Jg. 43, ~Ieft 15 H. WeLts: Itemmung der Serumcholh~esterase durch Cyelophosphamid (Endoxan®) 819 1. August 1965

gleieh der Spektrogramme der Ex~rakge untereinander fgllt auf, dab diejenigen sieh mehr entspreehen, die naeh gleieher Arbeitsweise gewonnen wurden (siehe Abb. 2, 4, 6 and 3, 5, 7), als jene, die aus demselben Ausgangsmateriai aufbereitet warden.

Vergleieht man die Spek~rogramme mit den ent- spreehenden quantitativen Werten (s. Tabelle), so kann angenommen werden, dab die Differenz zwischen beiden Methoden wahrscheinlieh auf einer zus/~tzlichen Abgrennung gewisser Beglei~subsganzen dutch die Methode von L~Ps (1.6.) beruht. Gin zus£tzlieher Sub- stanzverlus~ l£gt sich jedoeh nich~ sieher aussehlieBen.

Die Zusatzchromatographie naeh L~P (1960) bietet also die M6gtichkeit, den nach der Met.hode yon K~oe- PE~et al. (1955) gewonnenen Extrakt zu reinigen. Dies erfordert jedoch eine besonders sorgf/~ltige and sehonende Arbeitsweise und ist langwieriger. Wir wet- den demngehst fiber eine Me~hode beriehten, die weni- ger Arbeitsaufwand erfordert and die fiir die Bestim- mung des Residualpregnandiols geeignet is~.

Zusammen/assung. Es werden die Pregnandiol- bestimmungsmethoden yon KI~O~SE~ et al. and LIpS mit~ Hilfe der Infrarotspektrographie vergtichen. Ats VergleichsgPdndlage dienten ein Pregnandiol-diaeetat- S~andard sowie UrJnex~rak~e aus der 1. und 2. Cyelus- h/tlfte. Die naeh gleieher Arbeitsweise gewonnenen Extrakte /~hnelten sieh mehr als die vom gMehen Ausgangsmaterial stammenden. Die quantitative Be-

stimmung des entspreehenden Ausgangsmaterials zeig~, dal] die Werte naeh LI~F deutlieh unter denen naeh KLOPPEt~ liegen. Es kann angenommen werden, dab diese Untersehiede im wesenfliehen auf einem t~einigungseffek~ dureh die Methode yon L ~ beruhen.

Summary. To carry out a comparison between the methods for pregnanediol-determination given by KLOPeEa et al. and by LIPP we made infrared spectra with a Leitz infrared spectrograph. The pregnanediot-diaeetate standard and crystalline samples from different mqnary extracts of the follicle and luteal phase of the eyele prepared by both methods are compared.

Extracts obtained by the same method are less different than those received by the same urine. The lower values of ~he LrP~ method seem to be caused by further purifica,tion steps. This is suggested by lower losses working with the standard.

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Anschri]t: Dr. H E ~ N ~ P.-G. S c ~ D n ~ 2300 Kiel Universi$i~ts-Frauenklinik

Die Hemmung der Serumeholinesterase dureh Cyelophosphamid (Endoxan®) Von

H. WOLFF Aus der Chirurgisehen Klinik der Karl ~farx-Universit~,t Leipzig (Direktor: l~rof. Dr. IL IIEB~R~[IZ~)

Von den zahlreiehen bekann~en Inhibitoren der Chotinesterase (ChE) zeiehnen sieh besonders die Alkylphosphate dureh ihre spezifisehe Hemmung des Enzyms aus. Unbekanng ist der Einflug des Cyelo- phosphamid (Endoxan, N,N-Bis-(2-ehlor~thyl)-N,O- propylenphosphorsgureesterdiamid) auf die Cholin- esterase. Bei diesem Cytostatiemn ist die N-Lost- gruppe mig der Phosphors/~ure gekoppelt and damit die Bedingung des sog. ,,Transport-Prinzips" ge- sehaffenL Dadureh ist eine reversible Inaktivierung der N-Lostgruppe erreieht. Erst im K6rper erfolgt die Umwandhmg der Transport, form in die eigent- liehe Wh'kform.

Die Aktivierung des Endoxans gesehieht wahr- seheinlieh in der Leber, die Umwandlungsreaktion ist an die Lebermikrosomen gebunden ~,a. Das ey~o- statiseh wirksame Agens kann hafolge versehiedener strukturehemischer Ver/inderungen des Endoxan- molekfils entstehen. Am wahrseheinliehsten ist eine selektive Sprengung des hexaeyclisehen Esteramid- tinges. Das entstehende Zwitterion gibt dann sekun- dgr die eytosta~iseh wirksame N-Lostgruppe ab 4.

Da es sieh bei diesen Verbindungen um sehr aktive Phosphors/~ureester handelt, lag es nahe, die Wirkung auf die Serumeholinesterase (SChE) zu prfifen.

Methodik Die Bestimmung der SChE-Aktivit~t erfolgte spektro-

metrisch nach KALOW~,~. Als Subs~rat wurde Benzoyleholin verwandt und die Abnahme der Extinktion bei 240nm fiber

3 rain bei 260 C verfolgt. Unter ]3erficksichtigung des Ver- diinnungs-, Temperatur- and Zeit~aktors wurde die SChE- Aktivit~t in #~Ijml]h bei 370 C erreehnet.

Aut3erdem ffihrten wir zum Teil vergMchende Bestim- mtmgen der SChE nach der manometrischen Methode yon A?~o)r 7 aus, als Substrat diente Acetylcholin.

Die Untersuchungen warden bei 15 Carcinomkranken aus- geffihrt, die im Durehschnitt 5 Endoxaninjektionen yon je- wells 20 mg/kg i.v. bekamen. Zwischen den einzeluen Cyto- staticagaben wurde eine Zeitspanne yon mindestens I0 Tagen eingehalten. Insgesamt konnte das Verhalten der SChE bei 74 Endoxangaben verfolgt werden. Die Messung ei~olgte un- mittelbar vor und in bestimmten Zeitabst£nden nach den einzelnen Endoxanapplikationen.

Die statistische Auswertung erfolgte mit I~lfe des t- Test~s. Eine Signifikanz der Dffferenz zweier Mittelwerte wird bei/~ < 0,05 angenommen s.

Ergebrdsse 1. Die ermittelten SOhE-Werbe bei Applikation

der ersten Dosis yon 20 mg/kg Endoxan sind yon 15 Carcinompatienten hi der Tabelle 1 eingezeichnet.

Das VerhMten der SChE bei den insgesam~ 74 Endoxaninjekgionen wird als Kurve auf der Abb. 1 zur Darstetlung gebracht. Es sind die prozentuMen l~estaktivit/iten (NIittelwerte) der vor den Endoxan- gaben gemessenen SChE-Werte aufgezeiehneg. Dem- zufolge beMrkte Endoxan eine statistiseh signifikante Hemmung der SChE, die bis zum 4. Tag nach der Endoxanapplikation naehzuweisen war. Die nied- rigsten Werte warden nach 6, 12 und 24 Std gemessen. Ira Durehsehnitt betrug die I~estaktivitgt der SChE

Ktim Wsehr., 48. Jahrg. 55b

820 H. WOLFF: Hemmung tier Serumcholinesterase durch Cyclophosphamid (Endoxan®) KliI~ische Woehenschrift

/00 % 8O

% .k 60

d6

I D~doxzn 20m.g/kg

/d2~ 2 5 Abb. 1. Res~aktivit~t der Seh]g nach Endoxangaben

{

lO0 V - I % ~

Abb. 2. l{estaktiviffi$ der SChE bei versctliedenen ]Bndoxankonzen~rationen

gesunder Personen ermittelt wurde. Aufgetragen sind die Mittelwerte mit ihren Standardabweichungen.

Die SChE-Inaktivierung ist der Endoxankonzen- tration direkt proportional, w/thrend bei einer Test- ansatzkonzentration des Endoxans yon 10 -~ M eine IIemmung der SChE um 14% festzustellen ist, finder man bei ErhShung der Endoxanmenge auf 10 -3 M eine Inakt~ivierung des Enzyms yon 74%.

Die Inkubationsdauer des Serums mit Endoxan betrug bis zur Messung der SChE im Durchsehnitt 30min. Die nach KALow ermittelten Ergebnisse konnten ebenfalls mit der manometrisehen Methode von AMMON bei Verwendung yon Acetyleholin als Substra~ bes~/~tigt werden.

3. Da die N-Lostderivate im allgemeinen eine leichte SChE-Depression verursachen 9, pr/iften wit in vitro unter gleichen Bedingungen auch die Wirkung yon Mitomen (N-Oxyd-Lost) auf die SChE. In der Tabelle 2 wird die Wirkung beider Cytostatica bei den entsprechenden Konzentrationen angegeben. Da- bei zeigt sich, dab das Mitomen nut einen geringen AbfM1 der SChE-Aktivit/it bewirkt. Erst bei 10 -~ M Mitomen im Testansatz ist die Enzymaktivitgt etwa um die H/~lfte ihres ursprfinglichen Wertes gesenkt,

Tabelle 1. SGhE.Aktiv#Sten nach Endoxanapplikation (Einheiten nach KALOW)

Nach der Endoxangabe 20 mglkg

2 Std 3 Tage 4 Tage ~amo Vor

0.I. 108 S.M. 120 H.E. 68 V.~. 72 P.W. 164 G.M. 131 U.A. 144 G.M. 126 K.A. 70 K.H. 68 S.K. 48 D.A. 49 N.E. 107 S.E. 61 G.O. 78

Mit~el- I 94,2 wert S =t=36,6

84 65 38 40 80 72 70 86 40 44 20 28 77 36 36 54,4

±22,5

t 6 12 Std Std

48 32 22 18 23 28 30 20 50 41 36 28 40 36 55 41 18 23 23 18 1 8 ! 20 22 19 35 22 18 20 18 16 30,4 25,4

±11,7 ~- 8,5

24 Std 2 Tage

24 38 24 48 40 45 22 36 80 90 38 52 70 106 44 76 24 34 20 26 25 30 24 36 18 41 16 24 30 56 33,2 49,2

~= 18,8 -t-23,9

46 65

I 38 88 64

111 80 46 39 36 40 54 31 62 56,6

±22,1

54 63 5O 4O

llO 76

118 82 45 48 4O 43 65 42 58 62;2

±24,6

5 Tage 6 Tage

70 76 70 70 58 6O 44 55

121 122 96 88

120 126 84 83 44 56 48 49 42 48 41 44 67 80 42 54 68 67 67,6 71,8

±27,1 i +25,1

7 Tage

85 58 60

150 118 118 98 57 50 48 46 81 49 68 78,2

±31,3

8 Tage

86 llO 55 70

148 128 114 97 66 49 41 43 95 48 70

i

I 9Tage

102 122 65 66

156 122 131 101 74 48 45 46 94 55 72

,6 ,8

I0 Tage

104 118 65 68

160 128 140 119 76 64 46 48

102 58 75 91,4

:J:35,6

w~hrend dieser Zeit nur noch 30%. In den darauf- folgenden Tagen erh6hte sich der Enzymspiegel und erreichte nach 8--10 Tagen ann~hernd den Ausgangs- wert. Der prozentuale Abfall der SChE-Aktivit~t war bei den gleichen Patienten bei ~4ederholten Endoxan-Injektionen reproduzierbar, doch nach Ver- abreichung yon mehr als zwei Injektionen wurde nach zehnti~giger Pause der vor Beginn der Endoxanbehand- lung ermittelte Wer~ in den meisten F/~llen nicht mehr erreicht.

2. Nach Feststellung der relativ starken Hemm- wirkung der SChE durch Endoxan in ~ivo galt es zu prfifen, inwieweit und in welchen Konzentrationen auch eine Hemmung der SChE in vitro zu verzeichnen ist. Die diesbeziiglichen Untersuchungen best~tig~en die in vivo erhobenen Ergebnisse. Endoxan hemmt auch in vitro in relativ starkem AusmaBe die im Serum gesunder Personen vorhandene ChE.

Auf der Abb. 2 is~ die in vitro gemessene Inak- tivierung der SChE aufgezeichnet, die in ffinf Seren

¢ Tabelle 2. Prozentuale RestaktivitSten der SChE nach Endoxan- und Mitomenzusatz

tgndoxan ~i~omen

I0-2 lO-S I0-~ 10-5

nich~ naehweisbar 25,6 & 3,8 55,8 ± 3,0 85,6± 3,2

53,1 ± 5,1 92,4 ~ 4,3 96,0 ± 4,6 97,5 j= 3,9

dagegen findet man ann/ihernd diese Inaktivierungs- grSge schon bei 10 -4 M Endoxan.

Diskussion

Der Erfolg der eytostatischen Therapie ist weit- gehendst yon der verabreiehten Doses abhangig. Es besteh~ daher das Bestreben, mit der Applikations- menge his an die Grenze des Vertraglichen zu gehen 1°. Dabei werden die dutch Cytostatica allgemein be- dingten Seh/~digungen, besonders der stoffweohsel- aktiven Gewebe (Blutbild etc.), beim Endoxan gut

jg. 4~, ttef~ ]5 H. WOLFF: Hemmung der Serumcholinesterase durch Cyclophosphamid (Endoxan®) 821 1. August 1965

to ler ier t (n-~a) und wurden aueh yon uns selten be- obachte t .

I m Vorderg rund be i der oben angegebenen Dosie- rung s t auden v ie lmehr aku te Nebenwirkungen , die wenige S tunden naeh den E n d o x a n g a b e n ~uf t ra ten . Sie auger~en sieh in Inappe tenz , Ubelke i t , E rb reehen und DtgehfNlen . Diese S y m p t o m e waren aussehlieB- l ieh a m I n j e k t i o n s t a g und einera Tag d a n a & zu be- obaeh~en. N a e h raseher Erho tung waren die P~t ien- ten a m 3. Tag naeh der E n d o x a n g a b e meis~ beschwer- defrei. Diese du tch das E n d o x a n bed ing ten Neben- wi rkungen s ind aus de r L i t e r a t u r bekarmt . Sie t r a t e n bei e inem Tefl der P a t i e n t e n sehon bei einer geringeren Dosierung auf (1~-1~ u.a.), doeh bl ieben die at iologisehen F a k t o r e n bisher ungekl~rt . Obwohl diese Ersehei- nungen n u t kurze Zeit andauer ten , wurden sie doeh als sehr bel/~stigend empfunden und n a h m e n oft bedrohl iehe Ausmage an, sie waren in einem ge- wissen Umfang dureh hohe Dosen At rop in zu beherr- sehen. Als Ursaehe dieser aku t en Nebenwirkungen nehmen wi t die s t a rke t I e m m u n g der ChE dureh E n d o x a n an. Die Symptome /~hne ln auffgllig denen, die du t ch Vergi f tungen mi t A l k y l p h o s p h a t e n (z.B. Pa ra th ion , F luos t igmin u .a . ) zu beobaeh ten s in& Diese Subs tanzen s ind als Inh ib i to ren der ChE be- kann t .

Die oben beschr iebenen Ersehe inungen k o m m e n wahrseheinl ieh du tch eine , ,endogene AeetyleholLa- in~oxika t ion" zus tande . Die untersehiedl iche Wi r - kung yon E n d o x a n u n d Mitomen, beides N-Los t - de r iva te , auf die S C h E - A k t i v i t a t zeigt, dug die In- ak t iv i e rung wahrscheinl ieh du tch die Phosphors/~ure- komponen te des Endoxanmolek i i l s bed ing t wird.

D a die Spa l tung des Endoxanmolek i i l s sehr raseh, e twa innerha lb 15 rain erfolgt ~s, i s t anzunehmen, dab die Wirk~mg n ieh t dureh die Endoxanmolek t i l e selbst , sondern dureh die U m w a n d l u n g s p r o d u k t e zus tande kommt . E rh~r t e t wird diese A n n a h m e aueh dadureh , dal] die Inak~ivierung der SChE ers~ naeh 6 S td am ausgeprgg~esten war.

Die W i r k u n g dieser Phosphors/~ureester auf die ChE erfolgt wahrseheinl ieh auf die gleiehe Weise wie der angenommene Vergff tungsmeehanismus durel i die A l k y l p h o s p h a t e ~°. Zur Zei t f inden Unte r suehungen tiber die M6gliehkei t e iner g e a k t i v i e r u n g der du tch E n d o x a n b loek ie r ten ChE s tar t . D a m i t l iege sieh die Ver t rag l iehke i t des E n d o x a n s aueh bei hSherer Dos ierung verbessern.

Zusammen[ass~tng; Bei de r ey tos ta t i sehen Behand- lung k o m m t es in den ers ten Tagen naeh der Appl i - ka t ion yon 20 mg/kg E n d o x a n i .v. zu einer s t a rken Inak~iv ierung der Serumehol ines terase . Aueh in v i t ro h e m m t E n d o x a n die fin Sea-am gesunder Personen vorhandene Cholinesterase, Mi tomen zeigt dagegen nur eine geringe Wirkung .

Demzufolge werden die aku ten Nebenvdrkungen du tch E n d o x a n als Ausd ruek einer , ,endogenen Aeety l - ehol in in toxika~ion" angesehen.

Summary. In the first days of treatment with Endoxan® (20 mg/kg i.v.) we observed a marked inhibition of plasma cholinesterase. With healthy persons the enzyme activity is - - as shown by in vitro experiments - - also considerably reduced. However, :~Iitomen causes only a weak inhibition. The acute side effects of Endoxan are considered to be a con- sequence of a "endogene acetyl choline intoxication".

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Anschrl]t: Doz. Dr. reed. habil. H. WOLF~ Chirurgisehe Klinik der Karl Marx-Universit~it 701 Leipzig, Liebigstr. 20