Zeitschr. f. Hygiene, :Bd. ]31, S. 55,5--567 (1950).

Aus dem Institut PASTEUR, Bandung, und delt Universit/~tskliniken Djakarta.

Der Naehweis yon Antih~imagglutininen bei Variolapatienten als fliagnostisches Hilfsmittel.

Von W. A. COLLIF, I:, A. M. SmT und A. F. v. HF, F,m)F.

(Einffegangen am 24. Februar 1950.)

Zur Diagnose der Pocken kann man sich des Virusnachweises und serologischer Methoden bedienen. Die PnuLsche Augenimpfung am Kaninchen gibt h~ufig ausgezeichnete Resultate, die aber leider nieht in 100% zu erzielen sind. Dureh Virusfibertragung auf den Affen 1/~Bt sich gleiehfalls, allerdings erst nach einiger Zeit, eine sichere Diagnose stellen. Verschiedene Autoren haben auch durch Ei-Beimpfung sehr gute Resultate erzielt. Die/f l teren serologischen Methoden haben in der Hand versehiedener Untersueher brauehbare Ergebnissh geliefert, sind aber nicht in jedem Laborator ium anwendbar.

W~hrend der schweren Vuriola-Epidemie in Indonesien hat sieh uns die Untersuehung yon Antih/imagglutininen gegen die zuerst yon HmST angegebene Virus-H/~magglutination besonders gut bewEhrt. Die erste Anwendung dieser Methodik auf dem Poekengebiet f indet sieh bei NAGLV.~ (1942) und CLARK und NAGLER (1943}. Die theoretisehen Grundlagen der Methodik ~mrden im Ins t i tu t yon BVRNV.T weitgehend untersucht.

I m Bandunger Ins t i tu t wtu'de durch C O L m ~ {1949) naehgewiesen, dal] Pulpa vom Karbouw besonders gut geeignet ist, um Itfihner- erythrocyten zu agglutinieren. COLLIER und v. TmEL (1949), COLLIER, DE CLOE-E]ql~_~AR und Gv.ICE~-KoEDIJK (1949) und COLLIER und M~VER (im Druck) lmtersuchten darauf zahlreiche Sere von revaccinierten Personen und stellten mehr oder weniger hohe Titerwerte der Anti- h/~magglutinine lest. Sie wenden sieh gegen die noch vielfach vertretene Ansicht, daft man nur durch die bei der Revaccination gefundene lokale Reaktion den Grad der Immunit / i t feststellen kSnne. Da es sieh bei den Pocken um eine Allgemeininfektion handelt, muB die ImmunitEt vor allem humeral zum Ausdruek kommen.

Will man humorale Antistoffe nachweisen, so ist die Untersuchung der AntihEmagglutinine am einfachsten. Die Wahl gerade dieser Anti- stoffe war urspriinglich einigermaBen willkiirlich und bedingt dureh die zur Verf/igung stehenden Mittel des Inst i tuts . Wir sind uns wohl bewuBt, dab weder sie noch andere bekannte humorale Antistoffe fiir sich allein

Zeitschr. f. :Hygiene, Bd. 131. 37

556 COLLIER, SI~IIT U. V. HEEm)E:

den Immunit~ttsgrad des Individuums bestimmen. Ebenso wie die Revaecination nur eine - - obendrein sehr unvollkommene - - Vorstellung yon der Immuniti~t der Hau t geben kann, ebenso ist die Feststellung eines einzelnen der humoralen Antistoffe niehts welter als der Nachweis, daB die bei der Immunisierung in Wirksamkei t t retenden Zellgruppen des Organismus imstande sind, gegen bes t immte Antigene der Pocken- gruppe Antistoffe zu bilden und diese in die Blutbahn abzugeben.

Bes t immend fiir den Grad des Schutzes des Individuums g~geniiber der eindringenden Infektion ist zweifellos die cellul~re Immuni tg t . Innerhalb der Zellcn werden die vcrschicdenen Antistoffe gebildet und bedingen deren Resistenz gegen das Eindringen des Virus. :Bei fort- gesetzter Produkt ion dieser Antistoffe werden diese auch in die Blut- bahn abgegeben und zirkulieren dortl wobei auch (tie i~uBere Hiille anderer empfgnglicher Zellen beschfitzt wird.

Um ein Bild zu gebrauchen, das eine deutliche Vorstellung geben kann, darf man die immunen Zellen vielleicht a m besten mit einer Festung vergleiehen, die mit einem Netzwerk yon Forts u~ld Laufgr~iben umgeben ist. :Bei einer Belagerung halten die Forts den ersten Angriff des Feindes au~ mitunter sogar endgtiltig. Glfiekt cs abet dem Angreifer, durch ~ b e r m a c h t den ersten Verteidigungsgiirtel zu durchbrechen, so bietet die Festung selber noch Widerstand, und yon dort aus kann der Angriff oftmals noch erfolgreich abgesehlagen werden. Wendet man diese~ Bild auf die Pockenimmunit~it an, so muB man n a c h Dureh- dringung der porte d 'entrd durch das Virus im Blutplasma die erste Verteidigungsstelle sehen. Gelangen relat iv kleine Virusmengen in den KSrper, so werden diese dutch die humoralen Antistoffe aufgefangen und vernichtet , so daB sie nicht mehr imstande sind, an die empfgng- lichen Zellen zu gelangen. Hierftir spricht die Beobachtung, dab bei Personen mit hohem Antih~magglutinin-Gehalt bei erneuter Impfung keine Steigerung dcs Titers vorzukommen braucht. ])as eingebrachte Vaccinevirus wird in der Gef~Bbahn durch die Antistoffe gebunden und unwirksam gemacht, so dal] es keinen neuen Reiz auf die Immunstoffe bildenden Zellen ausiiben kann. ])er Titer bleibt also konstant. Reieht aber bei einer natfirlichen Infektion mit Variola die vorhandene Menge der kreisenden humoralen Antistoffe nicht aus, um das eingedrungene Virus unschiidlieh zu maehen, so halten die immunen Zellen selber noch stand und kSnnen oft noch die bis zu ihnen durchgedrungenen Virus- mengen unsch/idlich maehen. Nur in wenigen Fgllen bricht sehlieBlich aueh diese letzte Verteidigungsstellung zusammen, und es k o m m t zur Krankhcit :

Is t bei Personen, deren Impfung l~ngere Zeit zuriickliegt, die Mehr- zahl der humoralen Antistoffe verschwunden, so ist damit noch nicht gesagt, dab sie nun schutzlos der Infekt ion gegeniiberstehen. Dergleiehcn

Der Nachweis von Antih/imagglutininen. 557

Individuen k6nnen noeh eine sehr ausgesprochene cellu]~re Immunit/~t besitzen. Da ihnen aber die humoralen Antistoffe fehlen, ist die gartze Macht des ersten Angriffes direkt auf die Zeilen gerichtet, und diese kSnnen der Infekt ion daher leichter erliegen, als wenn die eingedrungenen Virusmengen vorher erst durch die humoralen Abwehrstoffe geschw/icht sind.

Es ist also durchaus vorstellbar, da~ bes t immte humorale An~istoffe den Immunit/~tsgrad mi tbes t immen und als Indikatoren der Immuni t~ t angesprochen werden dfirfen. Experimentel le Versuche am Menschen sind hierfiir nicht zu erbringen. Wohl aber liegen Versuche yon FEN~v.~ und F~ .~ER (1949) vor, die in M~used6rfern die Infekt ion mit M/iusc- pocken (Ectromelia) bei gut immunisierten, sehlecht immunisierten und normalen Mgusen untersuchten. Naeh Immunis ierung mit Vaccinevirus wurde zun~tchst bei allen Tieren der Titer der Antihii, magglutinine fest- gestellt und hierauf die Tiere der Infekt ion ausgesetzt. K a m es nicht zur Ausbildung yon Antihiimagglutinincn oder gingen diese im Laufe der Zeit im Blute zuriick, so verhielten sich die Tiere wie normale Kontrol l- m~use und waren empfanglich fiir die Virusinfektion. F E ~ R und FEN~'ER sprechen sieh dahin aus, da~ die Antih/imagg]utinine, wenn sie nicht etwa sogar den wichtigsten Antistoff selbst fiir (lie Beschiitzung der M/iuse gegen die M~usepocken darstellen, doch auf jeden Fall einen ausgezeiehneten Index fiir Anwesenheit oder Abwesenheit der anti- infektiSsen Antistoffe darstellen.

Vom Beginn der Poekenepidemie auf J a v a an wurde die Unter- suchung der Antihiimagglutinine zu diagnostischen Zwecken vor- genommen. Es zeigte sich sehr bald, da[~ zwiscimn den Titern der Anti- h~magglutinme, die sich im Anschlu~ an die Vaccination bzw. im Ver- laufe der Variola-Infektion entwiekelten, quanti tat ive Unterschiede vorhanden waren. ])iese waren teilweise so groi3, daft bereits nach wenigen Stunden eine Diagnose gesichert war, teilweise ergab eine Wiederholung der Reakt ion ein sicheres Rcsultat .

Methodik.

Eryth~vcyten: Das Blur s t ammte meistens yon Hiihnern der java- nischen Landrasse, die im Ins t i tu t gehalten wurden. Da sparer infolge einer Pseudovogelpest-Epizootie die gekauften I-Iiihner hSchstens wenige Tage am Leben bl ieben wurde dazu iibergegangen, auf dem Markt das Blur v0n frisch gesehlaehteten Tieren zu sammeln. Dabei zeigte sich, dab die Kampfhahn-Rasse wesentlich besser brauchbare Erythrocyten |ieferte. Das Blur /~lterer Tiere war meistens brauchbar, bei jiingeren Tieren nur etwa in 50 %.

])as Biut jedes Tieres wurde gesondert in ungei'dhr 20 m] Natr ium- citrat-L6sung aufgefangen und mit physiologiseher KoehsalzlSsung

37*

558 COLLIER, SMIT U. V. HEERDE:

3real ausgewaschen. Blutmischungen von verschiedenen Tieren wurden niemals benutzt. Konzentrierte Erythrocyten lassen sich einige Tage bewahren, miissen aber vor Gebrauch wieder ausgewaschen werden.

]_)as Blut wurde s tets so verdfinnt, dab eine endgfiltige Erythrocyten- Konzentrat ion yon 0,5% erreicht wurde. Fiir Virus=tt~magglutinations- versuche erscheint diese vielleicht etwas reichlich stark, doch erwies sic sich beim Ablesen als besonders vorteilhaft. Schwgchere Konzentra- tionen ergeben indessen auch brauchbare Resultate, was aus folgendem Versuch hervorgeht :

6 Serien yon W A s s E R ~ C - ~ 6 h r c h e n wurden mit je 0,2 ml fallender Verdiinnungen eines bekannten Variola-Serums beschickt, das letzte 1R6hrchen mi t 0,2 ml Kochsalzl6sung. Hierzu kam je 0,2 ml der 2fach agglutinierenden Vaccinekonzentration, in die letzten R6hrchen je 0,2 ml physiologische Kochsalzl6sung. Nach 1 Std bei 37 ~ kam in dic RShrchen der ersten Serie je 0,2 ml Htihnerblutsuspension yon 1,5%, in die RShrchen der zweiten Serie yon 1,0~ in die folgenften von 0,8%, 0,6%, 0,4~/o bzw. 0,2o/0. Abgelesen wurde nach etwa 3 Std.

Tabellc 1. Einflufl der Blutkonzentration au/ die Serum-Hemmuugs-Reaktion.

Benutztc Blut-Kon- zentration:

1,5% 1,0% 0,8% 0,6% 0,4% 0,2%

Endkonzentration yon Variolaserum Nr. 1317

1/1600

0 0 0. 0 0

(+)

1/3~oo 0 0 0 0 0

(+)

1/64oo (+) (+) (+) + +

(+)

1/12800

+ (+) + + +

(+)

NaC1- KontroUe

0 0 0 0 0

(+)

( Variolascrum 0,2 ml + 2lath agglutinicrende Virusverdiinnung 0,2 ml + ange- gebene Blutsuspension 0,2 ml.)

I n Tab. i sind die Ergebnisse zusammengestell t . Es zeigt sich hierbei, (tab yon den Konzentrat ionen yon 1,5 %--0 ,4 % alle Resultate fiberein- s t immen: in jedem :Fall hat die S~rumverdfinnung -con 1/3200 die Hiimagglutination gehemmt, die Scrumverdiinnung yon 1/6400 aber nicht mehr. Die Kochsalzkontrollen zeigen keine spontane H/~magglu- tination. Anders verh/ilt es sich bei der Blutkonzentrat ion yon 0,2%, denn bier sind so wenig Ery throcyten in der Mischung vorhanden, daI3 es nicht mehr zu einer guten Niederschlagsbildung kommt . :Die wenigen Ery throcyten liegen so wenig dicht, dab man aueh in dem Kontroll- rShrchen den Eindruck einer schwachen H/imagglutination bekommt.

Man sieht also, dab mit Blutkonzcntrat ionen yon 1,5%---0,4~ ver- gleichbare Resultate zu bekommen sind. Der subjektive Eindruck aber ist doch, dal~ die Konzentrat ion yon 1,5% die wenigste ~'V[iihe beim

Der Nachweis yon Antihi~magglutininen. 559

Ablesen macht. Wohlbemerkt handelt es sieh hierbei nur um H/~m- agglutination durch Vaceinevirus, denn bei anderen Virush/imagglu- tinationen ist eine geringere Blutkonzentration deutlich vorteilhafter.

Yaccineuirus: Das Vaccinevirus ~ r d e im MSrser mit physiologischer KochsalzlSsung zu einer mSglichst feinen Suspension verrieben un(l 10--20 Min bei 2000 Umdrehungen zentrifugiert. Man erh~lt eine opali- sierende Fliissigkeit, frei yon mikroskopisch siehtbaren Partikeln. Diese 10%ige Suspension kann bei Aufbewahren bei 4 ~ ungef/~hr 1 Woche lang gebraucht werden. ])as Aufbewahren erfolgt am besten in gut ver- schlossener Flasche mit mSglichst kleinem Luftraum darfiber.

Bei den hier mitgeteilten Versuchen wurde stets Rohpulpa yore Karbouw (Wasserbiiffel) gebraueht, die 3 Tage nach der Impfung geerntet worden war. Die Rohpulpa wird in gut schlieBenden Petri- sehalen bei - - 15 ~ aufbewahrt, h[eist wurde yon 6--8 Tieren in einem Vorversueh die Brauchbarkeit der verschiedenen Pulpen gepriift, und die beste wurde fiir die Versuche reserviert. Auf diese Weise kann man monatelang mit der gleichen Rohpulpa arbeiten.

Im Vacuum getrocknete Karbouwen-Pulpa eignet sieh gleiehfalls zur Hiimagglutination, doch liegt bei manehen Nummern der Titer relativ niedrig. Aueh bei - - 1 5 ~ aufbewahrte Glyeerin-Lymphe vom Karbouw kann mit Erfolg gebraucht werden, doeh finder man hier hiiufiger unbrauehbare Nummern. Um einen Vergleich zwischen den versehic- denen Vaccinepr/iparaten zu geben, ist der Endt i ter yon je 8 hIummern

�9 Rohpulpa, Glycerin-Vaccine und Trockenimpfstoff gegeniiber 5 ver- sehiedenen Erythrocyten-Proben in Tab. 2 zusammengestellt.

Auch Rohpulpa yon ve~'schiedenen anderen Tierarten und Testes- Virus vom Kaninchen eign~n sich zur Hiimagglutination. Die tIaltbar- keit ihres H~magglutinations-VermSgens ist aber viel weniger gut als die der Karbouwen-Pulpa. Diese groBe Labilit~t hiingt anscheinend mit der Entwicklung unspezifiseher Hemmungsstoffe zusammen.

Ferdi~nnungs]liis~igkeit: Nur zur Herstellnng der 10%igen Virus- Suspension wird physiologische Kochsalzl6sung gebraucht. Alle anderen Verdiinnungen werden mit einer Verdfinnungsflfissigkeit hergestellt. Diese besteht aus 1% igem Pferdeserum in physiologischer Kochsalz- 15sung, dem 0,25% Formol beigeffigt wird. ])as Formalin hat keinerlei EinfluB auf die Reaktion, ermSglicht aber, noeh nach 24 Std die Re- aktion zu kontrollieren, da sie die Bakterienentwicklung hemmt. An Stelle yon Pferdeserum kann auch Meerschweinchen- oder Kaninehen- Serum verwendet werden. Es ist aber darauf zu achten, dab dem Serum keinerlei Desinfectantia beigemengt sind, da sieh herausgestellt hat, dab beispielsweise Superol die Verbindung des Vaccinevirns mit den Erythroeyten hemmen kann. Die Verdfinnungsfliissigkeit ~)qrd am besten t//glieh friseh hergestell?~ oder bei ~ 15 ~ aufbewahrt.

560 COLLIER, SMIT U. V. HEERDE:

Tabelle 2. Endtiter der H~imagglatinatiou von HiZhnerblut (5 Tiere) dumh ]e 8 P,roben Rohpulpa, Glycerin-Vaccine und Trockenimp~sto// yore Bill[el.

Virus:

Rohpulpa ( - - 15 ~

Glycerin-Virus ( ~ ] 5 ~

Trockenimpfstoff (+ 22 ~

(Vir usverdiinnun

Nr. Alter in I Tagen: 49

ttiihnerblut Nr.:

71 6O 56 41 41 34 20 19

123 115 108 108

97 97 87 66

190 169 163 141 113 103 92 92

50

0 1600 3200 1600 6400

0 1600 1600

0 40o 400 400 100

0 0 0

8OO 2OO 80O

25 20O 8OO 100 100

547 550

: 0,3 ml + 1,5% Blutsuspension

0 3200 3200 1600 3200

0 1600 1600

0 1600 800

6400 200 100

0 0

1600 200

1600 100 2OO 8OO 2OO 2O0

51

0 3200 3200 1600 3200

0 1600 1600

0 8o0 800

6400 400 4O0

0 0

800 40O

3200 100 20O

1600 40O 100

52

50 3200 3200 1600 6400

0 3200 6400

0 8o0 4OO 8OO 400 20O

0 0

1600 8OO

1600 100

2 0 0 1600 4OO 2OO

0,3 ml.)

54

50 3200 3200 1600 3200

0 800

1600

0 400 800 800 200 200

0 0

8O0 200 80O

50 2O0 40O 100 2OO

Patientensera: Die Pa t i en tense ra werden im inak t i v i e r t en Zus tand

gebraucht . Bei - - I5 ~ ble iben sic p rak t i sch unbegrenz t ha l tbar . Einzelne

Ser~ wurden im Abs tand yon mehreren Monaten wiederhol t un te r such t und zeigten s te ts den gleichen T i t e r ; a l lerdings wurden sie s te ts vor der

Un te r suchung nochmals auf 56 ~ erwi~rmt.

Einl lu fi des Volumens: Man erh~lt die gleiehen Ergebnisse , wenn die Gcsamtf l i i ss igkei t smenge in den R6hrchen 0,5, 0,6, oder 1,0 ml be-

tr~gt . GrSI~eres F l i i s s igke i t svo lumen g ib t analoge Resu l ta te , nur m u $ dann en t sprechend weniger Blur beigefi igt werden. Alle hier gesehi lderten

Versuche x ~ r d e n mi t einer Gesamtf l i i s s igke i t smenge yon 0,6 ml durch- geftihrt .

JEin/lufl der Temperalur: Bet der Durchf i ih rung der R e a k t i o n i s t e s

gleiehgfil t ig, ob bet Zimmer tempera tur (22 ~ oder bet 37 ~ gea rbe i t e t

wird. Man b e k o m m t v o l l k o m m e n ident ische Resu l ta te . Bet 4 ~ verlKuft

die l~eakt ion wesent l ieh weniger gut. Bet den bier mi tge te i l t en Ver:

Der Nachweis von Antihi~magglutininen. 561

suchen erfolgte die Bindung bei 37~ wonach die RShrchen bei Zimmer- tempera tur stehen blieben.

Ein/lufl der Bindungszeit: Wenn auch die Bindung zwischen Serum und Virus praktiseh innerhalb weniger Minuten abgeschlossen ist, so wurde doch stets das Serum-Virus-Gemiseh 1 Std ]ang stehen gelassen, bevor das Blut beigefiigt wurde.

Ablesen der Reaktion: Es hat sich ais vorteilhaft erwiesen, beim Ab- lesen der Reakt ion nicht allzuviel Grade einzuftihren. Am zweckmiiBig- sten ist es, nur mit dem bloBen Auge oder einer schwaehen Lupe abzu- lesen und einen Blutniederschlag mit scharfem Rand als , ,negativ" zu bezeichnen. Is t der Rand abet dureh agglutinierte BlutkSrperchen auch n u r i m geringen Grade unscharf, so bezeichnet man dies als ,,positiv", ohne verschiedene Grade yon Positivit/~t einzufiihren. Hierdurch wird der subjektive Faktor zum grol3en Teil ausgeschaltet.

Vorversuch: Zum Vorversuch werden je 0,3 ml mit Verdiinnungs- fliissigkeit verdiinnte Virus-Suspension mit 0,3 ml 1,0~/o Hfihnerblut- Suspension gemischt und bei Zimmer tempera tur stehen gelassen. Naeh I Std wird abgelesen und die hSchste Verdiinnung best immt, bei der noch H/imagglutination zu sehen ist. Die doppelte, grade noch agglu- tinierende ])osis wird als Arbeitsdosis gew~thlt.

Hauptversuch: In eine Serie yon 10 WAssER)~T~-RShrchen bringt man je 0,2 ml fallende Verdfinnungen des zu untersuchenden Serums. Bei Seren yon Variolapatienten beginnt m a n zweckm~fligerweise mit der Verdtinnung yon 1/33,3, um nach dem Zugeben yon Virus und Blut eine Endkonzentrat ion yon 1/100 zu erhalten. ~qur selten wird man bei Se ren mit sehwachem Geha]t an Antihiimagglutininen mi t der Ver- diinnung yon 1/3,3 beginnen miissen, um als erste Endkonzentrat ion 1/10 zu bekommen. In die RShrehen kommt sodann 0,2 ml der im Vorversuch gefundenen doppelten Viruskonzentration. Ergibt der Vorversuch also als einfache agglutinierende Virusdosis die Verdfinnung yon 1/1600, so betrKgt die doppelte agglutinierende I)osis 1/800. Um dicse End- konzentration zu erreichen, muB also zu den Serumverdiinnungen je 0,2 ml der Arbeitsdosis 1/266 beigefiigt werden.

Nach kr~ftigem Durchschiitteln bringt man die ]~Shrchcn in den Thernlostaten yon 37 ~ und gibt nach 1 Std in jedes RShrchen 0,2 ml 1,5~/oiges Hiihnerblut bei. Nach gutem Durchsehiitteln 1Rf~t man bei Zimmer tempera tur stehen und kann nach 1 Std, besser noch naeh 2- -3 Std ablesen. Als Titer wird die Serumverdfinnung bezeichnet, welehe die H/s vol lkommen hemmt, wo also der Blut- niederschlag einen absolut glat ten Rand aufweist.

Als Kontrollen setzt man die 0,2 ml der berechneten doppelten, einfachen, halben und viertel agglutinierenden Dosis Virus mit je 0,2 ml

562 COLLIE]~, SMIT u. v. H~RI)E:

Verd i innungsf l f i ss igke i t und 0,2 ml 1 ,5%iger B lu t suspens ion an, ebenso ein R6hrchen m i t 0,4 ml Verdf innungsf l f i ss igkei t und 0,2 ml Blur . Bei s t a rken S e r u m k o n z e n t r a t i o n e n s ind wei te rh in noch Se rumkon t ro l l cn ohne Vi ruszusa tz nSt ig , u m t t g m a g g l u t i n a t i o n durch das Serum se lbs t zu e rkennen . I ) e r a r t i ge S e r u m - H ~ m a g g l u t i n i n e lassen sich gegebenen- fal ls durch A d s o r p t i o n an H t i h n e r b l u t en t fe rnen . Bei Anfangsver - d i innungen des Serums yon 1/33,3 s ind diese Se rumkon t ro l l e n i iber- fl i issig.

Ergebnisse der Versuche.

Zun~chs t sei an e in igen ve rk i i r z t en Kranke nge sc h i c h t e n die En t - wiek lung der An t ih~magg lu t i n ine gezeigt .

1. Siti, g~, 22 Jahre. KAinisch leicht verlaufender Fall mit diskreten Pocken- N~rben yon Pockeifimpfung in der Kindheit. l~ohes pr~eruptives ~ieber von 40 ~ Beginn der Eruption am 6. Krankheitstag. 9.--12. Krankheitstag niedriges sekun- di~res Fieber yon 38 ~ Typiseho Lokalisierung des Exanthems in Gesieht und Extremit~ten, I~andfl~ehe und Ful]sohle. Exanthem zeigt normale Entwieklung, im Gesieht 7. Tag vesicul6s, 12. Tag pustulSs, 19. Tag krustSs.

Der Titer steigt sehr l~ngsam an. Krankheitstag: 7 12 14 22 24 Titer: 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600.

H~ufig wird indessen eine sohnellere Titersteigerung wahrgenommen, woven folgender Fall ein Beispiel bietet:

2. Oedin, ~, 16 Jahre. Klinisoh ein leioht verlaufender Fall mit diskreten Poeken. Impfnarben aus den Kinderjahren. Begiml des Exanthems am 3. Kr~nk- heitstag. Sekund~res Fieber 7.--9. Krankheitstag, niedrig, bis 37,8 ~ Typisehes Poekenexanthem mit einer Papel in der Conjunctiva des re. unteren Augenlides lind Flecke auf Tonsillen und hinterster Pharynxwand. Titerverlauf:

Krankheitstag: 5 10 15 19 26 29 Titer: 1/100 1/12800 1/12800 1/25600 1/3200 1/3200

3. Amat, 0 ~, 25 Jahre. Ernste konfluierende Poeken. Beginn des Exanthems 3. Krankheitst~g. Sekund~res Fieber 7.--16. Krankheitstag, s~eigend bis 39,8 ~ Korffluierende Eruption, allgemeine Lymphdrfisenschwellung, Randulcera an Cornea des li. Auges. Fleeke auf Zunge, Plmrynxbogen und Pharynxwand. tteisere Stimme. Titerverlauf:

Krankheitstag: 8 13 18 22 28 31 Titer: 1/200 1/1600 1/12800 1/6400 1/12800 1/6400

4. I-Iadijat, ~, 19 Jahre. Arbeitete als I-Ielfer in den Poekenbaracken und konnte veto 2. Krankheitstag an verfolgt werden. Als Kind va~ciniert, vor einem halben Jahr revaceirgert, aber Reaktion nicht mehr bekannt. I-Iohes prim~res Fieber bis 40 ~ und mit kleinfleekigem rosa Rash an Sehenkelbeuge und auf Unter- baueh. Vom 3. Krankheitstag an Entwicklung einer m0,flig ausgebreiteten Poeken- eruption, die aber schnel! eintrocknete. Sekund/ires Fieber fehlte bis auf eine Zacke yon 37,8 ~ am 6. Krankheitstag. Titerverlauf:

Krankheitstag: 2 7 11 16 28 Titer: 1/100 1/3200 1/3200 1/3200 1/3200

Gelegentlich' kommt es zur sehr frfihzeitigen Ausbildung eines hohen Titers, der aber bald wieder leicht abf~llt.

Der Nachweis von Antihi~magglutininen. 563

5. Ena, ~', 20 Jahre. Narben yon Impfimg in der Jugend. Blaseninhalt durch Koll. WEST~a.~A.W.W (Eykman Institut) auf Haut eines Affen (Siacaca irus mordax) verimpft, gibt eine fiir Variolavirus eharakteristische Reaktion. Titerverlauf:

Krankheitstag : 7 13 18 Titer: 1/25600 1/12800 1/6400

Nicht immer werden so hohe Titer gefunden, wovon hicr ein Beispiel wieder- gegeben sei :

6. Ernmi, 9, 20 Jatrre. ]?rfiher vacciniert. Wird klinisch als ein ]~'all yon sehr leiehter und diskreter Variola angesehen. Titerverlauf:

:Krankheitstag : 6 11 25 Titer: 1/100 1/100 1/200.

Bei einem derartig lriedrigen Titerverl~uf bei eincm ktiniseh so durchaus gut- artigem Krankheitsbild mull man sich indessen fragen, ob die damalige klinisehe Diagnose wohl riehtig war, Und ob lfieht Varieellen vorgelegea haben.

.Nun, nehr folgen noeh einige F/~lle yon i~atienten, die infolge sehr schwerer Variola gestorben sind.

7. Saioni, o ~, 15 Jahre. Konfluierende 1)oekeneruption mit rosa Erythem rund um die Effloreseenzen. Stirbt am 10. Krankheitstag mit einer Temperatur you 41 ~ Am 6. Krankheitstag der sehr hohe Titer yon 1/12800.

8. Mardjuki, ~, 18 Jahre. Narbea volt frfiherer Impfung. Typische konfht- ierende pustulSse 1)oeken. Stirbt am 16. Krankheitstag, als die Eruption einzu- troeknen beginat. Titer am 14. Krankheitstag sehr hoch: 1/25600.

9. Parwoto, d, 18 Jahre. Friiher nicht vaeciniert. Stirbt aln 12. Krankheits- rage. Blutfarbige, teilweise konfluierende Efflorescenzem Blutung in Conjunctiva, sonst aber keine I-Iaut- oder Sohleimhautblutungem Titer am 8. und 10. Krank- heitstag je 1/800.

10. Liem, J , 22 Jahre. Narben yon friiherer Impfung. Stirbt am 12. Krank- heitstag. Ausgebreitete, abet nicht konfluierende Eruption. Viele Efflorescenzen mit totem hi~morrhagischem Hof. Von Anfang an maehte Patient einen sehwer- kranken Eindruck, war verwirrt und starb im Korea. Titer am 7. Tag 1/100, am 12. Tag 1/200. Auf diesen und einige andere analoge Falle wird weiter unten noch einmal kurz eingegangen.

Sehlieglich folgen noeh drei ]3eispiele von I~atienten, die anf/inglieh mih 1)oeken - verdacht aufgenomnlen wordert waren, bei denen sich indessen sparer kliniseh eine andere Krankheit herausstellte:

1. Gani, d r 25 g~hre. GenerMisierte Framb6sie-Eruption. hnpfimrben aus der Kinderzeit, aullerdem kurz vorher mit positiver Reaktion revacciniert. Titer am 23. Tage des tL~utaussehlags (= 26 Tage nzeh Revaeeination) 1/100.

2. Jo, ~, 15 Jab_re. VariceIlen und Fieber bis 39% Impfiiarben yon frfiher. Kurz vorher revaeciniert, jedenfalls mit immediate reaction. Titer am 18. Krank- heitstag 1/25.

3. Subarna, d', 21 Jahre. Dermatitis generalisata. Impfnarben aus der Kinder- zeit. Rcvaceiniert, abet die Reaktion wegen tier Dermatitis pieht feststellbar. Titer am 15. Tage nach der Revaceination 1/1600.

Z u m Sohlusse sei noch mitgete i l t , dab bei 8 gesunden, revaccinier ten Personen (1 Arzt u n d 7 Pf leger innen) , die einige Wochen au f den Pocken- baraoken arbe i te ten , der Ti ter zwischen 1/100 u n d 1/400 variierte.

5 6 4 COLLIER, SMIT U. V, HEERDE:

Dic 800 Se ro reak t i onen s ind in der Tabelle 3 zusammenges t e l l t .

Tabelle 3. Antihdmaqglutinine bei 800 Variolapatienten.

Krank- heitstag:

2 , - -5 . 6. 7. 8.

9.--10. 11.--12. 13.--15. 16.--18. 19.--24. 25.--29. 30.--70.

Summe

unter .

1/1001 5"1

Titer der Antih~tmagglutinine:

=1

!3

10 5 3 1 1 1

21

10 6

13 14: 16 13

11 4 [ 8 10 10 1 i 13 10 2

7 19 9 18 11 t 3 21 1 8 1 1 6 17 1 1 1 1 0 20 22 9 14 16 14 15 13 9

5 6 3 7 2 1 2 21

2 2 1 1 1 2 3 4

9 17

8 9 6 9 4 14 6 9 5 9 9 11 7 12 7 14 8 21

4 1 7 3 3 6 9 2 9 2 4

35 54 87 134 165 149 i 82 50 I10

s~. ~ z "~

90 1055 81 1056 65 2111 58 1836 71 3676 59 3200 81 4850 63 3200 82 !4525 71 3676 791 ,2986

800 ! 2599

Der 2. bis 5. K r a n k h e i t s t a g s ind zusammengezogen, der 6. bis 8. K r a n k - he i t s t ag i s t jeweils besonders wiedergegeben, und die spa t e ren K r a n k - he i t s t age s ind wieder zu i m m e r grSBeren Gruppen z u s a m m e n g e n o m m e n , u m n ich t zu k le ine Zahlen zu e rha l ten . I n tier 1. R u b r i k l i n d e n sich die Sera mi t e inem T i t e r yon weniger als 1/100, in der 2. die Sera mi t e inem T i t e r yon 1/100 usw. Zum SchluB s ind noch die geomet r i schen Mi t te l - wer te der T i t e r berechnet .

Aus der Tabe l l e i s t deu t l i ch zu ersehen, dal~ zu Beginn der K r a n k - he i t d ie T i t e r noch r e l a t i v n iedr ig sein kSnnen, wenn sich auch in einigen F/~llen schon T i t e r yon 1/12 800 u n d 1/25 600 l inden . Mi t wei te r schre i ten- dem Krankhe i t sp rozeB s t e ig t auch die Ti terhShe, u n d es zeigt sich ein M a x i m u m in .der 3. bis 4. Woche. Dann beg inn t wieder eine l angsame T i t e r senkung , wenn sich auch sogar zwischen dem 30. und 70. Tage noch 2mal e in T i t e r yon 1/51200 f inder .

W i c h t i g ffir die Di f fe ren t i a ld iagnose gegeni iber Var ice l len i s t zu wissen, wie sich be im Menschen nach Vacc ina t ion die An t ih~magg lu - t in ine en twicke ln . Zu Ze i t en e iner Var io laep idemie mul~ m a n d a m i t rechnen, dal~ p r a k t i s c h jeder e inzelne ein oder mehrere Male vacc in ie r t ist . Man mul~ also da r i ibe r u n t e r r i c h t e t sein, in welcher I-I6he sich die nach l~evacc ina t ion en twicke lnden T i t e r bewegen. K l in i sch s ind zur Zei t e iner Pockenep idemie die E r u p t i o n e n bei l e ich te r Var iola und schweren Var ice l len k a u m ause inande r zu ha l ten . Hie r f i i r spr ich t schon d ie b e k a n n t e Ta t sache , dab m a n wtthrend e iner Pockenep idemie auch s t e t s eine s t a r k e S te igerung yon Var ice l len zu sehen g laub t , was in W a h r - heir te i lweise wohl a u f bessere A c h t s a m k e i t , te i lweise abe r wohl auch

Der Nachweis yon Antih~magglutininen. 565

au f Feh ld iagnosen zur i ickzuff ihren sein d i i r f te . Auch die Var icel len- p a t i e n t e n s ind ge impf t und weisen dahe r mehr oder weniger Ant i - h/~magglutinine auf. Es is t nun wicht ig , d ie An t ih i imaggh l t i n ine aus- e inande r zu ha l t en , die du t ch eine Vacc ina t ion und die durch eine V a r i o l a e r k r a n k u n g e n t s t a n d e n sind.

I n der nachfo lgenden Tabelle 4 s ind vergle ichsweise die Ti tc r wieder- gegeben, die sich be i 3000 crwachsenen Personen fanden, yon denen der l e t z te R e v a c c i n a t i o n s t e r m i n genau b e k a n n t war. Die U n t e r v e r t e i l u n g erfolgte de ra r t , dal] in tier e r s t en Reihe al le die Personen zusammen- gefal] t wurden, die vor weniger als 1 Mona t r evacc in i e r t waren. Die Aufgabe ffir den 1. bis 6. Mona t e r fo lg t g e t r e n n t , d a n n is t de r 7. bis 12. Mona t zusammengefaBt , d a n n das 2. J a h r besonders u n d schlieB- rich wieder das 3. und mehr J a h r c zusammen . Auch b ier i s t zum Schlul] wieder der geomet r i sche M i t t e l w e r t de r h e m m e n d e n T i t e r ausgerechnet . ] )as M a x i m u m an A n t i h g m a g g l u t i n i n e n f inde r sich bei r evacc in ie r ten Pe r sonen vor und w/~hrend des 1. Monats .

Tabelle 4., AntiMimagglutinine bei 3000 revaccinierten Personen.

I n t e r v a l l :

1 Monat 1 2 Monate 3 , ,

4 , ,

5 , ,

6 , ,

7--12 2 Jahre 3 .

u. mehr

~ l l l l ] l I l e . .

T i t c r de r A n t i h i i m a g g l u t i n i n e :

u n t e r ,~

10 12 1 12 1 5 1 8 5 2 3

14 7 32 64 1

13 165

9 78i 32 104 :5 :81142, ~6 63 123]166 122 9 48 1021 103 48 :7 64 ~ 64 45

27 64 57 20

.3 43 22 29 7 27

~0 38 35 16 6 15 2 2 1 1 8 3 2 71 2

I

132 3191608 1748 [492

76 61 18 69 51 23 66 52 12 25 20 4

8 8 1 7 4 1 3 1 9 1 1 2 1 2

265 199 62

NIL : ~ ~ 4,..;

~~

4 523 149 2 547 113

633i 99 365 7O 260 57 202 53

1 106 43 184 40 101 43 79 28

7 3000 86

Nur kurz sei d a r a u f h ingewiesen, d a b es ansche inend e inen k le inen P rozen t sa t z yon Personen g ib t , d ie n i c h t i m s t a n d e sind, nach e inmal ige r ~ e v a c e i n a t i o n Ant ihEmagglu t in ine zu bi lden. W i c h t i g i s t fe rner (lie Be- obach tung , dab be re i t s nach 2 J a h r e n e twa 32% 4er u n t e r s u c h t e n Per sonen ke inen Ti te r yon ] /10 e r re ich ten , un(t d a b dies 3 und mehr J a h r e nach der l e t z t en R e v a c c i n a t i o n bei 64 yon 79 Personen n ich t m e h r de r Fa l l war.

U b e r b l i c k t man die Tab. 3 u n d 4 als Ganzes, so fEllt der s t a r k e Un te r sch i cd in dcr T i te rh6he zwischen vace in ie r t en Personen und

566 COLUER, SMIT 11. V. HEERDE."

Variolapatienten deutlich ins Auge. Auch wenn es sich in einem Falle um gesunde Personen und im anderen u m erkrankte handelt , darf man doch mit einiger Reserve beide Tabellen miteinander vergleichen.

In der Praxis is$ die Beurteilung des gefundenen Titers relat iv einfaeh : Keine Schwierigkeiten ergeben sich, wenn die erkrankte Person

nachgewiesenermaBen niemals geimpft ist. In diesem :Fall spricht selbst ein so niedriger Titer wie 1/100 fiir Variola.

Liegt die letzte Impfung 3 und mehr Jahre zuriiek, so spricht ein Titer yon 1/800 und mehr wohl aueh in jedem Fall fiir Variola, da der- artig hohe Titer im Anschlufi nach Vaccination nach so ]anger Zeit bisher nicht beobachtet wurden.

Liegt tier Serumti ter des Pat ienten bei 1/3200 und hSher, ~'o darf man gleichfalls mit Sicherheit auf Variola schliel~en, da so hohe Titer naeh Vaccination noeh nieht beobaehte t wurden.

Liegt der Serumtiter bei vorher vaccinierten Personen unter 1/3200, so ist gelegentlieh mit der MSglichkeit zu rechnen, da~ die Antistoffe auch auf eine vorherige Vaccination zuriickzufiihren sind. In diesem Fall wird das Serum nach 2 - -3 Tagen erneut untersucht. I s t der Titer dann konstant geblieben, so ist die Wahrscheinlichkeit groB, dab keine Variolainfektion vorliegt, sondern dab die Antih~magglutinine auf die vorherige Vaccination zuriiekzuffihren sind. Steigt der Titer abet in dieser Zeit um mindestens das Vierfache, so i s t mi t dem Vorliegen yon Variola zu rechnen. Es wird also das gleiche Prinzip angewandt, das man auch bei zweifelhafter serologiseher Untersuchung bei anderen akuten Infekt ionskrankhei ten anwendet.

I n einigen F~llen - - ~qe oben bei Fall 10 - - konnte noeh eine Be- obaehtung gemaeht werden, die sicher yon Interesse ist. Bei diesen Personen, die in schwerkrankem Zustande aufgenommen wurden, fand sich ein sehr niedriger Titer, der aber auch bei Wiederholung der Reak- t ion nicht stieg. Diese Patienten starben sehr schnell. MSglicherweise war der Tod auf ein ullgemeines UnvermSgen dieser Personen zuriiek- zufiihren, geniigend Antistoffe gegen Poekenvirus zu bilden, wenn auch die MSgliehkeit nicht vSllig ausgesehlossen ist, dab nur infolge des sehweren Krankheitszustandes die antistoffbildenden Zellsysteme ge- ]~hmt waren.

Abgesehen yon diesen wenigen Ausnahmen hat sich auf J a v a die Untersuehung der Antihi~magglutinine als ein brauchbares Hilfsmittel fiir die Varioladiagnose erwiesen.

Erw~hnt sei noch, dal] man den Eindruck bekommt, dat~ sieh manchmal bei leiehten F~llen ein sehr hoher Titer findet, w~hrend bei schweren F~llen ein relat iv niedriger Titer nachweisbar ist. Allerdings ist die Grenze zwischen leichten und sehweren F~llen schwierig zu defi- nieren.

Der Nachweis yon Antih/mmgglu6ininen. 567

Zusammen/assung. Ausfiihrliche Beschreibung der Technik des Nachweises yon Pocken-

An t ih~magg lu t in inen . Un te r such t wurden 800 Sera yon Variolapat ien- ten. Zu Beginn der K r a n k h e i t l i n d e n sich n icht scl ten noch rela6iv niedrige Titer , e in Max imum zeigt sich in der 3. bis 4. Woche. D a n n beg inn t eine langsame Ti te rsenkung, wenn auch spiiter ausnahmsweise noch Ti te r yon 1/51200 erha l ten werden.

Vergleicht m a n die durchschni t t l i ch recht hohcn Variola-Anti- h i imagglut in ine mi t den Ant ih i imagglu t in inen , (lie nach Revacc ina t ion yon 3000 erwachsenen Personen e rha l ten wurden, so zeigt sich ein deut- licher Unterschied. Bei Var io lapa t ien ten vom 2. bis 70. Krankhe i t s t ag f inder sich ein geometrischer Mit te lwer t von 1/2599, bei Revaccin ier ten n a c h < 1 Monat , 1 Monat u n d 2 Monaten geometrische Mit te lwerte dcr Ti ter yon 1/149, 1/113 und 1/99.

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Dr. W. A. COr,LIER, Den ttaag, Zoutmanstraat 40.