1965 4. Analyse yon biologischem Material 69

4. A n a l y s e y o n b i o l o g i s c h e m M a t e r i a l

Die Messung yon Tri t ium and Kohlenstof[- l~ in t ierisehen Geweben dutch Fliissigseintillationsz~ihlung ist der Gegenstand einer Arbeit yon g. DvLc~No, g . Bosco, W. G. VE~Lr and J . R . iVI_~sr~L Hauptgegenstand der Untersuehung war die Wahl eines geeigneten LSsungsmittels, einer geeigneten Scintillations- flfissigkeit und die Frage, ob die Art der verwendeten ticrischen Gewebeteile einen Einflug auf dss Ergebnis hat. Ferner kam es darauf an, ein Verfahren zu finden, bei dem es mSglich ist, den zeitraubenden Umweg fiber die Verbrennung im Saucr- stoffstrom zu vermeiden tmd eine ScintiIlationslSsung zu bestimmen, in tier die digerierte Probe dirckt and klar 16slich ist. Die Verff. empfehlen folgende Arbeits- weise: 3,5 g frisches Organgewebe yon Miiusen werden mit 15 ml 1 m methanolischer HyaminhydroxidlSsung 12 Std bei 65~ im Dunkeln in einem gut verschlossenen Gef/iB digeriert (Endvolumen 16 ml). 5 ml dieser digerierten Probe werden mit Dioxan auf 100 ml verdiinnt; zu 5 ml dieser LSsung (55 mg fi'ischem Organgewebe entsprechend) werden 10 ml Seintfllationsflfissigkeit and i ml Toluol (bzw. 1 ml dcr 1~C- and aH-Standard15sung in Tohol) gegeben. Die ScintiIlationsflfissigkeit enth~lt 10 g 2,5-Dil~henyloxazol, 250 mg 1,4-Bis-2(5-1ohenyl-oxazolyl)-benzol und 100 g Naphthsl in auf 1 1, wobei als LSsungsmittel entweder Dioxan, Toluol odor eine Mischung beider (1 : 1, v/v) verwendet werden kTrmen. Die Standards werden hergestellt mit 3H-Naphthylacetamid oder x4C-Naphthalin in Toluol. 1 ml davon hat eine Zerfallsrate yon 41700/rain fiir aH and 23000 fiir 1~C. Gemessen wird mit einem Packard ,,Tri-Carb-Automatic"-Spektrophotemeter. StSrungen durch Chemi- luminescenz sind bei 14C vernschlgssigbar, zum exskten Z//hlen des aH-Betrags ist eine Wsrtezeit yon 48 Std nogwendig. Der Einflul3 tier Auswahl bestimmter Gewebe- arten zeigt sich darin, dsl~ gegenfiber einer Blindwertzghlrate yon 50~ fiir 1~C und 17,5~ fiir 3I-I mit 100 mg Gewebe yon Magen, Innereicn, Gehirn and Muskeln Betriige yon 40 bzw. 5% gefunden werden, wghrcnd sich arts 100 mg Leber-, Lungen- und Herzgewebe nur die It/ilfte dieser Betri~ge ergibt.

1 Clin. claim. Acts (Amsterdam) 8, 58--65 (1963). Dept. Rsdiobiol., Study Center Nucl. Energy, Mol (Belgien). W. Czysz

Die Bes t immung yon ionisiertem Calcium in Serum mit ~urexid gelingt nach F. I-IA~zgAC~ und T. B. COOLIDGE 1 bei Verwendung yon besonders gereinigten Farbstoffproben such ohne Ultrafiltration, welm man beriicksichtigt, dal~ ungef~hr 5~ des Farbstoffes einen Proteinkomplex bilden, dessert Absorptionsspektrum mit dem des Caleiumkomplexes nahezu idcntisch ist, der abet im Gegensstz zu diesem such in Anwesenheit yon 2 , 5 . 1 0 - ~ m ~ D T A erhslten bleibt. -- Reinigung yon Murexid. 1 g des rohen Produktes wird in 900 ml dest. und deionisiertem Wasser bei 30~ gelSst, mit 60 g Ammoniumehlorid susgesalzen, zentrifugiert, der Reihe nseh durch Zentrifugieren mit 5 ml Wasser, 100 ml 600/0 Methanol und 100 ml abs. Methanol gewasehen, bei 110~ getrocknet und in einem bl'aunen Gef~l~ im Exsicca- for aufbewahrt. Die Extinktionen tier LOsungenverschiedener Chargen des so gereinig- ten Farbstoffes st immten innerhalb yon 0,6o/o tiberein and gehorchten dem Beer- schen Gesetz. -- Bestimmung der Extinktionen E w und Em sowie yon K. Eine 4 �9 10 -2 m CalciumlSsung wird mit einer frisch bereiteten LTsung yon Murexid in 0,03 m Tris-Puffer (pH 7,40) auf ei~e Fsrbstoffkonzentrstion yon 4,22 �9 10 -5 m, mit Natronlauge auf pI-I 7,40 and mi~ NstrlumcMorid auf eine Ionenstgrke yon 0,15 gebrscht. Sodann wird die Extinktion dieser LSsung bei 490, 510, 530, 550 und 570nm bestimmt (Ec~). Ansloge Mcssungcn werden such mit einer 4 �9 10 - a m Calcium- (E~) und mit einer 1 �9 10 - a m XDTA-LOsung (E~) ausgcffihrt. Aus diescn Wcrten wird flit she angegebenen Wellenli~ngen der BruehteiI ~r des im CalciumkompIex gebundenen

70 Bericht : Spezielle analytische Methoden Bd. 208

E x - - Em ~urex ids nach ~ - E c ~ - - E , , (1) und weiter mi t der bekann ten Calcium-

_ K _ ~ _ _ ~ konzent ra t ion [Ca 2+] = 4 . 1 0 -3 fiber [Ca 2+] -- 1 - - a (2) die scheinbare Stabili-

t i~tskonstante K des Calcium-Murexid-Komplexes unter den gewiihlten Bedingungen errechnet. JBestimmung der Extinlctionen A, B und C. Die Ext ink t ion A wird in Abwesenheit yon Calcium unter sonst gleichen Bedingungen wie Ec~ best immt, die Ex t ink t ion B an Serum, welches mi t 6~ Kohlendioxid in Sauerstoff au f p H 7,40 und mi t der zur Messung yon A verwendeten MurexidlSsung auf eine l~arbstoff- konzent ra t ion yon 4,22 �9 10 -5 m gebraeht wurde, und endlich die Ext ink t ion C an Serum, welches dari iber hinaus auch noch 2,5 �9 10 -2 m an _~DTA gemacht wurde. Als Leerwert ffir B a n d C client Serum und Serum mi t 2,5 �9 10 -2 m ADTA. Die Ex- t ink t ionen beim isosbestischen P u n k t 510 n m mfissen innerhalb der Fehlergrenzen identisch sein und die Ext ink t ionen A aueh bei den vier anderen Wellenlgngen mi t denen einer frisch berei te ten LSsung yon reinem 1Viurexid i ibereinstimmen. -- Berechnung der Calciumlconzentration. Die Berechnung der Calciumkonzentrat ion erfo]gt nach (2) mi t dem ffir die gewah]ten Bedingungen ermit te l ten Wef t yon K. Zur Bes t immung yon ~ diirfen in (1) jedoch n icht die gemessenen Ext inkt ionswerte eingesetzt werden, sondern die f'tir die Ex t ink t ion x des Protein-Farbstoff-Kom- plexes unter der Annahme einer mi t dem Calcium-Farbstoff-Komplex identischen

Absorpt ionskurve korrigierten E~ = B- -x , m ~ ~ - - x unct ~c~ = Em ~ - , wobei

x = ( A - - C ) / ( - ~ -- l ). Die Standardabweichung der aus den Extinkt ionen bei den

drei grSBeren Wellenl~ngen berechneten Calciumkonzentrat ionen gegen den ~ i t t e l - wert betrug bei einigen hunde r t im Laufe eines Jahres ausgefiihrten Analysen un- gef~hr 2o/0 . Un te r Einschlul~ der aus den Ext inkt ionen bei 490 n m berechneten Werte wird sic etwas grSl]er, weft die Serumproben einen Stoff enthal ten, dessen Absorpt ion bei Wellenl~ngen unter 500 nm du tch die Anwesenheit yon ADTA veri indert wird.

1 Analyt . Biochemistry 6, 477--485 (1963). Dept. Biochem. and Zoller Denta l Clinic, Univ. Chicago, Chicago, Illinois (USA). A. KOS~_K

Die Trennung und Bestimmung yon Calcium und Strontium in Urin ist nach H. H. T).vssK:~ 1 quant i ta t iv , wenn 100--500/~g Calcium neben 1000 bis 2000 #g S t ron t ium vorliegen. Bei kleineren Mengen St ront ium wird durch Zugabe einer bekann ten Menge Sr dieser I (onzentrat ionsbereieh eingestellt. Aus der Diffe- renz der manganometr ischen Ti t ra t ion der Summe yon Calcium- und Stront ium- oxalat und der des Calciumoxalats nach Abt rennung des St ront iums als Sulfat - - aus schwach saurer LSsung bei 90--100~ -- wird die anwesende Menge S t ron t ium und Calcium best immt. Die in Ur in anwesenden n ich t ngher bes t immten s t6renden Verbindungen werden durch eine vorangehende Ex t rak t ion mi t Chloroform abge- t rennt . - - Arbeitsweise. Eine 24 S td alte Urinprobe wird auf je 100 ml Ur in mi t 1,5 ml eines Gemisches aus 250 ml konz. Salzs~ure und 100 ml Eisessig versetzt. 30 ml dieser UrinlSsung werden in einem verschliefibaren 60 ml-Zentrifugenglas mi t 10 ml Chloroform 1 rain lang geschfittelt, dann 8 rain bei 1500 U/rain zentrifugiert. - - Ca ~- Sr. 20 ml des ext rahier ten Urins werden in ein 40 ml-Zentrifugenglas p ipet t ier t und mi t 3 Tr. Bromkresolgrfin-Indicatorl6sung (siehe unten) und ansch]ieBend mi t 4 ml 4~ Ammoniumoxalat lSsung versetzt , l~ach Umschi i t te ln wird mi t verd. Ammoniak (1:2) p H 5,5 eingestellt (erstes Auft re ten einer Grfinfiirbung). Naeh zweistfindigem Stehen bei Raumtempera tu r wird 6 rain bei 1500 U/rain zentrifu- giert, dann die fiberstehende L6sung abdekant ie r t und das umgedrehte Zentrifugen- glas au f einem Fil terpapier getrocknet. Der Gef~Binhalt wird zweimal mi t je 2 rn]