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Max-Planck-Institut für Biochemie Martinsried Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der Serinproteasen uPA und FXa Neuartige Wirkstoffe zur anti-metastatischen bzw. anti-thrombotischen Therapie Dissertation Stefan Sperl Martinsried 2000 online: http://tumb1.biblio.tu-muenchen.de/publ/diss/allgemein.html

Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der Serinpro · Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der Serinproteasen uPA und FXa Neuartige Wirkstoffe zur anti-metastatischen

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Max-P lanck- Ins t i tu t fü r B iochemie

Mar t ins r i ed

Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren

der Serinproteasen uPA und FXa

Neuartige Wirkstoffe zur anti-metastatischen bzw. anti-thrombotischen

Therapie

Dissertation

Stefan Sperl

Martinsried 2000

online: http://tumb1.biblio.tu-muenchen.de/publ/diss/allgemein.html

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Max-P lanck- Ins t i tu t fü r B iochemie

Mar t ins r i ed

Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der

Serinproteasen uPA und FXa

Neuartige Wirkstoffe zur anti-metastatischen bzw. anti-thrombotischen Therapie

Stefan Sperl

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Chemie der Technischen

Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

genehmigten Dissertation.

Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. Dr. Adelbert Bacher

Prüfer der Dissertation: 1. apl. Prof. Dr. Luis Moroder

2. Univ.-Prof. Dr. Johannes Buchner

3. Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Hiller

Die Dissertation wurde am 13.06.2000 bei der Technischen Universität München

eingereicht und durch die Fakultät für Chemie am 18.07.2000 angenommen.

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Teile der vorliegenden Arbeit wurden wie folgt zusammengefaßt:

Publikationen:

Sperl, S.; Bergner, A.; Stürzebecher, J.; Bode, W.; Moroder, L. (2000). Urethanyl-3-

Amidinophenylalanine Derivatives as Inhibitors of Factor Xa; X-Ray Crystal Structure

of a Trypsin/Inhibitor Complex and Modeling Studies. Biol. Chem. 381, 321-329.

Sperl, S.; Jacob, U.; Arroyo de Prada, N.; Stürzebecher, J.; Wilhelm, O. G.; Bode, W.;

Magdolen, V.; Huber, R.; Moroder, L. (2000). (4-aminomethyl)-phenylguanidine

derivatives as non-peptidic highly selective inhibitors of human urokinase. X-ray crystal

structure of an uPA/inhibitor complex at 1.8 Å resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

97, 5113-5118.

Zeslawska, E.; Schweinitz, A.; Karcher, A.; Sondermann, P.; Sperl, S.; Stürzebecher, J.;

Jacob, U. (2000). Crystals of the urokinase type plasminogen activator variant βc-uPA

in complex with small molecule inhibitors open the way towards structure based drug

design. J. Mol. Biol. 301, 465-475.

Magdolen, V.; Arroyo de Prada, N.; Sperl, S.; Muehlenweg, B.; Luther, T.; Wilhelm, O.

G.; Magdolen, U.; Graeff, H.; Reuning, U.; and Schmitt, M. (2000). Natural and

synthetic inhibitors of the tumor-associated serine protease urokinase-type plasminogen

activator. Adv. Exp. Med. Biol. 477, 331-342.

Bürgle, M.; Sperl, S.; Stürzebecher, J.; Schmalix, W.; Kessler, H.; Magdolen, V.; Wilhelm,

O. G.; Schmitt, M. (2000). Urokinase and its Receptor (CD87): new targets for tumor

therapy. in: Proteinase and peptidase inhibition: recent potential targets for drug

developement. (Smith, J. & Simons, C., ed.), Gordon & Breach Science Publishers,

Lausanne, Suisse. (im Druck).

Schmitt, M.; Wilhelm, O. G.; Reuning, U.; Krüger, A.; Harbeck, N.; Lengyel, E.; Graeff,

H.; Gänsbacher, B.; Kessler, H.; Bürgle, M.; Stürzebecher, J.; Sperl, S.; Magdolen, V.

(2000). The urokinase plasminogen activator system as a novel target for tumour

therapy. Fibrinolysis & Proteolysis 14, 114-132.

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Patentanmeldungen:

Sperl, S., Moroder, L., Magdolen, V., Stürzebecher, J., Wilhelm, O. G. (1999). Selektive

Inhibitoren des Urokinase -Plasminogen Aktivators. (DE 199 403 89.9)

Sperl, S., Jacob, U., Arroyo de Prada, N., Stürzebecher, J., Wilhelm, O. G., Bode, W.,

Magdolen, V., Huber, R., Moroder, L. (2000). Hochselektive Inhibitoren des Urokinase-

Plasminogenaktivators. (DE 100 137 15.6)

Sperl, S., Stürzebecher, J, Moroder, L. (2000). Derivate des (R)-3-Amidinophenylalanins

als Inhibitoren des Faktors Xa (eingereicht).

Vorträge:

Sperl, S. (1998). Design and synthesis of substrate-based inhibitors of urokinase. 16th

Winter School on Proteinases and their Inhibitors. Recent Developments. Tiers, Italien.

Sperl, S. (1999). New Lead Structures for uPA and Factor Xa Inhibitors. 17th Winter

School on Proteinases and their Inhibitors. Recent Developments. Tiers, Italien.

Sperl, S. (1999). Design und Synthese von selektiven uPA Inhibitoren. 4. Jenaer

Proteolysetag, DFG-Rundgespräch, Erfurt.

Sperl, S. (2000). Design, Synthesis and X-Ray Structure of a new class of selective uPA

Inhibitors. International Symposium on Proteinase Inhibitors and Activators – Strategic

Targets for Therapeutic Intervention, Oxford, UK.

Poster:

Sperl, S.; Jacob, U.; Arroyo de Prada, N.; Stürzebecher, J.; Wilhelm, O. G.; Bode, W.;

Magdolen, V.; Huber, R.; Moroder, L. (2000). Design, synthesis and X-ray crystal

structure of a new class of selective uPA-inhibitors. 15th International Congress on

Fibrinolysis and Proteolysis, Hamamatsu, Japan.

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Meinen Eltern

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Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Juni 1997 bis Juni 2000 am Max-

Planck-Institut für Biochemie in Martinsried unter Anleitung von Herrn Prof. Dr.

Luis Moroder angefertigt.

Mein besonders herzlicher Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Luis

Moroder, der mir diese sehr interessante Aufgabe gestellt hat. Er hatte immer ein

offenes Ohr für unkonventionelle Ideen und ließ mir gleichzeitig den nötigen

Freiraum zur Ausgestaltung des Themas und zur Umsetzung der Ideen. Darüber

hinaus möchte ich mich bei ihm auch für die übertragene Verantwortung innerhalb

der Arbeitsgruppe und das mir damit erwiesene Vertrauen bedanken.

Desweiteren bedanke ich mich recht herzlich bei allen Kooperationspartnern, ohne

die diese interdisziplinäre Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Ich danke

Ewa Zeslawska, Dr. Uwe Jakob und Prof. Dr. Robert Huber (Abteilung

Strukturforschung) für die Röntgenstrukturanalyse des uPA/Inhibitor-Komplexes,

Dr. Andreas Bergner und Prof. Dr. Wolfram Bode (Abteilung Strukturforschung)

für die Röntgenstrukturanalyse des Trypsin/FXa-Inhibitor-Komplexes und die

Durchführung der Modelling-Experimente,

PD Dr. Jörg Stürzebecher, Christa Böttner und Reiner Sieber (Klinikum der

Universität Jena, Zentrum für vaskuläre Biologie und Medizin, Erfurt) für die

rasche Bestimmung der Inhibitionskonstanten und die pharmakokinetischen

Untersuchungen,

Nuria Arroyo de Prada und Dr. Viktor Magdolen (Klinikum rechts der Isar der

Technischen Universität München) für die Toxizitätsuntersuchungen und die

zahlreichen interessanten und hilfreichen Diskussionen,

Prof. Dr. Marianne Jochum und Prof. Dr. Hans Fritz für die finanzielle

Unterstützung durch den Sonderforschungsbereich 469 der LMU München.

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Mein weiterer Dank gilt:

PD Dr. Olaf G. Wilhelm (Wilex Biotechnology GmbH, München) für sein großes

Vertrauen und Interesse an meiner Arbeit.

Der ganzen Arbeitsgruppe „Bioorganische Chemie“, die mich sehr freundlich

aufgenommen hat und deren Mitglieder mich stets nach Kräften unterstützt haben.

Namentlich hervorheben möchte ich Constanze Müller, die sehr viel Zeit und

Geduld bewies, um einen ehemaligen „Anorganiker“ in einen brauchbaren

bioorganischen Chemiker zu konvertieren. Günther Loidl, der mich bei etlichen

Gläsern Wein den Frust über nicht-inhibierende „Inhibitoren“ vergessen ließ.

Bernhard Gabriel und Norbert Schaschke danke ich für die zahlreichen

Diskussionen bei Syntheseproblemen. Besonders danken möchte ich Jürgen Musiol,

der zu jedem Problem stets hilfreiche Literatur bereithielt, aber auch für die netten

Kaffeepausen. Lissy Weyher und Sigi Bauer danke ich für die zuverlässige

Durchführung der Massenspektrometrie ebenso wie Hans Stocker für seine Hilfe

bei allen technischen Fragen. Meinem „Nachfolger“ Markus Michael Müller

wünsche ich weiterhin viel Erfolg und danke ihm, daß er mich diese Arbeit

weitgehend ungestört schreiben ließ. Vielen Dank auch an Bernd Mühlenweg, der

sich drei Jahre mit mir eine Stelle teilen mußte und während unserer

„Gründungsphase“ viel Engagement bewies.

Bei meiner WG (Ela, Flo, Julia und Amely) bedanke ich mich herzlichst für die

lustige Zeit und für das große Verständnis, wenn ich mich mal wieder um die

Hausarbeit gedrückt habe.

Besonderer Dank gebührt schließlich meinem cariñito Nuria, die mir durch ihre

unendliche Liebe die Freizeit versüßt und immer für mich da ist.

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Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung __________________________________________________________ 1

1.1. Klassifizierung der Proteasen _____________________________________________ 1

1.2. Struktur trypsin-ähnlicher Serinproteasen __________________________________ 2

1.3. Struktur der aktiven Zentren von Faktor Xa, uPA, Thrombin, tPA und Trypsin __ 4

2. Urokinase Inhibitoren ________________________________________________ 7

2.1. Die Rolle von uPA bei der Tumorprogression und Metastasierung ______________ 7

2.2. Der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator__________________________________ 10

2.3. Das uPA-uPAR-System _________________________________________________ 12

2.4. Klinische Relevanz von uPA, uPAR, PAI-1 und PAI-2 _______________________ 13

2.5. Inhibition des uPA-uPAR-Systems – Prinzipielle Therapieansätze______________ 14

2.6. uPA-Inhibitoren _______________________________________________________ 16

2.6.1. Natürliche uPA-Inhibitoren _________________________________________________ 16

2.6.2. Synthetische uPA-Inhibitoren________________________________________________ 18

2.7. Zielsetzung____________________________________________________________ 21

2.8. Ergebnisse und Diskussion ______________________________________________ 22

2.8.1. Tripeptid-Methylketone ____________________________________________________ 22

2.8.2. Phenylguanidin-Derivate als selektive uPA-Inhibitoren____________________________ 27

3. Faktor Xa Inhibitoren________________________________________________ 51

3.1. Die Blutgerinnungskaskade ______________________________________________ 51

3.2. Natürliche und synthetische FXa Inhibitoren _______________________________ 54

3.3. Zielsetzung____________________________________________________________ 59

3.4. Ergebnisse und Diskussion ______________________________________________ 60

3.4.1. Inhibition von FXa und verwandten trypsin-ähnlichen Serinproteasen ________________ 60

3.4.2. Synthese von 3- und (4-Amidino)-Phenylalanin-Derivaten _________________________ 63

3.4.3. Röntgenstrukturanalyse des FXa-Inhibitors 84 im Komplex mit Trypsin und Modelling-

Experimente _____________________________________________________________ 64

3.4.4. Einfluß der Chiralität von Amidino-Phenylalanin-Derivaten auf die Inhibition von FXa __ 69

4. Zusammenfassung und Ausblick _______________________________________ 73

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4.1. uPA-Inhibitoren _______________________________________________________ 73

4.2. FXa-Inhibitoren _______________________________________________________ 74

5. Summary __________________________________________________________ 77

5.1. uPA-inhibitors_________________________________________________________ 77

5.2. fXa-inhibitors _________________________________________________________ 78

6. Experimenteller Teil _________________________________________________ 80

6.1. Materialien und Methoden ______________________________________________ 80

6.2. Enzymkinetik _________________________________________________________ 82

6.2.1. Ermittlung der Inhibitionskonstanten (Ki-Werte)_________________________________ 82

6.2.2. Eingesetzte Enzyme und Substrate zur Ki-Wert-Bestimmung _______________________ 82

6.3. Röntgenstrukturanalyse des Inhibitor/uPA Komplexes _______________________ 83

6.3.1. Kristallisation mit Benzamidin als Inhibitor_____________________________________ 83

6.3.2. Soaking des uPA-Inhibitors 75 und Röntgenstrukturanalyse ________________________ 84

6.4. Röntgenstrukturanalyse des Faktor Xa Inhibitor 84/Trypsin-Komplexes ________ 85

6.5. Modelling-Experimente mit Faktor Xa Inhibitoren __________________________ 87

6.6. In vivo Eliminationsstudien ______________________________________________ 87

6.7. Toxizitätsstudien am uPA Inhibitor 75 ____________________________________ 88

6.8. Synthese der uPA Inhibitoren ____________________________________________ 89

6.8.1. Tripeptid-Methylketone ____________________________________________________ 89

6.8.2. nicht-peptidische Inhibitoren / Phenylguanidine _________________________________ 90

6.9. Synthese der Faktor Xa Inhibitoren ______________________________________ 111

7. Literaturverzeichnis ________________________________________________ 121

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Abkürzungen

Die Nomenklatur der Aminosäuren und Peptide entspricht den Vorschlägen der

IUPAG-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur (Europ. J. Biochem.,

1984, 138, 9-37)

Ac Acetyl

ACN Acetonitril

AcOH Essigsäure

AcOEt Essigsäure-Ethylester

Adoc 1-Adamantyloxycarbonyl

ATF Aminoterminales Fragment des uPA

Boc tert-Butyloxycarbonyl

ber. berechnet

Bz Benzyl

DC Dünnschichtchromatografie

DCC N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid

DCM Dichlormethan

DIEA Diisopropylethylamin

DIPE Diisopropylether

DMF Dimethylformamid

ESI Elektro-Spray-Ionisierung

EtOH Ethanol

FAB Fast Atom Bombardement

Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl

FXa Faktor Xa (aktiviert)

h Stunde(n)

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HBTU O-(Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium

Hexafluorophosphat

HOBt 1-Hydroxybenzotriazol

HOSu Hydroxysuccinimid

HPLC High Performance Liquid Chromatographie

HV Hochvakuum

i-PrOH Isopropanol

Ki Inhibitionskonstante

LM Lösungsmittel

M Molar

MS Massen-Spektrometrie

MeOH Methanol

n. b. nicht bestimmt

p. a. Pro Analyse

PAI-1/2 Plasminogenaktivator-Inhibitor Typ 1/2

Pbf 2,2,4,4-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl

pNA p-Nitroanilid

Rf Retentionsfaktor in der Dünnschichtchromatographie

RT Raumtemperatur

TBTU 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-

tetrafluoroborat

TFA Trifluoressigsäure

TFE Trifluorethanol

TIPS 2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl

Tos p-Toluolsulfonyl

tR Retentionszeit in der HPLC

uPA Urokinase-Typ Plasminogenaktivator

uPAR uPA-Rezeptor

Z Benzyloxycarbonyl

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1. Einleitung 1

1. Einleitung

1.1. Klassifizierung der Proteasen

Proteolytische Enzyme sind eine große und wichtige Gruppe von Proteinen die eine

Spaltung von Peptidbindungen katalysieren. Eine grobe Einteilung der Proteasen

läßt sich nach ihrem unterschiedlichen Katalysemechanismus vornehmen (Barrett,

A. J. et al. 1998).

A. Endopeptidasen: katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen im

inneren der Polypeptidkette

1. Serin-Proteasen Serin, Histidin und Aspartat im aktiven Zentrum

2. Cystein-Proteasen Cystein im aktiven Zentrum

3. Aspartat-Proteasen Aspartat-Reste im aktiven Zentrum

4. Metalloproteasen Metallion im aktiven Zentrum

5. Nicht klassifizierte Proteasen

B. Exopeptidasen: katalysieren die Abspaltung einer oder mehrerer

Aminosäuren vom N- oder C-Terminus des Substrats

1. Aminopeptidasen spalten eine Aminosäure vom N-Terminus ab

2. Dipeptidyl-Peptidasen spalten zwei Aminosäuren vom N-Terminus ab

3. Tripeptidyl-Peptidasen spalten drei Aminosäuren vom N-Terminus ab

4. Carboxy-Peptidasen spalten eine Aminosäuren vom C-Terminus ab

5. Peptidyl-Dipeptidasen spalten zwei Aminosäuren vom C-Terminus ab

Jede der aufgeführten Klassen läßt sich in Unterklassen („Clans“) aufteilen. Die

Serinproteasen werden zum Beispiel nach der Aminosäuresequenz ihrer

katalytischen Reste Asp, His und Ser unterteilt. Für trypsin-ähnliche Serinproteasen

gilt also die sequenzabhängige Reihenfolge His57–Asp102–Ser195, wohingegen

Subtilisin (eine extrazelluläre Endopeptidase aus Bacillus subtilis) die Reihenfolge

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1. Einleitung 2

Asp–His–Ser aufweist. Die folgenden Kapitel befassen sich näher mit der Klasse

der trypsin-ähnlichen Serinproteasen.

1.2. Struktur trypsin-ähnlicher Serinproteasen

Die dreidimensionale Röntgenstruktur des Rinder-Trypsins wurde bereits 1974

aufgeklärt (Huber, R. et al. 1974) und entwickelte sich zum Prototypen der

Serinproteasen mit Argininspezifität. Die Tertiärstrukturen dieser Enzyme zeigen

ein stark konserviertes Strukturmerkmal, obwohl die Primärstrukturen stark

voneinander abweichen können. Das allgemeine Nummerierungssystem der

Aminosäurereste folgt dem der homologen Protease Chymotrypsin. Chymotrypsin

hat eine beinahe identische Tertiärstruktur wie Trypsin, obwohl die beiden Enzyme

weniger als 50% Identität in der Primärstruktur aufweisen und Chymotrypsin eine

Substratspezifität für aromatische Reste besitzt. Die Positionen von

„Schlüsselresten“, wie jenen der katalytischen Triade (Asp102, His57 und Ser195) und

Asp189 am Boden der S1-Spezifitätstasche, sind in allen trypsin-ähnlichen

Serinproteasen identisch.

Die Tertiärstruktur dieser Proteasen besteht vorwiegend aus β-Faltblättern. Sie ist

charakterisiert durch 2 Domänen, wobei jede Domäne ein „β-barrel“ ausbildet. Die

„Active-Site Cleft“ mit der katalytischen Triade ist genau zwischen den beiden

Domänen lokalisiert (Abbildung 1). Jede der „barrel“-ähnlichen Domänen ist aus 6

anti-parallel laufenden Strängen aufgebaut, wobei 4 der 5 verbindenden „loops“

Haarnadel-Schleifen sind. Neben wenigen, kurzen Helices besitzen alle Enzyme

eine lange C-terminale α-Helix (Abbildung 1, rot).

Mitte Mai 2000 verzeichnete die Brookhaven Protein-Datenbank 160

Röntgenkristallstrukturen von Trypsin, 97 von Thrombin, 4 von Faktor Xa und 2

vom Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (uPA). Viele dieser Strukturen sind

Komplexe mit synthetischen oder natürlichen Inhibitoren, die aufgeklärt wurden,

um die Bindung und Selektivität der Inhibitoren rationell verbessern zu können. Die

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1. Einleitung 3

Tatsache, daß es vergleichsweise wenige Röntgenstrukturen von FXa und uPA gibt,

spiegelt die Schwierigkeiten wieder, die bei der Kristallisation dieser beiden

Enzyme auftreten. Da aber gerade diese Enzyme interessante Zielmoleküle in der

Therapie schwerwiegender Erkrankungen darstellen, kann man die hohe strukturelle

Ähnlichkeit der trypsin-ähnlichen Serinproteasen nutzen und Komplexstrukturen

von FXa- oder uPA-Inhibitoren mit Trypsin anfertigen.

Abbildung 1: Richardson-Diagramm der Tertiärstruktur von β-Trypsin im

Komplex mit dem Thrombin-Inhibitor NAPAP (PDB-Code:

1PPC). Die Sekundärstrukturelemente α-Helix und β-Faltblatt

sind dargestellt als helikales Band bzw. verdrehte Pfeile (Bode,

W. et al. 1990)

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1. Einleitung 4

Anschließend überlagert man die Trypsin/Inhibitor-Komplexstruktur mit einer

bekannten Struktur des Targetenzyms und erhält so Informationen über den

Bindungsmodus des Inhibitors (Banner, D. W. et al. 1991; Bode, W. et al. 1990;

Gabriel, B. et al. 1998; Matsuzaki, T. et al. 1989; Renatus, M. et al. 1998; Stubbs,

M. T. et al. 1995; Turk, D. et al. 1991).

1.3. Struktur der aktiven Zentren von Faktor Xa, uPA, Thrombin, tPA

und Trypsin

Obwohl Sekundär- und Tertiärstruktur aller trypsin-ähnlichen Serinproteasen

identisch sind, unterscheiden sie sich doch in einigen Bereichen entscheidend in der

Aminosäuresequenz (Primärstruktur). Gerade diese Unterschiede sind es aber, die

für die Selektivität der einzelnen Proteasen verantwortlich zeichnen. In Abbildung 2

sind die strukturellen Gemeinsamkeiten und Unterschiede der aktiven Zentren (S1-

S3/S4) von Faktor Xa, uPA (Urokinase-Typ Plasminogenaktivator), Thrombin, tPA

(Gewebe-Typ Plasminogenaktivator) und Trypsin schematisch dargestellt (Renatus,

M. et al. 1998).

Allen trypsin-ähnlichen Serinproteasen gemeinsam ist die relativ tiefe,

argininspezifische S1-Tasche. Die selektive Erkennung der basischen

Argininseitenkette erfolgt über die Ausbildung einer Salzbrücke zwischen der

positiv geladenen Guanidiniumfunktion des Arginins und der negativ geladenen

Carboxylgruppe des Asp189 am Boden der S1-Tasche. In uPA und Trypsin ist

außerdem die Bildung einer Wasserstoffbrücke zwischen der Seitenkette des Ser190-

Restes und der ε-NH Gruppe der Guanidinofunktion möglich. Diese

Wechselwirkung ist bei Thrombin, FXa und tPA nicht möglich, da diese Enzyme

anstelle von Serin eine Alanin-Mutation besitzen.

In der S2-Region gibt es bereits größere Unterschiede. Durch den sogenannten „60-

Insertion-Loop“ – bestehend aus Tyr60A, Pro60B, Pro60C und Trp60D – ist diese Region

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1. Einleitung 5

zusammen mit His57, Ser214 und Leu99 in Thrombin zu einer großen, lipophilen

Tasche ausgebildet, die z. B. Prolinreste in P2 sehr gut beherbergen kann. Bei uPA

tritt hingegen der entgegengesetzte Effekt auf. Hier ist die S2-Tasche durch den

„99-Insertion-Loop“ aus Thr98A und Leu98B in Verbindung mit His99 stark

verkleinert, so daß in dieser Region nur kleine Aminosäurereste wie Glycin binden

können. Dieser „99-Loop“ hat Auswirkungen bis in die S3/S4-Region, die in uPA

ebenfalls räumlich beschränkt und sehr hydrophob ist.

Die S3/S4-Region von Faktor Xa ist größer als die von uPA und ebenfalls sehr

hydrophob. Am Ende dieser Region befindet sich jedoch ein elektronegativer

Hohlraum, der von Glu97 und den Carbonyl-Sauerstoffen von Ile75 und Thr98 erzeugt

wird. Dieser Bereich kann z. B. von bis-basischen synthetischen Inhibitoren für eine

weitere ionische Interaktion genutzt werden (Gabriel, B. et al. 1998). Allerdings

besitzen auch tPA und Thrombin diesen elektronegativen Bereich, so daß auf diese

Weise keine selektiven FXa-Inhibitoren erzeugt werden können. Andererseits ist die

S3/S4-Region von tPA durch die räumliche Nähe der Arg174-Seitenkette weniger

hydrophob als die entsprechende Region in FXa, Trypsin oder Thrombin.

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1. Einleitung 6

HN

O

OO

NH2

NH2N

O O

Asp189

Tyr99

Thr98

Asp97Thr175

Arg174

Trp215

Leu217

δ− δ−

δ−

OH

HN

O

OO

O O

Asp189

Tyr99

Thr98

Glu97Ile175

Phe174

Trp215

Glu217

δ− δ−

δ−

OH

O

O

O O

Asp189

His99

Trp215

Arg217

NH

HN

NH2

H N2

NH

NH

Leu98BThr98AHO

OH

Tyr272

HN

O

O

O O

Asp189

Leu99

Thr98

Asn97

Gln175

Trp215

Ser217

δ−

δ−

HO

O N

HN

O

OO

O O

Asp 189

Thr 98

Arg 97Val 175

Ile 174

Trp 215

Glu 217

δ− δ−

δ−

O

O

Leu 99

Trp 60D

Pro 60C

Pro 60B

Tyr 60A

OH

Faktor Xa uPA

Thrombin

tPA Trypsin

Abbildung 2: Schematische Darstellung der aktiven Zentren von FXa, uPA,

Thrombin, tPA und Trypsin

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2. Urokinase Inhibitoren 7

2. Urokinase Inhibitoren

2.1. Die Rolle von uPA bei der Tumorprogression und Metastasierung

Bei der Tumorinvasion wandern Tumorzellen aus einem Primärtumor aus, um an

einer entfernten Stelle des Körpers einen Sekundärtumor (Metastase,

Tochtergeschwulst) zu bilden. Dafür sind eine Reihe aufeinanderfolgender

Vorgänge notwendig, welche als metastatische Kaskade bezeichnet werden

(Abbildung 3) (McKinnell, R. G. et al. 1998; Reuning, U. et al. 1998).

Der Prozeß der Metastasierung beinhaltet die Loslösung einzelner Tumorzellen aus

dem Primärtumor-Zellverband, die Adhäsion an und Invasion dieser Zellen durch

die extrazelluläre Matrix, Intravasation, den Transport mit dem allgemeinen

Blutkreislauf, erneute Adhäsion an die Basalmembran, Extravasation und

anschließend erneute Invasion der Zellen durch die extrazelluläre Matrix um die

Metastase zu bilden.

Für den Abbau der extrazellulären Matrix ist eine gerichtete proteolytische Aktivität

der Tumorzelle nötig. Diese wird durch verschiedene proteolytische Systeme

vermittelt, die miteinander interagieren und sich gegenseitig aktivieren (Koblinski,

J. E. et al. 2000). Im Einzelnen sind es

(1) die Serinproteasen Plasmin, uPA und tPA) (Danø, K. et al. 1985; Schmitt, M.

et al. 1997)

(2) die Matrixmetalloproteinasen (MMPs) (Cockett, M. I. et al. 1998; Kahari, V.

M. et al. 1999; Kleiner, D. E. et al. 1999; Westermarck, J. et al. 1999)

(3) die Cysteinproteinasen, z. B. Cathepsin B, H und L (Michaud, S. et al. 1998;

Sloane, B. F. 1990)

(4) die Aspartatproteinasen, z. B. Cathepsin D (Garcia, M. et al. 1996; Rochefort,

H. et al. 1996; Rochefort, H. et al. 1999)

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2. Urokinase Inhibitoren 8

Klonale Expansionund Wachstum

Adhäsion an undInvasion durch die

Basalmembran

Intravasation

Tumorzellhaufen

MetastaseMetastase

Basal-membran

Basal-membran

Primär-tumor

Transformierte Zelle

Metastatischer Subklon

Invasion durch dieExtrazellulärmatrix

Interaktion mitLymphozyten

Tumorzellhaufen

Adhäsion an dieBasalmembran

Extravasation

Metastase

Basal-membran

Basal-membran

Lymphozyt

Vene

Blutplättchen

Basal-membranExtrazellulär-

matrix

Abbildung 3: Weg der Krebszelle vom Primärtumor zum Ort der Metastase nach

McKinnell, R. G. et al. (1998)

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2. Urokinase Inhibitoren 9

uPA/uPAR

Plasminogen

Plasmin

pro-uPA/uPAR +

+Abbau von EZM- Fibrin- Fibronektin- Proteoglykane

Cathepsin B, L

+

pro-MMPs MMPs

+

-

PAI-1,2

+

Abbau vonBasalmembran-Kollagen-

TIMPs

α2-Antiplasmin

-

CystatineSteffine

-

Abbildung 4: Aktivierungskaskade der perizellulären Plasmin-Proteolyse

Eine zentrale Rolle bei der Tumorinvasion und Metastasierung spielt uPA

(Abbildung 4). Nach Bindung des Zymogens pro-uPA an den

zelloberflächengebundenen uPA-Rezeptor (uPAR, CD87) wird uPA rasch durch die

Cathepsine B oder L aktiviert. Die proteolytische Aktivität wird durch die Bindung

an den Rezeptor auf die Zelloberfläche fokussiert. Plasminogen wird durch den

uPA-uPAR-Komplex zu Plasmin aktiviert, das verschiedene Bestandteile der

extrazellulären Matrix abbauen kann. Desweiteren ist Plasmin durch einen positiven

„Feedback“-Mechanismus in der Lage, erneut uPA zu aktivieren. Zum anderen

werden durch uPA auch Matrixmetalloproteasen aktiviert, die schließlich zum

Abbau von Basalmembran-Kollagenen beitragen. Diese proteolytischen Prozesse

ermöglichen den Krebszellen schließlich die Invasion in benachbartes Gewebe

sowie die Metastasierung. Wegen der zentralen Rolle des uPA an diesen

pathologischen Prozessen, stellt die Inhibition der proteolytischen Aktivität des

Plasminogenaktivators ein vielversprechendes Ziel in der Tumortherapie dar.

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2. Urokinase Inhibitoren 10

2.2. Der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator

Der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (Urokinase, uPA, EC 3.4.21.31) wurde

erstmals bereits 1966 von White und Mitarbeitern aus Urin isoliert, wovon sich

auch der Name ableitet (White, W. F. et al. 1966). Das Interesse an diesem Enzym

stieg sprunghaft an, nachdem der schwedische Gynäkologe Åsted entdeckte, daß

uPA sehr stark von humanen Ovarialkarzinomzellen produziert wird (Åstedt, B. et

al. 1976). Inzwischen ist bekannt, daß uPA von einer Vielzahl normaler und

maligner Zellen synthetisiert und sekretiert wird (Danø, K. et al. 1985).

uPA wird als einkettiges Zymogen pro-uPA exprimiert, das aus 411 Aminosäuren

aufgebaut ist, 12 Disulfidbrücken enthält und mit Asn302 über eine

Glykosylierungsstelle verfügt (Wun, T. C. et al. 1982). Das Proenzym besteht aus

drei Domänen, wie in Abbildung 5 dargestellt.

• „Growth-Factor-Like Domain“ (GFD) uPA1-44:

In der N-terminalen GFD-Domäne befindet sich die Bindungsstelle zum

zelloberflächenassoziierten uPA-Rezeptor (Pollanen, J. J. 1993; Stoppelli, M.

P. et al. 1985). Diese Domäne besitzt eine starke Sequenzhomologie mit dem

epidermalen Wachstumsfaktor („Epidermal Growth Factor“, EGF) (Gunzler,

W. A. et al. 1982; Steffens, G. J. et al. 1982). Trotz dieser Homologie besteht

keine Affinität zwischen EGF und uPAR .

• Kringle-Domäne uPA45-135:

Diese Domäne besitzt Affinität zum extrazellulären Matrix-Proteoglykan

Heparin.

• Protease-Domäne uPA136-411:

In dieser C-terminalen Domäne befinden sich die Reste His204, Asp255 und

Ser356, die zusammen die katalytische Triade der Serinprotease bilden

(Strassburger, W. et al. 1983).

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2. Urokinase Inhibitoren 11

Abbildung 5: Schematische Darstellung der Domänen von pro-uPA

Durch enzymatische Spaltung, z. B. durch Plasmin, Kallikrein, Cathepsin D oder L,

der Peptidbindung zwischen Lys158 und Ile159, wird das inaktive, einkettige pro-

uPA zum zweikettigen HMW-uPA („high molecular weight uPA“) aktiviert. Die A-

Kette (uPA1-158) ist nach der Spaltung mit der B-Kette (uPA159-411) über eine

Disulfidbrücke zwischen Cys148 und Cys279 verknüpft. Erst durch die mit der

Spaltung einhergehende Konformationsänderung wird das aktive Zentrum

exponiert. HMW-uPA kann durch weitere Proteolyse in das aminoterminale

Fragment (ATF, uPA1-135) und „low molecular weight uPA“ (LMW-uPA, uPA136-

411) weiter prozessiert werden. LMW-uPA besitzt die volle proteolytische Aktivität

(Ellis, V. et al. 1991), kann aber nicht mehr an der uPA-Rezeptor binden.

Die Röntgenkristallstruktur der uPA-B-Kette, die das katalytische Zentrum enthält,

wurde erstmals 1995 von Spraggon und Mitarbeitern beschrieben (Spraggon, G. et

al. 1995). Die Auflösung dieser Struktur war mit 2,5 Å vergleichsweise gering. Erst

kürzlich wurden hochaufgelöste Röntgenstrukturen der uPA-B-Kette im Komplex

mit bekannten, synthetischen Inhibitoren veröffentlicht (Nienaber, V. et al. 2000)

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2. Urokinase Inhibitoren 12

(mehrere Komplexstrukturen, Auflösung: =1,5 Å), (Katz, B. A. et al. 2000)

(Auflösung 1,75, PDB-Code: 1C5X).

2.3. Das uPA-uPAR-System

Der uPA-Rezeptor (uPAR, CD 87) ist ein aus 313 Aminosäuren aufgebautes,

hochglycosyliertes (Kohlenhydratanteil 30%) Protein mit einem auffällig hohen

Cysteinanteil (Danø, K. et al. 1994). Der Rezeptor besteht aus 3 strukturell

ähnlichen Domänen und einem C-terminalen GPI-Anker, wobei die N-terminale

Domäne die GFD-Bindungsstelle enthält (Behrendt, N. et al. 1991), über die uPA

an uPAR bindet. Da uPAR keine Transmembrandomäne besitzt, ist eine

Signaltransduktion nur durch Wechselwirkung mit anderen Transmembranproteinen

möglich.

Der wichtigste natürliche Inhibitor des uPA ist der Plasminogenaktivator-Inhibitor

Typ 1 (PAI-1; siehe Kapitel 2.6.1). PAI-1 hemmt sowohl HMW-uPA als auch

LMW-uPA in freier oder rezeptorgebundener Form, tPA und in geringerem Maße

auch Plasmin.

Sobald sich auf der Zelloberfläche ein trimärer Komplex aus uPAR, uPA und PAI-1

gebildet hat, wird dieser mittels des Macroglobulinrezeptors (CD 91) in die Zelle

internalisiert (Casslen, B. et al. 1998; Conese, M. et al. 1995; Nykjaer, A. et al.

1997). Dort werden PAI-1 und uPA lysosomal abgebaut, während der uPAR auf der

Zelloberfläche regeneriert wird und erneut uPA binden kann. Bei Tumorzellen wird

der uPAR an die Migrations-/Invasionsfront regeneriert, wodurch die gerichtete

proteolytische Aktivität zustande kommt.

Im Gegensatz dazu wird der trimäre Komplex aus uPAR-uPA-PAI-2 (siehe Kapitel

2.6.1) nicht internalisiert, sondern auf der Zelloberfläche prozessiert. Durch

Spaltung des Komplexes entstehen 2 Fragmente: Ein 70 kD großes Fragment, das

PAI-2 und das aktive Zentrum von uPA enthält und ein 22 kD-Fragment, das das

ATF von uPA sowie uPAR enthält. Das ATF bleibt an uPAR gebunden und

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2. Urokinase Inhibitoren 13

verhindert dadurch die erneute Bindung von uPA an den Rezeptor (Ragno, P. et al.

1995; Ragno, P. et al. 1998).

Somit kann PAI-2 als „wirklicher“ Inhibitor von uPA und uPAR betrachtet werden,

während PAI-1 zwar die proteolytische Aktivität von uPA inhibiert, der uPAR aber

nach erfolgter Internalisierung des trimären Komplexes wieder auf die

Zelloberfläche zurückkehrt und erneut uPA binden kann. Dieser Unterschied ist ein

Grund für die unterschiedliche prognostische Relevanz von PAI-1- und PAI-2-

Konzentrationen in Tumoren (siehe Kapitel 2.4).

2.4. Klinische Relevanz von uPA, uPAR, PAI-1 und PAI-2

Nach der chirurgischen Entfernung eines soliden Tumors muß anhand geeigneter,

experimentell bestimmbarer Parameter das Risiko einer Neuerkrankung abgeschätzt

werden, um die Art und Intensität einer notwendigen Nachbehandlung (z. B.

Chemotherapie oder Bestrahlung) festzulegen. Seit einigen Jahren haben sich die

Bestandteile des uPA-uPAR-Systems zu wichtigen prognostischen Markern bei

einer Vielzahl von Krebserkrankungen entwickelt. Allein in den letzten 5 Jahren

sind weit über Hundert Veröffentlichungen zu diesem Thema erschienen. Der

interessierte Leser sei deshalb an dieser Stelle nur auf einige neuere Reviews

verweisen: (Allgayer, H. et al. 1997; Duffy, M. J. et al. 1999; Harbeck, N. et al.

1998; Look, M. P. et al. 1999; Pappot, H. et al. 1995; Reuning, U. et al. 1998).

Untersuchungen haben ergeben, daß hohe uPA-Werte nach der operativen

Entfernung verschiedener Tumoren mit einer schlechten Prognose für das

krankheitsfreie Überleben des Patienten verbunden sind. PAI-1-Werte stellten sich

mit der Zeit als noch bessere prognostische Marker heraus. Interessanterweise sind

es ebenfalls hohe Werte dieses uPA-Inhibitors, die eine schlechte Prognose

bedeuten, obwohl zunächst die proteolytische Aktivität von uPA gehemmt wird.

Eine mögliche Erklärung dieses Phänomens ist die Tatsache, daß der uPAR nach

Internalisierung des trimären Komplexes aus PAI-1/uPA/uPAR an der

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2. Urokinase Inhibitoren 14

Invasionsfront der Tumorzelle regeneriert wird und es nach Bindung von uPA

wieder zur gerichteten Proteolyse kommt.

Untersuchungen des uPAR-Gehalts zeigten ebenfalls, daß hohe Antigenwerte im

Tumorgewebe, aber auch im Blut, mit einer schlechten Prognose korrelieren, wenn

auch mit geringerer Signifikanz. Im Gegensatz zu den anderen Komponenten des

PA-Systems korrelieren hohe PAI-2-Werte mit einer guten Prognose für

rezidivfreies und Gesamtüberleben.

2.5. Inhibition des uPA-uPAR-Systems – Prinzipielle Therapieansätze

Wie in den Kapiteln 2.1-2.3 erläutert, spielt uPA eine zentrale Rolle in der Plasmin-

aktivierungskaskade und damit in den Prozessen der Tumorinvasion und

Metastasierung. Im vorangehenden Kapitel wurde gezeigt, daß hohe uPA- und

uPAR-Werte mit einer schlechten Prognose für das Überleben eines Krebspatienten

einhergehen. Aus diesen Befunden ergeben sich vier unterschiedliche Ansatzpunkte

zur therapeutischen Interaktion mit dem uPA-uPAR-System wie in Abbildung 6

erläutert.

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2. Urokinase Inhibitoren 15

GPI

GFD

Kringle

Protease

uPAR

GFD

Kringle

Protease

GFD

Kringle

Protease

GPI

uPAR

Inhibitor desaktiven Zentrums

uPA-Antagonist

uPAR-Antagonist

Inhibition derGenexpression(Antisense)

Aktives Zentrum

Abbildung 6: Inhibitionsmöglichkeiten des uPA/uPAR-Systems

• Reduktion der uPA- und/oder uPAR-Expression durch Antisense-Nukleotide

• uPAR-Antagonisten: Die Blockade des uPAR führt zu einer langsameren

Aktivierung von uPA und vor allem zur Aufhebung der Zelloberflächen-

fokussierung der proteolytischen Aktivität. Hierzu wurden z. B. zyklische,

vom ATF abgeleitete Peptide entwickelt, die etwa genauso gut an den

Rezeptor binden wie uPA selbst (Burgle, M. et al. 1997).

• uPA-Antagonisten: ähnlich wie uPAR-Antagonisten können auch uPA-

Antagonisten die Fokussierung der Proteolyse auf die Zelloberfläche

verhindern. Als möglicher Ansatzpunkt erwies sich „löslicher“ uPAR der

mit zelloberfächengebundenem uPAR um die Bindungsstelle zu uPA

konkurriert (Behrendt, N. et al. 1996)

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2. Urokinase Inhibitoren 16

• synthetische „uPA-Active-Site“-Inhibitoren zur Verringerung der

proteolytischen Aktivität von uPA. Solche Inhibitoren müssen

hochspezifisch sein, da sonst auch verwandte Serinproteasen gehemmt

werden, wodurch sich eventuell schwere Nebenwirkungen ergeben könnten.

2.6. uPA-Inhibitoren

Die proteolytische Aktivität von uPA wird durch 2 natürliche Inhibitoren reguliert.

Wegen der zentralen Rolle von uPA in pathologischen Prozessen wie der

Tumorinvasion und der Metastasierung, werden zunehmend auch synthetische

Inhibitoren als potentielle Arzneimittel interessant. Für eine Zusammenstellung

natürlicher und synthetischer Inhibitoren siehe auch Magdolen, V. et al. (2000).

2.6.1. Natürliche uPA-Inhibitoren

Die Aktivität des uPA/uPAR-Systems wird durch die Plasminogenaktivator-

Inhibitoren Typ 1 (PAI-1) und Typ 2 (PAI-2) reguliert [für Reviews zu diesen

Inhibitoren siehe Egelund, R. et al. (1997) und Ny, T. et al. (1997)]. Diese beiden

Inhibitoren gehören zur Serin-Protease-Inhibitor Superfamilie (Serpine) und

besitzen 55% Sequenzhomologie (33% Aminosäureidentität). Die strukturelle

Ähnlichkeit der beiden Proteine wurde durch Röntgenkristallstrukturen aktiver

Mutanten bewiesen [PAI-1: PDB-Code: 1B3K (Sharp, A. M. et al. 1999); PAI-2:

PDB-Code: 1BY7 (Harrop, S. J. et al. 1999)]. Beide Inhibitoren hemmen sowohl

uPA als auch tPA („Tissue-Type Plasminogen Activator“) durch Bildung eines 1:1

Komplexes. Aktives PAI-1 ist nur metastabil (Halbwertszeit etwa 2 h) und geht

spontan in eine latente, inaktive Konformation über. Durch Einführen von 4

Punktmutationen kann die Halbwertszeit allerdings auf über 140 h verlängert

werden (Berkenpas, M. B. et al. 1995). In vivo wird die Halbwertszeit von aktivem

PAI-1 durch Bindung an das extrazelluläre Matrix- und Plasma-Protein Vitronektin

auf etwa 4 h verdoppelt (Kanse, S. M. et al. 1996). Im Gegensatz zu PAI-2, wird

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2. Urokinase Inhibitoren 17

PAI-1 mit einem Signalpeptid (21 Aminosäuren) synthetisiert und von den Zellen in

glycosylierter Form sezerniert. Dem Inhibitor PAI-2 hingegen fehlt ein spaltbares

Signalpeptid. Es liegt zu 80% in nicht-glycosylierter Form intrazellulär vor (Ny, T.

et al. 1997).

Zwei weitere Serpine, die neben Thrombin, Trypsin, Plasmin bzw. Protein C auch

uPA und tPA hemmen, sind die Inhibitoren der Proteinase Nexin-1 und des Protein-

C. Unter physiologischen Bedingungen reagieren sie allerdings wesentlich

langsamer mit den Plasminogenaktivatoren als PAI-1 und PAI-2 (Andreasen, P. A.

et al. 1997; Sprengers, E. D. et al. 1987). Aprotinin und der Tumor-assoziierte

Trypsininhibitor (TATI) wurden ebenfalls als Inhibitoren von uPA beschrieben. Die

Inhibitionskonstanten dieser Enzyme gegen uPA liegen jedoch im mikromolaren

Bereich, so daß diesen Inhibitoren keine physiologische Bedeutung zukommt.

Tabelle 1: Natürliche uPA-Inhibitoren

Inhibitor Inhibition von uPA Literatur

PAI-1 k2=1-2 x 107 mol-1 s-1 (Thorsen, S. et al. 1988)

PAI-2 k2=2,4 x 106 mol-1 s-1 (Thorsen, S. et al. 1988)

Tumor-Associated TrypsinInhibitor (TATI) Ki = 0,3 µM (Turpeinen, U. et al. 1988)

Aprotinin Ki = 27 µM (Lottenberg, R. et al. 1988)

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2. Urokinase Inhibitoren 18

2.6.2. Synthetische uPA-Inhibitoren

Verglichen mit der Vielzahl reversibler synthetischer Inhibitoren die gegen andere

trypsin-ähnliche Serinproteasen wie z. B. Thrombin (Hauptmann, J. et al. 1999)

oder FXa (siehe Kapitel 3.2) entwickelt wurden, gibt es nur sehr wenige effiziente

uPA-Inhibitoren. Das gemeinsame Strukturmerkmal dieser uPA-Inhibitoren ist eine

basische Amidino- oder Guanidinogruppe, die die Ausbildung einer Salzbrücke zu

Asp189 in der S1-Tasche ermöglicht. Eine Übersicht bekannter uPA-Inhibitoren ist

in Tabelle 2 zusammengestellt. Die meisten dieser Verbindungen zeigen kaum oder

keine Selektivität für uPA, sondern hemmen auch Enzyme des Verdauungstraktes

(Trypsin) sowie der Blutgerinnungskaskade (z.B. Faktor Xa und Thrombin). Die

besten Verbindungen weisen lediglich Inhibitionskonstanten im niederen

mikromolaren Bereich auf.

Billström und Mitarbeiter konnten bei oraler Gabe des Inhibitors p-Amino-

Benzamidin im Mausmodell eine klare Verlangsamung des Wachstums von DU145

Tumoren feststellen (Billström, A. et al. 1995). Das Diuretikum Amilorid stellt

einen selektiven uPA-Inhibitor mit einer allerdings relativ hohen

Inhibitionskonstante von 7 µM dar. Im Mausmodell wurde gezeigt, daß Amilorid

die Bildung von Lungenmetastasen verhindert (Vassalli, J. D. et al. 1987). Die

derzeit potentesten und selektivsten "Active-Site" uPA-Inhibitoren sind die

substituierten Benzo[b]thiophen-2-Carboxamidine B-428 und B-623 mit einem Ki-

Wert von 0,53 bzw. 0,16 µM (Towle, M. J. et al. 1993). Für einen dieser

Inhibitoren, B-428, konnte gezeigt werden, daß diese Verbindung uPA-vermittelte

Prozesse wie die proteolytische Degradation von extrazellulären Matrixproteinen,

Tumorzelladhäsion, -migration und -invasion in vitro effektiv inhibieren kann

(Alonso, D. F. et al. 1996a). Desweiteren hemmt der synthetische Inhibitor in einem

syngenen Mammakarzinom-Maus-Modell die lokale Tumorinvasion (Alonso, D. F.

et al. 1996b; Alonso, D. F. et al. 1998) sowie die Metastasierung von Ratten-uPAR

überexprimierenden Zellen in einem syngenen Modell für Ratten-Prostata-

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2. Urokinase Inhibitoren 19

Karzinom (Rabbani, S. A. et al. 1995). Bei einer Kombinationstherapie mit dem

Anti-Östrogen Tamoxifen konnte ebenfalls eine Verringerung des Tumorvolumens

und von Metastasen in einem Ratten-Mammakarzinom-Modell beobachtet werden

(Xing, R. H. et al. 1997).

Tabelle 2: Synthetische uPA-Inhibitoren

Inhibitor Inhibition vonuPA

Literatur

NH2

NH

NH2

p-Amino-Benzamidin

Ki = 82 µM(Billström, A. et al. 1995;Geratz, J. D. et al. 1981;Jankun, J. et al. 1997)

NH

NH2NH

R

mono-subst. Phenylguanidine

Ki = 6 µM(Yang, H. et al. 1990)

NH

NH2R

Benzamidine

Ki = 5 µM (Stürzebecher, J. et al. 1978)

N

N NH NH2

NHO

NH2

Cl

NH2

Amilorid

Ki = 7 µM (Jankun, J. et al. 1997;Vassalli, J. D. et al. 1987)

NH

NNH

NH2

R

5-Amidinobenzimidazole undAmidinoindole

Ki > 4 µM (Geratz, J. D. et al. 1981;Tidwell, R. R. et al. 1983)

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2. Urokinase Inhibitoren 20

Inhibitor Inhibition vonuPA

Literatur

SH

R

NH

NH2

Benzo[b]thiophen-2-Carboxamidine

Ki [µM]:

B428: 0,53

B623: 0,16

(Alonso, D. F. et al. 1996a;Alonso, D. F. et al. 1996b;Alonso, D. F. et al. 1998;Rabbani, S. A. et al. 1995;Swiercz, R. et al. 1999;Towle, M. J. et al. 1993;Xing, R. H. et al. 1997)

O

NH O

R

S O

NH2

NH

3-Amidinophenylalanin-Derivate

Ki ≥ 0,5 µM(Stürzebecher, J. et al. 1999)

Pyr-Leu-Arg-H (Peptidaldehyd) IC50 = 11 µM (Kawada, M. et al. 1995;Saino, T. et al. 1988)

Ecotin Variante: M84R + D70R Ki = 50 pM (Yang, S. Q. et al. 1998a;Yang, S. Q. et al. 1998b)

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2. Urokinase Inhibitoren 21

2.7. Zielsetzung

In den vorangehenden Kapiteln wurde die hohe klinische Relevanz des Urokinase-

Typ Plasminogenaktivatorsystems in der Tumorprogression und Metastasierung

näher erläutert. Ziel dieser Arbeit war es, Inhibitoren der proteolytischen Aktivität

von uPA als Leitstrukturen für Therapeutika zu entwickeln. Aufgrund der, auf

medizinische Anwendung hin ausgerichteten Themenstellung, sollten die

Inhibitoren eine möglichst hohe Selektivität gegenüber den strukturverwandten,

trypsin-ähnlichen Serinproteasen aufweisen. Aus dem gleichen Grund sollte es sich

um reversible Inhibitoren, also ohne „Active-Site“-reaktive Gruppe handeln.

Desweiteren sollte das Molekulargewicht aus pharmakokinetischen Gründen nicht

über 500 D betragen.

Als Ausgangspunkt für die Inhibitorenentwicklung diente die Röntgenkristall-

struktur, die 1995 von Spraggon und Mitarbeitern publiziert wurde (Spraggon, G. et

al. 1995). Da die Selektivität sehr wichtig war, sollten alle Verbindungen auch auf

die Inhibition der trypsin-ähnlichen Serinproteasen Thrombin, FXa, tPA, Trypsin

und Plasmin untersucht werden.

Mit vielversprechenden Leitstrukturen sollten Röntgenkristallstruktur-

Untersuchungen durchgeführt werden, um das rationelle Design noch aktiverer

Hemmstoffe zu ermöglichen.

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2. Urokinase Inhibitoren 22

2.8. Ergebnisse und Diskussion

2.8.1. Tripeptid-Methylketone

Modelling der Tripeptid-Methylketone

Bis vor kurzem war nur eine einzige Röntgenkristallstruktur von uPA im Komplex

mit dem irreversiblen Inhibitor H-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon bekannt

(Spraggon, G. et al. 1995). Dieser Inhibitor bildet unter Abspaltung eines

Chloridions eine kovalente Bindung zwischen dem Imidazolring des His57 und der

Methylengruppe des Inhibitors aus. Desweiteren bildet die Seitenkette von Ser195

mit dem Keton ein Halbketal (siehe Abbildung 7), das durch Wasserstoffbrücken

mit Gly193 NH und Ser195 NH stabilisiert ist.

Ausgehend von dieser Struktur wurden Tripeptid-Methylketone als reversible

Inhibitoren synthetisiert, die keine kovalente Bindung mit His57 eingehen können.

Durch Angriff des Ser195 O? an das Keton, ist auch bei diesen Verbindungen die

Halbketalbildung prinzipiell möglich. Dieses Halbketal ist ein Analogon des

tetraedrischen Übergangszustands, der während der Substratspaltung auftritt.

Allerdings können Ketone durch Serinproteasen nicht gespalten werden und eignen

sich deshalb als Inhibitoren, die den genannten Übergangszustand stabilisieren.

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2. Urokinase Inhibitoren 23

Ser

His

195

57NH N

H

NH2NH

NH

CH2

N

NH

NH2

+NH2

O

ON

O O

O O

S1-TascheS3-Tasche

Gly193

O O

NH2

+NH2

NH

Asp189

Arg217

Abbildung 7: Bindungsmodus des irreversiblen Inhibitors H-Glu-Gly-Arg-

Chloromethylketon an uPA (Spraggon, G. et al. 1995). Wasserstoffbrücken sind als

gestrichelte rote Linien, kovalente Bindungen als durchgezogene rote Linien

dargestellt.

Neben der, direkt aus der Röntgenstruktur entnommenen Peptidsequenz, wurden

auch noch weitere Sequenzen synthetisiert. Eine Studie von Song-Hua Ke (Ke, S.

H. et al. 1997) mit verschiedenen peptidischen Substraten ermittelte eine Präferenz

von uPA für die Sequenz Ser-Gly-Arg (P3-P1), so daß davon auszugehen ist, daß

auch der analoge Tripeptid-Methylketon-Inhibitor eine höhere Affinität zu uPA

besitzen sollte. Modelling-Experimente mit der bekannten uPA-Röntgenstruktur

(Spraggon, G. et al. 1995) ergaben, daß sich der P2-Rest Glycin auch durch das

starrere Prolin ersetzten läßt, wodurch man die Flexibilität des Inhibitors

einschränken und damit den entropischen Verlust bei der Bindung an das Enzym

verringern könnte.

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2. Urokinase Inhibitoren 24

Festphasensynthese nach der Fmoc-Strategie

Zur Synthese von Methylketonen aus Peptiden sind 2 verschiedene Methoden

gebräuchlich. Die von John S. McMurray und Douglas F. Dyckes beschriebene

Abwandlung der Dakin-West-Reaktion (Dakin, H. D. et al. 1928; McMurray, J. S.

et al. 1985) hat allerdings den Nachteil, daß die C-terminale Aminosäure während

der Reaktion vollständig racemisiert. Eine weitere Methode stellt die Umsetzung

von N-Methoxy-N-Methylamiden (Weinrebamid) mit Methyl-Grignard-Reagenz

dar (Nahm, S. et al. 1981) (Abbildung 8).

R N

O

Me

OMe MeMgBr

THF NMe

OMeRMe

O Mg

R Me

OH3O+

Abbildung 8: Synthese von Methylketonen aus Weinrebamiden

Die N-Methylgruppe des Weinrebamids kann auch durch einen mit einem

polymeren Träger verbundenen Linker ersetzt werden (Dinh, T. Q. et al. 1996). Zur

Synthese der Tripeptid-Methylketone wurde eine Festphasensynthese nach Fmoc-

Strategie an einem Weinreb AM-Harz (NovaBiochem) gewählt (Abbildung 9). Da

das Weinrebamin sehr wenig nukleophil ist, wurde die erste Aminosäure [Fmoc-

Arg(Pbf)-OH] mit HATU/HOAt/DIEA im Verhältnis 1:1:1:2 mit einem 4-fachen

molaren Überschuß an den Harzlinker gekoppelt. Der weitere Aufbau der

Peptidkette erfolgte standardmäßig mit 4 Äquivalenten Fmoc-Xaa-

OH/TBTU/HOBt/DIEA (1:1:1:2). Die Fmoc-Abspaltung war nach 2

aufeinanderfolgenden Zyklen von 3 min und 12 min mit 20% Piperidin in DMF

quantitativ. Im letzten Schritt wurde das seitenkettengeschützte Produkt mit 20

Äquivalenten Methyl-Grignard-Reagenz in absolutem THF unter gleichzeitiger

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2. Urokinase Inhibitoren 25

Ausbildung des Methylketons vom Harz abgespalten. Die Schutzgruppenabspaltung

erfolgte schließlich in 95% TFA.

PNOMe

ArgFmoc

PNOMe

HCH3 +Arg

PNOMe

Fmoc

1. Piperidin2. Fmoc-Xaa1-OH/ HOBt/HBTU/DIEA

1. Piperidin2. Fmoc-Xaa2-OH/ HOBt/HBTU/DIEA

PNOMe

ArgXaa1Fmoc

1. Piperidin2. Fmoc-Arg(Pbf)-OH/ HOAt/HATU/DIEA

PNOMe

ArgXaa1Xaa2Fmoc

PNOMe

ArgXaa1Xaa2Ac

Xaa1Xaa2Ac

1. CH3MgBr2. H+

1. Piperidine2. Ac2O

Abbildung 9: Synthese von Tripeptid-Methylketonen am polymeren Träger

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2. Urokinase Inhibitoren 26

Inhibition von uPA und strukturverwandten Enzymen

Alle dargestellten Tripeptid-Methylketone wurden auf Inhibition von uPA und den

strukturverwandten Serinproteasen Plasmin, FXa, Thrombin und Trypsin untersucht

(Tabelle 3). Die Inhibitionskonstanten aller getesteter Verbindungen waren größer

als 1 mM (mit Ausnahme von Verbindung 3, die Trypsin mit 12 µM hemmt).

Aus diesen Ergebnissen wird ersichtlich, daß die Hemmwirkung des irreversiblen

Inhibitors H-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon praktisch ausschließlich durch

Bildung einer kovalenten Bindung mit His57 erzielt wird und nicht durch

Wechselwirkung mit den uPA-Bindungstaschen S1-S3. Daraus folgt direkt, daß der

irreversible Inhibitor praktisch keine Selektivität gegenüber den verwandten

Serinproteasen aufweisen kann und deshalb in vivo nicht verwendet werden kann.

Auf der Basis von Peptidaldehyden, die den tetraedrischen Übergangszustand

besser stabilisieren können als Methylketone, könnten vermutlich auch uPA-

Inhibitoren entwickelt werden. Aus oben genannten Gründen würde aber auch mit

solchen Inhibitoren das Selektivitätsproblem nicht zufriedenstellend gelöst werden.

Deshalb wurde schließlich mit der Entwicklung kleiner, organischer Moleküle als

uPA-Inhibitoren ein vollkommen neuer Weg eingeschlagen (Kapitel 2.8.2).

Tabelle 3: Struktur-Wirkungsbeziehung der Tripeptid-Methylketone auf dieInhibition von uPA und verwandten Serinproteasen

Ki [µM]Nr. Sequenz

uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin

(1) Ac-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000

(2) Ac-Glu-Gly-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000

(3) H-Glu-Pro-D,L-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 12

(4) Ac-Glu-Hyp-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000

(5) Ac-Ser-Hyp-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000

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2. Urokinase Inhibitoren 27

2.8.2. Phenylguanidin-Derivate als selektive uPA-Inhibitoren

Strukturbasiertes Inhibitordesign

Abbildung 10 zeigt das katalytische Zentrum der Röntgenkristallstruktur von uPA

im Komplex mit dem irreversiblen Inhibitor H-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon

(Spraggon, G. et al. 1995). Aus dem Bindungsmodus dieses substratähnlichen

Inhibitors lassen sich einige wichtige Rückschlüsse für das Inhibitordesign ziehen:

• Das natürliche Substrat Plasminogen wird von uPA nach Arginin 560 gespalten.

Die Guanidinogruppe des Arginins interagiert dabei mit der Seitenkette von

Asp189 in der S1-Tasche über eine Salzbrücke.

• Verglichen mit der S2-Tasche in Thrombin, ist die S2-Tasche von uPA durch

die Insertion von Thr97A und Leu97B im sogenannten „99-Loop“ stark

verkleinert. In der P2-Position des Substrats oder Inhibitors sind aus diesen

sterischen Gründen kleine Aminosäurereste wie Glycin bevorzugt.

• Ebenso wie in Thrombin gibt es eine S3/S4-Tasche die vorwiegend von den

hydrophoben Seitenketten aromatischer Aminosäuren gebildet wird.

Ein möglicher uPA-Inhibitor sollte somit ein Argininmimetikum in P1, einen

kleinen Spacer in P2 und einen hydrophoben Rest in P3 enthalten.

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2. Urokinase Inhibitoren 28

Abbildung 10: Röntgenkristallstruktur von uPA im Komplex mit dem irreversiblen

Inhibitor H-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon

Untersuchung verschiedener Argininmimetika

Zunächst wurden verschiedene Kopfgruppen synthetisiert und auf ihre

inhibitorische Wirkung getestet (Tabelle 4). Alle enthalten einen hydrophoben

Benzolring, substituiert mit basischen Amidino- bzw. Guanidino-Gruppen.

Prinzipiell sind alle diese Derivate also in der Lage an Asp189 in der S1-Tasche über

eine Salzbrücke zu binden.

Benzamidin (111) und Phenylguanidin (6) inhibieren uPA im mikromolaren

Bereich. Benzylcarbamidin (112), das zu Phenylguanidin isoster ist, hatte hingegen

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2. Urokinase Inhibitoren 29

keine inhibitorische Aktivität auf die untersuchten trypsinartigen Serinproteasen.

Wegen der besseren Selektivität wurde aufgrund dieser Ergebnisse Phenylguanidin

(6) als Kopfgruppe gewählt.

Tabelle 4: Struktur-Wirkungsbeziehung verschiedener Argininmimetika

Ki [µM]Nr. Formel

uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin

(111)NH2

NH81 350 410 220 35

(6) NH

NH2NH

30 > 1000 > 1000 > 1000 163

(112) NH2NH

> 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000

(7) NH NH2

NH> 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000

Screening verschiedener Phenylguanidin-Derivate – Suche nach einem

geeigneten P2-Spacer

Im nächsten Schritt wurde versucht, einen P2-Spacer geeigneter Länge zu finden.

Sämtliche Derivate der 4-Guanidino-Benzoesäure (8-11), des 4-Guanidino-Anilins

(31), sowie des 4-Guanidino-Phenylalanins (15, 18, 21) zeigten keine oder nur sehr

geringe hemmende Wirkung auf uPA (Tabelle 5). Interessanterweise sind die zu

Verbindung 18 und 21 analogen 3- bzw. 4-Amidino-Phenlalaninderivate als Serin-

proteaseinhibitoren bekannt (Gabriel, B. 1998; Gabriel, B. et al. 1998;

Stürzebecher, J. et al. 1999). Durch die Guanidinofunktion scheint sich also eine

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2. Urokinase Inhibitoren 30

völlig andere Bindungsgeometrie zu ergeben. Derivate von 3-Guanidinobenzylamin

erfüllen offensichtlich ebensowenig die strukturellen Voraussetzungen für einen

uPA-Inhibitor (66, 73, 74) wie Sulfonamid-Derivate des 4-Guanidinobenzylamins

(37–45). Einzig und allein Urethanyl- oder Acyl-Derivate des 4-

Guanidinobenzylamins (28, 29, 47, 49, 50) zeigten die gewünschte uPA Inhibition.

Während die Acyl-Derivate 47, 49 und 50 zumindest Trypsin noch mit

vergleichbaren Inhibitionskonstanten hemmen wie uPA, konnte für die

Urethanylderivate 28 und 29 keine Hemmwirkung auf Trypsin, Thrombin, FXa und

Plasmin nachgewiesen werden. Das tert-Butyloxycarbonyl-Derivat (29) wurde nun

als neue Leitstruktur für weitere Derivatisierungen eingesetzt.

Tabelle 5: Substituierte Phenylguanidine – Suche nach einem geeigneten Spacer umdie S2-Tasche zu überbrücken.

Ki [µM]Nr. Formel

uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin

(8) NNH

NH2NH

O

O

O

O

59 400 >1000 36 500

(9) NH

NH2NH

O

N MeMeO

100 100 >1000 >1000 >1000

(10) ONH

NH2NH

O

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(11) NH

NH2NH

O

OMe >1000 n. b. >1000 >1000 >1000

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2. Urokinase Inhibitoren 31

Ki [µM]Nr. Formel

uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin

(15)NH

NH2NH

NH

OO

OOMe

200 >1000 >1000 85 >1000

(18) NH

NH2NH

NH

OO

OOMe

>1000 300 >1000 >1000 >1000

(21) NH

NH2NH

NH

OOMe

SO

O>1000 >1000 >1000 54 >1000

(37)NH

NHNH2

NH

SO

O

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(38) NH

NHNH2

NH

SO

O

FF

F

F F

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(39) NH

NHNH2

NH

SO

ONH

O >1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(41) NH

NHNH2

NH

SO

OCF3

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(42) S

N

NH

NHNH2

NH

SO

ONH

O

240 >1000 >1000 >1000 >1000

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2. Urokinase Inhibitoren 32

Ki [µM]Nr. Formel

uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin

(43) NH

NHNH2

NH

SO

OF3C

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(44)SO

ON

OCF3

NH

NHNH2

NH

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(45)S

O

OS

O

O

O

NH

NH NH2

NH

NH

NHNH2

NH

>1000 >1000 >1000 >1000 63

(66)NH

NHNH2

NH

ONH >1000 450 600 >1000 >1000

(73)NH

S NH

NH2 NH

O

O >1000 >1000 1300 >1000 >1000

(74)NH

O

ONH

NH2 NH

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(31)NH

ONH

NHNH2O

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(28) NH

NHNH2

NHO

O 16 >1000 >1000 >1000 >1000

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2. Urokinase Inhibitoren 33

Ki [µM]Nr. Formel

uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin

(29) NH

NHNH2

NHO

O 36 >1000 >1000 >1000 >1000

(47)NH

NHNH2

NHO

NH

OO

37 n. b. >1000 >1000 >1000

(49)NH

NHNH2

NHO

NH

SO

O

NH

O

21 >1000 >1000 >1000 42

(50)NH

NHNH2

NHO

NH

SO

O

32 >1000 >1000 >1000 36

Einfluß der hydrophoben Wechselwirkungen in P3

Im nächsten Schritt sollten die hydrophoben Wechselwirkungen optimiert werden.

Hierzu wurde die tert-Butylgruppe der Leitstruktur 29 sukzessive durch andere

Alkyl-, Zykloalkyl- und aromatische Gruppen ausgetauscht (Tabelle 6). Bei allen

durchgeführten Variationen stellten wir fest, daß der Einfluß der hydrophoben

Wechselwirkungen weitaus geringer war als der Einfluß des geeigneten P2-Spacers

(siehe Tabelle 5). So bewegen sich die Inhibitionskonstanten nur im Bereich

zwischen 10 und 50 µM. Der bis-basische Inhibitor 54 hebt sich mit einer

Inhibitionskonstante von 2,8 µM etwas aus diesem Umfeld ab. Durch die zwei

Guanidino-Benzylaminreste in einem Molekül ist die Konzentration des Inhibitors

formal aber doppelt so hoch, d. h. hätte der Inhibitor nur eine Guanidinofunktion,

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2. Urokinase Inhibitoren 34

wäre der Ki-Wert etwa 6 µM. Deshalb ist auch nicht davon auszugehen, daß die

zweite Phenylguanidin-Einheit außerhalb der uPA-„Active-Site“ bindet, während

der erste Phenylguanidinrest in der S1-Tasche gebunden ist. Eine deutlichere

Verbesserung der Inhibitionskonstante findet man für diese Verbindung allerdings

in Bezug auf Tryptase, die ein Tetramer mit vier katalytisch aktiven Untereinheiten

bildet. Für die Kopfgruppe 4-Guanidino-Benzylamin (59) wurde gegen Tryptase

eine Inhibitionskonstante von 200 µM ermittelt. Durch den bis-basischen Inhibitor

54 verbessert sich hier der Ki auf 1 µM, was zumindest teilweise für bivalentes

Binden (gleichzeitiges Binden in zwei Untereinheiten der Tryptase) spricht.

Wegen der beobachteten leichten Präferenz für den sperrigen und inerten

Adamantylrest (Verbindung 36) und wegen der kommerziellen Verfügbarkeit der

benötigten Derivate, wurde der Inhibitor 36 als Leitstruktur für die weiteren

Optimierungsschritte gewählt.

Tabelle 6: Optimierung der hydrophoben Wechselwirkungen in P3

Ki [µM]Nr. Formel

uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin

(29) NH

NHNH2

NHO

O 36 >1000 >1000 >1000 >1000

(33) NH

NHNH2

NH

O

O

27 >1000 >1000 >1000 >1000

(34) NH

NHNH2

NHO

O 51 >1000 >1000 >1000 >1000

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2. Urokinase Inhibitoren 35

Ki [µM]Nr. Formel

uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin

(35) NH

NHNH2

NHO

O 52 >1000 >1000 >1000 >1000

(36) NH

NHNH2

NHO

O 13 >1000 >1000 >1000 >1000

(32) NH

NHNH2

NH

NH2

NH

46 >1000 >1000 >1000 >1000

(59)NH

NHNH2

NH2

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(53) NH

NH NH2

NH

O

O

NN 11 >1000 >1000 >1000 >1000

(52)NH

NH

NH2NH

O

O

NO2

MeOOMe

35 >1000 >1000 >1000 >1000

(28) NH

NHNH2

NHO

O 16 >1000 >1000 >1000 >1000

(51)O2N

NH

NH

NH2NH

O

O 12 200 >1000 >1000 36

(54) NH

NHNH2

NH

O

OO

ONH

NH

NHNH2

2,8 47 >1000 >1000 11

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2. Urokinase Inhibitoren 36

Ki [µM]Nr. Formel

uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin

(64) NH

NHNH2

NHO

NH

OO

70 390 >1000 >1000 >1000

(65)NH

NHNH2

NHO

NH252 250 >1000 >1000 >1000

Untersuchung der Wasserstoffbrücken-Donor/Akzeptor-Eigenschaften des P2-

Spacers

Als nächstes wurde untersucht, welche Atome des P2-Spacers für die Bindung zum

Enzym wichtig sind. Hierzu wurden einzelne Atome durch isostere Gruppen mit

anderen Wasserstoffbrücken-Donor- bzw. Akzeptoreigenschaften ausgetauscht

(Tabelle 7). So wurde zum Beispiel der Wasserstoffbrückenakzeptor O (Verbindung

36) durch die inerte Gruppierung CH2 (Verbindung 58) bzw. den Donor NH (75)

ausgetauscht. NH als H-Brückendonor scheint an dieser Stelle stark bevorzugt zu

sein, so daß sich die Inhibitionskonstante auf 2,4 µM verbesserte (75). Tauscht man

den Harnstoff in Verbindung 75 durch den isosteren Thioharnstoff (60) aus, ist

keinerlei uPA-Inhibition mehr zu messen. Beim Austausch des benzylischen NH in

Verbindung 75 durch die inerte Methylengruppe (62) verschlechtert sich die

Inhibitionskonstante auf 120 µM. Dieser Austausch beeinflußt auch die Selektivität,

so daß Plasmin vergleichbar gehemmt wird. Das Verkürzen des P2-Spacers von

Verbindung 75 um ein Atom in Verbindung 63 führte ebenso zu einer

Verschlechterung der uPA-Inhibition wie auch der Austausch der Adamantylgruppe

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2. Urokinase Inhibitoren 37

durch einen Phenylring (Verbindung 77, Ki=29 µM). Der zu Verbindung 77 analoge

Thioharnstoff (55) hemmt uPA nicht-kompetitiv (allosterisch) bei einer

Konzentration von 1 µM, während Trypsin mit Ki=37 µM kompetitiv gehemmt

wird. Diese Beispiele zeigen gut, wie wichtig jedes einzelne Atom eines kleinen

Inhibitors für eine hohe Affinität zum Enzym sein kann.

Die Analyse aller durchgeführten Derivatisierungen ergab folgende Ergebnisse (

Abbildung 11):

NH

NHNH2

NHO

NH

wichtigsehrwichtig

wichtig

essentiell

kann ersetztwerden

Abbildung 11: Analyse des Inhibitors 75, basierend auf den durchgeführten

Derivatisierungen

• Die 4-Guanidino-Benzyleinheit ist essentiell für die Bindung in der S1-Tasche

und läßt keine Veränderungen zu

• Der anschließende Harnstoff ist für gute Inhibitionskonstanten wichtig; das

Ersetzen einzelner Atome in dieser Gruppe und die damit verbundene

Abnahme der uPA-Inhibition, stützt die Annahme, daß die Harnstoffgruppe

in drei Wasserstoffbrücken involviert ist.

• Die Art und Größe der hydrophoben Gruppe (hier Adamantan) spielt eine

untergeordnete Rolle – durch andere Derivate mit Wasserstoffbrücken-

Donor/Akzeptoreigenschaften läßt sich die uPA-hemmende Wirkung des

Inhibitors eventuell noch verbessern

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2. Urokinase Inhibitoren 38

Tabelle 7: Optimierung des P2-Spacers durch Austausch einzelner Atome durchisostere Gruppen mit anderen Wasserstoffbrücken-Donor/Akzeptor-eigenschaften

Ki [µM]Nr. Formel

uPA Plasmin FXa Thrombin tPA

(36) NH

NHNH2

NHO

O 13 >1000 >1000 >1000 >1000

(58) NH

NHNH2

NHO

40 >1000 >1000 >1000 n. b.

(75) NH

NHNH2

NHO

NH 2,4 >1000 >1000 600 >1000

(62) NH

NHNH2

CH2O

NH

120 130 >1000 >1000 n. b.

(60) NH

NHNH2

NHS

NH >1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(77) NH

NHNH2

NHO

NH

29 170 >1000 >1000 >1000

(76) NH

NHNH2

NHO

NH 7,4 200 220 >1000 n. b.

(63) NH

NHNH2

NHO

102 460 >1000 >1000 n. b.

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2. Urokinase Inhibitoren 39

Ki [µM]Nr. Formel

uPA Plasmin FXa Thrombin tPA

(56)NH

NH

NH2NH

O

18 >1000 >1000 >1000 >1000

(78) NH

NHNH2

NHO

NHO

Cl37 180 >1000 >1000 n. b.

(55) NH

NHNH2

NHS

NH

nicht-

kompetitiv>1000 >1000 >1000 n. b.

Synthese des Inhibitors N-Adamantyl-N'-(4-Guanidinobenzyl)-Harnstoff (75)

Zur Synthese von N-Adamantyl-N'-(4-Guanidinobenzyl)-Harnstoff (Abbildung 12)

geht man vom kommerziell erhältlichen p-Aminobenzylamin aus. Im ersten Schritt

wird die Aminomethylgruppe mit tert-Butyloxycarbonyl geschützt (22).

Anschließend erfolgt die Umsetzung mit einem bis-Benzyloxycarbonyl-geschützten

Guanidinylierungsreagenz (Feichtinger, K. et al. 1998). Nach Abspaltung der Boc-

Schutzgruppe (23) wird das freie Amin mit Adamantylisocyanat zum

Adamantylharnstoff umgesetzt. Im letzten Schritt wird die Guanidinofunktion durch

katalytische Hydrierung an einem Pd-Katalysator entschützt um Inhibitor 75 zu

erhalten.

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2. Urokinase Inhibitoren 40

NH2

NH2

BOC2O (NH-Z)CF3SO2 N C(NH-Z)

NH

NH2

NH

N

Z

Z

H2/Pd/C

NHNH

N

Z

Z

NH

O

NH H

HH

NH2

NH

O

O *HCl

1.

2. 6M HCl/Dioxan

NHNH2

NH

NH

O

NH H

HH

1-Adamantylisocyanat/TEA

(75)

(23)(22)

Abbildung 12: Synthese des Inhibitors N-Adamantyl-N'-(4-Guanidinobenzyl)-

Harnstoff (75)

Röntgenkristallstruktur-Untersuchung des uPA/Inhibitor-75-Komplexes

In Kooperation mit der Arbeitsgruppe für Strukturforschung ist es gelungen die

rekombinant hergestellte uPA-B-Kette im Komplex mit Benzamidin zu

kristallisieren. Da Benzamidin ein schwacher uPA-Inhibitor ist, konnte es im

Kristall mittels der „Soaking“-Technik durch den Inhibitor 75 ersetzt werden.

Abbildung 13 zeigt die halbtransparente Oberflächendarstellung der

Röntgenstruktur von uPA im Komplex mit dem Inhibitor 75. Das Enzym ist in der

Standardorientierung für Serinproteasen abgebildet, das heißt die „Active-Site

Cleft“ verläuft von links nach rechts.

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2. Urokinase Inhibitoren 41

Abbildung 13: Halbtransparente Oberflächendarstellung des uPA/Inhibitor 75-

Komplexes

Wie erwartet bindet der Phenylguanidinteil in die S1-Tasche unter Ausbildung der

canonischen Salzbrücke zu Asp189. Die Harnstoffgruppe durchquert das katalytische

Zentrum und plaziert den sperrigen Adamantylrest in die S1'-Tasche.

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2. Urokinase Inhibitoren 42

Abbildung 14: Vergleich der Bindungsmodi des irreversiblen Inhibitors H-Glu-

Gly-Arg-Chloromethylketon (C-Atome in gelb) und des Inhibitors

75 (C-Atome in grün)

Wie oben erläutert, wurde der Inhibitor ursprünglich dahingehend entwickelt, daß er

die Taschen S1-S3 von uPA zur Bindung nutzt. Substratähnliche Inhibitoren wie

das in Abbildung 14 gezeigte Tripeptid-Chloromethylketon (C-Atome in gelb)

würden in diese Taschen binden. Der Inhibitor 75 (C-Atome in grün) durchquert in

unerwarteter Weise das aktive Zentrum und plaziert den hydrophoben Rest in die

S1’-Tasche. Dieser völlig neue Bindungsmodus ermöglicht es erstmals die

gestrichene Seite der „Active-Site“ für strukturbasierte Verbesserungen des

Inhibitors zu nutzen.

Das Schema in Abbildung 15 zeigt den experimentellen Bindungsmodus des

Inhibitors 75 in uPA.

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2. Urokinase Inhibitoren 43

NH

NH2

NH2

NH

O

NH

OO

+

-

O

H2O

Ala183

Asp189

OHO

O

Gly219

Ser190

H2O

O

Ser214

H2O

NH2

O

Gln192

SS

Cys58

Cys42NH

NHis57

NH

Gly193

BackboneGly 193Asp194Ser195

2.72Å

2.67Å

2.90Å

2.58Å

2.82Å

2.90Å

2.66Å

2.91Å

3.20Å

3.10Å

2.78Å

Abbildung 15: Bindungsmodus des Inhibitors 75 (blau) an uPA (wichtige Reste in

schwarz). Wasserstoffbrückenbindungen sind als rote, punktierte

Linien wiedergegeben.

Neben der canonischen Salzbrücke zu Asp189 ist die Guanidinofunktion noch in

zwei weitere Wasserstoffbrücken zu Gly219 O und der Seitenkette von Ser190

involviert. Interessanterweise binden die Stickstoffatome der Harnstoffgruppe über

Wassermoleküle einerseits zu Ser214 O und andererseits zur Seitenkette von Gln192.

Das Sauerstoffatom der Harnstoffgruppe formt eine starke Wasserstoffbrücke mit

Gly193 N. Wie bereits auf Seite 36 gezeigt, ist das Austauschen eines Atoms der

Harnstoffgruppe stets mit einem Verlust an Hemmwirkung des Inhibitors

verbunden. In Anbetracht der Tatsache, daß die Harnstoffgruppe in drei

Wasserstoffbrücken involviert ist, läßt sich dieser Befund sehr leicht erklären.

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2. Urokinase Inhibitoren 44

Die Adamantylgruppe ist an hydrophoben Wechselwirkungen beteiligt. Zum einen

mit den „Backbone“-Atomen zwischen Gly193 und Ser195, mit der Disulfidbrücke

zwischen Cys58 und Cys42 und schließlich mit der hydrophoben Ebene des

Imidazolrings von His57.

Der Inhibitor durchquert die „Active-Site“ ohne direkte Wechselwirkung mit den

katalytischen Resten Ser195 und His57. In der aktiven Konformation dieser Reste

wäre das Binden des Inhibitors im gefundenen Bindungsmodus aus sterischen

Gründen nicht möglich. Um die Bindung des Inhibitors dennoch zu ermöglichen,

müssen die Seitenketten von Ser195 und His57 eine andere Konformation einnehmen.

Abbildung 16: Umordnung der „Active-Site“-Reste His57 und Ser195 durch die

Bindung von Inhibitor 75. (violett: aktive Konformation der

katalytischen Triade; grün: umgeordnete Konformation während

der Bindung des Inhibitors 75)

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2. Urokinase Inhibitoren 45

In violett ist in Abbildung 16 die natürliche, aktive Anordnung der katalytischen

Triade dargestellt, wie man sie auch in der Röntgenstruktur von uPA im Komplex

mit Benzamidin vorfindet. Der Imidazolring von His57 bildet Wasserstoffbrücken-

Bindungen zu Asp102 und Ser195.

Während der Bindung des Inhibitors 75 werden diese Reste nun aus Platzgründen

umgeordnet, wie in Abbildung 16 in gün dargestellt. Dabei wird das ursprüngliche

Netz aus Wasserstoffbrücken zerstört. Um den damit verbundenen energetischen

Verlust wenigstens teilweise zu kompensieren, wird ein Wassermolekül neu in die

Struktur eingefügt. Dieses Wassermolekül ist nahezu perfekt tetraedrisch zwischen

Ser195, His57, Asp102 und Ser214 koordiniert.

Die hier beobachtete Umordnung zeigt ganz klar die Grenzen der heutigen

Modellingprogramme, die solche Adaptionen des Enzyms nicht berücksichtigen

können. Deshalb war es auch nicht möglich, den gefundenen Bindungsmodus mit

dem Computerprogramm FlexX vorherzusagen.

Diskussion der Selektivität des Inhibitors 75

Wie aus Tabelle 8 hervorgeht, besitzt der Inhibitor eine sehr hohe Selektivität. Die

wichtigsten Enzyme der Blutgerinnungskaskade sowie tPA und Plasmin, die für die

Fibrinolyse notwendig sind, werden von diesem Inhibitor nicht beeinflußt.

Wodurch die hohe Selektivität für uPA zustande kommt, ist aber trotz gelöster

Röntgenkristallstruktur nicht einfach zu verstehen. Im Falle von Thrombin, FXa

und tPA ist Ser190 durch Ala ersetzt (siehe Abbildung 15). Dadurch kann in diesen

Enzymen die Wasserstoffbrücken-Bindungskapazität der Guanidinogruppe nicht

vollständig abgesättigt werden. Desweiteren ist in Thrombin (Bode, W. et al. 1989)

und FXa (Padmanabhan, K. et al. 1993) die S1'-Tasche durch die Seitenketten von

Lys60F bzw. Gln61 kleiner als in uPA. In tPA befinden sich die geladenen

Seitenketten von Arg39 und Glu60A nahe an der S1'-Tasche, und würden die

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2. Urokinase Inhibitoren 46

hydrophoben Wechselwirkungen der Adamantylgruppe stören. Aus sterischen

Gründen wäre auch die notwendige Umorientierung des His57 (siehe Seite 44) in

Thrombin, FXa und tPA stark gehindert. Die synergistische Wirkung aller dieser

und wahrscheinlich noch weiterer kleiner Unterschiede, wird also letztlich zur

beobachteten hohen Selektivität des Inhibitors 75 beitragen.

Tabelle 8: Inhibitionskonstanten von Inhibitor 75 für verschiedene Serinproteasen

Ki [µM]Inhibitor

uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin tPA TryptasePlasma-

KallikreinFXIIa

75 2,4 >1000 >1000 600 46 >1000 400 >1000 >1000

Strukturbasierte Vorschläge zur Verbesserung der Leitstruktur 75

Die genaue Kenntnis des Bindungsmodus des Inhibitors 75 wird in Zukunft die

Optimierung dieser Leitstruktur stark vereinfachen. In diesem Kapitel sollen einige

Verbesserungsvorschläge vorgestellt werden, die wahrscheinlich eine stärkere

Bindung des Inhibitors zum Enzym ermöglichen würden und somit die

Inhibitionskonstante verbessern könnten (Abbildung 17).

• Optimierung der hydrophoben Wechselwirkungen in der S1'-Tasche:

Insbesondere die hydrophobe Wechselwirkung mit der Disulfidbrücke

zwischen Cys58 und Cys42 dürfte sich durch Einführung eines

Chlorsubstituenten im Adamantylrest deutlich verbessern lassen.

• Optimierung von Wasserstoffbrückenbindungen in des S1'-Tasche:

Südöstlich der Adamatylgruppe befindet sich im Kristall ein

Wassermolekül, das zwischen Tyr151 Oγ, Val41 O und Tyr40 O dreifach

koordiniert und somit in der Elektronendichte gut definiert ist. Durch einen

Hydroxymethl-Substituenten am Adamantylrest, ließe sich dieses

Wassermolekül aus der Struktur verdrängen und die Hydroxyfunktion wäre

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2. Urokinase Inhibitoren 47

anschließend nahezu perfekt tetraedrisch koordiniert. Anstelle der

Hydroxymethl-Gruppe könnte z. B. auch eine Carbonsäureamidfunktion

verwendet werden.

• Optimierung der Wasserstoffbrücken-Bindungen der Harnstoffgruppe:

Wie in Abbildung 15 dargestellt, binden die Stickstoffatome des bis-

substituierten Harnstoffs über Wassermoleküle an Ser214 O und an die

Seitenkette von Gln192. Durch Substitution der Harnstoff-Stickstoffatome

mit Hydroxyethylfunktionen, ließen sich zwei direkte Wasserstoffbrücken

zwischen dem Inhibitor und dem Enzym verwirklichen, die eine höhere

Bindungsstärke bewirken als die beiden wasservermittelten Bindungen.

Beispiele für die Realisierung eines solchen Inhibitors sind in Abbildung 17 und 18

zusammengefaßt.

NH

NH2

NH2

O

Cl

OH

OH

OH

OO

+

-

Asp189

OHO

O

Gly219

Ser190

O

Ser214NH2

O

Gln192

SS

Cys58

Cys42NH

NHis57

NH

Gly193

2.72Å

2.67Å

2.90Å 2.90Å

2.78Å

OH

Tyr151

O

O

Tyr40

Val41

Abbildung 17: Möglicher Bindungsmodus eines strukturbasiert verbesserten

Inhibitors (Änderungen sind in grün dargestellt)

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2. Urokinase Inhibitoren 48

NH

NHNH2

N

O

Cl

NH2

NH2

OH

O

O NH

NHNH2

O

HHH

Cl

NH2

NH2

OH

O

O

NH

NHNH2

O

NH2

OH

O

NH2

O

Abbildung 18: Weitere Strukturvorschläge für Inhibitoren mit verbesserten

Bindungseigenschaften

Untersuchung der Toxizität des Inhibitors 75

Die Zytotoxizität des Inhibitors wurde für drei verschiedenen Krebszellinien

bestimmt, indem steigende Inhibitorkonzentrationen zusammen mit den Zellen

inkubiert wurden und anschließend die Lebensfähigkeit der Zellen bestimmt wurde.

Die abgebildeten Kurven (Abbildung 19) repräsentieren die Ergebnisse nach 48 h

Inkubation, wobei sich nach 24 bzw. 72 h aber sehr ähnliche Resultate ergaben.

Dies bedeutet, daß bestimmte Inhibitorkonzentrationen toxisch wirken, die

Inkubationszeit hingegen scheinbar keinen Einfluß auf die Toxizität einer

bestimmten Konzentration hat. Für zwei Zellinien (MDA-MB-231 und OV-MZ-6)

war der Inhibitor bis zu einer Konzentration von 250 µM nicht toxisch.

Interessanterweise beeinflußte diese Konzentration bereits die Überlebensrate der

Keratinozyten-Krebszellinie A431. Auf jeden Fall liegen die toxischen

Konzentrationen aber 50- bis 100-fach über den Inhibitionskonstanten, was einen

großen therapeutischen „Spielraum“ für Tierexperimente schafft.

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2. Urokinase Inhibitoren 49

0,00

0,04

0,08

0,12

0,16

0,20

0 1 5 10 15 20 50 100

250

500 750 1000

Inhibitor-Konzentration [µM]

Abs

orpt

ion

[560

-640

nm

]

MDA-MB-231 OV-MZ-6A431 Puffer Kontrolle

Abbildung 19: Effekt des Inhibitors 75 auf die Zellproliferation. Die

Pufferkontrolle ist nur für OV-MZ-6-Zellen dargestellt

Pharmakokinetische Charakterisierung

Ein guter Anhaltspunkt für die orale Bioverfügbarkeit einer Substanz ist der

Verteilungskoeffizient zwischen Oktanol und Wasser. Eine sehr gute orale

Aufnahme erhält man normalerweise wenn der Logarithmus des

Verteilungskoeffizienten (logPOktanaol/Wasser) etwa +2 ist. In Übereinstimmung mit der

bei physiologischem pH positiv geladenen

Guanidinogruppe entspricht der Logarithmus des

Verteilungskoeffizienten der Verbindung 75 einem

Wert von –1,3 (experimentell mittels HPLC

bestimmt). Dies bedeutet, daß die orale

Bioverfügbarkeit des Inhibitors wahrscheinlich

eher schlecht ist, sofern keine aktiven

Transportsysteme für diese Verbindung existieren.

SO

NH

O

O

NH

O N

NH2 NHNAPAP

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2. Urokinase Inhibitoren 50

Für Clearance-Studien wurde der Inhibitor intravenös in Ratten appliziert. Die

Dosis betrug 1 mg/kg. Wie in Abbildung 20 dargestellt, wird der Inhibitor 75 sehr

rasch aus der Blutzirkulation eliminiert. Die Eliminationsrate ist vergleichbar mit

der Eliminationsrate des bekannten Thrombin-Inhibitors NAPAP (siehe

Formelzeichnung) der ebenfalls eine basische Gruppe und einen hydrophoben Rest

besitzt. Leider liegen noch keine Ergebnisse bezüglich des Eliminationsweges oder

in Bezug auf den Metabolismus der Verbindung 75 vor.

Abbildung 20: Plasma-Elimination des Inhibitors 75 nach intravenöser

Applikation von 1 mg/ml in Ratten

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3. Faktor Xa Inhibitoren 51

3. Faktor Xa Inhibitoren

3.1. Die Blutgerinnungskaskade: ein therapeutischer Ansatz bei

Thromboseerkrankungen

Die Blutgerinnung hat eine Notfallfunktion: größere Blutverluste sollen bei

Gefäßverletzungen vermieden werden. Der Hauptvorgang dieser Gerinnung besteht

darin, daß lösliches Fibrinogen (Faktor I) in unlösliches Fibrin überführt wird, das

anschließend durch Faktor XIIIa zu einem festen Fibringerinsel vernetzt wird.

Hierfür ist ein proteolytischer Katalysator, das Thrombin, notwendig. Durch

Proteolyse wird das Zymogen Prothrombin (Faktor II) in Thrombin umgewandelt.

Diese Aktivierung wird von Faktor Xa (FXa, andere Namen: Plasma-

Thrombokinase, Plasma-Thromboplastin, Stuart-Power-Factor, Autoprothrombin

C) katalysiert. FXa seinerseits wird wiederum durch proteolytische Spaltung aus der

inaktiven Vorstufe Faktor X gebildet. Die komplette Kaskade der einzelnen

Aktivierungsschritte, die letztendlich zur Bildung von Fibrin führt ist in Abbildung

21 dargestellt.

Man unterscheidet zwei unterschiedliche Aktivierungskaskaden die letztlich bei der

Aktivierung von FX zusammenlaufen. Beim intrinsischen System beginnt die

Blutgerinnungskaskade intravasal durch Kontaktaktivierung von FXII an

„Rauhigkeiten“ der endothelialen Auskleidung der Gefäße. Der extrinsische

Aktivierungsprozeß beruht hingegen auf der Freisetzung von FIII („tissue factor,

TF) aus dem endoplasmatischen Retikulum beschädigter oder zestörter

Gewebszellen. Die extrinsische Aktivierungskaskade läuft somit nach einer

Verletzung der Blutgefäße ab, aber auch bei einem Herzinfarkt oder anderen

pathologischen Zuständen (z. B. Entzündung oder Blutvergiftung) wird FIII

freigesetzt. Nach Bindung von FVII an den freigesetzten TF wird FVIIa durch

Autoaktivierung oder durch Proteolyse (Thrombin, FXa, FXIIa) erzeugt. Da beide

Enzymkaskaden bei der Aktivierung von FX zusammenlaufen, spielt der

entstehende FXa eine zentrale Rolle innerhalb des Blutgerinnungssystems.

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3. Faktor Xa Inhibitoren 52

Faktor XI Faktor XIa

+

Faktor IX Faktor IXa

Ca2+

+

Faktor X Faktor XaCa

2+ +Faktor VIIIa, PL,

+

Prothrombin ThrombinCa

2+ +Faktor Va, PL,

+

+

Fibrinogen Fibrin

Faktor XIIIa

Fibrin(quervernetzt)

+

OberflächeFaktor XIIHMW-KininogenPrekallikrein

+

+

Faktor VIIa Faktor VII

Faktor IX

Faktor X

+

+ PL

+ Faktor III, PL

ThrombinFaktor XaFaktor XIIa

+

+Aktivierung

Co-Faktoren

Legende:

Intrinsischer Weg Extrinsischer Weg

Spaltprodukte

-

+

Plasminogen Plasmin

uPA,tPA

- Abbau FIBRINOLYSE

BLUTGERINNUNG

PL: Phospholipid

Abbildung 21: Die Blutgerinnungskaskade

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3. Faktor Xa Inhibitoren 53

Die Synthese der Zymogene Prothrombin, FXII, FIX und FX ist Vitamin-K

abhängig. Sie enthalten γ-Carboxyglutaminsäurereste (Gla) die zusammen mit

Calciumionen die funktionelle Gla-Domäne bilden und sich dadurch an

Phospholipidmembranen anheften können. Bei Vitamin-K-Mangel kann die

zusätzliche γ-Carboxylgruppe nicht in vorhandene Glutaminsäurereste eingebaut

werden. Nach ihrer

Aktivierung sind die

Proteasen ohne Gla-Reste

viel weniger aktiv als jene

mit funktioneller Gla-

Domäne. In diesen

Mechanismus greifen die

oral wirksamen Vitamin-K-

Antagonisten Dicumarol,

Warfarin, Acenocoumarin

und Phenocumaron

(Abbildung 22) ein (Gulba,

D. C. 1996). Allerdings sind bei der Behandlung mit diesen Wirkstoffen auch viele

andere Proteasen betroffen, so daß eine Dauerbehandlung von Patienten nur unter

ständiger ärztlicher Kontrolle möglich ist. Die Anwendung beschränkt sich daher

auf die Prophylaxe nach akuten thrombotischen Ereignissen (Glusa, E. et al. 1996).

Ein weiterer Nachteil der Coumarin-Derivate ist der um 24 bis 36 h verzögerte

Wirkungseintritt nach Behandlungsbeginn, sowie die sich erst nach einigen Tagen

wieder einstellende Normalisierung des Blutgerinnungssystems nach Absetzen des

Medikaments.

Bestehende Blutgerinsel werden durch Plasmin wieder aufgelöst. Zur Fibrinolyse

bei akuten Thrombosen werden deshalb tPA oder andere Plasminogenaktivatoren

intravenös verabreicht (siehe Abbildung 21 unten).

O

OH

O O

OH

O O O

O

OH

O O

OH

O O

OH

NO2

O

Dicumarol Warfarin

Acenocoumarin Phenocoumaron

Abbildung 22: Vitamin-K-Antagonisten als oralwirksame Antikoagulantien

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3. Faktor Xa Inhibitoren 54

3.2. Natürliche und synthetische FXa Inhibitoren

Die Blutgerinnungskaskade ist ein hochreguliertes System. Bis auf FVIIa werden

alle aktiven Gerinnungsenzyme durch das Glykoprotein Antithrombin III (ATIII)

inhibiert. Durch Heparin wird die ansonsten langsam verlaufende Bildung des

Enzym-Inhibitor-Komplexes zwischen ATIII und FXa stark beschleunigt. Heparin

fördert also indirekt die Inhibition der Gerinnungsenzyme. „Low-Molecular-

Weight“-Heparin führt zur selektiven Inhibition von FXa, da nur die Bildung des

ATIII-FXa-Komplexes beschleunigt wird, während es keinen Einfluß auf die

Inhibition der anderen Gerinnungsenzyme ausübt.

Weitere gerinnungshemmende Enzyme sind Protein C und Protein S. Durch

proteolytische Spaltung inaktiviert Protein C die Blutgerinnungsfaktoren FV und

FVIII, so daß die Blutgerinnungskaskade und damit die Thrombinproduktion

unterbrochen wird. Protein S ist ein Co-Faktor von Protein C.

Selektive FXa-Inhibitoren konnten auch im Speichel hämatophager Tiere gefunden

werden (Dodt, J. 1995; Markwardt, F. 1996). Hierzu gehören:

• Antistasin (ATS)

aus dem Mexikanischen Blutegel Haementeria officinalis, [119 Aminosäuren,

auch rekombinante Form (rATS), Ki=43 pM, kein Effekt auf Thrombin]

(Dunwiddie, C. T. et al. 1993; Hauptmann, J. et al. 1993)

• Tick Anticoagulant Peptide (TAP)

aus der Weichzecke Ornithodoros moubata, [60 Aminosäuren auch

rekombinante Form (rTAP), Ki=200 pM, Selektivität (FXa/Thrombin): 90000]

(Dunwiddie, C. T. et al. 1993)

• Yagin

aus dem Blutegel Hirudo medicinalis (Rigbi, M. et al. 1996) [133

Aminosäuren, auch rekombinant hergestellt, Halbwertszeit in Pavianen mehr

als 2 h, in einem Hasen-Thrombosemodell war Yagin als Zusatz zur tPA-

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3. Faktor Xa Inhibitoren 55

Thrombolyse dem Einsatz von Hirudin oder Heparin überlegen (Kornowski,

R. et al. 1996)]

• Draculin

aus der Vampirfledermaus Desmodus rotundus (Apitzcastro, R. et al. 1995)

• „Ancylostoma Caninum Anticoagulant Peptide“ (AcAP)

aus dem Hakenwurm Ancylostoma caninum (Cappello, M. et al. 1995)

• FXa Hemmstoff der Gelbfiebermücke

aus den Weibchen der Gelbfiebermücke Aedes aegypti. Da die männlichen

Mücken kein Blut saugen, produzieren sie auch den FXa-Inhibitor nicht

(Stark, K. R. et al. 1995).

Wegen der zentrale Rolle von Thrombin in thrombotischen Erkrankungen, war

dieses Enzym über Jahrzehnte das Hauptziel in der Inhibitor-Entwicklung zur

antithrombotischen Therapie. Obwohl Heparin lange Zeit der Thrombin-Hemmstoff

der Wahl war, hat es doch einige Nachteile. Hierzu gehört die geringe Effektivität in

der Inhibition von Thrombin das an Blutgerinsel gebunden ist, wie auch die oftmals

auftretenden und nicht-akzeptierbaren Blutungen. Inzwischen wurden

hochwirksame, synthetische Thrombinhemmstoffe entwickelt. Doch auch mit

diesen Verbindungen zeigt sich die Tendenz von Blutungskomplikationen,

insbesondere in Verbindung mit einer Antikoagulationstherapie mittels tPA

(Antman, E. M. 1996; Philippides, G. J. et al. 1996; Zeymer, U. et al. 1995). Ein

weiterer und entscheidender Nachteil von Thrombininhibitoren ist, daß sie die

kontinuierliche Produktion von Thrombin aus Prothrombin nicht verhindern

können, und deshalb sehr hohe Konzentrationen dieser Inhibitoren nötig sind.

Im Gegensatz dazu inhibieren FXa-Inhibitoren gerade diese Nachproduktion von

Thrombin, wobei aber immer ein Mindestlevel an Thrombin für die primäre

Blutgerinnung zu Verfügung steht.

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3. Faktor Xa Inhibitoren 56

In den vergangenen Jahren ist eine Vielzahl von synthetischen FXa-Inhibitoren

entwickelt worden. Einige dieser Substanzklassen sind in Tabelle 9

zusammengefaßt. Bei einer genaueren Betrachtung der Strukturen lassen sich drei

unterschiedliche Entwicklungsrichtungen feststellen:

1. Inhibitoren mit zwei basischen Gruppen

2. Inhibitoren mit einer basischen Gruppe

3. Inhibitoren, die ohne stark basische Gruppe aktiv sind

Wie in Kapitel 1.3 beschrieben, besitzt FXa neben der sauren S1-Tasche noch eine

weitere, negativ geladene Bindungsstelle am Ausgang der S4-Tasche. Diese beiden

Bindungsstellen werden von den bis-basischen Inhibitoren adressiert. Die wohl

bekanntesten Vertreter dieser Inhibitorklasse sind die Daiichi-Verbindung DX-

9065a sowie das symmetrische bis-Benzamidin BABCH. Der große Nachteil dieser

Verbindungen sind die beiden sehr basischen Gruppen und die damit verbundene

schlechte orale Bioverfügbarkeit.

Zur zweiten Gruppe gehören die Verbindungen „Tenstop“ (Tosyl-Glycyl-(3-

Amidino)-Phenylalanin-Methylester) und die Verbindung der Firma Berlex

Biosciences. Letztere wurde in einem aufwendigen parallelsynthetischen Verfahren

aus der Verbindung Tenstop entwickelt.

Wegen der besseren Bioverfügbarkeit wurden bei Zeneca und Rhône-Poulenc

Rhorer Verbindungen entwickelt, die ohne basische Amidino- oder Guanidino-

funktionen auskommen und trotzdem sehr gute Inhibitionkonstanten besitzen.

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3. Faktor Xa Inhibitoren 57

Tabelle 9: Synthetische FXa-Inhibitoren

Inhibition [Ki]Struktur und Name

FXa ThrombinLiteratur

N

NH2

NH

OH O

O

NH

Daiichi DX-9065a

0,041 µM > 2000 µM

(Hara, T. et al. 1995;Herbert, J. M. et al.1996; Katakura, S. etal. 1993; Katakura, S.et al. 1995)

NH

S

O OO

O

NH O

NH

NH2

Tenstop

0,84 µM 66 µM (Stürzebecher, J. et al.1989)

O

NH

NH2 NH2

NH

BABCH

0,013 µM 3,8 µM (Wagner, G. et al.1977)

O

NH2

NHO

NH

NH2

DABE

0,57 µM 14,9 µM(Tidwell, R. R. et al.1978; Tidwell, R. R. etal. 1980)

NNH

NH2

NSO

O

O

NH

COOH

Yamanouch Pharma. YM-60828

1,3 nM >100 µM

(Kawasaki, T. et al.1998; Sato, K. et al.1997; Taniuchi, Y. etal. 1998)

NH2

NH

N SO2NH2MeOOC

DuPont Pharmaceuticals

1,3 nM 200 nM (Fevig, J. M. et al.1998)

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3. Faktor Xa Inhibitoren 58

InhibitionSynthetische FXa-Inhibitoren

FXa ThrombinLiteratur

NH

NH2

NH

O

OO

O

O

Hoffmann-LaRoche

0,03 µM 4,7 µM (Klein, S. I. et al.1998)

NH

NH2

O

O

NH2

NH

DuPont Merck

34 nM 1200 nM (Maduskuie, T. P. etal. 1998)

Cl

SN

O O

N

O

N

N

Zeneca

3 nM 50 µM (Faull, A. W. 1996)

N

N

N

NMe

COOHF F

O OOH

NH2

NHMe

Berlex Biosciences

0,11 nM 2000 nM (Buckman, B. O. et al.1998)

NN

NH2

NH2

O

NH

S NO O

Rhône-Poulenc Rhorer

6 nM >4µM(Becker, M. R. et al.1999; Choi-Sledeski,Y. M. et al. 1999)

Page 70: Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der Serinpro · Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der Serinproteasen uPA und FXa Neuartige Wirkstoffe zur anti-metastatischen

3. Faktor Xa Inhibitoren 59

3.3. Zielsetzung

Nachdem man erkannte, daß die direkte Hemmung von Thrombin zu nicht-

tollerierbaren Nebenwirkungen (z. B. schweren Blutungen) führen kann, fand die

Entwicklung selektiver FXa-Inhibitoren als antithrombotische Arzneistoffe in den

letzten Jahren zunehmendes Interesse. Ziel dieser Arbeit war es, durch Verkürzung

des N-terminalen Restes des FXa-Inhibitors „Tenstop“ (siehe Tabelle 9) auf der

Basis von N-Urethanyl-(3-Amidino)-Phenylalanin neue Leitstrukturen für FXa-

Inhibitoren zu entwickeln. Die Röntgenstruktur von FXa war in nicht-komplexierter

Form (Padmanabhan, K. et al. 1993), sowie im Komplex mit dem reversiblen

Inhibitor DX-9065a bekannt (Brandstetter, H. et al. 1996). Desweiteren gab es eine

Röntgenkristallstruktur des Trypsin/„Tenstop“-Komplexes (Renatus, M. et al.

1998), in der der Inhibitor einen substratähnlichen Bindungsmodus einnimmt sowie

eine Trypsin/Inhibitor-Komplexstruktur mit einem von Tenstop abgeleiteten bis-

basischen Inhibitor (Gabriel, B. et al. 1998).

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3. Faktor Xa Inhibitoren 60

3.4. Ergebnisse und Diskussion

3.4.1. Inhibition von FXa und verwandten trypsin-ähnlichen Serinproteasen

In Tabelle 10 sind die Inhibitionskonstanten der untersuchten 3- bzw. (4-Amidino)-

Phenylalanin-Derivate gegenüber FXa, uPA, Thrombin und Trypsin aufgelistet. Die

Präferenz von FXa für 3-Amidino- gegenüber (4-Amidino)-Phenylalanin-Derivaten

steht im Einklang mit früheren Beobachtungen (Gabriel, B. et al. 1998; Kunitada, S.

et al. 1996; Maduskuie, T. P. et al. 1998). Interessanterweise erfüllt das (4-

Guanidino)-Phenylalanin-Derivat (15) offensichtlich nicht die sterischen Ansprüche

an einen P1-Rest für FXa, so daß keine Inhibition meßbar war. Im Vergleich zum

(4-Amidino)-Phenylalanin-Derivat (93) tritt dieser Verlust an inhibitorischer

Aktivität ebenso bei uPA, Thrombin und Trypsin auf. Die Verbindungen 87 und 89

(freie Säure bzw. Amid-Derivat) besitzen keinen signifikanten Unterschied in der

Inhibition von FXa. Dieses Ergebnis würde einen Bindungsmodus ähnlich dem des

Inhibitors DX-9065a vorhersagen (Brandstetter, H. et al. 1996; Renatus, M. et al.

1998), bei dem die Carboxylatgruppe in den Lösungsmittelraum steht und keine

Wechselwirkung mit dem Enzym eingehen kann. Allerdings wiederspricht dieser

Theorie die signifikant verbesserte Inhibitionskonstante des Methylester-Derivats

(84), die eine zusätzliche Wechselwirkung des Esters in der Nähe der S1-Tasche

nahelegt.

Als mögliche S3/S4-Interaktionspartner wurden verschiedene hydrophobe Gruppen

getestet. Ein Vergleich der tert-Butyl-Gruppe (81), mit der planaren 9-

Fluorenylmethyl- (83) oder Benzyl-Gruppe (110) zeigt eindeutig eine Bevorzugung

der sterisch anspruchsvollen und nicht-aromatischen Adamantylgruppe (84). Diese

Verbindung hemmt FXa im submikromolaren Bereich (Ki=0,62 µM) und besitzt

eine vergleichsweise hohe Selektivität gegenüber uPA (Ki=44 µM), Thrombin

(Ki=2,9 µM), Trypsin (Ki=6 µM), Plasmin (Ki=38 µM), tPA (Ki=200 µM), Tryptase

(Ki=28 µM), Plasma Kallikrein (Ki=18 µM) und FXIIa (Ki>1000 µM). Um die

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3. Faktor Xa Inhibitoren 61

Rolle der Urethangruppe als potentiellen Wasserstoffbrückenakzeptor zu

analysieren, wurde sie durch den isosteren Harnstoff (85) ausgetauscht. Während

diese Substitution nahezu keinen Einfluß auf die Inhibition von FXa hat, steigert sie

doch die Selektivität des Inhibitors insbesondere gegenüber uPA entscheidend.

Tabelle 10: Struktur-Wirkungsbeziehung von Urethanylderivaten des 3/4-Amidino-Phenylalanins

NH

O

R2R1

R3

Ki [µM]Nr. R1 R2 R3

FXa uPA Thrombin Trypsin

(81)O

OOMe 3-Amidino 16 36 10 13

(105)O

ON

Me

OMe3-Amidino 16 79 6,7 35

(106)O

OL-Pro-OBz 3-Amidino 14 96 3,2 9,8

(108)O

OD-Pro-OBz 3-Amidino 14 > 1000 0,72 11

(107)O

OL-Pro-OH 3-Amidino 69 > 1000 66 > 1000

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3. Faktor Xa Inhibitoren 62

Ki [µM]Nr. R1 R2 R3

FXa uPA Thrombin Trypsin

(109)O

OD-Pro-OH 3-Amidino 52 > 1000 49 80

(83)O

OOMe 3-Amidino 3,4 140 12 12

(110) OO N 3-Amidino 33 120 5,2 9,7

(89)O

O N 3-Amidino 1,7 49 1,6 9,5

(87)O

O OH 3-Amidino 2,1 > 1000 86 39

(84)

O

O OMe 3-Amidino 0,62 44 2,9 6,0

(93)

O

O OMe 4-Amidino 1,4 47 0,32 12

(85)O

NH OMe 3-Amidino 0,90 > 1000 12 17

(15)O

O OMe 4-Guanidino > 1000 200 85 > 1000

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3. Faktor Xa Inhibitoren 63

3.4.2. Synthese von 3- und (4-Amidino)-Phenylalanin-Derivaten

Die allgemeine Synthese der Amidino-Phenylalanin-Derivate ist in Abbildung 23

für N-Adamantyloxycarbonyl-(3-Amidino)-Phenylalanin-Methylester beschrieben.

NH2

O

OH

CN

BOC2O

NH

O

OH

CN

O

O NH

O

OHO

O

NH2 NOH

H2NOH

KOH / EtOH

NH

O

OHO

O

NH2 NH

H2 / Pd

6M HCl/Dioxan MeOH/HCl

pH 2,5

NH

O

OO

NH2 NH

OMeNH2

O

NH2 NH

OMe

Adoc-F

H

H

HNH

O

OMeO

O

NH NH2

(79)

(80)(81)(82)

(84)

Abbildung 23: Synthese der Amidinophenylalanin-Derivate

Kommerziell erhältliches (3-Cyano)-Phenylalanin (Senn Chemicals, Dielsdorf,

Schweiz) wurde zunächst nach Standardmethoden N-terminal mit tert-

Butyloxycarbonyl geschützt (79). Die Umsetzung mit Hydroxylamin, gefolgt von

katalytischer Hydrierung zum Amidin (80) erfolgte nach einer leicht abgewandelten

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3. Faktor Xa Inhibitoren 64

Vorschrift von Stüber und Mitarbeitern (Stüber, W. et al. 1995). Der Methylester

(81) wurde durch Lösen in Methanol mit katalytischen Mengen an HCl innerhalb

von 2 Tagen erhalten. Nach Abspaltung der Boc-Schutzgruppe in 6M HCl/Dioxan

(82), konnten weitere N-terminale Derivatisierungen vorgenommen werden. Da sich

manche Reaktionen wegen der ungeschützten Amidinofunktion (z. B. die

Kupplungen zum Piperidid 89 oder zum Weinrebamid 105) auf der Stufe des

Amidins 80 nicht ohne größere Mengen an Nebenprodukten durchführen ließen,

wurden diese Reaktionen bereits auf der Stufe des Cyanophenylalanins 79

durchgeführt und die Amidinofunktion erst im letzten Syntheseschritt aufgebaut.

3.4.3. Röntgenstrukturanalyse des FXa-Inhibitors 84 im Komplex mit Trypsin

und Modelling-Experimente

Alle trypsinartigen Serinproteasen besitzen eine sehr ähnliche Tertiärstruktur,

unterscheiden sich aber maßgeblich in ihrer Aminosäuresequenz (siehe Kapitel 1.2).

Diese Tatsache legt einen vergleichbaren Bindungsmodus eines Inhibitors in allen

verwandten Enzymen nahe. Tatsächlich konnte der Bindungsmodus einiger FXa-

Inhibitoren auch im Komplex mit Trypsin vorhergesagt werden (Gabriel, B. et al.

1998; Renatus, M. et al. 1998; Stubbs, M. T. et al. 1995). Der gleiche Ansatz wurde

zuvor bereits für Thrombin-Inhibitoren beschrieben (Banner, D. W. et al. 1991;

Bode, W. et al. 1990; Brandstetter, H. et al. 1992; Matsuzaki, T. et al. 1989; Turk,

D. et al. 1991). Da Trypsinkristalle wesentlich leichter zu erhalten sind als FXa-

Kristalle, stellt diese Vorgehensweise eine vielversprechende Alternative zur

Bestimmung des Bindungsmodus in FXa dar.

Da die racemische Verbindung 84 mit einer Inhibitionskonstante von 6 µM noch

ausreichend Affinität zu Trypsin besitzt, konnte die Röntgenkristallstruktur dieser

Verbindung im Komplex mit Trypsin gelöst werden. Hierzu wurden mit

Benzamidin komplexierte Trypsinkristalle (Stubbs, M. T. et al. 1995) in einer

Lösung des Inhibitors 84 „gesoakt“, wodurch Benzamidin durch den besseren

Inhibitor verdrängt wurde. In Abbildung 24 ist der gefundene Bindungsmodus

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3. Faktor Xa Inhibitoren 65

dargestellt. Die 2FoFc Elektronendichtekarte war besonders für die

Benzamidingruppe sehr gut definiert. Neben der erwarteten canonischen Salzbrücke

zur Asp189-Seitenkette am Boden der S1-Tasche, gibt es zwei

Wasserstoffbrückenbindungen zu Ser190 O und Gly219 O. Außerhalb der S1-Tasche

war die Elektronendichte weniger gut definiert und ließ dadurch eine eindeutige

Bestimmung der Chiralität des Amidino-Phenylalanins nicht zu. Die Region des

Adamantylrestes war jedoch wieder klar definiert. Die Strukturverfeinerung wurde

deshalb sowohl mit dem L- bzw. D-Enantiomer separat, als auch durch Behandlung

beider Enatiomere gleichzeitig („Occupancy Refinement“) durchgeführt. Das

Ergebnis dieser Verfeinerungszyklen unterstützt ein

Abbildung 24: Röntgenkristallstruktur des FXa-Inhibitors 84 (D-Enantiomer) im

Komplex mit Trypsin

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3. Faktor Xa Inhibitoren 66

gleichzeitiges Binden beider Enantiomere, wobei das D-Enantiomer aber etwas

bevorzugt zu sein scheint. Der Methylester-Sauerstoff des D-Enantiomers bildet

eine Wasserstoffbrücke mit Gly219 N, während das Stickstoffatom des Amidino-

Phenylalanins mit der Seitenkette des Cys220 interagiert. Die Adamantylgruppe

bindet südöstlich der „Active-Site Cleft“ in einer kleinen, hydrophoben Vertiefung,

die durch die Seitenketten der Reste Cys191, Cys220, Asn143, Gln192, Lys145 und Thr149

ausgebildet wird.

Die Überlagerung des Trypsin/Inhibitor Komplexes mit der katalytischen Domäne

von FXa schließt einen ähnlichen Bindungsmodus in FXa aus (Abbildung 25B).

Fakt ist, daß FXa im Gegensatz zu Trypsin in der entsprechenden Region keine

hydrophobe Vertiefung besitzt. Deshalb würde die Adamantylgruppe mit den

Seitenketten von Arg143, Glu147, Lys148 sowie Gln192 kollidieren. Da auf diesem

Wege keine Aussage über den Bindungsmodus des Inhibitors in FXa gemacht

werden konnte, wurden Docking-Experimente mit dem Computerprogramm FlexX

durchgeführt (Rarey, M. et al. 1996). Um die Performance des Programms zu

überprüfen, wurde der Inhibitor aus unserer Trypsin-Kristallstruktur entfernt, und

anschließend von FlexX wieder in die Struktur „gedockt“. Den höchsten Score (-

42,7) und damit die stärkste Bindung erhielt die Lösung für das D-Enantiomer die in

Abbildung 25C in violett dargestellt ist. FlexX sagt ein Binden des Adamantylrestes

in einer Vertiefung südwestlich der „Active-Site“ voraus. Die 6. Lösung (grün,

Score –41,6) entspricht allerdings dem in der Röntgenkristallstruktur gefundenen

Bindungsmodus. Mit dem L-Enantiomer war es nicht möglich den gefundenen

Bindungsmodus vorherzusagen.

Für Docking-Experimente an FXa wurde die Röntgenkristallstruktur des FXa/DX-

9065a-Komplexes (PDB-Code: 1FAX) (Brandstetter, H. et al. 1996) sowie die

unkomplexierte Struktur (PDB-Code: 1HCG) (Padmanabhan, K. et al. 1993)

verwendet. Paradoxerweise führt die Bindung des Inhibitors DX-9065a an FXa

verglichen mit der unkomplexierten Form zu einer Kontraktion der S1-Tasche.

Deshalb schlugen alle Versuche Verbindung 84 oder auch nur Benzamidin in die

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3. Faktor Xa Inhibitoren 67

1FAX-Struktur zu docken fehl. Im Gegensatz dazu war FlexX sehrwohl in der Lage

die Apoenzymstruktur 1HCG unter Ausbildung der canonischen Salzbrücke mit

Asp189 als Rezeptormolekül zu erkennen. In der Konformation mit dem höchsten

Score (D-Enantiomer, violett, Score –35,3) bindet die Adamantylgruppe

südwestlich der „Active-Site Cleft“ (Abbildung 25D). Dabei ist sie von den

Seitenketten von Trp215, Glu217 und Phe174 umgeben und somit südlich der S3/S4-

Region angesiedelt. Diese Vorhersage ist mit der besten Lösung für Trypsin

(Abbildung 25C) identisch. Im weiteren wurden allerdings sehr unterschiedliche

Lösungen mit vergleichbaren Score-Werten gefunden. Im Gegensatz dazu wurde

für das L-Enantiomer ganz klar eine Bindung der Adamantylgruppe in der S3/S4-

Region gefunden (Abbildung 25D, grau, Score -37). Dieser Bindungsmodus

entspricht dem der Leitstruktur „Tenstop“ in Trypsin (Renatus, M. et al. 1998) und

hebt sich von alternativen Lösungen durch eine hohe Score-Differenz ab (Score-

Cluster 2: -29,9). Die Adamantylgruppe ist von den hydrophoben Resten Tyr99,

Phe174 und Trp215 umgeben. Ein drittes Rezeptor-Modell wurde aus der Struktur

1FAX durch Anwendung einer einfachen Moleküldynamik-Rechnung gewonnen,

wodurch sich die S1-Tasche etwas aufweitete und somit das Docking ermöglichte.

Das Resultat war eine klare Vorhersage eines Bindungsmodus, bei dem die

Adamantylgruppe in der S1'-Tasche liegt (Abbildung 25D, grün, umgeben von

Cys42, Phe41 und Gln192). Dieser Bindungsmodus ähnelt sehr stark dem für den uPA-

Inhibitor 75 in der Röntgenkristallstruktur gefundenen Bindungsmodus (siehe Seite

40).

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3. Faktor Xa Inhibitoren 68

Abbildung 25: Experimenteller und modellierter Bindungsmodus des Inhibitors 84in Trypsin und FXa. Oberflächendarstellung von (A) Röntgenkristallstruktur desTrypsin/Inhibitor 84 Komplexes; (B) Überlagerung der Trypsin/84 Struktur auf dieStruktur von FXa; (C) Docking-Experimente mit Trypsin (violett: Lösung mithöchstem Score, D-Enantiomer; grün: 6. Lösung, Bindungsmodus analog demBindungsmodus in der Trypsin/Inhibitor 84 Kristallstruktur); (D) Ergebnisse derDocking-Experimente mit FXa (siehe Kapitel 3.4.3). Alle Bilder haben die gleicheOrientierung des Enzyms, mit der von links nach rechts verlaufenden „Active-SiteCleft“. Bereiche des Enzyms, die positive bzw. negative Ladungen aufweisen, sindblau bzw. rot eingefärbt. Die Abbildung wurde mit dem Programm GRASP erzeugt(Nicholls, A. et al. 1993)

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3. Faktor Xa Inhibitoren 69

3.4.4. Einfluß der Chiralität von Amidino-Phenylalanin-Derivaten auf die

Inhibition von FXa

Eine klare Unterscheidung zwischen dem D- und L-Enantiomer konnte weder in der

Röntgenstrukturanalyse des Trypsin/Inhibitor 84-Komplexes noch durch Docking-

Experimente erzielt werden. Deshalb wurden beide Enantiomere dieser Verbindung

synthetisiert. Die Inhibitionskonstanten des L-Enantiomers (Verbindung 94) sowie

des D-Enantiomers (95) sind in Tabelle 11 zusammengefaßt. Beide Enantiomere

werden etwa mit vergleichbarer Affinität von Trypsin erkannt, wobei das D-

Enantiomer etwas bevorzugt ist. Dieses Ergebnis stimmt sehr gut mit der

Röntgenstrukturanalyse der racemischen Verbindung 84 überein.

FXa wird jedoch durch das D-Enantiomer 95 (Ki=0,39 µM) etwa 10-fach besser

inhibiert als durch das L-Enantiomer 94. Dieses Ergebnis impliziert, daß der

Bindungsmodus der Verbindung 95 in FXa nicht substratähnlich sein kann.

Während die Inhibition von Trypsin, Thrombin und Plasmin nur wenig von der

Chiralität der Verbindung abhängt, kann uPA offensichtlich nur das L-Enantiomer

94 erkennen.

Modelling-Experimente mit dem D-Enantiomer 95 (Abbildung 25D, violett bzw.

grün) sagen einen Bindungsmodus voraus, bei dem die Methylester-Gruppe in

Richtung der hydrophoben S3/S4-Region zeigt. Um diese Hypothese zu überprüfen,

wurde der Methylester durch Benzylamid (98) und Phenethylamid (99) ersetzt.

Dabei sollten zusätzliche hydrophobe Wechselwirkungen des Phenylrings in der

S3/S4-Tasche für eine Erhöhung der inhibitorischen Aktivität sorgen (Tabelle 11).

Durch das Phenethylamid-Derivat (99) (Ki=0,074 µM) konnte die

Inhibitionskonstante, verglichen mit Verbindung 95, um den Faktor 5 verbessert

werden, was stark für die Richtigkeit dieser Hypothese spricht. Wahrscheinlich ist

der „Spacer“ des Benzylamid-Derivats (98) für eine gute Interaktion in der S3/S4-

Tasche von FXa noch zu kurz, so daß sich die Inhibitionskonstante für diese

Verbindung nur um den Faktor 2 verbesserte, während der längere Spacer in

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3. Faktor Xa Inhibitoren 70

Verbindung 104 offensichtlich ebensowenig die sterischen Anforderungen für eine

gute Interaktion mit dem Enzym erfüllt.

H

H

HO

O

O

NH NH2

NH

R

Tabelle 11: Struktur-Wirkungsbeziehung enantiomerenreiner Derivate des 1-Adamantyloxycarbonyl-(3-Amidino)-Phenylalanins

Ki [µM]Nr. R Enan-

tiomer FXa uPA Thrombin Trypsin Plasmin

(94) OMe L 4,6 59 8,6 17 16

(95) OMe D 0,39 > 1000 1,6 5,7 8,9

(97) NH D 0,34 400 2,8 40 50

(98) NH D 0,22 > 1000 1,3 4,6 26

(99)NH

D 0,074 > 1000 1,2 2,7 39

(104) NH O

O D 0,23 > 1000 1,5 2,2 23

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3. Faktor Xa Inhibitoren 71

Wie in Kapitel 3.2 erläutert, besitzt FXa am Ausgang der S4-Tasche eine negativ

geladene Region, die bereits in einigen synthetischen Inhibitoren zur Bindung

ausgenutzt wurde. Aus diesem Grund wurde das 4-Hydroxyphenethylamid 100,

sowie das Hydroxyamidinderivat 102 und das Amidinderivat 103 synthetisiert

(Tabelle 12). Die Inhibitionskonstanten für diese Verbindungen liegen zwischen 0,2

und 0,5 µM und bringen somit keine Verbesserung. Eventuell ist die Position der

Substitution am Phenylring für diese hydrophile Wechselwirkung ungeeignet, oder

die geometrischen Notwendigkeiten werden nicht erfüllt. Dieses Problem ließe sich

aber nur durch eine Röntgenkristallstruktur der Verbindung 99 in FXa

zufriedenstellend lösen.

Tabelle 12: Derivatisierungen der Inhibitoren 98 und 99, die Interaktionen mit derelektronegativen Region am Ende der S4-Tasche ermöglichen sollten.

Ki [µM]Nr. R Enan-

tiomer FXa uPA Thrombin Trypsin Plasmin

(100)NH

OH

D 0,17 > 1000 1,2 2,5 19

(101)NH

CND 0,54 > 1000 2,0 6,6 18

(102)

NH

NH

NH

OH

D 0,48 > 1000 5,9 2,0 47

(103)NH

NH2

NH D 0,42 25 3,3 1,2 11

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3. Faktor Xa Inhibitoren 72

Das herausragende Ergebnis der dargestellten Untersuchungen ist die hohe

Präferenz von FXa für N-1-Adamantyloxycarbonyl-(3-amidino)-Phenylalanin-

Derivate in der D-Konfiguration, während die Leitstruktur Tosyl-Glycyl-(3-

Amidino)-Phenylalanin-Methylester (Tabelle 9, „Tenstop“) nur in der L-

Konfiguration an FXa bindet und dabei die Taschen S1-S4 zur Bindung ausnutzt.

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4. Zusammenfassung und Ausblick 73

4. Zusammenfassung und Ausblick

4.1. uPA-Inhibitoren

Der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (uPA) spielt eine zentrale Rolle bei

pathologischen Prozessen wie Tumorinvasion und Metastasierung, indem er

Plasmin und Matrix-Metalloproteasen aktiviert, die Bestandteile der extrazellulären

Matrix abbauen können. Durch die Bindung von uPA an den membrangebundenen

uPA-Rezeptor, kommt es an der Tumorinvasionsfront zu einer gerichteten

proteolytischen Aktivität. Deshalb stellt die Inhibition des Plasminogenaktivators

ein vielversprechendes Ziel in der

Tumortherapie da.

uPA ist eine trypsinähnliche Serinprotease mit

einer verhältnismäßig kleinen S2-Tasche und

einer, im Vergleich zu Trypsin, ebenfalls

kleinen, hydrophoben S3/S4-Region.

Ausgehend vom Argininmimetikum

Phenylguanidin (6), wurde dieses anhand von

Struktur-Wirkungsbeziehungen schrittweise

derivatisiert (siehe Abbildung 26) , um einen

„Spacer“ geeigneter Länge zur Überbrückung

der S2-Tasche zu finden (Verbindung 29).

Anschließend wurden die hydrophoben

Wechselwirkungen durch Einführen eines Adamantylrestes optimiert (36). Das

Wasserstoffbrücken-Bindungspotential des Spacers konnte durch weitere

Derivatisierungen noch verbessert werden, so daß mit N-Adamantyl-N'-(4-

Guanidinobenzyl)-Harnstoff (75) nun ein hochselektiver uPA-Inhibitor als neue

Leitstruktur zur Verfügung steht.

Die Röntgenkristallstruktur des uPA/Inhibitor 75-Komplexes, zeigt, daß der

Adamantylrest in der S1'-Tasche von uPA über hydrophobe Wechselwirkungen

NH

NH2NH

NH

NHNH2

NHO

O

NH

NHNH2

NHO

O

NH

NHNH2

NHO

NH

Ki = 30 µM

Ki = 36 µM

Ki = 13 µM

Ki = 2,4 µM

(6)

(29)

(36)

(75)

Abbildung 26: Entwicklungsstufen des

uPA-Inhibitors 75

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4. Zusammenfassung und Ausblick 74

gebunden ist, und nicht, wie zunächst angenommen, in der S3/S4-Region bindet.

Die genaue Kenntnis des Bindungsmodus wird die weitere Optimierung der

Leitstruktur in Bezug auf inhibitorische Aktivität deutlich vereinfachen. Erste

strukturbasierte Verbesserungsvorschläge wurden in Kapitel 2.8.2 besprochen.

Toxizitätsuntersuchungen mit Verbindung 75 anhand von drei unterschiedlichen

Krebszellinien haben gezeigt, daß zelltoxische Konzentrationen um einen Faktor 50

bis 100 oberhalb der inhibitorisch wirksamen Konzentration liegen. Aufgrund

dieses positiven Befundes sind für die nähere Zukunft einige in vivo Versuche

geplant, in denen die Effektivität des Inhibitors als anti-metastatische Verbindung

überprüft werden soll.

4.2. FXa-Inhibitoren

Die Entwicklung selektiver FXa-Inhibitoren als antithrombotische Arzneistoffe

fand in den letzten Jahren zunehmendes Interesse, da man erkannte, daß die direkte

Hemmung von Thrombin zu nicht-tollerierbaren Nebenwirkungen (z. B. schweren

Blutungen) führen kann. Ein weiterer Nachteil von Thrombin-Inhibitoren ist auch,

daß die Neugenerierung von Thrombin aus pro-Thrombin mit ihnen nicht verhindert

werden kann, und deshalb für eine effektive Antikoagulationstherapie sehr hohe

Mengen an Thrombin-Inhibitor gebraucht werden. Durch die Hemmung von FXa

ergeben sich deshalb zwei große Vorteile. Zum einen wird die Neubildung von

Thrombin unterbunden, da die Aktivierung von pro-Thrombin durch FXa gehemmt

wird. Noch wichtiger ist jedoch, daß durch die Hemmung von FXa immer eine

Minimalkonzentration von Thrombin im Blut aufrechterhalten wird, die für die

primäre Hämostase notwendig ist.

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4. Zusammenfassung und Ausblick 75

Ausgehend vom bekannten FXa-Inhibitor

„Tenstop”, sollte untersucht werden, wie sich

der Ersatz des Tosyl-Glycyl-Restes durch eine

Urethangruppe auf die Affinität zu FXa

auswirkt. Einzelne Entwicklungsstufen sind in

Abbildung 27 dargestellt.

Der Austausch der tert-Butylgruppe in

Verbindung 81 durch den größeren

Adamantylrest (84) führte erstaunlicherweise

zu einer 25-fachen Verbesserung der FXa-

Inhibition. Da die Kristallisation von FXa

immer noch mit großen Schwierigkeiten

verbunden ist, wurde der Bindungsmodus des

Inhibitors 84 durch Röntgenstrukturanalyse in

Trypsin untersucht. Obwohl dieses Verfahren in der Literatur bereits öfters

beschrieben wurde, führte es in diesem Fall nicht zum Erfolg: der Adamantylrest

befindet sich in der Trypsinstruktur in einer kleinen hydrophoben Tasche südöstlich

der „Active-Site Cleft“. Diese Tasche existiert aber in FXa nicht. Vielmehr würde

der Inhibitor in einem vergleichbaren Bindungsmodus mit dem Enzym kollidieren.

Um dennoch Informationen über einen möglichen Bindungsmodus in FXa zu

erhalten, wurden verschiedene Modelling-Experimente durchgeführt. Während für

die Adamantylgruppe von Verbindung 84 keine eindeutige Vorhersage getroffen

werden konnte, zeigte der Methylester in mehreren Bindungsvorschlägen in

Richtung der S3/S4-Tasche. Zur Überprüfung dieser Theorie wurde der Ester durch

hydrophobere Gruppen ersetzt, die in der S3-Tasche durch zusätzliche

Wechselwirkungen zu einer Verbesserung der Inhibitionskonstante beitragen

sollten. Das Phenethylamid (99) verbesserte die inhibitorische Aktivität in der Tat

auf Ki = 70 nM. Für eine endgültige Bestätigung dieser Theorie sowie für gezielte,

NH

S

O OO

O

NH O

NH

NH2

NH

O

O OO

NH

NH2

NH

O

O OO

NH

NH2

NH

O

O NHO

NH

NH2

Ki = 0,84 µM

Ki = 16 µM

Ki = 0,62 µM

Ki = 0,07 µM

Tenstop (Leitstruktur)

(99)

(84)

(81)

Abbildung 27: Entwicklungsstufen des

FXa-Inhibitors 99

Page 87: Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der Serinpro · Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der Serinproteasen uPA und FXa Neuartige Wirkstoffe zur anti-metastatischen

4. Zusammenfassung und Ausblick 76

strukturbasierte Verbesserungen des Inhibitors, wäre aber dennoch eine

Röntgenstrukturanalyse nötig.

Desweiteren konnte durch gezielte Synthese enantiomerenreiner Verbindungen, das

D-Enantiomer als das mindestens 10-fach stärker bindende Derivat ermittelt

werden. Dieser Befund überrascht um so mehr, da die Leitstruktur „Tenstop“ nur in

der L-Konfiguration aktiv ist und einen substratähnlichen Bindungsmodus aufweist.

Neben dem 1-Adamantyloxycarbonylderivat 84 wurde auch der isostere

Adamantylharnstoff 85 synthetisiert. Während dieser OàN-Austausch kaum

Einfluß auf die Inhibition von FXa hatte, verschlechterte sich doch die

Hemmwirkung gegenüber den verwandten trypsin-ähnlichen Serinproteasen. Vor

allem gegenüber uPA war keinerlei Inhibition mehr zu detektieren. Bei künftigen

Verbesserungen der Leitstruktur 99 sollte man diese Veränderung zur Erzielung

einer höheren Selektivität bedenken, zumal Harnstoffe z. B. gegenüber Säuren

(Magensäure) wesentlich stabiler sind als Urethane.

Außerdem ist durch Ersetzen der C-terminalen Gruppe (Phenethylamid)

höchstwahrscheinlich noch eine weitere Steigerung der Aktivität möglich.

Naphthylgruppen werden z. B. schon seit längerem sehr erfolgreich für hydrophobe

Wechselwirkungen in der S3/S4-Tasche eingesetzt

Letztlich bleibt zu hoffen, daß es gelingt eine Röntgenkristallstruktur von FXa im

Komplex mit dem Inhibitor 99 zu erhalten. Die daraus resultierende exakte

Kenntnis des Bindungsmodus, würde strukturbasierte Verbesserungen dieser

Leitstruktur stark vereinfachen.

Page 88: Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der Serinpro · Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der Serinproteasen uPA und FXa Neuartige Wirkstoffe zur anti-metastatischen

5. Summary 77

5. Summary

5.1. uPA-inhibitors

By activation of plasmin and matrix-metalloproteinases that are able to degrade

several extra-cellular matrix components, the urokinase-type plasminogen activator

(uPA) plays a central role in pathologic processes like tumor-cell invasion and

metastasis. The binding of uPA to its cell-

surface associated receptor (uPAR) enables

the directed proteolytic activity. Therefore,

inhibition of uPA may represents a promising

target in tumor therapy.

uPA is a trypsin-like serine protease with

comparable small S2- , S3- and S4-pockets.

Based on structure-activity relationships

(SAR), the starting-compound phenyl-

guanidine (6) was derivatized in order to

obtain a suitable spacer to bridge the S2-

pocket (see figure 28, compound 29).

Subsequently the hydrophobic interactions

were optimized by the introduction of an adamantyl moiety (36). Further

derivatizations led to an improved hydrogen-bonding potential of the spacer.

Finally, a highly selective uPA-inhibitor [N-adamantyl-N'-(4-guanidinobenzyl)-urea

(75)] was obtained, which represents a new lead-structure for the developement of

anti-metastatic drugs.

The X-ray crystal structure of uPA complexed with the inhibitor 75 showed an

unexpected binding mode, with the adamantyl moiety involved in hydrophobic

interactions in the S1'-pocket. The knowledge of the exact binding-mode will

definitely facilitate further improvements of the lead compound 75 in terms of

inhibitory potency. Some structure-based proposals to improve the binding of the

NH

NH2NH

NH

NHNH2

NHO

O

NH

NHNH2

NHO

O

NH

NHNH2

NHO

NH

Ki = 30 µM

Ki = 36 µM

Ki = 13 µM

Ki = 2,4 µM

(6)

(29)

(36)

(75)

Figure 28: Stages of developement of the

uPA-inhibitor 75

Page 89: Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der Serinpro · Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der Serinproteasen uPA und FXa Neuartige Wirkstoffe zur anti-metastatischen

5. Summary 78

inhibitor to the uPA active-site cleft have been discussed in chapter 2.8.2. Toxicity

studies for the inhibitor 75 on three different cancer cell-lines proved cell-toxic

concentrations to be 50- to 100-fold higher than the active concentrations. Because

of this positive result, in vivo studies are planed, in order to verify the anti-invasive

and anti-metastatic properties of this compound.

5.2. fXa-inhibitors

The interest in developing selective inhibitors of factor Xa (fXa) as anti-thrombotic

drugs increased by leaps and bounds after recognizing the strong side effects that

can occure by treatment with direct thrombin inhibitors. A second disadvantage of

thrombin inhibitors is, that they are not able to prevent a continuous production of

thrombin by activating pro-thrombin. Therefore increasing amounts of an inhibitor

are necessary for an efficient anti-thrombotic therapy. Thus, inhibition of fXa would

present two major advantages. Firstly, the fXa-mediated regeneration of thrombin is

suppressed. Even more importantly, the minimal thrombin concentration in the

blood is maintained, that is necessary for the

primary haemostasis.

Starting from the well known fXa-inhibitor

„Tenstop“ (see figure 29) the tosyl-glycyl

residue was replaced with several urethanes.

Surprisingly, replacement of the tert-butyl

group led to a 25-fold improvement of the

fXa-inhibition. Since crystallisation of fXa is

still difficult, the binding mode of compound

84 to the related enzyme trypsin was

investigated. Although this indirect approach

has previously been described, it did not

produce helpful results in our case. In trypsin,

the adamantyl residue occupies a small

hydrophobic pocket, south-east of the active-site cleft. Since this pocket does not

NH

S

O OO

O

NH O

NH

NH2

NH

O

O OO

NH

NH2

NH

O

O OO

NH

NH2

NH

O

O NHO

NH

NH2

Ki = 0.84 µM

Ki = 16 µM

Ki = 0.62 µM

Ki = 0.07 µM

Tenstop (lead-compound)

(99)

(84)

(81)

Figure 29: Stages of developement of the

fXa-inhibitor 99

Page 90: Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der Serinpro · Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der Serinproteasen uPA und FXa Neuartige Wirkstoffe zur anti-metastatischen

5. Summary 79

exist in fXa, in a comparable binding mode the inhibitor would clash with the

enzyme.

Therefore, to obtain information on the binding mode of the inhibitor, several

modeling experiments were performed. While the interaction site of the adamantyl

residue could not be clearly predicted, several docking results predicted the methyl

ester group pointing towards the S3/S4-pocket. To prove this working assumption,

the ester was exchanged by hydrophobic residues, that should enhance the

inhibition constants by additional hydrophobic interactions within the S3-pocket.

Indeed, with the phenethylamide-derivative 99, the inhibitory activity could be

improved to Ki = 70 nM. However, only the X-ray crystal structure of an

fXA/inhibitor 99-complex could ultimately prove the postulated binding mode and

allow for structure-based inhibitor design.

Furthermore, by synthesizing enantiomerically pure derivatives, the D-enantiomer

showed an inhibition constant at least 10-fold better than the L-enantiomer. This

result was very surprising since the lead-compound „Tenstop“ is active only in the

L-configuration and shows a substrate-like binding mode.

Besides the 1-adamantyloxycarbonyl-derivative 84, also the isosteric thiourea 85

was synthesized. While this OàN-exchange had nearly no influence on the

inhibition of fXa, this compound exhibited a much weaker inhibitory activity for the

related trypsin-like enzymes. Especially for uPA no inhibition was detectable. As a

possible perspective to improve the selectivity of the lead-compound 99, the ureas

would be promising even because of the higher chemical stability compared to the

acid-labile urethanes.

Page 91: Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der Serinpro · Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der Serinproteasen uPA und FXa Neuartige Wirkstoffe zur anti-metastatischen

6. Experimenteller Teil 80

6. Experimenteller Teil

6.1. Materialien und Methoden

Die verwendeten Lösungsmittel wurden von den Firmen Aldrich, Baker, Fluka und

Merck entweder in p. a. Qualität bezogen oder nach den üblichen Standardverfahren

gereinigt. Für analytische HPLC und präparative HPLC wurde LiChrosolv

Acetonitril von Merck eingesetzt. Weitere gängige Chemikalien wurden von

Aldrich, Bachem, Fluka und Merck bezogen. Zur Synthese der Amidino-

Phenylalanin-Derivate wurde racemisches 3- bzw. (4-Cyano)-Phenylalanin der

Firma Senn Chemicals (Dielsdorf, Schweiz) bzw. die isomerenreinen Verbindungen

Boc-L-(3-Cyano)-Phenylalanin und Boc-D-(3-Cyano)-Phenylalanin der Firma

Synthetech (Albany, Oregon, USA) eingesetzt. Als Katalysator für die

Hydrogenolyse wurde 10 % Pd auf Aktivkohle (Typ E10 E/W) der Firma Degussa

verwendet. p-Guanidino-Benzoesäure Hydrochlorid war in der Abteilung aus

früheren Synthesen vorhanden.

Dünnschichtchromatographie

Zur Dünnschichtchromatographie wurden Kieselgel-60-Fertigplatten mit

Fluoreszenzindikator der Firma Merck (Darmstadt) verwendet. Die Detektion der

Substanzen erfolgte in der Regel durch UV Absorption sowie mittels Chlor/o-

Tolidin (1.5 g o-Tolidin und 4.2 g KI in 60 ml Eisessig und 940 ml Wasser). Bei

schlecht detektierbaren Substanzen wurde mit KMnO4 (2 % in Wasser) oxidiert.

Als Laufmittel wurden folgende Lösungsmittelgemische eingesetzt:

Laufmittel A: Hexan:AcOEt:AcOH = 20:10:2

Laufmittel B: CHCl3:MeOH:AcOH = 10:10:2

Laufmittel C: CHCl3:MeOH:AcOH = 10:20:2

Laufmittel D: Hexan:AcOEt:AcOH = 10:10:1

Laufmittel E: AcOEt:n-BuOH:AcOH:H2O = 10:6:2:2

Laufmittel F: CHCl3:MeOH:AcOH = 40:10:2

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6. Experimenteller Teil 81

Laufmittel G: CHCl3:MeOH:AcOH = 190:10:2

Laufmittel H: CHCl3:MeOH:NH3 = 20:20:9

Präparative Säulenchromatographie

Für die präparative Säulenchromatographie wurde Kieselgel 60 (230-400 mesh

ASTM) der Firma Merck (Darmstadt) eingesetzt. Die verwendeten

Lösungsmittelgemische werden bei den entsprechenden Synthesen angegeben.

Analytische und präparative HPLC

Analytische HPLC wurde mit einer Flußrate von 1 ml/min auf Nucleosil 100/C8

Säulen der Firma Macherey-Nagel (Düren) durchgeführt. Dazu wurden folgende

Säulen und Gradienten verwendet:

(A) Säule 125/4, linearer Gradient, MeCN/2% H3PO4 von 5:95 auf 90:10 in 13

min mit weiteren 2 min isokratischer Elution.

(B) Säule 125/4, linearer Gradient, MeCN/2% H3PO4 von 5:95 auf 80:20 in 30

min.

(C) Säule 50/4, linearer Gradient, MeCN/2% H3PO4 von 5:95 auf 90:10 in 9 min

und 1 min isokratische Elution.

Für die präparative HPLC wurde Nucleosil RP 18 der Firma Macherey-Nagel

(Düren) mit den jeweilig angegebenen Eluenten und Gradienten benutzt.

Massenspektrometrie

FAB-Massenspektren wurden an einem Finnigan MAT 900 und ESI-

Massenspektren an einem PE API 165 aufgenommen. Letzteres Gerät wurde auch

zur kombinierten HPLC-MS Analyse eingesetzt.

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6. Experimenteller Teil 82

6.2. Enzymkinetik

6.2.1. Ermittlung der Inhibitionskonstanten (Ki-Werte)

Die Ki-Werte für die Hemmung der verschiedenen Enzyme wurden unter

Verwendung spezifischer synthetischer Substrate ermittelt. Die Reaktionen wurden

auf Mikrotiter-Platten ausgeführt und mit einem Mikroplate-Reader MR 5000 der

Firma Dynatech (Denkendorf) bei 25 °C gemessen. Das Testmedium bestand aus

200 µL Tris-Puffer (0,05 M; 0,154 M NaCl, 5 % EtOH, pH 8,0), 25 µL wäßriger

Substratlösung und 50 µL Enzymlösung. Die Ki-Werte wurden jeweils mit zwei

verschiedenen Substrat- und fünf unterschiedlichen Inhibitorkonzentrationen

bestimmt. Drei Minuten nach Meßbeginn wurde die Reaktion durch Zugabe von 25

µL 50 %-iger Essigsäure gestoppt und die Extinktion bei einer Wellenlänge von 405

nm erfaßt. Die Dissoziationskonstanten der Enzym-Inhibitor-Komplexe wurden

nach Dixon (Dixon, M. 1953) mit einem linearen Regressionsprogramm berechnet.

Die errechneten Ki-Werte sind Mittelwerte aus mindestens 3 Einzelbestimmungen.

6.2.2. Eingesetzte Enzyme und Substrate zur Ki-Wert-Bestimmung

Folgende Enzyme und Substrate wurden mit den jeweils in Klammern angegebenen

Aktivitäten und Konzentrationen zur Ermittlung der Inhibitionskonstanten

eingesetzt. Die verwendeten Substrate stammen von der Firma Pentapharm Ltd.

(Basel, Schweiz):

• bov. Pankreas-Trypsin (42 U/mg, 0,0038 U/mL), Serva (Heidelberg); Substrat:

MeSO2-D-hexahydrotyrosyl-Gly-Arg-pNA (0,18 und 0,06 mM).

• bov. Thrombin wurde gemäß der Beschreibung von Walsmann (Walsmann, P.

1968) hergestellt (2262 U/mg, 0,45 U/mL); Substrat: MeSO2-D-

hexahydrotyrosyl-Gly-Arg-pNA (0,18 und 0,09 mM).

• bov. FXa (5 U/vial, 0,11 U/mL), Diagnostic Reagents Ltd. (Thame, UK);

Substrat: MeSO2-D-Nle-Gly-Arg-pNA (0,36 und 0,18 mM).

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6. Experimenteller Teil 83

• hum. FXa (4 mg/vial, 0,18 µg/mL), Kordia Lab. Supplies (Leiden,

Niederlande); Substrat: MeSO2-D-Nle-Gly-Arg-pNA (0,36 und 0,18 mM).

• hum. uPA (500000 U/vial, abschließende Konzentration 150 U/mL),

Ribosepharm GmbH (Haan); Substrat: Bz-ßAla-Gly-Arg-pNA (0,18 und 0,09

mM).

• sc-tPA wurde aus CHO-Zellen gereinigt (4,1 mg/mL, 0,0031 µg/mL); Substrat:

MeSO2-D-hexahydrotyrosyl-Gly-Arg-pNA (0,54, 0,27 and 0,145 mM)

(Stürzebecher, J. et al. 1992).

• hum. Plasmin (0,67 CTA-U/mg, 0,06 CTA-U/mL), Behringwerke AG

(Marburg); Substrat: Tos-Gly-Pro-Lys-pNA (0,18 und 0,09 mM).

6.3. Röntgenstrukturanalyse des Inhibitor/uPA Komplexes

Die Röntgenstrukturanalyse des uPA/Inhibitor-75-Komplexes wurde in

Kooperation mit der Abteilung Prof. Huber (Abteilung für Strukturforschung, Max-

Planck-Institut für Biochemie, Martinsried) durchgeführt.

6.3.1. Kristallisation mit Benzamidin als Inhibitor

LMW-uPA wurde von Uwe Jakob (Abteilung Robert Huber) in E. coli

überexprimiert und aufgereinigt. Dabei wurde die Punktmutation C122S eingeführt,

so daß später die Disulfidbrücke zwischen Cys1 und Cys122 nicht gebildet werden

kann. Nach Aktivierung mit Plasmin wird so die katalytisch aktive B-Kette

erhalten, die momentan die kürzeste zu kristallisierende Einheit darstellt

(Zeslawska, E. et al. 2000).

Erste Kristallisationsversuche wurden mit einem Pipettierroboter (Crybot, Qiagen,

Deutschland) unter Anwendung der „hanging-drop“-Dampfdiffusionsmethode

unternommen. Alle Kristalle wurden zunächst in benzamidinhaltigen Lösungen

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6. Experimenteller Teil 84

gezüchtet. Benzamidin wurde später durch „soaken“ der Kristalle in Lösungen des

gewünschten Inhibitors ersetzt.

6.3.2. Soaking des uPA-Inhibitors 75 und Röntgenstrukturanalyse

Hierzu wurde ein Kristall in 5µl einer Lösung bestehend aus 1,25M LiSO4, 1M

(NH4)2SO4, 0,125M Natrium-Zitrat/HCl pH5,2 und einer Suspension des Inhibitors,

eingelegt. Durch täglichen Austausch dieser Lösung wurde Benzamidin im Kristall

langsam durch den Inhibitor 75 ausgetauscht. Anschließend wurde der Kristall

(Abmessungen 100 µm x 80 µm x 250 µm) auf einem

Drehanodenröntgengenerator (Rigaku, Japan) montiert. Die Detektion der Reflexe

erfolgte mit einem Flächendetektor der Firma Mar Research (Deutschland) bis zur

gerätespezifischen Auflösung von 1,8 Å. Zur Auswertung der Reflexe wurden die

Routinen der Programmsammlung CCP4 (Bailey, S. 1994) verwendet. Zur Lösung

der Struktur wurde die von Spraggon und Co-Autoren beschriebene uPA-

Röntgenstruktur (Spraggon, G. et al. 1995) (PDB-Zugangscode: 1LMW) und das

Programm AMoRe (Navaza, J. 1994) verwendet. Für die Strukturverfeinerung mit

CNS (Brünger, A. T. 1998) wurde das Engh-Huber-Parameterset (Engh, R. A. et al.

1991) verwendet. Die kristallographischen Daten sind in Tabelle 13

zusammengefaßt.

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6. Experimenteller Teil 85

Tabelle 13: Kristallographische Daten der Röntgenstruktur des uPA/Inhibitor 75-

Komplexes

Datensammlungsstatistik

Raumgruppe P212121

Zellkonstantena=52,85Å, b=54,77Å, c=81,58Å

α=β=γ=90°

Multiplizität 2.3

Vollständigkeit (gesamt/2.0 Å/1.8 Å) 84 % / 93 % / 60 %

Rmerge (gesamt/2.0 Å/1.8 Å) 8,7 % / 20 % / 56 %

Verfeinerungsstatistik

unabh. Reflexe 20187

R-Faktor 20.0 %

freier R-Faktor 24.0 %

σBindungslängen 0,005 Å

σBindungswinkel 1.2°

σB- Faktoren 4,4 Å2

Moleküle in der asymm. Einheit 1

6.4. Röntgenstrukturanalyse des Faktor Xa Inhibitor 84/Trypsin-

Komplexes

Die Röntgenstrukturanalyse des Trypsin/Inhibitor 84-Komplexes wurde in

Kooperation mit Andreas Bergner (Abteilung Prof. R. Huber) durchgeführt.

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6. Experimenteller Teil 86

Benzamidin-komplexierte Trypsinkristalle wurden gezüchtet wie von Stubbs und

Mitarbeitern beschrieben (Stubbs, M. T. et al. 1995). Ein Kristall wurde für 3 Tage

in eine 2mM Lösung des Inhibitors 84 (2,5M Ammoniumsulphat, pH 8) eingelegt,

wodurch Benzamidin im Kristall durch den Inhibitor ausgetauscht wurde. Das

verwendete Röntgengerät wurde bereits unter 6.3.2 erläutert. Die Daten wurden mit

den Computerprogrammen MOSFLM (Leslie, A. G. W. 1994) und CCP4 (Bailey,

S. 1994) und den Koordinaten der Struktur von β-Trypsin (PDB-Zugangscode:

1PPH) ausgewertet. Die Strukturverfeinerung wurde in alternierenden Schritten mit

X-PLOR (Brünger, A. T. 1993) und dem 3D-Modellierprogramm TURBO-FRODO

(Roussel, A. et al. 1989) durchgeführt. Da die Elektronendichte eine eindeutige

Bestimmung der Inhibitorkonfiguration nicht zuließ, wurde die Verfeinerung mit

den getrennten D- bzw. L-Enantiomeren sowie mit einer anteilmäßigen Besetzung

beider Enantiomere durchgeführt. Die kristallographischen Daten sind in Tabelle 14

zusammengefaßt.

Datensammlungs- und Verfeinerungsstatistik

Raumgruppe P212121

Zellkonstantena=63,7Å, b=63,5Å, c=69,1Å

α=β=γ=90°

Vollständigkeit (gesamt / letzte Schale) 96,3 % / 83,3 %

Rsym (gesamt / letzte Schale) 3,9 % / 8,1 %

R-Faktor 19,5 – 19,9 %

Tabelle 14: Kristallographische Daten des Inhibitor 84/Trypsin-Komplexes

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6. Experimenteller Teil 87

6.5. Modelling-Experimente mit Faktor Xa Inhibitoren

Die beschriebenen Untersuchungen wurden in Kooperation mit Andreas Bergner

(Abteilung Prof. R. Huber) durchgeführt.

Modelling-Experimente wurden mit dem Computerprogramm FlexX (Rarey, M. et

al. 1996) auf SGI Workstations durchgeführt. Hierzu wurden die Koordinaten der

unkomplexierten FXa-Röntgenstruktur (Padmanabhan, K. et al. 1993) (PDB-

Zugangscode: 1HCG) verwendet. Zur Validierung der Ergebnisse, sollten auch

Dockingversuche an der beschriebenen Röntgenstruktur des FXa-DX9065a-

Komplexes durchgeführt werden (Brandstetter, H. et al. 1996) (PDB-Zugangscode:

1FAX). Paradoxerweise führt die Bindung des Inhibitors (DX-9065a) in dieser

Struktur zu einer Kontraktion der S1-Tasche, so daß es FlexX nicht möglich war,

den Inhibitor 84 oder auch nur Benzamidin korrekt in die S1-Tasche zu docken.

Aus diesem Grund wurde diese Struktur einer einfachen Molekül-Dynamik-

Simulation (gemittelte Struktur nach 10 ps Simulation) unterworfen. Diese

gemittelte Struktur diente als drittes Rezeptormodell.

6.6. In vivo Eliminationsstudien

NAPAP (siehe Seite 49) und die Verbindung 75 wurden in wäßriger Lösung in

Dosen von 1 mg/kg intravenös narkotisierten (Urethan, 1.5 g/kg i.p.) Ratten

appliziert. Blutproben wurden nach unterschiedlichen Zeitintervallen aus der

Hauptschlagader entnommen, mit Zitratlösung antikoaguliert und zentrifugiert.

Blutplasma wurde auf einer Chromabond C18 Festphasen-Extraktionssäule

(Macherey-Nagel, Düren) aufgetragen. Die Inhibitorkonzentrationen in den

einzelnen Plasmaproben wurden mittels HPLC an einer Nucleosil 7/C18-Säule

(Macherey-Nagel, Düren) bei einer Flußrate von 1 mL/min mit dem Eluenten

ACN/Wasser/1M Perchlorsäure = 15/70/0.04 bestimmt. NAPAP wurde mittels

Fluoreszenzdetektor (λex = 232 nm, λem = 343 nm), der uPA Inhibitor 75 mit einem

UV-Detektor (λ = 238 nm) nachgewiesen.

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6. Experimenteller Teil 88

6.7. Toxizitätsstudien am uPA Inhibitor 75

Die Zytotoxizität des uPA Inhibitors 75 wurde in Kooperation mit Nuria Arroyo de

Prada (Frauenklink der TU München) anhand von 3 verschiedenen Krebszellinien

(Eierstockkrebszellinie OVMZ-6, Brustkarzinomzellinie MDA-MB-231,

Keatinozytenzellinie A431) mit dem nicht-radioaktiven Zell-Proliferations-Assay

CellTiter96TM der Firma Promega (Mannheim) bestimmt. Hierzu wurden die Zellen

auf 96-Loch-Mikrotiterplatten ausgesät und, mit steigenden Mengen des Inhibitors,

24, 48 bzw. 72 Stunden bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert. Nach Zugabe einer

Tetrazoliumsalz-haltigen Lösung {[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-

(3carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulphophenyl)-2H-tetrazolium} wurden die Zellen

weitere 4 Stunden inkubiert. Während dieser Zeit erfolgt durch lebende Zellen die

metabolische Umwandlung des Tetrazolium-Salzes in ein Formazanprodukt

(Abbildung 30). Durch Zugabe einer Stop-Lösung wurde dieser Vorgang beendet.

N

N NN

O COOH

SO3

+

-

NN N

N

N

SH

O COOH

O3S-

MTS Formazan

NS

Abbildung 30: Metabolische Formazan-Bildung durch lebende Zellen

Nach Inkubation über Nacht, wurde mittels eines ELISA-Readers die Absorption

bei 560 nm und 640 nm gemessen. Die Differenz der Meßwerte bei diesen

Wellenlängen ist der Anzahl lebender Zellen direkt proportional.

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6. Experimenteller Teil 89

6.8. Synthese der uPA Inhibitoren

6.8.1. Tripeptid-Methylketone

Die Synthese der Peptid-Methylketone wurde manuell in Maßstäben von 0,2 – 0,5

mmol auf N-Fmoc-N(OCH3)-(CH2)2-CO-AM Harz (Weinreb-AM Harz)

durchgeführt. Um die Fmoc-Gruppe des Linkers abzuspalten wurde das Harz in

DMF/CH2Cl2 (4:1) gequollen, mit 20% Piperidin in DMF/CH2Cl2 (4:1) für 3 min

und ein zweites mal für 12 min behandelt und anschließend mit CH2Cl2 und DMF

gewaschen. Durch Reaktion mit einem sechsfachen Überschuß an Fmoc-Arg(Pbf)-

OH/HATU/HOAt/DIEA (1:1:1:2) in DMF/CH2Cl2 (4:1) für 1 h wurde das Harz mit

0.5 mmol/g beladen, wie nach quantitativer Fmoc-Abspaltung und darauffolgender

Vermessung des Piperidiniumaddukts bei 301 nm mit einem angenommen ε von

7800 l mol-1 cm-1 bestimmt wurde. Die Verlängerung der Peptidkette erfolgte nach

Standardmethoden der Fmoc/tBu-Strategie mit Kopplung von vierfachen

Überschüssen an Fmoc-AA-OH/HBTU/HOBt/DIEA (1:1:1:2) in DMF/CH2Cl2

(4:1). Die Fmoc-Abspaltung erfolgte wie oben beschrieben. Soweit gewünscht,

wurde zur Acetylierung der N-Termini der Verbindungen das harzgebundene Peptid

nach Fmoc-Abspaltung mit 10 Äquivalenten Ac2O/DIEA (1:1) in DMF/CH2Cl2

(4:1) behandelt. Nach reduktiver Abspaltung mit 20 Äquivalenten MeMgBr in THF

für 1 h, wurde nach dem Abfiltrieren des Harzes mit AcOEt verdünnt, mit etwas Eis

hydrolysiert und gegen 5% KHSO4 verteilt. Die organische Phase wurde über

Na2SO4 getrocknet. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels, wurden die als

Rohprodukte erhaltenen seitenkettengeschützten Peptid-Methylketone schließlich

während 1 h in 95%-iger TFA entschützt. Nach Einengen der Lösung wurde das

Produkt mit DIPE gefällt, zentrifugiert und aus Wasser lyophyllisiert. Die so

erhaltenen Produkte besaßen eine Reinheit von mehr als 90% und wurden nicht

weiter aufgereinigt.

Folgende Verbindungen wurden nach dieser Methode synthetisiert:

Ac-Arg-CH3 (1): Ausbeute: 23 mg (28%); HPLC (Gradient B): tR 3,2 min; FAB-

MS: m/z = 215,2 (M+H)+; ber. für C9H18N4O4: 214,2

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6. Experimenteller Teil 90

Ac-Glu-Gly-Arg-CH3 (2): Ausbeute: 28 mg (15%); HPLC (Gradient B): tR 5,4 min;

ESI-MS: m/z = 401,0 (M+H)+; ber. für C16H28N6O6: 400,2

H-Glu-Pro-D,L-Arg-CH3 (3): Ausbeute: 29 mg (12%); HPLC (Gradient B): tR 3,7

min; FAB-MS: m/z = 399,2 (M+H)+; ber. für C17H30N6O5: 398,2

Ac-Glu-Hyp-Arg-CH3 (4): Ausbeute: 12 mg (21%); HPLC (Gradient B): tR 5,1 min;

FAB-MS: m/z = 457,3 (M+H)+; ber. für C19H32N6O7: 456,2

Ac-Ser-Hyp-Arg-CH3 (5): Ausbeute: 20 mg (70%); HPLC (Gradient B): tR 6,2 min;

FAB-MS: m/z = 415,3 (M+H)+; ber. für C17H30N6O6: 414,2

6.8.2. nicht-peptidische Inhibitoren / Phenylguanidine

Allgemeine Arbeitsvorschriften:

Zur Synthese der aromatischen Guanidinoverbindungen wurden die entsprechenden

aromatischen Amine mit einem bis-Z- bzw. bis-Boc-geschützten

Guanidinylierungsreagenz umgesetzt und die resultierenden Guanidino-

verbindungen anschließend entschützt. Als bis-Z-geschütztes

Guanidinylierungsreagenz wurde das von Feichtinger et al. beschriebene N,N'-

Dibenzyloxycarbonyl-N''-triflylguanidin synthetisiert (Feichtinger, K. et al. 1998).

Zur Darstellung von N,N'-di-Boc-1-Guanylpyrazol wurde in kommerziell

erhältliches N-Boc-1-Guanylpyrazol (Fluka) gemäß Wu et al. eine zweite Boc-

Schutzgruppe eingeführt (Wu, Y. et al. 1993).

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6. Experimenteller Teil 91

Allgemeine Arbeitsvorschrift 1 (AAV1): Guanidinylierung mit N,N'-di-Boc-1-

Guanylpyrazol

Die Aminokomponente (ca. 0,1 mmol) wurde in 1-2 ml Aceton gelöst, mit einem

Äquivalent N,N'-di-Boc-1-Guanylpyrazol versetzt und bei 50 °C in einem fest

verschlossenen Gefäß gerührt. Der Reaktionsfortschritt wurde mittels DC oder

HPLC verfolgt. Je nach Art des Amins betrug die Reaktionszeit bis zu 1 Woche.

Nach Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum, wurde der Rückstand zwischen

AcOEt/5% KHSO4 verteilt und die organische Phase 3x mit 5% KHSO4 gewaschen.

Nach Trocknung der organischen Phase über wasserfreiem Na2SO4, wurde das

Lösungsmittel abgezogen und das Produkt aus Ether umkristallisiert. Weitere

Derivatisierungen wurden auf dieser geschützten Stufe durchgeführt.

Zum Abspalten der Boc-Schutzgruppen wurde das Produkt in eiskalter 6N

HCl/Dioxan gelöst und 15 min. bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde

abgezogen und das Produkt als Hydrochlorid-Salz aus i-PrOH/DIPE

umkristallisiert.

Allgemeine Arbeitsvorschrift 2 (AAV2): Guanidinylierung mit N,N'-

Dibenzyloxycarbonyl-N''-triflylguanidin

Die Durchführung dieser Reaktion erfolgte wie in AAV1 beschrieben mit einem

Äquivalent N,N'-Dibenzyloxycarbonyl-N''-triflylguanidin.

Zum Abspalten der Z-Schutzgruppen wurde die Substanz in Methanol gelöst, mit

einem Äquivalent 1M HCl versetzt und über einem Pd/C-Katalysator hydriert. Das

Lösungsmittel wurde anschließend abgezogen und das Produkt als Hydrochlorid-

Salz aus i-PrOH/DIPE umkristallisiert.

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6. Experimenteller Teil 92

Spezielle Arbeitsvorschriften:

Phenylguanidin Hydrochlorid (6):

Phenylguanidin wurde nach AAV1 aus frisch destilliertem Anilin (13 µl; 0,139

mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 32 mg (92%); DC (Laufm. A): Rf = 0,08; ESI-MS: m/z = 136,2 (M+H)+;

ber. für C7H9N3: 135,1

Benzylguanidin Hydrochlorid (7):

Die Titelverbindung wurde nach AAV1 aus Benzylamin (207 µl; 1,96 mmol)

synthetisiert.

Ausbeute: 345 mg (95%); DC (Laufm. A): Rf = 0,09; ESI-MS: m/z = 150,0

(M+H)+; ber. für C8H11N3: 149,1

p-Guanidino-Benzoesäure-OSu Hydrochlorid (8):

p-Guanidino-Benzoesäure Hydrochlorid (500 mg; 2,32 mmol), HOSu (267 mg;

2,32 mmol), DCC (495 mg; 2,55 mmol) wurden bei 0 °C in DMF (6 ml) gelöst, bei

dieser Temperatur 3 h gerührt und über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Der

ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und das LM abgezogen. Der

Rückstand kristallisierte durch Behandlung mit Ether.

Ausbeute: 345 mg (95%); DC (Laufm. B): Rf = 0,55; ESI-MS: m/z = 276,8 (M+H)+;

ber. für C8H11N3: 276,1

p-Guanidino-Benzoesäure-Weinrebamid Hydrochlorid (9):

Eine Lösung von p-Guanidino-Benzoesäure-OSu Hydrochlorid (8) (100 mg; 0,32

mmol), N-Methoxy-N-Methylamin (31,2 mg; 0,32 mmol) und TEA (90 µl; 0,65

mmol) in DMF (1 ml) wurde 24 h bei RT gerührt. Nach Abfiltrieren des NS wurde

das Lösungsmittel abgezogen und der Rückstand 3x aus Methanol umkristallisiert.

Ausbeute: 50 mg (60%); DC (Laufm. B): Rf = 0,47; ESI-MS: m/z = 222,2 (M+H)+;

ber. für C8H11N3: 223,2

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6. Experimenteller Teil 93

p-Guanidino-Benzoesäureneopentylester Hydrochlorid (10):

Eine Lösung von p-Guanidino-Benzoesäure Hydrochlorid (200 mg; 0,93 mmol),

Neopentylalkohol (90 mg; 1,02 mmol) und DCC (198 mg; 1,02 mmol) in Pyridin (1

ml) wurde über Nacht bei RT gerührt. Nach Abziehen des Lösungsmittels im HV

wurde der Rückstand in wenig MeOH gelöst und die Verunreinigungen mit viel

Ether ausgefällt. Nach Abziehen des Ethers wurde das Rohprodukt in EtOH/AcOEt

1:1 gelöst, mit 160 µl 6N HCl/Dioxan versetzt und mit Hexan ausgefällt.

Ausbeute: 50 mg (60%); HPLC (Gradient A): tR 6,9 min; ESI-MS: m/z = 250,2

(M+H)+; ber. für C13H19N3O2: 249,1

p-Guanidino-Benzoesäuremethylester Hydrochlorid (11):

Zu einer Lösung von p-Guanidino-Benzoesäure Hydrochlorid (1 g; 4,64 mmol) in

Methanol (40 ml) wurde bei 0 °C langsam Thionylchlorid (405 µl; 5,57 mmol)

zugetropft und dann bei RT gerührt. Nach 3 h wurde nochmals die gleiche Menge

an Thionylchlorid zugegeben und die Reaktionslösung über Nacht weitergerührt.

Nach Abziehen des LMs im HV wurde das Rohprodukt aus Methanol

umkristallisiert um ein farbloses Produkt zu erhalten.

Ausbeute: 1,03 g (97%); DC (Laufm. B): Rf = 0,62; ESI-MS: m/z = 194,2 (M+H)+;

ber. für C9H11N3O2: 193,1

p-Nitro-Phenylalanin-Methylester Hydrochlorid (12):

Zu einer Lösung von p-Nitro-Phenylalanin (1 g; 4,72 mmol) in Methanol (5 ml)

wurde bei 0 °C langsam Thionylchlorid (687 µl; 9,44 mmol) zugetropft und dann

bei RT gerührt. Nach 4 h wurde nochmals die gleiche Menge an Thionylchlorid

zugegeben und die Reaktionslösung über Nacht weitergerührt. Nach Abziehen des

LMs im HV wurde das Rohprodukt mit DIPE gewaschen um ein hellgelbes Produkt

zu erhalten.

Ausbeute: 1,19 g (97%); DC (Laufm. C): Rf = 0,70; ESI-MS: m/z = 226,2 (M+H)+;

ber. für C10H12N2O4: 225,2

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6. Experimenteller Teil 94

N-Adoc-(4-nitro)-Phenylalanin-Methylester (13):

Eine Lösung von Verbindung 12 (500 mg; 1,91 mmol) und Adoc-F (454 mg; 2,29

mmol) in Dioxan (15 ml) wurde mit 1 ml 2N NaOH versetzt und bei RT gerührt.

Nach 5 min ist der pH Wert auf 5 gefallen und es wurden noch 0,5 ml NaOH

zugegeben. Eine Stunde später wurde das LM abgezogen und der Rückstand

zwischen AcOEt/H2O verteilt. Die organische Phase wurde getrocknet und das LM

abgezogen. Das erhaltene gelbe Öl wurde ohne weitere Aufarbeitung

weiterverarbeitet.

Ausbeute: 940 mg (100%); HPLC (Gradient A): tR 12,7 min;

N-Adoc-(4-Amino)-Phenylalanin-Methylester (14):

Eine Lösung von N-Adoc-(4-nitro)-Phenylalanin-methylester (13) (0,94 g; 1,91

mmol) in MeOH (20 ml) wurde mit 2 ml 1N AcOH versetzt und über Pd/C hydriert.

Nach 3 h wurde der Kat. abfiltriert und das LM abgezogen. Durch Behandlung mit

DIPE wurde ein hell rosafarbener Feststoff erhalten.

Ausbeute: 670 mg (94%); HPLC (Gradient A): tR 9,0 min; ESI-MS: m/z = 373,4

(M+H)+; ber. für C21H28N2O4: 372,2

N-Adoc-(4-Guanidino)-Phenylalanin-Methylester Hydrochlorid (15):

Die Titelverbindung wurde aus (14) (57 mg; 0,153 mmol) nach AAV2 unter Zusatz

von TEA (21 µl; 0,153 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 21 mg (30%); HPLC (Gradient A): tR 9,5 min; ESI-MS: m/z = 415,4

(M+H)+; ber. für C22H30N4O4: 415,2

N-Boc-(4-nitro)-Phenylalanin-Methylester (16):

Eine Lösung von Verbindung 12 (500 mg; 1,91 mmol) und Boc2O (461 mg; 2,11

mmol) in Dioxan (5 ml) wurde mit 1 ml 2N NaOH versetzt und bei RT gerührt.

Nach 1 h wurden weitere 0,5 ml NaOH zugegeben. Eine Stunde später wurde das

LM abgezogen und der Rückstand zwischen AcOEt/H2O verteilt. Die organische

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6. Experimenteller Teil 95

Phase wurde mit 5% KHSO4 und 5% NaHCO3 gewaschen, getrocknet und das LM

abgezogen. Die Verbindung kristallisierte im Vakuum.

Ausbeute: 597 mg (96%); HPLC (Gradient A): tR 11,2 min; ESI-MS: m/z = 325,4

(M+H)+; ber. für C15H20N2O6: 324,2

N-Boc-(4-Amino)-Phenylalanin-Methylester (17):

Die Titelverbindung wurde durch katalytische Hydrierung (vgl. Verbindung 14) von

Verbindung 16 gewonnen und über eine Kieselgelsäule (25 x 5 cm, Eluent:

Hexan/AcOEt/AcOH = 10:10:1) gereinigt.

Ausbeute: 730 mg (57%); HPLC (Gradient A): tR 6,7 min; DC (Laufm. D): Rf =

0,40; ESI-MS: m/z = 295,4 (M+H)+; ber. für C15H22N2O4: 294,2

N-Boc-(4-Guanidino)-Phenylalanin-Methylester Hydrochlorid (18):

Die Titelverbindung wurde aus (17) (500 mg; 1,67 mmol) nach AAV2 unter Zusatz

von TEA (256 µl; 1,5 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 342 mg (55%); HPLC (Gradient A): tR 7,5 min; ESI-MS: m/z = 337,2

(M+H)+; ber. für C22H30N4O4: 336,2

N-TIPS-(4-Nitro)-Phenylalanin-Methylester (19):

Eine Lösung von Verbindung 12 (80 mg; 0,31 mmol), 2,3,5-Triisopropyl-Phenyl-

Sulfonylchlorid (103 mg; 0,341 mmol) und TEA (86 µl; 0,62 mmol) in DMF (1 ml)

wurde bei RT gerührt. Nach 3 h wurde das LM abgezogen, der Rückstand in AcOEt

(10 ml) aufgenommen und mit 5% KHSO4 , 5% NaHCO3 und Wasser gewaschen.

Die organische Phase wurde getrocknet (Na2SO4) und das LM abgezogen. Das

erhaltene farblose Öl wurde ohne weitere Aufarbeitung weiterverarbeitet.

Ausbeute: 110 mg (71%); DC (Laufm. A): Rf = 0,50; HPLC (Gradient A): tR 13,7

min; ESI-MS: m/z = 491,4 (M+H)+; ber. für C25H34N2O6S1: 490,2

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6. Experimenteller Teil 96

N-TIPS-(4-Amino)-Phenylalanin-Methylester (20):

Die Titelverbindung wurde durch katalytische Reduktion von Verbindung 19 (110

mg; 0,22 mmol) in Methanol erhalten. Nach 4 h wurde der Kat. abfiltriert und das

LM abgezogen. Nach Trocknung im Vakuum wurde ein weißes Pulver erhalten.

Ausbeute: 100 mg (99%); HPLC (Gradient A): tR 10,9 min

N-TIPS-(4-Guanidino)-Phenylalanin-Methylester Hydrochlorid (21):

Die Titelverbindung wurde nach AAV2 erhalten unter Zusatz von TEA (30 µl;0,217

mmol). Die bis-Z-geschützte Guanidinoverbindung wurde über eine Kieselgelsäule

gereinigt (Säule: 19 cm x 2 cm; Fließmittel: Hexan/Ether = 1:4; Rf = 0,85).

Ausbeute: 20 mg (17%); HPLC (Gradient A): tR 13,7 min; ESI-MS: m/z = 503,2

(M+H)+; ber. für C26H38N4O4S1: 502,3

4-(N-Boc-Aminomethyl)-Anilin (22):

Zu einer Lösung von 4-Aminobenzylamin (2 ml; 17,6 mmol) in 10 ml Dioxan und

2N NaOH (17,6 ml; 35,2 mmol) wurde eine Lösung von Boc2O (3,08 g; 14,6 mmol)

in Dioxan (30 ml) zugetropft und über Nacht gerührt. Nach Abziehen des LM

wurde der Rückstand zwischen AcOEt/H2O verteilt, die organische Phase 2x mit

H2O gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und das LM abgezogen. Nach Trocknung im

Vakuum wurde ein hellgelbes Pulver erhalten.

Ausbeute: 2,38 g (76%); HPLC (Gradient A): tR 5,6 min; ESI-MS: m/z = 223,0

(M+H)+; ber. für C12H12N2O2: 222,1

1-[4-(N-Boc-Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin (23):

Die Titelverbindung wurde durch Guanidinylierung von Verbindung 22 (500 mg;

2,24 mmol) nach AAV2 hergestellt.

Ausbeute: 1,07 g (90%); HPLC (Gradient A): tR 13,4 min; ESI-MS: m/z = 533,4

(M+H)+; ber. für C29H32N4O6: 532,2

1-[4-(Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin Hydrochlorid (24):

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6. Experimenteller Teil 97

Verbindung 23 (1 g; 1,878 mmol) wurde in eiskalter 3N HCl/Dioxan Lösung (20

ml) gelöst und anschließend für 2 h bei RT gerührt. Das LM wurde abgezogen und

das kristalline Produkt im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 872 mg (99%); HPLC (Gradient A): tR 10,2 min; ESI-MS: m/z = 433,3

(M+H)+; ber. für C29H32N4O6: 432,1

4-(N-Z-Aminomethyl)-Anilin (25):

Zu einer Lösung von 4-Aminobenzylamin (1 ml; 8,82 mmol) in 10 ml Dioxan und

2N NaOH (8,82 ml; 17,64 mmol) wurde bei 0°C eine Lösung von Z-Cl (1,12 ml;

7,94 mmol) in Dioxan (5 ml) zugetropft und über Nacht bei RT gerührt. Nach

Abziehen des LM wurde der Rückstand in 100 ml H2O aufgenommen, mit 6N HCl

auf pH 1 angesäuert und die als Nebenprodukt entstandene di-Z-Verbindung 2x mit

wenig AcOEt extrahiert. Die organische Phase wurde nochmals mit 3N HCl

gewaschen. Nach Vereinigung der wäßrigen Lösungen wurde der pH-Wert mit

NaHCO3 auf 10 erhöht und das Produkt 3x mit AcOEt extrahiert. Die vereinigten

organischen Phasen wurden getrocknet (Na2SO4), das LM abgezogen und das

erhaltene Öl mit Hexan behandelt um einen leicht gelblichen Feststoff zu erhalten.

Ausbeute: 1,35 g (60%); HPLC (Gradient A): tR 7,0 min; ESI-MS: m/z = 257,1

(M+H)+; ber. für C15H16N2O2: 256,1

1-[4-(N-Z-Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Boc-Guanidin (26):

Die Titelverbindung wurde durch Guanidinylierung von Verbindung 25 (495 mg;

1,93 mmol) nach AAV1 synthetisiert.

Ausbeute: 670 mg (70%); HPLC (Gradient A): tR 12,1 min; ESI-MS: m/z = 499,2

(M+H)+; ber. für C26H34N4O6: 498,3

1-[4-(Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Boc-Guanidin Hydrochlorid (27):

Die Titelverbindung wurde durch katalytische Hydrierung von Verbindung 26 (600

mg; 1,2 mmol) in Ethanol gewonnen. Nach Abfiltrieren des Kat. und Abziehen des

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6. Experimenteller Teil 98

LMs wurde der Rückstand in wenig i-PrOH aufgenommen, mit 6N HCl/Dioxan

(200 µl; 1,2 mmol) versetzt und mit DIPE ausgefällt.

Ausbeute: 355 mg (74%); HPLC (Gradient A): tR 8,1 min; ESI-MS: m/z = 365,2

(M+H)+; ber. für C18H28N4O4: 364,2

4-(N-Z-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrotrifluoracetat (28):

Die Titelverbindung wurde durch Abspalten der Boc-Schutzgruppen mit TFA (1,5

ml) aus Verbindung 26 (25 mg; 0,05 mmol) gewonnen. Nach Abziehen der TFA

wurde das Produkt aus i-PrOH/DIPE gefällt.

Ausbeute: 18 mg (90%); HPLC (Gradient A): tR 7,6 min; ESI-MS: m/z = 299,2

(M+H)+; ber. für C16H18N4O2: 298,1

4-(N-Boc-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid (29):

Die Titelverbindung wurde durch kat. Hydrierung von Verbindung 23 (25 mg;

0,047 mmol) gewonnen. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Abziehen des LMs

wurde das Rohprodukt in wenig i-PrOH aufgenommen, mit 6N HCl/Dioxan (8 µl;

0,047 mmol) versetzt und mit DIPE ausgefällt.

Ausbeute: 12 mg (85%); HPLC (Gradient A): tR 7,1 min; ESI-MS: m/z = 265,4

(M+H)+; ber. für C13H20N4O2: 264,2

1-[4-(N-Boc-Amino)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin (30):

Die Titelverbindung wurde aus 4-(N-Boc-Amino)-anilin (500 mg; 2,4 mmol) nach

AAV2 synthetisiert.

Ausbeute: 1,12 g (90%); HPLC (Gradient A): tR 14,9 min; ESI-MS: m/z = 519,2

(M+H)+; ber. für C28H30N4O6: 518,2

4-(N-Boc-Amino)-Phenylguanidin Hydrochlorid (31):

Die Titelverbindung wurde durch katalytische Hydrierung von Verbindung 30 (50

mg; 0,097 mmol) in AcOEt erhalten. Nach Abfiltrieren des Katalysators und

Abziehen des LMs, wurde das Rohprodukt in wenig Dioxan gelöst, mit HCl/Dioxan

(16 µl; 0,097 mmol) angesäuert und mit DIPE gefällt.

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6. Experimenteller Teil 99

Ausbeute: 21 mg (76%); HPLC (Gradient A): tR 7,1 min; ESI-MS: m/z = 251,2

(M+H)+; ber. für C12H18N4O2: 250,1

4-Guanidinomethyl-Phenylguanidin di-Hydrochlorid (32):

Die Titelverbindung wurde aus 4-Aminobenzylamin (200 mg; 0,447 mmol) durch

zweifache Guanidinylierung nach AAV2 synthetisiert.

Ausbeute: 67 mg (54%); ESI-MS: m/z = 207,2 (M+H)+; ber. für C9H14N6: 206,1

4-(N-Ethyloxycarbonyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid (33):

Eine Lösung von 1-[4-(Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin Hydrochlorid

(24) (50 mg; 0,107 mmol), Chlorameisensäureethylester (10 µl; 0,107 mmol) und

TEA (45 µl; 0,321 mmol) in DCM (1 ml) wurde über Nacht bei RT gerührt. Nach

Abziehen des LMs wurde der Rückstand in AcOEt gelöst und 3x mit 5% KHSO4

und 1x mit H2O gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (Na2SO4) und

das LM abgezogen.

Die Z-Schutzgruppen wurden durch katalytische Hydrierung an Pd/C in Methanol

abgespalten. Nach Abfiltrieren des Katalysators wurde das LM abgezogen und das

Produkt mit DIPE aus i-PrOH (nach Zusatz von einem Äquivalent HCl/Dioxan)

gefällt.

Ausbeute: 12 mg (42%); HPLC (Gradient A): tR 5,0 min; ESI-MS: m/z = 236,2

(M+H)+; ber. für C11H16N4O2: 236,1

4-(N-Neopentyloxycarbonyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid (34):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 33 mit Chlorameisensäure-

neopentylester (16 µl; 0,107 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 28 mg (83%); HPLC (Gradient A): tR 8,2 min; ESI-MS: m/z = 279,4

(M+H)+; ber. für C14H22N4O2: 278,2

4-(N-Isobutyloxycarbonyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid (35):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 33 mit Chlorameisensäure-

isobutylester (14 µl; 0,107 mmol) synthetisiert.

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6. Experimenteller Teil 100

Ausbeute: 18 mg (56%); HPLC (Gradient A): tR 7,5 min; ESI-MS: m/z = 265,4

(M+H)+; ber. für C13H20N4O2: 264,2

4-(N-Adamantyloxycarbonyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid (36):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 33 mit Fluorameisensäure-

adamantylester (21 mg; 0,107 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 15 mg (37%); HPLC (Gradient A): tR 9,9 min; ESI-MS: m/z = 343,4

(M+H)+; ber. für C19H26N4O2: 342,2

4-[N-(2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl)-Aminomethyl]-Phenylguanidin Hydro-

chlorid (37):

Eine Lösung von 1-[4-(Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin Hydrochlorid

(24) (50 mg; 0,107 mmol), 2,4,6-Triisopropylphenylsulfonylchlorid (32 mg; 0,107

mmol) und TEA (45 µl; 0,321 mmol) in DCM (1 ml) wurde über Nacht bei RT

gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde der Rückstand in AcOEt gelöst und 3x mit

0,5N HCl und 1x mit H2O gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet

(Na2SO4) und das LM abgezogen.

Die Z-Schutzgruppen wurden durch katalytische Hydrierung an Pd/C in Methanol

abgespalten. Nach Abfiltrieren des Katalysators wurde das LM abgezogen und das

Produkt mit DIPE aus i-PrOH gefällt.

Ausbeute: 18 mg (37%); HPLC (Gradient A): tR 10,6 min; ESI-MS: m/z = 431,4

(M+H)+; ber. für C23H34N4O2S1: 430,2

4-[N-(Pentafluorphenylsulfonyl)-Aminomethyl]-Phenylguanidin Hydrochlorid (38):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 37 mit Pentafluorphenyl-

sulfonylchlorid (16 µl; 0,107 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 10 mg (22%); HPLC (Gradient A): tR 8,1 min; ESI-MS: m/z = 395,0

(M+H)+; ber. für C14H11N4O2S1F5: 394,1

4-[N-(4-Acetamido-Phenylsulfonyl)-Aminomethyl]-Phenylguanidin Hydrochlorid

(39):

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6. Experimenteller Teil 101

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 37 mit 4-Acetamido-phenyl-

sulfonylchlorid (25 mg; 0,107 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 23 mg (54%); HPLC (Gradient A): tR 9,3 min; ESI-MS: m/z = 362,0

(M+H)+; ber. für C16H19N5O3S1: 361,1

4-[N-(3-Trifluormethyl-Phenylsulfonyl)-Aminomethyl]-Phenylguanidin Hydro-

chlorid (40):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 37 mit 3-Trifluormethylphenyl-

sulfonylchlorid (17 µl; 0,107 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 15 mg (34%); HPLC (Gradient A): tR 8,3 min; ESI-MS: m/z = 373,4

(M+H)+; ber. für C15H15N4O2S1F3: 372,1

4-[N-(4-Trifluormethyl-Phenylsulfonyl)-Aminomethyl]-Phenylguanidin Hydro-

chlorid (41):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 37 mit 4-Trifluormethylphenyl-

sulfonylchlorid (26 mg; 0,107 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 18 mg (41%); HPLC (Gradient A): tR 8,4 min; ESI-MS: m/z = 373,0

(M+H)+; ber. für C15H15N4O2S1F3: 372,1

4-[N-(2-Acetamido-4-Methyl-5-Thiazolsulfonyl)-Aminomethyl]-Phenylguanidin

Hydrochlorid (42):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 37 mit 2-Acetamido-4-Methyl-5-

Thiazolsulfonylchlorid (26 mg; 0,107 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 43 mg (96%); HPLC (Gradient A): tR 6,7 min; ESI-MS: m/z = 383,2

(M+H)+; ber. für C14H18N6O3S2: 382,1

4-[N-(Trifluormethylsulfonyl)-Aminomethyl]-Phenylguanidin Hydrochlorid (43):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 37 mit Trifluormethyl-

sulfonylchlorid (18 µl; 0,107 mmol) synthetisiert. Das ausgefällte Rohprodukt

wurde durch präparative HPLC (linearer Gradient von 5% ACN auf 60% ACN in

30 min.) weiter aufgereinigt.

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6. Experimenteller Teil 102

Ausbeute: 9 mg (21%); HPLC (Gradient A): tR 6,9 min; ESI-MS: m/z = 297,2

(M+H)+; ber. für C9H11N4O2S1F3: 296,1

4-[N-(1,2,3,4-Tetrahydro-2-(Trifluoracetyl)-Isochinolin-7-Sulfonyl)-Aminomethyl]-

Phenylguanidin Hydrochlorid (44):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 37 mit 1,2,3,4-Tetrahydro-2-

(Trifluoracetyl)-Isochinolin-7-Sulfonylchlorid (35 mg; 0,107 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 8 mg (15%); HPLC (Gradient A): tR 8,3 min; ESI-MS: m/z = 456,4

(M+H)+; ber. für C19H20N5O3S1F3: 455,1

4,4'-Bis-(4-Guanidino-Benzylaminosulfonyl)-Diphenylether Dihydrochlorid (45):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 37 mit 4,4‘-Bis-Chlorosulfonyl-

Diphenylether (19,6 mg; 0,054 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 15 mg (53%); HPLC (Gradient A): tR 8,0 min; ESI-MS: m/z = 623,6

(M+H)+ und m/z = 312,4 (M+2H)2+; ber. für C20H19N4O5S2: 622,2

1-[4-(N-Boc-Glycyl-Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin (46):

Eine Lösung von 1-[4-(Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin Hydrochlorid

(24) (200 mg; 0,426 mmol), Boc-Gly-OSu (116 mg; 0,426 mmol) und TEA (119 µl;

0,852 mmol) in DMF (5 ml) wurde über Nacht bei RT gerührt. Nach Abziehen des

LMs wurde der Rückstand in AcOEt aufgenommen und 3x mit 5% KHSO4, 3x 5%

NaHCO3 und H2O gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (Na2SO4)

und das LM abgezogen.

Ausbeute: 236 mg (94%); HPLC (Gradient A): tR 12,4 min; ESI-MS: m/z = 590,2

(M+H)+; ber. für C31H35N5O7: 589,2

4-(N-Boc-Glycyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid (47):

Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 46 (16 mg; 0,027 mmol) durch

katalytische Hydrierung über Pd/C in MeOH gewonnen.

Ausbeute: 9 mg (94%); HPLC (Gradient A): tR 6,0 min; ESI-MS: m/z = 322,4

(M+H)+; ber. für C15H23N5O3: 321,2

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6. Experimenteller Teil 103

1-[4-(H-Glycyl-Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin Hydrochlorid (48):

Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 46 (260 mg; 0,441 mmol) durch

Entschützen in 3M HCl/Dioxan (10 ml) hergestellt. Nach 1 h wurde das LM

abgezogen und das Produkt aus i-PrOH/DIPE gefällt.

Ausbeute: 180 mg (76%); HPLC (Gradient A): tR 10,1 min; ESI-MS: m/z = 490,4

(M+H)+; ber. für C26H27N5O5: 489,3

4-(4-Acetamidophenylsulfonyl-Glycyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid

(49):

Eine Lösung von 4-(H-Glycyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid (48)

(30 mg; 0,057 mmol), 4-Acetamidophenylsulfonylchlorid (13 mg; 0,057 mmol) und

TEA (24 µl; 0,171 mmol) in DCM (1 ml) wurde 4 h bei RT gerührt. Nach Abziehen

des LMs wurde der Rückstand in AcOEt aufgenommen und mit 1M HCl

gewaschen. Das LM wurde abgezogen und der Rückstand in MeOH über Pd/C

katalytischen hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wurde die Lösung im

Vakuum stark eingeengt und das Produkt mit Ether ausgefällt.

Ausbeute: 21 mg (81%); HPLC (Gradient A): tR 5,8 min; ESI-MS: m/z = 419,2

(M+H)+; ber. für C18H22N6O4S1: 418,1

4-(2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl-Glycyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin

Hydrochlorid (50):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 49 mit 2,4,6-Triisopropyl-

phenylsulfonylchlorid (17 mg; 0,057 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 10 mg (33%); HPLC (Gradient A): tR 10,3 min; ESI-MS: m/z = 488,4

(M+H)+; ber. für C25H37N5O3S1: 487,3

4-(4-Nitrobenzyloxycarbonyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrotrifluoracetat

(51):

Eine Lösung von 1-[4-(Aminomethyl)-phenyl]-2,3-Di-Boc-guanidin Hydrochlorid

(27) (50 mg; 0,125 mmol), Chlorameisensäure-4-Nitrobenzylester (27 mg; 0,125

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6. Experimenteller Teil 104

mmol) und TEA (52 µl; 0,375 mmol) in DCM (1 ml) wurde über Nacht bei RT

gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde der Rückstand in AcOEt aufgenommen,

mit 0,5 M HCl und H2O gewaschen und die organische Phase getrocknet (Na2SO4).

Nach Abziehen des LMs wurde der Rückstand 1,5 h in 95% TFA (2 ml) gerührt um

die Boc-Schutzgruppen abzuspalten. Die Lösung wurde im Vakuum stark eingeengt

und das Produkt mit DIPE ausgefällt.

Ausbeute: 15 mg (27%); HPLC (Gradient A): tR 8,1 min; ESI-MS: m/z = 344,0

(M+H)+; ber. für C16H17N5O4: 343,1

4-(6-Nitroveratryloxycarbony)-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrotrifluoracetat

(52):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 51 mit Chlorameisensäure-

nitroveratrylester synthetisiert.

Ausbeute: 18 mg (28%); HPLC (Gradient A): tR 8,1 min; ESI-MS: m/z = 404,2

(M+H)+; ber. für C18H21N5O6: 403,2

4-(4-Phenylazobenzyloxycarbony-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrotrifluor-

acetat (53):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 51 mit Chlorameisensäure-4-

phenylazobenzylester (Schwyzer, R. et al. 1958) synthetisiert.

Ausbeute: 25 mg (39%); HPLC (Gradient A): tR 10,0 min; ESI-MS: m/z = 403,2

(M+H)+; ber. für C22H22N6O2: 402,2

2,2-bis-[N-(4-Guanidinobenzyl)-Carbamoyloxy-4-Phenyl]-Propan di-Hydrochlorid

(54):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 51 mit 2,2-Bis-[4-

(Chlorcarbonyloxy)-Phenyl]-Propan (22 mg; 0,0625 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 19 mg (45%); HPLC (Gradient A): tR 8,8 min; ESI-MS: m/z = 609,4

(M+H)+ und 305,2 (M+2H)2+; ber. für C33H36N8O4: 608,3

N-Phenyl-N'-(4-guanidinobenzyl)thioharnstoff Hydrotrifluoracetat (55):

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6. Experimenteller Teil 105

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 51 mit Phenylisothiocyanat (15

µl; 0,125 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 20 mg (39%); HPLC (Gradient A): tR 6,3 min; ESI-MS: m/z = 300,2

(M+H)+; ber. für C15H17N5S1: 299,1

Benzoesäure-(4-Guanidino)-Benzylamid Hydrochlorid (56):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 24 mit Benzoylchlorid (12 µl;

0,107 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 21 mg (64%); HPLC (Gradient A): tR 5,5 min; ESI-MS: m/z = 269,2

(M+H)+; ber. für C15H16N4O1: 268,1

2-Iod-Essigsäure-(4-Guanidino)-Benzylamid Hydrotrifluoracetat(57):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 51 mit Iodessigsäre-p-

Nitrophenylester (23 mg; 0,107 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 42 mg (76%); HPLC (Gradient A): tR 2,7 min; ESI-MS: m/z = 333,0

(M+H)+; ber. für C10H13N4O1I1: 332,0

2-(1-Adamantyl)-Essigsäure-(4-Guanidino)-Benzylamid Hydrotrifluoracetat (58):

Eine Lösung von Verbindung 24 (50 mg; 0,123 mmol), 2-(1-Adamantyl)-

Essigsäure (21 mg; 0,107 mmol), TBTU (40 mg; 0,107 mmol), HOBt (17 mg; 0,123

mmol) und TEA (45 µl; 0,321 mmol) in DMF (1ml) wurde über Nacht bei RT

gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde der Rückstand in AcOEt aufgenommen,

mit 5% KHSO4 und 5% NaHCO3 gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und das LM

abgezogen. Der Rückstand wurde in 95% TFA (3 ml) für 3 h gerührt, das LM

abgezogen und das Rohprodukt mit DIPE aus iPrOH ausgefällt.

Ausbeute: 15 mg (31%); HPLC (Gradient A): tR 8,7 min; ESI-MS: m/z = 341,2

(M+H)+; ber. für C20H28N4O1: 340,2

4-Aminomethylphenylguanidin di-Hydrochlorid (59):

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6. Experimenteller Teil 106

Die Titelverbindung wurde durch kat. Hydrierung von Verbindung 24 (65 mg;

0,139 mmol) an 10% Pd/C in MeOH (10 ml) nach Zusatz von 6 N HCl/Dioxan (47

µl; 0,28 mmol) gewonnen.

Ausbeute: 30 mg (91%); HPLC (Gradient A): tR 1,0 min; ESI-MS: m/z = 165,2

(M+H)+; ber. für C8H12N4: 164,1

N-(1-Adamantyl)-N'-(4Guanidinobenzyl)-Thioharnstoff Hydrochlorid (60):

Eine Lösung von Verbindung 59 (30 mg; 0,127 mmol), 1-Adamantylisothiocyanat

(24 mg; 0,127 mmol) und TEA ( 17,6 µl; 0,127 mmol) in DMF (1 ml) wurde 5 h bei

RT gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde der Rückstand mit DIPE aus iPrOH

gefällt und 2 mal mit Ether gewaschen.

Ausbeute: 14 mg (28%); HPLC (Gradient A): tR 9,8 min; ESI-MS: m/z = 358,0

(M+H)+; ber. für C19H27N5S1: 357,2

3-(4-N,N'-di-Z-Guanidino)-Phenyl-Propionsäure (61):

Eine Suspension von 3-(4-Amino)-Phenyl-Propionsäure (200 mg; 1,21 mmol) und

N,N’-Dibenzyloxycarbonyl-N''-triflylguanidin (556 mg; 1,21 mmol) in Aceton (200

µl) wurde im geschlossenen Gefäß für ca. 5 min auf 50 °C erhitzt, wodurch sich

eine klare gelbe Lösung ergab. Nach kurzer Zeit fiel das Produkt aus der Lösung

aus, und die zähe Suspension wurde mit Aceton (1ml) verdünnt und weitere 30 min

gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde der Rückstand 3x mit DIPE gewaschen.

Ausbeute: 550 mg (83%); HPLC (Gradient A): tR 10,8 min; ESI-MS: m/z = 476,2

(M+H)+; ber. für C26H25N3O6: 475,2

3-(4-Guanidinophenyl)-Propionsäure-(1-Adamantyl)-Amid Hydrochlorid (62):

Eine Lösung von Verbindung 61 (100 mg; 0,21 mmol), 1-Adamantylamin (32 mg;

0,21 mmol), TBTU (81 mg; 0,252 mmol), HOBt (34 mg; 0,252 mmol) und TEA

(88 µl; 0,63 mmol) in DMF (2 ml) wurde 1 h bei RT gerührt. Nach Abziehen des

LMs wurde der Rückstand in AcOEt aufgenommen und mit 5% NaHCO3, 0,5 M

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6. Experimenteller Teil 107

HCl und H2O gewaschen. Nach Trocknen (Na2SO4) und Abziehen des LMs wurde

das geschützte Zwischenprodukt aus MeOH (500 µl) umkristallisiert.

Die Z-Schutzgruppen wurden durch katalytische Hydrierung (10% Pd/C) in MeOH

abgespalten. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Abziehen des LMs bildete sich

ein farbloses Öl, das sich durch Behandlung mit Ether und Hexan verfestigen ließ.

Ausbeute: 21 mg (27%); HPLC (Gradient A): tR 7,4 min; ESI-MS: m/z = 341,0

(M+H)+; ber. für C20H28N4O1: 340,2

1-Adamantylcarbonsäure-(4-Guanidinobenzyl)-Amid Hydrochlorid (63):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 33 mit 1-Adamantyl-

carbonsäurechlorid (21 mg; 0,107 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 17 mg (40%); HPLC (Gradient C): tR 5,8 min; ESI-MS: m/z = 327,2

(M+H)+; ber. für C19H26N4O1: 326,2

Boc-Phe-(4-Guanidinobenzyl)-Amid Hydrochlorid (64):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 33 mit Boc-Phe-OSu (39 mg;

0,107 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 15 mg (31%); HPLC (Gradient C): tR 5,9 min; ESI-MS: m/z = 412,0

(M+H)+; ber. für C22H29N5O3: 411,2

H-Phe-(4-Guanidinobenzyl)-Amid Hydrochlorid (65):

Die Titelverbindung wurde durch Rühren von Verbindung 65 (8 mg; 0,018 mmol)

in 6N HCl/Dioxan (100 µl) erhalten. Das Produkt wurde mit DIPE ausgefällt und

im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 5 mg (72%); HPLC (Gradient C): tR 1,0 min; ESI-MS: m/z = 312,2

(M+H)+; ber. für C17H21N5O1: 311,2

N-(1-Adamantyl)-N'-(3-Nitrobenzyl)-Harnstoff (66):

Eine Lösung von 3-Nitrobenzylammoniumchlorid (100 mg: 0,53 mmol), 1-

Adamantylisocyanat (94 mg; 0,53 mmol) und TEA (148 µl; 1,06 mmol) in DCM (4

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6. Experimenteller Teil 108

ml) wurde über Nacht bei 4° stehen gelassen. Nach Abziehen des LMs wurde der

Rückstand in AcOEt aufgenommen, mit 0,5 M HCl und H2O gewaschen und die

organische Phase getrocknet (Na2SO4). Durch Abziehen des LMs und Trocknen im

Vakuum wurde ein weisses Produkt erhalten.

Ausbeute: 172 mg (99%); HPLC (Gradient C): tR 7,4 min; ESI-MS: m/z = 330,2

(M+H)+; ber. für C18H23N3O3: 329,2

N-(1-Adamantyl)-N'-(3-Aminobenzyl-Harnstoff (67):

Die Titelverbindung wurde durch katalytische Reduktion (10% Pd/C) von

Verbindung 66 in 20 ml MeOH/AcOEt = 1:1 erhalten.

Ausbeute: 100 mg (64%); HPLC (Gradient C): tR 5,7 min; ESI-MS: m/z = 300,1

(M+H)+; ber. für C18H25N3O1: 299,1

N-(1-Adamantyl)-N'-(3-Guanidinobenzyl)-Harnstoff (68):

Die Titelverbinding wurde aus Verbindung 67 (50 mg; 0,167 mmol) nach AAV1

synthetisiert. Die Z-Schutzgruppen wurden anschließend durch katalytische

Hydrierung abgespalten.

Ausbeute: 28 mg (44%); HPLC (Gradient C): tR 5,7 min; ESI-MS: m/z = 342,2

(M+H)+; ber. für C19H27N5O1: 341,2

N-Boc-3-Nitrobenzylamin (69):

Eine Lösung von 3-Nitro-Benzylammoniumchlorid (800 mg; 4,24 mmol) und

Boc2O (925 mg; 4,24 mmol) in einer Mischung aus Dioxan (10 ml) und 2 M NaOH

(4,24 mml; 8,48 mmol) wurde 2h bei RT gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde

der Rückstand in AcOEt aufgenommen, mit 5% KHSO4, 5% NaHCO3 und H2O

gewaschen und getrocknet (Na2SO4). Nach Abziehen des LMs wurde das

resultierende Öl mit DIPE behandelt, wobei das Produkt kristallisierte.

Ausbeute: 860 mg (80%); HPLC (Gradient C): tR 7,1 min; ESI-MS: m/z = 253,2

(M+H)+; ber. für C12H16N2O4: 252,1

N-Boc-3-Aminobenzylamin (70):

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6. Experimenteller Teil 109

Die Titelverbindung wurde durch katalytische Hydrierung von N-Boc-3-

Nitrobenzylamin (69) (860 mg; 2,52 mmol) in MeOH gewonnen.

Ausbeute: 720 mg (82%); HPLC (Gradient C): tR 2,5 min; ESI-MS: m/z = 223,2

(M+H)+; ber. für C12H16N2O4: 222,1

1-[3-(N-Boc-Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin (71):

Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 70 (700 mg; 2,7 mmol) durch

Guanidinylierung nach AAV1 erhalten. Das Rohprodukt wurde 2x aus MeOH

umkristallisiert.

Ausbeute: 720 mg (38%); HPLC (Gradient C): tR 8,3 min; ESI-MS: m/z = 533,4

(M+H)+; ber. für C29H32N4O6: 532,2

1-[3-Aminomethyl-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin Hydrochlorid (72):

Die Titelverbindung wurde durch Abspalten der Boc-Schutzgruppe von Verbindung

71 (500 mg; 0,937 mmol) in 6N HCl/Dioxan (2 ml) gewonnen.

Ausbeute: 460 mg (98%); HPLC (Gradient C): tR 6,8 min; ESI-MS: m/z = 433,4

(M+H)+; ber. für C24H24N4O4: 432,2

3-(2,4,6-Tri-Isopropylphenylsulfonyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid

(73):

Eine Lösung von Verbindung 72 (30 mg; 0,064 mmol), 2,4,6-Tri-

Isopropylphenylsulfonylchlorid (19 mg; 0,064 mmol) und TEA (27 µl; 0,192

mmol) in DCM (1 ml) wurde 2h bei RT gerührt. Nach Verdünnen mit DCM (10 ml)

wurde die Lösung mit 5% KHSO4, 5% NaHCO3 und H2O gewaschen und das LM

abgezogen.

Die Z-Schutzgruppen wurden durch katalytische Hydrierung (10% Pd/C) in MeOH

[unter Zusatz von 1M HCl (60 µl)] abgespalten.

Ausbeute: 25 mg (83%); HPLC (Gradient C): tR 7,0 min; ESI-MS: m/z = 431,2

(M+H)+; ber. für C23H34N4O2S1: 430,2

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6. Experimenteller Teil 110

3-(N-Boc-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid (74):

Die Titelverbindung wurde durch katalytische Hydrierung aus Verbindung 71 (30

mg; 0,056 mmol) gewonnen. Das Produkt wurde aus iPrOH/Ether gefällt.

Ausbeute: 16 mg (96%); HPLC (Gradient C): tR 4,8 min; ESI-MS: m/z = 265,1

(M+H)+; ber. für C13H20N4O2: 264,2

N-(1-Adamantyl)-N'-(4-Guanidinobenzyl)-Harnstoff Hydrochlorid (75):

Eine Lösung von 1-[4-(Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin Hydrochlorid

(24) (50 mg; 0,107 mmol), 1-Adamantylisocyanat (19 mg; 0,107 mmol) und TEA

(45 µl; 0,321 mmol) in DCM (1 ml) wurde bei RT gerührt. Nach 5 h wurde das LM

abgezogen, der Rückstand in AcOEt (10 ml) aufgenommen und mit 0,1 M HCl

gewaschen. Nach Trocknung der organischen Phase (Na2SO4) wurde das LM

abgezogen.

Die Abspaltung der Z-Schutzgruppen erfolgte durch katalytische Reduktion (10%

Pd/C) in MeOH. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Abziehen des LMs wurde

das Produkt aus iPrOH/DIPE umkristallisiert.

Ausbeute: 30 mg (74%); HPLC (Gradient A): tR 8,6 min; ESI-MS: m/z = 342,2

(M+H)+; ber. für C19H27N5O1: 341,2

N-(2-Naphthyl)-N'-(4-Guanidinobenzyl)-Harnstoff Hydrochlorid (76):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 75 mit 2-Naphthylisocyanat (18

mg; 0,107 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 33 mg (83%); HPLC (Gradient A): tR 7,1 min; ESI-MS: m/z = 334,0

(M+H)+; ber. für C19H19N5O1: 333,2

N-(Phenyl)-N'-(4-Guanidinobenzyl)-Harnstoff Hydrochlorid (77):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 75 mit Phenylisocyanat (12 µl;

0,107 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 25 mg (56%); HPLC (Gradient A): tR 6,5 min; ESI-MS: m/z = 284,0

(M+H)+; ber. für C15H17N5O1: 283,1

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6. Experimenteller Teil 111

N-(2-Chloracetyl)-N'-(4-Guanidinobenzyl)-Harnstoff Hydrochlorid (78):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 75 mit 2-Chloracetylisocyanat

(9,1 µl; 0,107 mmol) synthetisiert.

Ausbeute: 17 mg (50%); HPLC (Gradient A): tR 6,6 min; ESI-MS: m/z = 284,0

(M+H)+; ber. für C11H147N5O2Cl1: 283,1

6.9. Synthese der Faktor Xa Inhibitoren

Allgemeine Arbeitsvorschrift 3 (AAV3): Synthese der Amidinofunktion aus

Nitrilen

Zur Synthese der Amidino-Funktion wurden die Vorschriften von (Jendralla, H. et

al. 1995; Stüber, W. et al. 1995) abgewandelt.

Eine Lösung des aromatischen Nitrils (3 mmol), Hydroxylammoniumchlorid (5,2

mmol) und KOH(f) (8,6 mmol) in absolutem EtOH (50 ml) wurde über Nacht

refluxiert. Nach Abfiltrieren des ausgefallenen KCl und Abziehen des LMs wurde

der Rückstand in H2O (50 ml) aufgenommen und mit 1M HCl auf pH 3 angesäuert.

Zur Abtrennung des Nebenprodukts (Amid) wurde die Lösung mit AcOEt extrhiert.

Anschließend wurde die wäßrige Phase 5x mit wassergesättigtem n-BuOH

extrahiert. Das LM der vereinten BuOH-Lösungen wurde bei 35 °C im HV

abgezogen und das Produkt (N-Hydroxyamidin) aus i-PrOH/DIPE gefällt.

Zur Synthese der Amidin-Verbindung wurde das entsprechende N-Hydroxyamidin

(2,7 mmol) bei 50 °C in H2O (100 ml) über 10% Pd/C hydriert (Anmerkung: Die

Reaktion konnte im Allgemeinen nicht durch HPLC verfolgt werden, da Edukt und

Produkt die gleiche Retentionszeit aufwiesen). Nach Abfiltrieren des Katalysators

wurde das LM abgezogen (HV, 40 °C), mit Toluol nachrotiert und das Produkt im

Vakuum getrocknet.

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6. Experimenteller Teil 112

Spezielle Arbeitsvorschriften:

N-Boc-D/L-(3-Cyano)-Phenylalanin (79):

Zu einer Lösung von D/L-(3-Cyano)-Phenylalanin (5g; 26,3 mmol) in Dioxan (25

ml) und 1M NaOH (26,3 ml; 26,3 mmol) wurde unter Rühren eine Lösung von

Boc2O (5,74 g; 26,3 mmol) in Dioxan (5 ml) zugegeben. Nach 1 h wurde das LM

abgezogen, der Rückstand zwischen 5% KHSO4/AcOEt verteilt und 3x mit AcOEt

extrahiert. Die vereinten organischen Phasen wurden getrocknet (Na2SO4) und das

LM abgezogen. Das erhaltene Öl kristallisierte über Nacht bei 4 °C.

Ausbeute: 6,9 g (91%); DC (Laufm. B): Rf = 0,76; HPLC (Gradient A): tR 8,2 min;

ESI-MS: m/z = 291,0 (M+H)+; ber. für C15H18N2O4: 290,1

N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin Hydrochlorid (80):

Die Titelverbindung wurde aus Verbidung 79 (1 g; 3,44 mmol) nach AAV3

synthetisiert.

Ausbeute: 690 mg (58%); DC (Laufm. E): Rf = 0,18; HPLC (Gradient A): tR 5,3

min; ESI-MS: m/z = 308,4 (M+H)+; ber. für C15H21N3O4: 307,2

N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-Methylester Hydrochlorid (81):

Eine Lösung von Verbindung 80 (400 mg; 1,16 mmol) in MeOH (10 ml) wurde mit

6M HCl auf pH 2,5 angesäuert und 24 h bei RT stehen gelassen. Das LM wurde

abgezogen und das Produkt im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 415 mg (100%); DC (Laufm. E): Rf = 0,41; HPLC (Gradient A): tR 5,9

min; ESI-MS: m/z = 322,2 (M+H)+; ber. für C16H23N3O4: 321,2

D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-Methylester Di-hydrochlorid (82):

Eine Lösung von Verbindung 81 (230 mg; 0,64 mmol) in 6 M HCl/Dioxan (5ml)

wurde bei RT gerührt. Nach 1 h wurde das LM abgezogen und das Produkt im

Vakuum getrocknet.

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6. Experimenteller Teil 113

Ausbeute: 188 mg (100%); DC (Laufm. B): Rf = 0,10; ESI-MS: m/z = 222,2

(M+H)+; ber. für C11H15N3O2: 221,2

N-Fmoc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-Methylester Hydrochlorid (83):

Eine Lösung von Verbindung 82 (50 mg; 0,17 mmol), Fmoc-Cl (44 mg; 0,17 mmol)

und TEA (24 µl; 0,17 mmol) in DMF (500 µl) wurde bei RT gerührt. Um die

Reaktion zu vervollständigen wurde nach 30 min. nochmals TEA (12 µl; 0,085

mmol) zugegeben. Nach 3 h wurde das LM abgezogen und der Rückstand in H2O

gelöst und die Lösung mit 1M HCl auf pH 3 angesäuert. Der gebildete NS wurde

abzentrifugiert, im Vakuum getrocknet und aus AcOEt/DIPE umkristallisiert.

Ausbeute: 60 mg (73%); DC (Laufm. F): Rf = 0,58; HPLC (Gradient A): tR 8,0 min;

ESI-MS: m/z = 444,0 (M+H)+; ber. für C26H25N3O4: 443,2

N-Adoc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-Methylester Hydrochlorid (84):

Die Titelverbindung wurde wie für Verbindung 83 beschrieben mit Adoc-F (32 mg;

0,16 mmol) synthetisiert und aus AcOEt/DIPE umkristallisiert.

Ausbeute: 60 mg (86%); DC (Laufm. F): Rf = 0,55; HPLC (Gradient A): tR 7,6 min;

ESI-MS: m/z = 400,0 (M+H)+; ber. für C22H29N3O4: 399,2

N-1-Adamantylaminocarbonyl-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-Methylester

Hydrochlorid (85):

Eine Lösung von Verbindung 82 (46 mg; 0,156 mmol), 1-Adamantylisocyanat

(27,7 mg; 0,156 mmol) und TEA (22 µl; 0,156 mmol) in DMF (500 µl) wurde 3 h

bei RT gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde der Rückstand aus i-PrOH/DIPE

umkristallisiert.

Ausbeute: 55 mg (81%); HPLC (Gradient A): tR 8,7 min; ESI-MS: m/z = 399,4

(M+H)+; ber. für C22H30N4O3: 398,2

N-Adoc-D/L-(3-Cyano)-Phenylalanin (86):

Eine Lösung von D/L-3-Cyanophenylalanin (2 g; 10,5 mmol), Adoc-F (2,08 g; 10,5

mmol) und 2 M NaOH (7,8 ml; 15,6 mmol) in Dioxan (50 ml) wurde 3 h bei RT

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6. Experimenteller Teil 114

gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde der Rückstand zwischen AcOEt/5%

KHSO4 verteilt und die wäßrige Phase 3x mit 5% KHSO4 extrahiert. Die

organischen Phasen wurden vereinigt, gertrocknet (Na2SO4) und das LM

abgezogen. Das erhaltene gelbliche Öl wurde mit Ether behandelt und bildete

anschließend im Vakuum einen weißen Schaum.

Ausbeute: 3,7 g (96%); DC (Laufm. B): Rf = 0,72; HPLC (Gradient A): tR 11,5 min;

ESI-MS: m/z = 369,4 (M+H)+; ber. für C21H24N2O4: 368,2

N-Adoc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin Hydrochlorid (87):

Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 86 (3,5 g; 9.5 mmol) nach AAV3

synthetisiert.

Ausbeute: 3,0 g (75%); HPLC (Gradient A): tR 9,4 min; ESI-MS: m/z = 386,4

(M+H)+; ber. für C21H27N3O4: 385,2

N-Adoc-D/L-(3-Cyano)-Phenylalanin-Piperidid Hydrochlorid (88):

Zu einer Lösung von Verbindung 86 (300 mg; 0,814 mmol) und Piperidin (480 µl;

4,88 mmol) in DCM (5 ml) wurde unter heftigem Rühren bei 0 °C langsam

Thonylchlorid (120 µl; 1,63 mmol) zugetropft. Anschließend wurde die Lösung 2 h

bei RT gerührt, mit DCM verdünnt und mit 5% NaHCO3, 5% KHSO4, und H2O

gewaschen. Nach Trocknung (Na2SO4) wurde das LM abgezogen und das Produkt

im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 240 mg (68%); DC (Laufm. G): Rf = 0,76; ESI-MS: m/z = 436,2

(M+H)+; ber. für C26H33N3O3: 435,3

N-Adoc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-Piperidid Hydrochlorid (89):

Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 88 (240 mg; 0,55 mmol) nach AAV3

synthetisiert.

Ausbeute: 84 mg (31%); HPLC (Gradient A): tR 10,0 min; ESI-MS: m/z = 453,4

(M+H)+; ber. für C26H36N4O3: 452,3

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6. Experimenteller Teil 115

N-Boc-D/L-(4-Amidino)-Phenylalanin Hydrochlorid (90):

Die Titelverbindung wurde ausgehend von D/L-4-Cyanophenylalanin analog zu

Verbindung 80 hergestellt.

Ausbeute: 57%; HPLC (Gradient A): tR 5,2 min; ESI-MS: m/z = 308,4 (M+H)+; ber.

für C15H21N3O4: 307,2

D/L-(4-Amidino)-Phenylalanin Di-hydrochlorid (91):

Die Titelverbindung wurde durch Entschützen von Verbindung 90 (625 mg; 2,037

mmol) in 6 M HCl/Dioxan hergestellt wie für Verbindung 82 beschrieben.

Ausbeute: 540 mg (95%); DC (Laufm. H): Rf = 0,23; ESI-MS: m/z = 208,3

(M+H)+; ber. für C10H13N3O2: 207,2

H-D/L-(4-Amidino)-Phenylalanin-Methylester di-Hydrochlorid (92):

Zu einer Lösung von Verbindung 91 (230 mg; 0,824 mmol) in MeOH (2 ml) wurde

bei –70 °C Thionylchlorid (180 µl; 2,47 mmol) zugetropft und anschließend 18 h

bei RT gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde das Produkt aus EtOH/Ether

kristallisiert.

Ausbeute: 182 mg (75%); DC (Laufm. H): Rf = 0,54; ESI-MS: m/z = 222,4

(M+H)+; ber. für C11H15N3O2: 221,1

N-Adoc-D/L-(4-Amidino)-Phenylalanin-Methylester Hydrochlorid (93):

Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 92 (50 mg; 0,17 mmol) mit Adoc-F

synthetisiert wie für Verbindung 84 beschrieben.

Ausbeute: 32 mg (43%); HPLC (Gradient A): tR 9,4 min; ESI-MS: m/z = 400,0

(M+H)+; ber. für C22H29N3O4: 399,2

N-Adoc-L-(3-Amidino)-Phenylalanin-MethylesterHydrochlorid (94):

Die Titelverbindung wurde aus L-(3-Cyano)-Phenylalanin analog zu Verbindung 84

synthetisiert.

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6. Experimenteller Teil 116

HPLC (Gradient A): tR 9,6 min; ESI-MS: m/z = 400,0 (M+H)+; ber. für C22H29N3O4:

399,2

N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin-MethylesterHydrochlorid (95):

Die Titelverbindung wurde aus D-(3-Cyano)-Phenylalanin analog zu Verbindung 84

synthetisiert.

HPLC (Gradient A): tR 8,2 min; ESI-MS: m/z = 400,0 (M+H)+; ber. für C22H29N3O4:

399,2

N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin Hydrochlorid (96):

Die Titelverbindung wurde aus D-(3-Cyano)-Phenylalanin analog zu Verbindung 87

synthetisiert.

HPLC (Gradient A): tR 9,0 min; ESI-MS: m/z = 386,0 (M+H)+; ber. für C21H27N3O4:

385,2

N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin-Propylamid Hydrochlorid (97):

Eine Lösung von Verbindung 96 (50 mg; 0,118 mmol), TBTU (46 mg; 0,142

mmol), HOBt (19 mg; 0,142 mmol) und n-Propylamin (29 µl; 0,354 mmol) in DMF

(2 ml) wurde 3 h bei RT gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde das erhaltene Öl

in AcOEt (20 ml) gelöst. Nach kurzer Zeit bildete sich ein weißer flockiger NS des

Produktes der abzentrifugiert, mit wenig AcOEt gewaschen und im Vakuum

getrocknet wurde.

Ausbeute: 11 mg (20%); HPLC (Gradient A): tR 7,9 min; ESI-MS: m/z = 427,4

(M+H)+; ber. für C24H34N4O3: 426,3

N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin-Benzylamid Hydrochlorid (98):

Zu einer Lösung von Verbindung 96 (30 mg; 0,071 mmol), Benzylamin (23 µl;

0,213 mmol) und HOBt (11 mg; 0,085 mmol) in DMF (2ml) wurde TBTU (27 mg;

0,085 mmol) zugegeben und die Reaktionsmischung 3 h bei RT gerührt. Nach

Abziehen des LMs wurde der Rückstand in AcOEt (10 ml) aufgenommen, mit 5%

NaHCO3 und H2O gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und das LM abgezogen. Nach

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6. Experimenteller Teil 117

Abziehen des LMs wurde das Rohprodukt erneut in AcOEt (1 ml) aufgenommen,

mit 6 M HCl/Dioxan (10 µl) versetzt und mit MTBE gefällt. Das Produkt wurde mit

Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 16 mg (43%); HPLC (Gradient C): tR 6,5 min; ESI-MS: m/z = 475,2

(M+H)+; ber. für C28H34N4O3: 474,3

N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin-[(2-Phenyl)-1-Ethylamid] Hydrochlorid (99):

Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 96 (30 mg; 0,071 mmol) mit

Phenethylamin (27 µl; 0,213 mmol) analog zu Verbindung 98 synthetisiert. Nach 3

h Reaktionszeit wurde nochmals TBTU (15 mg; 0,047 mmol) zugesetzt und die

Reaktionsmischung weitere 3 h gerührt um die Reaktion zu vervollständigen. Nach

Abziehen des LMs wurde der Rückstand in AcOEt (10 ml) aufgenommen, 3x mit

5% NaHCO3 und 1x mit 0,5 M HCl gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und das LM

abgezogen. Das Rohprodukt wurde aus i-PrOH/DIPE kristallisiert, mit Ether

gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 10 mg (27%); HPLC (Gradient C): tR 6,8 min; ESI-MS: m/z = 489,4

(M+H)+; ber. für C29H36N4O3: 488,3

N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin-[2-(4-Hydroxyphenyl)-1-Ethylamid] Hydro-

chlorid (100):

Eine Lösung von Verbindung 96 (30 mg; 0,071 mmol), Tyramin (9,7 mg; 0,071

mmol), TBTU (27 mg; 0,085 mmol) und HOBt (11 mg; 0,085 mmol) in DMF (2ml)

wurde mit TEA (30 µl; 0,215 mmol) versetzt und 3 h bei RT gerührt. Nach

Abziehen des LMs wurde der Rückstand in AcOEt gelöst, 3x mit 5% NaHCO3, 1x

mit 0,5 M HCl und 1x mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, getrocknet

(Na2SO4) und das LM abgezogen. Das Rohprodukt wurde in DIPE suspendiert und

im Ultraschallbad mit einem Tropfen 6 M HCl/Dioxan versetzt. Der NS wurde

abzentrifugiert, mit DIPE nochmals gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 25 mg (65%); HPLC (Gradient A): tR 9,9 min; ESI-MS: m/z = 505,2

(M+H)+; ber. für C29H36N4O4: 504,3

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6. Experimenteller Teil 118

N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin-(4-Cyano)-Benzylamid Hydrochlorid (101):

Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 96 mit 4-Cyanobenzylamin analog zu

Verbindung 100 synthetisiert und gereinigt.

Ausbeute: 19 mg (51%); HPLC (Gradient A): tR 10,3 min; ESI-MS: m/z = 500,2

(M+H)+; ber. für C29H33N5O3: 499,3

N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin-(4-N-Hydroxyamidino)-Benzylamid Hydro-

trifluoracetat (102):

Eine Lösung von Verbindung 101 (30 mg; 0,056 mmol),

Hydroxylammoniumchlorid (5,8 mg; 0,084 mmol) und TEA (11,7 µl; 0,084 mmol)

in abs. EtOH (1ml) wurde in einem fest verschlossenen Gefäß über Nacht bei 80 °C

gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde das Rohprodukt über präp. HPLC gereinigt

und lyophyllisiert.

Ausbeute: 5 mg (14%); HPLC (Gradient A): tR 8,2 min; ESI-MS: m/z = 533,4

(M+H)+; ber. für C29H36N6O4: 532,6

N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin-(4-Amidino)-Benzylamid Hydrotrifluoracetat

(103):

Die Titleverbindung wurde durch katalytische Hydrierung von Verbindung 102 (4

mg; 0,006 mmol) in MeOH (5ml) über Pd/C gewonnen. Nach Abziehen des LMs

wurde das Produkt aus H2O (20 ml) lyophyllisiert.

Ausbeute: 3 mg (90%); HPLC (Gradient A): tR 8,1 min; ESI-MS: m/z = 517,4

(M+H)+ und m/z = 259,2 (M+2H)2+; ber. für C29H36N6O4: 516,4

N-Adoc-D-(3-Amidino)-Pphenylalanin-Glycyl-OBz Hydrochlorid (104):

Die Titelverbindung wurde mit Glycin-Benzylester Toluolsulfonsäuresalz (23 mg;

0,071 mmol) analog zu Verbindung 100 synthetisiert.

Ausbeute: 20 mg (49%); HPLC (Gradient C): tR 6,8 min; ESI-MS: m/z = 533,4

(M+H)+; ber. für C30H36N4O5: 532,3

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6. Experimenteller Teil 119

N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-(N'-Methoxy-N'-Methyl)-Amid Hydrotrifluor-

acetat (105):

Eine Lösung von N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin Hydrochlorid (80) (100 mg;

0,29 mmol), N,O-Dimethyl-Hydroxylamin Hydrochlorid (28 mg; 0,29 mmol), TEA

(81 µl; 0,58 mmol) und DCC (68 mg; 0,348 mmol) wurde bei RT gerührt. Nach 1 h

wurde nochmals DCC (34 mg; 0,174 mmol) zugegeben. Nach Abfiltrieren des

Dicyclohexylharnstoffs wurde der Rückstand in H2O geöst, mit 1 M HCl auf pH 2,5

angesäuert und 2x mit AcOEt extrahiert. Nach Abziehen des Ethylacetats wurde das

Rohprodukt mittels präparativer HPLC aufgereinigt (Gradient von 5% ACN auf

60% ACN in 60 min.).

Ausbeute: 30 mg (22%); HPLC (Gradient A): tR 5,4 min; ESI-MS: m/z = 351,4

(M+H)+; ber. für C17H36N4O4: 350,2

N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-L-Prolyl-OBz Hydrochlorid (106):

Eine Lösung von N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin Hydrochlorid (80) (200 mg;

0,58 mmol), Prolinbenzylester Hydrochlorid (155 mg; 0,64 mmol), TEA (178 µl;

1,28 mmol) TBTU (206 mg; 0,64 mmol) und HOBt (86 mg; 0,64 mmol) wurde bei

RT gerührt. Nach 4 h wurde das LM abgezogen, der Rückstand in AcOEt gelöst

und mit 5% NaHCO3, 0,5 M HCl und H2O gewaschen. Das LM wurde abgezogen

und das Produkt aus iPrOH/DIPE gefällt.

Ausbeute: 170 mg (55%); HPLC (Gradient A): tR 7,8 min; ESI-MS: m/z = 495,4

(M+H)+; ber. für C27H34N4O5: 494,3

N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-L-Pro-OH Hydrochlorid (107):

Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 106 (150 mg; 0,28 mmol) durch

katalytische Hydrierung (10% Pd/C) gewonnen.

Ausbeute: 64 mg (51%); HPLC (Gradient A): tR 5,6 min und 5,9 min

(Diastereomere); ESI-MS: m/z = 405,4 (M+H)+; ber. für C20H28N4O5: 404,2

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6. Experimenteller Teil 120

N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-D-Pro-OBz Hydrochlorid (108):

Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 106 mit D-Prolinbenzylester

Hydrochlorid synthetisiert.

Ausbeute: 150 mg (48%); HPLC (Gradient A): tR 9,3 min; ESI-MS: m/z = 495,4

(M+H)+; ber. für C27H34N4O5: 494,3

N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-D-Pro-OH Hydrochlorid (109):

Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 108 (150 mg; 0,28 mmol) durch

katalytische Hydrierung (10% Pd/C) gewonnen.

Ausbeute: 60 mg (47%); HPLC (Gradient A): tR 7,0 min und 7,3 min

(Diastereomere); ESI-MS: m/z = 405,4 (M+H)+; ber. für C20H28N4O5: 404,2

N-Z-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-Piperidid Hydrochlorid (110):

Die Synthese und Inhibitionskonstanten der Titelverbindung wurden von Bernhard

Gabriel beschrieben (Gabriel, B. 1998).

Benzamidin Hydrochlorid (111):

Die Titelverbindung wurde von Fluka bezogen.

Benzylcarbamidin Hydrochlorid (112):

Die Titelverbindung wurde aus 2-Phenyl-Acetonitril nach AAV3 synthetisiert.

Ausbeute: (49%); ESI-MS: m/z = 135,2 (M+H)+; ber. für C8H10N2: 134,1

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7. Literaturverzeichnis 121

7. Literaturverzeichnis

Allgayer, H.; Heiss, M. M.; Schildberg, F. W. (1997). Prognostic factors in gastric

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Alonso, D. F.; Bertolesi, G. E.; Farias, E. F.; Gomez, D. E.; Joffe, E. B. D. (1996a).

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Alonso, D. F.; Farias, E. F.; Ladeda, V.; Davel, L.; Puricelli, L.; Joffe, E. B. D.

(1996b). Effects of synthetic urokinase inhibitors on local invasion and

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