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Aus dem Institut für Neuroanatomie der Medizinischen Hochschule
und dem Zentrum für Systemische Neurowissenschaften Hannover
_________________________________________________________
Die molekulare Pathologie der neurodegenerativen Erkrankung Spinale
Muskelatrophie: das Survival of motoneuron Protein (SMN) und der
Rho-Kinase (ROCK)-Weg
Dissertation
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Naturwissenschaften - Doctor rerum naturalium –
(Dr. rer. nat.)
verliehen durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Anna-Friederike Nölle
aus Göttingen
Hannover, 2010
Betreuer: Prof. Dr. Peter Claus, Institut für Neuroanatomie, Medizinische Hochschule Hannover
1. Referent: Prof. Dr. Peter Claus, Institut für Neuroanatomie,
Medizinische Hochschule Hannover
2. Referentin: Prof. Dr. Susanne Petri, Abteilung für Neurologie, Medizinische Hochschule Hannover
3. Referent: PD Dr. Karl-Heinz Esser, Abteilung für Zoologie, Tierärztliche Hochschule Hannover
4. Referentin: Prof. Dr. Brunhilde Wirth, Institut für Humangenetik,
Köln (extern) Tag der Promotion: 09.10.2010 Diese Arbeit wurde durch das Georg-Christoph-Lichtenberg-Stipendium des Landes Niedersachsen gefördert.
Schriftenverzeichnis Originalarbeiten: 1) (The protein responsible for the pathogenesis of Spinal Muscular Atrophy is linked to the Rho-kinase pathway) Nölle et al., Publikation in Vorbereitung. 2) Fibroblast growth factor-2 regulates the stability of nuclear bodies. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Aug 4;106(31):12747-52. Bruns AF, van Bergeijk J, Lorbeer C, Nölle A, Jungnickel J, Grothe C, Claus P.
3) Mice lacking basic fibroblast growth factor showed faster sensory recovery. Exp Neurol. 2010 May; 223(1):166-72. Epub 2009 Jun 9 Jungnickel J, Haastert K, Grzybek M, Thau N, Lipokatic-Takacs E, Ratzka A, Nölle A, Claus P, Grothe C.
Vorträge: 1) Nölle A., van Bergeijk J., Claus P. Molecular pathology of the motoneuron disease spinal muscular atrophy. Kolloquium des Zentrums für Systemische Neurowissenschaften, Braunlage, 11/2008. 2) Nölle A., Grothe C., Niedenthal R., Claus P. The molecular pathology of the neurodegenerative disease spinal muscular atrophy: the role of profilin. 26. Arbeitstagung der Anatomischen Gesellschaft, Würzburg, 09/2009. Posterpräsentationen: 1) Nölle A., van Bergeijk J., O´mer J., Al Rayes S., Grothe C., Claus P. The survival of motoneuron (SMN) protein affects a pathway regulating the actin cytoskeleton. 25. Arbeitstagung der Anatomischen Gesellschaft, Würzburg, 09/2008. 2) Nölle A., van Bergeijk J., Claus P. The molecular pathology of the neurodegenerative disease spinal muscular atrophy. 8. Arbeitstagung der neurowissenschaftlichen Gesellschaft, Göttingen, 03/2009. 3) Nölle A., Grothe C., Niedenthal R., Claus P. The molecular pathogenesis of spinal muscular atrophy: Characterization of the interaction between SMN and the actin regulating protein Profilin Kolloquium des Zentrums für Systemische Neurowissenschaften, Braunlage, 09/2009. 4) Nölle A. 1,4; van Bergeijk J. 1; Niedenthal R. 2; Wirth B. 3; Grothe C 1,4; Claus P 1,4 A molecular link between SMN and the Rho-Kinase (ROCK) pathway 14. Jahrestagung der „Families of Spinal Muscular Atophy“(FSMA), Santa Clara, California, USA 06/2010.
Für meine Familie
Anna Nölle
Die molekulare Pathologie der neurodegenerativen Erkrankung Spinale
Muskelatrophie: das Survival of motoneuron Protein (SMN) und der Rho-Kinase
(ROCK)-Weg
Zusammenfassung
Die proximale Spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine autosomal rezessive Erkrankung, die
mit einer Degeneration der α-Motoneurone im Vorderhorn des Rückenmarks sowie im
Hirnstamm einhergeht. Die Degeneration wird verursacht durch eine Deletion oder Mutation
des Survival of motoneuron 1 (SMN1) Gens, die zu einer Reduktion des Proteinspiegels
führen. SMN wird ubiquitär exprimiert und nimmt in der Zelle viele verschiedene Funktionen
wahr. Das SMN-Protein lokalisiert perinukleär sowie in den Kernkörperchen (Cajal-
Körperchen und Gems) und vermittelt die Assemblierung von spleißosomalen RNA-
Proteinkomplexen (snRNPs). Neben dieser nukleären Funktion nimmt SMN eine wichtige
Rolle bei der Regulation des Zytoskeletts ein. Dies belegen Untersuchungen an
verschiedenen In-vitro- und In-vivo-Modellen der SMA, die Störungen beim axonalen
Wachstum und bei der Ausbildung der neuromuskulären Synapse (Neuromuscular junction,
NMJ) aufweisen. Unsere Arbeitsgruppe hat die Auswirkung von SMN auf das axonale
Wachstum bei differenzierten PC12-Zellen untersucht und festgestellt, dass SMN das
Neuritenwachstum über das Aktin-Zytoskelett in Anwesenheit von dem
Nervenwachstumsfaktors NGF beeinflusst (van Bergeijk et al., 2007). Gleichzeitig konnten in
SMN-defizienten PC12-Zellen Veränderungen eines Aktin-regulierenden Signalwegs, des
ROCK-Wegs, nachgewiesen werden.
In dieser Arbeit konnte belegt werden, dass der ROCK-Weg bei einem SMN-Mangel auch in
vivo differenziell reguliert wird. Dies zeigten die biochemischen Analysen von
Rückenmarkslysaten eines SMA-Typ-I-Mausmodells, bei denen eine Hyperphosphorylierung
von Profilin2 beobachtet werden konnte. Profilin2 wird über eine Interaktion mit ROCK2
phosphoryliert In PC12-Zellen konnte gezeigt werden, das die Phosphorylierung am
Serinrest 137 die Neuritenlänge beeinflusst. SMN besitzt eine Poly-Prolin-Domäne, die eine
direkte Interaktion mit Profilin2 vermuten ließ. Es konnte gezeigt werden. dass die Prolinreste
219-224 für die Interaktion von Bedeutung ist. In nachfolgenden Untersuchungen konnte
über einen neuen Protein-Protein-Interaktionsassay in vivo in einem zellulären System eine
direkte Bindung von SMN an Profilin2 nachgewiesen werden. Dieser Befund legt die
Annahme einer direkten molekularen Verbindung von SMN mit dem ROCK-Weg nahe. Um
einen Zusammenhang mit der SMA-Pathogenese herzustellen, wurden die in Patienten
gefundenen Punktmutationen W92S, E134K, S230L, Y272C, T274I näher untersucht.
Interessanterweise konnte festgestellt werden, dass die Profilin2-Bindung bei der SMN-
Mutante S230L gestört ist. In morphologischen Untersuchungen konnte nachgewiesen
werden, dass die Überexpression dieser Mutanten ähnlich wie bei einem Knock-Down von
SMN zu einer Hemmung des Neuritenwachstums führt. Mikroskopisch zeigten die Mutanten
keine veränderte Verteilung der SMN-Komplexe, was auf einen spezifischen Defekt der
Mutationen bei der Regulation des Neuritenwachstums hinweist.
Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass SMN in vitro und in vivo einen regulatorischen
Einfluss auf den ROCK-Weg ausübt. In Verbindung mit aktuell veröffentlichen Arbeiten, die
Veränderungen beim ROCK-Weg in SMN-defizienten Motoneuronen und deren Modifikation
durch eine ROCK-Inhibition in vivo beschreiben, deuten diese Ergebnisse auf den ROCK-
Weg als eine mögliche Zielstruktur für pharmakologische Interventionen bei der SMA hin.
Anna Nölle
The molecular pathogenesis of the neurodegenerative disease Spinal Muscular
Atrophy: the Survival of motoneuron (SMN) and the Rho-Kinase (ROCK) pathway
Summary
Proximal Spinal Muscular Atrophy (SMA) is an autosomal recessive disease accompanied by
a degeneration of the α-motor neurons in the anterior horn of spinal cord and in brainstem.
The degeneration is caused by a deletion or mutation of the Survival of motoneuron 1 (SMN1)
gene leading to a reduction in the SMN protein level. The ubiquitously expressed SMN gene
is involved in many different functions in the cell. The SMN protein is located in perinuclear
complexes as well as in nuclear bodies (cajal bodies and gems) mediating the assembly of
the spliceosomal RNA-protein complexes (snRNPs). Additionally to the nuclear function,
SMN plays a regulative role in actin dynamics. In different in vitro and in vivo SMA models,
defects of the axonal outgrowth and development of the neuromuscular junction has been
reported. Our group has demonstrated in PC12 cells that SMN regulates neurite outgrowth
via the actin cytoskeleton in presence of the nerve growth factor (NGF). Concomitantly,
changes of the actin regulating Rho-kinase (ROCK) pathway have been detected in this
cellular system. The present work confirmed a differential regulation of the ROCK pathway by
depletion of SMN in a severe SMA mouse model. Biochemical analysis of spinal cord lysats
showed a hyperphosphorylation of Profilin2. Profilin2 is phosphorylated by interacting with
ROCK2. In the present work the importance of phosphorylation of the serine residue 137 with
regard to neurite extension has been demonstrated. SMN exhibits a poly proline domain
putatively mediating a direct interaction with Profilin2. In the following studies a direct
interaction of SMN with Profilin2 has been detected using a new in vivo protein interaction
assay. Furthermore, the importance of the proline residues 219-224 for the Profilin2
interaction has been demonstrated. This finding points to a direct connection between SMN
and the ROCK pathway. Additionally, we analyzed mutations of SMA patient’s SMN with
regard to neuronal differentiation. In the morphological analysis, overexpression of the
mutants resulted in inhibition of the neurite outgrowth comparable to observations under
SMN-Knock-Down conditions. The EGFP-tagged mutants showed no differences in the
distribution of the SMN complexes indicating that inhibition of the neurite outgrowth is caused
by a specific defect. In summary, this work demonstrates a regulative role of SMN in vitro
and in vivo regarding the ROCK pathway and actin dynamics.
The outcomes of this study and the results of other groups, showing that the ROCK pathway
is altered in SMN depleted motor neurons and can be modified by ROCK inhibition, point to
the ROCK pathway as a potential target for pharmacological interventions.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ................................................................................................................ 1
1.1 Die Spinale Muskelatrophie – eine neurodegenerative Motoneuronen-Erkrankung .. 1
1.2 Tier- und In-vitro-Modelle der SMA........................................................................... 4
1.3 Die Anatomie der Motoneuronen .............................................................................. 6
1.4 Die Funktionen und Interaktionspartner des SMN-Proteins ...................................... 9
1.5 Der SMN Komplex und die snRNP-Biogenese ....................................................... 12
1.6 SMN und das Zytoskelett ....................................................................................... 14
1.7 Die Regulation des Aktin-Zytoskeletts .................................................................... 17
1.8 Zielsetzung der Arbeit ............................................................................................ 20
2 Material und Methoden ........................................................................................ 21
2.1 Zellkultur ............................................................................................................... 21
2.1.1 Beschichtung von Oberflächen ............................................................................... 21
2.1.2 Kultivierung der PC-Zellen .................................................................................... 21
2.1.3 Differenzierung von PC12-Zellen ........................................................................... 22
2.1.4 Die HEK293T-Zelllinie ............................................................................................ 22
2.1.5 Die NSC34-Zelllinie ................................................................................................ 23
2.1.6 Konservierung von Säugerzellen ........................................................................... 23
2.1.7 Kultivierung der PC-Zellen .................................................................................... 23
2.1.8 Konservierung von Säugerzellen ............................................................................ 23
2.1.9 Transfektion von Säugerzellen ............................................................................... 23
2.1.10 Lipofektion ............................................................................................................. 24
2.1.11 Nukleofektion ......................................................................................................... 24
2.1.12 Transfektion mit siRNA ........................................................................................... 24
2.1.13 Transfektion mit Polyethylenimin ............................................................................ 24
2.2 Molekularbiologische Methoden ............................................................................. 25
2.2.1 E.coli Zellen ........................................................................................................... 26
2.2.2 Erzeugung kompetenter Zellen .............................................................................. 26
2.2.3 Transformation ...................................................................................................... 26
2.2.4 Plasmidisolierung ................................................................................................... 26
2.2.5 Umklonierung von DNA-Sequenzen ...................................................................... 26
2.2.6 Restriktionsverdau ................................................................................................. 26
2.2.7 Auftrennung und Isolierung von DNA mittels Agarosegel-Elektrophorese .............. 27
2.2.8 Ligation .................................................................................................................. 27
2.2.9 Einfuhr neuer Schnittstellen mittels Polymerase-Kettenreaktion ............................. 27
2.2.10 Ortsgrichtete Mutagenese ...................................................................................... 28
2.2.11 Design der siRNA ................................................................................................... 29
2.3 Immunzytochemie .................................................................................................. 29
2.3.1 Immunzytochemische Markierungen ..................................................................... 29
2.3.2 Bildverarbeitung..................................................................................................... 30
2.3.3 Bestimmung der Anzahl der Kernkörperchen (CBs und Gems) ............................. 30
2.4 Gewinnung von Rückenmarksgeweben aus einem SMA-Typ-I-Mausmodells ........ 31
2.5 Biochemische Analysen ......................................................................................... 31
2.5.1 Proteinbestimmung ................................................................................................ 31
2.5.2 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) .................... 32
2.5.3 Isoelektrische Fokussierung ................................................................................... 32
2.5.4 Western Blot ......................................................................................................... 33
2.5.5 Nachweis der Chemiluminescence-Reaktion mit einem Röntgenfilm ..................... 34
2.5.6 Entfernen der Antikörper von einer Nitrozellulosemembran .................................... 34
2.5.7 Densitometrie von Chemilumineszenz-Signalen..................................................... 34
2.5.8 Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen mit dem TRS-System ........................ 34
2.6 Statistische Auswertung ......................................................................................... 35
2.7 Material .................................................................................................................. 35
2.7.1 Zellkulturmedien ..................................................................................................... 36
2.7.2 Puffer ..................................................................................................................... 37
2.7.3 Oligonukleotide ...................................................................................................... 38
2.7.4 Plasmide ................................................................................................................ 40
2.7.5 Antikörper............................................................................................................... 41
2.7.6 Geräte .................................................................................................................... 42
2.7.7 Chemikalien ........................................................................................................... 42
3 Ergebnisse ............................................................................................................ 44
3.1 Der Rho-Kinase (ROCK)-Weg ist bei SMA in vivo verändert .................................. 44
3.2 Die Aktivität von ROCK ist bei SMN-Überexpression herunterreguliert .................. 46
3.3 Die NSC34-Zelllinie als In-vitro-Modell der SMA .................................................... 47
3.4 Charakterisierung von NSC34-Zellen hinsichtlich der Synaptogenese ................... 49
3.5 Punktmutanten des SMN-Proteins lokalisieren im Zellkern in NSC34-Zellen .......... 52
3.6 SMN-Mutanten beeinflussen das Wachstum neuronaler Fortsätze ........................ 55
3.7 Die Mutante W92S beeinflusst die Verteilung und die Lokalisation von Kernkörperchen...................................................................................................... 56
3.8 Profilin2 und SMN: die molekulare Brücke von SMN zum ROCK-Weg .................. 59
3.8.1 Ein neuer In-vivo-Protein-Interaktionsassay zeigt die Bindung von SMN
an Profilin2 ............................................................................................................. 59
3.8.2 Eine Poly-Prolin-Sequenz ist für die Bindung von Profilin2 an SMN verantwortlich 64
3.8.3 Inhibition und Überexpression von ROCK moduliert die Profilin-SMN Bindung nicht ..
............................................................................................................................... 66
3.8.4 Eine bei Patienten gefundene Mutation verringert deutlich die Bindung von Profilin an SMN .................................................................................................................. 67
3.9 Die Phosphorylierung von Profilin2 reguliert das Wachstum von Neuriten.............. 68
3.10 Die SMN-Punktmutanten bilden Oligomere mit dem Wildtyp .................................. 69
4 Diskussion ............................................................................................................ 72
4.1 Der Rho-Kinase (ROCK)-Weg ist in vivo verändert ................................................ 73
4.2 SMN beeinflusst die ROCK-Aktivität ....................................................................... 74
4.3 NSC34-Zelllinie stellt ein geeignetes SMA-In-vitro-Modell dar ................................ 76
4.4 Charakterisierung der NSC34-Zelllinie ................................................................... 77
4.5 SMN-Patienten-Mutationen führen spezifisch zu einem axonalen Defekt ............... 79
4.6 SMN interagiert über eine direkte Bindung mit dem ROCK-Weg ............................ 80
5 Literaturverzeichnis ............................................................................................. 87
6 Danksagung ........................................................................................................ 106
7 Lebenslauf .......................................................................................................... 107
Abkürzungsverzeichnis AAV9 Adeno-associated virus 9 ADP Adenosindiphosphat ADF Actin depolymerizing factor ALS Amyolateralsklerose APS Ammoniumperoxodisulfat a-SMN axonale SMN-Isoform AS-Reste Aminosäure-Reste ASO Antisene-Oligonukleotide ATP Adenosintriphospat BCA-Assay Bicinchoninsäure-Assay bp base pairs, Basenpaare BSA bovine serum albumin, Rinderserumalbumin C3 Toxin aus Clostridium botunlinum CB Cajal-Körperchen Cdc42 Cell division cycle 42 CP Capping protein D.rerio Danio rerio DAPI 4’,6-Diaminphenylindol DMKP Dystrophia myotonica protein kinase DMEM Dulbecco`s modified eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphate DsRed2 rot-fluoreszierendes Protein aus Discosoma striata DTT Dithiothreitol ECL Enhanced Chemiluminescence E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat EGFP Enhanced green fluorescent protein EGTA Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylethyl)-tetraacetat ER Endoplasmatisches Retikulum ESCs Embryonic stem cells EWS Erwing’s sarcoma protein F-Aktin filamentöses Aktin FF fast twitch, fatigable FR fatigue restistant G-Aktin globuläres Aktin GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase GDNF Glial cell line-derived neurotrophic factor GDP Guanosindiphosphat GEF Guanine nucleotide exchange factor GTP Guanosintriphosphat HDAC Histon deacetylase HEK293T Human embryonic kidney cells
hnRNP heterogenous Ribonucleoprotein IP Immunpräzipitation iPSCs induced Pluripotent stem cells LB Luria broth LIMK Lin11-Isl1-Mec3-Kinase LSm- Like Sm protein MBS Subunit of myosin phosphatase MAPK Mitogen activated protein kinase mDia Mammalian homolog of Drosophila diaphanous MIM Mendelian inheritance in man, Datenbanksystem MLC Myosin light chain MLP Myosin light chain phosphatase MRCK Myotonic dystrophy kinase-related CDC42-binding
kinase alpha mRNA Boten-RNA, messenger RNA M. musculus Mus musculus NBD Nukleinsäure-bindende Domäne NT2 Teratokarzinom-Zellen NMJ Neuromuscular junction NGF Nervenwachstumsfaktor NSC34 Motoneuronenzelllinie aus der Maus OD Optische Dichte (bei einer bestimmten Wellenlänge) p75 Neurotrophin-Rezeptor für NGF PAK p21 activated kinase PBS Phosphate buffered saline PC12 Phaechromocytoma cells, PEG Polyethylenglykol PEI Polyethylenamin PFA Paraformaldehyd PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat PKC Proteinkinase-C PKN Proteinkinase-N PLL Poly-L-Lysin PND Postnatal day PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid PRMT5 Proteinmethyltransferase-5 pSupp.control pSuppressor-Vektor ohne Insert pSupp.SMN pSuppressor-Vektor kodiert eine gegen SMN mRNA
gerichtete shRNA Rac1 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 RhoA Ras-homologous member A RIPA-Puffer Radioimmunpräzipitationspuffer RNA Ribonukleinsäure ROCK RhoA-bindende Kinase RT Raumtemperatur S slow-twitch, fatigue resistant SDS Natriumdodecylsulfat SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese SHH Sonic hedgehog
shRNA Short hairpin RNA SIP1 SMN interacting protein 1 siRNA Small interfering RNA SMA Spinale Muskelatrophie/proximale Spinale
Muskelatrophie SMARD Spinal muscular atrophy with respiratory distress SMN Suvival of motoneuron (Protein/Gen) Sm-Protein Smith-Antigen-Protein snoRNA small nucleolar RNA snoRNP small nucleolar Ribonucleoprotein snRNA small nuclear RNA snRNP small nuclear ribonucleoprotein SPN Snurportin SUMO small ubiquitin-related modifier SV2 Synaptic vesicle proteins 2 SV40 Simian virus 40 TBE TRIS-Borat-EDTA TBST Tris-gepufferte Kochsalzlösung mitTriton-X-100 TRS Trans-Sumoylierungssystem TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin TMG-CAP Trimethylguanosin-Rest am 5’ einer RNA TrkA Rezeptortyrosinkinase für NGF TRS trans-Sumoylierungsystem UBC9 Ubiquitin-like protein SUMO-1 conjugating enzyme U snRNP Uridine-rich small nucleolar ribonucleoprotein v/v volume per volume VASP Vasodilator stimulated phosphoprotein w/v weight per volume WASP Wiskott-Aldrich-Syndrom-Protein WAVE WASP-family prolin-homologous protein WD-Wiederholungen Tryptophan-Asparaginsäure-Wiederholungen wt Wildtyp x g Erdbeschleunigung Y27632 ROCK-Inhibitor YG-Box Tyrosin-Glycin-reiche Sequenz X.laevis Xenopus laevis ZPR1 Zinc finger protein 1
Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Die Spinale Muskelatrophie – eine neurodegenera tive Motoneuronen-
Erkrankung
Spinale Muskelatrophien (SMAs) stellen eine Gruppe von erblichen neurodegenerativen
Erkrankungen dar, die durch einen fortschreitenden Untergang der Motoneurone im
Rückenmark und teilweise auch des Hirnstamms charakterisiert sind (Morrison und Harding,
1994). Der Verlust der Motoneurone wird begleitet von einer Atrophie der Muskeln, die beim
Patienten zu Muskelparesen, Muskelhypotonien und Muskelschwächen führen. Die SMAs
haben unterschiedliche genetische Ursachen. Die proximale Spinale Muskelatrophie wird
autosomal rezessiv vererbt und unterscheidet sich von der dominant vererbten Spinalen
Muskelatrophie mit Atemnot (Spinal muscular atrophy with respiratory distress, SMARD)
oder der X-chromosomalen Spinalen Muskelatrophie, die auch Kennedy‘s Disease genannt
wird (Grohmann et al., 2001; La Spada et al., 1991). Bei 90 % der Erkrankungen handelt es
sich um die proximale SMA. Mit einer Inzidenz von 1:6000-1:10000 ist die SMA nach der
zystischen Fibrose die zweithäufigste Erbkrankheit der kaukasischen Bevölkerung, die im
Kindesalter zum Tode führt (Pearn et al., 1980; Wirth et al., 2000, Feldkötter et al., 2002).
Jeder 35. der kaukasischen Bevölkerung ist ein Überträger der SMA (Feldkötter et al., 2002,
Cusin et al., 2003).
Bei der proximalen Muskelatrophie führt die progressive Degeneration der α-Motoneurone im
Vorderhorn des Rückenmarks zur symmetrischen Hypotonie und Atrophie der
Skelettmuskulatur (Crawford and Pardo, 1996). Dabei sind überwiegend die proximalen
Muskeln betroffen (Batten und Holmes 1912; Dubowitz 1999; Hirtz et al. 2005). Die SMA
wurde erstmals Ende des 19 Jh. in Veröffentlichungen der Neurologen Guido Werdnig und
Johann Hoffmann beschrieben (Werdnig 1891; Hoffmann 1893, 1897, 1900a, 1900b).
Ihr Beobachtungen wurden bald darauf durch die histochemischen Untersuchungen von
Batten und Holmes belegt (Batten und Holmes, 1912). In Rückenmarks-Präparaten von
SMA-Patienten konnten degenerierende α-Motoneurone im Vorderhorn des Rückenmarks
und atrophische Muskelfasern identifiziert werden. Gleichzeitig wurden Inseln mit
hypertrophen Muskelfasern gefunden (Batten and Holmes, 1912). Kugelberg und Welander
beschrieben Mitte der 1950er Jahre eine zweite Form der SMA, die mit einem milderen
Verlauf der Erkrankung einhergeht (Kugelberg und Welander, 1956). Nachfolgend wurde die
Einleitung
2
Erkrankung in drei verschiedene Typen unterschieden (Byers and Banker 1961, Dubowitz
1964). Die erste Klassifizierung orientierte sich lediglich an dem Zeitpunkt des Einsetzens
der Symptome. Heute wird die Erkrankung nach dem Einsetzen der Symptome, dem
Schweregrad der Muskelschwäche und dem Todeszeitpunkt in vier verschiedene Typen
unterschieden (Pearn 1980; Munsat, 1991; Munsat und Davies 1992; Zerres und Rudnik-
Schoneborn 1995).
Der SMA-Typ-I, auch Werdnig-Hoffmannsche Erkrankung oder infantile SMA genannt
(Mendelian inheritance in man, MIM #253300), manifestiert sich in den ersten sechs
Lebensmonaten mit proximalen Muskelschwächen, die sich in mangelnder Kopfkontrolle,
Bewegungsarmut und schwer eingeschränkter Atemfunktion äußern. Die Kinder lernen nie
sitzen („Non sitters“). Bulbäre Denervierungen verursachen Faszikulationen der Zunge,
Komplikationen beim Schlucken, Saugen und Husten. Eine schwache Interkostalmuskulatur
führt zu Lungeninfektionen, Lungenversagen und einem frühen Tod (<10 Jahre). Der SMA-
Typ-II („intermediate“, MIM #253550) beschreibt einen gemäßigten Verlauf der Erkrankung
mit schwächer ausgeprägten Symptomen, die im Alter von 7 bis 18 Monaten einsetzen.
Die Kinder erlernen das Sitzen („Sitters“), sind jedoch nicht in der Lage, eigenständig zu
gehen. Die Lebenserwartung übersteigt selten das Jugendalter. SMA-Typ-III (Kugelberg-
Welander-Erkrankung, juvenile SMA, MIM #253400) bezeichnet einen milderen Verlauf mit
einer nahezu normalen Lebenserwartung. Die Kinder erlernen sitzen und gehen („Walkers“).
Die Erkrankung manifestiert sich im Alter von einem Jahr bis 30 Jahren; ab dem Jugendalter
sind die Patienten meistens auf einen Rollstuhl angewiesen. SMA-Typ-IV (adulte SMA, MIM
#271150) stellt eine relativ seltene Spätform der SMA dar.
Bei einem Verdacht auf SMA dienten ursprünglich elektromyografische Ableitungen und
Untersuchungen von Muskelbiopsien der Differentialdiagnose (Emery et al., 1979; Buchthal
und Ohlsen, 1970). Im Elektromyogramm zeigt das Muskelpotential bei allen SMA-Typen
Kennzeichen einer neurogenen Erkrankung. Charakteristisch sind eine erhöhte Amplitude,
eine verlängerte Dauer und ein polyphasischer Verlauf des Endplattenpotentials. Gleichzeitig
treten reguläre Spontanaktivitäten, Fibrillationen oder gelegentlich auch Faszikulationen auf.
Muskelbiopsien von SMA-Patienten zeigen atrophische Muskelfasern mit Inseln von
hypertrophen Muskelfasern (Buchthal und Ohlsen, 1970). Nach Bekanntwerden der
genetischen Ursache der Erkrankung wurde die SMA anhand einer Genanalyse
diagnostiziert. In den 1990er Jahren gelang es zunächst, das Auftreten der SMA mit dem
Genort 5q11.2-q13.3 zu verbinden (Brzustowicz et al., 1990; Melki et al., 1990). Fünf Jahre
später wurde die Deletion oder Mutation des Survival of motoneuron 1 Gens (SMN1) als
Ursache der SMA identifiziert (Lefebvre et al., 1995). Das SMN1-Gen umfasst neun Exons
sowie fünf Introns und kodiert mit einem Stopcodon am Ende von Exon 7 für das 38
Einleitung
3
Kilodalton-große SMN-Protein, bestehend aus 294 Aminosäureresten (AS-Resten). SMN ist
von der Spalthefe bis zum Menschen hoch konserviert und wird nahezu ubiquitär exprimiert
(Paushkin et al., 2000; Miguel-Aliaga et al., 1999). Neben dem telomeren SMN1-Gen
befindet sich auf dem Chromosomabschnitt 5q13 eine zentromere Genkopie, das SMN2-
Gen. Das SMN2-Gen unterscheidet sich durch fünf Punktmutationen von SMN1, wobei
lediglich die C-zu-T-Transition im Exon 7 in den kodierenden Bereich fällt (Lefebvre et al.,
1995; Burglen et al., 1996, Monani et al., 1999, Lorson et al., 1999). Diese Mutation
verhindert die Bindung des Splicing enhancers SF2/ASF im SMN2-Gen und führt mit einer
Wahrscheinlichkeit von 90 % zu einer inkorrekt gespleißten mRNA und zum Fehlen des
Exon 7. Es wird ein trunkiertes SMN-Protein gebildet (SMN2∆7), dessen Stabilität und
Funktionalität stark beeinträchtigt sind (Lorson und Androphy, 2000, Cartegni et al., 2002). 10
% der SMN2-mRNA wird korrekt gespleißt und in das Volllänge-SMN translatiert (Lefebvre et
al., 1995; Lorson et Androphy., 2000).
96 % der SMA-Typ-I-, 94 % der SMA-Typ-II- und 86 % der Typ-III-Patienten weisen eine
Deletion des SMN1-Gens auf (Wirth, 2000). Dabei bestimmt die Anzahl der im Genom
vorhandenen SMN2-Kopien den Schweregrad der Erkrankung (Campbell et al. 1997; Harada
et al., 2002, Feldkötter et al., 2002). Die meisten SMA-Typ-II-Patienten besitzen zwei bis
drei, SMA-Typ-III-Patienten vier bis fünf Kopien des SMN2-Gens. Das Fehlen beider
SMN-Gene, SMN1 und SMN2, konnte nur in Überträgern gefunden werden und ist
vermutlich im frühen Embryonalstadium letal (Burghes, 1997). Neben dem Verlust des
SMN1-Gens führen zu etwa fünf Prozent auch kleine Mutationen und Punktmutationen zur
Ausprägung einer SMA (Burghes., 1997, Sun et al., 2005; zur Übersicht: Burghes und
Beattie, 2009). In diesen Fällen bestimmen neben der SMN2-Kopienzahl auch die Lage und
Art der SMN-Mutation den Schweregrad der Erkrankung. Es konnten allerdings auch einige
seltene Fälle beobachtet werden, bei denen der Verlust des SMN1-Gens trotz niedriger
SMN2-Kopienzahl nicht zur Ausprägung einer SMA führte (Cobben et al., 1995; Hahnen et
al., 1995). 2008 wurde bei diesen Patienten das Protein Plastin3 als SMA-Modifier
identifiziert (Oprea et al., 2008).
Einleitung
4
1.2 Tier- und In-vitro-Modelle der SMA
Es existieren verschiedene Tiermodelle für die SMA, die nach der Identifizierung des
SMN-Gens generiert wurden und seitdem zur Aufklärung des Pathomechanismus
herangezogen werden (zur Übersicht: Schmid und DiDonato, 2007). Da sich die
Genduplikation des SMN-Gens aus evolutionärer Sicht spät ereignete, besitzen die in der
Molekularbiologie verwendeten Modellorganismen nur ein SMN-Gen. Eine Deletion des
SMN-Gens ist bei diesen Tieren letal. Zur Etablierung eines SMA-Tiermodells werden daher
verschiedene Techniken zur Herabsetzung des SMN-Spiegels angewandt. Beim Zebrafisch
(D rerio) und dem Fadenwurm (C. elegans) werden Antisense-Oligonukleotide eingesetzt,
die gegen die SMN-mRNA gerichtet sind. Beim Zebrafisch führt dies zu Motoneuron-
spezifischen Störungen beim axonalen Wachstum und bei der Wegfindung (McWhorter et al.,
2003; Carrel et al., 2006). C.elegans entwickelt bei einer niedrigen SMN-Konzentration
Defekte bei der Fortbewegung und zeigt eine verkürzte Lebensdauer (Briese et al., 2009).
Beim Drosophila (D.melanogaster)-SMA-Modell liegt eine Spontanmutation im SMN-Gen vor,
welche die Aktivität des SMN-Proteins einschränkt (Chan et al., 2003). Die Fliegen sind
flugunfähig und zeigen Störungen bei der Ausbildung der neuromuskulären Synapse
(Neuromuscular junction, NMJ) Bei der Maus (M. musculus) wurden verschiedene Strategien
zur Herabsetzen des SMN-Spiegels verfolgt. 1997 versuchten Schrank et al. erstmals eine
SMN-Knockout-Maus zu entwickeln (SMN-/-). Die Blastomeren waren jedoch vor Implantation
in das Muttertier letal. Heterozygote Mäuse SMN+/- überleben hingegen bis zu sechs Monate
und bilden lediglich sehr abgeschwächte Symptome aus (Jablonka et al., 2000). Die ersten
SMA-Mausmodelle für einen schwereren Verlauf der Erkrankung wurde durch das
Einbringen des humanen SMN2-Gens in einen SMN-/- Hintergrund generiert (Hsieh-Li et al.,
2000; Monani et al., 2000). SMN-/- Mäuse mit zwei SMN-Transgenen zeigen Symptome, die
denen der SMA-Typ-I-Patienten gleichen (Monani et al., 2000). Durch ein zusätzliches
Einbringen eines SMN∆7-Transgens konnte der SMN-Proteinspiegel leicht angehoben und
die Symptome etwas abgeschwächt werden (Mausmodell für SMA-Typ-I, Le et al., 2005).
Bei einem weiteren Modell wurde ein verändertes SMN1-Gen mit der Mutation A2G, die im
SMA-Patienten identifiziert worden ist, in den SMA-Typ-I-Hintergrund eingebracht (Monani,
2003). Dies führte bei der Maus zur Ausprägung von SMA-Typ-III-ähnlichen Symptomen.
Das Einbringen eines SMN∆7- bzw. SMN1A2G-Transgens in einen SMN-/- Hintergrund kann
jedoch die Letalität des Embryos nicht verhindern. Acht transgene SMN2-Kopien dagegen
führen zur vollständigen Wiederherstellung des Wildtyp-Phänotyps (Monani, 2000).
In jüngerer Zeit wurde ein SMA-Typ-II-Mausmodell entwickelt, dass auf einer im endogenen
SMN eingeführten Mutation in Exon 7 beruht (SMN2B/-). Des Weiteren wurden Mausmodelle
Einleitung
5
hergestellt, bei denen SMN gewebespezifisch über das Cre-Lox-System im Muskel bzw. in
den Motoneuronen ausgeschaltet worden ist (Frugier et al., 2000; Cifuentes-Diaz et al.,
2001). Bei allen Mausmodellen wurden eine Degeneration der Motoneurone und
Muskelschwächen festgestellt (Monani, 2005).
Für die SMA ist bis heute keine Therapie verfügbar. Die beschriebenen Modelle,
insbesondere die Mausmodelle, haben einen hohen Stellenwert bei der Entwicklung neuer
Therapieansätze. Es werden verschiedene Strategien verfolgt, um neue Substanzen oder
Techniken zu entwickeln, die gegen die SMA eingesetzt werden können. Dabei stellt das
SMN2-Gen ein günstiges Target für eine Manipulation des SMN-Spiegels dar.
Die Anwendung von Histon-Deazetylase (Histon deacetylase, HDAC)-Hemmer führt
unspezifisch zur Erhöhung der Promoteraktivtiät des SMN2-Gens (Hahnen et al., 2006).
Einige der HDAC vermitteln zusätzlich die Korrektur beim Spleißen der SMN2-mRNA. Dazu
gehören Nariumphenylbutyrat, Valproinsäure, SAHA und M244 (Hahnen et al., 2006).
Natriumbutylrat und Valproinsäure sind in klinische Studien der Phase I/II eingegangen
(Swoboda et al., 2007). Den bisherigen Ergebnissen zufolge konnten jedoch bei ihrer
Anwendung nur geringe Verbesserungen der Symptome erzielt werden. Weitere
Substanzen, darunter Quinazolin, Salbutamol und Hydroxyurea, erhöhen die
SMN-Konzentration und werden für eine Therapie in Betracht gezogen (Grzeschik et al.,
2005; Wirth et al., 2006, Angelozzi et al., 2008; Thurmond et al., 2008). Einige dieser
Substanzen interagieren spezifisch mit dem SMN2-Promoter. Antisense-Oligonukleotide
(ASOs), die zur SMN2-mRNA komplementär synthetisiert worden sind, erhöhen den
SMN-Spiegel durch Korrektur des Spleißvorgangs beim SMN2-Transkript (Hua et al., 2008).
Weitere Strategien zur Erhöhung des SMN-Spiegels betreffen die Translation der
SMN-mRNA oder die Stabilität des SMN-Proteins (Grimmler et a., 2005; Wolstendroft, 2005).
Anhand von In-vitro-Screenings aus Patienten-Fibroblasten wurde eine große Zahl von
Substanzen ermittelt, die eine Anhebung des SMN-Spiegels bewirken. Jedoch scheiden viele
für eine Anwendung beim Patienten aus, da sie entweder toxisch sind und/oder die Blut-Hirn-
Schranke nicht überwinden können (Wirth et al., 2006).
Ein weiterer Ansatz verfolgt die Transplantation von Motoneuronen, die aus pluripotenten
Stammzellen generiert wurden. Diese Methode führt im SMN∆7-Mausmodell zu einer
verbesserten Motorik und längerem Überleben. Der Effekt ist vermutlich auf die Sezernierung
neurotropher Faktoren zurückzuführen, die eine neuroprotektive Wirkung auf die
Motoneurone ausüben könnten (Corti et al., 2010). In den letzten Jahren wurde die
Gentherapie von mehreren Gruppen vorangetrieben, die verschiedene Versionen des
Adenovirus zur Transfektion der Motoneurone mit dem SMN-Gens verwendeten (Azzouz et
al., 2004; Foust et al., 2010).
Einleitung
6
Der Arbeitsgruppe um Foust gelang es, 60 % der Motoneurone im Mausmodel durch eine
intravenöse Injektion des Adeno-associated virus 9 (AAV9) mit SMN zu transduzieren und
den SMA-Phänotyp abzuschwächen (Foust et al., 2010). Dabei zeigte sich, dass durch eine
frühe Anwendung wesentlich bessere Erfolge erzielt werden konnten. Neben SMN als
direktes Target können auch pharmakologische Interventionen mit Signalwegen, die bei der
SMA verändert sind, als Therapiemöglichkeit in Betracht gezogen werden. Ein wichtiger
Kandidat stellt dabei der Rho-Kinase (ROCK)-Weg dar, der die Aktin-Dynamik reguliert und
bei SMN-Defizienz verändert ist (Sharma et al., 2005; van Bergeijk et al., 2007; Bowerman et
al., 2007, 2009 und 2010).
1.3 Die Anatomie der Motoneuronen
Ein einzelnes Motoneuron innerviert eine Muskelfasergruppe und bildet mit ihr zusammen
eine funktionelle Einheit, die sogenannte motorische Einheit (zur Übersicht: Kanning et al.,
2010). Das Motoneuron ist eine multipolare Nervenzelle, die über den Dendritenbaum
exzitatorische und inhibitorische Potentiale von den afferenten Fasern der Muskelspindel
(Gruppe-Ia- und II-Afferenzen), Interneuronen oder dem ersten Motoneuron empfängt und
über die Synapse mit der Muskelfaser in Verbindung steht. Die neuromuskuläre Endplatte
(NJM) ist als Modell für die synaptische Übertragung zwischen Motoneuron und Synapse
besonders durch die Untersuchungen an Drosophila gut erforscht (Keshishian et al, 1996).
Die Muskelfaser wird während der Embryogenese zunächst vielfach innerviert.
Durch apoptotische Vorgänge werden postnatal ein Teil der Motoneurone eliminiert, so dass
eine Muskelfaser nur Eingänge von einem einzigen Motoneuron empfängt. Alle Moto-
neurone, die einen Muskel innervieren, gehören dem gleichen Motoneuron-Pool an. Dieser
beinhaltet verschiedene Typen von Motoneuronen und variiert je nach Muskelgruppe in
seiner Zusammensetzung. Gleichzeitig besitzen die Motoneuronen eines Pools gemeinsame
molekulare und morphologische Eigenschaften, die während der Entwicklung unter
Beteiligung der Hox-Gene induziert werden (zur Übersicht: Dasen and Jessell, 2009).
Die Motoneurone werden zum einen nach ihrem Zielort in α-, β- und γ-Typ klassifiziert.
α-Motoneurone innervieren die Skelettmuskulatur (extrafusal); die kleineren und
unverzweigteren γ-Motoneurone hingegen kontrollieren die Größe der Muskelspindel
(intrafusal) (Hunt und Kuffler, 1951; Kuffler et al., 1951). Die wenig charakterisierten
β-Motoneurone projizieren sowohl extra- als auch intrafusal. Die verschiedenen Typen, die
während der Entwicklung aus der gleichen Vorläuferzelle hervorgehen, unterscheiden sich in
ihren morphologischen, physiologischen und konnektiven Eigenschaften. Die bei SMA
betroffenen α-Motoneurone sind große, stark myelinisierte und vielfach verzweigte Zellen.
Einleitung
7
Bis jetzt konnte nicht geklärt werden, welche Eigenschaften die α -Motoneurone bei einem
verminderten SMN-Spiegel anfälliger als die anderen Zelltypen machen. Während der
Entwicklung können die beiden Populationen morphologisch nicht eindeutig voneinander
unterschieden werden. Postnatal konnte der Transkriptionsfaktor Err3 den γ-Motoneuronen
und die Expression von NeuN den α-Motoneuronen zugeordnet werden (Friese et al., 2009;
Shneider et al., 2009). Jedoch wurden noch keine Markergene identifiziert, die eine
Unterscheidung der beiden Motoneuronenarten im Embronalstadium erlauben. Es wäre
denkbar, dass die Innervierung mit den jeweiligen Targets Muskelspindel bzw. Skelettmuskel
erst die Differenzierung in verschiedene Subtypen induziert (Friese et al., 2009). Der Glial
cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) wird von der Muskelspindel sezerniert und
unterstützt spezifisch das Überleben der γ-Motoneurone. Ob GDNF postnatal die Expression
von Err3 vermittelt, bleibt noch zu erforschen (Dasen und Jessel, 2009).
Die α-Motoneuronen innervieren unterschiedliche Arten von Skelettmuskelfasern, die je nach
Expression der jeweiligen Myosin-Isoform langsam oder schnell ermüden (Muskelfaser Typ-I
oder -II). Daher werden die α-Motoneurone in einer weiteren Unterscheidung nach ihren
kontraktilen Eigenschaften klassifiziert (Burke et al., 1973).
Man unterscheidet:
1) schnell kontrahierende, schnell ermüdende Fasern (FF: fast twitch, fatigable)
2) schnell kontrahierende und ermüdungsresistente Fasern (FR: fast twitch,
fatigue resistant)
3) langsam kontrahierende und ermüdungsresistente Faser (S: slow-twitch,
fatigue resistant)
Die Größe der Zellkörper und Dendriten, die Verzweigung und die Größe der
präsynaptischen Endigungen nehmen von dem S-Typ zum FF-Typ zu. Allgemein gilt, dass
bei einer graduierten Muskelkontraktion zunächst die kleinen Fasern aktiviert werden und
später die FF-Fasern hinzukommen. Bei der SMA degenerieren die FF-Fasern zuerst, was
vermutlich zunächst ein Ausprossen der S-Fasern zur Folge hat, bis diese ebenfalls zu
Grunde gehen (Dubowitz 1978; Kanda und Hashizume 1989). Auch im ALS-Mausmodell
(SOD1-Maus) und beim natürlichen Alterungsprozess beim Menschen kann diese Abfolge
beobachtet werden (Hashizume et al., 1988; Hirofuji et al., 2000; David et al., 2007).
Was macht die FF-Fasern jedoch anfälliger? Genexpressions-Analysen der verschiedenen
Subtypen trugen bisher nicht zur Aufklärung des selektiven Untergangs bei. Lediglich
postnatal konnte gefunden werden, dass die Expression des Synaptic vesicle proteins 2
(SV2) auf die langsamen S-Fasern begrenzt ist (Chakkalakal et al., 2008). Im Gegensatz zu
Einleitung
8
den α- und γ-Motoneuronen sind jedoch die Grenzen zwischen den α-Subtypen weitgehend
fließend.
Ein Motoneuron-Pool umfasst Motoneurone aller Untertypen und ist wiederum in eine
Motor-Säule integriert. Eine Motor-Säule ist hoch stereotypisch aufgebaut. Dabei liegt die
Topographie in der entwicklungsbiologischen Herkunft und der späteren Funktion begründet
(Dasen und Jessel, 2009). Motoneurone der medialen Säule innervieren die
Rumpfmuskulatur und die proximale Muskulatur, die für die Körperhaltung und
Lungenaktivität verantwortlich ist. Motoneurone der lateralen Säule hingegen innervieren die
Gliedmaßen und regulieren die Feinmotorik. Bei der SMA ist überwiegend die proximale
Muskulatur betroffen (Batten und Holmes 1912; Dubowitz 1999; Hirtz et al. 2005). Dies
machen auch die histochemischen Befunde deutlich, die besonders einen Verlust der
Motoneurone im medialen Vorderhorn beschreiben. Auffälligerweise sind die Fazialnerven,
die okulomotorischen Nerven, die phrenischen Nerven und die Nerven des Onufschen Kerns
bei den SMA-Patienten nicht betroffen (Iwata et al 1978., Hirano et al., 1978). Welche
neuroprotektiven Eigenschaften diese Motoneuronen oder deren Umgebung bei der SMA
besitzen, ist noch nicht bekannt.
Motoneurone besitzen die längsten Axone im Nervensystem und sind daher besonderen
Anforderungen ausgesetzt. Die Zellen müssen den Transport von RNAs, Mitochondrien und
Proteinen zum distal gelegenen Axonende bewerkstelligen und besitzen aufgrund ihrer
Größe eine hohe Metabolismusrate. Daher sind diese vermutlich anfälliger für mitochondriale
Fehlfunktionen und oxidativen Stress, welche als Ursachen der selektiven Degeneration bei
Motoneuronen-Erkrankungen insbesondere bei der Amyolateralsklerose (ALS) diskutiert
werden (Heath und Shaw, 2002; Van Damme et al., 2005). Die spezifischen Eigenschaften
der Motoneurone können unter anderem an primären Zellkulturen, die aus isolierten
embryonalen Motoneuronen angelegt wurden, untersucht werden. In-vitro-
Charakterisierungen trugen bisher zur Aufklärung wichtiger Signalwege wie zum Beispiel
zum molekularen Verständnis des neuronalen Zelltod bei und führten zur Identifizierung
neurotropher Faktoren, die für das Überleben der Motoneuronen entscheidend sind.
Des Weiteren werden Motoneuronen-Kulturen herangezogen, um Substanzen an
geschädigten oder dysfunktionalen Motoneuronen auf ihre neuroprotektive Wirkung zu
testen. Ein weiteres Modell stellt die NSC34-Zelllinie dar, die aus einer Hybridisierung von
spinalen Motoneuronen mit Neuroblastoma-Zellen generiert wurden (Cashman et al., 1992).
Zum Anlegen eines In-vitro-Modells für die SMA wurden entweder Motoneurone aus
SMA-Tieren in Kultur genommen oder das SMN-Transkript durch die Knock-Down-
Technologie in den Zellen herunterreguliert (Rossoll et al., 2003; van Bergeijk et al., 2007;
Setola et al., 2007; Bowermann et al., 2007). Ein neuer Ansatz stellt die Differenzierung von
Einleitung
9
induzierten Stammzellen dar. 2006 demonstrierte die Gruppe um Yamanaka erstmals an
Fibroblasten, dass die Zellen durch das Einschleusen von vier Genen (Oct3/4, Sox2, c-Myc,
und Klf4) zu Stammzellen reprogrammiert werden können (Yamanaka et al., 2006). Diese
induzierten Stammzellen (induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs) können ähnlich wie
embryonale Stammzellen (embryonic Stem Cells, ESCs) in vitro zu Motoneuronen
differenziert werden (Ebert et al., 2010, Wichterle et al., 2002). Dabei treiben zunächst
verschiedene Kultivierungs-Schritte die Zellen zur Ausprägung eines neuronalen
Progenitor-Typs. Anschließend wird die Differenzierung in die Motoneurone in Anwesenheit
von Retinsäure, einem Vitamin A Derivat, und Sonic hedgehog (SHH) induziert. Beide
Faktoren spielen in vivo bei der Musterbildung während der Embryogenese eine wichtige
Rolle. Ein Vorteil der Differenzierung aus iES ist der Verzicht auf embryonale Stammzellen,
die wegen ethischer Implikationen nur begrenzt zur Verfügung stehen, und die Verwendung
von Patienten-Zellen. Ebert et al. generierten SMN-defiziente Motoneurone, die aus
Fibroblasten von SMA I-Patienten und Gesunden gewonnen und anschließend
reprogrammiert worden waren (Ebert et al., 2009). Bei Nachweis von verschiedenen
Motoneuron-spezifischen Markern wie zum Beispiel dem späten Motoneuronenmarker
SMI32 konnten sie zeigen, dass sich aus den SMN-defizienten Zellen im Vergleich zum
Wildtyp kleinere und insgesamt weniger Motorneurone entwickelten (Ebert et al., 2010).
1.4 Die Funktionen und Interaktionspartner des SMN- Proteins
Das SMN-Gen bzw. Protein ist seit seiner Entdeckung in den 1990ger Jahren Gegenstand
intensiver Forschung. Dem Protein können mittlerweile viele verschiedene Eigenschaften
zugeschrieben werden. Das Volllänge-Protein, bestehend aus 294 AS-Resten, wird in allen
somatischen Zellen exprimiert (Battaglia et al., 1997; Coovert et al., 1997). Dabei ist die
Expression im Rückenmark und im Hippocampus erhöht (Battaglia et al. 1997; Bechade et
al., 1999). Des Weiteren wurde bei der Ratte und beim Huhn beobachtet, dass SMN
verstärkt während der Embryogenese exprimiert wird und die Expression postnatal wieder
abnimmt (Pagliardini et al., 2000; Zhang et al., 2003). Untersuchungen an PC12-Zellen
zeigen, dass die SMN-Menge nach Induktion der neuronalen Differenzierung durch
Nervenwachstumfaktor hochreguliert wird (van Bergeijk et al., 2007).
Das SMN-Protein ist sowohl im Zytoplasma also auch im Zellkern lokalisiert. Intranukleär
konzentriert SMN in den Kernkörperchen, die in Cajal-Körperchen (CB) und Gems
unterschieden werden (Liu und Dreyfuss, 1996; Matera und Frey, 1998). SMN bildet über
eine Selbstassoziation Oligomere und ist Teil eines Multiproteinkomplexes (Lorson et al.,
1998; Young et al., 2000; Meister et al., 2000; Pauskin et al., 2002). Sowohl die
Einleitung
10
Oligomerisierung als auch die Komplexierung ist für die Stabilität des Proteins von
Bedeutung (Lorson et al.1998; Burnett et al., 2009). Das Vorhandensein verschiedener
Domänen in der Aminosäure-Sequenz lässt auf eine Vielzahl potentieller Interaktionspartner
schließen. Exon 2 besitzt eine konservierte Nukleinsäure-bindende Domäne (NBD, AS-Reste
29-51), die für die Bindung von ssDNA, bzw. dsDNA von Bedeutung ist (Lorson et al., 1998).
Das Tumorsuppressor-Protein p53 bindet ebenfalls an diese Domäne (Young et al., 2002).
In Exon 2b finden sich vermehrt Lysin-Reste, die für den basischen Charakter dieser Region
verantwortlich sind. Exon 6 weist eine RG-Box auf, welche in vielen RNA-bindenden
Proteinen konserviert ist (Hahnen, et al., 1995; Lorson et al., 1998). In Exon 2b und 6 wurden
die AS-Reste 51-90 und 240-277 als Bindestellen für die Selbstassoziierung identifiziert
(Young et al., 2000; Lorson et al., 1998). Die Tatsache, dass bei SMA-Patienten mehrere
Punktmutationen in Exon 6 (P245L, S261I, S272C, T274I, G275S) identifiziert wurden, hebt
die Bedeutung der Oligomerisierungsdomäne hervor (Hahnen et al., 1997). Allerdings weisen
Mutationen, die mit einem milderen SMA-Verlauf einhergehen, im Gegensatz zu SMA-Typ-I-
Mutationen in vitro keine gestörte Oligomerisierung auf (zur Übersicht: Burghes and Beattie,
2009). Neben Exon 6 ist auch das Exon 7 für die Oligomerisierung von Bedeutung (Lorson et
al., 1998; Lorson und Androphy, 2000). Die vom SMN2-Gen kodierte, trunkierte Form
SMN∆7 kann mit einem Verlust von 18 AS-Resten im Exon 7 nicht mehr oligomerisieren und
wird mit einer doppelten Halbwertszeit im Vergleich zum Wildtyp abgebaut (Burnett et al.,
2009). SMN unterliegt dem schnellen, proteosomalen Abbau (Burnett et al., 2009).
In Exon 3 wurde eine weitere Anhäufung von SMA-verursachenden Mutationen gefunden.
Die Mutationen W92S und E134K gehen mit einem Typ-I-Erkrankung einher (Sun et al.,
2005; Kotani et al., 2007). Über die AS-Reste-Sequenz 92-144 in Exon 3 erstreckt sich die
hochkonservierte Tudor-Domäne, die erstmals bei Drosophila identifiziert worden ist (Ponting
1997; Buhler et al. 1999). Die Tudor-Domäne des SMN-Proteins vermittelt zusammen mit
dem C-Terminus des SMN-Proteins die Bindung der Smith (Sm)-Proteine (D1, D3, B), die in
ihrer Gesamtheit ein wesentlicher Bestandteil der spleißosomalen Small Ribonuclear
Complexes (snRNPs) darstellen (Selenko et al., 2001). Dabei ermöglicht die negativ
geladene Oberfläche der fassförmigen Tudordomäne die Wechselwirkung mit den positiv
geladenen, RG-reichen Domänen der Sm-Proteine (Selenko et al., 2001; Sprangers et al.,
2003). Anhand der in SMA-Patienten identifizierten Mutation E134K, die eine Bindung der
Sm-Proteine verhindert, konnte dieser Domäne erstmals eine grundlegende Bedeutung bei
der Assemblierung des spleißosomalen snRNP zugeschrieben werden (Buhler er al., 1999;
Selenko et al., 2001). Eine Dimethylierung der RG-Motive erhöht die Bindungsaffinität der
Sm-Proteine zu SMN maßgeblich (Gubitz et al., 2004; Friesen et al. 2001). SMN nimmt
durch Bindung an die RG-Domäne von Fibrillarin und GAR1 vermutlich auch Einfluss auf den
snoRNP-Komplex, der kleine nukleoläre RNAs enthält (small nucleolar RNAs) (Whitehead et
Einleitung
11
al., 2002; Jones et al., 2001; Pellizoni et al., 2001). SMN interagiert über die Tudor-Domäne
mit Coilin (p 80), einem Markerprotein für die Cajalkörperchen, das mit den Sm-Proteinen um
die Bindung von SMN konkurriert (Hebert et al. 2001).
Die Untersuchungen an den in Patienten gefundenen Mutationen trugen zur Aufklärung
einiger wichtiger SMN-Funktionen bei. Zusammenfassend sind bei den bisher identifizierten
Typ-I-Mutationen sowohl die Oligomerisierung als auch die Sm-Bindung sowie die snRNP-
Assemblierung in vitro gestört. Bei Mutationen, die zu einem milderen Verlauf der
Erkrankung führen, lassen sich diese Defekte jedoch nicht beobachten (zur Übersicht:
Burghes and Beattie, 2009).
Die SMN-AS-Sequenz enthält noch weitere auffällige Regionen. Über Exon 4 und 5
erstrecken sich drei Prolin-reiche Mikrodomänen (AS 194-248), die eine Interaktion mit
Proteinen mit einer SH3-Domäne ermöglichen. Diese Region ist eine potentielle Bindestelle
für das Aktin-bindende Protein Profilin2 (Giesemann et al., 1999). Profilin2 ist an der
Regulation des Aktin-Zytoskeletts beteiligt und spielt eine Rolle beim axonalen Wachstum
(Gieselmann et al., 1995; da Silva et al., 2003; Sharma et al., 2005). Die SMN-
Bindungspartner hnRNP-R und hnRNP-Q co-lokalisieren mit SMN in RNA-haltigen Granula
und transportieren Aktin-mRNA über das Axon zum Wachstumskegel (AS-Reste 210–294)
(Rossoll et al., 2002; Rossoll et al., 2003). Die Interaktion erfolgt über den C-Terminus des
SMN-Proteins und wurde noch nicht genauer lokalisiert. In jüngster Zeit wurden Annexin II
und die Myosin regulatory light chain (MRLC) als zwei neue SMN-Interaktionspartner
identifiziert, die mit dem Aktin-Zytoskelett assoziiert sind (Shafery et al., 2010). Außerdem
bildet SMN in der Z-Scheibe der Muskelfibrillen mit ß-Actinin einen Komplex (Rajendra et al.,
2007).
In unserer Arbeitsgruppe konnte eine Interaktion von SMN mit dem
Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2) gefunden werden. Dabei bindet die nukleäre
Isoform FGF-223 (23 kD) an den N-Terminus von SMN im Bereich der AS 1-90 (Claus et al.,
2003; Claus et al., 2004). FGF-2 hat sowohl in vivo als auch in vitro einen neurotrophen bzw.
neuroprotektiven Effekt auf kultivierte Neurone (Grothe und Unsicker, 1992). Das Protein
bildet einen Komplex mit den Uridin-reichen snRNAs und bindet den Spleißfaktor SF3a66,
der mit SF3a120 und SF3a60 an der Prozessierung von U2 snRNPs beteiligt ist (Claus et al.,
2004; Gringel et al., 2004; Nesic und Kramer 2001). FGF-223 kompetiert im Bereich der
AS 1-90 mit Gemin2 (SMN interacting protein 1, SIP1) um die Bindung von SMN.
Gemin2 kommt bei der Assemblierung und Stabilität des snRNP-Komplexes eine große
Bedeutung zu. (Claus et al., 2004; Fischer et al., 1997; Ogawa et al., 2007). Die Gemin2-
Binderegion liegt im N-Terminus des SMN-Proteins (AS-Reste 52-91) und überlappt teilweise
mit der Selbst-Bindungsdomäne von SMN (Young et al., 2000). Es ist noch eine weitere
Einleitung
12
N-terminale Region (AS-Reste13-44) für die Bindung von Gemin2 identifiziert worden (Liu et
al., 1997). Gemin2-Dimere stabilisieren die N-terminale SMN-Selbstassoziation und bildet
vermutlich mit den SMN-Oligomeren einen quartären Komplex (Ogawa et al., 2007). Gemin2
ist im Vergleich mit den anderen Geminen das am stärksten konservierte Protein. SMN tritt
auch direkt mit Gemin3 und Gemin8 in Wechselwirkung (Charroux et al., 1999; Otter et al.,
2007). Gemin3 (dp103) besitzt ein DEAD-Box-Motiv und gehört damit zur Gruppe der RNA-
Helikasen. Das Protein bindet an den N-Terminus von SMN (Charroux et al., 1999). Gemin8
hingegen bindet an den C-Terminus des SMN-Proteins und rekrutiert durch eine direkte
Interaktion Gemin4 und Gemin7. Letzteres interagiert mit Gemin6 und Unrip. Gemin5 ist über
Gemin2 mit SMN assoziiert (Otter et al., 2007). SMN bildet zusammen mit den Geminen 2-8
und Unrip den etwa 300 Kilodalton großen, sehr stabilen SMN-Komplex (Lorson et al., 1998;
Paushkin et al., 2002; Otter et al., 2007).
1. 5 Der SMN-Komplex und die snRNP-Biogenese
Der SMN-Komplex bildet im Zytoplasma eine Plattform für die Assemblierung der
spleißosomalen U snRNPs (Pellizzoni et al., 1998 und 2002; Meister et al., 2000, Otter et al.,
2007). U snRNPs erkennen Spleiß-Stellen in der prä-mRNA und katalysieren das
Herausschneiden der Introns. Während der Biogenese der U snRNPs werden zunächst die
kleinen, Uridin-reiche RNAs (U 1, U2, U5 und U4/6 RNA) nach Transkription aus dem
Zellkern geschleust. Dort assoziieren diese mit zahlreichen Proteinen und katalysieren nach
Reimport in den Zellkern die Prozessierung der mRNA in den Spleißosomen. Dabei vermittelt
das SMN-Multimer unter ATP-Verbrauch die Assoziation der U snRNAs mit den
Sm-Proteinen und den Sm-like proteins (Lsm) (Will et al., 2001, Meister et al., 2002;
Pellizzoni et al., 2002). Die U6 snRNA nimmt eine Sonderrolle ein, indem sie bei der Reifung
im Kern verbleibt, dort mit sieben Lsm-Proteinen interagiert und anschließend im Nukleolus
modifiziert wird. Dabei wird die Assoziation der Lsm-Proteine mit der RNA vermutlich auch
durch SMN vermittelt (Will et al., 2001; Achsel et al., 1999; Meister et al., 2000).
Die Sm-Proteine (B/B’, D1, D2, D3, E, F und G) bilden als wesentlicher Protein-
Bestandteil der U snRNPs einen heptameren Ring und binden an die charakteristische Purin-
A-U4-6-G-Purin-Sequenz der RNAs (Sm-Site), die vom SMN-Komplex erkannt und den Sm-
Proteinen präsentiert wird (Achsel et al. 2001; Buhler et al., 1999). Dabei binden zunächst
alle Komponenten des SMN-Komplexes mit Ausnahme von Gemin2 an die Sm-Proteine. Für
die Interaktion mit der Tudor-Domäne von SMN müssen die Sm-Proteine B, D1 und D3
methyliert vorliegen (Friesen et al., 2000; Brahms et al., 2001). Die Methylierung findet im
20S Methylosom statt und wird vermittelt durch die Protein arginine methyltransferase 5
Einleitung
13
(PRMT5), die die Arginin-Reste der genannten Sm-Proteine symmetrisch methyliert (Brahms
et al., 2001 und 2002). Der Methylierungsstatus der Sm-Proteine wird auch durch die
Wechselwirkung mit dem inhibitorischen Phosphobindeprotein pICln reguliert (Pu et al.,
1999). Für die Bindung des SMN-Komplex mit den RNAs ist die Purin-A-U4-6-G Sequenz
(Sm-Site) in Verbindung mit einer benachbarten 3’ Haarnadelschlaufe von Bedeutung (Will et
al., 2001). Nach Assemblierung des Komplexes wird der Reimport in den Zellkern durch
Methylierung der RNA-CAP-Struktur vermittelt. Durch die Bildung von 2,2,7-
Trimethylguanosin-CAPs (TMG-CAP, m3G-CAP) bedingt, binden Snurportin (SPN1) und
Importin-β an den Komplex und vermitteln in Assoziation mit dem Zinc Finger Protein1
(ZPR1) den Kerntransport des snRNP/SMN-Komplexes (Narayanan et al., 2002; Gangwani
et al., 2001). Im Kern akkumulieren die snRNPs zunächst in den CBs. Dort werden weitere
Modifikationen wie Pseudouridylierung und 2’O-Methylierung durch CB-spezifischer RNPs
(scaRNAs) vorgenommen, bevor die snRNP in die Spleiß-Kompartimenten übergehen (Gall
2000; Cioce und Lamond 2005; Stanek und Neugebauer 2006). Die Bildung der CBs ist von
der Biogenese der U snRNPs abhängig (Lemm et al., 1993). Bei einer Hemmung der
snRNP-Reifung zerfallen die CBs in kleine, punktförmige Strukturen. Das CB-Markerprotein
Coilin bindet sowohl an SMN als auch an die Sm-Proteine und beeinflusst die
Translokalisation der snRNP in die CBs (Hebert et al., 2001) Das SMN-Protein und die
Gemine dissoziieren in den CBs von dem snRNP-Komplex und werden vermutlich recycelt.
Da die Gems sowohl SMN-Protein als auch die Gemine enthalten, aber RNP negativ sind,
werden sie als Recycling-Orte der Proteine des SMN-Komplexes diskutiert (Pellizzoni et al.
1998; Hebert et al. 2001). Die genaue Funktion der Gems konnte jedoch noch nicht
aufgeklärt werden. Gems co-lokalisieren teilweise mit den CBs, stellen aber eigenständige
Entitäten dar (Liu und Dreifuss 1996). Während der Entwicklung nimmt die Co-Lokalisation
der beiden Strukturen zu, wobei in Motorneuronen schon im fetalen Stadium eine starke
Co-Lokalisation beobachtet werden kann (Navascues et al., 2004). Die Anzahl der Gems ist
bei SMA-Patienten reduziert. Allerdings ist unklar, ob dieser Befund für die Degeneration der
Motoneurone eine Rolle spielt oder eher als eine Folge des SMN-Mangels gesehen werden
kann (Young et al., 2000 und 2001; Coovert et al., 1997).
In In-vitro-Studien wiesen die mit SMA-Typ-I-assoziierten Mutanten eine gestörte SMN-
Biogenese auf (Wan et al., 2005; Winkler et al., 2005). Winkler et al. beobachteten in
SMA-Fibroblasten eine verminderte snRNP-Assemblierung und untersuchten anschließend
die snRNP-Biogenese im Frosch (X. laevis) und Zebrafisch (D. rerio). Dabei injizierten sie
nach einem SMN-Knock-Down aufgereinigte snRNP-Komplexe aus humanen Zellen und
beobachteten eine Rettung des SMA-Phänotyps. Carrel und Mitarbeiter konnte jedoch unter
der Verwendung verschiedener SMN-Mutanten gravierende axonale Defekte trotz intakter
snRNP-Biogenese beobachten (Carrel et al., 2006). Untersuchungen am Maus-Modell
Einleitung
14
zeigen, dass bei der Embryonalentwicklung ein hoher Bedarf an snRNP besteht, der
postnatal wieder abfällt (Gabanella et al., 2007). Dieser Befund könnte auf die erhöhte
Transkription vieler in Proliferation und Differenzierung involvierter Gene zurückgeführt
werden. Beim SMA-Typ-I-Mausmodell konnte am postnatalen Tag 3 eine Störung der
snRNPs-Biogenese beobachtet werden. Diese war bei einem Mausmodell für einen milderen
SMA-Typ schwächer ausgeprägt (Gavrilina et al., 2007). Auch ein Knock-Down von Gemin2
führte bei dem Zebrafisch und bei der Maus zu Motoneuronen-spezifischen Defekten des
Axons (Winkler et al., 2005; Jablonka et al., 2002). In vitro zeigen die Gemin2-defizienten
Motoneurone nicht die typischen morphologischen Veränderungen. In unserer Arbeitsgruppe
konnte an PC12-Zellen gezeigt werden, dass Gemin2 einen zu SMN gegenläufigen Effekt
auf das axonale Wachstum hat. Ein SMN-Knock-Down führt zu kürzeren Neuriten, hingegen
stimulierte der Knock-Down von Gemin2 das Neuritenwachstum (van Bergeijk, 2007).
Die Gruppe um Zhang fand im SMA-Typ-II-Mausmodell eine veränderte Stöchiometrie der
snRNPs einhergehend mit gewebespezifischen Spleiß-Defekten (Zhang et al., 2008).
Insgesamt gingen aus den Untersuchungen von Extrakten aus Rückenmark, Gehirn, Niere,
Herz und Muskel mehr als 100 Gene hervor, deren Transkripte aberrant gespleißt waren.
Dabei wurden nur 2 Gene gefunden, deren mRNAs in allen untersuchten Geweben
verändert waren. Talbot et al. zeigten, dass aberrant gespleißte mRNAs bei den
SMA-Mäusen fast ausschließlich im Endstadium detektiert werden können und diese
vermutlich eher als eine Folge des oxidativen Stresses in den degenerierenden Zellen
gesehen werden kann (Baum et al., 2009). Gleichzeitig fanden sie eine veränderte
Expression von zahlreichen Genen, welche die postnatale Entwicklung des Nervensystems
regulieren (Baum et al., 2009).
1.6 SMN und das Zytoskelett
Anhand von Rückenmarksschnitten aus der Ratte konnte erstmals gezeigt werden, dass
SMN auch in den Zellfortsätzen lokalisiert und mit Elementen des Zytoskeletts assoziiert ist
(Bechede et al., 1999; Pagliardini et al., 2000). Weitere Befunde ließen schon bald eine
Beteiligung des SMN-Proteins an neuronalen Wachstumsvorgängen vermuten. So konnte
SMN in Wachstumskegel-ähnlichen Strukturen von differenzierten P19-Teratokarzinoma-
Zellen nachgewiesen werden (Fan und Simard 2002). Lebend-Zell-Untersuchungen an
Motoneuronen aus dem Huhn zeigten, dass SMN mit Mikrotubuli interagiert und in
RNA-haltigen Granula über einen bidirektionalen Transport im Axon aktiv transportiert wird
(Zhang et al., 2003). SMN∆7 wird dagegen nicht transportiert und führt zu einem
verminderten axonalen Wachstum (Zhang et al., 2003). Nach jüngsten Untersuchungen
Einleitung
15
enthalten die SMN-positiven Granula neben anderen Komponenten die Gemine 2-7, die
vermutlich auch peripher mit SMN einen Core-Komplex bilden (Todd et al., 2010).
Des Weiteren wurde in den Granula auch ZBP1, Profilin2, Unrip, Erwing’s sarcoma protein
(EWS) und hnRNP R detektiert (Todd et al., 2010a, b). Rossoll et al. untersuchten murine
Motoneuron-Kulturen und zeigten erstmals, dass SMN über die Interaktion mit hnRNP R den
Transport von ß-Aktin mRNAs zum distalen Ende des Axons vermittelt (Rossoll et al., 2002;
Rossoll et al., 2003). Eine axonale Translation von ß-Aktin erlaubt die ß-Aktin-Protein-
Synthese auf den jeweiligen Bedarf im Wachstumskegel einzustellen (Bassell et al., 1998;
Zhang et al., 1999, 2001). Aktinfilamente sind im Wachstumskegel sehr dynamisch und
treiben durch einen ständigen Auf- und Abbau das Längenwachstum voran. Aus SMN-/--
SMN2-Mäusen isolierte Motoneurone weisen eine reduzierte β-Aktin-mRNA-Menge im
Wachstumskegel auf (Rossoll et al., 2003). Gleichzeitig besitzen diese Motoneurone kleinere
Wachstumskegel und kürzere Ausläufer als die Wildtyp-Zellen. Setola et al. identifizierten
eine axonale, Motoneuron-spezifische SMN-Isoform (a-SMN) (Setola et al., 2007).
Diese besteht lediglich aus den ersten drei Exons und einen Teil des Introns 3. a-SMN
stimulierte in NSC34-Zellkulturen bei Überexpression das Neuritenwachstum. Vermutlich ist
jedoch das a-SMN in vivo nicht essentiell, da auch SMN-Konstrukte ohne den a-SNM
kodierenden Bereich den SMA-Phänotyp retten können (Gavrilina et al., 2008). Unsere
Arbeitsgruppe zeigte in vitro unter Verwendung von SMN-Deletionsmutanten, dass das
neuronale Wachstum über den C-Terminus vermittelt wird (van Bergeijk et al., 2007).
Auch in vivo wurden Störungen der neuronalen Differenzierung gefunden. Im SMA-
Zebrafisch-Modell sind Defekte beim axonalen Wachstum, der Verzweigung und der
Wegfindung der Motoneurone beschrieben worden (McWhorter et al., 2003). Carrell et al.
zeigten, dass die Sequenz VDQNQKE in Exon 7 für das axonale Wachstum von Bedeutung
ist (Carrel et al. 2006). Gleichzeitig korrelieren die beobachteten Defekte nicht mit Störungen
der snRNP-Biogenese (Carrel et al., 2006). Bei SMA-Patienten wurden heterotopische
Motoneurone in der weißen Substanz des ventralen Rückenmarks identifiziert (Simic et al.,
2007). Diese waren hyperchromatisch und besaßen weder Axone noch Dendriten.
Die Gruppe um McGovern untersuchte am SMA-Mausmodell das Schicksal der
Motoneurone während unterschiedlicher Embroynalstadien und postnatal (McGovern et al.,
2008). Dafür zogen sie ein Mausmodell heran, bei dem eine HB9-Promoter getriebene GFP-
Expression die Motorneurone selektiv markiert. Die Motoneurone zeigten nicht die im
Zebrafisch und beim Menschen beobachteten Differenzierungs- und Wegfindungsdefekte. Es
konnten jedoch sowohl prä- als auch postnatal Anschwellungen in den Axonen (swellings)
und unbesetzte ACh-Rezeptoren an der neuromuskulären Endplatte festgestellt werden.
Weitere Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Motoneuron-Degeneration durch
Störungen bei der Ausbildung und Aufrechterhaltung der NMJ verursacht wird. In neonatalen
Einleitung
16
Mäusen wurde eine hohe Konzentration des SMN-Proteins in der neuromuskulären
Endplatte nachgewiesen (Fan und Simard 2002). Cifuentes-Diaz et al. untersuchten die NJM
in einem SMA-Typ-I-Mausmodell und fanden Aggregationen von hyperphosphorylierten
Neurofilamenten in der Präsynapse und schwach verzweigte Nervenendigungen.
Gleichzeitig wurde erstmals ein dying-back Mechanismus der SMN-defizienten Motoneurone
beschrieben (Cifuentes-Diaz et al., 2002). In neueren Beobachtungen konnten die
strukturellen Veränderungen schon präsymptomatisch nachgewiesen werden (Kariya et al.,
2008; McGovern et al., 2008). Kariya et al. verglichen zwei Mausmodelle mit
unterschiedlichem Schweregrad der SMA. Dabei fanden sie bei beiden Modellen ein
verändertes ACh-Clustering, wenig verzweigte Nervenendigungen, NF- Akkumulation in der
Präsynapse und eine verminderte Transmitterausschüttung. Auch bei SMA-Patienten wurde
die Akkumulation von phosphorylierten Neurofilamenten beschrieben (Lippa und Smith 1988;
Kato und Hirano 1990; Murayama et al., 1991). Bei einer Überexpression des NF in der
Maus akkumulieren die Neurofilamente in den Axonen und Perikaryien und führen zu einer
Degeneration der Motoneuronen im Rückenmark (Xu et al., 1993; Lee und Cleveland 1994).
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass ein SMN-Mangel in vitro und beim
Zebrafisch überwiegend zu Defekten beim axonalen Wachstum, bei der Maus hingegen zu
einer gestörten Ausbildung und Integrität der NMJ führt. Interessanterweise fanden Oprea et
al. anhand Untersuchungen von 6 diskordanten Familien ein Aktin-bindendes Protein,
Plastin3, als ein Modifier der Erkrankung (Oprea et al., 2008). Plastin3 stabilisiert die Aktin-
Filamente über eine Quervernetzung (Giganti et al., 2005). Die untersuchten SMN1-
negativen Geschwister von SMA-Patienten wiesen eine hohe Expression von Plastin3 auf,
die eine protektive Wirkung hinsichtlich der SMA-Symptomen ausübte (Oprea et al., 2008).
In nachfolgenden Experimenten konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von
Plastin3 in vitro zu einer Wiederherstellung des neuronalen Wachstums bei SMN-defizienten
Zellen führte. Beim Zebrafisch konnte der SMA-Phänotyp durch Injektion von Plastin3-mRNA
gerettet werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Plastin3 die Aktin-Filamente in
einer aus Patienten gewonnenen Lymphoblasten-Zelllinie und in HEK-Zellen stabilisiert
(Oprea et al., 2008).
Unsere Arbeitsgruppe hat nachgewiesen, dass mit NGF differenzierte PC12-Zellen bei
einer SMN-Defizienz verkürzte Ausläufer bilden (van Bergeijk et al., 2007). Gleichzeitig
wiesen diese Zellen ein verändertes Verhältnis von F-(filamentöses) und G-(globuläres) Aktin
zu Gunsten von G-Aktin auf. Das Zytoskelett ist durch einen ständigen Auf- und Abbau der
Aktin-Filamente eine höchst dynamische Struktur, die während des neuronalen Wachstums
exakt reguliert sein muss.
Einleitung
17
1.7 Die Regulation des Aktin-Zytoskeletts
Das Aktin-Zytoskelett ist an grundlegenden Prozessen der Zelle beteiligt. Dazu gehören
mechanische Stabilisierung, Migration, intrazellulärer Transport und neuronale
Differenzierung. Weiter spielen Aktinfilamente eine Rolle bei der Muskelkontraktion und bei
der Ausbildung und Aufrechterhaltung der NMJ (zur Übersicht: Luo et al., 2002). In Neuronen
bedingt das Aktin-Zytoskelett die typische fingerförmige Gestalt des Wachstumskegels, der
aus Filopodien (Ausläufern) und dem Lamellipodium (Leitsaum) besteht. Der Wachstums-
kegel ist eine chemosensitive Struktur, welche die Zelle am Ende des Ausläufers mit Hilfe
von Lenkungsmolekülen zu ihrem Projektionsort führt. Dabei gewährleistet ein ständiger Auf-
und Abbau der Aktin-Filamente die Beweglichkeit des Wachstumskegels und erlaubt diesem
auf attraktive oder repulsive Lenkungsmoleküle zu reagieren. Gleichzeitig wird auch das
Längenwachstum des Neurons durch die Dynamik der Aktin-Filamente bestimmt. Die Aktin-
Filamente sind polarisiert aufgebaut und besitzen ein wachsendes Plus-Ende (Barbed end)
und ein schrumpfendes Minus-Ende (Pointed end). Unter Gleichgewichtsbedingungen
polymerisieren ATP-Aktin-Monomere (globuläres Aktin, G-Aktin) vermehrt am Plus-Ende,
während Aktin am Minusende die Depolymerisierung durch die Hydrolyse von gebundenen
ATP begünstigt wird. Durch diesen Mechanismus entsteht ein Fließgleichgewicht der
Aktinfilamente, das auch als Treadmilling bezeichnet wird. Dieser Vorgang wird durch
Assoziation vieler verschiedener Aktin-bindender Proteine wie ADF/Cofilin, Profilin und
Gelosin vermittelt. Bei der Regulation der Aktin-Dynamik nehmen die kleinen GTPasen Rho,
Rac und Cdc42 eine Schlüsselfunktion ein, die als Mediatoren zwischen Rezeptorsignal und
Aktin-bindenden Proteinen fungieren. GTPasen werden durch GTP-Bindung aktiviert und
durch ihre intrinsische GTPase-Aktivität, aber auch durch verschiedene GAPs (GTPase
activating protein) und GEFs (Guanine nucleotide exchange factor) reguliert. Rho A aktiviert
über eine Interaktion mit der Rho-Kinase (Rho-associated kinase, ROCK) den ROCK-
Signalweg, der eine zentrale Funktion bei der Regulation der Aktin-Dynamik einnimmt (zur
Übersicht: Hubert et al., 2003; Lowery and Vactor, 2009).
ROCK2, die neuronale Isoform von ROCK reguliert stromabwärts neben der Interaktion
mit MLC und MLCP die Aktivität der beiden kleinen Aktin-assoziierten Proteine Profilin und
ADF/Cofilin. Profilin2 liegt mit ROCK2 in einem Komplex vor und wird direkt von ROCK2
phosphoryliert (da Silva et al., 2003). Bei der Phosphorylierung von ADF/Cofilin interagiert
ROCK zunächst mit der LIMK1/2, welche nachfolgend die Phosphatreste auf ADF/Cofilin
überträgt (zur Übersicht: Bamburg et al., 1999). Die Konzentrierung und exakt regulierte
Aktivierung dieser Proteine im Wachstumskegel ist für das neuronale Wachstum von hoher
Bedeutung.
Einleitung
18
Die ADF/Cofilin-Familie besteht aus drei Proteinen mit redundanten Funktionen (ADF, Actin
depolymerizing factor; Cofilin1 und Cofilin2), von denen Cofilin1 in Säugetieren die
dominante Isoform darstellt (Hotulainen et al., 2005). ADF/Cofilin, zu Vereinfachung im
folgenden Cofilin genannt, induziert am Minus-Ende der Aktin-Filamente die Dissoziation von
ADP-Aktin. Gleichzeitig ruft Cofilin durch Assoziation an F-Aktin eine Konformationsänderung
hervor, die zum Bruch der Aktin-Filamente führt und dadurch neue Plus-Enden schafft
(McGough et al., 1997; McGough et al., 1998). Die Interaktion von Cofilin mit dem Protein
Arp2/3 begünstigt die Verzweigung der Filamente (Ichetovkin et al., 2002). Die Funktion von
Cofilin ist jedoch stark von der lokalen Konzentration abhängig. So kann Cofilin bei einer
hohen Konzentration auch die Polymerisation der Aktin-Monomere fördern (Nishida et al.,
1984; Andrianantoandro und Pollard 2006). Die Phosphorylierung am Serin-3-Rest von
Cofilin durch die Lim-Kinase führt zur Inaktivierung des Proteins (Arber et al., 1998; Yang et
al., 1998). Eine Aktivierung erfolgt über die Dephosphorylierung der Slingshot-Phosphatase-
Proteine (SSH1, SSH2, SSH3), die auch mit den LIMKs interagieren, und Cronophin (Niwa
et al., 2002; Ohta et al., 2003).
Anhand von Knock-Down- und Überexpression-Experimenten mit Cofilin, den LIMKs und
SHHs konnte gezeigt werden, dass die veränderte Expression jedes einzelnen Proteins in
vitro einen Einfluss auf das neuronale Wachstum hat (Endo et al, 2003 und 2007; Meberg et
al., 1998 und 2000). Ein Knock-Down von Cofilin führte zu verkürzten Ausläufern und ein
Doppel-Knock-Down von Cofilin und SSH1/SHH2 zeigte einen stärkeren negativen Effekt.
Diese Beobachtungen belegen, dass ein korrektes neuronales Wachstum eine definierte
Menge an aktivem Cofilin erfordert, die durch die Interaktion mit LIMK1/LIMK 2 und
SHH1/SHH2 exakt eingestellt wird (Endo et al., 2007).
Profilin katalysiert den Nukleotidaustausch an ADP-Aktin und fördert über die Interaktion mit
den Forminen die Polymerisierung von ATP-Aktin an das (+)-Ende von F-Aktin (Suetsugu et
al., 1998; Gieselmann et al., 1995; Kovar et al., 2006). In neuronalen Zellen überwiegt die
Isoform Profilin 2, die mit ROCK2 einen Komplex bildet und das neuronale Wachstum über
die Aktin-Dynamik maßgeblich reguliert (Witke et al., 1998; Sharma et al., 2003).
Eine verminderte Profilin2-Menge steigert das Längenwachstum durch vermehrte Aktin-
Depolymerisierung, eine Überexpression dagegen führt zu einer Hyperstabilisierung der
Aktinfilamente und zu verkürzten Neuriten (Sharma et al., 2003). Die Profilin-
Konzentrationen bewegen sich in der Zelle um 10-150 µM. Proteine mit einer Prolin-reichen
Sequenz können die Profilin2-Moleküle lokal anreichern, so dass an manchen Orten der
Zelle eine noch viel höhere Proteinkonzentration vermutet werden kann. Profilin interagiert
neben den Forminen auch mit den Aktin-bindenden Proteinen der Ena/Mena/VASP- Familie
und WASP (zur Übersicht: Birbach 2008).
Einleitung
19
Abb. 1: Schematische Darstellung zentraler Regulatoren des Aktin-Zytoskeletts (stark vereinfacht). Die Bindung des Nervenwachstumsfaktors NGF führt zu Inhibition der GTPase RhoA und infolge zur Inhibition des Rho-Kinase (ROCK)-Wegs. Die neuronale Isoform ROCK2 phosphoryliert Profilin2 über eine direkte Wechselwirkung. Profilin2 interagiert auch mit den Forminen Cofilin wird über die LIMK von ROCK2 phosphoryliert und damit inaktiviert. Die Phosphatase SHH ist ein weitere Regulator der Coflilin-Phosphorylierung.NGF führt auch über Dimerisierung von TrkA-Rezeptortyrosinkinasen zur Aktivierung der Rac1- und Cdc42-Rho-GTPasen. Die GTPasen nehmen eine Schlüsselfunktion bei der Regulation des Zytoskeletts ein. Profilin2, Cofilin und Arp2 regulieren über eine Bindung an Aktin die Dynamikder Aktin-Filamente.
NGF induziert die neuronale Differenzierung über den Rezeptor p75, der nachfolgend den
RhoA vermittelten Weg inhibiert. Auch eine direkte RhoA–Inhibition zum Beispiel durch das
chlostridiale Toxin C3, aber auch eine Hemmung von ROCK durch ROCK-Inhibitoren wie
zum Beispiel durch den Hemmer Y27632 induziert die neuronale Differenzierung und führen
sowohl in vitro als auch in vivo zu einem verstärkten Längenwachstum. NGF vermittelt über
eine Bindung an den Rezeptor TrKA die Aktivierung der GTPasen, Rac und cdc42, die über
Wave und WASP zur Aktivierung von Arp2/3 führt (Miki et al., 1998; Takenawa und Miki
2001).Eine Schnittstelle der beiden GTPase-vermittelten Wege bildet Pak21. Dieses Protein
wird von Rac und cdc42 aktiviert und tritt mit Rho A inhibierend, mit den Lim-Kinasen
aktivierend und mit den SHHs inhibierend in Wechselwirkung.
Einleitung
20
1.8 Zielsetzung der Arbeit
Bei der proximalen Spinalen Muskelatrophie führt der Verlust des Survival of motoneuron
(SMN1)-Gens spezifisch zu einer Degeneration der α-Motoneurone im Vorderhorn des
Rückenmarks. Obwohl viele Funktionen des SMN-Proteins in der Literatur beschrieben
worden sind, ist noch nicht bekannt, über welchen molekularen Mechanismus die
Degeneration der Motoneurone bei einem niedrigen SMN-Proteinspiegel ausgelöst wird.
Neben der Assemblierung der spleißosomalen Ribonukleinkomplexen im perinuklerären
Raum gewann in den Veröffentlichungen der letzten Jahre die axonale Funktion Hinblick auf
die Pathogenese an Bedeutung. Es ist bereits bekannt, dass SMN einen Einfluss auf das
Neuritenwachstum ausübt. Unsere Arbeitsgruppe konnte in differenzierten PC12-Zellen
zeigen, dass ein Knock-Down von SMN zu einer Reduktion der Neuritenlänge führt und eine
Überexpression das Neuritenwachstum stimuliert (van Bergeijk et al., 2007). Gleichzeitig
konnten Veränderungen des Aktin-Zytoskeletts gefunden werden. Diese Befunde führten zu
Untersuchungen des ROCK-Wegs, der an der Regulation der Aktin-Dynamik maßgeblich
beteiligt ist. Tatsächlich konnte nachgewiesen werden, dass eine Reduktion des SMN-
Gehalts zu einer Veränderung des Phosphorylierungsmusters der beiden ROCK-Substrate
Cofilin und Profilin2 kommt, die sich in einer Hypophosphorylierung von Cofilin und einer
Hyperphorphorylierung von Profilin2 äußert (van Bergeijk, 2007).
In dieser Arbeit sollte als zentrales Thema die molekulare Verbindung von SMN zum ROCK-
Weg charakterisiert werden. Dabei war insbesondere die Frage von Bedeutung, wie die
Proteine SMN, ROCK2 und Profilin2 funktionell und strukturell miteinander interagieren. Das
Vorhandensein einer Poly-Prolin-Domäne von SMN und andere Arbeiten wiesen darauf hin,
dass SMN und Profilin2 direkt miteinander in Wechselwirkung treten und dadurch einen
Einfluss auf ROCK2 bzw. den ROCK-Weg ausüben. Daher sollte in dieser Arbeit die Bindung
zwischen SMN und Profilin2 sowie deren Auswirkung in Hinblick auf den ROCK-Weg
untersucht werden. Als wichtiger Beleg für eine Rolle des ROCK-Wegs bei der SMA sollte in
einem SMA-Typ-I-Mausmodell überprüft werden, ob die in vitro gefundenen Veränderungen
auch in vivo bestätigt werden können. Als weiteren Bezug zur SMA-Pathogenese sollten
Punktmutationen herangezogen werden, um die Auswirkungen von SMN auf das Zytoskelett
genauer zu charakterisieren. Um näher zu untersuchen, inwieweit die axonale Funktion von
der Funktion im Kernkörperchen abgegrenzt werden kann, sollte die Struktur des Zellkerns in
Hinblick auf die Verteilung von SMN in den Kernkörperchen analysiert werden.
Material und Methoden
21
2 Material und Methoden
2.1 Zellkultur
2.1.1 Beschichtung von Oberflächen Poly-L-Lysin (PLL): Die Oberfläche wurde mit einer 0,5 mg/ml PLL-Lösung für 30 min. bei 37 °C im Brutschrank
inkubiert (33 µg/cm2) und ein Mal mit bidest. H2O Wasser gewaschen.
Kollagen I (aus der Ratte):
Die Stammlösung (4 mg/ml in 0,1 M Essigsäure) wurde in 50% (v/v) Ethanol verdünnt und
auf die Oberfläche aufgetragen (4 µg/cm2). Nach Verdunstung der Flüssigkeit wurde die
Oberfläche zwei Mal mit bidest. H2O gewaschen. Die beschichteten Zellkulturplatten bzw.
Dishes können bei -80 °C gelagert werden.
2.1.2 Die PC12-Zelllinie PC12-Zelllinie wurde 1976 von Greene und Tischler aus einem Tumor des
Nebennierenmarks der Ratte gewonnen und als Zelllinie etabliert (Greene und Tischler,
1976). Nach Stimulation mit dem Nervenwachstumsfaktor NGF zeigen die cromaffinen Zellen
einen neuronalen Phänotyp und dienen daher als Modellsystem für In-vitro-Untersuchungen
zur neuronalen Differenzierung.
2.1.3 Kultivierung der PC-Zellen Die PC12-Zellen wurden in 75 cm² großen, PLL-beschichteten Zellkultur-Flaschen bei einer
Temperatur von 37 °C unter 8,5%iger Kohlendioxid-At mosphäre im Brutschrank kultiviert. Die
Zellen wurden alle 7-10 Tage gesplittet. Zum proteolytischen Ablösen von der
Zellkulturflasche wurden die Zellen mit 2,5 ml Trypsin-EDTA-Lösung überschichtet und für
5-10 min. im Inkubator inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch leichtes Klopfen der
Zellkulturflasche auf die Tischoberfläche vom Boden vollständig gelöst. Nach Abstoppen der
Reaktion durch Zugabe von 5 ml Proliferationsmedium wurde die Zellsuspension in ein 15 ml
Röhrchen überführt und für 5 min. bei 1000 x g zentrifugiert. Anschließend wurde das
Zellpellet in 1 ml Proliferationsmedium aufgenommen und die Zellverbände mit einer über
dem Bunsenbrenner enggeschmolzenen Pasteurpipette durch mehrmaliges Triturieren
Material und Methoden
22
dissoziiert. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte nach einer 1:5 Verdünnung der Suspension
in einer Neubauer-Zählkammer.
2.1.4 Differenzierung von PC12-Zellen Für die neuronale Differenzierung wurden die PC12-Zellen auf einer Kollagen-beschichteten
Oberfläche ausgesät und mit NGF-haltigem, serumreduzierten Differenzierungsmedium
(1 % Pferdeserum) stimuliert. Nach der Plasmid-Transfektion wurden die Zellen für 24±2 h im
Proliferationsmedium und anschließend für 72±2 h im Differenzierungsmedium gehalten.
Messung der Neuritenlänge Die Bestimmung der Neuritenlängen erfolgt an differenzierten
Zellen (72±2 h) nach Fixierung mit 4%iger Paraformaldehyd (PFA). Die Neuriten wurden am
Epifluoreszenz-Mikroskop mit Hilfe der Funktion „Polygonlänge“ des Programms
analySIS3.0® bestimmt. Zur Identifikation transfizierter Zellen und zur besseren
Visualisierung der Neuriten wurden die PC12-Zellen mit dem pDsRed2-Vektor transfiziert.
Es wurden nur diejenigen Zellen für die Messung verwendet, die das rot fluoreszierende
Protein Red2 exprimierten. Für die Auswertung galten folgende Selektionskriterien
(van Bergeijk et al., 2007):
1) Es wird nur der längste Neurit einer Zelle gemessen.
2) Der Neurit darf nicht kleiner als der Zelldurchmesser sein.
3) Der Neurit muss mindestens eine Länge von 40 µm aufweisen.
Die Länge wurde ausgehend vom Mittelpunkt der Zelle bis zum äußeren Ende des
Ausläufers bestimmt. Es wurden mindestens 25 Zellen pro Ansatz zur Messung verwendet.
Für die statistische Analyse wurden die Daten von mindestens drei unabhängigen
Experimenten gepoolt.
2.1.5 Die HEK293T-Zelllinie HEK293T-Zellen wurden aus einer humanen embryonalen Niere gewonnen.
Durch Transformation mit Adenovirus-Typ-5-DNA wurden die Zellen immortalisiert und als
Zelllinie etabliert (Graham et al. 1977). Die modifizierte Zelllinie HEK293T exprimiert
zusätzlich das große SV40-T-Antigen und ermöglicht somit eine Replikation von Plasmiden
mit einem SV40 origin of replication (Lebkowski et al., 1985). Wegen einfacher Haltung und
hohen Transfektionserfolgen findet dieses Modell Anwendung in der Proteinbiochemie, wie
zum Beispiel bei der Produktion von Proteinen oder bei Untersuchungen von Protein-Protein-
Interaktionen. Des Weiteren eignen sich diese Zellen aufgrund ihrer großen Zellkerne gut für
Untersuchungen von nukleären Prozessen.
Die Zellen wurden in 75 cm² großen Zellkultur-Flaschen bei einer Temperatur von 37 °C
unter 8,5%iger Kohlendioxid-Atmosphäre im Brutschrank kultiviert und etwa alle zwei Tage
umgesetzt. Da die Zellen eine sehr hohe Teilungsrate besitzen, wurden die Zellen erst einige
Material und Methoden
23
Tage vor Beginn des Experiments in Kultur genommen und anschließend wieder bei -80°C
gelagert. Für immunzytochemische Untersuchungen wurden die Zellen auf
PLL-beschichteten Oberflächen ausgesät.
2.1.6 Die NSC34-Zelllinie Die murine NSC34 Zelllinie wurde von Cashman et al. (1992) als Motoneuron-Zelllinie
etabliert. Dabei wurden embryonale Motoneurone aus dem Rückenmark durch Fusion mit
Neuroblastoma-Zellen immortalisiert. Bei der Zelllinie konnten neben verschiedenen
Motoneuron-spezifischen Markerproteinen Kontraktionen von co-kultivierten Myotubes
nachgewiesen werden.
2.1.7 Kultivierung von NSC34-Zellen Die Zellkultur enthält runde proliferierende Zellen und differenzierte Zellen mit mehreren
Neuriten. Die Kultivierung erfolgte ebenfalls in 75 cm² großen Zellkultur-Flaschen bei einer
Temperatur von 37 °C unter 8,5%iger Kohlenstoffdiox id-Atmosphäre im Brutschrank.
Die Zellen wurden zwei Mal in der Woche umgesetzt.
2.1.8 Kultivierung von NSC34-Zellen Um eine höhere Differenzierungsrate zu erzielen, wurden die Zellen unter serumreduzierten
Bedingungen für 3 bis 14 Tage kultiviert. Für immunzytochemische Untersuchungen wurden
die Zellen auf einer PLL-beschichteten Oberfläche ausgesät.
2.1.9 Konservierung von Säugerzellen Im Gegensatz zu Zellverbänden können Zellsuspensionen in flüssigem Stickstoff gelagert
werden, da nahezu alle Stoffwechselvorgänge bei einer Temperatur von -196 °C zum
Erliegen kommen. Um Zellschädigungen durch Eiskristallbildung zu vermeiden, wird dem
Kulturmedium das Frostschutzmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzugegeben. Es wurden je
nach Zelltyp etwa 0,5–6 Mio. Zellen in 1 ml Kulturmedium mit 10 % DMSO in ein
Kryoröhrchen überführt und im flüssigen Stickstoff gelagert. Die Zellen können bei häufiger
Verwendung für einige Wochen bei -80 °C eingefroren werden.
2.1.10 Transfektion von Säugerzellen Als Transfektion bezeichnet man das Einbringen von genetischem Material in eine
eukaryotische Zelle. Als häufig verwendete Transfektionsmethoden gelten die Lipofektion,
Elektroporation, Nukleofektion und die virale Transduktion. Da das Einschleusen fremder
DNA oder RNA bei diesen Methoden auf unterschiedliche Weise vermittelt wird, muss je
Material und Methoden
24
nach Zelltyp und Versuchsaufbau abgewogen werden, welche Methode bevorzugt werden
soll. In dieser Arbeit wurde die Lipofektion und Nukleofektion zur Überexpression oder zum
Knock-Down eines Gens verwendet.
2.1.11 Lipofektion Die Lipofektion basiert auf der Verwendung kationischer Lipide, die nach Einschluss von
DNA oder RNA als Liposomen mit der Zellmembran fusionieren und ihren Inhalt in das
Zytoplasma erlassen. Gelangt die DNA durch Zellteilung oder mit Hilfe einer Signalsequenz
in den Zellkern, wird das gewünschte Gen unter Kontrolle eines geeigneten Promoters
exprimiert.
Für eine Transfektion in einer 24-Well-Platte wurden 10.000–20.000 Zellen ausgesät.
Am folgenden Tag wurden 0,5 µg DNA und 2 µl MetafecteneTM bzw. Metafectene ProTM
Biontex Laboratories GmbH, Martinsried, München) 30 µl PBS aufgenommen, vermengt und
für 20 min. bei RT inkubiert. Vor Zugabe der DNA-Lipidkomplexe wurde den Zellen frisches
Medium zugeführt. Anschließend wurde das Gemisch vorsichtig auf das Medium der Zellen
getropft und für mindestens 24±2 h im Brutschrank inkubiert.
2.1.12 Nukleofektion Bei der Nukleofektion wird die DNA bzw. RNA von der Zelle aufgenommen, indem die
Zellmembran durch einen elektrischen Puls kurzzeitig perforiert wird.
Das Transfektionsreagenz ermöglicht anschließend die Translokation der DNA in den
Zellkern. Diese Methode führt zu einer hohen Transfektionseffizienz und wurde für die
Gewinnung großer Mengen von Zelllysaten verwendet. Es wurden pro Ansatz 2 Mio. Zellen
und 4 µg DNA eingesetzt. Das Vorgehen mit dem Nucleofector® Kits for Neural Cells ( Lonza
Cologne AG, Köln) erfolgte nach Angaben des Herstellers.
2.1.13 Transfektion mit siRNA Durch Einschleusen einer spezifischen siRNA (Small interference RNA) kann die zu dieser
Sequenz komplementäre mRNA degradiert und somit die Proteintranslation der Sequenz
verhindert werden (Knock-Down).
Für einen Knock-Down wurden 250.000 Zellen in einer 6-Well-Platte ausgesät. Für die
Transfektion wurde das optimale RNA/Metafectene Verhältnis mit Hilfe von fluoreszierenden
Oligonukleotiden experimentell bestimmt; die beste Transfektionseffizienz wurde bei einem
RNA/Metafectene Verhältnis von 1:5 erzielt. Folglich wurden für einen Knock-Down in einer
6-Well-Platte 8 µl RNA-Lösung (Stammlösung: 20 nM) und 10 µl Metafectene ProTM
verwendet. Anhand einer Western-Blot-Analyse wurde auf Proteinebene 24 und 48 h nach
Material und Methoden
25
der Transfektion überprüft, ob die Expression des interessierenden Proteins unterdrückt
worden war. Es zeigte sich, dass die siRNA erst nach 48 h zu einer signifikanten
Herunterregulation des Proteins führte.
2.1.14 Transfektion mit Polyethylenimin Die Transfektion mit Polyethylenimin (PEI) ist eine sehr kostengünstige Methode und wurde
für die Transfektion von HEK293T-Zellen bei biochemischen Analysen verwendet.
Hierfür wurden 2 Mio. Zellen in einer 60 mm Petri-Schale ausgesät. Am folgenden Tag
wurden 6 µg Plasmid-DNA und 18 µl Polyethylenimin-Lösung (PEI, 1 mg/ml mit HCl auf pH7)
jeweils in 300 µl PBS verdünnt, vorsichtig vermischt und anschließend für 15 min. bei RT
inkubiert. Das DNA/PEI-Gemisch wurde auf die Zellen getropft und diese im Brutschrank für
24±2 h inkubiert.
2.2 Molekularbiologische Methoden
2.2.1 E.coli Zellen Für die molekularbiologischen Versuche wurden E. coli DH5α mit folgendem Genotyp
verwendet: F’ endA1 hsdR17(rkm+k) glnV44 thi-1 recA1 gyrA(Nalr) relA1 ∆(lacZIZYA-argF) U169
deoRLΦ80 dlac∆(lacZ)M15
2.2.2 Erzeugung kompetenter Zellen Kompetente Zellen nehmen unter bestimmten Bedingungen Plasmid-DNA vermehrt auf und
werden daher für eine Transformation verwendet. Die E.coli Zellen werden durch die
Behandlung mit Kalziumionen kompetent gemacht. Hierfür wurden 4 ml LB-Medium mit
E. coli angeimpft und bei 37 °C über Nacht im Bakterienschü ttler inkubiert (Ü/N-Kultur).
Anschließend wurden 40 ml LB-Medium im Verhältnis 10:1 mit 0,4 ml der Ü/N-Kultur
inkubiert und bei 37 °C für 2-3 h inkubiert. Bei ei ner OD550 von 0,3 wurde die Suspension für
10 min. bei 3000 x g zentrifugiert, das Pellet mit 20 ml 50 mM CaCl2 resuspendiert und
30 min. auf Eis gelagert. Es wurde erneut für 10 min. bei 3000 x g zentrifugiert, das Pellet in
4 ml 50 mM CaCl2 aufgenommen und mit 800 µl Glycerin versetzt. Anschließend wurden
Aliquots à 200 µl abgefüllt, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.
Material und Methoden
26
2.2.3 Transformation Bei der Transformation der E.coli Zellen wird durch einen Hitzeschock eine kurzzeitige
Permeabilität für Plasmid-DNA erreicht. Zu 100 µl kompetenten Zellen wurden 3 µl Plasmid-
DNA-Lösung hinzugegeben und für 10 min. auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte der
Hitzeschock bei 42 °C im Wasserbad für 1 min. Die Z ellen wurden für 2 min. auf Eis gekühlt
und dann mit 300 µl LB-Medium ohne Antibiotikum versetzt. Zur Expression des
Resistenzgens wurde der Batkerienansatz für mindestens 1 h bei 600 rpm und 37 °C im
Thermoschüttler inkubiert. 200 µl des Ansatzes wurden dann auf vorgewärmten LB-Platten
mit dem entsprechenden Antibiotikum ausplattiert und bei 37 °C über Nacht inkubiert.
Zur Herstellung der LB–Platten wurde festes LB-Medium in der Mikrowelle verflüssigt und
nach kurzem Abkühlen mit Ampicillin (Endkonzentration 30 µg/ml) oder Kanamycin
(Endkonzentration 100 µg/ml) versetzt.
2.2.4 Plasmidisolierung Die Plasmide wurden je nach benötigter Menge mit dem Mini-, Midi- oder Maxi-Präparations-
Kit (Mini und Maxi: Qiagen GmbH, Hilden, D, Midi: Nucleobond, MACHEREY-NAGEL AG,
Oensingen, CH) nach dem Prinzip der alkalischen Lyse isoliert. Das Vorgehen erfolgte nach
Angaben des Herstellers.
2.2.5 Umklonierung von DNA-Sequenzen Es ist eine Vielzahl von kommerziellen Vektoren vorhanden, die für eine Überexpression
eines interessierenden Gens verwendet werden können. Je nach gewünschter Stärke der
Expression kann ein Vektor mit starken oder schwachen Promotern gewählt werden.
Des Weiteren können Vektoren gewählt werden, welche zur Markierung des Proteins, zum
Beispiel durch eine zusätzliche Expression des Green fluorescent protein (GFP), führen.
Für diese Zwecke wurde das Insert aus einem ursprünglichen Vektor geschnitten und in
einen neuen Vektor kloniert.
2.2.6 Restriktionsverdau Vektor und Insert müssen mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten werden, um
eine Ligation des Insert mit dem Vektor zu ermöglichen. Der Restriktionsverdau wurde mit
den Enzymen und Puffersystemen der Firma Fermentas (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot)
nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Ansätze wurden für mindestens 2 h bei
37°C inkubiert. Bei unterschiedlichen Schnittstelle n wurde ein Doppelverdau unter
Verwendung des Tango-Puffers angesetzt. Die Isolierung der Fragmente erfolgte mit Hilfe
einer Agarosegel-Elektrophorese
Material und Methoden
27
2.2.7 Auftrennung und Isolierung von DNA mittels Agarosegel-Elektrophorese Bei der Agarosegel-Elektrophorese werden die negativ geladenen Nukleinsäuren durch den
Siebeffekt der Agarose im elektrischen Feld der Größe und der Ladung nach aufgetrennt. Die
DNA-Fragmente können anschließend mit dem Farbstoff Ethidiumbromid unter dem UV-Licht
sichtbar gemacht werden. .Für ein 1%iges Gel wurde 600 ml Agarose in 60 ml TBE-Puffer
aufgekocht. Nach kurzem Abkühlen der noch flüssigen Agarose-Lösung wurden 2 x 10-4 %
(v/v) Ethidiumbromid hinzugegeben und in die Gelkammer gegossen. Der DNA-Ansatz wird
mit DNA-Probenpuffer versetzt und nach Erkalten des Gels in die Taschen pipettiert. Zur
Bestimmung der Bandengröße wurde ebenfalls ein Marker mit DNA-Fragmenten bekannter
Größe aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte bei 100 V für 30 min. bis 1 h - je nach Größe
der erwarteten Fragmente. Dann wurden die Bande unter UV-Licht mit einem Skalpell aus
dem Gel ausgeschnitten und mit dem Gelextraktions-Kit (MinElute Gelextraktion Qiagen
GmbH, Hilden, D) nach Angaben des Herstellers aufgereinigt.
2.2.8 Ligation Die Ligation des Inserts in den linearisierten Vektor erfolgte mit der T4-Ligase nach Angaben
des Herstellers (T4 Ligase + Puffer: Promega GmbH, Mannheim, D). Zur Steigerung
intermolekularer Ligationsereignisse wurde zusätzlich das Glykosid PEG eingesetzt.
Der Ligationsansatz wurde bei 16 °C über Nacht inku biert und am folgenden Tag vollständig
für die Transformation eingesetzt.
2.2.9 Einfuhr neuer Schnittstellen mittels Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase chain reaction, PCR) Nicht immer kann das Insert aus dem ursprünglichen Vektor geschnitten und in den
gewünschten Vektor eingesetzt werden. Dies ist der Fall, wenn sich die Multiple cloning sites
und damit die Schnittstellen der beiden Vektoren unterscheiden. Die Sequenz muss dann
über eine PCR vervielfältigt und an den Enden über die Wahl geeigneter Primer mit den
passenden Schnittstellen versehen werden (Saiki et al., 1985,). Die PCR wurde mit der
Vektor 1 µl
Insert 4,5 µl
PEG (20%) 2,5 µl
Ligase Puffer 1 µl
Ligase 1 µl
Material und Methoden
28
GoTaq® DNA Polymerase (Promega GmbH, Mannheim, D) durchgeführt. Folgender
Reaktionsansatz wurde eingesetzt:
Vektor (2-20ng/µl) 1 µl
5x Reaction Puffer 5 µl
Primer F (10 pmol/µl) 0,5 µl
Primer R (10 pmol/µl) 0,5 µl
H20 bidest 15,5 µl
dNTP (10mM) 0,25 µl
Polymerase (5u/µl) 0,25 µl
Die DNA-Sequenz wurde anschließend im Thermocycler mit dem folgenden Programm
durch 30 Zyklen(Denaturierung, Annealing und Elongation) amplifiziert:
Nach Aufreinigung des PCR-Produkts wurde das PCR-Produkt nach Angaben des
Herstellers mit dem pGEM®-T Easy Vektor (Promega GmbH, Mannheim) ligiert.
Anschließend konnte das PCR-Produkt über seine 3’-Überhänge in den pGEM®-T Easy
Vektor mit 5’-T Überhänge ligiert werden, welcher nachfolgend für die Klonierung in den
gewünschten Vektor verwendet werden konnte.
2.2.10 Ortsgrichtete Mutagenese Untersuchungen von Mutanten können Aufschluss über Bindedomänen,
Aktivierungszustände und posttranslationale Modifikationen liefern. Die Mutation wird über
die ortsgerichtete Mutagenese mittels PCR gezielt in die DNA-Sequenz eines Vektors
eingebracht. Die Mutation wird über Primer-Sequenz vorgegeben. Die Durchführung erfolgte
mit dem GeneTailor™ System (Invitrogen GmbH, Mannheim, D) nach Angaben des
Herstellers. Abweichend wurde die FideliTaq Polymerase (UBS Hainer GmbH, Lauterbach-
Frischborn, D) verwendet und die PCR mit 25 Zyklen und einer Annealingzeit von 7 min.
durchgeführt. Anschließend wurde der Vektor zur Verifizierung der Mutation sequenziert.
92 °C 02:00 min.
94 °C 00:30 min. Denaturierung
55 °C 01:00 min. Annealing
72 °C 01:00 min. Elongation
72 °C 10:00 min.
Material und Methoden
29
Gleichzeitig musste ausgeschlossen werden, dass ungewünschte Mutationen über die PCR
eingebracht wurden.
2.2.11 Design der siRNA Die Interferenz-RNA führt zu einer Herunterregulierung (Knock-Down) der Protein-
Expression, indem sie zu ihr komplementäre Messenger-RNA-Sequenzen erkennt und deren
Abbau über einen Multiproteinkomplex vermittelt. Die Expression eines Proteins kann gezielt
durch die Synthese und Transfektion von siRNAs (Small interfering RNAs), die zur mRNA
des interessierenden Proteins komplementär sind, vorübergehend herabgesetzt werden.
Die siRNA-Sequenzen wurden mit einem speziellen Programm von der Firma Qiagen
entworfen und anschließend von dieser Firma synthetisiert.
2.3 Immunzytochemie
2.3.1 Fixierung von Zellen Für immunzytochemische Markierungen und mikroskopische Untersuchungen wurden die
Zellkulturen mit 4 % Paraformaldehyd, eine kurzkettige Form des Formaldehyds, fixiert.
Paraformaldehyd zerfällt in gelöster Form zu reaktiven Formaldehyd-Monomeren, die mit der
Aminogruppe von Proteinen reagieren und diese quervernetzen. PFA wurde in 8%iger
Lösung gelagert und nach Auftauen bei 37 °C mit PBS in einem Verhältnis von 1:1 verdünnt.
Die Zellen wurden vor der Fixierung ein Mal mit PBS gewaschen, dann anschließend mit
PFA-Lösung für 10 min. bei Raumtemperatur inkubiert und gewaschen. Für mikroskopische
Analysen wurden die Zellen auf beschichtete Deckgläschen (PLL: NSC34, HEK; Kollagen I:
differenzierte PC12-Zellen) kultiviert und nach der Fixierung mit Reagenz ProLong®Gold
(Invitrogen GmbH, Karlsruhe) eingedeckelt oder für immunzytochemische Markierungen
weiterverwendet.
2.3.2 Immunzytochemische Markierungen Bei der Immunzytochemie werden fixierte Proteine unter Verwendung von Erst- und
Zweitantikörper spezifisch markiert. Dabei richtet sich der Erstantikörper gegen ein Epitop
des interessierenden Proteins; der Zweitantikörper ist mit einem Fluophor oder anderem
Farbstoff markiert und bindet an den Erstantikörper. Die Proteinverteilung kann auf diese
Weise unter dem Mikroskop untersucht werden. Des Weiteren wird diese Methode zur
Identifizierung des Zelltyps eingesetzt.
Material und Methoden
30
Im Folgenden wird das Standard-Protokoll beschrieben. Für einige Antikörper-Färbungen
wurden jedoch einige Modifikationen vorgenommen, die bei der Auflistung der Antikörper
vermerkt sind.
Die fixierten Zellen wurden mit einer Blockinglösung (5 % BSA und 0,3 % Triton in PBS) für
1 h zur Permeabilisierung der Zellmembran inkubiert. Der Erstantikörper wurde in einer
1%igen BSA-Blockinglösung angesetzt. Nach einer zweistündigen Inkubation mit dem
Erstantikörper wurden die Zellen drei Mal mit PBS gewaschen und anschließend mit dem
zweiten Antikörper (in 1%iger Blockinglösung ohne Triton) im Dunkeln für 1 h inkubiert. Nach
drei weiteren Waschschritten wurden die Zellen mit 20 µl mit dem Reagenz ProLong®Gold
(Invitrogen GmbH, Karlsruhe) eingedeckelt und bei 4 °C im Dunkeln gelagert. Bei einer
Kernfärbung wurde bei dem zweiten Waschschritt PBS mit 3 µM 4’,6-Diaminphenylindol
(DAPI) verwendet. Die Analyse unter dem Mikroskop erfolgte nach frühestens zwei Tagen
2.3.3 Bildverarbeitung Die fixierten Zellen wurden unter einem inversen Olympus IX70-Epifluoreszenzmikroskop mit
CCD Digitalkamera (Colorview-II) und einem konfokalen Leica TCS SP2 Mikroskop
untersucht (Lichtman und Conchello 2005). Die Aufnahmen am Olympus IX70 wurden mit
einem UPlan FI (10x, numerische Apertur 0,3) und zwei LCPlan FI (20x, numerische Apertur
0,4 und 40x, numerische Apertur 0,6) Objektiven sowie den Filtereinsätzen UMNU
(360-370 nm, Sperrfilter >420 nm), UMNB (470-490 nm, Sperrfilter >515 nm) und UMNG
(530-550 nm, Sperrfilter >590 nm) aufgenommen. Am Leica TCS SP2 wurden die Öl-
Immersionsobjektive HCX PL APO CS40 (40x, numerische Apertur 1,25) HCX PL APO BL
(63x, numerische Apertur 1,4) verwendet. Die Aufnahme von Fotos und die
Fluoreszenzverarbeitung erfolgte mit Hilfe der Programme analySIS 3.0® bzw. LCS Lite®
(Leica confocal software) und Adobe Photoshop CS2®.
2.3.4 Bestimmung der Anzahl der Kernkörperchen (CBs und Gems) Für die Charakterisierung der Kernkörperchen wurden die HEK293T-Zellen auf
PLL-beschichtete Deckgläschen ausgesät und am folgenden Tag mit pSMN-EGFP
transfiziert. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert und über eine
Immunzyochemie mit einem Antikörper gegen Coilin markiert. Bei der Auswertung wurden
die Coilin-positiven bzw. die SMN-positiven Strukturen im Zellkern gezählt. Dabei wurden
mindestens 60 Zellen aus drei unabhängigen Experimenten für die Bestimmung heranzogen.
Material und Methoden
31
2.4 Gewinnung von Rückenmarksgeweben aus einem SMA- Typ-I-Mausmodells
In dieser Arbeit wurde das sogenannte Taiwanesische Mausmodell verwendet (Riessland et
al., 2010). Die Mäuse mit dem FVB.Cg-Tg(SMN2)2Hung Smn1tm1Hung/J wurden von der
Firma Jacksons Laboratory (Sacramento, CA, USA) bezogen (Stock Nummer: 005058)
bezogen. Das SMN–/–Mausmodell besitzt zwei humane SMN2-transgene Genkopien
(SMN2tg/tg). Die Mäuse weisen Schwanz und Ohrnekrosen auf; jedoch entwickeln sie keine
Muskelschwächen. Zur Gewinnung der SMA-Typ-I-Mäuse wurden Mäuse des Genotyps
SMN–/–; SMN2tg/tg mit heterozygoten Knock-Out-Mäusen (SMN+/–) verpaart. Die F1-
Generation enthielt zu 50 % Mäuse mit dem Genotyp SMN–/–; SMN2tg/+, die einen SMA-Typ-I
ähnlichen Phänotyp entwickelten und bis zu 10 Tage überlebten. Die heterozygoten
Geschwister (SMN+/–; SMN2tg/+) entwickelten keinen SMA-Phänotyp und wurden als
Kontrollen verwendet.
Die Mäuse wurden in einem künstlichen Tag/Nacht-Rhythmus gehalten und hatten freien
Zugang zu Futter und Wasser. Die Tierhaltung erfolgte in Übereinstimmung zu den
Anforderungen des Deutschen Tierschutzgesetzes. Die Mäuse wurden am postnatalen
Tag 9 (Postnatal day 9, PND 9) getötet. Anschließend wurde das gesamte Rückenmark
entnommen und in Stickstoff aufbewahrt. Für eine längere Lagerung wurden das Gewebe
bei –80 °C eingefroren Der Genotyp wurde mittels PC R-Analyse von Schwanzspitzen-
biopsien der Mäuse bestimmt.
2.5 Biochemische Analysen
2.5.1 Proteinbestimmung Die Proteinkonzentration wurde mit einem Bicinchonin-Assay (BCA) bestimmt. Bei dem
BCA-Assay kommt es unter Verwendung von Carbamoylharnstoff (Biuret) und Kupfersulfat
zu Kupfer-Protein-Komplexen (Biuret-Reaktion). Die Cu(II)-Ionen werden in alkalischer
Lösung von den Proteinen zu Cu(I)-Ionen reduziert, welche dann mit Bicinchonin einen
violetten Farbkomplex mit dem Absorptionsmaximum bei λ=562 nm bilden. Die
Proteinkonzentration wird schließlich über die optische Dichte der Proteinlösung mit Hilfe
eines Proteinstandards bestimmt.
Es wurde eine serielle Verdünnungsreihe eines BSA-Proteinstandards zwischen 5 µg/µl und
0,04 µg/µl hergestellt und als Triplikate neben den Proben auf eine 96-Well-Platte
aufgetragen. Dabei wurden jeweils 25 µl der Proteinlösung in ein Well vorgelegt und
anschließend mit jeweils 200 µl BCA-Reaktionsreagenz (2 % (v/v) Pierce BCA-Reagenz B in
BCAReagenz A) versetzt. Die Ansätze wurden bei 37 °C für 10 min. inkubiert.
Material und Methoden
32
Die Absorptionsmessung erfolge mit einem BioTekMultiplate Reader bei einer Wellenlinie von
580 nm.
2.5.2 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Bei der SDS-PAGE werden Proteinen unter denaturierenden Bedingungen im elektrischen
Feld aufgetrennt (Laemmli, 1970). Negativ geladenes SDS bildet mit Proteinen SDS-Protein-
Komplexe, welche im Gel je nach Molekulargewicht der Proteine ein unterschiedliches
Migrationverhalten zeigen. Größere Proteine werden aufgrund des Siebeffekts des
Acrylamid-Polymers aufgehalten und wandern langsamer als Proteine mit niedrigem
Molekulargewicht. Bei der diskontinuierlichen SDS-PAGE verwendet man zwei Gele
unterschiedlicher Porengröße. Zunächst werden die Proteine in einem weitporigen
Sammelgel mit einem pH-Wert von 6,8 aufkonzentriert. Anschließend erfolgt die Auftrennung
der Proteine im engporigen Trenngel bei einem pH-Wert von 8,8. Je nach Größe des
interessierenden Proteins wurde ein Trenngel mit 10-15 % (Acrylamid:Bisacrylamid
Verhältnis 39:1) verwendet. Das Puffer-Acrylamid-Gemisch wurde nach Zugabe von APS
und TEMED zügig in die vorgesehene Gelkammer gegossen und vorsichtig mit bidest H2O
überschichtet. Nach Auspolymerisieren des Trenngels wurde nach Entfernen des Wassers
das Sammelgel auf das Trenngel gegossen und der Kamm eingesetzt. Die Gelkammern
wurden nach Einsetzen der Gele mit Elektophorese-Puffer aufgefüllt. Die Proben wurden mit
2 x Laemmli-Puffer versetzt, bei 95 °C für 5 min. d enaturiert und anschließend aufgetragen.
Nach 10 minütigem Einlaufen der Proben bei 70 V wurde die Spannung auf 180 V
hochgesetzt. Nachdem die Lauffront das Ende des Gels erreicht hatte, wurde der Lauf
gestoppt, das Sammelgel entfernt und das Trenngel zügig in den Transferpuffer überführt.
2.5.3 Isoelektrische Fokussierung Bei der zweidimensionalen Gelelektrophorese werden Proteine nach Ladung bzw. pH-Wert
und Größe aufgetrennt (Klose 1975). Dabei erfolgt die Auftrennung nach dem isoelektrischen
Punkt des interessierenden Proteins über einen pH-Gradienten in der ersten Dimension.
Anschließend werden diese Proteine in einer zweiten Dimension nach ihrer Größe
aufgetrennt. Das Verfahren ermöglicht die Untersuchung von posttranslationalen
Modifizierungen wie z.B. Phosphorylierungen, die den isoelektrischen Punkt des Proteins
verändern. Die Zelllysate wurden in Slide-A-Lyzer Dialyse-Rahmen mit einem
Ausschlussvolumen von 10 kDa für 24±2 h gegen (3x) 600 ml bidest. H2O dialysiert. Die
Lösung wurde durch Gefriertrocknung bei –80 °C für 4±1 h eingeengt und die Proteinmenge
über einen BCA-Assay bestimmt. Für die 2D-Gelelektrophorese wird das ZOOM®-
IPGRunner System entsprechend der Herstellerangaben verwendet (Invitrogen GmbH,
Karlsruhe). Hierzu wird pro Ansatz ein ZOOM®-Streifen (pH-Bereich 4–7) mit 150 µg Protein
Material und Methoden
33
1:1 in Proben-Rehydratationspuffer aufgenommen und über Nacht in der IPG Runner-
Kassette inkubiert. Am folgenden Tag wird die IPGRunner-Zelle zusammengebaut und
650 ml bidest. H2O befüllt. Die isoelektrische Fokussierung erfolgt diskontinuierlich über eine
Spannung von 200-2000 V für 2 h (200 V: 20 min.; 450 V: 15 min.; 750 V: 15 min.; 2000 V:
105 min.) bei konstanter Leistung von 1 W und einer Stromstärke von 1 mA. Anschließend
werden die ZOOM®-Streifen für 15 min. in 5 ml 2 x-SDS-Puffer auf dem Schüttler inkubiert
und mit Hilfe einer Pinzette auf ein 5 % Sammelgel mit 15 % Trenngel für die SDS-PAGE
überführt. Es folgt eine SDS-PAGE mit anschließendem Western Blot zur Analyse der
Proben.
2.5.4 Western Blot Bei einer Western-Blot-Analyse werden die Proteine nach Auftrennung im Acrylamid-Gel
unter Spannung auf eine Membran übertragen. Anschließend können die Proteine auf der
Membran mit spezifischen Antikörpern detektiert und mit einem zweiten Antikörper sichtbar
gemacht werden.
Für den Transfer wurden das Gel, die Nitrozellulose-Membran, 2 Whatman-Papiere und die
Schwämme der Blotting-Kammer für wenige Minuten im Transferpuffer eingeweicht.
Anschließend wurde die Blotting-Kammer nach Angaben des Herstellers zusammengesetzt
und der Transfer bei 100 V für 1 h durchgeführt. Die Membran wurde dann nach einem
kurzen Waschschritt mit TBST bei RT für mindestens 30 min. mit Blocking-Lösung
(5 % Milchpulver oder BSA, je nach Antikörper) inkubiert. Bei diesem Schritt wurden durch
Protein-Absättigung der Membran die unspezifischen Bindungen des Antikörpers reduziert.
Anschließend erfolgte die Inkubation des Erstantikörpers bei 4 °C über Nacht. Die Antikörper
wurden nach Angaben des Herstellers verdünnt. Am folgenden Tag wurde die Membran mit
TBST gewaschen und bei RT für 1 h mit dem Zweitantikörper inkubiert. Der indirekte Protein-
Nachweis erfolgte über die an den Zweitantikörper gekoppelte Peroxidase, die die Oxidation
von Luminol in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid unter Emission von Lichtquanten
katalysiert. Dabei kann anhand der eingefangenen Lichtquanten eine semiquantitative
Aussage über die Proteinmenge getroffen werden. Für diese Reaktion wurde die Membran
nach drei weiteren Waschschritten mit TBST mit 2 ml Pierce ECL-Substrat-Lösung (Lösung A
und Lösung B 1:1) für 1 min. inkubiert. Die Signale wurden entweder mit dem einem
Chemolumineszenz Imager oder mit Hilfe eines Röntgenfilms detektiert.
Material und Methoden
34
2.5.5 Nachweis der Chemiluminescence-Reaktion mit einem Röntgenfilm Die Membran wurde zum Schutz des Röntgenfilms mit Cellophan-Folie eingewickelt und in
einer Autoradiographie-Kassette befestigt. Dann wurde ein Röntgenfilm je nach Signalstärke
für 5 s - 60 min. exponiert. Die Entwicklung des Films erfolgt für 1 min. im Entwicklerbad.
Nach dem Spülen mit deionisiertem Wasser wird der Film für 5 min. im Fixierer (Kodak)
gebadet, erneut in dH2O gewaschen und an der Luft getrocknet.
2.5.6 Entfernen der Antikörper von einer Nitrozellulosemembran Für einen weiteren Proteinnachweis werden die Antikörper nach einem kurzen Waschschritt
mit TBST durch eine zehnminütige Inkubation mit den Glycin-Stripping-Puffer von der
Membran abgelöst. Die Membran wurde kurz mit TBST gewaschen und erneut mit einem
Erstantikörper inkubiert.
2.5.7 Densitometrie von Chemilumineszenz-Signalen Signalintensität und Proteinmengen stehen lediglich im dynamischen Bereich in einem
linearen Verhältnis zueinander. Die Aussagen über die Konzentrationsveränderungen sind
daher semi-quantitativ. Für die densitometrische Auswertung wurden Signale verwendet, die
nicht im Sättigungsbereich lagen. Die entwickelten Röntgenfilme wurden mit einem AGFA
1212u Scanner digitalisiert und die Banden mit Hilfe des Programms ImageJ 1.41
densitometriert und anschließend einer statistischen Analyse unterworfen.
2.5.8 Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen mit dem TRS-System Das TRS-System wurde ursprünglich von Niedenthal und Mitarbeitern für Untersuchungen
von sumoylierten Proteinen entwickelt (Niedenthal, 2009). In dieser Arbeit wurde das System
in Kooperation mit Dr. Rainer Niedenthal (Institut für Physiologische Chemie, Medizinische
Hochschule Hannover) für den In-vivo-Nachweis verschiedener Protein-Protein-Interaktionen
verwendet. Für einen Transfektionsansatz wurden 50.000-100.000 Zellen in einer 6-Well-
Platte ausgesät. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit den entsprechenden Plasmiden
unter Verwendung von Metafectene Pro cotransfiziert.
Material und Methoden
35
Für die Transfektion wurden folgende DNA-Mengen des jeweiligen Plasmids eingesetzt:
SMN-EGFP 300 ng
SUMO-EGFP 187,5 ng
Profilin-UBC9 300 ng
SMN-UBC9 300 ng
UBC9 100 ng
Um bei jedem Ansatz gleiche Bedingungen zu gewährleisten, wurde die DNA-Menge mit
dem pcDNA 3.1 Vektor auf eine gleiche Menge aufgefüllt.
2.6 Statistische Auswertung
Die gesammelten Messwerte (n) aus mindestens drei unabhängigen Experimenten (N)
werden mit dem GraphPad Prism 4 mit einem für das Experiment entsprechenden, in der
Abbildung angegebenen Test analysiert. Signifikante Unterschiede zwischen Wertepaaren
werden durch p-Werte und Sterne (*) angegeben (p<0,05 (*), p<0,01 (**) und p<0,002 (***).
Die Fehlerbalken repräsentieren jeweils die Fehler der Standardabweichung des
Mittelwertes.
2.7 Material
2.7.1 Zellkulturmedien
PC12-Proliferationsmedium
(van Bergeijk et al. 2006):
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) high glucose
10 % (v/v) Pferde-Serum
5 % (v/v) Fetales Kälberserum
6 mM L-Glutamin
1 mM Natriumpyruvat
100 IU/ml / 0,1 mg/ml Penicillin/Streptomycin
Material und Methoden
36
PC12-Differenzierungsmedium
(van Bergeijk et al. 2006):
DMEM high glucose
1 % (v/v) Pferde-Serum
6 mM L-Glutamin
1 mM Natriumpyruvat
100 IU/ml / 0,1 mg/ml Penicillin/Streptomycin
100 ng/ml NGF-β 7S
Medium für HEK293T-Zellen
Bruns et al. 2007):
DMEM high glucose
10 % (v/v) Fetales Kälberserum
6 mM L-Glutamin
1 mM Natriumpyruvat
100 IU/ml / 0,1 mg/ml Penicillin/Streptomycin
NSC34-Proliferationsmedium :
DMEM low glucose
5 % (v/v) Fetales Kälberserum
3 mM L-Glutamin
100 IU/ml / 0,1 mg/ml Penicillin/Streptomycin
NSC34-Differenzierungs-
medium :
DMEM low glucose
1 % (v/v) Fetales Kälberserum
6 mM L-Glutamin
1 mM Natriumpyruvat
100 IU/ml / 0,1 mg/ml Penicillin/Streptomycin
Material und Methoden
37
2.7.2 Puffer
RIPA-Puffer
137 mM NaCl
20 mM Tris-HCl pH7,5
25 mM β-Glycerophosphat
2 mM EDTA
1 mM Natrium-Orthovanadat
1 % (w/v) Natrium-Desoxycholat
1 % (v/v) Triton-X-100
Vor Gebrauch hinzufügen:
50 mM NaF
1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)
2 % (v/v) Protease-Inhibitor-Cocktail (EDTA-frei)
1 % (v/v) Phosphatase-Inhibitor Cocktail 1
Elektrophorese-Puffer
25 mM Tris
192 mM Glycin
3,5 mM SDS
Trenngelpuffer
1,12 M Tris-HCl pH8,8
10 mM SDS
Sammelgelpuffer
274 mM Tris-HCl pH6,8
20 mM SDS
Transferpuffer
25 mM Tris,
192 mM Glycin
20 % Methanol
Material und Methoden
38
TBST-Puffer
137 mM NaCl
20 mM Tris-HCl pH7,6
0,1 % (v/v) Tween-20
2 x Laemmli-Puffer
125 mM Tris-HCl pH6,8
20 % (v/v) Glycerin
10 % (v/v) β-Mercaptoethanol
0,05 % (w/v) Bromphenolblau
Rehydratationspuffer
91 % (v/v) 1.1x ZOOM® 2D Protein-Solubilizer-1
20 mM Dithiothreitol (DTT)
0,8 % (v/v) ZOOM® Carrier Ampholytes
0,05 % (w/v) Bromphenol-Blau
3.7.3 Oligonukeotide Die Primer wurden von der Firma MWG (Biotech AG, Ebersberg, D) synthetisiert.
Name Sequenz Klonierung
PC390-SMN-pNU-EcoRI-f
PC389-SMN-pNU-Xho-r
CGAATTCATGGCGATGAGCAGCGGC
GCTCGAGTTAATTTAAGGAATGTGAGCACC
SMN in pNU
PC375-Prof-pNU-F-Eco25
PC376-Prof-pNU-R-Xhol25
CGAATTCGCCCTTATTCCGGAGATG
GCTCGAGCTAGAACCCAGAGTCTCT
Profilin in pNU
Name Sequenz Mutagenese
PC391_g275c_FW
PC392_g275c_RV:
CTTCCTTACAACAGTCGAAAGTTGGG
ACTGTTGTAAGGAAGCTGCAGTATTC
SMN W92S
PC383-g400a-f
PC384-g400a-r
GTGGTTTACACTGGATATGGAAATAGAAAGGAGCAAAATCTG
CAGATTTTGCTCCTTTCTATTTCCATATCCAGTGTAAACCAC
SMN E134K
PC405-c689t_FW
PC406-c689t_RV
CACCACCCCACTTACTATTATGCTGGCTG
ATAGTAAGTGGGGTGGTGGTGGTGGCG
SMN S230L
Material und Methoden
39
PC393_a815g_FW
PC394_a815g_RV:
CATGGTACATGAGTGGCTGTCATACTGGC
AGCCACTCATGTACCATGAAATTAACATACTTC
SMN Y272C
PC395_c821t_FW:
PC396_c821t_RV:
CATGAGTGGCTATCATATTGGCTATTATATG
TATGATAGCCACTCATGTACCATGAAATTAAC
SMN T274I
PC326-mut1polyPro CCATGGAACTCTTTTCTCCCTGCACGAGCCCCCATGCCAGGGCCAAGACTG
SMN P196-198A
PC327-mut2polyPro GGTCTAAAATTCAATGGCCCACCACCGGCAGCGGCAGCAGCACCACCCCACTTACTATCATGCTG
SMN P219-224A
PC328-mut3polyPro GGACCACCAATAATTCCCGCAGCAGCTCCCATATGTCCAGATTCTC
SMN P245-247A
PC432 PFN2 S137A FW
PC431_Profilin2_S137A
GGCAAAATACTTGAGAGACGCTGGGTTCTAGC
GTCTCTCAAGTATTTTGCCATTGAGTATGCC
Profilin S137A
PC433 PFN2 S137D FW
PC431_Profilin2_S137A
GGCAAAATACTTGAGAGACGATGGGTTCTAGC
GTCTCTCAAGTATTTTGCCATTGAGTATGCC
Profilin S137D
Name Sequenz Knock -Down
siRNA1 (Mm_Smn1-1) CCCGACCTGTGAAGTAGCTAA siRNA gegen SMN
siRNA2 (Mm_Smn1-4) ATGCCTTTAGAATTAAATAAA siRNA gegen SMN
siRNA3 (Mm_Smn1-5) AAGAAGGAAAGTGCTCACATA siRNA gegen SMN
siRNA4 (Mm_Smn1-6) CAGAAGTAAAGCACACAGCAA siRNA gegen SMN
Material und Methoden
40
3.7.4 Plasmide Die verwendeten Plasmide sind in unserer Arbeitsgruppe hergestellt worden oder wurden
uns freundlicherweise von der jeweils angemerkten Arbeitsgruppe zur Verfügung gestellt.
Einige Gensequenzen wurden je nach Anforderungen des Versuchs in einen geeigneten
Vektor umkloniert oder durch ortsgerichtete Mutagenese verändert (siehe Anmerkungen).
pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA, USA) pSupp (Imgenex, San Diego, CA, USA) pIRES2-EGFP (Clontech Laboratories, Inc. Mountain View, CA, U.S.A) pcDNA 3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) pYFP-N1 (Takara Bio Europe/Clontech, Saint-Germain-en-Laye, France) pCFP-N1 (Clontech Laboratories, Inc. Mountain View, CA, U.S.A) pDsRed2 (Clontech Laboratories, Inc. Mountain View, CA, U.S.A) pGEM-T (Promega, Madison, WI, USA) pNU (generiert von Niedenthal und Mitarbeitern*)
Protein Insert Backbone Anmerkungen
SMN-EGFP SMN (Mensch) pEGFP-N2
SMN W92S Mutation in SMN-EGFP
SMN E134K Mutation in SMN-EGFP
SMN S230L Mutation in SMN-EGFP
SMN Y272C Mutation in SMN-EGFP
SMN T274I Mutation in SMN-EGFP
SMN P196-198A Mutation in SMN-EGFP
SMN P219-224A Mutation in SMN-EGFP
SMN P245-247A Mutation in SMN-EGFP
SMN-UBC9 SMN pNU XhoI, EcoRI
Profilin2a; EGFP Profilin2a (Ratte) pIRES2-EGFP
Profilin S137A; EGFP Mutation in Profilin2a
Profilin S137D; EGFP Mutation in Profilin2a
Profilin-UBC9 Profilin2a (Ratte) pNU EcoRI, XhoI
ROCK2-HA ROCK2 (Maus) Generiert von Zhang und
Mitarbeitern**
SUMO1-EGFP SUMO EGFP-N2 Generiert von Niedenthal und
Mitarbeitern *
UBC9 UBC9 (Maus) pCDNA3.1 Generiert von Niedenthal und
Mitarbeitern*
*Rainer Niedenthal, Institut für Physiologische Chemie, Medizinische Hochschule Hannover **Zhang Yu, Tsunghua University, Medical Building C121, Tsunghua University
Material und Methoden
41
2.7.5 Antikörper
Für die Markierung von Antigenen bei einer immunozytochemische Markierung und bei einer Western-Blot-Analyse wurden folgende Antikörper verwendet:
Primärantikörper Ursprung Hersteller Verwendung
ßIII-Tubulin Maus Upstate/Millipore Corp.,
Billerica, MA 01821, U.S.A
Western Blot (1:3000),
Immunozytochemie (1:400)
Coilin 204/10 Kaninchen Angus Lamond, University of
Dundee, Dundee, GB
Immunozytochemie (1:300)
GAPDH Maus Chemicon/Millipore Corp.,
Billerica, MA 01821, U.S.A
Western Blot (1:4000)
GFP (Klon 7.1&13.1) Maus Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim, D
Western Blot (1:2000)
HA Maus Sigma-Aldrich Chemikalien
GmbH, Schnelldorf, D
Western-Blot (1:5000)
Profilin2 Huhn Abcam, Ltd., Cambridge, UK Western Blot (1:2000)
SMN Maus Clontech, Becton Dickinson
GmbH, Heidellberg, D
Western Blot (1:4000)
Synaptophysin Kaninchen Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D Immunozytochemie (1:400)
UBC9 Kaninchen Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg, D
Western-Blot (1:2000)
Sekundärantikörper
anti-Maus Alexa488 Ziege Molecular Probes, Invitrogen
GmbH, Karlsruhe, D
Immunozytochemie (1:500)
anti-Kaninchen
Alexa555
Ziege Molecular Probes, Invitrogen
GmbH, Karlsruhe, D
Immunozytochemie (1:500)
anti-Maus-Peroxidase Schaf Amersham plc, Little Chalfont,
GB
Western Blot (1:4000)
anti-Huhn-Peroxidase Kaninchen Sigma-Aldrich Chemikalien
GmbH, Schnelldorf,
Western Blot (1:8000)
anti-Rabbit-Peroxidase Ziege Jackson
ImmunoResearch/Dianova
GmbH Hamburg
Western Blot (1:10000)
Material und Methoden
42
3.7.6 Geräte
Bilddokumentationssystem Biometra GmbH, Göttingen, D Multiplate Reader ELX-800, BioTek Instruments GmbH, Bad
Friedrichshall, D PowerPac 200 bzw. 300 Spannungsquelle BioRad Laboratories GmbH, München, D Protean-II® Kammer BioRad Laboratories GmbH, München, D Chemiluminescence Imager Intas Science Imaging Instruments GmbH, Göttingen, D Weitere Geräte und Verbrauchsmaterialen entsprachen einer Grundausstattung eines Labors für molekularbiologische, zellbiologische und biochemische Analysen.
3.7.7 Chemikalien
Chemikalien Hersteller 0,05 % (w/v) Trypsin / 0,83 mM EDTA PAA GmbH, Pasching, Österreich 30%ige Salzsäure (HCl) Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz Hydroxyfasudil Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, D 4',6-Diaminphenylindol (DAPI) Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D 40 %-Acrylamid-Lösung (29:1) Roth GmbH, Karlsruhe, D Agarose Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D Ammoniumperoxodisulfat (APS) Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D BCA-200 Protein Assay Kit Pierce Chemical Company, Rockford, U.S.A Borsäure Merck KGaA, Darmstadt, D Bromphenolblau Roth GmbH, Karlsruhe, D Calciumchlorid (CaCl2) Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D Kollagen I Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D D-(+)-Saccharose Roth GmbH, Karlsruhe, D Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D DMEM High Glucose PAA GmbH, Pasching, Österreich Dulbecco's PBS Biochrom AG, Berlin, D ECL-Substrat-Lösungen 1 + 2 Pierce Chemical Company, Rockford, U.S.A ECM-Gel Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D EDTA (Natrium-Ethylendiamintetraacetat; Na2-EDTA) Roth GmbH, Karlsruhe, D EGTA (Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylethyl)-tetraacetat) Roth GmbH, Karlsruhe, D Ethanol JT Baker, Mallinckrodt Baker Inc., Phillipsburg, USA Ethidiumbromid Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D Fotoentwickler-Lösung Eastman Kodak Comp., New York, U.S.A fetales Kälberserum, FCS GOLD PAA GmbH, Pasching, Österreich Fotofixier-Lösung Eastman Kodak Comp., New York, U.S.A GeneRuler 100 bp DNA ladder Plus Fermentas GmbH, St.Leon-Rot, D Glycerin Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D Glycin Roth GmbH, Karlsruhe, D Isopropanol JT Baker, Mallinckrodt Baker Inc., Phillipsburg, USA Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Roth GmbH, Karlsruhe, D IX70 Fluoreszenzmikroskop Olympus Europa GmbH, Hamburg, D Kaliumchlorid (KCl) Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D Laminin tebu-bio GmbH, Offenbach, D LB Broth (für Flüssigkultur) Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D LB-Agar Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D Leica TCS2 SP2 confocal microscope Leica Microsystems Heidelberg GmbH L-Glutamin 200 mM PAA GmbH, Pasching, Österreich Magnesiumacetat Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D Magnesiumchlorid (MgCl2) Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D Metafectene® Biontex-Laboratories GmbH, Martinsried D Methanol JT Baker, Mallinckrodt Baker Inc., Phillipsburg, USA Milchpulver Heirler Canovis GmbH, Radolsfeld, D Millex®-HA 0,22 µm Millipore GmbH, Schwallbach, D Millex®-HA 0,45 µm Millipore GmbH, Schwallbach, D N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D
Material und Methoden
43
Natrium-Orthovanadat Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D Natriumchlorid (NaCl) Merck KGaA, Darmstadt, D Natriumdesoxycholat Roth GmbH, Karlsruhe, D Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz Natriumpyruvat 100 mM PAA GmbH, Pasching, Österreich NGF-β 7S Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D Nitrocellulose-Membran Hyperbond™ Amersham, Biosciences, Little Chalfont, GB Paraformaldehyd Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz Penicillin (10000 U/ml) / Streptomycin (10 mg/ml) PAA GmbH, Pasching, Österreich Pferde-Serum GibcoBRL-Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D Photometer DU520, Beckmann Coulter GmbH, Krefeld, D Polyethylenimin Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D Poly-L-Lysin Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D ProLong Gold Antifade Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D Protease-Inhibitor Cocktail (EDTA-frei) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, D Rinderserumalbumin (BSA) Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D Röntgenfilm Eastman Kodak Comp., New York, U.S.A Slide-A-Lyzer® Dialyse-Rahmen Pierce Chemical Company, Rockford, U.S.A SDS (sodium dodecylsulphate) Roth GmbH, Karlsruhe, D Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris-Base) Roth GmbH, Karlsruhe, D Triton®-X-100 Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz Tween®-20 Roth GmbH, Karlsruhe, D Wasser Ampuwa®, Fresenius Kabi GmbH, Bad Homburg, D β-Glycerophosphat Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH, Schnelldorf, D Whatman Filterpapiere Whatman International Ltd, Kent, GB ZOOM® Carrier Ampholytes (pH4-7) Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D ZOOM® IPGRunner System I nvitrogen GmbH, Karlsruhe, D
Ergebnisse
44
3 Ergebnisse
3.1 Der Rho-Kinase (ROCK)-Weg ist bei der SMA in vivo verändert
Bei der Spinalen Muskelatrophie (SMA) führt ein Mangel an SMN zu einem spezifischen
Absterben der Motoneurone im Rückenmark. Das SMN-Protein nimmt im Zellkern und im
Axon unterschiedliche Funktionen ein, die in der Literatur gut beschrieben sind.
Trotz intensiver Forschung konnte jedoch bis heute noch nicht geklärt werden, welche
Funktion für das Überleben der Motoneuronen notwendig ist. In neueren Studien hat unsere
Arbeitsgruppe in einem SMA-Zellkultursystem Veränderungen des Rho-Kinase-Wegs
(ROCK-Weg) gefunden. Dieser Signalweg beeinflusst die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts
und steuert dadurch das Längenwachstum während der neuronalen Differenzierung. Dabei
treibt ein ständiger Auf- und Abbau der Aktin-Filamente den Wachstumskegel am Ende des
Ausläufers (Neuriten) voran (da Silva und Dotti, 2002; Dent and Gertler, 2003). Dieser
Prozess wird vermittelt durch die Aktin-bindenden Proteine Profilin2 und Cofilin, die beide
unter der Kontrolle von ROCK stehen. Unsere Arbeitsgruppe konnte in In-vitro-Studien
zeigen, dass SMN auf die Phosphorylierung dieser Proteine Einfluss nimmt (van Bergeijk,
2007).
Eine Herunterregulierung von SMN führte in PC12-Zellen zu einer Hyperphosphorylierung
von Profilin2. Im Folgenden sollte daher untersucht werden, ob die in vitro gefundenen
Veränderungen auf ein In-vivo-Modell übertragen werden können. Hierfür wurde das
Phosphorylierungsmuster von Profilin2 im Rückenmark von SMA-Mäusen analysiert. Dabei
wurde ein Maus-Modell für den schweren Verlauf der Erkrankung (SMA-Typ-I) verwendet
(Riessland et al., 2010). Da bei der Maus das SMN2-Gen fehlt, sind SMN-Knockout-Mäuse
letal. Durch das Einbringen zwei humaner SMN2-Genkopien gewährleistet ein niedriger
SMN-Proteinspiegel das Überleben der Mäuse bei gleichzeitiger Ausprägung SMA-typischer
Symptome. Das SMA-Maus-Modell geht aus einer Kreuzung einer heterozygoten Knock-out-
Maus (SMN+/-) mit einer SMN2 transgenen Maus (SMN–/–; SMN2tg/tg) hervor. 50% der
Nachkommen besitzen den Genotyp SMN–/–; SMN2tg/- und überleben bis zu 10 Tage.
Die heterozygoten Tiere mit dem Genotyp SMN+/–; SMN2tg/- (ebenfalls 50 %) bilden keine
SMA-Symptome aus und dienten als Kontrollen. Für die biochemische Analyse wurde jeweils
das gesamte Rückenmark am postnatalen Tag 9 (PND 9) präpariert. Zu diesem Zeitpunkt
waren die SMA-Mäuse wie von Riessland et al. beschrieben deutlich kleiner als ihre
Ergebnisse
45
heterozygoten Geschwister und motorisch schwer beeinträchtigt. (Abb. 2) (Riessland et al.,
2009).
Der Nachweis von phosphoryliertem Profilin2 in Lysaten von Rückenmarksgeweben der
Maus erfolgte über eine isoelektrische Fokussierung, da ein Antikörper gegen Phospho-
Profilin2 nicht zur Verfügung stand. Anschließend wurden die Proteine auf eine
Nitrozellulosemembran transferiert und mit einem Antikörper gegen Profilin2 nachgewiesen.
Die IEF-Fokussierung der Lysate der Kontrollen zeigten zwei Profilin2-Signale, wobei das
Signal im saureren Bereich dem phosphorylierten Protein entsprechen sollte (Abb. 2).
In unserer Arbeitsgruppe konnte über eine Assay mit der alkalischen Phosphatase bestätigt
werden, dass über die isoelektrische Fokussierung detektierte Profilin2-Signale im saureren
Bereich spezifisch auf eine Phosphorylierung zurückzuführen sind (van Bergeijk et al., 2007).
Bei den Lysaten der SMA-Mäuse konnte noch ein zusätzliches starkes Signal bei einem sehr
niedrigen pH-Wert beobachtet werden, welches hyperphosphoryliertes Profilin2 darstellte
(Abb. 2). Diese Ergebnisse decken sich mit den In-vitro-Befunden unserer Arbeitsgruppe,
in denen hyperphosphoryliertes Profilin2 im Bereich von pH 4,1 bis 4,5 nachgewiesen
werden konnte (van Bergeijk, 2007). Es gibt fünf potentielle Serin-Reste die durch eine
Serin/Threonin-Kinase, z.B. ROCK2 phosphoryliert werden könnten. Der in silicio bestimmte
isoelektrische Punkt für murines Profilin2 liegt bei 6,78 (ExPASy-Server, Bjellqvist et
al.,1993); biochemische Analysen bei Neuroblastoma-Zellen der Maus zeigten jedoch, dass
der rechnerisch bestimmte Punkt aus der Maus von dem in vitro bestimmten Wert abweichen
kann (Oh et al., 2006).
A B
Abb. 2: (A) Die Abbildung zeigt repräsentativ eine SMA-Maus (SMN–/–; SMN2+/-) (links) im Vergleich mit einer heterozygoten Maus (SMN+/–; SMN2+/-) (rechts) aus dem gleichen Wurf. Die deutlich kleineren SMA-Tiere waren im Endstadium (PND10) motorisch schwer beeinträchtigt. Die heterozygoten Geschwister waren unbeeinträchtigt und wurden in den Analysen als Kontrollen herangezogen. (B) SMA-Mäuse weisen eine Hyperphosphorylierung von Profilin2 auf. Rückenmarksgewebe von SMA-Mäusen und Kontrollen wurden homogenisiert, gepoolt (n=4) und anschließend dialysiert. Die Auftrennung von Profilin2 und Phospho-Profilin2 erfolgte über eine isoelektrische Fokussierung (IEF) im Bereich von pH 4.0 – 7.0. Anschließend wurden die Proteine in einer zweiten Dimension der Größe nach aufgetrennt und geblottet. Der Nachweis von Profilin2 erfolgte über einen Profilin2-Antikörper. Dargestellt ist eine repräsentative Analyse, die ein unterschiedliches Phosphorylierungsmuster der SMA-Mäuse im Vergleich zu den Kontrollen aufweisen (n=2). Bei den Rückenmarkslysaten der SMA-Mäuse wurden stärkere Signale im saureren Bereich detektiert, welche ein- bzw. mehrfach phosphoryliertes Profilin2 darstellt (siehe Pfeil).
Ergebnisse
46
3.2 Die Aktivität von ROCK ist bei SMN-Überexpressi on herunterreguliert
SMN beeinflusst die durch ROCK2 vermittelte Phosphorylierung von Cofilin und Profilin2
sowohl in vitro als auch in vivo. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass SMN die ROCK2-
Aktivität moduliert. Um einen potentiellen Einfluss von SMN auf die ROCK2-Aktivität zu
untersuchen, wurde diese in differenzierten PC12-Zellen nach Herunterregulierung mittels
Knock-Down-Technologie und nach Überexpression von SMN bestimmt. Für den Knock-
Down wurden die Zellen mit einem Suppressor-Plasmid transfiziert, das für eine shRNA
kodiert, die zur SMN-mRNA komplementär ist. Die shRNA wird in der Zelle zu einer siRNA
prozessiert, die über einen Multiproteinkomplex spezifisch die Zerstörung der SMN-mRNA
vermittelt. Der Knock-Down von SMN bei PC12-Zellen wurde in unserer Arbeitsgruppe als
SMA-Zell-Modell etabliert und führt zur Abnahme des Proteinspiegels um 50 %.
(van Bergeijk et al., 2007). Zur Überexpression von SMN wurde mit dem Vektor pEGFP-
SMN transfiziert. Die Kontrollen wurden durch Transfektion mit den Leerplasmiden
pSuppressor (pSupp) bzw. pEGFP erzeugt. Die Transfektionen erfolgten mittels
Nukleofektion, einer Methode, mit der durch Kombination aus Elektroporation und
Transfektionsreagenz eine hohe Transfektionsrate erzielt werden kann. Nach 24 h
Proliferation und 72 h Differenzierung mit dem Nervenwachstumsfaktor (NGF) wurden die
Zellen lysiert und jeweils das SMN-Niveau mittels einer Western-Blot-Analyse bestimmt.
Der Einsatz gleicher Proteinmengen wurde mit dem Nachweis des konstitutiv exprimierten
Proteins GAPDH bestätigt. Sowohl der Knock-Down als auch die Überexpression waren
erfolgreich (Abb. 3A). Anschließend wurden die ROCK-Aktivität der Lysate mit dem Rho
Kinase Assay Kit (Cyclex, Inc. Columbia, MD, USA) gemessen. Bei dieser Methode wird die
Aktivität über die Phosphorylierung der Myosin-binding Subunit of myosin phosphatase
(MBS), einem Substrat von ROCK, bestimmt. Dafür wird ein Meerrettich-Peroxidase
gekoppelter Antikörper eingesetzt, der spezifisch die von ROCK vermittelte Phosphorylierung
am Threonin-Rest 696 der MBS erkennt. Es muss berücksichtigt werden, dass neben
ROCK2 auch eine Phosphorylierung von weiteren Mitgliedern der Myotonic dystrophy protein
kinase (DMKP)-Familie wie zum Beispiel der Myotonic dystrophy kinase-related Cdc42-
binding kinase (MRCK) und der DMPK möglich ist. Die Analysen zeigten bei der
Überexpression von SMN eine signifikante Abnahme der ROCK-Aktivität. Hingegen blieb die
Aktivität beim SMN-Knock-Down unverändert (Abb. 3B).
Ergebnisse
47
Abb. 3: Die Überexpression von SMN reduziert die ROCK-Aktivität in PC12-Zellen: (A) PC12-Zellen wurden zur Überexpression mit dem pSMN-EGFP-Plasmid bzw. pEGFP-Plasmid als Kontrolle und zur Herunterregulierung mit dem pSupp-SMN bzw. pSupp-Plasmid mittels Nukleofektion manipuliert. 24 h nach Transfektion wurden die Zellen in Differenzierungsmedium mit NGF für 72 h differenziert. Die anschließende Western-Blot-Analyse der Lysate bestätigte die Überexpression bzw. den Knock-Down von SMN. Diese Methode führt zu einem Knock-Down von 50 % (B) Die ROCK-Aktivität der Lysate wurde mit dem Rho kinase Assay Kit der Firma Cyclex nach Angaben des Herstellers bestimmt. Die Phosphorylierung wird am Threonin-Rest 696 des ROCK-Substrats MBS mit einem Peroxidase-gekoppelten Antikörper detektiert. 3 µg pro Ansatz wurden in einer 96-Well Platte mit Reaktionspuffer und ATP versetzt und für 30 min. bei 30 °C inkubiert. Nach einem Waschschritt erfo lgte die Antikörper-Inkubation für 60 min. bei Raumtemperatur. Nach einem weiteren Waschschritt wurde mit tetrabenzidinhaltigem Puffer für 10 min. inkubiert. Nach Abstoppen der Reaktion mit 0,5 N Schwefelsäure wurde die optische Dichte bei 450 nm in einem Elisa-Reader bestimmt. n=10 (2 Transfektionsansätze) (Mann-Witney-Test, *** p<0,0005)
3.3 Die NSC34-Zelllinie als In-vitro-Modell der SMA
Vorteile der Verwendung immortalisierter Zellen sind die einfache Haltung, Vermehrung und
Manipulation der Zellkulturen. Hingegen können explantierte postmitotische Motoneurone in
vitro nicht ausreichend angereichert werden und sind daher wenig geeignet für biochemische
Untersuchungen. Cromaffine PC-Zellen aus dem Nebennierenmark der Ratte differenzieren
nach Stimulation mit NGF in einen sympathischen Phänotyp. Die Zelllinie wird allgemein zur
Untersuchung neuronaler Differenzierungsprozesse herangezogen (Greene und
Kaplan, 1995). In unserer Arbeitsgruppe konnten nach Modulation des SMN-Proteinspiegels
und nach Stimulation mit NGF molekulare und morphologische Veränderungen der PC12-
Zelllen gefunden werden (van Bergeijk et al., 2007). Die murine NSC34-Zelllinie ist durch die
Fusion von Motoneuronen mit Neuroblastoma-Zellen etabliert worden. Die Hybrid-Zellen
zeigen Motoneuron-ähnliche Eigenschaften (Cashman et al., 1992). In dieser Arbeit sollte die
Motoneuronen-Zelllinie NSC34 mittels SMN-Knock-Down als In-vitro-Modell der SMA
etabliert und sowohl biochemisch als auch morphologisch untersucht werden. Für den
Knock-Down wurden zunächst vier verschiedene zur SMN-Messenger-RNA komplementäre
siRNAs konstruiert. Als Kontrolle wurde eine randomisierte Nukleotidsequenz eingesetzt.
Für die Transfektion mit MetafecteneTM Pro (Biontex Laboratories GmbH, München) wurde
ein RNA/Metafectene-Verhältnis von 1:5 verwendet, welches in einem Vorversuch als
Ergebnisse
48
optimales Verhältnis für eine hohe Transfektionseffizienz bestimmt worden ist (Daten nicht
gezeigt). Die Herunterregulierung von SMN wurde nach 24 bzw. 48 h nach Transfektion
anhand einer Western-Blot-Analyse überprüft. Nach der Transfektion wurde zur Förderung
der Differenzierung ein serumreduziertes Medium verwendet. Der Nachweis des
Haushaltsproteins GAPDH wurde als Auftragskontrolle herangezogen. Die Western-Blot-
Analyse zeigte, dass alle vier siRNAs nach 24 h zu einer geringen, nach 48 h zu einer
deutlichen Abnahme des SMN-Proteinniveaus führten (Abb. 4) In folgenden Experimenten
wurde die siRNA 4 für den Knock-Down eingesetzt. Nach einer densitometrischen Analyse
der Signale wurden die Werte für SMN mit den GAPDH-Werten normalisiert. Die Analyse
zeigte eine Abnahme der SMN-Banden-Stärke von 77,2 ± 9 % bei der mit siRNA 4
behandelten Probe im Vergleich zur Kontrolle.
Abb. 4: siRNA vermittelter Knock-Down von SMN vermindert das Neuritenwachstum bei NSC34-Zellen. (A). Zur Etablierung des Knock-Downs von SMN wurden vier verschiedene siRNA-Sequenzen getestet. Als Kontrolle wurde eine randomisierte Sequenz herangezogen. 24 h und 72 h nach Transfektion der NSC34 Zellen mit den siRNAs wurden Zell-Lysate hergestellt und einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Alle vier siRNAs führten im Vergleich zur Kontroll-siRNA nach 24 h zu einer gering, nach 72 h hingegen zu einem stark verminderten Proteinspiegel. (B) Zur Identifizierung der transfizierten Zellen wurden die Zellen mit Fluoreszenz-markierten Oligonukleotiden co-transfiziert. Zur Messung wurde jeweils der längste Neurit (Mindestlänge 40µm) einer Zelle herangezogen. Es wurden mindestens 45 Zellen aus drei unabhängigen Transfektionsansätzen zur Messung herangezogen. Signifikante Unterschiede wurden mit Hilfe eines Mann-Whitney-Tests bestimmt und mit *** (p<0,0001, zweiseitig) gekennzeichnet (Mittelwerte ± Fehler der Standardabweichung). Messbalken: 25 µm
Ergebnisse
49
Bei PC12-Zellen führt eine Abnahme des SMN-Proteins zu einem verminderten
Neuritenwachstum (van Bergeijk et al., 2007). Bei primären Motoneuronen eines SMA-Maus-
Modells sind die Ausläufer ebenfalls vermindert. Zudem ist die Fläche der Wachstumskegel,
die als chemo-sensorische Strukturen am Ende des Neuriten das Wachstum steuern,
reduziert (Rossoll et al., 2003). Um die funktionellen Auswirkungen der SMN-
Herunterregulation bei NSC34-Zellen zu untersuchen, wurden die Neuritenlängen nach
einem 72-stündigen Knock-Down von SMN gemessen. Die NSC34-Zellen wurden neben der
Transfektion zur Visualisierung der transfizierten Zellen mit Fluoreszenz-markierten
Oligonukleotiden co-transfiziert. Mit Hilfe dieser Markierung konnten unter dem Mikroskop
erfolgreich transfizierte Zellen identifiziert und die Ausläufer dieser Zellen gemessen werden.
Der Knock-Down von SMN führte nach drei Tagen zu einer signifikanten Abnahme der
Neuritenlänge (Abb. 4). Der Effekt ist mit der bei SMN-defizienten PC12-Zellen beobachteten
Reduktion der Neuritenlänge vergleichbar (van Bergeijk., 2007).
3.4 Charakterisierung von NSC34-Zellen hinsichtlich der Synaptogenese
Fehlgesteuerte Vorgänge bei der synaptischen Übertragung werden als eine mögliche
Ursache für eine retrograde Degeneration bei der SMA diskutiert. Im Zebrafisch-Modell für
die SMA wurde eine Reduktion des synaptischen Proteins SV 2 an der motorischen
Endplatte beobachtet (Boon et al., 2009). In vitro zeigen explantierte SMA-Motoneuronen ein
verändertes Calcium-Clustering an den Axonenendigungen (Jablonka et al., 2007). Daher ist
es von Bedeutung, den Einfluss von SMN auf die synaptischen Vorgänge, wie z.B.
Vesikelausschüttung und –recycling, in In-vitro-Studien zu untersuchen. Primäre
Motoneuronen-Kulturen bilden untereinander funktionelle synaptische Verbindungen. So
konnten bei explantieren Ratten-Motoneuronen in Co-Kultur mit Schwannzellen mittels
Calcium-Imaging prä- und postsynaptische Ströme gemessen werden (Haastert et al., 2005).
Um über ein einfaches SMA-Modell-System für die synaptische Übertragung zu verfügen,
sollten NSC34-Zellkulturen auf Merkmale synaptischer Netzwerke hin untersucht werden. Als
erste Hinweise für die Bildung funktioneller Synapsen sollten dabei die Expression und
Lokalisation des synaptischen Markermoleküls Synaptophysin analysiert werden. Das 38 kD
große Protein ist in der Vesikelmembran lokalisiert und spielt eine Rolle bei der Exozytose.
Um zusätzlich eine mögliche Reifung synaptischer Vesikel über einen längeren
Kultivierungszeitraum zu ermitteln, sollten die Expression und Lokalisation nach 3, 7 und 14
Tagen Differenzierung untersucht werden (Tegenge et al., 2009). Die Zellen wurden auf PLL-
beschichteten Deckgläschen kultiviert und die Expression von Synaptophysin zu den
gegebenen Zeitpunkten immunzytochemisch nachgewiesen. Gleichzeitig wurden die Zellen
Ergebnisse
50
anhand einer Doppelfärbung mit dem axonalen Marker βIII-Tubulin markiert. Für eine 14-
tägige Differenzierung von NSC34-Zellen wurde der Serum-Gehalt des
Differenzierungsmediums von 1 auf 3 % erhöht, um eine stärkere Adhäsion zu PLL und eine
höhere Überlebensrate der Zellen zu erreichen (Matusica et al., 2008). Die Synaptophysin-
bzw. βIII-Tubulin-Markierung war zu allen drei Zeitpunkten positiv (Abb. 5; A-F). Bei einer
dreitägigen Kultivierung zeigen nur wenige Zellen ausgeprägte Ausläufer (Abb. 6; A, B).
Nach 7 Tagen waren die meisten Zellen deutlich differenziert (Abb. 5; C, D) Bei einer
Kultivierung von 14 Tagen überwogen die undifferenzierten Zellen (Abb. 5; E, F). Die
differenzierten Zellen lösen sich bei einer längeren Kultivierung leicht von den
Deckglässchen und wurden bei dem Färbevorgang vermutlich abgespült. Eine 14-tägige
Kultur mit ausschließlich differenzierten Zellen konnte durch die Anwesenheit von 10 µM
Retinsäure im Medium erzielt werden (Daten nicht gezeigt). Die Synaptophysin-Markierung
zeigte eine Lokalisation im Zellkern, im perinukleären Raum und im Wachstumskegel
(Abb. 5; A-F). Eine Änderung der Verteilung des Proteins konnte über den Zeitraum von 3
bis 14 Tagen nicht beobachtet werden. Punktförmige Synaptophysin-positive Strukturen als
Hinweise auf synaptische Vesikel konnten gefunden werden (Tegenge et al., 2009).
Ergebnisse
51
Abb. 5: Expressionsprofil von Synaptophysin bei NSC34-Zellen nach 3, 7 und 14 tägiger Differenzierung (3 d, 7 d, 14 d). NSC34-Zellen wurden auf PLL-beschichteten Deckgläschen in serumreduziertem Medium differenziert. Nach Fixierung mit einer 4%igen PFA-Lösung wurden die Zellen anhand einer Doppelfärbung mit den primären Antikörpern gegen das synaptische Markerprotein Synaptophysin und gegen das axonale Markerprotein βIII-Tubulin inkubiert. Die Fluoreszenzmarkierung erfolgte mit den sekundären Antikörpern Alexa555 a-rabbit (Synaptophysin) und Alexa488 a-mouse (Tubulin), die Zellkerne wurden zur Visualisierung mit DAPI markiert. Die Bilder repräsentativer Zellen wurden mit dem Olympus BX60F5 Fluoreszenz-Mikroskop aufgenommen. Synptophysin wird in NSC34-Zellen exprimiert und lokalisiert im Zellkern, Endoplasmatischen Retikulum und im Wachstumskegel (3, 7, 14 d). Die Differenzierung nahm über einen Zeitraum von 3-14 Tagen deutlich zu. Das Expressionsmuster von Synaptophysin veränderte sich jedoch nicht. Messbalken: 200 µm ( Zeile 1, 3, 5) bzw. 50 µm (Zeile 2, 4, 6)
Ergebnisse
52
3.5 Punktmutanten des SMN-Proteins lokalisieren im Zellkern in NSC34-Zellen
95 % der SMA-Patienten weisen eine Deletion des SMN1-Gens auf (Lefebvre et al., 1995,
Burghes, 1997, Sun et al., 2005). In diesem Fall hängt der Schweregrad der Erkrankung
allein von der Anzahl der SMN2-Kopien im Genom ab (Lefebvre et al., 1995). Das SMN2-
Gen produziert aufgrund einer C-T-Transition in Exon 7 lediglich 10 % des Volllänge-SMN-
Proteins (Lorson et al, 1998). Die Anwesenheit mehrerer SMN2-Kopien erhöht den SMN-
Protein-Spiegel bei SMA-Patienten und führt zu einem milderen Verlauf der Erkrankung
(SMA-Typ-I und -II). Bei fünf Prozent der Patienten liegt keine Deletion sondern eine
Mutation des SMN1-Gens vor. In der Literatur sind diverse Punktmutationen beschrieben,
die sich in unterschiedlichen Domänen von SMN1 befinden können und sich in ihrer
Pathogenität unterscheiden (zur Übersicht Burghes und Beattie, 2009). Untersuchungen von
SMN-Punktmutanten geben Aufschluss über einen spezifischen Funktionsverlust des
Proteins und sind daher für die Aufklärung der SMA-Pathogenese von hoher Bedeutung.
Abb. 6: Lokalisation von fünf in Patienten gefundenen Mutationen im SMN-Protein: W92S und E134K liegen in der Tudor-Domäne in Exon 3 von SMN und beeinträchtigen die Bindung der Sm-Proteine. Coilin, ein Markerprotein für die Cajalkörperchen, bindet ebenfalls in Exon 3. Die Mutationen Y272C und T274I liegen in der SMN-Oligomerisierungsdomäne von Exon 6 und beeinträchtigen die SMN-Selbstassoziierung. Zusätzlich ist die Bindung der Sm-Proteine durch die Mutation Y272C gestört Die Mutation S230L liegt in der Nähe einer Prolin-reichen Sequenz von Exon 5. Die schematische Darstellung der Bindungspartner und -domänen des SMN Proteins wurden zum besseren Verständnis stark vereinfacht.
Um die Konsequenzen einer SMN-Mutation in vitro untersuchen zu können, wurden fünf in
Patienten gefundene Mutationen mittels ortsgerichteter Mutagenese jeweils in den pSMN-
EGFP-Vektor eingebracht und durch Sequenzierung verifiziert. Es handelte sich dabei um
die Mutationen W92S, E134K, S230L, Y272C, und T274I (Abb. 6). Die Mutationen W92S
und E134K liegen beide in der Tudor-Domäne (Exon 3) und weisen in vitro eine verminderte
Bindungs-Affinität zu den Sm-Proteinen auf. Beide Mutationen sind bei Anwesenheit von
Ergebnisse
53
zwei bzw. drei SMN2-Genkopien mit dem SMA-Typ-I assoziiert. Die Mutationen Y272C und
T274I liegen in der SMN-Bindungsdomäne (Exon 6). Y272C führt bei niedriger Kopienanzahl
(2) von SMN2 ebenfalls zu SMA-Typ-I und beeinträchtigt sowohl die Bindung von SMN als
auch die der Sm-Proteine maßgeblich. Bei gleicher SMN2-Kopienanzahl geht die Mutation
T274I beim Patienten mit einem milderen Verlauf der Erkrankung einher. Die Mutation S230L
am Anfang von Exon 6 wurde jüngst bei einem SMA-II-Patienten mit zwei SMN2-Genkopien
identifiziert und ist noch nicht charakterisiert worden (Brunhilde Wirth, Institut für
Humangenetik, Köln; mündliche Mitteilung). Die Expression der fünf mutierten SMN-Proteine
konnte 24 h nach der Transfektion von NSC34-Zellen anhand einer EGFP-Markierung
mikroskopisch nachgewiesen werden. Die Expression aller fünf Mutanten war im Vergleich
zum SMN-Wildtyp unverändert (Abb. 7). Auch hinsichtlich des Verteilungsmusters
unterschieden sich die Punkt-Mutanten nicht vom Wildtyp. Im Zellkern konzentrierte sich
SMN erwartungsgemäß in den Kernkörperchen (Abb. 7). Auch eine axonale Lokalisation
konnte festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). Im Folgenden sollten die SMN-Mutanten
in vitro in NSC34-Zellen und HEK-Zellen auf gemeinsame strukturelle und funktionelle
Veränderungen hin untersucht werden.
.
Ergebnisse
54
Abb. 7: Punktmutanten des SMN-Proteins lokalisieren in gleicher Weise wie der Wildtyp im Zellkern in NSC34-Zellen. Die NSC34-Zellen wurden mit den pEGP-SMN bzw. bzw. -SMNW92S, -SMN E134K, -SMNS230L, SMNY272C oder SMNT274I mittels Lipofektion transfiziert und nach mit einer 4%igen PFA-Lösung nach 24 h fixiert. Die Zellkerne wurden durch eine Anfärbung mit DAPI markiert Die Visualisierung erfolgte mit einem konfokalen Leica TCS SP2 Mikroskop. Die Abbildung zeigt repräsentative Zellen zur Lokalisation von SMN bzw. der SMN-Punktmutanten.
Ergebnisse
55
3.6 SMN-Mutanten beeinflussen das Wachstum neuronal er Fortsätze
In PC12-Zellen führt die Überexpression von SMN zur einem verstärkten, ein Knock-Down
von SMN zu einem verminderten Neuritenwachstum. Zudem ist gezeigt worden, dass das
Neuritenwachstum durch Überexpression von SMN nach einem Knock-Down wieder
hergestellt werden kann (van Bergeijk et al., 2007). Im Folgenden sollte untersucht werden,
inwieweit sich die SMN-Punktmutationen der Patienten in vitro auf das Wachstum der
Neuriten auswirken. PC12-Zellen wurden zur Überexpression mit den jeweiligen SMN-
Konstrukten und der pEGFP-Kontrolle am gleichen Tag transfiziert und nach dreitägiger
Differenzierung mit NGF mit 4%iger PFA-Lösung fixiert. Zudem wurde ein Ansatz mit
pSupp-SMN bzw. der pSupp-Kontrolle mitgeführt. Die Überexpression des SMN-Wildtyps
führte zu einer signifikanten Zunahme der Neuritenlängen (Abb. 8). Der Knock-Down durch
den shRNA-kodierenden pSupp-SMN (siRNA SMN) verringerte signifikant die
Neuritenlängen im Vergleich zu den Kontrollplasmiden pEGFP und pSupp (siRNA K).
Diese Ergebnisse bestätigen die Beobachtungen von van Bergeijk und al. (2007).
Die Überexpression der Mutanten hingegen führte in allen fünf Fällen zu einer signifikanten
Abnahme der Neuritenlänge im Vergleich zum Wildtyp. Überraschenderweise waren die
Neuriten auch im Vergleich zur GFP-Kontrolle signifikant verkürzt. Die Mutanten W92S und
S230L zeigten mit der Reduktion den stärksten dominant-negativen Effekt (Abb. 8).
Ergebnisse
56
Abb. 8: Die Überexpression der Patienten-Mutanten hemmen das Neuritenwachstum in vitro. PC12-Zellen wurden mittels Lipofektion mit den Plasmiden pEGFP-Kontrolle bzw. pEGFP-SMN, SMNW92S, -SMNE134K, -SMNS230L, SMNY272C oder SMNT274I, zur Überexpression von SMN, mit pSupp-Kontrolle und pSupp-SMN zur Herunterregulierung von SMN transfiziert. Um die Neuritenlänge genetisch veränderter Zellen zu bestimmen, erfolgte eine Co-Transfektion mit pDsRed2. Nach Transfektion wurden die Zellen für 24 h unter Proliferationsbedingungen auf Kollagen I kultiviert , anschließend für 72 h in Anwesenheit von NGF differenziert und mit 4%-iger PFA-Lösung fixiert. Die Quantifizierung der Neuritenlängen erfolgte durch die Bestimmung des jeweils längsten Neuriten einer pDsRed-positiven Zelle. Der Fortsatz musste mindestens einen Zelldurchmesser und >40 µm lang sein. In drei voneinander unabhängigen Experimenten (n=3) wurden mindestens 60 Neuriten vermessen. Eine Überexpression führte zu einer Zunahme der Neuritenlänge, der Knock-Down zu einer Abnahme der Neuritenlänge. Alle fünf SMN-Mutationen führten zu einer signifikanten Abnahme der Neuritenlänge. Die Mutationen W92S und S230L zeigten den stärksten dominant-negativen Effekt. Signifikante Unterschiede wurden mit einer One-way-Anova-Analyse bestimmt und mit ** (p<0,001) bzw. ***(p<0,0001) gekennzeichnet (Mittelwerte ± Fehler der Standardabweichung).
3.7 Die Mutante W92S beeinflusst die Verteilung und die Lokalisation von
Kernkörperchen
SMN ist im Zellkern in den Kernkörperchen konzentriert, die in Cajal-Körperchen (CBs) und
Gems unterschieden werden. Coilin ist ein Markerprotein der CB und bindet über seine
RG-reiche Sequenz an die Tudor-Domäne von SMN. Diese Bindung vermittelt die
Akkumulation der U snRNP in den CBs (Hebert et al., 2001). Dort durchlaufen diese mehrere
Reifungsprozesse, bevor sie in Spleißosomen übergehen und dort die mRNA-Prozessierung
erlauben. Im perinukleären Raum nimmt das SMN-Protein bei der Assemblierung der
U snRNPs. eine zentrale Rolle ein und vermittelt den Reimport des RNA-Proteins-
Komplexes in den Zellkern (Pellizzoni et al., 1998 und 2002; Meister et al., 2000; Otter et al.,
2007). Gems werden durch die Markierung der Proteine Gemin2 und/oder SMN von den
CBs unterschieden. Ob die Gems an der Regulation von Spleißvorgängen beteiligt sind,
konnte bis heute noch nicht geklärt werden. Die Anzahl der Gems ist bei Fibroblasten von
SMA-Patienten vermindert (Coovert et al., 1997). Bei den Patienten führt die Deletion oder
Mutation des SMN1-Gens zur Ausprägung einer SMA. Im folgenden Experiment sollte
untersucht werden, ob die in Patienten gefundenen SMN-Punktmutationen W92S, E134K,
S230L, Y272C, T274I die Bildung der Kernkörperchen beeinflussen. Hierfür wurden
HEK293T-Zellen mit den SMN-EGFP bzw. mit dem mutagenisierten Vektor transfiziert und
nach 24 h fixiert. Die CBs wurden immunozytochemisch mit Hilfe eines Coilin-Antikörpers
markiert. Endogenes und überexprimiertes SMN wurden mit einem SMN-Antikörper
detektiert. Die Abbildung zeigt die SMN-positiven Gems und die CBs, die teilweise
co-lokalisieren. Um einen Einfluss der Mutation auf die Verteilung der Kernkörperchen näher
bestimmen zu können, erfolgte eine Quantifizierung der Gems und der CBs. Dabei wurden
zwischen SMN-positiven und SMN-negativen CBs unterschieden.
Ergebnisse
57
A
Ergebnisse
58
B Abb.9: Die Mutation W92S beeinflusst die Verteilung der Kernkörperchen. (A) HEK293T-Zellen wurden mittels Lipofektion mit pEGFP-SMN bzw. mit dem mutagenisierten Vektor -SMNW92S, -SMNE134K, -SMNS230L,-SMNY272C oder -SMNT274I transfiziert und nach einer 24-stündigen Expression mit 4%iger PFA-Lösung fixiert. Anschließend erfolgte immunzytochemisch eine Doppelfärbung mit den primären Antikörpern gegen SMN und Coilin und den sekundären Antikörpern Alexa488 anti-mouse (SMN) und Alexa555 anti-rabbit (Coilin). Die Zellkerne wurden durch eine Anfärbung mit DAPI markiert. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop Leica TCS SP2 aufgenommen. Die Abbildung zeigt repräsentative Zellen zur Lokalisation der CBs und der Gems bei einer Überexpression von SMN bzw. von den SMN-Punktmutanten. Coilin ist ein Markerprotein für die CBs. Ein Teil der Gems co-lokalisiert mit den CBs. (B) Quantifizierung der SMN-positiven Cajal-Körperchen (I) (SMN positiv, Coilin positiv), der SMN negativen Cajalkörperchen (II), und der Gems (III) (SMN positiv, Coilin negativ). W92S führt zu einer Abnahme der Coilin-negativen Gems SMN und zum Anstieg der SMN-negativen CBs, der auf einen Zerfall der CBs in residuale CBs zurückzuführen ist. Signifikante Unterschiede wurden mit einer One-way-Anova-Analyse bestimmt und mit ***(p<0,0001) gekennzeichnet (Mittelwerte ± Fehler der Standardabweichung). Messbalken: 5 µm
Ergebnisse
59
Die Anzahl der SMN-positiven CBs war bei Überexpression der Mutanten im Vergleich zum
Wildtyp nicht signifikant verändert (Abb. 9A). Die Mutanten E134K, S230L, Y272C, T274I
wiesen auch keine veränderte Anzahl der Gems auf (Abb. 9B). Bei Mutante W92S hingegen
konnten keine Coilin-negativen Gems nachgewiesen werden. Anschließend konnte gezeigt
werden, dass bei dieser Mutation die Anzahl der SMN-negativen CBs (Coilin positiv, SMN
negativ) im Vergleich zu den vier Mutanten und dem Wildtyp stark anstieg (Abb. 9B).
Diese Strukturen werden auch als residuale CBs bezeichnet. Vermutlich führte die Mutation
am N-Terminus der Tudordomäne zu einer gestörten Coilin-Bindung.
3.8 Profilin2 und SMN: die molekulare Brücke von SM N zum ROCK-Weg
3.8.1 Ein neuer In-vivo-Protein-Interaktionsassay z eigt die Bindung von SMN an Profilin2 SMN nimmt auf das Neuritenwachstum Einfluss, indem es mit dem ROCK-Signalweg
interagiert. Dies zeigte sich bei einem SMN-Knock-Down am veränderten
Phosphorylierungsmuster der beiden ROCK2-Substraten Cofilin und Profilin2, bei dem die
Phosphorylierung von Profilin2 begünstigt wird. Gleichzeitig konnte unsere Arbeitsgruppe
eine Hyperstabilisierung der Aktin-Filamente in vitro und in explantierten Motoneuronen der
Maus nachweisen, die vermutlich auf eine erhöhte Aktivität von Profilin2 zurückzuführen ist
(van Bergeijk, Doktorarbeit, 2007, da Silva et al., 2003). Es konnte jedoch noch nicht geklärt
werden, über welchen Interaktionspartner SMN den ROCK-Weg reguliert. Folgende
Beobachtungen liefern starke Hinweise darauf, dass Profilin2 als molekulare Brücke dient
und SMN mit dem ROCK-Weg verbindet. Eine Überexpression von Profilin2 hat einen
negativen Einfluss auf das Neuritenwachstum; bei einem Knock-Down von Profilin2 konnte
ein verstärktes Neuritenwachstum beobachtet werden. Eine Überexpression bzw. Hemmung
von ROCK2 liefert ein ähnliches Bild (da Silva et al., 2003). SMN hingegen zeigt ein dazu
gegenläufiges Verhalten (van Bergeijk et al., 2007). Dies erlaubt die Annahme, dass SMN
mit ROCK2 um die Profilin2-Bindung konkurriert.
SMN besitzt in Exon5 eine Prolin-reiche Sequenz, die eine Interaktion mit der Polyprolin-
Bindestelle von Profilin2 vermuten lässt. Verschiedene Arbeiten liefern Hinweise zu einer
Existenz eines Profilin2-SMN-Komplexes. Immunfärbungen zeigen Co-Lokalisationen von
SMN im Zellkern, im perinukleären Raum und im Wachstumskegel (Giesemann et al., 1999;
Sharma et al., 2005). Außerdem konnte eine Profilin2-Bindung durch SMN in vitro
nachgewiesen werden. Ein Co-Immunpräzipitationsnachweis von Giesemann et al. erfolgte
jedoch unter Verwendung eines Quervernetzers und lässt keine eindeutige Aussage über
eine direkte Interaktion in vivo zu (Giesemann et al., 1999). Daher sollte in dieser Arbeit
Ergebnisse
60
anhand eines neuen Assays eine In-vivo-Interaktion von Profilin2 und SMN nachgewiesen
werden. Die Basis des Assays zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen ist das
Trans-SUMOylierungs-System (TRS). Dieses System soll im Folgenden kurz erläutert
werden: Die SUMOylierung ist eine posttranslationale Modifikation ähnlich der
Ubiquitinierung, die einen Einfluss auf die Proteineigenschaften ausüben kann. Dabei führt
die kovalente Bindung des kleinen Proteins SUMO beispielsweise zu Aktivierung, Interaktion
oder Veränderung der enzymatischen Aktivität des Proteins. SUMO liegt zunächst an dem
Protein UBC9 gebunden vor und wird auf ein Protein mit SUMOylierungsstellen übertragen,
nachdem die Interaktionspartner von einer E3 Ligase in direkte Nähe gebracht wurden. Beim
TRS wird UBC9 mit einem interessierenden Protein fusioniert. Die Fusion mit UBC9 führt zu
einer sehr starken SUMOylierung des Proteins und vereinfacht den Nachweis von potentiell
SUMOylierten Proteinen (Niedenthal, 2009). Durch die Fusion werden interessanterweise
auch die Interaktionspartner stark SUMOyliert, da sich diese durch die Protein-
Wechselwirkung in unmittelbarer Nähe von UBC9 befinden. Dieser Effekt wird genutzt, um
eine putative Proteininteraktion nachzuweisen. Dabei wird zunächst das Protein mit dem
UBC9 fusioniert. Anschließend wird das Fusionsprotein, SUMO und der putative
Interaktionspartner im entsprechenden Zellmodell überexprimiert. Danach untersucht man
mittels Western-Blot-Analyse den Interaktionspartner auf seinen SUMOylierungsstatus.
Durch die Übertragung des Proteins SUMO nimmt das Molekulargewicht des Proteins zu,
was zu einer Verschiebung der Bande bei einer Western-Blot-Analyse führt (Abb. 10,
schematische Darstellung). Weist der Interaktionspartner keine natürlichen
SUMOylierungsstellen auf, können diese durch eine zusätzliche Fusion angehängt werden.
Abb. 10: Schematische Darstellung des Trans-SUMOylierungssystems. (A) Die SUMOylierung, eine posttranslationale Modifikation von Proteinen, wird vermittelt durch UBC9 (orange): UBC9 überträgt das kleine Protein SUMO (blau) auf Lysin-Reste eines Proteins mit geeigneten SUMOylierungsstellen (rot). (B) Bei dem Trans-SUMOylierungssystem führt die Fusion von UBC9 und mit einem Protein, hier angedeutet durch eine Verbindungslinie, zusätzlich zur SUMOylierung von Interaktionspartnern des Proteins (violett). (C) Zum Nachweis einer Profilin2-SMN-Interaktion wurde in dieser Arbeit Profilin2 mit UBC9 fusioniert und der potentielle Interaktionspartner SMN auf SUMOylierung hin untersucht. Die SUMOylierung von SMN weist in einer Western-Blot-Analyse eine differentielle Laufgeschwindigkeit auf.
Ergebnisse
61
Zur Untersuchung der SMN-Profilin2-Interaktion wurde ein Konstrukt zur Überexpression von
UBC9-Profilin2 hergestellt. Nach einer Co-Expression von UBC9-Profilin2, SUMO1 und
SMN-EGFP sollte SMN auf SUMOylierung hin untersucht werden. Dabei wurde davon
ausgegangen, dass das SUMOylierte SMN die Profilin2-SMN Interaktion widerspiegelt.
Hierfür wurde das Maus-Profilin2a in den Vektor pNU kloniert, der uns freundlicherweise von
Rainer Niedenthal. (Zentrum für physiologische Chemie, Medizinische Hochschule
Hannover) zur Verfügung gestellt wurde. Profilin2a wird im Folgenden als Profilin2
bezeichnet. Alle verwendeten Konstrukte wurden in die NSC34-Zellen mittels Lipofektion
eingebracht und für 24 h exprimiert. Die Zellen wurden nach einem Waschschritt mit PBS
direkt mit Laemmli-Puffer versetzt und einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Für den
Interaktions-Nachweis diente ein Antikörper gegen SMN. Die Spur 1 zeigt die Expression
von endogenen SMN der NSC34 Zellen auf der Höhe von 38 kD (Abb.12A). Bei
Überexpression von SMN-EGFP wurden zwei weitere Banden detektiert, wobei die SMN-
EGFP-Bande auf der Höhe von 64 kD liegt. Die zweite Bande bei ungefähr 54 kD ist
vermutlich auf ein Spaltprodukt von SMN-EGFP zurückzuführen und kann in diesem
Ergebnisse
62
Zusammenhang vernachlässigt werden (Abb. 12A, Spur 2). Die Co-Expression von SMN-
EGFP und SUMO1 führte zu keiner Veränderung des Bandenmusters und somit zu keiner
nachweisbaren SUMOylierung von SMN. Die Expression des 12 kD großen Proteins
SUMO1, fusioniert mit EGFP, wurde mit einem EGFP-Antikörper nachgewiesen.
SUMOylierungen von Proteinen unter natürlichen Bedingungen sind sehr instabil und in einer
Western-Blot-Analyse schwer nachweisbar (Abb. 11A, Spur 3). Daher konnten vermutlich
keine endogen SUMOylierten Proteine nachgewiesen werden. Bei einer zusätzlichen
Expression des SUMO-Bindeproteins UBC9 konnte ebenfalls keine zusätzliche Bande
detektiert werden (Abb. 3A, Spur 3). Hingegen zeigte sich bei einer Co-Expression des
Fusionsproteins UBC9-Profilin2 eine sehr starke zusätzliche Bande, die auf eine
SUMOylierung von SMN durch UBC9-Profilin2 zurückgeführt werden kann (Abb. 12A, Spur
5). Dies weist stark auf eine Interaktion von Profilin2 mit SMN hin, da durch diese das UBC9-
Fusionsprotein in unmittelbare Nähe des SMN-Proteins gebracht und die Übertragung des
SUMO-Proteins von UBC9 auf SMN ermöglicht werden könnte. SMN wird vermutlich
mehrfach SUMOyliert, da das SUMOylierte SMN weit oberhalb der erwarteten Größe von
ca.100 kD lag. Endogenes SMN führt nach Expression von UBC9-Profilin2 und SUMO1 zu
keiner Verschiebung der Bande (Abb. 11A, Spur 6). Der Nachweis der Expression von UBC9
und des Fusionsproteins UBC9-Profilin2 erfolgte mit einem gegen UBC9 gerichteten
Antikörper. Bei der Überexpression der Konstrukte wurden von Niedenthal und Mitarbeitern
definierte DNA-Mengen eingesetzt, die experimentell bestimmt worden sind. Dies erklärt eine
schwächere Expression von UBC9 im Vergleich zu UBC9-Profilin2.
Die Ansätze wurden parallel mit dem EGFP-Antikörper entwickelt. Der Antikörper
detektiert SMN-EGFP in Spur 2 (Abb. 11B). Bei einer Überexpression von SUMO-EGFP
wurden mehrere Proteine erkannt: SUMO-EGFP, SMN-EGFP und alle Proteine der Zelle, die
durch SUMO-EGFP modifiziert wurden (Abb. 11B, Spur 3-6). Daher ergaben sich bei einer
Überexpression von SUMO1 mehrere Banden, die nicht einem bestimmten Protein
zugeordnet werden können, sondern welche die SUMOylierung von Proteinen zeigen, die
allein durch die Überexpression von SUMO1 begünstig werden. Jedoch führte lediglich die
Überexpression von SMN-EGFP, UBC9-Profilin2 und SUMO1 zu einer starken Bande auf
der Höhe von ca. 140 kD, die auch mit dem SMN-Antikörper detektiert worden ist (Abb. 11B,
Spur 5). Die SUMOylierung von SMN und damit die Interaktion von Profilin2 und SMN
konnte also auch mit dem EGFP-Antikörper nachgewiesen werden. Die Ergebnisse aus A
und B sind hoch reproduzierbar. Das Ergebnis konnte auch in HEK bzw. PC12-Zellen
reproduziert werden (Daten nicht gezeigt). Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass
mit Hilfe des TRS erstmals eine Interaktion zwischen SMN und Profilin2 in vivo in einem
neuronalen Zellmodell nachgewiesen werden konnte.
Ergebnisse
63
Abb. 11: Das Trans-Sumoylierungs-System zeigt eine Interaktion von SMN und Profilin2 in vivo. Beim TRS erfolgt der Nachweis einer Protein-Protein-Interaktion über die SUMOylierung. (A) Zur Untersuchung der putativen Interaktionspartner Profilin2 und SMN wurde Profilin2 mit UBC9 fusioniert und mit pSMN-EGFP und pSUMO-1 in NSC34-Zellen mittels Lipofektion co-transfiziert. Zudem wurden 5 Kontrollen mitgeführt. 24 h nach Transfektion wurden die Zellen mit 1 x Laemmli-Puffer versetzt. Anschließend wurden 20 µl der Lysate auf ein 10%iges SDS-Gel aufgetragen und einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Für die Detektion von SMN bzw. SMN-EGFP-SUMO1 (S1) wurde ein SMN-Antikörper verwendet. Spur 1 und 2 zeigen die SMN Expressionsmuster von endogenen bzw. überexprimierten SMN. Eine zusätzliche Expression von SUMO1 führte zu keiner nachweisbaren Veränderung des SMN-Bandenmusters (Spur 3). Eine Co-Expression von SMN-EGFP, SUMO und UBC9 zeigten ebenfalls keine Veränderung (Spur 4). Die Co-Expression von SMN-EGFP, SUMO-1 und dem Fusionsprotein UBC-Profilin2 hingegen führte zu einer zusätzlichen SMN-Bande (Spur 5), die auf die SUMOylierung von SMN zurückzuführen ist. Endogenes SMN hingegen wurde nicht nachweisbar SUMOyliert (Spur 6). (B) Der EGFP-Antikörper detektiert EGFP-SUMO1 und SMN-EGFP. Durch die Überexpression von SUMO1 wurden einige Proteine unspezifisch SUMOyliert (3-6). Bei Co-Expression von Profilin2-UBC9, SMN-EGFP und SUMO-EGFP ergab sich eine zusätzliche Bande, die auf die SUMOylierung von SMN-EGFP durch UBC9-Profilin2 zurückzuführen ist. Die Interaktion ließ sich damit auch mit EGFP-Antikörpern nachweisen. Das Ergebnis ist hoch reproduzierbar.
Ergebnisse
64
3.8.2 Eine Poly-Prolin-Sequenz ist für die Bindung von Profilin2 an SMN verantwortlich Profilin2 bindet vermutlich über seine Prolin-Bindungsdomäne an die repetitiven
Prolinsequenzen in Exon5 des SMN-Proteins. Dabei handelt es sich um drei Prolin-
Mikrodomänen innerhalb der Aminosäure-Sequenz von 195-248, die jeweils 17 AS
voneinander getrennt liegen. Im folgenden Versuch sollte die Bindung von Profilin2 an diese
Region anhand des TRS nachgewiesen werden. Dafür wurden durch ortsgerichtete
Mutagenese drei SMN-Mutanten hergestellt, bei denen in jeweils einer Mikrodomäne Proline
durch Alanine ausgetauscht wurden (P1: SMN P196-198A, P2: SMN P219-224A,
P3: SMN P245-247A). Um zunächst die Verteilung der Prolin-Mutanten zu untersuchen,
wurde die pEGFP und die SMN-Prolin Mutanten in HEK293T-Zellen überexprimiert, nach
24h fixiert und mikroskopisch analysiert. Die Prolin-Mutanten zeigten eine unveränderte
Verteilung im Zellkern und perinukleär (Abb. 12A). Um den Einfluss der Mutation auf die
Profilin2-Bindung zu untersuchen, wurden die SMN-Mutanten jeweils mit SUMO1 und UBC9-
Profilin2 in NSC34-Zellen co-exprimiert und mit einem SMN-Antikörper auf SUMOyliertes
SMN überprüft. Die Western-Blot-Analyse zeigt in Spur 1 erwartungsgemäß eine zusätzliche
SMN-Bande, das SUMOylierte SMN, welches in diesem Fall die Profilin2-SMN-Interaktion
widerspiegelt (Abb. 12B). Die Analyse der Mutanten P1 und P3 zeigten eine vergleichbar
starke SUMO1-SMN-Bande (Abb. 12B, Spur 2 und 4). Die Interaktion wurde demnach durch
den Austausch der fünf Proline in der ersten bzw. der dritten Mikrodomäne nicht
beeinträchtigt. Die Mutante P2, bei der fünf Proline in der Mitte von 10 ausgetauscht worden
sind, zeigte eine deutliche Abnahme der SMN-SUMOylierung und damit eine Zerstörung der
Interaktion. Dieses Ergebnis bestätigt, dass das TRS eine direkte Interaktion von Profilin2
und SMN widerspiegelt. Gleichzeitig konnte anhand der Prolin-Mutanten die 2.Mikrodomäne
als die für die Bindung bedeutsame Sequenz identifiziert werden.
Ergebnisse
65
A
B Abb. 12.: Die Mutation der zweiten Prolin-Sequenz in Exon 5 von SMN zerstört die SMN-Profilin2-Bindung. (A) HEK293T-Zellen wurden mittels Lipofektion mit pEGFP-SMN bzw. mit dem mutagenisierten Vektor transfiziert: SMNP196-198A (P1), SMNP219-224A (P2), SMNP245-247A (P3) wurden nach einer 24-stündigen Expression mit 4%igen PFA-Lösung fixiert. Anschließend wurden die Zellkerne immunzytochemisch durch eine Anfärbung mit DAPI markiert. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop Leica TCS SP2 aufgenommen. Die Abbildung zeigt repräsentative Zellen zur Lokalisation der Prolin-Mutanten im Zellkern. (B) Für einen Interaktionsnachweis mit dem TRS wurden NSC34-Zellen mit pSMN-EGFP bzw. den Prolin-Mutanten P1, P2 und P3, pSUMO-1 und dem Fusionskonstrukt pUBC-Profilin2 für 24 h co-exprimiert und einer Western-Blot-Analyse unterworfen. SMN bzw. SUMO1-SMN wurde mit einem Antikörper gegen SMN detektiert. Das Wildtyp-SMN (WT) wies erwartungsgemäß eine starke SUMO-SMN Bande auf (siehe Pfeil, Spur 1). Die SUMO-SMN-Bande war auf die Wechselwirkung mit UBC9-Profilin2 zurückzuführen und bestätigte die SMN-Profilin2-Interaktion. Die Prolin-Mutanten P1 und P3 wurden gleichermaßen SUMOyliert. Die Interaktion wurde durch die Mutation also nicht gestört. Die Mutante P2 wies jedoch lediglich noch eine sehr schwache SUMOylierung auf. Die Profilin2-Bindung wurde durch die Mutation in der zweiten Prolin-Sequenz von SMN stark gestört. Das Ergebnis ist in vier unabhängigen Experimenten reproduziert worden. P1: SMNP196-198A, SMNP219-224A, SMNP245-247A
Ergebnisse
66
3.8.3 Inhibition und Überexpression von ROCK2 modul iert die Profilin2-SMN Bindung nicht In dieser Arbeit konnte erstmals in einem In-vivo-Experiment die direkte SMN-Interaktion mit
Profilin2 in einem zellulären System nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis untermauert die
Annahme, dass SMN den ROCK-Weg über eine Profilin2-Bindung regulatorisch beeinflusst.
Es wäre denkbar, dass SMN an einen Profilin2-ROCK-Komplex bindet. Verschiedene Daten
weisen jedoch eher darauf hin, dass SMN und ROCK2 um die Profilin2-Bindung
konkurrieren. Zum einen hat die Überexpression von SMN bzw. Profilin2 einen
gegenläufigen Effekt auf das Neuritenwachstum. Zum anderen führt ein verminderter
SMN-Proteinspiegel zu einer verstärkten Phosphorylierung von Profilin2, die auf eine
verstärkte Profilin2-Interaktion zurückgeführt werden kann. (van Bergeijk, 2007) Vermutlich
hemmt SMN durch die Profilin2-Bindung das ROCK2-Protein und nimmt auf diese Weise
Einfluss auf das Neuritenwachstum. Um den Zusammenhang von SMN, Profilin2 und
ROCK2 näher zu charakterisieren, sollte die Profilin2-SMN-Bindung sowohl bei Hemmung
der ROCK-Aktivität als auch nach Überexpression von ROCK2 mit dem TRS analysiert
werden. Zum Nachweis der Profilin2-Bindung wurden NSC34-Zellen wie bereits beschrieben
mit SMN-EGFP transfiziert. Zur Hemmung wurde der ROCK-Inhibitor Hydroxyfasudil
verwendet. Hydroxyfasudil findet in der Klinik Anwendung bei kardio-vaskulären
Erkrankungen. Arbeiten unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass eine Konzentration von 30 µM
in SMN-defizienten PC12-Zellen zu einer Wiederherstellung der Neuritenlänge führt.
Diese Konzentration wurde daher für die Manipulation von ROCK in diesem Versuch
eingesetzt. Hydroxyfasudil wurde direkt nach der Transfektion ins Medium gegeben und für
24 h angewendet. Zur Überexpression von ROCK2 wurde ein Ansatz mit pROCK2-HA co-
transfiziert. Die anschließende Western-Blot-Analyse zeigte in allen drei Ansätzen eine
Profilin2-SMN-Bindung (Abb. 13). Jedoch führte weder die Zugabe von Hydroxyfasudil noch
die Überexpression von ROCK2 zu einer Veränderung der SMN-Profilin2-Bindung im TRS.
Ergebnisse
67
Abb. 13: Die SMN-Profilin2-Bindung wird weder durch die Inhibition noch durch Überexpression von ROCK2 beeinflusst. Für einen Interaktionsnachweis mit dem TRS wurden NSC34-Zellen mit pSMN-EGFP, pSUMO1 und dem Fusionskonstrukt pUBC9-Profilin2 für 24 h co-exprimiert und einer Western-Blot-Analyse unterworfen. SMN bzw. SUMO1-SMN wurde mit einem Antikörper gegen SMN detektiert. Für eine ROCK-Inhibierung wurde dem Medium die Substanz Hydroxyfasudil zu einer Endkonzentration von 30 µM beigefügt. Für die Überexpression von ROCK2 wurden die Zellen mit pROCK-HA co-transfiziert. SUMOyliertes SMN spiegelt in diesem System die SMN-Profilin2-Interaktion wider. Die unbehandelte Kontrolle wies erwartungsgemäß eine starke SUMO-SMN-Bande auf (Spur 1). In Anwesenheit des ROCK-Inhibitors Hydroxyfasudil veränderte sich die SMN-SUMOylierung nicht. Die SMN-Profilin2-Bindung wurde also nicht beeinflusst (2). Auch nach Überexpression von ROCK2 veränderten sich die SMN-SUMOylierung und damit die Profilin2-Interaktion nicht. Das Ergebnis ist in drei unabhängigen Experimenten reproduziert worden.
3.8.4 Eine bei Patienten gefundene Mutation verring ert deutlich die Bindung von Profilin2 an SMN Es wurden fünf in Patienten gefundene SMN Punktmutationen nach funktionellen
Veränderungen untersucht. Die Überexpression der Mutanten führte in PC12-Zellen zu einer
Hemmung des neuronalen Wachstums und hat ähnliche Auswirkungen wie ein Knock-Down
von SMN. Nachfolgend sollte nun überprüft werden, ob die Mutanten Profilin2 binden
können. Dafür wurde die Profilin2-Bindung bei den SMN-Mutanten mit dem TRS-Assay, wie
bereits beschrieben, analysiert. Zunächst konnte anhand der Western-Blot-Analyse gezeigt
werden, dass das SMN-Niveau in Lysaten der Mutanten und des Wildtyp-SMNs gleich war.
Die Mutation führte also nicht zu einer Veränderung der SMN-Stabilität. Die Bindung von
Profilin2 konnte bei den Mutanten W92S, E134K, Y272C und T274I nachgewiesen werden
und war im Vergleich zum Wildtyp unverändert (Abb. 14, Spur 1, 2, 3, 5, und 6). Die Mutation
S230L führte hingegen zu einer deutlichen Abnahme der Bindung. S230L liegt am Anfang
von Exon 6 und in unmittelbarer Nähe der identifizierten Profilin2-Bindungsstelle. Dieser
Befund weist darauf hin, dass die gestörte Bindung an Profilin2 für die Pathogenese von
SMA eine wichtige Rolle spielt.
Ergebnisse
68
Abb.: 14.: Die bei Patienten identifizierte Mutation SMNS230L stört die SMN-Profilin2-Interaktion. Für einen Interaktionsnachweis mit dem TRS wurden NSC34-Zellen mit pSMN-EGFP bzw. mit dem mutagenisierten Vektor -SMNW92S, -SMNE134K, -SMNS230L,-SMNY272C oder -SMNT274I transfiziert, mit pSUMO1 und pUBC9-Profilin2 für 24 h co-exprimiert und einer Western-Blot-Analyse unterworfen. SMN bzw. SUMO1-SMN wurde mit einem Antikörper gegen SMN detektiert. Die Mutation beeinträchtigte den SMN-Protein-Spiegel nicht. Lediglich die Mutante E134K wies hier eine leicht verringerte SMN-Überexpression auf. Dieser Befund war nicht reproduzierbar. Anhand der SMN-SUMOylierung (siehe Pfeil) konnte beim Wildtyp und bei den Mutanten eine vergleichbare Profilin2-SMN-Interaktion nachgewiesen werden (Spur 1, 2, 3, 5, 6). Die Mutante S230L weist jedoch eine deutliche verringerte SMN-Profilin2-Interaktion auf. Das Ergebnis wurde in drei unabhängigen Experimenten reproduziert.
3.9 Die Phosphorylierung von Profilin2 reguliert da s Wachstum von Neuriten
Bei der neuronalen Differenzierung bindet NGF an den Rezeptor p75 und hemmt in Folge
die Rho-A vermittelte Aktivierung des ROCK-Wegs. Eine pharmakologische Hemmung der
ROCK-Aktivität fördert das Aussprossen der Neuriten und das Längenwachstum (da Silva et
al., 2003). Die Überexpression von ROCK2 wirkt sich hingegen inhibitorische auf die
Neuritogenese aus und führt zu einer Akkumulation der Aktin-Filamente. SMN moduliert die
ROCK2-vermittelte Phosphorylierung der Aktin-bindenden Proteine Cofilin und Profilin.
Cofilin und nicht Phospho-Cofilin begünstigt überwiegend die Depolymerisation von Aktin-
Filamenten. Bei reduziertem SMN-Spiegel nimmt die Phosphorylierung von Cofilin ab; dieses
Protein ist also vermehrt in aktiver Form vorhanden. Gleichzeitig liegt Profilin2 bei einem
SMN-Mangel hyperphosphoryliert vor; die Bedeutung der Phosphorylierung von Profilin2
durch ROCK2 konnte noch nicht eindeutig geklärt werden. Shao et al. identifizierten bei
Untersuchungen zur Phosphorylierung von Profilin1 durch ROCK 1 den Serin-Rest-137 als
Phosphorylierungsstelle. In neuronalen Zellen überwiegen die Formen ROCK2 und Profilin2.
Im Folgenden sollte die Bedeutung des Serin-Rest-137 auf die neuronale Differenzierung
analysiert werden. Hierfür wurde die dominant-negative Mutante Profilin2 S137A und die
konstitutiv-aktive Mutante Profilin2 S137D generiert. Die Phospho-Mutanten und der
Profilin2-Wildtyp wurden in PC12-Zellen mit einer Co-Transfektion von pDs-red
Ergebnisse
69
überexprimiert und nach 24 h Proliferation für 72 h bei Anwesenheit von NGF differenziert.
Weder die Mutante S137A noch die Mutante S137D führte zu einer signifikanten
Veränderung der Neuritenlänge (Abb. 15). Jedoch zeigte die konstitutiv-aktive Mutante
S137D eine abnehmende Tendenz. Im Vergleich mit der dominant negativen Mutante S137A
sind die Neuriten bei S137D hoch signifikant verkürzt. Es konnte damit gezeigt werden, dass
die Phosphorylierung von Profilin2 am Serin-Rest 137 das Neuritenwachstum beeinflusst.
Abb. 15: Die Phosphorylierung am Serin-Rest 137 von Profilin2 beeinflusst das Neuritenwachstum. PC12-Zellen wurden mittels Lipofektion mit pIRES-Profilin2 bzw. mit der mutagenisierten dominant-negativen Form S137A und mit der konstitutiv-phosphorylierten Form S137D transfiziert. Um die Neuritenlänge genetisch veränderter Zellen zu bestimmen, erfolgte eine Co-Transfektion mit pDsRed2. Nach Transfektion wurden die Zellen für 24 h unter Proliferationsbedingungen auf Kollagen I kultiviert, anschließend für 72 h in Anwesenheit von NGF differenziert und mit 4% PFA fixiert. Die Quantifizierung der Neuritenlängen erfolgte durch die Bestimmung des jeweils längsten Neuriten einer pDsRed-positiven Zelle. Der Fortsatz musste mindestens einen Zelldurchmesser und >40 µm lang sein. Es wurden mindestens 75 Zellen von drei unabhängigen Transfektionsansätzen gemessen. Signifikante Unterschiede wurden mit einer One-way-Anova-Analyse bestimmt und mit *** (p<0,0002) gekennzeichnet (Mittelwerte ± Fehler der Standardabweichung).
3.10 Die SMN-Punktmutanten bilden Oligomere mit dem Wildtyp-SMN
SMN bildet über die Bindedomänen in Exon 2 und Exon 6 Oligomere (Young et al., 2000;
Lorson et al., 1998). Um die Selbstassoziierung von SMN mit dem TRS darzustellen, wurde
SMN mit UBC9 über eine Klonierung in den Vektor pNU fusioniert und mit pSMN-EGFP und
pSUMO1 in NSC34-Zellen für 24 h co-exprimiert. Der Nachweis der Oligomerisierung von
SMN erfolgte über die SUMOylierung von SMN-EGFP, die in der Western-Blot-Analyse
detektiert wurde. Als Positiv-Kontrolle für den Interaktionsnachweis über eine
SMN-SUMOylierung wurde ein Ansatz mit Profilin2-UBC9 und Kontrolle mitgeführt (Abb. 16,
Spur 1 und 2). Mit diesem Ansatz konnte die unter 3.5.1 beschriebene Interaktion von
Profilin2 und SMN reproduziert werden. Eine Überexpression von SMN-EGFP und SMN-
UBC9 zur Darstellung der Oligomerisierung führte ebenfalls zur einer SUMOylierten SMN-
Bande auf der Höhe von ca. 140 kD (Abb. 16, Spur 3, siehe Pfeil). Die Negativ-Kontrolle
Ergebnisse
70
ohne EGFP zeigte diese Bande nicht. Damit konnte mit dem TRS auch eine
SMN-Oligomerisierung nachgewiesen werden. Da UBC9 das Protein SUMO1 bindet, werden
mit dem SMN-Antikörper weitere SMN Banden detektiert, die auf eine SUMOylierung von
SMN-UBC9 zurückgeführt werden können. Ein Vergleich mit der Negativkontrolle zeigte,
dass die Bande bei 140 kD in Spur 3 auf eine SUMOylierung von SMN-EGFP zurückgeht
und damit die Interaktion mit SMN-UBC9 reflektiert.
Als Teil dieser Arbeit wurden die Auswirkungen einer Überexpression der SMN-Patienten-
Mutanten in verschiedenen zellulären Systemen untersucht. Bei den Analysen war unklar, ob
die SMN-Mutanten noch in der Lage sind, mit den endogenen SMN Oligomere zu bilden.
Daher wurde eine Oligomerisierung der SMN-Mutanten mit SMN-UBC9 im TRS untersucht.
In der Western-Blot-Analyse wurde beim Wildtyp und bei allen SMN-Mutanten über die
SUMOylierte SMN-Bande eine Interaktion detektiert (Abb.16, siehe Pfeil,). Die Analyse
lieferte einen Nachweis dafür, dass alle untersuchten Punktmutanten noch in der Lage sind,
bei Überexpression in einem zellulären System Oligomere zu bilden.
Abb. 16: Die Punktmutanten weisen noch eine Interaktion mit dem Wildtyp-SMN auf (A) Zum Nachweis der SMN-Oligomerisierung mit dem TRS wurde SMN mit UBC9 fusioniert und mit pSMN-EGFP und pSUMO1 in NSC34-Zellen mittels Lipofektion co-transfiziert. Als Postivkontrolle wurde ein Ansatz mit einer Co-Transfektion von SMN-EGFP, pUBC9-Profilin2 und pSUMO1 zur Darstellung der Profilin2-SMN-Interaktion mitgeführt. Die Ansätze wurden 24 h nach Transfektion einer Western-Blot-Analyse unterworfen. Die Überexpression von pUBC9-Profilin2 führte erwartungsgemäß zur SUMOylierung von SMN. Eine Überexpression von SMN-EGFP und SMN-UBC9 zur Darstellung der Oligomerisierung führte ebenfalls zur Detektion einer SUMOylierten SMN-Bande auf der Höhe von ca. 140 kD (Spur 3, siehe Pfeil). Die Negativ-Kontrolle ohne pEGFP zeigten diese Bande nicht (Spur 2 und 4). Da UBC9 das Protein SUMO1 bindet, werden mit dem SMN-Antikörper weitere SMN Banden detektiert, die auf eine SUMOylierung von SMN-UBC9 zurückgeführt werden können. Ein Vergleich mit der Negativkontrolle zeigte, dass die Bande bei 140 kD in Spur 3 auf eine SUMOylierung von SMN-EGFP zurückgeht und damit die Interaktion mit SMN-UBC9 reflektiert. (B) Für einen Interaktionsnachweis von SMN mit den Patienten-Mutanten wurden NSC34-Zellen mit pSMN-EGFP bzw. mit dem mutagenisierten Vektor -SMNW92S, -SMNE134K, -SMNS230L,-SMNY272C oder -SMNT274I transfiziert, mit pSUMO1 und pUBC9-Profilin2 für 24 h co-exprimiert und einer Western-Blot-Analyse unterworfen. Die Mutation führte im Vergleich zum Wildtyp zu keiner veränderten Oligomerisierung, wiedergegeben durch SUMOyliertes SMN auf der Höhe 140 kD,
Ergebnisse
71
A
B
Diskussion
72
4 Diskussion
Bei der proximalen Spinalen Muskelatrophie (SMA) führt die Deletion oder Mutation des
SMN1-Gens zur Degeneration der α-Motoneurone im Vorderhorn des Rückenmarks. Es
konnte noch nicht geklärt werden, welche molekularen Konsequenzen, die letztendlich zum
Absterben der Motoneurone führen, der SMN-Verlust verursacht. Das SMN-Protein ist an
vielen Prozessen in der Zelle beteiligt. Neben der Assemblierung der snRNPs im
perinukleären Raum hat SMN axonale Funktionen. Diese sind belegt durch Beobachtungen
an verschiedenen In-vitro- und In-vivo-Modellen der SMA, die Störungen beim axonalen
Wachstum und bei der Ausbildung der neuromuskulären Synapse (NMJ) aufweisen. Unsere
Arbeitsgruppe hat die Auswirkung von SMN auf das axonale Wachstum bei PC12-Zellen
untersucht. Da bei den PC12-Zellen Axon und Dendriten nicht voneinander unterschieden
werden können, werden die Ausläufer allgemein als Neuriten bezeichnet. Es konnte gezeigt
werden, dass SMN das Neuritenwachstum in Anwesenheit von NGF stimuliert und eine
verminderte SMN-Menge in kürzeren Neuriten resultiert (van Bergeijk et al., 2007). In
nachfolgenden Untersuchungen konnten auch Veränderungen des Aktin-Zytoskeletts und
eines Aktin-regulierenden Signalwegs, des ROCK-Weges, gefunden werden. Letzteres
äußerte sich in einem differentiellen Phosphorylierungsmuster der stromabwärts bindenden
ROCK2-Substraten Profilin2 und Cofilin, welche die Aktin-Dynamik während der neuronalen
Differenzierung maßgeblich regulieren. Auffälligerweise co-lokalisiert SMN mit Profilin2 in
RNA-haltigen Granula und im Wachtumskegel (Sharma et al., 2005). SMN besitzt eine Poly-
Prolin-Domäne, die eine direkte Interaktion mit Profilin2 vermuten lässt.
Als zentrales Thema dieser Arbeit wurde die Interaktion von SMN mit dem ROCK-Weg
näher charakterisiert. Dabei stand das Aktin-bindende Protein Profilin2 im Mittelpunkt der
Untersuchungen. Biochemischen Analysen mit Lysaten, die aus Rückenmarksgewebe von
SMA-Mäusen und Wildtypmäusen hergestellt worden sind, deckten sich mit den in vitro
gefundenen Veränderungen des ROCK-Wegs. Diese In-vivo-Befunde heben die Bedeutung
des ROCK-Wegs im Hinblick auf die SMA-Pathogenese hervor. In nachfolgenden
Untersuchungen konnte dann ein näherer molekularer Zusammenhang zwischen SMN und
dem ROCK-Weg hergestellt werden. Dabei erbrachten Analysen mit einem neuen Protein-
Protein-Interaktionssystem auf zellulärer Ebene Evidenz für eine direkte Interaktion von SMN
mit Profilin2. Der Profilin2-Interaktionsnachweis legte die Annahme einer direkten
Verknüpfung von SMN mit dem ROCK-Weg nahe. Interessanterweise konnte bei einer SMA-
assoziierten SMN-Punktmutation eine gestörte Profilin2-SMN-Bindung nachgewiesen
Diskussion
73
werden. Trotz zunehmender Evidenzen für eine wichtige axonale Rolle von SMN ist bis
heute noch nicht eindeutig geklärt, ob die axonale und/oder nukleäre Funktion für die SMA-
Pathogenese von Bedeutung ist. Daher wurden in dieser Arbeit auch die SMN-haltigen
Kernkörperchen (Cajal-Körperchen und Gems) in die Untersuchungen mit einbezogen.
Anhand jüngster Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe kann dem SMN-Interaktionspartner
FGF-223 eine neue regulatorische Rolle bei der Stabilität der Gems zugeschrieben werden
(Bruns et al., 2009). Dieser neue Befund ist insofern für die Charakterisierung der SMA-
Pathogenese von Bedeutung, als die Kernkörperchen bei den SMA-Patienten reduziert sind.
Im Folgenden werden die Ergebnisse dieser Arbeit zur axonalen bzw. nukleären Funktion
von SMN im Kontext der bereits vorhandenen Literatur diskutiert.
4.1 Der Rho-Kinase (ROCK)-Weg ist in vivo verändert
Bei PC12-Zellen führt ein Knock-Down von SMN zu einem veränderten Neuritenwachstum.
Zudem konnten biochemische Veränderungen des Aktin-regulierenden ROCK-Signalwegs
nachgewiesen werden, die mit einer Hyperstabilisierung der Aktin-Filamente einhergehen
(van Bergeijk et al., 2007). Eine Expressionsveränderung von Profilin2, einem Stabilisator
des Aktin-Zytoskeletts und Interaktionspartner von ROCK, konnte jedoch nicht festgestellt
werden. Interessanterweise wurden in den biochemischen Analysen Veränderungen von
Profilin2 auf posttranslationaler Ebene gefunden. Profilin2 lag bei den SMN-defizienten
Zellen hyperphosphoryliert vor (van Bergeijk, 2007).
In dieser Arbeit konnte bestätigt werden, dass ein SMN-Mangel auch in vivo zu einer
Hyperphosphorylierung von Profilin2 führt. Diese Veränderung wurde anhand von
biochemischen Analysen von Rückenmarksgeweben, die am postnatalen Tag 9 (PND 9) aus
SMA-Mäusen und Wildtyp-Geschwistern entnommen worden sind, nachgewiesen. Dabei
wurde ein Mausmodell herangezogen, das den Verlauf einer schweren SMA widerspiegelt.
Diese SMA-Tiere unterscheiden sich am PND 9 in ihrer Größe und ihren motorischen
Fähigkeiten wesentlich von ihren gesunden Geschwistern. Die Profilin2-Phosphorylierung
wird direkt von ROCK2 vermittelt, wie Untersuchungen von Da Silva und Mitarbeitern anhand
von PC12-Zellen zeigten. Dabei führte eine Hemmung von ROCK2 mit dem Inhibitor Y26732
zu einer Abnahme von Phospho-Profilin2 und einer Stimulation des Neuritenwachstums (Da
Silva et al., 2003). Die in dieser Arbeit beschriebene Hyperphosphorylierung von Profilin2
weist daher stark darauf hin, dass der ROCK-Signalweg im SMA-Mausmodell differentiell
reguliert wird. Profilin2 interagiert auch mit weiteren Aktin-Regulatoren wie z.B. N-WASP,
einem Substrat der kleinen GTPase Cdc42. Es wäre daher auch denkbar, dass die
Hyperphosphorylierung von Profilin2 über einen anderen Signalweg reguliert wird. Unsere
Diskussion
74
Arbeitsgruppe konnte jedoch in SMN-defizienten PC12-Zellen zeigen, dass noch weitere
Interaktionspartner von ROCK2, nämlich die MLCP, LIMK und stromabwärts Cofilin,
hyperphosphoryliert vorliegen (van Bergeijk, 2007). In Verbindung mit diesen Befunden kann
stark angenommen werden, dass die beobachtete In-vivo-Veränderung auf eine Interaktion
mit dem ROCK-Weg zurückgeführt werden kann. Die hier verwendeten SMA-Mäuse zeigten
zum Zeitpunkt PND 9 schon Symptome des fortgeschrittenen Stadiums. Daher kann aus
diesen Analysen nicht eindeutig gefolgert werden, ob die Beobachtung eine Ursache der
Neurodegeneration (oder) darstellt oder ob diese eher als eine Folge dieser gesehen werden
kann. Nachfolgend konnte jedoch eine direkte Interaktion von SMN mit dem ROCK-Weg
nachgewiesen werden, die eine Veränderung des ROCK-Wegs als direkte Konsequenz
eines SMN-Verlusts vermuten lässt.
Bowerman et al. beobachteten einen Anstieg der Profilin2-Expression in SMN-defizienten
PC12-Zellen (Bowerman et al., 2007). Dabei verwendeten sie eine PC12-Zelllinie, bei
welcher der SMN-Spiegel durch eine stabile Transfektion mit shRNA herunterreguliert wurde
(PC12 C59). In unseren Analysen untersuchten wir transient transfizierte PC12-Zellen und
fanden keine Veränderung des Profilin2-Spiegels (van Bergeijk et al., 2007). In jüngster Zeit
haben Bowerman und Mitarbeiter die Profilin2-Expression anhand eines SMA-Typ-II-
Mausmodells (SMN 2B/-) analysiert. Dabei fanden sie in immunhistochemischen
Untersuchungen eine Motoneuron-spezifische Erhöhung der Profilin2-Expression. Die
Befunde dieser Arbeit deuten jedoch darauf hin, dass Lysaten, die aus Rückenmarksgewebe
der SMA-Typ-I-Maus hergestellt worden waren, keine veränderte Profilin2-Expression
aufweisen. Das Ergebnis deckt sich mit unseren In-vitro-Daten, die anhand transient SMN-
defizienten PC12-Zellen gewonnen wurden. Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass eine
von Bowerman et al. beschriebene zell-autonome Erhöhung der Profilin2-Expression in den
Rückenmarkslysaten maskiert wird und mittels Western-Blot-Analyse nicht detektiert werden
kann. Es konnte jedoch bei diesen Lysaten anhand einer isoelektrischen Fokussierung eine
Hyperphosphorylierung von Profilin2 nachgewiesen werden. Im Zusammenhang mit unseren
In-Vitro-Daten, ist stark anzunehmen, dass dieses Ergebnis nicht auf eine zell-autonome
erhöhte Profilin2-Expression zurückzuführen, sondern vielmehr mit einer veränderten
Regulation des ROCK-Wegs zu begründen ist.
ROCK2 phosphoryliert sowohl Profilin2 als auch die LIMK, die stromabwärts zu einer
Phosphorylierung von Cofilin führt. Untersuchungen an PC12-Zellen und primären
neuronalen Zellkulturen aus der Ratte und dem Huhn belegen, dass eine verstärkte
Phosphorylierung von Cofilin das Wachstum und die Mobilität der Wachstumskegel hemmte
(Endo et al., 2007; Meberg und Bamburg, 2000). Dabei geht die Phosphorylierung von
Cofilin mit einer Inaktivierung des Proteins einher, die durch die Phosphatase SHH wieder
Diskussion
75
aufgehoben werden kann. Bei diesen Beobachtungen muss berücksichtigt werden, dass die
Funktion von Cofilin von der lokalen Konzentration in den Zellen abhängt (Andrianantoandro
und Pollard 2006).
Die Auswirkungen der Profilin2-Phosphorylierung ist in der Literatur bisher noch nicht
beschrieben worden. Shao und Mitarbeiter haben bei der Isoform Profilin1 den Serin-Rest
137 als Phosphorylierungsstelle identifiziert (Shao et al., 2009). In dieser Arbeit wurde in
PC12-Zellen anhand von zwei, Punktmutanten, von einer dominant-negativen und einer
konstitutiv-phosphorylierten Mutante, der Einfluss der Phosphorylierung am Serinrest 137 auf
das Neuritenwachstum ermittelt. Die konstitutive Phosphorylierung führte zu einer Abnahme
der Neuritenlänge. Dieses Ergebnis liefert ein ähnliches Bild, wie es in SMN-defizienten
PC12-Zellen gefunden worden ist. In Zusammenhang mit diesen Daten könnte angenommen
werden, dass die Phosphorylierung von Profilin2 einen negativen Effekt auf das
Neuritenwachstum ausübt. Jedoch kann Profilin2 nicht isoliert betrachtet werden, sondern es
müssen auch weitere Faktoren wie z.B. weitere ROCK-Substrate mit einbezogen werden.
Unsere Arbeitsgruppe hat gezeigt, dass auch Cofilin bei einem SMN-Mangel verändert
phosporyliert vorliegt. Wie bereits erwähnt, konnte dem Protein Cofilin eine zentrale Rolle bei
der Regulation des Neuritenwachstums zugesprochen werden. Daher sollte eine putative
Rolle von Cofilin bei den Betrachtungen nicht ausgeschlossen werden.
4.2 SMN beeinflusst die ROCK-Aktivität
ROCK2 spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation des Neuritenwachstums, unter anderem
indem sie die Aktivität zweier Aktin-bindender Proteine reguliert. Bei einer p75-Rezeptor-
vermittelten Induktion des neuronalen Wachstums wird zunächst RhoA und in Folge ROCK2
bzw. der ROCK-Signalweg gehemmt. Sowohl eine Inhibition von RhoA durch das Exoenzym
C3 als auch eine Hemmung von ROCK durch den Inhibitor Y26732 führen zu einem
verstärkten Wachstum der Ausläufer (Jalink et al., 1994; Bito et al., 2000).
Eine Überexpression einer konstitutiv aktiven RhoA-Mutante hemmt die Neuritogenese und
resultiert in einer Zurückbildung bereits ausgesprosster Ausläufer. Wie bereits ausgeführt,
kommt dem SMN-Protein eine regulierende Funktion beim neuronalen Wachstum zu.
Im Folgenden wurde untersucht, ob SMN einen Einfluss auf die ROCK-Aktivität in einem
etablierten ROCK-Aktivitätsassay zeigt.
In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass eine Überexpression von SMN bei
PC12-Zellen zu einer verminderten ROCK-Aktivität führt. Dieses Ergebnis zeigt ähnliche
Effekte wie eine RhoA bzw. ROCK-Inhibition. Allerdings kann SMN in Abwesenheit von NGF
das Aussprossen der Neuriten im Gegensatz zu einer RhoA-Inhibition nicht induzieren (van
Diskussion
76
Bergeijk, 2007). SMN hat vielmehr eine modulierende Funktion beim Neuritenwachstum. Ein
Knock-Down von SMN führt zu einem verminderten Wachstum der Ausläufer. Im ROCK-
Aktivitätsassay konnte jedoch keine Veränderung der ROCK-Aktivität gemessen werden. Die
ROCK-Aktivität wurde in diesem Assay über die Phosphorylierung der Subunit of myosin
phosphatase (MBS), eines künstlichen Peptids, gemessen. Es liegen aber auch Daten zu
natürlichen ROCK-Substraten, nämlich der LIMK und der MLP, vor. Diese zeigen, dass ein
Knock-Down von SMN neben einer verstärkten Phosphorylierung von Profilin2 mit einer
Abnahme von Phospho-LIMK und Phospho-MLCP einhergeht (van Bergeijk, 2007). Diese
Ergebnisse lassen vermuten, dass die ROCK-Aktivität durch den verminderten SMN-Gehalt-
vermutlich über Profilin2-gehemmt wird. Es stellt sich die Frage, warum dieser Befund nicht
mit dem ROCK-Aktiviätsassay bestätigt werden konnte. Da sich die untersuchten
Phosphorylierungsstellen bei der MLCP bzw. des Peptids MBS voneinander unterscheiden,
könnte der SMN-Verlust einen differentiellen Einfluss auf diese ausüben. Bei dem ROCK-
Aktivitätsassay detektiert der verwendete Antikörper die Phosphorylierung des Threonin-
Restes 696 der MBS. Der in der Western-Blot-Analyse verwendete Antikörper erkennt die
Phosphorylierung am Threonin-Rest 850. Es wäre daher denkbar, dass SMN über ROCK2
auf die Phosphorylierungsstellen der MLCP einen differentiellen Einfluss hat. Zudem kann
nicht völlig ausgeschlossen werden, dass die gemessene verminderte Phosphorylierung von
MBS bei einer SMN-Überexpression auf eine differentielle Aktivität weiterer Mitglieder der
Dystrophia myotonica protein kinase (DMKP)-Familie zurückzuführen ist. Außerdem muss
berücksichtig werden, dass die ROCK-Aktivität nicht über die Phosphorylierung eines
einzigen Substrat definiert werden kann. Die Phosphorylierung der ROCK2-Substrate wird
durch die Interaktion weiterer Proteine, z.B. mit den Phosphatasen beeinflusst. Die LIMK
wird über die Interaktion mit der SHH dephosphoryliert. Es müsste daher noch ein Einfluss
von SMN auf die Phosphatasen untersucht werden.
4.3 NSC34-Zelllinie stellt ein geeignetes SMA-In-vi tro-Modell dar
Die Anwesenheit von NGF im Medium induziert bei den PC12-Zellen die neuronale
Differenzierung, die durch SMN moduliert wird. Neben dieser Zelllinie konnte auch in
weiteren In-vitro-Modellen ein Einfluss von SMN auf das Neuritenwachstum festgestellt
werden. In primären Motoneuron-Zellkulturen, die aus SMA-Mäusen angelegt worden sind,
besitzen die Zellen kürzere Ausläufer und Anschwellungen am Neuritenende (Rossoll et al.,
2003; Ting et al., 2007). Darüber hinaus konnte ein gestörter axonaler Transport der ß-Actin-
mRNA beobachtet werden (Rossoll et al., 2003). Die NSC34-Zellen stellen eine Motoneuron-
ähnliche Hybrid-Zelllinie dar, die von Cashman und Mitarbeitern 1992 durch eine Fusion von
Diskussion
77
Rückenmarkszellen und Neuroblastoma-Zellen der Ratte generiert worden sind (Cashman et
al., 1992). Die Autoren haben bei den NSC34-Zellen unter anderem eine Expression von
Cholin-Azetyltransferase (ChAT) und Neurofilament-assoziierten Genen nachgewiesen. In
dieser Arbeit wurde das Neuritenwachstum unter einer reduzierten SMN-Menge untersucht
und die Gültigkeit als ein Motoneuron-Modell für die SMA ermittelt. Eine reduzierte, aber
nicht völlig fehlende Expression von SMN entpricht der Situation bei Patienten.
Über einen siRNA-vermittelten Knock-Down konnte einer Verminderung des SMN-
Niveaus auf 77,3 % herbeigeführt werden. Diese SMN-Menge kommt einer Situation nahe,
die in Fibroblasten-Zellen von SMA-Typ I-Patienten gefunden worden ist (van Bergeijk,
2007). In nachfolgenden morphologischen Untersuchungen konnte ein reduziertes
neuronales Wachstum festgestellt und damit die in der Literatur beschriebene Rolle von
SMN als Modulator des Längenwachstums bestätigt werden. NSC34-Zellen differenzieren
bereits unter Normalbedingungen und müssen im Gegensatz zu PC12-Zellen nicht mit
Zusatz von Wachstumsfaktoren stimuliert werden. Die neuronale Differenzierung beginnt
daher anders als bei PC12-Zellen oder murinen SMN-defizienten Motoneuronen schon vor
der Manipulation des SMN-Proteinspiegels. Der Knock-Down, generiert durch eine transiente
Transfektion mit siRNA, führte bei den NSC34-Zellen jedoch gleichermaßen zur Abnahme
der Neuritenlänge.
Einer jüngsten Veröffentlichung der Arbeitsgruppe von Hsieh-Li zufolge kann dem SMN-
Protein eine weitere regulatorische Rolle bei der Dynamik des Zytoskeletts zugesprochen
werden. Die Gruppe konnte nach einem Knock-Down in NSC34-Zellen eine Hochregulation
von Statmin, einem Tubulin-destabilisierenden Protein, nachweisen. Interessanterweise
führte ein Knock-Down von Statmin zu einer Stimulation des neuronalen Wachstums (Wen et
al., 2010). Mikrotubuli und Aktinfilamente unterliegen beim Längenwachstum der Zelle einer
exakten Regulation. Aktin-Filamente sind dabei im Wachstumskegel am Ende des
Ausläufers lokalisiert und dynamisch; hingegen gewährleisten die Mikrotubuli die Stabilität
des Axons/Neuriten und treiben das Längenwachstum durch eine fortlaufende
Polymerisation am distalen Ende voran. Daher wäre es denkbar, dass SMN sowohl auf das
Aktin-Zytoskelett als auch auf die Mikrotubuli eine regulierende Funktion ausübt.
Zusammengefasst führt eine transiente Reduktion von SMN bei der Motoneuron-
ähnlichen Zelllinie NSC34 in gleicher Weise wie bei PC12-Zellen und primären
Motoneuronen zu einem verminderten Wachstum der Ausläufer. Daher ist anzunehmen,
dass SMN in dieser Hybridzelllinie eine ähnliche Rolle einnimmt und sich die in NSC34-
Zellen gewonnenen Erkenntnisse auf die Motoneuronen übertragen lassen. Diesen
Ergebnissen zufolge stellen die SMN-defizienten NSC34-Zellen ein geeignetes In-vitro-
Modell für die SMA dar.
Diskussion
78
4. 4 Charakterisierung der NSC34-Zelllinie
Wie bereits ausgeführt, konnte bei den untersuchten In-vitro-Systemen aber auch beim
Zebrafisch Veränderungen bei der neuronalen Entwicklung beobachtet werden. Jüngste
Veröffentlichungen zeigen, dass verschiedene SMA-Mausmodellen Fehlentwicklungen der
NMJ aufweisen, die sich in einer Akkumulation von Neurofilamenten, einer schwachen
Verzweigung an der Präsynapse und einem veränderten ACh-Rezeptor-Clustering äußern
(Kariya et al., 2008; McGovern et al., 2008, Kong et al., 2009). Kong und Mitarbeiter
beobachteten beim SMN∆7-Maus-Modell eine verminderte synaptische Übertragung, welche
über das Endplattenpotential bestimmt werden konnte (Kong et al., 2009). Da die NMJ zu
diesem Zeitpunkt vollständig innerviert waren, wurden strukturelle Veränderungen der Prä-
und/oder Postsynapse als Ursache vermutet. Mit Hilfe von elektronenmikroskopischen
Untersuchungen konnte die Gruppe Evidenzen dafür erbringen, dass die synaptischen
Vesikel der SMA-Mäuse eine verringerte Dichte aufweisen. Interessanterweise spielt das
Aktin-Zytoskelett in der Präsynapse eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des
Vesikel-Pools sowie bei der Mobilität und dem Transport der synaptischen Vesikel (zur
Übersicht: Dillon und Goda, 2005). Dies belegen auch Beobachtungen an einer Profilin2-
Knock-Out-Maus, die eine vermehrte Vesikel-Ausschüttung in neokortikalen glutamatergen
Neuronen beschreiben (Pilo Boyl et al., 2007).
In dieser Arbeit wurde bereits mehrfach dargelegt, dass SMN sowohl in vitro als auch in
vivo einen Einfluss auf die Dynamik des Aktin-Zytoskelett ausübt. In Verbindung mit diesen
Ausführungen stellte sich die Frage, ob diese regulative Funktion von SMN sich auch auf
den Transport bzw. das Recycling der synaptischen Vesikel auswirkt.
Da die NSC34-Zellen in dieser Arbeit als geeignetes In-vitro-Modell der SMA beschrieben
werden konnten, sollte dieses Modell für Untersuchungen synaptischer Vorgänge
herangezogen werden. Cashman und Mitarbeiter haben gezeigt, dass die NSC34-Zellen in
einer Co-Kultur mit Myotubes, die aus C2C12-Zellen differenziert worden waren, funktionelle
Synapsen ausbilden können. Zur Untersuchung synaptischer Vorgänge können aber auch
reine Motoneuron-Kulturen herangezogen werden (Haastert et al., 2004; Tegenge et al.,
2009). In dieser Arbeit wurde untersucht, ob in einer reinen NSC34-Zellkultur Synapsen
ausgebildet werden, die nachfolgend unter reduzierten SMN-Spiegel untersucht werden
könnten.
Als erster Schritt wurde die Differenzierung der NSC34-Zellen in Hinblick auf die synaptische
Reifung untersucht. Dabei konnte unter serumreduzierten Bedingungen beobachtet werden,
dass die auf PLL-kultivierten Zellen nach einer Woche ausgeprägte ß-Tubulin-positive
Diskussion
79
Ausläufer entwickelten und überwiegend eine multipolare Gestalt annahmen. Über die
Markierung mit dem synaptischen Vesikel-Marker Synaptophysin wurde die Reifung
möglicher Synapsen über den Zeitraum von 2 Wochen nachverfolgt. Der
immunzytochemische Nachweis mit Synaptophysin erbrachte jedoch keine Belege für eine
Bildung synaptischer Vesikel in der differenzierten NSC34-Zellkultur. Möglicherweise
erfordert es eine Kultivierung der Zellen über einen längeren Zeitraum, bis die Reifung der
synaptischen Vesikel einsetzt. Tegenge und Mitarbeiter haben eine Motoneuron-Zellkultur
etabliert und charakterisiert, die aus der Teratokarzinoma-Zelllinie (NT2) hervorgeht und
nach mehreren Kultivierungsschritten sowie einer Stimulation mit Retinsäure in 70 %
Motoneurone differenziert werden können (Tegenge et al., 2009). Neben mehreren
synaptischen Markerproteinen konnte bei diesen Zellen in Anwesenheit von
Fluoreszenzfarbstoffen ein Vesikeltransport und -recycling im Axon nachgewiesen werden,
die den Vorgängen an der Synapse ähnelten. Dies konnten sie deutlich nach einer
vierwöchigen Kultivierung der Zellen beobachten. Eine Kultivierung der NSC34-Zellkultur
über drei Wochen konnte jedoch nicht erreicht werden. Daher scheinen die differenzierten
NSC34-Zellen kein geeignetes Modellsystem zur Untersuchung synaptischer Vorgänge
darzustellen. In nachfolgenden Untersuchungen könnte die NT2-Zelllinie herangezogen
werden, um nach der Differenzierung zu Motoneuronen den Einfluss von SMN auf die
synaptischen Vesikel näher zu untersuchen. Synaptische Vorgänge können
elektrophysiologisch anhand der Technik des Calcium-Imagings visualisiert werden. Bei
einer weiteren Methode werden die Zellen durch eine hohe Kaliumkonzentration im Puffer
depolarisiert. Bei Anwesenheit von Fluoreszenz-Farbstoffen können dann die
wiederaufgenommenen Vesikel und deren Schicksal nachverfolgt werden.
4.5 SMN-Patienten-Mutationen führen spezifisch zu e inem axonalen Defekt
Bei fünf Prozent der SMA-Patienten ist das SMN1-Gen noch vorhanden; jedoch führt in
diesen Fällen eine Mutation im SMN1-Gen zur Expression eines defekten Proteins, welches
das Überleben der Motoneurone nicht mehr gewährleisten kann. Da die Mutationen nicht
zwangsläufig zu einem Verlust aller SMN-Funktionen in der Zelle führen, sind diese für
Untersuchungen zur Beschreibung des Pathomechanismus von großer Bedeutung. In dieser
Arbeit wurden die SMN-Punktmutanten W92S, E134K, S230L, Y272C und T274I auf
verschiedene Charakteristika hin näher untersucht. Anhand mikroskopischer Unter-
suchungen konnte die Lokalisation der Mutanten nach Überexpression in NSC34-Zellen
genauer beschrieben werden. Alle fünf untersuchten Mutanten lokalisierten in den
Kernkörperchen sowie den neuronalen Ausläufern und weisen damit ein ähnliches
Diskussion
80
Verteilungsmuster wie der SMN-Wildtyp auf. In Western-Blot-Analysen konnte nachgewiesen
werden, dass die SMN-Mutationen 24 h nach Überexpression der Konstrukte zu keinen
Unterschieden bezüglich der SMN-Konzentration führen. Es kann daher angenommen
werden, dass die Mutationen nicht zu einem völligen Funktionsverlusts des Proteins führen,
sondern dass vielmehr ein spezifischer Defekt von SMN vorliegt.
Die untersuchten Mutationen W92S und E134K liegen in Exon3 bzw. Y272Cin Exon6 und
gehen beim Patienten mit einer schweren Verlaufsform einher. Diese Mutanten zeigen in
vitro neben Oligomerisierungsdefekten eine verminderte Affinität zu den Sm-Proteinen; bei
den Mutationen E134K und Y272C ist auch eine gestörte snRNP Biogenese beschrieben
worden (Kotani et al., 2007; Shpargel und Matera, 2005; Buhler et al., 1999; Sun et al.,
2005); snRNPs werden im perinuklerären Raum in Assoziation mit dem SMN-Komplex
assembliert und anschließend in den Zellkern in die CBs transloziert. Da eine nukleäre
Lokalisation des SMN-Proteins nachgewiesen werden konnte, ist vermutlich der SMN-Import
in den Zellkern durch die Mutationen nicht maßgeblich gestört. Es wäre jedoch denkbar,
dass das endogene SMN-Protein in den NSC34-Zellen die Lokalisation über eine
Oligomerisierung mit den Mutanten beeinflusst. Diese Vermutung wird unterstützt durch
Befunde des In-vivo-Interaktionsassays, der in dieser Arbeit durchgeführt worden ist. Anhand
dieses Assays konnte gezeigt werden, dass alle fünf untersuchten Mutanten in der Lage
sind, mit dem Wildtyp-SMN zu oligomerisieren. Zudem haben Lorson und Mitarbeiter in vitro
nachweisen können, dass die mit SMA-I-assoziierten Mutanten mit dem Wildtyp-SMN
Oligomere bilden können (Lorson et al., 1998). Um einen Einfluss von endogenem SMN zu
verringern, verwendeten Young et al. für ihre Untersuchungen SMN-defiziente Fibroblasten
von SMA-Patienten. Dabei konnten sie beobachten, dass die Mutanten E134K und Y272C in
gleicher Weise wie bei dem Wildtyp in den Kernkörperchen vorlagen (Young et al., 2004). In
Zusammenhang mit diesen Beobachtungen kann angenommen werden, dass die in dieser
Arbeit untersuchten SMN-Mutanten auch ohne Einfluss des endogenen SMNs in gleicher
Weise wie der Wildtyp in den Nukleus transportiert werden und dort in subnukleären
Strukturen lokalisieren.
Um eine genauere Aussage über die nukleäre Verteilung treffen zu können, wurden die
Mutanten in HEK-Zellen überexprimiert und anschließend die CBs anhand einer Coilin-
Immunfärbung markiert. HEK-Zellen besitzen besonders große Zellkerne und sind aus
diesem Grund ein geeignetes Modell für Untersuchungen nukleärer Strukturen.
Auffälligerweise zeigte die Überexpression der Mutante W92S einen Zerfall der CB in
zahlreichen kleinen SMN-negativen Strukturen, die auch als residuale CBs bezeichnet
werden. Das Auftreten dieser residualen CBs ist auch in HeLa-Zellen nach einem Knock-
Down von SMN beschrieben worden (Girard et al., 2006). Girard und Mitarbeiter konnten in
dieser Veröffentlichung zeigen, dass die Bildung der CBs von der SMN-Protein-
Diskussion
81
Konzentration abhängt. Die Mutation W92S liegt in oder in der Nähe der Bindungsdomäne
von Coilin; eine gestörte Coilin-Bindung könnte daher die CBs destabilisieren. Bisher ist die
Bindungsaffinität von W92S zu Coilin noch nicht untersucht worden. Überraschenderweise
co-lokalisieren die Gems zu 100% mit den verbliebenen CBs, was gegen einen vollständigen
Verlust der Coilin-W92S-Bindung spricht. Es könnten noch weitere Faktoren an der
Destabilisierung der CBs beteiligt sein: Kotani und Mitarbeiter haben gezeigt, dass die W92S
nicht mehr an Fibrillarin und SmB binden kann (Kotani et al., 2007). Interessanterweise wies
die Überexpression der Mutante E134K keine Veränderung der CBs auf, obwohl diese
Mutation in gleicher Weise nicht mehr mit Fibrillarin und SmB in Wechselwirkung treten kann.
Auch die übrigen untersuchten Mutanten zeigten keine signifikante Veränderung bei der
Anzahl der CBs bzw. Gems. Es wäre denkbar, dass SMN in den Kern transportiert und in
den CBs gebunden wird, jedoch aufgrund einer inkorrekten Assemblierung der snRNPs nicht
weiter prozessiert werden kann. snRNPs unterliegen in den CBs verschiedenen
Modifikationen wie der 2-O-Methylierung und Pseudouridylierung. Eine fehlgesteuerte
Modifikation in de CBs könnte veränderte Spleiß-Prozesse zur Folge haben.
Anhand von Deletionsmutanten ist gezeigt worden, dass ein Fehlen des Exon3 zu einer
Anreicherung von SMN im Nukleus führt, hingegen kann SMN bei einer Deletion von Exon6
nicht mehr in den Zellkern transportiert werden (Morse et al., 2007). Die in dieser Arbeit
untersuchten Mutationen wiesen trotz Lokalisation in Exon3 bzw. Exon6 keine von den
Autoren beschriebenen Defekte auf.
Allgemein muss berücksichtigt werden, dass ein Einfluss des endogenen SMNs auf die
nukleäre Verteilung nicht ausgeschlossen werden kann. In weiteren Untersuchungen an
SMN-defizienten Zellen könnte ein möglicher Einfluss genauer bestimmt werden. Darüber
hinaus wäre es interessant, die CB auf eine Co-Lokalisation mit den snRNPs hin zu
untersuchen.
In nachfolgenden Analysen wurde untersucht, in wieweit sich die Mutanten bei
Überexpression auf das Wachstum der neuronalen Ausläufer auswirkt. In unserer
Arbeitgruppe konnte bereits bei PC12-Zellen gezeigt werden, dass eine Überexpression von
SMN das neuronale Wachstum stimuliert und dieser Effekt über den C-Terminus (AS Reste
235-294) von SMN reguliert wird (van Bergeijk et al., 2007). Um die Auswirkung einer
Überexpression mit den vorhandenen Daten vergleichen zu können, wurden für die
folgenden Analysen PC12-Zellen herangezogen. Dabei ergaben die morphologischen
Untersuchungen, dass alle fünf untersuchten Mutanten nach Überexpression der Mutanten
eine verminderte Neuritenlänge aufweisen. Anhand von explantierten kortikalen Neuronen
des Huhns und beim Zebrafisch ist gezeigt worden, dass eine Deletion oder Mutation einer
kurzen Sequenz (VDQNQKE) in Exon7 die axonale Translokation hemmt und Defekte des
Diskussion
82
axonalen Wachstums zur Folge hat (Zhang et al., 2003; Carrel et al., 2006). Anhand des
SMN-Expressionsprofils der NSC34-Zellen konnte jedoch nachgewiesen werden, dass alle
in dieser Arbeit untersuchten SMN-Varianten zum distalen Bereich des Axons bzw. in den
Wachstumskegel transportiert werden. Es ist daher nicht anzunehmen, dass ein Mangel an
SMN in den Neuriten bzw. im Wachstumskegel Ursache für ein verändertes
Längenwachstum ist. Interessanterweise wurden bei diesen Untersuchungen anders als bei
den nukleären Beobachtungen bei allen 5 Mutanten Defekte festgestellt. Dieser Befund
könnte auf eine von den Kernkörperchen unabhängige Funktion hinweisen. Einige der
Mutanten weisen in vitro Oligomerisierungsdefekte und eine geringe Affinität zu den Sm-
Proteinen auf (Burghes und Beattie); Sm-Proteine konnten jedoch in axonalen SMN-
Komplexen nicht nachgewiesen werden (Todd et al., 2010a). Diese Aussagen werden
unterstützt von Beobachtungen des axonalen Wachstums beim Zebrafisch-Modell. Die
Mutation A111G weist keine Defekte bei der Oligomerisierung und der Bindung der Sm-
Proteine auf. Jedoch konnten die axonalen Defekte des SMA-Zebrafisches nach Injektion
von SMN-RNA, welche die Mutation A111G enthält, nicht mehr korrigiert werden (Carrel et
al., 2006).
Es ist auffällig, dass die Überexpression der SMN-Varianten zu einer Hemmung des
Neuritenwachstums nicht nur im Vergleich mit dem SMN-Wildtyp sondern auch mit dem
GFP-Kontrollvektor führt. Aus den in dieser Arbeit gezeigten Western-Blot-Analysen von
NSC34-Zelllysaten konnte bereits gefolgert werden, dass die Expression des endogenen
SMN durch die Überexpression von SMN bzw. der SMN-Mutanten nicht beeinflusst wird. Die
Mutanten zeigen daher bezüglich des axonalen Wachstums einen dominant-negativen
Effekt. Dieser könnte zum einen auf eine kompetitive Verdrängung des endogenen SMNs
zurückgeführt werden. Als eine weitere Erklärung wäre eine Bildung von Hetero-Oligomeren
aus endogenen und SMN-EGFP denkbar, welche möglicherweise axonale nicht mehr
funktionell sind.
Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass die Mutanten einen unterschiedlich
starken Effekt auf das Wachstum ausübten. Im Zebrafischmodell ist eine Korrelation der
SMN-Menge mit den axonalen Defekten beschrieben worden (Carrel et al., 2006). In dieser
Arbeit konnte bei den PC12-Zellen keine Übereinstimmung axonaler Defekte mit dem mit der
Mutation verbundenen Schweregrad beim Patienten gefunden werden. Bei der Korrelation
muss jedoch auch immer die Anzahl der SMN2-Genkopien berücksichtig werden. Die SMA-
Typ-I-Mutation (2 SMN2-Genkopien) Y272C weist eine mäßige Reduktion des
Neuritenwachstums auf, hingegen die Mutation W92S und die SMA-Typ-II (2 SMN2-
Genkopien) Mutation S230L mit einer starken Hemmung des Neuritenwachstums
Diskussion
83
einhergehen. In nachfolgenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Mutation
S230L die Regulation des Aktin-Zytoskeletts direkt beeinflusst.
4.6 SMN interagiert über eine direkte Bindung mit d em ROCK-Weg
Wie bereits ausgeführt, konnte in dieser Arbeit in vivo ein Einfluss von SMN auf die Profilin2-
Phosphorylierung beobachtet werden. SMN weist in Exon5 drei Prolin-reiche Mikrodomänen
auf, die eine putative Profilin2-Bindedomäne darstellen. Eine Co-Lokalisation von Profilin2
und SMN im Wachstumskegel und im Zellkern ist bereits beschrieben worden (Sharma et al.,
2005). Jedoch gelang ein Interaktionsnachweis der Bindung anhand Co-
Immunpräzipitationsanalysen (Co-IP) lediglich unter Verwendung eines Quervernetzers, da
der Profilin2-SMN-Komplex im Zelllysat sehr instabil ist (Giesemann et al., 1999). In dieser
Arbeit konnte mit Hilfe eines neuen Protein-Protein-Interaktionsassays (TRS) erstmals eine
direkte Bindung der Proteine SMN und Profilin2 in vivo in einem zellulären System
nachgewiesen werden. Dieser Assay stellt einen erheblichen Vorteil im Vergleich zu einer
Co-IP dar, da die Interaktion unabhängig von der Stabilität der Komplexe im Lysat
nachgewiesen werden kann. Die Interaktion wird durch die Übertragung des kleinen Proteins
SUMO, in diesem Fall von Profilin2 auf SMN, noch in der lebenden Zelle markiert. In dieser
Arbeit konnte das SUMOylierte SMN-Protein als Beleg für die Interaktion mit Profilin2 in einer
Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden.
Interessanterweise führte der Austausch von fünf Prolinen zu Alaninen in der zweiten
Mikrodomäne (P219-224) zu einer drastischen Abnahme der Bindung, die in diesem Assay
durch eine Abnahme der SMN-SUMOylierung reflektiert wurde. Die Tatsache, dass weitere
Prolin-Mutanten, welche die beiden anderen Mikrodomänen betrafen, die Bindung nicht
beeinflussten, hebt die Bedeutung der zweiten repetitiven Prolin-Sequenz für diese
Interaktion hervor. Der in dieser Arbeit erbrachte Nachweis einer direkten Bindung des SMN-
Proteins mit Profilin2 belegt eine molekulare Verknüpfung mit dem ROCK-Signalweg.
In nachfolgenden Analysen wurde die direkte Profilin2-Interaktion mit Hilfe der Patienten-
Mutanten im Zusammenhang mit der SMA-Pathogenese betrachtet. In dieser Arbeit ist
gezeigt worden, dass alle der fünf untersuchten Patienten-Mutanten bei Überexpression in
vitro zu einer Hemmung des Neuritenwachstums führen. Wie bereits ausgeführt, hat bei
diesem Vorgang die Aktin-Dynamik, die von den Aktin-bindenden Proteinen Profilin und
Cofilin katalysiert wird, einen wesentlichen Einfluss. Daher lag die Vermutung nahe, dass
eine gestörte SMN-Profilin2-Interaktion die Ursache des differentiellen Neuritenwachstums
darstellt. Bei den Profilin2-Interaktionsanalysen der Mutanten konnte tatsächlich eine
Diskussion
84
Mutante identifiziert werden, die eine deutlich verminderte Profilin2-Bindungsaffinität aufwies.
Es handelt sich dabei um eine neue, bisher noch nicht charakterisierte Mutation am Anfang
von Exon6. Auffälligerweise liegt diese Mutation in der Nähe der zweiten, für die Profilin2-
Bindung wichtigen Prolin-Sequenz (219-224). Diese Mutante zeigte in den mikroskopischen
Analysen in gleicher Weise wie die Prolin-Mutante P219-224A im Zellkern und noch
wichtiger im Ausläufer eine unauffällige Verteilung des Proteins. Darüber hinaus zeigen die
Ergebnisse der Western-Blot-Analysen keine veränderte Stabilität dieser Mutante. In
Verbindung mit diesen Befunden kann gefolgert werden, dass die Mutation S230L einen
spezifischen Defekt aufweist, der mit der Ausbildung einer gemäßigten Form der SMA
einhergeht (bei zwei SMN2-Kopien). Dabei deuten die Ergebnisse dieser Arbeit stark darauf
hin, dass dieser spezifische Defekt auf einen Verlust der Profilin2-Interaktion zurückzuführen
ist. Nachfolgende Untersuchungen der S230L-Mutante könnten diese Vermutung
bekräftigen, indem weitere mögliche, durch die Mutation verursachte Defekte
ausgeschlossen werden könnten. Es wäre denkbar, dass der Serinrest an Position 230 eine
wichtige Phosphorylierungsstelle des SMN-Proteins darstellt. Möglicherweise beeinflusst die
Mutation S230L die Phosphorylierung von SMN und verändert dadurch die Affinität von
SMN-Bindungspartnern insbesondere von Profilin2. Bei den anderen untersuchten Mutanten
konnte keine Veränderung der Profilin2-Interaktion festgestellt werden. Die Mutanten sind in
der Literatur bereits eingehend untersucht worden. Bei den SMA-Typ-I-Mutanten (W92S,
E134K und Y272C) sind Defekte der Oligomerisierung und der Sm-Bindung beschrieben
worden. In Verbindung mit den in dieser Arbeit und in der Literatur gemachten
Beobachtungen können diese Defekte jedoch weniger mit einem gestörten axonalen
Wachstum in Verbindung gebracht werden (Carrel et al., 2006). Es wäre denkbar, dass bei
diesen Mutanten weitere Interaktionen betroffen sind, welche einen Einfluss auf die Dynamik
des Zytoskeletts ausüben könnten. In einer jüngsten Veröffentlichung konnte eine
Verbindung zwischen Plastin3, -einem SMA-Modifier und Aktin-Quervernetzer- und Profilin2
hergestellt werden (Bowerman et al., 2009). Die Autoren haben bei einem SMA-Mausmodell
(SMN2B/-) einen verminderten Plastin3-Gehalt festgestellt. Durch eine zusätzliche Reduktion
von Profilin2a konnte bei diesem Mausmodell wieder ein nahezu normales Plastin3-Niveau
erreicht werden. Allerdings führte dieser Befund nicht zu einer Verbesserung des SMA-
Phänotyps. Vermutlich stört die Reduktion von SMN bereits die Ausbildung der SMN-
Profilin2a-Interaktion so, dass eine Profilin2a-Defizienz keinen weiteren Effekt hätte.
Neben SMN interagiert Profilin2 auch direkt mit ROCK2 (da Silva et al., 2003). Da eine
Abnahme von SMN zu einer stärkeren Phosphorylierung von Profilin2 führte, lag die
Vermutung nahe, dass ROCK2 und SMN um die Profilin2-Bindung konkurrieren könnten. Für
ein kompetitives Modell sprechen zudem auch weitere Daten unserer Arbeitsgruppe, die
Diskussion
85
zeigen, dass die LIMK und Cofilin hypophosphoryliert vorliegen. Um die Verknüpfung
zwischen SMN, Profilin2 und ROCK2 näher charakterisieren zu können, wurde die SMN-
Profilin2-Bindung in Anwesenheit von Hydroxyfasudil, einem ROCK-Inhibitor untersucht.
Hydroxyfasudil findet als in der Klinik beispielsweise bei vaskulären Erkrankungen
Anwendung. In unserer Arbeitsgruppe konnte bereits gezeigt werden, dass das
Neuritenwachstum bei SMN-defizienten PC12-Zellen durch die Anwesenheit von
Hydroxyfasudil im nanomolaren Bereich wiederhergestellt werden kann. Hier sollte daher
analysiert werden, ob die Bindung durch die ROCK-Aktivität beeinflusst wird. Anhand des
TRS-Interaktionsassays konnten aber keine Veränderungen der Profilin2-Bindung durch die
pharmakologische Inhibition beobachtet werden. Möglicherweise übt die ROCK-Aktivität
keinen Einfluss auf die Profilin2-SMN-Bindung aus. Da Silva et al. haben gezeigt, dass eine
Hemmung der ROCK-Aktivität auf die ROCK2-Bindung von Profilin2 keinen Einfluss hat (da
Silva et al., 2003). Daher wurde in einem weiteren Ansatz die SMN-Profilin2-Interaktion bei
einer ROCK2-Überexpression untersucht. Auch bei einem Überschuss von ROCK2-
Molekülen konnte keine veränderte Wechselwirkung zwischen SMN und Profilin2 festgestellt
werden. Möglicherweise liegen SMN, Profilin2 und ROCK2 in einem gemeinsamen Komplex
vor. Da der TRS-Assay von Niedenthal und Mitarbeitern in jüngerer Zeit etabliert wurde, ist
noch nicht bekannt, inwieweit der TRS-Assay für eine Darstellung von
Interaktionsmodulatoren herangezogen werden kann. Gleichzeitig liegen unserer
Arbeitsgruppe Daten vor, die für eine kompetitive Bindung zwischen SMN und Profilin2
sprechen. Daher ist dieser Befund für eine eindeutige Aussage mit weiteren Untersuchungen
z.B. einem Nachweis eines Profilin2/SMN/ROCK2-Komplexes mit Hilfe von nativen Gelen zu
ergänzen.
In einer neuen Veröffentlichung konnte durch Anwendung des ROCK-Inhibitors Y27632 im
SMA-Typ-II-Maus-Modell eine deutlichen Verlängerung der Lebensdauer erzielt werden
(Bowerman et al., 2010). Dabei konnten die Autoren beobachten, dass Y27632 einen
Einfluss auf die Integrität der NMJ ausübt und die durch den SMN-Mangel hervorgerufenen
neuromuskulären Defekte korrigiert. Diese neuen Erkenntnisse heben die Rolle des ROCK-
Wegs als therapeutisches Target hervor. Ein genaueres Verständnis der Regulation dieses
Signalwegs trägt daher dazu bei, molekulare Zielstrukturen zu charakterisieren, die für eine
pharmakologische Intervention von Bedeutung sein können.
Diskussion
86
Abb. 17: Modell der Interaktion von SMN mit dem ROCK-Weg. SMN tritt mit Profilin2 direkt in Wechselwirkung und beeinflusst über die Profilin2-Bindung die ROCK2-Aktivität. Die SMN-Mutation S230L führt zu einer gestörten Profilin2-Interaktion. Ein Verlust der Profilin2-SMN-Bindung resultiert in einer verstärkten Interaktion von ROCK2 mit Profilin2 und nachfolgend in einer differentiellen ROCK-Aktivität. Diese Veränderungen haben einen negativen Einfluss auf die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts, welcher sich auf das Neuritenwachstum und auf die Integrität der NMJ auswirkt.
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Zhang, H.L., F. Pan, D. Hong, S.M. Shenoy, R.H. Singer, and G.J. Bassell. 2003. Active transport of the survival motor neuron protein and the role of exon-7 in cytoplasmic localization. J Neurosci. 23:6627-6637.
Zhang, H.L., R.H. Singer, and G.J. Bassell. 1999. Neurotrophin regulation of beta-actin mRNA and protein localization within growth cones. J Cell Biol. 147:59-70.
Zhang, Z., F. Lotti, K. Dittmar, I. Younis, L. Wan, M. Kasim, and G. Dreyfuss. 2008. SMN deficiency causes tissue-specific perturbations in the repertoire of snRNAs and widespread defects in splicing. Cell. 133:585-600.
Danksagung
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6 Danksagung
Ich danke Frau Prof. Grothe für die freundliche Aufnahme in ihre Arbeitsgruppe und für ihre Unterstützung. Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Claus für die Bereitstellung des sehr interessanten Themas, für die stetige Unterstützung und Anregungen während der drei Jahre meiner Arbeit im Institut, für den Freiraum für eigene Ideen, seinen stetigen Optimismus und für das offene Ohr zu jeder Zeit. Ich danke auch meinen Co-Supervisoren Frau Prof. Petri und Herrn Dr. Esser für die Betreuung meiner Doktorarbeit. Ich danke Hella Brinkmann für ihre exzellente technische Unterstützung und für die sehr angenehme Zusammenarbeit. Ebenso bedanke ich mich bei Kerstin Kuhlemann, die immer passende Lösungsvorschläge bereit hält - was auch immer das Problem gerade sein mag –für ihre Hilfsbereitschaft. Danke! Natascha Heidrich und Silke Fischer danke ich für die Aufmunterung und den Schokoladen-Support! Ich möchte mich bei allen Mitarbeitern im Institut für die kollegiale Atmosphäre bedanken. Mein besonderer Dank gilt den PhD-Studenten für die unterhaltsamen und lustigen Kaffeepausen! Ich danke den Koordinatoren des PhD-Programmes Dagmar Esser und Nadja Borsum, nicht nur für ihre administrative Unterstützung, sondern auch für ihre Hilfsbereitschaft-besonders am Anfang meiner Doktorarbeit -als Neuling in Hannover. Ich danke den Internationals aus dem PhD-Programms, - auch wenn schon über alle Welt verstreut - für ihre Unterstützung und Freundschaft. Ich werde mich gerne an die vielen Unternehmungen und Treffen in Hannover zurückerinnern. Ich danke auch meinen Freunden für die Unterstützung aus der Ferne…aus München, Stuttgart, Berlin, Würzburg, Tübingen, Heidelberg…!!! Meinen ganz besonderen Dank gilt meinen Eltern und Geschwistern für die Unterstützung und Hilfsbereitschaft zu jeder Zeit meines Studiums und meiner Promotionszeit. Danke!!!
Lebenslauf
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7 Lebenslauf
Name: Anna-Friederike Nölle
Geburtsdatum: 26.08.1980
Geburtsort: Göttingen
Wohnsitz: Annenstr. 21, D-30171 Hannover
09/1991 - 06/2000 Riemenschneider Gymnasium Würzburg Abschluss: Allgemeine Hochschulreife 10/2000 - 12/2006 Studium an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Fachrichtung:
Diplombiologie Hauptfach: Neurobiologie, Nebenfächer: Zellbiologie, Genetik/Molekularbiologie, Psychologie
01/2004 - 04/2004 Laboraufenthalt, Laboratoire de Pharmacologie Cellulaire et
Moléculaire, INSERM 505, l’EPHE, Paris, Frankreich 07/2005 - 08/2005 Laboraufenthalt, Institut für Neurobiologie, Freie Universität Berlin 01-12/2006 Diplomarbeit, Biologie I, Abteilung Neurobiologie/Tierphysiologie an der
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Betreuer: Prof. Dr. Johannes von Lintig
Thema: Molekulare und funktionelle Analysen zur Biosynthese des Sehpigmentchromophors bei Drosophila melanogaster
01/2007 Abschluss des Studiums mit dem Hochschulgrad Diplom-Biologin 10/2007-10/2010 Phd-Studium des Zentrums für systemische Neurowissenschaften
(ZSN) , Tierärztliche Hochschule Hannover Dissertation, Institut für Neuroanatomie der Medizinischen Hochschule Hannover Betreuer: Prof. Dr. Peter Claus Thema: Die molekulare Pathologie der neurodegenerativen Erkrankung Spinale Muskelatrophie: das Survival of motoneuron Protein (SMN) und der Rho-Kinase (ROCK)-Weg
10/2010 Abschluss mit dem Hochschulgrad Dr. rer. nat. an der Tierärztlichen
Hochschule Hannover
Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Die molekulare Pathologie der neurodegenerativen Erkrankung Spinale Muskelatrophie: das Survival of motoneuron Protein (SMN) und der Rho-Kinase (ROCK)-Weg“ selbstständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen: Bei der technischen Durchführung der Experimente waren folgende Personen aus dem Institut für Neuroanatomie, Hannover, beteiligt: Hella Brinkmann (Unterstützung bei der Durchführung von Western-Blot-Analysen, Herstellung der Prolin-Mutanten) Prof. Peter Claus (Fluoreszenz-Mikroskopie, Isoelektrische Fokussierung, Präparation des Rückenmarksgewebes) David Aphkazava ( Quantifizierung der Neuritenlängen und der Kernkörperchen bei den SMN-Mutanten) Verena Tacke (Immunfärbungen ,NSC34-Zellen) Externe Anregung zur Durchführung der Versuche mit dem Trans-SUMOylierungs-System erhielt ich von Ratnesh Sivastav und Dr. Rainer Niedenthal (Institut für physiologische Chemie, Hannover). Dr. Lars Tönges und Elisabeth Barski , Göttingen führten die Messung der ROCK-Aktivität der Zellysate durch. Die Mutation S230L ist von Dr. Anne Baasner aus der Abteilung von Prof. Brunhilde Wirth (Humangenetik, Köln) identifiziert worden. Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die Dissertation am folgenden Institut angefertigt: Institut für Neuroanatomie, Medizinische Hochschule Hannover Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. Hannover, den 14.11.2010
