Planta (Berl.) 67, 107--121 (1965)

Aus dem Botanischen Institut der UniversitEt Freiburg i. Br.

D I E H E M M U N G D E R P H Y T O C H R O M - I N D U Z I E R T E N ANTHO- C Y A N S Y N T H E S E D U R C H ACTINOMYCIN D U N D P U R O M Y C I N

HERB]~I%T LANOE und HA~S Mot{~

Mit 5 Textabbildungen

(Eingegangen am 15. Juli 1965)

The Inhibitory Eflect of Actinomyein D and Puromycin on the Phytochrome Induced Synthesis of hnthocyanin

Summary Photomorphogenesis, i.e. the control of plant growth and development by light

independent of photosynthesis, is mediated mainly through phytoehrome. Recently the hypothesis has been advanced that Pv3o, the active phytochrome, may act through differential gene activation (HOCK and Mom~ 1964) at least in those cases where growth or biosynthetic processes are promoted under the influence of PTao. Phytoehrome-induced anthocyanin synthesis is a typical photoresponse of this type.

In the present paper the hypothesis that P730 acts through the activation of "potentially active genes" has been tested. The phytochrome-induced antho- cyanin synthesis of the mustard seedling, Sinapis alba L., has been used as a photoresponse (BERTSCg and MoJ~ 1965). I t has been shown that phytochrome- induced anthocyanin synthesis can be blocked by the application of aetinomycin D, which is known to be a highly specific inhibitor of DNA-dependent RNA synthesis. If aetinomycin D at the usual concentrations (e.g. 10 ~g/ml) is applied to the seedlings before or at the onset of light (continuous far-red) the synthesis of antho- cyanln is totally blocked. If, however, the actinomycin D is added some time later, e.g. at the end of the lag-phase, 6 hours after the onset of light, anthocyanin syn- thesis is inhibited only partially (Fig. 2, 3). Because a shift in the steady state concentration of P730 influences the rate of anthocyanin synthesis within 4--5 hours (Fig. 4) it cannot be assumed that a m-RNA with a long life-time is involved in light-induced anthoeyanin synthesis. This is supported by the data in Table 2. We therefore conclude that aetinomycin D at a suitable concentration will block the formation of new kinds of m-RNA but will still to a certain extent permit the continued synthesis of m-RNAs already in production at the time the actino- mycin is added. - - Recently we have reached the same conclusion with respect to phytochrome-indueed expansion of the cotyledons of the mustard seedling (Mogn, SC~rLICKEW~I and LANGE 1965). The conclusions based on the results with aetinomycin D are supported by experiments with pnromycin which is kno~n to be a specific inhibitor of translation, i.e. m-RNA dependent protein synthesis. Puromyein also will selectively inhibit phytochrome-dependent anthocyanin formation in accordance with the hypothesis that PTs0 acts through the activation of potentially active genes (Fig. 5, Table 1).

Einleitung Die Regula t ion der pflanzliehen Morphogenese dureh Lieht (,,Pho-

tomorphogenese") erfolgt in erster Linie fiber das Phy toehrom (Zu- sammenf~ssung M o ~ 1965). Die morphogenetische Wi r kung des

1~ (Berl.), Bd, 67 8

108 HERBERT LA~O~ und H~NS MOOR:

Phytochroms beruht auf der photoehemisehen Bildung des physiologisch aktiven Phytoehroms 730 (=- Pv~0). W~hrend die komplizierte Photo- chemie des Phytochroms sowohl in vivo als auch in vitro in jiingster Zeit genau untersueht werden konnte (Zusammenfassung BuTL~ u. Mitarb. 1965), besteht hinsichtlich der Wirkungsweise des physio- logisch aktiven P730 trotz vieler diesbezfiglicher Untersuchungen noch keine einheitliehe AufZassung. Die Beltsville-Gruppe (z. B. HE~D~ICKS und BO~T~WICK 1965) vertrRt die auf allgemeinen Argumenten be- ruhende Vorstellung, dad Pv~0 als ein Sehlfisselenzym angesehen werden muD, das entseheidend darfiber bestimmt, wie etwa Aeetyl-CoA oder Pyruvat im Stoffwechsel der Ze]le verwendet werden k5nnen. Hin- gegen sind wit zu der Auffassung gelangt, dal3 die Wirkung des Phyto- chroms im Zusammenhang mit der Photomorphogenese yon Keim- pflanzen auf eine difZerentielle Gen~ktivierung dureh P730 zurfiek- zuffihren sei (HOCK und Mog~ 1964, M o ~ 1965). Naeh unserer AuL fassung kann man sieh die Tatsache, dad die verschiedenen Gewebe und 0rgane einer Keimpflanze auZ die Bildung yon P730 nieht nur quantitativ, sondern aueh qualitativ versehieden reagieren, am ehesten mit der Hypothese verst~tndlieh maehen, dad Pv30 ~ls ,,AuslSser" fiber eine ,Signalkette" die Aktivit~t ,potentiell aktiver Gene" auslSst. Welche Gene in einer bestimmten Zelle ,,potentiell aktiv" sind, wird dutch jene Wechselwirkungen zwischen den Zellen des Keimlings Zest- gelegt, die zur Ausbildung des prim~ren Differenzierungsmusters in dem vielzelligen System des Dunkelkeimlings ffihren. Das Pv30 ist also nur ein ,AuslSser", die Spezifiti~t der photomorphogenetisehen Reaktion einer bestimmten Zelle oder eines bestimmten Gewebes h~t nichts mit dem P730 zu tun, sondern aussehliel~lieh mit jenen Faktoren, die Zest- legten, welehe Gene in einer bestimmten Zelle des Dunkelkeimlings ,,potentiell aktiv" sind. - - Die vorliegende ArbeR stiitzt diese Hypo- these. Als Testreaktion ws wir die liehtabh~ngige Anthoeyan- synthese des Senfkeimlings, Sinapis alba L. Diese l~eaktion ist~ jeden- falls bei Verwendung yon Wellenl~ngen oberhalb 500 nm, w~hrsehein- lich ausschlieD]ieh auZ die Funktion yon P7~0 zurfiekzuZfihren (MoH~ u. Mitarb. 1965a, B~RTSCE und M o ~ 1965b). Die lichtinduzierte Anthocyansynthese kann somit als eine reprs ,,Photomor- phose" des Senfkeimlings angesehen werden (Mon~ 1964), repr~sentativ jedenfalls ffir die ,,positiven" phytochromabh~ngigen Vers des Senfkeimlings, d.h. ffir solehe Photomorphosen, bei denenes zu einer AuslSsung oder Steigerung yon Biosynthesen oder Waehstums- prozessen kommt.

Wenn im Sinn der oben skizzierten Hypothese das Pv~o die Antho- cyansynthese fiber eine Aktivierung potentiell aktiver Gene reguliert, so mii~te sieh die Liehtwirkung durch spezifische Inhibitoren se]ektiv

Anthocy~nsynthess durch Acthmmycin D und Puromycin 109

ausschalten lassen, z. B. dureh Actinomycin D, welches als hochgradig spezifischer Inhibitor der DNS-abh~ngigen RNS-Synthese bekannt ist (z. B. R~IcH u. Mitarb. 1962, CAVALIEnI und N]sMc~nx 1964, G~T,L~T U. Mitarb. 1965, REICH 1964), oder dureh Puromycin, welches die Pro- teinsynthese an den Ribosomen spezifisch hemmt, weft es offenbar als ein AnMogon yon Aminoaeyl-sRNS fungieren kann (z. B. NATHANS 1964). - - In tier vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dab die beiden Anti- biotiea in der Tat jene Effekte auf die ]iehtabhiingige Anthocyansyn- these ausfiben, die man erwarten mul~, wenn die oben skizzierte t typo- these zur Wirkung yon PT~0 riehtig ist.

Zur Beliehtung (Dauerlicht) verwenden wir das bei Langzeitbestrah- lung besonders wirksame ,Dunkel ro t" . Unter diesen Bedingungen ist ein Effekt fiber die Photosynthese ausgesehlossen (BERTSCg und MOHI~ 1965a). Einer ffir den Lactuca-Keimling gebildeten Hypothese yon ]:IARTMANN (1965) folgend, erkli~ren wir die besonders starke Wirkung des Dunkelrot bei Langzeitbestrahlung damit, dal] unter diesen Bedin- gungen fiber eine lunge Zeit hinweg eine zwar niedrige, aber praktisch konstante station~re Konzentration an PT~0 erhalten bleibt; hingegen sinkt ira Dauerhellrot infolge rascher Destruktion yon Pw0 (z. B. BUTL]~ 1964, BUTLER und LA~E 1965) die Konzentrat ion an Pw0 yon einem hohen Anfangswert innerhalb weniger Stunden auf einen Wert, der offenbar unterhalb der ffir Dunkelrot eharakteristischen station/~ren Konzentrat ion liegt. - - I m Prinzip wenigstens dfirfte die Hypothese yon HAtCTMANN aueh beim Senfkeimling die Wirkung yon Langzeit- bestrahlungen, z. B. auf die Anthocyansynthese, deuten (MoHI~ u. Mitarb. 1965a). Jedenfalls seheint die Annahme berechtigt, dM] Hellrot und Dunkelrot ira Zusammenhang mit der Anthoeyansynthese sowohl bei Kurzzeit- als aueh bei Langzeitbestrahlungen ausschliel]lieh fiber P730 wirksam werden (BERgson: und MOHR 1965b).

Material und Methoden M~terial: Das SamenmateriM yon Sinapis alba L. (Ernte 1964, Botanischer

Garten Freiburg i. Br.) ist die 3. Nachzucht einer seit 1957 verwendeten, relativ homogenen Population.

Antibiotika: Das Actinomycin D stammt yon Merck~ Sharp & Dohme, Bah- way, N.J./USA, das Puromyeiu (Ms Puromycindihydrochlorid) yon der NutritionM BiochemicMs Corporation, Cleveland, Ohio/USA, das Desoxyguanosin yon der Fluka AG, Buchs, Schweiz. Die ChemikMien wurden unmi~telbar in aqua dest. gel6st.

Bestrahhmgsanlage: Das verwendete Standardfeld f/ir Dunkelrot ist in einer vorangeg~ngenen Arbeit beschrieben (WEID~E~ U. ~itarb. 1965). D~s Emissions- maximum der gefflterten Stratflung liegt bei 740 nm, die ttalbwertsbreite betr~gt etwa 100 nm. UnterhMb 680 nm wh'd weniger als 0,1%, oberhMb 980 nm weniger Ms 5 % des MaximMwerts abgegeben. Die Intensit~t an den ffir unsere Experimente verwendeten Positionen des Feldes betrug 2700 erg/cm e. see =[= 10%.

8*

110 HEI~BEI~T LA~E und HAI~s Mom~:

Die allgemeine Versuchsdurchfiihrung: Keimung und Anzucht auf Keim- papier erfolgen unter Standardbedingungen (Hock und Mo~I~ 1964) bei 250 C. 36 Std naeh Aussaat werden im sehr schwaehen ,,Sieherheitslieht" (Mom~ und AI,~UI~ 1963) aus je 25 Keimlingen elf Keimlinge mit mittlerer Hypokotyll~nge selektioniert. Ihnen wird die Radicul~ abgeschnitten. Je elf derurt pr~parierter Keimlinge werden dann in eigens dafiir hergestellte Sehiilehen in aqua dest. ein- geh~ngt. Die Sch~lehen werden in wasserdampfges~ttigte Keimdosen (,,Gerda"- Kiihlschrankdosen) geste]lt und ffir weitere 12 Std ira Dunkeln gehalten. Danaeh bringt man die Keimdosen in das Dunkelrot-Feld und ersetzt die Deekel der Keim- dosen dureh genormte Glasscheiben. Zu diesem Zeitpunkt werden die Kotyledonen mit einem Tropfen aqua dest. umgeben. Die Applikation dieses Tropfens liil~t sieh gut standardisieren. Zur Applikation von Aetinomyein D oder Puromyein werden die Keimlinge ia Seh~lehen mit der entspreehenden wiil3rigen Antibioticum- 15sung ulngeh~ngt. Die Kotyledonen werden aueh hier mit einem Tropfen LSsung umgeben (Abb. 1).

Abb. 1. Eine Skizze, welche die Applikation der Antibiotica veranschaulichen soll. Die Keimlinge (ohne Radicula) werden in die LScher des durchbohrten Deckels eingeh~.ngt. Die L6sung ist

gepunktet angegeben

Anthocyanbestimmung: Extrahiert werden lediglieh die Kotyledonen ein- schliei~lieh dem Kotyledonarknoten. Die Hypokotyle werden unterhalb des Ko- tyledonarknotens abgetrennt und verworfen. Die Hauptmenge des Anthocyans befindet sioh in den Zellen der unteren Epidermis der Kotyledonen. - - Die elf Kotyledonenpaare einer Schale werden zusammen in 10 ml LSsungsmittel (18 Vol.- % Propanol, 1 Vol.-% HC1, l~est H20 ) extrahiert. Die KSlbchen hi~lt man 1,5 rain im koehenden Wasserbad. Die weitere Extraktion erfolgt fiber etwa 24 Std hinweg ira Dunkeln bei 200 C. Danaeh wird der Extrakt 35 lain lang bei 6000 U/min zentrifugiert. Die Extinktion des gelfl~rten Extraktes wird im Spektralphotometer (Schichtdicke 1 cm) bei 535 und 650nm bestimmt. Der Extinktionswert bei 535 nm wird fiir die Liehtstreuung der L5sung korrigiert. Der Streuwert $5~ 5 der LSsung bei 535 nm ergibt sieh n~herungsweise ~us dem Streuwert $65 o bei 650 nm. Gem~l~ der Abh~ngigkeit der Extinktionskonst~nten yon der Wellenl~nge bei der

6504 Ray]eighsehen Streuung gilt: S~ 5 = - - • S~50 = 2,2 • $650. - - Die fiir die Lieht- 5354 streuung korrigierten Extinktionswerte bei 535nm repr~sentieren also jeweils den Anthocyangehalt yon elf Kotyledonenpaaren in 10 ml LSsungsmittel bei einer Schichtdicke yon 1 cm. In den Abbildungen und Tabellen sind stets Mittel- werte aus 4--16 Einzelbestimmungen (Schalen) angegeben.

Ergebnisse

a) Experimente mit Actinomycin D (~ Act.). Die Abb. 2 zeigt die Ver~nderungen in der K ine t ik der An thocyanakkumula t ion , welche durch Act. (200 ~g/ml in der L5sung u m die Keimlinge) hervorgebracht werden. Die wichtigsten t~esultate der Ac t inomyc inbehand lung mit dieser relativ hohen Konzen t r a t i on sind die folgenden: Wird Act. 3 Std vor Licht- beginn gegeben, so erfolgt keine Anthoeyansynthese . Bietet ma n das Act.

Anthocy~nsynthese durch Actinomycin D und Puromycm l l l

jedoch w/~hrend oder nach der lag-Phase den Keimlingen, z. B. 6 Std nach Lichtbeginn, so 1/~uft die Anthocyansynthese im Prinzip so ab wie bei den Kontrollen, nur mit reduzierter Intensit/~t. Diese Fakten zeigen uns, da$ die vSllige oder fast vSllige Hemmung der Anthocyan- synthese bei Zugabe yon Act. vor oder zu Beginn der Belichtung kein

~ o,2

Zi~ltrontroi/e

- , ~ ' - - . . . . . . . - ", ~,' Dunt~el2ontfolle

0 3 G 12 18 Std 2~ z Ze// io2 Dunke//,ot

~,kbb. 2. Die Anthoey~nsynthese hn D~uer-Dunkelrot mit and ohne Aetinomcyein ]). l u re Zeitpunkt 0 beginnt die Beliehtung. Act. ( - - 3 Std) bedeutet, dab die Keimlinge 3 Std ve t Lichtbeginn mit einer w~[~rigen LSsung yon Aetinomyein D (200 ~g/ml) umgeben warden. Entspreehend sind die

anderen Symbole za verstehen

~u,a

i ~ Z/cktA'onii'olle

~ . I ~ ~ .-o Ao/. (-2Std )

~O

7 " -7-- , . - ~ e - - - - - - o - - : Uunkelkontrolle

o 8 12 18 Std zfx Zei t i ~ Dunkelzot

Abb. 3, Die Anthoeyansynthese hn Dauer-Dunkelrot ]nit und ohne Actinomycin D. Im Gegensatz zu Abb. 2 betrug die Konzentration der w ~ r i g e n LSsung yon Aetinomyein D nur 10 ~g/ml. Symbole

wie in J-bb. 2

unspezifischer Effekt sein kann. Darauf weist aueh die Beobaehtung bin, dag Schgdigungen allgemeiner Art an den Keimlingen nicht auf- treten, und da~ man mit einer Konzentrat ion yon 10 ~g/ml Act. in der L6sung um den Keimling sehr ahnliche Kurven bekommt wie mit der hohen Konzentrat ion (Abb. 3). Diese Konzentrat ion liegt in dem fib- licherweise bei Experimenten mit pflanzlichen und tierischen Zellen

112 HEI~BERT LANGE und HA~s Mo~:

verwendeten Konzentrationsbereieh (z. B. ZETSCH~ 1964 bei Aceta- bularia, SCOTT und BELL 1965 bei Hfihnerembryonen, Du~E und WATErs 1965 bei Baumwollkeimlingen). - - Um die Kurven der Abb. 2 deuten zu kSnnen, ben5tigen wir zusiitzliehe Information hinsichtlieh der Schnelligkeit, mit der die Epidermisze]len der Kotyledonen die Intensit~t der Anthoeyansynt.hese in Abhangigkeit yon der Konzen- tration an P7s0 regulieren k5nnen. Die Abb. 4, welehe die Anthoeyan- synthese intakter Senfkeimlinge wiedergibt, weist darauf hin, dab sieh

~ ~ o Duzkelp~

Punkel

. . . . . , - - - - : 9 - - '

o o s3 78 ~ 30 gtd @ Zeit n&ck l/c~l~eg/za

Abb. 4. Die Anthocyansynthese im Dauer-Dunkelro~ (Dunkelrot-Feld bei 3300 erg/cm 2. sec) und Dauer-Itellrot (Hellrot-Feld bei 650 ergicm *.sec) sowie nach ~berftihrung der Xeimlinge yore Dunkelrot ins Dunkel. Ffir diese Experimente wurden intakte Keimlinge yon Sinapis alba L. ~er- wendet (Ernte 1963). 86 S~d nach Aussaat begann die Eelichtung. S~andardanzucht auf Keimpapier

(vgh z. B. Es~msc~I und D/fouR 1965b) (nach Daten yon E. WAGNER)

eine Xnderung der effektiven Konzentration an P730 etwa 4--6 Std sp/~ter anf die Intensit/~t der Anthocyansynthese answirkt. Dieser SchluB wird sowohl dutch die lag-Phase nach Beginn der Beliehtung nahe gelegt als auch durch die _~nderungen in der Intensit/~t der Antho- cyansynthese, wenn man die Keimlinge vom Dunkeh'ot ins Dunkle bringt. Unter diesen Bedingungen mnB man nach den Befunden von B u T L ~ (1964) zur Instabilit/~t von PTs0 damit rechnen, dab die geringe stationgre Konzentration an PTs0, welche die Keimlinge beim IDbergang vom Dunkelrot zum Dunkel besitzen, rasch destruiert wird, ohne dab im Dunkeln eine weitere Naehlieferung yon P730 aus dem groBen Pool des Pss0 erfolgen kann. Jedenfalls wirkt sieh eine Xnderung in der Konzentration yon Pvs0 erstaunlich rasch auf die Intensiti~t der Antho- cyansynthese aus. Wenn man das fibliche Gen -~ m-RNS -~ Enzym- Konzept zugrunde legt und unsere Hypothese, wonaeh P7~o bei der Anthocyansynthese fiber eine Aktivierung potentiell aktiver Gene wirkt, akzeptiert, so folgt, dab sowohl die unter dem EinfluB yon P730 entstehende m-RNS als aueh die betreffenden Enzyme eine relativ kurze Lebensdauer besitzen mfissen. Zu einer ahnlichen Auffassung

Anthocyansynthese durch Actinomycin D und Puromycin 113

gelangten K~Y und I~GL~ (1965) bei ihren Untersuehungen fiber RNS- Synthese und Wachstumskinetik (Hypokotylsegmente yon Soya- bohnen) unter dem Einflug yon Aetinomyein D und 5-Fluoruraeil. Es w/~re also nieht gerechtfertigt, eine langlebige m-RNS anzunehmen, mn die Kurven der Abb. 2 zu deuten; z. B. kann man sieh die Kurve Act. (d- 6 Std) nieht dadureh verst/~ndlieh maehen, dag man mit der Funk- tion einer relativ langlebigen m-RNS rechnet, die ws der lag- Phase gebildet wurde. Man ist vielmehr zu der Auffassung genStigt, dab Aetinomyein D in dem yon uns untersuehten Konzentrationsbereieh die Bildung einer neuen Sorte yon m-RNS total bloekieren kann, w~hrend es die kontinuierliehe Synthese yon m-RNS dort nieht vSllig verhindern kann, wo die Produktion zum Zeitpunkt der Aetinomyeingabe sehon im Gange ist. - - Zum gleiehen Sehluft gelangten wir bei der Untersuehung des Dunkelwaehstums und des phytoehrom-induzierten Waehstums der Kotyledonen yon Sinapis alba L. unter dem Einflug yon Act. (10 ~zg/ml) in der L6sung um den Keimling. Bei dieser Konzentration wird das Dunkelwaehstum der Kotyledonen nicht beeinfluftt, das dureh Dunkel- rot fiber PTs0 hervorgerufene Kotyledonenwachstum wird hingegen vSllig verhindert, wenn das Act. bei Liehtbeginn appliziert wh'd. Bietet man das Act. erst 6 Std naeh Liehtbeginn an, wenn das liehtinduzierte Waehstum gerade in Gang gekommen ist, so beobachtet man nur noeh eine partielle Hemmung des yon PTs0 abMngigen Kotyledonen- waehstums (Mog~ u. Mitarb. 1965b). - - Die Auffassung, daft ,,an inactive gene is more sensitive to aetinomycin than are certain active genes" vertreten aueh B ~ Y u. Mitarb. (1964) bei ihren Untersuchungen zur Synthese von ,,Blutproteinen" in verletzten Puppen yon Hyalophora cecropia.

b) Experimente mit Puromycin. Wenn man den Senfkeimlingen zu Beginn der Beliehtung Puromyein appliziert und 24 Std sp/~ter das Anthocyan miftt, so findet man die in Abb. 5 angegebene Dosiseffekt- kurve. Man kann aus der Abb. 5 entnehmen, daft Puromyein die phyto- ehrominduzierte Anthoeyansynthese in der Weise hemmt, wie es die oben skizzierte tIypothese fordert. Die ben5tigten Konzentrationen liegen in einem Konzentrationsbereieh, der aueh bei Arbeiten mit anderen pflanz- lichen und tierisehen Zellen als wirksam gefunden wurde (z. B. ZETSC~ 1965 bei Acetabularia, B ~ Y u. Mitarb. 1964 bei Puppen yon Hyalo- phora cecropia, CL~v~ 1964a bei Larven yon Chironomus tentans). - - Im Gegensatz zu der Wirkung yon Act. ist beim Puromyein der Effekt auf die Anthoeyansynthese (gemessen 24 Std nach Liehtbeginn) unab- hgngig vom Zeitpunkt der Applikation ws der lag-Phase (Tabelle 1). Dieser Befund bedeutet offenbar, daft der Grad einer Hemmung dureh Puromyein unabh~tngig ist yon dem momentanen Zustand des protein- bildenden Apparats. Zum Zeitpunkt (0 Std) gibt es noeh keine phyto-

114 HERBERT LANGE und HA~s M o ~ :

chromabh/~ngige Enzymsyn these im Hinb l i ck auf die An thoeyan - synghese, zum Z e i t ) u n k t ( + 6 Std) is t hingegen die lag-Phase gerade

/ Z.l'C/i //e o n ti'o //e

0,2 " , , ".,

/DLin/m/Avu/,v//e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . *.~.-. -

7 70 SO 700 500 1000

Konzentfcitlbn, ~ Purom<qcl',7/ml.

Abb. 5. Die Anthoeyanmenge nach 24 Std Dauer-Dunkelrot in Abh~tngigkeit yon der applizierten Puromycinkonzentration. Die Keimlinge wurden zu Lichtbeginn (Zeitpunkt 0) mit der wiiBrigen

PuromyeinlGsung in der in Abb. 1 skizzierten Weise umgeben

abgelaufen, die re levante Enzymsyn these is t berei ts in Gang gekommen. Fe rne r weisen auch die D a t e n der Tabel le 1 da rauf hin, dab die

Tabelle 1. Die Anthocyanmenge nach 24 Std Dauer-Dunkdrot in AbMingigkeit vom Zeitpunkt der Puromycinapplikation w~ihrend der lag-

Phase Pu (+ 3 Std) bedeutet, dM~ die Keimlinge

3 Std nach Lichtbeginn yon einer w~grigen PuromycinlSsung (50~g/ml) umgeben wurden. Entsprechend sind die anderen Symbole zu verstehen. DR = Dunkelrot. Pu = Puromyein.

Anthocyanmenge Behandlung (Extinktion, 535 nm)

0,016 Dunkelkonf0rolle . . . . . Lichtkon~rolle

(24 Std DR, kein P u ) . . 24 Std DR; Pu (0 Std) . . 24 Std DR;; Pu (+ 3 Std) 24 Std DR; Pu (+ 6 Std) .

0,245 0,105 0,105 0,106

Enzyme , die im Hinb l i ck auf die A n thoe ya nsyn the se un te r dem EinfluB yon P730 gebi ldet werden, nur eine kurze , ,Lebensdauer" be- sitzen. W/~ren die zum Zei tpunk~ ( + 6 Std) bere i ts gebi lde ten E n z y m e nieht sehr kurzlebig, so mfiBte der A n t h o e y a n w e r t bei einer P u r o m y e i n a p p l i k a t i o n zum Ze i tpunk t ( + 6 Std) signi- f ikan t h6her l iegen als bei einer P u r o m y e i n a p p l i k a t i o n zum Ze i tpunk t (0 Std). - - Der grSgte Tell der Zeit,

die yon den Zellen des Senfkeimlings benSt ig t wird, bis sich eine Anderung der K o n z e n t r a t i o n an Pv3o in einer ~ n d e r u n g der Intensit /~t der An thocyansyn the se manifes t ier t , i s t somit - - wenn wir unsere Hypo these zugrunde legen - - auf den K a u s a l a b l a u f zwischen P730 und der Genak t iv ie rung zurt ickzufi ihren. Mit dieser Vorstel lung s teht auch

Anthocyansynthese dureh Aetinomycin D und Puromycin 115

der wiehtige Befund in Einklang (BERTSCH und MOHg 1965b), dal3 eine mit Hellrot dnrehgef/ihrte Induktion der Anthoeyansynthese beim Senfkeimling naeh 4 Std Hellrot noch annghernd 100%ig dutch einen Dunkelrotstol~ revertiert werden kann. Wghrend dieser 4 Std - - w~hrend der lag-Phase also (Abb. 4) - - kSnnen somit weder eine stabile m-RNS noeh relevante Enzyme mit erheblieher Lebensdauer gebildet worden sein. Die ,,Trs mit der sieh in den Zellen des Senfkeimlings eine Jmderung in der Konzentration yon PTs0 auf die Intensitgt der Antho- eyansynthese auswirkt, diirfte somit in erster Linie auf die ,,Signal- kette" (vgl. Einleitung) zur/iekzuf/ihren sein, insbesondere anf den Anfang dieser Signalkette beim P730. - - Wenn man die eben skizzierten 1)berlegnngen zugrunde legt, so versteht man, dab z .B. der folgende Versuehsansatz ein negatives Resultat braeh~e : Es wurde zum Zeitpunkt (0 Std) Pnromyein (100 [~g/ml) zugef/igt und 6 Std mit Dunkelrot beliehtet. Danaeh wnrden die Keimlinge in Wasser umgesetzt und ins Dnnkle gebraeht (Tabelle 2). Im Gegensatz zu Zswscgg (1965), der bei

Tabelle 2. Experimente zum Nachweis einer im Dunkeln ablau/enden Synthese yon Anthocyan al8 Folge einer in Anwesenheit von Puromycin durchge/iihrten Bestrahlung

mit Dunkelrot Die Experimente ergaben ein negatives Resultat. - - Zu Lichtbeginn wurden

die Keimlinge mit einer wgBrigen Puromyein-L6sung (100 ~g/ml) umgeben. Die 18 Std nach Lichtbeginn gebilde~e Anthocyanmenge wurde bestimmt. DR = Dunkelrot, Pu = Puromyein.

Anthocyanmenge Behandlung (Extinktion, 535 rim)

Dunkelkontrolle . . . . . . . . . . . . . . Lichtkontroll% (18 Std DR; kein Pu) . . . . . . Lichtkontro]l% (18 Std DR; Pu) . . . . . . . . Lichtkontroll% (6 Std DR, dann Dunkel; kein Pu) 6 Std DR -4- Pu - - 12 Std Dunkel d- Pu . . . . . 6 Std DR + Pu - - 12 Std Dunkel d- aqua d e s t . . . 6 Std DR d- Pu - - 12 Std DR + aqua dest . . . .

0,019 0,140 0,057 0,062 0,026 0,028 0,078

einem ghnlichen Experiment mit Acetabularia zeigen konnte, dal~ der Kern w/thrend der Puromyeinbehandlung fortf~hrt, stabile morpho- genetisehe Subs~anzen an das Cytoplasma abzugeben, fanden wit keiner- lei Hinweise auf eine Anreieherung stabiler m-t~NS. Die in Wasser umgesetzten Keimlinge, aus denen allerdings unter unseren Bedingungen das Puromyein nur langsam wieder ausdiffundiert (Tabelle 2), zeigen keine signifikante Anthoeyansynthese im Dunkeln.

c) Experimente mit Desoxyguanosin. KERSTEN (1961) Iand, dab sich Actino- mycin mit Desoxyguanosin sehr viel starker verbindet als mit Guanosin oder anderen Nucleosiden. Diese Befunde yon K]S~STEN fiihrten, zusammen mit anderen Daten, zu der Vorstellung, die Bindung yon Actinomycin sei in erster

116 HERBERT LANGE und HANs MoR-~:

Linie mit dem Guaningehalt einer D~qS in Verbindung zu bringen (z. B. REICtt u. Mitarb. 1962, Sc~MI])T 1964). Da KERST~ U. Mitarb. (1960) weiterhin beob- achier hatten, dab Desoxyguanosin bei der Reversion einer Waehstumshemmung, die durch Aetinomycin bei Neurospora crassa verursaeht wurde, neben DNS am wirksamsten war, so lag die Erwartung nahe, dal~ auch im Fall der Senfkeimlinge der Effekt des Actinomyein D wenigstens partie]l dureh die Zugabe yon Desoxy- guanosin aufzuheben sei. Diese Erwartung erffi]lte sich aber nieht (Tabelle 3). Die

Tabelle 3. Die Wirkung yon Desoxyguanosin ( =dG) au/ die Anthocyansynthese yon Keimlingen, die vor- her 6 Std lang im Dunkel yon einer wdifirigen Acti-

nomyein D-LSsung (10 #g/ml) umgeben waren Die Aetinomycinapplikation erfolgte 6 Std

vor Lichtbeginn. Act. (1,4 rag dG/ml) bedeutet z.B., da$ die mit Aetinomycin D behandelten Keimlinge zu Lichtbeginn in eine w/i$rige dG-L5- sung der Konzentration 1,4 mg/ml umgesetzt wur- den. Die Auswertung erfolgte nach 24 Std Dauer- Dunkelrot.

:Behandlung

Dunkelkontrolle . . . . . . Lichtkontrolle (24 Std Dunkelrot; kein Act.) Act. (8,6/~g dG/ml) . . . . . Act. (1,4 nag dG/ml) . . . . . Act. (2,6 mg dG/ml) . . . . . Act. (aqua dest.) . . . . . .

Anthocyanmenge (Extinktion, 585 nm)

0,026

0,235 0,034 0,047 0,050 0,042

Keimlinge wurden 6 Std vor Lichtbeginn mit einer Act.- LSsung yon 10 ~g/ml in Kontakt gebraeht. Zu Licht- beginn wurden die Keim- linge in Desoxyguanosin- LSsung bzw. in aqua dest. umgeh~ngt. ~Iit den ange- wandten Konzentrationen yon Desoxyguanosin, die den yon KE~STEN verwendeten entspreehen, konnten wir keinen spezifisehen Effekt erzielen. Dieses negative Resultat ist versti~ndlieh. Inzwischen wurde n~m]ich gezeigt (z. B. G~LLERT U. Mitarb. 1965), da6 die Bin- dung yon Act. an DNS an zwei verschiedenen Stellen und thermodynamiseh g~nz

verschiedenartig erfolgen kann. Einmal kommt es zu einer sehr starken Bindung

einer geringen Quantit~t an Act., die offenbar ffir den biologischen Effekt aus- sehlaggebend ist, andererseits beobaehtet man eine schw~chere Bindung einer gr5feren Menge an Act., die o~ienbar mit dem biologischen Effekt nichts zu tun hat. Die Bindungskonstante ffir die Bindung yon Act. an die stark bindenden Stellen der DNS ist etwa 103real grSSer als die Bindungskonstante fiir die Bindung yon Act. an Desoxyguanosin oder dGMP.

Diskussion W i t sind geneigt , die D a t e n der vor l iegenden und einer voran-

gegangenen Arbe i t (MoH~ u. Mitarb . 1965b) als eine Best&tigung der Hypo these aufzufassen, daft das physiologisch ak t ive PTa0 fiber eine Ak t iv i e rung po ten t ie l l ak t ive r Gene wirke; jedenfal ls bei solchen , ,Pho tomorphosen" , ffir die eine AuslSsung oder Ste igerung von Bio- syn thesen oder Wachs tumsprozessen charak te r i s t i sch ist. Es mu$ j e t z t kurz d i sku t i e r t werden, ob die yon uns ( H o c x und M o ~ 1964) vorge- schlagene Sequenz : PTs0 -+ Genak t iv ie rung -+ m - R N S -+ E n z y m -~ l icht- abh/~ngige R e a k t i o n (z. B. An thocyansyn these ) t a t s i c h l i c h gerech~- fer t ig t i s t und es also vernfinft ig erscheint , die D a t e n dieser Arbe i t

Anthoeyansy~these durch Actinomyein D und Puromycin 117

unter dem Gesichtspunkt einer selektiven St6rung von Transcription und Translation zu interpretieren.

a) Das Konzept DNS -~ m-RNS -* Protein wird momentan all- gemein ftir richtig gehalten, sowohl ffir Bakterienzellen als auch ffir kernhaltige Zellen. Die Hypothese, dab die Proteinsynthese fiber m-lZNS reguliert wird, kann aber nieht als generell bewiesen angesehen werden; jedenfalls ist bei einer ~bertragung des an Bakterien ausgearbeiteten Konzepts auf h6here Organismen Vorsieht geboten (z. B. HAm~is 1965). Diese Vorsieht ist insbesondere dann am Platze, wenn man sieh an- sohiekt, die Modellvorstellungen der Regulation yon Genaktiviti~ten, die durch genetisehe und biochemische Untersuchungen an Bakterien gewonnen wurden, ant kernhaltige Systeme zu fibertragen. Es erseheint gfinstiger, bei der Behandlung yon Genaktivierungen chromosomen- haltiger Systeme eine neutrale Terminologie zu verwenden, um die Diskussion nieht yon vornherein ant die hypothetisehen Regulations- modelle der Bakteriengenetik festzulegen (z. B. CL~V~R 1964b, PEI~LI~G und SCI~OLTISSEK 1964, HAI~RIS 1965).

b) In einer Reihe von Arbeiten mit Geweben h6herer Pflanzen wurde die Auffassung begrfindet, dab man aueh bei diesen Systemen mit m- t~NS reehnen kann, die in maneherlei ttinsieht der m-RNS ghnlich ist, die yon bakteriellen Systemen her bekannt ist (z. B. Lo~ING 1962, I~IC~T~R und S ~ G E ~ 1964, K~Y und IsG5~ 1964). Die ,,Lebensdauer" der m-RNS darf man allerdings nieht zum Kriterium maehen; h/iufig mug man offenbar mit m-RNS yon langer Lebensdauer reehnen, sowohl bei pflanzliehen als aueh bei tierisehen Systemen (z. B. TRAKATELLIS u. Mitarb. 1964, SCOT~ und B~LL 1965, DURE nnd WATERS 1965, SPECTO~ und KO~ISnITA 1965).

C) Die Wirkung des Aetinomyein D wird im allgemeinen darauf zurfiekgeffihrt, dab es die RNS-Polymerase hemmt und damit die Transcription bloekiert. Diese tIemmung kann als eine direkte Kom- petition yon Aetinomyein und RNS-Polymerase um die stark bindenden Stellen der DNS anfgefal]t werden (z. B. CAVALIERI und NsMc~I~ 1964). Die DNS-Polymerase hingegen wird dutch das Aetinomyein nut wenig beeinflugt. - - Neuerdings wird zwar yon einigen Forsehern angenommen, Aetinomyein D bewirke in Bakterienzellen aueh direkt eine Depolymeri- sierung gewisser RNS-Fraktionen (z. B. K ~ S ~ L L 1964, A~r und ENG~Lm~G 1965), die Experimente yon C~A~Tm~?qN~ (1965) zeigen abet, dal~ kein Grund zu der Annahme vorliegt, Actinomyein D ver- ursaehe direkt eine Destruktion yon RNS.

d) Puromyein verhindert offenbar die riehtige Translation an den l~ibosomen dadnreh, dab es als ein Analogon yon Aminoaeyl-sI~NS fungiert. Mit der Bildung yon Peptidyl-Puromyein wird das ,,Waehs- turn" der Polypeptidkette abgeschlossen. NAW~A~S (1964)konnte mit

118 HERBERT LANGE und HANS MOHR:

markiertem Puromycin zeigen, dab Purmomycin tats~chlich fiber eine Peptidbindung an die Polypeptidkette gebunden wird. Die unfertigen Peptidketten werden von den l~ibosomen abgelSst. Vielleicht muB man abet auch mit anderen Wirkungen des Puromyeins reehnen, z. B. wird die Hemmung der l~NS-Synthese dureh Puromycin (Sr~cTo~ und KI~OSnITO 1965) dureh die eben skizzierte Auffassung vom Wirkungs- meehanismus des Puromycins offenbar nieht gedeutet.

e) Wenn man die Daten der vorliegenden Arbeit vor dem eben skizzierten Hintergrund betraehtet, so erscheint die Auffassung bereeh- tigt, in diesen Daten eine gute Stfitze ffir die Hypothese PTs0 --~ Aktivie- rung potentiell aktiver Gene -> m-RNS - . Enzyme -* lichtabhangige Reaktion (z. B. Anthoeyansynthese) zu sehen. Gestfitzt wird diese Hypothese ferner dureh allgemeine Argumente (MoHa 1965) sowie dureh den direkten Befund, dab die RNS- und die Proteinsynthese des Senf- keimlings fiber PTa0 reguliert werden kSnnen (WEID~ER U. Mitarb. 1965). - - Besonders wichtig ffir die in der vorliegenden Arbeit gezogenen Schliisse sind die Daten einer vorangegangenen Arbeit, in der das Wachstum der Kotyledonen des Senfkeimlings unter dem EinfluB yon P730 und Actinomycin D untersucht wurde (MoH~ u. Mitarb. 1965b). Bei einer Konzentration von 10 ~g/ml Actinomycin D in der LSsung um den Keimling wird das Dunkelwachstum der Kotyledonen nicht beeinfluBt. Das phytochrominduzierte Wachstum wird hingegen vSllig verhindert, wenn das Aetinomycin D zu Liehtbeginn appliziert wird. Bietet man das Actinomycin D erst 6 Std naeh Liehtbeginn an, wenn das lichtinduzierte Wachstum gerade in Gang gekommen ist, so kommt es nur noeh zu einer schwachen Hemmung des phytoehrominduzierten Waehstums. Wit sehen in diesem Befund eine Stfitze fiir die in der vor- liegenden Arbeit skizzierte Auffassung, wonaeh bei dem von uns unter- suchten System solche Gene, die bereits aktiv sind, sehr viel schwerer dureh Aetinomycin D zu hemmen sind a]s ,,potentiell aktive Gene". Wir haben bereits darauf hingewiesen, dab s Phiinomene aueh bei Tieren ge~unden wurden (BElfry u. Mitarb. 1964). Es kSnnte sein, dab die ,exponierten" Gene, die wir als ,,potentiell aktiv" dan ,,aktiven" und ,,inaktiven" Genen gegeniiberstellen (Hock und !V[o~IR 1964), besonders lest mit Aetinomycin D reagieren kSnnen, so dab die Kom- petition mit der RNS-Polymerase zugunsten des Actinomycins ver- schoben ist.

]) Es sei noeh darauf hingewiesen, dab die lichtabh~ngige Caro- tinoidsynthese einer Mycobacterium-Art yon RILLII~G (1962, 1964) i~hnlich gedeutet wird wie yon uns die lichtabh~ngige Anthoeyansyn- these. RIZ]~ING gelangt , z. B. auf Grund yon Experimenten mit Chlor- amphenieol zu der Auffassung, dab das Produkt der nut in Anwesenheit yon O 2 und nur im Blaulicht ablaufenden Photoreaktion als ein zell-

Anthocyansynthese durch Actinomycin D und Puromycin 119

intern hergestellter I n d u k t o r einer fiir die Carotinoidbfldung wichtigen Enzymsynthesc anzusehen sci. Mit dem Phy toch rom ha t die yon I~IL- LING studierte Photoreakt ion allerdings nichts zu tun.

Zusammenfassung I n der vorliegenden Arbeit wurde die Hypothese geprfift (HOCK

und MoH~ 1964), dab PT~0, das akt ivc Phytochrom, die Photomorpho- genese fiber eine Aktivierung ,,potentiell akt iver Gene" ansl6se, zumin- dest in solchen F~llen, woes fiber PTa0 zu einer AuslSsung oder Steigerung yon Biosynthesen odor Wachstumsprozessen kommt. Wit verwenden die phytochromabh~ngige Anthocyansynthese des Senfkeimlings, cine typische , ,Photomorphose" dicker Art. - - Durch Act inomycin D, einen spezifischen Inhibi tor der Transcription, und Puromycin , einen spe- zifischen Inhibi tor der Translation, kann die phytochrominduzier te Anthocyansynthesc in genau der Weise bceinflu~t werden, wie man es auf Grund der Hypothese zu erwarten hat. Zu entsprechenden Resul- ta ten gelangten wir bei der Untersuchung des Koty ledonenwachs tums yon Sinapsis alba L. unter dem EinfluB yon PT~o und Act inomycin D (Moor u. Mitarb. 1965b).

Die Arbeit wurde durch die Unterstfitzung der Deutschen Forschungsgemein- schaft ermSglicht.

Herrn E. WAG~ER danken wir ffir seine Daten und Diskussionsbeitr~ge.

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