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Aus der Plastisch- und Handchirurgischen Klinik
der
Friedrich- Alexander- Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. R. E. Horch
Der stadienabhängige Einfluss von ionisierender Strahlung auf den TGFβ1-Pathway Dupuytren´scher Fibroblasten und dessen
Blockade mittels Smad7 -
Eine in vitro Studie
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Martin Stock
aus
Erlangen
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler
Referent: PD. Dr. med. Jürgen Kopp
Korreferent: Prof. Dr. med. Raymund Horch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.01.2011
Meinen Eltern gewidmet
Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung 1
1.1. Hintergrund und Ziele 1
1.2. Material and Methoden 1
1.3. Ergebnisse und Beobachtungen 1
1.4. Praktische Schlußfolgerungen 2
2. Summary 3 2.1. Background and Targets 3
2.2. Material and Methods 3
2.3. Results and Observations 3
2.4. Practical Conclusions 4
3. Einleitung 5 3.1. Morbus Dupuytren 5
3.2. Transforming-Growth-Factor beta (TGF-β) 6
3.3. Ionisierende Strahlung 7
4. Fragestellung 8 5. Material und Methoden 9
5.1. Gewinnung und Aufarbeitung der Gewebeproben 9
5.2. Explant- Zellkultur 9
5.3. Kryokonservierung und Auftauen 10
5.4. Colony Forming Units Assay 11
5.5. Adenovirale Transfektion 12
5.6. Luciferase Assay 13
5.7. Statistische Auswertungen 13
6. Ergebnisse 14 6.1. Analyse ungeblockter Fibroblasten 14
6.2. Analyse geblockter Fibroblasten 20
7. Diskussion 25 8. Literaturverzeichnis 28 9. Abkürzungsverzeichnis 31 10. Danksagung 32
1
1 Zusammenfassung 1.1 Hintergrund und Ziele
Der Morbus Dupuytren ist eine TGFβ1 assoziierte, fibroproliferative Erkrankung der
Palmaraponeurose. Sie führt zu einer progressiven Beugekontraktur der Finger,
woraus Funktionseinbußen resultieren. Eine Fasziektomie und / oder Fasziotomie ist
die Standardtherapie, die Rezidivrate liegt bei etwa 50%. Auch ein
strahlentherapeutischer Ansatz zum Stoppen der TGFβ1 induzierten
Fibroblastenproliferation, Transdifferenzierung zu Myofibroblasten und exzessiven
Transkription von Matrixproteinen existiert1, 2. Die vorliegende Arbeit soll die Aktivität
der TGFβ1– spezifischen Genantwort Dupuytren´scher Fibroblasten aller Stadien nach
ionisierender Bestrahlung, sowie einer Blockade des TGFβ1 Signalpfades untersuchen.
1.2 Material und Methoden
Zu diesem Zweck wurden Fibroblasten aus Dupuytren´schen Kontrakturen sowie aus
Ringbändern als Kontrollen isoliert und kultiviert. Nach einem Koloniebildungstest
wurden 2 Gy als Strahlendosis festgelegt. Als quantifizierbares Vergleichskriterium
wurde die TGFβ1- induzierte Genaktivität gewählt. Sie wurde in Luciferase – Assays
detektiert, was eine vorausgehende transiente Transfektion der zu untersuchenden
Zellen mit einem adenoviralen Reporterkonstrukt erforderlich machte. Alle Assays der
erst- zweit-, dritt- und viertgradigen Dupuytren`schen Fibroblasten sowie Kontrollzellen
wurden mit 0 Gy, 1 Gy, 2Gy sowie 3Gy durchgeführt - und zwar 12,- 24,- sowie 48
Stunden nach erfolgter Bestrahlung. Dabei wurden alle Versuche immer mit
unstimuliert ungeblockten, stimuliert ungeblockten, unstimuliert geblockten und
stimuliert geblockten Fibroblasten durchgeführt.
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen
Bei erst- und zweitgradigen Dupuytren- Fibroblasten sowie Kontrollfibroblasten wird
durch eine Applikation von 1-3 GY die TGFβ1 induzierte Genantwort geringgradig
reduziert, bei viertgradigen Dupuytren´schen Fibroblasten jedoch erhöht. Die
vorliegende Arbeit belegt die hochsignifikante Reduktion der Genantwort auf einen
TGFβ1- Stimulus bei allen Graden Dupuytren´scher Fibroblasten nach Infektion mit
2
adenoviral codierten Smad7. Auch die Kombination von Smad7 und ionisierender
Strahlung wurde untersucht, wobei eine strahleninduzierte Reportergen-
Aktivitätssteigerung bei viertgradigen Dupuytren- Fibroblasten mit adenoviralen-
Smad7 geblockt werden konnte. Die gezeigten Daten belegen die signifikant stärkeren
Auswirkungen einer adenoviral mediierten Smad7 Genexpression im Vergleich zu den
getesteten Strahlendosen an allen Dupuytren- und Kontrollfibroblasten.
1.4 Praktische Schlussfolgerungen Da ionisierende Strahlung die TGFβ1– spezifische Genantwort bei erst- und
zweitgradigen Dupuytren- Fibroblasten und Kontrollfibroblasten senkt, erscheint eine
prophylaktische Strahlentherapie im Initialstadium der Dupuytren- Kontraktur plausibel.
Eine adenoviral mediierte Blockade der TGFβ1– spezifischen Signaltransduktion durch
ektope Überexpression von Smad7 ist jedoch deutlich wirkungsvoller und bei allen
Graden der Dupuytren- Kontraktur effektiv. Eine solche Blockade ist nach den in vitro
gewonnenen Erkenntnissen sehr gut geeignet eine Strahlenfibrose zu verhindern, sie
müsste aber noch im Tierversuch evaluiert werden.
3
2 Summary 2.1 Background and Targets
Dupuytren´s disease is a TGFβ1 associated fibroproliferative disorder of the palmar
aponeurosis that leads to a contraction of fingers and a subsequent loss of hand
function. Palmar fasciectomy or fasciotomy is the standard therapy, though relapses
are observed in about 50% of the patients. A prophylactic radiotherapy approach to
intervene in early stages has been proposed in order to blunt TGFβ1 induced fibroblast
proliferation, as well as their transdifferation to myofibroblasts and excessive
transcription of matrix proteins. The target of this study is the examination of shifts in
the TGFβ1 specific gene answer or specific pathway interruption caused by ionizing
irradiation.
2.2 Material and Methods
Fibroblasts were isolated and cultivated from patients suffering from Dupuytrens
disease. Cells isolated from partially cised tendon pulleys served as controls. After a
colony forming unit assay a 2 gy irradiation dosis was determined to be suitable. TGFβ1
induced gene activity was detected by using a luciferase assay. Results were chosen
as quantifiable means of comparison. This required a transient transfection with an
adenoviral reporter construct prior to measurement. All Dupuytrens fibroblasts of first,
second, third, and fourth stage as well as control fibroblasts underwent irrdiation with 0
gy, 1 gy, 2 gy as well as 3gy, followed by luciferase assays 12, 24 and 48 hours after
iradiation. All tests were performed with unstimulated unblocked, stimulated unblocked,
unstimulated blocked as well as stimulated blocked fibroblasts.
2.3 Results and Observations TGFβ1 specific gene activity of first and second stage Dupuytren´s fibroblasts was
slightly reduced by applying doses of 1-3 gy, whereas fourth stage fibroblasts showed
increased activity after the same treatment. Transient infection with adenoviral encoded
smad7 resulted in a highly significant reduction of TGFβ1 specific gene activity which
was observed in all Dupuytrens and control fibroblasts. Radiation induced increase of
gene activity in forth stage Dupuytrens fibroblasts was blocked by smad7 when
4
examining combined application of smad7 and irradiation, proving the significantly
higher potential of smad7 in comparison to the tested radiation doses.
2.4 Practical Conclusions
Leading to diminished TGFβ1 specific gene activity in first and second stage
Dupuytren´s fibroblasts, initial stages of the contracture should benefit from
prophylactic radiotherapy. However, blocking the TGFβ1 pathway by ectopic
overexpression of smad7 is proven to be comparably more effective and is not limited
to the early stages of the disease. Evaluation of in vitro tests strongly recommends
blocking the TGFβ1 pathway at irradiation caused fibrosis, if the results can be
confirmed by animal model.
5
3 Einleitung 3.1 Morbus Dupuytren Der Morbus Dupuytren ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Palmarfaszie,
die zu einer Beugekontraktur der Finger mit konsekutiven Funktionseinbußen führt3.
Die Prävalenz in Zentraleuropa liegt bei 1-3%4. Aus fibroproliferativer Aktivität im
befallenen Gewebe folgen Symptome wie palpable Knötchen in der Hohlhand. Im
weiteren Krankheitsverlauf folgt der Umbau in Stränge, klinisch progressive
Gelenkkontrakturen, sowie Verziehungen des Hautweichteilmantels. Als
Differentialdiagnosen kommen intrinsische Gelenkkontrakturen, stenosierende
Tendosynovitis, Einschlußzysten, Epitheloidzellsarkome oder auch sekundäre
Veränderungen bei rheumatoider Arthritis in Betracht.
Männer sind häufiger betroffen als Frauen. Die Erkrankung beginnt zumeist in der
fünften Lebensdekade, wobei der Verlauf bei Frauen später einsetzt und milder ist.
Kinder sind nur sehr selten betroffen. Bei familiärer Prädisposition können vor allem
junge Männer jedoch an schnell fortschreitenden Kontrakturen leiden, was in einer
seltenen aggressiven Verlaufsform als Dupuytrensche Diathese bekannt ist. Der
Morbus Dupuytren findet seine Entsprechung in der Morbus Ledderhose der Fußsohle
und der Peyronie – Krankheit, einer Kontraktur des Ligamentum fundiforme penis. Ein
eindeutiges Entstehungsmuster der Krankheit ist nicht erkennbar. Ein autosomal
dominanter Erbgang mit inkompletter Penetranz wird vermutet, es fällt aber eine
Assoziation der Kontraktur mit erhöhtem Alkohol- und Nikotinkonsum auf. Gleiches gilt
bei persistierenden Diabetes Mellitus oder Epilepsie. Mikrovaskuläre Veränderungen
und antiepileptische Medikation werden hier als Ursache vermutet. Patienten mit
therapierter rheumatoider Arthritis zeigten eine verringerte Inzidenz der Kontraktur, was
auf die antiinflammmatorische Medikation zurückgeführt wird. Unter
pathohistologischen Gesichtspunkten fallen beim Morbus Dupuytren entzündliche
Infiltrate mit Lymphozyten und Makrophagen auf. Es folgt eine überschießende
Zytokin- Sekretion mit entscheidenden Folgen für den fibrotischen Gewebsumbau.
Beteiligt sind „transformig growth factor β“ (TGF-β), Interleukin-1 (IL-1), „tumor nekrosis
faktor α“ (TNFα) und auch „basic fibroblast growth factor“ (bFGF). TGF-β1 triggert dabei
die Transformation von Fibroblasten zu Myofibroblasten. Der Krankheitsverlauf wird in
drei zeitlich aufeinanderfolgende Stadien eingeteilt. In der Proliferationsphase erfolgt
die überschießende Bildung von Myofibroblasten an den Spannungslinien der
Palmarfaszie, was palpierbare Nodula nach sich zieht. In der folgenden
Rückbildungsphase richten sich die Myofibroblasten entlang der palmaren
Spannungslinien aus, um schließlich in der Residualphase azelluläres Gewebe mit
6
kräftigen Kollagensträngen zurückzulassen. Am Gesunden besteht die Palmarfaszie
hauptsächlich aus Kollagen Typ I mit marginalen Anteilen des Typ III. Im Verlaufe der
Dupuytren`schen Kontraktur überwiegt dann Typ III Kollagen. Die geschilderten
Vorgänge prädestinieren den Morbus Dupuytren als „Modellkrankheit der Fibrose“3.
Neuartige Therapieansätze fokussieren sich auf N-Acetyl-L-Cystein, Kollagenasen,
Kalzium-Kanal-Blocker, IFN-γ, und Steroide5-8. Darüber hinaus ist auch die
kontinuierlich langsame Skelett-Traktion (TEC) erwähnenswert9. Die vollständige
Heilung ist derzeit nicht möglich, eine verlangsamte Progression, aber auch
Regressionen konnten beobachtet werden. Die effektivste Form der Therapie bleibt
vorerst die chirurgische Entfernung der veränderten Palmarfaszie.
3.2 Transforming-Growth-Factor beta (TGF- β) TGF- β bezeichnet eine Familie von 25 Zytokinen, die Wachstums- und
Differenzierungsvorgänge in vielfältiger Weise beeinflusst10. Die wichtigsten
Untergruppen stellen TGF- β1,2,3,4,5 , Aktivine und Inhibine, die „Bone Morphogenetic
Proteins“ (BMPs) und „Decaptaplegic Proteins“ (DPPs) dar.
TGF- β1, 2, 3 sind bei Vorgängen der Wundheilung bedeutungsvoll. Neben ihrer
Anwesenheit ist auch die Relation der Isoformen zueinander entscheidend. So zieht
ein verändertes Verhältnis von TGF- β1 zu TGF- β3 eine veränderte Narbenqualität
nach sich10. Bei den fibrotischen Umbauvorgängen des Morbus Dupuytren nimmt TGF-
β1 eine Schlüsselfunktion ein. Es ist an der Aufrechterhaltung der chronischen
Entzündung beteiligt und steigert die extrazellulären Kollagenablagerungen. Via
Expression von „α-smooth muscle actin“ (α-SMA) bewirkt es die Transdifferenzierung
von Fibroblasten zu Myofibroblasten. TGF-β1 vermittelt seine Wirkung indem es als
extrazellulärer Ligand spezifisch den membranständigen Typ II des TGF-β
Rezeptorkomplexes bindet. Der Typ I des Komplexes phosphoryliert die intrazellulär
agierenden Proteine Smad2 und Smad311. Smads sind eine Familie intrazellulärer
Signalmoleküle. Diese bilden einen hetero-oligomeren Komplex mit dem Co-SMAD4
und können in dieser Form in den Nukleolus translozieren12. Dies resultiert in einer
gesteigerten Transkription der profibrotischen Proteine Pro-Kollagen α, Pai-1 und α-
SMA13. Bei der TGFβ1- induzierten Expression Fibrose- asoziierter Gene kommt es
intrinsisch gleichzeitig zur Transkription von inhibitorischen Smad7, wodurch die TGFβ
- Signalkaskade mit einem negativer Feedbackmechanismus gehemmt wird11, 14, 15.
7
3.3 Ionisierende Strahlung
Die Applikation ionisierender Stahlen im Rahmen der Strahlentherapie als kurativer
Ansatz zur Bekämpfung von malignen Neoplasien ist heute im interdisziplinaren
Konzept von Chirurgie, Radiotherapie und gegebenenfalls Chemotherapie etabliert.
Darüber hinaus besteht die palliative Verwendungsmöglichkeit einer Radiatio bei
Tumoren.
Ein therapeutischer Einsatz bei nichtmalignen Erkrankungen ist die prophylaktische,
fraktionierte Bestrahlung Dupuytren`scher Kontrakturen. Die Gesamtdosis
überschreitet dabei 30 GY bei 120 kV Gleichspannung nicht. Eine Progression der
Erkrankung soll dadurch schon im frühen Stadium verhindert werden. Das eigentliche
Ziel sind die proliferierenden Fibroblasten16, 17. Ihre Transdifferenzierung in
Myofibroblasten und deren gesteigerter Synthese extrazellulärer Matrix soll
eingeschränkt werden. Die Empfindlichkeit von proliferierenden Fibroblasten und
Myofibroblasten für ionisiernde Strahlung spricht für deren Applikation. Darüber hinaus
entstehen freie Radikale, die durch Zellschädigung progessives Wachstum stoppen
und die Zelldichte vermindern. Dem aktivierten Monozyten-Makrophagen–System wird
eine bedeutende Rolle bei der Proliferation der Myofibroblasten zugeschrieben, es ist
ebenfalls hoch strahlensensibel. Zusätzlich wird ein Einfluß auf die überexprimierten
Wachstumsfaktoren TGF-β1 und PDGF postuliert. Ohne Therapie liegt die
Progressionsrate bei 50% nach 5 Jahren. Klinische Studien belegen ihre signifikante
Senkung durch eine prophylaktische Radiotherapie bei guter Akzeptanz durch den
Patienten16. Auch Regressionen konnten dabei beobachtet werden16, 18. Eine
Standardtherapie ist die prophylaktische Bestrahlung Dupuytren`scher Kontrakturen
jedoch nicht. Es werden Ineffizienz über lange Zeiträume und erschwerte
Operationsbedingungen in vorher bestrahlten Arealen beobachtet. Zu den am
häufigsten beobachteten Nebenwirkungen zählen Rötung, Trockenheit, Schuppung
und Atrophie der bestrahlten Hautareale, sowie Veränderungen der Sensibilität16.
8
4 Fragestellung
Die vorliegende Arbeit untersucht, ob ionisierende Strahlung die TGFβ1 induzierte
Genantwort verschiedener Stadien der Dupuytrenschen Kontraktur im Sinne einer
veränderten Aktivität beeinflusst und ob die Stadien unterschiedlich reagieren.
Darüber hinaus soll die Kombination von Bestrahlung mit Stimulation und Blockade des
TGF-β1 Signalweges mittels rekombinantem TGF-β1 und adenoviral codierten (Ad-)
Smad7 untersucht werden, um zu klären, ob eine strahleninduzierte Fibrogenese durch
Blockade des Smad- mediierten Signalpfades geblockt bzw. abgeschwächt werden
kann.
9
5 Material und Methoden
5.1 Gewinnung und Aufarbeitung der Gewebeproben Zur Durchführung der Versuche wurden humane Fibroblasten aus
Resektionspräparaten Dupuytren´scher Kontrakturen verschiedener Stadien isoliert.
Dazu wurden die resezierten Gewebeproben in sterile Transportröhren (50 ml Falcon,
Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland), gegeben und in das Zellkulturlabor der
Klinik für Plastische- und Handchirurgie der Chirurgischen Universitätsklinik Erlangen
verbracht. Als Kontrollzellen dienten Fibroblasten, welche aus partiell resezierten
Karpalbändern bei Karpaltunnelsyndrom-Operationen gewonnen wurden.
Unter einem Laminar Air Flow (NuAire, Plymouth, USA) erfolgte dann unter sterilen
Bedingungen in einer 10 cm Petrischale (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen,
Deutschland) die Desinfektion des Gewebes. Als Desinfektionsmittel werden 10 ml
Betaisadona (Braun, Melsungen, Deutschland) als 8 minütiges Bad verwendet.
Anschließend wurden die Proben in jeweils neuen Petrischalen für fünf Minuten in
gepufferter Phosphatlösung (phosphate buffered saline, PBS, w/o Ca2+, Mg2+,
Biochrom, Berlin, Deutschland) gespült.
Nachfolgend wurde eine weitere Desinfektion für zwei Minuten in einer Petrischale mit
70%igem Ethanol (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland) durchgeführt und erneut für fünf
Minuten mit PBS gespült. Dieser Arbeitsschritt erfolgte insgesamt drei mal.
5.2 Explant-Zellkultur Um eine möglichst sichere und hohe Ausbeute an Fibroblasten erzielen zu können
erfolgte die Isolation der Zellen aus den Gewebeproben in der sogenannten
Explantationskulturtechnik 19, 20.
Hierzu zunächst erfolgte am desinfizierten Gewebe die mechanische Separierung von
anhängigem Fettgewebe sowie die Zerkleinerung der Proben in 3 mm große
Fragmente mit Hilfe steriler Instrumente. 75 cm2 Zellkulturflaschen (Greiner, Bio-One,
Frickenhausen, Deutschland), wurden mit 1 ml sterilem Zellkulturmedium (DMEM w.
Glucose 1.0 g/l, NaHCO3 3.7 g/l, N-Acetyl-L-Alanyl-L-Glutamin 1.0289 g/l,
BIOCHROM) supplementiert mit 10% FCS, 40 µg/ml Gentamycin (GIBCO/BRL) ohne
Wachstumsfaktorzusätze) benetzt. In diese vorbereiteten Flaschen erfolgte sodann die
Verbringung der vorbereiteten Gewebefragmente, welche in diesen gleichmäßig verteilt
und unter vorsichtigem mechanischem Druck angepresst wurden, um ein späteres
10
Abschwimmen der Gewebefragmente zu verhindern. Die bestückten Flaschen wurden
zunächst für 1 h in den Zellkulturschrank („Biohit“, Nunk, Wiesbaden, Deutschland)
unter Standardbedingungen (37° C, 90% Luftfeuchtigkeit, 5% CO2) verbracht, und
sodann final mit 10 ml Zellkulturmedium aufgefüllt. Das Medium wurde jeden dritten
Tag gewechselt. Bei Erreichen einer 80%igen Konfluenz erfolgte die Subkultur der
Zellen. Dazu wurde das Medium abgesaugt und die Zellen zweimal mit PBS gespült.
Nach Zugabe von 5 ml Trypsin / EDTA (Biochrom, Berlin, Deutschland) erfolgt für 6
Minuten die Lagerung im Brutschrank. Die Ablösung der Zellen vom Flaschenboden
wurde unter dem Lichtmikroskop („Axiovert 25“, Carl Zeiss Jena GmbH, Jena,
Deutschland) kontrolliert und das Enzym durch die Zugabe von 10 ml Zellkulturmedium
geblockt. Die resultierende Zellsuspension wurde dann in ein 50 ml
Zentrifugenröhrchen (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany) überführt und in eine
Zentrifuge (Heraeus, Hanau, Deutschland) gegeben. Nach achtminütigem
Zentrifugieren bei 1000 „rounds per minute“ (rpm) wurde der Überstand verworfen und
das resultierende Pellet mit Zellkulturmedium resuspendiert. Danach erfolgte die
Reinkubation der Zellen in Kulturflaschen im Expansionsverhältnis 1:3.
5.3 Kryokonservierung und Auftauen Falls die Zellen erst zu einem späteren Zeitpunkt verwendet werden sollten erfolgte
ihre Kryokonservierung. Dabei wurde, wie bei der Subkultivierung beschrieben, eine
Lyse des Zellverbandes durchgeführt, mit Erhalt eines Pellets nach Zentrifugation. Im
Falle der Kryokonservierung wurde das Pellet nach dem Verwerfen des Überstandes in
500 µl FCS resuspensiert worauf bis zum Erreichen eines 10% Dimethylsulfoxid
(DMSO, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) Gehaltes 20% iges DMSO in das
FCS getropft wurde. Die DMSO- Zugabe erfolgte auf Eis. Nach Überführung in
Kryoröhrchen (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland) wurden diese auf -70°C
gefroren. Eine Lagerung über Monate erfolgte in flüssigem Stickstoff.
Das Auftauen der in Kryoröhrchen gelagerten Zellsuspension erfolgte durch kurzes
benetzen in einem 37°C temperierten Waserbad (Julabo, Seelbach, Deutschland). Bei
Bildung eines Flüssigkeitsfilms zwischen Kryoröhrchen und dem enthaltenen Eis,
wurde der Inhalt unter sterilen Kautelen im Laminar Air- Flow in ein
Zentrifugenröhrchen mit 10 ml Zellkulturmedium überführt. Nach 8 minütiger
Zentrifugation bei 1000 rpm wurde der Überstand verworfen und das Pellet wie bei der
Subkultivierung beschrieben resuspendiert und in Zellkulturflaschen ausgesäht. Alle
nachfolgend beschriebenen Versuche erfolgten mit Fibroblasten der vierten Passage.
11
5.4. Colony Forming Units Assay
Der Koloniebildungstest dient der Erstellung einer Dosiswirkungsbeziehung zwischen
Strahlung und klonalem Überleben. Mit ihm wurde mittels Survival fraction (SF) 2 Gy
als effiziente Stahlendosis für die später durchzuführenden Versuche bestimmt. Unter
sterilen Bedingungen wurden unter dem Laminar Air Flow die zu untersuchenden
Fibroblasten in 10 cm Petrischalen mit 10 ml Zellkulturmedium ausgesäht, wobei das
Verhältnis von DMEM zu FCS 4:1 betrug. Um eine hohe Stoffwechselaktivität der
Zellen zu gewährleisten, wurden nur Kulturen gewählt, welche eine 70%-ige Konfluenz
nicht überschritten, wodurch eine Zellumsatzminderung durch Kontaktinhibition
ausgeschlossen wurde. Die Petrischalen wurden im Brutschrank unter
Standardbedingungen kultiviert und das Medium bei Farbumschlag oder spätestens
nach einer Woche gewechselt. Da später einzelne Kolonien ausgezählt wurden, war
die Zellzahl so bemessen, dass sich innerhalb von drei Wochen kein vollständiger,
gleichmäßiger Bewuchs der Schale ergab.
Am Tag nach der Aussaat wurden die Petrischalen mit verschiedenen
Strahlungsdosen bestrahlt. Die Bestrahlung erfolgt an einem Gerät mit Gleichspannung
(RT 250, Phillips, Hamburg, Deutschland; 120kV/20 mAs/2 mm Al, Abstand 10 cm).
20 Tage nach Bestrahlung erfolgte unter dem Mikroskop die Auszählung der Kolonien
zur Bestimmung der idealen Strahlendosis. Dazu wurde das Kulturmedium abpipettiert
und durch 3 ml Methylenblau (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland) ersetzt, wobei
der Boden der Petrischale gleichmäßig benetzt sein mußte. 30 Minuten später wurde
die Färbelösung verworfen. Die Zellen wurden zuerst mit H2O und nachfolgend mit
Milli-Q-H2O (Aqua dest., ELGA Process Water, Marlow, UK) zur Vermeidung von
Kalkflecken gespült. Danach erfolgte die Trocknung der Petrischalen bei Raumluft
sowie Markierung und Auszählung der Kolonien. Die im Colony Forming Units Assay
ausgesähten Zellzahlen, die verwendeten Strahlendosen, sowie die entstandenen
Zellkolonien sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Zellzahl (Z) Strahlendosis (Gy) Kolonien (K)
500 0 18
500 0 18
500 1 18
500 1 Pilzbefall
1000 2 11
1000 2 12
1500 3 10
12
1500 3 10
2500 4 8
2500 4 9
4000 6 5
4000 6 3
7500 8 0
7500 8 0
Tab. 1 Colony Forming Units Assay
5.5 Adenovirale Transfektion Um eine gesteigerte oder gesenkte Transkriptionsaktivität TGFβ1-abhängiger
Genabschnitte zu quantifizieren, wurde ein adenovirales CAGA-Reporter-Konstrukt
(freundlicherweise von Prof. Steven Dooley, Universität Heidelberg/ Mannheim,
Deutschland zur Verfügung gestellt) eingesetzt. Es bindet spezifisch an CAGA-DNA-
Sequenzen, wie sie in Promotorregionen von TGF-β1 Zielgenen vorkommen. In dem
adenoviralen Konstrukt sind neun Kopien der CAGA-Box an einen MLP (Major Late
Promoter) Promoter mit TATA-Box gekoppelt. Das Konstrukt codiert zusätzlich für
Luciferase. Eine Transkription fibroproliferativer Genabschnitte führt so zur Synthese
des Enzyms Luciferase. Es decarboxyliert bei Vorhandensein von ATP und Mg2+
Luciferin oxidativ unter Freisetzung von Licht. Der Nachweis erfolgt mittels eines
Luciferase- Assay.
Unter dem Laminar Air Flow erfolgte die Aussaat der Fibroblasten in eine 96 Well- LIA-
Platte (steril, mit Deckel, transparentem Boden, Wände weiss, beschichtet für.
Zellkultur, Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland), 5000 Zellen pro Well, in
100µl Zellkulturmedium pro Well. Anschließend wurden die Zellen für 24h bei 37°C im
Brutschrank inkubiert.
Um die Transfektion vorzubereiten wurde das Medium durch ein Hungermedium mit
5% FCS ersetzt, bei anschließender Lagerung im Inkubator unter
Standardbedingungen für eine Stunde. Danach wurde ein Austausch durch ein
Hungermedium mit 0,5% FCS vorgenommen. Es folgte eine einstündige Inkubation im
Brutschrank unter Standardbedingungen.
Unter S2 Bedingungen wurden die Fibroblasten mit dem für CAGA codierenden
adenoviralen Konstrukt bei einer MOI („multiplicity of infection“) von 50 infiziert. Dies
entspricht einem Verhältnis von 50 infektiösen Partikeln (ifu) pro Zelle. Die
13
Wahrscheinlichkeit einer nicht erfolgten Infektion von Fibroblasten beträgt laut
statistischer Poisson-Verteilung 2 x 10 -20 %.
Nach einer Stunde Inkubation unter Standardbedingungen im Brutschrank wurde das
mit den Viren kontaminierte Hungermedium durch frisches Hungermedium ersetzt,
worauf die Bebrütung fortgesetzt wurde.
Nach 24 Stunden fand die Stimulation der vorgesehenen Wells durch Zugabe von 5
ng/ml TGF-β1 (R&D Systems GmbH, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) mit.
anschließender einstündiger Inkubation im Brutschrank unter Standardbedingungen
statt. Nach der nun durchgeführten Bestrahlung lagerte die Platte wieder unter
Standardbedingungen im Inkubator. Je nach Meßpunkt erfolgte das Luciferase Assay
nach 12, 24 oder 48 Stunden.
5.6 Luciferase Assay
Bei Raumtemperatur wurde das lyophylisierte Luciferase-Assay-Reagenz im Lyse-
Puffer gelöst (“Steady-Glo Luciferase Assay System”, Promega Corporation, Madison,
USA). Das Ansetzen erfolgte mittels Rollmischer („CAT RM 5", CAT Ingenieurbüro,
Staufen, Deutschland). Das Reagens wurde entweder sofort für die durchzuführenden
Untersuchungen verwendet oder bei –20°C bei 8% Wirkungseinbuße für maximal zwei
Wochen gelagert. Beim Auftauen wurde das Gemisch nicht über 25°C erwärmt.
Der Inhalt jedes Wells wurde mit Steady-Glo Luciferase Reagens im Verhältnis 1:1
expandiert. Nach 15 Minuten erfolgte die Quantifizierung der Transkription mittels
Messung der Lumineszenz am Chemoluminometer ("Lumat Centro LB 960", Berthold
Technologies GmbH, Bad Herrenalb, Deutschland). Das Ergebnis wurde in „light
cycles per second“ (LCPS) angegeben.
5.7 Statistische Auswertungen Jeweils sechs Felder der 96-Well Platten repräsentierten die gleiche Testsituation. Das
Chemoluminometer gab für jedes Well ein Ergebnis in LCPS an. Davon wurde der
Leerwert abgezogen und zur statistischen Analyse ein two-tailed unpaired Student t-
test mit einem P-Wert von mindestens 0.05 durchgeführt. Die statistischen
Berechnungen sowie die graphische Auswertung erfolgte mit GraphPad Prism
(GraphPad Software for Science, Inc., San Diego, CA, USA) Version 4.02.
14
6 Ergebnisse 6.1 Analyse ungeblockter Fibroblasten Ionisierende Strahlung reduziert die TGFβ1 induzierte Ad-(CAGA)9-MLP-Luc Reportergen-Aktivität an erstgradigen Dupuytren`schen Fibroblasten
Um die Wirkung ionisierender Strahlung auf den TGFβ1-Pathway zu bestimmen
wurden Dupuytren`sche Fibroblasten und Kontrollfibroblasten mit einem adenoviralen
(CAGA)9-MLP-Luc Reporterkonstrukt infiziert und mit TGFβ1 stimuliert. Die Messungen
am Chemoluminometer wurden 12, 24 und 48 Stunden nach der Bestrahlung
durchgeführt. Dupuytren-Fibroblasten Grad I (DF°I) und Kontrollfibroblasten (CF)
zeigen nach Anwendung ionisierender Strahlen verminderte Aktivität des
Reportergens. Die Transkription fibroproliferativer Gene sinkt mit steigender
Strahlendosis [Abb. 1]. Bei Kontrollfibroblasten reduzierten nur 3Gy die 24 Stunden
Messwerte signifikant [0Gy (1193±206,9), n = 4 vs. 3GY (833±107,2), n = 4; P = 0,021]
[Abb. 2A]. Bei Dupuytren´schen Fibroblasten Grad I erzielten ionisierende Strahlen nur
bei dem 12- Stunden Messwert eine signifikante Reduktion der LCPS [0GY
(1080±50,0), n=3 vs. 1GY (838±135,4), n = 4, P = 0,034] [Abb. 2B].
DF°I CF0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 GY 1 GY 2 GY 3 GY
1700
1900
2100
2300
LCPS
267,7 245,6221,1
218,2
206,9207,7
199,1
107,2
Abb. 1 24- Stunden Meßwerte, Ad-(Caga)9 MLP-Luc + 5ng TGF1/ml Ionisierende Strahlen reduzieren die Ad-(CAGA)9-MLP-Luc Reportergen-Aktivität bei
Dupuytren- Fibroblasten Grad I (DF°I) sowie Kontrollfibroblasten (CF). Die Infektion der 80%
15
konfluenten Zellen wurde durch 24- stündige Inkubation mit einem Hungermedium (0,5% FCS)
vorbereitet. Die Infektion selbst erfolgte bei einer Einwirkzeit der Viren für eine Stunde bei einer
MOI von 50. Am folgenden Tag fand die Stimulation mit TGFβ1 und eine Stunde später die
Bestrahlung statt. Die Messung wurde nach 24 Stunden an einem Chemoluminometer
durchgeführt und in LCPS auf der Y- Achse aufgetragen. Die Standardabweichung ist als ± SD
über den Balken dargestellt. Mittels „two-tailed unpaired Student t-Test“ wurden die
Signifikanzen berechnet.
0 GY 3 GY0
200
400
600
800
1000
1200
1400
A
206,9
107,2
Kontrollzellen, stimuliert, 24h - Werte, 3Gy gg. 0Gy, p=0,021
LCPS
0 GY 1 GY0
200
400
600
800
B
174,5
162,2
DF°I, stimuliert, 48h - Werte, 1Gy gg. 0Gy, p=0,034
LCPS
Abb. 2 [A] Ionisierende Strahlung von 3 Gy bewirkt nach 24 Stunden eine signifkant reduzierte
Ad-(Caga)9-MLP-Luc Reportergen-Aktivität bei Kontrollfibroblasten (CF). [B] Ionisierende
Strahlung von 1 Gy bewirkt nach 48 Stunden eine signifkant reduzierte Ad-(Caga)9-MLP-Luc
Reportergen-Aktivität bei Dupuytren- Fibroblasten Grad I (DF°I). Die Infektion der 80%
konfluenten Zellen wurde durch 24 stündige Inkubation mit einem Hungermedium (0,5% FCS)
vorbereitet. Die Infektion selbst erfolgte bei einer Einwirkzeit der Viren für eine Stunde bei einer
MOI von 50. Ein Tag später fand die Stimulation mit TGFβ1 und eine Stunde danach die
Bestrahlung statt. Die Messung wurde an einem Chemoluminometer durchgeführt und ist in
LCPS angegeben. Die Standardabweichung ist als ±SD über den Balken dargestellt. Mittels
„two-tailed unpaired Student t-Test“ wurden die Signifikanzen berechnet.
Bei zweitgradigen Dupuytren`schen Fibroblasten wird die TGFβ1 induzierte Ad-(CAGA)9-MLP-Luc Reportergen-Aktivität durch ionisierende Strahlung reduziert
Zweitgradige Dupuytren- Fibroblasten und Kontrollfibroblasten wurden mit einem
adenoviralen (CAGA)9-MLP-Luc Reporterkonstrukt infiziert und mit TGFβ1 stimuliert.
Nach einer Stunde wurden die Zellen bestrahlt. Die TGFβ1 – spezifische Genantwort
wurde über eine Chemolumineszenzreaktion nach 12, 24 und 48 Stunden gemessen.
Bei Dupuytren-Fibroblasten Grad II (DF°II) und Kontrollfibroblasten (CF) fällt die
Aktivität des Reportergens nach Anwendung ionisierender Strahlen ab [Abb. 3].
16
Bei Dupuytren´schen Fibroblasten Grad II erzielten ionisierende Strahlen nur bei dem
24 Stunden Messwert eine signifikante Reduktion der LCPS [0GY (4465±610,3), n=4
vs. 2GY (3335±668,9), n = 4, P = 0,047] [Abb. 4].
DF°II CF0
250
500
750
1000
1250
0 GY 1 GY 2 GY 3 GY
2500
3500
4500
5500
LCPS
610,2
477,2 668,9 478,4
206,9207,7
199,1
107,2
Abb. 3 24- Stunden Meßwerte, Ad-(Caga)9 MLP-Luc + 5ng TGF1/ml Die Aktivität des Adenoviralen Reportergens wird bei Dupuytren`schen Fibroblasten Grad II
(DF°II) und bei Kontrollfibroblasten (CF) durch ionisierende Strahlen reduziert. Vor der Infektion
der zu 80% konfluenten Zellen mit dem Ad-(CAGA)9-MLP-Luc Reportergen wurden sie 24
Stunden synchronisiert (0,5%FCS). Bei der Infektion konnten die Viren für eine Stunde bei einer
MOI von 50 einwirken. Am folgenden Tag fand die Stimulation mit TGFβ1 und eine Stunde
später die Bestrahlung statt. Die Messung am Chemoluminometer wurde nach 24 Stunden
durchgeführt und in LCPS angegeben. Die Standardabweichung ist als ±SD über den Balken
dargestellt. Die Signifikanzen wurden durch einen „two-tailed unpaired Student t-Test“
errechnet.
0 GY 2 GY0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
610,3
668,9
DF°II, stimuliert, 24h - Werte, 2Gy gg. 0Gy, P =0,047
LCPS
Abb. 4 Ionisierende Strahlung von 2GY senkt 24-Stunden LCPS- Wert bei DF°II signifikant. Die Hungerphase vor der Infektion mit dem
Reporterkonstrukt betrug 24 Stunden. Ein Tag
nach der Infektion mit 50 Adenoviren pro
Fibroblast folgte die Stimulation der TGFβ1
Signalkaskade, eine Stunde später erfolgte die
Applikation der Strahlendosis. Ab dann betrug die
Zeitspanne bis zum Luziferase Assay 24 Stunden.
Zur Berechnung der Signifikanzen“ wurde der
„two-tailed unpaired Student t-Test verwendet.
17
Bei drittgradigen Dupuytren- Fibroblasten zeigt sich kein Zusammenhang zwischen Strahlendosis und Ad-(CAGA)9-MLP-Luc Reportergen-Aktivität TGFβ1 ist ein extrazelluärer Ligand der über zytoplasmatische SMAD Proteine die
Transkription zahlreicher Matrixproteine in der Fibrogenese bewirkt. Es wurde die
Wirkung einer Bestrahlung auf drittgradige Dupuytren`sche Fibroblasten und
Kontrollfibroblasten untersucht. Die Proben wurden erst mit einem adenoviralen
(CAGA)9-MLP-Luc Reporterkonstrukt infiziert und 24 Stunden später mit TGFβ1
stimuliert. Nach einer Stunde wurde die Bestrahlung, nach weiteren 12, 24 und 48
Stunden die Messungen am Chemoluminometer durchgeführt. Dupuytren- Fibroblasten
Grad III (DF°III) zeigen nach Anwendung ionisierender Strahlen verminderte, aber auch
gesteigerte Aktivität des Reportergens. Signifikanzen wurden dabei nur von 48-
Stunden Messwerten erreicht. Bei Kontrollfibroblasten bewirkte eine höhere GY- Zahl
einen niedrigeren LCPS- Wert [Abb. 5]. Bei Dupuytren´schen Fibroblasten Grad III
erzielten ionisierende Strahlen mit 1 GY bei dem 48- Stunden Messwert eine
signifikante Reduktion der LCPS [0GY (1288±110,2), n=6 vs. 1GY (988±155,6), n = 6,
P = 0,003] [Abb. 6 A]. Der gleiche Effekt trat nach 48 Stunden bei einer Dosis von 2 GY
auf [0GY (1288±110,2), n=6 vs. 2GY (898±147,4), n = 6, P = 0,0004] [Abb. 6 B]. Im
Vergleich zu 2 GY bewirkten 3GY ionisierender Strahlung hingegen einen signifikant
Anstieg, gemessen in LCPS [2GY (898±147,4), n=6 vs. 3GY (1167±185,7), n = 6, P =
0,020] [Abb. 6 C].
DF°III CF0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 GY 1 GY 2 GY 3 GY
179,0137,2
242,5
156,2206,9
207,7
199,1
107,2
LCPS
Abb. 5 Ionisierende Strahlen haben keinen einheitlichen Effekt auf die Ad-(CAGA)9-MLP-Luc Reportergen-Aktivität bei Dupuytren- Fibroblasten Grad III (DF°III). Bei den
Kontrollfibroblasten (CF) zeigt sich unter identischen Umständen eine verminderte Reportergen-
18
Aktivität. Die Durchführung der Versuche erfolgte nach vorhergehend beschriebenem
Prozedere.
0 GY 1 GY0
200
400
600
800
1000
1200
1400
A
110,2
155,6
DF°III, stimuliert, 48h - Werte, 1Gy gg. 0Gy, P= 0,003
LCPS
0 GY 2 GY0
200
400
600
800
1000
1200
1400
B
110,2
147,4
DF°III, stimuliert, 48h - Werte, 2Gy gg. 0Gy, P= 0,0004
LCPS
Abb. 6 Drittgradige Dupuytren- Fibroblasten zeigen 48 Stunden nach erfolgter Bestrahlung keine einheitlich gesteigerte oder gesenkte Ad-(CAGA)9-MLP-Luc Reportergen-Aktivität. [A] Eine
Strahlendosis von 1 Gy führte im Vergleich
mit unbestrahlten Zellen zu signifikant
gesenkten LCPS- Werten (P = 0,003). [B] Eine Strahlendosis von 2 Gy senkt den
LCPS-Wert im Vergleich zu 0 Gy signifikant
(P = 0,0004). [C] Mit 3 Gy bestrahlte DF°III
wiesen eine signifikant höhere Reportergen-
Aktivität auf als mit 2 Gy bestrahlte Proben (P
= 0,020). Die Versuche wurden wie oben
beschrieben durchgeführt.
2GY 3GY0
200
400
600
800
1000
1200
1400
C
147,4
185,7
DF°III, stimuliert, 48h - Werte, 3Gy gg. 2Gy, P= 0,020
LCPS
Bei viertgradigen Dupuytren- Fibroblasten steigert Ionisierende Strahlung die TGFβ1 induzierte Ad-(CAGA)9-MLP-Luc Reportergen- Aktivität
Es wurden die Auswirkungen ionisierender Strahlen auf die TGFβ1– Signalkaskade bei
DF°IV- Fibroblasten untersucht. Nach 12, 24 und 48 Stunden wurde die
Transkriptionsaktivität des Reporterkonstruktes am Chemoluminometer gemessen.
19
Dupuytren- Fibroblasten Grad IV (DF°IV) zeigen mit steigender Strahlendosis eine
höhere Transkriptionsaktivität fibroproliferativer Gene. Kontrollfibroblasten (CF) zeigen
nach Anwendung ionisierender Strahlen mit niedrigeren LCPS- Werten eine
verminderte Transkriptionsaktivität [Abb. 7].
Bei viertgradigen Dupuytren´schen Fibroblasten steigerten 3Gy die 24- Stunden
Messwerte gegenüber 0 Gy hochsignifikant [0Gy (10553±1010,4), n = 6 vs. 3GY
(14758±1041,2), n = 6; P = 0,00003] [Abb. 8A]. Ebenso waren die LCPS- Werte nach
3Gy im Vergleich mit 1 Gy signifikant gesteigert [1Gy (12237±2469,6), n = 6 vs. 3GY
(14758±1041,2), n = 6; P = 0,044] [Abb. 8B]. Auch gegenüber 2 GY waren die 3 GY
Ergebnisse höher [2Gy (11973±1300,7), n = 6 vs. 3GY (14758±1041,2), n = 6; P =
0,002] [Abb. 8C].
DF°IV CF0
250
500
750
1000
1250
0 GY 1 GY 2 GY 3 GY
9000
11000
13000
15000
17000
1010,4
2469,61300,7
1041,2
206,9207,7
199,1
107,2LCPS
Abb. 7 24- Stunden Meßwerte, Ad-(CAGA)9 MLP-Luc + 5ng TGF1/ml Ionisierende Strahlung steigert die Reportergen- Aktivität bei DF°IV. Im Gegensatz dazu
sinkt bei den Kontrollfibroblasten (CF) die Aktivität nach Bestrahlung. Die Hungerphase vor der
Infektion mit dem Reporterkonstrukt betrug 24 Stunden. Ein Tag nach der Infektion mit 50
Adenoviren pro Fibroblast folgte die Stimulation der TGFβ1 Signalkaskade, eine Stunde später
erfolgte die Applikation der Strahlendosis. Ab dann betrug die Zeitspanne bis zum Luziferase
Assay 24 Stunden.
20
0 GY 3 GY0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
A
1010,4
1041,2
DF°IV, stimuliert, 24h - Werte, 3Gy gg. 0Gy, P= 0,00003
LCPS
1 GY 3 GY0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
B
2469,61041,2
DF°IV, stimuliert, 24h - Werte, 3Gy gg. 1Gy, P= 0,044
LCPS
Abb. 8 Ionisierende Strahlung steigert die Reportergen- Aktivität bei DF°IV signifikant. [A] Ionisierende Strahlung von 3 Gy bewirkt
nach 24 Stunden eine gegen 0 GY signifkant
gesteigerte Ad-(CAGA)9-MLP-Luc Reporter-
gen- Aktivität bei viertgradigen Dupuytren-
Fibroblasten (DF°IV) (P = 0,00003). [B] Eine
Bestrahlung mit 3 Gy bewirkt nach 24
Stunden eine im Vergleich mit 1 Gy signifkant
erhöhte Ad-(CAGA)9-MLP-Luc Reportergen-
Aktivität. [C] Die Reportergen- Aktivität fällt
durch 3 Gy ionisierende Strahlung signifikant
höher aus als nach 2 Gy (P = 0,002).
2 GY 3 GY0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
C
1300,7
1041,2
DF°IV, stimuliert, 24h - Werte, 3Gy gg. 2Gy, P= 0,002
LCPS
6.2 Analyse geblockter Fibroblasten Die fibroproliferative Wirkung von TGFβ1 wird cytoplasmatisch über Smad Proteine
vermittelt21, 22. Sie gelten als TGFβ kontrollierte Co-Modulatoren der Transkription23. Zu
der Familie der Smads zählen auch inhibitorische Smads, die im Sinne eines negativen
Rückkoppelungsmechanismus die Smad Aktivierung duch TGFβ blockieren. Smad 7
kann duch Unterbrechung der Signalkaskade die TGFβ1 initiierte Transkription
fibroproliferativer Proteine senken22, 24.
Es wurde die Auswirkung ionisierender Strahlung auf die Aktivierung des TGFβ1–
spezifischen Pathways und gleichzeitiger Blockade durch Smad7 untersucht. Dazu
21
wurden Dupuytren`sche Fibroblasten aller Grade und Kontrollfibroblasten isoliert aus
dem Ligamentum carpi transversum verwendet. Die Zellen wurden gleichzeitig mit
adenoviralen Smad7 und einem adenoviralen (CAGA)9-MLP-Luc Reporterkonstrukt
infiziert. Am folgenden Tag fand die Stimulation des Pathways mit TGFβ1 und eine
Stunde später die Bestrahlung statt. Die Messungen der Transkriptionsaktivität mittels
Luciferase Assay wurden nach 12, 24 und 48 Stunden durchgeführt.
Die TGFβ1 induzierte Ad-(CAGA)9-MLP-Luc Reportergen- Aktivität erstgradiger Dupuytren´scher Fibroblasten wird durch Ad-Smad7 hochsignifikant gesenkt. Ad-Smad7 Transfektion unbestrahlter DF°I bewirkt eine hochsignifikant gesenkte Ad-
(CAGA)9-MLP-Luc Reportergen- Aktivität [ohne Ad-Smad7 (1870±267,7), n = 4 vs. mit
Ad-Smad7 (203±60,2), n = 4; P = 0,00002] [Abb. 9A]. Ionisierende Strahlung bewirkt
keine zusätzliche Veränderung.
DF°I CF 0
500
1000
1500
2000
TGFβ1 TGFβ1 + Ad-Smad7
A267,7
60,2
206,9
22,7
LCPS
DF°I CF0
25
50
0 GY 1 GY 2 GY 3 GY
B
60,2
29,941,9
39,5
42,4
20,815,0
22,2
150
200
250
300
350
LCPS
Abb. 9 Stimulierte aber gleichzeitig mit Ad-Smad7 geblockte DF°I zeigen hochsignifikant verminderte Reportergen-Aktivität (P = 0,00002) [A]. Bei mit TGFβ1stimulierten und
gleichzeitig mit Ad- Smad7 geblockten DF°I ändert ionisierende Strahlung die Reportergen-
Aktivität nicht signifikant [B]. Die Hungerphase vor der synchronen Co-Transfektion mit dem Ad-
(CAGA)9 MLP-Luc Reporterkonstrukt und Ad-Smad7 betrug 24 Stunden. Ein Tag nach der
Infektion mit je 50 der beiden adenoviralen Konstrukte pro Fibroblast folgte die Stimulation der
TGFβ1 Signalkaskade, eine Stunde später erfolgte die Applikation der Strahlendosis. Ab dann
betrug die Zeitspanne bis zum Luziferase Assay 24 Stunden. Der „two-tailed unpaired Student
t-Test“ wurde zu Berechnung von Signifikanzen eingesetzt.
Zweitgradige Dupuytren- Fibroblasten zeigen nach Ad- Smad7- Infektion eine hochsignifikante Reduktion TGFβ1 induzierter Ad-(CAGA)9-MLP-Luc Reportergen- Aktivität.
22
Ad-Smad7 Transfektion unbestrahlter DF°II bewirkt eine hochsignifikant gesenkte Ad-
(CAGA)9-MLP-Luc Reportergen- Aktivität [ohne Ad-Smad7(4465±610,3), n = 4 vs. mit
Ad-Smad7(1353±98,1), n = 4; P = 0,00006] [Abb. 10A].
Nach Applikation von 3Gy zeigt sich im Vergleich zu unbestrahlten Proben eine
signifikant gesenkte Reportergen- Aktivität [3 Gy (1158±97,1), n = 4 vs. 0 Gy
(1353±98,1), n = 4; P = 0,030] [Abb. 10B]. Von diesem 24 Stunden 3 Gy- Messwert
abgesehen zeigt sich auch bei 12- und 24- Stunden keine Auswirkung der Bestrahlung.
DF°II CF 0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
5500
TGFβ1 TGFβ1 + Ad-Smad7
A
610,3
98,1 206,9
22,7
LCPS
DF°II CF0
200
400
600
0 GY 1 GY 2 GY 3 GY
B
98,1 178,6234,7
97,1
42,420,8 15,022,2
900
1100
1300
1500
1700
LCPS
Abb. 10 24- Stunden Meßwerte Ad-(Caga)9 MLP-Luc + Ad-Smad7 + 5ng TGF1/ml [A] TGFβ1- stimulierte DF°II zeigen mit Ad-Smad7 hochsignifikant verminderte Reportergen-
Aktivität (P = 0,00006). [B] Zusätzlich zur Blockade des TGFβ1 Pathways duch Ad- Smad7
senkt ionisierende Strahlung die Reportergen- Aktivität nur bei dem 24- Stunden 3 Gy Wert signifikant. Die Versuche wurden der oben beschriebenen Vorgehensweise entsprechend
durchgeführt.
Die TGFβ1 induzierte Ad-(CAGA)9-MLP-Luc Reportergen- Aktivität drittgradiger Dupuytren´scher Fibroblasten wird durch Ad-Smad7 hochsignifikant gesenkt. Zusätzliche Bestrahlung bewirkt nach 24 Stunden gesteigerte, nach 48 Stunden gesenkte LCPS- Werte.
Die Ad-(CAGA)9-MLP-Luc Reportergen- Aktivität wird durch eine ektope
Überexpression von Smad7 in unbestrahlten DF°III hochsignifikant gesenkt [ohne Ad-
Smad7 (1482±179,0), n = 6 vs. mit Ad-Smad7 (740±108,4), n = 6; P = 0,000006 [Abb.
11 A]. Nach Anwendung ionisierender Strahlung von 2Gy steigt nach 24 Stunden im
Vergleich zu unbestrahlten Proben die Reportergen- Aktivität signifikant [2 Gy
(968,3±139,9), n = 6 vs. 0 Gy (740±108,4), n = 6; P = 0,010] [Abb. 10B]. Gleiches gilt
für 3 Gy [3 Gy (981,7±75,5), n = 6 vs. 0 Gy (740±108,4), n = 6; P = 0,001] [Abb. 10B].
Nach 48 Stunden fällt die Reportergen- Aktivität durch die Bestrahlung signifikant [1 Gy
23
(535±53,6), n = 6 vs. 0 Gy (635±57,8), n = 6; P = 0,011] [Abb. 10 C]. Der gleiche Effekt
zeigt sich nach 2 GY [2 Gy (457±44,6), n = 6 vs. 0 Gy (635±57,8), n = 6; P = 0,0001]
[Abb. 10 C] und nach 3 Gy [3 Gy (478±109,6), n = 6 vs. 0 Gy (635±57,8), n = 6; P =
0,011] [Abb. 10 C]. Die LCPS- Werte der Kontrollen steigen nach 48 Stunden bei
gleichzeitiger Stimulation und Blockade durch Ad-Smad7 mit der Strahlendosis
geringgradig aber nicht signifikant an [Abb. 11 C].
DF°III CF 0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
TGFβ1 TGFβ1 + Ad-Smad7
A179,0
108,4
206,9
22,7
LCPS
DF°III CF200
300
400
0 GY 1 GY 2 GY 3 GY
B
108,4 57,4
139,9
97,1
42,4
20,815,0
22,2
75,5
600
800
1000
1200
LCPS
Abb. 11 Ad-(Caga)9 MLP-Luc +5ng TGF1/ml+ Ad- Smad7- Infektion von III°igen DK`s. [A] TGFβ1- stimulierte DF°III zeigen mit Ad-
Smad7 nach 24 Stunden hochsignifikant
verminderte Reportergen-Aktivität (P =
0,000006). [B] Ionisierende Strahlung
steigert nach 24 Stunden die Reportergen-
Aktivität Ad- Smad7- geblockter DF°III
signifikant. [C] Ionisierende Strahlung senkt
die 48 Stunden Werte der Reportergen-
Aktivität in Ad- Smad7 geblockten DF°III
signifikant. Identisch behandelte CF zeigen
mit Bestrahlung nicht signifikant erhöhte
LCPS- Werte.
DF°III CF0
100
200
300
0 GY 1 GY 2 GY 3 GY
C57,9
53,6
44,6
109,6
29,9 10,0
78,0
23,8
400
500
600
700
LCPS
Ad-Smad7 reduziert bei viertgradigen Dupuytren- Fibroblasten die TGFβ1 induzierte Reportergen- Aktivität hochsignifikant. Zusätzliche Bestrahlung bewirkt eine leichte Senkung der LCPS- Werte, die jedoch nur in einem 12- Stunden Messwert signifikant ist.
24
Die Ad-(CAGA)9-MLP-Luc Reportergen- Aktivität unbestrahlter DF°IV wird durch eine
transiente Ad-Smad7 Transfektion hochsignifikant gesenkt [ohne Ad-Smad7
(1055±1010,4), n = 6 vs. mit Ad-Smad7 (4278±195,9), n = 6; P = 0,00000004] [Abb. 12
A]. Mit Ionisierender Strahlung von 3 GY ist der 12-Stunden Messwert signifikant
reduziert [3 GY (3777±283,7), n = 6 vs. 0 Gy (4405±132,3), n = 6; P = 0,001] [Abb. 12
B].
DF°IV CF 0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
TGFβ1 TGFβ1 + Ad-Smad7
A
1010,4
195,9
206,922,7
LCPS
DF°IV CF0
250
500
750
0 GY 1 GY 2 GY 3 GY
B
132,3262,0531,9
102,1137,4145,2
125,0
283,7
3000
4000
5000
LCPS
Abb. 12 Ad-(Caga)9 MLP-Luc + 5ng TGF1/ml [A] TGFβ1- stimulierte DF°IV zeigen mit Ad-Smad7 nach 24 Stunden hochsignifikant
verminderte Reportergen-Aktivität (P = 0,00000004). [B] Zusätzlich zur Blockade des TGFβ1-
Pathways durch Ad- Smad7 senkt ionisierende Strahlung die Reportergen- Aktivität nur bei dem
12- Stunden- 3 Gy- Wert signifikant (P = 0,001).
25
7 Diskussion
Der Morbus Dupuytren gilt als Modell idealer fibroproliferativer Erkrankungen und ist
unter pathohistologischen Aspekten durch Phasen der Fibroblastenproliferation, ihrer
Transdifferenzierung zu Myofibroblasten und schließlich der Residualphase geprägt.
Die genannten Vorgänge sind größtenteils TGFβ1 assoziiert. Obwohl Strahlenfibrose
als häufige negative Begleiterscheinung bei adjuvanter Radiotherapie bekannt ist, wird
seit 1950 auch zur Behandlung Dupuytren´scher Kontrakturen eine prophylaktische
Strahlentherapie eingesetzt17. Es stellt sich also die Frage, ob ionisierende Strahlen bei
Dupuytren-Fibroblasten antifibrotisch statt - wie sonst beobachtet - profibrotisch wirkt.
Die Frage einer Dosis- Wirkungsbeziehung ist dabei immer noch nicht restlos geklärt.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Auswirkungen ionisierender Strahlung
auf die TGFβ1 Signaltransduktion am Beispiel erst-, zweit-, dritt- und viertgradiger
Dupuytren´scher Fibroblasten, wobei Zellen aus partiellen und vollständigen
Aponeurektomien Verwendung fanden. Als Vergleich dienten Fibroblasten, die bei
operativen Dekompressionen des Ligamentum carpi transversum gewonnen und durch
Explant- Zellkultur isoliert wurden.
Die durchgeführten Versuche zeigten dass ionisierende Strahlung die TGFβ1-
spezifische Genantwort an erst- und zweitgradigen Dupuytren- Fibroblasten senkt.
Dies lässt sich mit den Ergebnissen anderer Studien vereinbaren, die auf
antifibroproliverative Eigenschaften einer Strahlentherapie im Initialstadium der
Dupuytren- Kontraktur hinweisen2, 16, 18. Dabei sind die in der Proliferationphase
befindlichen Fibroblasten und die Zytokin ausschüttenden Monozyten und
Makrophagen das Ziel. Die Kontrollzellen zeigten jedoch ebenfalls eine duch
Bestrahlung gesenkte TGFβ1- spezifische Antwort. Aus diesem Blickwinkel scheint es
wahrscheinlich, dass die Genantwort auf ein gegebenes TGFβ1- Signal bei bestrahlten
Kontrollfibroblasten und proliferierenden erst- und zweitgradigen Dupuytren-
Fibroblasten generell reduziert ist.
Wenn es keine gesteigerte Genantwort vorhandener Fibroblasten auf ein bestehendes
TGFβ1- Signal gibt, könnten beobachtete Strahlenfibrosen möglicherweise mit
erhöhten TGFβ1- Werten in bestrahltem Gewebe erklärt werden. Andere
Arbeitsgruppen konnten nach erfolgter Bestrahlung erhöhte TGFβ1- Werte in
Tierversuchen beobachten25,26. Nach strahleninduzierten Zelluntergang einwandernde
und Zytokine sezernierende Monozyten und Makrophagen sind dabei als ursächlicher
Mechanismus vorstellbar.
Die Ergebnisse an dritt- und viertgradigen Dupuytren´schen Fibroblasten wichen stark
von denen der Kontrollzellen ab. Bei viertgradigen Dupuytren- Fibroblasten konnte
26
nach Bestrahlung eine gesteigerte TGFβ1- spezifische Genantwort mit eindeutiger
Dosis- / Wirkungsbeziehung beobachtet werden.
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich daher auch mit dem Thema einer möglichen
Blockade des TGFβ1- spezifischen Signalweges. Dazu wurde ein rekombinantes
Adenovirus eingesetzt, um Smad7 ektop zu exprimieren; ein Ansatz, der auch schon
von anderen Arbeitsgruppen verfolgt wurde27.
Bei unseren Versuchen zeigte sich an unbestrahlten erst-, zweit-, dritt- und
viertgradigen Dupuytren´schen Fibroblasten sowie Kontrollfibroblasten eine in allen
Fällen hochsignifikante Blockade der TGFβ1- spezifischen Genantwort. Dies steht im
Einklang mit anderen Arbeiten, die so eine verminderte Schrumpfung von Gel-
Matrices oder im Tierversuch eine Leberfibrose nach Gallengangligatur inhibieren
konnten28, 14. Die Bestrahlung unterschied sich in ihrer Wirkung und Wirksamkeit bei
frühen und späten Stadien der Dupuytren´schen Fibroblasten. Die Unterbrechung der
Signaltransduktion zeigte bei allen Zellen einen einheitlichen und sehr viel stärkeren
Effekt.
Somit stellt sich die Frage nach dem Zusammenwirken von ionisierender Strahlung
und der Blockade des TGFβ1 Signalweges.
Die Versuche bei erst- und zweitgradigen Dupuytren- sowie bei Kontrollfibroblasten
zeigten dass beide Applikationen für sich alleine eine gesenkte TGFβ1- spezifische
Genantwort bewirken, aber keinen synergistischen Effekt, welcher effektiver war als die
Smad7 Blockade.
Ein anderer Aspekt ist die Blockade einer strahleninduzierten Hochregulation der
TGFβ1- spezifischen Genantwort, wie sie sich bei viertgradigen Dupuytren-
Fibroblasten zeigte. Hier konnte die TGFβ1- induzierte Expression Fibrose assoziierter
Gene mittels Ad- Smad7 sogar stärker als bei unbestrahlten Zellen geblockt werden,
wobei sich eine Dosis- Wirkungsbeziehung zeigte. Das deutet darauf hin, dass die
Blockade der TGFβ1- spezifischen Signaltransduktion eine strahleninduzierte Fibrose
besonders effektiv inhibieren könnte. Auch Arbeiten einer anderen Arbeitsgruppe, die
nach Gamma- Bestrahlung eine verstärkte Expression eines exogenen Smad7 Gens
beobachten konnten, deuten in diese Richtung27. Als Schlußfolgerung untermauern die
in vitro gewonnenen Erkenntnisse den Nutzen der prophylaktischen Strahlentherapie
im Frühstadium der Dupuytren´schen Kontraktur. Weitaus effektiver und in jedem
Stadium der Kontraktur erfolgversprechend ist jedoch die Blockade der TGFβ1-
Signalkaskade, die insbesondere bei strahleninduzierter Fibrogenese wirkungsvoll ist.
Für einen praxisnahen therapeutischen Einsatz am Patienten ist es jedoch
wünschenswert die Blockade selektiv im betroffenen Areal ohne Gentransfer zu
erreichen. Beschrieben wurde dies unter anderen Bedingungen bereits für N-Acetyl-L-
27
Cystein6. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkentnisse über die Wirkung ionisierender
Strahlen auf die TGFβ1- spezifische Signaltransduktion lassen dessen Einsatz auch bei
strahleninduzierter Fibrose aussichtsreich erscheinen und legen weitere
Untersuchungen in dieser Richtung nahe.
28
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9 Abkürzungsverzeichnis Co-Smad - Common Partner Smad
DMEM - Dulbecco´s MEM
DMSO - Dimethylsulfoxid
EDTA - Ethyldiamintetraessigsäure
FCS - fetal calf serum
MOI - multiplicity of infection
PBS - phosphate buffered saline
rpm - rounds per minute Smad - Small body size mother against decapentaplegic
TGF - Transforming growth factor
32
10 Danksagung
Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater, Herrn Priv. Doz. Dr. med. Jürgen
Kopp. Er ermöglichte diese Arbeit erst und opferte für ihre Betreuung so manche
Abendstunde.
Herrn Prof. Dr. med. Raymund Horch möchte ich für die Möglichkeit der
wissenschaftlichen Arbeit in den Räumlichkeiten der Klinik für Plastische- und
Handchirurgie danken.
Ebenso gilt mein Dank Herrn Prof. Dr. med. Grabenbauer für die Unterstützung meiner
Versuche durch die Strahlenklinik.
Meine Mitdoktoranden kann ich nicht ausreichend würdigen. Im Erfahrungsaustausch,
in gemeinsamer Labortätigkeit und in Konversation bei Koffeingenuß sind sie mir zu
Freunden geworden.
Meine Familie und meine Freunde waren eine belastbare Unterstützung und stete
Motivation bei Studium und Dissertation; ich danke ihnen dafür.
