdurchfüh-

rung sinnvoll sein. Während des laufenden Versuches könnte an zuvor definierten Ta-

gen exemplarisch an ein bis zwei Mäusen eine Herzpunktion erfolgen. Somit könnte im

zeitlichen Verlauf nachgewiesen werden, zu welchem Zeitpunkt die höchsten HGF-

Werte erreicht werden und ab wann diese abfallen. Gleiches Vorgehen wäre auch für

beide Versuchsgruppen hinsichtlich der Entnahme von Gewebebiopsaten zur histologi-

schen Verlaufskontrolle denkbar.

Diese Erkenntnisse könnten in Bezug auf eine therapeutische Nutzung des HGFs von

Bedeutung sein und dementsprechend effektiv genutzt werden.

4.6 Therapeutische Perspektive

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ermöglichen einen besseren Einblick auf die

klinische Wirksamkeit des Wachstumsfaktors pdHGF im Vergleich mit rHGF. Beide

Formen erwiesen sich in unserer Studie als signifikante Einflussgröße auf die Wundhei-

lung, mit der Fähigkeit diese zu beschleunigen.

Durch die gewonnenen Daten unserer Studie ist es vorstellbar, dass zukünftig eine Be-

handlung mit pdHGF von therapeutischer Relevanz sein könnte. Diesbezüglich sind

aber weiterführende Versuche erforderlich, welche unter anderem auch die potentiellen

Nebenwirkungen einer Langzeittherapie mit pdHGF eingehender beleuchten.

Diskussion

80

Unsere Studie liefert einige Ansätze, die möglicherweise von Relevanz für die Entwick-

lung neuer Therapiestrategien zur Behandlung von Wundheilungsstörungen, aber auch

von Haarerkrankungen, sind. Die Ergebnisse unserer Studie führen zu der Annahme,

dass pdHGF einen etwas besseren Einfluss auf die Behandlung von Wundheilungsstö-

rungen ausübt als rHGF. rHGF hingegen erwies sich vor allem in der Beeinflussung des

Haarwachstums als potenter Wirkstoff.

So könnten die zugrundeliegenden Befunde dieser Arbeit bezüglich der Wirkung von

pdHGF dazu genutzt werden, das Potential dieses Wirkstoffes auf die Verbesserung des

Heilungsprozesses eindringlicher zu untersuchen, um einen therapeutischen Nutzen in

der Behandlung chronischer Wunden zu gewinnen. Zusätzlich sollte die Anwendung

von rHGF im Bereich von Haarerkrankungen ausführlicher studiert werden.

Darüber hinaus sollte die Möglichkeit bedacht werden, andere Wachstumsfaktoren mit

pdHGF oder rHGF in der Therapie chronischer Wunden oder Haarerkrankungen mitei-

nander zu kombinieren. Sofern die Wirkung von HGF durch synergistisches Zusam-

menspiel mit anderen Wachstumsfaktoren potenziert werden würde, ließe sich womög-

lich die Effektivität der Behandlung steigern.

Verschiedene Studien zur Wundheilung weisen bereits darauf hin, dass eine Kombinati-

on von Wachstumsfaktoren zu einer Steigerung ihrer Effektivität führen kann. Diese

Überlegungen sind sinnvoll, da der kutane Heilungsprozess durch die zeitliche Interak-

tion vieler Wachstumsfaktoren gesteuert wird198. In vitro und in vivo Untersuchungen

bestätigen, dass eine Verbindung mehrerer Wachstumsfaktoren der Gabe eines einzel-

nen Wachstumsfaktors überlegen ist80,127,91,25. Nath et al. (1998) hoben daher hervor,

dass eine Kombination verschiedener Wachstumsfaktoren in der Therapie der kutanen

Wundheilung sehr effizient ist171. Die vorliegende Arbeit bestärkt Überlegungen, die

Forschungen zur Beschleunigung der Wundheilung mit Hilfe von HGF vor allem für

die Zeitspanne von Tag 13 bis Tag 16 zu intensivieren. Dieser Zeitraum entspricht der

in dieser Studie vorgenommenen Einteilung der Wundheilung in die späte Regenerati-

onsphase (Periode 4). Vorstellbar wäre, während dieser Phase abermals HGF auf die

Wunden zu applizieren, um den Heilungsprozess noch gezielter zu unterstützen und zu

beschleunigen. Somit können die Ergebnisse der vorliegenden Studie als Ansatzpunkt

für den therapeutischen Einsatz von pdHGF und rHGF während der Wundheilung ge-

nommen werden.

Zusammenfassend liefern unsere Versuche einige neue Aspekte, die einen effizienten

Einfluss von pdHGF auf die Wundheilung verdeutlichen und Auswirkungen auf die

Diskussion

81

Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Behandlung von Wundheilungsstö-

rungen haben könnten.

Zusammenfassung

82

5 Zusammenfassung

Der pleiotrope Wachstumsfaktor Hepatocyte Growth Factor (HGF) ist bekannt für seine

vielfältigen Auswirkungen auf unterschiedliche Zielzellen. Über die Bindung mit dem

transmembranen Rezeptor Met kann HGF je nach Zielorgan zur Induktion von Angio-

genese, Mitogenese, Anti-Apoptose, Morphogenese und Motogenese führen. So spielt

er eine wesentliche Rolle für die Entwicklung, Proliferation und Regeneration vieler

Organe und ist zentrales Zytokin für die kutane Wundheilung.

Bislang durchgeführte Studien legen die Vermutung nahe, dass eine Behandlung mit

rekombinant hergestelltem rHGF von therapeutischem Nutzen für die Therapie chroni-

scher Wunden ist, weil es nachweislich die Wundheilung beschleunigt. Bisher war al-

lerdings unbekannt, welche Effekte das aus Patientenserum gewonnene pdHGF auf den

Heilungsprozess ausübt. Dabei besitzt pdHGF ein schwereres Molekulargewicht als

rHGF, weshalb vermutet wird, dass pdHGF die stabilere Zustandsform darstellt.

Daher lag das Ziel der vorliegenden Arbeit darin, die Auswirkungen von pdHGF auf die

kutane Wundheilung darzustellen. In einem ersten Versuchsmodell wurde ein diabeti-

sches Mausmodell herangezogen, um herauszuarbeiten, welchen Einfluss eine topische

Applikation von pdHGF auf eine gestörte Wundheilung ausübt. Um die Wirksamkeit

von pdHGF in einem physiologischen Organismus aufzuzeigen, wurden in einem zwei-

ten Versuch C57/BL6 Mäuse verwendet. Hierbei wurde pdHGF subkutan verabreicht

und seine Auswirkungen auf das Haarwachstum als Ausdruck der Zellproliferation und

Regeneration untersucht.

Unsere Studie legt erstmals dar, dass pdHGF in der Lage ist die Wundheilung signifi-

kant zu beschleunigen. Dieser Effekt konnte ebenfalls für rHGF bestätigt werden. Eine

zeitliche Unterteilung des Heilungsverlaufes in fünf Perioden erleichterte die Einord-

nung der verschiedenen Stadien der Wundheilung. Dabei stellte sich heraus, dass

pdHGF von Tag 13 bis einschließlich Tag 16 (Periode 4) die wirksamste Behandlung

zur Beschleunigung des Heilungsprozesses darstellte. Zudem zeigte sich eine bessere

Hautstruktur der Wunden, die mit pdHGF behandelt wurden. Gegen Ende der Versuche

bildeten sie weniger starre Kollagenfasern, weshalb ihre Hautstruktur elastischer war als

die der mit rHGF behandelten Wunden. Dies bedeutet, dass die Wundbehandlung mit

pdHGF in der Lage ist, die physiologische Struktur der Haut und damit ihre natürliche

Funktion größtenteils wiederherzustellen. Diesen Tatsachen sollten in weiterführenden

Untersuchungen nachgegangen werden, wobei sie möglicherweise Einfluss auf die

Zusammenfassung

83

Entwicklung zukünftiger therapeutischer Strategien zur Behandlung von chronischen

Wunden haben.

Des Weiteren stellte sich heraus, dass wesentlich niedrigere HGF-Konzentrationen effi-

zient zur Behandlung chronischer Wunden verwendet werden können als bisher ange-

nommen wurde.

Zusätzlich weisen die Ergebnisse der vorliegenden Studie darauf hin, dass rHGF eine

zentrale Rolle in der Beschleunigung des Haarwachstums zukommt und somit neue

Möglichkeiten in der Therapie von Haarerkrankungen eröffnen könnte.

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Anhang

99

Anhang

Gruppe Wundheilung

Wundfläche:

Wundfläche - Gruppe Wundheilung Behandlung Periode Anzahl


NaCl

1 19 0.1725299 0.0388770 0.1001599 0.2413748 2 19 0.1323699 0.0309692 0.0747779 0.1943348 3 19 0.0811353 0.0240715 0.0368162 0.1415988 4 19 0.0313993 0.0172795 0.0077173 0.0814167 5 19 0.0062935 0.0074851 0 0.0222450

pdHGF

1 10 0.1622729 0.0361670 0.1211580 0.2436354 2 10 0.1229295 0.0348745 0.0811443 0.1990776 3 10 0.0709608 0.0274129 0.0401662 0.1398000 4 10 0.0140287 0.0098453 0.0045528 0.0335877 5 10 0.0028620 0.0037559 0 0.0079763

rHGF

1 9 0.1836539 0.0481091 0.1141772 0.2791403 2 9 0.1379376 0.0420537 0.0907580 0.2320254 3 9 0.0747943 0.0366540 0.0404988 0.1636788 4 9 0.0181881 0.0140169 0.0030683 0.0523023 5 9 0.0018501 0.0022445 0 0.0051410

Wundfläche - Gruppe Wundheilung Subgruppenanalyse ANOVA Effekt der Behandlungen in den Perioden p-Wert Behandlungseffekt in Periode 1 0.4838 Behandlungseffekt in Periode 2 0.6249 Behandlungseffekt in Periode 3 0.5826 Behandlungseffekt in Periode 4 0.0120 Behandlungseffekt in Periode 5 0.1440

Wundfläche - Gruppe Wundheilung Post Hoc-Test Behandlungen Periode p-Wert NaCl + pdHGF 4 0.0064 NaCl + rHGF 4 0.0388 pdHGF + rHGF 4 0.5278

Anhang

100

Gruppe Wundheilung

Wundhöhe:

Wundhöhe - Gruppe Wundheilung Behandlung Periode Anzahl


NaCl

1 19 0.4583759 0.0580127 0.3329026 0.5423415 2 19 0.3925750 0.0943390 0.2764722 0.7215030 3 19 0.2811438 0.0512318 0.1940862 0.3934878 4 19 0.1371063 0.0517727 0.0459172 0.2421433 5 19 0.0187317 0.0179237 0 0.0637033

pdHGF

1 10 0.4918537 0.0509914 0.4139759 0.5702382 2 10 0.3943636 0.0294092 0.3383730 0.4505658 3 10 0.3056279 0.0639544 0.2111562 0.4132720 4 10 0.0965404 0.0416254 0.0429340 0.1843387 5 10 0.0244954 0.0233338 0 0.0571430

rHGF

1 9 0.4846655 0.0371078 0.4099358 0.5411683 2 9 0.3943636 0.0294092 0.3383730 0.4505658 3 9 0.2697023 0.0300997 0.2347892 0.3320628 4 9 0.1028700 0.0365542 0.0357068 0.1515600 5 9 0.0084292 0.0110398 0 0.0304185

Wundhöhe - Gruppe Wundheilung Subgruppenanalyse ANOVA Effekt der Behandlungen in den Perioden p-Wert Behandlungseffekt in Periode 1 0.2047 Behandlungseffekt in Periode 2 0.9062 Behandlungseffekt in Periode 3 0.3382 Behandlungseffekt in Periode 4 0.0230 Behandlungseffekt in Periode 5 0.0979

Wundhöhe - Gruppe Wundheilung Post Hoc-Test Behandlungen Periode p-Wert NaCl + pdHGF 4 0.0230 NaCl + rHGF 4 0.0369 pdHGF + rHGF 4 0.9164

Anhang

101

Gruppe Wundheilung

Wundbreite:

Wundbreite - Gruppe Wundheilung Behandlung Periode Anzahl


NaCl

1 19 0.3693371 0.0535157 0.2534000 0.4735048 2 19 0.3087680 0.0493557 0.2331031 0.4258230 3 19 0.2171562 0.0418987 0.1521205 0.2999405 4 19 0.0989972 0.0344105 0.0552070 0.1709808 5 19 0.0145128 0.0153008 0 0.0514597

pdHGF

1 10 0.3818650 0.0489888 0.3245205 0.4624207 2 10 0.3082806 0.0504875 0.2381312 0.3959057 3 10 0.2366769 0.0643459 0.1592230 0.3713000 4 10 0.0690177 0.0330312 0.0339880 0.1355832 5 10 0.0210946 0.0207386 0 0.0579310

rHGF

1 9 0.3563856 0.0537751 0.2739033 0.4246162 2 9 0.2769645 0.0407147 0.2016931 0.3125198 3 9 0.1914682 0.0312021 0.1365522 0.2331452 4 9 0.0685161 0.0275287 0.0234742 0.1046482 5 9 0.0060646 0.0082251 0 0.0223230

Wundbreite - Gruppe Wundheilung Subgruppenanalyse ANOVA Effekt der Behandlungen in den Perioden p-Wert Behandlungseffekt in Periode 1 0.5338 Behandlungseffekt in Periode 2 0.2733 Behandlungseffekt in Periode 3 0.1190 Behandlungseffekt in Periode 4 0.0117 Behandlungseffekt in Periode 5 0.0596

Wundbreite - Gruppe Wundheilung Post Hoc-Test Behandlungen Periode p-Wert NaCl + pdHGF 4 0.0161 NaCl + rHGF 4 0.0168 pdHGF + rHGF 4 0.9431

Anhang

102

Gruppe Haarwachstum

Nachwachsendes Haarkleid:

Nachwachsendes Haarkleid – Gruppe Haarwachstum Subgruppenanalyse ANOVA Effekt der Behandlungen in den Perioden p-Wert Behandlungseffekt in Periode 1 --- Behandlungseffekt in Periode 2 0.8048 Behandlungseffekt in Periode 3 0.0185 Behandlungseffekt in Periode 4 <0.0001 Behandlungseffekt in Periode 5 <0.0001

Nachwachsendes Haarkleid - Gruppe Haarwachstum Post Hoc-Test Behandlungen Periode p-Wert NaCl + pdHGF 3 0.0077 NaCl + rHGF 3 0.5664 pdHGF + rHGF 3 0.0288 NaCl + pdHGF 4 <0.0001 NaCl + rHGF 4 0.1418 pdHGF + rHGF 4 <0.0001 NaCl + pdHGF 5 0.0001 NaCl + rHGF 5 0.3172 pdHGF + rHGF 5 <0.0001

Scoringverfahren - Gruppe Haarwachstum

Behandlung Periode Anzahl Beob.

MW SD Minimum Maximum

NaCl

1 9 0 0 0 0 2 9 0.2222222 0.1666667 0 0.3333333 3 9 1.7222222 0.5068969 1.0000000 2.5000000 4 9 3.0555556 0.5270463 2.5000000 3.5000000 5 9 3.8888889 0.3333333 3.0000000 4.0000000

pdHGF

1 9 0 0 0 0 2 9 0.2222222 0.0833333 0 0.2500000 3 9 1.1666667 0.2500000 1.0000000 1.5000000 4 9 2.1111111 0.3333333 2.0000000 3.0000000 5 9 3.3888889 0.2204793 3.0000000 3.5000000

rHGF

1 9 0 0 0 0 2 9 0.2592593 0.1469862 0 0.3333333 3 9 1.6111111 0.4166667 1.0000000 2.0000000 4 9 3.3333333 0.2500000 3.0000000 3.5000000 5 9 4.0000000 0 4.0000000 4.0000000

Anhang

103

Gruppe Haarwachstum

Kapillarneubildung:

Anzahl neugebildeter Kapillare Tag 19 - Gruppe Haarwachstum Behandlung Anzahl


pdHGF 9 13.26 4.83 7.00 23.33 rHGF 9 9.41 2.57 4.33 12.33 NaCl 9 1.56 1.29 0.00 4.00

Anzahl neugebildeter Kapillare Tag 19 - Gruppe Haarwachstum Globaler Behandlungseffekt: p-Wert <0.0001 Behandlungen p-Wert (Post Hoc-Test) NaCl + pdHGF <.0001 NaCl + rHGF 0.0189 pdHGF + rHGF <.0001

Anzahl neugebildeter Haarfollikel:

Anzahl neugebildeter Haarfollikel Tag 19 - Gruppe Haarwachstum Behandlung Anzahl


rHGF 9 73.63 13.98 50.00 96.67 pdHGF 9 62.00 15.65 43.67 83.67 NaCl 9 55.78 18.93 19.33 75.33

Anzahl neugebildeter Haarfollikel Tag 19 – Gruppe Haarwachstum Globaler Behandlungseffekt: p-Wert = 0.0824

Anhang

104

Gruppe Haarwachstum

ELISA:

HGF-Konzentrationen [pg/ml] Tag 19 - Gruppe Haarwachstum Behandlung Anzahl


NaCl 8 2970.99 1446.84 1114.42 4765.79 pdHGF 7 1030.27 6.340.975.438 2.688.300.000 1999.92 rHGF 7 3385.35 2059.69 6.234.420.000 6034.91

HGF-Konzentrationen [pg/ml] Tag 19 - Gruppe Haarwachstum Globaler Behandlungseffekt: p-Wert = 0.0180 Behandlungen p-Wert (Post Hoc-Test) NaCl + pdHGF 0.0663 NaCl + rHGF 0.8675 pdHGF + rHGF 0.0281

Danksagung

105

Danksagung

Herrn Univ.-Prof. Dr. med. Dr. med. univ. Prof. h.c. (RC) Norbert Pallua, Direktor der

Klinik für Plastische Chirurgie, Hand- und Verbrennungschirurgie, danke ich für die

freundliche Überlassung des Dissertationsthemas.

Mein besonderer Dank gilt Herrn PD Dr. med. Timm Philipp Wolter für die Betreuung

während meiner Doktorarbeit. Ich bedanke mich für die zahlreichen Gespräche, Rat-

schläge und Anregungen sowie für seine ständige Unterstützung. Er war mir immer ein

sehr verständnisvoller und geduldiger Ratgeber.

Mein persönlicher Dank gilt meinen Eltern, die mir stets in allen Angelegenheiten zur

Seite stehen. Ohne ihre jahrelange, liebevolle Unterstützung wäre ich nicht zu dem

Menschen geworden, der ich jetzt bin. Lieben Dank an meine Mutter für die Hilfe beim

Korrigieren dieser Arbeit und für den Zuspruch, niemals den Mut zu verlieren.

Mein ebenso großer Dank gilt meinem Freund Simon Frank, der immer für mich da ist.

Ich danke ihm für all seine Geduld mit mir, die aufbauenden Worte und großartigen

Anregungen. Er gab dieser Doktorarbeit den perfekten Feinschliff und hat mich be-

stärkt, wenn ich an mir gezweifelt habe.

Ich bedanke mich ebenfalls bei Herrn Professor Dr. rer. nat. Christoph Suschek, der mir

besonders bei der Fertigstellung dieser Arbeit eine hervorragende Hilfe war.

Des Weiteren möchte ich allen Mitarbeitern des Labors für Plastische Chirurgie der

RWTH Aachen, vor allem Frau Andrea Fritz, für die tatkräftige Unterstützung und Be-

ratung danken.

Frau PD Dr. Claudia-Simone Kauczok möchte ich für ihre Hilfe bei der Begutachtung

und Auswertung der histologischen Präparate danken. Ich bin sehr froh, dass ich mich

mit all meinen Fragen bezüglich der Histologien stets an sie wenden konnte.

Frau Dipl.-Math. Sabine Ernst, Institut für Medizinische Statistik, danke ich herzlich für

die statistische Betreuung dieser Arbeit und ihren unermüdlichen Beitrag.

Erklärung § 5 Abs. 1 zur Datenaufbewahrung

106

Erklärung § 5 Abs. 1 zur Datenaufbewahrung

Hiermit erkläre ich, dass die dieser Dissertation zu Grunde liegenden Originaldaten in

der

Klinik für Plastische Chirurgie, Hand- und Verbrennungschirurgie des Universitäts-

klinikums Aachen

hinterlegt sind.

Lebenslauf

107

Lebenslauf

Persönliche Daten Name Britta Anna Kühlmann

Geburtsdatum 10.06.1985

Geburtsort Kandel

Staatsangehörigkeit deutsch

Familienstand ledig

Ausbildung seit 04/2011 Assistenzärztin in der Klinik für Unfall- und Handchirurgie

des Universitätsklinikums Düsseldorf

10/2004–05/2010 Studium der Humanmedizin an der RWTH Aachen

Abschluss: Staatsexamen

08/2009–05/2010 Praktisches Jahr (PJ) im Luisenhospital, Aachen

1. PJ-Tertial Plastische Chirurgie

2. PJ-Tertial Innere Medizin

3. PJ-Tertial Chirurgie

01/2008–03/2011 Wissenschaftlich-experimentelle Dissertation in der Klinik

für Plastische Chirurgie, Hand- und Verbrennungschirurgie,

Universitätsklinikum Aachen (Prof. Dr. Dr. Pallua)

Titel: „Der Einfluss des Wachstumsfaktors pdHGF auf die

Wundheilung“

1995–06/2004 Abitur, St. Angela Gymnasium der Ursulinen, Düren

Praktische Erfahrungen 03/2009–04/2009 Famulatur in der Rheumatologie, Slocum-Dickson Hospital,

Utica, New York

02/2009–03/2009 Famulatur in der Plastischen Chirurgie, Luisenhospital,

Aachen

09/2008–10/2008 Famulatur in der Psychiatrie, Jüdisches Krankenhaus, Berlin

08/2006–09/2006 Famulatur in der Allgemeinmedizin, Praxis für Allgemein-

medizin, Düren

seit 01/2008 Forschungstätigkeit in der Klinik für Plastische Chirurgie,

Universitätsklinikum Aachen

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Der Einfluss von pdHGF auf die Wundheilung Von der ...darwin.bth.rwth-aachen.de/opus3/volltexte/2012/4292/pdf/4292.pdf · Aqua destillata (lat. = destilliertes Wasser) Arg Arginin