Die extrazelluläre RNA-Welt von Listeria monocytogenesgeb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2019/14246/pdf/FrantzRenate_2018_11_19.pdf · Pathogen, L. ivanovii, das vorwiegend Tiere infiziert

Die extrazelluläre RNA-Welt von Listeria monocytogenes

und deren Potential zur Typ-I-IFN Induktion

Proteomanalyse der von Listeria monocytogenes

produzierten Membrane Vesicles

Inauguraldissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Humanbiologie

des Fachbereichs Medizin

der Justus-Liebig-Universität Gießen

Vorgelegt von Frantz, Renate

aus Siebenbürgen (Rumänien)

Gießen 2018

Aus dem Zentrum für Medizinische Mikrobiologie und Virologie

unter der Leitung von Prof. Dr. Trinad Chakraborty

des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen

1. Gutachter: Prof. Dr. Trinad Chakraborty

2. Gutachter: Prof. Dr. Günther Lochnit

Tag der Disputation: 19.11.2018

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ................................................................................................................................................ 1

1.1. Listeria monocytogenes .................................................................................................................... 1

1.2. Immunantwort gegen L. monocytogenes .......................................................................................... 3

1.3. Induktion von Typ-I-Interferon (Typ-I-IFN) .................................................................................... 5

1.3.1. Induktion von Typ-I-IFN während einer Infektion mit L. monocytogenes ............................... 8

1.4. Produktion von Vesikeln (OMVs bzw. MVs) durch Bakterien ...................................................... 11

1.5. Sekretion von RNA durch Bakterien .............................................................................................. 14

1.6. Zielsetzung dieser Arbeit ................................................................................................................ 17

2. Material und Methoden ....................................................................................................................... 18

2.1. Bakterienstämme und Virusstamm ................................................................................................. 18

2.2. Zelllinien ........................................................................................................................................ 18

2.3. Antibiotika-Stammlösungen ........................................................................................................... 18

2.4. Antikörper ...................................................................................................................................... 19

2.5. Molekulargewichtsmarker .............................................................................................................. 19

2.6. Vektoren ......................................................................................................................................... 20

2.6.1. Plasmidkarte des pCR2.1-TOPO-Vektors .............................................................................. 20

2.6.2. Multiple Cloning Site (MCS) des pCR2.1-TOPO-Vektors .................................................... 21

2.6.3. Plasmidkarte des pERL3-Vektors ........................................................................................... 22

2.7. Oligonukleotide (Primer) ............................................................................................................... 22

2.7.1. Primer für die Real-Time PCR (RT-PCR) .............................................................................. 22

2.7.2. Primer für die Herstellung der 25 RNA-Kandidaten .............................................................. 23

2.7.3. Primer für die Herstellung der rli32-Motive ........................................................................... 25

2.7.4. Primer für die Herstellung von Lm-pERL3-rli32 .................................................................... 25

2.7.5. Primer für die Herstellung von Lm-pERL3-ssrS .................................................................... 26

2.8. Chemikalien ................................................................................................................................... 26

2.9. Kits, Enzyme, gebrauchsfertige Lösungen und Chemikalien ......................................................... 27

2.10. Medien, Puffer und Enzyme für die Zellkultur ............................................................................ 28

2.11. Medien für die Anzucht von Bakterien ........................................................................................ 28

2.12. Gele und Puffer ............................................................................................................................ 31

2.13. Verbrauchsmaterialien .................................................................................................................. 37

2.14. Geräte ........................................................................................................................................... 37

2.15. Arbeiten mit DNA ........................................................................................................................ 39

2.15.1. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ..................................................................................... 39

2.15.2. Agarosegel-Elektrophorese von DNA-Fragmenten .............................................................. 40

2.15.3. Aufreinigung von DNA-Fragmenten .................................................................................... 41

2.15.4. Extraktion von DNA-Fragmenten aus dem Agarosegel ....................................................... 41

2.15.5. Isolierung von Plasmid-DNA ............................................................................................... 42

2.15.6. Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration ..................................................................... 42

2.15.7. Klonierung ............................................................................................................................ 43

2.15.7.1. Konierung durch TA Cloning ....................................................................................... 43

Inhaltsverzeichnis

II

2.15.7.2. Klonierung durch Restriktionsverdau und Ligation ...................................................... 44

2.16. Bakteriologische Arbeiten ............................................................................................................ 46

2.16.1. Kultivierung von Bakterien .................................................................................................. 46

2.16.2. Messung des Bakterienwachstums ....................................................................................... 46

2.16.3. Kompetenz und Transformation ........................................................................................... 46

2.16.3.1. Herstellung von elektro-kompetenten E. coli-Zellen .................................................... 47

2.16.3.2. Herstellung von chemisch-kompetenten E. coli-Zellen ................................................ 47

2.16.3.3. Herstellung von elektro-kompetenten L. monocytogenes-Zellen .................................. 48

2.16.3.4. Transformation von elektro-kompetenten E. coli-Zellen .............................................. 48

2.16.3.5. Transformation von chemisch-kompetenten E. coli-Zellen .......................................... 49

2.16.3.6. Transformation von elektro-kompetenten L. monocytogenes-Zellen ............................ 49

2.17. Arbeiten mit RNA ........................................................................................................................ 49

2.17.1. Transfektion von RNA in eukaryotischen Zellen ................................................................. 49

2.17.2. In vivo Transfektion von RNA ............................................................................................. 50

2.17.3. Isolierung der zellulären RNA aus eukaryotischen Zellen ................................................... 51

2.17.4. Isolierung der zellulären RNA aus Bakterien ....................................................................... 52

2.17.5. Isolierung von RNA aus Mausorganen ................................................................................. 53

2.17.6. Qualitätskontrolle der RNA und RNA-Profilanalyse ........................................................... 54

2.17.7. Reverse Transkription (cDNA-Synthese) ............................................................................. 54

2.17.8. Real-Time PCR (RT-PCR) ................................................................................................... 55

2.17.9. Isolierung von MVs-RNA .................................................................................................... 56

2.17.10. Isolierung von sec-RNA ..................................................................................................... 57

2.17.11. Sequenzierung .................................................................................................................... 58

2.17.12. Herstellung von RNA durch in vitro Transkription (IVT) .................................................. 58

2.17.13. Verdau des DNA-templates ................................................................................................ 59

2.17.14. Dephosphorylierung von RNA ........................................................................................... 59

2.17.15. Denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese ............................................................. 60

2.17.16. Extraktion von RNA aus dem Polyacrylamidgel ................................................................ 60

2.17.17. Phenol/Chloroform-Fällung von RNA ............................................................................... 60

2.18. Proteinanalytische Methoden ....................................................................................................... 61

2.18.1. Isolierung von Membrane Vesicles (MVs), die von L. monocytogenes produziert werden .. 61

2.18.2. Bestimmung der Proteinkonzentration mit der Bradford-Methode ...................................... 61

2.18.3. Bestimmung der Proteinkonzentration mit der BCA-Methode ............................................ 62

2.18.4. Probenvorbereitung für die Elektronenmikroskopie (EM) ................................................... 63

2.18.5. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) ......................................................... 63

2.18.6. Western blot-Analyse von MVs ........................................................................................... 64

2.18.7. Untersuchung der Internalisierung von MVs in PtK-Zellen ................................................. 65

2.18.8. Hämolyse-Assay ................................................................................................................... 65

2.19. Zellkultur-Methoden .................................................................................................................... 66

2.19.1. Kultivierung von Zelllinien .................................................................................................. 66

2.19.2. Gewinnung von primären Knochenmark-Makrophagen aus der Maus ................................ 67

2.19.2.1. Gewinnung von M-CSF ................................................................................................ 68

2.19.3. Infektion von HEK293-Zellen mit A/PR/8/34 (H1N1) ........................................................ 68

2.19.3.1. Virusquantifizierung durch Focus Forming Assay (FFA) ............................................ 68

2.20. Statistische Analyse ...................................................................................................................... 69

3. Ergebnisse ............................................................................................................................................. 70

3.1. Isolierung und Identifizierung der von L. monocytogenes sekretierten RNA................................. 70

3.1.1. Co-Isolierung von sec-RNA und MVs-RNA .......................................................................... 70

Inhaltsverzeichnis

III

3.1.2. Profilanalyse von sec-RNA und MVs-RNA ........................................................................... 71

3.1.3. Untersuchung der Fähigkeit von sec-RNA und MVs-RNA IFN-β zu induzieren .................. 72

3.1.4. Analyse der Zusammensetzung von sec-RNA und MVs-RNA .............................................. 73

3.1.5. Herstellung einzelner sRNAs durch in vitro Transkription .................................................... 74

3.1.6. Untersuchung der Fähigkeit einzelner sRNAs IFN-β zu induzieren ...................................... 78

3.1.6.1. Untersuchung der Abhängigkeit der IFN-β Induktion von dem Rezeptor RIG-I............ 80

3.1.6.2. Untersuchung der Abhängigkeit der IFN-β Induktion von dem Rezeptor MDA5 .......... 81

3.1.6.3. Untersuchung der rli32-Motive hinsichtlich der Fähigkeit IFN-β zu induzieren ............ 82

3.1.7. Untersuchung der Inhibition der viralen Replikation durch rli32 und rli47 ........................... 83

3.1.7.1. Untersuchung der Abhängigkeit der viralen Inhibition von den Rezeptoren RIG-I und

MDA5 .......................................................................................................................................... 85

3.1.7.2. Untersuchung der Abhängigkeit der viralen Inhibition von der RNA-Konzentration .... 86

3.1.7.3. Untersuchung der Inhibition der viralen Replikation durch weitere sRNAs................... 87

3.1.8. Untersuchung der Fähigkeit von rli32 Typ-I-IFN in der Maus zu induzieren ........................ 88

3.1.9. Überexpression von rli32 und ssrS in L. monocytogenes ....................................................... 90

3.1.9.1. Untersuchung der IFN-β Induktion durch sec-RNA und MVs-RNA in BMDMs .......... 91

3.1.9.2. Untersuchung der IFN-β Induktion durch sec-RNA und MVs-RNA in HEK293-Zellen92

3.1.9.3. Untersuchung der Abhängigkeit der IFN-β Induktion durch sec-RNA und MVs-RNA

von dem Rezeptor RIG-I.............................................................................................................. 93

3.1.9.4. Untersuchung der Fähigkeit von MVs IFN-β zu induzieren ........................................... 94

3.2. Charakterisierung der von L. monocytogenes produzierten MVs ................................................... 95

3.2.1. Elektronenmikroskopische Visualisierung von L. monocytogenes und isolierten MVs ......... 95

3.2.2. Bestimmung der Größe, Anzahl und Proteinkonzentration von isolierten MVs .................... 96

3.2.3. Proteomanalyse (Massenspektrometrie) von MVs ................................................................. 98

3.2.3.1. Klassifizierung der MVs-Proteine nach Funktion ........................................................... 98

3.2.3.2. Klassifizierung der MVs-Proteine nach Lokalisation ................................................... 105

3.2.3.3. Die 20 häufigsten Proteine in den MVs ........................................................................ 107

3.2.3.4. Virulenzfaktoren in den MVs ....................................................................................... 109

3.2.4. SDS-PAGE- und Western blot-Analyse von MVs ............................................................... 111

3.2.5. Untersuchung der hämolytischen Aktivität von MVs........................................................... 112

3.2.6. Untersuchung der Fähigkeit von MVs zur Internalisierung in PtK-Zellen ........................... 113

4. Diskussion ........................................................................................................................................... 115

4.1. Die von L. monocytogenes sekretierte RNA ist in den Fraktionen sec-RNA und MVs-RNA

gegenwärtig ......................................................................................................................................... 115

4.2. Unterschiedliche Zusammensetzung von sec-RNA, MVs-RNA und zellulärer RNA ................. 116

4.3. Anreicherung von kleinen nicht-kodierenden RNAs in MVs-RNA ............................................. 117

4.4. Unterschiedliche IFN-β Induktion durch sRNAs, die in sec-RNA und MVs-RNA identifiziert

worden sind ......................................................................................................................................... 118

4.4.1. RIG-I-Abhängigkeit der IFN-β Induktion durch die sRNAs ................................................ 119

4.4.2. Protektion von HEK293-Zellen gegen das Influenza A Virus durch die sRNAs ................. 120

4.5. Das Motiv 2 ist für die hohe IFN-β Induktion durch rli32 verantwortlich ................................... 121

4.6. Hohe Typ-I-IFN Induktion durch rli32 in der Maus .................................................................... 122

4.7. Erhöhte IFN-β Induktion durch die sekretierten RNA-Fraktionen und MVs nach Überexpression

von rli32 in L. monocytogenes ............................................................................................................ 122

4.8. Produktion von MVs durch L. monocytogenes ............................................................................ 124

4.9. MVs enthalten Enzyme, die möglicherweise an deren Biogenese beteiligt sind .......................... 125

Inhaltsverzeichnis

IV

4.10. MVs enthalten Proteine aus allen subzellulären Fraktionen: Cytoplasma, Cytoplasmamembran,

Zellwand und Extrazellulär ................................................................................................................. 126

4.11. MVs enthalten zum Teil vollständige Stoffwechselwege zur Energiegewinnung ..................... 127

4.12. MVs enthalten Virulenzfaktoren, die während der Infektion eine Rolle spielen ........................ 129

5. Zusammenfassung .............................................................................................................................. 131

5.1. Summary ...................................................................................................................................... 132

6. Abkürzungsverzeichnis...................................................................................................................... 134

7. Literaturverzeichnis ........................................................................................................................... 135

8. Anhang ................................................................................................................................................ 152

8.1. Veröffentlichungen ....................................................................................................................... 152

8.2. Kongressteilnahme ....................................................................................................................... 153

8.3. Danksagung .................................................................................................................................. 154

8.4. Eidesstattliche Erklärung .............................................................................................................. 155

8.5. Tab. 1: Einteilung der COGs in 25 funktionelle Kategorien ........................................................ 156

8.6. Tab. 2: Berechnung des Anteils an MVs-Proteine in den funktionellen Kategorien und Gruppen

anhand des NSAF-Wertes in % ........................................................................................................... 157

8.7. Tab. 3: Funktionelle Klassifizierung der 516 MVs-Proteine (EggNOG 4.5.1) ............................ 158

1. Einleitung

1

1. Einleitung

1.1. Listeria monocytogenes

L. monocytogenes (Lm) ist ein stäbchenförmiges, gram-positives und fakultativ

intrazelluläres Bakterium, das sowohl für den Menschen als auch für das Tier pathogen

ist. Es gehört zur Gattung Listeria mit insgesamt 17 Arten, darunter ein weiteres

Pathogen, L. ivanovii, das vorwiegend Tiere infiziert (Orsi und Wiedmann, 2016).

L. monocytogenes ist weit verbreitet und kommt in zahlreichen Tierarten und in der

Umwelt vor, wie beispielsweise im Boden, Wasser und Abwasser (Weis und Seeliger,

1975; Nightingale et al, 2005). Dieses Bakterium ist äußerst resistent gegenüber

extremen Umweltbedingungen. Es toleriert einen weiten Temperatur- (0-45°C) und pH-

Bereich (4,5-9,0) sowie hohe Salzkonzentrationen (10%) (Koutsoumanis et al, 2003;

Johnson et al, 1988). Aufgrund dieser Eigenschaften und wegen der ubiquitären

Verbreitung erfolgt die Infektion mit L. monocytogenes in der Regel durch den Verzehr

von verunreinigten Lebensmitteln in Form von rohen Milch- und Fleischprodukten

sowie ungewaschenem Obst und Gemüse (Bille et al, 2006; McLauchlin et al, 1990).

Nach der oralen Aufnahme gelangt L. monocytogenes zunächst in den Magen-Darm-

Trakt. Der weitere Verlauf der Infektion hängt von der immunologischen Fitness des

Wirtes ab. Das Krankheitsbild der Listeriose reicht dabei von Durchfall und grippe-

ähnlichen Symptomen bis hin zu Entzündungen der Hirnhäute (Meningitis) und des

Gehirns (Enzephalitis) (Roberts et al, 2003; Todd und Notermans, 2011). Bei immun-

kompetenten Menschen tritt eine nicht-invasive Listeriose auf, die sich in einer

fiebrigen Gastroenteritis äußert. Immunsupprimierte Menschen, darunter ältere

Menschen, Schwangere und Neugeborene, sind besonders für eine invasive Listeriose

anfällig. Die Mortalität bei einer Erkrankung an invasive Listeriose beträgt 20-30%

(Farber und Peterkin, 1991; Mead et al, 1999). Bei der invasiven Listeriose durchbricht

L. monocytogenes die intestinale Barriere und breitet sich über Blut und Lymphe in eine

Vielzahl von Organen aus. L. monocytogenes ist in der Lage weitere Barrieren im

menschlichen Körper zu durchbrechen. Zum einen die Blut-Hirn-Schranke, woraus die

Infektion der Hirnhäute und des Gehirns resultiert, und zum anderen die Placenta-

Barriere, die zu einer Infektion des Fötus mit Fehl- und Totgeburt führen kann (Lecuit

et al, 2004; Lecuit, 2005).

1. Einleitung

2

Die Abb. 1.1 zeigt den intrazellulären Infektionszyklus von L. monocytogenes. Während

die Infektion von Makrophagen durch Phagocytose erfolgt, wird die Internalisierung

von L. monocytogenes in nicht-phagocytierende Zellen durch rezeptorvermittelte

Endocytose nach dem Zipper-Mechanismus über Internalin A (InlA) und Internalin B

(InlB) induziert (Mengaud et al, 1996; Veiga und Cossart, 2005). Der Rezeptor für InlA

ist das auf Epithelzellen vorkommende E-Cadherin, während der von verschiedenen

Zelltypen exprimierte Rezeptor für HGF (hepatocyte growth factor), die sogenannte

Tyrosin-Kinase Met, die Internalisierung in Hepatozyten über InlB vermittelt (Mengaud

et al, 1996; Shen et al, 2000).

Abb. 1.1: Intrazellulärer Infektionszyklus von L. monocytogenes. Invasion von Lm in eine nicht-

phagocytierende Zelle über die Internaline A und B (InlA und InlB). Lyse der Vakuole durch die koor-

dinierte Aktivität von Listeriolysin O (LLO), den beiden Phospholipase C-Enzymen, PlcA und PlcB,

sowie der Zink-Metalloprotease (Mpl). Intrazelluläre Fortbewegung mit Hilfe des Aktinfilament-

akkumulierenden Faktors A (ActA). Invasion in die Nachbarzelle und Beginn eines neuen Infektions-

zyklus. (Pillich et al, 2015)

Nach dem Eintritt in Wirtszellen befreit sich L. monocytogenes mit Hilfe der koordi-

nierten Aktivität von Listeriolysin O (LLO) und den beiden Phosphatidylinositol- und

Phosphatidylcholin-spezifischen Phospholipase C-Enzymen (PlcA und PlcB) aus der

primären Vakuole ins Cytosol. Letzteres wird als Proenzym synthetisiert und durch die

Zink-Metalloprotease (Mpl) im sauren Milieu der Vakuole aktiviert (Portnoy et al,

1988; Mengaud et al, 1991; Geoffroy et al, 1991; Domann et al, 1991). Im Cytosol ist L.

monocytogenes in der Lage sich mit einer Verdopplungszeit von ca. 1 Stunde zu ver-

mehren, wobei es Glukose-1-Phosphat, das frei im Cytosol zugänglich ist, als Energie-

quelle nutzt. Die Aufnahme dieses Zuckers wird durch den Hexose-Phosphat-

Transporter (UhpT) vermittelt (Gaillard et al, 1987; Chico-Calero et al, 2002). Der

1. Einleitung

3

Aktinfilament-akkumulierende Faktor A (ActA), der die polarisierte Polymerisation von

Aktin der Wirtszelle induziert, vermittelt sowohl die intra- als auch die interzelluläre

Bewegung von L. monocytogenes, wobei es zur Infektion von Nachbarzellen kommt

(Kocks et al, 1992; Domann et al, 1992). Nach der Invasion in Nachbarzellen befreit

sich das Pathogen erneut durch Lyse der sekundären Vakuole und kann einen neuen

Infektionszyklus beginnen. Mit dieser Strategie kann sich L. monocytogenes von Zelle

zu Zelle ausbreiten, wodurch es der humoralen Immunantwort des Wirtes entkommt.

Das Genom von L. monocytogenes EGD-e (Serotyp 1/2a), der Stamm der in dieser

Arbeit verwendet wurde, ist im Jahr 2001 vollständig sequenziert worden. Dieser besitzt

ein zirkuläres Chromosom, das ein GC-Gehalt von 39% aufweist und aus 2944528 Bp

besteht. Die Anzahl der proteinkodierenden Gene beträgt 2853 (Glaser et al, 2001).

Die für den Infektionszyklus essentiellen Virulenzgene prfA, plcA, hly, mpl, actA und

plcB sind in dem 9 Kb langen Virulenzgencluster LIPI-1 organisiert (Listeria pathoge-

nicity island 1) (Chakraborty et al, 2000). Dieser wird von dem positiven Regulations-

faktor A (PrfA), der selbst Teil des Clusters ist, positiv reguliert. Die PrfA-abhängige

Transkription unterliegt einer Thermoregulation und wird erst bei 37°C induziert

(Chakraborty et al, 1992; Renzoni et al, 1999; Johansson et al, 2002). Das inlAB-Operon

ist an einer anderen Stelle des Genoms lokalisiert und wird nur teilweise von PrfA

reguliert (Lingnau et al, 1995). Dies gilt auch für Internalin C (InlC), ein Homolog der

beiden Internaline A und B, dem aufgrund der stark induzierten Transkription während

der Vermehrung von L. monocytogenes im Cytosol eine Rolle in der späten Phase des

Infektionszyklus zugeschrieben wird (Engelbrecht et al, 1996).

1.2. Immunantwort gegen L. monocytogenes

In der frühen Phase einer Infektion mit L. monocytogenes wirkt das angeborene

Immunsystem unspezifisch und wirksam zur raschen Eindämmung der Infektion.

Hierbei spielen die Aktivierung und Rekrutierung einer Reihe von Immunzellen eine

entscheidende Rolle. In Milz und Leber, die primären Zielorgane von L. monocytogenes

nach einer systemischen Infektion, wird die Mehrheit der Bakterien von gewebs-

ständigen Makrophagen phagocytiert (Mackaness, 1962; Conlan und North, 1992).

Diese produzieren daraufhin die pro-inflammatorischen Cytokine TNF-α und IL-12.

Dadurch werden Natürliche Killer-Zellen (NK-Zellen) zur Produktion von IFN-γ

stimuliert (Havell, 1989; Wherry et al, 1991; Tripp et al, 1993). IFN-γ ist eines der

https://de.wikipedia.org/wiki/Chromosom

https://de.wikipedia.org/wiki/GC-Gehalt

https://de.wikipedia.org/wiki/Gen

1. Einleitung

4

wichtigsten Cytokine in der frühen Phase einer Infektion mit L. monocytogenes. Es

führt zur Aktivierung von Makrophagen, indem es deren Effektorfunktionen, wie

beispielsweise die Produktion reaktiver Sauerstoff- (ROS) und Stickstoffspezies (RNS),

sowie die Sekretion von pro-inflammatorischen Cytokinen steigert (Buchmeier und

Schreiber, 1985; Huang et al, 1993; Beckerman et al, 1993). In der frühen Phase einer

Infektion mit L. monocytogenes sind NK-Zellen die Hauptproduzenten von IFN-γ.

Jedoch stellen T-Zellen des adaptiven Immunsystems eine alternative Quelle an

anfänglichen IFN-γ dar, wodurch diese die angeborene Immunabwehr unterstützen.

CD4+- und CD8+-T-Zellen werden in Anwesenheit von IL-12 und IFN-γ selbst zur

Produktion von IFN-γ angeregt. Dieser Prozess findet in der frühen Phase der Infektion

ohne Antigenstimulation über MHC-Moleküle (major histocompatibility complex) statt

und wird ausschließlich von Cytokinen ausgelöst (Andersson et al, 1998; Berg et al,

2002; Lertmemongkolchai et al, 2001).

Bei der Bekämpfung von L. monocytogenes in der frühen Phase der Infektion sind

neben Makrophagen weitere unspezifische Immunzellen beteiligt. Neutrophile Granulo-

zyten werden durch Chemokine, die beispielsweise von infizierten Hepatozyten

sekretiert werden, an die Infektionsorte gelockt (Rogers et al, 1996). Ähnlich wie

Makrophagen verfügen diese über antimikrobielle Mechanismen, indem sie u.a.

phagocytierte Bakterien durch die Bildung von ROS und RNS töten (Bortolussi et al,

1987; Conlan und North, 1991; Rogers und Unanue, 1993). Ly6C+ Monocyten sind

weitere Effektorzellen, die durch das Chemokin CCL2 (CC-chemokine ligand 2), das

von infizierten Makrophagen sekretiert wird, rekrutiert werden. Diese wandern aus dem

Knochenmark in die infizierten Organe ein und differenzieren zu TipDCs (TNF and

inducible nitric oxide synthase (iNOS) producing dendritic cells). Deren hohe

Produktion an TNF und iNOS ist für die Begrenzung der Infektion unentbehrlich

(Serbina et al, 2003; Serbina und Pamer, 2006).

Aufgrund der intrazellulären Lebensweise dieses Pathogens spielt die humorale Immun-

antwort keine wesentliche Rolle. Für die Überwindung einer Infektion mit L.

monocytogenes ist die Aktivität von T-Zellen des adaptiven Immunsystems notwendig.

Sowohl CD4+- als auch CD8+-T-Zellen sind darin involviert, jedoch ist die Aktivität

von antigenspezifischen cytotoxischen CD8+-T-Zellen für die vollständige Elimi-

nierung des Pathogens essentiell (Ladel et al, 1994). Während CD4+-T-Zellen als TH1-

Helferzellen die Funktion von Makrophagen antigenspezifisch über den T-Zell-

1. Einleitung

5

Rezeptor regulieren, töten cytotoxische CD8+-T-Zellen infizierte Zellen. Diese werden

durch die Aktivität von DCs, den wichtigsten antigenpräsentierenden Zellen des

Immunsystems (APCs), aktiviert. Im Gegensatz zu Makrophagen sind DCs in der Lage

Antigene über MHC-Klasse-I-Moleküle an naive CD8+-T-Zellen zu präsentieren (Jung

et al, 2002). Unreife DCs, die im peripheren Gewebe patrouillieren, nehmen Antigene

auf und reifen daraufhin zu APCs. Diese wandern aus den infizierten Organen in die

Lymphknoten ein und präsentieren Antigene an naive CD8+-T-Zellen. Diese

differenzieren daraufhin zu antigenspezifischen cytotoxischen CD8+T-Zellen und

lysieren infizierte Körperzellen. Dies führt zur Freisetzung der intrazellulären Listerien

und zur deren Tötung durch aktivierte Makrophagen. Weil DCs kein bedeutendes

Reservoir für Listerien darstellen, findet das Priming von CD8+-T-Zellen über

Kreuzpräsentation exogener Antigene statt (Albert et al, 1998).

Voraussetzung für die Bildung listerienspezifischer CD8+T-Zellen ist die Invasion von

L. monocytogenes ins Cytosol der infizierten Zellen. LLO-defiziente Listerien, die nicht

ins Cytosol der Wirtszellen eindringen können, führen nicht zur Bildung von listerien-

spezifischen CD8+T-Zellen (Berche et al, 1987; Brunt et al, 1990). Ausschließlich im

Cytosol erhalten Listerien-Antigene, die während der Vermehrung des Pathogens

sekretiert werden, Zugang zu dem MHC-Klasse-I-Antigen-Präsentationsweg. Dabei

agiert das Hämolysin LLO als eines der wirksamsten Listerien-Antigene (Berche et al,

1987; Safley et al, 1991). Ein weiteres Antigen, das eine ebenso effektive CD8+-T-Zell-

vermittelte Immunantwort gegen L. monocytogenes auslöst, ist das Autolysin P60 (Sijts

et al, 1997). Die antigenspezifischen cytotoxischen CD8+T-Zellen sind sowohl bei einer

primären als auch bei einer sekundären Infektion mit L. monocytogenes essentiell. Die

Ausbildung einer protektiven Immunität gegen L. monocytogenes erfolgt nur bei einer

Immunisierung mit lebenden Bakterien, nicht mit HKLM (heat-killed Lm) oder LLO-

defizienten Stämmen (von Koenig und Finger, 1982).

1.3. Induktion von Typ-I-Interferon (Typ-I-IFN)

Typ-I-IFN umfasst eine Vielzahl von Interferonen, darunter IFN-β und verschiedene

IFN-α Subtypen. Die vielfältigen antiviralen Mechanismen, die nach deren Bindung an

den interferon alpha and beta receptor (IFNAR) ausgelöst werden, zählen zu der am

besten charakterisierten Immunantwort gegen virale Infektionen (Isaacs und

Lindemann, 1957; Müller et al, 1994; Sadler und Williams, 2008). Neben der

1. Einleitung

6

antiviralen Aktivität wirken Interferone auch antiproliferativ auf Tumorzellen,

immunmodulatorisch und als Signalüberträger zwischen Immunzellen (Trinchieri,

2010).

Typ-I-IFN wird von verschiedenen Zelltypen als Antwort auf virale und bakterielle

Infektionen produziert. Die Produktion von Typ-I-IFN wird nach Detektion von

sogenannten PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) durch PRRs (pattern

recognition receptors) des angeborenen Immunsystems über intrazelluläre Signal-

kaskaden ausgelöst (Abb. 1.2). Hierbei sind sowohl membrangebundene TLRs (Toll-

like receptors) als auch cytosolische PRRs involviert (Meylan und Tschopp, 2006; Kato

et al, 2011).

Abb.1.2: Induktion von Typ-I-IFN nach Detektion bakterieller und viraler Strukturen durch

verschiedene Immunrezeptoren. Die Erkennung von LPS erfolgt durch TLR4 an der Zelloberfläche.

Die Detektion von dsRNA, ssRNA und DNA erfolgt durch TLR3, TLR7/8 und TLR9 im Endosom.

TLR4 und TLR3 nutzen TRIF als Adapterprotein für die Signalübermittlung, TLR7/8 und TLR9 hin-

gegen MyD88. RIG-I und MDA5 erkennen RNA im Cytosol und nutzen IPS-1 als Adapterprotein.

STING ist der Rezeptor für cyklische Dinukleotide und dient gleichzeitig als Adapterprotein. Die Signal-

kaskaden münden in die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren IRF3 und IRF7, die zur Produktion von

Typ-I-IFN führen. (Abbildung angepasst nach Kawai und Akira, 2008)

TLR4, der Lipopolysaccharide (LPS) der äußeren Membran von gram-negativen

Bakterien erkennt, ist in der Cytoplasmamembran lokalisiert. Die in der Membran von

Endosomen verankerten TLR3, TLR7/8 und TLR9 detektieren die von außen

aufgenommenen Nukleinsäuren. Während TLR3 beispielsweise vom Reovirus

abgeleitete dsRNA erkennt, erkennt TLR7/8 ssRNA des Human Immunodeficiency

Virus (HIV). TLR9 hingegen detektiert unmethylierte CpG-DNA-Motive von Bakterien

1. Einleitung

7

und Viren (Perry et al, 2005; Takeuchi, 2009). Für die Signalübermittlung nutzen TLR4

und TLR3 das Adapterprotein TRIF (TIR-domain-containing adaptor protein inducing

IFN-β). Die von plasmazytoiden DCs (pDCs) besonders stark exprimierten TLR7/8 und

TLR9 hingegen nutzen das Adapterprotein MyD88 (myeloid differentiation primary

response protein 88) (Kawai und Akira, 2010).

Zu den cytosolischen Immunrezeptoren, die nach Detektion viraler RNA die Produktion

von Typ-I-IFN auslösen, zählen die Rezeptoren der RLR-Familie (RIG-I-like recep-

tors), RIG-I (retinoic acid-inducible gene-I) und MDA5 (melanoma differentiation-

associated gene 5) (Kato et al, 2006; Kato et al, 2011). Im Gegensatz zu den TLRs, die

nur von bestimmten Zellen des Immunsystems, wie beispielsweise DCs und

Makrophagen, exprimiert werden, kommen diese Rezeptoren im Cytosol der meisten

kernhaltigen Zellen vor (Kato et al, 2006). Diese unterscheiden sich in ihrem RNA-

Erkennungsmuster und detektieren infolgedessen verschiedene RNA-Viren. RIG-I

erkennt 5`-Triphosphat-ssRNA mit einer sogenannten panhandle structure, wie sie

beispielsweise von dem Influenza A Virus (IAV), dem Newcastle Disease Virus (NDV)

und dem Sendaivirus (SeV) generiert wird. MDA5 hingegen erkennt lange dsRNA, die

von Picornaviren, wie beispielsweise dem Encephalomyocarditis Virus (EMCV),

erzeugt wird (Kato et al, 2011; Yoneyama et al, 2015).

RIG-I und MDA5 bestehen aus zwei N-terminalen CARD-Domänen (caspase

activation and recruitment domain), einer zentralen DExD/H box Helikase-Domäne

und einer C-terminalen Domäne (CTD) (Yoneyama et al, 2015). Zwei Studien an RIG-I

haben durch Kristallstrukturanalyse und NMR-Spektroskopie gezeigt, dass nach

Bindung des Liganden durch die CTD die ATPase-Aktivität der Helikase aktiviert wird.

Durch die daraufhin ausgelöste Konformationsänderung werden die ansonsten

„maskierten“ CARD-Domänen, die für die Dimerisierung und Signalübermittlung

verantwortlich sind, exponiert. Nach Dimerisierung von RIG-I Molekülen erfolgt die

Interaktion mit dem an der Mitochondrienmembran lokalisierten Adapterprotein IPS-1

(IFN-β-promoter stimulator 1) (Cui et al, 2008; Takahasi et al, 2008).

Sowohl der TRIF- als auch der IPS-1-abhängige Signalweg führt zur Aktivierung der

Serin/Threonin-Proteinkinase TBK1 (TANK-binding kinase 1). STING (stimulator of

inteferon genes), ein weiterer cytosolischer Immunrezeptor, der nach Bindung von

cyklischen Dinukleotiden die Produktion von Typ-I-IFN auslöst, nutzt ebenfalls TBK1

für die Signalweitergabe. Die Aktivierung von TBK1 führt zur Phosphorylierung und

1. Einleitung

8

Dimerisierung des Transkriptionsfaktors IRF3 (interferon regulatory factor 3), der nach

Translokation in den Zellkern die Initiation der Transkription von Typ-I-IFN induziert.

Der MyD88-abhängige Signalweg in pDCs führt über IRF7 zur Produktion von Typ-I-

IFN. Darüber hinaus erfolgt über Aktivierung des MAPK- (mitogen-activated protein

kinase) und NF-ҡB-Signalwegs (nuclear factor-kappa B) die Produktion von pro-

inflammatorischen Cytokinen (Honda und Taniguchi, 2006; Kawai und Akira, 2010;

Burdette et al, 2011).

1.3.1. Induktion von Typ-I-IFN während einer Infektion mit L. monocytogenes

L. monocytogenes befällt nach einer systemischen Infektion zunächst Milz und Leber

des Wirtes. Hier werden die Bakterien von gewebsständigen Phagocyten aufgenommen.

Es kommt zu einer effizienten Eliminierung des Pathogens durch IFN-γ-aktivierte

Makrophagen. Einige Bakterien sind dennoch in der Lage aus dem Phagosom zu

entkommen und sich im Cytosol der infizierten Zellen zu vermehren. Die Invasion von

L. monocytogenes ins Cytosol führt, neben der Produktion von pro-inflammatorischen

Cytokinen, zur Produktion von IFN-β (Abb. 1.3). Nach einer Infektion der Maus mit L.

monocytogenes sind Makrophagen die wichtigsten Produzenten von IFN-β (Stockinger

et al, 2009). Dabei ist die von L. monocytogenes ausgelöste IFN-β Antwort von

cytosolischen Immunrezeptoren abhängig. LLO-defiziente Listerien, die nicht ins

Cytosol der Wirtszellen eindringen können, führen nicht zur Produktion von IFN-β

(O`Riordan et al, 2002; McCaffrey et al, 2004; Leber et al, 2008). Infolgedessen spielen

membrangebundene TLRs in der IFN-β Induktion im Kontext einer Infektion mit L.

monocytogenes keine wesentliche Rolle. In peritoneale Makrophagen allerdings trägt

TLR2, der durch Bestandteile der Zellwand im Phagosom aktiviert wird, maßgeblich

zur Produktion von IFN-β bei (Aubry et al, 2012).

Die sogenannte späte Antwort (late response), die von cytosolischen Listerien ausgelöst

wird, wird hauptsächlich von IFN-β und die daraufhin aktivierten IRGs (IFN response

genes) dominiert (McCaffrey et al, 2004). Die cytosolische Immunüberwachung dient

der Detektion von virulenten Bakterien, die aus dem Phagosom ins Cytosol der Wirts-

zelle entkommen sind. Hierfür ist eine Reihe von verschiedenen Immunrezeptoren von

Bedeutung. Diese erkennen diverse bakterielle Produkte, die von L. monocytogenes

während der Vermehrung im Cytosol sekretiert werden.

1. Einleitung

9

Abb. 1.3: Detektion einer Infektion mit L. monocytogenes durch verschiedene Immunrezeptoren.

Nach einer Infektion wird Lm zunächst an der Zelloberfläche und im Phagosom durch TLRs erkannt.

Dies führt zu einer MyD88- und NF-ҡB-abhängigen frühen Antwort (early response). Die Invasion ins

Cytosol löst nach Detektion von Lm durch cytosolische Immunrezeptoren die späte Antwort (late

response) aus. Diese wird von IFN-β und die daraufhin aktivierten IRGs dominiert. (Abbildung angepasst

nach Radoshevich und Cossart, 2018)

Eines der wichtigsten Immunrezeptoren für die Detektion von cytosolischen Listerien

ist das am endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisierte Protein STING, das als

direkter Sensor für cyklische Dinukleotide und gleichzeitig als Adapterprotein in der

Signalübermittlung dient. Die von L. monocytogenes über MDRs (multi-drug efflux

pumps) ins Cytosol sekretierten sekundären Botenstoffe, c-di-AMP und c-di-GMP,

führen über die Aktivierung von STING zur Produktion von IFN-β (Crimmins et al,

2008; Woodward et al, 2010; Burdette et al, 2011). Die durch Listerien-DNA im

Cytosol der infizierten Zellen ausgelöste IFN-β Anwort ist ebenfalls von dem

Immunrezeptor STING abhängig (Stetson et al, 2006; Leber et al, 2008; Hansen et al,

2014). Der eigentliche DNA-Rezeptor cGAS (cGAMP synthase) synthetisiert nach

Bindung von DNA den sekundären Botenstoff cyklisches GMP-AMP (cGAMP), der

letztendlich zur Aktivierung von STING führt (Sun et al, 2013; Wu et al, 2013).

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4009421/#B149

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4009421/#B15

1. Einleitung

10

Weitere Immunrezeptoren, die eine essentielle Rolle in der Detektion von virulenten

Listerien im Cytosol spielen, sind RIG-I und MDA5. Diese detektieren die von L.

monocytogenes sekretierte RNA und führen daraufhin zur Produktion von IFN-β

(Abdullah et al, 2012). Vor allem in Nicht-Immunzellen, wie beispielsweise Epithel-

zellen, die keine funktionsfähige STING-Signalübermittlung besitzen, spielt RIG-I eine

wesentliche Rolle in der IFN-β Produktion während einer Infektion mit L. monocyto-

genes (Hagmann et al, 2013). Die Einbeziehung verschiedener Liganden und deren

individuelle Erkennung durch die entsprechenden Immunrezeptoren stellt ein

Mechanismus dar, der die Identifizierung von virulenten Listerien im Cytosol

sicherstellt.

In der Signalübermittlung, die nach Detektion von cytosolischen Listerien zur

Produktion von IFN-β führt, sind die Serin/Threonin-Proteinkinase TBK1 und der

Transkriptionsfaktor IRF3 involviert. Die Aktivierung von TBK1 durch die Adapter-

proteine STING und IPS-1 führt über IRF3 zur Produktion von IFN-β (O`Connell et al,

2004; O`Connell et al, 2005; Leber et al, 2008; McWhirter et al, 2009).

Anders als bei viralen Infektionen hat die IFN-β Antwort, die durch bakterielle

Infektionen ausgelöst wird, unterschiedliche Auswirkungen auf den Wirt. Diese erhöht

die Anfälligkeit des Wirtes bei einer Infektion mit L. monocytogenes und fördert dessen

Vermehrung, wobei verschiedene Mechanismen eine Rolle spielen. IFN-β induziert

nach Bindung an den entsprechenden Rezeptor (IFNAR) die Expression einer Vielzahl

von Genen mit antiviraler und antiproliferativer Wirkung, darunter auch die

Proteinkinase R (PKR). Diese spielt bei der IFN-β-vermittelten Hemmung der

Proteinsynthese eine entscheidende Rolle (Williams, 2001). Im Zuge der Translations-

hemmung kommt es zu einer Cap-unabhängigen Translation des pro-apoptotischen

Transkriptionsfaktors ATF4 (activating transcription factor 4). Die daraufhin

ausgelöste integrierte Stressantwort, ISR (integrated stress resonse), führt zur Apoptose

der betroffenen Zellen (Valderrama et al, 2017). So haben beispielsweise ältere Studien

eine massive Apoptose von Makrophagen und Lymphozyten in den mit Listerien

infizierten Mäusen gezeigt (Carrero et al, 2004; Stockinger et al, 2002). Infolgedessen

sind IFNAR-defiziente Mäuse deutlich resistenter gegenüber einer Listerien-Infektion

als Wildtyptiere. Diese weisen in den primären Zielorganen, Milz und Leber, eine

deutlich reduzierte Bakterienlast auf (Carrero et al, 2004; O`Connell et al, 2004;

Auerbuch et al, 2004). Darüber hinaus wird die Immunantwort des Wirtes durch das

1. Einleitung

11

anti-inflammatorische Cytokin IL-10, das von Makrophagen nach Phagocytose der

apoptotischen Immunzellen produziert wird, gedrosselt (Carrero et al, 2006). Zudem

unterdrückt die von L. monocytogenes ausgelöste IFN-β Antwort die Aktivierung von

Phagocyten durch eine reduzierte Expression von IFN-γ, eines der wichtigsten Cytokine

in der frühen Phase einer Infektion mit diesem Pathogen (Rayamajhi et al, 2010).

1.4. Produktion von Vesikeln (OMVs bzw. MVs) durch Bakterien

Die Produktion von Vesikeln ist in allen bislang auf diesen Prozess hin untersuchten

Organismen nachgewiesen worden. Dies ist daher ein universeller Prozess, der in

Prokaryoten, Eukaryoten und Archaeen während des Wachstums stattfindet. Die

Produktion von Vesikeln durch Bakterien ist, bezüglich deren Anzahl und Inhalt, von

äußeren Faktoren, wie beispielsweise Temperatur, Antibiotikaeinwirkung und

Wachstumsmedium, abhängig (McBroom und Kuehn, 2007; Kadurugamuwa und

Beveridge, 1995; Sidhu et al, 2008).

In gram-negative Bakterien entstehen Vesikel durch Knospung der äußeren Membran

und werden daher als OMVs (outer membrane vesicles) bezeichnet (Abb. 1.4A und

1.4C). Diese enthalten verschiedene Proteine und Lipide der äußeren Membran und des

Periplasmas (Kadurugamuwa und Beveridge, 1995; Kulp und Kuehn, 2010;

Schwechheimer und Kuehn, 2015; Lappann et al, 2013; Roier et al, 2016). Darüber

hinaus wird für eine OMVs-Subpopulation ein weiterer Biogenese-Mechanismus

vermutet, in dem auch die Cytoplasmamembran involviert ist (Abb. 1.4B).

Entscheidend für deren Freisetzung sind kontrollierte Brüche in der Peptido-

glykanschicht durch die gezielte Einwirkung von Autolysinen (Kadurugamuwa und

Beveridge, 1995). Dieses vorgeschlagene Modell wurde Jahre später durch

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) von Shewanella vesiculosa bestätigt (Abb.

1.4D). Infolgedessen sind diese OMVs von einer doppelten Membran umgeben und

enthalten darüber hinaus cytosolische Proteine, RNA und DNA (Pérez-Cruz et al,

2013).

1. Einleitung

12

(A) (B)

(C) (D)

Abb. 1.4: Produktion von OMVs durch gram-negative Bakterien. A und B: Vorgeschlagener Mecha-

nismus für die OMVs-Biogenese von Kadurugamuwa und Beveridge, 1995. Demnach entstehen OMVs

durch Knospung der äußeren Membran, wodurch one-bilayer OMVs produziert werden (A). Durch

temporäre und gezielte Brüche in der Zellwand entstehen durch Knospung der darunter liegenden

Cytoplasmamembran double-bilayer OMVs (B). C und D: TEM-Aufnahmen von S. vesiculosa zeigen die

Produktion dieser 2 unterschiedlichen OMVs. (Pérez-Cruz et al, 2013)

Der genaue Biogenese-Mechanismus von Vesikeln, die von gram-positiven Bakterien

produziert und als MVs (membrane vesicles) bezeichnet werden, ist bislang nicht

bekannt. Lange Zeit hat man angenommen, dass gram-positive Bakterien aufgrund der

dicken Peptidoglykanschicht, die eine physikalische Barriere für deren Freisetzung

darstellt, keine MVs produzieren. Inzwischen belegen zahlreiche Studien die Produktion

von MVs durch gram-positive Bakterien, wie beispielsweise Staphylococcus aureus,

Bacillus anthracis, Streptococcus pneumoniae und Mycobacterium tuberculosis (Lee et

al, 2009; Rivera et al, 2010; Olaya-Abril et al, 2014; Lee et al, 2015).

Von besonderem Interesse sind Vesikel, die von pathogenen Bakterien produziert

werden. Zahlreiche Studien belegen die Anwesenheit von Virulenzfaktoren in den

Vesikeln und deren Mitwirkung in der Pathogenese während einer Infektion. Die

Vesikel verursachen, ähnlich wie bakterielle Infektionen, Entzündungen und schwere

1. Einleitung

13

pathologische Veränderungen von Gewebe, wie beispielsweise Lungenschäden bis hin

zum Zelltod (Fiocca et al, 1999; Lee et al, 2012; Gurung et al, 2011; Thay et al, 2013).

Die Sekretion von Virulenzfaktoren über die Produktion von Vesikeln stellt einen

zusätzlichen Sekretionsmechanismus dar, der von pathogenen Bakterien genutzt wird.

Helicobacter pylori beispielsweise sekretiert ein Teil (25%) des Exotoxins VacA über

OMVs (Ricci et al, 2005). Die Aminopeptidase PaAP, eines der Hauptproteine in den

OMVs, die von Pseudomonas aeruginosa (cystische Fibrose-Isolate) produziert werden,

fördert zudem deren Assoziation und Aufnahme durch Lungenepithelzellen (Bauman

und Kuehn, 2006; Bauman und Kuehn, 2009). Ähnlich vermittelt das hitzelabile Entero-

toxin LT, das von ETEC (Enterotoxigenic Escherichia coli) hauptsächlich über OMVs

sekretiert wird (mehr als 95%), die Anheftung der OMVs an Wirtszellen (Kesty et al,

2004). Vesikel fungieren daher als Transportvehikel, die speziell gerichtet die

Aufnahme von Virulenzfaktoren durch Wirtszellen vermitteln. Darüber hinaus bietet die

Sekretion von Virulenzfaktoren über Vesikel weitere Vorteile. Hierdurch können

Virulenzfaktoren gleichzeitig und über lange Strecken hinweg transportiert werden. Des

Weiteren sind diese vor Abbau durch Proteasen im extrazellulären Milieu geschützt.

Vesikel nutzen verschiedene Mechanismen für deren Internalisierung in Wirtszellen.

Hierzu zählt die Fusion von OMVs, die von P. aeruginosa produziert werden, mit der

Plasmamembran von Wirtszellen (Bomberger et al, 2009). Für Shigella flexneri-OMVs

wurde gezeigt, dass diese durch Phagocytose in Wirtszellen gelangen (Kadurugamuwa

und Beveridge, 1998). OMVs, die von Porphyromonas gingivalis und H. pylori

produziert werden, gelangen über Endocytose in Wirtszellen (Furuta et al, 2009; Parker

et al, 2010).

Aufgrund der komplexen Zusammensetzung aus verschiedenen biologisch aktiven

Biomolekülen stellen Vesikel eine Quelle für Antigene dar. Eines der Hauptbestandteile

von OMVs, die von gram-negativen Bakterien produziert werden, ist LPS der äußeren

Membran. Durch die Internalisierung von OMVs gelangt LPS in die Wirtszellen und

löst die Produktion von IL-1β und IL-18 durch Aktivierung von Caspase-11 aus (Vanaja

et al, 2016). Durch die Produktion von Vesikeln können selbst nicht-intrazelluläre

Pathogene die Aktivierung des Inflammasoms und weiterer cytosolischer Immun-

rezeptoren auslösen. Peptidoglykan beispielsweise wird über Vesikel in Wirtszellen

transportiert und löst NOD-abhängig (nucleotide-binding and oligomerization domain)

die Produktion von IL-8 aus (Kaparakis et al, 2010). Weitere pro-inflammatorische

1. Einleitung

14

Cytokine, wie beispielsweise TNF-α and IL-12, werden von Makrophagen und DCs

nach deren Aktivierung durch OMVs, die von Salmonella typhimurium produziert

werden, sekretiert. Darüber hinaus werden diese Immunzellen zu einer gesteigerten

Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen stimuliert (Alaniz et al, 2007). Als APCs

sind diese mit den adaptiven T- und B-Lymphozyten verlinkt, woraus protektive

Immunantworten resultieren. Zahlreiche Studien haben im Mausmodell gezeigt, dass

eine Immunisierung mit Vesikeln, die von verschiedenen pathogenen Bakterien

produziert werden, vor der anschließenden Infektion schützt (Schild et al, 2008; Avila-

Calderón et al, 2012; Olaya-Abril et al, 2014; Alaniz et al, 2007). Aufgrund der

immunogenen Eigenschaften werden Vesikel zur Formulierung von Vakzinen

eingesetzt. Ein auf OMVs-basierendes Vakzin gegen Neisseria meningitidis der Gruppe

B wird beispielsweise derzeit erfolgreich eingesetzt (Uli et al, 2006; Holst et al, 2009;

Masforrol et al, 2017). Die Nutzung von Vesikeln für die Antigen-Präsentation bietet

den Vorteil, dass oberflächenassoziierte Antigene, wie beispielsweise das immun-

dominante Antigen Porin PorA in den von N. meningitidis produzierten OMVs, deren

native Struktur behalten. Daraufhin wird eine robuste Antikörperproduktion ausgelöst,

die vor invasiven Meningokokken-Erkrankungen schützt.

Ein weiterer bedeutsamer Aspekt der Produktion von Vesikeln durch Bakterien ist der

Transfer von Antibiotikaresistenzen. Beta-Laktamase positive Moraxella catarrhalis-

Stämme beispielsweise vermitteln Amoxicillin-Resistenz durch den Transfer von

OMVs auf andere Bakterienspezies mit denen diese häufig in Mischinfektionen

auftreten (Schaar et al, 2011). Der Transfer von Resistenzgenen über OMVs wurde

anhand eines Carbapenemase-Resistenzgens innerhalb verschiedener Acinetobacter

baumannii-Stämmen gezeigt (Rumbo et al, 2011). Weitere Studien belegen den

horizontalen Transfer von DNA über Vesikel zwischen Bakterien (Yaron et al, 2000;

Renelli et al, 2004; Klieve et al, 2005; Fulsundar et al, 2014).

1.5. Sekretion von RNA durch Bakterien

Die Sekretion von RNA durch Bakterien wurde erstmal 1989 im Zusammenhang mit

OMVs, die von Neisseria gonorrhoeae produziert werden, gezeigt (Dorward et al,

1989). Erst Jahre nach dieser Entdeckung rückte die von Bakterien sekretierte RNA in

den Fokus wissenschaftlichen Interesses. In jüngster Zeit beschreiben zahlreiche

Studien die Anwesenheit von RNA in den Vesikeln, die von verschiedenen Bakterien-

1. Einleitung

15

spezies produziert werden (Biller et al, 2014; Sjöström et al, 2015; Ghosal et al, 2015;

Resch et al, 2016; Koeppen et al, 2016; Blenkiron et al, 2016). Deren umfassende

Untersuchung über RNA-Sequenzierung hat gezeigt, dass es sich hierbei um eine

komplexe Zusammensetzung aus RNAs verschiedener Größe und zellulärer Funktion

handelt. Die von UPEC (UroPathogenic E. coli) über OMVs sekretierte RNA beispiels-

weise beinhaltet sämtliche zelluläre RNA-Spezies, rRNA, tRNA, mRNA und sRNA.

Diese Reihenfolge entspricht der Häufigkeit der identifizierten RNA-Spezies in den

OMVs (Blenkiron et al, 2016). Eine ähnliche Zusammensetzung ergab die Unter-

suchung der RNA in den MVs, die von Streptococcus pyogenes produziert werden

(Resch et al, 2016).

Von entscheidender Bedeutung ist die Feststellung, dass sich die über Vesikel

sekretierte RNA im Auftreten und in der Häufigkeit bestimmter RNA-Spezies von dem

intrazellulären RNA-Profil unterscheidet. Daher wird ein selektiver Export von RNA

durch Bakterien vermutet. Ähnliche Beobachtungen wurden über die extrazelluläre

RNA, die von eukaryotischen Zellen zum Teil über Exosomen sekretiert wird, berichtet

(Valadi et al, 2007; Nolte-'t Hoen et al, 2012; Li et al, 2013). Der Mechanismus hinter

der Verpackung von RNA in den Vesikeln ist bislang nicht bekannt. Deren Funktion

wird in der interzellulären Kommunikation vermutet, in der die RNA Spezies- und

kingdom-übergreifend eine regulatorische Rolle einnimmt. Dies wird durch Studien

begründet, die den Transport und die Lieferung von RNA über Vesikel in Wirtszellen

gezeigt haben (Blenkiron et al, 2016). Darüber hinaus hat eine weitere Studie gezeigt,

dass P. aeruginosa die Immunantwort des Wirtes herunterreguliert, indem es kleine

nicht-kodierende RNAs über OMVs in Wirtszellen transportiert (Koeppen et al, 2016).

Hierfür verantwortlich wurde ein tRNA-Fragment identifiziert, das durch Inhibition der

Expression von MAPK-Kinasen zu einer Reduktion der IL-8 Produktion führt.

Zahlreiche Hinweise deuten auf eine Einflussnahme pathogener Bakterien auf ihre

Wirtszellen über sekretierte RNA hin. So wurden beispielsweise zahlreiche RNA-

Moleküle mit Charakteristika von miRNA-Vorläufermolekülen in den Genomen von

Krankheitserregern durch computerbasierende Vorhersagen identifiziert. Als mögliche

targets der daraus resultierenden miRNAs wurden Genprodukte, die in verschiedenen

Erkrankungen involviert sind, ausgemacht (Shmaryahu et al, 2014). Ein weiterer

Hinweis auf einen wahrscheinlichen RNAi-Mechanismus (RNA interference) durch

bakterielle RNAs kam von einer Studie aus dem gleichen Jahr. Nach Infektion von

1. Einleitung

16

humanen Zelllinien mit verschiedenen pathogenen Bakterien wurden zahlreiche

bakterielle RNAs, die mit dem RISC-Komplex (RNA-induced silencing complex)

assoziiert waren, identifiziert (Furuse et al, 2014). Eine Manipulation der Genexpression

durch bakterielle RNA während einer Infektion setzt voraus, dass diese unbeschadet in

die Wirtszellen gelangt. Vesikel als Transportvehikel für RNA zu nutzen, bietet Schutz

vor Abbau durch allgegenwärtige RNasen und ermöglicht zudem deren Transport über

lange Distanzen (Bomberger et al, 2009).

Zahlreiche Studien aus der Eukaryoten-Forschung haben bereits Jahre zuvor gezeigt,

dass der Großteil der extrazellulären RNA (bis zu 90%) in einer freien, nicht

Exosomen-assoziierten Form sekretiert wird (Wang et al, 2010; Turchinovich et al,

2011; Arroyo et al, 2011). Analog zu den Eukaryoten wird RNA auch von den

Bakterien in einer freien, nicht Vesikel-assoziierten Form sekretiert. Im Jahr 2015

wurde diese RNA-Fraktion, die von E. coli sekretiert wird, erstmals umfassend

untersucht (Ghosal et al, 2015). Diese Untersuchung hat gezeigt, dass die freie, nicht

Vesikel-assoziierte RNA eine vergleichbare, komplexe Mischung verschiedener RNA-

Spezies besitzt wie die Vesikel-assoziierte RNA. Der funktionelle Unterschied

zwischen den beiden sekretierten RNA-Fraktionen ist nicht bekannt. Dies gilt auch für

den Sekretionsmechanismus der freien, nicht Vesikel-assoziierten RNA. Für L. mono-

cytogenes wurde gezeigt, dass die SecA2-ATPase der Sec-Translokase, die einen

generellen Sekretionsweg für Proteine darstellt, teilweise an der RNA-Sekretion

beteiligt ist. Die Deletion dieses Proteins resultiert in einer reduzierten Sekretion von

RNA ins extrazelluläre Milieu (Desvaux und Hébraud, 2006; Abdullah et al, 2012).

Die Sekretion von RNA durch Bakterien hat einen essentiellen immunologischen

Aspekt während einer Infektion. Die Detektion von bakterieller RNA signalisiert dem

Immunsystem die Lebendigkeit und damit das Ausmaß der infektiösen Gefahr. Die

RNA gehört zur Klasse der vita-PAMPs (viability-associated PAMPs) und dient als

Kriterium für das Immunsystem, um lebende von toten Bakterien unterscheiden zu

können (Sander et al, 2011). Die sekretierte RNA spielt beispielsweise eine essentielle

Rolle in der Detektion virulenter Listerien, die ins Cytosol der infizierten Zellen

gelangen (Abdullah et al, 2012). Die Translokation von RNA ins Cytosol der

Wirtszellen während einer Infektion mit L. monocytogenes wurde anhand einer

Fluoreszenzmarkierung gezeigt. Daraufhin führt die Detektion der RNA durch den

Immunrezeptor RIG-I zur Produktion von Typ-I-IFN (Hagmann et al, 2013). Die

1. Einleitung

17

während einer Infektionen mit S. pyogenes durch RNA ausgelöste Typ-I-IFN Antwort

trägt maßgeblich zur Ausbildung einer protektiven Immunantwort gegen dieses

Pathogen bei (Gratz et al, 2011). Darüber hinaus löst die bakterielle RNA die

Produktion von pro-inflammatorischen Cytokinen, wie beispielsweise IL-12, aus (Koski

et al, 2004). Hierzu zählen des Weiteren IL-1β und IL-18, die nach Aktivierung des

Inflammasoms durch RNA produziert werden (Kanneganti et al, 2006; Sha et al, 2014).

Die bakterielle RNA spielt eine essentielle Rolle in der Bekämpfung von Pathogenen

durch Aktivierung des Immunsystems über Typ-I-IFN und pro-inflammatorische

Cytokine.

1.6. Zielsetzung dieser Arbeit

Ziel dieser Arbeit war es die von L. monocytogenes sekretierte RNA aus den Über-

ständen von Bakterienkulturen zu isolieren und deren Zusammensetzung über

Sequenzierung zu identifizieren. Anschließend sollte das Potential einzelner sekretierter

RNAs eine IFN-β Antwort in Wirtszellen auszulösen, untersucht werden. Dies sollte

durch Transfektion der hergestellten RNAs in Epithelzellen und BMDMs (bone

marrow-derived macrophages) durchgeführt werden. Hierbei war es von besonderem

Interesse herauszufinden, ob Unterschiede in der IFN-β Induktion durch die einzelnen

RNAs festzustellen sind. Darüber hinaus sollte untersucht werden welcher cytosolischer

Rezeptor der RLR-Familie für die Detektion der einzelnen RNAs und der daraufhin

ausgelösten IFN-β Antwort verantwortlich ist. Dies sollte in Zelllinien, die eine

Defizienz des jeweiligen Rezeptors aufweisen, untersucht werden.

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es die von L. monocytogenes produzierten MVs aus

den Überständen von Bakterienkulturen zu isolieren und zu charakterisieren, bezüglich

Größe, Proteinkonzentration und Anzahl. Darüber hinaus sollte über Massen-

spektrometrie der Proteininhalt der MVs identifiziert werden. Es galt herauszufinden

welche zelluläre Funktion und Lokalisation die Proteine in den MVs, die von L.

monocytogenes produziert werden, haben. Des Weiteren sollten die MVs auf die Anwe-

senheit von RNA untersucht werden. Es galt herauszufinden welche RNA-Spezies über

die Produktion von MVs exportiert werden. Anschließend sollte deren IFN-β Induk-

tionspotential durch Transfektion in verschiedenen Zelllinien untersucht werden.

2. Material und Methoden

18


2.1. Bakterienstämme und Virusstamm

Bakterienstämme Herkunft

Escherichia coli DH10β Invitrogen

Escherichia coli TOP10 Invitrogen

Listeria monocytogens EGD-e (Lm) Glaser et al, 2001

Lm-pERL3-rli32 Diese Arbeit

Lm-pERL3-ssrS Diese Arbeit

2.2. Zelllinien

2.3. Antibiotika-Stammlösungen

Ampicillin: Stock-Konzentration: 100 mg/ml. Gelöst in 70% EtOH.

Erythromycin: Stock-Konzentration: 30 mg/ml. Gelöst in 50% EtOH.

Penicillin: Stock-Konzentration: 10 mg/ml. Gelöst in H2O. Anschließend steril-filtriert.

Die Stocklösungen wurden bei -20°C gelagert.

Virusstamm Ursprung Wirt Herkunft

Influenza A Virus

(H1N1)

Puerto Rico

(1934)

Mensch Medizinische Virologie

(JLU Gießen)

Zelllinie Name Spezies Herkunft

HEK293 human embryonic kidney cell Mensch Niere

MDCK-II Madin Darby canine kidney cells Hund Niere

PtK rat-kangaroo epithelial kidney cells Rattenkänguru Niere

BMDMs bone marrow-derived macrophages Maus Knochenmark

L929 mouse fibroblast L929 cells Maus Fibroblasten


19

2.4. Antikörper

Primäre Antikörper

Sekundäre Antikörper

2.5. Molekulargewichtsmarker

A B C D

Abb. 2.1: DNA-, RNA- und Protein-Größenstandards. A: GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder

(Thermo Scientific). B: 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). C: RNA Century Marker-Plus

(ThermoFisher Scientific). D: Precision Plus Protein Standard (Bio-Rad).

Name Spezies Hersteller

anti-LLO Maus Eigene Herstellung

anti-InlB Maus Eigene Herstellung

anti-P60 Maus Eigene Herstellung

anti-β-Aktin Hase Cell signaling

anti-IAV-Nukleoprotein Maus S. Ludwig, Münster

anti-mouse IgG-HRP Ziege Santa Cruz B

anti-rabbit IgG-HRP Ziege Santa Cruz B


20

2.6. Vektoren

2.6.1. Plasmidkarte des pCR2.1-TOPO-Vektors

Abb. 2.2: Plasmidkarte des pCR2.1-TOPO-Vektors (Addgene Vector Database)


21

2.6.2. Multiple Cloning Site (MCS) des pCR2.1-TOPO-Vektors

Abb. 2.3: Multiple Cloning Site (MCS) des pCR2.1-TOPO-Vektors (Invitrogen)


22

2.6.3. Plasmidkarte des pERL3-Vektors

Abb. 2.4: Plasmidkarte des pERL3-Vektors

2.7. Oligonukleotide (Primer)

Die Primer für die RT-PCR wurden bei Qiagen bestellt. Die Primer für die PCR wurden

selbst entworfen und bei Eurofins Genomics bestellt.

2.7.1. Primer für die Real-Time PCR (RT-PCR)

Gen Name Spezies

IFN-β Ifnb1_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00249662) Maus

IFN-α4 Ifna4_2_SG QuantiTect Primer Assay (QT01774353) Maus

Rplp Rplp0_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00249375) Maus

IFN-β IFNB1_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00203763) Mensch

PPIA PPIA_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00052311) Mensch


23

2.7.2. Primer für die Herstellung der 25 RNA-Kandidaten

Die Sequenz des Promotors der T7-RNA-Polymerase ist unterstrichen.

Primer Sequenz (5`-3`)

rli32_for TAATACGACTCACTATAGGTGTGGAGAGCTTTCATTTTT

rli32_rev AAAAAAATAACCGCACCAGG

rli47_for TAATACGACTCACTATAGGTGCGAATGAAACAAACTTGG

rli47_rev CTCAAGATATTCTAACTTAC

rli48_for TAATACGACTCACTATAGGAAAGGCATGTTATAATTTAT

rli48_rev CACTCTTGCAGTAGCGCTGA

rli50_for TAATACGACTCACTATAGGTTTCTTATGCTATAATAAATTT

rli50_rev ACATGACTCCCTGAGCAGTAG

rli51_for TAATACGACTCACTATAGGATATCCCAAAGTTTAAGCCAC

rli51_rev AAACTAAGTTTAAGCCACCT

rli56_for TAATACGACTCACTATAGGGAGCACAAAGACGTGTGGAA

rli56_rev ATAGAAAGAGCCCCTTAAAA

rli60_for TAATACGACTCACTATAGGATTTTTTTCAAAAATGTGCGAC

rli60_rev TTTTCGATGCTTGAAAACTCG

rli62_for TAATACGACTCACTATAGGTGTGATTGGTTATGATAATT

rli62_rev ACGGAGCATAATAAAATAAGG

rli87_for TAATACGACTCACTATAGGAAACACTATAATAATTGAGG

rli87_rev TCTAGACCATTTATCGGAAAG

rli90_for TAATACGACTCACTATAGGAGTAAAAAGAGAGACAATTG

rli90_rev TTATTGTATAGAAAAGCACG

rli98_for TAATACGACTCACTATAGGGAAGGATGTTTTAGAGGAAA

rli98_rev GTGAAAGGCATGTTATAATT

rli99_for TAATACGACTCACTATAGGTTCGGATTTAAGGTATAATT

rli99_rev ATTTAGAGGAATTAGAGCGT


24

rli100_for TAATACGACTCACTATAGGAAAAATCAGAATTCATAGTAC

rli100_rev GCTGGTGGCTAATAAGGGACT

rli105_for TAATACGACTCACTATAGGCAAGACTGTTAGAATAGGGA

rli105_rev TTTCAAGACTATTAAACTAGC

rli108_for TAATACGACTCACTATAGGGCTATCATTAGTAGTATTTT

rli108_rev TTAAAAGTAAGGGAGCGCTG

rli111_for TAATACGACTCACTATAGGGCTCATTTCTAAGGATGACT

rli111_rev TGGGCTGTATGAAAAAACATC

rli114_for TAATACGACTCACTATAGGCATATGGTGGTACTATATCC

rli114_rev ATATCAGCCAAAAAACTAATA

rliG_for TAATACGACTCACTATAGGGATGACGACACTTCTGTTCA

rliG_rev CAACAGATGGAAAGGGCTAT

LhrA_for TAATACGACTCACTATAGGGAACAATAGTAAAATAAGTT

LhrA_rev CATTTCCAGCGTTGCCATCA

rnpB_for TAATACGACTCACTATAGGTTCCGGCAGAAATGCTCGGA

rnpB_rev AAAAAGCTGTTTTAAGAGGG

SRP_for TAATACGACTCACTATAGGTTTATTTGGCATTTAATTAT

SRP_rev AGCAAAATAGTCTTTTATAT

ssrA_for TAATACGACTCACTATAGGTTTTTCCTGTATAATAACTA

ssrA_rev GTTTTCTTGACTCCATCGTT

ssrS_for TAATACGACTCACTATAGGAGAAAAGAAACCCTAATGTA

ssrS_rev CAAAAAAGAAACCCCAATCG

lmot11_for TAATACGACTCACTATAGGGGACAGACTCGAAATCTGTT

lmot11_rev TCTACGGAGAAACGGGGATT

lmot67_for TAATACGACTCACTATAGGAGTATCACCTTGACATGGT

lmot67_rev AAAGGGATGCTTTTTTGATAAATG


25

2.7.3. Primer für die Herstellung der rli32-Motive

Die Sequenz des Promotors der T7-RNA-Polymerase ist unterstrichen.

Die Einzelstränge der DNA-templates für die Motive 1 und 3 wurden bei Eurofins

Genomics bestellt. In einem weiteren Schritt erfolgte das annealing der ssDNA zur

dsDNA. Die Sequenz des Promotors der T7-RNA-Polymerase ist unterstrichen.

2.7.4. Primer für die Herstellung von Lm-pERL3-rli32

Die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme und die überstehenden Sequenzen für die

Fusion von hly-Promotor und hly-Terminator an rli32 sind unterstrichen.

Primer Sequenz (5`-3`)

Motiv 2_for TAATACGACTCACTATAGGAATAATGTTAGAGCAATAA

Motiv 2_rev AATAATATTAAAGCGAGCCA

ssDNA Sequenz (5`-3`)

Motiv 1_for TAATACGACTCACTATAGGGCTTTCATTTTTCCCAAGAGAA

AGC

Motiv 1_rev GCTTTCTCTTGGGAAAAATGAAAGCCCTATAGTGAGTCGT

ATTA

Motiv 3_for TAATACGACTCACTATAGGCCTAATACTCCCTTAACCGCAT

CCCCCTGGTGCGGTTATTTTTTT

Motiv 3_rev AAAAAAATAACCGCACCAGGGGGATGCGGTTAAGGGAGT

ATTAGGCCTATAGTGAGTCGTATTA

Primer Sequenz (5`-3`) Restriktionsenzym

hly-p_for GCGCGTCGACGTGACTTTTATGTTGAGGCA Sal I

hly-p_rev GCTCTCCACAGCTTGCTTTATAGCTTTAT

rli32_for TAAAGCAAGCTGTGGAGAGCTTTCATTTTT

rli32_rev ACTTTTACAAAAAAAAATAACCGCACCAGG

hly-t_for TTATTTTTTTTTGTAAAAGTAATAAAAAATT

hly-t_rev GCGCCCCGGGGCTTATATTATATGGATAAA Xma I


26

2.7.5. Primer für die Herstellung von Lm-pERL3-ssrS

Die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme und die überstehenden Sequenzen für die

Fusion von hly-Promotor und hly-Terminator an ssrS sind unterstrichen.

2.8. Chemikalien

Roth: NaCl, Agarose, Borsäure, Harnstoff, Tris, Glycin, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate),

Roti-Phenol/Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1, pH = 4,5-5,0), Roti-Aqua-Phenol,

Roti-Chloroform, Ficoll 400, Ampicillin, KH2PO4, CaCl2 × 2 H2O, Xylencyanol,

Deionisiertes Formamid, Saccharose, Ethidiumbromid, DTT (Dithiothreitol)

SIGMA ALDRICH: Ethanol, 2-Propanol, β-Mercaptoethanol, Penicillin, Erythromycin,

MgSO4 × 7 H2O, Riboflavin, Thiamin, L-Arginin, L-Leucin, L-Isoleucin, L-Methionin,

L-Valin, L-Cystein, L-Glutamin, BSA (Bovine Serum Albumin), PMSF (Phenylmethyl-

sulfonyl Fluoride), Mutanolysin, Na-Deoxycholat

Merck: DMSO (Dimethylsulfoxid), Na2HPO4, NaH2PO4 × H2O, NaOAc, Glukose,

Essigsäure, MgCl2 × 6 H2O, MnCl2 × 4 H2O, KAc, Glycerin, APS (Ammonium-

persulfat), Eisencitrat

SERVA: Tween 20, Triton X-100, HEPES (Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonsäure),

EDTA (Ethylendiamintetraacetat), Bromphenolblau

GERBU: Coomassie Brilliant Blue R

VWR: Lysozym, Methanol

BD: BHI (Brain Heart Infusion), Trypton, Hefeextrakt, Agar

Primer Sequenz (5`-3`) Restriktionsenzym

hly-p_for GCGCGTCGACGTGACTTTTATGTTGAGGCA Sal I

hly-p_rev TTTCTTTTCTGCTTGCTTTATAGCTTTAT

ssrS_for TAAAGCAAGCAGAAAAGAAACCCTAATGTA

ssrS_rev ACTTTTACAACAAAAAAGAAACCCCAATCG

hly-t_for TTCTTTTTTGTTGTAAAAGTAATAAAAAATT

hly-t_rev GCGCGGATCCGCTTATATTATATGGATAAA BamH I


27

2.9. Kits, Enzyme, gebrauchsfertige Lösungen und Chemikalien

Name Hersteller

Taq-DNA-Polymerase Kit Invitrogen

dNTP-Set (100 mM) ThermoFisher Scientific

high fidelity DNA-Polymerase ThermoFisher Scientific

M-MLV Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific

RNA 5`-Polyphosphatase Epicenter

QIAquick PCR Purification Kit Qiagen

GeneJET Gel Extraction Kit Thermo Scientific

QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen

TOPO TA Cloning Kit Invitrogen

FastDigest Sal I, Xma I und BamH I ThermoFisher Scientific

T4 DNA Ligation Kit ThermoFisher Scientific

Lipofectamine 2000 Invitrogen

miRNeasy Mini Kit Qiagen

RNase-free DNase-Kit Qiagen

RNAprotect Bacteria Reagent Qiagen

Agencourt AMPure XP Kit Beckman Coulter Genomics

SUPERase In, RNase Inhibitor ThermoFisher Scientific

MiSeq Reagent Kit V2 Illumina

Proteinase K Solution ThermoFisher Scientific

in vivo-jetPEI Polyplus transfection

Qubit RNA BR Assay Kit (20-1000 ng) Invitrogen

Qubit RNA HS Assay Kit (5-100 ng) Invitrogen

Qubit dsDNA HS Assay Kit (0,2-100 ng) Invitrogen

SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen

Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent Biotechnologies

Agilent Small RNA Kit Agilent Biotechnologies


28

2.10. Medien, Puffer und Enzyme für die Zellkultur

ThermoFisher Scientific: Opti-MEM Reduced Serum Medium, RPMI 1640 Medium

(ATCC modification), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), MEM (Minimum

Essential Medium)

Merck: FKS (Fötales Kälberserum), PBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline), NEA

(Nicht-essenzielle Aminosäuren), Trypsin

2.11. Medien für die Anzucht von Bakterien

Herstellung von Brain Heart Infusion-Medium (BHI-Medium)

Für die Herstellung von BHI-Medium wurden 37 g BHI in 1 L H2O gelöst. Anschlie-

ßend wurde das Medium autoklaviert. Für die Herstellung von BHI-Agarplatten wurden

dem Medium 15 g Agar/L zugesetzt.

High sensitivity DNA Kit Agilent Biotechnologies

RNaseOut Invitrogen

QuantiTect SYBR Green PCR Kit Qiagen

RNase, DNase-free Roche

T7-RNA-Polymerase NEB

rNTP-Set (100 mM) GE Healthcare

DNase I, RNase-free ThermoFisher Scientific

Alkaline Phosphatase, Calf intestinal (CIAP) NEB

ECL Plus Western Blotting Detection Reagent GE Healthcare

AEC Staining Kit SIGMA ALDRICH

Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad

Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit SIGMA ALDRICH

Rotiphorese Gel 30 Roth

Tetramethylethylendiamin (TEMED) SERVA

RNase-Away Reagent ThermoFisher Scientific

0,5 M EDTA, pH = 8,0 ThermoFisher Scientific

Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific


29

Herstellung von Luria Bertani-Medium (LB-Medium)

Zusammensetzung LB-Medium:

Die Reagenzien wurden zunächst in H2O gelöst und anschließend autoklaviert. Für die

Herstellung von LB-Agarplatten wurden dem Medium 15 g Agar/L zugesetzt.

Herstellung von SOC-Medium

Das SOC-Medium in dem die E. coli-Zellen nach der Transformation zur Expression

der Antibiotika-Resistenzgene aufgenommen wurden, bestand aus SOB-Medium, das

20 mM Glukose enthielt.

Zusammensetzung SOB-Medium (Super Optimal Broth):

Die Reagenzien wurden zunächst in H2O gelöst und anschließend autoklaviert.

Reagenz Konzentration

Trypton 1% (w/v)

Hefeextrakt 0,5% (w/v)

NaCl 0,5% (w/v)


Trypton 2% (w/v)

Hefeextrakt 0,5% (w/v)

NaCl 10 mM

KCl 2,5 mM

MgCl2 × 6 H2O 10 mM

MgSO4 × 7 H2O 10 mM


30

Herstellung von Minimalmedium

Zusammensetzung Minimalmedium:

Reagenz Volumen

Salzkomponente A 100 ml

Salzkomponente B 10 ml

Eisencitrat (0,44 g in 100 ml H2O) 20 ml

Glukose (20%) 50 ml

Aminosäure-Lösung (1 mg/ml) 10 ml

L-Cystein (5 mg/ml) 20 ml

L-Glutamin (30 mg/ml) 20 ml

Riboflavin (1 mg/ml in 1 M Ameisensäure) 0,5 ml

Thiamin (1 mg/ml) 1 ml

(+)-Biotin (1 mg/ml in 0,1 M NaOH) 0,5 ml

DL-6,8-Thioctansäure (0,1 mg/ml in 70% EtOH) 50 µl

H2O 768 ml

Salzkomponente A:

Salzkomponente B:

Reagenz Menge/Volumen

MgSO4 × 7 H2O 4,09 g

H2O x ml

Gesamtvolumen 100 ml


KH2PO4 32,8 g

Na2HPO4 82,1 g

H2O x ml



31

Aminosäure-Lösung:

Das Wasser, Salzkomponente A und B wurden vor dem Ansetzen des Minimalmediums

autoklaviert. Die anderen Bestandteile wurden steril filtriert. Das Eisencitrat wurde auf

einem Heizrührer bei ca. 60°C im Dunkeln über Nacht gelöst. Die Aminosäure-Lösung

wurde bei 4°C gelagert. Die Aminosäuren Cystein und Glutamin sind nur wenige Tage

stabil und wurden deshalb vor Herstellung des Minimalmediums frisch angesetzt. Die

Vitamin-Lösungen wurden bei -20°C gelagert.

2.12. Gele und Puffer

Puffer für die Herstellung von chemisch-kompetenten E. coli-Zellen

Zusammensetzung CCMB80-Puffer:

Die Reagenzien wurden zunächst in H2O gelöst. Danach wurde der pH-Wert der

Lösung auf 6,4 eingestellt. Anschließend wurde der Puffer steril filtriert und bei 4°C

gelagert.


L-Arginin 1 g

L-Isoleucin 1 g

L-Leucin 1 g

L-Methionin 1 g

L-Valin 1 g

H2O x ml



CaCl2 × 2 H2O 80 mM

MnCl2 × 4 H2O 20 mM

MgCl2 × 6 H2O 10 mM

KAc 10 mM

Glycerin 10% (v/v)


32

Puffer für die Herstellung von elektro-kompetenten L. monocytogenes-Zellen

Zusammensetzung HEPES-Saccharose-Puffer:

Zusammensetzung HEPES-Saccharose-Glycerin-Puffer:

Die Reagenzien für die Herstellung des HEPES-Saccharose- und HEPES-Saccharose-

Glycerin-Puffers wurden zunächst in H2O gelöst. Anschließend wurden die Puffer steril

filtriert und bei 4°C gelagert.

Gele und Puffer für die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Zusammensetzung SDS-Sammelgel (4%) für 2 Gele:


HEPES (10 mM, pH = 7,0) 1 mM

Saccharose (1 M) 0,5 M


HEPES (10 mM, pH = 7,0) 1 mM

Saccharose (1 M) 0,5 M

Glycerin 10% (v/v)

Reagenz Volumen

H2O 2,9 ml

Tris (0,5 M, pH = 6,8) 1,25 ml

30% Acrylamid, 0,8% Bisacrylamid 850 µl

SDS (10%) 50 µl

TEMED 10 µl

APS (25%) 10 µl


33

Zusammensetzung SDS-Trenngel (12%) für 2 Gele:

Zusammensetzung 10× Lauf-Puffer:

ad H2O

Zusammensetzung 2× Lade-Puffer:

Zusammensetzung Bitzentfärber:

ad H2O

Reagenz Volumen

H2O 5,1 ml

Tris (1,5 M, pH = 8,8) 3,8 ml

30% Acrylamid, 0,8% Bisacrylamid 6,0 ml

SDS (10%) 150 µl

TEMED 20 µl

APS (25%) 20 µl


Tris 0,25 M

Glycin 1,92 M

SDS 1% (w/v)

Reagenz Volumen

Glycerin 2 ml

SDS (10%) 1 ml

β-Mercaptoethanol 200 µl

Tris (0,5 M, pH = 6,8) 290 µl

Bromphenolblau (2 mg/ml in 0,1 M Tris, pH = 7,5) 160 µl

H2O 6,9 ml


Methanol 40% (v/v)

Essigsäure 10% (v/v)


34

Zusammensetzung Coomassie-Färbelösung:

ad H2O

Puffer für Western blot

Zusammensetzung 10× Blot-Puffer:

ad H2O

Zusammensetzung 1× Blot-Puffer:

ad H2O

Zusammensetzung 10× TBS-Puffer:

ad H2O

Zusammensetzung 1× TBS-Tween 20-Puffer:

ad H2O


Methanol 40% (v/v)

Essigsäure 10% (v/v)

Coomassie Brilliant Blue R 8 Tabletten


Tris 0,25 M

Glycin 1,92 M


10× Blot-Puffer 10% (v/v)

Methanol 10% (v/v)

SDS (10%) 0,5% (v/v)


Tris 0,1 M

NaCl 1,5 M


10× TBS-Puffer 10% (v/v)

Tween 20 0,1% (v/v)


35

Zusammensetzung RIPA-Puffer:

ad H2O

Puffer für die Agarosegel-Elektrophorese

Zusammensetzung Lade-Puffer:

Die Reagenzien wurden in TE-Puffer (pH = 8,0) gelöst.

Zusammensetzung TE-Puffer:


Tris 10 mM

EDTA 1 mM

Die Reagenzien wurden zunächst in H2O gelöst. Danach wurde der pH-Wert der

Lösung auf 8,0 eingestellt.


Tris (1 M, pH = 7,4) 50 mM

NaCl 150 mM

EDTA 1 mM

Triton X-100 1% (v/v)

Na-Deoxycholat 1% (w/v)

SDS 0,1% (w/v)


Ficoll 400 25% (w/v)

Bromphenolblau 0,25% (w/v)


36

Gele und Puffer für die denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Zusammensetzung denaturierendes Polyacrylamidgel (10%) für 1 Gel:

Zusammensetzung 10× TBE-Puffer:

Zusammensetzung Lade-Puffer:

ad H2O


Harnstoff 18,9 g

10× TBE-Puffer 4,5 ml

30% Acrylamid, 0,8% Bisacrylamid 15 ml

TEMED 60 µl

APS (20%) 300 µl

H2O x ml

Gesamtvolumen 45 ml


Tris 109 g

Borsäure 55 g

EDTA (0,5 M, pH = 8,0) 40 ml

H2O x ml

Gesamtvolumen 1 L


Harnstoff 6 M

Deionisiertes Formamid 80% (v/v)

Bromphenolblau 0,1% (w/v)

Xylencyanol 0,1% (w/v)

10× TBE-Puffer 10% (v/v)


37

2.13. Verbrauchsmaterialien

ThermoFisher Scientific: MicroAmp Optical Adhesive Film, MicroAmp Fast Optical

96-Well Reaction Plate (0,1 ml), RNase-freie Eppendorf-Reaktionsgefäße (1,5 ml und 2

ml), 12er-Well Platten für die Zellkultur, große Zellkulturflaschen, 10 cm Zellkultur-

schalen, Petrischalen, Kryoröhrchen

Merck: Express PLUS 0,22 µm Filtereinheit, Millex-GV 0,22 µm Filtereinheit

SARSTEDT: Eppendorf-Reaktionsgefäße (1,5 ml und 2 ml)

VWR: Poly-D-Lysin 12er-Well Platten für die Zellkultur, Zellsieb, Zellschaber

Roche: PVDF-Membran

Beranek: 500 ml Becher, Ultrazentrifugenröhrchen

Braun: Feindosierungsspritzen

TERUMO NEOLUS: Einmalkanülen

Spectrum Laboratories: Hollow Filter Module (>30 kDa-Membran)

Bio-Rad: Elektroporationsküvetten

Bertin Technologies: Precellys Lysing Kit (Soft tissue homogenizing CK14-Röhrchen)

Greiner Bio-One: Greiner-Röhrchen (15 ml und 50 ml), 96er-Well Platten mit F- und

U-Boden

2.14. Geräte

Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Biotechnologies)

MiSeq Next Generation Sequencer (Illumina)

Ultrafiltrationsgerät: KrosFlo Research II TFF Systems (Spectrum Laboratories)

Thermomixer: Eppendorf Thermomixer comfort

Thermocycler: Applied Biosystems 2720 Thermal Cycle

Heizblock (Eigenbau der Institutswerkstatt)

Tischzentrifuge: Eppendorf Centrifuge 5424

Kühlzentrifuge: Eppendorf Centrifuge 5424 R

Zentrifuge für Greiner-Röhrchen: Heraeus Megafuge 1.0R

Zentrifuge für 500 ml Becher: Sorvall Superspeed RC2-B

Ultrazentrifuge: L8 60M ultracentrifuge (Beckman Coulter)

SW41 Ti-Rotor: Sorvall TH-641

F10 Rotor: Piramoon Technologies F10-6x500y Fiberlite

pH-Messgerät: SevenEasy (Mettler Toledo)

https://www.google.de/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjE86SEnJPYAhUKbRQKHYpxCyMQFggsMAE&url=http%3A%2F%2Fscienceservices.de%2Fde%2Fultrazentrifugenrohrchen-open-top-pc-14x89mm-50-stuck.html&usg=AOvVaw14X3IkTZzB4MAx5UEc-3GJ

https://www.google.de/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=4&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwj2lqOB4YvYAhWCGuwKHXlfCNIQFgg-MAM&url=https%3A%2F%2Fus.vwr.com%2Fstore%2Fproduct%2F4832829%2Fkrosflo-research-ii-tff-systems-spectrum-laboratories&usg=AOvVaw18RvwOvNwu7XILaOr9770T

https://www.google.de/aclk?sa=l&ai=DChcSEwia17SB4ovYAhUUPBsKHYqTBIwYABAAGgJ3bA&sig=AOD64_2qsh7EJhgc428pHArSqoiuOrPpsQ&q=&ved=0ahUKEwjTsbCB4ovYAhXQ5qQKHQzmADQQ0QwIJQ&adurl=

https://www.google.de/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwiuu6zmg4zYAhURoKQKHZe3A_EQFgg-MAA&url=https%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com%2Fde%2Fde%2Fhome%2Flife-science%2Fpcr%2Fthermal-cyclers-realtime-instruments%2Fthermal-cyclers%2F2720-thermal-cycler.html&usg=AOvVaw1WyHJDKCo5FLvVmXRe9_lU

https://www.google.de/aclk?sa=l&ai=DChcSEwi5n6b14YvYAhVDFhsKHXF_Dc0YABAFGgJ3bA&sig=AOD64_3vdjUOFTbnzr5NXA4DDokfzxXAxg&q=&ved=0ahUKEwjO3qH14YvYAhWF66QKHS7bBDcQ0QwILg&adurl=

https://www.google.de/aclk?sa=l&ai=DChcSEwi5n6b14YvYAhVDFhsKHXF_Dc0YABAFGgJ3bA&sig=AOD64_3vdjUOFTbnzr5NXA4DDokfzxXAxg&q=&ved=0ahUKEwjO3qH14YvYAhWF66QKHS7bBDcQ0QwILg&adurl=


38

Magnetrührer: IKAMAG RED

Elektrophorese-Kammer für Protein-, DNA-, und RNA-Gele (Eigenbau der Instituts-

werkstatt)

Spannungsgerät: Electrophoresis Power Supply EPS 601 (Amersham Biosciences)

Gel-Dokumentationssystem (Bio-Rad)

Elektroporationsgerät (Bio-Rad electroporation system)

Taumelnder Plattformschüttler: Heidolph Polymax 1040 (Heraeus)

Schüttler für Bakterienkulturen: INFORS HAT (Ecotron)

Brutschrank für Bakterienkulturen (Heraeus)

Brutschrank für Zellkulturen (Thermo Scientific Forma Steri-Cycle CO2 Incubators)

Wasserbad für Bakterienkulturen (Eigenbau der Institutswerkstatt)

Wasserbad für Zellkulturen (Grant Instruments)

-20°C Gefrierschrank (Bosch) und -80°C Gefrierschrank (Thermo Scientific)

Kühlschrank (Liebherr)

365 nm UV-Tisch (Vilber)

Plattenphotometer: Infinite M200 PRO NonoQuant (Tecan)

Photometer für Messung des Bakterienwachstums: Ultrospec 10 (Amersham Bio-

sciences)

Vortexer: Vortex Genie 2 (Scientific Industries)

Bachofer Speed Vacuum Concentrator

Mikrowelle (Moulinex)

Pipetten (Eppendorf)

Sterilbank: HERAsafe Sicherheitswerkbänke (Thermo Scientific)

Sterilbank: NuAire Biological Safety Cabinets (Thermo Scientific)

StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems)

Mikroskop: Wilovert S (Hund Wetzlar)

Digitalkamera (Canon)

NanoDrop Technologies (ThermoFisher Scientific)

Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies)

Waage und Feinwaage (KERN)

Precellys 24-Homogenisator (Bertin Technologies)

NanoSight Gerät (Malvern Instruments)

Kritische-Punkt-Trocknungseinrichtung: CPD 030 (Balzers, Liechtenstein)


39

Sputtercoater: SCD 500 (Balzers, Liechtenstein)

Elektronenmikroskop (Carl Zeiss)

2.15. Arbeiten mit DNA

2.15.1. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Die PCR ist ein Verfahren zur Amplifikation von DNA-Sequenzen. Die Reaktion findet

in einem Thermocycler statt und benötigt: DNA-template, Vorwärts- und Rückwärts-

primer, dNTPs und eine hitzestabile DNA-Polymerase, wie beispielsweise die Taq-

DNA-Polymerase aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus. Die PCR läuft

in 3 sich wiederholenden Reaktionsschritten ab. Im ersten Reaktionsschritt wird das

DNA-template durch Erhitzen auf 95°C denaturiert. Im zweiten Reaktionsschritt wird

die Temperatur soweit abgesenkt, dass sich die komplementären Primer an die DNA-

Einzelstränge anlagern. Im dritten Reaktionsschritt findet die DNA-Synthese durch die

DNA-Polymerase statt, wobei die Primer als Startersequenzen dienen. Dadurch

entstehen neue DNA-Doppelstränge, die im nächsten PCR-Zyklus ebenfalls als

template dienen. Infolgedessen steigt die synthetisierte DNA-Menge pro Zyklus

exponentiell an.

Die PCR-Reaktionen wurden mit dem Taq-DNA-Polymerase Kit (Invitrogen)

durchgeführt.

Pipettierschema pro Reaktionsansatz:


DNA-template 50-100 ng

Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl) 0,15 µl

10× Taq-DNA-Polymerase-Puffer ohne MgCl2 5 µl

MgCl2 (50 mM) 1,5 µl

dNTP-Mix (1,25 mM) 3 µl

Vorwärtsprimer (10 µM) 1 µl

Rückwärtsprimer (10 µM) 1 µl

H2O x µl

Gesamtvolumen 50 µl


40

PCR-Programm:

Die Schritte 2 bis 4 wurden 30mal wiederholt.

2.15.2. Agarosegel-Elektrophorese von DNA-Fragmenten

In der Agarosegel-Elektrophorese findet die Auftrennung von DNA nach Größe statt,

wobei eine Agarosegel-Matrix als Trägermaterial dient. Aufgrund des Zucker-Phosphat-

Rückgrats sind DNA-Moleküle negativ geladen und wandern infolgedessen in einem

elektrischen Feld zum positiven Pol.

Agarose löst sich beim Erhitzen in 1× TBE-Puffer und bildet beim Abkühlen ein

dreidimensionales Netzwerk, das je nach Agarose-Konzentration unterschiedlich große

Poren aufweist. Mit steigender Agarose-Konzentration steigt der Vernetzungsgrad der

Agarose. Die Konzentration der eingesetzten Agarose hängt von der Größe der aufzu-

trennenden DNA-Fragmente ab. Die in dieser Arbeit verwendeten Gele bestanden aus

1% und 2% Agarose. Hierfür wurde die Agarose zunächst abgewogen und danach in 1×

TBE-Puffer in einem Erlenmeyer-Kolben durch Aufkochen in einer Mikrowelle gelöst.

Nach kurzem Abkühlen der Agarose wurde Ethidiumbromid zur Färbung der DNA

hinzugefügt. Anschließend wurde die gelöste Agarose in den dafür vorbereiteten Gel-

träger gegossen. Nach Auspolymerisierung der Agarose wurde das Gel in eine

horizontale Kammer reingelegt. Die Kammer wurde zuvor mit 1× TBE-Puffer befüllt.

Vor dem Auftragen auf das Gel wurden die DNA-Proben mit Ladepuffer versetzt. Die

Elektrophorese wurde für 1 Stunden bei 150 V, 150 mA und 100 W durchgeführt. Um

die Größe der DNA-Fragmente bestimmen zu können, wurde ein DNA-Größenstandard

verwendet (Abb. 2.1). Nach der Elektrophorese wurden die DNA-Fragmente visualisiert

und fotografiert.

Schritte Temperatur [°C] Zeit

1 95 5 Minuten

2 95 20 Sekunden

3 55 30 Sekunden

4 72 30 Sekunden

5 4 ∞


41

2.15.3. Aufreinigung von DNA-Fragmenten

Die Aufreinigung von PCR- und Verdau-Produkten sowie cDNA wurde mit dem

QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers durchgeführt.

Dieser Kit eignet sich für die Aufreinigung von DNA-Fragmenten mit einer Größe von

100 Bp bis 10 Kb.

Zunächst wurden 5 V PB-Puffer zu den DNA-Proben pipettiert. Danach wurden die

Proben gevortext und auf dafür vorgesehenen Säulen gegeben. Die Säulen wurden für 1

Minute bei 13200 rpm und RT zentrifugiert. An die Säulen gebundene DNA wurde mit

750 µl PE-Puffer gewaschen. Dabei wurden die Säulen erneut für 1 Minute bei 13200

rpm und RT zentrifugiert. Es folgte eine Zentrifugation von 3 Minuten bei 13200 rpm

und RT. Nach dem die Säulen auf neue Eppis draufgesetzt wurden, wurde die DNA mit

50 µl H2O von den Säulen eluiert. Dabei wurden die Säulen für 1 Minute bei 13200 rpm

und RT zentrifugiert. Die Konzentration der DNA wurde mit dem NanoDrop gemessen.

2.15.4. Extraktion von DNA-Fragmenten aus dem Agarosegel

Durch unspezifische Bindung der Primer an das DNA-template können Nebenprodukte

während der PCR entstehen. In diesem Fall wird das entsprechende DNA-Fragment aus

dem Agarosegel extrahiert. Die Extraktion der DNA-Fragmente aus dem Agarosegel

wurde mit dem GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific) nach Angaben des

Herstellers durchgeführt. Dieser Kit eignet sich für die Extraktion von DNA-

Fragmenten mit einer Größe von 25 Bp bis 20 Kb.

Nach Auftrennung der PCR-Produkte durch Agarosegel-Elektrophorese wurden die

entsprechenden DNA-Banden mit einem Skalpell aus dem Gel herausgeschnitten und in

Eppis überführt. Zur Bestimmung der DNA-Größe wurde ein DNA-Größenstandard

verwendet (Abb. 2.1). Dabei wurde die DNA auf einem UV-Tisch (365 nm) visualisiert.

Um die DNA aus dem Agarosegel zu extrahieren, wurden die Gelstücke zunächst mit

einem Skalpell in kleine Stücke geschnitten und danach mit 100 µl Binding-Puffer/100

mg Gel versetzt. Anschließend wurden die Proben solange auf dem Heizblock bei 50-

60°C inkubiert bis sich das Gel aufgelöst hatte. Zur schnelleren Auflösung des Gels

wurden die Proben in dieser Zeit öfters kräftig gevortext. Anschließend wurden die

Proben auf dafür vorgesehenen Säulen gegeben. Diese wurden für 1 Minute bei 6000

rpm und RT zentrifugiert. An die Säulen gebundene DNA wurde mit 700 µl Wash-


42

Puffer gewaschen. Dabei wurden die Säulen erneut für 1 Minute bei 6000 rpm und RT

zentrifugiert. Es folgte eine Zentrifugation von 1 Minute bei 13200 rpm und RT.

Nach dem die Säulen auf neue Eppis draufgesetzt wurden, wurde die DNA mit 50 µl

H2O von den Säulen eluiert. Hierfür wurden die Säulen für 1 Minute bei 13200 rpm und

RT zentrifugiert. Die DNA-Konzentration wurde mit dem NanoDrop gemessen.

2.15.5. Isolierung von Plasmid-DNA

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli-Zellen wurde mit dem QIAprep Spin

Miniprep Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Hierfür wurden

Übernachtkulturen von plasmidhaltigen E. coli-Zellen verwendet. Diese wurden

zunächst in Eppis überführt und für 3 Minuten bei 13200 rpm abzentrifugiert. Der

Überstand wurde verworfen. Anschließend wurde das Bakterienpellet in 250 µl P1-

Puffer resuspendiert. Es folgte die Zugabe von 250 µl P2-Puffer. Die Eppis wurden

mehrmals invertiert und für 5 Minuten bei RT inkubiert. Hierdurch erfolgte die Lyse der

Bakterienzellen unter alkalischen Bedingungen. Zur Neutralisation und Renaturierung

der Plasmid-DNA wurden 350 µl N3-Puffer hinzugefügt. Die Eppis wurden erneut

mehrmals invertiert. Anschließend wurden die Eppis für 10 Minuten bei 13200 rpm und

RT zentrifugiert. Der Überstand mit der darin gelösten Plasmid-DNA wurde auf dafür

vorgesehenen Säulen gegeben. Die Säulen wurden für 1 Minute bei 6000 rpm und RT

zentrifugiert. An die Säulen gebundene Plasmid-DNA wurde mit 750 µl PE-Puffer

gewaschen. Dabei wurden die Säulen erneut für 1 Minute bei 6000 rpm und RT

zentrifugiert. Es folgte eine Zentrifugation von 3 Minuten bei 13200 rpm und RT. Nach

dem die Säulen auf neue Eppis draufgesetzt wurden, wurde die DNA mit 50 µl H2O von

den Säulen eluiert. Dabei wurden die Säulen für 1 Minute bei 13200 rpm und RT

zentrifugiert. Die Konzentration der isolierten Plasmid-DNA wurde mit dem NanoDrop

gemessen.

2.15.6. Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration

Nach Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli-Zellen und Isolierung von RNA aus

eukaryotischen Zellen und Bakterienzellen sowie nach Aufreinigung von cDNA, PCR-

und Verdau-Produkten wurde die Nukleinsäure-Konzentration mit dem NanoDrop

gemessen. Nukleinsäuren haben, aufgrund der Absorption durch die quasi-aromatischen

Purine und Pyrimidine, ein Absorptionsmaximum bei 260 nm. Eine Absorption von 1


43

entspricht einer Nukleinsäure-Konzentration von 50 µg/ml dsDNA, 33 µg/ml ssDNA

und 40 µg/ml ssRNA.

Der Quotient aus A260/A280 gibt die Reinheit einer DNA- bzw. RNA-Lösung an.

Proteine haben, aufgrund der Absorption durch die aromatischen Aminosäuren, ein

Absorptionsmaximum bei 280 nm. Ein A260/A280-Quotient von >1,8 spricht für eine

reine DNA-Isolierung, ein Verhältnis von >2,0 für eine reine RNA-Isolierung. Ist die

Nukleinsäure-Lösung mit Proteinen oder Phenol kontaminiert, so beträgt der A260/A280-

Quotient <1,5.

2.15.7. Klonierung

Bei der Klonierung wird ein bestimmtes DNA-Fragment in einen Vektor, der als

Transportvehikel zur Übertragung der gewünschten DNA-Sequenz in eine Wirtszelle

dient, integriert. Durch Selektionsdruck mittels Antibiotikum im Wachstumsmedium

wird erreicht, dass sich nur die vektorhaltigen Zellen vermehren. Zu diesem Zweck

enthalten Vektoren Antibiotika-Resistenzgene und weitere Elemente, die beispielweise

für deren Vervielfältigung in den Wirtszellen essentiell sind.

2.15.7.1. Konierung durch TA Cloning

Durch TA Cloning können PCR-Produkte mit glatten Enden (blunt ends) in den

pCR2.1-TOPO-Vektor kloniert werden (Abb. 2.2). Hierfür macht man sich zunutze,

dass die Taq-DNA-Polymerase am 3`-Ende der synthetisierten DNA-Produkte nicht

template-abhängig ein A-Nukleotid hinzufügt. Infolgedessen besitzen diese PCR-

Produkte an den 3`-Enden jeweils ein überstehendes A-Nukleotid. Der linearisierte

pCR2.1-TOPO-Vektor besitzt komplementär dazu an den 3`-Enden jeweils ein

überstehendes T-Nukleotid. Daraufhin integrieren die PCR-Produkte über TA-

Basenpaarung in den pCR2.1-TOPO-Vektor (Abb. 2.3).

Für die Herstellung von Lm-pERL3-rli32 und Lm-pERL3-ssrS wurden die entspre-

chenden PCR-Produkte zunächst über TA-Basenpaarung in den pCR2.1-TOPO-Vektor

kloniert. Dabei wurde der TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) nach Angaben des

Herstellers verwendet.


44


Anschließend wurden die Proben für 10 Minuten bei RT inkubiert. Es folgte die

Transformation von kompetenten E. coli-Zellen. Für die Transformation von elektro-

kompetenten E. coli-Zellen wurde die Salt Solution 1:4 in H2O verdünnt.

2.15.7.2. Klonierung durch Restriktionsverdau und Ligation

Eine weitere Methode, um gewünschte DNA-Fragmente in einen Vektor zu klonieren,

wird mittels Restriktionsenzymen durchgeführt. Hierfür werden im ersten Schritt

Vektor und DNA-Fragment, das in den Vektor kloniert werden soll, mit den gleichen

Restriktionsenzymen geschnitten. Vorzugsweise verwendet man Restriktionsenzyme

die versetzt schneiden, so dass überstehende Enden (sticky ends) entstehen. Durch

Hybridisierung der komplementären Enden wird das gewünschte DNA-Fragment in den

Vektor kloniert. Im zweiten Schritt wird durch Ligation mittels DNA-Ligase das

Phosphodiester-Band kovalent geschlossen.

Für die Herstellung von Lm-pERL3-rli32 und Lm-pERL3-ssrS wurden die entspre-

chenden DNA-Fragmente zunächst durch Restriktionsverdau aus dem pCR2.1-TOPO-

Vektor herausgeschnitten. Diese wurden anschließend durch Ligation in den pERL3-

Vektor kloniert (Abb. 2.4).

Restriktionsverdau

Zunächst wurde ein Restriktionsverdau beider Vektoren, pCR2.1-TOPO und pERL3,

mit FastDigest Restriktionsenzymen (ThermoFisher Scientific) durchgeführt. Hierfür

wurden die entsprechenden DNA-Fragmente aus dem pCR2.1-TOPO-Vektor mit Sal I

und Xma I (für rli32) bzw. Sal I und BamH I (für ssrS) herausgeschnitten. In einem

parallelen Ansatz wurde der pERL3-Vektor mit Sal I und Xma I (für rli32) bzw. Sal I

und BamH I (für ssrS) linearisiert.


pCR2.1-TOPO-Vektor 1 μl

Salt Solution 1 μl

PCR-Produkt 4 μl (150-200 ng)

Gesamtvolumen 6 µl


45


Anschließend wurden die Proben für 2 Stunden bei 37°C auf dem Heizblock inkubiert.

In einem weiteren Schritt wurden die Verdau-Produkte elektrophoretisch in einem

1%igen Agarosegel aufgetrennt, visualisiert und fotografiert.

Ligation

Die Ligation wurde mit dem T4 DNA Ligation Kit (ThermoFisher Scientific) nach

Angaben des Herstellers durchgeführt.


Die Ligationsansätze wurden über Nacht bei 16°C im Wasserbad inkubiert. Am

nächsten Tag wurde die T4-DNA-Ligase zunächst durch Hitze inaktiviert. Hierfür

wurden die Proben für 20 Minuten bei 65°C auf dem Heizblock inkubiert. Es folgte die

Transformation von kompetenten E. coli-Zellen.


Sal I 1 μl

Xma I bzw. BamH I 1 μl

10× Restriktionsenzym-Puffer 2 μl

pCR2.1-TOPO- bzw. pERL3-Vektor 1 µg

H2O x µl



T4-DNA-Ligase (1 U/µl) 1,5 μl

10× T4-DNA-Ligase-Puffer 2 μl

Verdautes pCR2.1-TOPO-Vektor 4 μl (150-300 ng)

Verdautes pERL3-Vektor 1,5 μl (50-100 ng)

H2O x µl



46

2.16. Bakteriologische Arbeiten

2.16.1. Kultivierung von Bakterien

Die Kultivierung von E. coli-Zellen erfolgte in LB-Medium oder auf LB-Agarplatten.

Für die Isolierung von Plasmid-DNA wurden am Vortag Übernachtkulturen von

plasmidhaltigen E. coli-Zellen in 10 ml LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum

in 100 ml Erlenmeyer-Kolben angesetzt. Hierfür wurden die Bakterien mit einer Öse

von der Platte eingeimpft. Zuvor wurde das Antibiotikum ins Medium pipettiert, 100

µg/ml Ampicillin für die Anzucht von pCR2.1-TOPO-haltigen E. coli-Zellen und 300

µg/ml Erythromycin für die Anzucht von pERL3-haltigen E. coli-Zellen. Die Über-

nachtkulturen für die Herstellung von kompetenten E. coli-Zellen wurden in LB-

Medium ohne Antibiotikum angesetzt.

L. monocytogenes wurde in BHI-Medium oder auf BHI-Agarplatten sowie in Minimal-

medium kultiviert. Die Übernachtkulturen für die Isolierung von MVs (MVs-RNA),

sec-RNA und zellulärer RNA der Stämme Lm-pERL3-rli32 und Lm-pERL3-ssrS

wurden in BHI-Medium mit 5 µg/ml Erythromycin angesetzt. Diese wurden 1:50 in

Minimalmedium eingeimpft. Zuvor wurden 5 µg/ml Erythromycin ins Medium

pipettiert. Lm wurde ohne Zugabe von Antibiotikum im Wachstumsmedium angezogen.

Die Bakterienkulturen wurden bei 37°C und 180 rpm auf einen Schüttler angezogen.

2.16.2. Messung des Bakterienwachstums

Das Wachstum der Bakterienkulturen wurde durch Messung der optischen Dichte

überprüft. Diese wurde mit einem Spektralphotometer in Einmal-Mikroküvetten bei

einer Wellenlänge von 600 nm gemessen. Bei OD600nm-Werten über 1 wurden die

Bakterienkulturen verdünnt. Infolgedessen wurde bei der Bestimmung der optischen

Dichte der Verdünnungsfaktor berücksichtigt.

2.16.3. Kompetenz und Transformation

Die Transformation ist ein Prozess, bei dem Bakterien frei in der Umgebung

vorliegende Fremd-DNA aufnehmen. Voraussetzung für die Transformation ist die

Kompetenz, die Fähigkeit von Bakterienzellen DNA aufzunehmen. Nur wenige

Bakterienarten, wie beispielsweise Bacillus subtilis, zeigen eine natürliche Kompetenz.

Deshalb müssen Bakterienzellen zunächst für die Aufnahme von DNA kompetent

gemacht werden. Danach erfolgt die Aufnahme von DNA durch Poren, die


47

vorübergehend durch Elektroporation oder Hitzeschock in der Zellmembran erzeugt

werden.

2.16.3.1. Herstellung von elektro-kompetenten E. coli-Zellen

Eine E. coli-Übernachtkultur wurde 1:50 in 50 ml LB-Medium in einem 300 ml

Erlenmeyer-Kolben eingeimpft und bis zum Erreichen einer OD600nm von 0,5 bis 0,6 bei

37°C und 180 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Anschließend wurde die Bakterienkultur

in ein 50 ml Greiner-Röhrchen überführt und für 8 Minuten bei 5000 rpm und 4°C

abzentrifugiert. Das Röhrchen wurde auf Eis gestellt und der Überstand wurde mit der

Pipette abgesaugt. Das Bakterienpellet wurde insgesamt 3mal mit jeweils 30 ml kaltem

10%igem Glycerin gewaschen. Dabei wurden die Bakterienzellen durch Zentrifuga-

tionen von jeweils 8 Minuten bei 5000 rpm und 4°C pelletiert. Nach jeder Zentri-

fugation wurde das Röhrchen auf Eis gestellt und der Überstand wurde mit der Pipette

abgesaugt. Im letzten Schritt wurde das Bakterienpellet in 500 µl kaltem 10%igem

Glycerin resuspendiert und als 50 µl Aliquot in Kryoröhrchen überführt. Die Bakterien-

zellen wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur deren Verwendung bei

-80°C gelagert.

2.16.3.2. Herstellung von chemisch-kompetenten E. coli-Zellen

Eine E. coli-Übernachtkultur wurde 1:50 in 50 ml LB-Medium in einem 300 ml

Erlenmeyer-Kolben eingeimpft und bis zum Erreichen einer OD600nm von 0,3 bei 37°C

und 180 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Anschließend wurde die Bakterienkultur in

ein 50 ml Greiner-Röhrchen überführt und für 10 Minuten auf Eis gestellt. Die

Bakterienzellen wurden durch eine Zentrifugation von 10 Minuten bei 4000 rpm und

4°C pelletiert. Das Röhrchen wurde auf Eis gestellt und der Überstand wurde mit der

Pipette abgesaugt. Das Bakterienpellet wurde zunächst in 1/3 V (17 ml) CCMB80-

Puffer resuspendiert und danach für weitere 10 Minuten auf Eis gestellt. Anschließend

wurden die Bakterienzellen erneut durch eine Zentrifugation von 10 Minuten bei 4000

rpm und 4°C pelletiert. Das Röhrchen wurde auf Eis gestellt und der Überstand wurde

mit der Pipette abgesaugt. Im letzten Schritt wurde das Bakterienpellet in 1/12 V (4,2

ml) CCMB80-Puffer resuspendiert und als 200 µl Aliquot in Kryoröhrchen überführt.

Die Bakterienzellen wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur deren


48

Verwendung bei -80°C gelagert. Der CCMB80-Puffer wurde vor dessen Verwendung in

den Kühlschrank gestellt.

2.16.3.3. Herstellung von elektro-kompetenten L. monocytogenes-Zellen

Eine L. monocytogenes-Übernachtkultur wurde zunächst 1:100 in 200 ml 1× BHI-

Medium + 0,5 M Saccharose in einem 1 L Erlenmeyer-Kolben eingeimpft und danach

bei 37°C und 180 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Nach Erreichen einer OD600nm von

0,2 wurden 200 µg Penicillin hinzugefügt. Danach wurde die Bakterienkultur für

weitere 2 Stunden auf dem Schüttler inkubiert. Anschließend wurde die Bakterienkultur

in 4× 50 ml Greiner-Röhrchen überführt und für 10 Minuten bei 5000 rpm und 4°C

abzentrifugiert. Die Röhrchen wurden auf Eis gestellt und der Überstand wurde mit der

Pipette abgesaugt. Die Bakterienpellets wurden in jeweils 10 ml kaltem HEPES-

Saccharose-Puffer resuspendiert und in ein 50 ml Greiner-Röhrchen zusammengeführt.

Danach wurden die Bakterienzellen erneut für 10 Minuten bei 5000 rpm und 4°C

pelletiert. Das Bakterienpellet wurde insgesamt 3mal mit jeweils 10 ml kaltem HEPES-

Saccharose-Puffer gewaschen. Dabei wurden die Bakterienzellen durch Zentrifu-

gationen von jeweils 15 Minuten bei 6000 rpm und 4°C pelletiert. Nach jeder

Zentrifugation wurde das Röhrchen auf Eis gestellt und der Überstand wurde mit der

Pipette abgesaugt. Im letzten Schritt wurde das Bakterienpellet in 500 µl kaltem

HEPES-Saccharose-Glycerin-Puffer resuspendiert und als 50 µl Aliquot in

Kryoröhrchen überführt. Die Bakterienzellen wurden in flüssigem Stickstoff

schockgefroren und bei -80°C gelagert.

2.16.3.4. Transformation von elektro-kompetenten E. coli-Zellen

Die bei -80°C gelagerten elektro-kompetenten E. coli-Zellen wurden zunächst auf Eis

aufgetaut. Danach wurden 2 µl aus den Klonierungsansätzen (TA-Cloning bzw.

Ligation) hinzugefügt. Anschließend wurden die Zellen in dafür vorgesehenen Küvetten

überführt und auf Eis gestellt. Es folgte die Elektroporation durch einen kurzen

Stromstoß (200 Ω, 1,8 V und 125 µF) mittels Elektroporationsgerät. Nach der

Elektroporation wurden die Zellen in 500 µl SOC-Medium aufgenommen und für 1

Stunde (pCR2.1-TOPO-Vektor) bzw. für 3 Stunden (pERL3-Vektor) bei 37°C und 180

rpm auf dem Schüttler inkubiert. Anschließend wurden die Zellen auf LB-Agarplatten


49

mit entsprechendem Antibiotikum ausplattiert und über Nacht bei 37°C im Brutschrank

inkubiert.

2.16.3.5. Transformation von chemisch-kompetenten E. coli-Zellen

Die bei -80°C gelagerten chemisch-kompetenten E. coli-Zellen wurden zunächst auf Eis

aufgetaut und danach mit 5 µl aus den Klonierungsansätzen (TA-Cloning bzw.

Ligation) versetzt. Die Zellen wurden für weitere 10 Minuten auf Eis gestellt. Danach

wurden die Zellen einem kurzen Hitzeschock von 90 Sekunden bei 42°C im Wasserbad

ausgesetzt. Es folgte eine erneute Inkubation von 10 Minuten auf Eis. Anschließend

wurden die Zellen in 500 µl SOC-Medium überführt und für 1 Stunde (pCR2.1-TOPO-

Vektor) bzw. für 3 Stunden (pERL3-Vektor) bei 37°C und 180 rpm auf dem Schüttler

inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Zellen auf LB-Agarplatten mit entspre-

chendem Antibiotikum ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C im

Brutschrank inkubiert.

2.16.3.6. Transformation von elektro-kompetenten L. monocytogenes-Zellen

Für die Herstellung von Lm-pERL3-rli32 und Lm-pERL3-ssrS wurden elektro-

kompetente Lm-Zellen mit den entsprechenden pERL3-Vektoren transformiert. Hierfür

wurden die bei -80°C gelagerten Zellen zunächst auf Eis aufgetaut. Danach wurden 50-

100 ng entsprechender pERL3-Vektor hinzugefügt. Für die anschließende Elektro-

poration wurden die Zellen in dafür vorgesehenen Küvetten überführt und auf Eis

gestellt. Die Zellen wurden zunächst einem kurzen Stromstoß (400 Ω, 1 V und 125 µF)

mittels Elektroporationsgerät ausgesetzt. Danach wurden die Zellen in 500 µl 1× BHI-

Medium + 0,5 M Saccharose aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen für 3

Stunden bei 37°C und 180 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Die Zellen wurden auf

BHI-Platten mit 5 µg/ml Erythromycin ausplattiert und für 2 Tage bei 37°C im

Brutschrank inkubiert.

2.17. Arbeiten mit RNA

2.17.1. Transfektion von RNA in eukaryotischen Zellen

Unter Transfektion versteht man das Einschleusen von Nukleinsäuren (DNA bzw.

RNA) in eukaryotische Zellen. Für die Transfektion von RNA in HEK293-Zellen und

BMDMs wurde Lipofectamine 2000 (Invitrogen) nach Angaben des Herstellers


50

verwendet. Lipofectamine 2000 besteht aus kationischen Lipide, die an das negativ

geladene Zucker-Phosphat-Rückgrat von Nukleinsäuren binden und diese in Liposomen

einschließen. Die positive Ladung der Liposomen vermittelt die Wechselwirkung mit

der negativ geladenen Zellmembran. Über Endocytose gelangt die Nukleinsäure in die

Zellen.

HEK293-Zellen wurden am Vortag in DMEM + 10% FKS in 12er-Well Platten

ausgesät. Zum Zeitpunkt der Transfektion lag die Konfluenz der Zellen bei 60-70%,

deren Zahl betrug ca. 7 × 105 Zellen/Well.

BMDMs wurden aus flüssigem Stickstoff aufgetaut, in BMDM-Medium + 30% M-CSF

aufgenommen, gezählt und in 12er-Well Platten ausgesät. Am nächsten Tag (24

Stunden später) wurde das Medium der Zellen gewechselt. Zum Zeitpunkt der

Transfektion (48 Stunden später) lag die Konfluenz der Zellen bei 80-90%, deren Zahl

betrug ca. 1 × 106 Zellen/Well. Das BMDM-Medium setzte sich wie folgt zusammen:

RPMI-Medium + 10% FKS + 50 µM β-Mercaptoethanol.

Vor der Transfektion der RNA in die Zellen wurden die RNA-Lipofectamine 2000-

Komplexe hergestellt. Hierfür wurden 50 bzw. 100 ng RNA in jeweils 50 µl Opti-MEM

Reduced Serum Medium pipettiert. In einem parallelen Ansatz wurden 0,25 µg Trans-

fektionsreagenz ebenfalls in jeweils 50 µl Opti-MEM Reduced Serum Medium

pipettiert. Anschließend wurde die RNA zu dem Transfektionsreagenz pipettiert, mit

der Pipette vorsichtig vermischt und für 20 Minuten bei RT inkubiert. In dieser Zeit

wurde das Medium der Zellen gewechselt. Zuvor wurden 100 U/ml Penicillin und 100

µg/ml Streptomycin zu dem Medium hinzugefügt. Im letzten Schritt wurden die RNA-

Lipofectamine 2000-Komplexe ins Medium zu den Zellen pipettiert. Die Zellen wurden

im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Dabei wurden die HEK293-Zellen für

24 Stunden inkubiert. Die BMDMs wurden für 6 Stunden inkubiert. In beiden Fällen

folgte die Untersuchung der Typ-I-IFN Antwort über RNA-Isolierung, cDNA-Synthese

und RT-PCR.

2.17.2. In vivo Transfektion von RNA

Die von rli32 und ssrS ausgelöste Typ-I-IFN Antwort in vivo wurde in Milz und Leber

der Maus untersucht. Als Transfektionsreagenz wurde in vivo-jetPEI (Polyplus

transfection) nach Angaben des Herstellers verwendet. Dieses Reagenz enthält eine von

dem kationischen Polymer Polyethylenimin (PEI) abgeleitete Substanz als Transport-


51

molekül für Nukleinsäuren. Nach einer intravenösen Injektion wird die Nukleinsäure

von in vivo-jetPEI u.a. in Leber und Milz der Maus geliefert.

Für diesen Versuch wurden insgesamt 20 Mäuse, die in 4 Gruppen eingeteilt wurden,

verwendet. Eine Gruppe aus 5 Mäusen diente als Kontrolle. Diese Tiere wurden nur mit

dem Transfektionsreagenz intravenös injiziert. Die Tiere in den restlichen 3 Gruppen (5

Tiere/Gruppe) wurden mit jeweils 40 µg RNA (rli32, ssrS bzw. eukaryotische RNA)

intravenös injiziert. Vor der in vivo Transfektion der RNA wurden die RNA-in vivo-

jetPEI-Komplexe hergestellt. Hierfür wurde die RNA (jeweils 40 µg) in jeweils 50 µl

einer 10%igen Glukose-Lösung aufgenommen und auf 100 µl mit H2O aufgefüllt. In

einem parallelen Ansatz wurde das Transfektionsreagenz (jeweils 6,4 µl) ebenfalls in

jeweils 50 µl einer 10%igen Glukose-Lösung aufgenommen und auf 100 µl mit H2O

aufgefüllt. Anschließend wurden die Ansätze miteinander vermischt, gevortext und für

15 Minuten bei RT inkubiert. Es folgte die intravenöse Injektion der Mäuse mit den

RNA-in vivo-jetPEI-Komplexen.

2.17.3. Isolierung der zellulären RNA aus eukaryotischen Zellen

Die Isolierung der zellulären RNA aus eukaryotischen Zellen wurde mit dem miRNeasy

Mini Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Zunächst wurde das

Medium der Zellen in den 12er-Well Platten abgesaugt. Anschließend wurden die

Zellen mit 700 µl QIAzol/Well lysiert. Das Zelllysat wurde in Eppis überführt. Nach

Zugabe von 0,2 V (140 µl) Chloroform wurden die Eppis kräftig geschüttelt und für 3

Minuten bei RT inkubiert. Zur Phasentrennung wurden die Eppis für 15 Minuten bei

13200 rpm und 4°C zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in neue Eppis

überführt und mit 1,5 V 100% EtOH versetzt. Nach kräftigem Mischen mit der Pipette

wurden die Proben auf miRNeasy Mini Säulen gegeben. Danach wurden die Säulen für

30 Sekunden bei 10000 rpm und RT zentrifugiert. An die Säulen gebundene RNA

wurde mit 350 µl RWT-Puffer gewaschen, wobei die Säulen erneut für 30 Sekunden bei

10000 rpm und RT zentrifugiert wurden.

Es folgte ein DNase-Verdau mit dem RNase-free DNase-Kit (Qiagen) nach Angaben

des Herstellers. Hierfür wurden 80 µl (10 µl DNase I + 70 µl RDD-Puffer)/Säule

eingesetzt. Der DNase-Verdau wurde für 30 Minuten bei 30°C auf dem Thermomixer

durchgeführt. An die Säulen gebundene RNA wurde anschließend erneut mit 350 µl

RWT-Puffer gewaschen. Hierfür wurden die Säulen für 30 Sekunden bei 10000 rpm


52

und RT zentrifugiert. Es folgten 2 weitere Waschschritte mit jeweils 500 µl RPE-Puffer,

wobei im letzten Waschschritt die Säulen für 2 Minuten bei 10000 rpm und RT

zentrifugiert wurden. Anschließend wurden die Säulen für 1 Minute bei 13200 rpm und

RT zentrifugiert. Nach dem die Säulen auf neue Eppis draufgesetzt wurden, wurde die

RNA mit 40 µl H2O von den Säulen eluiert. Dabei wurden die Säulen für 1 Minute bei

13200 rpm und RT zentrifugiert.

Die RNA-Konzentration wurde mit dem NanoDrop gemessen. Die Qualität der

isolierten RNA wurde mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer untersucht.

2.17.4. Isolierung der zellulären RNA aus Bakterien

Für die Isolierung der zellulären RNA wurden Lm-, Lm-pERL3-rli32- und Lm-pERL3-

ssrS-Übernachtkulturen zunächst 1:50 in 10 ml Minimalmedium eingeimpft und danach

bei 37°C und 180 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Zuvor wurden 5 µg/ml Erythro-

mycin ins Medium der beiden überexprimierenden Stämme gegeben. Nach Erreichen

einer OD600nm von 1 wurden 0,5 ml aus den Bakterienkulturen entnommen, mit 1 ml

RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) versetzt, gevortext und für 5 Minuten bei RT

inkubiert. Anschließend wurden die Bakterienzellen für 5 Minuten bei 13200 rpm und

RT pelletiert. Der Überstand wurde verworfen. Die Bakterienpellets wurden bis zur

RNA-Isolierung bei -80°C gelagert.

Für die Isolierung der zellulären RNA wurden die Bakterienzellen zunächst lysiert.

Hierfür wurde das Bakterienpellet in 200 µl SET-Puffer [50 mM NaCl, 5 mM EDTA

und 30 mM Tris-HCl (pH = 7,0)] + 10% SDS (v/v) resuspendiert. Danach wurden die

Bakterienzellen durch eine Zentrifugation von 3 Minuten bei 13200 rpm und RT

abzentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig mit der Pipette abgezogen. Anschlie-

ßend wurde das Bakterienpellet in 83 µl 50 mM Tris-HCl (pH = 6,5) + 50 mg/ml

Lysozym resuspendiert. Es folgte die Zugabe von 2 µl SUPERase In, RNase Inhibitor

(20 U/µl), 5 µl Mutanolysin (5 U/µl) und 10 µl Proteinase K (20 mg/ml). Die Proben

wurden gevortext und für 45 Minuten bei 37°C und 350 rpm auf dem Thermomixer

inkubiert.

Nach Lyse der Bakterienzellen wurden zunächst 600 µl QIAzol dazugegeben. Danach

wurden die Eppis gevortext und für 5 Minuten bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 0,2

V (140 µl) Chloroform wurden die Eppis kräftig geschüttelt und für weitere 3 Minuten

bei RT inkubiert. Zur Phasentrennung wurden die Eppis für 15 Minuten bei 13200 rpm


53

und 4°C zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in Eppis überführt und mit 1,5 V

100% EtOH versetzt. Nach kräftigem Mischen mit der Pipette wurden die Proben auf

miRNeasy Mini Säulen (Qiagen) gegeben. Die weiteren Schritte wurden, wie bereits im

Abschnitt 2.17.3 beschrieben, durchgeführt.

Im letzten Schritt wurde die RNA mit 40 µl H2O von den Säulen eluiert, wobei die

Säulen für 1 Minute bei 13200 rpm und RT zentrifugiert wurden. Die Konzentration der

isolierten RNA wurde mit dem NanoDrop gemessen. Die RNA-Qualität wurde mit dem

Agilent 2100 Bioanalyzer untersucht.

2.17.5. Isolierung von RNA aus Mausorganen

5 Stunden nach der intravenösen Injektion von Mäusen mit RNA wurden Milz und

Leber entnommen, mit einer Präzisionswaage gewogen, in Eppis überführt und in

flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Für die RNA-Isolierung wurden Teile von Milz und Leber (in tiefgefrorenem Zustand)

in 700 µl QIAzol in 2 ml Soft tissue homogenizing CK14-Röhrchen (Bertin

Technologies) überführt und auf Eis gestellt. Die Röhrchen enthalten 1,4 mm ceramic

beads und eignen sich für die Homogenisierung von 20-200 mg Gewebe. Die

Homogenisierung der Organe wurde mit einem Precellys 24-Homogenisator durch-

geführt, wobei die Proben zwischendurch auf Eis gestellt wurden. Anschließend wurden

die Proben für 5 Minuten bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 0,2 V (140 µl)

Chloroform wurden die Proben kräftig geschüttelt und für weitere 3 Minuten bei RT

inkubiert. Zur Phasentrennung wurden die Proben für 15 Minuten bei 13200 rpm und

4°C zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in Eppis überführt und mit 1,5 V

100% EtOH versetzt. Nach kräftigem Mischen mit der Pipette wurden die Proben auf



Im letzten Schritt wurde die RNA mit 40 µl H2O und eine Zentrifugation von 1 Minute

bei 13200 rpm und RT von den Säulen eluiert. Die Konzentration der isolierten RNA

wurde mit dem NanoDrop gemessen. Die Qualität der RNA wurde mit dem Agilent

2100 Bioanalyzer untersucht.


54

2.17.6. Qualitätskontrolle der RNA und RNA-Profilanalyse

Der Agilent 2100 Bioanalyzer wird zur Qualitätsüberprüfung von isolierter RNA

verwendet. Ähnlich herkömmlicher Standardverfahren zur RNA-Analyse wird die RNA

in eine Gelmatrix, die als Trägermaterial dient, elektrophoretisch nach Größe aufge-

trennt. Dabei wird die RNA durch eingelagerten Fluoreszenzfarbstoff detektiert. Die

Analyse von RNA-Proben mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer liefert sogenannte

Elektropherogramme (Peaks), wobei die y-Achse die RNA-Menge in FU (fluorescence

units) und die x-Achse die RNA-Länge in Nukleotiden angibt. Diese liefert darüber

hinaus gelartige Bilder (Banden) von RNA-Proben. Diese bildlichen Darstellungen

decken selbst kleine Degradierungseffekte in den Proben auf. Zusätzlich wird die RNA-

Qualität als RIN-Wert (RNA-Integritätsnummer) angegeben.

Diese Technologie wurde zur Qualitätsüberprüfung von RNA, die aus eukaryotischen

Zellen, Bakterienzellen und Organe der Maus isoliert wurde, verwendet. Diese wurde

des Weiteren zur Profilanalyse der von L. monocytogenes sekretierten RNA-Fraktionen,

sec-RNA und MVs-RNA, verwendet.

2.17.7. Reverse Transkription (cDNA-Synthese)

Die Untersuchung der Typ-I-IFN Antwort nach der in vitro und in vivo Transfektion

von RNA erfolgte über RT-PCR. Hierfür wurde die isolierte RNA zunächst in cDNA

durch Reverse Transkription mit der SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen)

umgeschrieben. Zum Umschreiben der RNA in cDNA wurden ein Oligo (dT) 21-

Primer, der an den Poly(A)-Schwanz von mRNAs bindet, und ein Random-Primer (N9)

verwendet.



RNA 500 ng

Oligo (dT) 21-Primer (20 µM) 1 µl

N9 (100 µM) 2 µl

H2O x µl



55

Die Proben wurden zunächst für 5 Minuten bei 70°C auf dem Thermomixer inkubiert

und danach auf Eis gestellt. Es folgte die Zugabe von Reverse Transkriptase, Reverse

Transkriptase-Puffer, DTT, RNaseOut und dNTP-Mix, wodurch ein Gesamtvolumen

von 20 µl/Probe erreicht wurde.


Anschließend wurden die Proben für 1 Stunde bei 42°C und 300 rpm auf dem

Thermomixer inkubiert. Zur Deaktivierung der Reversen Transkriptase wurden die

Proben für 15 Minuten bei 70°C auf dem Thermomixer inkubiert.

2.17.8. Real-Time PCR (RT-PCR)

Nach Umschreiben der RNA in cDNA wurde eine RT-PCR angesetzt. Diese beruht auf

dem im Abschnitt 2.15.1 beschriebenen Prinzip. Allerdings lässt sich durch die

Anwesenheit des Farbstoffes SYBR Green die Amplifizierung der DNA-Fragmente

unter Echtzeitbedingungen messen. Der Farbstoff lagert sich während der DNA-

Synthese unspezifisch in die neu synthetisierten DNA-Doppelstränge ein und wird

durch Fluoreszenzmessung detektiert. Die Fluoreszenz nimmt dabei proportional mit

der DNA-Menge zu, wodurch eine Quantifizierung der untersuchten cDNA und damit

der ursprünglich vorhandenen RNA in einer Probe möglich ist.

Zur Auswertung wurde der Ct-Wert (Cycle threshold) verwendet. Dieser beschreibt den

PCR-Zyklus an dem die Amplifikation der DNA exponentiell ansteigt. Die Berechnung

der relativen Expression erfolgte über das effizienz-korrigierte relative Quantifizie-

rungsmodell (Pfaffl, 2001). Zur Normalisierung der Expressionsergebnisse wurde

sowohl die Expression des Zielgens (IFN-β/IFN-α4) als auch die Expression eines nicht

regulierten Haushaltsgens in der gleichen Probe untersucht. Für die Untersuchung der

Reagenz Volumen

Reverse Transkriptase (200 U/µl) 1 µl

5× Reverse Transkriptase-Puffer 4 µl

DTT (100 mM) 2 µl

RNaseOut (40 U/µl) 1 µl

dNTP-Mix (10 mM) 1 µl


56

Typ-I-IFN Antwort in HEK293-Zellen wurde das Haushaltsgen PPIA (peptidylprolyl

isomerase A) verwendet. In BMDMs und in den Mausorganen wurde Rplp (ribosomal

protein, large, P0) verwendet.

Die RT-PCR wurde mit dem QuantiTect Primer Assay (Qiagen) und dem QuantiTect

SYBR Green PCR Kit (Qiagen) durchgeführt.


Anschließend wurden 12,5 µl QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix dazugegeben.

Die Proben wurden in 96er-Well Platten pipettiert. Für jede Probe wurden

Dreifachbestimmungen durchgeführt. Die RT-PCR wurde mit dem StepOnePlus Real-

Time PCR System (Applied Biosystems) durchgeführt.

PCR-Programm:

Die Schritte 2 bis 4 wurden 40mal wiederholt.

2.17.9. Isolierung von MVs-RNA

Vor der Isolierung von MVs-RNA wurde ein RNase-Verdau durchgeführt, um die an

der äußeren Oberfläche von MVs assoziierte RNA zu verdauen. Zu 50 µg MVs-Probe

wurden 2,5 µg RNase, DNase-free (Roche) pipettiert. Die Proben wurden für 30


cDNA 100 ng

QuantiTect Primer Assay 7,5 µl

H2O x µl

Gesamtvolumen 12,5 µl

Schritte Temperatur [°C] Zeit

1 95 15 Minuten

2 95 20 Sekunden

3 55 30 Sekunden

4 72 30 Sekunden

5 4 ∞


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Minuten bei 37°C auf dem Thermomixer inkubiert. Anschließend wurden die MVs-

Proben auf 500 µl mit PBS aufgefüllt. Nach Zugabe von 1,5 V (750 µl)

Phenol/Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1, pH = 4,5-5,0) wurden die Proben gevor-

text und für 5 Minuten bei RT inkubiert. Zur Phasentrennung wurden die Proben für 15

Minuten bei 13200 rpm und 4°C zentrifugiert. Anschließend wurde die obere wässrige

Phase in Eppis überführt und mit 0,1 V 3 M NaOAc (pH = 4,8-5,2) und 2 V 100%

EtOH versetzt. Die Proben wurden zunächst für mindestens 1 Stunde bei -80°C

inkubiert. Danach wurden die Proben für 15 Minuten bei 13200 rpm und 4°C

zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das RNA-Pellet wurde über Nacht

getrocknet.

Im letzten Schritt wurde das RNA-Pellet in 50 µl H2O resuspendiert. Die Konzentration

der isolierten MVs-RNA wurde mit dem Qubit gemessen. Die RNA-Profilanalyse

wurde mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer durchgeführt.

2.17.10. Isolierung von sec-RNA

Nach dem die MVs in dem eingeengten Überstand (ca. 30 ml) von L. monocytogenes-

Kulturen durch Ultrazentrifugation pelletiert worden sind, wurde der MVs-freie

Überstand für die Isolierung von sec-RNA verwendet. Dieser wurde in ein 50 ml

Greiner-Röhrchen überführt, in einem Verhältnis von 1:1 mit 100% EtOH versetzt und

über Nacht bei -20°C inkubiert.

Am nächsten Tag wurde das Röhrchen für 30 Minuten bei 6000 rpm und 4°C

zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet über Nacht getrocknet.

Anschließend wurde das Pellet in 3 ml H2O resuspendiert und in Eppis (500 µl/Eppi)

überführt. Nach Zugabe von 1,5 V (750 µl) QIAzol wurden die Proben gevortex und für

5 Minuten bei RT inkubiert. Anschließend wurden 0,2 V (250 µl) Chloroform

dazugegeben und die Proben kräftig geschüttelt. Nach einer Inkubation von 3 Minuten

bei RT wurden die Proben zur Phasentrennung für 15 Minuten bei 13200 rpm und 4°C

zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in Eppis überführt und mit 1,5 V 100%

EtOH versetzt. Nach kräftigem Mischen mit der Pipette wurden die Proben auf



Im letzten Schritt wurde die RNA mit 50 µl H2O von den Säulen eluiert. Dabei wurden

die Säulen für 1 Minute bei 13200 rpm und RT zentrifugiert. Die Konzentration der


58

isolierten sec-RNA wurde mit dem Qubit gemessen. Die RNA-Profilanalyse wurde mit

dem Agilent 2100 Bioanalyzer durchgeführt.

2.17.11. Sequenzierung

Zunächst wurde die RNA mit einer RNA 5'-Polyphosphatase (Epicenter) behandelt.

Anschließend wurden Oligonukleotid-Adapter an den 5`- und 3`- Enden der RNA

ligiert. Die first-strand cDNA-Synthese wurde mit der M-MLV Reverse Transcriptase

(ThermoFisher Scientific) durchgeführt, wobei der 3`-Adapter als Primer diente. Die

resultierende cDNA wurde mit einer high fidelity DNA-Polymerase (ThermoFisher

Scientific) über PCR amplifiziert. Anschließend wurde die cDNA mit dem Agencourt

AMPure XP Kit (Beckman Coulter Genomics) aufgereinigt. Die Menge und

Größenverteilung der cDNA wurde mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer analysiert.

Anschließend wurden die cDNA libraries verdünnt und mit dem MiSeq Next

Generation Sequencer mittels MiSeq Reagent Kit V2 (Illumina) sequenziert und

analysiert. Die Adapter-Sequenzen wurden mittels Sequence Quality Trimming mit

cutadapt 1 entfernt (Martin, 2011). Die reads wurden gegen das Referenzgenom von L.

monocytogenes mittels CLC Genomics Workbench (Qiagen) gemappt (Glaser et al,

2001).

2.17.12. Herstellung von RNA durch in vitro Transkription (IVT)

Die 25 ausgesuchten RNA-Kandidaten, die in den sekretierten RNA-Fraktionen von L.

monocytogenes identifiziert worden sind, wurden enzymatisch durch in vitro Trans-

kription mittels T7-RNA-Polymerase (NEB) hergestellt. Zunächst wurde das DNA-

template durch PCR hergestellt. Dabei enthielt der Vorwärtsprimer am 5`-Ende die

Sequenz des Promotors der T7-RNA-Polymerase (5`-taatacgactcactatagg-3`). Anschlie-

ßend wurden die PCR-Produkte in 1%ige und 2%ige Agarosegele aufgetrennt,

visualisiert und fotografiert. Nach Aufreinigung der PCR-Produkte wurde die DNA-

Konzentration mit dem NanoDrop gemessen. Es folgte die in vitro Transkription der

DNA in RNA.


59


Anschließend wurden die Proben für 3 Stunden bei 37°C auf dem Thermomixer

inkubiert.

2.17.13. Verdau des DNA-templates

Nach der in vitro Transkription wurde das DNA-template in den Proben durch DNase-

Verdau mit der DNase I, RNase-free (ThermoFisher Scientific) entfernt. Hierfür wurden

5 µl DNase I (2 U/µl) und 5 µl 10× DNase I-Puffer zu den Proben hinzugefügt. Das

Gesamtvolumen der Proben betrug 50 µl. Danach wurden die Proben für 1 Stunde bei

37°C auf dem Thermomixer inkubiert. Anschließend wurde die DNase I durch Zugabe

von 5 µl EDTA (50 mM) und eine Inkubation von 10 Minuten bei 75°C auf dem

Thermomixer deaktiviert.

2.17.14. Dephosphorylierung von RNA

Um die 5`-Triphosphat-Gruppe der RNAs, die durch in vitro Transkription hergestellt

worden sind, sowie der RNAs in sec-RNA und MVs-RNA zu entfernen, wurde eine

Dephosphorylierung mit der Alkaline Phosphatase, Calf intestinal (NEB) durchgeführt.

Hierfür wurden 1 µl Alkalische Phosphatase (10 U/µl) und 5 µl 10× Alkalische

Phosphatase-Puffer zu 1 µg RNA hinzugefügt. Das Gesamtvolumen der Proben betrug

50 µl. Die Proben wurden für 1 Stunde bei 37°C auf dem Thermomixer inkubiert.

Anschließend wurde die RNA durch Phenol/Chloroform-Fällung aufgereinigt.


DNA 1 µg

T7-RNA-Polymerase (50 U/µl) 2 µl

10× T7-RNA-Polymerase-Puffer 5 µl

DTT (100 mM) 5 µl

rNTP-Mix (25 mM) 4 µl

RNaseOut (40 U/µl) 2 µl

H2O x µl



60

2.17.15. Denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Nach Herstellung der 25 ausgesuchten RNA-Kandidaten durch in vitro Transkription

wurden diese unter denaturierenden Bedingungen (7 M Harnstoff) in 10%ige und

12%ige Polyacrylamidgele elektrophoretisch aufgetrennt. Die Zugabe von Harnstoff

verhindert die Bildung von Sekundärstrukturen, wodurch eine Auftrennung der RNA

nach Länge erfolgt. Hierfür wurden jeweils 10 µl aus den in vitro Transkriptions-

ansätzen auf das Gel aufgetragen. Vor dem Auftragen wurden die RNA-Proben mit

Ladepuffer in einem Verhältnis von 1:1 vermischt und für 10 Minuten bei 65°C auf dem

Thermomixer inkubiert. Danach wurden die Proben auf Eis gestellt.

Die Auftrennung der RNA erfolgte in 20 cm × 20 cm große Glasplatten, die in vertikale

Kammern reingelegt wurden. Die Kammern wurden zuvor mit 1× TBE-Puffer befüllt.

Die Elektrophorese wurde für 2 Stunden bei 400 V, 150 mA und 150 W durchgeführt.

Zur Färbung der RNA wurden die Gele in ethidiumbromidhaltiges 1× TBE-Puffer für

10 Minuten reingelegt. Anschließend wurde die RNA auf einem UV-Tisch (365 nm)

visualisiert und fotografiert. Um die Größe der RNA bestimmen zu können, wurde ein

RNA-Größenstandard verwendet (Abb. 2.1). Die entsprechenden RNA-Banden wurden

mit einem Skalpell aus dem Gel herausgeschnitten, in Eppis überführt und bei -80°C

gelagert.

2.17.16. Extraktion von RNA aus dem Polyacrylamidgel

Um die RNA aus dem Polyacrylamidgel zu extrahieren, wurden die Gelstücke zunächst

mit einem Skalpell in kleine Stücke geschnitten und danach mit 500 µl Elutionspuffer

[0,5 M NaOAc (pH = 5,0), 1 mM EDTA (pH = 8,0) und 2,5% Phenol (v/v)] versetzt.

Anschließend wurde die RNA durch wiederholtes Einfrieren in flüssigem Stickstoff,

Auftauen und Vortexen sowie einer Inkubation über Nacht bei 1500 rpm auf dem

Thermomixer aus dem Gel extrahiert. Es folgte die Aufreinigung der RNA durch

Phenol/Chloroform-Fällung.

2.17.17. Phenol/Chloroform-Fällung von RNA

Nach Dephosphorylierung der RNA und Extraktion der RNA aus dem Polyacrylamidgel

wurde die RNA durch Phenol/Chloroform-Fällung aufgereinigt. Hierfür wurden die

RNA-Proben mit 1,5 V (750 µl) Phenol/Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1, pH = 4,5-

5,0) versetzt und gevortext. Das Gesamtvolumen der Proben betrug 500 µl. Nach einer


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Inkubation von 5 Minuten bei RT folgte die Phasentrennung durch eine Zentrifugation

von 15 Minuten bei 13200 rpm und 4°C. Die obere wässrige Phase wurde in Eppis

überführt und mit 0,1 V 3 M NaOAc (pH = 4,8-5,2) und 2 V 100% EtOH versetzt.

Anschließend wurden die Proben für mindestens 1 Stunde bei -80°C inkubiert. Nach

dieser Inkubation wurden die Proben für 15 Minuten bei 13200 rpm und 4°C zentri-

fugiert. Der Überstand wurde verworfen und das RNA-Pellet wurde über Nacht

getrocknet. Im letzten Schritt wurde das RNA-Pellet in 50 µl H2O resuspendiert. Die

RNA-Konzentration wurde mit dem Qubit gemessen.

2.18. Proteinanalytische Methoden

2.18.1. Isolierung von Membrane Vesicles (MVs), die von L. monocytogenes

produziert werden

Für die Isolierung von MVs, die von Lm, Lm-pERL3-rli32 und Lm-pERL3-ssrS

produziert werden, wurden Übernachtkulturen in BHI-Medium angezogen. Das Mini-

malmedium (2 L) wurde nach Fertigstellung auf 6× 1 L Erlenmeyer-Kolben aufgeteilt

(ca. 300 ml Medium/Kolben). Anschließend wurden die Übernachtkulturen 1:50 in

Minimalmedium eingeimpft und die Kolben bei 37°C und 180 rpm auf dem Schüttler

inkubiert. Zuvor wurden 5 µg/ml Erythromycin ins Medium der beiden überexpri-

mierenden Stämme pipettiert. Nach Erreichen einer OD600nm von 1 wurden die

Bakterienkulturen in 6× 500 ml Zentrifugenbecher überführt und für 15 Minuten bei

9000 rpm und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Express PLUS 0,22

µm Filtereinheit steril filtriert. Anschließend wurde der Überstand durch Ultrafiltration

mit einer Membran mit einem Cut Off von 30 kDa auf ca. 30 ml eingeengt. Der

eingeengte Überstand (das Ultrafiltrat) wurde zunächst mit einer Millex-GV 0,22 µm

Filtereinheit steril filtriert. Danach wurde das Ultrafiltrat in 3 Röhrchen für den SW41

Ti-Rotor der Ultrazentrifuge überführt und für 3 Stunden bei 30000 rpm und 4°C

abzentrifugiert. Hierdurch wurden die während des Wachstums produzierten und ins

Medium abgegebenen MVs pelletiert. Das MVs-Pellet wurde zunächst getrocknet,

danach in 300 µl PBS resuspendiert und bei -80°C gelagert.

2.18.2. Bestimmung der Proteinkonzentration mit der Bradford-Methode

Die Messung der Proteinkonzentration von isolierten MVs wurde mit der Bradford-

Methode durchgeführt. Diese Methode beruht auf der Anlagerung des Farbstoffs


62

Coomassie an kationische und nichtpolare, hydrophobe Seitenketten von Proteinen.

Dadurch kommt es zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums des Farbstoffs

von 450 zu 595 nm. Da die Zunahme der Absorption bei 595 nm direkt proportional zur

Proteinkonzentration in der Lösung ist, lässt sich unter Verwendung einer Eichkurve die

Proteinkonzentration bestimmen.

Für die Messung wurden jeweils 10 µl MVs-Probe (1:3 in PBS verdünnt) zu 200 µl

Bradford-Reagenz (1:5 in H2O verdünnt) in einer 96er-Well Platte pipettiert und

vermischt. In einem parallelen Ansatz wurde zur Herstellung einer Eichkurve eine

BSA-Verdünnungsreihe in PBS angesetzt. Anschließend wurden jeweils 10 µl aus der

BSA-Verdünnungsreihe zu 200 µl Bradford-Reagenz pipettiert und vermischt. Sowohl

für die MVs-Proben als auch für die Eichkurve wurden Doppelbestimmungen durch-

geführt. Die Platte wurde für 5 Minuten bei RT inkubiert. Anschließend wurde die

optische Dichte der Proben bei 595 nm mit einem Photometer gemessen. Zur Aus-

wertung wurde eine Eichkurve hergestellt, wobei die Absorption (x-Achse) gegen die

Proteinkonzentration (y-Achse) des BSA-Standards aufgetragen wurde. Für die

Berechnung der Proteinkonzentration wurde die Gleichung verwendet, die man nach

dem Erstellen der Regressionsgerade erhält.

2.18.3. Bestimmung der Proteinkonzentration mit der BCA-Methode

Die Fähigkeit von MVs in PtK-Zellen zu internalisieren, wurde durch Detektion des

Autolysins P60 im Zelllysat über Western blot untersucht. Hierfür wurde zunächst die

Proteinkonzentration des Zelllysats der PtK-Zellen mit der BCA-Methode bestimmt.

Grundlage für die BCA-Methode ist die Reduktion von Cu2+

zu Cu+ durch

Peptidbindungen unter alkalischen Bedingungen. Das entstandene Cu+ bildet mit

Bicinchoninsäure (BCA) einen Farbkomplex mit einem Absorptionsmaximum bei 562

nm.

Für die Messung der Proteinkonzentration des Zelllysats wurden jeweils 6,25 µl Probe

(1:5 in RIPA-Puffer verdünnt) zu 50 µl BCA-Reagenz in einer 96er-Well Platte

pipettiert und vermischt. In einem parallelen Ansatz wurde zur Herstellung einer

Eichkurve eine BSA-Verdünnungsreihe in RIPA-Puffer angesetzt. Anschließend

wurden jeweils 6,25 µl aus der BSA-Verdünnungsreihe zu 50 µl BCA-Reagenz

pipettiert und vermischt. Sowohl für die Proben als auch für die Eichkurve wurden

Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Platte wurde für 30 Minuten bei 37°C


63

inkubiert. Anschließend wurde die optische Dichte der Proben bei 562 nm mit einem

Photometer gemessen. Die Auswertung erfolgte ähnlich wie bei der Bradford-Methode.

2.18.4. Probenvorbereitung für die Elektronenmikroskopie (EM)

Für die Transmissionselektronenmikroskopie wurde zunächst ein Tropfen aus den MVs-

Proben auf ein Trägermaterial (Grid) pipettiert. Anschließend wurde zur Kontrastierung

ein Tropfen aus einer 3%igen Uranylacetat-Lösung auf die Proben pipettiert und

vermischt. Nach einer Inkubation von wenigen Minuten bei RT wurde die Flüssigkeit

mit einem Filterpapier abgezogen. Anschließend wurden die Proben analysiert.

Für die Rasterelektronenmikroskopie wurden die Lm-Proben zunächst mit 5%

Formaldehyd und 1% Glutaraldehyd chemisch fixiert. Anschließend wurden die Proben

durch eine aufsteigende Aceton-Reihe (10-100%) dehydriert und durch Kritische-

Punkt-Trocknung (KPT) mit CO2 in der KPT-Anlage getrocknet. Um eine Aufladung

der Proben zu vermeiden, wurden elektrisch leitende Schichten aus Gold-Palladium auf

die Oberfläche der Proben durch Sputtern aufgebracht. Anschließend wurden die

Proben analysiert.

2.18.5. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE)

Durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese werden Proteine in einem Netzwerk aus

Acrylamid/Bisacrylamid elektrophoretisch nach Größe aufgetrennt. Durch Zugabe des

Detergenz SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) werden nicht-kovalente Bindungen in den

Proteinen gelöst. Zur Reduktion von Disulfidbrücken wird β-Mercaptoethanol im

Ladepuffer hinzugefügt. Darüber hinaus wurden die Proben vor dem Auftragen auf das

Gel für 5 Minuten bei 95°C aufgekocht. Zuvor wurden die Proben mit 2× Ladepuffer

vermischt. Durch die Einwirkung von SDS, Reduktionsmittel und Hitze werden die

Proteine vollständig denaturiert. Durch die Bindung von SDS-Anionen an die Haupt-

kette erhalten die Proteine eine konstant negative Ladungsverteilung. Daraufhin

wandern die Proteine in einem elektrischen Feld zum positiven Pol.

Die in dieser Arbeit verwendeten Gele bestanden aus einem Sammelgel (4%) und einem

Trenngel (12%). Das Sammelgel dient zum Bündeln der aufgetragenen Proben und

ermöglicht für alle Proteine den gleichen Startpunkt für die Trennung im Trenngel.

Die Auftrennung der Proteine erfolgte in 10 cm × 10 cm große Glasplatten, die in

vertikale Kammern reingelegt wurden. Die Kammern wurden zuvor mit 1×


64

Elektrophorese-Puffer befüllt. Die Elektrophorese wurde für 90 Minuten bei 125 V und

25 mA/Gel durchgeführt. Die Gele wurden über Nacht in Coomassie-Färbelösung

gefärbt und anschließend mittels Bitzentfärber teilentfärbt.

2.18.6. Western blot-Analyse von MVs

Die Anwesenheit des Autolysins P60 und der beiden Virulenzfaktoren, InlB und LLO,

in den von L. monocytogenes produzierten MVs wurde über Western blot untersucht.

Dies ist ein Verfahren zur Detektion von bestimmten Proteinen in einem Protein-

gemisch über spezifische Antikörperbindung.

Die durch SDS-PAGE aufgetrennten Proteine in den MVs-Proben wurden zunächst

elektrophoretisch aus dem Gel auf eine PVDF-Membran übertragen. Diese wurde zuvor

für 1 Minute in 100% Methanol inkubiert, anschließend in H2O geschwenkt und für

eine weitere Minute in 1× Blot-Puffer inkubiert. Anschließend wurde das Gel in einem

Stapel aus Whatman-Filterpapieren, die zuvor für 1 Minute in 1× Blot-Puffer inkubiert

wurden, auf die PVDF-Membran in der Blotting-Apparatur gelegt. Der Transfer der

Proteine aus dem Gel auf die Membran erfolgte für 90 Minuten bei 50 V und 54

mA/Gel.

Um freie Bindungsstellen auf der PVDF-Membran zu blockieren, wurde diese für 1

Stunde bei RT in 1× TBS-Tween 20-Puffer* geschwenkt. Anschließend wurde die

Membran mit dem primären Antikörper (mouse anti-P60, mouse anti-InlB bzw. mouse

anti-LLO) über Nacht bei 4°C geschwenkt. Die Antikörper wurden wie folgt in 1×

TBS-Tween 20-Puffer* verdünnt: mouse anti-P60 (1:50), mouse anti-InlB (1:10) und

mouse anti-LLO (1:10). Am nächsten Tag wurde die PVDF-Membran 3mal für jeweils

5 Minuten in 1× TBS-Tween 20-Puffer bei RT geschwenkt. Es folgte die Inkubation der

Membran mit dem sekundären Antikörper für 1 Stunde bei RT. Hierfür wurde ein goat

anti-mouse IgG-HRP, der 1:2000 in 1× TBS-Tween 20-Puffer* verdünnt wurde,

verwendet. Anschließend wurde die Membran erneut 3mal für jeweils 5 Minuten in 1×

TBS-Tween 20-Puffer bei RT geschwenkt. Der 1× TBS-Tween 20-Puffer* enthielt 5%

Milch (w/v).

Die Detektion der Proteine erfolgte durch Chemilumineszenz mit dem ECL-System

(GE Healthcare). Hierfür wurde die Membran zunächst für 1 Minute in ECL-Lösung 1

und 2 (1:1) inkubiert. Dadurch wurde die von der Meerrettich-Peroxidase (HRP) kataly-


65

sierte Reaktion gestartet. Durch anschließendes Auflegen eines Röntgenfilms wurden

die Proteinbanden sichtbar gemacht.

2.18.7. Untersuchung der Internalisierung von MVs in PtK-Zellen

Am Vortag wurden PtK-Zellen in MEM + 10% FKS + 1% NEA in einer 24er-Well

Platte ausgesät. Vor der Zugabe von MVs wurde das Medium der Zellen gewechselt.

Anschließend wurden 5 bzw. 10 µg MVs ins Medium zu den Zellen pipettiert. Als

Negativkontrolle dienten Zellen, die nicht mit MVs inkubiert wurden. Nach einer

Inkubation von 24 Stunden wurde das Medium abgesaugt und die Zellen wurden 3mal

mit jeweils 500 µl PBS/Well gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 300 µl

PBS/Well abgedeckt, mit einem Zellschaber abgeschabt und in Eppis überführt. Die

Zellen wurden für 5 Minuten bei 13200 rpm und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand

wurde verworfen und die Zellen wurden mit 10 µl RIPA-Puffer + Protease-Inhibitoren

lysiert. Hierfür wurden die Proben für 30 Minuten bei 4°C und 300 rpm auf dem

Thermomixer inkubiert. Nach einer Zentrifugation von 10 Minuten bei 13200 rpm und

4°C wurde der Überstand (das Zelllysat) in Eppis überführt.

Zunächst wurde die Proteinkonzentration des Zelllysat mit der BCA-Methode bestimmt.

Danach wurden die Proteine im Zelllysat durch SDS-PAGE nach Größe aufgetrennt,

wobei 15 µg Protein/Ansatz aufgetragen wurden. Anschließend wurden die Proteine

durch Western blot auf eine PVDF-Membran übertragen. Es folgte die Detektion des

Autolysins P60 im Zelllysat über spezifische Antikörperbindung. Hierfür wurden mouse

anti-P60 (1:50) und goat anti-mouse IgG-HRP (1:2000) verwendet. Beide Antikörper

wurden in 1× TBS-Tween 20-Puffer* verdünnt. Um sicherzustellen, dass von jedem

Ansatz die gleiche Proteinmenge aufgetragen wurde, wurde das Haushaltsgen β-Aktin

als Ladekontrolle verwendet. Für die Detektion von β-Aktin wurden rabbit anti-β-Aktin

(1:2000 in 1× TBS-Tween 20-Puffer** verdünnt) und goat anti-rabbit IgG-HRP (1:2000

in 1× TBS-Tween 20-Puffer* verdünnt) verwendet. Der 1× TBS-Tween 20-Puffer*

enthielt 5% Milch (w/v). Der 1× TBS-Tween 20-Puffer** enthielt 5% BSA (w/v).

2.18.8. Hämolyse-Assay

Die hämolytische Aktivität von MVs wurde anhand der Lyse von Schafserythrozyten

untersucht. Zunächst wurde das Schafsblut in ein 50 ml Greiner-Röhrchen überführt und

solange mit PBS gewaschen bis der Überstand klar war. Hierfür wurde das Röhrchen


66

mehrmals invertiert und für 5 Minuten bei 4000 rpm und 4°C zentrifugiert. Anschlie-

ßend wurde eine 1%ige Erythrozyten-Lösung mit Hämolyse-Puffer hergestellt. Für die

Herstellung des Hämolyse Puffers wurden 50 mM NaH2PO4 × H2O und 150 mM NaCl

abgewogen und in H2O gelöst. Nach dem der pH-Wert auf 6,6 eingestellt wurde,

wurden 0,1% BSA (w/v) und 5 mM DTT hinzugefügt.

In einer 96er-Well Platte wurden zunächst 50 µl/Well Hämolyse-Puffer vorgelegt.

Anschließend wurden 10 µg MVs in einem Volumen von 50 µl im ersten Well pipettiert,

vermischt und in das nächste Well der Reihe überführt. Hierdurch wurde die MVs-Probe

1:2 verdünnt. Diese Verdünnungsreihe wurde mit allen nachfolgenden Wells der Reihe

durchgeführt. Aus dem letzten Well der Reihe wurden 50 µl verworfen. In der 2ten

Reihe wurde eine weitere Verdünnungsreihe mit PBS, das als Negativkontrolle diente,

angesetzt. In einem weiteren Well wurden 50 µl H2O zu den 50 µl Hämolyse-Puffer

pipettiert. Der durch H2O erzielte hämolytische Effekt entspricht der maximalen

Hämolyse (100%-Wert). Nach der Zugabe von 50 µl 1%ige Erythrozyten-Lösung/Well

und Mischen wurde die Platte für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die

Platte zentrifugiert und die Überstände in eine 96er-Well Platte überführt. Die optische

Dichte der Überstände wurde bei 405 nm mit einem Photometer gemessen.

2.19. Zellkultur-Methoden

2.19.1. Kultivierung von Zelllinien

Die Epithelzelllinien HEK293 und MDCK-II wurden in 10 ml DMEM + 10% FKS in

10 cm Zellkulturschalen kultiviert. Für die Epithelzelllinie PtK wurde MEM + 10%

FKS + 1% NEA verwendet. Nach Erreichen einer Konfluenz von 80-90% wurde das

Medium abgesaugt, die Zellen 1mal mit PBS gewaschen und mit 3 ml Trypsin/Schale

abgelöst. Die Zellen wurden für die weitere Kultivierung 1:3 in frischem Medium

verdünnt und in Schalen überführt. Die Zellen wurden bei 37°C und 5% CO2 im Brut-

schrank inkubiert. Vor jedem Versuch wurde die Zahl der Epithelzellen mikroskopisch

durch Auszählen der Zellen mittels Neubauer-Zählkammer bestimmt. Hierfür wurden

die Epithelzellen 1mal mit PBS gewaschen, mit Trypsin abgelöst, abzentrifugiert und in

ein bestimmtes Volumen an Medium aufgenommen. Anschließend wurde die Zellzahl

in einem 10 μl Aliquot gezählt und diese pro Milliliter berechnet.

Die BMDMs wurden 48 Stunden vor der Transfektion aus flüssigem Stickstoff auf-

getaut, in BMDM-Medium + 30% M-CSF aufgenommen, gezählt und in 12er-Well


67

Platten ausgesät. Am nächsten Tag wurde das Medium der Zellen gewechselt. Die

Zellen wurden bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank inkubiert. Das BMDM-Medium

setzte sich wie folgt zusammen: RPMI-Medium + 10% FKS + 50 µM β-Mercapto-

ethanol.

2.19.2. Gewinnung von primären Knochenmark-Makrophagen aus der Maus

Die von den einzelnen sRNAs, den sekretierten RNA-Fraktionen und MVs ausgelöste

Typ-I-IFN Antwort wurde in Knochenmark-Makrophagen (BMDMs = bone marrow-

derived macrophages) untersucht. Hierfür wurden BMDMs aus C57BL/6-Mäusen

isoliert.

Zunächst wurden Femur (Oberschenkel-Knochen) und Tibia (Schienbein) vom Fleisch

befreit und in 70% EtOH reingelegt. Anschließend wurden die Knochen in PBS rein-

gelegt. Unter sterilen Bedingungen wurden die Röhrenknochen an den Enden geöffnet

und die Markhöhle mit kaltem BMDM*-Medium mit Hilfe einer Kanüle durchgespült.

Die Knochenmarkzellen wurden zunächst durch ein Zellsieb passiert und danach durch

eine Zentrifugation von 5 Minuten bei 1500 rpm pelletiert. Anschließend wurden die

Zellen in BMDM*-Medium + 30% M-CSF resuspendiert und in 10 cm unbeschichteten

Petrischalen ausgesät. Die Schalen wurden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.

Die Ausdifferenzierung der Zellen zu BMDMs erfolgte in einem Zeitraum von 6 Tagen,

wobei am 4ten Tag ein Mediumwechsel durchgeführt wurde. Am 6ten Tag wurden die

Zellen durch Kryokonservierung eingefroren. Hierfür wurde zunächst das Medium

abgesaugt. Danach wurden die Zellen mit 5 ml BMDM*-Medium abgedeckt, mit einem

Zellschaber abgeschabt und in ein 50 ml Greiner-Röhrchen überführt. Die Zellen

wurden durch eine Zentrifugation von 5 Minuten bei 1500 rpm pelletiert. Anschließend

wurden die Zellen in FKS + 10% DMSO (Dimethylsulfoxid) resuspendiert. Die Zellen

wurden in Kryoröhrchen überführt und in einem speziellen Einfrierbehälter, der mit 2-

Propanol gefüllt war, zunächst bei -80°C gelagert. Diese Vorgehensweise gewährleistet

ein schrittweises Abkühlen von 1°C/Minute. Danach wurden die Zellen in flüssigem

Stickstoff überführt.

Das BMDM*-Medium setzte sich wie folgt zusammen: RPMI-Medium + 10% FKS +

50 µM β-Mercaptoethanol + 100 U/ml Penicillin + 100 µg/ml Streptomycin.


68

2.19.2.1. Gewinnung von M-CSF

Der Makrophagen-Differenzierungsfaktor M-CSF (macrophage colony stimulating

factor) wird von mouse fibroblast L929 cells produziert. Dieser unterstützt die Reifung

und das Wachstum von Makrophagen, die aus dem Knochenmark von Mäusen isoliert

werden (Ladner et al, 1988).

Für die Gewinnung von L929-Zellüberstand wurden die Zellen zunächst aus flüssigem

Stickstoff aufgetaut und danach bis zur Konfluenz in DMEM + 10% FKS in 10 cm

Zellkulturschalen kultiviert. Anschließend wurde das Medium abgesaugt, die Zellen

1mal mit PBS gewaschen und mit 3 ml Trypsin/Schale abgelöst. Die Zellen wurden in

DMEM + 5% FKS aufgenommen und auf große Zellkulturflaschen umgesetzt. Die

Zellen wurden 5 bis 6 Tage bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank inkubiert. Anschlie-

ßend wurde der Zellüberstand in 50 ml Greiner-Röhrchen überführt und für 5 Minuten

bei 3000 rpm abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, in 50 ml Greiner-

Röhrchen überführt und bis zur Verwendung bei -20°C gelagert.

2.19.3. Infektion von HEK293-Zellen mit A/PR/8/34 (H1N1)

24 Stunden nach der Transfektion von HEK293-Zellen mit den einzelnen sRNAs

wurden die Zellen zunächst mit PBS++

gewaschen und anschließend mit A/PR/8/34

(H1N1) für 1 Stunde bei RT infiziert. Dabei wurde eine MOI von 0,1 in PBS++

/BSA/P/S

eingesetzt. Nach dem das Virusinokulum abgesaugt wurde, wurden die Zellen mit

DMEM/FKS/P/S + 2 µg/ml Trypsin für 24 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.

2.19.3.1. Virusquantifizierung durch Focus Forming Assay (FFA)

Der FFA verwendet zur Detektion von infektiösen Viruspartikeln die Anfärbung von

virusspezifischen Antigenen mittels Antikörpern (Ma et al, 2010).

In einer 96er-Well Platte ausgesäte MDCK-II-Zellen wurden zunächst mit PBS++

gewaschen und anschließend mit 50 µl/Well einer 1:3 in PBS++

/BSA/P/S angesetzten

Verdünnungsreihe des virushaltigen Überstandes für 1 Stunde bei RT infiziert. Nach

dem das Virusinokulum abgesaugt wurde, wurden die Zellen mit Avicel-Medium

(DMEM/FKS + 1,25% Avicel + 2 µg/ml Trypsin) für 24 Stunden bei 37°C und 5% CO2

inkubiert. Die Überschichtung der Zellen mit einem halbfesten Overlay-Medium

verhindert die Ausbreitung von infektiösen Viruspartikeln, wodurch lokalisierte

Infektionsherde entstehen. Um diese zu detektieren wurden die Zellen zunächst mit 4%


69

Paraformaldehyd + 1% Triton X-100 in PBS++

für 1 Stunde bei 4°C fixiert und

permeabilisiert. Danach wurden die Zellen 3mal mit PBS++

+ 0,05% Tween 20

gewaschen. Die Zellen wurden mit 50 µl/Well des primären Antikörpers (mouse anti-

IAV-Nukleoprotein) für 1 Stunde bei RT inkubiert. Dieser wurde zuvor 1:100 in PBS++

+ 3% BSA verdünnt. Anschließend wurden die Zellen erneut 3mal mit PBS++

+ 0,05%

Tween 20 gewaschen. Es folgte die Zugabe von 50 µl/Well des sekundären Antikörpers

(goat anti-mouse IgG-HRP). Dieser wurde zuvor 1:1000 in PBS++

+ 3% BSA verdünnt.

Nach einer Inkubation von 1 Stunde bei RT wurden die Zellen 3mal mit PBS++

+ 0,05%

Tween 20 gewaschen und mit 40 µl/Well AEC staining solution inkubiert. Anschlie-

ßend wurden die Platten gescannt und mit dem Photoshop software package analysiert.

Das PBS++

setzte sich wie folgt zusammen: PBS + 1 mM MgCl2 + 0,9 mM CaCl2.

Das PBS++

/BSA/P/S setzte sich wie folgt zusammen: PBS++

+ 0,2% BSA + 100 U/ml

Penicillin + 100 µg/ml Streptomycin.

2.20. Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit dem zweiseitigen ungepaarten t-Test durchgeführt.

Alle Daten sind mit Mittelwert ± Standardabweichung (MW ± SA) dargestellt.

3. Ergebnisse

70

3. Ergebnisse

3.1. Isolierung und Identifizierung der von L. monocytogenes sekretierten RNA

3.1.1. Co-Isolierung von sec-RNA und MVs-RNA

Um die von L. monocytogenes sekretierte RNA zu isolieren, wurde ein Protokoll

entwickelt, das zunächst die Trennung beider RNA-Fraktionen und anschließend die

Isolierung der RNA beinhaltet (Abb. 3.1). Um eine Freisetzung von zellulärer RNA

durch Lyse der Bakterienzellen zu vermeiden, wurden die sekretierten RNA-Fraktionen

aus dem Überstand von Bakterienkulturen isoliert, die sich in der exponentiellen

Wachstumsphase befanden. Des Weiteren wurde ein chemisch definiertes Medium

verwendet, um eine Kontamination durch RNA, die in einem komplexen Medium wie

BHI-Medium vorhanden ist, auszuschließen (Premaratne et al, 1991).

Abb. 3.1: Co-Isolierung von sec-RNA und MVs-RNA. Lm wurde in 2 L Minimalmedium bis OD600nm

von 1 kultiviert und anschließend abzentrifugiert. Der steril filtrierte Überstand wurde durch Ultra-

filtration auf ca. 30 ml eingeengt. Anschließend wurden die MVs durch Ultrazentrifugation pelletiert. Das

MVs-Pellet diente für die Isolierung von MVs-RNA. Der MVs-freie Überstand wurde für die Isolierung

von sec-RNA verwendet.

Nach Abzentrifugation der Bakterienzellen wurde der Überstand steril filtriert und

durch Ultrafiltration mit einer Membran mit einem Cut Off von 30 kDa von 2 L auf ca.

30 ml eingeengt. Dies ist ein Verfahren um bestimmte Moleküle, abhängig von der

Porengröße der dabei verwendeten Membran, zu konzentrieren. Dabei wird die

Flüssigkeit aus der Lösung entfernt. Durch anschließende Ultrazentrifugation wurden

die MVs in dem eingeengten Überstand von L. monocytogenes-Kulturen pelletiert. Das

MVs-Pellet wurde in PBS aufgenommen. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration

mit der Bradford-Methode erfolgte die Isolierung der MVs-RNA. Zuvor wurde ein

RNase-Verdau durchgeführt, um die an der äußeren Oberfläche von MVs assoziierte

RNA zu entfernen. Aus dem eingeengten MVs-freien Überstand von L. monocytogenes-

Kulturen wurde die sec-RNA isoliert.

3. Ergebnisse

71

Aus 2 L L. monocytogenes-Kulturen wurden anhand dieses Protokolls 150-200 µg MVs

isoliert. Daraus wurden in einem weiteren Schritt ca. 12 µg MVs-RNA isoliert. Die

Konzentration an sec-RNA, die aus 2 L L. monocytogenes-Kulturen isoliert wurde,

beträgt ca. 120 µg.

3.1.2. Profilanalyse von sec-RNA und MVs-RNA

Nach Isolierung und Quantifizierung von sec-RNA und MVs-RNA wurde eine

Profilanalyse der beiden sekretierten RNA-Fraktionen mittels Agilent 2100 Bioanalyzer

durchgeführt (Abb. 3.2). Diese Technologie liefert eine visuelle Darstellung der Grö-

ßenverteilung von RNAs, die in einer RNA-Population vorhandenen sind. Die RNA

wird, ähnlich herkömmlicher Standardverfahren zur RNA-Analyse, elektrophoretisch

nach Größe aufgetrennt, wobei eine Gelmatrix als Trägermaterial dient. Dabei wird auf

der y-Achse die RNA-Menge in FU (fluorescence units) angegeben, während die x-

Achse die RNA-Länge in Nukleotiden (Nt) angibt.

(A) (B) (C)

Abb. 3.2: Profilanalyse von sec-RNA, MVs-RNA und zelluläre RNA. Die Profilanalyse der 3 RNA-

Fraktionen von Lm wurde mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer durchgeführt. Hierdurch wurde die Menge

(FU) und die Länge (Nt) der RNAs in den beiden sekretierten RNA-Fraktionen von Lm erstmals

visualisiert. Der Peak zwischen 25-200 Nt zeigt die Anwesenheit von kleinen nicht-kodierenden RNAs in

sec-RNA (A) und MVs-RNA (B). Die beiden Peaks in der zellulären RNA zeigen die ribosomalen RNAs,

16S- und 23S-rRNA (C).

Das typische Bild einer zellulären RNA-Präparation zeigt die beiden ribosomalen

RNAs, die 16S- und die 23S-rRNA (Abb. 3.2C). Die beiden sekretierten RNA-

Fraktionen, sec-RNA und MVs-RNA, hingegen weisen ein völlig anderes RNA-Profil

auf (Abb. 3.2A und 3.2B). In beide RNA-Fraktionen sind kleine nicht-kodierende

RNAs mit einer Größe, die weniger als 200 Nt beträgt, zu sehen. Diese überwiegen in

MVs-RNA, während in sec-RNA auch längere RNAs, darunter ribosomale RNAs, zu

sehen sind.

3. Ergebnisse

72

Um eine höhere Auflösung der kleinen nicht-kodierenden RNA-Population in sec-RNA

und MVs-RNA zu erreichen, wurde ein Small RNA Chip verwendet. Dadurch können

RNAs mit einer Länge von 6-150 Nt analysiert werden. Die Abb. 3.3 zeigt die Größen-

verteilung der kleinen nicht-kodierenden RNAs in sec-RNA (Abb. 3.3A) und MVs-

RNA (Abb. 3.3B). In sec-RNA besteht diese RNA-Population überwiegend aus 60 Nt

langen RNAs, während in MVs-RNA die 20 Nt langen RNAs überwiegen.

(A) (B)

Abb. 3.3: Profilanalyse von sec-RNA und MVs-RNA. Um eine höhere Auflösung der kleinen nicht-

kodierenden RNA-Population in den sekretierten RNA-Fraktionen von Lm zu erzielen, wurde ein Small

RNA Chip verwendet. Diese Analyse zeigt, dass die Zusammensetzung dieser RNA-Population in sec-

RNA (A) und MVs-RNA (B) unterschiedlich ist. In sec-RNA haben diese RNAs eine Länge von

überwiegend 60 Nt. In MVs-RNA hingegen überwiegen die 20 Nt langen RNAs.

3.1.3. Untersuchung der Fähigkeit von sec-RNA und MVs-RNA IFN-β zu

induzieren

Die von L. monocytogenes sekretierten RNA-Fraktionen, sec-RNA und MVs-RNA,

wurden auf deren Fähigkeit IFN-β zu induzieren, untersucht. Hierfür wurden jeweils

100 ng sec-RNA, MVs-RNA und zelluläre RNA in BMDMs transfiziert. Die zelluläre

RNA diente als Vergleich zu den beiden sekretierten RNA-Fraktionen. In einem

weiteren Ansatz wurden die 3 RNA-Fraktionen vor deren Transfektion in BMDMs mit

der Alkalischen Phosphatase (CIAP) dephosphoryliert. Nach einer Inkubation von 6

Stunden wurde die IFN-β Induktion über RT-PCR untersucht (Abb. 3.4). Zuvor wurde

die RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Die Berechnung der relativen Expre-

ssion erfolgte über das effizienz-korrigierte relative Quantifizierungsmodell (Pfaffl,

2001). Zur Normalisierung der Expressionsergebnisse wurde die Expression des

Zielgens (IFN-β) auf ein nicht-reguliertes Haushaltsgen (Rplp) in der gleichen Probe

bezogen.

3. Ergebnisse

73

Abb. 3.4: IFN-β Induktion in BMDMs durch sec-RNA und MVs-RNA. Jeweils 100 ng aus den 3

RNA-Fraktionen, sec-RNA, MVs-RNA und zelluläre RNA, von Lm wurden in BMDMs transfiziert. 6

Stunden später wurde die IFN-β Induktion über RT-PCR untersucht. Sec-RNA und MVs-RNA haben zu

einem signifikanten Anstieg der IFN-β Induktion im Vergleich zu der zellulären RNA geführt. Die

Dephosphorylierung der sekretierten RNA-Fraktionen vor deren Transfektion in BMDMs hat zu einer

signifikanten Reduktion der IFN-β Induktion geführt. (*P ˂0,05; **P ˂0,01; ns = nicht signifikant)

Die Abb. 3.4 zeigt, dass nach Transfektion der 3 RNA-Fraktionen in BMDMs sec-RNA

die höchste IFN-β Antwort ausgelöst hat, gefolgt von MVs-RNA. Beide sekretierte

RNA-Fraktionen haben zu einem signifikanten Anstieg der IFN-β Induktion im

Vergleich zu der zellulären RNA geführt. Diese zeigen ein Vielfach höheres IFN-β

Induktionspotential als die zelluläre RNA. Die in BMDMs ausgelöste IFN-β Antwort ist

durch sec-RNA ca. 70fach und durch MVs-RNA ca. 20fach höher im Vergleich zu der

zellulären RNA. Die Dephosphorylierung von sec-RNA und MVs-RNA mit der

Alkalischen Phosphatase (CIAP) vor deren Transfektion in BMDMs hat zu einer

signifikanten Reduktion der IFN-β Induktion geführt.

3.1.4. Analyse der Zusammensetzung von sec-RNA und MVs-RNA

Um die Zusammensetzung der sekretierten RNA-Fraktionen von L. monocytogenes zu

identifizieren, wurde eine Sequenzierung durchgeführt. Die zelluläre RNA, die als

Vergleich diente, wurde ebenfalls sequenziert. Für die Sequenzierung wurden von jeder

RNA-Fraktion 3 biologische Replikate verwendet. Die Abb. 3.5 zeigt die Anzahl der

total reads, die an das Referenzgenom von L. monocytogenes gemappt haben (Glaser et

al, 2001). Diese weisen eine hohe Reproduzierbarkeit auf.

3. Ergebnisse

74

Abb. 3.5: Anzahl der total reads in % in den 3 RNA-Fraktionen von L. monocytogenes. Durch

Sequenzierung wurden die RNA-Spezies in den beiden sekretierten RNA-Fraktionen von Lm erstmals

identifiziert. Auffallend ist der höhere Anteil an kleinen nicht-kodierenden RNAs (sRNAs) in sec-RNA

im Vergleich zu der zellulären RNA. In MVs-RNA hingegen ist der Anteil an mRNAs höher als in der

zellulären RNA. Beide sekretierte RNA-Fraktionen enthalten mehr tRNAs als die zelluläre RNA.

Die häufigste RNA-Spezies in sec-RNA und MVs-RNA ist rRNA (47,9% und 64,4%),

wobei in MVs-RNA der Anteil höher ist. In der zellulären RNA macht die rRNA 80,6%

aus.

Zu der zweithäufigsten RNA-Spezies in MVs-RNA zählen mRNA-Fragmente mit 18%.

Deren Anteil in MVs-RNA ist deutlich höher als in sec-RNA (6,7%) und zellulärer

RNA (6%). In sec-RNA hingegen gehören sRNAs mit 12,9% zu der zweithäufigsten

RNA-Spezies. Diese sind in sec-RNA im Vergleich zu der zellulären RNA (2,4%)

deutlich angereichert. Der Anteil an sRNAs in MVs-RNA beträgt 0,7%.

Der Anteil an tRNAs in den beiden sekretierten RNA-Fraktionen, sec-RNA (8,3%) und

MVs-RNA (11,3%), ist deutlich höher als in der zellulären RNA (0,2%). Besonders 2

tRNAs, lmot28 (tRNA-Met) und lmot67 (tRNA-Val), weisen in MVs-RNA eine viel

höhere Anzahl an reads auf als in der zellulären RNA.

Des Weiteren ist die Region zwischen lmo2271 und lmo2332, die den Prophagen A118

kodiert, in sec-RNA deutlich angereichert (Rabinovich et al, 2012). Diese weist eine

geringere Anzahl an reads in MVs-RNA auf und ist in der zellulären RNA nahezu

abwesend.

3.1.5. Herstellung einzelner sRNAs durch in vitro Transkription

Im Vorfeld wurde gezeigt, dass die von L. monocytogenes sekretierten RNA-

Fraktionen, sec-RNA und MVs-RNA, eine hohe IFN-β Antwort in BMDMs auslösen.

In einem weiteren Schritt wurde die Zusammensetzung der beiden sekretierten RNA-

3. Ergebnisse

75

Fraktionen identifiziert. Als nächstes wurde untersucht welchen Beitrag einzelne in sec-

RNA und MVs-RNA identifizierte RNAs an der IFN-β Antwort haben. Hierfür wurden

insgesamt 25 RNA-Kandidaten, 23 sRNAs und 2 tRNAs, ausgesucht und auf deren

Fähigkeit IFN-β zu induzieren, untersucht. Hierbei handelt es sich um sRNAs, die in

sec-RNA eine höhere Anzahl an reads aufweisen als in der zellulären RNA (rli48, rli62,

rliG, SRP, ssrA und ssrS). Diese zählen in MVs-RNA zu den sRNAs mit der höchsten

Anzahl an reads. Darüber hinaus wurden auch solche sRNAs ausgesucht, die in beiden

sekretierten RNA-Fraktionen eine geringe Anzahl an reads aufweisen (rli100, rli105

und rli114). Ein weiteres Kriterium für die Auswahl der sRNAs war deren Trans-

kriptionslevel während des intra- bzw. extrazellulären Wachstums von L. monocyto-

genes. So zählen rli32, rli47, rli48, rli51, rli98, rli105 und rliG zu den sRNAs deren

Transkriptionslevel während des intrazellulären Wachstums höher ist. Andere hingegen,

wie rli62, rli87, rli90, rli99, rli108, rli114, rnpB, ssrA und ssrS, weisen während des

extrazellulären Wachstums einen höheren Transkriptionslevel auf (Mraheil et al, 2011).

Des Weiteren wurden 2 tRNAs ausgesucht, die in den sekretierten RNA-Fraktionen

häufiger vertreten sind als in der zellulären RNA, zum einen lmot11 (tRNA-Serin) in

sec-RNA und zum anderen lmot67 (tRNA-Val) in MVs-RNA.

Der erste Schritt bestand darin die 25 ausgesuchten RNA-Kandidaten herzustellen. Die

Abb. 3.6 zeigt die einzelnen Schritte, die für die Herstellung der RNAs durchgeführt

worden sind. Die RNAs wurden enzymatisch durch in vitro Transkription mit der T7-

RNA-Polymerase hergestellt. Diese katalysiert die Synthese von ssRNA in 5`-3`-

Richtung von einem DNA-template aus, das stromabwärts vom T7-spezifischen

Promotor (5`-taatacgactcactataGg-3`) liegt. Die T7-RNA-Polymerase bevorzugt an der

Position +1 ein G (in der Sequenz groß geschrieben), daher beginnen die RNA-

Transkripte mit 5´-GG. Darüber hinaus besitzen die so hergestellten RNAs am 5`-Ende

eine Triphosphat-Gruppe.

3. Ergebnisse

76

Abb. 3.6: Schematische Darstellung der einzelnen Schritte für die Herstellung der 25 RNA-

Kandidaten. Im ersten Schritt wurde das DNA-template durch PCR hergestellt. Nach Aufreinigung der

PCR-Produkte wurde die in vitro Transkription (IVT) mit der T7-RNA-Polymerase durchgeführt.

Anschließend wurden die RNAs in denaturierende Polyacrylamidgele aufgetrennt. Im letzten Schritt

wurden die RNAs aus dem Gel herausgeschnitten und aufgereinigt.

Die DNA-templates für die Herstellung der einzelnen RNAs durch in vitro

Transkription wurden durch PCR hergestellt. Dabei enthielt der Vorwärtsprimer am 5`-

Ende die Sequenz des Promotors der T7-RNA-Polymerase. Die PCR-Produkte wurden

zunächst in 1%ige und 2%ige Agarosegele aufgetrennt und danach visualisiert und

fotografiert (Abb. 3.7). Nach Aufreinigung der PCR-Produkte folgte die in vitro

Transkription der DNA in RNA. Die hergestellten RNAs wurden unter denaturierenden

Bedingungen (7 M Harnstoff) in 10%ige und 12%ige Polyacrylamidgele aufgetrennt

(Abb. 3.8). Durch die Zugabe von Harnstoff wurde die Bildung von Sekundärstrukturen

verhindert, so dass die RNAs nach Länge aufgetrennt wurden.

3. Ergebnisse

77

Abb. 3.7: DNA-templates für die Herstellung der 25 RNA-Kandidaten durch in vitro Transkription.

Nach Herstellung der DNA-templates für die in vitro Transkription durch PCR wurden die PCR-Produkte

in 1%ige und 2%ige Agarosegele aufgetrennt. Zur Größenbestimmung der PCR-Produkte wurde ein

DNA-Größenstandard (Abb. 2.1) verwendet.

Die T7-RNA-Polymerase kann zusätzlich als RNA-abhängige RNA-Polymerase

funktionieren, wenn die synthetisierte RNA am 3`-Ende eine gewisse Selbst-

komplementarität aufweist, wodurch es zur Bildung einer Haarnadelschleife kommt. In

diesem Fall verwendet die T7-RNA-Polymerase den RNA-Strang als template und

verlängert diesen am 3`-Ende (Schlee et al, 2009; Schmidt et al, 2009). Dieser copy-

back-Mechanismus wurde für virale Polymerasen während der Virusreplikation

beschrieben (Behrens et al, 1996).

Abb. 3.8: Visualisierung der durch in vitro Transkription hergestellten 25 RNA-Kandidaten. Die

durch in vitro Transkription hergestellten RNAs wurden unter denaturierenden Bedingungen in 10%ige

und 12%ige Polyacrylamidgele aufgetrennt. Zur Größenbestimmung der RNAs wurde ein RNA-Größen-

standard (Abb. 2.1) verwendet.

3. Ergebnisse

78

In der Abb. 3.8 sind die Produkte der in vitro Transkription dargestellt. In den einzelnen

in vitro Transkriptionsansätzen sind, außer den RNAs mit der entsprechenden Länge,

sowohl kürzere als auch längere Nebenprodukte zu sehen. Zur Bestimmung der RNA-

Länge wurde ein RNA-Größenstandard (Abb. 2.1) verwendet. Die entsprechenden

RNAs wurden aus dem Gel herausgeschnitten, extrahiert und über Phenol/Chloroform-

Fällung aufgereinigt.

3.1.6. Untersuchung der Fähigkeit einzelner sRNAs IFN-β zu induzieren

Nach dem die 25 RNA-Kandidaten enzymatisch hergestellt worden sind, wurde deren

IFN-β Induktionspotential in HEK293-Zellen untersucht. Hierfür wurden jeweils 50 ng

RNA in die Zellen transfiziert. Nach einer Inkubation von 24 Stunden wurde die von

den einzelnen RNAs ausgelöste IFN-β Antwort über RT-PCR untersucht (Abb. 3.9).

Abb. 3.9: Unterschiedliche IFN-β Induktion in HEK293-Zellen durch sRNAs, die in sec-RNA und

MVs-RNA identifiziert worden sind. Die 25 RNA-Kandidaten wurden nach deren Herstellung durch in

vitro Transkription in HEK293-Zellen transfiziert. Darunter zeigen rli32, rli47, rli99 und rli100 die

höchste IFN-β Induktion. SsrS hingegen und die beiden tRNAs, lmot11 und lmot67, zeigen eine sehr

schwache IFN-β Induktion. Die restlichen sRNAs zeigen eine mehr oder weniger starke Induktion von

IFN-β.

Die Transfektion der 25 RNA-Kandidaten in HEK293-Zellen zeigt, dass diese ein

unterschiedliches Potential besitzen IFN-β zu induzieren. Von den untersuchten sRNAs

haben rli32, rli47, rli99 und rli100 die höchste IFN-β Antwort ausgelöst. Andere sRNAs

hingegen, wie beispielsweise rli98, rli111, rli114, rliG und ssrS, haben eine sehr

schwache IFN-β Antwort ausgelöst. Dies gilt auch für die beiden tRNAs, lmot11 und

lmot67. Die restlichen untersuchten sRNAs zeigen ein moderates Potential die IFN-β

Antwort auszulösen.

3. Ergebnisse

79

In einem weiteren Versuch wurden 8 der 23 ausgesuchten sRNAs in BMDMs

transfiziert. Für diesen Versuch wurden, wie zuvor in HEK293-Zellen, jeweils 50 ng

RNA in die Zellen transfiziert. Nach einer Inkubation von 6 Stunden wurde die IFN-β

Antwort über RT-PCR untersucht (Abb. 3.10). Hier, ähnlich wie in HEK293-Zellen,

gehören rli32, rli99 und rli100 zu den sRNAs mit der höchsten IFN-β Induktion,

während ssrS eine sehr schwache IFN-β Antwort ausgelöst hat. Die Transfektion der 8

sRNAs in BMDMs bestätigt das zuvor in HEK293-Zellen erzielte Ergebnis (Abb. 3.9).

Die einzelnen sRNAs, die in den sekretierten RNA-Fraktionen von L. monocytogenes

identifiziert worden sind, besitzen ein unterschiedliches Potential IFN-β zu induzieren.

Abb. 3.10: Unterschiedliche IFN-β Induktion in BMDMs durch sRNAs, die in sec-RNA und MVs-

RNA identifiziert worden sind. Von den 25 RNA-Kandidaten wurden einige sRNAs, die zuvor in

HEK293-Zellen ein unterschiedliches IFN-β Induktionspotential gezeigt hatten, in BMDMs transfiziert.

In BMDMs, wie zuvor in HEK293-Zellen, zeigen rli32, rli99 und rli100 die höchste IFN-β Induktion.

SsrS hingegen zeigt auch in BMDMs eine sehr schwache Induktion von IFN-β.

Von den 23 ausgesuchten sRNAs, die in sec-RNA und MVs-RNA identifiziert worden

sind, hat rli32 sowohl in HEK293-Zellen (Abb. 3.11A) als auch in BMDMs (Abb.

3.11B) die höchste IFN-β Antwort ausgelöst. Anders hingegen ssrS, das eine sehr

schwache IFN-β Antwort ausgelöst hat (Abb. 3.11A und 3.11B).

3. Ergebnisse

80

(A) (B)

Abb. 3.11: Rli32 und ssrS, 2 sRNAs mit sehr unterschiedlichem IFN-β Induktionspotential. Von den

25 RNA-Kandidaten, die in sec-RNA und MVs-RNA identifiziert worden sind, zeigt rli32 die höchste

und ssrS die niedrigste IFN-β Induktion sowohl in HEK293-Zellen (A) als auch in BMDMs (B). (***P

˂0,001)

3.1.6.1. Untersuchung der Abhängigkeit der IFN-β Induktion von dem Rezeptor

RIG-I

Die cytosolischen Immunrezeptoren der RLR-Familie, RIG-I und MDA5, sind dafür

bekannt, dass sie nach Detektion viraler RNA im Cytosol die Produktion von Typ-I-IFN

auslösen (Kato et al, 2006; Kato et al, 2011). In einem ersten Versuch wurde die

Abhängigkeit der IFN-β Antwort, die von den sRNAs in HEK293-Zellen ausgelöst

wurde, von dem Rezeptor RIG-I untersucht. Hierfür wurden 11 der 23 ausgesuchten

sRNAs in RIG-I-defiziente HEK293-Zellen transfiziert. Darunter waren sRNAs, die

zuvor in Wildtypzellen eine starke (rli32, rli47, rli99 und rli110) sowie eine sehr

schwache bis moderate (rli48, rli51, rli60, rli62, rli105, SRP und ssrS) IFN-β Antwort

ausgelöst hatten (Abb. 3.9). Wie in dem zuvor durchgeführten Transfektionsversuch

wurden jeweils 50 ng RNA in die Zellen transfiziert. Nach einer Inkubation von 24

Stunden wurde die IFN-β Antwort über RT-PCR untersucht. Die Abb. 3.12 zeigt, dass

in RIG-I-defiziente Zellen die IFN-β Antwort, die von den sRNAs in Wildtypzellen

ausgelöst wurde, nahezu ausgeblieben ist. In dieser Zelllinie zeigen die sRNAs,

unabhängig von deren IFN-β Induktionspotential, eine sehr schwache IFN-β Antwort.

3. Ergebnisse

81

Abb. 3.12: RIG-I-Abhängigkeit der IFN-β Antwort in HEK293-Zellen durch sRNAs, die in sec-

RNA und MVs-RNA identifiziert worden sind. Von den 25 RNA-Kandidaten wurden einige sRNAs,

die in den Transfektionsversuchen zuvor eine sehr schwache bis starke IFN-β Induktion gezeigt hatten, in

HEK293 RIG-I-/-

-Zellen transfiziert. In dieser Zelllinie ist die von den sRNAs in Wildtypzellen ausgelöste

IFN-β Antwort nahezu ausgeblieben.

3.1.6.2. Untersuchung der Abhängigkeit der IFN-β Induktion von dem Rezeptor

MDA5

In einem weiteren Versuch wurde auch die Beteiligung des Rezeptors MDA5 an der

IFN-β Antwort, die von den sRNAs in HEK293-Zellen ausgelöst wurde, untersucht.

Hierfür wurde rli32 in HEK293-Zellen mit einer Defizienz in eines der beiden

Rezeptoren, RIG-I oder MDA5, transfiziert. In einem parallelen Ansatz wurde rli32 in

HEK293-Wildtypzellen (WT) transfiziert. In einem weiteren Ansatz wurde rli32 vor der

Transfektion in Wildtypzellen mit der Alkalischen Phosphatase (CIAP) dephospho-

ryliert. Diese sRNA hat in den Transfektionsversuchen zuvor die höchste IFN-β

Antwort sowohl in HEK293-Zellen als auch in BMDMs ausgelöst (Abb. 3.9 und 3.10).

Das Ergebnis dieser Untersuchung ist in der Abb. 3.13 dargestellt. Die Transfektion von

rli32 in Wildtypzellen zeigt eine ähnlich hohe IFN-β Induktion wie in dem zuvor

durchgeführten Transfektionsversuch (Abb. 3.9). Anders hingegen die Transfektion von

rli32 in RIG-defiziente Zellen, die eine signifikante Reduktion der IFN-β Induktion im

Vergleich zu den Wildtypzellen zeigt. Die Transfektion von rli32 nach Dephospho-

rylierung mit der Alkalischen Phosphatase (CIAP) in Wildtypzellen zeigt ebenfalls eine

signifikante Reduktion der IFN-β Induktion. Die IFN-β Induktion durch rli32 in MDA5-

defiziente Zellen hingegen zeigt keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zu den

Wildtypzellen.

3. Ergebnisse

82

Abb. 3.13: RIG-I-Abhängigkeit der IFN-β Antwort in HEK293-Zellen durch rli32. Rli32 wurde in

Wildtyp-, RIG-I- und MDA5-defiziente HEK293-Zellen transfiziert. RIG-I-defiziente Zellen zeigen eine

signifikante Reduktion der IFN-β Induktion im Vergleich zu den Wildtypzellen. Die Transfektion von

rli32 nach Dephosphorylierung mit der Alkalischen Phosphatase (CIAP) in Wildtypzellen zeigt ebenfalls

eine signifikante Reduktion der IFN-β Induktion. MDA5-defiziente Zellen hingegen zeigen keine

signifikante Reduktion der IFN-β Induktion. (***P ˂0,001; ns = nicht signifikant)

3.1.6.3. Untersuchung der rli32-Motive hinsichtlich der Fähigkeit IFN-β zu

induzieren

Anders als DNA ist RNA einzelsträngig allerdings nicht linear. Die komplementären

Basen C-G und A-U bilden stabile Basenpaare über Wasserstoffbrückenbindungen

(Watson-Crick-Basenpaare). Aufgrund der Komplementarität der Basen kommt es zur

Faltung der RNA-Sequenz, die als Sekundärstruktur (2D-Faltung) bezeichnet wird.

Hierbei definieren die Basenpaare, die zwischen den verschiedenen Teilen eines RNA-

Moleküls gebildet werden, dessen Sekundärstruktur.

In einem weiteren Versuch wurde die Abhängigkeit des hohen IFN-β Induktions-

potentials von rli32 von dessen strukturellen Beschaffenheit näher untersucht. Hierfür

wurde eine in silico Vorhersage der Sekundärstruktur von rli32 mit dem RNAfold

WebServer durchgeführt (Gruber et al, 2008). Die in der Abb. 3.14A dargestellte

Nukleotidsequenz von rli32 bildet eine Sekundärstruktur, die aus 3 Motiven besteht

(Abb. 3.14B). Diese weisen verschiedene stem-loop Strukturen auf. Um herauszufinden

welches Motiv für das hohe IFN-β Induktionspotential von rli32 verantwortlich ist,

wurden diese zunächst einzeln durch in vitro Transkription hergestellt. Anschließend

wurden die einzelnen rli32-Motive in BMDMs transfiziert.

3. Ergebnisse

83

(A)

(B) (C)

Abb. 3.14: Nukleotidsequenz, Sekundärstruktur und IFN-β Induktion durch die rli32-Motive. A:

Nukleotidsequenz von rli32. Rli32 besteht aus 150 Nt, wobei die Pfeile die Sequenzen zeigen, die über

Basenpaarung zur Ausbildung der 3 Motive führen. B: Sekundärstruktur von rli32. Die in silico

Vorhersage der Sekundärstruktur von rli32 wurde mit dem RNAfold WebServer durchgeführt. Rli32

bildet 3 Motive, die aus unterschiedlichen stem-loop Strukturen bestehen. C: IFN-β Induktion durch die

rli32-Motive in BMDMs. Die 3 rli32-Motive wurden einzeln durch in vitro Transkription hergestellt und

in BMDMs transfiziet. Das Motiv 2 zeigt eine gleich hohe IFN-β Induktion wie rli32 selbst. Während das

Motiv 3 eine schwächere IFN-β Induktion zeigt, zeigt das Motiv 1 eine sehr schwache Induktion von

IFN-β.

Das Ergebnis dieser Untersuchung zeigt, dass Motiv 2 für das hohe IFN-β Induktions-

potential von rli32 verantwortlich ist (Abb. 3.14C). Die von diesem Motiv ausgelöste

IFN-β Antwort ist so hoch wie die von rli32 selbst. Während das Motiv 3 eine viel

schwächere IFN-β Antwort ausgelöst hat, zeigt das Motiv 1 eine sehr schwache

Induktion von IFN-β.

3.1.7. Untersuchung der Inhibition der viralen Replikation durch rli32 und rli47

Die Transfektionsversuche mit den einzelnen sRNAs haben gezeigt, dass diese das

Potential besitzen IFN-β zu induzieren, wenn auch im unterschiedlichem Maße. Die von

Isaacs und Lindemann im Jahr 1957 beobachtete „Interferenz“ mit der Virusreplikation

3. Ergebnisse

84

führte zur Namensgebung der Interferone (Isaacs und Lindemann, 1957). Diese,

darunter IFN-β, inhibieren über verschiedene Mechanismen, die nach deren Bindung an

den entsprechenden Rezeptor (IFNAR) ausgelöst werden, die virale Replikation und

damit die Vermehrung der Viren in den infizierten Zellen (Müller et al, 1994; Sadler

und Williams, 2008).

Als nächstes wurde untersucht, ob die von den sRNAs ausgelöste IFN-β Antwort zu

einer Inhibition der viralen Replikation in den infizierten Zellen führt. Hierfür wurden 3

sRNAs ausgesucht, die im Vorfeld eine starke (rli32 und rli47) und eine sehr schwache

(ssrS) IFN-β Antwort in HEK293-Zellen ausgelöst hatten (Abb. 3.9). Wie in den

Transfektionsversuchen zuvor wurden jeweils 50 ng RNA in HEK293-Zellen trans-

fiziert. Nach einer Inkubation von 24 Stunden wurden die Zellen mit dem Influenza A

Virus (A/PR/8/34/(H1N1)) infiziert, wobei eine MOI von 0,1 eingesetzt wurde. Die

Zellen wurden für weitere 24 Stunden inkubiert. Der Virustiter in den Überständen der

infizierten Zellen wurde in MDCK-II-Zellen mittels FFA (focus forming assay)

bestimmt (Abb. 3.15). Die Infektionen von HEK293-Zellen mit dem Influenza A Virus

(A/PR/8/34/(H1N1)) wurden in Kooperation mit Christin Müller und Prof. Dr. Stephan

Pleschka (Institut für Medizinische Virologie, Justus-Liebig-Universität Gießen)

durchgeführt.

Abb. 3.15: Antivirale Aktivität von rli32 und rli47 in HEK293-Zellen. 24 Stunden vor der Infektion

mit A/PR/8/34/(H1N1) wurden HEK293-Zellen mit rli32, rli47 und ssrS transfiziert. Der Virustiter in den

Überständen der infizierten Zellen wurde mittels FFA in MDCK-II-Zellen bestimmt. Die Vorbehandlung

der Zellen mit rli32 und rli47 hat zu einer signifikanten Reduktion des Virustiters geführt. Anders

hingegen die Vorbehandlung der Zellen mit ssrS, die nicht zu einer Inhibition der viralen Replikation

geführt hat. (***P ˂0,001; ns = nicht signifikant)

3. Ergebnisse

85

Das in der Abb. 3.15 dargestellte Ergebnis dieser Untersuchung zeigt, dass die

Vorbehandlung der HEK293-Zellen mit rli32 und rli47 zu einer signifikanten Inhibition

der viralen Replikation im Vergleich zu dem Transfektionsreagenz (T.R.) geführt hat.

Der Virustiter in den Überständen dieser Zellen zeigt eine Reduktion von 85% durch

rli32 und von 80% durch rli47. Anders hingegen der Ansatz, in dem die Zellen vor der

viralen Infektion mit ssrS behandelt worden sind. Die Vorbehandlung der Zellen mit

ssrS, das im Vorfeld eine sehr schwache IFN-β Antwort ausgelöst hatte, hat nicht zu

einer Inhibition der viralen Replikation geführt. Dieser Ansatz zeigt einen ähnlich

hohen Virustiter wie das Transfektionsreagenz.

3.1.7.1. Untersuchung der Abhängigkeit der viralen Inhibition von den Rezeptoren

RIG-I und MDA5

In einem weiteren Versuch wurde die Beteiligung der beiden Rezeptoren RIG-I und

MDA5 an der antiviralen Antwort, die von rli32 und rli47 ausgelöst wurde, untersucht.

Hierfür wurden RIG-I- und MDA5-defiziente HEK293-Zellen, ähnlich wie die

Wildtypzellen zuvor, mit den 3 sRNAs transfiziert und anschließend mit dem Virus

infiziert (Abb. 3.16).

(A) (B)

Abb. 3.16. Untersuchung der antiviralen Aktivität von rli32, rli47 und ssrS in HEK293 RIG-I

-/--

und HEK293 MDA5-/-

-Zellen. RIG-I- und MDA5-defiziente Zellen wurden 24 Stunden vor der

Infektion mit A/PR/8/34/(H1N1) mit rli32, rli47 und ssrS transfiziert. A: Keine Inhibition der viralen

Replikation in HEK293 RIG-I-/-

-Zellen durch rli32 und rli47. Die Vorbehandlung der RIG-I-defizienten

Zellen mit rli32 und rli47 hat nicht zu einer Inhibition der viralen Replikation geführt. Unabhängig von

der transfizierten sRNA zeigen RIG-I-defiziente Zellen einen gleich hohen Virustiter in allen Ansätzen.

B: Inhibition der viralen Replikation in HEK293 MDA5-/-

-Zellen durch rli32 und rli47. Die Vorbe-

handlung der MDA5-defizienten Zellen mit rli32 und rli47 hat zu einer signifikanten Reduktion des

Virustiters geführt. (*P ˂0,05; ***P ˂0,001; ns = nicht signifikant)

3. Ergebnisse

86

Anders als in Wildtypzellen zuvor hat die Vorbehandlung der RIG-I-defizienten Zellen

mit rli32 und rli47 nicht zu einer Inhibition der viralen Replikation geführt (Abb.

3.16A). Alle Ansätze zeigen einen ähnlich hohen Virustiter. Anders hingegen die

Vorbehandlung der MDA5-defizienten Zellen mit rli32 und rli47, die zu einer

signifikanten Inhibition der viralen Replikation im Vergleich zu dem Transfektions-

reagenz (T.R.) geführt hat (Abb. 3.16B). In diesen Ansätzen zeigt der Virustiter eine

Reduktion von 65% durch rli32 und von 70% durch rli47.

3.1.7.2. Untersuchung der Abhängigkeit der viralen Inhibition von der RNA-

Konzentration

Als nächstes wurde die Abhängigkeit der viralen Inhibition von der eingesetzten rli32-

Konzentration untersucht. Dabei wurde ssrS, das in den Versuchen zuvor keine

antivirale Aktivität gezeigt hatte, ebenfalls untersucht. Hierfür wurden HEK293-Zellen

zunächst mit 3 unterschiedlichen Konzentrationen an rli32 und ssrS transfiziert und

anschließend mit dem Virus infiziert (Abb. 3.17).

Abb. 3.17: Konzentrationsabhängige Inhibition der viralen Replikation durch rli32 in HEK293-

Zellen. HEK293-Zellen wurden 24 Stunden vor der Infektion mit A/PR/8/34/(H1N1) mit 3 unterschied-

lichen Konzentrationen an rli32 und ssrS transfiziert. Die anschließende Bestimmung des Virustiters in

den Überständen der infizierten Zellen zeigt eine konzentrationsabhängige Inhibition der viralen Repli-

kation durch rli32. (***P ˂0,001; ns = nicht signifikant)

Das Ergebnis dieser Untersuchung zeigt eine signifikante Inhibition der viralen

Replikation durch rli32 im Vergleich zu dem Transfektionsreagenz (T.R.). Mit

steigender rli32-Konzentration zeigt der Virustiter in den Überständen der infizierten

Zellen eine zunehmende Reduktion, von 75% durch 10 ng, von 90% durch 50 ng und

3. Ergebnisse

87

von 95% durch 100 ng. Anders hingegen die Ansätze mit ssrS, die einen ähnlich hohen

Virustiter zeigen wie das Transfektionsreagenz. Unabhängig von der eingesetzten

Konzentration zeigt diese sRNA keine antivirale Aktivität. Selbst die Vorbehandlung

der Zellen mit 100 ng ssrS hat nicht zu einer Inhibition der viralen Replikation geführt.

3.1.7.3. Untersuchung der Inhibition der viralen Replikation durch weitere sRNAs

In einem abschließenden Versuch wurde die antivirale Aktivität weiterer sRNAs, die in

sec-RNA und MVs-RNA identifiziert worden sind, untersucht (Abb. 3.18). Hierfür

wurden sRNAs ausgesucht, die im Vorfeld eine moderate (rli48, rli51, rli60 und rli62)

bis starke (rli99 und rli100) IFN-β Antwort in HEK293-Zellen ausgelöst hatten (Abb.

3.9). Als eine der schwach IFN-β induzierenden sRNAs wurde ssrS eingesetzt.

Abb. 3.18: Unterschiedliche antivirale Aktivität von sRNAs, die in sec-RNA und MVs-RNA

identifiziert worden sind. 24 Stunden vor der Infektion mit A/PR/8/34/(H1N1) wurden HEK293-Zellen

mit 7 sRNAs, die in sec-RNA und MVs-RNA identifiziert worden sind, transfiziert. Bis auf ssrS, das

keine antivirale Aktivität zeigt, zeigen die anderen sRNAs eine unterschiedlich starke Inhibition der

viralen Replikation. (**P ˂0,01; ***P ˂0,001; ns = nicht signifikant)

Das Ergebnis dieser Untersuchung zeigt, dass die Vorbehandlung der HEK293-Zellen

mit rli99 und rli100 zu einer signifikanten Inhibition der viralen Replikation im

Vergleich zu dem Transfektionsreagenz (T.R.) geführt hat. In diesen Ansätzen zeigt der

Virustiter eine Reduktion von 92% durch rli99 und von 87% durch rli100. Anders

hingegen die Vorbehandlung der Zellen mit ssrS, die nicht zu einer Inhibition der

viralen Replikation geführt hat. Die Bestimmung des Virustiters in den Überständen der

Zellen, die mit den anderen sRNAs vorbehandelt worden sind, zeigt eine mehr oder

weniger signifikante Inhibition der viralen Replikation.

3. Ergebnisse

88

3.1.8. Untersuchung der Fähigkeit von rli32 Typ-I-IFN in der Maus zu induzieren

Die im Vorfeld durchgeführten in vitro Transfektionsversuche haben gezeigt, dass von

den untersuchten sRNAs rli32 das höchste IFN-β Induktionspotential besitzt. Als

nächstes wurde die von rli32 ausgelöste Typ-I-IFN Antwort (IFN-β und IFN-α4) in vivo

im Mausversuch untersucht. Dabei wurde auch ssrS, das im Vorfeld ein sehr schwaches

Potential zur IFN-β Induktion gezeigt hatte, untersucht. Des Weiteren wurde zelluläre

RNA von HEK293-Zellen (eukaryotische RNA), die als Vergleich zu den bakteriellen

sRNAs diente, eingesetzt. Für diesen Versuch wurden insgesamt 20 Mäuse verwendet.

Davon wurden 15 Mäuse mit jeweils 40 µg rli32, ssrS und eukaryotische RNA (5

Tiere/Gruppe) und 5 Mäuse nur mit dem Transfektionsreagenz intravenös injiziert. Die

Mausversuche wurden in Kooperation mit Jessica Wingerath und Dr. Thomas Wirth

(Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie, Medizinische

Hochschule Hannover) durchgeführt.

Als Transfektionsreagenz wurde in vivo-jetPEI verwendet, das jede Art von

Nukleinsäure in eine Reihe von Organen effizient liefert. Hierbei bestimmt die

Injektionsart der Nukleinsäure-in vivo-jetPEI-Komplexe weitgehend die target-Organe.

Nach einer intravenösen Injektion wird die Nukleinsäure von in vivo-jetPEI u.a. in

Leber und Milz geliefert. Diese Organe wurden 5 Stunden nach Injektion der RNA und

des Transfektionsreagenz entnommen. Die dort ausgelöste Typ-I-IFN Antwort wurde

nach Isolierung der RNA und Umschreibung dieser in cDNA über RT-PCR untersucht

(Abb. 3.19 und 3.20). In der Gruppe ssrS ist eine Maus gestorben. Eine weitere Maus in

dieser Gruppe hat keine Typ-I-IFN Antwort gezeigt. Diese wurden von der Auswertung

ausgeschlossen.

Das Ergebnis dieser Untersuchung zeigt, dass rli32 in beide Organe der Maus eine hohe

IFN-β Antwort ausgelöst hat. In der Leber wurde eine ca. 10000fache (Abb. 3.19A) und

in der Milz eine ca. 14000fache (Abb. 3.19B) IFN-β Induktion festgestellt. Insgesamt ist

die IFN-β Antwort in der Milz höher ausgefallen als in der Leber. Anders als in den in

vitro Transfektionsversuchen hat ssrS in der Maus eine hohe IFN-β Antwort ausgelöst.

In der Milz hat ssrS eine höhere IFN-β Antwort ausgelöst (ca. 20000fache) als rli32

(Abb. 3.19B). Die eukaryotische RNA hat, anders als die beiden sRNAs, eine schwache

IFN-β Antwort ausgelöst. Im Vergleich zu der eukaryotischen RNA zeigen beide

sRNAs eine signifikant höhere IFN-β Induktion in beide Organe der Maus.

3. Ergebnisse

89

(A) (B)

Abb. 3.19: Untersuchung der IFN-β Induktion durch rli32 und ssrS in Leber und Milz der Maus.

Jeweils 40 µg RNA (eukaryotische RNA, rli32 und ssrS) wurden intravenös in die Mäuse injiziert. 5

Stunden später wurde die IFN-β Induktion in Leber und Milz über RT-PCR untersucht. A: Hohe IFN-β

Induktion durch rli32 und ssrS in der Leber. Rli32 hat zu einer ca. 10000fachen Induktion von IFN-β in

der Leber geführt. SsrS hat mit einer ca. 5000fachen Induktion eine halb so hohe IFN-β Antwort

ausgelöst. B: Höhere IFN-β Induktion durch ssrS als durch rli32 in der Milz. SsrS hat mit einer ca.

20000fachen Induktion eine höhere IFN-β Antwort in der Milz ausgelöst als rli32 (ca. 14000fache). (**P

˂0,01; ***P ˂0,001)

Die IFN-α4 Antwort ist in beide Organe der Maus insgesamt schwächer ausgefallen als

die IFN-β Antwort (Abb. 3.20). Diese zeigt allerdings ein ähnliches Induktionsmuster

wie die zuvor beschriebene IFN-β Antwort. In der Milz ist die IFN-α4 Antwort höher

ausgefallen als in der Leber. Des Weiteren zeigt ssrS mit einer ca. 15000fachen

Induktion eine höhere IFN-α4 Antwort in der Milz als rli32 (ca. 10000fache) (Abb.

3.20B).

(A) (B)

Abb. 3.20: Untersuchung der IFN-α4 Induktion durch rli32 und ssrS in Leber und Milz der Maus.

5 Stunden nach der intravenösen Injektion von Mäusen mit jeweils 40 µg eukaryotische RNA, rli32 und

ssrS wurde die IFN-α4 Induktion in Leber und Milz über RT-PCR untersucht. A: Hohe IFN-α4 Induktion

durch rli32 und ssrS in der Leber. Rli32 hat zu einer ca. 2500fachen und ssrS zu einer ca. 1500fachen

Induktion von IFN-α4 in der Leber geführt. B: Höhere IFN-α4 Induktion durch ssrS als durch rli32 in der

Milz. SsrS hat in der Milz zu einer höheren IFN-α4 Induktion (ca. 15000fache) geführt als rli32 (ca.

10000fache). (**P ˂0,01; ***P ˂0,001)

3. Ergebnisse

90

3.1.9. Überexpression von rli32 und ssrS in L. monocytogenes

Die in vitro Transfektionsversuche haben gezeigt, dass einzelne in sec-RNA und MVs-

RNA identifizierte sRNAs ein unterschiedliches IFN-β Induktionspotential besitzen.

Unter den 23 ausgesuchten sRNAs hat sich rli32 als die sRNA mit dem höchsten IFN-β

Induktionspotential herausgestellt. Im Laufe dieser Arbeit kam die Frage auf, ob eine

Überexpression von rli32 in L. monocytogenes eine höhere IFN-β Antwort durch die

sekretierten RNA-Fraktionen und MVs in Wirtszellen auslöst. Um dies zu überprüfen,

wurde rli32 in L. monocytogenes überexprimiert. In einem parallelen Ansatz wurde ssrS

ebenfalls in L. monocytogenes überexprimiert. Hierfür wurde die Nukleotidsequenz der

beiden sRNAs von chromosomaler DNA aus über PCR amplifiziert und mit dem hly-

Promotor stromaufwärts und dem hly-Terminator stromabwärts von der kodierenden

Sequenz ausgestattet. Anschließend wurden diese Transkriptionseinheiten in den

pERL3-Vektor über Restriktionsverdau und Ligation kloniert. Durch Transformation

von L. monocytogenes mit den pERL3-Vektoren mit entsprechender sRNA-Kassette

wurden 2 Stämme konstruiert, die als Lm-pERL3-rli32 und Lm-pERL3-ssrS bezeichnet

wurden. Es folgte die Isolierung von sec-RNA, MVs-RNA und zellulärer RNA der

Stämme Lm (WT), Lm-pERL3-rli32 und Lm-pERL3-ssrS. Die RNA, die vom Wildtyp

isoliert wurde, diente als Vergleich zu den beiden überexprimierenden Stämmen.

In einem weiteren Schritt wurde die Überexpression der beiden sRNAs in L. monocyto-

genes über RT-PCR überprüft. Zuvor wurde die isolierte RNA in cDNA umge-

schrieben. Das Ergebnis dieser Untersuchung ist in der Abb. 3.21 dargestellt. Der

sogenannte Ct-Wert (Cycle threshold) auf der y-Achse ist ein Maß für die Quantität der

untersuchten cDNA und damit der ursprünglich vorhandenen RNA in einer Probe. Je

niedriger der Ct-Wert desto mehr DNA und infolgedessen desto mehr RNA ist in der

untersuchten Probe vorhanden. Das Ergebnis dieser Untersuchung zeigt, dass die

Überexpression von rli32 und ssrS in L. monocytogenes zu einem Anstieg der

entsprechenden sRNA-Transkripte in allen 3 RNA-Fraktionen der beiden Stämme

geführt hat.

3. Ergebnisse

91

(A) (B)

Abb. 3.21: Untersuchung der Überexpression von rli32 und ssrS in L. monocytogenes. Nach Über-

expression der beiden sRNAs in Lm wurden die 3 RNA-Fraktionen von Lm, Lm-pERL3-rli32 und Lm-

pERL3-ssrS isoliert, in cDNA umgeschrieben und über RT-PCR untersucht. A: Anstieg der rli32-Trans-

kripte in den RNA-Fraktionen von Lm-pERL3-rli32. Die Überexpression von rli32 in Lm hat zu einem

Anstieg der rli32-Transkripte in allen 3 RNA-Fraktionen geführt. B: Anstieg der ssrS-Transkripte in den

RNA-Fraktionen von Lm-pERL3-ssrS. Die von Lm-pERL3-ssrS isolierte RNA zeigt einen Anstieg an

ssrS in allen 3 Fraktionen. (***P ˂0,001)

3.1.9.1. Untersuchung der IFN-β Induktion durch sec-RNA und MVs-RNA in

BMDMs

Nach dem rli32 und ssrS in L. monocytogenes erfolgreich überexprimiert worden sind,

wurde das IFN-β Induktionspotential der isolierten RNA-Fraktionen in BMDMs

untersucht. Hierfür wurden jeweils 100 ng aus den 3 RNA-Fraktionen der Stämme Lm

(WT), Lm-pERL3-rli32 und Lm-pERL3-ssrS in die Zellen transfiziert. Nach einer

Inkubation von 6 Stunden wurde die IFN-β Antwort über RT-PCR untersucht (Abb.

3.22). Von den 3 untersuchten Stämmen hat die von Lm-pERL3-rli32 isolierte RNA die

höchste IFN-β Antwort ausgelöst. Sowohl die sekretierten RNA-Fraktionen als auch die

zelluläre RNA zeigen einen signifikanten Anstieg der IFN-β Induktion im Vergleich zu

der RNA, die vom Wildtyp isoliert wurde. Dabei hat sec-RNA die höchste IFN-β

Antwort ausgelöst, gefolgt von MVs-RNA und zelluläre RNA. Anders hingegen die

Überexpression von ssrS in L. monocytogenes, die nicht zu einem Anstieg der IFN-β

Induktion durch die sekretierten RNA-Fraktionen geführt hat. Die sec-RNA, die von

diesem Stamm isoliert wurde, zeigt eine signifikante Reduktion der IFN-β Induktion im

Vergleich zu der RNA, die vom Wildtyp isoliert wurde.

3. Ergebnisse

92

Abb. 3.22: Erhöhte IFN-β Induktion in BMDMs durch sec-RNA, MVs-RNA und zelluläre RNA

nach Überexpression von rli32 in L. monocytogenes. Nach Überexpression von rli32 und ssrS in Lm

wurden die 3 RNA-Fraktionen von Lm, Lm-pERL3-rli32 und Lm-pERL3-ssrS isoliert und in BMDMs

transfiziert. 6 Stunden später wurde die IFN-β Induktion über RT-PCR untersucht. Die von Lm-pERL3-

rli32 isolierten RNA-Fraktionen haben zu einem signifikanten Anstieg der IFN-β Induktion geführt. Die

sec-RNA, die von Lm-pERL3-ssrS isoliert wurde, zeigt im Vergleich zu Lm eine signifikante Abnahme

der IFN-β Induktion. (**P ˂0,01; ***P ˂0,001; ns = nicht signifikant)

3.1.9.2. Untersuchung der IFN-β Induktion durch sec-RNA und MVs-RNA in

HEK293-Zellen

In einem weiteren Versuch wurde das IFN-β Induktionspotential der RNA, die aus den

3 Fraktionen der Stämme Lm (WT), Lm-pERL3-rli32 und Lm-pERL3-ssrS isoliert

wurde, in HEK293-Zellen untersucht. Hierfür wurden, wie zuvor in BMDMs, jeweils

100 ng RNA in die Zellen transfiziert. Nach einer Inkubation von 24 Stunden wurde die

IFN-β Antwort über RT-PCR untersucht (Abb. 3.23). Das Ergebnis dieser Unter-

suchung zeigt, dass die von Lm-pERL3-rli32 isolierten RNA-Fraktionen einen

signifikanten Anstieg der IFN-β Antwort im Vergleich zu der RNA, die vom Wildtyp

isoliert wurde, ausgelöst hatten. Anders als in BMDMs hat MVs-RNA eine höhere IFN-

β Antwort ausgelöst als sec-RNA. Des Weiteren hat auch die Überexpression von ssrS

in L. monocytogenes zu einem signifikanten Anstieg der IFN-β Induktion durch die

sekretierten RNA-Fraktionen geführt.

3. Ergebnisse

93

Abb. 3.23: Erhöhte IFN-β Induktion in HEK293-Zellen durch die sekretierten RNA-Fraktionen

nach Überexpression von rli32 und ssrS in L. monocytogenes. Nach Überexpression von rli32 und ssrS

in Lm wurden die 3 RNA-Fraktionen von Lm, Lm-pERL3-rli32 und Lm-pERL3-ssrS isoliert und in

HEK293-Zellen transfiziert. 24 Stunden später wurde die IFN-β Antwort über RT-PCR untersucht. Die

Überexpression von rli32 in Lm hat zu einem signifikanten Anstieg der IFN-β Induktion durch die

sekretierten RNA-Fraktionen geführt. Die sekretierten RNA-Fraktionen von Lm-pERL3-ssrS haben

ebenfalls einen signifikanten Anstieg der IFN-β Antwort ausgelöst. (*P ˂0,05; **P ˂0,01; ***P ˂0,001;

ns = nicht signifikant)

3.1.9.3. Untersuchung der Abhängigkeit der IFN-β Induktion durch sec-RNA und

MVs-RNA von dem Rezeptor RIG-I

Als nächstes wurde die Abhängigkeit der IFN-β Antwort, die von den sekretierten

RNA-Fraktionen der beiden überexprimierenden Stämme in HEK293-Zellen ausgelöst

wurde, von dem Rezeptor RIG-I untersucht. Hierfür wurden jeweils 100 ng aus den 3

RNA-Fraktionen der Stämme Lm (WT), Lm-pERL3-rli32 und Lm-pERL3-ssrS in RIG-

I-defiziente HEK293-Zellen transfiziert. Nach einer Inkubation von 24 Stunden wurde

die IFN-β Antwort über RT-PCR untersucht. Das Ergebnis dieser Untersuchung ist in

der Abb. 3.24 dargestellt. Es zeigt, dass in RIG-I-defiziente Zellen die IFN-β Antwort,

die von den sekretierten RNA-Fraktionen der beiden überexprimierenden Stämme in

Wildtypzellen ausgelöst wurde, nahezu ausgeblieben ist.

3. Ergebnisse

94

Abb. 3.24: RIG-I-Abhängigkeit der IFN-β Antwort in HEK293-Zellen durch die sekretierten RNA-

Fraktionen von Lm-pERL3-rli32 und Lm-pERL3-ssrS. Die von Lm, Lm-pERL3-rli32 und Lm-pERL3-

ssrS isolierten RNA-Fraktionen, sec-RNA, MVs-RNA und zelluläre RNA, wurden in HEK293 RIG-I-/-

-

Zellen transfiziert. Die über RT-PCR untersuchte IFN-β Induktion 24 Stunden nach der Transfektion

zeigt, dass diese in RIG-I-defiziente Zellen nahezu ausgeblieben ist.

3.1.9.4. Untersuchung der Fähigkeit von MVs IFN-β zu induzieren

Die Überexpression von rli32 in L. monocytogenes hat zu einem Anstieg der IFN-β

Induktion durch die RNA, die aus den MVs isoliert wurde (MVs-RNA), geführt (Abb.

3.22 und 3.23). In einem weiteren Versuch wurde untersucht, ob der Anstieg an rli32-

Transkripte das immunstimulatorische Potential der MVs, die von L. monocytogenes

produziert werden, erhöht. Hierfür wurden BMDMs mit jeweils 10 µg MVs, die von Lm

(WT), Lm-pERL3-rli32 und Lm-pERL3-ssrS isoliert wurden, für 6 Stunden inkubiert.

Anschließend wurde nach Lyse der Zellen die RNA isoliert und in cDNA umge-

schrieben. Die von den MVs ausgelöste IFN-β Antwort wurde über RT-PCR untersucht

(Abb. 3.25). Das Ergebnis dieser Untersuchung zeigt, dass die Überexpression von rli32

das IFN-β Induktionspotential der MVs, die von L. monocytogenes produziert werden,

erhöht hat. Die von Lm-pERL3-rli32 isolierten MVs zeigen eine ca. 7,5fach höhere

IFN-β Induktion als die MVs, die vom Wildtyp isoliert wurden. Die MVs hingegen, die

von Lm-pERL3-ssrS isoliert wurden, zeigen ein schwächeres Potential IFN-β zu

induzieren als die MVs vom Wildtyp.

3. Ergebnisse

95

Abb. 3.25: Erhöhte IFN-β Induktion in BMDMs durch MVs nach Überexpression von rli32 in L.

monocytogenes. BMDMs wurden mit jeweils 10 µg MVs, die von Lm, Lm-pERL3-rli32 und Lm-pERL3-

ssrS isoliert wurden, inkubiert. 6 Stunden später wurde die IFN-β Antwort über RT-PCR untersucht. Die

Überexpression von rli32 in Lm hat zu einem Anstieg der IFN-β Induktion durch die MVs geführt. Die

von Lm-pERL3-ssrS isolierten MVs zeigen eine reduziertere IFN-β Antwort als die MVs, die vom

Wildtyp isoliert wurden.

3.2. Charakterisierung der von L. monocytogenes produzierten MVs

3.2.1. Elektronenmikroskopische Visualisierung von L. monocytogenes und

isolierten MVs

Eine erste Charakterisierung der MVs, die von L. monocytogenes produziert werden,

wurde durch Elektronenmikroskopie (EM) durchgeführt. Die elektronenmikrosko-

pischen Aufnahmen wurden in Kooperation mit Prof. Dr. Manfred Rohde (Zentrale

Einheit für Mikroskopie, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig)

durchgeführt. Die durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) erzielten Bilder

zeigen, dass die von L. monocytogenes produzierten MVs eine sphärisch geformte

Struktur haben (Abb. 3.26A und 3.26B). Diese scheint von einer doppelschichtigen

Membranhülle begrenzt zu sein. Des Weiteren enthüllt die Visualisierung der isolierten

MVs durch TEM, dass diese nicht einheitlich sind, bezüglich ihrer Größe. Eine MVs-

Isolierung enthält sowohl kleinere als auch größere MVs. Dies wird durch Raster-

elektronenmikroskopie (REM) von L. monocytogenes bestätig (Abb. 3.26C und 3.26D).

Die hierdurch erzielten Bilder zeigen unterschiedlich große MVs, die über die gesamte

Oberfläche der Bakterien verteilt sind.

Für die EM müssen biologische Proben zur Erzeugung des notwendigen Bildkontrasts

durch Anlagerung von Schwermetallen gefärbt (kontrastiert) werden. Dies führt

allerdings zum Schrumpfen der Proben und häufig zur Bildung von Eindellungen,

weshalb sich die EM nicht zur Größenbestimmung eignet. Für die Größenbestimmung

der MVs, die von L. monocytogenes produziert werden, wurde eine relativ neue

3. Ergebnisse

96

Technologie, die NTA (Nanoparticle Tracking Analysis), verwendet. Die NTA wurde

erstmals im Jahr 2011 von unabhängigen Gruppen für die Charakterisierung von

eukaryotischen Exosomen genutzt und beschrieben. Seitdem wird diese Technologie für

die Größenbestimmung von Vesikeln allgemein verwendet (Sokolova et al, 2011;

Dragovic et al, 2011).

(A) (B)

(C) (D)

Abb. 3.26: Visualisierung von MVs und L. monocytogenes durch Elektronenmikroskopie. A und B:

TEM-Aufnahmen von Lm-MVs. Die MVs wurden von Lm-Kulturen isoliert, die in Minimalmedium bis

OD600nm von 1 gezüchtet wurden. Eine MVs-Isolierung enthält unterschiedlich große MVs mit einer

sphärisch geformten Struktur. C und D: SEM-Aufnahmen von Lm. Sphärisch geformte MVs sind über die

gesamte Oberfläche der Bakterien verteilt.

3.2.2. Bestimmung der Größe, Anzahl und Proteinkonzentration von isolierten

MVs

Die Größe der von L. monocytogenes produzierten MVs wurde durch NTA mittels

NanoSight-Gerät bestimmt. Diese Technologie ermöglicht die Detektion und Verfol-

3. Ergebnisse

97

gung (tracking) einzelner Nanopartikel, die sich aufgrund der Brown’schen Molekular-

bewegung stets in Bewegung befinden. Die Partikel werden mit einem Laser ange-

strahlt, wobei das gestreute Licht von einem Mikroskop erfasst und von einer Video-

kamera aufgezeichnet wird. Die Software berechnet mit Hilfe der Stokes-Einstein-

Gleichung den hydrodynamischen Durchmesser der einzelnen Partikel.

Die NTA-Analyse hat ergeben, dass die von L. monocytogenes produzierten MVs eine

durchschnittliche Größe von 130,7 ± 1,0 nm haben (Abb. 3.27A). Da mit dieser

Technologie einzelne Partikel sichtbar gemacht werden können, kann eine direkte

Bestimmung der Anzahl von Nanopartikeln in einer Probe erfolgen (Abb. 3.27A). Die

Anzahl der MVs, die aus 2 L L. monocytogenes-Kulturen isoliert wurden, beträgt laut

NTA-Analyse ca. 70 × 109. Des Weiteren liefert die NTA einen unmittelbaren visuellen

Eindruck der Proben und lässt somit Rückschlüsse auf deren Beschaffenheit zu (Abb.

3.27B).

(A) (B)

Abb. 3.27: Größenbestimmung, Zählung und Visualisierung von MVs durch Nanoparticle Tracking

Analysis (NTA). A: Größenbestimmung und Zählung von Lm-MVs mittels NTA. Die von Lm produ-

zierten MVs haben eine durchschnittliche Größe von 130,7 ± 1,0 nm. Die Anzahl der MVs, die aus 2 L

Lm-Kulturen isoliert wurden, beträgt ca. 70 × 109. B: Repräsentatives Bild der NTA. Videostandbild von

MVs, die sich aufgrund der Brown’schen Molekularbewegung unregelmäßig und ruckartig in Lösung

bewegen.

Darüber hinaus wurde die Proteinkonzentration der MVs mit der Bradford-Methode, die

zur quantitativen Bestimmung von bakteriellen Vesikeln verwendet wird, bestimmt

(Kaparakis et al, 2010; Lee et al, 2012; Olaya-Abril et al, 2014). Demnach beträgt die

Proteinkonzentration der MVs, die aus 2 L L. monocytogenes-Kulturen isoliert wurden,

150-200 µg.

3. Ergebnisse

98

3.2.3. Proteomanalyse (Massenspektrometrie) von MVs

Die Identifizierung der Proteine in den MVs, die von L. monocytogenes produziert

werden, erfolgte über Massenspektrometrie (MS). Gleichzeitig wurde eine markierungs-

freie relative Proteinquantifizierung durchgeführt. Diese basierte auf den Vergleich der

identifizierten MS/MS-Spektren eines Proteins zwischen LC-MS/MS-Läufen (spectral

counting) und den zur Normalisierung herangezogenen NSAF-Wert (normalized

spectral abundance factor) (Zybailov et al, 2005; Zybailov et al, 2006; Zhu et al, 2010).

Die MS-Analyse wurde von Dr. Andreas Otto und Prof. Dr. Dörte Becher (Institut für

Mikrobiologie, Abteilung für Mikrobielle Proteomics und Massenspektrometrie, Ernst-

Moritz-Arndt-Universität Greifswald) durchgeführt.

Die MS-Analyse führte zur Identifizierung von insgesamt 612 Proteinen in den von L.

monocytogenes produzierten MVs. Für weitere Analysen wurden ausschließlich

Proteine verwendet, die in mindestens 2 von 3 biologischen Replikaten identifiziert

worden sind. Nach Abzug der Proteine, die nur in eine MVs-Isolierung identifiziert

worden sind, wurden die restlichen 516 Proteine näher analysiert (Tab. 3). Anhand des

NSAF-Wertes wurde der Anteil jedes Proteins an der Gesamtmasse der Proteine in den

MVs in % berechnet.

3.2.3.1. Klassifizierung der MVs-Proteine nach Funktion

Um herauszufinden welche zelluläre Funktion die in den MVs identifizierten Proteine

haben, wurde eine funktionelle Klassifizierung durchgeführt. Hierfür wurde die

EggNOG 4.5.1-Datenbank (evolutionary genealogy of genes: Non-supervised

Orthologous Groups), die auf der COG-Ontologie basiert, verwendet (Jensen et al,

2008; Huerta-Cepas et al, 2016). Jedes COG (Cluster of Orthologous Groups) enthält

orthologe Proteine aus mindestens 3 unterschiedlichen Spezies. Sämtliche COGs

werden dabei in 25 funktionelle Kategorien, die eine Vielzahl von biologischen

Prozessen in der Zelle beschreiben, eingeteilt (Tab. 1). Diese werden den folgenden

funktionellen Gruppen zugeordnet: Metabolismus, Zelluläre Prozesse und Signale sowie

Informationsspeicherung und -prozessierung. In der Gruppe Wenig charakterisiert

werden Proteine eingeteilt, die nur eine allgemeine Funktion beschrieben haben oder

deren Funktion unbekannt ist. Die Proteine für die es in der EggNOG 4.5.1-Datenbank

kein Treffer gibt, werden der Gruppe Kein Ortholog gefunden zugeordnet. Für jede

3. Ergebnisse

99

funktionelle Kategorie und Gruppe, die in den MVs vertreten ist, wurde anhand des

NSAF-Wertes der Anteil an Proteine in % berechnet (Tab. 2).

Die Abb. 3.28 zeigt, dass mehr als ein Drittel (37,37%) der Proteine in den von L.

monocytogenes produzierten MVs eine Funktion im Metabolismus beschrieben haben.

Die zweithäufigsten Proteine in den MVs mit 26,44% gehören der Gruppe Wenig

charakterisiert an. In der Gruppe Zelluläre Prozesse und Signale sind knapp 15% der

Proteine in den MVs eingeteilt worden. Es folgen die Proteine, die eine Funktion in der

Gruppe Informationsspeicherung und -prozessierung beschrieben haben, mit 10,55%.

Für 11% der Proteine in den MVs hat die EggNOG 4.5.1-Datenbank kein Ortholog

gefunden.

Abb. 3.28: Funktionelle Klassifizierung der MVs-Proteine unter Verwendung der EggNOG 4.5.1-

Datenbank. Die über MS-Analyse identifizierten Proteine in den MVs, die von Lm produziert werden,

wurden in 3 funktionelle Gruppen eingeteilt. Des Weiteren sind 26,44% der MVs-Proteine nur wenig

charakterisiert. Für 11% der Proteine in den MVs hat die EggNOG 4.5.1-Datenbank kein Ortholog

gefunden.

MVs-Proteine, die im Metabolismus involviert sind

Die meisten über MS-Analyse in den MVs identifizierten Proteine (37,37%) haben eine

Funktion im Metabolismus beschrieben (Abb. 3.28). Diese Gruppe umfasst 8 funktio-

nelle Kategorien (Tab. 1). Hierzu werden Proteine, die in den Transport und im Stoff-

wechsel von verschiedenen Biomolekülen, Coenzymen, anorganische Ionen und

Sekundärmetaboliten involviert sind, eingeteilt. Die Abb. 3.29 zeigt den Anteil der

Proteine, die in den verschiedenen funktionellen Kategorien dieser Gruppe eingeteilt

worden sind.

Die Proteine, die in den Transport von anorganischen Ionen und deren Metabolismus

(funktionelle Kategorie P) involviert sind, machen mit 11,21% den höchsten Anteil

einer beschriebenen Funktion in den von L. monocytogenes produzierten MVs aus.

Allerdings gehört das häufigste Protein in den MVs, die von L. monocytogenes während

3. Ergebnisse

100

des Wachstums in Minimalmedium unter aeroben Bedingungen produziert werden, mit

einem Anteil von 8% dieser funktionellen Kategorie an. Es handelt sich hierbei um das

Dps-Protein (DNA protection during starvation protein) auf das später in dieser Arbeit

näher eingegangen wird (Abschnitt 3.2.3.3). Weitere Proteine, die in der funktionellen

Kategorie P eingeteilt worden sind, sind beispielsweise die Katalase (kat, lmo2785) und

die Superoxid-Dismutase (sodA, lmo1439), die ähnlich wie das Dps-Protein Schutz vor

oxidativem Schaden vermitteln (Tab. 3) (Vasconcelos und Deneer, 1994; Myers und

Martin, 1994).

Abb. 3.29: Einteilung der MVs-Proteine in funktionelle Kategorien der Gruppe Metabolismus.

Basierend auf der EggNOG 4.5.1-Klassifizierung sind die häufigsten beschriebenen Funktionen in den

MVs, die von Lm produziert werden, der Transport und Metabolismus von anorganischen Ionen

(11,21%), Aminosäuren (10,34%) und Kohlenhydraten (knapp 10%).

Die zweithäufigste beschriebene Funktion in den MVs, die von L. monocytogenes

produziert werden, ist der Transport von Aminosäuren und deren Metabolismus

(funktionelle Kategorie E). Insgesamt 10,34% der Proteine in den MVs sind in diese

funktionelle Kategorie eingeteilt worden. Hierzu zählt OppA, eines der häufigsten

Proteine in den von L. monocytogenes produzierten MVs, mit einem Anteil von 1,22%

(Abschnitt 3.2.3.3). Darüber hinaus sind weitere ABC-Transporter über MS-Analyse in

den MVs identifiziert worden (Tab. 3). Hierzu zählen verschiedene Bestandteile zweier

in L. monocytogenes osmotisch regulierten Transportsysteme für osmoprotektive

3. Ergebnisse

101

Substanzen, der Glycin-Betain Transporter Gbu und der Carnitin-Transporter OpuC (Ko

und Smith, 1999; Fraser et al, 2000). Zu dieser funktionellen Kategorie zählen des

Weiteren 2 Enzyme, die über α-Ketoglutarat den Kohlenhydratstoffwechsel mit der

Fixierung von Ammonium verbinden, Glutamat-Dehydrogenase (lmo0560) und

Glutamin-Synthetase (glnA, lmo1299) (Tab. 3).

Die Proteine in den funktionellen Kategorien C (Energieproduktion und -konversion)

und G (Transport von Kohlenhydraten und deren Metabolismus) ergeben gemeinsam

knapp 10% und stellen damit die dritthäufigste beschriebene Funktion in den von L.

monocytogenes produzierten MVs dar. In diese funktionellen Kategorien eingeteilte

Proteine sind in den Transport und im Stoffwechsel von Kohlenhydraten zur Energie-

gewinnung involviert. Diese Arbeit hat MVs untersucht, die von L. monocytogenes

während des Wachstums in Minimalmedium mit Glukose als Energiequelle unter

aeroben Bedingungen produziert werden. Unter diesen Bedingungen wird Glukose über

die Glykolyse und den Pentosephosphat-Weg zur Energiegewinnung und Bereitstellung

von Vorstufen für Biosynthesen abgebaut (Müller-Herbst et al, 2014). Sämtliche

Enzyme beider Stoffwechselwege sind über MS-Analyse in den MVs identifiziert

worden (Tab. 3). Das aus der Glykolyse resultierende Pyruvat wird unter aeroben

Bedingungen zum Teil durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (pdhABCD), der

ebenfalls in den MVs identifiziert worden ist, zu Acetyl-CoA oxidiert und in den Citrat-

Zyklus eingeschleust (Kim et al, 2006). Verschiedene Enzyme, sowohl des oxidativen

als auch des reduktiven Zweigs des Citrat-Zyklus, sind in den MVs identifiziert worden

(Tab. 3). Darüber hinaus sind verschiedene Bestandteile der Atmungskette, die in L.

monocytogenes relativ einfach aufgebaut ist, über MS-Analyse in den MVs identifiziert

worden (Tab. 3) (Glaser et al, 2001; Patchett et al, 1991). Hierzu zählen 2 NADH-

Dehydrogenasen, lmo2389 und lmo2638, die durch Oxidation Reduktionsäquivalente

regenerieren und gleichzeitig Elektronen in die Atmungskette einschleussen.

Verschiedene Bestandteile der beiden terminalen Oxidasen, cytochrome aa3

(qoxABCD) und cytochrome bd (cydABCD), die diese Elektronen auf Sauerstoff

übertragen, zählen ebenfalls dazu (Müller-Herbst et al, 2014).

Des Weiteren sind Enzyme der Substratkettenphosphorylierung, die von L. monocyto-

genes auch unter aeroben Bedingungen genutzt wird, in den MVs identifiziert worden

(Tab. 3). Hierzu zählen Fumarat-Reduktase (lmo0355) und Laktat-Dehydrogenasen

3. Ergebnisse

102

(ldh1, lmo0210 und ldh2, lmo1534), deren Aktivität zur Oxidation von Reduktions-

äquivalenten und Bildung von Säuren führt (Romick et al, 1996).

Verschiedene Transporter für Kohlenhydrate, die über MS-Analyse in den MVs

identifiziert worden sind, sind ebenfalls in den funktionellen Kategorien C und G

eingeteilt worden (Tab. 3). Hierzu zählen beispielsweise verschiedene Bestandteile

zweier Phosphotransferase-Systeme (PTS), PTSMan

-2/Mpt (mptACD, lmo0096-0098)

und PTSMan

-3/Mpo (mpoABCD, lmo0781-0784). Diese Transporter befördern zusätz-

lich zur Mannose auch Glukose (Stoll und Goebel, 2010). Ein weiterer in den MVs

identifizierter Transporter für Glukose ist der PrfA-regulierte Hexose-Phosphat-

Transporter UhpT (uhpT, lmo0838), der während des Wachstums von L. monocyto-

genes im Cytosol der Wirtszellen eine essentielle Rolle spielt (Chico-Calero et al,

2002).

MVs-Proteine, die in Zelluläre Prozesse und Signale involviert sind

Knapp 15% der Proteine in den MVs, die von L. monocytogenes produziert werden,

haben eine Funktion in der Gruppe Zelluläre Prozesse und Signale beschrieben (Abb.

3.28). Diese Gruppe umfasst 10 funktionelle Kategorien (Tab. 1). Die funktionellen

Kategorien Nukleäre Struktur [Y], Zytoskelett [Z] und Extrazelluläre Strukturen [W]

sind in den MVs nicht vertreten. Die restlichen funktionellen Kategorien umfassen

Proteine, die in verschiedene zelluläre Prozesse, darunter Biogenese der Zellwand und

Cytoplasmamembran, Proteinsekretion, Signaltransduktion und Verteidigung, involviert

sind. In der Abb. 3.30 sind die verschiedenen funktionellen Kategorien und der

jeweilige Anteil an Proteine in den von L. monocytogenes produzierten MVs dargestellt.

Die Proteine, die in der funktionellen Kategorie M (Biogenese der

Zellwand/Membran/Hülle) eingeteilt worden sind, gehören mit 7,10% zu der

vierthäufigsten beschriebenen Funktion in den von L. monocytogenes produzierten

MVs. Hierbei handelt es sich um Proteine, die überwiegend in der Umgestaltung

(remodeling) der Zelloberfläche, ein für Zellwachstum und Zellteilung essentieller

Prozess, involviert sind (Tab. 3). Dieser Prozess beinhaltet u.a. ein koordiniertes

Zusammenspiel von Abbau und Biosynthese der Zellwand durch die entsprechenden

Enzyme. In den von L. monocytogenes produzierten MVs sind Enzyme, die an beide

Vorgänge beteiligt sind, über MS-Analyse identifiziert worden. So zählen

beispielsweise MurA (lmo2691), Ami (ami, lmo2558), P60 (iap, lmo0582) und P45

3. Ergebnisse

103

(spl, lmo2505) zu den Autolysinen, die als Zellwandhydrolasen die Spaltung von

kovalenten Bindungen katalysieren (Carvalho et al, 2014). Die Penicillin-bindende

Proteine (PBP), PBPA1 (pbpA, lmo1892), PBPA2 (lmo2229), PBPB1 (lmo1438) und

PBPB2 (pbpB, lmo2039), hingegen zählen zu den Enzymen, die in der Zellwand-

synthese involviert sind (Bierne und Cossart, 2007). Das DltD-Protein (dltD, lmo0971),

das als Teil des dlt-Operons in der Modifikation von Lipoteichonsäuren der Zellwand

involviert ist, ist ebenfalls in diese funktionelle Kategorie eingeteilt worden (Abachin et

al, 2002).

Abb. 3.30: Einteilung der MVs-Proteine in funktionelle Kategorien der Gruppe Zelluläre Prozesse

und Signale. Basierend auf der EggNOG 4.5.1-Klassifizierung sind 7,10% der Proteine in den MVs, die

von Lm produziert werden, in der Biogenese der Zellwand und der Cytoplasmamembran [M] involviert.

Die funktionellen Kategorien Zellteilung [D], Verteidigung [V] und Zellbewegung [N] sind in den MVs

unterrepräsentiert.

In der funktionellen Kategorie U (Intrazellulärer Verkehr, Sekretion, vesikulärer

Transport) sind Bestandteile des generellen Sekretionswegs, der Sec-Translokase, die

über MS-Analyse in den MVs identifiziert worden sind, eingeteilt worden (Tab. 3).

Hierzu zählen die Komponenten SecY (lmo2612), SecDF (lmo1527), YajC (lmo1529),

YidC1 (lmo1379) und YidC2 (lmo2854), die den Proteinkanal der Sec-Translokase in

der Cytoplasmamembran bilden. Eine zentrale Komponente der Translokase, die SecA-

ATPase (lmo2510), ist ebenfalls in den MVs identifiziert worden. Diese katalysiert

durch ATP-Hydrolyse die Translokation von sekretorischen Proteinen nach Bindung an

deren N-terminalen Signalsequenz. Die Signalpeptidasen des Typ I, SipX (lmo1269),

SipY (lmo1270) und SipZ (lmo1271), die während oder kurz nach der Translokation der

3. Ergebnisse

104

Proteine das Signalpeptid abspalten, sind ebenfalls in den MVs identifiziert worden

(Desvaux und Hébraud, 2006). Weitere in diesem Prozess involvierte Proteine, die über

MS-Analyse in den von L. monocytogenes produzierten MVs identifiziert worden sind,

sind Chaperone, die das targeting von sekretorischen Proteinen zur Sec-Translokase

vermitteln (Tab. 3). Hierzu zählen PrsA2 (prsA2, lmo2219), DnaK (dnaK, lmo1473),

GroEL (groEL, lmo2068) und GroES (groES, lmo2069) (Desvaux und Hébraud, 2006;

Beha et al, 2003). PrsA2 gehört mit einem Anteil von 1,34% zu den häufigsten

Proteinen in den MVs, die von L. monocytogenes produziert werden (Abschnitt 3.2.3.3).

Diese Chaperone sind in der funktionellen Kategorie O (Posttranslationale Modifika-

tionen, Proteinumsatz, Chaperone) eingeteilt worden.

Zu den Proteinen, die eine Funktion in der Signaltransduktion (funktionelle Kategorie

T) beschreiben haben, gehört beispielsweise das RNA-bindende Protein Hfq (lmo1295)

mit einem Anteil von 0,66% (Tab. 3). Dieses RNA-Chaperon hat eine Schlüsselfunktion

in der post-transkriptionellen Genregulation, indem es die Stabilität und Bindung von

sRNAs an deren mRNA-targets vermittelt (Møller et al, 2002; Geissmann und Touati,

2004).

Die funktionelle Kategorie V (Verteidigungsmechanismen) umfasst 17 Proteine, die mit

einem Anteil von 0,86% zu den unterrepräsentierten Proteinen in den MVs, die von L.

monocytogenes produziert werden, gehören (Tab. 3). Hierzu zählen überwiegend ABC-

Transporter, darunter die Strukturproteine BceA (lmo2114) und BceB (lmo2115) des

BceAB-Transporters, der Resistenz gegen das Antibiotikum Bacitracin vermittelt

(Bernard et al, 2007; Rietkötter et al, 2008).

MVs-Proteine, die in der Speicherung, Weitergabe und Umsetzung der genetischen

Information involviert sind

In der funktionellen Gruppe Informationsspeicherung und -prozessierung sind 10,55%

der MVs-Proteine, die über MS-Analyse identifiziert worden sind, eingeteilt worden

(Abb. 3.28). Diese Gruppe umfasst 5 funktionelle Kategorien (Tab. 1). Die funktio-

nellen Kategorien RNA-Prozessierung und -Modifikation [A] sowie Chromatinstruktur

und deren Dynamik [B] sind in den MVs nicht vertreten. Die restlichen funktionellen

Kategorien umfassen Proteine, die in der Replikation, Rekombination, Reparatur und

Transkription der DNA sowie Ribosomen-Aufbau und Proteinsynthese involviert sind

(Abb. 3.31).

3. Ergebnisse

105

Abb. 3.31: Einteilung der MVs-Proteine in funktionelle Kategorien der Gruppe Informations-

speicherung und -prozessierung. Laut EggNOG 4.5.1-Datenbank sind 10,55% der Proteine in den MVs,

die von Lm produziert werden, an der Speicherung und Weitergabe der genetischen Information [L und

K] sowie Ribosomen-Aufbau und Proteinsynthese [J] beteiligt.

In der funktionellen Kategorie L (Replikation, Rekombination und Reparatur) ist eines

der häufigsten Proteine, das in den von L. monocytogenes produzierten MVs identifi-

ziert worden ist, eingeteilt worden. Es handelt sich hierbei um das SSB2-Protein

(Single-stranded DNA-binding protein 2) mit einem Anteil von 3,58% (Abschnitt

3.2.3.3). Die Mehrheit der restlichen Proteine, die in dieser funktionellen Kategorie

eingeteilt worden ist, ist ebenfalls an der Replikation, Rekombination und Reparatur der

DNA beteiligt (Tab. 3). Hierzu zählen beispielsweise die DNA-Gyrase (gyrA,

lmo0007), die DNA-Polymerase (polA, lmo1565), das RecA-Protein (recA, lmo1398)

und DNA-Helikasen (addA, lmo2267 und addB, lmo2268). Das Histon-ähnliche Protein

Hup (hup, lmo1934), das durch unspezifische Bindung an die DNA zu deren

Kondensation beiträgt, zählt ebenfalls dazu (Bonnefoy und Rouvière-Yaniv, 1992).

In der funktionellen Kategorie J (Translation, ribosomale Struktur und Biogenese) sind

32 Proteine, die über MS-Analyse in den MVs identifiziert worden sind, eingeteilt

worden (Tab. 3). Diese machen knapp 4% der Proteine in den von L. monocytogenes

produzierten MVs aus. Der überwiegende Teil dieser Proteine sind ribosomale Proteine

und Aminoacyl-tRNA-Synthetasen. Die Elongationsfaktoren EF-Tu (tuf, lmo2653), EF-

G (fus, lmo2654) und EF-Ts (tsf, lmo1657) zählen ebenfalls dazu.

3.2.3.2. Klassifizierung der MVs-Proteine nach Lokalisation

Um herauszufinden aus welchen subzellulären Kompartimenten der Zelle die Proteine

in den MVs stammen, wurden diese unter Verwendung der NCBI-Datenbank nach

Lokalisation klassifiziert. Die Abb. 3.32 zeigt, dass die Proteine in den MVs, die von L.

monocytogenes produziert werden, aus allen 4 subzellulären Kompartimenten der Zelle

stammen, allerdings mit unterschiedlicher Häufigkeit.

3. Ergebnisse

106

Abb. 3.32: Klassifizierung der MVs-Proteine nach der subzellulären Lokalisation unter Verwen-

dung der NCBI-Datenbank. Laut NCBI-Datenbank enthalten die MVs, die von Lm produziert werden,

Proteine aus allen 4 subzellulären Kompartimenten. Die meisten MVs-Proteine (37,62%) sind als

cytosolische Proteine beschrieben. Für 26,49% der Proteine in den MVs ist laut NCBI-Datenbank keine

Lokalisation beschrieben.

Mehr als ein Drittel (37,62%) der Proteine in den MVs sind als cytosolische Proteine

beschrieben. Hierzu zählen Proteine, die eine Funktion im Metabolismus von Kohlen-

hydraten, Aminosäuren, Lipide und Nukleotide beschrieben haben. Die Proteine, die

eine Funktion in der Gruppe Informationsspeicherung und -prozessierung beschrieben

haben, werden ebenfalls dazugezählt. Hierzu gehören Proteine, die in der Replikation,

Rekombination und Transkription der DNA sowie Ribosomen-Aufbau und Protein-

synthese involviert sind.

Integrale und Membran-assoziierte Proteine stellen 20,59% der Proteine in den von L.

monocytogenes produzierten MVs dar. Hierzu zählen die Membranproteine verschie-

dener ABC-Transporter, die über MS-Analyse in den MVs identifiziert worden sind.

Verschiedene Bestandteile der Sec-Translokase und der Atmungskette, die über MS-

Analyse in den MVs identifiziert worden sind, wurden ebenfalls in diesem subzellulären

Kompartiment eingeteilt.

Die Proteine, die eine Lokalisation in der Zellwand beschrieben haben, sind mit einem

Anteil von 8,48% deutlich weniger in den von L. monocytogenes produzierten MVs

vorhanden. Hierzu zählen beispielsweise Internalin A (inlA, lmo0433) und Internalin H

(inlH, lmo0263), die über das LPXTG-Motiv kovalent an die Zellwand gebunden sind.

Internalin B (inlB, lmo0434), das über ein GW-Modul nicht-kovalent mit der Zellwand

assoziiert ist, zählt ebenfalls dazu (Trost et al, 2005; Bierne und Cossart, 2007).

Die extrazellulär beschriebenen Proteine stellen mit 6,82% die kleinste Gruppe in den

von L. monocytogenes produzierten MVs dar. Hierzu gehört beispielsweise das Auto-

lysin P60 (iap, lmo0582), das mit 2,28% zu den häufigsten Proteinen in den MVs zählt

(Abschnitt 3.2.3.3). Die sekretierten Virulenzfaktoren Listeriolysin O (hly, lmo0202),

Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C (plcA, lmo0201) und Zink-Metallo-

3. Ergebnisse

107

protease (mpl, lmo0203) werden ebenfalls dazu gezählt (Trost et al, 2005). Auf diese

Virulenzfaktoren wird im Abschnitt 3.2.3.4 näher eingegangen.

Für die restlichen Proteine (26,49%), die über MS-Analyse in den von L. monocyto-

genes produzierten MVs identifiziert worden sind, hat die NCBI-Datenbank keine

Lokalisation beschrieben. Die Mehrheit dieser Proteine ist weitgehend nicht charakte-

risiert.

3.2.3.3. Die 20 häufigsten Proteine in den MVs

In der Abb. 3.33 sind die 20 häufigsten Proteine in den MVs, die von L. monocytogenes

während des Wachstums in Minimalmedium unter aeroben Bedingungen produziert

werden, dargestellt. Deren Anteil an der Gesamtmasse der Proteine in den MVs liegt bei

jeweils über 1%. Diese 20 Proteine machen knapp die Hälfte der Masse (47,18%) aller

Proteine in den MVs aus. Die restlichen 496 Proteine, deren Anteil bei jeweils unter 1%

liegt, machen knapp 53% aus. Dieser Abschnitt beschreibt einige der häufigsten

Proteine in den von L. monocytogenes produzierten MVs.

Das häufigste Protein in den MVs ist das DNA protection during starvation protein

(dps, lmo0943) mit einem Anteil von 8,06%. Dieses Protein wurde ursprünglich in E.

coli identifiziert als eines der Hauptproteine, die in der stationären Wachstumsphase

induziert werden (Altuvia et al, 1994). Das Dps-Protein ist ein Ferritin-ähnliches

Protein, das die Bildung toxischer Hydroxyl-Radikale über die Fenton-Reaktion

verhindert, indem es frei in der Zelle vorliegendes Eisen bindet. Es reduziert darüber

hinaus vorhandenes H2O2 zu H2O, wobei das gebundene Eisen als Reduktionsmittel

dient (Zhao et al, 2002). Dadurch werden die beiden reaktiven Komponenten aus der

Fenton-Reaktion entfernt. Das Dps-Protein bietet zusätzlichen Schutz vor oxidativem

Schaden, indem es unspezifisch an DNA bindet (Martinez und Kolter, 1997). Aufgrund

dieser Eigenschaften spielt das Dps-Protein eine essentielle Rolle in der intrazellulären

Vermehrung und damit in der Virulenz von L. monocytogenes (Olsen et al, 2005).

Ein weiteres häufiges Protein in den von L. monocytogenes produzierten MVs ist das

Single-stranded DNA-binding protein 2 (ssb2, lmo2308) mit einem Anteil von 3,58%.

Durch die Bindung an DNA vermittelt das SSB2-Protein u.a. Schutz vor Abbau durch

Exo- und Endonukleasen unter Stressbedingungen (Meyer und Laine, 1990).

3. Ergebnisse

108

Abb. 3.33: Die 20 häufigsten Proteine in den MVs, die von L. monocytogenes produziert werden.

Die 20 häufigsten Proteine machen knapp die Hälfte (47,18%) der Gesamtmasse der Proteine in den

MVs, die von Lm produziert werden, aus. Deren Anteil liegt bei jeweils über 1%. Der Anteil der

restlichen 496 Proteine liegt bei jeweils unter 1%.

Die Enolase (eno, lmo2455) gehört mit 2,90% ebenfalls zu den 20 häufigsten Proteinen

in den MVs, die von L. monocytogenes produziert werden. Der Enolase, die ein

glykolytisches Enzym ist, werden zusätzliche moonlighting Funktionen außerhalb der

Zelle, wie beispielsweise die Bindung von humanem Plasminogen, zugeschrieben. Die

Enolase wird trotz fehlender Signalsequenz durch die SecA2-ATPase der Sec-Trans-

lokase sekretiert und ist sowohl in der Zellwand als auch im Überstand von L.

monocytogenes-Kulturen identifiziert worden (Lenz et al, 2003; Schaumburg et al

2004).


Autolysin Probable endopeptidase p60 (iap, lmo0582) mit einem Anteil von 2,28%.

P60 wird, ähnlich wie die Enolase, durch die SecA2-ATPase der Sec-Translokase

sekretiert. Es trägt als Autolysin zur Trennung der Tochterzellen in der Zellteilung bei.

Darüber hinaus wurde für P60 eine Beteiligung an der Invasion von L. monocytogenes

in nicht-phagocytierenden Zellen gezeigt, weshalb es auch als Invasion-associated

secreted endopeptidase bezeichnet wird (Kuhn und Goebel, 1989; Pilgrim et al, 2003;

Lenz et al, 2003; Machata et al, 2005).

3. Ergebnisse

109

Foldase protein PrsA2 (prsA2, lmo2219) zählt mit 1,34% ebenfalls zu den häufigsten

Proteinen in den MVs, die von L. monocytogenes produziert werden. Es unterstützt als

Chaperon die korrekte Faltung von sekretierten Proteinen im Anschluss an die Trans-

lokation (Alonzo und Freitag, 2010). PrsA2 trägt zur Virulenz von L. monocytogenes

bei, indem es die Faltung und Stabilität und dadurch die Aktivität der Virulenzfaktoren

LLO und PlcB kontrolliert. Die PrsA2-Deletionsmutante zeigt eine verringerte

Hämolyse- und Phospholipase-Aktivität und infolgedessen eine abgeschwächte

Virulenz im Mausinfektionsmodell (Alonzo et al, 2009). Ein weiterer Hinweis für die

Bedeutung von PrsA2 in der Virulenz von L. monocytogenes ist dessen Hochregulation

während des intrazellulären Wachstums in Makrophagen aufgrund der PrfA-abhängigen

Regulation (Chatterjee et al, 2006; Port und Freitag, 2007).


Oligopeptid-bindende Protein OppA (lmo2196) mit einem Anteil von 1,22%. Dieses

Protein ist Teil des Oligopeptidpermease-Operons (Opp), das den Transport von

Peptiden in die Zelle vermittelt (Borezee et al, 2000). Während des intrazellulären

Wachstums von L. monocytogenes vermittelt OppA die Aufnahme von Peptiden, die als

Quelle für Aminosäuren genutzt werden. Infolgedessen spielt OppA eine essentielle

Rolle in der Virulenz dieses Pathogens (Borezee et al, 2000; Marquis et al, 1993).

Darüber hinaus wird diesem Protein eine Rolle in der Kälteadaptation von L.

monocytogenes zugeschrieben (Borezee et al, 2000).

3.2.3.4. Virulenzfaktoren in den MVs

In den von L. monocytogenes produzierten MVs ist eine Vielzahl von Virulenzfaktoren,

die für den intrazellulären Infektionszyklus dieses Pathogens essentiell sind, über MS-

Analyse identifiziert worden. Diese machen 10% der Proteine in den MVs aus (Abb.

3.34).

Mit einem Anteil von 3,59% ist Internalin C (inlC, lmo1786) der häufigste Virulenz-

faktor in den MVs, die von L. monocytogenes produziert werden. Es handelt sich

hierbei um ein sekretiertes Protein, das homolog zu den beiden Internaline A und B ist

(Engelbrecht et al, 1996). Aufgrund der induzierten Expression während der

Vermehrung von L. monocytogenes im Cytosol von Wirtszellen wird diesem Internalin

eine Rolle in der späten Phase des Infektionszyklus zugeschriebe (Engelbrecht et al,

1996). Darüber hinaus wurde für Internalin C eine unterstützende Rolle in der InlA-

3. Ergebnisse

110

induzierten Internalisierung in nicht-phagocytierenden Zellen gezeigt (Bergmann et al,

2002). Die reduzierte Virulenz der InlC-Deletionsmutante im Mausinfektionsmodell

bestätigt dessen Rolle als Virulenzfaktor von L. monocytogenes (Engelbrecht et al,

1996).

Abb. 3.34: Virulenzfaktoren in den von L. monocytogenes produzierten MVs. Die MS-Analyse hat

zur Identifizierung von Virulenzfaktoren, die in den intrazellulären Infektionszyklus von Lm involviert

sind, in den MVs geführt. Diese machen 10% der Proteine in den MVs aus, wobei Internalin C mit einem

Anteil von knapp 4% der häufigste Virulenzfaktor ist.

In den von L. monocytogenes produzierten MVs sind weitere Internaline, Internalin A

(inlA, lmo0433) und Internalin B (inlB, lmo0434), identifiziert worden. Diese vermitteln

die Internalisierung von L. monocytogenes in nicht-phagocytierenden Zellen (Abb. 1.1)

(Mengaud et al, 1996; Shen et al, 2000).

Die für die Befreiung von L. monocytogenes aus dem Phagosom der Wirtszellen

essentiellen Virulenzfaktoren Listeriolysin O (hly, lmo0202), die beiden Phosphatidyl-

inositol- und Phosphatidylcholin-spezifischen Phospholipase C-Enzyme (plcA, lmo0201

und plcB, lmo0205) sowie die Zink-Metalloprotease (mpl, lmo0203) sind ebenfalls in

den MVs identifiziert worden (Gedde et al, 2000; Leimeister-Wächter et al, 1991;

Geoffroy et al, 1991; Domann et al, 1991). Dies gilt auch für den Aktinfilament-

akkumulierenden Faktor A (actA, lmo0204), der die intra- und interzelluläre Bewegung

von L. monocytogenes über die Akkumulierung von Aktin der Wirtszelle vermittelt

(Abb. 1.1) (Kocks et al, 1992; Domann et al, 1992).

Nach InlC ist LLO mit 2,12% der zweithäufigste Virulenzfaktor in den MVs, die von L.

monocytogenes produziert werden. Es folgen InlA, PlcA, ActA und PlcB mit jeweils

1%. Mpl und InlB machen jeweils 0,15% der Proteine in den MVs aus (Abb. 3.34).

3. Ergebnisse

111

3.2.4. SDS-PAGE- und Western blot-Analyse von MVs

Das Proteinprofil der MVs, die von L. monocytogenes produziert werden, wurde durch

SDS-PAGE und anschließende Coomassie-Färbung visualisiert. Hierfür wurden MVs

aus 3 biologischen Replikaten verwendet, wobei jeweils 5 µg MVs in einem 12%igem

SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt wurden (Abb. 3.35A).

(A) (B)

Abb. 3.35: Proteinprofil- und Western blot-Analyse von MVs, die von L. monocytogenes produziert

werden. A: Proteinprofil-Analyse von Lm-MVs mittels SDS-PAGE. Jeweils 5 µg MVs aus 3 biolo-

gischen Replikaten wurden in einem 12%igem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Diese Untersuchung

enthüllt eine Vielzahl unterschiedlicher Proteine in den MVs, wobei alle 3 MVs-Isolierungen das gleiche

Proteinprofil zeigen. B: Western blot-Analyse von Lm-MVs. Nach Auftrennung der MVs-Proteine durch

SDS-PAGE wurden diese elektrophoretisch auf eine Trägermembran übertragen und mit P60-, InlB- und

LLO-Antikörper behandelt. Diese Untersuchung enthüllt die Anwesenheit des Autolysins P60 und der

beiden Virulenzfaktoren, InlB und LLO, in den Lm-MVs.

Das durch SDS-PAGE erzielte Proteinprofil bestätigt das in den Abschnitten zuvor

beschriebene Ergebnis der MS-Analyse. Es zeigt, dass die von L. monocytogenes produ-

zierten MVs eine Vielzahl von verschiedenen Proteinen mit jeweils unterschiedlicher

Häufigkeit enthalten. Des Weiteren zeigen die MVs aus den 3 verschiedenen Iso-

lierungen das gleiche Proteinprofil.

In einem weiteren Schritt wurde die Anwesenheit des Autolysins P60 und der beiden

Virulenzfaktoren, Internalin B (InlB) und Listeriolysin O (LLO), in den MVs über

Western blot untersucht. Hierfür wurden Antikörper, die gegen P60, InlB und LLO

gerichtet sind, verwendet. Die Abb. 3.35B zeigt die Detektion dieser Proteine über

spezifische Antikörperbindung in den von L. monocytogenes produzierten MVs und

bestätigt das Ergebnis der MS-Analyse (Abb. 3.33 und 3.34).

3. Ergebnisse

112

3.2.5. Untersuchung der hämolytischen Aktivität von MVs

Die Anwesenheit von Listeriolysin O (LLO) in den MVs, die von L. monocytogenes

produziert werden, wurde über MS- und Western blot-Analyse identifiziert (Abb. 3.34

und 3.35B). Die hämolytische Aktivität dieses Virulenzfaktors vermittelt u.a. die

Befreiung von L. monocytogenes aus dem Phagosom der Wirtszellen (Abb. 1.1). In

einem weiteren Schritt wurde untersucht, ob das in den MVs identifizierte LLO

hämolytisch aktiv ist. Hierfür wurde ein Hämolyse-Assay durchgeführt. In einer 96er-

Well Platte wurden 5 µg MVs heruntertitriert und mit einer 1%igen Schafserythrozyten-

Lösung für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Platte abzentrifugiert

und die Überstände wurden in eine neue Platte überführt (Abb. 3.36).

(A)

(B)

Abb. 3.36: Konzentrationsabhängige Lyse von Schafserythrozyten durch MVs, die von L.

monocytogenes produziert werden. 5 µg Lm-MVs wurden heruntertitriert und mit einer 1%igen

Schafserythrozyten-Lösung inkubiert. Anschließend wurde die Platte abzentrifugiert und die Überstände

wurden in eine neue Platte überführt. Die Verfärbung der Überstände in den einzelnen Wells zeigt den

Grad der Hämolyse an (B). Dabei ist eine konzentrationsabhängige Lyse von Schafserythrozyten durch

die MVs zu sehen.

Das Ausmaß der Lyse von Erythrozyten lässt sich anhand der Verfärbung, die durch

Freisetzung von Hämoglobin verursacht wird, in den einzelnen Wells optisch feststellen

und photometrisch messen. Der durch H2O erzielte hämolytische Effekt entspricht der

maximalen Hämolyse (100%-Wert). Als Negativkontrolle diente PBS. Die Abb. 3.36

3. Ergebnisse

113

zeigt, dass LLO in den von L. monocytogenes produzierten MVs hämolytisch aktiv ist.

Es zeigt des Weiteren eine konzentrationsabhängige Lyse von Schafserythrozyten durch

die MVs. Die Messung der optischen Dichte bei 405 nm ergab, dass 0,078 µg MVs

einer hämolytischen Einheit (HU) und damit 50% der durch H2O verursachten

Hämolyse entsprechen.

3.2.6. Untersuchung der Fähigkeit von MVs zur Internalisierung in PtK-Zellen

Um herauszufinden, ob die von L. monocytogenes produzierten MVs die Fähigkeit zur

Internalisierung in Wirtszellen haben, wurden PtK-Zellen mit 2 verschiedenen MVs-

Konzentrationen für 24 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die Zellen gründlich

gewaschen und lysiert. Die Anwesenheit des Autolysins P60 im Zelllysat der PtK-

Zellen wurde über Western blot untersucht (Abb. 3.37). Hierfür wurde ein Antikörper,

der gegen P60 gerichtet ist, verwendet. P60 wurde zuvor über MS- und Western blot-

Analyse in den MVs identifiziert (Abb. 3.33 und 3.35B). Es gehört zu den häufigsten

Proteinen in den MVs, die von L. monocytogenes produziert werden.

Abb. 3.37: Internalisierung von MVs, die von L. monocytogenes produziert werden, in PtK-Zellen.

Nach Inkubation von PtK-Zellen mit 5 und 10 µg MVs wurde die Anwesenheit des Autolysins P60 im

Zelllysat über Western blot untersucht. Während die unbehandelten Zellen (Neg. Kontrolle) kein Signal

zeigen, ist eine zunehmende Signalintensität in den behandelten Ansätzen zu sehen. Die Ladekontrolle (β-

Aktin) zeigt in allen 3 Ansätzen die gleiche Intensitätsstärke.

Die Abb. 3.37 zeigt die Detektion des Autolysins P60 im Zelllysat der PtK-Zellen, die

mit den MVs inkubiert wurden. Die Signalintensität ist in dem Ansatz, der mit einer

höheren MVs-Konzentration (10 µg) inkubiert wurde, stärker. Dies spricht für eine

dosenabhängige Internalisierung von MVs in PtK-Zellen. Im Zelllysat der Zellen, die

nicht mit MVs inkubiert wurden und als Negativkontrolle dienten, ist kein Signal zu

sehen. Dies zeigt, dass der verwendete P60 Antikörper nicht unspezifisch an Zell-

strukturen von PtK-Zellen bindet. Des Weiteren zeigt die Ladekontrolle (β-Aktin) in

allen Ansätzen die gleiche Signalintensität. Das Ergebnis dieser Untersuchung zeigt,

3. Ergebnisse

114

dass die von L. monocytogenes produzierten MVs die Fähigkeit zur Internalisierung in

Wirtszellen haben.

4. Diskussion

115

4. Diskussion

4.1. Die von L. monocytogenes sekretierte RNA ist in den Fraktionen sec-RNA und

MVs-RNA gegenwärtig

Diese Arbeit hat gezeigt, dass die von L. monocytogenes sekretierte RNA in zwei

Fraktionen vorkommt, in den MVs und in einer freien, nicht MVs-assoziierten Fraktion.

Daraufhin wurden die Begriffe MVs-RNA und sec-RNA eingeführt, um eine

Unterscheidung dieser beiden sekretierten RNA-Fraktionen machen zu können. Diese

Unterscheidung wurde von früheren Studien, die sich mit der von L. monocytogenes

sekretierten RNA beschäftigt haben, nicht gemacht (Abdullah et al, 2012; Hagmann et

al, 2013). Die Erkenntnis, dass die von L. monocytogenes sekretierte RNA in zwei

Fraktionen vorkommt, wurde erst im Laufe dieser Arbeit gewonnen. Dabei wurde ein

Protokoll etabliert, das zunächst die Trennung beider RNA-Fraktionen und anschlie-

ßend die Isolierung der RNA beinhaltet (Abb. 3.1). Sowohl MVs als auch sec-RNA

werden von L. monocytogenes während des Wachstums ins Medium freigesetzt, daher

war der Rohstoff für die Isolierung beider RNA-Fraktionen der bakterienfreie Über-

stand. Nach dem dieser durch Ultrafiltration eingeengt wurde, wurden die MVs

pelletiert. Daraus erfolgte in einem weiteren Schritt die Isolierung von MVs-RNA.

Der resultierende MVs-freie Überstand diente als Grundlage für die Isolierung von sec-

RNA. Anhand dieses Protokolls wurden aus 2 L L. monocytogenes-Kulturen ca. 12 µg

MVs-RNA und ca. 120 µg sec-RNA isoliert. Infolgedessen sekretiert L. monocytogenes

10mal mehr RNA in einer freien, nicht MVs-assoziierten Form. Bislang gibt es keine

Studie, die eine Quantifizierung der RNA, die von den Bakterien sekretiert wird,

durchgeführt hat. Daher ist an dieser Stelle ein Vergleich mit anderen Bakterienspezies

nicht möglich. Dies ist allerdings analog zu eukaryotischen Zellen, die den Großteil der

extrazellulären RNA in einer freien, nicht Exosomen-assoziierten Form sekretieren

(Wang et al, 2010; Arroyo et al, 2011; Turchinovich et al, 2011).

Dass Bakterien die Produktion von Vesikeln u.a. für den Export von RNA nutzen,

wurde von weiteren Studien gezeigt, wenngleich der Mechanismus für die selektive

Sortierung von RNA in die Vesikel weitgehend unbekannt ist (Ho et al, 2015; Sjöström

et al, 2015; Resch et al, 2016). Aufgrund der Tatsache, dass L. monocytogenes 10mal

mehr RNA in einer freien, nicht MVs-assoziierten Form sekretiert, muss es für deren

Export weitere Sekretionswege geben. Eine Studie aus dem Jahr 2012 hat gezeigt, dass

4. Diskussion

116

die SecA2-ATPase der Sec-Translokase, die einen generellen Sekretionsweg für

Proteine darstellt, teilweise an der Sekretion von RNA durch L. monocytogenes beteiligt

ist. Die SecA2-Deletionsmutante zeigt eine reduzierte Sekretion von RNA ins extra-

zelluläre Milieu (Desvaux und Hébraud, 2006; Abdullah et al, 2012). Die SecA2-

ATPase vermittelt u.a. die Sekretion von sogenannten moonlighting Proteinen, wie

beispielsweise DnaK, GroEL, EF-Tu, Enolase, RNA-Polymerase und ribosomale

Proteine, die für deren RNA-Bindung bekannt sind (Lenz et al, 2003; Georgellis et al,

1995; Py et al, 1994; Miczak et al, 1996; Vanzo et al, 1998). Es wäre daher denkbar,

dass L. monocytogenes RNA über Proteinsekretionswege in Verbindung mit RNA-

bindenden Proteinen sekretiert. Eine Sekretion von RNA über RNA-bindende Proteine,

wie beispielsweise Argonaute 2 (AGO2), Nucleophosmin (NPM1) und High Density

Lipoprotein (HDL), wird auch bei Eukaryoten vermutet (Wang et al, 2010; Turchi-

novich et al, 2011; Vickers et al, 2011). Dies würde die Stabilität der freien, nicht MVs-

assoziierten RNA im extrazellulären Milieu erklären. Darüber hinaus könnte diese

Transportform deren Aufnahme durch target-Zellen vermitteln, wie das bereits für

HDL-assoziierte miRNAs gezeigt wurde (Vickers et al, 2011).

4.2. Unterschiedliche Zusammensetzung von sec-RNA, MVs-RNA und zellulärer

RNA

Diese Arbeit hat erstmals die Zusammensetzung der RNA, die von L. monocytogenes

sekretiert wird, identifiziert. Durch die Sequenzierung von sec-RNA und MVs-RNA

wurde gezeigt, dass die von L. monocytogenes sekretierte RNA alle bekannten RNA-

Spezies enthält, rRNA, tRNA, mRNA und sRNA (Abb. 3.5). Darüber hinaus wurde

gezeigt, dass die beiden sekretierten RNA-Fraktionen sich sowohl untereinander als

auch von der zellulären RNA unterscheiden, bezüglich Vorkommen und Häufigkeit

bestimmter RNA-Spezies. Diese Feststellung und die hohe Reproduzierbarkeit der

erzielten Sequenzierungsdaten aus drei biologischen Replikaten weisen auf einen

selektiven Export von RNA durch L. monocytogenes hin. Ähnliche Beobachtungen

wurden von weiteren Studien, die sich mit der von verschiedenen Bakterienspezies

sekretierten RNA beschäftigt haben, berichtet (Ghosal et al, 2015; Koeppen et al, 2016;

Blenkiron et al, 2016). Daher wird für die sekretierte RNA eine Funktion in der

interzellulären Kommunikation, in der pathogene Bakterien die Genexpression ihrer

Wirtszellen manipulieren, vermutet. Dies wird zum einen durch Studien begründet, die

4. Diskussion

117

den Transfer von RNA über Vesikel in Wirtszellen gezeigt haben (Koeppen et al, 2016;

Blenkiron et al, 2016). Zum anderen wurde eine veränderte Expression von bestimmten

Proteinen, die von Vesikel-assoziierten RNAs in Wirtszellen ausgelöst wurde, gezeigt

(Koeppen et al, 2016). Weitere Analysen wären notwendig, um eine genaue Aussage

darüber machen zu können, ob die von L. monocytogenes sekretierte RNA eine

Funktion in der interzellulären Kommunikation erfüllt.

Diese Arbeit hat allerdings gezeigt, dass die von L. monocytogenes sekretierten RNA-

Fraktionen, sec-RNA und MVs-RNA, eine hohe IFN-β Antwort nach Transfektion in

Wirtszellen auslösen (Abb. 3.4). Hierdurch wurde gezeigt, dass die in BMDMs ausge-

löste IFN-β Antwort durch sec-RNA ca. 70fach und durch MVs-RNA ca. 20fach höher

ist im Vergleich zu der zellulären RNA. Wie bereits eingangs erwähnt, erhöht die von L.

monocytogenes während einer Infektion ausgelöste IFN-β Antwort die Anfälligkeit des

Wirtes gegenüber diesem Pathogen und fördert dessen Vermehrung (Carrero et al,

2004; O`Connell et al, 2004). So wurde beispielsweise diesbezüglich gezeigt, dass die

von L. monocytogenes ausgelöste Typ-I-IFN Antwort die polarisierte Polymerisation

von Aktin der Wirtszelle durch den Virulenzfaktor ActA fördert, wodurch dessen

intrazelluläre Bewegung und Infektion von Nachbarzellen unterstützt wird (Osborne et

al, 2017). Die Induktion von IFN-β über die Sekretion von RNA ist daher als eine Form

von Einflussnahme durch L. monocytogenes auf die Wirtszellen anzusehen.

4.3. Anreicherung von kleinen nicht-kodierenden RNAs in MVs-RNA

Ein erster Eindruck über die Zusammensetzung von sec-RNA und MVs-RNA wurde

durch Profilanalyse mittels Agilent 2100 Bioanalyzer erzielt. Hierdurch wurde die

Anwesenheit von kleinen nicht-kodierenden RNAs in beide sekretierten Fraktionen

gezeigt (Abb. 3.2). Die höhere Auflösung dieser RNA-Population hat gezeigt, dass in

MVs-RNA der überwiegende Teil aus 20 Nt langen RNAs besteht (Abb. 3.3B). Diese

Länge entspricht der von eukaryotischen miRNAs, die als kleine nicht-kodierende

RNAs eine Schlüsselfunktion in der post-transkriptionellen Genregulation haben. RNAs

mit dieser Länge wurden in verschiedenen Bakterienspezies, darunter E. coli und

Streptococcus mutans, identifiziert und werden als msRNAs (microRNA-size, small

RNAs) bezeichnet (Kang et al, 2013; Lee und Hong, 2011). Deren Funktion ist

weitgehend unbekannt, allerdings wird aufgrund der Häufigkeit und der Diversität ihres

Vorkommens in den Bakterienzellen eine regulatorische Funktion angenommen.

4. Diskussion

118

Eine weitere Studie hat die Anwesenheit von msRNAs in den MVs, die von Strepto-

coccus sanguinis produziert werden, gezeigt (Choi et al, 2016). Eine mögliche Funktion

dieser RNA-Spezies in den von Bakterien produzierten MVs wird in der interzellulären

Kommunikation vermutet. Diese Vermutung wird von zahlreichen Studien aus der

Eukaryoten-Forschung, die den Export von miRNAs über Exosomen gezeigt haben,

begründet (Chevillet et al, 2014; Baldwin et al, 2017). Darüber hinaus wurde eine

Einflussnahme auf die Genregulation von Empfängerzellen nach Transfer von miRNAs

über Exosomen gezeigt (Kogure et al, 2011).

4.4. Unterschiedliche IFN-β Induktion durch sRNAs, die in sec-RNA und MVs-

RNA identifiziert worden sind

Aufgrund der höheren IFN-β Induktion durch die sekretierten RNA-Fraktionen im

Vergleich zu der zellulären RNA wurde untersucht welchen Beitrag einzelne RNAs, die

in sec-RNA und MVs-RNA identifiziert worden sind, an der IFN-β Antwort haben. Die

Transfektion der einzelnen sRNAs, die durch in vitro Transkription hergestellt worden

sind, in HEK293-Zellen hat gezeigt, dass diese ein unterschiedliches Potential besitzen

IFN-β zu induzieren (Abb. 3.9). So haben rli32, rli47, rli99 und rli100 die höchste IFN-

β Antwort ausgelöst. Andere hingegen, wie rli98, rli111, rli114, rliG, ssrA und ssrS,

haben eine sehr schwache IFN-β Antwort ausgelöst. Weitere sRNAs, wie rli50, rli51,

rli56, rli60, rli62, LhrA und SRP, haben ein moderates IFN-β Induktionspotential

gezeigt. In einem weiteren Versuch, in dem einige dieser sRNAs in BMDMs transfiziert

worden sind, wurde das unterschiedliche Potential einzelner sRNAs IFN-β zu indu-

zieren, bestätigt (Abb. 3.10).

Die Fähigkeit einer gegebenen sRNA IFN-β zu induzieren, korreliert nicht mit der

Häufigkeit ihres Vorkommens in den beiden sekretierten RNA-Fraktionen. So zählen

beispielsweise ssrA und ssrS zu den häufigsten sRNAs in sec-RNA und MVs-RNA,

dennoch haben diese sRNAs eine sehr schwache IFN-β Antwort ausgelöst. SRP, die

häufigste sRNA in den beiden sekretierten RNA-Fraktionen, hat eine moderate IFN-β

Antwort nach Transfektion in HEK293-Zellen ausgelöst. Anders hingegen rli100, das

im Vergleich dazu eine viel geringere Anzahl an reads in sec-RNA und MVs-RNA

aufweist und dennoch zu den sRNAs mit der höchsten IFN-β Induktion zählt.

Einige in den sekretierten RNA-Fraktionen von L. monocytogenes identifizierten

sRNAs sind von früheren Studien beschrieben worden. Für rli32 beispielsweise wird,

4. Diskussion

119

aufgrund der höheren Transkription während des intrazellulären Wachstums von L.

monocytogenes und dessen möglichen mRNA-targets, eine Rolle in der Virulenz

vermutet (Mraheil et al, 2011; Toledo-Arana et al, 2009). Ähnliches wird für rli47

angenommen, dessen Transkription von dem alternativen Sigma Faktor B, der die

generelle Stressantwort in der stationären Wachstumsphase und während der Infektion

kontrolliert, abhängt (Hain et al, 2008; Mraheil et al, 2011; Oliver et al, 2009). Des

Weiteren wurde über Transkriptom-Analyse gezeigt, dass LhrA in der stationären

Wachstumsphase die Expression von ca. 300 Genen reguliert. Experimentell wurde die

chiA-mRNA, die für eine der beiden Chitinasen von L. monocytogenes kodiert, als

target nachgewiesen (Christiansen et al, 2006; Nielsen et al, 2011). Für rli60 wurde eine

Rolle in der Anpassung von L. monocytogenes an verschiedenen Stressbedingungen und

in der Biofilmbildung gezeigt. Für rli50 hingegen wird, aufgrund der reduzierten Viru-

lenz der rli50-Deletionsmutante im Mausinfektionsmodell, eine Rolle in der intra-

zellulären Vermehrung von L. monocytogenes vermutet (Peng et al, 2016; Mraheil et al,

2011).

4.4.1. RIG-I-Abhängigkeit der IFN-β Induktion durch die sRNAs

Diese Arbeit hat gezeigt, dass die von L. monocytogenes sekretierten sRNAs ein

unterschiedliches Potential besitzen IFN-β zu induzieren. In einem weiteren Schritt

wurde die Abhängigkeit der IFN-β Antwort, die von den einzelnen sRNAs in HEK293-

Zellen ausgelöst wurde, von den Rezeptoren RIG-I und MDA5 untersucht. Hierfür

wurden einige der 23 ausgesuchten sRNAs in RIG-I-defiziente Zellen transfiziert.

Darunter waren sRNAs, die in Wildtypzellen eine starke (rli32, rli47, rli99 und rli110)

sowie eine sehr schwache bis moderate (rli48, rli51, rli60, rli62, rli105, SRP und ssrS)

IFN-β Antwort ausgelöst hatten (Abb. 3.9). In RIG-I-defiziente Zellen haben diese

sRNAs, unabhängig von deren in Wildtypzellen gezeigten IFN-β Induktionspotential,

eine sehr schwache IFN-β Antwort ausgelöst (Abb. 3.12). Hierdurch wurde gezeigt,

dass die von den sRNAs in HEK293-Zellen ausgelöste IFN-β Antwort von dem

Rezeptor RIG-I abhängig ist. Dies wurde durch Transfektion von rli32, das unter den

ausgesuchten sRNAs das höchste IFN-β Induktionspotential gezeigt hatte, in HEK293-

Zellen mit einer Defizienz in eines der beiden Rezeptoren, RIG-I oder MDA5, bestätigt

(Abb. 3.13). RIG-I-defiziente Zellen zeigen eine signifikante Reduktion der IFN-β

Antwort im Vergleich zu den Wildtypzellen. Anders hingegen MDA5-defiziente Zellen,

4. Diskussion

120

die keinen signifikanten Unterschied in der IFN-β Antwort im Vergleich zu den

Wildtypzellen zeigen. Die signifikante Reduktion der IFN-β Induktion durch rli32 nach

Entfernung der 5`-Triphosphat-Gruppe durch Dephosphorylierung weist ebenfalls auf

eine RIG-I-Abhängigkeit der IFN-β Antwort durch die sRNAs in HEK293-Zellen hin.

Die erforderliche molekulare Struktur von RNAs für die Bindung und Aktivierung des

Rezeptors RIG-I wurde von zwei Studien identifiziert. Diese haben gezeigt, dass RNAs,

die am 5`-Ende eine basengepaarte Struktur mit einer Triphosphat-Gruppe besitzen, der

optimale Ligand für diesen Rezeptor darstellen. Dabei ist die Anwesenheit einer

Triphosphat-Gruppe am 5`-Ende von RNAs eine Grundvoraussetzung für deren

Bindung durch RIG-I (Schlee et al, 2009; Schmidt et al, 2009). Nach Entfernung der 5`-

Triphosphat-Gruppe durch Dephosphorylierung verliert rli32 die Fähigkeit einer effek-

tiven Bindung durch RIG-I und infolgedessen das hohe immunstimulatorische Potential.

4.4.2. Protektion von HEK293-Zellen gegen das Influenza A Virus durch die

sRNAs

Zahlreiche Studien haben die Bedeutung des Rezeptors RIG-I in der antiviralen Immun-

antwort gezeigt. Nach Detektion viraler RNA im Cytosol der infizierten Zellen löst

RIG-I über die Produktion von Typ-I-IFN antivirale Mechanismen aus, die zur Inhibi-

tion der viralen Vermehrung führen (Pichlmair et al, 2006; Kato et al, 2006; Kato et al,

2011). In einem weiteren Schritt wurde untersucht, ob die von den sRNAs ausgelöste

IFN-β Antwort die virale Replikation nach Infektion von HEK293-Zellen mit dem

Influenza A Virus (A/PR/8/34/(H1N1)) inhibiert. Diese Untersuchung hat gezeigt, dass

die Vorbehandlung von HEK293-Zellen mit rli32 und rli47, die im Vorfeld eine starke

IFN-β Antwort ausgelöst hatten, zu einer signifikanten Reduktion des Virustiters in den

Überständen der infizierten Zellen geführt hat (Abb. 3.15). Infolgedessen hat die von

den sRNAs ausgelöste IFN-β Antwort zu einer Inhibition der viralen Replikation in den

infizierten Zellen geführt. Anders hingegen ssrS, das nicht zu einer Inhibition der

viralen Replikation geführt hat. Diese sRNA hat im Vorfeld eine sehr schwache IFN-β

Antwort in HEK293-Zellen ausgelöst. Aufgrund des sehr schwachen Potentials von ssrS

eine IFN-β Antwort auszulösen, blieb die Inhibition der viralen Replikation in den

infizierten Zellen aus. Hierdurch wurde gezeigt, dass das unterschiedliche IFN-β

Induktionspotential einzelner sRNAs zu einer entsprechend mehr oder weniger starken

Inhibition der viralen Replikation geführt hat.

4. Diskussion

121

Des Weiteren wurde eine konzentrationsabhängige Inhibition der viralen Replikation

durch rli32 gezeigt. Die Vorbehandlung von HEK293-Zellen mit zunehmenden rli32

Konzentrationen hat zu einer zunehmenden Reduktion des Virustiters in den Über-

ständen der infizierten Zellen geführt (Abb. 3.17). Infolgedessen hat der Einsatz einer

höheren rli32 Konzentration zu einer höheren IFN-β Antwort mit entsprechend höherer

antiviraler Aktivität in den Zellen geführt.

In einem weiteren Versuch wurde die direkte Beteiligung von RIG-I an der antiviralen

Antwort, die von den sRNAs ausgelöst wurde, gezeigt. Die Vorbehandlung von RIG-I-

defizienten Zellen mit rli32 und rli47 hat nicht zu einer Inhibition der viralen Repli-

kation geführt (Abb. 3.16A). In MDA5-defiziente Zellen hingegen wurde eine signifi-

kante Reduktion des Virustiters festgestellt (Abb. 3.16B). Hierdurch hat diese Arbeit

erstmals die RIG-I-abhängige antivirale Aktivität von individuellen bakteriellen sRNAs

gezeigt. Verschiedene Studien haben die antivirale Aktivität von RIG-I-aktivierenden

RNA-Oligonukleotiden gezeigt. So wurde beispielsweise gezeigt, dass diese synthe-

tischen RIG-I-Liganden humane Lungenepithelzelllinien vor der Infektion mit den von

1918 und 2009 pandemischen Influenza A Viren schützen (Ranjan et al, 2010). Eine

weitere Studie hat gezeigt, dass die intravenöse Injektion von Mäusen mit einem

solchen RNA-Oligonukleotid Schutz gegen eine letale Infektion mit dem Influenza A

Virus bietet (Coch et al, 2017).

4.5. Das Motiv 2 ist für die hohe IFN-β Induktion durch rli32 verantwortlich

Rli32 hat sich unter den 23 ausgesuchten sRNAs, die in sec-RNA und MVs-RNA

identifiziert worden sind, als die sRNA mit dem höchsten IFN-β Induktionspotential

herausgestellt. Eine in silico Vorhersage der Sekundärstruktur von rli32 mit dem

RNAfold WebServer hat gezeigt, dass diese sRNA aus 3 Motiven besteht, die

verschiedene stem-loop Strukturen aufweisen (Gruber et al, 2008). Um herauszufinden

welche strukturelle Beschaffenheit für die hohe immunstimulatorische Aktivität von

rli32 verantwortlich ist, wurden die einzelnen Motive nach deren Herstellung in

BMDMs transfiziert. Diese Untersuchung hat Unterschiede, bezüglich der Fähigkeit

einzelner Motive IFN-β zu induzieren, gezeigt (Abb. 3.14). Während die Motive 1 und

3 eine sehr schwache bis moderate IFN-β Antwort ausgelöst hatten, hat das Motiv 2

eine ähnlich hohe IFN-β Antwort ausgelöst wie rli32 selbst. Basierend auf dieses

Ergebnis ist Motiv 2 für das hohe IFN-β Induktionspotential von rli32 verantwortlich.

4. Diskussion

122

Darüber hinaus hat diese Untersuchung gezeigt, dass Unterschiede in der strukturellen

Beschaffenheit von RNAs für die unterschiedliche IFN-β Antwort verantwortlich sind.

Zusätzlich zu der 5`-Triphosphat-Gruppe bestimmt die Struktur einer gegebenen RNA

die Bindung und Aktivierung des Rezeptors RIG-I. Dies ist möglicherweise der Grund

für die unterschiedliche IFN-β Induktion durch die von L. monocytogenes sekretierten

sRNAs.

4.6. Hohe Typ-I-IFN Induktion durch rli32 in der Maus

Die Untersuchung des immunstimulatorischen Potentials von rli32 in vivo hat gezeigt,

dass diese sRNA in beide Organe der Maus, Leber und Milz, eine hohe Typ-I-IFN

Antwort ausgelöst hat (Abb. 3.19 und 3.20). SsrS, das sich in den in vitro Transfektions-

versuchen als eine sRNA mit einem sehr schwachen IFN-β Induktionspotential

herausgestellt hatte, hat ebenfalls eine hohe Typ-I-IFN Antwort ausgelöst. Darüber

hinaus hat ssrS in der Milz eine höhere Typ-I-IFN Antwort ausgelöst als rli32. Die Typ-

I-IFN Antwort ist insgesamt in der Milz höher ausgefallen als in der Leber. Es wurde

gezeigt, dass die DCs-Subpopulationen in der Leber schwache Aktivatoren des Immun-

systems sind. Diese sind weniger reif, erfassen weniger Antigene und induzieren eine

schwächere T-Zelle Stimulation als die DCs in de Milz (Pillarisetty et al, 2004). Dies

erklärt die schwächere Typ-I-IFN Antwort in der Leber gegenüber der Milz.

Die von ssrS ausgelöste hohe Typ-I-IFN Antwort in der Maus ist möglicherweise auf

dessen Detektion durch pDCs, die das TLR-System und das Adapterprotein MyD88 für

die Produktion von Typ-I-IFN nutzen, zurückzuführen (Kawai und Akira, 2010). Diese

DCs-Subpopulation ist für die hohe Typ-I-IFN Antwort nach Detektion viraler RNA

bekannt (Cella et al, 1999; Colonna et al, 2002; Diebold et al, 2003). So lösen beispiels-

weise pDCs einen antiviralen Status nach Detektion des Hepatitis C Virus (HCV) über

TLR7 aus (Takahashi et al, 2010). Die Erkennung von ssrS durch die aktiveren pDCs in

der Milz ist möglicherweise der Grund dafür, dass ssrS eine höhere Typ-I-IFN Antwort

in der Milz ausgelöst hat als rli32.

4.7. Erhöhte IFN-β Induktion durch die sekretierten RNA-Fraktionen und MVs

nach Überexpression von rli32 in L. monocytogenes

Die Überexpression von rli32 in L. monocytogenes hat zu einem signifikanten Anstieg

der IFN-β Induktion durch alle RNA-Fraktionen, die von diesem Stamm isoliert und in

4. Diskussion

123

BMDMs transfiziert wurden, geführt (Abb. 3.22). Dabei hat sec-RNA die höchste IFN-

β Antwort ausgelöst, gefolgt von MVs-RNA und zellulärer RNA. Dadurch wurde das

IFN-β Induktionspotential der sec-RNA von L. monocytogenes um ein 10faches erhöht,

von ca. 1000fach auf ca. 10000fach. Darüber hinaus hat diese Untersuchung gezeigt,

dass nicht nur durch in vitro Transkription hergestelltes rli32 die Fähigkeit besitzt eine

hohe IFN-β Antwort auszulösen. Das von den Bakterienzellen selbst transkribierte rli32

besitzt das Potential IFN-β zu induzieren. Die von dem ssrS-überexprimierenden Stamm

isolierte RNA hingegen hat nicht zu einem Anstieg der IFN-β Antwort nach Transfek-

tion in BMDMs geführt. Dieses Ergebnis bestätigt die im Vorfeld durchgeführten in

vitro Transfektionsversuche und verdeutlicht, dass einzelne in den sekretierten RNA-

Fraktionen vorhandene sRNAs ein unterschiedliches Potential besitzen IFN-β zu

induzieren. Infolgedessen bestimmt die Zusammensetzung der sekretierten RNA-

Fraktionen aus verschiedenen RNAs mit unterschiedlichem immunstimulatorischem

Potential letztendlich die Höhe der IFN-β Antwort.

In HEK293-Zellen zeigen die sekretierten RNA-Fraktionen von Lm-pERL3-rli32,

ähnlich wie in BMDMs, eine höhere IFN-β Antwort als die zelluläre RNA (Abb. 3.23).

Anders als in BMDMs hat MVs-RNA eine höhere IFN-β Antwort ausgelöst als sec-

RNA. Ein weiterer Unterschied ist die höhere IFN-β Induktion durch die sekretierten

RNA-Fraktionen von Lm-pERL3-ssrS im Vergleich zu den RNA-Fraktionen, die vom

Wildtyp isoliert wurden. In einem weiteren Versuch wurde allerdings gezeigt, dass die

von den sekretierten RNA-Fraktionen der Stämme Lm-pERL3-rli32 und Lm-pERL3-

ssrS ausgelöste IFN-β Antwort in HEK293-Zellen von dem Rezeptor RIG-I abhängig ist

(Abb. 3.24). In BMDMs wurde eine signifikante Reduktion der IFN-β Antwort nach

Dephosphorylierung und Transfektion von sec-RNA und MVs-RNA festgestellt (Abb.

3.4). Dies spricht dafür, dass auch in BMDMs der Rezeptor RIG-I in der Detektion der

RNA, die von L. monocytogenes sekretiert wird, involviert ist. Allerdings könnten hier

auch andere Rezeptoren, wie beispielsweise TLRs, eine Rolle spielen. Weitere Analy-

sen wären notwendig, um eine genaue Aussage darüber machen zu können.

Des Weiteren hat die Überexpression von rli32 in L. monocytogenes das immun-

stimulatorische Potential der MVs erhöht (Abb. 3.25). Die von Lm-pERL3-rli32

isolierten MVs haben eine höhere IFN-β Antwort in BMDMs ausgelöst als die MVs, die

vom Wildtyp isoliert wurden. Das IFN-β Induktionspotential der MVs hingegen, die

von Lm-pERL3-ssrS isoliert wurden, liegt unter dem Niveau der MVs vom Wildtyp.

4. Diskussion

124

Infolgedessen hat das unterschiedliche IFN-β Induktionspotential der beiden sRNAs zu

der unterschiedlichen IFN-β Antwort durch die MVs der beiden Stämme geführt.

4.8. Produktion von MVs durch L. monocytogenes

Diese Arbeit hat die Produktion von MVs durch L. monocytogenes in der exponentiellen

Phase während des Wachstums in Minimalmedium unter aeroben Bedingungen gezeigt.

Die Charakterisierung der von L. monocytogenes produzierten MVs unter diesen

Bedingungen beinhaltete u.a. die Visualisierung und Bestimmung der Größe, Anzahl

und Proteinkonzentration. Die optische Darstellung der MVs wurde durch

Transmissions- und Rasterelektronenmikroskopie durchgeführt (Abb. 3.26). Diese

Visualisierung zeigt, dass L. monocytogenes sphärisch geformte MVs, die mehr oder

weniger einheitlich sind in ihrer Größe, produziert. Die Größenbestimmung der MVs

durch NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) ergab, dass die von L. monocytogenes

produzierten MVs eine durchschnittliche Größe von 130,7 ± 1,0 nm haben (Abb. 3.27).

Eine Studie, die im Jahr 2013 erstmals die Produktion von MVs durch L. monocyto-

genes gezeigt hatte, hat dabei eine Größe von 20-100 nm festgestellt (Lee et al, 2013).

Allerdings hat diese Studie MVs untersucht, die von L. monocytogenes in der

stationären Phase während des Wachstums in BHI-Medium unter aeroben Bedingungen

produziert werden. Die Anzahl der MVs, die aus 2 L L. monocytogenes-Kulturen

isoliert wurden, beträgt laut NTA-Analyse ca. 70 × 109. Die Bestimmung der

Proteinkonzentration mit der Bradford-Methode ergab 150-200 µg/2 L Bakterienkultur.

Die im Jahr 2013 durchgeführte Studie hat eine Proteinkonzentration von 121 ± 6,2

µg/1 L L. monocytogenes-Kultur angegeben. Diese Unterschiede zwischen der

vorliegenden Arbeit und der Studie von Lee et al (2013) zeigen, dass die Produktion

von MVs durch L. monocytogenes von äußeren Faktoren, wie beispielsweise das

Wachstumsmedium, beeinflusst wird. Dass die Produktion von Vesikeln durch

Bakterien von äußeren Bedingungen beeinflusst wird, wurde auch von anderen Studien

gezeigt. Eine davon beispielsweise beschreibt den Einfluss des Wachstumsmediums auf

die MVs-Produktion durch das Pflanzen-Pathogen Xanthomonas campestris (McBroom

und Kuehn, 2007; Kadurugamuwa und Beveridge, 1995; Sidhu et al, 2008).

4. Diskussion

125

4.9. MVs enthalten Enzyme, die möglicherweise an deren Biogenese beteiligt sind

Die durch Rasterelektronenmikroskopie (REM) erzielten Bilder zeigen die Produktion

von MVs durch L. monocytogenes (Abb. 3.26C und 3.26D). Darauf kann man erkennen,

dass die Produktion von MVs über die gesamte Oberfläche von L. monocytogenes

erfolgt. Der genaue Biogenese-Mechanismus für die Produktion von MVs durch gram-

positive Bakterien ist weitgehend unbekannt. Ein Modell, das für die Produktion von

OMVs durch gram-negative Bakterien von zwei Studien vorgeschlagen wurde,

beschreibt die MVs-Produktion durch L. monocytogenes am plausibelsten (Kaduru-

gamuwa und Beveridge, 1995; Pérez-Cruz et al, 2013). Basierend auf dieses Modell und

aufgrund der Bilder, die durch REM erzielt wurden, kann man davon ausgehen, dass die

von L. monocytogenes produzierten MVs von der Cytoplasmamembran abgeschnürt

und ins extrazelluläre Milieu freigesetzt werden. Vor dem Abschnüren werden die MVs

mit diversem zellulärem Material von der Mutterzelle befüllt. Dies würde die Anwesen-

heit von RNA und zahlreicher cytosolischer Proteine, die mit 37,62% die häufigsten

Proteine in den von L. monocytogenes produzierten MVs darstellen, erklären (Abb.

3.32). Der Unterschied in der Größe spiegelt wahrscheinlich den Beladungszustand der

MVs wieder.

Wegen der Zellwand, die eine physikalische Barriere für deren Freisetzung darstellt,

findet die Produktion von MVs sehr wahrscheinlich während des Wachstums und der

Zellteilung von L. monocytogenes statt. Diese Prozesse beinhalten die Umgestaltung

(remodeling) der Zelloberfläche durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Proteinen,

darunter Enzyme, die den Abbau und die Biosynthese der Zellwand vermitteln. Die

funktionelle Klassifizierung der über MS-Analyse identifizierten Proteine unter Ver-

wendung der EggNOG 4.5.1-Datenbank zeigt, dass 7,10% der Proteine in den MVs in

der Biogenese der Zellwand/Membran/Hülle involviert sind (Abb. 3.30). Diese

funktionelle Kategorie ist die vierthäufigste beschriebene Funktion in den von L.

monocytogenes produzierten MVs. Hierzu gehören die Autolysine MurA, Ami, P60 und

P45, die als Zellwandhydrolasen die Spaltung von kovalenten Bindungen katalysieren

(Carvalho et al, 2014). Eine Vielzahl von verschiedenen Penicillin-bindenden Proteinen

(PBP), die in der Zellwandsynthese involviert sind, zählt ebenfalls dazu (Bierne und

Cossart, 2007). Die Anwesenheit weiterer Proteine, die in der Biogenese der Zellhülle

involviert sind, spricht ebenfalls dafür, dass die Produktion von MVs durch L. mono-

cytogenes an Stellen erfolgt wo ein aktives remodeling der Zelloberfläche stattfindet.

4. Diskussion

126

Der hohe Anteil an Proteine, die laut NCBI-Datenbank eine Lokalisation in der

Cytoplasmamembran (20,59%) und in der Zellwand (8,48%) beschrieben haben, ist ein

weiterer Hinweis dafür, dass die Zellhülle in der Biogenese der MVs involviert ist (Abb.

3.32).

4.10. MVs enthalten Proteine aus allen subzellulären Fraktionen: Cytoplasma,

Cytoplasmamembran, Zellwand und Extrazellulär

Die über MS-Analyse identifizierten Proteine in den MVs wurden unter Verwendung

der NCBI-Datenbank nach Lokalisation eingeteilt. Dies ergab, dass die MVs, die von L.

monocytogenes produziert werden, Proteine aus allen subzellulären Fraktionen enthalten

(Abb. 3.32). Allerdings sind die Proteine aus den subzellulären Fraktionen Cytoplasma,

Cytoplasmamembran, Zellwand und Extrazellulär mit jeweils unterschiedlichem Anteil

in den MVs vertreten. Die meisten Proteine in den MVs mit 37,62% sind als

cytosolische Proteine beschrieben. Der Grund hierfür ist der hohe Anteil an Proteine,

die eine Funktion im Metabolismus beschrieben haben (Abb. 3.28). Diese stellen mit

37,37% die häufigsten Proteine in den von L. monocytogenes produzierten MVs dar.

Ein ähnlich hoher Anteil an cytosolischen Proteinen wurde auch in den Vesikeln, die

beispielsweise von Acinetobacter radioresistens (gram-negativ) und Mycobacterium

tuberculosis (gram-positiv) produziert werden, identifiziert (Fulsundar et al, 2015; Lee

et al, 2015). Aufgrund des hohen Anteils an cytosolischen Proteinen kann man davon

ausgehen, dass L. monocytogenes die Produktion von MVs u.a. für die Sekretion von

cytosolischen Proteinen nutzt. Dies würde zum Teil die Sekretion von Proteinen, die

keine Signalsequenz besitzen und für die es keinen beschriebenen Sekretionsweg gibt,

erklären. Des Weiteren wäre eine Sekretion von bestimmten Proteinen sowohl über

Proteinsekretionswege als auch über MVs denkbar. So wurde beispielsweise für die

sogenannten moonlighting Proteinen, wie DnaK, GroEL, EF-Tu, Enolase, RNA-

Polymerase und ribosomale Proteine, eine Sekretion über die SecA2-ATPase der Sec-

Translokase gezeigt (Lenz et al, 2003). Diese Proteine sind auch in den MVs über MS-

Analyse identifiziert worden. Das glykolytische Enzym Enolase beispielsweise zählt

mit 2,90% zu den häufigsten Proteinen in den MVs, die von L. monocytogenes

produziert werden (Abb. 3.33). Ein weiteres Protein für das eine Sekretion über die

SecA2-ATPase gezeigt wurde, ist das Autolysin P60, das zur Trennung der Tochter-

zellen in der Zellteilung beiträgt (Pilgrim et al, 2003; Machata et al, 2005; Lenz et al,

4. Diskussion

127

2003). Ähnlich wie die Enolase zählt P60 mit 2,28% zu den häufigsten Proteinen in den

MVs. Dies zeigt, dass L. monocytogenes für die Sekretion von bestimmten Proteinen ins

extrazelluläre Milieu sowohl Proteinsekretionswege als auch die Produktion von MVs

nutzt. Dass Bakterien beide Formen der Sekretion für den Export von bestimmten

Proteinen nutzen, wurde auch von anderen Studien gezeigt. So wurde beispielsweise das

Shiga-Toxin (Stx), das von E. coli O104:H4 produziert wird, teils in den OMVs (30%)

und teils in den OMVs-freien Überstand (70%) identifiziert (Kunsmann et al, 2015).

Weitere Analysen wären notwendig, um eine genaue Aussage darüber machen zu

können welche Proteine von L. monocytogenes ausschließlich über MVs sekretiert

werden.

Die Proteine, die von der NCBI-Datenbank als extrazellulär beschrieben sind, stellen

mit 6,82% die kleinste Gruppe in den von L. monocytogenes produzierten MVs dar

(Abb. 3.32). Dies spricht dafür, dass L. monocytogenes die Produktion von MVs nicht

für die Sekretion von Proteinen, die für den Export bestimmt sind, nutzt.

Proteine aus zwei weiteren subzellulären Fraktionen sind ebenfalls in den MVs

identifiziert worden. Laut NCBI-Datenbank haben 20,59% und 8,48% der Proteine in

den MVs eine Lokalisation in der Cytoplasmamembran und in der Zellwand beschrie-

ben. Wie bereits erwähnt ist die Zellhülle möglicherweise in der Biogenese der MVs

involviert. Dies würde die Anwesenheit zahlreicher sowohl Integraler und Membran-

assoziierter Proteine als auch Zellwand-assoziierter Proteine erklären.

4.11. MVs enthalten zum Teil vollständige Stoffwechselwege zur Energie-

gewinnung

Die funktionelle Klassifizierung der Proteine unter Verwendung der EggNOG 4.5.1-

Datenbank zeigt, dass die meisten in den MVs identifizierten Proteine (37,37%) im

Metabolismus involviert sind (Abb. 3.28). Diese funktionelle Gruppe beinhaltet u.a.

Proteine, die den Transport und den Stoffwechsel von Kohlenhydraten vermitteln. Diese

machen knapp 10% der Proteine in den MVs aus und stellen damit die dritthäufigste

beschriebene Funktion dar (Abb. 3.29). Eine genaue Analyse dieser Proteine ergab, dass

die von L. monocytogenes produzierten MVs zum Teil vollständige Stoffwechselwege,

die zur Energiegewinnung genutzt werden, enthalten. Die Glukose, die als einzige

Energiequelle dem Minimalmedium zugefügt wurde, wird von L. monocytogenes unter

aeroben Bedingungen über die Glykolyse und den Pentosephosphat-Weg zur

4. Diskussion

128

Energiegewinnung und Bereitstellung von Vorstufen für Biosynthesen abgebaut

(Müller-Herbst et al, 2014; Kim et al, 2006). Sämtliche Enzyme beider Stoffwechsel-

wege sind über MS-Analyse in den MVs identifiziert worden. Es wäre daher denkbar,

dass diese Stoffwechselwege nach der Freisetzung der MVs ins extrazelluläre Milieu

weiterhin aktiv sind. Dies würde bedeuten, dass in den von L. monocytogenes produ-

zierten MVs Energie in Form von ATP über die Glykolyse erzeugt wird. Der

Pentosephosphat-Weg würde als alternativer Abbauweg für die Glukose u.a.

Zwischenprodukte für die Glykolyse bereitstellen.

Die für die aerobe Atmung notwendigen Enzyme des Citrat-Zyklus und der

Atmungskette sind nicht vollständig aber zum großen Teil ebenfalls in den MVs identi-

fiziert worden. Diese dienen dem weiteren Abbau von Glukose, wodurch Vorstufen für

Biosynthesen entstehen und die Regenerierung von Reduktionsäquivalenten erfolgt.

Denkbar wäre es, dass manche Reaktionen dieser Stoffwechselwege in den MVs statt-

finden, aufgrund der darin vorhandenen Enzyme.

Basierend auf der Anwesenheit sämtlicher Enzyme der Glykolyse und ganz entschei-

dend der Laktat-Dehydrogenase wäre eine Energiegewinnung durch Substratketten-

phosphorylierung in Form einer Milchsäuregärung in den MVs denkbar. Die Regene-

rierung von Reduktionsäquivalenten würde in diesem Fall über Oxidation durch die

Laktat-Dehydrogenase stattfinden und damit ein Weiterlaufen der Glykolyse sicher-

stellen.

Die Vermutung, dass in den von L. monocytogenes produzierten MVs energie-

erzeugende Prozesse stattfinden, wird durch die Anwesenheit von Transporter für

Kohlenhydrate unterstützt. So wurden über MS-Analyse Bestandteile verschiedener

Phosphotransferase-Systeme (PTS), darunter PTSMan

-2/Mpt und PTSMan

-3/Mpo, in den

MVs identifiziert (Stoll und Goebel, 2010). Es wäre daher denkbar, dass diese

Transporter die Aufnahme von Glukose in die MVs vermitteln, woraus letztendlich

ATP über die vorhin erwähnten Stoffwechselwege erzeugt wird. Die Erzeugung von

ATP würde bedeuten, dass in den von L. monocytogenes produzierten MVs biologische

Prozesse stattfinden, die Energie benötigen. Um eine genaue Aussage darüber machen

zu können, wären weitere Untersuchungen notwendig, wie beispielsweise die Messung

der Aktivität verschiedener Enzyme und des ATP-Levels. Eine aktuelle Studie hat

bereits gezeigt, dass in den von Bacteroides fragilis produzierten OMVs verschiedene

4. Diskussion

129

biochemische Reaktionen, die in dem Stoffwechsel von Kohlenhydraten, Aminosäuren

und Nukleotiden eine Rolle spielen, aktiv sind (Zakharzhevskaya et al, 2017).

4.12. MVs enthalten Virulenzfaktoren, die während der Infektion eine Rolle

spielen

Diese Arbeit hat die Anwesenheit von Virulenzfaktoren in den MVs, die von L.

monocytogenes produziert werden, gezeigt. Diese wurden durch MS- und teils durch

Western blot-Analyse identifiziert (Abb. 3.34 und 3.35). Hierbei handelt es sich um

Virulenzfaktoren, die für den intrazellulären Infektionszyklus von L. monocytogenes

essentiell sind (Abb. 1.1). Diese machen 10% der Proteine in den MVs aus. Die im Jahr

2013 durchgeführte Studie hat ebenfalls die Anwesenheit verschiedener Virulenz-

faktoren in den MVs, die von L. monocytogenes während des Wachstums in BHI-

Medium produziert werden, gezeigt (Lee et al, 2013). Demnach nutzt L. monocyto-

genes, selbst in unterschiedlichen Wachstumsmedien, die Produktion von MVs u.a. für

die Sekretion von Virulenzfaktoren. Eine ähnliche Beobachtung wurde beispielsweise

von einer Studie über das gram-negative Bakterium Xanthomonas campestris berichtet.

Die von diesem Pflanzen-Pathogen produzierten OMVs enthalten als konstanten

Bestandteil, trotz deren Produktion in unterschiedlichen Wachstumsmedien und einem

entsprechend unterschiedlichem Proteininhalt, Virulenzfaktoren (Sidhu et al, 2008). Die

Sekretion von Virulenzfaktoren über die Produktion von Vesikeln wurde für verschie-

dene pathogene Bakterienspezies gezeigt (Rivera et al, 2010; Thay et al, 2013;

Kunsmann et al, 2015). ETEC (Enterotoxigenic Escherichia coli) beispielsweise

sekretiert den überwiegenden Teil des hitzelabilen Enterotoxins LT (mehr als 95%) über

OMVs (Kesty et al, 2004). Daher stellen Vesikel, neben den bekannten Sekretionswege

für Proteine, einen zusätzlichen Sekretionsmechanismus für Virulenzfaktoren und

weitere Proteine dar.

Diese Arbeit hat des Weiteren die Internalisierung von MVs, die von L. monocytogenes

produziert werden, in die Epithelzelllinie PtK gezeigt. Dies wurde durch Detektion des

Autolysins P60 im Zelllysat der PtK-Zellen nach deren Inkubation mit MVs über

Western blot-Analyse gezeigt (Abb. 3.37). Eine aktuelle Studie hat die Internalisierung

von MVs, die von L. monocytogenes produziert werden, in die Epithelzelllinie HeLa

gezeigt. Hierfür wurde allerdings kein Mechanismus gezeigt (Vdovikova et al, 2017).

4. Diskussion

130

Eine rezeptorvermittelte Endocytose über die Internaline A und B, die durch MS- und

teils durch Western blot-Analyse in den MVs identifiziert worden sind, wäre für deren

Internalisierung denkbar (Abb. 3.34 und 3.35B). Diese Virulenzfaktoren, die für die

Internalisierung von L. monocytogenes in nicht-phagocytierenden Zellen essentiell sind,

könnten in ähnlicher Weise die Internalisierung der MVs vermitteln (Seveau et al,

2004). Um eine genaue Aussage über die Beteiligung der Internaline an dem Interna-

lisierungsprozess von MVs in eukaryotische Zellen machen zu können, wären weitere

Untersuchungen notwendig. Dass Virulenzfaktoren in den Vesikeln, die von verschie-

denen pathogenen Bakterienspezies produziert werden, deren Assoziation und

Aufnahme durch eukaryotische Zellen vermitteln, wurde von weiteren Studien gezeigt

(Bauman und Kuehn, 2006; Bauman und Kuehn, 2009; Kesty et al, 2004).

Die Funktionalität der Virulenzfaktoren in den von L. monocytogenes produzierten MVs

wurde durch Hämolyse-Assay gezeigt (Abb. 3.36). Hierdurch wurde eine konzen-

trationsabhängige Lyse von Schafserythrozyten durch die MVs gezeigt. Dieser Effekt

wurde durch Listeriolysin O (LLO), das mit 2,12% zu den häufigsten Proteinen in den

MVs zählt, verursacht (Abb. 3.33). Dies wurde von einer aktuellen Studie bestätig, die

gezeigt hat, dass die von der LLO-Deletionsmutante produzierten MVs keinen

hämolytischen Effekt haben (Vdovikova et al, 2017). Diese Studie hat zudem gezeigt,

dass LLO in einer nicht-aktiven Form in den MVs vorhanden ist. Listeriolysin O ist ein

Hämolysin, das seine maximale Aktivität bei einem leicht saurem pH-Wert, wie das

beispielsweise im Lysosom der Fall ist, entfaltet (Glomski et al, 2002). Allerdings

gelangen MVs nach der Internalisierung im Lysosom, woraus sie möglicherweise durch

die Aktivität des MVs-assoziierten LLO entkommen (Vdovikova et al, 2017).

5. Zusammenfassung

131

5. Zusammenfassung

Diese Arbeit hat erstmals die RNA, die von L. monocytogenes während des Wachstums

sekretiert wird, umfassend untersucht. Im Rahmen dieser Untersuchung wurde gezeigt,

dass L. monocytogenes die Produktion von Membrane vesicles (MVs) für die Sekretion

von RNA (MVs-RNA) nutzt. Darüber hinaus hat diese Arbeit gezeigt, dass der

überwiegende Teil der extrazellulären RNA in einer freien, nicht MVs-assoziierten

Form (sec-RNA) sekretiert wird. Die umfassende Untersuchung von sec-RNA und

MVs-RNA hat die einzigartige Zusammensetzung und Vielfalt der RNA, die von L.

monocytogenes sekretiert wird, enthüllt. Hierdurch wurde gezeigt, dass sec-RNA und

MVs-RNA sich sowohl untereinander als auch von der zellulären RNA unterscheiden,

bezüglich Vorkommen und Häufigkeit bestimmter RNA-Spezies. Darüber hinaus hat

diese Arbeit die besondere Eigenschaft von sec-RNA und MVs-RNA eine höhere IFN-β

Antwort in Wirtszellen auszulösen als die zelluläre RNA gezeigt. Hierdurch wurde

gezeigt, dass die Induktion von IFN-β ein Charakteristikum der RNA, die von L.

monocytogenes sekretiert wird, darstellt. Diese Erkenntnis weist auf eine funktionelle

Abgrenzung von sec-RNA und MVs-RNA von der zellulären RNA hin. Für die

unterschiedliche IFN-β Antwort wurde die diverse Zusammensetzung von sec-RNA,

MVs-RNA und zelluläre RNA aus RNAs mit unterschiedlichem immun-

stimulatorischem Potential ausgemacht. Dies beruht auf der Erkenntnis, dass

individuelle RNAs, die in sec-RNA und MVs-RNA identifiziert worden sind, ein

unterschiedliches Potential besitzen eine IFN-β Antwort in Wirtszellen auszulösen. Im

Rahmen dieser Untersuchung wurden zwei sRNAs, rli32 mit einem sehr hohen und ssrS

mit einem sehr schwachen IFN-β Induktionspotential, identifiziert. In diesem

Zusammenhang hat diese Arbeit erstmals die antivirale Aktivität von individuellen

bakteriellen sRNAs gezeigt. Hierdurch wurde die Wirksamkeit der RIG-I-abhängigen

IFN-β Antwort, die von den sRNAs ausgelöst wird, im Kontext einer viralen Infektion

gezeigt.

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die von L. monocytogenes

produzierten MVs eine Vielzahl von unterschiedlichen Proteinen, die in verschiedenen

zellulären Prozessen involviert sind, enthalten. Im Rahmen dieser Untersuchung hat

diese Arbeit erstmals die Anwesenheit zum Teil vollständiger Stoffwechselwege und

Kohlenhydrattransporter, die zur Energiegewinnung genutzt werden, gezeigt. Diese

Erkenntnis weist auf aktive biologische Prozesse in den MVs, die von L.

5. Zusammenfassung

132

monocytogenes produziert werden, hin. Darüber hinaus hat diese Arbeit die Anwesen-

heit von Virulenzfaktoren in den MVs und damit deren potentielle Beteiligung an dem

Infektionsprozess von L. monocytogenes gezeigt.

5.1. Summary

This work has for the first time extensively studied the RNA secreted by L.

monocytogenes during growth. In the context of this research it was shown that L.

monocytogenes are using the production of membrane vesicles (MVs) for the secretion

of RNA (MVs-RNA). In addition, this work has shown that the majority of the extra-

cellular RNA is being secreted in a free, not MVs-associated form (sec-RNA). The

comprehensive study of sec-RNA and MVs-RNA has revealed the unique composition

and diversity of RNA, which is secreted by L. monocytogenes. It was shown that sec-

RNA and MVs-RNA differ in their occurrence and abundance of specific RNA species,

both among each other and from the cellular RNA. Moreover, this work has revealed

the special characteristic of sec-RNA and MVs-RNA to elicit a higher IFN-β response

in host cells than the cellular RNA. Thru this it was shown that the induction of IFN-β is

a characteristic of the RNA secreted by L. monocytogenes. This finding points to a

functional demarcation of sec-RNA and MVs-RNA from cellular RNA. It was shown

that the diverse composition of sec-RNA, MVs-RNA and cellular RNA consisting of

RNAs with different immune stimulatory potential is responsible for the different IFN-β

response. This is based on the finding that individual RNAs, which have been identified

in sec-RNA and MVs-RNA, have a different potential to trigger an IFN-β response in

host cells. Within this study, two sRNAs, rli32 with a very high and ssrS with a very

weak IFN-β induction potential, were identified. In this context, this work has for the

first time demonstrated the antiviral activity of individual bacterial sRNAs. This

demonstrated the effectiveness of the RIG-I-dependent IFN-β response triggered by the

sRNAs in the context of a viral infection.

In the second part of this work, it has been shown that the MVs produced by L.

monocytogenes contain a large number of different proteins which are involved in

different cellular processes. In the context of this study, this work has for the first time

shown the presence of partially complete metabolic pathways and carbohydrate

transporters used for energy production. This finding points to active biological

processes in the MVs produced by L. monocytogenes. In addition, this work has shown

5. Zusammenfassung

133

the presence of virulence factors in the MVs and with that their potential involvement in

the infection process of L. monocytogenes.

6. Abkürzungsverzeichnis

134

6. Abkürzungsverzeichnis

BMDMs = bone marrow-derived macrophages

Bp = Basenpaare

BSA = Bovine Serum Albumin

CIAP = Alkaline Phosphatase, Calf intestinal

DCs = Dendritic cells

dsDNA = double-stranded DNA

dsRNA = double-stranded RNA

FKS = Fötales Kälberserum

IVT-RNA = in vitro transkribierte RNA

Lm = Listeria monocytogenes

MDA5 = melanoma differentiation-associated gene 5

MS = Massenspektrometrie

MVs = Membrane Vesicles

Nt = Nukleotide

NTA = Nanoparticle Tracking Analysis

OMVs = Outer Membrane Vesicles

PBS = Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline

PCR = Polymerase chain reaction

P/S = Penicillin/Streptomycin

REM = Rasterelektronenmikroskopie

RIG-I = retinoic acid-inducible gene I

Rli = RNA in Listeria

RLR = RIG-I-like receptors

RT = Raumtemperatur

RT-PCR = Real-Time PCR

ssRNA = single-stranded RNA

sRNA = small non-coding RNA

TEM = Transmissionselektronenmikroskopie

T.R. = Transfektionsreagenz

WT = Wildtyp

7. Literaturverzeichnis

135


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8. Anhang

152

8. Anhang

8.1. Veröffentlichungen

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Dodel, Richard; Frantz, Renate; Mraheil, Mobarak Abu; Chakraborty, Trinad (2017):

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Mraheil, Mobarak Abu; Frantz, Renate; Teubner, Lisa; Wendt, Heiko; Linne, Uwe;

Wingerath, Jessica; Wirth, Thomas; Chakraborty, Trinad (2017): Requirement of the

RNA-binding protein SmpB during intracellular growth of Listeria monocytogenes. In:

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Die in dieser Arbeit gezeigten Daten über die von L. monocytogenes sekretierten sRNAs

und deren Potential zur Induktion von IFN-β wurden als Manuskript bei Nature

Communications unter folgendem Namen submittiert: Comprehensive analysis of the

secRNome of Listeria monocytogenes reveals small non-coding RNA as potent inducers

of IFN-β response.

Folgende Autoren: Frantz, Renate; Schultze, Tilman; Teubner, Lisa; Wingerath, Jessica;

Müller, Christin; Gwozdzinski, Konrad; Pillich, Helena; Hain, Torsten; Gerlach,

Michaela; Mostafa, Ahmed; Weber, Friedemann; Rohde, Manfred; Pleschka, Stephan;

Wirth, Thomas; Chakraborty, Trinad; Mraheil, Mobarak Abu

8. Anhang

153

8.2. Kongressteilnahme

GGL (2013)

Poster: Detection of nucleic acids secreted by L. monocytogenes

GGL (2014)

Poster: Characterization of membrane vesicles (MVs) produced by L. monocytogenes

GGL Retreat (2015)

Vortrag: Secreted nucleic acids and membrane vesicles (MVs) released by L. monocyto-

genes

Proantilis, Porto (2015)

Vortrag: Mechanisms affecting secretion and shedding of bacterial components.

Production of Membrane Vesicles and NAs secretion

Vorgetragen von Dr. Abu Mraheil

Isopol, Paris (2016)

Poster: Immunogenic capacity of membrane vesicles (MVs) produced by L. monocyto-

genes

Proantilis, Paris (2017)

Vortrag: Secretion mechanisms of nucleic acids by L. monocytogenes


Proantilis, Gießen (2017)

Vortrag: Analysis of the secRNome of L. monocytogenes


8. Anhang

154

8.3. Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Chakraborty für die Bereitstellung des Projekts und

die Möglichkeit diese Arbeit im Institut für Medizinische Mikrobiologie anfertigen zu

können. Des Weiteren möchte ich mich bei Ihm für die Betreuung und Unterstützung

der Arbeit bedanken.

Weiterhin möchte ich mich bei Dr. Abu Mraheil für die kontinuierliche Betreuung der

Arbeit bedanken.

Des Weiteren möchte ich mich bei den Kooperationspartner Dr. Andreas Otto, Prof. Dr.

Dörte Becher, Christin Müller, Prof. Dr. Stephan Pleschka, Jessica Wingerath, Dr.

Thomas Wirth und Prof. Dr. Manfred Rohde für deren Unterstützung bedanken.

Mein herzlicher Dank gilt Lisa Teubner für ihre unermüdlich gute Laune, die mich in

dieser Zeit aufgebaut hat. Des Weiteren möchte ich mich bei Ihr für die tatkräftige

Unterstützung in allen Belangen des alltäglichen Laboraltags ganz lieb bedanken.

Des Weiteren möchte ich mich bei den anderen Kollegen im Labor bedanken, Tilman

Schultze, Nelli und Juri Schklarenko, Sylvia Krämer, Martina Hudel, Besim Berisha,

Luigi La Pietra, Konrad Gwozdzinski, Helena Pillich, Christina Gerstmann und

Alexandra Amend.

Ein herzlicher Dank gilt der Familie Keil, besonders Frau Keil und Jochen, für deren

aufmerksame Unterstützung und Hilfsbereitschaft in jeglichen Lebenssituationen.

Im Besonderen möchte ich mich bei meinen Eltern für deren Hilfe und Beistand in

dieser Zeit bedanken. Dies gilt auch für meine Zwillingsschwester und Bruder, die

immer für mich da waren. Abschließend danke ich meinen Eltern für das Verständnis

dafür, dass ich aufgrund dieser Arbeit nicht so viel Zeit mit Ihnen verbringen konnte.

8. Anhang

155

8.4. Eidesstattliche Erklärung

„Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne

unzulässige Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel

angefertigt habe. Alle Textstellen, die wörtlich oder sinngemäß aus

veröffentlichten oder nichtveröffentlichten Schriften entnommen sind, und alle

Angaben, die auf mündlichen Auskünften beruhen, sind als solche kenntlich

gemacht. Bei den von mir durchgeführten und in der Dissertation erwähnten

Untersuchungen habe ich die Grundsätze guter wissenschaftlicher Praxis, wie sie

in der „Satzung der Justus-Liebig-Universität Gießen zur Sicherung guter

wissenschaftlicher Praxis“ niedergelegt sind, eingehalten sowie ethische,

datenschutzrechtliche und tierschutzrechtliche Grundsätze befolgt. Ich versichere,

dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für

Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten

Dissertation stehen, oder habe diese nachstehend spezifiziert. Die vorgelegte

Arbeit wurde weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form

einer anderen Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion oder eines anderen

Prüfungsverfahrens vorgelegt. Alles aus anderen Quellen und von anderen

Personen übernommene Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das

direkt Bezug genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere

wurden alle Personen genannt, die direkt und indirekt an der Entstehung der

vorliegenden Arbeit beteiligt waren. Mit der Überprüfung meiner Arbeit durch

eine Plagiatserkennungssoftware bzw. ein internetbasiertes Softwareprogramm

erkläre ich mich einverstanden.“

_____________________ ______________________________

Ort, Datum Unterschrift

8. Anhang

156

8.5. Tab. 1: Einteilung der COGs in 25 funktionelle Kategorien

Metabolismus

[C] Energieproduktion und -konversion

[G] Transport von Kohlenhydraten und deren Metabolismus

[E] Transport von Aminosäuren und deren Metabolismus

[F] Transport von Nukleotiden und deren Metabolismus

[I] Transport von Lipiden und deren Metabolismus

[P] Transport von anorganischen Ionen und deren Metabolismus

[H] Transport von Coenzymen und deren Metabolismus

[Q] Biosynthese von Sekundärmetaboliten, deren Transport und Katabolismus

Zelluläre Prozesse und Signale

[D] Kontrolle des Zellzyklus, Zellteilung, Partitionierung von Chromosomen

[M] Biogenese der Zellwand/Membran/Hülle

[O] Posttranslationale Modifikationen, Proteinumsatz, Chaperone

[U] Intrazellulärer Verkehr, Sekretion, vesikulärer Transport

[T] Mechanismen der Signaltransduktion

[V] Verteidigungsmechanismen

[N] Zellbewegung

[Y] Nukleäre Struktur

[Z] Zytoskelett

[W] Extrazelluläre Strukturen

Informationsspeicherung und -prozessierung

[A] RNA-Prozessierung und -Modifikation

[B] Chromatinstruktur und deren Dynamik

[J] Translation, ribosomale Struktur und Biogenese

[K] Transkription

[L] Replikation, Rekombination und Reparatur

Wenig charakterisiert

[R] Nur generelle Funktion vorhergesagt

[S] Funktion unbekannt

Kein Ortholog gefunden

8. Anhang

157

8.6. Tab. 2: Berechnung des Anteils an MVs-Proteine in den funktionellen

Kategorien und Gruppen anhand des NSAF-Wertes in %

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8. Anhang

158

8.7. Tab. 3: Funktionelle Klassifizierung der 516 MVs-Proteine (EggNOG 4.5.1)

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8. Anhang

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6E

7_

LIS

MO

Lm

o1740 p

rote

in

lmo

1740

Am

ino

acid

AB

C t

ran

sp

ort

er

perm

ease

Q8Y

7I0

_L

ISM

OG

luta

min

e s

yn

theta

se

gln

A

lmo

1299

Q8Y

6E

8_

LIS

MO

Lm

o1739 p

rote

in

lmo

1739

Am

ino

acid

AB

C t

ran

sp

ort

er

AT

P-b

ind

ing

pro

tein

Q8Y

9G

8_

LIS

MO

Glu

tam

ate

deh

yd

rog

en

ase

lmo

0560

Q8Y

6V

2_

LIS

MO

Ala

nin

e d

eh

yd

rog

en

ase

lmo

1579

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7_

LIS

MO

Imid

azo

leg

lycero

l-p

ho

sp

hate

deh

yd

rata

se

his

B

lmo

0566

Q7A

P65_

LIS

MO

Op

uC

A p

rote

in

op

uC

A

lmo

1428

Q8Y

8C

6_

LIS

MO

Lm

o0982 p

rote

in

lmo

0982

Pep

tid

ase

Q8Y

775_

LIS

MO

Lm

o1422 p

rote

in

lmo

1422

Gly

cin

e/b

eta

ine A

BC

tra

nsp

ort

er

perm

ease

Q8Y

581_

LIS

MO

Lm

o2192 p

rote

in

lmo

2192

Pep

tid

e A

BC

tra

nsp

ort

er

AT

P-b

ind

ing

pro

tein

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_L

ISM

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eta

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ase

mp

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AC

3_

LIS

MO

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ste

ine s

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cy

sK

lm

o0223

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LIS

MO

Op

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C

lmo

1426

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L_

LIS

MO

N-a

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min

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lmo

1012

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_L

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yd

roxy

meth

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sfe

rase

gly

A

lmo

2539

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LIS

MO

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bab

le g

lycin

e d

eh

yd

rog

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ase (

decarb

oxy

lati

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bu

nit

2

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PB

lm

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LIS

MO

Lm

o1862 p

rote

in

lmo

1862

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LIS

MO

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uC

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rote

in

op

uC

D

lmo

1425

Q8Y

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4_

LIS

MO

Lm

o0152 p

rote

in

lmo

0152

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tid

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tra

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ort

er

su

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ate

-bin

din

g p

rote

in

Q8Y

486_

LIS

MO

Lm

o2569 p

rote

in

lmo

2569

Pep

tid

e A

BC

tra

nsp

ort

er

su

bstr

ate

-bin

din

g p

rote

in

Q8Y

8P

9_

LIS

MO

Lm

o0847 p

rote

in

lmo

0847

Glu

tam

ine A

BC

tra

nsp

ort

er

GC

SP

A_

LIS

MO

Pro

bab

le g

lycin

e d

eh

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rog

en

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decarb

oxy

lati

ng

) su

bu

nit

1

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PA

lm

o1349

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LIS

MO

Gb

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pro

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g

bu

A

lmo

1014

Q7A

P69_

LIS

MO

Lm

o1421 p

rote

in

lmo

1421

Gly

cin

e/b

eta

ine A

BC

tra

nsp

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er

AT

P-b

ind

ing

pro

tein

Q8Y

730_

LIS

MO

Lm

o1493 p

rote

in

lmo

1493

Olig

op

ep

tid

ase

Q8Y

583_

LIS

MO

Lm

o2188 p

rote

in

lmo

2188

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pep

tid

ase

Q8Y

8D

0_

LIS

MO

Bra

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-ch

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rase

lmo

0978

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AA

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ISM

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nin

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lmo

1619

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_L

ISM

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yd

roxy

-tetr

ah

yd

rod

ipic

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ate

red

ucta

se

dap

B

lmo

1907

Q8Y

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LIS

MO

Gb

uC

pro

tein

g

bu

C

lmo

1016

Q8Y

AB

2_

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MO

Seri

ne a

cety

ltra

nsfe

rase

cy

sE

lm

o0238

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_L

ISM

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ho

sp

ho

sh

ikim

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1-c

arb

oxy

vin

ylt

ran

sfe

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aro

A

lmo

1923

Q8Y

527_

LIS

MO

Arp

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arp

J lm

o2250

Q8Y

9X

2_

LIS

MO

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e-5

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late

red

ucta

se

pro

C

lmo

0396

Q8Y

8Y

7_

LIS

MO

Lm

o0755 p

rote

in

lmo

0755

Q8Y

6T

0_

LIS

MO

Lm

o1603 p

rote

in

lmo

1603

Am

ino

pep

tid

ase

Q8Y

8P

8_

LIS

MO

Lm

o0848 p

rote

in

lmo

0848

Am

ino

acid

AB

C t

ran

sp

ort

er

AT

P-b

ind

ing

pro

tein

8. Anhang

161

DA

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_L

ISM

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ah

yd

rop

yri

din

e-2

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icarb

oxy

late

N-a

cety

ltra

nsfe

rase

dap

H

lmo

1011

Q92A

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LIS

MO

Lm

o1711 p

rote

in

lmo

1711

Am

ino

pep

tid

ase

Q8Y

7Q

5_

LIS

MO

Lm

o1217 p

rote

in

lmo

1217

En

do

-1,4

-beta

-glu

can

ase a

nd

to

am

ino

pep

tid

ase

Q8Y

4H

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MO

Lm

o2462 p

rote

in

lmo

2462

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tid

ase

PE

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_L

ISM

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ep

tid

ase C

p

ep

C

lmo

2338

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_L

ISM

OP

ho

sp

ho

seri

ne a

min

otr

an

sfe

rase

serC

lm

o2825

Q8Y

6S

2_

LIS

MO

Lm

o1611 p

rote

in

lmo

1611

Am

ino

pep

tid

ase

Q8Y

6T

2_

LIS

MO

3-d

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xy-D

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bin

o-h

ep

tulo

so

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7-p

ho

sp

hate

sy

nth

ase

aro

A

lmo

1600

Q8Y

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3_

LIS

MO

Lm

o2349 p

rote

in

lmo

2349

Am

ino

acid

AB

C t

ran

sp

ort

er

su

bstr

ate

-bin

din

g p

rote

in

Q8Y

4M

4_

LIS

MO

Cy

ste

ine d

esu

lfu

rase

lmo

2413

Q8Y

6R

4_

LIS

MO

Lm

o1620 p

rote

in

lmo

1620

Dip

ep

tid

ase P

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TA

_L

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p

otA

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PT

_L

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ase T

p

ep

T

lmo

1780

HIS

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LIS

MO

His

tid

ino

l d

eh

yd

rog

en

ase

his

D

lmo

0567

Q8Y

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LIS

MO

Lm

o0452 p

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lmo

0452

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Tran

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kle

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den

un

d d

eren

Meta

boli

sm

us

Q8Y

560_

LIS

MO

Lm

o2216 p

rote

in

lmo

2216

His

tid

ine t

riad

(H

IT)

pro

tein

Q926Y

9_

LIS

MO

Ino

sin

e-5

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ho

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deh

yd

rog

en

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gu

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lm

o2758

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ISM

OL

mo

0132 p

rote

in

lmo

0132

Ino

sin

e 5

-mo

no

ph

osp

hate

deh

yd

rog

en

ase

Q8Y

6B

8_

LIS

MO

Ad

en

ylo

su

ccin

ate

ly

ase

pu

rB

lmo

1773

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_L

ISM

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ne n

ucle

osid

e p

ho

sp

ho

ryla

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eo

D-t

yp

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D

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1856

Q8Y

6B

6_

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MO

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am

ino

imid

azo

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ibo

nu

cle

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se

pu

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lmo

1775

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LIS

MO

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un

cti

on

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uri

ne b

iosy

nth

esis

pro

tein

Pu

rH

pu

rH

lmo

1765

ND

K_

LIS

MO

Nu

cle

osid

e d

iph

osp

hate

kin

ase

nd

k

lmo

1929

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LIS

MO

Deo

xyg

uan

osin

etr

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osp

hate

tri

ph

osp

ho

hy

dro

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rote

in

lmo

2657

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LIS

MO

Ph

osp

ho

rib

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lfo

rmy

lgly

cin

am

idin

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sy

nth

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glu

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yd

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zin

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gu

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lm

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1_

LIS

MO

Rib

ose-p

ho

sp

hate

py

rop

ho

sp

ho

kin

ase 1

p

rs1

lmo

0199

PU

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LIS

MO

Ph

osp

ho

rib

osy

lam

ino

imid

azo

le-s

uccin

ocarb

oxa

mid

e s

yn

thase

pu

rC

lmo

1772

Q8Y

6J3

_L

ISM

OL

mo

1691 p

rote

in

lmo

1691

Deo

xyu

rid

ine t

rip

ho

sp

hate

nu

cle

oti

do

hy

dro

lase

KP

RS

2_

LIS

MO

Rib

ose-p

ho

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hate

py

rop

ho

sp

ho

kin

ase 2

p

rs2

lmo

0509

Q8Y

6B

7_

LIS

MO

N5-c

arb

oxy

am

ino

imid

azo

le r

ibo

nu

cle

oti

de s

yn

thase

pu

rK

lmo

1774

Q8Y

5V

2_

LIS

MO

Pu

rin

e n

ucle

osid

e p

ho

sp

ho

ryla

se

pn

p

lmo

1953

Q8Y

AJ5

_L

ISM

OL

mo

0130 p

rote

in

lmo

0130

5'-n

ucle

oti

dase

PU

R2_

LIS

MO

Ph

osp

ho

rib

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lam

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lycin

e lig

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pu

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lmo

1764

Q8Y

6C

2_

LIS

MO

Am

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ph

osp

ho

rib

osy

ltra

nsfe

rase

pu

rF

lmo

1768

PU

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lgly

cin

am

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lm

o1770

8. Anhang

162

PU

RL

_L

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OP

ho

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rmy

lgly

cin

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lm

o1769

PY

RE

_L

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OO

rota

te p

ho

sp

ho

rib

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ltra

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rase

py

rE

lmo

1831

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RB

_L

ISM

OA

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art

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carb

am

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nsfe

rase

py

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lmo

1838

Q8Y

5B

2_

LIS

MO

Rib

on

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e-d

iph

osp

hate

red

ucta

se

lmo

2155

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ISM

OG

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inase

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k

lmo

1827

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RB

_L

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am

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boli

sm

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PH

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o0205

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6N

7_

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MO

Lm

o1647 p

rote

in

lmo

1647

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cy

lgly

cero

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ho

sp

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O-a

cy

ltra

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rase

Q8Y

5H

3_

LIS

MO

Lm

o2089 p

rote

in

lmo

2089

Lip

ase

Q8Y

794_

LIS

MO

Lm

o1396 p

rote

in

lmo

1396

Ph

osp

hati

dy

lgly

cero

ph

osp

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sy

nth

ase

TA

RI_

LIS

MO

Rib

ito

l-5-p

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cy

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yly

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nsfe

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lm

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Q8Y

574_

LIS

MO

3-o

xoacy

l-[a

cy

l-carr

ier-

pro

tein

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nth

ase 2

lm

o2201

Q8Y

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LIS

MO

Malo

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l C

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l carr

ier

pro

tein

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lase

fab

D

lmo

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LIS

MO

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lm

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ier-

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lm

o2202

Q8Y

5P

0_

LIS

MO

Lm

o2017 p

rote

in

lmo

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Q8Y

781_

LIS

MO

Lm

o1415 p

rote

in

lmo

1415

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luta

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yn

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LIS

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lmo

0943

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rote

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m

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lmo

2785

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LIS

MO

Lm

o0153 p

rote

in

lmo

0153

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c A

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tra

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er

su

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-bin

din

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in

Q8Y

4M

0_

LIS

MO

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rote

in

lmo

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Q8Y

9I7

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ISM

OL

mo

0541 p

rote

in

lmo

0541

AB

C t

ran

sp

ort

er

su

bstr

ate

-bin

din

g p

rote

in

Q8Y

992_

LIS

MO

Lm

o0641 p

rote

in

lmo

0641

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y m

eta

l-tr

an

sp

ort

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AT

Pase

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TB

_L

ISM

OM

an

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ran

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sy

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m A

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din

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m

ntB

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o1849

Q8Y

876_

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MO

Lm

o1041 p

rote

in

lmo

1041

Mo

lyb

date

AB

C t

ran

sp

ort

er

su

bstr

ate

-bin

din

g p

rote

in

Q8Y

580_

LIS

MO

Lm

o2194 p

rote

in

lmo

2194

Pep

tid

e A

BC

tra

nsp

ort

er

perm

ease

Q8Y

7D

2_

LIS

MO

Lm

o1351 p

rote

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1351

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CA

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LIS

MO

Calc

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nsp

ort

ing

AT

Pase lm

o0841

lmo

0841

Q8Y

845_

LIS

MO

Lm

o1073 p

rote

in

lmo

1073

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l A

BC

tra

nsp

ort

er

su

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ate

-bin

din

g p

rote

in

Q8Y

4K

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LIS

MO

Lm

o2431 p

rote

in

lmo

2431

Ferr

ich

rom

e A

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nsp

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Mn

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lm

o1439

Q8Y

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2_

LIS

MO

Lm

o0154 p

rote

in

lmo

0154

Zin

c A

BC

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nsp

ort

er

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P-b

ind

ing

pro

tein

Q929C

7_

LIS

MO

Lm

o2248 p

rote

in

lmo

2248

8. Anhang

163

Q8Y

579_

LIS

MO

Lm

o2195 p

rote

in

lmo

2195

Pep

tid

e A

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nsp

ort

er

perm

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ME

TN

2_

LIS

MO

Meth

ion

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rote

in M

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2

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2

lmo

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MO

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lmo

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MO

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1318

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MO

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in (

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4R

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8. Anhang

167

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8. Anhang

168

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2299

8. Anhang

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MO

Lm

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MO

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Lm

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Lm

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lmo

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MO

Lm

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lmo

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LIS

MO

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LIS

MO

Lm

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LIS

MO

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LIS

MO

Lm

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MO

Lm

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lmo

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MO

Lm

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lmo

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Lm

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Lm

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MO

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rote

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lmo

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LIS

MO

Lm

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lmo

1898

Q8Y

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LIS

MO

Lm

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rote

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lmo

1499

Q8Y

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LIS

MO

Lm

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rote

in

lmo

0950

Q8Y

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LIS

MO

Lm

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in

lmo

1637

8. Anhang

170

Q8Y

3X

4_

LIS

MO

Lm

o2705 p

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Documents

Die extrazelluläre RNA-Welt von Listeria monocytogenesgeb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2019/14246/pdf/FrantzRenate_2018_11_19.pdf · Pathogen, L. ivanovii, das vorwiegend Tiere infiziert