Die Adsorption von DEAE Dextran an die Oberfläche von Schweinelymphozyten

Zbl. Vet. Med. B, 26, 577-590 (1979) @ 1979 Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg ISSN 0514-7166/ASTM-Coden: ZVRBAZ

Aus der Bundesforschungsanstalt f u r Viruskrankheiten der Tiere, Tubingen

Die Adsorption von DEAE Dextran an die Oberflache von Schweinelymphozyten

Von

G. WITTMANN

Mit einer Abbildung und 5 Tabellen

(Eingegangen am 17. Januar 1979)

Das Polykation DD ist ein wirksames Adjuvans in Schweinevakzinen (10, 1 1 ) das anscheinend auf immunkompetente Zellen wirkt. So werden Schweinelymphozyten durch DD stimuliert und ihre Reaktion mit Antigenen verstarkt (13, 14). Im Mauseversuch konnte nachgewiesen werden, dai3 DD sowohl auf T- als auch auf B-Lymphozyten wirkt (12). Weiterhin steigert DD die MLR in MLC vom Schwein, eine in vitro Reaktion der zellvermittel- ten Immunitat (15). Das Polyanion DS zeigt dagegen eine entgegengesetzte Wirkung, es stimuliert Schweinelymphozyten nicht und unterdruckt die MLR (15). Der unterschiedliche EAekt von DD und DS scheint mit ihrer entgegengesetzten elektrischen Ladung und dem elektrischen Potential der Zellober- flache im Zusammenhang zu stehen.

Im Hinblick auf den Adjuvansmechanismus von DD ist von Bedeutung, ob DD an die Lymphozytenoberflache adsorbiert wird, wie lange es dort bleibt und ob die Aufnahme von DD durch die Zelle Voraussetzung fur seine Aktivitat ist. Ober entsprechende Ergebnisse wird in der vorliegenden Arbeit berichtet.

Material und Methoden Praparation der Zellsuspensionen und der MLC

Kehlgangslymphknoten von Schlachtschweinen wurden wie bereits beschrieben verarbei- tet (12) und Zellsuspensionen (8 x lo8 lebende Zellen / 2ml ) in Eagels Minimal Essential Medium (MEM) mit Zusatz von 15 "/o inaktiviertem (56 O C / 30 Min.) fetalem Kalberserum, 200 E Penicillin und 0,l mg Streptomycin pro ml hergestellt. Fur die MLC wurden 4 X lo8 Zellen eines Schweines mit 4 x 106 Zellen eines anderen Schweines gemischt. Lebende und tote Zellen sind durch Trypanblaufarbung diff erenziert worden. Zellsuspensionen mit mehr als 20 O/o toter Zellen wurden verworfen. Die Zellsuspensionen enthielten zwischen 59,l O,'n

und 82,9 o/o lymphozytenahnliche Zellen, der Durchschnittswert betrug 68,9 O/o.

Abkurzungen: Cpm: Counts pro Min.; DD: Diethylaminoathyl Dextran; DS: Dextran- sulfat; MLC, MLR: Mischlymphozyten-Kultur(en), -Reaktion(en); SI: Stimulierungsindex (indices).

U. S. Copyright Clearance Center Code Staremem: 0514-7166/79/2607-0577$02.50/0

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Stirnulierung der Lymphozytenkulturen Zur Stirnulierung der autologen Kulturen sowie der MLC wurden D D (MG 5 X lo5)

und DS (MG 5 x lo5) - Pharrnica, Uppsala, Schweden - verwendet. Die Mengen dieser Substanzen variierten bei den verschiedenen Versuchen. In Vorversuchen ist festgestellt worden, dafi die optimal stimulierende Konzentration von D D 36 k 7 p g / 8 X lo6 Zellen betrug; bei Dosen von 54 p g war die Stirnulierungsaktivitat stark zuriickgegangen und bei noch hoheren Dosen fehlte sie ganz. Lyrnphozytenkulturen ohne Dextranverbindungen dienteii als Kontrollen.

Technische Details hinsichtlich der Markierung der Lyrnphozyten rnit 1 pCi / 6-"- Thyrnidin pro 8 x lo6 Zellen und die weitere Verarbeitung dieser Zellen sind bereits ver- offentlicht worden (12).

Der SH-Thymidineinbau wurde bei autologen Kulturen am 3. Tag (optirnale DD- Stirnulierung) und bei MLC am 3. Tag (ansteigende MLR) sowie am 7. Tag (abfallende MLR, optimaler DD-Verstarkungseffekt) bestimrnt (15). Die cpm-Werte von jeweils 3 Kultur- rohrchen wurden gernessen und der Durchschnittswert sowie die Standardabweichung crrechnet. Die spezifische Stirnulierung der Kulturen durch die Dextranverbindung wird durch dcn Stimulierungsindex (SI) ausgedriickt;

cprn in Gegenwart der Dextrane cprn der Kontrolle SI =

Die Signifikanz (p 5 0,05) der SI ist mit Hilfe des t-Tests bestimmt worden.

Versuche und Ergebnisse Die Entfernung von zellgebundenem D D durch Waschung

Wird DD d u r h Waschung der Lymphozyten von deren Oberflache entfernt, so durfte keine DD-Stimulierung der Lymphozyten auftreten. Kommt es dagegen trotz des Waschprozesses zur DD-Stimulierung, so deutet dies darauf hin, dai3 entweder DD fest an die Zelloberflache gebunden oder DD bereits von der Zelle aufgenommen worden ist.

Autologe Zellkulturen sowie MLC wurden mit der optimal stimulierenden Dosis von DD (36 pg pro 8 X lo6 Zellen) inkubiert, eine Stunde sowie

Tabelle 1 Entfernung von zellgebundenem DD durch Waschung der Lyrnphozyten

DD- behandelte Lyrnphozyten

Keine Waschung

Waschung nach 1 Stunde

Waschung nach 5 Stunden



iutologe Kul DD- Sti- rnulieruns

616 '

516

4 1 6

316

216

ren 13. Tag) Lebende Zellen

32,2 * 152' 28,s f 4,4 ' 28,8 f 14,s 36,7 f 11.5 26,9 f 9,0

22,s t 8,9 20,s f 9,0 12,7 t 7,O 24,7 i 12,3

28,s f 9,l

MLC DD-Sti- rnulierung

10110

31 9

1110

01 8

01 8

Tag ) Lebende Zellen

343 r 9,2 38,l t 11,7 28,3 f 6,1 358 t 45 22,6 t 4,0 30,7 t 47 24,3 t 9,0 15,9 t 5,8 213 t 10,l 24,6 t 5,6

MLC DD- Sti- rnulierung

31 3

113

1 I3

1 I3

013

Tag I Lebende Zellen

15,s~ 7,)

16,gt 6,O 20,3f 6,O

22,l ? 6,O

14,Lt 6,l

3,2* 2,O 21,6i 8,8

18,2Z 7,3

11,l ? 3,4

18,8* 6,8

Autologe Kulturen und MLC von Lymphknotenzellen von Schweinen wurden DD- behandelt und 1, 5, 24 und 48 Stunden sparer gewaschen und nachher in Medium resuspendiert und weiter inkubiert. Lyrnphozytenstirnulierung durch D D wurde durch den Einbau von SH-Thyrnidin nach 3 Tagen (analoge Kulturen, MLC) und nach 7 Tagen (MLC) gernessen.

Zahler: Zahl der Versuche rnit signifikanter DD-Stirnulierung; Nenner: Zahl der Versuche. 2 , s Prozentsatz der lebenden Zellen (Mittelwerte) am 3. und 7.Tag im Vergleich rnit der Ausgangszellsuspension (= 100 O/o); *in Gegenwart von D D ; sohne DD.

Die Adsorption von DEAE Dextran 579

5, 24 und 48 Stunden nach DD-Zusatz dreimal mit PBS gewaschen und das letzte Zellsediment im ursprunglichen Volumen (2 ml) Medium resuspendiert und weiter bebrutet. Die Bestimmung des 3H-Thymidineinbaus erfolgte bei autologen Kulturen am 3. Tag und bei MLC am 3. und 7. Tag. Gleichzeitig wurde die Zahl der lebenden Zellen ermittelt. Die Ergebnisse der verschiedenen Einzelversuche sind in Tabelle 1 zusammengefai3t. Es ist daraus ersichtlich, dai3 die Stimulierungsaktivitat von DD umso geringer war, je spater die Waschung stattfand. Diese Abnahme war bei MLC wesentlich starker als bei autologen Kulturen. Nach den Ergebnissen der Zellzahlung kann jedoch nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden, dafl die Abnahme der DD-Stimu- lierung wenigstens zum Teil (besonders nach 48 Stunden-Waschung) auf einen Zellverlust bei der Waschprozedur zuriickzufuhren ist. Allerdings spricht gegen einen entscheidenden Einflui3 der Zellzahlreduktion auf die Ergebnisse, dai3 die Zellzahlen bis zur 24-Stundenwaschung in den meisten Fallen nicht signi- fikant unter jenen der ungewaschenen DD-behandelten Kulturen lagen und bei den ungewaschenen DD-behandelten 7-Tage-MLC der Mittelwert der lebenden Zellen nur 15,5 k 7,l O/o vom Ausgang betrug, aber trotzdem eine signifikante DD-Stimulierung auftrao, wahrend z. B. bei 3-Tage-MLC, die nach 48 Stunden gewaschen wurden, trotz 23,3 f 10,l O/o lebender Zellen, in keinem Fall eine DD-Stimulierung feststellbar war.

Die leichte Entfernbarkeit von DD durch Waschung hat gezeigt, dai3 die Bindung von DD an die Zelloberflache relativ schwach ist. Dies w ird besonders deutlich bei 3-Tage-MLC. Die Bindung scheint in den ersten 5 Stunden am starksten gewesen zu sein, dann nahm die Bindungsintensitat ab. Eine Pene- tration des DD trat anscheinend innerhalb 48 Stunden nicht ein, denn dann hatte die DD-Stimulierung im spateren Verlauf zunehmen oder zumindest gleichbleiben mussen.

Quantitative Verhaltnisse bei der Neutralisierung von DD durch DS Eine Absicherung der vorherigen Ergebnisse im Hinblick auf die DD-

Penetration ist moglich, wenn die Gegenwart von DD an der Zelloberflache nachgewiesen werden kann. Auf Grund der entgegengesetzten Ladungen des Polykations DD und des Polyanions DS ist anzunehmen, dai3 beide Substan- Zen einander neutralisieren und zellgebundenes D D durch DS inaktiviert wird und seine Lymphozyten-stimulierenden Eigenschaften verliert. Ein DD Mole- kiil mit einem MG von 5 X105 hat 850 DEAE-Komponenten und ein Mole- lriil DS hat 1347 Sulfatkomponenten, d. h. 0,62 DS-Molekule waren zur Neutralisierung eines DD-Molekuls notwendig bzw. 1,58 DD-Molekule zur Neutralisierung eines DS-Molekiils.

Um diese Theorie zu prufen, wurden verschiedene DS-Mengen (4, 5, 9, 18, 36, 54 und 7 2 p g / 2 m l ) mit 3 6 p g DD eine Stunde lang bei Zimmer- temperatur gehalten. Unmittelbar nach dem Mischen zeigten Gemische, die zwischen 18 pg und 72 ,ug DS enthielten, eine Trubung, wahrend Gemische mit 4,s p g und 9 p g DS klar blieben. Alle Gemische wurden durch Millex Filtereinheiten mit 22 pg Porengroi3e (Millipore, Buc, Frankreich) filtriert. Die Filtrate waren vollig klar. Eine zweite Mischreihe ist rnit 50 p g DD und 6,25, 12,5, 25, 50, 72 und 100 p g DS angesetzt worden. Bei dieser Reihe trat im Bereich zwischen 25 pg und 100 pg DS eine Trubung auf, die nach Filtra- tion verschwand. Von den Filtraten wurden 0,l ml zu autologen Kulturen und MLC gegeben und am 3. Tag die Stimulierung bestimmt. Kulturen mit 36 p g DD und 36 pg DS allein und Kontrollen ohne Zusatz liefen parallel. Das Ergebnis dieses Versuches zeigt Abbildung 1.

580

SI

4 -

3 -

2 -

1 -

G. WITTMANN

MLC

* 0

I )

a A

0 Am

A A e A P i -

A

0

0

A

A

Abb. 1. Quantitative Vcr- haltnisse fur die Neutrali- sation von DD durch D S In 3 Expcrimentcn ( 0 A m) wurdcn autologc Kul- turen und M L C von Schweine-Lymph knotenzcl- len (8 X loo Zellen / 2 ml) mit DD/DS-Mischungen (0,1 ml) inkubiert. Die Mischungen enthielren eine konstante DD-Menge (36 p g / 2 ml) und verschiedene Mengen von DS (4,5 pg - 72 pg). Die Mischungen waren eine Stunde lang bei Zimmer- temperatur prainkubiert und dann durch 22 !tm Miliporefilter filtriert worden. Die Bestimmung des 3H-Thymidineinbaus erfolgte am 3. Tag. Mit 36 p DD (0 A 0) oder 36 p g DS (@ A 0) behandeltc Kul- turen sowie unbehandelte Kontrollkulturen liefen par-

allel

cpm in behandelten Kulturen cpmin Kontrollkulturen

SI =

Mischungen, in denen DS vor der Filtration im Oberschui3 war (74 p g und 54 pg) riefen keine DD-Stimulierung hervor, die SI lagen unter dem SI der Kontrolle. Im Bereich von 36 j i g DD und 18 pg und 36 pg DS war keine DD-Stimulierung festzustellen; die SI lagen im Bereich der Kontrolle (SI 1,O). Erst bei Mischungen, in denen DD vor der Filtration im Oberschui3 war (DD 36 pg / DS 4,5 und 9 pg) kam es zu einer signifikanten DD-Stimulierung, die bei 9 pg DS unter jener der DD-Kontrolle, bei 4,5 pg DS etwa im Bereich der DD-Kontrolle lag. Bei der 50,ug DD/DS-Serie wurde der DD-Effekt bei einer DS-Konzentration von 25 pg bis 100 pg unterdruckt.

Diese Ergebnisse zeigen, dai3 DD mit DS Komplexe bildete, die durch die Milliporefiltration entfernt werden konnten, wahrend ungebundenes DD und DS den Filter passierten und ihre Wirkung auf die Zelle ausubten. Das DS : DD-Verhaltnis, das gerade nicht mehr eine DD-spezifische Stimulierung hervorrief, betrug 0,5 bis 1,O und stimmt relativ gut mit dem theoretischen Neutralisationsverhaltnis von 0,68 uberein. Fur alle weiteren Neutralisie- rungsversuche wurden deshalb 27 pg / 2 ml und 36 pg / 2 ml DD (Verhfltnis 0,75) gewahlt.

Unvermogen des DDIDS-Komplexes die Lymphozytenstimulierung durch freies DD zu hemmen

Die weiteren Untersuchungen zum Nachweis von DD an der Lympho- zytenoberflache konnten nur durchgefuhrt werden, wenn der inaktive DD/DS-


Komplex nicht an die Lymphozytenoberflache gebunden wird und keine DD- Rezeptoren besetzt. Um das zu klaren, wurde eine Mischung von 36 pg DD und 27pg DS eine Stunde bei Zimmertemperatur gehalten und ohne vor- herige Filtration auf Lymphozytenkulturen verimpft. Nach einer Stunde und nach 5 Stunden erfolgte dann die Zugabe von 36 pg DD. Der 3H-Thymidin- einbau in die Kulturen wurde am 3. Tag bestimmt. Zu Kontrollzwecken dienten Kulturen, die mit 3 6 p g DD oder 27pg DS oder mit dem DD/DS- Komplex allein geimpft waren sowie Kontrollkulturen ohne Zusatz. Das Ergebnis dieser Versuche zeigte, dafi der DD/DS-Komplex nicht imstande war, mit der stimulierenden Aktivitat von freiem DD zu interferieren, denn die DD-Stimulierung in Gegenwart des Komplexes war ungefahr in der gleichen Grofienordnung wie die DD-Stimulierung in Abwesenheit des Kom- plexes.

Bei dem verwendeten Mengenverhaltnis von 36 p g DD und 27 pg DS kann man einwenden, dafi zu wenig DD/DS-Komplexe enthalten waren, um

Tabelle 2 Lymphozyteiistimulierung durch freies D D in Gegenwart von DD/DS-Kon

Komplex

LOO pg DS + LOO pg DD

LOO yg DS + 500 pg DD

LOO pg DS 600 pg DD

LOO pg DS + 700 yg DD

400 pg DS + 800 pg DD

Keiner

Freies zugesetztes DD

u g / 2 ml 72 5.4 36 18

72 SL 36 18 72 SL 36 18 72 54 36 18 72 51, 36 18 72 54 36 18

lexen

Autologe Kulturen und MLC (8 x lo6 Zellen / 2 ml) von Lymphknotenzellen von Schweinen (A, B) wurden rnit DD/DS-Komplexen (4OOpg DS plus verschiedene Mengen von DD, eine Stunde bei Zimmertemperatur gehalten) geimpft und nach einer Stunde verschiedene Mengen von freiem DD zugesetzt. Kulturen mit D D allein sowie Kontrollkulturen ohne Mitogen liefen parallel. Die Lymphozytenstimulierung wurde durch SH-Thymidineinbau am 3. Tag gemessen.

cpni der behandeltcn Kulturen cpm der Kontrollkulturen ' SI =

Signifikante SI (p 7 0,05) sind unterstrichen

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alle Zellrezeptoren damit zu besetzen, wodurch Rezeptoren fur freies DD verfiigbar blieben. Deshalb wurden weitere Versuche mit DD/DS-Mischungen unternommen, die 400pg DS (hohere Dosen waren zytotoxisch) und abgestufte Mengen von DD (zwischen 400 pg und 800 pg) enthielten. Eine Stunde nach Verimpfung des DD/DS-Gemisches wurden 18, 36, 54 und 72 pg DD zu den Kulturen gegeben und der SH-Thymidineinbau am 3. Tag gemessen. Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, fie1 die stimulierende Dosis von freiem DD (optimal stimulierende Dosis allein 36 k 7 pg / 8 x los Zellen) rnit dem An- stieg der DD-Konzentration im DD/DS-Komplex. Bei den Komplexen 400 pg DS / 700 pg DD und 400 pg DS / 800 pg DD war die stimulierende Dosis des nachher zugesetzten freien DD mit der DD-Kontrolle etwa iden- tisch, d. h. im Komplex hatte eine vollige Neutralisierung von DD durch DS stattgefunden. Bei DS/DD-Verhaltnissen von 400 : 500 und 400 : 600 p g waren groi3ere Mengen von freiem DD zur Stimulierung notwendig, was darauf hinweist, dai3 der DS-Anteil im Gemisch durch die DD-Menge nicht ganz neutralisiert worden war. In Gegenwart des Gemisches von 400 pg DS / 400 pg DD trat keine Stimulierung durch spater zugesetztes DD auf, da offensichtlich freies DS, das im Gemisch noch enthalten war, alles zugesetzte DD abband.

Diese Ergebnisse zeigen, dai3 selbst bei einer DD/DS-Komplexkonzeii- tration, die wahrscheinlich hoch genug war, um alle Zellrezeptoren zu besetzen (48 X loi3 Molekule von DS und 96 X lotS Molekiile von DD pro 8 X lo6 Zellen), keine Interferenz mit der stimulierenden Aktivitat von freiem DD auftrat.

Die Neutralisation uon zellgebundenem DD durcb DS Nachdem gesichert war, dai3 eine equilibrierte Mischung von DD und

DS einen inaktiven, unloslichen Komplex bilden, der nicht mit der stimulierenden Wirkung von freiem DD interferiert, konnte die Adsorption von DD an die Zelloberflache und die Zeit der DD-Aufnahme durch die Zelle untersucht werden. Falls DD-behandelte Lymphozyten nach dem Zusatz von DS keine DD-Stimulierung zeigen, so ist das ein Zeichen dafur, dai3 DD an der Zelloberflache ist und durch DS inaktiviert wird. Wenn dagegen eine DD- Stimulierung auftritt, so ist DD entweder von der Zelle aufgenommen worden oder in die Zellmembran integriert und der DS-Wirkung entzogen worden.

Um dies zu untersuchen wurden 2 7 p g DS nach einer Stunde und nach 5, 24 und 48 Stunden zu DD-vorbehandelten (36 pg DD) autologen Kulturen und MLC zugesetzt und die DD-Stimulierung der Lymphozyten bestimmt. Tabelle 3 zeigt eine Zusammenfassung aller Versuchsergebnisse.

DS hemmte in der Regel die Stimulierung von DD-behandelten Kultureii in den ersten 24 Stunden. Nach 48stundi er DD-Behandlung von autologen

unterdrucken. fhnliche Ergebnisse wurden mit MLC erhalten, wenn man die DD-Stimulierung am 3. Tag bestimmte, jedoch war der Prozentsatz der Ver- suche mit einem DS-Hemmeffekt bei den 48 Stunden mit DD-behandelten MLC hoher (67 O / o ) als bei den autologen Kulturen (25 O / o ) . Wurde die DD- Stimulierung der MLC am 7. Tag gemessen, so wurde die DD-Stimulierung, von einer Ausnahme abgesehen, durch DS vollig gehemmt.

Um auszuschlieflen, dai3 die Unterdriickung der DD-Stimulierung auf einen zytotoxischen Eff ekt des DD/DS-Komplexes zuriickzufuhren war, wurde die Zahl der lebenden Zellen in den Kulturen zum Zeitpunkt der Bestimmung des SH-Thymidineinbaus ermittelt. Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, dai3 bei autologen Kulturen und MLC keine Reduktion der Zellzahl im Vergleich zur

Kulturen war DS nur noch bei 2 Versu 2 en imstande, die Stimulierung zu


Behandlung der Kulturen

Kontrolle DD

DD 1 DS DD + DS DD 1 hr + DS DD 5 hr DS

DD 48 hr + DS DD 72 hr + DS

DS

DD 24 hr + DS

Autologe Kulturen MLC, 3. Tag MLC, 7. lag DD-St i - Lebende DD-Sti - Lebende DD-Sti- Lebende mulierung' Zellen2 mulierung Zelten mutierung Zetlen

0111 42,82 9,6 0111 L7,4+16,0 0110 28,5*11,6 11 / 1 1 42'8 t 16,O 121 12 44,9 t 21,O 101 10 20,s 2 $6

0111 42,9?16,9 0112 L3,0+14,3 0110 30,3211,l 0111 41,9217,3 0112 43,4212,l 0110 19,9t 5,4 0 1 5 40,8 2 163 01 3 448 t 12,8 01 3 23,l t 8,6 1 1 8 37,6 2 17,9 01 3 42,L f 21,7 01 5 28,3* 12,L

61 8 40,l 2 17,4 31 9 41,) t 19,3 01 7 17,s t 8,3 n. d. n. d. 01 7 15,l t 14,8

0111 43,5t15,0 0112 45,3tl4,6 0110 26,5t12,8

01 1 1 39,22 lL,2 0 1 12 L1,9 t 16,L 1 1 10 15,2i 43

Autologe Kulturen und MLC (8 >( 10' Zellen / 2 ml) von Schweine-Lymphknoten wurden beimpft a) mit 3 6 p g D D (DD), b) mit 2 7 p g DS (DS), c) mit einer prainkubierten (1 Std.) Mischung von D D und DS (DD/DS) und d) gleichzeitig mit D D und DS (DD + DS). DD-vorbehandelten Kulturen wurde zu verschiedenen Zeiten DS zugesetzt (DD hr + DS). Kulturen ohne Behandlung liefen parallel als Kontrolle. Die Lymphozytenstimulierung wurde durch den Einbau von SH-Thymidin nach 3 Tagen (autologe Kulturen, MLC) und 7 Tagcn (MLC) gemessen.

Zahler: Zahl der Versuche mit signifikanter DD-Stirnulierung; Nenner: Zahl der Versuche. Prozentsatz der lebenden Zellen (Mittelwert) im Vergleich zur Ausgangszellsuspension

(: 100%).

Kontrolle erfolgte, wenn die Kulturen am 3. Tag getestet wurden. Dagegen war bei MLC, deren Zellzahl am 7. Tag bestimmt wurde, die Zahl der lebenden Zcllen wesentlich niedriger als am 3. Tag und die DD/DS-Behandlung verursachte im Vergleich zu den Kontrollen eine weitere Reduzierung der Zellzahl, wenn DS 24-72 Stunden nach DD gegeben worden war. Deshalb kann nicht ganz ausgeschlossen werden, dai3 die niedere Zellzahl bei der Nicht- stimulierbarkeit der ,,spaten" MLC von Einflui3 war. Eine allzu groi3e Be- deutung durfte jedoch der Zellzahl nicht beizumessen sein, da bei den iiur mit DD behandelten MLC eine DD-Stimulierung auftrat, obwohl nur 20,5 f 5,6 O/o lebende Zellen vorhanden waren.

DD konnte somit mindestens 24 Stunden lang, bei einem Teil der K~i l - turen, besonders der MLC, sogar 48 und 72 Stunden lang an der Lynipho- zytenoberflache nachgewiesen werden.

Die Zellaffinitat uon DS Zur Bestimmung der Adsorption und der Affinitat von DS an die Zell-

oberflache wurde folgender Versuch unternommen: Autologe Kulturen und MLC wurden mit 2 7 p g DS vorbehandelt und eine Stunde sowie 5 und 24 Stunden spater ein Teil der Kulturen gewaschen, wahrend der andere Teil ungewaschen blieb. Nachher erfolgte die Zugabe von 36 pg DD zu jeder Kultur. Kulturen, die nur DD oder DS erhielten sowie Kulturen ohne Zusatz liefen parallel.

Die Zusammenstellung der Ergebnisse in Tabelle 4 zeigt, dai3 die DS- Vorbehandlung die DD-Stimulierung vollstandig unterdruckte. Dies bedeutet, dai3 DS mindestens 24 Stunden lang an der Zelloberflache war und dort einen inaktiven Komplex rnit DD gebildet hat. Durch Waschung wurde bei einem Teil der DS-vorbehandelten Kulturen die Reaktionsfahigkeit mit DD

41*

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r

Behandlung der Kulturen

DO 0s DS 1 hr + M DS 5 hr + DO DS 24 hr + DD DS 1 hr, gewaschen + DO DS 5 hr, gewaschen + DO DS 24 hr, gewaschen + OD

DD-Stirnulierung der Kulturen

Kulturen 3. l a g I. Tag Autologe M LC M LC

6 1 6 5 1 5 5 1 5 0 1 6 0 1 5 0 1 5 0 1 3 0 1 2 0 1 3 0 1 6 0 I 5 0 1 3 0 1 6 0 1 5 0 1 5 1 I 3 0 1 2 3 1 3 4 1 6 115 3 1 3 3 1 6 3 1 5 2 1 3

Tabelle 4 Die Zellaffinitat von DS

Autologe Kulturen und MLC von Srhweine-Lymphknotenzellen wurden eine Stunde sowie 5 und 24 Stunden mit 27 p g DS behandelt. N a h diesen Zeiten wurden ein Teil der Kulturen gewaschen und zu den gewaschenen und ungewasrhenen Kulturen 3 6 p g D D zugesetzt. Der 3H-Thyniidineinbau wurde bei autologen Kulturen am 3. Tag und bei MLC am 3. und 7. Tag bestimmt. Kulturen mit D D oder DS allein sowie Kulturen ohne Mitogene dienten als Kon- trollen.

Zahler: Zahl der Versuche mit signifikanter DD-Stimulierung; Nenner: Zahl der Versuche.

wieder hergestellt. Der Wascheff ekt war nach einer Stunde DS-Einwirkung weniger wirksam als nach 5 und 24 Stunden.

Die Ergebnisse deuten darauf hin, dai3 DS mindestens 24 Stunden lang relativ schwach an die Zelloberflache gebunden ist und die Zellaffinitat nach einer Stunde am starksten ist.

Versuche, die DD- und DS-Spezifitat der Zellrezeptoren zu bestimmen Die Blockade des Stimulierungsefiekts von zellgebundenem DD durch

DS wird durch Komplexbildung verursacht. Wenn eine der Substanzen an Zellrezeptoren gebunden ist, wird die andere durch die entgegengesetzte elektrische Ladung angezogen. Dieses Phanomen schliei3t jedoch nicht aus, dai3 DD und DS primar mit verschiedenen Rezeptoren reagieren. Falls verschiedene Rezeptoren fur DD und DS vorhanden sind, sollte bei Absattigung der Lym hozytenoberflache mit DS eine DD-Stimulierung auftreten, wenn DD im 8berschuB zugesetzt wird. Nach Neutralisierung des zellgebundenen DS wurde dann noch genugend DD frei bleiben, um mit den DD-Rezeptoren der Zelle zu reagieren. Reagieren dagegen DD und DS mit dem gleichen Rezep- tor, so wiirde auch bei DD-Oberschui3 keine DD-Stimulierung auftreten, da alle Rezeptoren durch DS besetzt waren.

Zur Absattigung der Zellen wurden 8 X los lebende Zellen von autologen Kulturen und MLC mit 400 pg DS eine Stunde lang bei 37 OC inkubiert. Eine Steigerung der DS-Menge war nicht moglich, da hohere Konzentrationen zytotoxisch wirkten. Die DS-Menge pro Zelle betrug 6 X lo7 Molekule. Sie durfte ausgereicht haben, urn alle Rezeptoren auf der Zelloberflache zu besetzen, wenn man Zahlen, die mit Schweinelymphozyten und Phytohamagglu- tinin (PHA) zum Vergleich heranzieht, denn ALLAN und CRUMPTON (1) fan- den, dai3 bei einem MG von 1,2 X lo5 etwa 6 X lo5 PHA-Molekule pro Schweinelymphozyt maximal gebunden werden. Das DS-Molekul (MG 5 X lo5) ist groi3er als das PHA-Molekiil, und verglichen mit der Zahl der maximal gebundenen PHA-Molekule war die Zahl der zugesetzten DS-Mole- kule hundertmal groi3er. Nach einstundiger Inkubation der Zellen mit DS wurden bei 560 pg DD beginnend, in Steigerungsstufen von 20 pg, bis 920 p g D D zugesetzt und der 3H-Thymidineinbau bei den autologen Kulturen am


Autologe Kulturen 3. Tag 1. Versuch 2. Versuch A l B A I B

3. Tag und bei dem MLC am 3. und 7. Tag gemessen. Zur Kontrolle wurden autologe Kulturen mit entsprechenden DS/DD-Gemischen, die eine Stunde bei Zimmertem eratur gehalten und dann durch Milliporefilter filtriert worden waren, geimpz. Kontrollen ohne Zusatz dienten zur Berechnung des SI. Der Versuch ist einmal wiederholt worden. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 5.

Tabelle 5

Die Reaktion von DS-behandelten Lymphozyten rnit im Uberschud zugesetztem DD

MLC 3. Tag MLC 7. Tag 1. Vers. 2. Vers. 1. Vers. 2. Vers.

A + B A * B A + B A + B

400 1.19 DS- Vorbehandlung dann Zugabe von

920 pg DO 900 880 860 EL0 820 800 780 760 7.4 0 720 700 680 - 560

Autologe Kulturen und MLC von Schweinelymphknotenzellen wurden rnit 400 p g D S cine Stunde lang bei 37 OC inkubiert und dann abgestufte Mengen DD im Uberschud dazugegeben. Die Lymphozytenstimulierung durch DD wurde durch den Einbau von 3H-Thymidin nach 3 Tagen (autologe Kulturen und MLC) und nach 7 Tagen (MLC) gemessen. Kontrollen in dcr Tabelle nicht aufgefuhrt, Beschreibung siehe Text.

' = cpm unbehandelte Kulturen cpm der DS/DD-behandelten Kulturen

Die DD-Stimulierung war ziemlich unregelmafiig, was wahrscheinlich auf die hohen Konzentrationen von DD und DS zuruckzufuhren ist, denn dai3 dabei regelmai3ig die optimal stimulierende DD-Menge von 36 k 7 p g frei bleibt, ist sicher nicht in jedem Fall gewahrleistet. Die Mehrzahl der signifikanten DD-Stimulierungen trat im Bereich von 840-880 pg DD auf. Bei den nicht in der Tabelle aufgefuhrten Kontrollen war dies ebenfalls der Fall.

Im optimalen Oberschuflbereich war D D also imstande, trotz Absatti- gung der Lymphozytenoberflache mit DS, eine Lymphozytenstimulierung aus- zulosen. Somit durfte DD mit anderen Zellrezeptoren reagiert haben als DS.

Diskussion Aus der Literatur ist bekannt, dai3 das Polykation DD eine starke Akti-

vitat gegenuber Zellmembranen besitzt, wobei Zell-mit-Zellreaktionen be- gunstigt werden (4, 16). Polykationen reduzieren die negative elektrische Ladung der Zelloberflache und verursachen wahrscheinlich eine Bruckenbildung zwischen den Zellen (6). Das Polyanion DS, das ebenfalls Oberflachenaktivitat besitzt, ruft im Vergleich mit DD entgegengesetzte Oberflacheneffekte hervor (16). Infolge der Zunahme der negativen Ladung der Zelloberflache scheint es zur gegenseitigen Abstoi3ung der Zellen zu kommen (7). Zelloberflachen- reaktionen sind in der MLC und bei der MLR von groaer Bedeutung (8), so

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dai3 bei MLC die Wirkung von DD und DS besonders ausgepragt ist (15). Die positive elektrische Ladung von DD ist fur die Reaktion rnit

Lymphozyten von entscheidender Bedeutung, da in Lymphozytenkulturen kein DD-Effekt auftrat, wenn die positive Ladung von DD durch die negative von DS neutralisiert wurde. khnliche Ergebnisse werden mit dem Polykation Polymyxin B und DS berichtet (3). DD und DS bilden in vitvo einen unloslichen Komplex, wenn sie in einem Equivalenzverhaltnis von 0,5 bis 1,0 gemischt wurden. Dies stimmt relativ gut mit dem theoretisch berechneten Wert von 0,62 (s. S. 579) iiberein. Das in diesem Komplex enthaltene DD war nicht mehr fahig, Lymphozyten in autologen Kulturen und MLC zu stimulieren. Der Komplex wird offensichtlich nicht an die Zelloberflache adsorbiert, da er selbst in groi3em Oberschui3 nicht imstande war, die stimulierende Aktivitat von freiem DD zu hemmen. Wurden DD-vorbehandelte Zellen mit DS in Kontakt gebracht, so kam es zur Hemmung der DD-Wirkung. Dies zeigt, dai3 diese Komplexbildung off ensichtlich auch an der Zelloberflache stattfindet.

Mit Hilfe dieser DD/DS-Reaktion konnte nachgewiesen werden, dai3 DD mindestens 24 Stunden lang an die Lymphozytenoberflache gebunden bleibt. Nach 48 Stunden konnte bei autologen Kulturen in 75 O/o der Versuche die DD-Stimulierung durch DS nicht mehr unterdriickt werden, d. h. DD war entweder von der Zelle aufgenommen oder so in die Zellmembran integriert worden, dai3 es nicht mehr mit DS reagieren konnte. In 25 O/o der Versuche war DD auch noch nach 48 Stunden an der Zelloberflache nachweisbar, dies zeigt, dai3 das Verschwinden von DD von der Zelloberflache zeitlich nicht genau fixiert ist. Noch deutlicher wurde dies bei MLC, wo DD in der Mehrzahl der Versuche auch noch nach 48 und 72 Stunden an der Zelloberflache feststellbar war. Dies weist aber auch darauf hin, dai3 zwischen autologen Kulturen und MLC Unterschiede bei der zellularen Integration von DD bestehen. Waschversuche haben gezeigt, dai3 die Aff initat von DD zur Zelloberflache gering ist. Es konnte somit moglich sein, dai3 das gebundene DD in MLC infolge von direkten Zell-mit-Zell-Reaktionen (8) laufend mechanisch entfernt und wiedergebunden wird und somit langer an der Zelloberflache bleibt, oder dai3 DD ein Verbindungsglied zwischen den Zellen bildet und infolge der gleichmaaigen Bindung mit beiden Zellen nicht oder nur schlecht in die Zellmembran eindringen kann.

Unterschiede zwischen autologen Kulturen und MLC wurden auch im Hinblick auf die Intensitat der DD-Bindung an die Zelloberflache gefunden. Wurden DD-behandelte MLC zu verschiedenen Zeiten gewaschen, so konnte DD von der 5. Stunde an bei der Mehrzahl der Versuche (85 "0) von der Zelloberflache entfernt werden, wahrend dies bei autologen Kulturen nach 24 Stunden nur bei 50 O/o und nach 48 Stunden bei 66 O/o der Versuche der Fall war. In jedem Fall waren die Bindungskrafte zwischen DD und der Zelloberflache nach einer Stunde am starksten. Diese Ergebnisse zeigen, dai3 die Bindungskrafte zwischen DD und den Lymphozyten im Laufe der Zeit abnehmen und diese Krafte bei autologen Kulturen starker sind als bei MLC. Aui3erdem bekraftigen die Ergebnisse der Waschversuche die Befunde der DD/DS-Versuche, nach denen DD 24 bis 48 Stunden an der Lymphozyten- oberflache bleibt. Eine zeitlich bedingte Abnahme der Bindungskrafte wie bei DD ist auch bei DS festgestellt worden, allerdings traten hier keine Unter- schiede zwischen autologen Kulturen und MLC auf.

Vergleicht man die rnit DD erhaltenen Ergebnisse mit jenen von Con A, PHA, Lentil-Mitogen (Literaturstellen siehe 8) und LPS (5), so zeigen sich wesentliche Unterschiede. Diese Mitogene konnten von Mause- und Menschen- lymphozyten durch Waschung nicht entfernt werden, sie werden also wesent-


lich starker gebunden als DD und DS. Durch Zugabe von Mitogen-spezifischen Antikorpern wurde die Mitogen-induzierte Lymphozytenstimulation bis zu 12 Stunden nach Mitogenzugabe gehemmt, spater war dies nicht mehr moglich. Die oben genannten Mitogene blieben also nur 12 Stunden lang an der Zell- oberflache und wurden dort durch die spezifischen Antikorper neutralisiert. Diese Zwolfstundenzeit fand man auch, wenn die LPS-Stimulierung von Lymphozyten durch Polymyxin B gehemmt wurde. Im Gegensatz dazu bleibt DD 24 bis 48 Stunden an der Lymphozytenoberflache. Vielleicht ist die spate zellulare Integration von DD der Grund dafur, dai3 der Stimulierungseffekt von DD wesentlich schwacher ist als der von Con A und LPS (unveroffent- lichte Versuche).

Die Untersuchungen lassen weiterhin vermuten, dai3 DD und DS auf verschiedene Zellrezeptoren wirken. Wurden namlich Lymphozyten mit 6 X lo7 DS-Molekule pro Zelle vorbehandelt, so konnten sie durch im optimalen Oberschui3 zugesetztes DD stimuliert werden, trotzdem anzunehmen ist, dai3 die verwendete DS-Menge ausgereicht hat, um alle Zellrezeptoren zu besetzen (s. S. 584). Die verschiedene Rezeptorenspezifitat von DD und DS wird umgangen, wenn eine der genannten Substanzen bereits an der Zell- oberflache sitzt. Dann kommt es zu einer ladungsbedingten Anziehung zwischen dem Polyanion und dem Polykation. Das rezeptorbedingte Bindungs- potential der Lymphozyten scheint somit wesentlich schwacher zu sein als jenes der adsorbierten Polyelektrolyte.

Da die Reaktionsfahigkeit von DD mit Zellen in erster Linie auf elektrische Ladungsdifferenzen zuruckzufiihren ist, reagiert DD nicht nur rnit Lymphozyten sondern mit anderen Zellen, z. B. Sarcoma S-180-Zellen (9) oder Erythrozyten (16). Somit durfte DD im immunologischen Zellsystem nicht nur mit B- und T-Zellen (2) sondern auch mit anderen Lymphozyten- subpopulationen (z. B. Null-Zellen), Makrophagen und Leukozyten eine Bin- dung eingehen, und sie in ihrer Reaktionsfahigkeit beeinflussen.

Aus den Versuchen kann die Schlufifolgerung gezogen werden, dai3 der immunologische Adjuvanseff ekt von DD neben einer direkten relativ schwa- chen Lymphozyten-stimulierenden Aktivitat, in erster Linie auf einen Ober- flacheneff ekt beruht, worauf besonders der Verstarkungseff ekt von DD bei der MLR hinweist (15). Durch den Oberflacheneff ekt diirften Lymphozyten- reaktionen untereinander (z. B. zwischen B- und T-Zellen, oder Effektor- und Responderzellen) und Lymphozytenreaktionen mit anderen Zellen (z. B. Makrophagen) sowie Lymphozytenreaktionen mit Antigenen und Mitogenen (2,12) verstarkt werden.

Ich danke Frau ILSE LEITZKE fur ihre gewissenhafte und fleii3ige Mit- arbeit.

Zusammenf assung Im Hinblick auf die Adjuvansaktivitat des Polykations DD ist seine

Bindung an die Lymphozytenoberflache untersucht worden. Die Versuche wurden mit autologen Lymphozytenkulturen und MLC vom Schwein durchgefuhrt. Der Nachweis von DD an der Lymphozytenoberflache erfolgte in erster Linie durch das Polyanion DS. Dieses bildete im Uberschui3- und Kqui- valenzbereich mit DD unlosliche Komplexe, in denen die Aktivitat von DD viillig aufgehoben war. Daneben gaben Waschversuche Hinweise auf das Vor- handensein von DD an der Zelloberflache und auf die Bindungsintensitat.

Die Versuche haben gezeigt, dai3 DD an die Lymphozytenoberflache adsorbiert wurde. Die Bindungskrafte zwischen Zelloberflache und DD waren

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jedoch relativ schwach und nahmen von einer Stunde bis 48 Stunden konti- nuierlich ab, wobei die Abnahme bei MLC starker war als bei autologen Kul- turen. Das adsorbierte DD blieb mindestens 24 Stunden lang an der Lympho- zytenoberflache. Aber auch nach 48 Stunden war DD bei 25 O / o der Versuche mit autologen Kulturen und bei 67O/o der Versuche mit MLC noch an der Zelloberflache nachweisbar. Das zeigt, dai3 a) der Zeitpunkt, an dem DD von der Zelle aufgenommen wird, nicht genau fixiert ist und b) Unterschiede zwischen autologen Kulturen und MLC bestehen. Untersuchungen, die mit DS-vorbehandelten Lymphozyten und optimalem DD-Oberschui3 durchgefuhrt wurden, lassen vermuten, dai3 DD und DS mit verschiedenen Zell- rezeptoren reagieren.

Die Versuche werden diskutiert und die Schlui3folgerung gezogen, dafl die immunologische Adjuvanswirksamkeit von DD neben einer direkten Lymphozyten-stimulierenden Aktivitat, in erster Linie auf einem Oberflachen- efFekt beruht, durch den Lymphozytenreaktionen untereinander und mit anderen Zellen sowie Lymphozyten-Antigenreaktionen verstarkt werden.

Summary The adsorption of DEAE dextran onto the surface of pig lymphocytes In regard to the adjuvant activity of the polycation DD, its binding to

the lymphocyte surface has been studied. The experiments were carried out using autologous lymphocyte cultures and MLC from pigs. For the demonstra- tion of DD on the lymphocyte surface, the polyanion DS was mainly used. This forms, in excess and in equivalence regions, with DD insoluble complexes in which the activity of DD is completely neutralized. In addition, washing procedures have been used to indicate the presence of DD on the cell surface and for the intensity of the binding.

The experiments have shown that DD is adsorbed onto the lymphocyte surface. However, the binding force between the cell surface and DD was relatively weak and decreased continually from one to 48 hours whereby the decrease with MLC was more intense than with autologous cultures. The adsorbed DD remained at least 24 hours on the lymphocyte surface. Moreover, D D could still be demonstrated on the cell surface after 48 hours in 25 O/o of experiments with autologous cultures and in 67 O / o of the experiments with MLC. This shows that, a) the moment in which DD is attached to the cell is not definitely defined and, b) differences exist between autologous cultures and MLC. This shows that, a) the moment in which DD is attached to the cell is not and optimal DD exces led to the assumption that DD and Ds react with different cell receptors.

The experiments are discussed and the conclusion is drawn that, the immunological adjuvant efficacy of DD, besides a direct lymphocyte stimulat- ing activity, is based mainly on a surface-effect by which the lymphocyte reactions with each other and with other cells as well as lymphocyte-antigen reactions are increased.

Resume Adsorption du DEAE-dextran h la surface des lymphocytes du porc O n a examink la liaison du polycation DD A la surface des lymphocytes

du pont de vue de son activitk d’adjuvant. Les recherches ont ktC faites avec des cultures autologues de lymphocytes et MLC du porc. La mise en kvidence de DD A la surface des lymphocytes a rkussi en premier lieu avec le polyanion DS. Ce dernier formait avec DD un complexe insoluble en excks ou en Cqui-


valence dans lequel l’activitk de DD ktait complktement anihilke. Des lavages ont indiquk la prksence de DD A la surface des cellules et donnk I’intensitC de la liaison. Les essais ont montrk que DD ktait adsorbk A la surface des lymphocytes. Les forces de laison entre la survace cellulaire et DD furent relativement faibles et diminukrent continuellement d’une ?i 48 heures, cette diminution i tant plus forte pour MCL que dans les cultures autologues. DD adsorbk resta au moins 24 heures A la surface des lymphocytes. D D fut m6me mis en kvidence aprhs 48 heures dans le 25 O / o des essais avec des cultures autologues et dans le 67 O / o des essais avec MLC. Ceci montre que: a) le moment de l’adsorption du DD par la cellule n’est pas fixe b) il existe des diffkrences entre cultures autologues et MLC. Les recherches qui ont k tk faites avec des lymphocytes prkalablement traitks avec DS et avec un excks de DD laissent supposer que DD et DS rkagissent avec diffkrents rkcepteurs cellulaires.

Les rksultats sont discutks et la conclusion suivante en a k t k tirke: L’action immunologique d’adjuvant de DD repose en premier lieu sur un effet de surface A c8tk d’une activitk directe stimulante des lymphocytes; elle est ren- forcke par des rkactions de lymphocytes entre eux et avec d’autres cellules ainsi que par des rkactions lymphocytes-antigkne.

Resumen La adsorci6n de dextrano DEAE (DD) a la superficie de linfocitos porcinos

En atenci6n a la actividad de adyuvante del policati6n D D se examin6 su fijaci6n a la superficie de 10s linfocitos. Los ensayos se llevaron a cabo con cultivos aut6logos de linfocitos y MLC del cerdo. La puesta en evidencia de la ligaz6n de DD a la superficie de 10s linfocitos se verificaba en primera instancia por el poliani6n DS. Este formaba en el imbito de sobra y equiva- lencia con DD complejos insolubles, en 10s cuales se hallaba neutralizada por completo la actividad de DD. Ademis facilitaron ensayos de lavado indica- ciones hacia la presencia de DD en la superficie celular y a la intensidad de la ligazbn.

Con 10s ensayos se pudo demostrar que el DD fuk adsorbido a la superficie de 10s linfocitos. Sin embargo, las fuerzas de ligaz6n entre la superficie celular y el DD eran relativamente dkbiles y disminuian de forma continua desde una hora hasta 48 horas, siendo la disminuci6n mis intensa en MLC que en 10s cultivos aut6logos. El DD adsorbido permanecia, a1 menos durante 24 horas, en la superficie de 10s linfocitos. Pero incluso tras 48 horas se podia identificar aun DD en el 25 O/o de 10s ensayos con cultivos autblogos y cn el 67 O / o de 10s ensayos con MLC en la superficie celular. Esto manifiesta que a) no se halla fijado con exactitud el instante en que el DD es incorporado por la cklula y b) existen diferencias entre 10s cultivos aut6logos y el MLC. Los estudios, efectuados con linfocitos pretratados con DS y exceso 6ptimo de DD, permiten sospechar que DD y DS reaccionan con receptores celulares diferentes.

Se discuten 10s ensayas, sacindose la conulusibn que la actividad inmuno- 16gica de adyuvante de DD se basa, a1 lado de una actividad estimulante direc- ta de 10s linfocitos, en primera instancia en un efecto de superficie, mediant- el cual se refuerzan las reacciones de 10s linfocitos entre si y con otras cklulas, asi como las reacciones linfocitos-antigenos.

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Anschrift des Verfassers: Postfach 1149, D-7400 Tiibingen.

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Die Adsorption von DEAE Dextran an die Oberfläche von Schweinelymphozyten