Die Anwendung der laserinduzierten Massenspektrometrie zur Charakterisierung von Staubteilchen der Stalluft

Zbl. Vet. Med. B, 32, 4 2 5 4 4 5 (1985) 0 1985 Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg ISSN 0721-1856/ Intercode: ZVRBA2 J

I Institut fur Tiermedizin und Tierhygiene, Fachgebiet Tierhaltungs- und Tropenhygiene und

Institut fur Physik der Universitat Hohenheim, Garbenstrape 30, 7000 Stuttgart 70

Die Anwendung der laserinduzierten Massenspektrometrie zur Charakterisierung von Staubteilchen der StallufP

Von WOLFGANG MULLERI, EGON SCHMID' und PAUL WIESER~

Mit 9 Abbildungen und 8 Tabellen

(Eingegangen am 7. Juni 1984)

Einleitung und Literaturubersicht Die Massentierhaltung hat eine Reihe von lufthygienischen Fragen aufgeworfen, die

nicht nur mit der Bildung und Freisetzung gasformiger Substanzen zu tun haben. Es sind insbesondere Staubteilchen, d. h. Stoffe in kondensierter, aber fein verteilter Form, die durch unterschiedlichste Prozesse im Stall entstehen, an die Stalluft abgegeben werden und 2.B. durch die Zwangsentluftung auch in die AuBenwelt gelangen konnen. Sie konnen damit zumindest in der naheren Stallumgebung zu Geruchs- und Staubbelastigungen fuhren. Mikroskopisch bzw. submikroskopisch kleine Teilchen sind durch ein vergleichsweise groBes Oberflachen-Volumenverhaltnis charakterisiert. An der Partikeloberflache konnen Gase absorbiert werden und bestimmte chemische Prozesse ablaufen.

Eine besondere hygienische Bedeutung der Stallstaubteilchen liegt in ihrer Wirkung als Trager von Luftkeimen. Die Uberlebenschancen luftgetragener Krankheitserreger konnen dabei durch antimikrobielle Wirkungen der Tragerteilchen verringert werden (1). Staubteilchen konnen aber auch wesentlich zur Erhohung der Uberlebenschancen luftgetragener Keime beitragen, etwa durch ihre Fahigkeit Feuchte aufzunehmen und zu speichern oder durch die Abschattung angelagerter Keime, d. h. durch Schutz vor Aus- trocknung, Einstrahlung und einer Wechselwirkung mit toxischen Komponenten des Tragergases Luft.

Entsprechend der hygienischen Bedeutung der Stallstaube in der Nutztierhaltung sind eine Reihe von Untersuchungen durchgefuhrt worden, die sich neben der Herkunft und Freisetzung insbesondere mit der Konzentration und Grofienverteilung der luftgetragenen Teilchen befassen ( 2 , 3, 4, 5).

Uns sind aber keine Literaturangaben uber Meflwerte im Grogenbereich sehr kleiner Teilchen bis hin zu den ultrafeinen Teilchen bekannt.

Einen Schwerpunkt der vorliegenden Literatur bildet der Zusammenhang zwischen Luftkeimflora und Staubgehalt der Stalluft (6,7, 8,9, 10). Die bisher bekannten Daten sind jedoch fur eine realistische Abschatzung der Wirkungen der Staubbelastung auf Mensch und Tier und ihre Bedeutung im Keimhaushalt von Nutztierstallen vielfach nicht ausreichend.

't Herrn Prof. Dr. DIETRICH FEWSON herzlichst zum 60. Geburtstag gewidmet. Die Untersuchungen wurden von der Deutschen Forschungsgemeinschaft unterstiitzt.

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426 MULLER, SCHMID und WIESER

Wichtige Informationen uber die stoffliche Zusammensetzung und die aerodynamischen Partikeleigenschaften (z. B. Lungengangigkeit) fehlen und werden notgedrungen durch allgemeine Hinweise ersetzt. Ergebnisse, wie z. B. die von MAN (1 l), nach welchen die organische Komponente von Staubproben aus Geflugelstallen zu 70,8 YO aus Rohpro- tein, 11 % aus Kohlehydrate, 10 % aus Asche, 4 % aus Fett, 4 % aus Wasser und 3,4 % aus Cellulose bestehen, weisen schon auf die komplexe Zusammensetzung solcher Teilchen hin.

Einflusse der aufgestallten Tiere, der Haltungsform, der Futtermittel usw. konnen hier festgestellt werden (12, 13). In bestimmten Partikelgroflenbereichen durften die wichtigsten Auflenluftkomponenten auch in der Stalluft dominieren.

Die an grofleren Staubproben, d. h. groflen Partikelkollektionen gewonnenen mittle- ren Teilcheneigenschaften lassen keine Ruckschlusse auf die Verteilung dieser Eigenschaf- ten innerhalb des betrachteten Teilchenkollektivs zu. Damit gehen zahlreiche wichtige Informationen uber die Entstehung und Freisetzung der Teilchen verloren.

Geht man z. B. davon aus, dai3 ein wesentlicher Teil der Luftkeime mit bestimmten Tragerteilchen (Hautfragmenten, Teilen des Gefieders, Absonderungen von Schleimhau- ten, feindispersen Bestandteilen der Fakalien, der Einstreu und des Futters usw.) in den luftgetragenen Zustand uberfuhrt werden, so kann die Analyse dieser Tragerteilchen wichtige Hinweise auf die Keimquellen und die durch diese hervorgerufene Gefahrdung geben. Zur Gewinnung solcher Informationen benotigt man die Moglichkeit einer Unter- scheidung zwischen keimtragenden und nicht keimtragenden Staubteilchen. Die Bestim- mung der physikalischen und chemischen Eigenschaften der ausgewahlten Tragerpartikeln mufl dann praktisch durch Einzelteilchenanalyse erfolgen.

Eine vergleichsweise schnelle Einzelpartikelanalyse ist mit dem Lasermikrosonden- Massenanalysator LAMMA 500 (Leybold-Heraeus) moglich.

Die vorliegende Arbeit berichtet iiber erste Ergebnisse, die bei der Anwendung dieses Gerates auf luftgetragene Staubteilchen einer Legehennen-Batteriehaltung gewonnen wurden. Dabei standen, neben der Gewinnung von Informationen uber die Homogenitat des Partikelmaterials, Untersuchungen uber die Moglichkeit einer statistischen Verarbeitung der sehr zahlreich anfallenden Massenspektren und einer darauf beruhenden Unterschei- dung zwischen Bakterien und Tragerteilchen der Stalluft im Vordergrund.

Zur Veranschaulichung der im Stall vorhandenen Quellen fur luftgetragene Partikeln wurden Messungen der Groflenverteilungen von Stalluftteilchen im Groflenbereich zwischen etwa 0,007 pm und etwa 1 pm durchgefuhrt.

Material und Methoden PartikelgroJIen- und Partikelvolumenverteilung

In einer Legehennenbatteriehaltung mit Zwangsliiftung des Versuchsgutes ,,Unterer Lindenhof" der Universitat Hohenheim wurden die ultrafeinen Partikeln der Stalluft mittels eines Elektrischen Aerosolspektrometers, EAS Nr. 3030 der Fa. TSI, Minneapolis, USA, gemessen. Der erfagte Teil- chen-Grogenbereich liegt zwischen etwa 0,007 pm und 1 pm. Die angesaugten Teilchen werden durch Anlagerung von ,,Kleinionen" elektrisch aufgeladen und nach elektrischen Beweglichkeiten getrennt auf einer Elektrode niedergeschlagen. Gemessen wird die durch Teilchen einer elektrischen Beweg- lichkeitsklasse transportierte elektrische Ladung. Die elektrische Ladung ist ein Ma& fur die Teilchen- konzentration, die elektrische Beweglichkeit ist ein Mag fur die PartikelgroBe. Unter der Annahme kugelformiger Teilchen wurden aus den TeilchengroBenverteilungen die Verteilungen der Teilchenvo- lumina berechnet.

Gewinnung der Praparate fur die Analyse im LAMMA 500 A . Partikelpraparate

Zum Sammeln der Luftstaubteilchen wurde neben der Aerosolzentrifuge nach STOBER und FLACHSBART (14) ein Kaskadenimpaktor mit 8 Abscheidestufen eingesetzt. Die den verwendeten Stufen zugeordneten ,,cut off" Durchmesser (Abscheidewirkungsgrad 50 Yo) sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Die Teilchen wurden in den Sammelgeraten auf rnit extrem diinnen Formvarschichten (etwa 20 nm) bedeckten Tragernetzchen abgeschieden. Die auf diese Weise gewonnenen Partikelpra-

Die Anwendung der laserinduzierten Massenspektrometrie

Tabelle 1 ,,Cut-off" Durchmesser der sechs untersten Stufen des verwendeten achtstufigen (Stufen 0-7) Kaska-

denimpaktors

42 7

Impaktorstufe ,,Cut-off" Durchmesser (bm)

parate sind unmittelbar fur die Analyse im LAMMA 500 geeignet, wenn eine fur die Einzelteilchen- analyse geforderte relativ geringe Belegungsdichte gegeben ist. Die Haftung der Teilchen auf der Folie envies sich in den meisten Fallen als ausreichend. Die durch die Laserpulse ausgelosten StoBwellen fuhrten nur vereinzelt zu Partikelverlusten, die dann auf innerhalb einer Netzmasche liegenden Teilchen beschrankt blieben.

B. Bakterienprliparate Zur Gewinnung von Vergleichsspektren und zur Kontrolle der Wiederholbarkeit der MeBergeb-

nisse wurden auch Praparate mit Reinkulturen von Mikroorganisrnen hergestellt. Eine geringe Menge von Oberflachenkulturen, die auf Standard-I-Agar angezuchtet worden waren, wurden in 1 ml aqua dest. suspendiert. Mittels einer Pasteurpipette wurden kleine Tropfchen auf das mit Formvar beschichtete Tragernetzchen ubertragen. Nach Abtrocknen des Wassers blieben einzelne Mikro- organismen an der Folie haften. Unmittelbar nach dieser Praparation wurden die Proben in das LAMMA 500 eingeschleust. In Tabelle 2 sind die Spezies der untersuchten Mikroorganismen ausgefuhrt.

Tabelle 2 Ubersicht uber die verwendeten Mikroorganismen

Mikroorganismen GroBe (pn)

Staphylococcus aureus Streptococcus faecalis Corynebacterium equi

Escherichia coli (ATCC 11229) Pseudomonas aeruginosa Bacillus cereus Candida albicans

1 0,8-1,2 gebogene Stabchen 0,5-1 und 2-6 0,5-1,5 und 2-4 0,5-1,5 und ca. 4 0,8-1 ,O und 2-4 Hefezellen 4-6

Lasermikrosonden-Massenanalysator LAMMA 500 Im LAMMA 500 (Leybold-Heraeus) konnen einzelne Objekte unter mikroskopischer Kontrolle

im Fokus eines gepulsten Leistungslasers spontan verdampft und die als Folge der Laser-Target- Wechselwirkung gebildeten Ionen in einem Flugzeit-Massenspektrorneter hoher Transmission analy- siert werden. Unmittelbar nach jedem LaserschuB erhalt man ein vollstandiges Flugzeitrnassenspek- trum entweder der positiven oder der negativen Ionen. Das Verfahren ist aufierordentlich empfind- lich. Das in seiner jetzigen Form im wesentlichen von KAUFMANN, HILLENKAMP, WECHSUNG und Mitarbeitern entwickelte Gerat wurde bereits in zahlreichen Veroffentlichungen beschrieben (15). Fur einzelne Elemente werden in der Literatur Nachweisgrenzen von g bis g genannt (16,17,18).

Die Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des LAMMA 500. Die zu analysierende Probe ist unmittelbar hinter einem Deckglas (Spektrosil) auf dem Kreuztisch eines hochauflosenden Lichtmikroskops mit Auflicht- und Durchlichtbeleuchtung montiert. Das Deckglas dient als Vaku-


Abb. 1. Aufbau des Lasermikrosonden-Massenanalysators LAMMA@ 500, Fa. Leybold-Heraeus (schematisch). Links unten: Vergroflerter Ausschnitt des Strahlengangs der Lasermikrosonde

umabschlufi. Ein zu dem Nd-YAG-Leistungslaser kollinear justierter He-Ne-Laser (Dauerstrich) markiert den Analysenort im Gesichtsfeld des Mikroskops. Der Nd-YAG-Laser ist giitegeschaltet (Pulsdauer 15 ns) und frequenzvervierfacht (Wellenlange: 265 nm). 1st durch x-,y-Manipulation (Kreuztisch) ein bestimmter Probenort (z. B. Staubteilchen) ausgewahlt, so wird ein Laserpuls ausgelost und dadurch der im Fokus liegende Mikrobereich verdampft.

Die laterale Auflosung liegt bei etwa 0,5 pm. Mit Hilfe einer Filterkombination kann die Leistungsdichte im Laserfokus um etwa 2 bis 3 Grodenordnungen variiert und damit sehr unterschiedliche Verdampfungs- und Ionisierungsbedingungen im Laserfokus eingestellt werden. Wird der Durchlichtkondensor pneumatisch gegen die Ionenlinse ausgetauscht, so gelangen die durch einen Laserpuls gebildeten Ionen in das zur Verbesserung der Massenauflosung (thermische Anfangsener- gie!) mit einem Ionenreflektor ausgestattete Flugrohr. Zur Ionendetektion am Ende des Flugrohres wird ein offener Cu/Be-Multiplier verwendet. Die Flugzeit wird mit einem Transientenrecorder (Biomation Mod. 8100) gemessen. Die Triggerung erfolgt durch die Laserelektronik, der Zeitnull- punkt wird durch ein Photodioden-Signal in den Flugzeitspektren markiert. Die Flugzeitspektren werden mit einem Kleinrechner (zur Zeit DEC LSI 11/23) auf ein Magnetband und von dort in den ICL-Grofirechner des Rechenzentrums der Universitat Hohenheim iibertragen.

Die Umwandlung der Flugzeit- in Massenspektren ist fur die darauf aufbauende statistische Bearbeitung des Mehaterials notwendig und muRte wegen nicht vorhandener Software neu formu- liert werden. Ausgehend von der ersten Ableitung und Glattung des diskret vorliegenden zeitlinearen Flugzeitspektrums wurde das ,,Peakzentroid” anhand des Nulldurchgangs (positiv + negativ) der ersten geglatteten Ableitung festgelegt, sofern die Ionensignale zu diesem Zeitpunkt bestimmte Werte (Basislinie plus Rauschpegel) iiberschritten. Nachdem Laufzeiten unter Beriicksichtigung des elektro- nisch addierten Lasersignals (Nullpunkt der Zeitskala) berechnet wurden, konnten die relativen Atom- bzw. Molekiilmassen mittels des fur die Flugzeitmassenspektrometrie geltenden Zusammen- hangs zwischen Flugzeit (tdnfr) und Masse (m): m/z = c(tdri# mit empirisch festgelegter Konstante c bestimmt werden. Die Ionenladung (z) betragt in allen Fallen 1 Elementarladung. Eine genauere Bestimmung der Atom- bzw. Molekiilmassen erfolgte durch Iteration (Variation von Zeitnullpunkt und Kalibrierungskonstante c). Gesucht wurde das Minimum der Abweichungen der berechneten Atom- bzw. Molekiilmassen von den bekannten Nominalwerten. Dieses rechenintensive Verfahren erwies sich als sehr stabil.

Die Anwendung der laserinduzierten Massenspektrometrie 429

Massenspektren Insgesamt wurden mehr als 2500 Massenspektren ausgewertet. Die Handhabung einer grogen

Zahl von Massenspektren wirft spezielle Probleme bei der Datenverarbeitung und der angemessenen statistischen Verarbeitung der erhaltenen Informationen auf. Jedes einzelne Flugzeitspektrum mug in ein Massenspektrurn umgerechnet werden. Ungenauigkeiten beirn Zielen mit der Lasermikrosonde, Schwankungen der Laserenergie, eine vergleichsweise geringe Dynamik und eine begrenzte Zeitauflo- sung der elektronischen Bausteine (19) usw. fuhren selbst bei der Analyse vollig gleichartiger Teilchen zu Unterschieden in den Massenspektren. Eine statistische Verarbeitung der gewonnenen Informatio- nen hat diese begrenzte Reproduzierbarkeit der Massenspektren zu berucksichtigen. Ausgehend von einer aus den Massenspektren ermittelten Datenmatrix wurden fur die statistische Verarbeitung Methoden der Multivariaten-Analyse, insbesondere die Diskriminanz- und Clusteranalyse verwendet. Die berechneten Diskriminanzfunktionen dienten zur Identifikation. In Abbildung 2 sind die unterschiedlichen Zielsetzungen dieser drei Methoden der nurnerischen Taxonomie dargestellt (20 a). Bei der Clusteranalyse wird versucht die Partikeln auf Grund von bestirnmten Merkmalen der LAMMA-Spektren (Auftreten und Intensitat von Massenlinien und deren Kombinationen) in Grup- pen (Cluster) aufzuteilen. Im Gegensatz hierzu geht die Diskriminanzanalyse von bestimmten Gruppenzugehorigkeiten aus (z. B. Massenspektren der Teilchen bestirnmter chemischer Zusammen- setzung einzelner Impaktorstufen bzw. Bakterienstamme). Die Aufgabe der Diskriminanzanalyse besteht darin, eine Funktion zu bestimmen, die es gestattet, moglichst viele Partikeln aufgrund bestimmter Merkrnalsauspragungen der Massenspektren der richtigen Gruppe zuzuordnen. Bei der Identifikation bestehen bekannte Gruppen. Von einigen weiteren Objekten ist die Gruppenzugeho- rigkeit unbekannt. Diese sol1 nun anhand bestimmter Merkmalsauspragungen der Massenspektren festgelegt werden. Einzelheiten uber diese Verfahren konnen der Literatur entnommen werden (20. 21, 22, 23, 24).

I C l u s t e r a n a l v s e

Abb.2. Zielsetzung der Cluster- , analyse, der Diskriminanzanalyse und der ldentifikation (Einzelhei-

ten siehe Text)

I " , C h t zuqeordcete Lt,eLte v c l u s t e r I Cluster 2

I D i s k r i m i n a n z a n a l y s e 1 A

3 Gruppe I cruppe 2 I 1 l d e n t i f i k a t i o n I

I . . I


Tabelle3 a Teilchengroflenverteilung (Anzahl X cm" x pm-I) ~~ ~ ~

Zeit Durchmesser

4,2 x lo-'

1,33 x 2,37 x 4,22 x lo-' 7,5 x l c T 2 1,33 x lo-' 2,37 x 10.' 4,22 x 10-1

7,5 x 10-3

7,55 x lo-'

9:40 a

9:50 a

1o:oo a

1O:lO a

1,47 X 10' 5,92 x 104 i,42 x 104 i , i6 x 104 3,9 x 103 8,O X 10' 3,O X lo2

- 1,2 x 106 6,i x 105 6,Ol X 10' i,o4 x 104 2 , ~ x 104 i , i6 x 104 5,o x 103 5,O X lo2 3,O X lo2

i,52 x 107 2,i7 x 105

3,48 x 104 i,78 x 104 8,7 x 103 i,o x 103

2,67 X lo4

4,O X 10'

1,14 X lob 8,3 x 103 i,54 x 105 i,39 x 104

8,7 x 103 4,4 x 10' 5,O X 10' l,o x 10'

1,42 X 10'

A 84,12 24,19 45,2 1 24,49

X 2,67 3,69 3,65 3,61

a = Auflenmessung; i = Messung im Stall; A,x = adjustierbare Parameter

Ergebnisse Partikelgroj3enverteilung

Die Ergebnisse einer MeGreihe mit dem EAS sind in Tabelle 3 a und 3 b dargestellt. Die Messungen wurden zunachst aui3erhalb des Stalles begonnen und dann im Stall fortgefuhrt. Die erste Spalte gibt die fur die einzelnen Groflenintervalle charakteristischen Teilchendurchmesser, die nachfolgenden Spalten geben die diesen GroGenintervallen zu den genannten Meheiten zugeordneten Teilchenkonzentrationen (Abb. 3 a) bzw. Teil- chenvolumina (Abb. 3 b) an. Die Teilchenvolumenverteilungen wurden aus den Teilchen- groflenverteilungen unter der Annahme kugelformiger Teilchen berechnet. Die Approxi- mation der Teilchengroflenverteilungen im Bereich der grofleren Teilchen durch eine Potenzfunktion (25):

(N, = Teilchenkonzentration, D, = Teilchendurchmesser, A und x adjustierbare Parame- ter) fuhrt zu den in Tabelle 3 a angegebenen Werten fur die Approximationsparameter A

Tabelle3 b Teilchenvolumenverteilung

Zeit 9:40 9:50 1o:oo 1O:lO Durchmesser a a a a

- - 4,2 x 10-3 - - 7,5 x 10-3 -

7,4 x 10-1 3,37 l,o x 10-2 1,33 x lo-' - 1,02 4,2 X 1cT' 2,7 X lo-' 1,l x 10-1

4,22 x 2,32 4,l x lo-' 1,9 x 10.' 5,5 x 10-1

2,86 - 2,5 x 10.'

2,37 x

7,5 x lo-' 3,14 6,28 1,37 3,14 1,33 x lo-' 1,42 X 10' 1,42 X lo1 7,69 1,07 X 10' 2,37 x lo-' 2,74 X 10' 3,43 x 10' 4,28 X 10' 3,09 X 10'

7,55 x 10-1 6,21 X 10' 6,21 X 10' 9,31 X 10' 3,l X 10' 4,22 x 10-I 3,15 X 10' 2,l x 10' 3,87 X 10' 2,l x 101

Die Anwendung der laserinduzierten Massenspektrometrie 43 1

Tabelle3 a mit Werten fur A und x [Potenzverteilung]

10:30 10:40 10:45 10:50 10:54 10:58 i i 1 1 1 1

- 1,52 X 10' 3,8 x 105 i,47 x 105 i,39 x 104 i,42 x 104

3,9 x 103 i , i x 103

8,7 X 10'

3,O X lo2

- 3,43 x 10' 7,i7 x 105 2,87 x 105

i,o6 x 104 5,4 x 103 i ,3 x 103 l,o x 10'

2,44 X 10' 2,66 X 10'

- i,64 x 107 1,35 X 10' 7,88 x 105 5,57 x 10' 3,2 X 10' 1,64 X 10' 5,9 x 103 8,O X lo2 l,o x 102

7,24 X 10' 8,67 x 105 2,87 x 105 4,i8 x 104 3,02 X 10' 1,64 X 10' 3,4 x 103 2,o x 102 8,O X lo2

1,9 X 10' 1,9 X 10' 3,84 x 105 4,5 x 105 2,34 x 105 2,27 x 105 2,44 X 10' 3,48 x 104 2,49 x 104 2,49 X 10' i , i6 x 104 i , i6 x 104 3,0 x 103 2,5 X 10' 8,O X 10' 5,O X lo2 3,O X lo2 l,o x 102

150,71 101,49 278,13 29,16 123,70 56,66

2,27 2,45 1,85 3,41 2,20 2,62

und x. Die Teilchengroi3enverteilungen in der Aufienluft sind in der Regel steiler, als die im Stall gemessenen. Auch ist die von der Partikelkonzentration abhangige Grofie A fur die Teilchen der Stalluft grofier als fur Teilchen der Aufienluft.

Die Auflenmessungen sind teilweise durch herrschenden landwirtschaftlichen Ver- kehr beeinflufit (2. und 3.Mefireihe), wahrend sich bei der Mei3reihe im Stallinnern ein plotzliches Erschrecken der Tiere in einer erhohten Produktion ultrafeiner Staube auswirkt (10.40 Uhr). Dieser Anstieg der gemessenen Partikelkonzentration macht besonders deutlich, dai3 sich Tieraktivitaten durch Produktion und Freisetzung von Teilchen bis hinunter zu Teilchengrofien von 0,0075 pm auswirken konnen. Schon um 10.54 Uhr sind die vorher gemessenen Werte praktisch wieder erreicht. Mit einem Minimum der Volu- menverteilung bei etwa 0,04 pm zeigen sowohl die Messungen in der Aufienluft, als auch in der Stalluft im betrachteten Grofienintervall die ubliche bimodale Verteilung. Deren Ursache ist in der Bildung ultrafeiner Teilchen aus der Gasphase (Aitken-Kerne) und dem Wachstum dieser Teilchen durch Kondensation, Koagulation und Prozesse der chemischen Konversion (Akkumulationsbereich) zu sehen (26) .

Gleichzeitig ist auch ein Anstieg der groi3eren Teilchen zu verzeichnen, der allerdings weniger uberraschte.

(pm3 x cm-' x pm-') Tabelle3 b

10:30 10:40 10:45 10:50 10:54 10:58 1 1 1 i I I

- 3,4 x 10-1 4,7 x 10-1 1,02 5,5 x 10-1 3,14 1,07 X 10' 2,75 X 10' 4,21 X 10' 6,21 X 10'

7,6 x lo-' 8,8 X 1W 2,o 9,5 x 10-1 5,89 1,30 X 10' 3,77 x 10' 5,24 X 10' 3,l X 10'

3,62 1,66 5,49 2,19 7,06 2,02 x 10' 3,43 x 10' 3,15 X 10' 3,l X 10'

1,07 2 8 1,13 X 10' 6,67 2,02 x 10' 2,4 X 10' 1,05 X 10' 1,86 X lo2

4,2 x lo-' 4,7 x 10-1 1,63 9,6 x lo-' 5,5 1,43 X lo1 2,06 X lo1 3,14 X lo1 6,21 X 10'

- 4,2 x 10.' 5,5 x 10-1 1,58 1,37 5,49 1,42 X 10' 1,71 X l o L 2,l x 10' 3,l X loL

a = Auflenmessung; i = Messung im Stall


LI N"L %A1

positive ions

FeO 85

Abb. 3. Veranschaulichung der Einzelpartikelanalyse mit dem Lasermikrosonden-Mas- senanalysator LAMMA@ 500. Die beiden an Position 1 und 2 der rasterelektronenmikroskopischen Aufnahme abgeschiedenen Teilchen wurden mit Laserschussen verdarnpft. Zuruck bleiben Perforationen in der dunnen organischen Tragerfolie. Als Folge dieser Laserstrahlung-Teilchen- Wechselwirkung erhalt man die Flugzeitmassenspektren 1 und 2. Das Teilchen der Posi- tion 2 konnte erst mit einem zweiten LaserschuS vollstandig verdarnpft werden. Damit bestand die Moglichkeit ein Massenspektrum der positiven (2a) und vorn Teilchen- rest ein Massenspektrum der negativen Ionen (2 b) zu er-

halten

L T41K positive ions

negative ions

136 152

m k - Massenspektren (Staubteilchen)

Die Abbildung 3 veranschaulicht noch einmal die Einzelpartikelanalyse mit dem LAMMA 500. Die rasterelektronenmikroskopische Aufnahme zeigt einzelne auf der dunnen organischen Folie abgeschiedene Staubteilchen. Die mit 1 und 2 gekennzeichneten Perforationen sind durch die laserinduzierte Verdampfung der ursprunglich dort liegenden Teilchen entstanden. Die am linken Bildrand sichtbaren Laserperforationen erhalt man, wenn nur die Tragerfolie ,,beschossen" wird. Die den beiden Teilchen der Positionen 1 und 2 zugeordneten Flugzeitmassenspektren sind unter der rasterelektronenmikroskopischen Aufnahme dargestellt. Das Teilchen 2 konnte mit einem ,,Laserschui3" nicht vollstandig verdampft werden, so dai3 bei einem zweiten ,,SchuS" auch das Massenspektrum der negativen Ionen (2 b) gewonnen werden konnte. Die in diesen Spektren naher gekennzeichneten Element- bzw. Molekulionen sind typisch fur Teilchen der Stallumgebung (27).

In der Abbildung 4 sind als Beispiel normierte LAMMA-Spektren negativer Ionen, die bei der Analyse von 54 Staubteilchen der GroBenklasse 0,5 bis 0,8pm gewonnen wurden, dargestellt. Davon zeigen 19 Massenspektren, wenn auch sehr unterschiedlich ausgepragt, die Massenlinie m/z = 97, die dem fur Ammoniumsulfat typischen Anion (HS04)~ zugeordnet werden kann. Mit m/z = 119 und m/z = 135 bzw. 137 treten

Die Anwendung der laserinduzierten Massenspektrornetrie 433

Abb. 4. Massenspektren ne- 1- gativer Ionen von 54 Staub- teilchen der Stalluft, aero- dynarnische Groflenklasse: 0,5 prn bis 0,8 prn. Ordinate: Signalhohe (willk. Einheiten);

Abszisse : m/z- Werte

vereinzelt die neben den Fragmentionen (SO4), (SO,), (SO,), (SO) und S (m/z = 96,80, 64, 48, 32) z. B. fur Natrium- und Kaliumsulfat typischen Anionen (NaS04) und (KS04) auf. Ahnliche Verhaltnisse findet man auch bei den Massenlinien m/z = 1 ( H ) , 12 (C) , 13

(CO,), 62 (NO,). Massenlinien mit m/z-Werten um 24, 36, 48, 60 und 72 lassen sich haufig den Ionentypen (C,H,) zuordnen, die mit relativ groi3er Wahrscheinlichkeit in den Massenspektren der negativen Ionen auftauchen. Demnach kann man schon aus einfachen Spektren-Sammlungen charakteristische Unterschiede in der Zusammensetzung einzelner Staubteilchen erkennen. Insbesondere wird deutlich, daf3 einzelne Teilchen entscheidend von der ,,Schwefelchemie" gepragt sind. In Abbildung 5 sind die Haufigkeiten des Auftretens bestimmter Massenlinien in Abhangigkeit von den zugehorigen m/z-Werten fur die Spektren positiver (Abb. 5 a) und negativer (Abb. 5 b) Ionen getrennt nach einzelnen Impaktorstufen dargestellt. Fur diese Darstellung wurden mehr als 2500 Massenspek- tren ausgewertet.

Einige besonders haufig auftretende Massenlinien sind in Tabelle 4 und Tabelle 5 zusammengestellt. Nach dem derzeitigen Kenntnisstand ist die Zuordnung bestimmter Ionenarten zu den entsprechenden m/z-Werten mit einer Reihe von Unsicherheiten verbunden. Dies gilt insbesondere fur die schweren Ionen, die nach unseren an Standard- teilchen bekannter Zusammensetzung gewonnenen Erfahrungen, hochstwahrscheinlich auf organische Molekule von Futter- und Gefiederbestandteilen zuruckzufuhren sind.

In Abbildung 5 b zeigen die auf der 7. Impaktorstufe abgeschiedenen Teilchen der Adenluf t und der Stalluft sehr ahnliche Massenspektren. Diese Ahnlichkeit bleibt auch noch erhalten, wenn man die Massenspektren aller untersuchter Teilchen der Stufen 3 bis 7 gemeinsam betrachtet.

( C H ) , 14 (CH2), 15 (CH3), 16 (0), 17 (OH), 35 bzw. 37 (Cl), 44 (CO,), 46 ( N 0 2 ) , 60


Innan 3.+. Slufm

u I I . . , "I

eb id0 iho 140 id0 id0 zdo zho 240 Innan 3. Stufa l + l

11.. . . .- , L r . 8 , - I , .... ;I . , do 140 id0 id0 2d0 2io 240

Innan 4. S l u f e l + l

140 d o id0 2d0 2io 2.40 Innan 1. Slufa l + I

Ill

Aueean 7. Stufa l + I I I I I

I_ . . . . d. . . ido id0 140 id0 id0 zdo 280 ' 240

Abb. 5 a. Haufigkeiten des Auftretens bestimmter Mas- senlinien (Ordinaten) in Ab- hangigkeit von den zugehorigen m/z-Werten (Abszissen) fur die Spektren positiver Ionen nach Impaktorstufen getrennt (etwa 2600 Einzel-

spektren)

Mit zunehmender Teilchengrone nimmt die Haufigkeit des Auftretens von Ionen wie (SO3)-, (HSO,)~, (SO+)- und (HS04)- deutlich ab. Wir folgern hieraus, dai3 die grofieren Partikeln der Stalluft eine vollig andere Entstehungsgeschichte aufweisen, als die kleinen Teilchen, die den vergleichbaren Teilchen der AuBenluft auffallend ahneln. Diese Aussage wird bekraftigt durch die Haufigkeitsverteilungen der positiven Ionen in Abbildung 5 a.

Bei den Teilchen der 7. Impaktorstufe und der 3. bis 7. Impaktorstufe, nicht aber der 6., 5. , 4. und 3. Impaktorstufe, tritt das Ion (NH,)' vergleichsweise haufig auf. Man mui3 also annehmen, dai3 die kleinen Teilchen haufig aus Ammoniumsulfat bestehen. Auch Blei als typischer Indikator des Straflenverkehrs (Benzinzusatz) tritt bevorzugt in kleinen Teilchen auf und zeigt, dai3 diese Teilchen der Stalluft aus der Stallumgebung stammen (Zwangsbeliiftung). Bei den Massenspektren der positiven Ionen ist die Ahnlichkeit der 6., 5. , 4., und 3. Impaktorstufe vergleichbar gut wie in Abbildung 5 b. Diese Ahnlichkeit deutet auf Entstehungsprozesse dieser Teilchen hin, die anders sind, als diejenigen fur Teilchen der 7. Impaktorstufe.

Vermutete Zusammenhange konnen im Rahmen statistischer Modelle verdeutlicht werden. So ist zur Veranschaulichung der Clusteranalyse in Abbildung 6 a noch einmal eine Sammlung negativer Massenspektren von Staubteilchen der 7. Impaktorstufe wieder- gegeben. Die zwischen den einzelnen Teilchen aufgrund des Auftretens bestimmter


I Innen 3 . q . Slur* 1

Abb. 5 b. Haufigkeiten des Auftretens bestirnmter Mas- senlinien (Ordinaten) in Ab- hangigkeit von den zugehorigen m/z-Werten (Abszissen) fur die Spektren negativer Ionen nach Impaktorstufen getrennt (etwa 2600 Einzel-

spektren)

Innen 5. S tu fa (-1

I I Innen 6. S t u f e (-1

Ionensignale in den Massenspektren bestehenden Ahnlichkeiten sind als Dendrogramm in Abbildung 6 b dargestellt (28). Wie man aus diesem Dendogramm erkennt, bestehen grofle Ahnlichkeiten nur zwischen sehr wenigen Teilchen einer aerodynamischen Groflenklasse. Dies ist sicherlich ein deutlicher Hinweis, dai3 man bei der Betrachtung partikelgebundener Spurenstoffe der Stall- und auch der Auflenluft von sehr unterschiedlichen Entstehungs- und Transportprozessen auszugehen hat und dafl man eine Vielzahl von Teilchen untersu- chen mug, will man statistisch gesicherte Aussagen erhalten.

Ein auf der Grundlage einer Clusteranalyse durchgefuhrter Vergleich zwischen kleinen Teilchen (7. Impaktorstufe) der Stall- und solchen der Auflenluft deutet darauf hin, dafl Massenspektren von negativen Ionen, die im wesentlichen nur (HS04) Ionen (Ammo- niumsulfat!) aufweisen, uberwiegend aus der Stalluft isoliert wurden. Teilchen dieser Eigenschaft (Cluster 1) kommen, wie Tabelle 6 verdeutlicht, praktisch nur auf der 7. Impaktorstufe vor. Andere Cluster, die z. B. bei einer Einteilung entsprechend dem 55 %-Ahnlichkeitsniveau entstehen, sind mehr oder weniger ausgepragt uber alle Impak- torstufen, d. h. Partikelgroflenklassen verschmiert. Der z. B. durch Ionen wie ( S O ) , (SiOz) und (SO3)- characterisierte Cluster 5, der also wohl Teilchen aus bodenoriginaren Materialien enthalt, bleibt in diesem Bild auf die 3. Impaktorstufe beschrankt und bestatigt, dafl solche durch mechanische Zerkleinerung entstehenden Teilchen relativ grofl sind.


Tabelle 4 Zusamrnenstellung einiger in den Spektren der negativen Ionen haufig auftretenden Ionenmassen und

den verrnutlich zugeordneten Ionenarten (die haufigsten Isotope sind unterstrichen).

Masse Ion Masse Ion

1 12 13 14 15 16 17 24 25 26 32 34

-

-

35 36 -

37 38 40 41 42 43 44 46 48 49 50 59 60

H- - C- CH-. C- CH; CH; 0- OH- C; C2H- C2H; - S- S- - c1- C; Cl-, C3H-

C N , C3H;, NO; C7HO- CiHzO-

NO;

C4H-, CCI-

C2H30- SiO-, CO;

Ci, SO-

C4HY

CO;, C;, SiO; CHjCO;, C2 Clk

61

62 63

64 72 73 75 76 79 80 - 81 92 96 97 98 99

104 119 120 127 135 136 137 152

HCO,, CSH-, CZCI-, ClCzH; NO,, C5H, C5H<, HNO,, PO,, CLCZ H, so, C; C3H2Cl-, C6H- C3HZC1- SiO; B r- so, - HSO,, Br- SiO; so; HSO; HZSO; H3SO; Si20; NaS0; Si20; J- KSO; Si20< KSO; Siz 0;

270 Teilchen, die diesern Beispiel zugrunde liegen, sind eine fur eine solche Untersuchung sicherlich zu kleine Kollektion, reichen aber vielleicht dam aus, die Moglichkeiten dieses Instrurnentariurns aufzuzeigen.

Eine entsprechend Tabelle 6 fur positive Ionen auf der Grundlage von 273 Teilchen durchgefuhrte Clusteranalyse bestatigt, dai3 der irn wesentlichen aus Na', K', Ca' und dern Ion (NH4)' gebildete Cluster bevorzugt auf der 7. Irnpaktorstufe anzutreffen ist.

Massenspektren (Keime) Zeigen die Massenspektren der Staubteilchen von Laserschui3 zu Laserschui3 fast

ausnahmslos deutliche Unterschiede, so sind LAMMA-Spektren einzelner Mikroorganis- men durch eine vergleichsweise gute Reproduzierbarkeit gekennzeichnet. Als Beispiel sind in Abbildung 7 LAMMA-Spektren positiver Ionen, die bei der Analyse von 55 einzelnen Bakterienzellen (Staph. aureus) gewonnen wurden, dargestellt. Auch an Staubteilchen angelagerte Mikroorganisrnen geben ahnlich brauchbare Ergebnisse. Voraussetzung hierzu ist allerdings, dai3 die Massenspektren nicht durch rnitverdarnpftes Material des Tragerteil- chens verfalscht werden. In vielen praktischen Fallen kann diese Bedingung hinreichend erfullt werden. Zudem ist, zumindest irn Einzelfall, eine Trennung von Keirn und Tragerteilchen unter rnikroskopischer Kontrolle moglich. In allen bisher untersuchten Beispielen unterscheiden sich die Massenspektren von Staubteilchen und Mikroorganisrnen sowohl hinsichtlich der positiven, ah auch der negativen Ionen signifikant.


Tabelle 5 Zusammenstellung einiger in den Spektren der positiven Ionen haufig auftretenden Ionenmassen und

den vermutlich zugeordneten Ionenarten (die haufigsten Isotope sind unterstrichen).

Masse Ion Masse Ion

12 13 14 15 18 23 24 25 26 27 28 29 30 31

-

-

39 40 41

- -

44 46 47 48 49 -

50 51 52 53 54 55

-

56 57 -

- Sit Si+ Sit P+ - Kt - Ca+ K+ Ca+ Ti +

Ti+ - Ti+ Ti+ Ti+, Cr+ V+ - Cr+ Cr+ Cr', Fe+ Mn+ - Fe+ Fei

58 60 61 62 63 64 65 66 67 68 72

116 117 118 119 120 121 122 123 124 134 135 136 137 138 206 207 208

-

- -

- -

-

-

- Nit Ni +

Nit Ni +

- c u + Ni+ &I+ c u + Zn+ Zn+, VO+ Zn+ FeO +

Sn+ Sn+ Sn+ Snt - Sn+ - Sbt Sn+ Sb+ Sn+ Bat Ba+ Ba+ Baf - Bat Pb+ Pb+ - Pb+

Eine weit uber diese Zielsetzung hinausgehende Fragestellung ist die Differenzierung der an Tragerteilchen angelagerten Mikroorganismen im Sinne einer Taxonomie. Hierzu liegen, rnit Ausnahme von Untersuchungen, die LINDNER und SEYDEL (29) in jungster Zeit an Mycobakterien durchgefiihrt haben, keine verlafllichen Literaturhinweise vor, die direkt auf die Lasermikrosonden-Massenanalyse ubertragen werden konnten, wenn auch andere massenspektrometrische Verfahren in diesem Zusammenhang zum Teil erfolgreich eingesetzt worden sind (30).

Fuhrt man anhand von Massenspektren der in Tabelle 2 aufgelisteten Mikroorganis- men eine stufenweise Diskriminanzanalyse (31) durch, so erhalt man die in Tabelle 7 wiedergegebene Klassifikationsmatrix. Wie man erkennt, 1aGt sich eine Klassifikations- funktion bestimmen, die 95,2 % der durch Einzelteilchenanalyse von B. cereus (BC) gewonnenen Massenspektren diesem Bakterium wieder zuordnet. Die entsprechenden Werte fur Cand. albicans (CA), C. equi (CE), E. cofi (EC), Pseud. aeruginosa (PA), Staph. aureus (SA) und S t y . faecalis (SF) sind 87,7%, 95,2%, 77,2%, 68,3%, 9 4 3 % und 76,7 %. Der jeweils zu 100 O h fehlende Anted wird, wie Tabelle 7 verdeutlicht, falsch zugeordnet. Abbildung 8 zeigt eine Darstellung der Einzelspektren durch die ersten beiden kanonischen Variablen.

43 8 MULLER, SCHMID und WIESER

I I _

d ' Z b ' 4b ' E b ' Eb ' Id0 ' l i 0 ' 140 '

I

6 22 23 70 4E 167 62 47 40

I 6 1 200 170 226 82 243 188 210 187 108 41 126 137 42 138 86 262 264 04 168 213 220 131 218 286 07 120 164 218 268 263 268 267 260 267 288 270 240 233 241

a t

Abb. 6 . Ergebnis einer Clusteranalyse von 270 Staubteilchen auf der Grundlage der Massenspektren negativer Ionen. Abbildung 6 a (links). Auswahl aus den Massenspektren (Ordinaten: Signalhohen; Abszissen: m/z-Werte) in der in Abbildung 6 b gegebenen Ordnung; Abbildung 6 b (rechts). Ausschnitt aus dem Dendrogramm zur Veranschaulichung bestehender Ahnlichkeiten zwischen den

Massenspektren (,,Furthest Neighbour" Clusteranalyseverfahren)

Es wurden folgende Bezeichnungen gewahlt:

Keimspezies Einzelspektren Gruppenmittelwerte

B. cereus A 1 Cand. albicans B 2 C. equi C 3 E. coli D 4 Ps. aeruginosa E 5 Staph. aureus Strept. faecalis

F G

6 7

Uberschneidungen sind durch Sternchen gekennzeichnet. Die Gruppenmittelwerte aller 7 untersuchten Mikroorganismen liegen voneinander getrennt. Die groi3e Streuung der Einzelspektren macht diese vermeintliche Unterscheidungsmoglichkeit weitgehend


Tabelle 6 Zusammenfassung der Ergebnisse einer Clusteranalyse (furthest neighbour) von 270 Einzelteilchen- spektren (neg. Ionen). Die Teilchen wurden bei einer Exposition im Gefliigelstall auf den 5 letzten Stufen des Kaskadenimpaktors abgeschieden (Ahnlichkeitsniveau fur die Einteilung in Cluster: 55 YO).

~~

Cluster Impaktorstufe Zahl der Falle Nr. 7 6 5 4 3 n

- - 1 28 2 3 33 2 8 4 1 3 1 17

3 3 1 1 1 2 4 1 1

1 9 10 5 6 1 17 11 8 4 41

2 2 7 - 8 5 5 4 7 11 32 9 3 3 5 2 13

10 4 1 4 7 16 11 2 1 3

5 12 5 13 2 1 3 14 1 2 3

1 2 1 1 5 15 - 2 16 - 2 17

ungruppiert 78

- - - - -

- - -

- - -

- - - - - - - - - - - - - - -

- - 1 1 2 - - - -

insgesamt 270

Tabelle 7 Zuordnung der einzelnen Massenspektren (pos. Ionen) der untersuchten Mikroorganismen aufgrund

der berechneten Klassifikationsfunktion (beziiglich der gewahlten Abkiirzungen siehe Text).

Gruppe Prozent Zahl der Spektren zugeordnet zur Gruppe korrekt BC CA CE EC PA SA SF

BC 95,2 79 0 1 0 3 0 0 CA 87,8 0 43 6 0 0 0 0 CE 95,2 0 2 60 0 0 0 1 EC 77,2 0 0 0 44 10 0 3 PA 68,3 0 0 0 10 41 0 9 SA 94,5 0 3 0 0 0 52 0 SF 76,7 0 0 2 2 6 0 33

Total 85,9 79 48 69 56 60 52 46

zunichte. Dennoch treten deutliche Haufungszonen, etwa fur B. cereus aber auch fur St. aureus, Cand. albicans und E. coli auf, die auf charakteristische Unterschiede in den LAMMA-Spektren dieser Mikroorganismen hinweisen. In diesem Zusammenhang mui3 man berucksichtigen, da13 aus der zweidimensionalen Darstellung nu r sehr begrenzte Ruckschlusse auf die Leistungsfahigkeit der abgeleiteten Diskriminanzfunktionen moglich sind.

440 MULL,,, SCHMID und WIESER

d ' eo ' rb ' so ' so ' d o ' l i 0 ' 1lO a 140 ' 1da ' zdo

Abb. 7. 55 Massenspektren positiver Ionen von Srapby- lococcus ui4reu5 (Ordinaten: Signalhohen; Abszissen: m/z-

Werte)

Vor einer Wiederholung dieser Versuche wurden die Proben vertauscht. Die Massen- spektren wurden mit Hilfe der aus den Ergebnissen der ersten Versuchsreihe berechneten Diskriminanzfunktion einzelnen Mikroorganismen zugeordnet. Das Ergebnis ist in Tabelle 8 zusammengefaflt. Bei B. cereus und Str. faecalis wurden 77 YO der Massenspektren richtig zugeordnet. Bei Cand. albicans ist dieser Wert 56 YO und bei Coryn. equi 41 Yo. Bei E. coli wurden von 51 Spektren nur zwei richtig zugeordnet, wahrend je 22 davon Pseud. aeruginosa und Str. faecalis zugeordnet wurden. Bei Pseud. aeruginosa wurden von 55 Massenspektren 46 Str. faecalis zugeordnet usw.

Tabelle 8 Zuordnung der Spektren (pos. Ionen) zu den einzelnen Keimarten mit Hilfe der berechneten

Diskriminanzfunktion (beziiglich der gewahlten Abkiirzungen siehe Text).

Anzahl der Spektren zugeordnet zum Keim Keim n BC CA C E E C PA SA SF %

- J 5 - 4 4 77 2 56 1 21 1 41

- - L 72 1 40" 29 - - M 59 11 24:' 1 - - 1 51 5 22 4 22

0 55 1 3 1 4'F 46 7 P 50 2 18 17 - - 13" - 26 Q 57 - 1 5 1 6 - 44'b 77

- 2 ii - -

total 416 95 % 5 4 % 2 7 % 40% 1 0 % 38% 38% 44%

......

b . 0 +

L . 5 1

3 . 3 I

1 . 5 . ’ . C I

L - 1 . 1 t

B L

- 5 . ” . - 4 . 5 . - b . @ *

- i . 5 t

..


................ ’..............,....,....,.........*....,.........*.........*....,....,.......................

D b D

I

....*.........*......_.................................,....,....*...................*....,..............*.........*... - 8 . l d - 4 . 5 2 - 1 . 5 2 - 1 . 7 0 - . m 0 .TOO 2.70 L . 5 0 b . 3 0 8.10 9.vo 11.7

-I.?c - i . ~ @ -7.60 - 1 . 8 0 n.oo 1 . ~ 1 1 3.60 1 . 4 0 7.20 9.00 10.8

Abb. 8. Darstellung der Einzelspektren von 7 Mikroorganismen durch die ersten kanonischen Variablen. Die fur die Einzelspektren (A bis G) und die Gruppenrnittelwerte (1 bis 7) verwendeten

Zeichen werden im Text definiert

0

Abb. 9. Biplot fur Bacillus cereus (0) und Escherzchiu coli (0) aufgrund von 14 Massenli- nien (24, 25, 26, 28, 40, 41, 57, 66, 72, 81, 83, 88, 125 und 138). Erste und zweite Hauptkomponente der positi-

ven Ionen

0 0 0


Das fur eine bestimmte Teilchenkollektion in Form einer Matrix vorliegende Daten- material kann auf unterschiedliche Weise graphisch dargestellt werden. Wahlt man z. B. 14 verschiedene Ionensignale von 116 Massenspektren aus, so erhalt man eine darzustellende Datenmatrix mit 14 Spalten und 116 Zeilen. Diese Matrix kann so in Zeilen- und Spaltenvektoren zerlegt werden, dafl sie eine zweidimensionale Darstellung der Zeilen und Spalten erlaubt. Eine hierauf beruhende Darstellung ist das auf GABRIEL (32) zuruckge- hende ,,Biplot". Ohne Angabe von weiteren Einzelheiten ist in Abbildung 9 das ,,Biplot" fur B. cereus und E. coli dargestellt. Es zeigt, dafl mit dieser Darstellungsart eine relativ gute Unterscheidung dieser beiden Mikroorganismen moglich scheint. Die in Abbildung 9 eingezeichneten Pfeile deutern an, dafl die Richtungen durch m/z-Werte festgelegt sind. Die Lange der Pfeile ist ein Mafl fur die Streuung der Intensitat der entsprechenden Massenlinie innerhalb des verwendeten Datensatzes.

Diskussion Die gefundenen Ergebnisse legen nahe, dafl kleine Teilchen (< 1 pm) der Stalluft im

wesentlichen aus Sulfaten, insbesondere auch aus Ammoniumsulfat, bestehen und sich damit signifikant von den grof3eren Teilchen unterscheiden.

Einerseits werden ultrafeine Aerosolteilchen vermutlich im Stall aus der Gasphase z. B. unter Beteiligung von Ammoniak und Schwefelwasserstoff gebildet und wachsen dort zu Teilchengroflen heran, die eine Analyse mit dem LAMMA 500 moglich machen. Auf der anderen Seite zeigen gerade die bleihaltigen Teilchen, dad uber die Zwangsluftung eine direkte Verbindung zwischen Auflen- und Stalluft besteht. Neben den Sulfaten sind Wasser, chlorhaltige Verbindungen, Kohlenwasserstoffe, Nitrate, Karbonate und bei sehr groflen Teilchen vereinzelt auch Silikate typische Inhaltsstoffe der untersuchten Teilchen.

Bei einer Anstiegszeit des Laserpulses von wenigen Nanosekunden erfolgt der Verdampfungs- und Ionenbildungsprozefl im Laserfokus aui3erordentlich rasch und kann n,icht bzw. nur sehr eingeschrankt als Gleichgewichtsphasenubergang verstanden werden. Ahnlich wie bei der Felddesorptions- und Sekundarionen-Massenspektrometrie (33) werden in den LAMMA-Spektren Ionensignale beobachtet, die grofleren Molekulen zugeordnet sind. Erfolgt die Ionenbildung durch Anlagerung eines Protons oder Alkali- Ions, so treten selbst in den Spektren von nicht verdampfbaren, thermisch labilen organischen Verbindungen ,,Quasimolekulionen" oder charakteristische Fragment-Ionen auf. Die hohen Leistungsdichten im Laserfocus von lo8 bis 10'' W cm-2 fiihren wegen den kurzen Pulsdauern also nicht zwangslaufig zur Pyrolyse molekularer Bestandteile. Die physikalisch sehr interessanten Ionenbildungsprozesse im Laserfokus (z. B. Freisetzung praformierter Ionen, Bildung von Cluster-Ionen, chemische Reaktionen im Mikrobereich der unmittelbaren Laser-Target-Wechselwirkung) und deren Abhangigkeit von Eigen- schaften (Grofle, geometrische Gestalt, Zusammensetzung) der zu untersuchenden Objekte ist derzeit noch weitgehend unverstanden. Eine quantitative Deutung der LAMMA-Spektren komplex zusammengesetzter Objekte ist schon allein aus diesem Grunde nur mit Einschrankungen moglich.

Es hangt also insbesondere auch von der Weiterentwicklung dieses Verfahrens ab, ob man z. B. die organischen Stallstaubkomponenten in den Spektren groflerer Teilchen richtig deuten kann und damit quantitative Einblicke in den Stoffhaushalt des Stallaerosols erreicht.

Bei den Untersuchungen konnten keine gesicherten Hinweise gefunden werden, dai3 nur bestimmte, etwa durch Grofle, geometrische Gestalt und LAMMA-Spektren, von anderen eindeutig unterscheidbare Teilchen als Keimtrager in der Stalluft bevorzugt werden. Um derartige eventuell bestehende Unterschiede erkennbar zu machen, benotigt man wahrscheinlich wesentlich umfangreichere Datensatze. Selbst ein Zusammenhang zwischen der geometrischen Teilchengestalt (soweit sie im Lichtmikroskop bestimmbar ist) und entsprechenden ,,fingerprint" Massenspektren ist aus dem begrenzten Material nicht zu entnehmen.


Insgesamt verspricht die Moglichkeit einer Unterscheidung von Mikroorganismen und Tragerteilchen in Verbindung mit einem entsprechenden statistischen Instrumenta- rium interessante Anwendungsmoglichkeiten der Lasermikrosonden-Massenanalyse in dem behandelten Rahmen.

Zusammenfassung In einer Legehennen-Batteriehaltung wurde die Grogenverteilung luftgetragener

Teilchen im Groflenbereich zwischen etwa 0,007pm und etwa 1 pm gemessen. Die Meflwerte zeigen eine Abhangigkeit von der Aktivitat der Tiere. Selbst im GroBenbereich der ultrafeinen Aerosole werden im Stall Teilchen erzeugt.

Staubteilchen der Stalluft wurden mittels Aerosolzentrifuge und Kas kadenimpakto- ren gesammelt. Davon wurden etwa 2500 im Laser-Mikrosonden-Massenanalysator LAMMA 500 (Leybold-Heraeus) einzeln untersucht.

Die Massenspektren zeigen eine sehr komplexe Zusammensetzung der Staubteilchen. Einzelne Komponenten, z. B. Schwefelverbindungen, treten bevorzugt nur in kleinen Teilchen auf. Eine Zuordnung der erhaltenen Massenhien zu bestimmten chemischen Verbindungen ist derzeit nur mit Einschrankung moglich. Die Massenspektren konnen aber als eine Art ,,fingerprint“ des Teilchenmaterials betrachtet werden. Durch Anwen- dung spezieller statistischer Modelle im Rahmen einer multivariaten Analyse erscheint es moglich, luftgetragene Keime von ihren Tragerteilchen allein aufgrund der LAMMA- Spektren zu unterscheiden.

Damit erweist sich der LAMMA 500 als interessantes Hilfsmittel zur Aufklarung des Aerosol- und Keimhaushalts der Stalluft.

Danksagung Wir danken Herrn Dr. ROLAND WURSTER fur die Uberlassung von Bild- und

Megmaterial und wertvolle Diskussionsbeitrage. Frl. R. JACOBI danken wir fur die Erstel- lung der Zeichnungen.

Summary The use of laser-induced mass spectrometry

for characterization of dust particles in air of animal houses Size distribution of air-particulate matter in the size-range of about 0.007 pm to about

1 pm was measured. The results agree with the assumption of an animal-induced produc- tion and liberation process of very small particles.

Large and giant particles (diameter larger than 0.3 pm) were collected by the help of inertia particle sampling devices and analyzed using the Lasermicroprobe Massanalyser LAMMA 500 (Leybold-Heraeus). The chemical information obtained from the laser- induced mass spectra of many hundreds of single particles confirms the very complex of nature of the air particules. Besides some typical molecular ions such as sulphur compounds, many mass lines appear which cannot be attributed to certain inorganic as well as organic chemical compounds and can only be considered like a “finger-print’’ characteriz- ing the action of quite different particle sources. Air particulate matter often works as a vehicle of particle-attached airborne microbes. In such an airborne dust particle-microbe- system the microbes can be distinguished as different from the dust particules by means of statistical techniques of numerical taxonomy applied to the LAMMA-spectra obtained.

Risumi Utilisation d’une spectrophotomitrie de masse induite au laser

pour la caractirisation des particules de poussikres de l’air dans I’itable La taille des particules airiennes d’une grosseur situie environ entre 0,007 pm et 1 pm

a eti mesurie ont dipendu de I’activitk des animaux. Des particules dans I’ordre de


grandeur d’airosols ultra-fins sont induites dans I’itable. Les particules de poussikres de Pair de I’itable ont i t6 collecties au moyen d’une centrifugeuse d’atrosol ou d’impacts en cascades. Environ 2500 particules ont i t i examinies individuellement dans un appareil d’analyse de masse par microsonde au laser LAMMA 500 (Leybold-Heraeus).

Les spectres de masse ont montri une composition trks complexe des particules de poussikres. Chaque composant, par exemple des liaisons de soufre, n’apparaissent avant tout qu’en trks petites particules. Une classification des lignes de masse obtenues en liaisons chimiques diterminies n’est que partiellement possible pour le moment. Les spectres de masse peuvent &tre considiris comme une sorte de aFingerprint* du mattriel des particules. I1 semble possible de diffirencier les germes airiens de leurs particules porteuses sur la base des spectres LAMMA en utilisant un modkle statistique special dans le cadre d’une analyse multivariable. L’appareil LAMMA 500 s’est rivilC itre un auxiliaire intiressant pour expliquer la composition de I’airosol dans I’air d’une itable.

Resumen La ap l icac ih de la espectrometria de masas inducida por laser

para la caracter izacih de particulas de polvo del aire e n 10s gallineros En un rigimen de vida de gallinas ponedoras en baterias, se midi6 la distribucion de

tamaiios de las particulas aeroportadas en el dmbito de tamaiios de unas 0,007 pm y 1 pm aprox. Los valores de medici6n muestran una dependencia de la actividad de 10s animales. Incluso en el imbito de 10s tamaiios de 10s aerosoles ultrasutiles se producen particulas en el gallinero.

Las particulas de polvo del aire de gallinero fueron recolectadas mediante centrifuga de aerosoles e impactores de cascadas. Unas 2500 muestras de las mismas se analizaron por separado en el analizador de masas-laser-microsonda LAMMA 500 (Leybold-Heraeus).

Los espectros de masas muestran una composici6n muy compleja de las particulas de polvo. Algunos componentes, por ej, combinaciones de azufre suelen aparecer solo en particulas pequeiias. La adjunci6n de las lineas de masa obtenidas a determinadas combinaciones quimicas solo es posible en la actualidad con reservas. Pero 10s espectros de masas se pueden considerar como una especie de uimpresiones digitalesn del material de particulas. Empleando modelos estadisticos especiales en el marco de un andlisis multivariado, resulta posible distinguir 10s girmenes aeroportados de sus particulas portadoras solo en virtud de 10s espectros LAMMA.

Con ello se revela el LAMMA 500 como medio auxiliar interesante para el esclareci- miento del gobierno de aerosoles y girmenes aireos estabulares.

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Die Anwendung der laserinduzierten Massenspektrometrie zur Charakterisierung von Staubteilchen der Stalluft