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Fresenius Z. Anal. Chem. 294, 356-360 (1979) FresenillS Zeitschrift fiir Die Mechanisierung der photometrischen Analyse mit den Bausteinen der Fliissigkeits-Chromatographie 1. Mitteilung Prinzip und Optimierung* W. Huber BASF Aktiengesellschaft,AmmoniaklaboratoriumD-6700 Ludwigshafen by Springer-Verlag 1979 Mechanization of Photometric Analysis with the Component Parts of Liquid Chromatography. I. Principle and Optimization Summary. The principle of automation of photometric analysis by the continuous flow method and the particular advantages of the use of component parts of liquid chromatography are discussed in detail. The optimization of the following parameters is pointed out: residence (reaction) time, injection volume, pump- ing rate, column dimensions and particle diameter. Zusammenfassung. Das Prinzip der Automatisierung der photometrischen Analyse mit kontinuierlichem ReagentienfluB und die speziellen Vorteile der Verwen- dung von Bausteinen der Fliissigkeits-Chromatogra- phie werden ausftihrlich diskutiert. Die Optimierung folgender Parameter wird besprochen: Verweilzeit (Reaktionszeit), Einspritzmenge, Pumpgeschwindig- keit, SS, ulenabmessungen, Partikeldurchmesser. Key words: Spektralphotometrie; Mechanisierung, Prinzip, Optimierung. I. Prinzip Die photometrische Analyse nimmt in der Routineana- lytik nach wie vor einen bedeutenden Platz ein. Dies gilt sowohl ffir,die anorganische wie auch besonders ffir die organische Analyse. Wertvoll ist bei diesen Methoden neben dem relativ bescheidenen Aufwand, der Schnel- ligkeit und der Spezifit/it vor allem der augerordentli- che Erfahrungsschatz, der sich in Tausenden von Publikationen niedergeschlagen hat. Es gibt fast keine Fragestellung, die sich nicht photometrisch bearbeiten liege. * Herrn Prof. Dr. H. Pommer zum 60. Geburtstaggewidmet 0016/1152/79/0294/0354/~;01,00 Trotz dieser VorziJge ist es unverkennbar, dab die Anwendung photometrischer Methoden eher ab- nimmt. Die Ursache dieser Erscheinung diirfte neben dem Aufkommen rein physikalischer Methoden haupt- sfichlich in dem Umstand zu suchen sein, dab sich photometrische Methoden bis jetzt nur mit grol3em Aufwand mechanisieren und automatisieren liegen. Die Automatisierung lfiBt sich im Prinzip nach zwei Arten durchfiihren. Man kann das manuelle Verfahren unmittelbar imitieren, indem die Probe mit den entspre- chenden Reagentien portionsweise versetzt, zur Reak- tion gebracht und schlieglich vermessen wird. Diese Arbeitsweise soll hier nicht besprochen werden. Die andere M6glichkeit besteht in der Einftihrung der Probe in einen kontinuierlich fliegenden Reagentien- flug (continuous flow Methode). W/ihrend des Flfissig- keitstransports vermischt sich die Probe ~it dem Reagens, die Farbe entwickelt sich und wird in einem Durchflugphotometer vermessen. Weite Verbreitung, besonders auf klinischem Ge- biet, hat das Auto-Analyzer-System | [5] erfahren. Hier werden ftir den Transport yon Reagentien und Probe relativ dicke Schl~iuche verwendet. Da die L/ingsdurch- mischung in solchen Systemen sehr grog ist, werden in kurzen Abstfinden Luftblasen in das flieBende System gedrfickt. Die sich ausbildenden Fltissigkeitspfropfen sorgen sowohl ffir eine gute Durchmischung zwischen Probe und Reagens, wie auch fiir eine Eindfimmung der L/ingsvermischung. Weniger aufwendig ist ein Verfahren, bei dem Capillarschlfiuche zum Transport des Reagentienstro- rues verwendet werden [2-4, 6, 8]. Anders als beim Auto-Analyzer-System wird nicht eine gr613ere Proben- menge kontinuierlich mit dem Reagentienstrom ver- mischt. Vielmehr erfolgt wie bei der Fltissigkeits- Chromatographic eine Injektion der Probe in das fliegende System. W/ihrend des Weitertransports kommt es dann zu einer L~ingsvermischung des Sub- stanzpfropfens mit dem Reagentienstrom in der Lei-

Die Mechanisierung der photometrischen Analyse mit den Bausteinen der Flüssigkeits-Chromatographie

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Page 1: Die Mechanisierung der photometrischen Analyse mit den Bausteinen der Flüssigkeits-Chromatographie

Fresenius Z. Anal. Chem. 294, 356-360 (1979) FresenillS Zeitschrift fiir

Die Mechanisierung der photometrischen Analyse mit den Bausteinen der Fliissigkeits-Chromatographie

1. Mitteilung

Prinzip und Optimierung*

W. Huber

BASF Aktiengesellschaft, Ammoniaklaboratorium D-6700 Ludwigshafen

�9 by Springer-Verlag 1979

Mechanization of Photometric Analysis with the Component Parts of Liquid Chromatography. I. Principle and Optimization

Summary. The principle of automation of photometric analysis by the continuous flow method and the particular advantages of the use of component parts of liquid chromatography are discussed in detail. The optimization of the following parameters is pointed out: residence (reaction) time, injection volume, pump- ing rate, column dimensions and particle diameter.

Zusammenfassung. Das Prinzip der Automatisierung der photometrischen Analyse mit kontinuierlichem ReagentienfluB und die speziellen Vorteile der Verwen- dung von Bausteinen der Fliissigkeits-Chromatogra- phie werden ausftihrlich diskutiert. Die Optimierung folgender Parameter wird besprochen: Verweilzeit (Reaktionszeit), Einspritzmenge, Pumpgeschwindig- keit, SS, ulenabmessungen, Partikeldurchmesser.

Key words: Spektralphotometrie; Mechanisierung, Prinzip, Optimierung.

I. Prinzip

Die photometrische Analyse nimmt in der Routineana- lytik nach wie vor einen bedeutenden Platz ein. Dies gilt sowohl ffir, die anorganische wie auch besonders ffir die organische Analyse. Wertvoll ist bei diesen Methoden neben dem relativ bescheidenen Aufwand, der Schnel- ligkeit und der Spezifit/it vor allem der augerordentli- che Erfahrungsschatz, der sich in Tausenden von Publikationen niedergeschlagen hat. Es gibt fast keine Fragestellung, die sich nicht photometrisch bearbeiten liege.

* Herrn Prof. Dr. H. Pommer zum 60. Geburtstag gewidmet

0016/1152/79/0294/0354/~;01,00

Trotz dieser VorziJge ist es unverkennbar, dab die Anwendung photometrischer Methoden eher ab- nimmt. Die Ursache dieser Erscheinung diirfte neben dem Aufkommen rein physikalischer Methoden haupt- sfichlich in dem Umstand zu suchen sein, dab sich photometrische Methoden bis jetzt nur mit grol3em Aufwand mechanisieren und automatisieren liegen.

Die Automatisierung lfiBt sich im Prinzip nach zwei Arten durchfiihren. Man kann das manuelle Verfahren unmittelbar imitieren, indem die Probe mit den entspre- chenden Reagentien portionsweise versetzt, zur Reak- tion gebracht und schlieglich vermessen wird. Diese Arbeitsweise soll hier nicht besprochen werden. Die andere M6glichkeit besteht in der Einftihrung der Probe in einen kontinuierlich fliegenden Reagentien- flug (continuous flow Methode). W/ihrend des Flfissig- keitstransports vermischt sich die Probe ~it dem Reagens, die Farbe entwickelt sich und wird in einem Durchflugphotometer vermessen.

Weite Verbreitung, besonders auf klinischem Ge- biet, hat das Auto-Analyzer-System | [5] erfahren. Hier werden ftir den Transport yon Reagentien und Probe relativ dicke Schl~iuche verwendet. Da die L/ingsdurch- mischung in solchen Systemen sehr grog ist, werden in kurzen Abstfinden Luftblasen in das flieBende System gedrfickt. Die sich ausbildenden Fltissigkeitspfropfen sorgen sowohl ffir eine gute Durchmischung zwischen Probe und Reagens, wie auch fiir eine Eindfimmung der L/ingsvermischung.

Weniger aufwendig ist ein Verfahren, bei dem Capillarschlfiuche zum Transport des Reagentienstro- rues verwendet werden [2-4, 6, 8]. Anders als beim Auto-Analyzer-System wird nicht eine gr613ere Proben- menge kontinuierlich mit dem Reagentienstrom ver- mischt. Vielmehr erfolgt wie bei der Fltissigkeits- Chromatographic eine Injektion der Probe in das fliegende System. W/ihrend des Weitertransports kommt es dann zu einer L~ingsvermischung des Sub- stanzpfropfens mit dem Reagentienstrom in der Lei-

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tung, was zur Farbstoffentwicklung auch notwendig ist. In einer beheizbaren Verweilspirale wird die Reak- tion durchgefiihrt und der gebildete Farbstoff passiert die Detektorzelle eines Photometers, wo er vermessen wird. In einem Diagramm (Abb. 1) stellt sich der Vorgang schematisch folgendermal3en dar: Die Probe tritt in das System als Substanzpfropfen ein, der etwa des Konzentrationsprofil eines Rechtecks aufweist. W/ihrend des Transports vermischt sich dieser Pfropfen mit dem nach beiden Seiten angrenzenden Reagentien- strom. Das Konzentrationsprofil geht dabei allm/ihlich in die angen/iherte Form einer Gaul3'schen Verteilungs- funktion fiber. Die Breite nimmt zu, w/ihrend die Konzentration durch die Vermischung mit dem Rea- gens abnimmt. Dies ist auch der Unterschied zum Auto-Analyzer-Verfahren. Dort wird wegen der konti- nuierlichen Zusammenffihrung yon Reagens und Probe an Stelle eines Peaks ein Plateau erzeugt.

Wenn es gelingt, Vermischungsgrad und Reaktions- ausbeute genau zu reproduzieren, ist die Peakh6he ein genaues MaB ffir die ursprfingliche Substanzkonzentra- tion. Die Zeit to entspricht der Verweilzeit der Probe im flieBenden System. Sie ergibt den Zeitaufwand yon der

~ Injektion bis zum Ergebnis. Uber Anzahl der m6gli- chen Bestimmungen in der Zeiteinheit (Analysenfre- quenz) sagt t o nichts aus. Daffir ist die Peakbreite w maggebend. Sie ergibt den Mindestzeitaufwand pro Bestimmung. Es ist somit m6glich, mit ein und dersel- ben Verweilstrecke gleichzeitig mehrere Bestimmungen durchzuffihren deren Peakmaxima durch die Zeit w getrennt sind.

W/ihrend bei der tiblichen photometrischen Analy- se zuerst in definierter Weise mit dem Reagens ver- mischt und anschliel3end die Farbreaktion durchge- ffihrt wird, erfolgen diese beiden Vorg/inge bei der Injektionsmethode gleichzeitig und miteinander gekop- pelt. Aus Vereinfachungsgrfinden soll angenommen werden, dab die Abh/ingigkeit linear w/ire, was in Wirklichkeit nicht der Fall ist. Die VerhNtnisse lassen sich schematisch in Abb. 2 darstellen: Bei manueller Arbeitsweise bewegt man sich vom Ausgangspunkt A zun/ichst durch Verdfinnung mit Reagens nach B (optimale Verdfinnung) und verweilt bei dieser Verdiin- hung, bis C, der Punkt optimaler Verweilzeit, erreicht ist.

Bei der Injektionsmethode ist es unm6glich, diesel- ben optimalen Bedingungen einzustellen. Der Punkt C ist zwar durch geeignete Auswahl der Mischungspara- meter in vielen FNlen erreichbar (Kurve as), die Reaktionsbedingungen waren jedoch wfihrend dieser Zeit nicht optimal, bei Beginn der Vermischung sogar ausgesprochen ungfinstig.

Die Folge mug ein Ausbeuteverlust sein, der wiederum zu einer Erniedrigung der Empfindlichkeit ftihrt. Schwerer wiegend ist die Einfiihrung eines neuen

IL to A l--w--I

Zeit

Abb.1. Anderung des Konzentrationsprofils einer injizierten Sub- stanz in einer Verweilstrecke (schematisch). to ~ Verweilzeit; w

Peakbreite

IE ,ti, /

/ /

/ , /

B I~/ C

A Verweilzeit

Abb. 2. Abh~ingigkeit yon Vermischungsgrad und Verweilzeit bei manueller und mechanisierter Arbeitsweise. Nfihere Erl~uterung siehe Text

Parameters, n/imlich der Farbstoffausbeute, der in die Empfindlichkeit eingeht. Er mul3 ebenfalls exakt repro- duzierbar sein. Man kann den Ausbeuteverlust kom- pensieren, wenn man die Verweilzeit verl/ingert (Kurve a2). Dies ffihrt jedoch zu einer Erh6hung des Vermi- schungsgrades und ist daher keine gute L6sung. Besser w/ire eine Aufteilung der Verweilstrecke in Zonen starker und schwacher L/ingsvermischung. Dabei liege sich eine Kurve a 3 erzielen: L/ings der Strecke AD findet eine starke Durchmischung statt. Sie wfirde zum Punkt E f/ihren, wo der Verdfinnungsgrad viel zu hoch liegt. Gelingt es, durch )~nderung der Geometrie der Verweilstrecke die Lfingsvermischung zwischen D und C zu Verringern, mfil3te sich eine Angleichung an die Bedingungen der manuellen Arbeitsweise erzielen las- sen.

Dazu bietet sich der Einsatz von Bausteinen der Flfissigkeits-Chromatographie an [1], da formal grol3e

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358 Fresenius Z. Anal. Chem., Band 294 (1979)

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7/ i

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Abb. 3. a Peakverzerrung bei der Injektion von 5 gl Probe in eine Capillare yon 300mm Uinge und 0,8mm Durchmesser (V~ = 151 mma). Pumpgeschwindigkeit 8,9 mm3/s, b Injektion yon 5 gl Probe auf eine S~iule yon 150 mm Lfinge und 3 mm Durchmesser (V c = 1060mm 3, Totvolumen ca. 420mm3). Pumpgeschwindigkeit 8,9 mm3/s. Partikeldurchmesser 0,12 ram. (Die Ordinaten sind nicht direkt miteinander vergleichbar)

Reagentien- gernisch

Detektor zet[e

Pumpe

Einspritztei|

S&ute

Verst&r- Schreiber ker

Bremss&ute

Ahnlichkeiten zwischen den beiden Methoden beste- hen. Die L/ingsvermischung in Verweilstrecken, insbe- sondere in chromatographischen S/iulen, wurde prak- tisch wie theoretisch vielfach bearbeitet und spielt als wesentlicher Parameter in der van Deemter-Gleichung eine erhebliche Rolle bei der Erkl~irung chromatogra- phischer Prozesse. Es hat sich gezeigt, dab hier grol3e M6glichkeiten zur rationellen Mechanisierung der photometrischen Analyse vorhanden sind. Ohne we- sentliche Entwicklungsarbeiten k6nnen die kfiuflichen Bausteine der Fltissigkeits-Chromatographie direkt fibernommen werden. Da Trennprozesse keine Rolle spielen, werden die S~iulen mit einem inerten Material gefiJllt.

Ftir kurze Verweilzeiten, wie auch f/Jr die Prim~ir- vermischung der Probe mit dem Reagens (Abb. 2, Kurve AD), k6nnen Capillarleitungen eingesetzt werden.

Capillaren sind allerdings keine guten Mischstrek- ken. Nur bei relativ hohen Flieggeschwindigkeiten, die zur Turbulenz im str6menden Medium ftihren, ergibt sich fiir die Form des entstehenden Peaks eine angen/i- herte Gaul3'sche Verteilungskurve. Bei Flieggeschwin- digkeiten, wie sie in der Flfissigkeits-Chromatographie tiblich Sind, werden hgufig starke Verzerrungen, minde- stens aber tailing-Bildungen beobachtet (Abb. 3 a). Da dies zur Vergr6Berung von Peakbreite w ffihrt, sinkt hierdurch die Analysenfrequenz. Dies gilt ganz beson- ders dann, wenn die Verweilstrecke wegen langsamer Reaktion vergr613ert werden muB. Die iiberwiegende Anzahl besonders der organischen Reaktionen geh6rt zu diesem Typ. Capillarleitungen lassen sich in diesen

Abb. 4. Schema der Apparatur

Ffillen nicht mehr einsetzen. Der Grund hierftir beruht letzten Endes auf dem Umstand, dab die Lfingsvermi- schung in durchstr6mten R6hren etwa mit dem Qua- drat des Durchmessers zunimmt [7]. Demgegentiber ist die L~ingsvermischung in gepackten Sfiulen innerhalb gewisser Grenzen, die mit der erzielbaren Packungs- qualit~it zusammenh/ingen, vom Kolonnendurchmes- ser unabhfingig.

Als weiterer Vorteil ergibt sich die Ausbildung eines Peaks, der einer Gaug-Kurve sehr nahe kommt und fast v611ig symmetrisch ist (Abb. 3 b). Trotz einer Erh6- hung des Totvolumens aufdas Dreifache gegentiber der Capillarleitung ist die Peakbreite w auf die H~ilfte gesunken.

Chromatographische S~iulen sind somit als Verweil- strecken den Capillarleitungen prinzipiell tiberlegen. Durch Anwendung verschiedener feiner Packungsma- terialien l~il3t sich die L/ingsvermischung in weiten Grenzen steuern. Dafiir mug allerdings auch ein Preis bezahlt werden: Der aufzuwendende Druck wird we- sentlich h6her. Billige Schlauchpumpen sind nicht mehr verwendbar. Es ergibt sich jedoch ein anderer Vorteil: Durch die Druckerh6hung 1/il3t sich die Bildung yon Gasblasen in der geheizten Verweilstrecke, welche die Detektion schwer st6ren wiirde, vermeiden. Dazu wird vorzugsweise zus~itzlich eine Bremssfiule verwendet, die auch noch die Detektorzelle unter Druck h/ilt. Ein Schema der Apparatur zeigt Abb. 4.

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w. Huber: Mechanisierung der photometrischen Analyse 359

II. Optimiernng des Systems Um ein bestimmtes Analysenproblem zu 16sen, mug das Verfahren optimiert werden. Ziele der Optimierung sind: M6glichst hohe Empfindlichkeit, m6glichst hohe Reproduzierbarkeit, m6glichst hoher Probendurchsatz pro Zeiteinheit, m6glichst geringer Reagentienverbrauch.

Probleme der Spezifit/it mfissen durch geeignete Auswahl der Methode gel6st werden.

Um diese Ziele zu erreichen, die z.T. im Wider- spruch zueinander stehen, k/Snnen folgende Parameter ge/indert werden:

Verweilzeit (Reaktionszeit) t o Einspritzmenge A V Pumpgeschwindigkeit S/iulenabmessungen d c, L Partikeldurchmesser d v.

a) Verweilzeit Die Verweilzeit innerhalb der Sfiule sollte einerseits so kurz wie m6glich sein, um rasche Ergebnisse zu erhal- ten, andererseits so lang wie n6tig, um ausreichende Ausbeuten bei der Farbreaktion zu erzielen. Hohe Ausbeuten ergeben hohe Nachweisempfindlichkeiten und bessere Reproduzierbarkeiten, weil sich kleine Abweichungen bei der Verweilzeit nur wenig auf das Ergebnis auswirken. Besonders wichtig sind hohe Aus- beuten, falls nicht eine Einzelkomponente, sondern Homologe mit gemeinsamer funktioneller Gruppe be- stimmt werden sollen. Da sich die Einzelkomponenten in der Regel in der Reaktionsf/ihigkeit unterscheiden, ist ein einigermagen quantitativer Umsatz in diesen Ffillen unbedingt notwendig. Die Verweilzeit stellt somit - bei einer zu ermittelnden Temperatur - eine experimentell gegebene Gr6Be dar. Sie wird am ein- fachsten durch systematische )~nderung der Pumpge- schwindigkeit ermittelt, evtl. mit zus/itzlicher Anderung der S/iule.

b) Einspritzmenge / Mischungsverhiiltnis

Die zweite zu wfihlende Gr6Be ist das Mischungsver- h/iltnis zwischen Reagens und Probe. Falls eine hohe Nachweisempfindlichkeit gefordert wird, muB es so klein wie m6glich sein. Der Wert von 1 dfirfte ein unterer Grenzwert sein, da andernfalls die Reagentien- konzentration nicht mehr ausreicht, um eine gute Farbstoffausbeute zu gewfihrleisten.

Das Mischungsverh/iltnis lfiBt sieh fiber die Ein- spritzmenge A V steuern. Bei der Auswertung fiber die Peakh6he ist das ffir die Reaktion wesentliche Mi- schungsverhfiltnis dasjenige am Peakmaximum. Im allgemeinen genfigt es, den Wert zu optimieren, ohne

ihn zahlenm/ii3ig festzulegen. Falls dies gewtinscht wird, kann er - bei quantitativ verlaufenden Reaktio- n e n - fiber den Extinktionskoeffizienten des geffirbten Produkts und die bekannte Konzentration der Testsub- stanz berechnet werden. Da sich w/ihrend der Verweil- zeit in der Sfiule der injizierte Substanzpfropfen mit dem angrenzenden Reagentienstrom vermischt (vgl. Abb. 1), kann man durch entsprechende Wahl der Einspritzmenge jedes beliebige Mischungsverhgltnis erzeugen. Bei zu grol3er Einspritzmenge ergibt sich, wie zu erwarten, eine Peakumkehr bei dem zu erwartenden Maximum, da hier die Reagentienkonzentration ffir die Reaktion nicht ausreicht. Es existiert somit eine maxi- male Einspritzmenge, die zu einer maximalen Empfind- lichkeit ffihrt. Dies ftihrt jedoch zu einer Vergr6i3erung der Peakbreite w und damit zu einer Verringerung des Probendurchsatzes pro Zeiteinheit. Die Optimierung der Einspritzmenge und damit des Mischungsverhfilt- nisses lfiBt sich somit - bei gegebenen Apparatepara- metern - einfach darstellen:

Ffir optimale Empfindlichkeit: Vergr613erung bis zur maximal erreichbaren Peak- h6he.

Ffir maximalen Probendurchsatz: Verkleinerung bis zur Erreichung einer noch brauch- baren Empfindlichkeit.

In der Praxis wird es in der Regel zu einem Kompromil3 zwischen beiden Forderungen kommen, zumal ein Faktor 2 bei der Nachweisempfindlichkeit meist ohne Bedeutung ist, wfihrend er beim Proben- durchsatz erheblich zu Buche schl/igt.

c) Pumpgeschwindigkeit Die optimale Pumpgeschwindigkeit ~b ist relativ einfach zu erhalten: Unter der Annahme, daB eine gewisse Verweilzeit erforderlich ist - andernfalls ergeben sich keine Probleme - sollte ein m6glichst kleiner Wert angestrebt werden. Er erlaubt die Anwendung kleiner Partikel als S/iulenffillung, weil dann keine hohen Drucke resultieren. Eine untere Grenze ergibt sich aus der Art der verwendeten Pumpe. Ein pulsarmer und f6rderkonstanter Betrieb ist um so schwieriger, je kleiner die F6rderungsgeschwindigkeit ist. Der kleinste in dieser Hinsicht befriedigende Weft ist somit der beste. Dies ffihrt gleichzeitig zu einem minimalen Reagentienverbrauch.

d) Siiulenabmessungen und Partikeldurchmesser Die gr6Bte Freiheit in der Wahl der Parameter besteht in den Mal3en der verwendeten Sfiule. Es soll angenom- men werden, dab die Vermischung zwischen Probe und Reagens schon stattgefunden hat. Die optimale Pump- geschwindigkeit �9 ist gegeben, ebenso die optimale

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360 Fresenius Z. Anal. Chem., Band 294 (1979)

Verweilzeit to. Das notwendige S~ulenvolumen Vc errechnet sich dann aus

~. t o V c -

z = Por6sit~t des Ffillmaterials, bei massiven Partikeln ~ 0,4, bei por6sen Partikeln ~ 0,75.

Da gleichzeitig die Beziehung vorliegt

d~ zr L V c - 4

d c = Durchmesser der Kolonne L = Lgnge der Kolonne

ergeben sich eine Vielzahl von m6glichen L6sungen ffir die Abmessungen der Kolonne. Die Auswahl der optimalen d~- und L-Werte 1/igt sich folgendermagen treffen: Die unerwfinschte Lgngsvermischung ist pro- portional der S/iulenl~nge und umgekehrt proportional der S~ulenqualit/it. Diese kann ausgedrfickt werden als

Bodenh6he H = L_, die mit steigender S/iulenqualit/it f /

kleiner wird. Der Weg zur Optimierung ist damit klar vorgezeichnet. Man benutzt eine m6glichst kurze S/iule mit grogem Querschnitt. Die Packungsqualit/it mul3 noch optimal sein. Daher daft ein Durchmesser von ca. 10 mm nicht wesentlich fiberschritten, ein solcher yon 3 mm nicht wesentlich unterschritten werden. Inner- halb dieser Grenzen werden kaum Unterschiede in der Packungsqualit/it beobachtet. Als minimale Lfinge kann man ca. 100 mm ansehen. Kfirzere S~iulen bringen keine Vorteile mehr, weil die Fehler an den Ubergangs- stellen relativ zu grog werden. Aus Abb. 5 lassen sich die S/iulenabmessungen ffir verschiedene Werte von Vc entnehmen. Bei einer angenommenen Pumpgeschwin- digkeit ~ von ca. 1 ml/min ergeben sich damit Verweil- zeiten von 1 - 40 rain, was einen grogen Arbeitsbereich ergibt.

Ffir die Bodenh6he H ist ein m6glichst kleiner Weft optimal. Erreicht werden kann dies in erster Linie durch eine Verkleinerung des Partikeldurchmessers d v. Diese ffihrt zu einer Druckerh6hung und kann daher wegen der begrenzten Pumpenleistung nicht beliebig weit getrieben werden.

Ftir die Optimierung der Gesamtanlage ergibt sich somit folgender Weg:

Zun/ichst wird empirisch die notwendige Verweilzeit = Reaktionszeit to festgestellt, unter Anwendung der optimalen Temperatur. Die minimale Pumpgeschwin- digkeit ~ ffir einen m6glichst rauscharmen Betrieb ist ein GerMeparameter, der allerdings etwas yon der verlangten Nachweisempfindlichkeit abhfingt. Aus to

l&o ooo I I l /

3 0 0 0 0 -

=

20000 -

10000 - -

0 I I 100 200 300 I-,00 ,500 600

Longe mm

Abb. 5. Ermittlung der optimalen S~iulenabmessungen in Abh/ingig- keit vom S/iulenvolumen V~ (massive Partikel)

und ~b wird V~ berechnet. Aus Abb. 5 werden mit Hilfe dieser Gr6Be die Sfiulenabmessungen ermittelt. Jetzt lggt sich auch der Partikeldurchmesser dp festlegen: So klein es der maximal anwendbare Pumpendruck (ein Gerfiteparameter) unter den angewandten Bedingun- gen zul/iBt. Die optimale Einspritzmenge hfingt yon den Anforderungen ab: GroB ffir optimale Empfindlich- keit, klein ffir maximalen Probendurchsatz.

Es ist mir ein Bedfirfnis, den Herren E. Fr6hlke und A. Harjung, die viel zur Ausarbeitung der Methode beigetragen haben, auch an dieser Stelle zu danken.

Literatur

1. Huber, W. : Vortrag beim Symposium ffir Mikrochemische Ar- beitsmethoden am 27. 5. 1977 in Davos: Mechanisierung der photometrischen Analyse mit den Bausteinen der Flfissigchroma- tographie. Deutsche Anmeldung 0. Z. 31840.

2. Nagy, G., Feh6r, Zs., Pungor, E. : Anal. Chim. Acta 52, 47 (1970) 3. Ruzicka, J., Hansen, E. H.: Anal. Chim. Acta 78, 145 (1975) 4. Ruzicka, J., Hansen, E. H.: Anal. Chim. Acta 99, 37 (1978)

(Ubersicht) 5. Skeggs, L. T.: Am. J. Clin. Pathol. 28, 311 (1957) 6. Stewart, K. K., Beeeher, G. R., Hare, P. E. : Anal. Biochem. 70, 167

(1976) 7. Taylor, G. : Proc. Royal Soc. (London) 219 A, 186 (1953) 8. White, V. R., Fitzgerald, J. M.: Anal. Chem. 44, 1267 (1972)

Eingegangen am6. September 1978