(Aus dem Marine Biological Laboratory, Woods Hole, Mass. U.S.A.)

D I E B I P O L A R E D I F F E R E N Z I E R U N G

DES CEPITALOPODEN- U N D DES P R O S O B R A N C H I E R E I E S .

(VITALFJI_RBUNGSVERSUCHE MIT INDIKATOREN AN DEN EIERN VON LOLIGO VULGARIS U1VD COLUMBELLA AVARA.)

Von

JOS~F SP~K, Heidelberg.

1VIit Tafel I.

(Einyegangen am 21. Februar 1934.)

Die Frage, wie die morphologische Polaritat der tierisehen Keime und im besonderen, wie die Polaritat der Organanlagen zustande kommt, war fiir die Ent- wieklungsmechanik yon jeher ein Grundproblem. Bei der Entwicklung vieler Ei- zellen gehen der morphologisehen Differenzierung stoffliehe oder strukturelle D~ffe- renzierungen des Eik6rpers oder der einzelnen Blastomeren voraus. Die deskriptive Entwieklungsgeschichte hat ires in vielen F/~llen eine genaue Beschreibmlg aller mikroskopiseher Details dieser struk~urellen Differenzierungen gegeben. Aber diese minutiSsen Analysen des mikroskopisehen Brides haben uns kaum jemals einen Einblick in das Wesen oder das Prinzip der neuau~tretenden stoffliehen Diffe- renzierungen erSffnet, und die kausalanalytisehen Versuehe der Entwicklungs- mechaniker haben vielfaeh die Zahl der ungelSsten Probleme zunachst nur noch vergrSBert, indem sie z. B. zeigten, dab eine scharfausgepragte Verschiedenwertigkeit yon Eiabschnitten oder yon verschiedenen Blastomeren schon vorhanden sein kann, we es mit keinem der his dahin angewandten 1Vii%el gelungen war, irgendwelehe Protoplasmaunterschiede bei denselben nachzuweisen, oder dai3 andererseits auf- fallige mi~roskopische Strukturen, wie Pigmentringe und andere Granulationen, trotzdem sie in sehr gesetzma~iger raumlicher Beziehung zu den spateren Keim- bezirken stehen, fiir die Determination der Polaritat ganz belanglos sind. Ja die Erkenntnis, dal3 auch in isolierten Einzelblastomeren die bipolare Differenzienmg zur Ausbfldung kommen kann, die sich sonst fiber den ganzen Keim erstreekt, hat ja eine Zeitlang sogar prinzipielle Zweifel aufkommen lassen, ob man diese Lei- stungen der Organismen physikaliseh noch erklaren kann. Mit einem Mal hat sich dann aber ein neuer Einblick in die Frage, wie morphologisehe Polaritat mit physi- kalischer Polaritat zusammenhangen diirfte, ergeben. In IYntersuchungen der letzten Jahre (J. SPF_~ 1930, 1933 und 1934a und b) lied sich namlich zunachst zeigen, dab die Entstehung der Protoplasmadi//erenzen zwischen der animalen und der vegetativen Hgl/te der Eizellen yon Vertretern der versehiedensten Klassen des Tierrelches yon der gleichen lahysikalisch-chemischen GesetzmaBigkeit beherrseht ist., Sie besteht darin, daft nach der RiehtungskSrperbildung saute Substanzen nach dem vegetativen, und alkalische navh dem animaleu Pole wandern. An der Wanderung nehmen mikroskopisch-sichtbare Teilehen (Lipoid- und Eiwefl3tropfen, Granulen usw.) and Teilchen kolloidaler GrSBenordnung teft. Die Wanderung ist jedenfalls ein elektrisches Phanomen. Die yon dem 1Veutralpunk~ oft ganz erheblieh abweichende Eigenreaktion der Teflchen (die Werte ffir die Reaktion der sauren Teflehen bewegten sieh zwisehen pit =5,0--5,6, die der alkalisehen zwisohen PH = 7,6 und 7,8) boslbimm~ jedenf~lls auch ihre Ladung. Besitzt nan auoh die Zellmembran eine geniigend starke Ladung, so wandern, wenn diese Membranladung tiberall gleieh ist, z. ]3. alle alkalischen Teilehen zur Membran

Die bipolare Differenzierung des Cephalopoden- und des Prosobranehiereies. 868

bin und sammein sioh unter ihr an, die sauren riicken dagegen yon ihr immer mehr ab. Ist die Membranladung regional versehieden, dann wandern die alkalisehen Teilchen nach dem einen ,,Pol", die sauren nach dem gegeniiber- liegenden Ende der Zelle. Bei den Eizellen yon Anneliden und Teleosteern, bei denen diese Gesetzmi~igkeit zum ersten Male erkannt wurde, wird nach der Reifung die Gegend um den Riehtungsk6rperpol zu der Stelle, nach der die alka- lischen Stoffe hinwandern, wihrend es zu einer Anreicherung der sauren am vegetativen Pol kommt. Bei vielen Epithelzellen sind dis beiden Enden die ,,Pole". Die lebende Zelle scheint uns bei diesen Substanzwanderungen den sch6nsten Kataphoreseversueh vorzufiihren, den man sieh denken kann.

Von diesen Dingen kann man - - an geeigneten Objekten oft spielend leicht die Reaktion der Substanzen und ihre Yersehiebung durch Vitalf~rbung mit Indi- katoren oder dutch Mikroinjektion yon Indikatoren naehweisen. Die Deutung der Phinomene als Kataphorese ist vorliufig noeh hypothetisch, doeh stehen ihr keiner- lei prinzipielle Schwierigkeiten im Wege, da ja Membranpotentiale sehon oft fest- gestellt ~vurden.

Die Potentialdifferenzen an der Oberfliehe w~hrend und naeh der Riehtungs- kSrperbildung kommen irgendwie (lurch lokales oder lokal stirkeres Eindringen von Kaliumehlorid (und eventuell aueh anderen Elektrolyten) zustande. (Vgl. die Aus- 15sung der normalen bipolaren Differenzierung beim l~ereis-Ei dureh KCI und die AuslSsung bipolarer Stoffwanderungen~ im Asterias-Ei dutch KC1. SP~,K 1930 und 1934e).

Beziiglich der Reaktion des Protvplasmas mul~ noch Iolgendes klargelegt werden. Man hat sieh yon dem PH in der lebenden Zelle vielfach ein viel zu einfaehes Bfld gemacht. NIan glaubte, da~ die einzelne Zelle jeweils nut ein einziges, vSllig aus- geglichenes pl~ besitze. Davon kann gar keine Rede sein. Wir miissen scharf unter- scheiden zwisehen der Reaktion der dispersen Phasen der Plasmakolloide und der Reaktion des wisserigen Dispersionsmittels. Die Reaktion der Kolloidteilehen ist yon der des umgebenden Mediums in sehr weiten Grenzen unabhingig i. Die kolloid- dispersen Teilchen der verschiedenen Plasmasubstanzen aber kSnnen wiederum, ihrer sehr verschiedenen chemischen l~atur entsprechend, eine sehr versehiedene Reaktion haben. Wodurch die Teilchen versehiedener Reaktion darer gesehfitzt sind, dal~ sie sieh gegenseitig neutralisieren und ausf~llen, ist noch nieht geklirt. Es k6nnte vielleicht eine r~umliche Sonderung durch ein Schutzkolloidsystem vorhanden sein. Da~ TrSpfchen yon Eiweil3kSrpern und Lipoiden bei vitaler Firbung der Zelle mit Indikatoren oft einen anderen Farbton zeigen als das umgebende Plasma, also auch eine andere Reaktion haben diirften, ist sehon seit langem bekannt. Auch wenn sich die versehiedenen Plasmasubstanzen irgendwie r~umlieh sondern, ist es oft sehr leicht zu zeigen, dab sie in allen Indikatoren einen sehr verschiedenen Farbton annehmen k6nnen mud dann dauernd und in allen geeigneten Indikatoren die entsprechenden Farbuntersehiede zeigen, trotzdem sie in stindigem Kontakt miteinander stehen (vgl. die Farbunterschiede yon Rinden- und Dotterplasma der mit Indikatoren vitalgef~rbten Ctenophoren-Eier, SP~K 1926). Sehr viel sehwerer ist der Naehweis, da~ aueh in einem mikroskopiseh homogenen Plasma, in dem die verschiedenen Substanzen in feinster Vermengung aussehliel~lieh in kolloid-disperser Form verteilt sind, Teilehen verschiedener Reaktion nebeneinander existieren. Dieser I~aehweis ist an den Teleosteer-Eiern gelungen (SP~K 1933), bei denen sieh die Substanzen versehiedener Reaktion wegen ihrer sehr verschiedenen physi- kalisehen Eigensehaften leieht trennen lassen.

Bringt man in ein solches Gemisch yon versehiedenen Zellkolloiden einen Farbstoff hinein, so f irbt er meist nur eine Substanz an, selbst wenn an sieh alle

i Vgl. hierzu besonders J. Si'~K: Protoplasma 18, 497.

864 Josef Spek:

Substanzen den Farbs~off adsorbieren oder 16sen. Trennen sieh die Substanzen bei irgendeinem DifferenziertmgsprozeB, so erfolgt nach der Sonderung vielfaeh sofortige Anfarbung beider Phasen. Man kann das Phgnomen in einem lehrreichen Versueh an mikroskopisch-dispersen Tropfen yon Forelleneiern - - den Lipoid- tropfen dieser Eizellen - - demonstrieren. Auch bei intensivster Vitalf~irbung der Eier mit Brfllantkresylviolett gehr gar niehts yon dem Farbstoff in die Tropfen hinein, trotzdem sie ringsum yon gefgrbtem Plasma umgeben shad. Isoliert man die Tropfen aber und legt sie in eine wgsserige L6sung des Farbstoffes, so f~rben sie sich alsbald tier kirsehrot. - - Von den yon mir verwandten vitalf~rbenden Farb- stoffen zeiehnet sieh Kresyleehtviolett dadureh aus, dab es in vielen Objekten mehrere Subs~anzen des Protoplasmas zugleieh anfgrbt. Ich bin dadurch darau:[ auz[merksam geworden, dab Kresylechtviolett das gleiehe Objekt (die ~r yon 2Vereis limbata) in einem alkaliseheren l%rb$on anf~rbte als alle fibrigen Indikatoren. Ich erkl~rte mir das so, da~ dieser Farbstoff auBer dem in groBer Menge vorhandenen sauren Kolloid, welches aueh in allen anderen Farbstoffen gefgrbt war, Spuren einer diffus verteilten alkalisehen Substanz mitfgrbt. Und in der Tat sonderte sich in spgteren Stadien diese Substanz yon der anderen, so da/3 nun an ihrer Existenz nieht mehr gezweifelt werden konnte.

Was sieh bei der Vital/grbung mit Indikatoren fgrbt, sind die dispersen Phasen der Plasmakolloide. Ihre Reak~ion wird also durch den l%rbton des Indikators an- gezeigt. Wird der Farbstoff nieh~ yon irgendeiner kolloiden Substanz adsorbiert und dadureh gespeichert, ist yon ihm bei den angewandten sehr verdiinnten L6sungen im Mikroskop in der Zelle gar niehts zu sehen. Ausgefiihr~ wird der Vitalfgrbungs- versuch am besten so, dab zu 25 ecru Seewasser mit den Objekten ein Tropfen einer 1/2%igen Farb16sung zugesetzt wird. Je nach der Alkalinit~t des Seewassers k6nnen dabei manehe l~arbstoffe, wie Niiblausulfat B oder Kresyleehtviolett zum Teil ausgefall~ werden. Dies kann dadureh vermieden werden, dab man die Stamm- 16sung starker verdiinnt und dann dementsprechend mehr Tropfen allm~hlich dem Seewasser zuse~zt. - - In alien ~11en daft das Seewasser mit dem Farbzusatz nur eine ga~z blasse, eben erkennbare Farbe haben. V erwendet wurden die In- dikatoren: ]~eutralrot, Brillantvltalrot, ~ilblau~ul/at B, BriUantkresylviolett, Kresyl- eohtviolett und Methylrot. Die beiden ersten, roten Farbstoffe schlagen yon der saueren nach der alkalisehen SeRe yon Rosa fiber Seharlaehrot in Rostgelb, die drei blauen Farbstoffe yon Blau fiber Violett in Rosa urn. (~ber ihre sonstigen Eigen- sehaften vgl. J. SPEK ~). l~Iethylrot muB in isotoniseher NaC1-L6snng verwandt werden, da es aus Seewasser in die Zellen nieht eindringt.

Meine Unte r suchungen fiber die bipolare Differenzierung der Eier zahlreicher Knochen/ische haben gezeigt, dab Eier mi t diskoidalem Fur- ehungs typ ein besonders geeignetes Material zum Stud ium der bipolaren Subs tanzsonderung sind. Dies veranla~te reich, die gleiehe Unter - suchung aueh an Cephalopocleneiern vorzunehmen, u n d zw~r fiel meine Wahl auf die Eier yon Zoligo v~algaris L~-w., die aueh durch ihre GrS~e u n d Durehsichtigkeit manehe Vorzfige zu bieten sehienen. Bei dieser Un te r suehung u n d der an Prosobranchiereiern ka m es mir im fibrigen zungchst e inmal daratff an, zu ermit teln, ob die bis dah in ffir die bipolare Differenzierung der Eier yon Anneliden und Teleosteern festgestellten GesetzmgBigkeiten auch ffir die Differenzierungsprozesse der Eier anderer Tiere gelten. I)ieses war das I-I~up~ziel der Untersuchung.

1 J. Sp~,K. Protoplasma (Berl.) 28, 501L (1933).

Die bipolare Differenzierung des Cephalopoden- und des Prosobranchiereies. 365

Der Laich yon Loligo vulgaris besteht aus B/ischeln dicker, fingerfSrmiger Gallertschl~uche, in denen jeweils einige Dutzend Eier liegen, l~ach Entfernung der derbcn ~uf~eren G~llertschichten kann man die Eier leicht aus der weichen inneren Gallertmasse herausholen. Junge Entwicklungsstadien erh~lt man aus frisch abgelegtem Laieh oder dureh kiinstliche Befruehtung yon reifen, dem KSrper weiblieher Tiere entnommenen Eiern. Setzt man diesen zerzupfte Spermaf~phoren zu, so f~ngt ein - - me[st nieht allzuhoher - - Prozentsatz derselben sich an zu ent- wickeln. L~flt man reife unbefruchte~e Eier in Seewasser stehen, so setzt stets bei einer Anzahl derselben spontane Entwicklung ohne Befruchtung ein.

Loligo-Eier sind fiir Vitalf/~rbungsversuche ein ausgezeichnetes Material. Mit all den oben angefiihrten Farbstoffen kann man ohne Schwierigkeit eine intensive F~rbung des ganzen ZellkSrpers erreichen. Durch die Gallerte und das Chorion dringen die Farbstoffe hindureh, ohne sie anzuf~rben. Die gef/~rbten Eier entwickeln sich ohne Schaden welter. Nach der Aussonderung des Keimpl~smas f/s sich auch dieses in allen Farbstoffen an. So konnte denn auch der Hauptversueh auf den ersten Ansatz durehgefiihrt werden.

Bei den Teleosteer-Eiem kommt die Kappe yon Keimplasma am animalen Pol dadurch zustande, dab die Plasmateflchen, welehe die hSchste alkalisehe Reaktion haben, aus dem ganzen ZellkSrper nach dem Richtungs- kSrperpol wandern und sich dort anh~ufen. Die sauren Dottersubstanzen rficken yon diesem Pol immer mehr ab. Ganz ebenso ist es beim Loligo:Ei. Vor der bipolaren Differenzierung sind beim Loligo-Ei die Komponenten des Eiplasmas ganz gleiehm/~13ig verteilt; weder ist irgendwo eine struk- turelle Sonderung derselben zu sehen, noch t r i t t bei Vitalf/~rbungen Jrgendeine Differenzierung hervor. In allen Indikatoren f/~rbt sieh der EikSrper gleiehm/~13ig im gleiehen Farbton an, der weiter unten erSrtert wird. Zonen versehiedener Farbe treten im Eik5rper erst nach der RiehtungskSrperbildung bei den Vorg/~ngen auf, welche zur Absonderung der Keimplasmakappe fiihren. (Bei den Eiern mit diskoidaler ~urchung ist ja die Sonderung des Keimplasmas vom Dotterplasma der wesentliehe Teil der bipolaren Differenzierung.) In diesem Stadium ergeben die Vitalf/~rbungen mit den Indikatoren, dab sich die Plasmasubstanzen, welche sich nach der RichtungskSrperbildung am animalen Pol an: h~ufen und sieh schlieBlieh durch eine Phasengrenze vom Dotterplasma abgrenzen, in allen Indikatoren im alkalischen Farbton anfiirben, w/~hrend die grebe Masse der Dottersubstanzen sauren Farbton zeigt. Abb. 2 (Tafel I), welehe ein mit Briilantkresylviolett gef/~rbtes Ei nach eben vollzogener Keimplasmabildung darstellt, zeigt, wie man sieh diese Ver- h/r'ltnisse vorzustellen hat. In den meisten Indikatoren stellen die im Keimplasma und Dotterplasma beobaehteten Farben die beiden extremen FarbtSne der sauren und der aikalisehen Seite dar. Die erhaltenen F/~rbungsbefunde sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Die Farbdifferenzen, welche man in Methylrot erh/~lt, zeigt Abb. 3 (Tafel I). Da sie jedoch ein /~lteres Entwicklungsstadium darstellt, sell sie erst sparer erSrtert werden.

866 Josef Spek:

I n d i k a t o r

Farbe des Keim-

Farbe des Dotter- plasmas

B r i l l a n t v i t a l r o t

blaB-r6tlieh-gelb (Es scheiden sich

scharlaehrote Granulen aus)

r o s a

Tabe lle 1.

N e u t r a l - r o t

r6tlich- gelb

(Rote Granulen)

B r i ~ a n t - Kre sy l - k r e s y l - ech t - v io l e t t v io l e t t

I

tiefrosa [ grau rosa

Ni lb lau - su] fa t B

blab violett

M e t h y l r o t

zitronen- gelb

ziegelrot

Aus dem tiefrosa l~arbton des Keimplasmas in Brillantkresylviolett geht hervor, dab dieses Substanzen enthalten muB, die ein p~ yon etwa 7,8 haben. Die ziegelrote Methylrotf~rbung des Dotterplasmas dagegen zeigt, dab dieses eine Aeidit~t yon p~ 5,0 besitzt!

Das alkalisehe Keimplasma muB vor der Absonderung der animalen Plasmakappe im Eik6rper verteilt gewesen sein, f~rbt sich aber offenbar, solange seine Teflchen noeh zwischen denen des sauren Dotterplasmas liegen, in Brfllantvitalrot, Neutralrot, Brillantkresylviolett, Nilblausulfat und Methylrot nicht an. Werm z. B. an dem in Abb. 2 (Tafel I) abgebil- deten Ei das Keimplasma vorher im Eik6rper verteflt und dort ebenso tier- rosa gef~rbt w~e , kSnnte das Ei nicht rein blau sein. Dies ist aber vor der Differenzierung der FaN, und ebenso zeigen die Eier in den anderen oben erw~hnten l%rben vor der Differenzierung nur den fiir das saure Dotterplasma eharakteristischen Farbton. Einzig und allein in Kresyl- echtviolett zeigen die Eier vor der Differenzierung einen tiefblauen Farbton mit einem blassen Stich ins Rote, und diese r6tliche F~rbung wandert bei der Keimplasmabildung naeh dem Richtungsk6rperpol ab und ver- st~rkt sich dabei an diesem Ende der Eizelle immer mehr. Offenbar ist also in diesem Indikator die alkalische Plasmasubstanz auch sehon w~hrend ihrer Wanderung zum animalen Pol gef~rbt. Die Kresyleehtviolett- f~rbungen dieser Stadien zeigen ein naeh dem Riehtungsk6rperpol zu- nehmendes und nach der Zellmitte abklingendes Konzentrationsgef~lle der alkalischen Substanz [s. Abb. 1 (Tafel I)]. Da in diesem Stadium ohne Zweifel aueh eine Zunahme der Intensit~t der blauen F~rbung der sauren Substanzen nach dem vegetativen Pol zu erkennen ist, ist das Gesamt- bild so sch6n, wie ich es wghrend der Entstehung der bipolaren Di//eren- zierung yon Eizellen bei anderen Tieren kaum jemals gesehen habe. Die erste Andeutung der Versehiedenfarbigkeit der Pole ist nngef~hr eine Stunde nach der Riehtungsk6rperbildung zu erkennen. Naeh einer weiteren Stunde erreicht die bipolare Differenzierung ungef~hr die In- tensit~t wie in dem in Abb. 1 (Tafel I) abgebildeten Ei. Da] die alka- lisehen Teilchen tats~ehlich nach dem animalen Pole wandern, geht daraus hervor, dab die Sehichtdieke ihrer starksten Anh~ufung, die sich schlieglich als Keimplasma dureh eine Phasengrenze yore iibrigen

Die bipolare Differenzierung des Cephalopoden- und des Prosobranchiereies. 867

EikSrper abgrenzt, immer grSBer wird, und dab sie schlieBlieh aus dem iibrigen EikSrper - - soweit Sie mit dieser F~rbung nachweisbar sind fast vSllig versehwinden. Bei der ersten Furchungsteflung finder man im Dotterplasma auch bei Kresylechtfgrbung ghnlieh wie bei der in Abb. 2 (Tafel I) dargestellten Brillantkresylviolettfgrbung nut noeh einige violette KSrnchen vor.

Dreht man die mit Kresylechtviolett gefgrbten Eier im Stadium der Abb. 1 (Tafel I), so karm man bei vielen festst~llen, dab die Zuwanderung der alkalisehen Stoffe zum animalen Pole auf einer Seite etwas starker ist als auf der gegeniiberliegenden. Ob dies etwas mit der Ungleichheit der Keimscheibe am sp~teren Vorder- und Hinterende zu tun hat, ist noch nicht ermittelt worden.

Die alkalisehen Kolloide, die sieh nach der RichtungskSrperbildung im Keimplasma konzentrieren, stammen wahrseheinlieh noch yore alkalisehen Plasma der Oogonien her. Es ist immer leiehter, die kompli- zierte physikalisch-ehemische Konstellation im ZellkSrper des fertigen Eies riehtig zu verstehen, wenn man zuerst ihre allmghliehe Entstehung w~hrend der Ovogenese verfolgt. Mit Indikatorfgrbungen zu verfolgen, wie die verschiedenen Phasen des Eiplasmas, die sich dutch sehr versehie- dene Reaktion auszeichnen, bei der Ovogenese naeheinander entstehen und nebeneinander bestehen bleiben, ist auBerdem aueh fiir die Methodik der pH-Bestimmungen in lebenden Zellen sehr lehrreich. Vitalfgrbungen mit Indikatoren an Floeken kleiner, unreifer Ovarien yon Loligo haben ergeben, dab die Zellen des Keimepithels durehwegs alkalisches Proto~ plasma haben. Der ganze ZellkSrper fgrbt sieh z. B. in Kresylechtviole~t und Brfllantkresylviolett diffus violett. Wghrend des Waehstums- stadiums der Ooeyten treten dann die groBen Massen saurer Dotter- substanzen auf, die sieh im ganzen ZellkSrper verteflen und bewirken, daB seine Farbe in den beiden Indikatoren in ein tiefes Blau umschl~gt. Um den Kern herum bleibt oft noeh eine Wolke different (violett) ge- f~rbter alkaliseher Substanzen erhalten, und in Kresylechtviolett behglt das Blau besonders bei stiirkerer Anfgrbung auch einen diffusen Stich ins Rote. Jedenfalls bleibt die alkalische Grundmasse des Protoplasmas zwischen dem sauren Dotterplasma erhalten. Es sei aber anch erwghnt, daB die Follikelzellen, die bei Loligo die grSBeren Ovarialeier fest urn. sehlieBen, aueh alkalisehes Protoplasma haben. In Kresylechtviolett fgrbt sieh das Follikelepithel sowie das Keimepithel violett. MSglieher- weise kommen also auch die Follikelzellen als Lieferanten alkalischer Substanzen in Frage.

So wie bei meinen diesbeziiglichen Versuchen an Fiseheiern (vgl. J. SPEx 1933, S. 532f.) habe ieh auch beim Loligo.Ei versueht, das Gemiseh der beiden Phasen wieder zu trennen, um so zu zeigen, dab sie wirklieh noeh beide da sind. An den Fiseheiern gelang das an expipet- tierten Plasmatropfen z. B, d~dureh, dab die sauren Dottersubstanzen

368 Josef Spek:

in destilliertem Wasser schneidbar lest werden (gerinnen), w~hrend die alkalischen Substanzen in Wasser 15slich sind und aus der festen Masse herausdiffundieren. Am Plasma der Loligo-Eier ist mir dieser wichtige Versueh leider nieht gelungen. Auch hier gerinnen zwar die sauren Substanzen unter der Einwirkung yon destilliertem Wasser zu einer schmierigen, halbfesten Masse, aber wie man am abgesonderten Keim- plasma feststellen kann, entsteht in den alkalischen Kolloiden--wenigstens in denen des Keimplasmas - - dureh destilliertes Wasser eine oekerbraune Fallung. Offenbar werden also die alkalischen Substanzen dureh F~llung in der erws schmierigen, br5ekeligen Masse festgehalten. Diese Masse kann man auch mit einigen Indikatoren, die in die Zellen nieht eindringen - - etwa denen yon CLA~K und LVBS - - fs und auch einige dieser Farbstoffreaktionen sind wohl nur verst~ndlich, wenn man an- nimmt, dab in der Masse saure und alkalische Teflchen unausgeglichen nebeneinander existieren. So fiirbt sieh die Masse in Bromkresolpurpur moosgrfin und in Chlorphenolrot blutrot, beides FarbtSne, die in der Skala der Umschl~ge dieser Indikatoren iiberhaupt nieht vorkommen, dagegen ]eieht erhalten werden kSnnen, wenn man im ersten Fall Gelb und Blauviolett, im zweiten Fall Orangegelb und Rosa, die FarbtSne, die diese Indikatoren bei p~ 5,0 und auf der alkalisehen Seite zeigen, iibereinanderlegt 1. Eine Trennung der beiden Phasen des Plasmas gelang aueh mit anderen Methoden nicht. Die Versuche wurden mit reifen Ovarialeiern ausgeffihrt, die in neutraler NaCi-LSsung gewaschen und dann in verschiedenen Medien zersehnitten wurden.

W~hrend der Furehung, der Ausbreitung der Zellen der Keimscheibe mud der Keimbl~tterbildung t r i t t keine prinzipielle Jfmderung in der Verteilung der alkalisehen und sauren Eisubstanzen ein. So wie bei den Teleosteern werden alle Zellen der Keimseheibe und alle KSrper- schiehten aus den alkalischen Substanzen aufgebaut [vgl. das in Abb. 3 (Tafel I) abgebildete Stadium der Ausbreitung der Keimseheibe, Indikator Methylrot]. Dieser Befund besagt aber natfirlieh nicht, daB innerhalb des alkalisehen Bereiehes nicht eventuell feinere Differenzen im p~ der Kolloide der verschiedenen Regionen vorhanden sein kSnnten, die wir nut mit unseren Indikatoren nieht erfassen kSnnen. Wenn sie z .B . zwischen oder fiber den Umsehl~gen unserer Indikatoren liegen, w~re gar nicht zu erwarten, dab sie dureh irgendwelehe Farbi~nderungen angezeigt wiirden. Und selbst dort, wo in einem Keimbezirk zuerst Substanzgleichheit vorlag, bleibt sie bei der weiteren Entwicklung oft nieht lange erhalten. In die Grundmasse des alkalischen Plasmas werden wahrseheinlieh aus der 1~ahrung wieder saure Substanzen aufgenommen (oder vielleieht werden sie bei chemischen Ums~tzen neugebfldet) und sie rufen lokale Umschl~ge der Indikatoren hervor, die in ganz gesetz-

1 I~ur kleine abgesprengte F16ckehen der Masse f~rben sich in rein saurem Farbton aus. Wahrseheinlich war aus ihnen die alkalisehe Phase herausdiffundiert.

Die bipolare Differenzierung des Cephalopoden- und des Prosobranchiereies. 869

m/~Biger Beziehung zu den Organanlagen des Embryos stehen. Die ersten Differenzen werden aus den er6rterten Grfinden wieder von Kresyl- eehtviolett angedeutet. F/~rbt man damit einen Loligo-Embryo in dem Stadium, in dem Augen, Trichter und Arme angelegt werden, so erh/~lt man ein sehr gesetzm/~Biges ~arbenmosaik: Die Hauptmasse des Embryo- k6rpers ist zwar noch rosa. Dazwischen sind aber eine Reihe blauer Felder zu sehen; so sind der Mantel und die Wfilste fiber den Augen blau, die Augenanlagen selbst violett. Die Trichteranlage ist dunkelrosa, w/s die Epithelfelder zwisehen den Organanlagen (vielleieht dutch teilweise Reduktion des Farbstoffes) einen Stich ins Gelbliche zeigen. Die Spitze der Armanlagen ist blau und die Indikatorfarbe geht - - auf beiden Seiten des Kbrpers in genau derselben Weise - - kontinuierlich fiber Violett in das Rosa der Anlagebasis fiber. Solehe Bilder deuten an, daB bei der sp~teren Entwieklung, streng auf die versehiedenen Organ- anlagen lokalisiert, neue H-Ionenkonzentrationsf~lle entstehen kbnnen, die irgendwie yon Zelle zu Zelle gehen. Um ihre Bedeutung zu ver- stehen muBten wir sie natfirlich erst alle einzeln genauer analysieren. Hier wollte ieh diese Gesetzm~Bigkeiten nur kurz zur Sprache bringen, um anzudeuten, wie das gleiehe Prinzip der Substanzdifferenzierungen eventuell aueh bei der sp/~teren Entwieklung lokal in Aktion treten k6nnte.

Den besehriebenen Befunden fiber die Farbaussehl/s der Indikatoren im Protoplasma des Cephalopoden-Eies mbchte ieh hier eine kurze Sehilde- rung der Parallelversuche, die mit den gleichen Indikatoren aueh an Prosobranchier-Eiern ausgefiihrt wurden, anfiigen. Gerade diese Gegen- fiberstellung zeigt n~tmlieh, wie trotz der vbllig versehiedenen Be- sehaffenheit dieser Eier das gleiehe Prinzip der bipolaren Stoffwan- derungen ihre ganze Differenzierung beherrseht, der andere Charakter der Furehung aber dann doeh ein ganz anderes Endergebnis zeitigt.

Die Versuehe wurden an den Eiern des kleinen, in der Bueht yon Woods Hole sehr h/tufigen Prosobranchiers Columbella avara (anacris) ausgeffihrt, den man aueh leieht im Aquarium halten kann. Die Eier werden, in Gallerte eingebettet, in durehsiehtigen kleinen Kokons an der Wand des Aquariums abgelegt. Dutch die untere flaehe Wand des Kokons k6nnen sie im Mikroskop aueh direkt beobaehtet werden. Die obere Fl~ehe des Kokons ist dazu zu sehr gekrfimmt. Ein Herausholen der Eier aus dem Kokon ist nicht ganz leieht, da der hfillenlose, weiehe Zellkbrper hierbei leieht beseh~digt wird. Dis Vitalfarben dringen aueh in den Kokon leieht ein und f/~rben alle Regionen des Eik6rpers intensiv an. Die F/~rbung karm durch Offnen der Kokonwandung besehleunigt werden.

Auch bei Columbella begirmt die polare Differenzierung der Eier naeh der Riehtungskbrperbildung. Aueh hier ist ihr Endergebnis das, dab die Substanzen mit der h6chsten Alkalinit~t unter dem Riehtungsk6rper- pol angereiehert werden, w/~hrend die sauren naeh dem vegetativen Pol abwandern. Da aber die Col~zmbella-Eier sehr verschiedenartige

W . l~oux ' A r c h i v f. E n t w i c ~ u n g s m e e h a n i k . Bd . 131. 2 4

870 gosef Spek:

Substanzen enthalten, die teils hyalin gol6st, toils in groBen, mittloron odor feinst~n Tr6pfehen in dor Grundmasso dos Eios verteflt sind und alle an dor Wanderung nach don beiden Polon teilnohmen, kommt oin h6ehst eigonartiges Differenzierungsbfld zustando, dessen Gesetzm~Bigkeit dureh die F~rbungon noeh bosonders horvorgehoben wird.

An dom animalon Pol entsteht oine Ansammlung yon klarom, hyalinen Protoplasma, welches sieh in Brfllantkrosylviolott rosa, in BriUant- vitalrot blab rostgolb und in Methylrot (wiedor in isotoniseher NaC1- L6sung angewandt) zitronengelb fi~rbt. In Kresyleehtviolott tritt nut sehr langsam Anf~rbung ein. Aueh dieser Indikator nimmt rosa Farbe an. In Brillantvitalrot seheidon sieh - - wio fast stets in alkalisohem Plasma - - aueh bier in dot rostgelben Plasmakuppe mohr odor weniger zahlroiehe zinnoborroto Tr6pfehen aus. Die naeh dem animalen Pol wandornden Kolloido verdr/~ngen yon dort allo Tropfon und Granulationon. Untor der animalon Hy~loplasmaansammlung roiehern sieh zahlroiehe kleine Tr6pfehen an. Diose .und die hyaline Grundsubstanz dazwisehen zeigen, sowoit sic sieh fiberhaupt anf/~rben, sehon etwas sauren Farbton, sind in Brillantkrosylviolett violett. Dieso Substanzon dringen niemals z. B. bis zum animalon Pole vor. Die ganzo vegetative Eih~lfte nehmen die groBen Dottortropfon ein. Sie haben eine golbliehe Eigonfarbe, welche blasseren Indikatoffarbon oinon Stieh ins Gelbo verleiht. Das Dotter- plasma f/~rbt sieh: in Brillantvita]rot gleiehm~Big tiofrosa, in Mothy]rot blab rosarot, in Brfllantkrosylrot blau (isolierte Dottortropfen or- seheinen hierin rein stahlblau, die Masse des gelbliehen Dotters erseheint abet mehr odor weniger grfinblau). In Krosylechtviolett zoigt die Dottor- h~lfto oine tiefblaue Farbe, die durch oinen Stieh ins Rote vorr~t, dab doeh aueh noeh hier Spuren yon alkalischen Substanzen vorhanden sein miissen.

Der Abschnitt des Eik6rpers, der die sauorsten Substanzen enths wird zu Beginn der Furehung (vor/ibergehond ?) als kernloser Dotterlappen abgesehntirt. Die bei seiner Bildung entstehondo Durehschn/irung dos Ei- k6rpers stoht insoforn immer in strenger Beziehung zur Substanzsonderung im Ei, als sio stets in der gleiehen Quorzone erfolgt. Dem Dotterlappen sitzon naehher die l~urehungszellon wie oine Koimseheibo auf. An den Blastomeren entstehen die/~quatorialen Furehon so, dab sie die Substanz- anh/~ufung mit intermodis Reaktion yon dem hyalinen animalen Plasma sondorn, welches in die obersto ZeUsorio zu liegon kommt. So ist ein Furehungsstadinm nach dieser etagenweisen Sondorung der bipolar aus- oinandorgowanderton Substanzen besonders interessant und bosondors seh6n bei F/irbung mit einem Indikator, dor wio Brfllantkresylviolott allo Substanzen des Eies f~rbt. Wir erhalten darin das pr/~chtigo Bild der Abb. 4 (Tafel I). Die Farbon der versehiedenon Quorzonen des Keimes stellon eine lfickenloso Aufeinanderfolge s/tmtlieher Farbumsehl~go des In- dikators yon dem alkalisehsten Farbton bis zum sauersten dar. Nicht nut

Die bipolare Differenzierung des Cephalopoden- und des Prosobranehiereies. 371

die Zellen der beiden Zellagen und die Dottermasse nehmen einen ganz verschiedenen Farbton an,-auch die Zellen jeder Sehieht ffir sieh zeigen wiederum eine naehtr/~glich noeh sch~rfer gewordene bipolare Differen- zierung, so dab die beiden Enden jeweils deutlieh versehieden aussehen. Der Farbton tier rosa Zellen zeigt an ihrem oberen Ende einen deutlichen Stieh ins Gelbliehe, wie ieh das bei Brillantkresylviolettf/~rbungen aueh schon bei anderen Objekten an den alkalisehen Enden der Zellen be- obachtet babe. An den mittleren Zellen dagegen dringt am animalen Ende schon deutlieh ein rosa Farbton dureh, u n d e s reichern sieh dort mehr hyaline Substanzen an, w~hrend die blauvioletten Substanzen und die Hauptmasse der Granulen an das vegetative Zellende zu liegen kommen. Selbst in der groSen Masse des Dotterplasmas ist noah eine deutliehe Bipolaritat zu erkennen, insofera, als am animalen Ende andere, feinere und weniger blau gefgrbte Granulen angereiehert sind. Bei den meisten F/~rbungen dominiert im Dotterplasma die Farbe einer Substanz, doeh ist nach Analogie mit anderen Objekten und dem Befund in Kresyl- echtviolett damit zu reehnen, dab zwisehen der Masse der sauren Dotter- substanzen aueh bier noch Spuren yon alkaliseheren Substanzen vor- handen sind, so dab das vorliegende Bild der bipolaren Differenzierung des Dotterabsehnittes noah nieht komplet t sein dfirfte.

Bei der epibolisehen Gastrulation waehsen die rosa Zellen um die iibrigen herum und liefern das Ektoderm, so dab eine/~hnliehe Verteflung der Substanzen yon verschiedenem p~ zustande kommt wie bei der epi- bolisehen Gastrulation der Annelideneier. I m einzelnen sind die Be- deutung und die Potenzen der differenten Keimbezirke noeh nieht unter- sucht worden. Da das hiillenlose, plastiseh weiehe Prosobranchierei sowohl flit kausalanalytiseh-entwieklungsmeehanische, als auch fiir mikrurgisehe Versuehe geeignet zu sein seheint, sind weitausholende Untersuehungen daran geplant, die in der vergangenen Sommersaison nieht mehr in Angriff genommen werden koanten. Hier in dieser Darstellang kam es mir zun/~chst nur darauf an, zu zeigen, dab sich aueh an diesem Objekt das gleiehe Prinzip der bipolaren Differenzierung manifestiert, wie an den Anneliden-, Cephalopoden- and Teleosteereiern.

Kurze Zusammenfassung, Zu den an anderer Stelle publizierten Untersuehungen fiber die sog. bipolare

Differenzierung der Anneliden- und der Teleosteer-Eier w~rden Parallelunter- suchungen an Cephalopoden- und Prosobranchiereiern ausgeffihrt. Die unter- suchten 0bjekte waren die Eier yon Zoligo vulgaris und ColumbeUa avara. Die Hauptmethode waren Vitalf~rbungen atler Entwicklungsstadien mit den Indika- toren: Neutralrot, Brillantvitalrot, Brillantkresylviolett, Kresylechtviolett, l~il- blausulfat B und Methylrot.

Auch beim Loligo- und beim Columbella-Ei entsteht die substantielle Ver- schiedenheit des animalen und des vegetativen Poles dadureh, da~ nach der Rich- tungskSrperbildung alkalisehe Substanzen nach dem RichtungskSrperpol und saure nach dem vegetativen Pol zu wandern beginnen. I)ieses Ph~nomen kann

24*

372 Josef Spek.

vorl~ufig nich~ anders erkl~r~ werden, als dab die Eizelle nach der Rich~ungskSrper- bfldung ein elektrisches Feld darstetlt, in dem wio im sch6nsten Kataphoresever- such die Kolloidteilchen und mikroskopischen TrSpfchen nach dem einen oder nach dem anderen Pole wandcrn. Die versehiedene Reaktion der Teilchen diiffte auch verschiedene Ladung zur ~olge haben. Welt ausholende Untersuchungen an anderen Objekten haben zu dem Resultat gefiihrt, dal3 im lebenden Protoplasma alkalisehe und saure Kolloidteilehen, in irgendeiner Weise voreinander gesehfi~zL unausgeglichen nebeneinander vorkommen. Unter bestimmtcn Bedingungen wandern sic in gesetzm~Biger Weise auseinander. Beim Loligo-Ei kommt durch polare Anreicherung der alkalisehen Substanzen und Entstehung einer Phasen- grenze zwischen itmen und den sauren Substanzen die Kappe des Keimplasmas zust~nde. Es gelang bei diesem Objekt besonders sch6n dureh Kresylech~violett- f~rbung die intermedi~ren Stadien der bipolaren Wanderung der Substanzen zu demonstrieren. Das PK der alkalisehen Substanzen diirfte bei 7,8 liegen, das der sauren ungef~hr bei 5,0.

Die mit geeigneten Indikatoren gef~rbten Columbella-Eier bieten nach voll- zogen0r bipolarer Differenzierung ein auBerordentlich schiines Bild des gleichen Ph~nomens dar. Hier wird der Eiabsehnit~, der die sauersten Substanzen enth~lt, als Dotterlappen abgesehniirt. Bei der ~urchung werden zwei Lagen yon Blast~- meren gebildet, yon denen die der oberen (animalen) die Plasmasubstanzen mi~ dem h6chsten PH, das auch hier bei 7,8 oder noch hSher liegen diirfte, abbekommt, wfiJarend in die der unteren die Subst~nzen yon mittlerem PH hineingelangen. Auch die einzelnen Blastomeren zeigen eine ausgepr~gte bipolare Differenzierung. Bei der Entwieklung umwachsen die alkalischen Zellen die anderen bei der epibolisehen Gastrulation. - - Das PH der Do~tersubstanzen liegt bier vielleicht sogar mater 5,0.

Erkliirung tier Abbildungen auf der Talel I. Abb. 1. Ei yon Loligo vulgaris nach der Richtungsk6rperbildung w~hrend dcr noch fortsehrei~enden Wanderung der alkalischen Plasmasubstanzen nach dem animalen Pol. Unter den Rich~ungsk6rpern ist schon eine diinne Schich~ yon Keimplasma abgesonder~. Vitalf~rbung mi~ Kresylechtviolett. Alkalische Sub-

stanzen graurosa, saure blau gefarbt. Abb. 2. Ei yon Loligo vulgaris nach eben vollendeter Absonderung der Kcim- plasmakappe. u mit Brillantkresylviolett. Alkalisches Plasma rosa,

saures blau. Abb. 3. Ei yon Loligo vulgaris. Stadium der Randverdickung der abgefurchten Keimscheibe. u mit Methylrot. Alkalisches Plasma gelb. Saures

Do~terplasma ziegelrot. Abb. 4. Furchungsstadium yon Coiumbella avara. Vitalf~rbung mi~ Brillantkresyl- violett. Oberste Schich~ der Blastomeren en~h~l~ das alkalischste (rosa gefarbte) Protoplasma, die mittlere (viole~te) schw~eher alkalisches. Dotterplasma saner. Grtine l~arbe zusammengesetzt aus gelber Eiger~arbe und blauem Farbton des

Indika~ors.

Literaturverze ichnis . Spek, J.: ~ber gesetzm~Bige Substanzverteilungen bei der Furchung des Cteno-

phoreneies. Arch. En~w.mechan. 107 (1926). - - Zus~ands~nderungen der Plasma- kolloide bei Befruch~ung und Entwicklung des lqereis-Eies. Protoplasma (Berl.) 9 (1930). - - ~ber die bipolare Differenzierung des Teleosteer-Eies. Pro~oplasma (BerL) 18 (1933). - - Die bipolare Differenzierung des Eies yon Nereis limbata und Chaeto~erus l~ergamentaceus. Protoplasma (Berl.) ~.1 (1934a). - - Die Reaktion der Protoplasmakomponenten des Asterias-Eies. Protoplasma (Berl.) 21 (1934 b). - - Vialleton, L.: Sur la f6eonda/~ion ehez les C6phalopodes. C. r. Acad. Sciences 101 (1885). - - Watase~ S.: Studies on Cephalopods. I. Cleavage of the ovum. J. ~orph. a. Physiol. 4 (1891).