Die Rolle der SoxC-Proteine in der Mausembryogenese · Die Rolle der SoxC-Proteine in der Mausembryogenese Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität

Die Rolle der SoxC-Proteine

in der Mausembryogenese

Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades

vorgelegt von

Melanie Hoser

aus Donauwörth

Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten

der Universität Erlangen-Nürnberg.

Tag der mündlichen Prüfung: 17. Dezember 2008

Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch

Erstberichterstatter: Prof. Dr. Michael Wegner

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Andreas Burkovski

Meiner Familie

Inhaltsverzeichnis

___

V

Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung..................................................................................................................XI

Summary ..............................................................................................................................XIII

1 Einleitung .............................................................................................................. 1

1.1 Die Entwicklung des Nervensystems ........................................................................................... 1

1.1.1 Die Organisation des cerebralen Kortex.......................................................................................... 4

1.1.2 Der Aufbau und die Entwicklung des Kleinhirns (Cerebellum) ..................................................... 5

1.1.2.1 Aufbau............................................................................................................................................. 5

1.1.2.2 Entwicklung .................................................................................................................................... 7

1.2 Zelltypen des zentralen Nervensystems..................................................................................... 10

1.2.1 Radial-Glia .................................................................................................................................... 13

1.2.2 Bergmann-Glia – die Radial-Glia des Kleinhirns.......................................................................... 14

1.3 Das reeler-Maus-Modell.............................................................................................................. 15

1.4 Die Familie der Sox-Proteine...................................................................................................... 16

1.4.1 Sox-Proteine der Gruppe C ........................................................................................................... 17

1.4.1.1 Sox4 .............................................................................................................................................. 18

1.4.1.2 Sox11 ............................................................................................................................................ 20

1.4.1.3 Sox12 ............................................................................................................................................ 22

2 Problemstellung.................................................................................................. 25

3 Ergebnisse ........................................................................................................... 27

3.1 Herstellung und Analyse Sox12-defizienter Mäuse.................................................................. 27

3.1.1 Herstellung von spezifischen Antikörpern gegen Sox12, Sox11 und Sox4 .................................. 27

3.1.2 Generierung Sox12-defizienter Mäuse.......................................................................................... 28

3.1.3 Sox12-defiziente Mäuse zeigen keine offensichtlichen phänotypischen Veränderungen ............. 32

3.1.4 Analyse der Sox12-Expression während der Embryonalentwicklung der Maus........................... 34

3.1.5 Die DNA-Bindungseigenschaften von Sox12............................................................................... 40

3.1.6 Die Fähigkeit von Sox12 zur Transaktivierung und dessen Einfluß auf die Transaktivierungskapazität anderer SoxC- und POU-Proteine ..................................................... 43

3.1.7 Die in vivo Aktivität von Sox12 während der frühen Entwicklung des Rückenmarks im Huhn... 47

3.2 Funktionelle Analyse der Sox-Proteine der Gruppe C in Überexpressionsstudien............... 49

Inhaltsverzeichnis

___

VI

3.2.1 Herstellung GFAP-Sox4-transgener Mäuse .................................................................................. 50

3.2.2 Expression des GFAP-Sox4-Transgens während der embryonalen und postnatalen Entwicklung der Maus........................................................................................................................................ 51

3.2.3 Analyse des Phänotyps GFAP-Sox4-transgener Mäuse................................................................ 53

3.2.4 Die Expression des GFAP-Sox4-Transgens im Cerebellum und in cerebellären Kulturen .......... 56

3.2.5 Die Histologie des Cerebellums GFAP-Sox4 transgener Mäuse .................................................. 59

3.2.6 Untersuchungen transgener Cerebella auf Apoptose und Proliferation......................................... 60

3.2.7 Analyse der neuronalen und glialen Zelltypen in den Cerebella GFAP-Sox4 transgener Mäuse . 61

3.2.7.1 Untersuchungen der neuronalen Subtypen in den transgenen Cerebella....................................... 61

3.2.7.2 Untersuchungen der Glia-Zellen in den transgenen Cerebella ...................................................... 63

3.2.8 Untersuchungen des cerebralen Kortex GFAP-Sox4-transgener Mäuse....................................... 65

4 Diskussion ........................................................................................................... 69

4.1 Das Sox12-defiziente Mausmodell ............................................................................................. 69

4.1.1 Bedeutung von Sox12 für die embryonale und frühe postnatale Entwicklung der Maus.............. 69

4.1.2 Funktionelle Kompensation als ein möglicher Grund für einen fehlenden Phänotyp in Sox12- defizienten Mäusen ....................................................................................................................... 71

4.1.3 Nichtreziproke funktionelle Kompensation aufgrund von Unterschieden in der embryonalen Expression der SoxC-Gene ........................................................................................................... 72

4.1.4 Nichtreziproke funktionelle Kompensation aufgrund unterschiedlicher funktioneller Eigenschaften der SoxC-Proteine.................................................................................................. 73

4.2 Das GFAP-Sox4-transgene Mausmodell ................................................................................... 76

4.2.1 Expression des Sox4-Transgens in Radial-Glia und Astrozyten des sich entwickelnden Cerebellums................................................................................................................................... 76

4.2.2 Gestörte Entwicklung der Bergmann-Glia im GFAP-Sox4-transgenen Cerebellum .................... 78

4.2.3 Das GFAP-Sox4-transgene Kleinhirn zeigt eine veränderte cerebelläre Architektur ................... 78

4.2.4 Bedeutung von Sox4 für die Reifung von Radial-Glia.................................................................. 81

5 Material ............................................................................................................... 85

5.1 Organismen.................................................................................................................................. 85

5.1.1 Mausstämme ................................................................................................................................. 85

5.1.2 Bakterienstämme........................................................................................................................... 85

5.1.3 Zelllinien ....................................................................................................................................... 85

5.2 Chemikalien und allgemeine Reagenzien.................................................................................. 86

5.3 Zusammensetzung gebräuchlicher Medien und Lösungen ..................................................... 86

5.4 Proteine und Enzyme.................................................................................................................. 89

5.5 Oligonukleotide ........................................................................................................................... 89

5.5.1 Oligonukleotide für die Genotypisierung der GFAP-Sox4-transgenen Mäuse ............................. 89

Inhaltsverzeichnis

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VII

5.5.2 Oligonukleotide für die Genotypisierung der Sox12--Mäuse........................................................ 89

5.5.3 Oligonukleotide für Klonierungen ................................................................................................ 89

5.5.4 Oligonukleotide für RT-PCR ........................................................................................................ 90

5.6 Plasmide ....................................................................................................................................... 91

5.7 in situ Sonden............................................................................................................................... 91

5.8 Southern-Blot-Sonden................................................................................................................. 92

5.9 Antikörper ................................................................................................................................... 92

5.9.1 Primärantikörper ........................................................................................................................... 92

5.9.2 Sekundärantikörper ....................................................................................................................... 94

6 Methoden............................................................................................................. 95

6.1 Tierhaltung .................................................................................................................................. 95

6.2 Zellkulturmethoden .................................................................................................................... 95

6.2.1 Transfektion von DNA in eukaryontische Zellen.......................................................................... 95

6.2.1.1 Transfektion von Säugerzellen mit Polyethylenimin (PEI)........................................................... 95

6.2.1.2 Transfektion von Säugerzellen mit Superfect ............................................................................... 96

6.2.2 Luciferase-Aktivitätstest ............................................................................................................... 96

6.2.3 Präparation primärer cerebellärer Kulturen................................................................................... 96

6.2.4 Immuncytochemie von primären cerebellären Kulturen ............................................................... 97

6.3 Allgemeine molekularbiologische Methoden ............................................................................ 98

6.3.1 Standardmethoden......................................................................................................................... 98

6.3.2 Isolierung von genomischer DNA aus Schwanz- oder Choriongewebe........................................ 98

6.3.3 Isolierung hochreiner genomischer DNA aus Schwanzgewebe.................................................... 98

6.3.4 Präparation von Gesamt-RNA....................................................................................................... 99

6.3.5 Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels Polymerase-Kettenreaktion ................................. 100

6.3.6 Genotypisierungs-PCR-Reaktionen ............................................................................................ 100

6.3.6.1 GFAP-Sox4-transgene Mäuse..................................................................................................... 100

6.3.6.2 Sox12--Mäuse.............................................................................................................................. 101

6.3.7 Reverse Transkription und RT-PCR ........................................................................................... 102

6.3.8 DIG-Markierung von cRNA-Sonden mittels in vitro Transkription ........................................... 103

6.3.9 Radioaktive Markierung von DNA durch „Random Primer“ ..................................................... 103

6.3.10 Identifizierung von DNA-Fragmenten durch Hybridisierung ..................................................... 104

6.3.10.1 DNA-Transfer von Agarose-Gelen auf Membranen (Southern-Blot) ......................................... 104

6.3.10.2 Hybridisierung von DNA............................................................................................................ 104

6.4 Proteinbiochemische Methoden ............................................................................................... 105

Inhaltsverzeichnis

___

VIII

6.4.1 Proteinbestimmung nach Bradford.............................................................................................. 105

6.4.2 Herstellung von Gesamt-Proteinextrakten aus eukaryontischen Zellen ...................................... 105

6.4.3 Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)............................................... 105

6.4.4 Western-Blot und immunologischer Nachweis von Proteinen auf Membranen ......................... 106

6.4.5 Bakterielle Expression und Aufreinigung von His6-Tag-Fusionsproteinen ................................ 107

6.5 Histologische Methoden............................................................................................................ 108

6.5.1 Gewebepräparation...................................................................................................................... 108

6.5.2 In situ Hybridisierung.................................................................................................................. 109

6.5.3 Immunhistochemie auf Gefrierschnitten ..................................................................................... 110

6.5.4 TUNEL-Färbung ......................................................................................................................... 111

6.6 Generierung transgener Mäuse ............................................................................................... 112

6.6.1 Elektroporation embryonaler Stammzellen mit dem Transgen-Konstrukt.................................. 112

6.6.2 Blastozysteninjektion .................................................................................................................. 113

6.7 In ovo Elektroporation in den Huhn-Embryo ........................................................................ 113

7 Abkürzungsverzeichnis.................................................................................... 115

8 Literatur............................................................................................................ 119

Publikationen........................................................................................................................ 139

Lebenslauf ............................................................................................................................. 141

Danksagung........................................................................................................................... 143

Abbildungsverzeichnis ___

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IX

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Die Bildung der Neuralplattengrenze und die Neurulation ............................................................... 1 Abb. 2: Die Entwicklung der neuralen Vorläuferzellen in der ventralen Ventrikulärzone ........................ 3 Abb. 3: Die Entstehung des Kortex cerebri ....................................................................................................... 5 Abb. 4: Die Struktur des Cerebellums und seine neuronale Verschaltung ................................................... 7 Abb. 5: Die Position des Isthmus-Organisators ................................................................................................ 8 Abb. 6: Die Entwicklung des Cerebellums ....................................................................................................... 9 Abb. 7: Die Zelltypen des zentralen Nervensystems ..................................................................................... 10 Abb. 8: Die Entwicklung von Oligodendrozyten ........................................................................................... 12 Abb. 9: Die Sox-Proteine der Gruppe C .......................................................................................................... 18 Abb. 10: Lokalisation der Peptide für die Herstellung spezifischer Antikörper gegen Sox4, Sox11 und Sox12 ...... 27 Abb. 11: Schema zur Generierung des Sox12-Knockout-Allels .................................................................. 29 Abb. 12: Southern-Blot Analysen zum Nachweis des rekombinierten Sox12-Allels ............................... 30 Abb. 13: Southern-Blot Analyse und Genotypisierung zum Nachweis des Sox12-Knockout-Allels .... 31 Abb. 14: RT-PCR zur Analyse der Sox12-Expression in Wildtyp- und Sox12-defizienten Mäusen ..... 31 Abb. 15: In situ Hybridisierung zur Analyse der Sox12-Expression in Sox12-defizienten Mäusen ...... 32 Abb. 16: Genotypen- und Geschlechter-Verteilung der Nachkommen aus Verpaarungen von Sox12+/--Mäusen ..... 33 Abb. 17: Bestimmung der Wachstumsparameter Sox12-defizienter Mäuse .............................................. 34 Abb. 18: RT-PCR zur Analyse der SoxC-Genexpression in Wildtyp-Embryonen ................................... 35 Abb. 19: In situ Hybridisierung und RT-PCR zur Analyse der Sox11- und Sox4-Expression in Sox12-defizienten

Embryonen ................................................................................................................................................... 36 Abb. 20: In situ Hybridisierung zur Bestimmung der frühen embryonalen Sox12-Expression .............. 37 Abb. 21: In situ Hybridisierung zur Bestimmung der Sox12-Expression an 14.5 dpc im Rumpf .......... 38 Abb. 22: In situ Hybridisierung zur Bestimmung der Sox12-Expression an 18.5 dpc im Rumpf .......... 39 Abb. 23: In situ Hybridisierung zur Bestimmung der spät-embryonalen Sox12-Expression im Kopf ... 40 Abb. 24: Die DNA-Bindungsaktivität von Sox12 .......................................................................................... 41 Abb. 25: Analyse der Fähigkeit von Sox12 zur Bildung ternärer Komplexe am FXO-Oligonukleotid . 42 Abb. 26: Western-Blot zur Bestimmung der endogenen SoxC- und POU-Proteinmengen in Zellkultur .................. 43 Abb. 27: Die Kapazität von Sox12 zur Transaktivierung des 3xSX-luc Reportergens ............................ 44 Abb. 28: Die Kapazität von Sox12 zur Transaktivierung des 3xFXO-luc Reportergens ......................... 45 Abb. 29: Einfluß von Sox12 auf die Transaktivierungskapazität von Sox11 ............................................. 45 Abb. 30: Analyse der Fähigkeit von Sox12 zur synergistischen Aktivierung des 3xFXO-luc Reportergens ............ 46 Abb. 31: Die Fähigkeit der SoxC-Proteine zur Aktivierung des neuralen Tubb3-Zielgen-Promotors ...................... 47 Abb. 32: Die Aktivität von Sox12 während der frühen Entwicklung des Rückenmarks im Huhn ............................. 48 Abb. 33: Schematische Darstellung des GFAP-Sox4-Transgen-Konstrukts .............................................. 50 Abb. 34: Southern-Blot Analyse zur Bestimmung der Kopienzahl des Transgens ................................... 51 Abb. 35: Das embryonale Expressionsmuster des GFAP-Sox4-Transgens ................................................ 52 Abb. 36: RT-PCR-Analyse zum Nachweis der Expression des GFAP-Sox4-Transgens ......................... 53 Abb. 37: Histologische Analyse des Aquaeductus mesencephali im Gehirn transgener Mäuse ............. 54 Abb. 38: Untersuchungen des Plexus Choroideus GFAP-Sox4-transgener Mäuse ................................... 55 Abb. 39: Analyse der ependymalen Cilien GFAP-Sox4-transgener Mäuse ............................................... 55 Abb. 40: Die Morphologie des Gehirns GFAP-Sox4-transgener Mäuse .................................................... 56 Abb. 41: Die Expression des GFAP-Sox4-Transgens im Cerebellum ........................................................ 57 Abb. 42: Zelltyp-spezifische Expression des GFAP-Sox4-Transgens im Cerebellum ............................. 57 Abb. 43: Die Expression des GFAP-Sox4-Transgens in cerebellären Kulturen ........................................ 58 Abb. 44: Die Histologie des Cerebellums GFAP-Sox4-transgener Mäuse ................................................ 59 Abb. 45: Untersuchungen GFAP-Sox4-transgener Cerebella auf Apoptose und Proliferation .............. 60 Abb. 46: Analyse der neuronalen Subtypen in den Cerebella GFAP-Sox4-transgener Mäuse ............... 62 Abb. 47: Analyse der glialen Zelltypen in den Cerebella GFAP-Sox4-transgener Mäuse ....................... 64 Abb. 48: Analyse der Radial-Glia im cerebralen Kortex GFAP-Sox4-transgener Mäuse ....................... 66 Abb. 49: Analyse der neuronalen Schichten im cerebralen Kortex GFAP-Sox4-transgener Mäuse ...... 67

Zusammenfassung

XI

Zusammenfassung

Transkriptionsfaktoren der Sox-Proteinfamilie sind an den verschiedensten Entwicklungs-

prozessen während der Embryogenese beteiligt. Die 20 in Säugern identifizierten Mitglieder

lassen sich in die Gruppen A-H einteilen, wobei Sox4, Sox11 und Sox12 zur Gruppe C gehören.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden das embryonale Expressionsmuster von Sox12 in der Maus und

seine biochemischen Eigenschaften im Vergleich zu Sox4 und Sox11 detailliert bestimmt. Wie

die anderen SoxC-Proteine zeigte Sox12 ein Vorkommen in vielen verschiedenen embryonalen

Geweben der Maus, unter anderem im zentralen Nervensystem, der Niere und dem Herzen, war

jedoch im Allgemeinen niedriger und gleichförmiger exprimiert. Sox12 wies darüber hinaus in

vitro ein zu Sox4 und Sox11 ähnliches DNA-Bindeverhalten auf und wirkte in vivo ebenfalls

transaktivierend. Im Vergleich zu Sox11 waren die transaktivierende Kapazität von Sox12 und die

Fähigkeit, mit Transkriptionsfaktoren der POU-Proteinfamilie synergistisch zusammen zu wirken,

jedoch sehr viel geringer.

Zur Charakterisierung der Funktion von Sox12 wurde eine Sox12-defiziente Mauslinie generiert.

Die Analyse der Sox12-Knockout-Tiere ließ allerdings keine Entwicklungsdefekte erkennen. Die

Mausmutanten waren lebensfähig, fertil und zeigten ein unauffälliges postnatales Wachstum.

Somit ist der Verlust von Sox12 durch die funktionell ähnlichen und ko-exprimierten Sox4 und

Sox11 weitgehend kompensierbar.

Da die funktionelle Redundanz zwischen SoxC-Proteinen eine Funktionsbestimmung durch

Gendeletion erschwert, wurde im zweiten Teil der Arbeit die Rolle von Sox4 nach Über-

expression in Radial-Glia-Zellen und Astrozyten untersucht. Zu diesem Zweck wurden transgene

Mäuse generiert, die das Sox4-Transgen unter dem humanen GFAP-Promotor exprimierten. Diese

Tiere entwickelten kurze Zeit nach ihrer Geburt schwere Ataxien auf Grund cerebellärer

Entwicklungsstörungen sowie einen Hydrocephalus und verstarben Ende der dritten postnatalen

Woche. Histologische Analysen ließen im Cerebellum der transgenen Mäuse fehlende Fissuren

und eine gestörte neuronale Schichtung erkennen, obwohl sich neuronale Subtypen, Astrozyten

und Oligodendrozyten in den transgenen Cerebella normal bildeten. Die pathologischen

Veränderungen der transgenen Kleinhirne ließen sich durch einen Verlust funktioneller

Bergmann-Glia erklären, der sekundär neuronale Migrationsdefekte verursachte. Sox-Proteine der

Gruppe C verhindern demnach in Gliazellen die Differenzierung. Dies kontrastiert mit dem zuvor

nachgewiesenen differenzierungsfördernden Einfluß auf Neuronen und beweist, dass die Funktion

von SoxC-Proteinen kontext-abhängig ist.

Summary

XIII

Summary

Transcription factors of the Sox protein family are involved in a diverse range of

developmental processes during embryogenesis. The 20 members which have been identified

in mammals can be divided into groups A to H, with Sox4, Sox11 and Sox12 belonging to

group C.

One aim of this study was to determine the embryonic expression pattern of Sox12 in the

mouse and its biochemical properties in comparison to Sox4 and Sox11. Similar to the other

SoxC proteins, Sox12 showed expression in many developing organs of the mouse, including

the central nervous system, the kidney, and the heart, although at lower and relatively uniform

levels. Furthermore Sox12 exhibited similar DNA-binding properties as Sox4 and Sox11 in

vitro and was also able to transactivate in vivo. The transactivation capacity of Sox12 and the

ability to function synergistically with transcription factors of the POU protein family was

however less efficient than Sox11.

To analyze the function of Sox12 a knockout mouse line was generated. Sox12-deficient mice

developed surprisingly normally and showed no gross phenotypic abnormalities. The mouse

mutant was viable, fertile and postnatal growth was unaffected. This shows that the lack of

Sox12 can largely be compensated by the functionally equivalent and coexpressed Sox4 and

Sox11.

As redundancy among SoxC proteins impedes functional analyses by gene deletion, the role

of Sox4 was additionally studied upon overexpression in radial glia and astrocytes. For this

reason, transgenic mice were generated in which the Sox4 transgene was expressed under the

control of the human GFAP promoter. These animals developed severe ataxia due to

cerebellar developmental defects as well as hydrocephaly and died around the end of the third

postnatal week. Histological stainings of the cerebellum of transgenic mice showed that

fissures were not formed and neuronal layering was dramatically disturbed, although neuronal

subtypes, astrocytes and oligodendrocytes developed normally. The cerebellar malformations

could be explained by the loss of functional Bergmann glia, which in turn led to neuronal

migration defects. Sox proteins of group C thus prevent differentiation of glial precursors.

This contrasts with previous findings of enhanced neuronal differentiation upon Sox4

overexpression and shows that the function of SoxC proteins is context-dependent.

Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 DIE ENTWICKLUNG DES NERVENSYSTEMS

Nach Befruchtung der Eizelle und vollzogener Gastrulation besteht der Embryo aus drei

Keimblättern, dem äußeren Ektoderm, dem inneren Entoderm und dem mittleren Mesoderm.

Aus dem Entoderm entsteht das Epithel des Verdauungstraktes sowie assoziierte Organe,

während aus dem Mesoderm unter anderem Knochen, Muskeln, Bindegewebe, Herz, Nieren,

Keimdrüsen, Blut und Blutgefäße gebildet werden. Aus dem äußeren Keimblatt, dem

Ektoderm gehen die Epidermis und das Nervensystem hervor.

Die Entwicklung des Nervensystems beginnt mit der Bildung des Neuralrohrs, ein Vorgang,

der als Neurulation bezeichnet wird (Abb. 1). Dabei werden zunächst ektodermale Zellen

durch das darunter liegende paraxiale Mesoderm und die Chorda dorsalis (Notochord) dazu

veranlasst, eine entlang der dorsalen Mittelachse flächenförmig verdickte Neuralplatte

(Neuroektoderm) auszubilden (Kelly und Melton, 1995). Im weiteren Verlauf faltet sich die

Neuralplatte seitlich zu Neuralwülsten auf und eine U-förmige Neuralrinne entsteht. Die

Neuralfalten bewegen sich aufeinander zu und verschmelzen miteinander, um das Neuralrohr

zu bilden. Schließlich löst sich dieses vollständig vom Oberflächenektoderm ab (Colas und

Schoenwolf, 2001; Copp et al., 2003; Smith und Schoenwolf, 1997).

Abb. 1: Die Bildung der Neuralplattengrenze und die Neurulation Die Neuralplattengrenze wird durch Signale zwischen Neuroektoderm und dem nicht-neuralen Ektoderm und vom darunterliegenden paraxialen Mesoderm induziert. Während der Neurulation erheben sich die Neuralfalten und schließen sich zum Neuralrohr. Die Neuralleistenzellen verlassen den dorsalen Bereich des Neuralrohrs und wandern in die Peripherie. Abbildung entnommen und leicht verändert aus (Gammill und Bronner-Fraser, 2003).

Einleitung

2

An der Grenze zwischen der Neuralplatte und dem nicht-neuralen Ektoderm werden Zellen

induziert, die die Neuralleiste bilden. Während oder nach dem Verschluß der Neuralfalten

verlassen die Neuralleistenzellen den dorsalen Bereich des Neuralrohrs und wandern von

beiden Seiten ausgehend gruppenweise entlang definierter Bahnen in die Peripherie. Dort

differenzieren sie zu verschiedenen Zelltypen wie Neurone und Gliazellen des peripheren

Nervensystems, Melanozyten, Knorpel, Knochen, Bindegewebe und endokrine Zellen

(Anderson, 1997; Gammill und Bronner-Fraser, 2003; Garcia-Castro und Bronner-Fraser,

1999; Knecht und Bronner-Fraser, 2002).

Aus dem Neuralrohr selbst entwickelt sich im weiteren Verlauf das zentrale Nervensystem, zu

dem Gehirn und Rückenmark gehören. Noch bevor sich der posteriore Teil des Neuralrohrs

ausgebildet hat, formen sich im anterioren Bereich drei primäre Vesikel, die zunächst

Anlagen für Vorderhirn (Prosencephalon), Mittelhirn (Mesencephalon) und Rautenhirn

(Rhombencephalon) darstellen. Später bildet sich aus dem Prosencephalon das anterior

gelegene Endhirn (Telencephalon), das die Großhirnrinde (Kortex), die Basalganglien, den

Hippokampus und den Riechkolben (Bulbus olfactorius) hervorbringt, sowie das mehr kaudal

gelegene Zwischenhirn (Diencephalon), aus dem sich der Thalamus, Hypothalamus und die

Augenblasen formen. Das Rhombencephalon gliedert sich weiter in das Hinterhirn

(Metencephalon), aus dem die Brücke (Pons) und das Kleinhirn (Cerebellum) hervorgehen,

und das Nachhirn (Myelencephalon), das zum verlängerten Mark (Medulla oblongata) wird.

Der weitere kaudale Bereich des Neuralrohrs wird zum Rückenmark. Neben der anterior-

posterioren Regionalisierung des Neuralrohrs findet auch eine Kompartimentierung in dorsale

und ventrale Bereiche statt. Induziert wird diese Musterbildung durch Sekretion dorsaler und

ventraler Signalmoleküle (Tanabe und Jessell, 1996). Sonic Hedgehog (Shh), das aus dem

Notochord (Chorda dorsalis) freigesetzt wird, induziert die Bildung einer Bodenplatte auf der

ventralen Seite des Neuralrohrs (Abb. 2). Die Zellen der Bodenplatte sezernieren ebenfalls

Shh, das in dorsale Richtung diffundiert, wodurch ein ventral-dorsaler Konzentrationsgradient

im Neuralrohr entsteht. An der dorsalen Musterbildung sind Proteine der BMP-Familie (bone

morphogenetic proteins) beteiligt, die vom epidermalen Ektoderm und später auch von der

Deckplatte, die sich auf der dorsalen Seite des Neuralrohrs bildet, sezerniert werden. Im

embryonalen Rückenmark kommt es durch den Einfluß des BMP- und Shh-Gradienten zur

Ausbildung definierter Vorläuferdomänen entlang der Ventrikulärzone, einer proliferativen

Epithelzellschicht, die den inneren Hohlraum des Neuralrohrs auskleidet (Anderson, 2001;

Briscoe und Ericson, 2001; Caspary und Anderson, 2003; Jessell, 2000; Lee und Jessell,

Einleitung

3

1999). Aus diesen Domänen werden schließlich die verschiedenen Vorläuferzellen der

neuronalen und später auch der glialen Subtypen generiert.

Abb. 2: Die Entwicklung der neuralen Vorläuferzellen in der ventralen Ventrikulärzone Die dorso-ventrale Achse wird durch Gradienten von Shh und BMP spezifiziert, die von der Bodenplatte (FP) und Deckplatte (RP) sezerniert werden. Daraufhin unterteilt sich die Ventrikulärzone (VZ) über die abge-grenzten Homeodomänen-Proteinexpressionen in definierte Vorläuferdomänen (p0, p1, p2, pMN, p3). Aus diesen Domänen gehen verschiedene neuronale Subklassen (V3, MN, V2, V1, V0) und später auch Glia (Oligo, Astro) hervor. In dieser schematischen Darstellung ist nur die Unterteilung der ventralen Hälfte des Rücken-marks gezeigt. Abbildung entnommen aus (Anderson, 2001).

Wenn die Zellen des embryonalen Rückenmarks aus der Ventrikulärzone auswandern, bilden

sie eine neue Schicht, die Mantelzone, die später auch als graue Substanz bezeichnet wird.

Die Neuronen in der Mantelzone senden ihre Axone nach außen, so dass eine weitere Schicht

entsteht, die Marginalzone, die in der Folge zur weißen Substanz wird. Die typische weiße

Färbung ist auf den hohen Anteil an Myelin zurückzuführen, eine lipidreiche Schicht zur

Isolierung der Axone, die von den Oligodendroglia gebildet wird. Sowohl im Rückenmark als

auch in der Medulla bleibt der grundlegende dreischichtige Aufbau in Ventrikulär-, Mantel-

und Marginalzone während der Entwicklung und im adulten Organismus erhalten.

Einleitung

4

1.1.1 Die Organisation des cerebralen Kortex

Im Gegensatz zum Rückenmark und der Medulla, bei denen eine dreischichtige Architektur

zu erkennen ist, kann man in der Großhirnrinde (Kortex cerebri) Modifikationen dieses

Aufbaus feststellen. Die Entwicklung des Kortex cerebri als äußere Schicht des

Telencephalon beginnt mit der Proliferation von Vorläuferzellen in der Ventrikulärzone

(Gupta et al., 2002) (Abb. 3). Am Embryonalstadium 11 dpc (days post coitum; Tage post

coitum) der Maus wandern postmitotische Neurone aus der Ventrikulärzone in radialer

Richtung zur pialen Oberfläche des Gehirns aus und bilden die sogenannte Präplatte. Mit

fortschreitender Migration postmitotischer Neurone kommt es zu einer Spaltung der Präplatte

in eine äußere Marginalzone und eine tiefer positionierte Subplatte. Dazwischen postieren

sich die Zellen der Kortikalplatte. Während der Entwicklungsstadien 14 dpc bis 18 dpc der

Maus migrieren Populationen postmitotischer Neurone in radialer Richtung durch die

Subplatte hindurch und bilden der Reihe nach die Schichten der Kortikalplatte. Dabei

wandern jeweils später generierte Neurone an ihren Vorgängern vorbei und verbleiben direkt

unterhalb der Marginalzone. Somit erfolgt die Bildung der Großhirnrinde nach einem „inside-

out“-Prinzip, bei dem früh entstandene Nervenzellen die tiefen Schichten und später erzeugte

Neurone die weiter an der Oberfläche liegenden Schichten der Kortikalplatte besetzen

(Angevine und Sidman, 1961). Nachdem sich diese Platte vollständig ausgebildet hat, kann

man einen zerebralen Kortex mit sechs Schichten identifizieren, wobei die Marginalzone als

Schicht eins gezählt wird.

Die Entwicklung dieser neuronalen Schichten ist mit der Migration von Neuronen in radialen

und tangentialen Richtungen zu ihrem Zielort verbunden (Hatten, 2002; Kriegstein und

Noctor, 2004). Dabei gibt es für die Wanderung von Zellen in radialer Richtung offensichtlich

zwei Möglichkeiten. Eine davon ist die Migration von Neuronen entlang der Fasertrakte von

Radial-Glia-Zellen, wobei der Leitfortsatz der wandernden Zelle frei beweglich ist und dessen

Länge während der Wanderung relativ konstant bleibt. Zum anderen können sich Neurone

auch unabhängig von glialen Fasertrakten durch Translokation fortbewegen. Hierfür ist die

Zelle mit ihrem langen nach außen gerichteten Fortsatz fest an der pialen Oberfläche

verankert und der Zellnukleus bzw. das gesamte Zellsoma bewegen sich nach außen, während

sich der Leitfortsatz der Zelle verkürzt (Gupta et al., 2002; Nadarajah et al., 2001). Die

tangentiale Wanderung von Neuronen findet parallel zur inneren oder äußeren Oberfläche des

Gehirns statt und wird beispielsweise von GABAergen Interneuronen genutzt (Marin und

Rubenstein, 2001).

Einleitung

5

Abb. 3: Die Entstehung des Kortex cerebri Am Embryonalstadium 11 dpc der Maus (E11) bildet sich nach Wanderung postmitotischer Neurone von der Ventrikulärzone (VZ) zur pialen Oberfläche (PS) die Präplatte (PP) aus. An 13 dpc (E13) teilen die durch die Intermediärzone (IZ) migrierenden postmitotischen Neurone die PP in die Marginalzone (MZ) sowie die Subplatte (SP) und die Kortikalplatte (CP) entsteht. Von 14 dpc bis 18 dpc (E14-E18) vergrößern Populationen von Neuronen die CP in einem „inside-out“-Prinzip, bei dem später generierte Neurone an ihren Vorgängern vorbei wandern und unter der MZ zu liegen kommen. Im Erwachsenenalter degeneriert die SP und ein sechsschichtiger zerebraler Kortex bleibt bestehen. Die Wanderung der Zellen erfolgt hauptsächlich über radiale Glia (gezeigt als vertikale Linien). Abbildung entnommen aus (Gupta et al., 2002).

1.1.2 Der Aufbau und die Entwicklung des Kleinhirns (Cerebellum)

1.1.2.1 Aufbau

Wie für das Großhirn bereits beschrieben, lässt sich auch beim Kleinhirn eine nach außen

gewandte, nervenzellhaltige Rinde mit einem Aufbau in Schichten identifizieren. Doch

zunächst soll die Lage des Cerebellums im Gehirn und seine äußere Gestalt betrachtet werden.

Das Kleinhirn, das eine wichtige Rolle bei der Koordination und Feinabstimmung von

Bewegungsabläufen spielt, befindet sich in der hinteren Schädelgrube und ist mit dem

Hirnstamm durch die drei Kleinhirnstiele verbunden. Es sitzt dem Nachhirn (Myelencephalon)

und der Brücke (Pons) auf und bildet so das Dach des vierten Ventrikels. Morphologisch lässt

sich das Cerebellum in den zentralen Wurm (Vermis) und die beiderseits davon liegenden

Hemisphären gliedern (Abb. 4A). Die Oberfläche des Kleinhirns wird durch Furchungen

(Fissuren) in einzelne blattförmige Windungen (Folia) unterteilt (Abb. 4B). Gruppen von

Einleitung

6

Folia kann man wiederum als Läppchen (Lobuli) zusammenfassen. Im Kleinhirn von

Säugetieren lassen sich so zehn Lobuli unterscheiden.

Im Inneren des Cerebellums findet man eine dreischichtige, stark gefaltete Rinde (Kortex),

die die zentral gelegene weiße Substanz (Marklager) bedeckt (Abb. 4B). Eingebettet in dieser

Substanz liegen die Kleinhirnkerne. Zu den drei Schichten des adulten Kortex cerebelli

gehören die innere, direkt an das Mark angrenzende Körnerschicht (Stratum granulosum), die

darüber liegende Purkinjezellschicht (Stratum purkinjense) und die äußere Molekularschicht

(Stratum moleculare) (Abb. 4B, C). In der Körnerschicht befinden sich vor allem die kleinen

Körnerzellen, die die einzigen erregenden Zellen der Kleinhirnrinde sind (Abb. 4C). Die

Axone dieser Neurone steigen in die Molekularschicht auf und verzweigen sich dort unter

Bildung von Parallelfasern. Neben den Körnerzellen kann man auch GABAerge, inhibi-

torische Golgizellen in der Körnerschicht finden. Im mittleren Kortexbereich kommen in

einer einzigen Zellschicht die großen GABAergen, hemmenden Purkinjezellen zu liegen.

Diese Zellen besitzen ein birnenförmiges Soma mit einem langen nach unten in Richtung

Marklager gerichteten Axon und einem großen, stark verzweigten Dendritenbaum, der in die

Molekularschicht hineinreicht. Außerdem stellen sie die einzigen Projektionsneurone der

Kleinhirnrinde dar. Neben den Purkinjezellen lassen sich in der mittleren Schicht auch die

Somata von Bergmann-Glia-Zellen finden. Die langen Fortsätze dieser Glia reichen bis zur

pialen Oberfläche und dienen auf- und abwandernden Zellen während der Entwicklung des

Kleinhirns als Leitstruktur.

Zusätzlich zu den Dendriten der Purkinjezellen, den Axonen der Körnerzellen und Palisaden

von Bergmann-Glia-Fortsätzen sind in der äußeren Molekularschicht auch GABAerge,

inhibitorische Korb- und Sternzellen enthalten. Im Gegensatz zu den Sternzellen umspannen

die tief in der Molekularschicht liegenden Korbzellen mit ihren Axonen die Somata der

Purkinjezellen und bilden dadurch sogenannte „Faserkörbe“ aus. Schließlich lassen sich auch

Afferenzen zur Kleinhirnrinde finden, wobei hier vor allem die Moos- und Kletterfasern zu

nennen sind (Chizhikov und Millen, 2003; Voogd und Glickstein, 1998).

Einleitung

7

Abb. 4: Die Struktur des Cerebellums und seine neuronale Verschaltung (A) Dorsale Sicht auf das Cerebellum einer adulten Maus. Zu sehen sind die cerebelläre Vermis (CV) und die beiden Hemisphären (CH). (B) Ein Sagittalschnitt durch das Cerebellum. Gekennzeichnet sind die Molekularschicht (ML), die Purkinjezellschicht (PC), die interne Körnerzellschicht (IGL), die tiefen cerebellären Kerne (DCN) und die parallelen Fissuren, die die Folia unterteilen. Eine Folia ist mit einer Klammer versehen. (C) Schematische Darstellung der prinzipiellen neuronalen Verschaltungen im Cerebellum. Information wird über die präcerebellären Kerne (PCN) und Moosfasern an Körnerneurone gesendet. Über Axone der Körner-zellen (Parallelfasern) wird das Signal an Purkinjezellen weitergegeben. Auch Kletterfasern aus dem Olivenkern-komplex (IOC) können Information an Purkinjezellen schicken. Die Purkinjezellen senden ihre Axone zu den tiefen cerebellären Kernen (DCN), von wo aus die Impulse nach extracerebellär weitergeleitet werden. Abbildung entnommen und leicht verändert aus (Chizhikov und Millen, 2003).

1.1.2.2 Entwicklung

Während der Embryogenese lässt sich das Rhombencephalon entlang der anterior-posterioren

Achse in Segmente, die sogenannten Rhombomere, gliedern, wobei das Kleinhirn aus dem

ersten Rhombomer entsteht (Millet et al., 1996; Wingate, 2001; Wingate und Hatten, 1999)

(Abb. 5A). Im Grenzbereich zwischen Mittelhirn und Rhombomer 1 befindet sich ein für die

cerebelläre Entwicklung wichtiges Signalzentrum, der Isthmus-Organisator. Die Position

dieses Organisators wird durch die Grenzen der Expressionsdomänen der Transkriptions-

faktoren Otx2 (orthodenticle homologue 2) und Gbx2 (gastrulation brain homeobox 2)

bestimmt (Broccoli et al., 1999; Millet et al., 1999; Simeone, 2000; Wurst und Bally-Cuif,

2001) (Abb. 5B). Im weiteren Verlauf der Embryogenese kommt es in der Organisator-Region

zur Induktion der Gene für die Transkriptionsfaktoren Pax2 (paired box 2) und En1

(engrailed 1) sowie für das sezernierte Molekül Wnt1 (wingless 1). Etwas später werden auch

die Transkriptionsfaktoren Pax5 und En2 sowie der sezernierte Wachstumsfaktor Fgf8

(fibroblast growth factor 8) exprimiert (Crossley und Martin, 1995; Liu und Joyner, 2001).

Fgf8 wird bei der Entwicklung des Mittel- und Hinterhirns eine besondere Rolle zuge-

Einleitung

8

schrieben (Crossley und Martin, 1995). So kann dieser Faktor im embryonalen Huhngehirn

sowohl Gewebe mit Mittelhirn- als auch mit Kleinhirncharakter induzieren (Crossley et al.,

1996; Martinez et al., 1999), während eine Inaktivierung von Fgf8 zum Verlust dieser

Strukturen führt (Chi et al., 2003; Meyers et al., 1998; Reifers et al., 1998). Ebenfalls eine

Rolle bei der Entwicklung von Mittelhirn und Cerebellum spielt der Transkriptionsfaktor

Lmx1b (LIM-Homeobox 1b), der neben einigen anderen Genen auch die Expression von Fgf8

und Wnt1 reguliert (Adams et al., 2000; Guo et al., 2007; Matsunaga et al., 2002). Durch das

Zusammenspiel einer Reihe von sezernierten Molekülen und Transkriptionsfaktoren entsteht

schließlich eine Anlage, aus der später das Cerebellum hervorgeht.

Abb. 5: Die Position des Isthmus-Organisators (A) Schematische Darstellung des zentralen Nervensystems der Maus am Embryonalstadium 9.5 dpc. Das Neuralrohr ist in Segmente gegliedert. Am anterioren Ende (A) des Neuralrohrs entsteht das Vorderhirn (grün), das sich später in Telencephalon (tel) und Diencephalon (di) unterteilt. Weiter posterior (P) gelegene Regionen sind das Mittelhirn (gelb), das Rautenhirn (rot) und das Rückenmark (blau). Das Rautenhirn gliedert sich in 7 Rhombomere (rh 1-7). Das Cerebellum geht aus dem dorsalen rh 1 hervor und der Isthmus-Organisator (IsO) bildet sich an der Grenze zwischen Mittel- und Rautenhirn aus. (B) Die Grenze zwischen den Gbx2- (grün) und Otx2- (gelb) Expressionsdomänen positioniert den IsO (Pfeil) im Wildtyp (Wt) an 9.5 dpc und bestimmt die anteriore Grenze von Mittelhirn (midbrain) und Cerebellum. Auch dargestellt sind die Expressionsdomänen von Wnt1 (rot) und Fgf8 (blau). D, dorsal; V, ventral. Abbildung entnommen aus (Chizhikov und Millen, 2003).

Die unterschiedlichen Zelltypen des Kleinhirns entwickeln sich aus zwei verschiedenen

Keimregionen (Abb. 6). Dabei bringt die Ventrikulärzone die tiefen nukleären Neurone, die

Purkinjezellen, die Korb- und Sternzellen sowie die Golgizellen hervor, während die

Rautenlippe die Körnerzellen bildet (Goldowitz und Hamre, 1998). Aus der Ventrikulärzone

im Dach des vierten Ventrikels gehen als erstes die tiefen nukleären Neurone (10 dpc bis

12 dpc in der Maus) hervor. Kurz darauf werden die Purkinjezellen (11 dpc bis 13 dpc)

gebildet.

Einleitung

9

Abb. 6: Die Entwicklung des Cerebellums Schematische Darstellung des sich entwickelnden Cerebellums an den Embryonalstadien 13 dpc (e13) und 16 dpc (e16), am Postnatalstadium P6 (p6) und in der adulten Maus. Aus der Ventrikulärzone (VZ) im Dach des vierten Ventrikels (IVth ventr.) gehen Neurone der tiefen cerebellären Kerne (DCN, pink) und Purkinjezellen (rot) hervor. Die Purkinjezell-Vorläufer wandern über ein Radial-Glia-Fasersystem (vertikale schwarze Linien) in den cerebellären Kortex ein. Aus der Rautenlippe (rl) entwickeln sich die Körnerzellen (schwarz), die tangential an der cerebellären Oberfläche in den Kortex migrieren und die externe Körnerzellschicht (EGL) bilden. Nach Proliferation der Körnerzellen in der EGL beginnen diese zu differenzieren. Dabei wandern sie entlang von Bergmann-Glia-Fasern durch die Purkinjezellschicht (PC) hindurch und die interne Körner-zellschicht (IGL) entsteht. Die Pfeile zeigen die jeweilige Richtung der Zellmigration an. Abbildung entnommen aus (Chizhikov und Millen, 2003).

Anschließend wandern postmitotische Purkinjezellen aus der Ventrikulärzone (Altman und

Bayer, 1978; Miale und Sidman, 1961), vermutlich entlang eines Radial-Glia-Fasersystems

(Edwards et al., 1990), in den cerebellären Kortex ein. Dort verbleiben diese zunächst nahe

der Kleinhirnoberfläche in einer mehrlagigen Zellschicht. In den ersten fünf postnatalen

Tagen der Maus bildet sich daraus eine einlagige Purkinjezellschicht (Jankowski et al., 2004).

Zwischen den Embryonalstadien 13 dpc und 15 dpc beginnen die Körnerzellen aus der von

der beidseitigen Ausstülpung der Flügelplatte des Metencephalons gebildeten Rautenlippe

auszuwandern. Dabei migrieren sie tangential an der cerebellären Oberfläche entlang in den

Kortex und bilden dort die mitotisch aktive externe Körnerzellschicht. Auch die Golgizellen

bewegen sich zu dieser Zeit in den Kortex des Kleinhirns. Die Zellen in der externen

Körnerzellschicht bleiben während der ersten zwei postnatalen Wochen mitotisch aktiv. Um

den Zeitpunkt der Geburt herum beginnt ein Teil der Körnerzellen den Zellzyklus zu

verlassen, um sich als postmitotische Körnerzellen im inneren Bereich der externen

Körnerschicht zu postieren. Aus dieser Position heraus wandern die Zellen schließlich radial

entlang von Bergmann-Glia-Fasern nach innen in den cerebellären Kortex und bilden

unterhalb der Purkinjezellen die interne Körnerzellschicht. Die Migration und Reifung der

Körnerzellen kommt am Postnataltag 20 der Maus zum Abschluß und die grobe

morphologische Entwicklung des Cerebellums ist nach der zweiten Postnatalwoche der Maus

Einleitung

10

beendet (Chizhikov und Millen, 2003; Goldowitz und Hamre, 1998; Sillitoe und Joyner,

2007).

1.2 ZELLTYPEN DES ZENTRALEN NERVENSYSTEMS

Das zentrale Nervensystem der Vertebraten besteht aus drei Hauptklassen von Neuralzellen.

Dazu gehören die Nervenzellen sowie die zu den Makroglia gehörenden Astrozyten und

Oligodendrozyten (Miller, 2002; Rowitch, 2004), wobei alle drei Zelltypen vom

Neuroektoderm abstammen. Daneben kann man einen weiteren Zelltypus im zentralen

Nervensystem finden, der nicht aus dem Neuroektoderm, sondern aus dem Mesoderm

hervorgeht und als Mikroglia bezeichnet wird (Barron, 1995) (Abb. 7).

Abb. 7: Die Zelltypen des zentralen Nervensystems Gezeigt sind die verschiedenen Typen von Gliazellen im zentralen Nervensystem (ZNS) und ihre Interaktionen untereinander und mit Neuronen. Astrozyten sind sternförmige Zellen mit vielen Ausläufern, die die Somata, Dendriten und Axone von Neuronen, die Somata und Fortsätze von Oligodendrozyten und andere Astrozyten kontaktieren. Oligodendrozyten sind die myelinbildenden Zellen des ZNS. Sie besitzen einen kleinen, runden Zellkörper mit vielen Zellfortsätzen, mit denen sie mehrere neuronale Axone umhüllen. Neurone haben ihre Funktion in der Aufnahme, der Verarbeitung und Weiterleitung von Informationen. Über ihre fein verästelten Dendriten können sie Signale empfangen, in den Zellkörpern verarbeiten und über lange dünne Axone weitergeben. Mikroglia entstehen aus Vorläuferzellen des blutbildenden Systems und stellen die Immunzellen des ZNS dar. Abbildung entnommen und leicht verändert aus (Baumann und Pham-Dinh, 2001).

Neurone erfüllen ihre Aufgabe in der Aufnahme, Verarbeitung und Weiterleitung von

Informationen. Mit ihren fein verästelten Fortsätzen, den Dendriten, können sie Signale

empfangen und an den Zellkörper (Perikaryon, Soma) weiterleiten. Dort werden die

Einleitung

11

Informationen verarbeitet und über einen langen, dünnen Ausläufer weitergeleitet, der als

Axon (Nervenfaser, Neurit) bezeichnet wird.

Oligodendrozyten stellen die myelinbildenden Zellen des zentralen Nervensystems dar, die

mit ihren Zellfortsätzen die Axone der Nervenzellen spiralförmig umhüllen und isolieren, so

dass eine schnelle, saltatorische Erregungsleitung gewährleistet ist. Die Oligodendrozyten-

Entwicklung beginnt mit der Spezifizierung von Vorläuferzellen im Neuroepithel (Abb. 8).

Während dieser Phase kommt es in den Zellen zur Expression der bHLH (basic helix-loop-

helix)- Transkritionsfaktoren Olig1 und Olig2 (Lu et al., 2000; Zhou et al., 2000) und des

HMG-Box (high mobility group-box) Proteins Sox10 (Kuhlbrodt et al., 1998b). Etwas später

lässt sich ein weiterer Faktor in den Oligodendrozyten-Vorläuferzellen nachweisen, der

PDGFRα (platelet-derived growth factor receptor-alpha). Im Laufe der Entwicklung wandern

die bipolaren Vorläuferzellen aus der Keimzone in die Umgebung aus und proliferieren dabei

weiter. Nachdem sie als Pro-Oligodendrozyten mit der Migration aufgehört haben,

differenzieren sie schließlich zu postmitotischen, myelinbildenden Oligodendrozyten (Jessen,

2004; Woodruff et al., 2001). In dieser Phase beginnen die Zellen eine Reihe von

Myelinkomponenten wie MBP (myelin basic protein) und PLP (proteolipid protein) zu

exprimieren (Baumann und Pham-Dinh, 2001; Lemke, 1988; Pfeiffer et al., 1993). Während

jedoch die PDGFRα-Expression im Laufe der Oligodendrozyten-Entstehung abgeschaltet

wird, bleiben Olig1, Olig2 und Sox10 weiter exprimiert und können auch in adulten

Oligodendrozyten noch detektiert werden. Die Bedeutung der letztgenannten Faktoren für die

Entwicklung dieser Gliazellen konnte durch die Analyse von Mausmutanten ermittelt werden.

So lässt sich im Olig2-defizienten Rückenmark ein Spezifizierungsdefekt von Motoneuronen

und Oligodendrozyten feststellen (Lu et al., 2002; Takebayashi et al., 2002; Zhou und

Anderson, 2002), während in Abwesenheit von Sox10 diese Gliazellen im Rückenmark nicht

in der Lage sind, terminal zu differenzieren (Stolt et al., 2002).

Neben den Oligodendrozyten gibt es eine weitere Gruppe von Gliazellen im zentralen

Nervensystem, die als Astrozyten bezeichnet werden (Abb. 7). Sie haben ein unregelmäßiges,

sternförmiges Aussehen und können morphologisch in zwei Typen unterteilt werden. Die

protoplasmatischen Astrozyten besitzen kürzere, stärker verzweigte Fortsätze und befinden

sich vor allem in der grauen Substanz, wohingegen die fibrillären Astrozyten längere

Ausläufern bilden und hauptsächlich in der weißen Substanz vorkommen. Neben vielen

weiteren Funktionen sorgen diese Zellen durch die Aufnahme von Kaliumionen, die während

der Erregungsleitung von Nervenzellen freigesetzt werden, für die Aufrechterhaltung des

Ionenhaushaltes (Barres et al., 1990a; Barres et al., 1990b; Sontheimer et al., 1992). Über

Einleitung

12

cytoplasmatische Brücken, die man als gap junctions bezeichnet, stehen Astrozyten

untereinander in engem Kontakt (Brightman und Reese, 1969), wodurch ein großes Netzwerk

(funktionelles Syncytium) entsteht, über das aufgenommenes Kalium schnell weitergegeben

und abgepuffert werden kann. Daneben sind Astrozyten auch in der Lage, von den Synapsen

der Nervenzellen freigesetzte Neurotransmitter wie beispielsweise Glutamat aufzunehmen

und dadurch zu beseitigen (Rothstein et al., 1994). Dieser Gliazelltyp entwickelt sich unter

anderem durch Transdifferenzierung aus Radial-Glia-Zellen (Schmechel und Rakic, 1979;

Voigt, 1989) und wird oft durch das Intermediärfilamentprotein GFAP (glial fibrillary acidic

protein) identifiziert, das ab dem Zeitpunkt der Zelldifferenzierung exprimiert wird (Bignami

und Dahl, 1974a; Bignami et al., 1972; Eng et al., 1971).

Im Gegensatz zu den Neuronen und Makroglia entstehen Mikroglia aus Vorläuferzellen des

blutbildenden Systems. Diese stellen die Immunzellen des zentralen Nervensystems dar, die

zur Antigenpräsentation befähigt sind und sich in phagozytierende Makrophagen umwandeln

können (Barron, 1995).

Abb. 8: Die Entwicklung von Oligodendrozyten Oligodendrozyten entwickeln sich aus Vorläuferzellen im Neuroepithel, die die Transkriptionsfaktoren Olig1 und Olig2 (Olig+) exprimieren. Mit Beginn der Auswanderung kennzeichnet das Vorkommen von PDGF-Rα die Oligodendrozyten-Vorläufer. Nach der Umwandlung zu nichtwandernden Pro-Oligodendrozyten präsentieren die Zellen das Oberflächen-Antigen O4. Schließlich differenzieren sie zu Prä-myelinisierenden Oligodendrozyten mit der Expression von Galactocerebrosid (GC+) und zu myelinisierenden Oligodendrozyten mit der Bildung des basischen Myelinproteins (MBP+) und des Proteolipidproteins (PLP+). Abbildung entnommen und leicht verändert aus (Jessen, 2004).

Einleitung

13

1.2.1 Radial-Glia

Radial-Glia sind die ersten Glia-Zellen, die während der Entwicklung des zentralen

Nervensystems in Erscheinung treten und aus Neuroepithel-Zellen hervorgehen (Götz und

Huttner, 2005). Radial-Glia-Zellen lassen sich durch ihre charakteristische radiäre Morpho-

logie und ihre glialen Eigenschaften definieren. Das Soma dieser Zellen liegt in der

Ventrikulärzone und ein langer Fortsatz erstreckt sich vom Zellkörper bis zur pialen

Oberfläche (Bentivoglio und Mazzarello, 1999; Cameron und Rakic, 1991). Dieses Aussehen

zeigen jedoch nicht nur Radial-Glia, sondern auch Neuroepithel-Zellen. Diesen beiden

Zelltypen ist weiterhin gemeinsam, dass sie das Intermediärfilament Nestin und die Antigene

RC1 und RC2 (Chanas-Sacre et al., 2000; Hartfuss et al., 2001; Misson et al., 1988; Mori et

al., 2005) exprimieren. Im Unterschied dazu zeigen nur Radial-Glia eine Expression

astroglialer Marker, zu denen der Astrozyten-spezifische Glutamat-Transporter GLAST

(Hartfuss et al., 2001; Malatesta et al., 2000), die Glutamin-Synthetase (GS) (Akimoto et al.,

1993), Tenascin C (TNC) (Götz et al., 1998), Vimentin (Schnitzer et al., 1981) und BLBP

(brain lipid binding protein; auch als B-FABP (brain-related fatty acid-binding protein)

bekannt) gehören (Hartfuss et al., 2001). Diese Moleküle wiederum werden auch von

reaktiven Astroglia und neuralen Stammzellen im adulten Gehirn exprimiert. Das saure

Gliafaserprotein GFAP dagegen wird nur in Radial-Glia-Zellen einiger Spezies wie zum

Beispiel den Primaten (Choi, 1981; Levitt und Rakic, 1980) hergestellt, in Nagetieren jedoch

nicht (Bignami und Dahl, 1974b). Zudem kommt dieses Protein in reaktiven Astroglia und

neuralen Stammzellen vor (Mori et al., 2005). Somit lassen sich anhand von molekularen

Markern Radial-Glia von Neuroepithel-Zellen abgrenzen. Im Gegensatz dazu sind bisher noch

keine Marker identifiziert worden, die eine Differenzierung zwischen Radial-Glia und

reaktiven Astrozyten erlauben. Radial- und reaktive Glia können jedoch aufgrund ihrer

Morphologie unterschieden werden. Zu den Aufgaben, die von Radial-Glia-Zellen ausgeführt

werden, gehört ihre unterstützende Funktion bei der radiären neuronalen Migration, indem sie

mit ihren langen Fortsätzen eine Art Gerüst bilden, an denen Nervenzellen entlang wandern

können (Hatten, 1999; Rakic, 1972). Daneben fungieren diese mitotisch aktiven Zellen auch

als Vorläuferzellen, aus denen nicht nur Glia, sondern auch Neurone hervorgehen können

(Malatesta et al., 2000; Miyata et al., 2001; Noctor et al., 2001; Tamamaki et al., 2001).

Nachdem die Generierung und Migration von Neuronen abgeschlossen ist, kommt es

schließlich zur Transformation von Radial-Glia-Zellen zu Astrozyten (Schmechel und Rakic,

1979; Voigt, 1989). Jedoch lassen sich auch im zentralen Nervensystem erwachsener

Einleitung

14

Organismen noch Radial-Glia finden, wie zum Beispiel die Bergmann-Glia im sich

entwickelnden und adulten Cerebellum und die Müller-Glia in der Retina.

1.2.2 Bergmann-Glia – die Radial-Glia des Kleinhirns

Bergmann-Glia, auch als Golgi-Epithelzellen bezeichnet, sind reife radiäre Astrozyten im

Kleinhirn. Ihre Zell-Somata befinden sich in der Purkinjezellschicht und ihre radiären

Fortsätze erstrecken sich durch die Molekularschicht zur pialen Oberfläche. Mit ihren

Ausläufern umhüllen sie die Synapsen der Purkinjezellen (Reichenbach et al., 1995).

Außerdem können in diesen Glia-Zellen verschiedenste Rezeptoren und Transporter gefunden

werden. Zu ihnen gehören die AMPA-Rezeptoren, die für Calciumionen permeabel sind.

Werden diese Rezeptoren durch genetische Manipulationen impermeabel für Calciumionen,

ziehen sich infolge dessen die glialen Ausläufer, die die Synapsen der Purkinjezellen

umgeben, zurück (Iino et al., 2001). Neben den AMPA-Rezeptoren gibt es in Bergmann-Glia-

Zellen noch weitere Glutamatrezeptoren wie zum Beispiel die NMDA- (Lopez et al., 1997)

und Kainatrezeptoren (Ortega et al., 1991). Zu den Transportern, die sich in diesen Glia-

Zellen identifizieren lassen, zählen die Glutamat- und Glycintransporter (Lopez et al., 2005).

Durch diese Ausstattung an Rezeptoren und Transportern sind Bergmann-Glia in der Lage,

die neuronale Übertragung auf verschiedenste Weise zu beeinflussen (Muller und Kettenmann,

1995; Muller et al., 1996). Weiterhin ist bekannt, dass Bergmann-Glia während der

Entwicklung des Kleinhirns mit wandernden Körnerzellen assoziieren, weshalb das Konzept

der „Glia-geführten“ neuronalen Migration aufgestellt wurde (Rakic, 1971). Ähnlich wie

andere Radial-Glia-Populationen exprimieren auch Bergmann-Glia Vimentin, B-FABP,

Glutamin-Synthetase, GFAP und GLAST. RC2 dagegen ist nur bis zur zweiten postnatalen

Woche der Kleinhirnentwicklung zu finden (Pinto und Götz, 2007). Mit Hilfe einer

induzierbaren Form der Cre-Rekombinase (CreERT2), die im Lokus des Astrozyten-

spezifischen Glutamat-Transporters (GLAST) exprimiert wird, konnte gezeigt werden, dass

embryonale Radial-Glia-Zellen sowohl cerebelläre Neurone als auch Bergmann-Glia

hervorbringen können (Mori et al., 2006). Damit ist das Cerebellum ähnlich wie andere

Regionen des entstehenden zentralen Nervensystems im Besitz neurogener Radial-Glia-Zellen.

Über Signalwege, die die Differenzierung von Bergmann-Glia regulieren, ist bisher nicht viel

bekannt. Vor kurzem wurde jedoch Caspase-3 mit der Reifung dieser Glia-Zellen in

Verbindung gebracht. So führt die Inhibierung der Caspase-3-Aktivität zur Verringerung der

Differenzierung von Bergmann-Glia-Zellen in Kultur und zur Erhöhung der Zahl

Einleitung

15

proliferierender Vorläuferzellen (Oomman et al., 2006). Weitere Faktoren, die in Bergmann-

Glia vorkommen, sind die Rezeptoren Notch1-3, die in den ersten zwei postnatalen Wochen

deutlich in den Fortsätzen der Zellen zu detektieren sind. Danach nehmen die Signale für

diese Rezeptoren graduell ab und sind im Erwachsenenalter nicht mehr nachzuweisen. Zudem

sind in den Ausläufern von Bergmann-Glia des postnatalen Kleinhirns die Notch-Liganden

Jagged1 und 2 lokalisiert (Tanaka und Marunouchi, 2003). Schließlich kann in adulten

Bergmann-Glia die Expression der Transkriptionsfaktoren Sox1, Sox2 und Sox9, die als

Marker für neurale Stammzellen fungieren, detektiert werden (Sottile et al., 2006). Damit

könnten diese Zellen möglicherweise die Stammzellen im adulten Cerebellum repräsentieren

(Sottile et al., 2006).

1.3 DAS REELER-MAUS-MODELL

In den letzten Jahren wurden bemerkenswerte Fortschritte bei der Identifizierung und

Charakterisierung von Genen gemacht, die für die korrekte Zellpositionierung im sich

entwickelnden Gehirn von Maus und Mensch gebraucht werden (D'Arcangelo und Curran,

1998; Walsh, 1999). Die reeler-Maus, eine klassische ataktische Mausmutante, fungiert seit

längerem als Prototyp für die Untersuchung neurologischer Mutationen, durch die die

neuronale Migration und die Organisation des zentralen Nervensystem beeinträchtigt werden.

Das Kennzeichen dieser Mutante ist die gestörte neuronale Zytoarchitektur im cerebralen

Kortex, Cerebellum und Hippokampus (D'Arcangelo und Curran, 1998; Rakic und Caviness,

1995). Reelin, ein großes extrazelluläres Protein, das in reeler-Mäusen defekt ist, wird von

den Cajal-Retzius-Zellen in den kortikalen Marginalzonen und von cerebellären Körnerzellen

in der externen Körnerzellschicht sezerniert (D'Arcangelo et al., 1995; Schiffmann et al.,

1997). Auffällige Abweichungen im Cerebellum von reeler-Mäusen sind die Verlagerung der

Purkinjezellen und eine Reduktion der Körnerzellzahl. Purkinjezellen, die normalerweise

direkt unterhalb der externen Körnerzellschicht zu liegen kommen, befinden sich in diesen

Mäusen in subkortikalen Regionen, wo sie Cluster bilden (Goffinet, 1984; Goffinet et al.,

1984; Mariani et al., 1977). Als Folge dieser gestörten Zellmigration sind die Purkinjezellen

nicht nah genug an den Körnerzellen, um deren Proliferation mit Hilfe des Körnerzell-

Mitogens Shh zu unterstützen (Dahmane und Ruiz i Altaba, 1999; Wallace, 1999; Wechsler-

Reya und Scott, 1999). Kurz nachdem das Reelin-Gen identifiziert worden war, wurde ein der

reeler-Maus ähnlicher Phänotyp beschrieben. Diese neue spontane Mausmutante wurde

scrambler genannt (Sweet et al., 1996). Das scrambler-Gen ließ sich als cytoplasmatisches

Einleitung

16

Adaptorprotein Dab1 (disabled 1) identifizieren und wird in Zellen, die auf Reelin reagieren,

wie zum Beispiel die Kortikalplatten- oder Purkinjezellen, exprimiert (Howell et al., 1997;

Sheldon et al., 1997; Ware et al., 1997). Weitere reeler-ähnliche Phänotypen lassen sich in

Mäusen mit Mutationen in den beiden Lipoprotein-Rezeptoren, dem VLDLR (very low

density lipoprotein receptor) und dem ApoRE2 (apolipoprotein E receptor type 2), finden.

Reelin kann direkt an diese Rezeptoren binden, wodurch eine Kinase-Signal-Kaskade

aktiviert wird, die die Tyrosin-Phosphorylierung von Dab1 auslöst (D'Arcangelo et al., 1999;

Hiesberger et al., 1999; Trommsdorff et al., 1999). All diese Faktoren gehören vermutlich

einem gemeinsamen Signalweg an, der die Zellpositionierung im sich entwickelnden

zentralen Nervensystem kontrolliert. Reelin fungiert dabei möglicherweise als Stopsignal für

Neuronen am Ende ihres Migrationsweges.

1.4 DIE FAMILIE DER SOX-PROTEINE

Transkriptionsfaktoren der Sox-Proteinfamilie traten mit der Entdeckung des

geschlechtsbestimmenden Faktors SRY (sex determining region on Y chromosome) zum

ersten Mal in Erscheinung (Gubbay et al., 1990; Sinclair et al., 1990). SRY befindet sich auf

dem Y-Chromosom der Säugetiere und enthält eine DNA-Bindedomäne, die als HMG-Box

(high mobility group-box) oder auch als SRY-Box bezeichnet wird, wovon sich der Name der

Sox-Proteine ableitet. SRY und Sox-Proteine werden aufgrund ihrer Ähnlichkeiten in der

HMG-Domäne (mindestens 50 % Aminosäure-Identität) in eine Proteinfamilie eingeteilt und

bilden eine Untergruppe der HMG-Box Superfamilie. Diese Superfamilie kann in zwei

Unterfamilien eingeteilt werden, eine bilden die Sox- und TCF-Proteine und die andere die

HMG/UBF-Proteine. Während die Mitglieder der HMG/UBF-Familie mehrere HMG-

Domänen besitzen, mit denen sie unspezifisch an DNA binden können, haben TCF/Sox-

Proteine eine einzelne HMG-Box und binden sequenzspezifisch an DNA (Grosschedl et al.,

1994; Laudet et al., 1993). Die DNA-Bindung der Sox-Proteine erfolgt über die kleine Furche

der Doppelhelix an die heptamere Konsensussequenz 5’-A/T A/T CAA A/T G-3’ (Harley et al.,

1994; Weiss, 2001). Dadurch kommt es zu einer Beugung der DNA um einen Winkel von

70-85 ° und zu ihrer partiellen Entwindung (Connor et al., 1994; Ferrari et al., 1992; Werner

et al., 1995). Diese Eigenschaft ist ein Grund dafür, dass man Sox-Proteinen auch

architektonische Funktionen zuordnet (Werner und Burley, 1997). Über die DNA-Bindung

und -Beugung hinaus kann die HMG-Domäne auch Protein-Protein-Interaktionen vermitteln

Einleitung

17

(Ambrosetti et al., 1997; De Santa Barbara et al., 1998; Hosking et al., 2001; Wissmüller et al.,

2006).

Mitglieder der Sox-Proteinfamilie sind im gesamten Tierreich zu finden und an vielen

verschiedenen Entwicklungsprozessen beteiligt. In Säugetieren wurden 20 verschiedene Sox-

Proteine identifiziert, die aufgrund von Sequenzhomologien in acht Untergruppen (A-H)

eingeteilt werden (Bowles et al., 2000; Pevny und Lovell-Badge, 1997; Schepers et al., 2002;

Wegner, 1999). Innerhalb einer Untergruppe sind die HMG-Domänen zu mehr als 80 %

identisch. Häufig findet man bei Mitgliedern einer Untergruppe auch außerhalb der DNA-

Bindedomäne konservierte Regionen. Dazu gehört die Transaktivierungsdomäne, die sich

häufig, wie bei den Untergruppen C und E, am C-Terminus befindet (Kuhlbrodt et al., 1998a;

Pusch et al., 1998; van de Wetering et al., 1993), während sie bei Sox18 als Mitglied der

Untergruppe F zentral lokalisiert ist (Hosking et al., 1995). Bei den Mitgliedern der

Untergruppe D kann man neben der HMG-Domäne ein Leucin-Zipper Motiv mit

angrenzender Glutamin-reicher Region finden. Gemeinsam bilden diese beiden Bereiche eine

sogenannte coiled-coil-Domäne, die eine Homo- und Heterodimerisierung vermittelt

(Lefebvre et al., 1998; Takamatsu et al., 1995). Auch bei der genomischen Organisation der

Sox-Gene von Säugern kann man innerhalb der Mitglieder der einzelnen Untergruppen

Ähnlichkeiten erkennen. So sind die Sox-Gene der Gruppe B und C intronlos, während die

Mitglieder der Gruppen D bis G eine Exon-Intron-Struktur aufweisen (Wegner, 1999).

Um als Transkriptionsfaktoren an ihren Wirkort zu gelangen, muß eine Translokation der

Sox-Proteine in den Zellkern möglich sein. Für SRY und die Proteine der Gruppe E ließen

sich bereits die für den Transport erforderlichen Kern-Lokalisierungssignale (NLS) nach-

weisen (Rehberg et al., 2002; Sudbeck und Scherer, 1997). Zudem konnte in der HMG-

Domäne von Sox9 und Sox10 ein Kern-Exportsignal (NES) identifiziert werden, das einen

aktiven Transport aus dem Zellkern erlaubt (Gasca et al., 2002; Rehberg et al., 2002). Beide

Signale zusammen ermöglichen diesen Proteinen ein Shuttling zwischen Nukleus und

Cytoplasma, was für ihre Funktion von Bedeutung zu sein scheint.

1.4.1 Sox-Proteine der Gruppe C

In Drosophila melanogaster (Cremazy et al., 2001) und niederen Tierspezies gibt es nur ein

einziges Sox-Protein, das der Gruppe C zugeordnet wird, während man in Maus, Mensch und

den meisten anderen Vertebraten drei Mitglieder finden kann, die als Sox4, Sox11 und Sox12

bezeichnet werden (Abb. 9). Zumindest in Wirbeltieren werden die Mitglieder dieser Gruppe

Einleitung

18

durch Gene kodiert, in denen der offene Leserahmen ein einziges Exon umfasst. Die DNA-

Bindedomäne der zugehörigen Proteine befindet sich im N-terminalen Drittel und ist

innerhalb der Gruppe hoch konserviert. Im C-terminalen Drittel der Transkriptionsfaktoren

gibt es einen weiteren homologen Bereich, der als Transaktivierungsdomäne identifiziert

werden konnte (Bowles et al., 2000; Schepers et al., 2002; Wegner, 1999).

Abb. 9: Die Sox-Proteine der Gruppe C Schematisch dargestellt sind die Gruppe C-Proteine Sox4 und Sox11 aus der Maus (mo-SOX4, mo-SOX11), SOX12 aus dem Menschen (hu-SOX12) und Sox24 aus der Regenbogenforelle (tr-SOX24). Die Proteine besitzen keine Introns (ni). Die HMG-Boxen liegen im N-terminalen Drittel (schwarze Box), und im C-termi-nalen Drittel befinden sich die Transaktivierungsdomänen (TA, hellgrauer Kasten mit roter Umrandung) von mo-SOX4, mo-SOX11 und tr-SOX24. Die weißen Boxen am Anfang und Ende aller vier Proteine sind hoch konservierte Bereiche. Im C-terminalen Teil des mo-SOX4 läßt sich eine Serin-reiche Region (hellblaue Raute) nachweisen, die auch im mo-SOX11 vorhanden ist. Zudem besitzt das mo-SOX11-Protein eine saure Region (gelbe kreisähnliche Form), an die sich eine Prolin-Glutamin-reiche Sequenz (dunkelblauer Kasten) anschließt. Ein saurer Bereich ist ebenfalls in hu-SOX12 und tr-SOX24 zu finden. Abbildung entnommen und leicht verändert aus (Bowles et al., 2000).

Auf Grund der nahen Verwandtschaft von Sox4, Sox11 und Sox12 geht man davon aus, dass

sie sich biochemisch ähnlich verhalten und somit den Verlust der jeweiligen anderen Proteine

in den Geweben, in denen sie gemeinsam exprimiert werden, kompensieren können. Solch

eine stark überlappende Expression dieser Proteine findet man zum Beispiel im zentralen

Nervensystem (Cheung et al., 2000; Jay et al., 1997).

1.4.1.1 Sox4

Sox4 ist das erste Mitglied der Sox-Genfamilie, von dem gezeigt werden konnte, dass es als

Transaktivator der Transkription wirken kann. Seine transaktivierende Kapazität ist im

serinreichen C-Terminus des Proteins lokalisiert (Abb. 9). In derselben Studie wurde auch die

Expression von Sox4 in T- und prä-B-Lymphozyten-Zelllinien, in den Gonaden und im

fötalen Gehirn der Maus nachgewiesen (van de Wetering et al., 1993). Desweiteren wurde

eine Sox4-Expression in den Endokardkissen und Endokardleisten des Herzens der Maus am

Embryonalstadium 13 dpc festgestellt. Um die Funktion von Sox4 zu analysieren, wurde

Einleitung

19

dieses Gen in Mäusen deletiert. Sox4-defiziente Tiere sterben an 14 dpc aufgrund einer

Herzklappeninsuffizienz. Histologische Untersuchungen der mutanten Embryonen lassen eine

Fehlbildung der Taschenklappen und schwere Missbildungen der Ausstrombahn des Herzens

erkennen. Zusätzlich zeigen die Sox4-defizienten Mäuse auch eine Blockade der

Lymphozytenentwicklung auf dem pro-B-Zellstadium (Schilham et al., 1996). Desweiteren

konnte gezeigt werden, dass das Sox4-Transkript im Uterus der Maus vorkommt und die

Expression unter hormoneller Kontrolle steht (Graham et al., 1999; Hunt und Clarke, 1999).

Im sich entwickelnden zentralen Nervensystem der Maus zeigt die Analyse des

Expressionsmusters von Sox4 eine Zunahme der Expression in neuralen Vorläuferzellen, die

die proliferierende Ventrikulärzone des Neuralrohrs verlassen und nach außen wandern, wo

sie mit der Differenzierung beginnen. Während der weiteren Entwicklung der Zellen zu reifen

Neuronen wird die Expression von Sox4 abgeschaltet. Auch im sich entwickelnden Gehirn

findet man schon sehr früh hohe Mengen an Sox4-Transkript. Zu den Regionen mit hohem

Sox4-Vorkommen gehören der zerebrale Kortex, der Thalamus, der Hippokampus und der

cerebelläre Kortex. Trotz der deutlichen Expression von Sox4 sowohl im Rückenmark als

auch im Gehirn lässt sich jedoch in den Sox4-defizienten Embryonen bis zum Zeitpunkt ihres

Absterbens am Embryonalstadium 14 dpc keine abnormale Entwicklung des zentralen

Nervensystems feststellen. Ein Grund hierfür könnte sein, dass das zu Sox4 nah verwandte

Protein Sox11, das ein sehr ähnliches Expressionsmuster zeigt, den Funktionsverlust von

Sox4 im zentralen Nervensystem kompensieren könnte, zumindest zu frühen Zeitpunkten der

Entwicklung (Cheung et al., 2000). Desweiteren wird Sox4 in den embryonalen

Wachstumsfugen der Maus exprimiert und dort durch das Parathyroidhormon reguliert

(Reppe et al., 2000). In einer kürzlichen Studie konnte außerdem gezeigt werden, dass Sox4

eine wichtige Rolle bei der Regulation der postnatalen Knochenbildung spielt (Nissen-Meyer

et al., 2007).

Um neben der Maus auch den Huhn-Embryo als Modellorganismus einsetzen zu können,

wurde infolge das Sox4-Gen des Huhns isoliert und näher charakterisiert. Dabei stellte man

fest, dass sich Sox4 aus dem Huhn und aus der Maus in Struktur und Expressionsmuster sehr

ähnlich sind (Maschhoff et al., 2003). Untersuchungen des sich entwickelnden Pankreas der

Maus identifizierten dieses Organ als weiteren Expressionsort von Sox4, ohne dem Gen

jedoch eine Funktion zuzuordnen (Lioubinski et al., 2003). Weiterhin konnte sowohl in der

Maus als auch im Zebrafisch gezeigt werden, dass Sox4 eine wichtige Rolle bei der

Entwicklung des endokrinen Pankreas spielt (Mavropoulos et al., 2005; Wilson et al., 2005).

Im Zebrafisch beispielsweise lässt sich aufgrund einer Genom-Duplikation bei Knochen-

Einleitung

20

fischen sowohl ein Sox4a als auch ein Sox4b finden. Jedoch ist nur Sox4b stark im sich

entwickelnden Pankreas exprimiert und wird in erster Linie für die Differenzierung

Glukagon-sezernierender alpha-Zellen benötigt (Mavropoulos et al., 2005). Schließlich

konnte man auch eine Überexpression von Sox4 in verschiedenen Tumorarten nachweisen.

Dazu zählen beispielsweise die meisten klassischen Medulloblastome (maligne embryonale

Tumore des Kleinhirns) (Lee et al., 2002), Adenoid-zystische Karzinome (ACC) der

Speicheldrüsen (Frierson et al., 2002) und Prostatakrebs (Liu et al., 2006). Eine

Herabregulierung der Sox4-Expression durch RNA-Interferenz induziert offensichtlich

sowohl in der ACC3-Zelllinie (Pramoonjago et al., 2006) als auch in Prostata-Krebszellen

(Liu et al., 2006) Apoptose. Somit könnte Sox4 durch Förderung des Zellüberlebens zu einem

malignen Zellphänotyp beitragen.

1.4.1.2 Sox11

Nach der Identifizierung von Sox4 wurden mit Sox11 und Sox12 zwei weitere Mitglieder der

Gruppe C in der Maus gefunden (Gubbay et al., 1990; Wright et al., 1993). Untersuchungen

im Huhn lassen eine starke Homologie von Sox11 zu Sox4 in der C-terminalen Region

erkennen. Sox11 wird im zentralen Nervensystem stark in reifenden Neuronen exprimiert, die

das Neuroepithel verlassen haben. Im Laufe der weiteren neuronalen Entwicklung nimmt die

Expression von Sox11 wieder ab. Neben dem zentralen Nervensystem kann man aber auch im

peripheren Nervensystem Sox11-Transkripte nachweisen (Uwanogho et al., 1995). Im

Menschen ist SOX11 auf dem kurzen Arm des Chromosoms 2 (2p25) lokalisiert. Die

Aminosäuresequenz zwischen dem humanen SOX11 und dem Huhn-Homolog ist stark

konserviert. Im C-Terminus des Proteins befindet sich eine sehr saure Region, an die ein

Prolin-Glutamin-reicher Bereich anschließt. Eine weitere Domäne, die in Nähe des

Polypeptidendes liegt, enthält mehrere Serine. Während jedoch die saure Domäne auch im

Huhn und anderen Spezies vorhanden ist, lässt sich die Serin-reiche Region in diesem

Organismus und in Xenopus nicht auffinden (Hargrave et al., 1997; Jay et al., 1995; Miyata et

al., 1996; Uwanogho et al., 1995). Wie im Huhn so ist auch SOX11 im menschlichen Embryo

im zentralen und peripheren Nervensystem exprimiert (Jay et al., 1995). Analysen in der

Maus zeigen ebenfalls hoch konservierte C-terminale Motive (Abb. 9) und Expression im sich

entwickelnden Nervensystem. Daneben können Transkripte in Regionen des Embryos

nachgewiesen werden, in denen während der Gewebeentwicklung und Organausformung

Interaktionen zwischen Epithel und Mesenchym stattfinden. So kommt Sox11 beispielsweise

Einleitung

21

in den Branchialbögen, den Genitalhöckern, den Extremitäten, dem Gesicht, den nasalen

Einstülpungen, den Somiten, den Augen und Ohren vor. Außerdem lässt es sich im Epithel

der Speiseröhre, des Magens, des Pankreas, der Speicheldrüsen und der Zähne detektieren

und ist auch in der Lunge und der Niere vorhanden (Hargrave et al., 1997).

Untersuchungen der eigenen Arbeitsgruppe konnten Sox11 und auch Sox4 in

oligodendroglialen Zellen identifizieren. Dabei werden beide Faktoren in Oligodendrozyten-

Vorläuferzellen exprimiert und während der terminalen Differenzierung wieder

herunterreguliert (Kuhlbrodt et al., 1998a). Sox11 besitzt außerdem eine starke intrinsische

Transaktivierungskapazität, die durch eine Transaktivierungsdomäne im C-terminalen Teil

des Proteins vermittelt wird (Kuhlbrodt et al., 1998a) (Abb. 9). Genau in diesem Bereich

wurde vorher schon die transaktivierende Funktion von Sox4 aufgezeigt (van de Wetering et

al., 1993). Die carboxyterminalen Regionen beider Proteine lassen erhebliche Ähnlichkeiten

erkennen. Beide Faktoren enthalten eine Serin-reiche Domäne in diesem Abschnitt und

stimmen mit 82 % in den letzten 34 Aminosäuren überein. Deshalb ist es wahrscheinlich, dass

entweder eine dieser Domänen oder beide an der Vermittlung der transaktivierenden Funktion

beteiligt sind. Zusätzlich dazu sind sowohl Sox11 als auch Sox4 in der Lage, synergistisch mit

POU-Proteinen zu interagieren. Dabei stellen Brn-1 und Brn-2 ihre bevorzugten Partner dar.

Der Synergismus wiederum ist abhängig vom Binden beider Proteine (POU- und Sox-Protein)

an benachbarte DNA-Elemente und dem Vorhandensein der entsprechenden

Transaktivierungsdomäne in jedem Protein (Kuhlbrodt et al., 1998a).

Experimente an Zebrafischen zeigten, dass Sox11, wie Sox4, ebenfalls dupliziert als Sox11A

und Sox11B vorliegt. Die Transkripte sind im Ei angehäuft und bis zur Gastrulation in allen

Zellen vorhanden. Später sind sie auf das sich entwickelnde zentrale Nervensystem

beschränkt und im adulten Tier ist keine Expression mehr zu detektieren. Das Vorhandensein

von Sox11-Transkripten vor der Midblastula-Transition, dem Einsetzen der Transkription des

embryonalen Genoms, deutet darauf hin, dass diese Transkripte maternal abgelegt werden

(Rimini et al., 1999). Die Ergebnisse von Xenopus-Studien deuten an, dass Sox11, durch die

Expression von Chordin induziert, mit der Nemo-like Kinase (NLK) kooperiert, um die

neurale Entwicklung zu stimulieren (Hyodo-Miura et al., 2002). Eine starke Expression von

Sox11 kann auch in Tumoren wie beispielsweise den klassischen Medulloblastomen

nachgewiesen werden (Lee et al., 2002). Anhand weiterer Untersuchungen konnte eine neue

Domäne in der konservierten Region von Sox11 identifiziert werden. Diese Region scheint

eine inhibierende Wirkung auf die eigene DNA-Bindungsfähigkeit in vitro und die

Einleitung

22

Aktivierung der Reporter-Genexpression in Zellkultur zu haben. Die Domäne enthält saure

Aminosäuren und ist relativ zentral im Protein gelegen (Wiebe et al., 2003).

Um die Funktion von Sox11 während der Säuger-Embryogenese zu studieren, wurde von der

eigenen Arbeitsgruppe eine Sox11-defiziente Maus generiert (Sock et al., 2004). Diese Mäuse

sterben kurze Zeit nach ihrer Geburt. Zum Zeitpunkt der Geburt weisen die Sox11-defizienten

Tiere verschiedenste Entwicklungsdefekte auf. Dazu gehören eine Unterentwicklung der

Lunge, des Magens und des Pankreas. Desweiteren lassen sich in den mutanten Mäusen

schwere Herzfehler nachweisen. So wird die Scheidewand zwischen den beiden

Herzkammern nicht vollständig ausgebildet und in der Ausstrombahn des Herzens unterbleibt

oft die Auftrennung in Aorta und Truncus pulmonalis. Daneben kann es auch zu einer

Transposition der großen Gefäße kommen, wodurch Aorta und Lungenarterie gemeinsam aus

dem rechten Ventrikel hervorgehen. Außerdem treten in den Sox11-defizienten Tiere häufig

Lippenkiefergaumenspalten sowie Verschlussdefekte des Augenlids und der Bauchhöhle auf.

Zudem sind Defekte in der Schädelverknöcherung und der Skelettausbildung sowie ein

Fehlen der Milz zu nennen. Trotzdem lassen sich im zentralen und peripheren Nervensystem

bis zur Geburt der Sox11-defizienten Mäuse keine signifikanten Entwicklungsstörungen

nachweisen (Sock et al., 2004). Dies könnte mit der weitgehenden Ko-Expression von Sox11

mit Sox4 im sich entwickelnden Nervensystem erklärt werden. Kürzlich konnten schließlich

Beweise für eine Rolle von Sox11 und Sox4 in neuronaler Differenzierung mit Hilfe von

Elektroporationsexperimenten in das frühe Neuralrohr des Huhns erbracht werden. In dieser

Studie wurde gezeigt, dass beide Transkriptionsfaktoren für die Expression pan-neuronaler

Gene wie des Klasse III ß-Tubulin-Gens (auch unter dem Namen Tuj1 bekannt) benötigt

werden. Dieses Gen wurde als ein möglicher direkter Zielort von Sox-Proteinen der Gruppe C

identifiziert (Bergsland et al., 2006).

1.4.1.3 Sox12

Im Gegensatz zu Sox4 und Sox11 ist Sox12 als drittes Sox-Protein der Gruppe C bisher nur

wenig analysiert. Ein einziger Bericht existiert, der die Expression von SOX12 im

menschlichen Embryo beschreibt. Zu diesem Zeitpunkt war humanes SOX12 unter dem

Namen SOX22 bekannt (Jay et al., 1997). Aufgrund starker Homologien nicht nur innerhalb,

sondern auch außerhalb der HMG-Domänen von Sox12 in der Maus und von SOX22 im

Menschen sowie der chromosomalen Lokalisation beider Gene in Regionen mit konservierter

Syntenie konnte bestätigt werden, dass sie Orthologe sind. Daher wurde humanes SOX22 in

Einleitung

23

SOX12 umbenannt (Bowles et al., 2000; Jay et al., 1997; Schepers et al., 2002). Humanes

SOX12 ist auf Chromosom 20p13 lokalisiert und scheint aus einem einzigen Exon zu

bestehen. Neben der HMG-Box gibt es in der SOX12-Sequenz einen weiteren zu Sox4 und

Sox11 sehr ähnlichen Bereich, der sich im C-Terminus des Proteins befindet und in den

Gruppenmitgliedern als Transaktivierungsdomäne identifiziert werden konnte (Jay et al.,

1997; Kuhlbrodt et al., 1998a; van de Wetering et al., 1993) (Abb. 9). Für SOX12 allerdings

ist die Transaktivierungskapazität dieser Domäne bisher noch nicht gezeigt worden. SOX12-

Expression kann im menschlichen Embryo in vielen mesodermalen und in einigen

entodermalen Derivaten nachgewiesen werden. Eine starke Genexpression für Sox12 ist vor

allem im zentralen Nervensystem festzustellen mit einer großen Ähnlichkeit zum Sox4- und

Sox11-Expressionsmuster. Auch in adulten Geweben wie zum Beispiel im Herzen, Pankreas,

Testis und Ovar lässt sich SOX12-mRNA finden (Jay et al., 1997).

Problemstellung

25

2 Problemstellung

Die Mitglieder der Sox-Proteinfamilie spielen eine wichtige Rolle bei der transkriptionellen

Regulation verschiedenster Entwicklungsprozesse. Dabei gehören die Transkriptionsfaktoren

Sox4, Sox11 und Sox12 zur Gruppe C der Sox-Proteine.

Im Gegensatz zu Sox4 und Sox11 ist Sox12 bislang noch nicht funktionell charakterisiert und

seine Expression nur für den menschlichen Embryo beschrieben. Daher sollte im ersten Teil

dieser Arbeit die Expression von Sox12 im sich entwickelnden Mausembryo mit Hilfe der

RT-PCR- und in situ Hybridisierungstechnik genauer untersucht werden und mit der

Expression von Sox4 und Sox11 verglichen werden. Zusätzlich sollte die Funktion dieses

Transkriptionsfaktors anhand eines Knockout-Mausmodells analysiert werden. Anhand von

Untersuchungen embryonaler Gewebe mittels in situ Hybridisierung und RT-PCR sollte die

Auswirkung der Sox12-Defizienz auf die Expression von Sox4 und Sox11 beobachtet werden.

Daneben sollten das DNA-Bindeverhalten von Sox12 mit Hilfe der Gelshiftanalyse und eine

mögliche transaktivierende Wirkung dieses Transkriptionsfaktors durch Luciferase-Aktivi-

tätstests sowie durch in ovo Elektroporation im Huhn-Embryo erforscht werden.

Für die Gruppe C-Mitglieder Sox4 und Sox11 wird eine wichtige Rolle im sich ent-

wickelnden Nervensystem postuliert, da in früheren Arbeiten eine starke Expression dieser

Faktoren nachgewiesen werden konnte. Auf Grund einer zu vermutenden gegenseitigen

funktionellen Redundanz der beiden Proteine lassen sich im Maus-Modell weder für Sox4

noch für Sox11 neurale Defekte nach Deletion dieser Proteine nachweisen. Deshalb sollte im

zweiten Teil dieser Arbeit die Funktion der Sox-Proteine der Gruppe C in Überexpressions-

studien analysiert werden. Dafür waren transgene Mäuse generiert worden, die den

Transkriptionsfaktor Sox4 unter dem humanen GFAP-Promotor in Radial-Glia und

Astrozyten exprimieren. Mittels histologischer Methoden sollte die räumliche und zeitliche

Expression des Sox4-Transgens dokumentiert und die Auswirkungen auf die Entwicklung

von Radial-Glia-Zellen und Astrozyten aufgezeigt werden.

Ergebnisse

27

3 Ergebnisse

3.1 HERSTELLUNG UND ANALYSE SOX12-DEFIZIENTER MÄUSE

Sox12 gehört mit Sox4 und Sox11 zur Gruppe C der Sox-Proteinfamilie. Über die Funktion

von Sox12 ist im Gegensatz zu Sox4 und Sox11 nicht viel bekannt. Bislang ist das Sox12-

Expressionsmuster nur im menschlichen Embryo beschrieben (Jay et al., 1997) und dort

ähnelt es dem Vorkommen der beiden anderen SoxC-Gene (Hargrave et al., 1997; Kuhlbrodt

et al., 1998a; Schilham et al., 1996). Funktionelle Studien oder Tiermodelle für Sox12 gibt es

bisher noch nicht. Deshalb sollte im ersten Teil dieser Arbeit die Expression von Sox12 im

sich entwickelnden Mausembryo genauer charakterisiert und die Funktion von Sox12 nach

Deletion des Gens in der Maus analysiert werden.

3.1.1 Herstellung von spezifischen Antikörpern gegen Sox12, Sox11 und Sox4

Zur genaueren Charakterisierung der Sox12-Expression im sich entwickelnden Nervensystem

und um diese mit den verwandten Proteinen Sox4 und Sox11 vergleichen zu können, sollten

spezifische Antikörper gegen die drei Faktoren generiert werden.

Dafür wurden zunächst ihre Aminosäuresequenzen verglichen, um Bereiche zu identifizieren,

die spezifisch für das jeweilige Sox-Protein sind. Dabei konnte für Sox4 eine Region

bestimmt werden, die im Protein der Ratte die Aminosäuren 240-333 umspannt (Genbank-Ref.

XP_344595). Für Sox11 wurden die Aminosäuren 204-285 des Rattenproteins gewählt

(Genbank-Ref. NP_445801), während für Sox12 die Aminosäuresequenz 5-31 des

Mausproteins identifiziert wurde (Genbank-Ref. NP_035568) (Abb. 10). Die hier

verwendeten Rattensequenzen sind nahezu identisch mit denen der Maus und waren früher im

Labor kloniert worden.

Abb. 10: Lokalisation der Peptide für die Herstellung spezifischer Antikörper gegen Sox4, Sox11 und Sox12 Schematisch dargestellt sind die drei Sox-Proteine der Gruppe C Sox12, Sox11 und Sox4 mit ihren N-terminal gelegenen HMG-Domänen und den Bereichen in den Proteinen, die als Peptide für die Antikörperherstellung verwendet wurden (α).

Ergebnisse

28

Die ausgewählten Bereiche für Sox4 und Sox11 wurden, mit einem N-terminalen His6-Tag

versehen, bakteriell exprimiert. Die hergestellten rekombinanten Peptide wurden

denaturierend aufgereinigt und anschließend vom Pineda-Antikörper-Service (Berlin) für die

Immunisierung verschiedener Spezies (Ratte, Meerschweinchen, Kaninchen) verwendet. Das

Sox12-Peptid wurde kommerziell synthetisiert und aufgereinigt (Pineda-Antikörper-Service,

Berlin).

Für alle drei Peptide wurden Antikörper generiert, die im Western-Blot spezifisch das

jeweilige SoxC-Protein erkannten (siehe Abb. 26 und Daten nicht gezeigt). In immun-

histochemischen Analysen zeigten nur Antikörper gegen Sox4 und Sox11 ein spezifisches

Signal (siehe Abb. 32, Abb. 35). Die Spezifität dieser Antikörper wurde durch ein fehlendes

Signal nach Immunfärbungen auf Sox4- bzw. Sox11-defizientem embryonalem Gewebe der

Maus ersichtlich (Daten nicht gezeigt). Die Antikörper gegen Sox12 zeigten immun-

histochemisch auf Mausgewebe keine spezifische Färbung. Sowohl auf Wildtyp- als auch auf

Sox12-defizientem embryonalem Gewebe des Rückenmarks war mit diesen ein

vergleichbares Färbemuster zu erkennen (Daten nicht gezeigt). Im Huhn-Embryo dagegen

konnte mit Sox12-Antikörpern überexprimiertes Sox12 der Maus detektiert werden (siehe

Abb. 32). Zusätzlich ließen sich die Antikörper auch in Gelshift-Experimenten zum Nachweis

von Sox12 in Protein-DNA-Komplexen einsetzen (siehe Abb. 24, Abb. 25).

3.1.2 Generierung Sox12-defizienter Mäuse

In früheren Arbeiten wurde das SOX12-Gen des Menschen auf dem kurzen Arm des

Chromosoms 20 (20p13) nachgewiesen (Jay et al., 1997). Das Sox12-Gen der Maus dagegen

ist in der H1-Region des Chromosoms 2 lokalisiert. Um eine Deletion des Sox12-Gens in der

Maus zu erreichen, wurde die in Abb. 11 dargestellte Strategie entwickelt.

Zur Herstellung des Targeting-Konstrukts wurde die genomische Sequenz des Sox12-Lokus

von C57BL/6J-Mäusen aus dem BAC (bacterial artificial chromosome) -Klon RP23-396N8

(BACPAC Resources, Oakland, USA) verwendet. Ein 9,1 kb langes XbaI/ScaI-gespaltenes

Fragment, das das Sox12-Gen enthält, wurde in mehreren kleinen Sequenzabschnitten in

verschiedene Vektoren subkloniert. Über die XhoI-Restriktions-Schnittstelle in der 5’-

untranslatierten Region 268 bp stromaufwärts des Startcodons von Sox12 wurde eine loxP-

Erkennungsstelle eingefügt. Zusätzlich wurde in die HindIII-Restriktions-Schnittstelle in der

3`-untranslatierten Region von Sox12 eine Kassette eingefügt, die ein mit loxP- und FRT-

Stellen versehenenes Neomycin-Resistenzgen, eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES)

Ergebnisse

29

und ein enhanced green fluorescent protein (EGFP) enthielt. Die verschiedenen

Einzelkomponenten des modifizierten Sox12-Gens wurden schließlich zwischen die XbaI-

und SalI-Restriktions-Schnittstellen in den Vektor pTV-0 (Riethmacher et al., 1995) eingefügt.

Abb. 11: Schema zur Generierung des Sox12-Knockout-Allels Schematische Darstellung des Targeting-Konstrukts, des Sox12-Wildtyp-Lokus sowie des mutierten Lokus vor und nach der Cre-vermittelten Entfernung des Sox12-Leserahmens und des Neomycin-Resistenzgens. Die transkribierte Region des Sox12-Gens ist als Kasten und die flankierenden Bereiche sind als Balken dargestellt. Außerdem sind der offene Leserahmen von Sox12 (ORF), die Position des Startcodons (ATG), die im Genom der Maus annotierte kurze Intronsequenz (I), die Neomycin-Resistenz-Selektionskassette (neo), die EGFP-Sequenz mit vorgeschalteter interner Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES-EGFP) und die Erkennungsstellen für die Cre- und Flp-Rekombinase (loxP und FRT) im Schema gezeigt. Homologe Regionen im Wildtyp-Lokus und Targeting-Konstrukt, zwischen denen Rekombination stattfindet, sind durch gekreuzte Linien gekennzeichnet. Ebenfalls gezeigt sind Positionen der Restriktions-Schnittstellen für BamHI (B), BglII (G) und PstI (P), die Lage der 5’- und 3’-Sonde für den Southern-Blot und die Primer a-c für die Genotypisierung (Pfeilspitzen). Tk: Thymidinkinase-Selektionskassette des Herpes Simplex Virus.

In einem nächsten Schritt erfolgte die Linearisierung dieses Targeting-Vektors vor dem

vorderen Homologie-Arm durch das Restriktionsenzym ClaI. Danach wurde der geöffnete

Vektor in die embryonale Stammzell- (ES) Linie V6.5 (C57BL/6J x 129Sv) (Rideout et al.,

2000) elektroporiert und die Zellen mit G418 (Positivselektion) und Gancyclovir

(Negativselektion) selektioniert. Mittels Southern-Blot konnten unter den selektionierten ES-

Zellen schließlich solche mit homologem Rekombinationsereignis identifiziert werden (Abb.

12). Für den Nachweis der homologen Rekombination über den 5’-Homologie-Arm wurde

genomische ES-Zell-DNA mit dem Restriktionsenzym PstI gespalten (Abb. 11). Durch

Hybrisierung mit einer radioaktiv markierten, 320 bp langen 5’-Sonde, die außerhalb des

rekombinierten Bereichs liegt, konnte im Southern-Blot für das Wildtyp-Allel ein 5,3 kb

langes Fragment und für das rekombinierte Sox12-Allel ein 4,8 kb langes Fragment detektiert

Ergebnisse

30

werden (Abb. 12A). Die korrekte Integration des 3’-Bereichs des Rekombinationskonstrukts

über den 3’-Homologie-Arm wurde mit einer radioaktiv markierten, 581 bp langen 3’-Sonde

kontrolliert. Nachdem genomische ES-Zell-DNA mit BamHI gespalten worden war (Abb. 11),

konnte anhand dieser Sonde im Southern-Blot ein 7,8 kb langes Wildtyp-Fragment und ein

6,6 kb langes Fragment für das rekombinierte Sox12-Allel gefunden werden (Abb. 12B).

Abb. 12: Southern-Blot Analysen zum Nachweis des rekombinierten Sox12-Allels (A, B) Southern-Blot mit DNA aus ES-Zellen vor (+/+) und nach (+/fl) erfolgreicher homologer Rekombination. Die korrekte Integration des Targeting-Konstrukts wurde durch Spaltung der DNA mit PstI unter Verwendung der 5’-Sonde (A) und durch Spaltung der DNA mit BamHI unter Verwendung der 3’-Sonde (B) verifiziert. Die Größen der Fragmente (in kb) für das Wildyp- (+) und das rekombinierte (fl) Allel sind auf der linken Seite des jeweiligen Blots angegeben.

Die genetisch modifizierten ES-Zellen wurden anschließend in Blastozysten eingebracht und

in Ammen implantiert. Dies wurde in Zusammenarbeit mit M. Bösl am Max-Planck-Institut

für Neurobiologie in Martinsried durchgeführt. Die erhaltenen chimären Tiere wurden mit

EIIa-Cre transgenen Mäusen (Lakso et al., 1996) verpaart, um nach Keimbahntransmission

den Sox12-Leserahmen und die Neomycin-Resistenz-Selektionskassette in den Nachkommen

zu entfernen (Abb. 11, Abb. 13A). Die erfolgreiche Deletion wurde mit Southern-Blot und

genomischer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) überprüft (Abb. 13A, B). Dafür wurde DNA

aus adulten Wildtyp- (Sox12+/+), heterozygoten (Sox12+/-) und homozygoten (Sox12-/-)

Mäusen isoliert. Für den Southern-Blot erfolgte die Spaltung der genomischen DNA mit BglII

(siehe Abb. 11). Anschließend konnte durch Hybridisierung mit der radioaktiv markierten 320

bp langen 5’-Sonde ein 6,2 kb langes Fragment für das Wildtyp-Allel und ein 10,3 kb langes

Fragment für das durch die Cre-Rekombinase deletierte Sox12-Allel detektiert werden. In der

Genotypisierungs-PCR ließ sich unter Verwendung der isolierten genomischen DNA und der

in Abb. 11 dargestellten Primer a-c ein 468 bp langes Sox12-Wildtyp-Fragment und ein 580

bp langes Fragment für das deletierte Sox12-Allel identifizieren.

Ergebnisse

31

Abb. 13: Southern-Blot Analyse und Genotypisierung zum Nachweis des Sox12-Knockout-Allels (A) Southern-Blot mit DNA aus adulten Wildtyp- (+/+), heterozygoten (+/-) und homozygoten (-/-) Mäusen nach Cre-vermittelter Deletion. Der Verlust der kompletten Sequenzen zwischen der ersten und dritten loxP-Stelle, inklusive des Sox12-Leserahmens, wurde durch Spaltung der DNA mit BglII unter Verwendung der 5’-Sonde verifiziert. Die Größen der Fragmente (in kb) für das Wildyp- (+) und das deletierte (-) Allel sind auf der linken Seite des Blots angegeben. (B) Genotypisierungs-PCR mit DNA aus adulten Wildtyp- (+/+), heterozygoten (-/-) und homozygoten (-/-) Mäusen. Die untere Bande mit 468 bp repräsentiert das Wildtyp-Allel, die obere Bande mit 580 bp das deletierte Sox12-Allel.

Im Weiteren sollte untersucht werden, ob nach Deletion von Sox12 tatsächlich keine

Expression mehr in der Maus nachzuweisen war. Anhand von Reverse-Transkriptase (RT)-

PCR-Analysen mit cDNA aus Wildtyp- und Sox12-defizienten Embryonen an 12.5 dpc

konnte in den Mutanten keine Sox12-Expression detektiert werden, während in den Wildtyp-

Embryonen ein deutliches Sox12-Signal zu sehen war (Abb. 14). Die RT-PCR-Primer wurden

so gewählt, dass sie eine Region, die im Genom der Maus als eine kurze Intronsequenz mit

264 bp annotiert wurde, umspannten (Abb. 11). Die Größe des PCR-Produktes, das mit der

cDNA von Wildtyp-Embryonen erhalten wurde, zeigte jedoch, dass die putative

Intronsequenz Teil des Transkripts ist. Dies bestätigte, dass Sox12 ebenso wie die beiden

anderen SoxC-Gene Sox4 und Sox11 aus einem einzigen Exon besteht (Wegner, 1999).

Anstelle der Expression von Sox12 konnte in den mutanten Embryonen an 12.5 dpc eine

Expression von GFP detektiert werden (Abb. 14).

Abb. 14: RT-PCR zur Analyse der Sox12-Expression in Wildtyp- und Sox12-defizienten Mäusen RT-PCR mit cDNA aus den Köpfen und Rümpfen von Wildtyp- (+/+) und Sox12-defizienten (-/-) Embryonen am Entwicklungsstadium 12.5 dpc unter Verwendung von spezifischen Primern für Sox12, GFP und ß-Aktin. C: Wasserkontrolle.

Ergebnisse

32

Über die Stärke der GFP-Expression ließ sich anhand der RT-PCR-Analyse keine Aussage

treffen. Aufgrund des äußerst schwachen Signals, das in Immunfärbungen mit einem

Antikörper gegen GFP auf Sox12-defizientem Embryonalgewebe der Maus erhalten wurde

(Daten nicht gezeigt), wurde auf eine schwache GFP-Expression geschlossen.

Bestätigt wurde die fehlende Expression von Sox12 in der neu generierten Sox12-defizienten

Mutante durch in situ Hybridisierungen auf Schnitten von Embryonen an 12.5 dpc mit einer

Sonde, die gegen die 3`-untranslatierte Region von Sox12 gerichtet war (Abb. 15).

Abb. 15: In situ Hybridisierung zur Analyse der Sox12-Expression in Sox12-defizienten Mäusen In situ Hybridisierung mit einer DIG-markierten antisense-cRNA-Sonde gegen einen Teil des 3’-untranslatierten Bereichs von Sox12 auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks von Wildtyp- (+/+) und Sox12-defizienten (-/-) Embryonen am Entwicklungsstadium 12.5 dpc.

3.1.3 Sox12-defiziente Mäuse zeigen keine offensichtlichen phänotypischen

Veränderungen

Nach Deletion von Sox4 oder Sox11 in der Maus lassen sich zahlreiche Entwicklungsdefekte

in diesen Tieren nachweisen (Schilham et al., 1996; Sock et al., 2004). Aufgrund ihrer

Fehlbildungen versterben die Mäuse während der Embryogenese oder kurze Zeit nach ihrer

Geburt. Infolge dessen wurde auch für Sox12 eine ähnlich wichtige Rolle in der Entwicklung

eines oder mehrerer Gewebetypen postuliert.

Wurden jedoch Sox12-heterozygote Mäuse mit einem gemischten genetischen Hintergrund

miteinander verpaart, ließen sich in den ersten Wochen nach der Geburt bis zum Absetzen

vom Muttertier alle erwarteten Genotypen finden. Die Genotypisierung der abgesetzten

Mäuse zeigte außerdem, dass Sox12-defiziente Tiere in der nach Mendel zu erwartenden

Verteilung vorkamen (Abb. 16A). Dies deutet daraufhin, dass Sox12 für das Überleben

während der Embryogenese und der ersten postnatalen Wochen keine Rolle spielt. Im

Gegensatz dazu hatten frühere Analysen gezeigt, dass weder Sox4- noch Sox11-defiziente

Mäuse nach der Geburt lebensfähig sind (Schilham et al., 1996; Sock et al., 2004).

Ergebnisse

33

Des Weiteren ließ sich eine normale Verteilung der Geschlechter in Sox12-defizienten

Mäusen nachweisen, da jeweils etwa die Hälfte der Knockout-Tiere Männchen bzw.

Weibchen waren (Abb. 16B). Zudem ergab die Verpaarung Sox12-defizienter Mäuse

untereinander Würfe mit normaler Anzahl von Nachkommen (Daten nicht gezeigt). Diese

Ergebnisse zeigen, dass die neu generierten Sox12-defizienten Mäuse mit zum

Analysezeitpunkt gemischtem genetischem Hintergrund nicht nur lebensfähig, sondern auch

fertil sind.

Abb. 16: Genotypen- und Geschlechter-Verteilung der Nachkommen aus Verpaarungen von Sox12+/--Mäusen (A) Die Bestimmung der Genotypen aus Sox12-heterozygoten (+/-) Verpaarungen erfolgte unmittelbar nach dem Absetzen der Nachkommen vom Muttertier. Mehr als 15 Würfe wurden gezählt. Die Verteilung ist als Prozent der gesamten Nachkommen angegeben. (B) Dargestellt ist die prozentuale Verteilung der Geschlechter innerhalb der Sox12-defizienten (-/-) Nachkommen aus Sox12-heterozygoten Verpaarungen.

Bei der Bestimmung der Wachstumsparameter Sox12-defizienter Mäuse während der ersten

zwei Monate postnataler Entwicklung stellte sich heraus, dass schon zum frühesten Zeitpunkt

der Analyse die männlichen und weiblichen Sox12-defizienten Mäuse im Hinblick auf ihr

Gewicht nicht von den Wildtyp-Tieren zu unterscheiden waren (Abb. 17A, B). Die

männlichen und weiblichen Knockout-Mäuse nahmen während der folgenden Wochen

ebenfalls normal zu. Weiterhin ließen sich in beiden Geschlechtern weder zum Zeitpunkt der

Geburt noch während der darauf folgenden Wochen signifikante Unterschiede in der

Körpergröße nachweisen (Abb. 17C, D). Die Wildtyp- und Sox12-defizienten Tiere konnten

ebenfalls nicht durch ihr äußeres Erscheinungsbild im Käfig auseinander gehalten werden.

Die Untersuchung der wichtigsten inneren Organe zeigte keine offensichtlichen

Veränderungen in Lage, Form oder Größe (Daten nicht gezeigt).

Diese Daten lassen darauf schließen, dass Sox12 weder für die Embryonalentwicklung der

Maus noch für essentielle postnatale Körperfunktionen benötigt wird.

Ergebnisse

34

Abb. 17: Bestimmung der Wachstumsparameter Sox12-defizienter Mäuse (A, B) Das Körpergewicht von Wildtyp- (nicht gefüllte Kreise) und homozygoten Sox12-defizienten (gefüllte Dreiecke) weiblichen (A) und männlichen (B) Nachkommen (mehr als fünf Tiere für jeden Genotyp und jedes Geschlecht) wurde während der ersten 50 Tage nach der Geburt bestimmt. (C, D) Die Körperlänge von der Nase bis zum Anus wurde zu den angegebenen Lebenstagen von Wildtyp- (nicht gefüllte Kreise) und homozygoten Sox12-defizienten (gefüllte Dreiecke) Weibchen (C) und Männchen (D) während der ersten 50 Tage nach der Geburt (mehr als fünf Tiere für jeden Genotyp und jedes Geschlecht) gemessen. Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt. Mit dem t-Test konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede ermittelt werden.

3.1.4 Analyse der Sox12-Expression während der Embryonalentwicklung der Maus

Um zu verstehen, weshalb die phänotypischen Auswirkungen nach Deletion von Sox12

weniger gravierend sind als nach Deletion von Sox4 oder Sox11, sollte das Expressionsmuster

aller drei SoxC-Gene während der Embryogenese untersucht werden. Mittels quantitativer

RT-PCR konnte Sox12 in der cDNA verschiedener Organe an den Entwicklungsstadien

14.5 dpc, 16.5 dpc und 18.5 dpc nachgewiesen werden (Abb. 18A). Die Mengen an Sox12-

Transkript waren im zentralen Nervensystem, der Niere und dem Herzen am höchsten.

Ansonsten waren die Unterschiede in der Sox12-Expression zwischen den einzelnen Organen

nicht gravierend. Dies zeigt, dass Sox12 in vielen Geweben und in gleichförmigen Mengen im

sich entwickelnden Maus-Embryo exprimiert vorliegt. Wie für Sox12 konnte auch für Sox4

eine Expression in vielen verschieden Organen detektiert werden (Abb. 18C). Zudem

enthielten Organe mit höheren Sox12-Transkript-Mengen gewöhnlich auch mehr Sox4. Im

Gegensatz zu Sox12 unterschied sich die Expression von Sox4 in den einzelnen Organen

jedoch deutlicher (vergleiche Abb. 18C mit Abb. 18A). Das dritte SoxC-Protein Sox11

Ergebnisse

35

dagegen kam an 14.5 dpc und 16.5 dpc vor allem im zentralen Nervensystem vor, während es

in den meisten anderen Organen niedrig exprimiert vorlag (Abb. 18B). An 18.5 dpc war auch

die Expression im zentralen Nervensystem signifikant gesunken. Dies stimmt gut mit früheren

Berichten über eine starke allgemeine Abnahme der Sox11-Expression in Embryonen ab

14.5 dpc überein (Hargrave et al., 1997; Kuhlbrodt et al., 1998a).

Abb. 18: RT-PCR zur Analyse der SoxC-Genexpression in Wildtyp-Embryonen (A-C) Die Expression von Sox12 (A), Sox11 (B) und Sox4 (C) wurde durch quantitative RT-PCR mit cDNA aus verschiedenen Geweben von Wildtyp-Embryonen an den Entwicklungsstadien 14.5 dpc, 16.5 dpc und 18.5 dpc bestimmt. Die Mengen an PCR-Produkten wurden auf die ß-Aktin-Mengen normiert. RM: Rückenmark; M-D: Magen-Darmtrakt. In Zusammenarbeit mit E. Sock.

Um herauszufinden, ob der Verlust von Sox12 möglicherweise durch eine erhöhte Expression

der anderen beiden SoxC-Gene kompensiert werden kann, sollte die Expression von Sox4 und

Sox11 auch in Sox12-defizienten Embryonen untersucht werden.

Auf Grund von in situ Hybridisierungen auf Schnitten von Wildtyp- und Sox12-defizienten

Mäusen an 12.5 dpc konnten keine beträchtlichen Unterschiede in der Expressionsstärke oder

dem -muster von Sox4 und Sox11 zwischen Mutante und Wildtyp festgestellt werden

Ergebnisse

36

(Abb. 19A). Jedoch war an 14.5 dpc und 16.5 dpc eine mäßige, meist transiente Erhöhung der

Expression von Sox4, Sox11 oder beider Gene in bestimmten Organen Sox12-defizienter

Embryonen mittels quantitativer RT-PCR nachweisbar (Abb. 19B, C). Diese ausgleichende

Erhöhung der Sox4- und/oder Sox11-Expression könnte den Verlust von Sox12 kompensieren

und zum Fehlen eines Phänotyps in Sox12-defizienten Embryonen beitragen.

Abb. 19: In situ Hybridisierung und RT-PCR zur Analyse der Sox11- und Sox4-Expression in Sox12-defizienten Embryonen (A) In situ Hybridisierung mit DIG-markierten cRNA-Sonden gegen Sox11 und Sox4 auf transversalen Gefrierschnitten von Wildtyp- (+/+) und Sox12-defizienten (-/-) Embryonen am Embryonalstadium 12.5 dpc. (B, C) Quantitative RT-PCR zur Bestimmung der Expression von Sox11 (B) und Sox4 (C) in ausgewählten Geweben Sox12-defizienter Embryonen an den Entwicklungsstadien 14.5 dpc und 16.5 dpc. Die Mengen an PCR-Produkten wurden auf die Expressionsmengen von ß-Aktin normiert und mit der entsprechenden Expression im Wildtyp verglichen. Erhöhte Transkriptmengen in den Sox12-defizienten Embryonen sind in Prozent angegeben. RM: Rückenmark.

Da das Auflösungsvermögen der quantitativen RT-PCR begrenzt ist, wurde in einem weiteren

Schritt die embryonale Sox12-Expression mittels in situ Hybridisierung analysiert. Auch in

diesem Fall wurden die verwandten Gene Sox4 und Sox11 in die Studie mit einbezogen. An

11.5 dpc und 12.5 dpc zeigten alle drei SoxC-Gene eine breite Expression im sich

entwickelnden Embryo (Abb. 20). Als gemeinsame Expressionsorte aller drei SoxC-Gene

wurden das zentrale Nervensystem, das kraniofaziale Mesenchym, das Kiemenbogen-

mesenchym, das Skelettmesenchym der Wirbelsäule, die Dorsalwurzel-Ganglien, der Darm

und das Mesenchym der Genitalhöcker nachgewiesen. Sowohl für Sox4 als auch für Sox11

war das in situ Signal im zentralen Nervensystem am höchsten.

Ergebnisse

37

Abb. 20: In situ Hybridisierung zur Bestimmung der frühen embryonalen Sox12-Expression (A-I) In situ Hybridisierung mit DIG-markierten cRNA-Sonden gegen Sox12 (A, D, G), Sox11 (B, E, H) und Sox4 (C, F, I) auf sagittalen Gefrierschnitten von Wildtyp-Embryonen an den Entwicklungsstadien 11.5 dpc (A-C) und 12.5 dpc (D-I) . Die Schnitte in A-C und G-I zeigen die Mitte der Embryonen, während die Embryonen in D-F mehr lateral durchschnitten wurden. bm: Kiemenbogenmesenchym; fb: Vorderhirn; fm: kraniofaziales Mesenchym; hb: Rhombencephalon; drg: dorsale Wurzelganglien; gt: Genitalhöcker; sc: Rückenmark; vc: Skelettmesenchym der Wirbelsäule. In Zusammenarbeit mit M. Potzner.

Sox11 zeigte außerdem eine starke Färbung in den Dorsalwurzel-Ganglien. Im Gegensatz

dazu ließ sich für Sox12 eine eher gleichmäßige Färbung der Gewebe feststellen. An 14.5 dpc

war die SoxC-Genexpression auf weniger Gewebe beschränkt als an früheren

Entwicklungsstadien. Trotzdem ließ sich beim Vergleich der Expressionsmuster immer noch

eine auffallende Ähnlichkeit feststellen (Abb. 21). Transversale Schnitte des Rumpfes zeigten

das Rückenmark, die dorsalen Wurzelganglien und sympathischen Ganglien, die Lunge, den

Darm, die Niere und Teile des sich bildenden Skeletts als wichtige Expressionsorte aller drei

SoxC-Gene (Abb. 21A-F). In der Lunge wurde eine Expression im Mesenchym und im

Epithel nachgewiesen. Dabei war für alle drei SoxC-Gene ein starkes in situ Signal im

Bronchialepithel zu beobachten (Abb. 21G-I). In der Niere ließ sich eine Expression in den

Ureterknospen und dem kondensierenden metanephrogenen Mesenchym detektieren

(Abb. 21G-I). Trotz dieser generellen Ähnlichkeit gab es auch deutliche Unterschiede im

jeweiligen Expressionsmuster. So war zum Beispiel für Sox4 eine starke Expression im

Thymus, den Endokardkissen des Atrioventrikularkanals des Herzens oder den sich bildenden

Ergebnisse

38

Haarfollikeln charakteristisch. Zudem konnte für die Expression von Sox4 im Rückenmark

ein abnehmender Gradient von dorsal nach ventral festgestellt werden (Abb. 21C, F und Daten

nicht gezeigt), der auch an 18.5 dpc immer noch vorhanden war (Abb. 22A-C). Für Sox4 und

Sox11 ließ sich in der Ventrikulärzone des Rückenmarks eine deutlich geringere Expression

detektieren als außerhalb dieser Region, während die Expression von Sox12 sowohl in der

Ventrikulärzone als auch im umgebenden Gewebe des Rückenmarks sehr gleichmäßig

erschien (Abb. 21G-I). Im Gegensatz zu Sox4 und Sox11 konnte für Sox12 auch kein

deutliches in situ Signal im Darmepithel nachgewiesen werden.

Abb. 21: In situ Hybridisierung zur Bestimmung der Sox12-Expression an 14.5 dpc im Rumpf (A-I) In situ Hybridisierung mit DIG-markierten cRNA-Sonden gegen Sox12 (A, D, G), Sox11 (B, E, H) und Sox4 (C, F, I) auf transversalen Gefrierschnitten von Wildtyp-Embryonen am Entwicklungsstadium 14.5 dpc. Verwendet wurden Schnitte vom Rumpf auf Höhe des Herzen (A-C) und auf Höhe der Niere (D-F). Die Pfeilspitzen in C und F markieren Haarfollikel mit starker Sox4-Expression. Die Vergrößerungen aus den Übersichten (A-F) zeigen das Rückenmark (RM), die Lunge, die Niere und den Darm (G-I) . In Zusammenarbeit mit M. Potzner.

Ergebnisse

39

Weitere Unterschiede wurden erst an späteren Entwicklungsstadien offensichtlich. An

14.5 dpc waren alle drei SoxC-Gene in den dorsalen Wurzelganglien und den sympathischen

Ganglien stark exprimiert. An 18.5 dpc dagegen hatte die Expression von Sox11 deutlich

abgenommen und war in den sympathischen Ganglien nahezu verschwunden (Abb. 22D-F).

Abb. 22: In situ Hybridisierung zur Bestimmung der Sox12-Expression an 18.5 dpc im Rumpf (A-F) In situ Hybridisierung mit DIG-markierten cRNA-Sonden gegen Sox12 (A, D), Sox11 (B, E) und Sox4 (C, F) auf transversalen Gefrierschnitten von Wildtyp-Embryonen am Entwicklungsstadium 18.5 dpc. Gezeigt sind das Rückenmark (A-C), die dorsalen Wurzelganglien (DRG) und die symphatischen Ganglien (SG) (D-F). In Zusammenarbeit mit M. Potzner.

Untersuchungen des Kopfes und des Gehirns ließen ebenfalls Ähnlichkeiten und Unterschiede

in den Expressionmustern der drei SoxC-Gene erkennen. So war eine starke Expression aller

drei SoxC-Gene im sich entwickelnden Kortex cerebri (zerebraler Kortex, Großhirnrinde),

Thalamus, Hippokampus und Kortex cerebelli (Kleinhirnrinde) nachzuweisen (Abb. 23A-F

und Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz zu Sox11 waren Sox12 und Sox4 an 14.5 dpc in der

dorsalen Kortikalplatte der sich entwickelnden Großhirnrinde angereichert (Abb. 23G-I). An

18.5 konnte für Sox11 und Sox4 eine starke Expression in der Subventrikulärzone des

cerebralen Kortex nachgewiesen werden (Abb. 23K, L), die sich für Sox12 nicht finden ließ

(Abb. 23J). Alle drei SoxC-Gene wurden auch in verschiedenen Zelltypen des sich

entwickelnden Auges exprimiert. Dabei war an 14.5 dpc eine besonders starke Expression

von Sox12 in der Augenlinse auffallend (Abb. 23S-X). Im Riechepithel wiederum konnte

sowohl an 14.5 dpc als auch an 18.5 dpc überwiegend Sox11-Signal detektiert werden

(Abb. 23M-R). Zudem wurde nur Sox11 in den Verschmelzungsbereichen der zwei

Gaumenplatten an 14.5 dpc in signifikanten Mengen exprimiert (Abb. 23N), was die bei

Sox11-Knockout-Tieren auftretende Lippen-, Gaumen-, Kieferspalte erklärt. Die in situ

Ergebnisse

40

Ergebnissen zeigten somit, dass alle drei SoxC-Gene ein sehr ähnliches und überlappendes

Expressionsmuster während der Embryogenese der Maus besitzen.

Abb. 23: In situ Hybridisierung zur Bestimmung der spät-embryonalen Sox12-Expression im Kopf (A-F) In situ Hybridisierung mit DIG-markierten cRNA-Sonden gegen Sox12 (A, D, G, J, M, P, S, V), Sox11 (B, E, H, K, N, Q, T, W) und Sox4 (C, F, I, L, O, R, U, X) auf transversalen Gefrierschnitten von Wildtyp-Embryonen an den Entwicklungsstadien 14.5 dpc (A-C, G-H, M-O, S-U) und 18.5 dpc (D-F, J-L, P-R, V-X). Dargestellt sind eine telencephale Hemisphäre in niedriger Auflösung (A-F) sowie der sich entwickelnde Kortex in Vergrößerung (G-L) , das Riechepithel (M-R) und das Auge (S-X). Die fusionierenden Gaumenplatten an 14.5 dpc sind mit Pfeilspitzen markiert (M-O) . In Zusammenarbeit mit M. Potzner.

3.1.5 Die DNA-Bindungseigenschaften von Sox12

Im Folgenden wurde die DNA-Bindungsaktivität von Sox12 untersucht und mit der von Sox4

und Sox11 verglichen. Zu diesem Zweck wurden Gelshift-Experimente (EMSAs)

durchgeführt. Bisher sind nur sehr wenige Zielgene für SoxC-Proteine bekannt. In früheren

Arbeiten konnten sowohl die eigene Arbeitsgruppe als auch andere Gruppen zeigen, dass

Sox4 und Sox11 an ein Sox-Konsensusmotiv des CD3ε-Enhancers binden und dadurch

Reportergen-Aktivierung vermitteln können. Die Sequenz dieses Motivs ist im sogenannten

SX-Oligonukleotid vorhanden (Kuhlbrodt et al., 1998a; Kuhlbrodt et al., 1998b; van de

Wetering et al., 1993). Zusätzlich zu dieser Bindestelle wurde die Bindestelle S23 des Tubb3-

Gens als ein bona fide Response-Element eines neuralen SoxC-Zielgens in Gelshift-

Ergebnisse

41

Experimenten eingesetzt (Bergsland et al., 2006). Mit Extrakten aus HEK293-Zellen, die

vorher mit einem Expressionsplasmid für Sox12 transfiziert wurden, erhielt man sowohl mit

dem SX- als auch mit dem S23-Oligonukleotid einen Protein-DNA-Komplex (Abb. 24).

Durch den Einsatz von Antikörpern, die gegen Sox12 gerichtet waren, konnte die Mobilität

dieses Komplexes reduziert werden. Dies wurde als Beweis für die Anwesenheit von Sox12

in diesem Komplex gewertet. Extrakte aus nicht transfizierten HEK293-Zellen dienten als

Kontrolle und zeigten keine Komplexbildung. Nach Mutation des Sox-Konsensusmotivs im

S23-Oligonukleotid (S23M in Abb. 24) formte sich ebenfalls kein Komplex. Da frühere

Bindungsstudien mit Sox4 und Sox11 zu ähnlichen Ergebnissen geführt hatten (Bergsland et

al., 2006; Kuhlbrodt et al., 1998a), erkennen folglich alle drei SoxC-Proteine die gleichen

Bindestellen.

Abb. 24: Die DNA-Bindungsaktivität von Sox12 In Gelshift-Experimenten wurden die radioaktiv markierte SX-Sequenz und Oligonukleotide mit der Bindestelle S23 des Tubb3-Promotors in der Wildtyp- (S23) oder einer mutierten Version (S23M) mit Extrakten aus CMV- (C) oder CMV-Sox12-transfizierten HEK293-Zellen inkubiert. Komplexe, die nach Inkubation mit einem Sox12-spezifischen Antikörper (α-Sox12) erhalten wurden, sind mit einem Stern gekennzeichnet. -: kein Extrakt zugegeben. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.

Weiterhin sind die beiden Proteine Sox4 und Sox11 in der Lage, mit dem FXO-

Oligonukleotid einen Komplex zu bilden (Kuhlbrodt et al., 1998a). Dies konnte in der

vorliegenden Arbeit auch für Sox12 bewiesen werden (Abb. 25).

Ergebnisse

42

Das FXO-Oligonukleotid enthält neben dem Sox-Erkennungselement des FGF4-Enhancers

(Yuan et al., 1995) auch eine benachbarte Bindestelle für POU-Proteine. In früheren Arbeiten

konnte festgestellt werden, dass sowohl Sox4 als auch Sox11 ternäre Komplexe mit Klasse III

POU-Proteinen (wie zum Beispiel Oct6 oder Brn2) an diesem Oligonukleotid bilden. Diese

gemeinsame Bindung an einem Zielgen-Enhancer könnte entscheidend für die synergistische

Aktivierung der Genexpression durch SoxC- und POU-Proteine im sich entwickelnden

Neuralrohr sein (Kuhlbrodt et al., 1998a; Tanaka et al., 2004; Wiebe et al., 2003).

Daher wurde auch die Sox12-Bindung an das FXO-Oligonukleotid in Anwesenheit von Oct6

oder Brn2 untersucht (Abb. 25).

Abb. 25: Analyse der Fähigkeit von Sox12 zur Bildung ternärer Komplexe am FXO-Oligonukleotid Ein radioaktiv markiertes FXO-Oligonukleotid mit benachbarten Bindestellen für Sox- und POU-Proteine wurde mit Extrakten aus CMV- (C), CMV-Sox12-, CMV-Brn2 oder CMV-Oct6-transfizierten HEK293-Zellen inkubiert. Bei gleichzeitiger Anwesenheit von Sox12 und einem POU-Protein zeigte sich ein zusätzlicher Komplex. Das Vorkommen beider Proteine in diesem ternären Komplex (TC) wurde durch Zugabe von Antikörpern gegen Sox12 (α-Sox12), Brn2 (α-Brn2) und Oct6 (α-Oct6) bestätigt. Diese Komplexe sind mit Sternen kenntlich gemacht. -: kein Extrakt zugegeben. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.

Inkubierte man Sox12 oder das POU-Protein alleine mit dem Oligonukleotid, bildeten beide

Komplexe mit charakteristischer Mobilität. In Anwesenheit beider Proteine, Sox12 und Oct6

oder Brn2, wurde zusätzlich ein Komplex mit geringerer Mobilität sichtbar. Die Mobilität

dieses neuen Komplexes ließ sich mit Antikörpern gegen Sox12 oder gegen das

Ergebnisse

43

entsprechende POU-Protein weiter reduzieren. Dadurch bestätigte sich seine Identität als ein

ternärer Komplex, der sowohl DNA als auch Sox- und POU-Protein enthielt (Abb. 25). Dies

führte zu der Schlußfolgerung, dass Sox12 ebenso die Fähigkeit besitzt, bei benachbarten

Bindestellen an DNA einen ternären Komplex mit Klasse III POU-Proteinen zu bilden, wie

Sox11 und Sox4.

3.1.6 Die Fähigkeit von Sox12 zur Transaktivierung und dessen Einfluß auf die

Transaktivierungskapazität anderer SoxC- und POU-Proteine

Ob sich diese ähnlichen DNA-Bindungseigenschaften auch in vergleichbaren Transakti-

vierungskapazitäten niederschlagen, wurde mittels Luciferase-Aktivitätstests in transient

transfizierten HEK293-Zellen und Neuro2a-Zellen analysiert. Das Luciferase-Reportergen

war unter der Kontrolle eines artifiziellen Promotors, der aus einem Minimalpromotor mit

multimerisierten SX- oder FXO-Bindestellen bestand (Kuhlbrodt et al., 1998b).

Zunächst wurden im Western-Blot die Mengen an endogen vorhandenen SoxC-Proteinen in

Neuro2a- und HEK293-Zellen bestimmt. Dabei stellte sich heraus, dass in Neuro2a-Zellen

nur Sox4 endogen in signifikantem Maße vorkam. In HEK293-Zellen dagegen ließ sich

keines der SoxC-Proteine nachweisen (Abb. 26). Somit kann zumindest für HEK293-Zellen

eine Beeinflussung der Transfektionsversuche durch die endogene Expression eines der

SoxC-Gene ausgeschlossen werden.

Abb. 26: Western-Blot zur Bestimmung der endogenen SoxC- und POU-Proteinmengen in Zellkultur Endogene Mengen an SoxC- und POU-Proteinen in Neuro2a- und HEK293-Zellen wurden mittels Western-Blot bestimmt. Extrakte von 293-Zellen, die mit den entsprechenden Plasmiden transfiziert wurden, dienten als Positivkontrollen (C). Die Qualität der Extrakte wurde mit einem Antikörper gegen acetyliertes α-Tubulin (Tub) überprüft. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.

Ergebnisse

44

Bei der Transfektion des 3xSX-luc Reporters mit steigenden Mengen von Sox4 erfolgte eine

Dosis-abhängige Aktivierung des Reportergens. Dabei stiegen die Induktionsraten in

HEK293-Zellen vom 2-fachen auf das 17-fache und in Neuro2a-Zellen vom 5-fachen auf das

58-fache an (Abb. 27A, B). Für Sox11 ließen sich sogar noch höhere Induktionsraten

ermitteln, die in HEK293-Zellen vom 4-fachen bis zum 49-fachen und in Neuro2a-Zellen

vom 14-fachen bis zum 229-fachen reichten. Diese Ergebnisse bestätigten die Erkenntnisse

aus früheren Arbeiten, dass Sox11 ein stärkerer Transkriptionsaktivator ist als Sox4

(Kuhlbrodt et al., 1998a). Bei Ko-Transfektion von Sox12 anstelle von Sox4 oder Sox11

konnte der 3xSX-luc Reporter in HEK293-Zellen zwischen 2- und 7-fach und in Neuro2a-

Zellen zwischen 8- und 20-fach aktiviert werden (Abb. 27A, B). Somit verhielt sich Sox12 mit

diesem Reporter als schwächster Transaktivator der drei SoxC-Proteine.

Abb. 27: Die Kapazität von Sox12 zur Transaktivierung des 3xSX-luc Reportergens (A, B) Transiente Transfektionen von HEK293- (A) und Neuro2a-Zellen (B) mit dem 3xSX-luc (A, B) Reporterplasmid (375 ng) in Anwesenheit steigender Mengen von Sox12, Sox11 und Sox4 (15 ng, 50 ng, 125 ng, 375 ng, 750 ng). Die Luciferase-Aktivitäten wurden in Duplikaten aus zwei unabhängigen Experimenten ermittelt und die mittlere Induktionsrate ± Standardabweichung ist dargestellt. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.

Bei Verwendung des 3xFXO-luc Reporters war ein Unterschied in den Kinetiken und den

absoluten Werten der Transaktivierung feststellbar (Abb. 28). Mit diesem Reporter stiegen

zunächst die Aktivierungsraten an und fielen dann bei der höchsten Konzentration an

transfiziertem Sox-Expressionsplasmid wieder ab. Diese Kinetiken ließen sich für alle drei

SoxC-Proteine in ähnlicher Weise beobachten. Auch mit diesem Reporter zeigten sich für die

drei verschiedenen Sox-Proteine deutliche Unterschiede in der Reportergen-Aktivierung. In

HEK293-Zellen konnte Sox12 den 3xFXO-luc Reporter nur bis zu 9-fach aktivieren, während

sich für Sox4 eine 12-fache und für Sox11 eine 37-fache Induktion nachweisen ließ

(Abb. 28A). In Neuro2a-Zellen wurde eine bis zu 41-fache Aktivierung für Sox12, eine 158-

fache für Sox11 und eine 30-fache für Sox4 ermittelt (Abb. 28B). Dies bestätigte, dass Sox12

und Sox4 im Vergleich zu Sox11 schwächere Aktivatoren des Reporters sind. Die

Ergebnisse

45

Induktionsfähigkeit von Sox4 und Sox12 waren jedoch miteinander vergleichbar, wobei Sox4

in HEK293-Zellen den Reporter etwas höher aktivieren konnte als Sox12. In den Neuro2a-

Zellen war dies der umgekehrte Fall.

Abb. 28: Die Kapazität von Sox12 zur Transaktivierung des 3xFXO-luc Reportergens (A, B) Transiente Transfektionen von HEK293- (A) und Neuro2a-Zellen (B) mit dem 3xFXO-luc (A, B) Reporterplasmid (375 ng) in Anwesenheit steigender Mengen von Sox12, Sox11 und Sox4 (15 ng, 50 ng, 125 ng, 375 ng, 750 ng). Die Luciferase-Aktivitäten wurden in Duplikaten aus zwei unabhängigen Experimenten ermittelt und die mittlere Induktionsrate ± Standardabweichung ist dargestellt. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.

Im nachfolgenden Experiment sollte nun untersucht werden, ob Sox11 bei der Aktivierung

der Expression des 3xSX-luc sowie des 3xFXO-luc Reporters durch die Anwesenheit von

Sox12 beeinflusst wird (Abb. 29). Zu diesem Zweck wurden Reporterplasmide mit konstanten

Gesamtmengen an Expressionsplasmiden in unterschiedlichen Verhältnissen von Sox11 zu

Sox12 transfiziert. Sowohl in Neuro2a- als auch in HEK293-Zellen spiegelte die Reportergen-

Aktivität das Verhältnis transfizierter Expressionsplasmide wider. Die Induktionsraten stiegen

mit zunehmendem Anteil an Sox11 stetig an und erreichten nach alleiniger Transfektion von

Sox11 ihr Maximum (Abb. 29A, B und Daten nicht gezeigt).

Abb. 29: Einfluß von Sox12 auf die Transaktivierungskapazität von Sox11 (A, B) Transiente Transfektionen von Neuro2a-Zellen mit dem 3xSX-luc (A) oder dem 3xFXO-luc (B) Reporterplasmid. 375 ng des jeweiligen Reporterplasmids wurden mit konstanten Gesamtmengen an Expressionsplasmiden (375 ng), aber verschiedenen Verhältnissen von Sox12 zu Sox11 (10:0, 8:2, 5:5, 2:8, 0:10) ko-transfiziert. Die Luciferase-Aktivitäten wurden in Duplikaten aus drei unabhängigen Experimenten ermittelt und die mittlere Induktionsrate ± Standardabweichung ist dargestellt. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.

Ergebnisse

46

Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass Sox12 keinen wirksamen Einfluß auf

die Aktivität von Sox11 hat. Bei einer reprimierenden Funktion von Sox12 auf die

Induktionsfähigkeit von Sox11 müsste irgendwann ein Verhältnis von Sox12 zu Sox11

entstehen, an dem Repression und Aktivierung sich die Waage halten. Das an dieser Stelle des

Kurvenverlaufs zu erwartende Plateau konnte mit den hier erhaltenen Ergebnissen nicht

nachgewiesen werden.

In einem nächsten Schritt sollte nun die Fähigkeit von Sox12 zur synergistischen Aktivierung

der Reportergen-Expression analysiert und mit der Aktivierung der beiden anderen SoxC-

Proteine verglichen werden. Für diese Studien wurde der 3xFXO-luc Reporter mit

verschiedenen Kombinationen von SoxC- und Klasse III POU-Proteinen in Neuro2a-Zellen

ko-transfiziert (Abb. 30). Keines der hier verwendeten Klasse III POU-Proteine war endogen

in dieser Zelllinie exprimiert, was im Western-Blot mit Antikörpern gegen das jeweilige

POU-Protein gezeigt werden konnte (Abb. 26). Wie bereits veröffentlicht (Kuhlbrodt et al.,

1998a), wurde der 3xFXO-luc Reporter in Kombination von POU-Protein und Sox11 viel

stärker aktiviert als nach Einsatz des jeweiligen Proteins alleine. Die Kombination von Sox11

und Brn2 beispielsweise führte zu einer 1400-fachen Aktivierung, während nach Transfektion

von Sox11 oder Brn2 alleine die Expression des Reportergens nur 89-fach bzw. 18-fach

aktiviert wurde (Abb. 30A). Mit Sox11 und dem POU-Protein Oct6 in Kombination wurde

eine 915-fache Induktionsrate ermittelt (Abb. 30B). Damit waren die Aktivierungsraten für

Sox11 und Brn2 in Kombination 13mal und die für Sox11 und Oct6 in Kombination 8,5mal

höher als die Summe der Raten, die für jeden Faktor alleine erhalten wurden.

Abb. 30: Analyse der Fähigkeit von Sox12 zur synergistischen Aktivierung des 3xFXO-luc Reportergens (A, B) Transiente Ko-Transfektionen von Neuro2a-Zellen mit dem 3x-FXO-luc Reporterplasmid (375 ng) und verschiedenen Kombinationen der Expressionsplasmide für Sox12, Sox11, Sox4, Brn2, Oct6 oder dem leeren Vektor (jeweils 400 ng). Die Luciferase-Aktivitäten wurden in Duplikaten aus drei unabhängigen Experimenten ermittelt und die mittlere Induktionsrate ± Standardabweichung ist dargestellt. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.

Ergebnisse

47

Synergistische Effekte ließen sich allerdings auch beobachten, wenn POU-Proteine mit Sox4

oder Sox12 ko-transfiziert wurden (Abb. 30). In Kombination mit Sox4 waren die

synergistischen Aktivierungsraten 7,7 bis 8,8mal höher als die Summe der Aktivierungsraten

für jeden Transkriptionsfaktor alleine. Im Falle von Sox12 wurden synergistische

Aktivierungsraten gemessen, die 3,9 bis 4,3mal höher lagen als die Summe der Einzelwerte.

Ähnliche Ergebnisse erhielt man, wenn anstelle von Neuro2a-Zellen HEK293-Zellen

eingesetzt wurden (Daten nicht gezeigt). Damit konnte gezeigt werden, dass alle drei SoxC-

Proteine die Fähigkeit besitzen, synergistisch mit Klasse III POU-Proteinen zu wirken,

wenngleich Sox12 etwas weniger effizient zu sein scheint als Sox4 und Sox11.

Zum Schluss wurde die Fähigkeit der drei SoxC-Proteine zur Aktivierung des neuralen

Tubb3-Zielgen-Promotors (Bergsland et al., 2006) miteinander verglichen. Im Gegensatz zu

den artifiziellen Promotoren wurde der Tubb3-Promotor nur in Neuro2a-Zellen, nicht aber in

HEK293-Zellen aktiviert (Abb. 31 und Daten nicht gezeigt). Auch hier war Sox11 wiederum

der stärkste Aktivator, der die Tubb3-Promotoraktivität bis zu 20-fach induzierte. Sox12

aktivierte den Promotor bis zu 14-fach, während mit Sox4 nur eine 6-fache Induktion erreicht

wurde.

Abb. 31: Die Fähigkeit der SoxC-Proteine zur Aktivierung des neuralen Tubb3-Zielgen-Promotors Transiente Transfektionen von Neuro2a-Zellen mit dem Tubb3-Luciferase-Reporterplasmid (375 ng) in Anwesenheit steigender Mengen von Sox12, Sox11 und Sox4 (15 ng, 50 ng, 125 ng, 375 ng, 750 ng). Die Luciferase-Aktivitäten wurden in Duplikaten aus drei unabhängigen Experimenten ermittelt und die mittlere Induktionsrate ± Standardabweichung ist dargestellt. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.

3.1.7 Die in vivo Aktivität von Sox12 während der frühen Entwicklung des

Rückenmarks im Huhn

Zur Klärung, ob sich die erhaltenen Zellkultur-Ergebnisse ebenso auf die in vivo Situation

übertragen lassen, wurden Elektroporations-Experimente des Neuralrohrs von Huhn-

Embryonen durchgeführt. In früheren Arbeiten konnte durch derartige Versuche gezeigt

Ergebnisse

48

werden, dass die Überexpression von Sox11 und Sox4 zu einer frühzeitigen und erhöhten

Expression von Tubb3 führt (Bergsland et al., 2006).

Tatsächlich ließ sich 24 Stunden nach der Elektroporation von Sox11 oder Sox4 in das

Neuralrohr des Huhn-Embryos (Abb. 32E, F) eine vorzeitige Expression von Tubb3

(Abb. 32H, I) auf der elektroporierten Seite nachweisen. Die elektroporierte Hälfte des

embryonalen Neuralrohrs konnte durch zusätzlich eingebrachtes GFP kenntlich gemacht

werden (Abb. 32B, C).

Abb. 32: Die Aktivität von Sox12 während der frühen Entwicklung des Rückenmarks im Huhn (A-L) Immunhistochemie mit Antikörpern gegen Sox12 (D), Sox11 (E), Sox4 (F) und Tubb3 (Tuj1) (G-L) auf transversalen Gefrierschnitten von Huhn-Embryonen, die mit Expressionsplasmiden für Sox12 (A, D, G, J), für Sox11 (B, E, H, K) oder Sox4 (C, F, I, L) elektroporiert wurden, 24 (24h) (A-I) oder 48 Stunden (48h) (J-L) nach der Elektroporation. Die elektroporierte Seite zeigt nach rechts und ist durch die GFP-Autofluoreszenz (A-C) gekennzeichnet.

Selbst 48 Stunden nach dem Elektroporationsereignis war die Tubb3-Expression auf der

elektroporierten Seite immer noch erhöht, obgleich die endogene Tubb3-Expression begonnen

hatte (Abb. 32K, L). Außerdem war die Tubb3-Expression im mit Sox11 elektroporierten

Ergebnisse

49

Neuralrohr höher als im mit Sox4 elektroporierten. Dies zeigt, dass auch in vivo Sox11 ein

stärkerer Transaktivator zu sein scheint als Sox4. Wurde Sox12 in das Neuralrohr des Huhn-

Embryos eingebracht (Abb. 32D), war ebenfalls eine erhöhte Tubb3-Expression auf der

elektroporierten Seite (Abb. 32A) nachzuweisen. Dies galt sowohl 24 als auch 48 Stunden

nach der Elektroporation (Abb. 32G, J). Die Induktion von Tubb3 durch Sox12 war

vergleichbar mit der Induktion durch elektroporiertes Sox4. Im Vergleich zu elektroporiertem

Sox11 waren die Tubb3-Mengen jedoch immer niedriger. Diese Ergebnisse bestätigen in vivo,

dass alle drei SoxC-Proteine Transaktivierungskapazität besitzen, sich aber trotzdem in der

Wirksamkeit unterscheiden, mit der sie bestimmte Zielgene aktivieren.

3.2 FUNKTIONELLE ANALYSE DER SOX-PROTEINE DER GRUPPE C IN

ÜBEREXPRESSIONSSTUDIEN

In der bisher beschriebenen Analyse des Expressionsmusters von Sox4 und Sox11 sowie in

früheren Arbeiten wurde eine starke Expression dieser Faktoren im sich entwickelnden

zentralen Nervensystem gezeigt (1-3). Mögliche neurale Defekte ließen sich dennoch weder

in Sox4-defizienten (Cheung et al., 2000) noch in Sox11-defizienten Mäusen (Sock et al.,

2004) nachweisen. Auf Grund der hohen Homologie auf Aminosäureebene sowie der

weitgehenden Ko-Expression der beiden Faktoren ist zu vermuten, dass sie ähnliche

Aufgaben erfüllen. In Geweben mit Ko-Expression kann deshalb ein Faktor den Verlust des

jeweilig anderen Sox-Proteins kompensieren. Für die Untersuchung der Funktion von Sox4

und Sox11 während der Neuralentwicklung ist somit eine gleichzeitige Deletion beider Gene

im Nervensystem erforderlich. Die Klärung des eventuellen Beitrags von Sox12 zur

gegenseitigen funktionellen Kompensation der Gruppe C-Sox-Proteine erscheint ebenfalls

notwendig, da sich auch für Sox12 eine Expression im sich entwickelnden Nervensystem

feststellen lässt.

Als Vorarbeiten zu der späteren Analyse der Sox4/ Sox11 doppelt- bzw. Sox4/ Sox11/ Sox12

dreifach-defizienten Mäuse sollte im zweiten Teil dieser Arbeit die Rolle der Sox-Proteine der

Gruppe C in Überexpressionsstudien analysiert werden. Hierzu wurden transgene Mäuse

generiert, die den Transkriptionsfaktor Sox4 unter dem humanen GFAP-Promoter in Radial-

Glia-Zellen und Astrozyten exprimieren.

Ergebnisse

50

3.2.1 Herstellung GFAP-Sox4-transgener Mäuse

Zur Erzeugung GFAP-Sox4-transgener Mäuse wurde zunächst ein 2,2 kb langes Promotor-

Fragment des humanen GFAP-Gens (von Position -2163 bis +47) (Brenner et al., 1994; Nolte

et al., 2001) zwischen die Restriktions-Schnittstellen NheI und EcoRI des pIRES2-EGFP-

Vektors (Clontech, Heidelberg, Deutschland) eingefügt (Abb. 33). Bereits in früheren

Arbeiten konnte für dieses Promotor-Fragment gezeigt werden, dass es eine Expression des

Transgens in Radial-Glia-Zellen und Astrozyten ermöglicht (Brenner et al., 1994; Nolte et al.,

2001). Im Anschluss wurde ein 2 kb langes Fragment des Sox4-Gens (Rattus norvegicus;

Genbank-Ref. XM_344594) mit dem gesamten offenen Leserahmen von Sox4 über die

EcoRI-Restriktions-Schnittstellen zwischen den GFAP-Promotor und die IRES-EGFP-PolyA-

Kassette eingebracht (Abb. 33). Auf Grund der dem Sox4-Transgen folgenden IRES-EGFP-

Kassette war es möglich, die Expression des Transgens über die Ko-Expression mit EGFP zu

detektieren.

Abb. 33: Schematische Darstellung des GFAP-Sox4-Transgen-Konstrukts Das GFAP-Sox4-Transgen besteht aus dem human GFAP- (hGFAP) Promotor (Positionen -2163 bis +47), dem offenen Leserahmen von Sox4 aus der Ratte (rSox4) und einer IRES-EGFP-Kassette. Ebenfalls im Konstrukt enthalten sind die Restriktions-Schnittstellen für NheI (N), EcoRI (E) und AscI (A). pA: Poly-A-Signal. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.

Zur Herstellung der transgenen Tiere wurde das GFAP-Sox4-Konstrukt über die Restriktions-

Schnittstellen NheI und AscI aus dem Vektor isoliert und dieses in Zusammenarbeit mit

M. Bösl (MPI für Neurobiologie, Martinsried) in den männlichen Pronukleus befruchteter

FVB/N-Oocyten mikroinjiziert.

Als Resultat konnten drei transgene Weibchen und ein transgenes Männchen (Founder-Tiere)

erhalten werden. Eine Analyse der Anzahl der in das Genom der Maus integrierten transgenen

Kopien wurde mittels Southern-Blot durchgeführt (Abb. 34). Nach der Spaltung von

genomischer DNA mit dem Restriktionsenzym EcoRI erfolgte eine Hybridisierung mit einer

radioaktiv markierten, 0,6 kb langen Sonde, die den Bereich des Sox4-Gens nach der HMG-

Domäne erkennt. Für das Sox4-Gen konnte hierdurch ein 3,4 kb langes Fragment und für das

Sox4-Transgen ein 2 kb langes Fragment nachgewiesen werden (Abb. 34). Die Bestimmung

der Kopienzahlen des Transgens erfolgte durch die Vermessung der Fragment-Bandenstärken

Ergebnisse

51

im Phospho-Imager. Die Kopienzahlen errechneten sich jeweils aus dem Verhältnis der

Bandenstärke des Sox4-Gens zu der des Sox4-Transgens. In den drei Founder-Weibchen

ließen sich so sieben bis zehn und im Founder-Männchen 22 integrierte Kopien des Transgens

nachweisen (Abb. 34).

Abb. 34: Southern-Blot Analyse zur Bestimmung der Kopienzahl des Transgens Southern-Blot mit genomischer DNA von Wildtyp- (wt) und transgenen Nachkommen der weiblichen Founder-Tiere (#1, #2, #3) nach der Spaltung mit EcoRI. Die Größen der Fragmente (in kb) für das Wildyp-Sox4-Gen und das Sox4-Transgen sind auf der linken Seite des Blots angegeben. Die Kopienzahlen wurden mit einem Phospho-Imager bestimmt und sind unterhalb der Spuren kenntlich gemacht. In Zusammenarbeit mit E. Sock.

Die transgenen Kopien in den Founder-Tieren waren mehrheitlich an einer Integrationsstelle

hintereinander (Konkatamere) eingefügt (Daten nicht gezeigt). Alle vier Founder-Tiere gaben

das Transgen mit einer hohen Rate an die Nachkommen weiter. Im Gegensatz zu den

Founder-Weibchen zeigten jedoch nur wenige der Nachkommen des Founder-Männchens

eine starke Expression des Transgens (Daten nicht gezeigt).

3.2.2 Expression des GFAP-Sox4-Transgens während der embryonalen und

postnatalen Entwicklung der Maus

Zur Analyse der transgenen Mäuse sollte zunächst anhand der EGFP-Autofluoreszenz das

embryonale Expressionsmuster des GFAP-Sox4-Transgens im zentralen Nervensystem

untersucht werden.

An 10.5 dpc konnte auf Gefrierschnitten im Rückenmark der Maus keine EGFP-Expression

durch Autofluoreszenz nachgewiesen werden (Abb. 35A), während an 11.5 dpc in dem am

weitesten ventral gelegenen Teil der Ventrikulärzone EGFP-Autofluoreszenz auftrat

(Abb. 35B). Einen Tag später (12.5 dpc) ließen sich EGFP-Signale auch in der dorsalen Hälfte

der Ventrikulärzone finden (Abb. 35C). In diesem Stadium der Rückenmarksentwicklung war

eine überlappende Expression von EGFP und SoxB1 in der Ventrikulärzone festzustellen.

Dies weist auf eine Expression des GFAP-Sox4-Transgens in pluripotenten proliferierenden

Ergebnisse

52

Vorläuferzellen mit Radial-Glia-Charakter hin (Bylund et al., 2003) (Abb. 35F). Sobald die

Zellen die Ventrikulärzone verlassen, werden sie spezifiziert. An 12.5 dpc entstehen so vor

allem postmitotische neuronale Vorläuferzellen. In diesen Zellen ist die SoxB1-Expression

reprimiert und die Expression von Sox11 beginnt (Bylund et al., 2003; Uwanogho et al.,

1995). In den Sox11-positiven neuronalen Vorläuferzellen, die im transgenen Rückenmark an

12.5 dpc zu finden waren, ließ sich keine EGFP-Expression mehr erkennen (Abb. 35G). Diese

blieben auch während der weiteren Differenzierung zu NeuN-positiven Neuronen EGFP-

negativ (Bylund et al., 2003) (Abb. 35H). Damit konnte gezeigt werden, dass nach der

Spezifizierung von Radial-Glia-Zellen zu neuronalen Vorläuferzellen ein sehr schnelles

Abschalten der Transgen-Expression erfolgt. An 14.5 dpc wurden zusätzlich EGFP-Signale in

Astrozyten der Mantelzone entdeckt (Abb. 35D). Am Entwicklungsstadium 18.5 dpc waren

die meisten EGFP-positiven Zellen Astrozyten (Abb. 35E). Auch während der postnatalen

Entwicklung der transgenen Mäuse wurde EGFP weiter exprimiert (siehe Abb. 42, Abb. 47

und Abb. 48).

Abb. 35: Das embryonale Expressionsmuster des GFAP-Sox4-Transgens (A-H) EGFP-Autofluoreszenz auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks GFAP-Sox4-transgener Mäuse an den Entwicklungsstadien 10.5 dpc (A), 11.5 dpc (B), 12.5 dpc (C, F-H), 14.5 dpc (D) und 18.5 dpc (E). Der gekennzeichnete Bereich in C ist in F-H vergrößert dargestellt. (F-H) Immunhistochemie mit Antikörpern gegen SoxB1 (F), Sox11 (G) und NeuN (H) (alle in rot), und EGFP-Autofluoreszenz (in grün) auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks GFAP-Sox4-transgener Embryonen am Entwicklungsstadium 12.5 dpc. Die obere Reihe zeigt die Färbungen mit spezifischen Markern, die mittlere Reihe die entsprechenden EGFP-Signale und die untere Reihe die Überlagerungen (merge) der beiden oberen Bilder. Die Balkenlängen entsprechen 100 µm.

Ergebnisse

53

Um die Expression des Sox4-Transgens direkt zu zeigen, wurde RNA aus den Vorderhirnen

und Cerebella von transgenen Nachkommen der drei Founder-Weibchen am Postnatalstadium

P15 isoliert. Mittels quantitativer RT-PCR erfolgte der Vergleich der Transkript-Mengen des

Sox4-Transgens mit denen des Wildtyp-Gens. So konnte sowohl im Vorderhirn als auch im

Cerebellum transgener Tiere eine Expression des Sox4-Transgens nachgewiesen werden.

Zudem ließ sich zwischen den Nachkommen der verschiedenen Founder-Tiere eine

unterschiedlich starke Expression des Transgens feststellen. Im Vergleich der Expression von

Sox4 im Vorderhirn von Wildtyp-Tieren mit der des Sox4-Transgens in den Mutanten war

eine zwei- bis dreizehnmal höhere Expression des Transgens ersichtlich. Eine besonders

starke Expression des Sox4-Transgens war im transgenen Cerebellum zu beobachten, die die

des Sox4-Gens im Wildtyp-Cerebellum um das 10-24 fache überstieg (Abb. 36).

Abb. 36: RT-PCR-Analyse zum Nachweis der Expression des GFAP-Sox4-Transgens Quantitative RT-PCR mit cDNA aus Vorderhirn und Cerebellum von Wildtyp-Mäusen (wt) und Nachkommen der transgenen Founder-Tiere (#1, #2, #3) am Postnatalstadium P15. Die Werte wurden auf ß-Aktin normiert und als Vielfaches der Wildtyp-Werte ± Standardabweichung dargestellt.

3.2.3 Analyse des Phänotyps GFAP-Sox4-transgener Mäuse

Zwischen der zweiten und dritten Woche nach der Geburt entwickelten die Nachkommen der

drei Founder-Weibchen Hydrocephali (Wasserkopf) und schwere Ataxien. Das Schädeldach

der Tiere wölbte sich auf und sie bekamen Probleme, die Vorder- und Hinterbeine koordiniert

zu bewegen und gerade aus zu laufen. Die Symptome der Ataxie verstärkten sich bis zu ihrem

Tod, der meist nach drei Wochen eintrat. Nur eine transgene Maus überlebte sieben Wochen.

Die Analyse des Gehirns nach dem Tod dieser Mäuse bestätigte den Hydrocephalus mit

Vergrößerung der Lateralventrikel und des dritten Ventrikels (siehe Abb. 40).

Histologische Untersuchungen von Serienschnitten der mesencephalen Region von Wildtyp-

und GFAP-Sox4-transgenen Gehirnen ließen einen deutlich verengten Aquaeductus mes-

Ergebnisse

54

encephali in den transgenen Tieren am Postnatalstadium P3 erkennen (Abb. 37). Dieser Kanal

verbindet den dritten mit dem vierten Hirnventrikel und kann bei Verschluß zu Abfluss-

störungen des Liquor cerebrospinalis (Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit) und damit zu einem

Hydrocephalus führen. Der Liquor gelangt vom vierten Ventrikel in den Zentralkanal des

Rückenmarks und über die seitlichen und untere Öffnungen (mediane Apertur; Foramen

Magendii) in den äußeren Liquorraum. Dieser Zentralkanal und die mediane Apertur des

vierten Hirnventrikels waren in den transgenen Tieren nicht verschlossen. Die Morphologie

der Zellen um den Aquaeduct zeigte sich in den transgenen und den Wildtyp-Tieren als

vergleichbar. Sie waren normal um den Aquaeduct verteilt und GFAP-positiv (Abb. 37 und

Daten nicht gezeigt).

Abb. 37: Histologische Analyse des Aquaeductus mesencephali im Gehirn transgener Mäuse Nissl-Färbungen auf Paraffinschnitten der mesencephalen Region von Wildtyp- (wt) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) Gehirnen am Postnatalstadium P3. Der gekennzeichnete Bereich in den Übersichten, der den Aquaeductus mesencephali zeigt, ist jeweils rechts oben vergrößert dargestellt. Die Balkenlänge in der Übersicht entspricht 1mm und in der Vergrößerung 50 µm. In Zusammenarbeit mit S. Baader.

Ebenfalls konnte in den transgenen Mäusen ein Plexus Choroideus, ein baumartig verzweigtes

Adergeflecht, welches sich in jedem der vier Ventrikel des Gehirns befindet und den Liquor

cerebrospinalis bildet, identifiziert werden. Zudem zeigten sich in histologischen Analysen

und immunhistochemischen Färbungen mit Antikörpern gegen Sox9 keine offensichtlichen

morphologischen Veränderungen dieses Geflechts (Pompolo und Harley, 2001) (Abb. 38 und


Ergebnisse

55

Abb. 38: Untersuchungen des Plexus Choroideus GFAP-Sox4-transgener Mäuse Immunhistochemische Färbung des Plexus Choroideus mit einem Antikörper gegen Sox9 auf Gefrierschnitten von Wildtyp- (wt) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) Gehirnen am Postnatalstadium P15. Die Balkenlänge entspricht 50 µm.

Als nächstes erfolgte eine Untersuchung der Ependymzellen. Diese kleiden die Ventrikel des

Gehirns aus und sind im Besitz von Cilien, die durch ihre Bewegungen für den stetigen Fluß

des Liquors sorgen. Anhand einer Immunfärbung mit Antikörpern gegen acetyliertes α-

Tubulin konnten in den transgenen Tieren ependymale Cilien nachgewiesen werden (Abb. 39).

Eine Überprüfung der korrekten Funktion der Cilien konnte durch diese Färbung jedoch nicht

gezeigt werden.

Abb. 39: Analyse der ependymalen Cilien GFAP-Sox4-transgener Mäuse Immunhistochemische Färbung der ebendymalen Cilien mit einem Antikörper gegen acetyliertes α-Tubulin auf Gefrierschnitten von Wildtyp- (wt) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) Gehirnen am Postnatalstadium P9. Bei den Bildern handelt es sich um konfokale Aufnahmen. Die Balkenlänge entspricht 10 µm.

Die postmortale Analyse der transgenen Tiere zeigte eine starke Hypoplasie der Cerebella,

was ein möglicher Grund für die beobachtete Koordinationsstörung sein konnte. Die

Cerebella der transgenen Tiere waren kleiner und die Windungen der beiden

Kleinhirnhemisphären und des Kleinhirnwurms (Vermis) deutlich reduziert (Abb. 40).

Ergebnisse

56

Abb. 40: Die Morphologie des Gehirns GFAP-Sox4-transgener Mäuse In der oberen Reihe sind die Gehirne von Wildtyp- (wt) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) Mäusen am Postnatal-stadium P19 in Aufsicht gezeigt. Die untere Reihe stellt die Cerebella in Vergrößerung dar.

Der Phänotyp des Hydrocephalus, der cerebellären Fehlbildungen und des daraus

resultierenden Todes war vollständig penetrant. Deshalb konnte keine transgene Linie

generiert werden und die Analysen mussten mit den direkten Nachkommen der transgenen

Founder-Mäuse durchgeführt werden. Aufgrund der beschränkten Anzahl an transgenen

Tieren, die für die Studie verfügbar waren, wurde deshalb das Augenmerk auf die cerebelläre

Entwicklung gelegt.

3.2.4 Die Expression des GFAP-Sox4-Transgens im Cerebellum und in cerebellären

Kulturen

Im Gegensatz zum Rückenmark wurde in der cerebellären Anlage an 12.5 dpc noch keine

Expression des Transgens über die EGFP-Autofluoreszenz nachgewiesen (Abb. 41A). Erst

zwei Tage später ließen sich Signale in der Ventrikulärzone des Cerebellums detektieren

(Abb. 41B). An 18.5 dpc wurden EGFP-positive Zellen vor allem in den inneren Regionen des

Cerebellums gefunden (Abb. 41C). Regionen nahe der Oberfläche wie beispielsweise die

äußere Körnerzellschicht enthielten wenige EGFP-positive Zellen, was vermuten lässt, dass in

den meisten Körnerzell-Vorläufern keine signifikante Transgen-Expression vorhanden ist.

Ergebnisse

57

Abb. 41: Die Expression des GFAP-Sox4-Transgens im Cerebellum (A-C) EGFP-Autofluoreszenz auf sagittalen Gefrierschnitten des sich entwickelnden Cerebellums GFAP-Sox4-transgener Mäuse an den Embryonalstadien 12.5 dpc (A), 14.5 dpc (B) und 18.5 dpc (C). Die Balkenlängen entsprechen 100 µm.

Zur Bestimmung des Zelltyps, der das Transgen exprimiert, wurden ko-immunhistochemische

Färbungen mit EGFP-Antikörpern und Markern für bestimmte Zelltypen im sich ent-

wickelnden Cerebellum an P3, P9 und P15 durchgeführt (Abb. 42 und Daten nicht gezeigt).

Dabei wurde eine EGFP-Expression vor allem in B-FABP-positiven Radial-Glia-Zellen

detektiert (Abb. 42A). In Regionen mit GFAP-positiven Zellen ließ sich ebenfalls eine

Überlappung mit EGFP nachweisen, wenngleich die Ko-Expression aufgrund der unter-

schiedlichen subzellulären Lokalisation von EGFP und GFAP schwieriger zu sehen war

(Abb. 42B). Im Gegensatz dazu exprimierten an P3 nur wenige Sox10-positive Zellen EGFP.

Diese Expression war an P9 und P15 so gut wie nicht mehr nachzuweisen (Abb. 42C und


Abb. 42: Zelltyp-spezifische Expression des GFAP-Sox4-Transgens im Cerebellum (A-D) Doppel-Immunfluoreszenz-Analysen mit Antikörpern gegen B-FABP (A), GFAP (B), Sox10 (C) und NeuN (D) als Marker für spezifische Zelltypen (alle in rot) in Kombination mit einem Antikörper gegen EGFP (in grün) auf sagittalen Gefrierschnitten GFAP-Sox4-transgener Cerebella am Postnatalstadium P9. Die obere Reihe zeigt die Färbungen mit zelltyp-spezifischen Markern, die mittlere Reihe die entsprechenden EGFP-Färbungen und die untere Reihe die Überlagerungen (merge) der beiden oberen Bilder. Die Balkenlänge entspricht 25 µm.

Ergebnisse

58

Da Sox10 einen Marker der Oligodendrozyten-Zelllinie darstellt, könnte eine Erklärung für

die Detektion von EGFP in manchen Sox10-positiven Zellen sein, dass Oligodendrozyten-

Vorläuferzellen aus pluripotenten proliferativen Vorläuferzellen entstehen, die in den

transgenen Tieren EGFP exprimieren. Direkt nach Generierung Sox10-positiver

Oligodendrozyten-Vorläufer wäre es möglich, dass ehemals in den Zellen exprimiertes EGFP

immer noch vorhanden ist. Später jedoch lässt sich die Expression des Transgens deutlich von

Oligodendrozyten abgegrenzen. Körnerzell-Vorläufer und differenzierte Neurone des

Cerebellums enthielten zu keinem Zeitpunkt signifikante Mengen an EGFP (Abb. 42D und


Immuncytochemische Untersuchungen von primären cerebellären Kulturen bestätigten, dass

EGFP ausschließlich in B-FABP- und GFAP-positiven Zellen (Abb. 43A, B) und nicht in

Tuj1- oder MAP2-positiven Neuronen (Abb. 43C, D) exprimiert wird. Da sich die EGFP-

Expression auf B-FABP- und GFAP-positive Zellen beschränkt und die Expression dieser

Marker wiederum auf Radial-Glia-Zellen (auch Bergmann-Glia) und Astrozyten im frühen

postnatalen Cerebellum begrenzt ist, kommt das Transgen vor allem in Radial-Glia und

Astrozyten vor.

Morphologisch ließen sich die Neurone der GFAP-Sox4-transgenen cerebellären Kulturen

nicht von denen der Wildtyp-Kulturen unterscheiden (Abb. 43C, D). Im Gegensatz dazu

zeigten EGFP-exprimierende Glia-Zellen transgener Cerebella in Kultur kürzere Fortsätze als

die Glia-Zellen in Wildtyp-Kulturen. Zusätzlich fehlten oft die Endfuß-ähnlichen Strukturen

am Ende der Zell-Fortsätze (Abb. 43A, B). Trotz dieser Unterschiede wurden die EGFP-

positiven Glia-Zellen transgener Kulturen wie die Wildtyp-Glia immer noch in engem

Kontakt mit cerebellären Neuronen gefunden (Abb. 43C, D).

Abb. 43: Die Expression des GFAP-Sox4-Transgens in cerebellären Kulturen (A-D) Doppel-Immunfluoreszenz-Analysen mit Antikörpern gegen B-FABP (A), GFAP (B), Tuj1 (C) und MAP2 (D) als Marker für spezifische Zelltypen (alle in rot) in Kombination mit einem Antikörper gegen EGFP (in grün) auf primären Zellkulturen von Wildtyp- (wt) oder GFAP-Sox4-transgenen (tg) Cerebella. Die obere Reihe zeigt die Färbungen mit zelltyp-spezifischen Markern, die mittlere Reihe die entsprechenden EGFP-Färbungen und die untere Reihe die Überlagerungen (merge) der beiden oberen Bilder. Die Balkenlänge entspricht 25 µm. In Zusammenarbeit mit S. Baader.

Ergebnisse

59

3.2.5 Die Histologie des Cerebellums GFAP-Sox4 transgener Mäuse

In Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Schnitten bestätigte sich die Hypoplasie und reduzierte

Furchung transgener Cerebella. An P3 waren die Größenunterschiede der Kleinhirne beider

Genotypen noch gering. Klar abgegrenzte Lobuli ließen sich jedoch nur in den Cerebella von

Wildtyp-Mäusen erkennen (Abb. 44A, B). Die Region unterhalb der Oberfläche des Klein-

hirns war in Wildtyp- und transgenen Mäusen ähnlich mit Nuclei angereichert, was die

Existenz einer externen Körnerzellschicht in beiden Genotypen vermuten ließ. Auch die

Dicke dieser Körnerschicht war in den transgenen Cerebella nicht verändert. Nur Regionen, in

denen sich im Wildtyp schon Fissuren gebildet hatten, zeigten in den transgenen Cerebella

eine verdickte externe Körnerzellschicht (Abb. 44A, B).

Abb. 44: Die Histologie des Cerebellums GFAP-Sox4-transgener Mäuse (A-F) Hämatoxylin-Eosin-Färbungen auf sagittalen Paraffinschnitten von Wildtyp- (wt) (A, C, E) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) (B, D, F) Cerebella an den Postnatalstadien P3 (A, B), P9 (C, D) und P15 (E, F). Die römischen Ziffern III-X bezeichnen die verschiedenen Lobuli. Die Vergrößerungen stammen aus den gekennzeichneten Bereichen in den Übersichten und sind jeweils rechts davon dargestellt. Die Pfeile markieren die externe Körnerzellschicht, die Pfeilspitzen die Molekularschicht sowie Ansammlungen von Purkinjezellen und die Doppelpfeile zeigen die innere Körnerzellschicht sowie Ansammlungen von Körnerzellen an. Die Balkenlänge in der Übersicht A entspricht 200 µm, in C 500 µm und in E 1mm. In den Vergrößerungen A, C und E stellen die Balkenlängen 100 µm dar. Die Bilder von Wildtyp- und transgenen Cerebella wurden mit der gleichen Vergrößerung aufgenommen. fc: Fissura culminata; fp: Fissura prima; fs: Fissura secunda; fl: Fissura flocculonodularis. In Zusammenarbeit mit S. Baader.

Ergebnisse

60

An P9 war der Unterschied in der Furchung des cerebellären Kortex noch deutlicher

(Abb. 44C, D) und auch an P15 fehlten Fissuren und Lobuli noch immer vollständig in den

transgenen Mäusen (Abb. 44E, F). Mit Ausnahme der externen Körnerzellschicht waren keine

anderen Zellschichten im cerebellären Kortex GFAP-Sox4-transgener Mäuse zu erkennen.

3.2.6 Untersuchungen transgener Cerebella auf Apoptose und Proliferation

Die Analyse der Proliferationsraten in der äußeren Körnerzellschicht in Wildtyp- und GFAP-

Sox4-transgenen Mäusen an P3 zeigte keine Unterschiede zwischen den beiden Genotypen.

Jedoch waren die Teilungsraten in tieferen Regionen der transgenen Cerebella vermindert

(Abb. 45A, B). Dies ließ sich durch eine statistisch signifikante 36 %ige Reduktion an Ki67-

positiven Zellen in diesen cerebellären Regionen belegen (Abb. 45E).

Abb. 45: Untersuchungen GFAP-Sox4-transgener Cerebella auf Apoptose und Proliferation (A, B) Immunhistochemie mit einem Antikörper gegen den Proliferationsmarker Ki67 auf sagittalen Gefrier-schnitten von Wildtyp- (wt) (A) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) (B) Cerebella am Postnatalstadium P3. (C, D) TUNEL-Färbungen auf sagittalen Gefrierschnitten von Wildtyp- (C) und GFAP-Sox4-transgenen (D) Cerebella am Postnatalstadium P3. (E, F) Quantifizierung aller Ki67-positiven Zellen außerhalb der externen Körnerzellschicht (E) und der TUNEL-positiven Zellen (F) im Cerebellum. Mindestens 12 separate Schnitte von zwei verschiedenen Cerebella wurden für jeden Genotyp gezählt. Die gezählten Zellen wurden auf die Größe der Cerebella normiert und sind als Mittelwerte pro Flächeneinheit ± Standardabweichung angegeben. Unterschiede zum Wildtyp waren nach dem t-Test für die Proliferationsraten im mutanten Genotyp statistisch signifikant (P ≤ 0.001). Die Balkenlänge in A entspricht 100 µm und gilt auch für B-D.

Ergebnisse

61

Diese verringerte Proliferation in den transgenen Tieren könnte zu den Unterschieden in den

Größen der Wildtyp- und transgenen Cerebella während der postnatalen Entwicklung

beitragen. Eine alternative Erklärung für die unterschiedlichen Größen der Cerebella könnte

auch das Absterben von Zellen während der Entwicklung sein. Daher sollte durch TUNEL-

Färbungen die Rate an apoptotischen Zellen in den Wildtyp- und transgenen Cerebella an P3

analysiert werden. Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Apoptoserate,

die während dieser frühen postnatalen Periode im Cerebellum generell hoch ist (Krueger et al.,

1995), in den transgenen Cerebella ebenfalls erhöht war, ohne jedoch einen statistisch

signifikanten Unterschied zum Wildtyp zu erreichen (Abb. 45C, D, F).

3.2.7 Analyse der neuronalen und glialen Zelltypen in den Cerebella GFAP-Sox4

transgener Mäuse

3.2.7.1 Untersuchungen der neuronalen Subtypen in den transgenen Cerebella

Neuronale Zelltypen des Cerebellums lassen sich durch ihre Position und eine Kombination

immunhistochemischer Marker identifizieren. Die äußeren Körnerzellen befinden sich direkt

unterhalb der Oberfläche des Kleinhirns und exprimieren Ki67 und Pax6 (Baader et al., 1999;

Engelkamp et al., 1999). Sowohl in Wildtyp- als auch in transgenen Cerebella wurden an P3

und P9 Ki67- und Pax6-positive Zellen nahe der Oberfläche gefunden (Abb. 46A und Daten

nicht gezeigt). Im Gegensatz zum Wildtyp waren in den transgenen Cerebella an P15 jedoch

immer noch Ki67-positive proliferierende Körnerzellen zu sehen, was auf eine etwas

verzögerte oder verlängerte Entwicklung dieser Zellen hindeutet (Abb. 46F).

Nur ein geringer Teil der Zellen in der äußeren Körnerzellschicht war schwach NeuN-positiv.

Bei diesen Zellen handelt es sich um differenzierende Körnerzellen auf dem Weg von der

äußeren Zellschicht in tiefere Schichten des Cerebellums (Abb. 46B, G) (Weyer und Schilling,

2003). Dieses Färbemuster konnte sowohl in transgenen als auch in Wildtyp-Cerebella

beobachtet werden. Dagegen exprimieren differenzierende und differenzierte Körnerzellen in

tieferen Schichten der Wildtyp-Cerebella hohe Mengen an NeuN (Weyer und Schilling, 2003).

NeuN-positive Signale waren auch in tieferen Regionen der transgenen Cerebella zu finden,

was darauf hindeutet, dass die Körnerzellen in diesem Genotyp trotz des offensichtlichen

Fehlens einer geordneten internen Körnerzellschicht in der Lage sind, zu differenzieren (Abb.

46B, G).

Desweiteren ließen sich Calbindin-positive Neurone mit großen Somata in den transgenen

Cerebella nachweisen. Dies deutet darauf hin, dass Purkinjezellen spezifiziert werden und

Ergebnisse

62

sich entwickeln (Celio, 1990). Die Purkinjezellen in den transgenen Tieren konnten

verzweigte Dendritenbäume ausbilden und ließen sich auch mit Parvalbumin markieren,

wodurch eine korrekte Reifung auf zellulärer Ebene angezeigt wird (Abb. 46C, H und Daten

nicht gezeigt). Im Gegensatz zum Wildtyp formten die Purkinjezellen in den GFAP-Sox4

transgenen Mäusen jedoch keine Einzel-Zellschicht, sondern erzeugten Aggregate tief im

cerebellären Parenchym und vermischten sich dort mit Korb/Sternzellen (Abb. 46, vergleiche

C, H mit D, I und Daten nicht gezeigt). Bei den Korb/Sternzellen handelt es sich um

cerebelläre Interneurone, die wie Purkinjezellen sowohl positiv für RORα als auch positiv für

Parvalbumin sind. Eine Unterscheidung von Purkinjezellen ist jedoch aufgrund ihrer kleineren

Somata möglich (Ino, 2004). In den Purkinjezell-Aggregaten der transgenen Cerebella

konnten dagegen nur selten NeuN-positiven Körner- oder Pax2-positive Golgi-Zellen

detektiert werden (Abb. 46, vergleiche C, H mit B, G und E, J) (Weisheit et al., 2006).

Abb. 46: Analyse der neuronalen Subtypen in den Cerebella GFAP-Sox4-transgener Mäuse (A-J) Immunhistochemie mit Antikörpern gegen Ki67 (A, F), NeuN (B, G), Calbindin D28K (C, H), RORα (D, I) und Pax2 (E, J) auf sagittalen Paraffinschnitten von Wildtyp- (wt) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) Cerebella an den Postnatalstadien P3 (A-E) und P15 (F-J). Die Bilder stammen aus dem Bereich des zentralen Lobus. Die Balkenlänge entspricht 50 µm. Die Antikörperfärbung ist als braunes Diaminobenzidin-Präzipitat sichtbar und Hämatoxylin wurde als Gegenfärbung verwendet. Die Pfeile deuten auf Golgi-Neurone, die Pfeilspitzen auf undifferenzierte und differenzierte Korb/Sternzellen in der weißen Substanz und der Molekularschicht. In Zusammenarbeit mit S. Baader.

Golgizellen lagen in den transgenen Mäusen mit Körnerzellen durchmischt vor, ähnlich wie

dies auch im Wildtyp nachzuweisen war (Abb. 46, vergleiche E, J mit B, G). Pax2- oder

Ergebnisse

63

Parvalbumin-positive Neurone waren auch in tieferen Regionen transgener Cerebella zu

finden (Abb. 46E, J und Daten nicht gezeigt). Pax2-positive Neurone wurden vor allem in der

weißen Substanz nachgewiesen und entsprechen Vorläufer-Zellen GABAerger cerebellärer

Interneurone. Im Gegensatz dazu repräsentieren Parvalbumin-positive Neurone des

cerebellären Parenchyms Zellen der tiefen cerebellären Nuclei (Maricich und Herrup, 1999).

Trotz der ordnungsgemäßen Differenzierung der wichtigsten neuronalen Zelltypen im

cerebellären Kortex und der richtigen Sortierung der Zellen war die Schichtung stark gestört.

Die Purkinjezell-Dendriten in transgenen Cerebella zeigten keine ordnungsgemäße

Orientierung in Richtung Oberfläche, obwohl sie immer noch eine Tendenz in radiale

Richtung aufwiesen (Daten nicht gezeigt). Im Vergleich zum Wildtyp schienen sich in den

transgenen Tieren auch mehr interne Körnerzellen zwischen Purkinjezellen und der

cerebellären Oberfläche zu positionieren, ohne ihren Weg bis zu ihrem Zielort fortzusetzen

(Abb. 46B, G).

Aus diesen Beobachtungen wurde geschlossen, dass alle wichtigen neuronalen Subtypen in

den transgenen Cerebella vorhanden sind und differenzieren können, dass sie jedoch

Aggregate bilden, anstelle sich in die typischen cerebellären Schichten zu organisieren.

3.2.7.2 Untersuchungen der Glia-Zellen in den transgenen Cerebella

Da das Sox4-Transgen nicht in neuronalen Vorläufern und Neuronen des Cerebellums

exprimiert wurde und die Spezifikation und Differenzierung neuronaler Subtypen weitgehend

normal erschien, wurde der Fokus auf die Analyse der Entwicklung der Glia-Zellen gelegt.

Zu allen untersuchten Zeitpunkten der cerebellären Entwicklung war es möglich, Zellen

nachzuweisen, die das Transgen exprimierten und sich mit EGFP-Antikörper markieren

ließen (Abb. 47A, F, K). Die Verteilung dieser Zellen stimmte genau mit dem B-FABP-

Färbemuster überein und deutete darauf hin, dass die meisten EGFP-exprimierenden Zellen

Radial-Glia waren (Abb. 47B, G, L). Die Färbungen für SoxB1- und Sox9-Proteine als

unabhängige Radial-Gia-Marker (Pompolo und Harley, 2001; Sottile et al., 2006) bestätigten

diese Schlussfolgerung (Abb. 47C, H, M und Daten nicht gezeigt). Zellen, die B-FABP,

SoxB1-Proteine und Sox9 exprimierten, waren in den transgenen Tieren von P3 bis P15 über

die ganze cerebelläre Region verteilt. In den Wildtyp-Cerebella hingegen positionierten sich

diese Zellen im Laufe der postnatalen Entwicklung in der Purkinjezellschicht (Abb. 47B, G, L

sowie C, H, M und Daten nicht gezeigt). Die B-FABP-markierten Zellen in der Purkinjezell-

schicht der Wildtyp-Cerebella streckten lange, radial orientierte Fasern in Richtung der

Oberfläche aus, welches ihre Entwicklung zu Bergmann-Glia anzeigt (Abb. 47B, G, L). Im

Ergebnisse

64

Gegensatz dazu bildeten B-FABP-gefärbte Zellen in den transgenen Cerebella keine radialen

Ausläufer (Abb. 47B, G, L).

Mit GFAP als Marker konnten in Wildtyp-Tieren in tieferen Regionen des Cerebellums

Astrozyten der weißen Substanz angefärbt werden. Zudem ließen sich damit in Regionen nahe

der Oberfläche Bergmann-Glia und ihre Ausläufer markieren. In den transgenen Tieren

hingegen konnten nur in tieferen cerebellären Regionen GFAP-Signale detektiert werden.

Abb. 47: Analyse der glialen Zelltypen in den Cerebella GFAP-Sox4-transgener Mäuse (A-O) Immunhistochemie auf sagittalen Gefrierschnitten von Wildtyp- (wt) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) Cerebella an den Postnatalstadien P3 (A-E), P9 (F-J) und P15 (K-O) mit Antikörpern gegen EGFP (A, F, K), gegen den Radial- und Bergmann-Glia-Marker B-FABP (B, G, L), den Radial-Glia-Marker SoxB1 (C, H, M), den Bergmann-Glia- und Astrozyten-Marker GFAP (D, I, N) und den Oligodendrozyten-Marker Sox10 (E, J, O). Die Balkenlänge entspricht 50 µm.

Folglich scheint die Bildung von Astrozyten der weißen Substanz in transgenen Cerebella

nicht gestört zu sein. B-FABP-positive Zellen in äußeren Regionen der Cerebella waren

Ergebnisse

65

jedoch offenbar nicht in der Lage, in Anwesenheit des Sox4-Transgens in GFAP-

exprimierende Bergmann-Glia auszureifen (Abb. 47D, I, N). Die Färbungen mit dem Radial-

Glia-Zellmarker RC2 bestätigten das Fehlen von Bergmann-Glia und ihrer radialen Ausläufer

(Daten nicht gezeigt). Oligodendrozyten dagegen entwickelten sich normal, was an der

Zunahme Sox10-positiver Zellen in tieferen Regionen transgener Cerebella zu beobachten

war (Abb. 47E, J, O).

Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass das Sox4-Transgen die Expression glialer

Marker an sich nicht stört, sondern verhindert, dass Radial-Glia-Zellen im Cerebellum zur

Position der Bergmann-Glia-Zellen wandern, terminal differenzieren und den komplett

differenzierten Bergmann-Glia-Phänotyp erwerben.

3.2.8 Untersuchungen des cerebralen Kortex GFAP-Sox4-transgener Mäuse

Abschließend erfolgte eine Analyse der Radial-Glia-Zellen im Vorderhirn GFAP-Sox4-

transgener Mäuse. Nach Färbung mit Antikörpern gegen B-FABP und SoxB1 wurden in

neugeborenen transgenen Tieren EGFP-positive Radial-Glia in zum Wildtyp vergleichbarer

Anzahl gefunden (Abb. 48A, B und Daten nicht gezeigt). Am Tag der Geburt besaßen diese

Radial-Glia-Zellen im Vorderhirn radiale Ausläufer (Abb. 48B). Allerdings waren diese in

den transgenen Mäusen weniger regelmäßig angeordnet als in den Wildtyp-Tieren. Zudem

erreichten einige radiale Ausläufer in den transgenen Tieren nicht die Oberfläche (Abb. 48B).

Bei Fortschreiten der Entwicklung (an P3 und P9) ließen sich mit GFAP, B-FABP oder RC2

als Marker keine radialen Ausläufer mehr im cerebralen Kortex transgener Mäuse detektieren,

während sie im Wildtyp immer noch nachzuweisen waren (Abb. 48C und Daten nicht gezeigt).

Ab der Geburt konnte somit auch eine fortschreitende Schädigung von Radial-Glia im

Vorderhirn GFAP-Sox4-transgener Mäuse beobachtet werden. Die daraus resultierenden

Fehlbildungen neuronaler Schichten waren nicht gravierend, da die neuronale Wanderung im

cerebralen Kortex bis zum Tag der Geburt schon weit vorangeschritten ist (Fukumitsu et al.,

2006). Obwohl kleinere Abweichungen und eine verringerte Ausdehnung des cerebralen

Kortex an P9 zu beobachten waren, ließ sich die prinzipielle Schichtung erkennen.

Ergebnisse

66

Abb. 48: Analyse der Radial-Glia im cerebralen Kortex GFAP-Sox4-transgener Mäuse (A-C) Immunhistochemie auf kortikalen Gefrierschnitten von Wildtyp- (wt) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) Vorderhirnen am Tag der Geburt (P0) (A, B) und am Postnatalstadium P3 (C) mit Antikörpern gegen EGFP (A), B-FABP (B) und GFAP (C). Die Balkenlänge in A entspricht 50 µm und gilt auch für B und C.

Dies war sowohl mit histologischen als auch mit immunhistochemischen Färbungen von

Calretinin-positiven nicht-pyramidalen Neuronen in den Schichten 1-3 (Jacobowitz und

Winsky, 1991) und Oct6-positiven Neuronen in den Schichten 2/3 und 5 nachzuweisen

(Bermingham et al., 1996) (Abb. 49A-C).

Diese Daten zeigen, dass eine Schädigung von Radial-Glia-Zellen zu einem Zeitpunkt, an

dem die Wanderung von Zellen in radialer Richtung weitgehend abgeschlossen ist, keine

gravierenden Veränderungen der Kortexschichten mehr verursacht.

Am Zeitpunkt P15 war die Größenreduktion des transgenen cerebralen Kortex weiter

fortgeschritten und die Schichtung schwieriger zu erkennen (Abb. 49D, E). Zu diesem

Zeitpunkt waren die Neuronen dicht gebündelt, ihre nukleäre Morphologie sehr heterogen

geworden und die Zahl apoptotischer Zellen erhöht (Abb. 49D). Calretinin-positive Neurone

zeigten ungewöhnlich kurze und unverzweigte Ausläufer (Abb. 49E). Diese späten

Veränderungen im cerebralen Kortex sind jedoch vermutlich degenerativ und ein Ergebnis

des zunehmenden Hydrocephalus.

Ergebnisse

67

Abb. 49: Analyse der neuronalen Schichten im cerebralen Kortex GFAP-Sox4-transgener Mäuse (A, D) Nissl-Färbungen auf kortikalen Paraffinschnitten von Wildtyp- (wt) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) Vorderhirnen an den Postnatalstadien P9 (A) und P15 (D). (B, C, E) Immunhistochemie auf kortikalen Gefrierschnitten von Wildtyp- und GFAP-Sox4-transgenen Vorderhirnen an den Postnatalstadien P9 (B, C) und P15 (E) mit Antikörpern gegen Calretinin (Calr) (B, E) und Oct-6 (C). In A ist der Bereich gekennzeichnet, aus dem die Vergrößerungen (B, C) stammen. Die Balkenlänge in A entspricht 1mm, in B und C 100 µm, in D und E 25 µm. Die kortikalen Schichten sind mit den römischen Ziffern I-VI gekennzeichnet. In Zusammenarbeit mit S. Baader.

Diskussion

69

4 Diskussion

4.1 DAS SOX12-DEFIZIENTE MAUSMODELL

4.1.1 Bedeutung von Sox12 für die embryonale und frühe postnatale Entwicklung der

Maus

Sox12 zählt neben Sox4 und Sox11 zur Gruppe C der Sox-Proteinfamilie. Vor Beginn dieser

Studie war dieser Transkriptionsfaktor kaum untersucht. Das Expressionsmuster von Sox12

war nur im menschlichen Embryo beschrieben (Jay et al., 1997). Analysen über die Funktion

von Sox12 oder Tiermodelle waren noch nicht vorhanden. Deshalb wurde im Rahmen dieser

Arbeit das Expressionsmuster von Sox12 während der Mausembryogenese genauer bestimmt.

Darüber hinaus wurde die Funktion von Sox12 durch Generierung Sox12-defizienter Mäuse

analysiert.

In der vorliegenden Arbeit konnte für die Maus gezeigt werden, dass Sox12 ebenso wie Sox4

und Sox11 während der Säuger-Embryogenese in vielen Geweben exprimiert vorliegt.

Frühere Untersuchungen von Sox4- und Sox11-Knockout-Mäusen konnten zahlreiche

Entwicklungsdefekte in diesen Tieren nachweisen (Schilham et al., 1996; Sock et al., 2004).

In Anbetracht dessen war es überraschend, dass die Sox12-defizienten Tiere während der

embryonalen und frühen postnatalen Entwicklung keine Fehlbildungen aufwiesen. Im

Gegensatz zu Sox4-defizienten Mäusen, die um den Embryonaltag 14 sterben und Sox11-

Knockout-Tieren, die perinatal letal sind, wurden Mäuse, denen Sox12 fehlte, lebend geboren

und hatten ein normales Erscheinungsbild. Die Tiere zeigten ein unauffäliges postnatales

Wachstum und waren fortpflanzungsfähig. Dies deutet darauf hin, dass Sox12 für die

embryonale und frühe postnatale Entwicklung weitgehend entbehrlich ist. Hier muss jedoch

berücksichtigt werden, dass die Sox12-defizienten Mäuse zum Zeitpunkt der Analyse noch

einen gemischten genetischen Hintergrund besaßen. So setzte sich die ES-Zelllinie, in die das

Sox12-Targeting-Konstrukt eingebracht wurde, aus dem C57BL/6J- und dem 129Sv-Wildtyp-

Mausstamm zusammen, während die Blastozysten, in die die veränderten ES-Zellen injiziert

wurden, von C57BL/6J-Tieren stammten. Die erhaltenen Chimären wurden in der Folge mit

C57BL/6J-Mäusen, die das EIIa-Cre-Transgen enthielten, verpaart. Die anschließenden

Analysen erfolgten in den darauffolgenden drei Generationen (F2-F4). Es ist nicht

Diskussion

70

ausgeschlossen, dass ein Entwicklungsdefekt erst dann zu beobachten ist, wenn das Nullallel

durch intensives Rückkreuzen auf einen reinen genetischen Hintergrund gebracht wurde.

Erst kürzlich wurde in einer Studie über E2F-Transkriptionsfaktoren wieder deutlich, dass der

genetische Hintergrund bei der Ausprägung eines Phänotyps tatsächlich eine Rolle spielen

kann (Tsai et al., 2008). Zur Familie der E2F-Faktoren gehört das E2f3-Gen, das eine

Funktion bei der Kontrolle der Zellproliferation besitzt (Humbert et al., 2000; Wu et al., 2001).

Durch alternative Promotoren können von diesem Gen zwei Isoformen entstehen, die als

E2f3a und E2f3b bezeichnet werden (Leone et al., 2000). Wurden diese beiden Isoformen in

Mäusen mit einem gemischten genetischen Hintergrund inaktiviert, entwickelten sich die

Nachkommen dieser Tiere relativ normal (Humbert et al., 2000; Wu et al., 2001). Nachdem

die Mäuse jedoch auf einen reinen genetischen Hintergrund gebracht worden waren,

resultierte daraus eine embryonale Letalität dieser Tiere (Tsai et al., 2008).

Ähnliches wurde auch für Sox18-Knockout-Mäuse festgestellt. Sox18 wird während der

Mausembryogenese im sich entwickelnden vaskulären Endothel und in Haarfollikeln

exprimiert. Nach Deletion von Sox18 konnten zunächst keine schweren Fehlentwicklungen in

den Mäusen nachgewiesen werden (Pennisi et al., 2000). Die Züchtung der Knockout-Tiere

auf einen reinen genetischen Hintergrund führte jedoch zu erheblichen Defekten des

Vaskularsystems in diesen Mausmutanten (Francois et al., 2008). Auch in Sox8-defizienten

Mäusen lässt sich der Einfluß des genetischen Hintergrunds auf die Ausprägung des

Phänotyps erkennen. Beobachtungen der eigenen Arbeitsgruppe zeigen, dass Störungen in der

Entwicklung wie verringertes Körperwachstum und Infertilität stärker ausgeprägt werden, je

mehr diese Tiere rückgekreuzt werden.

Aus diesem Grund sollte im weiteren Verlauf der Analysen der Sox12-defizienten Mäuse der

Versuch unternommen werden, die Tiere durch wiederholte Verpaarungen mit Wildtyp-

Tieren auf einen reinen genetischen Hintergrund zu züchten. Sollte sich in den Mäusen

daraufhin kein Phänotyp ausprägen, kann zumindest ausgeschlossen werden, dass in unseren

Untersuchungen eine essentielle Funktion von Sox12 vom genetischen Hintergrund überdeckt

wurde.

Diskussion

71

4.1.2 Funktionelle Kompensation als ein möglicher Grund für einen fehlenden

Phänotyp in Sox12-defizienten Mäusen

Neben der Möglichkeit, dass der genetische Hintergrund der Sox12-defizienten Mäuse

entscheidend für die Ausprägung eines Phänotyps ist, könnte auch eine funktionelle

Redundanz als Ursache für fehlende Entwicklungsdefekte in Betracht kommen. Beim

Vergleich der Expression von Sox12 mit Sox4 und Sox11 war für alle drei SoxC-Gene ein

stark überlappendes Expressionsmuster festzustellen. Somit könnte in Sox12-defizienten

Mäusen die Funktion des fehlenden Faktors von den ko-exprimierten Genen Sox4 und/oder

Sox11 übernommen werden. Dafür spricht, dass in manchen Organen Sox12-defizienter

Mäuse eine Zunahme der Sox4- und Sox11-Expression zu beobachten war. In anderen

Organen wiederum blieben die Transkript-Mengen der beiden zu Sox12 verwandten Gene

unverändert. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass die funktionelle Kompensation organ-

spezifisch ist. Auch in Studien einer anderen Arbeitsgruppe wurde eine Ko-Expression dieser

drei SoxC-Gene in vielen verschiedenen Geweben nachgewiesen (Dy et al., 2008). Eine

gemeinsame Expression von Gruppenmitgliedern ließ sich bereits für einige andere Sox-

Gruppen zeigen. So sind beispielsweise die SoxB1-Proteine Sox1, Sox2 und Sox3 in neuralen

Stammzellen des sich entwickelnden Nervensystems ko-exprimiert (Collignon et al., 1996;

Pevny et al., 1998; Rex et al., 1997). Die SoxE-Proteine wiederum kommen unter anderem in

Oligodendrozyten gemeinsam vor (Stolt et al., 2004; Stolt et al., 2003; Stolt et al., 2002).

Eine funktionelle Kompensation wird auch als Erklärung für den fehlenden Phänotyp in der

Neuralentwicklung Sox11-defizienter Mäuse vermutet. Trotz einer sehr starken Expression

dieses Gens in reifenden neuronalen Vorläuferzellen des zentralen Nervensystems zeigten

diese bei einem Fehlen von Sox11 keinen Defekt (Sock et al., 2004). Da die neuronalen

Vorläuferzellen neben Sox11 den nah verwandten Transkriptionsfaktor Sox4 (Cheung et al.,

2000) und, wie in dieser Studie gezeigt, Sox12 exprimieren, könnten diese Proteine die

Funktion von Sox11 in den Sox11-defizienten Zellen übernehmen und damit die Ausprägung

eines Phänotyps verhindern. Ebenso können Sox11 und Sox12 offenbar den Verlust von Sox4

in neuronalen Vorläuferzellen kompensieren, denn auch in Sox4-defizienten Mäusen konnte

bis zu ihrem Absterben am Entwicklungsstadium 14 dpc kein offensichtlicher Defekt im

zentralen Nervensystem festgestellt werden (Cheung et al., 2000; Schilham et al., 1996). Ob

später in der Embryogenese der Verlust der Sox4-Funktion eine Auswirkung auf die

neuronale Entwicklung hat, kann mit der konstitutiven Sox4-defizienten Maus aufgrund des

frühen Herzdefektes nicht analysiert werden. Vor kurzem wurde aber eine Maus generiert, bei

Diskussion

72

der das Sox4-Gen konditional deletiert werden kann (Penzo-Mendez et al., 2007) und in der

Untersuchungen am spätembryonalen Nervensystem möglich sind. Mit Hilfe von

verschiedenen Cre-transgenen Mauslinien lässt sich in diesen Tieren das Sox4-Allel Gewebe-

oder Zelltyp-spezifisch entfernen. Die konditionalen Sox4-defizienten Mäuse werden zur Zeit

von der eigenen Arbeitsgruppe eingesetzt, um Sox4/Sox11-doppelt-defiziente Mäuse zu

generieren, in denen Sox4 spezifisch im zentralen Nervensystem deletiert ist. Dadurch soll

eine Analyse der Funktion von Sox4 und Sox11 während der Neuralentwicklung möglich

werden. Sollte die Nervensystem-Entwicklung in den Sox4/Sox11 doppelt-defizienten Tieren

weiterhin normal erfolgen, so spräche dies für eine funktionelle Kompensation durch Sox12.

Mit Hilfe der in dieser Arbeit generierten Sox12-defizienten Mäuse kann diese Hypothese

experimentell untersucht werden. Durch die Art, wie das Sox12-Gen verändert wurde, besteht

die Möglichkeit, für solche Versuche neben dem konstitutiven Sox12-Nullallel auch ein

konditionales Sox12-Allel einzusetzen. Dieses konditionale Allel hat den Vorteil, dass Sox12

spezifisch im Nervensystem deletiert werden kann. Dadurch lassen sich Defekte vermeiden,

die außerhalb des Nervensystems im Dreifach-Knockout aufgrund funktioneller Redundanz

zwischen Sox12 und Sox11 auftauchen könnten (Sox4∆/∆, Sox11-/-, Sox12-/- versus Sox4∆/∆,

Sox11-/-, Sox12∆/∆). Zudem kann nur dieses konditionale Sox12-Allel beweisen, dass auf-

tretende Defekte zellautonom für das Nervensystem sind.

4.1.3 Nichtreziproke funktionelle Kompensation aufgrund von Unterschieden in der

embryonalen Expression der SoxC-Gene

Wenn es sich beim Fehlen eines Phänotyps in den Sox12-defizienten Mäusen tatsächlich um

eine funktionelle Kompensation handeln sollte, so muss diese nichtreziprok sein. Das

bedeutet, dass Sox4 und Sox11 den Verlust von Sox12 ausgleichen können, während Sox12

das Fehlen von Sox4 oder Sox11 nicht zu kompensieren vermag. Dies lässt sich daran

erkennen, dass in den Sox4- und Sox11-defizienten Mäusen (Schilham et al., 1996; Sock et al.,

2004) schwere Entwicklungsdefekte nachzuweisen sind, obwohl Sox12 in diesen Tieren noch

vorhanden ist.

Die hier beschriebene Situation für Sox4, Sox11 und Sox12 erinnert an frühere Erkenntnisse

über die SoxE-Proteine Sox8, Sox9 und Sox10. Auch diese drei Proteine zeigen während der

Embryogenese ein stark überlappendes Vorkommen. Das Fehlen von Sox9 oder Sox10

verursacht jeweils schwere Entwicklungsdefekte, die unter anderem Chondrozyten bzw.

verschiedene Neuralleisten-Derivate betreffen. Diese Fehlbildungen führen embryonal oder

Diskussion

73

perinatal zum Tod der Mäuse (Bi et al., 1999; Britsch et al., 2001). Im Gegensatz dazu

werden Sox8-defiziente Tiere normal geboren und zeigen nur vergleichsweise schwache

Defekte während der postnatalen Entwicklung (Sock et al., 2001). Dies lässt den Schluß zu,

dass Sox9 und Sox10 den Verlust von Sox8 kompensieren können, andersherum Sox8 jedoch

nicht in der Lage dazu ist. Diese nichtreziproke Kompensation wird offenbar durch

Unterschiede in der Expressionshöhe und durch funktionelle Abweichungen zwischen den

drei Proteinen verursacht (Kellerer et al., 2006; Maka et al., 2005).

Auch bei den SoxC-Proteinen könnten Unterschiede in der embryonalen Expression eine

Begründung für die nichtreziproke funktionelle Redundanz sein. Mittels quantitativer RT-

PCR und in situ Hybridisierungen war im Vergleich zu Sox4 und Sox11 die Expression von

Sox12 niedriger. Außerdem ließ sich im gesamten Embryo eine annähernd gleichförmige

Expression von Sox12 beobachten. Es ist bezeichnend, dass gerade in jenen Organen, die in

Sox4- oder Sox11-Mausmutanten einen Entwicklungsdefekt aufwiesen, im Wildtyp ein

besonders starkes Vorkommen von Sox4 bzw. Sox11 nachzuweisen war. Der Mangel einer

verstärkten Sox12-Expression in einzelnen Geweben könnte folglich eine Erklärung für den

fehlenden Phänotyp in Sox12-defizienten Mäusen sein. Darüber hinaus gilt zu klären,

inwieweit es zu einer verstärkten Expression von Sox12 in Sox4- und Sox11-defizienten

Mäusen kommt. Nichtsdestotrotz reicht in den jeweiligen Mausmutanten das Vorkommen

von Sox12 nicht für eine kompensatorische Wirkung aus.

4.1.4 Nichtreziproke funktionelle Kompensation aufgrund unterschiedlicher

funktioneller Eigenschaften der SoxC-Proteine

Ein weiterer Grund für eine nichtreziproke funktionelle Redundanz zwischen den SoxC-

Proteinen könnten auch unterschiedliche funktionelle Eigenschaften sein. Die Ergebnisse

dieser Studie lassen jedoch vermuten, dass diese Unterschiede nicht sehr groß sind. So konnte

Sox12 in Gelshift-Experimenten an ähnliche DNA-Sequenzen im Promotor von Zielgenen

binden wie Sox4 und Sox11 (Bergsland et al., 2006; Kuhlbrodt et al., 1998a; van de Wetering

et al., 1993). Diese Promotor-Sequenzen wurden von den SoxC-Proteinen auch verwendet,

um Zielgen-Promotoren in Zellkultur und im Neuralrohr des Huhn-Embryos zu aktivieren.

Dabei waren alle drei Proteine zur alleinigen sowie zur synergistischen Aktivierung mit POU-

Proteinen befähigt. Diese ähnlichen funktionellen Eigenschaften sind möglicherweise darauf

zurückzuführen, dass sowohl die HMG-Domäne, die für die DNA-Bindung der Proteine

verantwortlich ist, als auch der etwa 35 Aminosäuren lange C-Terminus zwischen den drei

Diskussion

74

SoxC-Proteinen stark konserviert ist (Hargrave et al., 1997; Jay et al., 1997; Kuhlbrodt et al.,

1998a). Dabei stellt die konservierte C-terminale Region vermutlich die Transaktivierungs-

domäne dar, die im Falle von Sox4 und Sox11 bislang nur auf das C-terminale Drittel

eingegrenzt worden war (Kuhlbrodt et al., 1998a; van de Wetering et al., 1993). Vor kurzem

konnten die Ergebnisse einer weiteren Forschergruppe bestätigen, dass genau diese

konservierte C-terminale Sequenz notwendig und ausreichend für die transaktivierende

Kapazität der SoxC-Proteine ist (Dy et al., 2008).

Vor Beginn dieser Arbeit war für Sox12 noch keine Transaktivierungsdomäne identifiziert

worden. Deshalb konnte nicht ausgeschlossen werden, dass dieser Transkriptionsfaktor

ebenso als Repressor fungieren könnte. Aus diesem Grund wurde auch jener Aspekt

untersucht. Ein Beweis für eine reprimierende Funktion von Sox12 auf die Transkription

konnte in der vorliegenden Studie jedoch nicht erbracht werden. Damit verhält sich Sox12

anders zu Sox4 und Sox11 als die SoxB2-Mitglieder Sox14 und Sox21 zu den SoxB1-

Proteinen Sox1, Sox2 und Sox3 (Wegner und Stolt, 2005). Für diese beiden Gruppen

verwandter Sox-Proteine konnte eine antagonistische Wirkung nachgewiesen werden. Dabei

üben die SoxB1-Proteine eine aktivierende und die SoxB2-Faktoren eine reprimierende

Funktion auf dieselben Zielgene aus (Sandberg et al., 2005; Uchikawa et al., 1999). Diese

entgegengesetzte Wirkungsweise lässt sich wahrscheinlich dadurch erklären, dass die beiden

Sox-Gruppen zwar nahezu identische HMG-Domänen für die DNA-Bindung besitzen, jedoch

in den SoxB1-Proteinen eine Transaktivierungsdomäne vorhanden ist, während die Mitglieder

der SoxB2-Gruppe eine Transrepressordomäne aufweisen.

Obgleich sich die Transaktivierungsdomänen der drei SoxC-Proteine in ihren Aminosäure-

sequenzen sehr ähneln, gibt es Unterschiede in den Transaktivierungskapazitäten dieser

Transkriptionsfaktoren. So verhielt sich Sox12 im Vergleich zu Sox11 als ein deutlich

schwächerer Transaktivator und zeigte im Gegensatz zu Sox4 und Sox11 nur relativ mäßige

synergistische Effekte mit POU-Proteinen der Klasse III. Sox12 kann folglich weniger zur

Aktivierung der SoxC-Zielgene beitragen als das ko-exprimierte Sox11. Aus diesem Grund

hätte das Fehlen von Sox12 weniger Auswirkungen als der Verlust von Sox11, selbst wenn

beide Gene gleichermaßen hoch exprimiert werden. Sox12 scheint daher eher modulierend

auf die Expression der Gene zu wirken, die unter der Kontrolle von Sox4 und Sox11 stehen.

Um den Einfluß von Sox12 auf die embryonale Entwicklung tiefergehend zu analysieren,

müssten in Zukunft Maus-Mutanten generiert werden, in denen zusätzlich zu Sox12 weitere

SoxC-Gene deletiert werden.

Diskussion

75

Die in dieser Arbeit nachgewiesene schwächere transaktivierende Wirkung von Sox12 wurde

in Untersuchungen einer anderen Arbeitsgruppe bestätigt. In dieser Studie wurde auch die

DNA-Bindeeffizienz der drei SoxC-Proteine untersucht. Dabei ließ sich feststellen, dass das

Sox4-Protein in Gelshift-Experimenten besser an DNA binden konnte als Sox12, während

Sox11 kaum eine Bindung mit der DNA einging (Dy et al., 2008). Diese mangelhafte DNA-

Bindung des Sox11-Proteins, die in dieser Studie erhalten wurde, ließ sich durch die

Ergebnisse einer weiteren Forschergruppe bestätigen (Wiebe et al., 2003). Da die HMG-

Domänen der SoxC-Proteine in ihrer Sequenz sehr ähnlich sind, wurde der Grund für die

unterschiedlichen DNA-Bindefähigkeiten in Sequenzabweichungen außerhalb dieser DNA-

Bindedomäne gesucht. Dies ließ sich dadurch beweisen, dass alle drei SoxC-Proteine nach

Entfernen der Hälfte oder eines Drittels der C-terminalen Aminosäuresequenz gleichermaßen

gut an DNA binden konnten. Dabei wurde auch festgestellt, dass möglicherweise mehrere

Regionen im Sox11- und Sox12-Protein die Fähigkeit besitzen, die Bindung der HMG-Box

an DNA in vitro zu beeinträchtigen (Dy et al., 2008).

Als mögliche Erklärung wurde von der Arbeitsgruppe um Veronique Lefebvre ein Modell der

Autorepression formuliert (Dy et al., 2008). In diesem Modell fungieren die sauren Domänen

im Protein als Gelenke, wodurch es der C-terminalen Transaktivierungsdomäne möglich wird,

das Binden von DNA an die HMG-Domäne sterisch zu verhindern. Die C-terminale Domäne

kann folglich transaktivierend wirken und gleichzeitig ihre eigene Aktivität durch ein

Blockieren der Protein-DNA-Bindung einschränken. Die Kontrolle der SoxC-Aktivität in vivo

könnte so durch Faktoren vermittelt werden, die in der Lage sind, diese negative Auto-

regulation zu verhindern. Es stellt sich jedoch die Frage, ob diese Beobachtungen der

unterschiedlichen DNA-Bindeeffizienz in vitro für die in vivo Situation relevant sind, da das

Bindeverhalten nicht wirklich mit der Transaktivierungsfähigkeit korreliert.

Diskussion

76

4.2 DAS GFAP-SOX4-TRANSGENE MAUSMODELL

Die Sox-Proteine der Gruppe C zeigen ein stark überlappendes Expressionsmuster und eine

damit verbundene zumindest teilweise redundante Funktion. Eine gemeinsame Expression der

drei SoxC-Gene lässt sich auch im zentralen Nervensystem erkennen. Aufgrund ihrer

vermuteten gegenseitigen Funktionsübernahme können allerdings weder in Sox4- noch in

Sox11-defizienten Mäusen, vor ihrem embryonalen oder perinatalen Absterben, Defekte im

zentralen Nervensystem nachgewiesen werden (Cheung et al., 2000; Sock et al., 2004). Auch

in Sox12-Mausmutanten entwickelte sich das zentrale Nervensystem in Abwesenheit von

Sox12 normal.

Zur genaueren Untersuchung der Funktion von SoxC-Proteinen in der Entwicklung des

zentralen Nervensystems müssten somit alle drei Gruppenmitglieder gleichzeitig in der Maus

deletiert werden. Die Generierung doppelt- bzw. dreifach-defizienter Embryonen ist aber

extrem aufwendig und wurde auch erst im Laufe dieser Doktorarbeit nach Erzeugung Sox12-

defizienter Mäuse möglich. Als einen alternativen Ansatz zur Ermittlung der Funktion von

Sox12-Proteinen im sich entwickelnden Nervensystem wurden deshalb Überexpressions-

experimente gewählt.

Die Expression von Sox-Genen der Gruppe C kann in vivo in neuronalen Vorläuferzellen

detektiert werden, die bereits spezifiziert, aber noch nicht terminal differenziert sind

(Uwanogho et al., 1995). Auch in den Vorläuferzellen von Oligodendrozyten läßt sich eine

Expression der SoxC-Gene nachweisen, die später während der terminalen Differenzierung

herunterreguliert wird (Kuhlbrodt et al., 1998a). Aufgrund dieses Expressionsmusters wurde

im Rahmen der vorliegenden Arbeit der humane GFAP-Promotor verwendet, der eine

Überexpression von Sox4 in Radial-Glia-Zellen erlaubt, aus denen sich neuronale

Vorläuferzellen und Astrozyten entwickeln. Nur letztere bleiben GFAP-positiv (Brenner et al.,

1994; Nolte et al., 2001). Damit sollte es möglich sein, die Folgen einer transgenen Sox4-

Expression sowohl in einem undifferenzierten als auch in einem differenzierten Zelltyp zu

analysieren.

4.2.1 Expression des Sox4-Transgens in Radial-Glia und Astrozyten des sich

entwickelnden Cerebellums

Die Überexpression von Sox4 löste in den transgenen Mäusen Ataxien, Hydrocephali und den

Tod der Tiere am Ende der dritten postnatalen Woche aus. Die cerebelläre Ataxie war nicht

durch Veränderungen in den Körnerzellvorläufern erklärbar, da diese in dem hier

Diskussion

77

beschriebenen Mausmodell normal differenzierten. Wenn auch der GFAP-Promotor unter

bestimmten Gegebenheiten eine Expression des Transgens in externen Körnerzellen

ermöglicht (Marino et al., 2000), war dies in den im Rahmen dieser Arbeit generierten

transgenen Mäusen nicht der Fall. Zu keinem der untersuchten Zeitpunkte wurden in

Körnerzellvorläufern und differenzierten Neuronen nachweisbare Mengen des GFAP-Sox4-

Transgens exprimiert. Diese Beobachtungen stimmen wiederum mit den Ergebnissen überein,

die für das GFAP-HSV-TK-Transgen erhalten wurden (Delaney et al., 1996). In diesen

transgenen Mäusen wird das Gen für die Herpes simplex Virus-Thymidinkinase unter der

Kontrolle des humanen GFAP-Promotors exprimiert. Die Behandlung der neugeborenen

transgenen Mäuse mit Ganciclovir führte in Zellen, die die Thymidinkinase exprimieren, zur

Phosphorylierung des Medikaments in ein toxisches Nukleotid-Analogon, das in der Folge die

DNA-Replikation in proliferierenden Zellen kompetitiv beeinträchtigt. Diese Tiere

entwickelten Ataxien, und histologische Untersuchungen zeigten vor allem im Cerebellum

eine gestörte Astrozytenentwicklung. Desweiteren war das Kleinhirn in seiner Größe

reduziert und an Körnerzellen verarmt. Trotz der starken Auswirkungen der Ganciclovir-

behandlung auf die sich entwickelnden Körnerzellen der transgenen Tiere konnten weder in

unreifen Vorläufern noch in reifen Körnerzellen Trankripte des Thymidinkinase-Transgens

detektiert werden (Delaney et al., 1996).

In den hier beschriebenen GFAP-Sox4-transgenen Mäusen konnte eine Expression des

Transgens in Zellen der Ventrikulärzone mit Radial-Glia-Charakter und in Astrozyten

festgestellt werden. Für die Radial-Glia-Population konnte in früheren Untersuchungen

gezeigt werden, dass sie neben der Transformation zu Astrozyten (Schmechel und Rakic,

1979; Voigt, 1989) auch als Quelle für neuronale und oligodendrozytäre Vorläuferzellen

fungieren können (Malatesta et al., 2000; Miyata et al., 2001; Noctor et al., 2001; Tamamaki

et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit konnte im Zuge der Spezifizierung der Radial-Glia

keine Expression des GFAP-Sox4-Transgens in neuronalen Vorläuferzellen oder Neuronen

festgestellt werden. Ähnliches wurde für die Entwicklung von Oligodendrozyten beobachtet.

Auch hier ließ sich weder in unreifen noch in reifen Oligodendrozyten ein transgenes Protein

nachweisen.

Diskussion

78

4.2.2 Gestörte Entwicklung der Bergmann-Glia im GFAP-Sox4-transgenen

Cerebellum

Trotz der deutlichen Expression des GFAP-Sox4-Transgens in den Radial-Glia des sich

entwickelnden Mausembryos schienen diese Zellen in ihrer Entwicklung nicht ernsthaft

beeinträchtigt zu sein. Jedoch konnten im postnatalen Cerebellum keine Zellen detektiert

werden, die von ihrer Position im Kleinhirn und ihrer Morphologie den Bergmann-Glia

entsprachen. Bergmann-Glia sind reife radiäre Astrozyten im Cerebellum, die mit ihren

Ausläufern Neurone bei ihrer Wanderung unterstützen (Rakic, 1971). Alle in dieser Studie

verwendeten Zellmarker, zu denen B-FABP, SoxB1, Sox9, RC2 und GFAP gehörten, wurden

in den GFAP-Sox4-transgenen Cerebella weiterhin exprimiert. Während sich im Wildtyp-

Cerebellum die Bergmann-Glia-Zellen jedoch sowohl mit dem Radial-Glia-Marker B-FABP

als auch mit dem Astrozyten-Marker GFAP anfärben ließen, war es im transgenen

Cerebellum nicht möglich, einen Zelltyp zu identifizieren, der beide Proteine enthielt. Die

meisten Zellen, die das Transgen exprimierten, waren B-FABP-positiv und wurden deshalb

den Radial-Glia-Zellen zugeordnet. Allerdings bildeten diese im mutanten Cerebellum keine

radiären Ausläufer. Während sich die B-FABP-positiven Zellen im Laufe der Entwicklung

des Wildtyp-Cerebellums in der Purkinjezellschicht positionierten und GFAP-positiv wurden,

waren diese Zellen im transgenen Kleinhirn überall verteilt und zeigten kein GFAP-Signal. In

den transgenen Mäusen konnten GFAP-positive Glia nur in tieferen Regionen des Kleinhirns

detektiert werden. In diesem Bereich befinden sich im Cerebellum von Wildtyp-Mäusen die

Astrozyten der weißen Substanz. Folglich konnte daraus geschlossen werden, dass die

fortwährende Expression von Sox4 in Radial-Glia-Zellen die Differenzierung dieser Zellen zu

Bergmann-Glia verhindert.

4.2.3 Das GFAP-Sox4-transgene Kleinhirn zeigt eine veränderte cerebelläre

Architektur

Frühere Studien ließen bereits erkennen, dass fehlende oder defekte Bergmann-Glia-Zellen

Störungen in der cerebellären Architektur verursachen können. So führte beispielsweise die

Deletion von Pten (phosphatase and tensin homolog), einem Tumorsuppressorgen, in

Bergmann-Glia zu einer verfrühten Differenzierung dieser Zellpopulation und einer

darauffolgenden Störung der neuronalen Migration und der Schichtenbildung im Cerebellum

(Yue et al., 2005). Die vorzeitige Reifung der Pten-defizienten Bergmann-Glia ließ sich

Diskussion

79

anhand der Entwicklung zahlreicher Fortsätze und der Ausbildung einer Astrozyten-ähnlichen

Morphologie erkennen. Ebenfalls konnte in der Largemyd-Maus ein Defekt in den Bergmann-

Glia identifiziert werden (Qu and Smith, 2005). In dieser spontanen Mausmutante ist das Gen

deletiert, das für die putative Glykosyltransferase Large kodiert. Large wird für die

Glykosylierung von Dystroglykan, einem Transmembran-Laminin-Rezeptor, benötigt und ist

im sich entwickelnden Cerebellum am stärksten in Bergmann-Glia und Purkinjezellen

exprimiert. In der Largemyd-Maus zeigten Populationen von cerebellären Körnerzellen einen

Migrationsdefekt und verblieben in Aggregaten an der pialen Oberfläche und in der

Molekularschicht des adulten Kleinhirns. Der Verlust der Large-Genexpression löste eine

Störung der Verankerung der Bergmann-Gliazell-Endfüße und eine Desorganisation der

Bergmann-Glia-Ausläufer aus. Die Fortsätze dieser Zellen ordneten sich weniger regelmäßig

an, kreuzten sich häufiger und besaßen mehrere Verzweigungen. Einhergehend mit dieser

Störung des glialen Netzwerkes ließ sich eine abweichende Struktur der externen

Körnerzellschicht nachweisen. Eine verzögerte Körnerzellwanderung in der externen

Körnerzell- und Molekularschicht führte dazu, dass Körnerzellen an falschen Positionen im

Kleinhirn anfingen, zu differenzieren und schließlich in diesen Schichten liegen blieben. Ein

Grund für diese wenig effiziente neuronale Migration könnte im gestörten Glia-Netzwerk zu

suchen sein (Qu and Smith, 2005).

Da auch in der hier beschriebenen GFAP-Sox4-Mausmutante Bergmann-Glia und ihre

Ausläufer fehlten, sollte die cerebelläre Architektur in diesen transgenen Tieren ebenfalls

schwer gestört sein. Genau dieser Befund war zu beobachten. Der cerebelläre Kortex GFAP-

Sox4-transgener Mäuse zeigte keinen typischen, in Schichten gegliederten Aufbau und es

bildeten sich keine Fissuren und Lobuli aus. Allerdings waren die wichtigsten neuronalen

Zelltypen korrekt spezifiziert und wiesen eine normale Differenzierung auf. Purkinje-, Korb-

und Sternzellen gruppierten sich ebenso wie die Körner- und Golgizellen zusammen, wobei

keine Vermischung dieser Gruppen beobachtet werden konnte. Somit schienen die Zelltypen

ebenfalls richtig sortiert zu sein (Gliem et al., 2006). Dennoch erreichten die neuronalen

Subtypen ihren eigentlichen Bestimmungsort nicht und sammelten sich in Aggregaten an.

Somit ist der cerebelläre Phänotyp der GFAP-Sox4-transgenen Mäuse durch das Fehlen der

Bergmann-Glia erklärbar.

In anderen Studien konnten als Ursache für Störungen in der Kleinhirnarchitektur auch

intrinsische Defekte in cerebellären Neuronen oder Oligodendrozyten gefunden werden. So

löste beispielsweise eine Mutation des extrazellulären Matrixmoleküls Reelin, das unter

anderem von cerebellären Körnerzellen sezerniert wird, eine gestörte Migration der

Diskussion

80

Purkinjezellen aus. Dadurch bildeten diese keine einlagige Purkinjezellschicht aus, sondern

verblieben größtenteils in Zellhaufen tief im cerebellären Kortex (Goffinet et al., 1984).

Die Rolle der Oligodendrozyten bei der Entstehung der cerebellären Architektur ließ sich

durch ein transgenes Mausmodell ermitteln, bei dem diese Gliazellen selektiv in einem

gewünschten Zeitrahmen entfernt werden konnten. Die hierfür verwendeten MBP-TK

transgenen Mäuse exprimierten das Herpes Simplex Virus 1 Thymidinkinasegen unter der

Kontrolle des MBP (basisches Myelin Protein)-Promotors spezifisch in Oligodendrozyten

(Mathis et al., 2003). Durch die Injektion des nicht gesundheitsschädlichen Nukleosid-

analogons FIAU, das in den transgenen Mäusen durch die Thymidinkinaseaktivität in ein

toxisches Produkt umgewandelt wurde, konnten Oligodendrozyten in einer zeitlich

induzierbaren Art und Weise zerstört werden. Der Verlust von Oligodendrozyten während der

ersten postnatalen Wochen führte zu einer Störung der cerebellären Zytoarchitektur. Die

kortikalen Schichten waren desorganisiert und eine abnormale Ausbildung der Folia ließ sich

erkennen. Die Purkinjezellen kamen in einer mehrzelligen Schicht zu liegen und ihre

Dendritenbäume waren schlecht entwickelt. Zusätzlich konnte eine verringerte

Körnerzelldichte und ein ungeordnetes Bergmann-Glia-Netzwerk festgestellt werden.

Desweiteren beeinträchtigte das Fehlen von Oligodendrozyten die Migration von

Interneuronen in die Molekularschicht (Mathis et al., 2003).

Auch in den Untersuchungen der GFAP-Sox4-transgenen Mäuse war ein neuronaler oder

oligodendroglialer Beitrag zum cerebellären Defekt in den transgenen Tieren theoretisch

denkbar. Denn sowohl Neurone als auch Oligodendrozyten können aus Radial-Glia-Zellen

hervorgehen (Malatesta et al., 2000; Miyata et al., 2001; Noctor et al., 2001; Tamamaki et al.,

2001) und diese Vorläuferzellen exprimierten das GFAP-Sox4-Transgen. Jedoch kann davon

ausgegangen werden, dass diese Beiträge eher eine geringe Rolle spielen, da die

Spezifizierung der GFAP-Sox4-exprimierenden Zellen normal war. Ebenso wurde die

Expression des Transgens im Zuge der Spezifizierung in neuronalen und Oligodendrozyten-

Vorläufern abgeschaltet. Die Tatsache, dass in diesen Vorläuferzellen Sox4 und Sox11 bereits

endogen exprimiert werden (Cheung et al., 2000; Kuhlbrodt et al., 1998a; Uwanogho et al.,

1995), sprechen ebenfalls gegen einen störenden Einfluß von möglicherweise noch

vorhandenen Restmengen des GFAP-Sox4-Transgens in diesen Zellen.

Diskussion

81

4.2.4 Bedeutung von Sox4 für die Reifung von Radial-Glia

Aufgrund ihres Expressionsmusters wurde den Sox-Proteinen der Gruppe C eine Rolle bei der

neuronalen und glialen Reifung zugeordnet. Ihr Vorkommen läßt sich in neuronalen und

oligodendroglialen Vorläuferzellen nachweisen, die aus der Ventrikulärzone ausgewandert

sind. Während der terminalen Differenzierung dieser Zellen kommt es schließlich zum

Abschalten der Genexpression (Hargrave et al., 1997; Kuhlbrodt et al., 1998a). In der hier

vorliegenden Arbeit gibt es Hinweise, dass die fortwährende Anwesenheit von Sox4 eine

Beeinträchtigung der Reifung von Radial-Glia-Zellen zur Folge hat. Somit kann die

Hypothese aufgestellt werden, dass SoxC-Proteine in glialen Vorläuferzellen vorhanden sind,

damit diese Zellen in einem undifferenzierten Zustand gehalten werden. Um eine terminale

Differenzierung der Zellen zu ermöglichen, muß die Expression der SoxC-Gene abgeschaltet

werden.

Ähnliches konnte in Überexpressionsstudien von Engrailed-2 in Purkinjezellen festgestellt

werden. Der Transkriptionsfaktor Engrailed-2 ist während der Embryonalentwicklung der

Maus in cerebellären Purkinjezellen exprimiert und wird nach ihrer Geburt in diesen Zellen

herunterreguliert. Zu diesem Zeitpunkt beginnen die Purkinjezellen zu differenzieren. Um

herauszufinden, ob das Abschalten der Expression von Engrailed-2 für die Reifung dieser

Zellen notwendig ist, wurden Untersuchungen an L7En-2 transgenen Mäusen durchgeführt

(Jankowski et al., 2004). In diesen Tieren kommt es zu einer fortlaufenden Expression von

Engrailed-2 in Purkinjezellen über den Tag der Geburt hinaus. Die verlängerte Expression

dieses Transkriptionsfaktors bewirkte eine verzögerte Reifung der Purkinjezellen. Dies zeigte

sich vor allem in einer verlangsamten Dendritogenese dieser Neurone und einer verspäteten

Ausbildung der einlagigen Purkinjezellschicht. Zusätzlich war auch die Expression von Parv-

albumin in den transgenen Purkinjezellen um einige Tage verzögert (Jankowski et al., 2004).

In einer anderen Studie der Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass auch eine verlängerte

Expression von Sox4 in Oligodendrozyten eine vollständige Reifung dieser Zellen verhinderte.

Für diese Untersuchungen wurden MBP-Sox4-transgene Mäuse generiert, in denen Sox4

unter dem MBP-Promotor exprimiert wurde (Potzner et al., 2007). Dieser Promotor

ermöglichte eine Transkription des Transgens in terminal differenzierenden Oligodendrozyten

des zentralen Nervensystems. Nach den ersten postnatalen Wochen der Mausentwicklung

wurde die Transgenexpression jedoch wieder abgeschaltet. Während Sox4 normalerweise in

reifenden Oligodendrozyten herunterreguliert wird, blieb die Expression in den transgenen

Mäusen aufgrund der Aktivität des MBP-Sox4-Transgens über dieses Stadium hinaus erhalten.

Diskussion

82

Das Ergebnis der verlängerten Sox4-Produktion war eine schwere Hypomyelinisierung

während der ersten postnatalen Wochen der Mausentwicklung. Die Myelin-Genexpression

war stark reduziert und die Myelinscheiden in einigen Regionen des zentralen Nervensystems

sehr dünn. Erst nachdem die Expression des MBP-Sox4-Transgens abgeschaltet wurde,

konnte eine Besserung des Phänotyps erfolgen (Potzner et al., 2007). Diese Beispiele deuten

darauf hin, dass Zellen nach dem Austritt aus dem Mitosezyklus den Weg der Differenzierung

einschlagen und dass dieser Prozess blockiert werden muß, um eine Zelle in einem

undifferenzierten und wandernden Zustand zu halten.

Bei der Analyse des Einflusses der Sox-Proteine der Gruppe C auf die Neurogenese durch

Überexpressionsstudien im frühen Huhn-Embryo wurden entgegengesetzte Ergebnisse

erhalten. Diese Studie zeigte, dass sowohl Sox4 als auch Sox11 vorzeitig pan-neuronale

Eigenschaften in unreifen neuronalen Vorläuferzellen induzieren. Offensichtlich scheinen sich

die Sox-Proteine der Gruppe C gegensätzlich auf die neuronale und gliale Differenzierung

auszuwirken. Dabei wird die neuronale Reifung gefördert, während es bei der glialen

Differenzierung zur Repression kommt (Bergsland et al., 2006).

Der in den GFAP-Sox4-transgenen Mäusen auftretende Hydrocephalus könnte ebenfalls auf

einen Reifungsdefekt der Radial-Glia-Zellen in diesen Tieren zurückzuführen sein. Ein

Hydrocephalus lässt sich oft beobachten, wenn Ependymzellen fehlen oder nicht

funktionieren. Diese Zellen entwickeln sich ähnlich wie Bergmann-Glia aus Radial-Glia-

Zellen (Spassky et al., 2005). Sie kleiden die Wände der Gehirnventrikel aus und spielen eine

wichtige Rolle beim Transport der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) durch das Ventrikelsystem.

Um dies bewerkstelligen zu können, sind die gewöhnlichen Ependymzellen im Besitz von

beweglichen Flimmerhaaren, den Kinocilien. Kommt es zum Verlust der Beweglichkeit der

ependymalen Cilien, kann dies zu einer Beeinträchtigung des Flüssigkeitsstroms in den

Gehirnventrikeln und zu einem Hydrocephalus führen. Dieser Phänotyp war beispielsweise in

Untersuchungen von Mäusen mit Mutationen des axonemalen Dyneins Mdnah5 (dynein,

axonemal, heavy chain 5) zu beobachten (Ibanez-Tallon et al., 2004). Mdnah5 wird in

Ependymzellen exprimiert und ist wichtig für die ultrastrukturelle und funktionelle

Unversehrtheit der ependymalen Cilien. Wird das Mdnah5-Gen mutiert, führt dies zu einer

gestörten Beweglichkeit der ependymalen Cilien und zum Verlust einer gerichteten

Fließbewegung der Cerebrospinalflüssigkeit. Das Fehlen eines Flüssigkeitsstroms in den

Mdnah5-defizienten Mäusen verursachte einen Verschluß des cerebralen Aquädukts

(Aquaeductus cerebri oder auch Aquaeductus mesencephali) während der frühen postnatalen

Gehirnentwicklung. Als Folge dessen kam es zur Ausbildung eines Hydrocephalus. Mit dieser

Diskussion

83

Studie wurde zum ersten Mal gezeigt, dass ein direkter funktioneller Zusammenhang

zwischen der Flüssigkeitsströmung, die durch die Bewegungen der ependymalen Cilien

erzeugt wird, und der korrekten Ausbildung des Ventrikelsystems während der frühen

postnatalen Gehirnentwicklung besteht (Ibanez-Tallon et al., 2004). In den hier analysierten

GFAP-Sox4-transgenen Mäusen ließen sich Ependymzellen mit Cilien nachweisen.

Allerdings konnte aufgrund der begrenzten Zahl an verfügbaren Tieren nicht analysiert

werden, ob diese Zellen und ihre Cilien funktionsfähig waren. Ähnlich wie bei den Mdnah5-

defizienten Mäusen ließ sich auch in den GFAP-Sox4-transgenen Mäusen ein verengter

Aquaeductus mesencephali beobachten. Dies könnte ebenfalls auf einen Defekt der

ependymalen Cilien in den transgenen Tieren und dem daraus resultierenden Hydrocephalus

hindeuten.

Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit wichtige Funktionen der SoxC-Proteine

aufgezeigt werden. Diese Faktoren sind entscheidend an der Aufrechterhaltung des

undifferenzierten Zustands glialer Vorläuferzellen beteiligt. Erst nach Abschalten der SoxC-

Genexpression wird eine terminale Differenzierung dieser Zellen möglich. Zudem konnte

nachgewiesen werden, dass alle drei Gruppenmitglieder ähnliche biochemische Eigenschaften

und eine überlappende Expression während der Embryogenese der Maus aufweisen.

Aufgrund der fehlenden Entwicklungsdefekte in den analysierten Sox12-defizienten Mäusen

kann eine kompensatorische Wirkung von Sox4 und Sox11 angenommen werden. Diese

Vermutung ließ sich durch den Nachweis einer erhöhten Expression der beiden Faktoren in

einzelnen Organen Sox12-defizienter Tiere bekräftigen.

Material

85

5 Material

5.1 ORGANISMEN

5.1.1 Mausstämme

Für die Zucht der im Rahmen dieser Arbeit generierten, gentechnisch veränderten Mauslinien

wurden der Wildtyp-Inzucht-Mausstamm FVB/N (Charles River Deutschland, Sulzfeld) und

die genetisch veränderte EIIaCre-Mauslinie (Lakso et al., 1996) verwendet.

5.1.2 Bakterienstämme

Folgende Bakterienstämme der Firma Stratagene (La Jolla, USA) wurden in dieser Arbeit

verwendet:

Bezeichnung Genotyp

XL1 Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac

[F’ proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)]

BL21 (DE3) pLysS E.coli B F- dcm ompT hsdS(rB- mB

-) gal λ(DE3) [pLysS Camr]

5.1.3 Zelllinien

Folgende Zelllinien wurden in dieser Arbeit verwendet:

Linie Herkunft Referenz

HEK293 Mensch, embryonale Nierenzellen American Type Culture Collection

(ATCC)

Neuro2a Maus, Neuroblastom American Type Culture Collection

(ATCC)

Material

86

5.2 CHEMIKALIEN UND ALLGEMEINE REAGENZIEN

Salze, Lösungsmittel, Chemikalien und allgemeine Reagenzien stammten, soweit nicht anders

vermerkt, von den Firmen Carl Roth (Karlsruhe), Merck (Darmstadt) und Sigma (München).

Medien, Puffersubstanzen und Materialien für die Zellkultur wurden von den Firmen

Gibco/BRL (Eggenstein), Invitrogen (Karlsruhe), Serva (Heidelberg), Sarstedt (Nümbrecht),

Renner (Darmstadt) und TPP (Trasadingen, Schweiz) bezogen.

Radiochemikalien wurden von der Firma Amersham (Braunschweig) erhalten.

5.3 ZUSAMMENSETZUNG GEBRÄUCHLICHER MEDIEN UND LÖSUNGEN

Für die Herstellung von Lösungen, Puffern und Verdünnungen wurde Reinstwasser aus einer

Deionisationsanlage MilliQ der Firma Millipore (Eschborn) mit einem spezifischen

Widerstand von 18,2 MΩ/cm3 verwendet.

Medien/ Lösungen Zusammensetzung

AP-Puffer

100 mM Tris, pH 9,5; 50 mM MgCl2; 100 mM NaCl;

steril filtrieren; vor Gebrauch 5 µl 20 % Tween-20 und 1 µl

1 M Levamisol pro ml Puffer zugeben

Citratpuffer 9 ml Stammlösung A; 41 ml Stammlösung B; 450 ml H2O

Citrat-Stammlösung A 100 mM Citronensäure

Citrat-Stammlösung B 100 mM Natriumcitrat

Coomassie-Färbelösung 0,1 % Coomassie brilliant blue R-250; 10 % Eisessig;

40 % Ethanol

Coomassie-Entfärbelösung 10 % Eisessig, 40 % Ethanol

Denaturierungslösung 0,5 M NaOH; 1,5 M NaCl

Denhardt (50 x) 1 % Ficoll 400; 1 % Polyvinylpyrrolidon; 1 % BSA

Digestion-Puffer 10 mM Tris, pH 8,0; 100 mM NaCl; 25 mM EDTA;

0,5 % SDS

10 x DNA-Probenpuffer 50 % TE; 50 % Glycerin; 0,05 % Xylencyanol;

0,05 % Bromphenolblau

ECL Lösung A 0,025 % Luminol; 0,1 M Tris, pH 8,6

Material

87


ECL Lösung B 0,11 % p-Hydroxy-Cumarinsäure in DMSO

ECL Entwicklerlösung 6 ml Lösung A; 60 µl Lösung B; 1,8 µl H2O2

ES-Lysispuffer

50 mM Tris, pH 8,0; 10 mM EDTA; 10 mM NaCl;

0,1 % SDS; vor Gebrauch 100 µg/ml RNase A und 1 mg/ml

Proteinase K zugeben

Hanks-Lösung

137 mM NaCl; 5 mM KCl; 0,7 mM Na2HPO4;

5 mM Glucose; 2,5 mM CaCl2; 1,2 mM MgSO4;

4,17 mM NaHCO3; pH 7,2; steril filtrieren; bei 4 °C lagern

Hybridisierungspuffer

(in situ)

1 ml 10 x Salz; 5 ml Formamid; 2 ml 50 % Dextransulfat;

1 ml Yeast-RNA (10 mg/ml); 100 µl 50 x Denhardt-Reagenz;

900 µl H2O

3 x Lämmli-Probenpuffer 187 mM Tris, pH 6,8; 6 % SDS; 30 % Glycerin;

0,02 % Bromphenolblau; 15 % β-Mercaptoethanol

LB-Agar LB-Medium; 1,5 % Agar

LB-Medium 1 % Bacto-Trypton; 0,5 % Hefe-Extrakt; 0,5 % NaCl

Lower-Tris 1,5 M Tris, pH 8,8; 0,4 % SDS

Luciferase-Lysispuffer

88 mM Tris, pH 7,8; 88 mM MES, pH 7,8;

12,5 mM MgOAc; 1 mM DTT; 0,1 % Triton X-100;

2,5 mM ATP

MABT-Puffer 100 mM Maleinsäure, pH 7,5; 150 mM NaCl; Lösung

autoklavieren; vor Gebrauch 0,1 % Tween-20 zugeben

Mowiol

6,0 g Glycerin und 2,4 g Mowiol 488 in 6 ml H2O geben; 2 h

bei RT inkubieren; 12 ml 0,2 M Tris pH 8,5 zugeben; 24 h

bei 53 °C rotieren; bei 4000 Upm zentrifugieren, aliquotieren

Narkotikum

(Ketamin/Rompun)

1,2 ml Ketamin (10 %); 0,8 ml Rompun (2 %); 8 ml isotone

NaCl-Lösung; 10 µl pro g Gewicht der Maus einsetzen

PBS (1 x) 140 mM NaCl; 2,7 KCl; 10 mM Na2HPO4;

1,2 mM KH2PO4; pH 7,3

PBS-T PBS mit 0,1 % Tween-20; pH 7,3

Material

88


PFA (4 %) 20 g Paraformaldehyd (PFA) in 300 ml H2O (65 °C) lösen;

50 ml 10 x PBS; ad 500 ml H2O; pH 7,4; steril filtrieren

Prähybridisierungslösung

(für Southern-Blot)

50 % Formamid; 5 x SSC; 5 x Denhardt-Reagenz;

1,5 % SDS; 100 µg/ml denaturierte (3 min bei 96 °C)

Lachsspermien-DNA

Puffer A

6 M Guanidinhydrochlorid; 0,1 M NaH2PO4;

0,01 M Tris; pH 8,0 bzw. für die Aufreinigung des Sox4-

Peptids Zugabe von 10 mM Imidazol und 0,01 % NP-40

Puffer B

8 M Harnstoff; 0,1 M NaH2PO4; 0,01 M Tris bzw. für die

Aufreinigung des Sox4-Peptids Zugabe von 10 mM Imidazol

und 0,01 % NP-40

10 x Salz 126 mM Tris, pH 7,5; 1,85 M NaCl; 100 mM NaH2PO4;

50 mM EDTA

SDS-Laufpuffer 25 mM Tris, pH 8,3; 190 mM Glycin; 0,1 % SDS

SSC (20 x) 3 M NaCl; 0,3 M Natriumcitrat; pH 7,0

TAE (1 x) 40 mM Tris-Acetat; 1 mM EDTA; pH 8,0

Tail-Lysispuffer 50 mM Tris, pH 8,0; 100 mM EDTA, pH 8,0; 0,5 % SDS

TBE (1 x) 90 mM Tris; 90 mM Borsäure; 2,5 mM EDTA; pH 8,3

TE-Puffer 10 mM Tris; 0,1 mM EDTA; pH 8,0

Upper-Tris 0,5 M Tris, pH 6,8; 0,4 % SDS

Waschpuffer (in situ) 1 x SSC; 50 % Formamid; 0,1 % Tween-20

Western-Transferpuffer 48 mM Tris; 39 mM Glycin; 0,04 % w/v SDS;

20 % v/v Methanol

Zell-Lysispuffer

10 mM HEPES, pH 7,9; 10 mM KCl; 5 mM MgCl2; 350 mM

NaCl; 0,1 mM EDTA; 0,1 mM EGTA; 0,75 % NP-40; 2 mM

DTT; 10 % Glycerin; 5 µg/ml Aprotinin; 5 µg/ml Leupeptin

Material

89

5.4 PROTEINE UND ENZYME

Alle in dieser Arbeit verwendeten Enzyme wurden von Gibco/BRL(Eggenstein) MBI

Fermentas (St. Leon-Roth), NewEngland Biolabs (Frankfurt) oder Roche Diagnostics

(Mannheim) bezogen.

5.5 OLIGONUKLEOTIDE

Die im Folgenden aufgelisteten Oligonukleotide wurden von der Firma Invitrogen (Karlsruhe)

hergestellt und für die angegebenen Anwendungen eingesetzt.

5.5.1 Oligonukleotide für die Genotypisierung der GFAP-Sox4-transgenen Mäuse

Name Sequenz (5’-3’) Primer

GFAP-tg1 TCG CCA GTC TAG CCC ACT CC 5’

rnSox4-tg1 GAA AGC GAC ATC GTC TCT AGC 3’

5.5.2 Oligonukleotide für die Genotypisierung der Sox12--Mäuse

Name Sequenz (5’-3’) Primer

mmSox12-19 (Primer a) GGA GAA CAG ATG GGC AGC G 5’

mmSox12-20 (Primer b) GGC CAG TAG AGC TCC TCC G 3’

mmSox12-21 (Primer c) CGC ACA CCG GCC TTA TTC C 3’

5.5.3 Oligonukleotide für Klonierungen

Name Sequenz (5’-3’) Pr. Matrize Position Anwendung

mmSox12-11 GAA TGA GCT GAT

GGA CTA GC 5’

pBKS-Sox12up-

8,4kb 5.2 8438-8457

mmSox12-12 CCA TAT GAA AAT

ACC GAA TCA G 3’

pBKS-Sox12up-

8,4kb 5.2 8757-8736

Herstellung

der 5`-Sonde

für Southern-

Blot

Material

90

5.5.4 Oligonukleotide für RT-PCR

Name Sequenz (5’-3’) Pr. Genbank-Ref. Position Anwendung

Actin-1 CCT GGG CAT GGA

GTC CTG 5’ ------- -------

Actin-2 GGA GCA ATG ATC

TTG ATC TTC 3’ ------- -------

für quantitative

und Standard-

RT-PCR

mmSox11-60 ACC CAC AGA AAC

CAT TAC GG 5’ NM_009234 3652-3671

mmSox11-61 CTT CCT CAC CAT

GGA AAA CG 3’ NM_009234 4014-3995

für quantitative

RT-PCR

mmSox12-25 CGA GGT TAC CGA

GAT GAT CG 5’ NM_011438 1224-1243

mmSox12-26 GAG GGA TGG TTC

AAG CTG AG 3’ NM_011438 1813-1794

für Standard-

RT-PCR (um-

fassen putatives

Sox12-Intron)

mmSox12-27 CAG TCT GGG GAC

AGA GTT CC 5’ NM_011438 2224-2243

mmSox12-28 GAC CAG TGG AGC

AGA CTT GG 3’ NM_011438 2624-2605

für quantitative

RT-PCR

PLP/GFP1 CGG TCA CGA ACT

CCA GCA GG 5’ ------- -------

PLP/GFP2 GCG ACG TAA ACG

GCC ACA AG 3’ ------- -------

für Standard-

RT-PCR

Sox4-23 mm/rat TCG TGA ACT GCA

ATC GAC TG 5’ XM_344594 321-340

Sox4-24 mm/rat CGC GTT GTT GGT

CTG TTG TA 3’ XM_344594 677-658

quant./ erkennen

Transkripte des

Sox4-Gens und

Sox4-Transgens

Sox4-25 mm/rat AGC TTC TTG GCT

TCC TAC CT 5’ NM_009238 168-187

Sox4-26 mm/rat TTG GTA GCC GGA

GTA TCT TC 3’ NM_009238 428-409

für quantitative

RT-PCR

Material

91

5.6 PLASMIDE

Gen Plasmid Verwendung kloniert/ erhalten

von

mmSox12 (ORF) pBKS Vorlage für die Klonierung und für die

in situ Sonde M. Hoser

Sox12up-8,4kb 5.2 pBKS Vorlage für die 5’-Southern-Sonde M. Hoser

mmSox4 pCING-B in ovo Elektroporation E. Sock

mmSox11 pCING-B in ovo Elektroporation E. Sock

mmSox12 pCING-A in ovo Elektroporation E. Sock

rnSox4 pCMV5 Transfektionen, Zellextrakte E. Sock

rnSox11 pCMV5 Transfektionen, Zellextrakte E. Sock

mmSox12 (ORF) pCMV5 Transfektionen, Zellextrakte M. Hoser

delta-Sox4rat pET28a für die Peptidsynthese M. Hoser

delta-Sox11rat pET28c für die Peptidsynthese M. Hoser

delta-Sox12mouse pET28a für die Peptidsynthese M. Hoser

5.7 IN SITU SONDEN

Gen Plasmid Linearisierung

für antisense

RNA-

Pol.

Genbank-

Ref. Position

kloniert

von

rnSox4 pZL1-Sox4 BglII SP6 XM_344594 2015-3142 E. Sock

rnSox11 pZL1-Sox11 BglII SP6 NM_053349 543-2035 E. Sock

mmSox12 pBKS-

mmSox12 BglII T7 NM_011438 559-1293 M. Hoser

mmSox12-

3’UTR

pBKS-Sox12-

3’UTR XhoI T7 NM_011438 1932-2620 M. Hoser

Material

92

5.8 SOUTHERN-BLOT -SONDEN

Name Sonde Länge Herkunft

5’-Sonde PCR-Produkt; Primer mmSox12-11/12 320 bp pBKS-Sox12up-8,4kb 5.2

3’-Sonde Spaltung mit BamHI/PstI 581 bp pBKS-Sox12-3’South-

Sonde 4

5.9 ANTIKÖRPER

Die im Folgenden aufgelisteten Antikörper und -konjugate wurden für Western-Blot (WB),

Gelshift (GS), Immuncytochemie (ICC) bzw. Immunhistochemie (IHC) verwendet.

5.9.1 Primärantikörper

Antigen Bezeichnung Spezies Anw. Verd. Herkunft

α-acetyliertes

α-Tubulin C3B9 Maus, monoklonal IHC 1:100

K. Gull, Uni

Oxford, UK

α-acetyliertes

α-Tubulin

6-11B-1

T 6793 Maus, monoklonal WB 1:2000

Sigma, St. Louis,

MO

α-B-FABP ------- Kaninchen,

Antiserum

IHC

ICC

1:10.000

1:40.000

T. Müller, MDC,

Berlin

α-Brn2 α-Brn2-ET Kaninchen,

Antiserum

WB

GS

1:2000

0,2 µl

M. Wegner,

Erlangen

α-Calbindin

D28k CB-38

Kaninchen,

Antiserum IHC 1:3000

Swant, Bellinzona,

Schweiz

α-Calretinin 7699/4 Kaninchen,

Antiserum IHC 1:2000

Swant, Bellinzona,

Schweiz

α-DIG-AP-

konj. 1093 274

Schaf Fab-

Fragmente in situ -------

Roche Diagnostics,

Mannheim

α-DIG-

Rhodamin S7165 ApopTag Red Kit TUNEL -------

Serologicals/QBio-

gene, Heidelberg

α-GFAP G-A-5

MAB3402 Maus, monoklonal

IHC

ICC

1:1000

1:4000

Millipore,

Temecula, CA

Material

93

Antigen Bezeichnung Spezies Anw. Verd. Herkunft

α-GFP 1 814 460 Maus, monoklonal IHC 1:100 Roche Diagnostics,

Mannheim

α-GFP A11122 Kaninchen,

Antiserum

IHC

ICC

1:500

1:2000

Molecular Probes,

Göttingen

α-Ki67 RM-9106 Kaninchen,

monoklonal IHC 1:500

Lab Vision,

Fremont, CA

α-MAP2 M1406 Maus, monoklonal ICC 1:500 Sigma, St. Louis,

MO

α-NeuN MAB377 Maus, monoklonal IHC 1:500 Millipore,

Temecula, CA

α-Oct6 5499

(α-Tst-1)

Kaninchen,

Antiserum

IHC

WB

1:1000

1:3000 M. Wegner

α-Pax2 71-6000 Kaninchen,

Antiserum IHC 1:200

Zymed, San

Francisco, CA

RC2 ------- Maus, monoklonal,

IgM IHC 1:200

DSHB, Uni Iowa,

USA

α-RORα sc-6062 Ziege, Antiserum IHC 1:100 Santa Cruz Biotech.,

Santa Cruz, CA

α-SoxB1 ------- Kaninchen,

Antiserum IHC 1:500

Hisato Kondoh, Uni

Osaka, Japan

α-Sox4 α-Sox4 gp2

8°

Meerschweinchen,

Antiserum

IHC

WB

1:1000

1:3000 M. Hoser, Pineda

α-Sox9 O9-1 aff.pur. Kaninchen,

Antiserum, aff.-pur. IHC 1:2000 E. Sock, Pineda

α-Sox10 α-Sox10-1 gp Meerschweinchen,

Antiserum IHC 1:1000 E. Sock, Pineda

α-Sox11 α-Sox11 gp2

3°

Meerschweinchen,

Antiserum

IHC

WB

1:1000

1:3000 M. Hoser, Pineda

α-Sox12 α-Sox12

Nterm rb2 aff

Kaninchen,

Antiserum, aff.-pur. IHC 1:1000 Pineda

α-Sox12 α-Sox12 Nt

gp2

Meerschweinchen,

Antiserum

WB

GS

1:3000

0,2 µl Pineda

α-Tuj1 MMS-435P Maus, monoklonal IHC

ICC

1:5000

1:20.000

Covance, Denver,

PA

Material

94

5.9.2 Sekundärantikörper

Antigen Spezies Konjugat Anwendung Verd. Herkunft

α-Kaninchen Ziege Cy2

Cy3 IHC, ICC

1:100

1:200

Dianova,

Hamburg

α-Maus Ziege Cy2

Cy3 IHC, ICC

1:100

1:200

Dianova,

Hamburg

α-Maus IgM Ziege Alexa Fluor 546 IHC 1:500 Mol. Probes,

Göttingen

α-Meerschweinchen Ziege Cy2

Cy3 IHC

1:100

1:200

Dianova,

Hamburg

α-Maus Ziege HRP WB 1:3000 Biorad,

München

ProteinA ------- HRP WB 1:3000 Biorad,

München

Methoden

95

6 Methoden

6.1 TIERHALTUNG

Die Mäuse wurden gemäß dem Tierschutzgesetz (TSchG) artgerecht gehalten. Um das Sox12-

-Allel zu generieren, wurden die chimären Tiere mit der EIIa-Cre-Mauslinie (C57BL/6J)

(Lakso et al., 1996) verpaart. Die Sox12--Mäuse wurden im heterozygoten Zustand mit dem

Wildtyp-Inzucht-Stamm FVB/N (bezogen von Charles River Deutschland, Sulzfeld)

weitergezüchtet. Zur Erzeugung von Sox12-/--Tieren wurden heterozygote Tiere untereinander

verpaart. Die Analysen der Sox12-Mausmutanten wurden in dieser Arbeit mit den Nach-

kommen der zweiten bis vierten Generation (F2-F4) durchgeführt. Die GFAP-Sox4-

transgenen Tiere basieren ebenfalls auf Verpaarungen mit dem Wildtyp-Inzucht-Stamm

FVB/N (bezogen von Charles River Deutschland, Sulzfeld).

6.2 ZELLKULTURMETHODEN

6.2.1 Transfektion von DNA in eukaryontische Zellen

Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Zelllinien wurden in DMEM- (+ Glutamax I;

Gibco/BRL, Eggenstein) Medium in Gegenwart von 10 % fötalem Kälberserum (FKS) sowie

100 U/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin kultiviert und je nach Zelllinie alle drei bis

fünf Tage im Verhältnis 1:3 bis 1:10 verdünnt. Das Ablösen der adhärenten Zellen zur

Subkultivierung erfolgte durch Inkubation mit Trypsin-EDTA (Gibco/BRL, Eggenstein). Die

Inkubation der Zellkulturplatten fand bei 37 °C in einer 5 %igen CO2-Atmosphäre statt.

6.2.1.1 Transfektion von Säugerzellen mit Polyethylenimin (PEI)

Transiente Transfektionen von HEK293-Zellen zur Luciferase-Aktivitätsmessung wurden in

3,5 cm Zellkulturplatten (Sarstedt, Nümbrecht) durchgeführt. Die entsprechenden Mengen

Luciferase-Reporter- und Effektor-Plasmid wurden in 500 µl serumfreiem DMEM-Medium

gelöst. Nach Zugabe von 6 µl 1 x PEI (Sigma, München) wurden die Ansätze gut durchmischt,

10 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 250 µl pro Zellkulturplatte in das

Medium der Zellen gegeben. Nach 48 h wurden die Zellen geerntet und für den Luciferasetest

verwendet (siehe 6.2.2).

Methoden

96

Transiente Transfektionen von HEK293-Zellen zur Gewinnung rekombinanter Proteine

erfolgte in 10 cm Zellkulturplatten (Sarstedt, Nümbrecht). 10 µg CMV-Expressionsplasmid

wurden in 500 µl serumfreiem DMEM-Medium gelöst. Nach Zugabe von 30 µl 1 x PEI

wurden die Ansätze gut durchmischt, 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend

in das Medium der Zellen gegeben. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet

und Proteinextrakte hergestellt (siehe 6.4.2).

6.2.1.2 Transfektion von Säugerzellen mit Superfect

Transiente Transfektionen von Neuro2a-Zellen zur Luziferase-Aktivitätsmessung erfolgten

unter Verwendung von SuperFect (Qiagen, Hilden) nach den Angaben des Herstellers in

3,5 cm Zellkulturplatten. Ab der Transfektion wurden die Zellen in DMEM mit 5 % FKS

kultiviert. Die mit den entsprechenden Mengen Luziferase-Reporter- und Effektor-Plasmid

transfizierten Zellen wurden nach 48 h geerntet und für den Luziferasetest verwendet (siehe

6.2.2).

6.2.2 Luciferase-Aktivitätstest

Nachdem das Medium von den Zellkulturplatten (3,5 cm) abgesaugt worden war, wurden je

200 µl Luziferase-Lysispuffer gleichmäßig auf den Platten verteilt. Nach Lyse der Zellen

konnten je 150 µl der Zellextrakte in Luminometerröhrchen überführt werden. Die Messung

wurde mit dem Luminometer Lumat LB 9501 (Berthold, Bad Wildbad) und 0,5 mM Luciferin

(Serva, Heidelberg) in 5 mM Kaliumphosphat, pH 7,8 durchgeführt. Nach automatischer

Injektion von 100 µl Luciferinlösung wurden die relativen Lichteinheiten direkt bestimmt.

6.2.3 Präparation primärer cerebellärer Kulturen

Für die Kultivierung der primären cerebellären Zellen wurden 24-Well-Zellkulturplatten (TPP,

Trasadingen, Schweiz) mit Glasplättchen versehen und mit einer Poly-L-Lysin-Lösung

(200 µg/ml in PBS) über Nacht bei RT unter sterilen Bedingungen beschichtet. Tags darauf

wurden die einzelnen Wells dreimal mit sterilem H2O gewaschen und unter der Sterilbank ca.

1 h getrocknet.

Für die Herstellung primärer cerebellärer Kulturen wurden die Cerebella von Mäusen am

Postnatalstadium P9 verwendet. Unter mehrmaligem Wechsel der kalten Hanks-Lösung und

der 5 cm Kulturschalen wurden die Cerebella herauspräpariert und von den Meningen befreit.

Methoden

97

Anschließend wurde das Gewebe mechanisch zerkleinert und für 15 min bei 37 °C mit 10 ml

0,1 % Trypsin-EDTA in PBS behandelt. Die Zellsuspension wurde in 20 ml 15 % FKS in

PBS überführt, durch ein Zellsieb (250 µm) filtriert und das Filtrat für 10 min bei RT und

1200 Upm in einer Eppendorf Centrifuge 5810 R (Eppendorf, Hamburg) abzentrifugiert. Das

Zellpellet wurde in 5 ml Neurobasal-Medium (Gibco/BRL, Eggenstein), das mit 2 % B-27

Supplement und 2 mM Glutamax (Gibco/BRL, Eggenstein) versetzt war, resuspendiert und

die Zellzahl mit einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Schließlich wurden 2 x 105 Zellen in

die mit Glasplättchen versehenen und beschichteten Vertiefungen (siehe oben) einer 24-Well-

Zellkulturplatte gegeben. Nach 24 h wurde das Medium einmal gewechselt und die Zellen für

weitere sieben Tage kultiviert.

6.2.4 Immuncytochemie von primären cerebellären Kulturen

Nach Absaugen des Mediums wurden die auf Glasplättchen kultivierten primären

cerebellären Zellen ( 6.2.3) bei RT 15 min mit 3 % Paraformaldehyd in PBS fixiert und

anschließend dreimal mit PBS gewaschen. Zur Unterdrückung der Eigenfluoreszenz wurden

die Kulturen für 5 min mit 100 mM NH4Cl in PBS inkubiert. Nach zweimaligem Waschen für

je 2 min mit PBS wurden die Zellen mit 0,1 % Triton-X100 in PBS für 3 min permeabilisiert

und umgehend dreimal mit PBS gewaschen. Danach wurde für 1-2 h mit 10 % FKS,

1 % BSA in PBS blockiert. Es folgte eine einstündige Inkubation des Primärantikörpers

(Verdünnung in PBS mit 10 % FKS und 1 % BSA). Überschüssiger Antikörper wurde durch

sechsmaliges Waschen mit PBS von den Zellen entfernt und der jeweilige

fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper in PBS (10 % FKS, 1 % BSA) auf die Zellen

gegeben. Die Inkubation erfolgte im Dunkeln für 1 h. Nach erneutem sechsmaligem Waschen

wurde eine zweiminütige Kernfärbung mit DAPI (0,5 µg/ml in PBS; Sigma, München)

durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen dreimal in PBS gewaschen. Die Deckgläschen

wurden zur Konservierung und Dokumentation mit Mowiol (Calbiochem/Merk Biosciences,

Bad Sonden) eingedeckt. Nach dem Aushärten erfolgte die Dokumentation mit einem

inversen Fluoreszenzmikroskop (DMIRB, Leica Microsystems, Bensheim) und einer

gekühlten SPOT-CCD-Kamera (Diagnostic Instruments, Michigan, USA) und die

Auswertung mittels IPLab- und Adobe Photoshop Software.

Methoden

98

6.3 ALLGEMEINE MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN

6.3.1 Standardmethoden

Standardmethoden wie die Isolierung von Plasmid-DNA in analytischem und präparativem

Maßstab, Reinigung von Nukleinsäuren durch Phenolextraktion und Ethanolfällung,

Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren, Gelelektrophoretische Auftrennung von

Nukleinsäuren, Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen, Spaltung von DNA mit

Restriktions-Endonukleasen, Modifikation von DNA-Enden, Ligation von DNA-Fragmenten

in linearisierte Plasmidvektoren und Transformation von DNA in E. coli wurden allgemeinen

Methodensammlungen entnommen (Ausubel et al., 2002; Sambrook et al., 2001).

6.3.2 Isolierung von genomischer DNA aus Schwanz- oder Choriongewebe

Zur Genotypisierung der verschiedenen Mauslinien wurde den Tieren im Alter von

3-6 Wochen ein etwa 3 mm langes Schwanzstück abgenommen. Bei der Präparation von

Embryonen wurde ein Teil des Dottersacks oder ein kleines Stück Schwanz aufbewahrt. Die

Gewebebiopsie wurden in 250 µl Tail-Lysispuffer und 10 µl Proteinase K (16 mg/ml, Roth,

Karlsruhe) bei 55 °C unter ständigem Schütteln für 1-2 h lysiert. Danach wurde die DNA mit

200 µl Isopropanol gefällt und 10 min bei 13.200 Upm in einer Tischzentrifuge (Centrifuge

5415 D, Eppendorf, Hamburg) abzentrifugiert. Nach dem Waschen des DNA-Pellets in

500 µl 70 % Ethanol wurde es getrocknet und anschließend in 300-600 µl H2O aufgenommen.

Von dieser genomischen DNA-Lösung wurden 0,5-1 µl für die verschiedenen Geno-

typisierungs-PCR-Reaktionen verwendet.

6.3.3 Isolierung hochreiner genomischer DNA aus Schwanzgewebe

Zur Isolierung hochreiner genomischer DNA für den Einsatz im Southern-Blot wurde den

Mäusen ein etwa 5 mm langes Schwanzstück abgenommen. Die Gewebebiopsie wurde in

500 µl Digestion-Puffer mit 2,5 µl RNase A (10 mg/ml, Roche Diagnostics, Mannheim) und

5 µl Proteinase K (16 mg/ml, Roth, Karlsruhe) bei 55 °C unter leichtem Schütteln 2 h bis über

Nacht lysiert. Zur Proteinextraktion wurden 500 µl Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol

(25: 24: 1) zugegeben, kurz geschüttelt und zur Phasentrennung 5 min bei 13.200 Upm in

einer Tischzentrifuge (Centrifuge 5415 D, Eppendorf, Hamburg) zentrifugiert. Der Überstand

Methoden

99

wurde vorsichtig abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Anschließend

wurden nochmals 500 µl Phenol:Chlorophorm:Isoamylalkohol zugefügt, 30-60 min kopfüber

rotiert und die Phasen durch Zentrifugation getrennt. Nach Abnahme des DNA-haltigen

Überstandes wurde das gleiche Volumen an Chlorphorm:Isoamylalkohol (24: 1) zugesetzt

und nach kurzem Schütteln 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues

Reaktionsgefäß überführt und die DNA durch Zugabe von 0,1 Vol 3 M Natriumacetat (pH 5,2)

und 2,5 Vol reinen Ethanols präzipitiert. Nach Zentrifugation für 10 min bei 13.200 Upm

wurde die sedimentierte DNA mit 70 % Ethanol gewaschen. Es erfolgte das Trocknen des

DNA-Pellets, das anschließend in einem geeigneten Volumen 1 mM Tris-Puffer (pH 8,5)

resuspendiert wurde.

6.3.4 Präparation von Gesamt-RNA

Aus verschiedenen Geweben von Mäusen unterschiedlicher Entwicklungsstadien wurde

Gesamt-RNA isoliert. Die Gewebe wurden zügig herauspräpariert, in Trizol (1 ml Trizol pro

50-100 mg Gewebe; Invitrogen, Karlsruhe) überführt und mit einem Polytron PT1200C-

Homogenisator (Kinamatica AG, Littau, Schweiz) homogenisiert. Nach 5 min Inkubation bei

RT wurden 0,2 ml Chlorophorm pro ml Trizol zugegeben, 15 s kräftig geschüttelt und für

weitere 3 min bei RT inkubiert. Danach wurde die Probe je nach Volumen für 15 min bei

4 °C und 11.000 Upm in einer Heraeus Sepatech Biofuge B Zentrifuge (Heraeus, Hanau) bzw.

bei 10.000 Upm in einer Sorvall RC 5B Plus Zentrifuge mit SS-34-Rotor (Kendro,

Rodenbach) zentrifugiert. Die obere, wässrige Phase wurde in ein frisches Reaktiongefäß bzw.

Polypropylen-Röhrchen (Greiner, Solingen) überführt, mit 0,5 ml Isopropanol pro

eingesetztem ml Trizol versetzt, gut gemischt, für 10 min bei RT inkubiert und erneut 10 min

zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurde das RNA-Pellet getrocknet und in

RNase-freiem Wasser (Roth, Karlsruhe) resuspendiert. Anschließend konnte die

Konzentration der RNA-Lösung photometrisch mit Hilfe eines UltroSpec 3000 UV-

Photometers (Pharmacia Biotech, Freiburg) bestimmt werden.

Methoden

100

6.3.5 Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels Polymerase-Kettenreaktion

Mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) konnten spezifische DNA-Fragmente hergestellt

werden. Dafür wurde folgender Standardansatz verwendet:

Reagenz Menge

Matrizen-DNA 10-100 ng

10 x-Reaktionspuffer +/- (NH4)2SO4 (MBI-Fermentas, St. Leon-Roth) 5 µl

MgCl2 (25 mM) 3 µl

dNTP-Mix (je 2,5 mM) 4 µl

DMSO 0-5 µl

forward Primer (40 pmol/µl) 2 µl

reverse Primer (40 pmol/µl) 2 µl

Taq-DNA-Polymerase (2,5 U/µl) (MBI-Fermentas, St. Leon-Roth) 1 µl

ddH2O ad 50 µl

Die Proben wurden in ein 0,2 ml PCR-Reaktionsgefäß gegeben und durchliefen in einem T3-

Thermocycler (Biometra, Göttingen) folgendes Standardprogramm:

Programmpunkt Variablen Zyklen

Initiale Denaturierung 2 min, 94 °C

Denaturierung 30 s, 94 °C

Annealing 30 s, den Primern angepasste Temperatur

Elongation 1 min/ kb Fragmentlänge, 72 °C

25-32 x

Finale Elongation 5 min, 72 °C

Kühlung 5 min, 4 °C

6.3.6 Genotypisierungs-PCR-Reaktionen

6.3.6.1 GFAP-Sox4-transgene Mäuse

Für die Genotypisierung der GFAP-Sox4-transgenen Mäuse wurden die Primer GFAP-tg1

und rnSox4-tg1 (siehe 5.5.1) im folgenden Reaktionsansatz verwendet:

Methoden

101

Reagenz Menge

Matrizen-DNA 0,5 µl

10 x-Reaktionspuffer +(NH4)2SO4 (MBI-Fermentas, St. Leon-Roth) 2 µl

MgCl2 (25 mM) 1,2 µl


DMSO 1 µl

GFAP-tg1 (40 pmol/µl) 0,2 µl

rnSox4-tg1 (40 pmol/µl) 0,2 µl

Taq-DNA-Polymerase (2,5 U/µl) (MBI-Fermentas, St. Leon-Roth) 0,4 µl

ddH2O ad 20 µl

Die Amplifikation der DNA erfolgte mit dem folgenden PCR-Programm:


Initiale Denaturierung 94 °C, 1 min

Denaturierung 94 °C, 30 s

Annealing 30 s, 60 °C

Elongation 30 s, 72 °C

35 x


6.3.6.2 Sox12--Mäuse

Für die Genotypisierung der Sox12--Mäuse wurden die Primer mmSox12-19, mmSox12-20

und mmSox12-21 (siehe 5.5.2) im folgenden Reaktionsansatz verwendet:

Reagenz Menge

Matrizen-DNA 0,5 µl

10 x-Reaktionspuffer +(NH4)2SO4 (MBI-Fermentas, St. Leon-Roth) 2 µl

MgCl2 (25 mM) 1,2 µl


DMSO 2 µl

mmSox12-19 (40 pmol/µl) 0,3 µl



Taq-DNA-Polymerase (2,5 U/µl) (MBI-Fermentas, St. Leon-Roth) 0,4 µl

ddH2O ad 20 µl

Methoden

102

Die Amplifikation der DNA erfolgte mit dem folgenden PCR-Programm:


Initiale Denaturierung 94 °C, 2 min

Denaturierung 94 °C, 30 s

Annealing 30 s, 62 °C

Elongation 30 s, 72 °C

35 x


6.3.7 Reverse Transkription und RT-PCR

Mittels der Reversen Transkription wurde aus 2 µg Gesamt-RNA cDNA hergestellt. Dafür

wurde die RNA in 14 µl RNase-freiem Wasser (Roth, Karlsruhe) verdünnt. Nach Zugabe von

1 µl Oligo(dT)-Primer (100 pmol/µl) wurde der Ansatz für 10 min bei 70 °C inkubiert und

anschließend auf Eis abgekühlt. Danach wurden 2,5 µl 10 x Reverse Transkriptase Puffer

(New England Biolabs, Frankfurt), 2 µl dNTP-Mix (je 2,5mM), 4,5 µl RNase-freies Wasser

(Roth, Karlsruhe), sowie 1 µl M-MuLV Reverse Transkriptase (200 U/µl; New England

Biolabs, Frankfurt) zugegeben und 1 h bei 37 °C inkubiert. Abschließend erfolgte eine

fünfminütige Inaktivierung bei 70 °C. Für die RT-PCR-Analysen wurden in der Regel 0,5 µl

cDNA in einem Reaktionsansatz mit einem Endvolumen von 25 µl eingesetzt.

Für quantitative RT-PCR-Analysen wurde eine Rapid Cycle Real-Time PCR mit Hilfe eines

LightCyclers (Roche Diagnostics, Mannheim) durchgeführt. Dabei bindet in jedem Zyklus

der DNA-Synthese ein Farbstoff an das amplifizierte PCR-Produkt, das somit anhand seiner

Fluoreszenz detektiert werden kann. In einem 10 µl Ansatz wurden 0,2-0,5 µl cDNA mit

0,5 µl Primer 1 (10 pmol/µl), 0,5 µl Primer 2 (10 pmol/µl), 1 µl DMSO (kein DMSO bei

Verwendung der Primer mmSox11-60/61) und 2 µl Fast Start DNA Master SYBR Green I –

Mix (Roche Diagnostics, Mannheim) gemischt. Der Fast Start DNA Master SYBR Green I –

Mix enthält den Farbstoff und die Taq-DNA-Polymerase. Das PCR-Programm bestand aus 4

Schritten: Denaturierung (8 min 95 °C), Amplifikation (45 Zyklen aus: 0 sec 95 °C, 7 sec 56-

60 °C, 20 sec 72 °C), Schmelzkurve (0 sec 95 °C, 10 sec 66 °C, 5 min ansteigend bis 95 °C

bei 0,1 °C/sec) und Kühlung (5 sec 40 °C). Die Auswertung erfolgte unter Verwendung der

LightCycler Software (Version 3.5), wobei über β-Aktin normalisiert wurde.

Methoden

103

6.3.8 DIG-Markierung von cRNA-Sonden mittels in vitro Transkription

Zur gezielten Detektion einer mRNA durch nicht-radioaktive in situ Hybridisierung wurde

eine komplementäre RNA als Sonde verwendet. Dazu wurde eine cDNA-Sequenz der zu

detektierenden mRNA in ein Plasmid eingefügt, dessen multiple Klonierungstelle von

Promotoren einer RNA-Polymerase (T3, T7 oder SP6) flankiert ist. Für die Transkription

einer komplementären RNA-Sonde wurden 10 µg Plasmid-DNA stromaufwärts der cDNA-

Sequenz mit einem geeigneten Restriktionsenzym (am besten mit 5’-Überhang) gespalten.

Die linearisierte DNA wurde mit Hilfe des High Pure PCR Product Purification Kits (Roche

Diagnostics, Mannheim) nach den Herstellerangaben aufgereinigt.

1 µg linearisierte, aufgereinigte DNA wurde für die in vitro Transkription mit dem DIG RNA

Labeling Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) verwendet. Entsprechend den Angaben des

Herstellers wurde die DNA in einem Reaktionsansatz von 20 µl mit 2 µl

10 x Transkriptionspuffer, 2 µl DIG RNA Labeling Mix, 0,5 µl RNase Inhibitor (40 U/µl) und

2 µl der entsprechenden RNA-Polymerase (T3, T7 oder SP6) versetzt. Nach einer Inkubation

von 3 h bei 37 °C erfolgte der Abbau der DNA-Matrize durch Zugabe von 2 µl DNase I für

15 min bei 37 °C. Anschließend wurde die Reaktion mit 2 µl 0,2 M EDTA pH 8,0 abgestoppt.

Die DIG-markierte cRNA wurde mit Hilfe der mini Quick Spin Columns (Roche Diagnostics,

Mannheim) nach den Angaben des Herstellers aufgereinigt, mit RNase-freiem Wasser (Roth,

Karlsruhe) auf ein Volumen von 50 µl aufgefüllt, mit 50 µl Formamid versetzt, aliquotiert

und bei –80 °C gelagert. Die Qualität der RNA-Sonde wurde durch Agarose-Gelelektro-

phorese überprüft.

6.3.9 Radioaktive Markierung von DNA durch „Random Primer“

Die Markierung von Sonden für die Hybridisierung mit DNA nach dem Southern-Blot (siehe

6.3.10.1) erfolgte mit dem Random Primer DNA Labeling System (Gibco/BRL, Eggenstein).

Dafür wurden 40 ng DNA mit H2O auf 23 µl aufgefüllt und durch fünfminütiges Kochen

denaturiert. Danach wurde der Ansatz sofort auf Eis abgekühlt, wodurch ein Rehybridisieren

der Einzelstränge verhindert werden sollte. Es folgte die Zugabe von je 2 µl 0,5 mM

dATP/dGTP/dTTP, 15 µl einer Mischung aus degenerierten Primern (0,67 M HEPES, 0,17 M

Tris/HCl, 17 mM MgCl2, 33 mM 2-Mercaptoethanol, 1,33 mg/ml BSA, 18 OD260 Einheiten

pro ml Oligodesoxyribonukleotid-Primer Hexamere, pH 6,8), 5 µl α-32P-dCTP (10 µCi/µl,

Amersham, Braunschweig) sowie 1 µl Klenow-Enzym (2,5 U/µl). Der Ansatz wurde 1 h bei

Methoden

104

RT inkubiert und nach Angaben des Herstellers durch mini Quick Spin Columns (Roche

Diagnostics, Mannheim) zentrifugiert. Dadurch konnte die Reaktion abgestoppt und die freien

(radioaktiven) Nukleotide abgetrennt werden. Abschließend wurde 1 µl der Sonde im

Szintillationszähler (Tri-Carb 2800TR, Perkin Elmer) vermessen.

6.3.10 Identifizierung von DNA-Fragmenten durch Hybridisierung

6.3.10.1 DNA-Transfer von Agarose-Gelen auf Membranen (Southern-Blot)

Genomische DNA wurde nach entsprechendem Restriktions-Verdau auf ein mit TAE-Puffer

hergestelltes 0,7 %iges Agarose-Gel aufgetragen und aufgetrennt (TAE-Puffer-System). Zur

Vorbereitung für einen alkalischen Southern-Blot erfolgte eine Bestrahlung des Gels mit UV-

Licht (0,005 J) im UV-Crosslinker BLX-254 (Vilber Lourmat, Marne la Vallee, Frankreich).

Dabei werden die DNA-Fragmente gespalten und so deren Transfer erleichtert. Durch

zweimalige Inkubation des Gels für 20 min in Denaturierungslösung wurde die DNA in

hybridisierbare Einzelstränge denaturiert. Danach wurde eine positiv geladene Nylon-

Membran (Appligene, Illkirch, Frankreich) kurz in H2O und in Denaturierungslösung

äquilibriert. Der Transfer der DNA auf die Membran erfolgte über Nacht durch Kapillarkraft

in Denaturierungslösung. Dafür wurden auf einen Stapel Haushaltspapier drei trockene und

zwei in Denaturierungspuffer äquilibrierte Whatman 3MM Papiere (Whatman, Maidstone,

USA) gelegt, auf die die angefeuchtete Nylon-Membran, das Gel und drei weitere in Puffer

äquilibrierte Whatman 3MM Papiere folgten. Nachdem mit drei feuchten Whatman 3MM

Papieren eine Brücke vom Stapel zu einem Gefäß mit Denaturierungslösung hergestellt

worden war, wurde der gesamte Aufbau mit einem Gewicht beschwert. Im Anschluß an den

Transfer wurde die Membran kurz in H2O gewaschen und für 10 min in 50 mM Natrium-

Phosphat-Puffer (pH 6,5) neutralisiert. Vor dem Hybridisieren (siehe 6.3.10.2) erfolgte die

Fixierung der transferierten DNA durch Bestrahlung der feuchten Membran im UV-

Crosslinker (0,125 J).

6.3.10.2 Hybridisierung von DNA

Die mit DNA behaftete Nylon-Membran aus dem Southern-Blot wurde in eine 100 ml

Glasröhre (Schott) gegeben und in 20 ml Prähybridisierungslösung für mindestens 1 h bei

42 °C prähybridisiert. Nach Zugabe von 5 % Dextransulfat und α-32P-dCTP markierter DNA-

Sonde (siehe 6.3.10.1; 1x 106 cpm/ml Hybridisierungslösung), die vorher für 5 min bei 96 °C

Methoden

105

denaturiert worden war, erfolgte die Hybridisierung über Nacht bei 42 °C. Danach wurde die

unspezifisch gebundene Sonde durch mehrere Waschschritte entfernt. Zunächst wurde die

Membran für 5 min bei RT in 2 x SSC mit 0,5 % SDS inkubiert, danach für 15 min bei RT in

2 x SSC mit 0,1 % SDS und zum Schluß für 30 min bei 65 °C in 0,1x SSC mit 0,1 % SDS.

Die Membran wurde in einer lichtdichten Filmkassette in Anwesenheit einer signal-

verstärkenden Folie bei -80 °C für 1-7 Tage gegen einen Biomax MS Röntgenfilm (Kodak)

exponiert.

6.4 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN

6.4.1 Proteinbestimmung nach Bradford

Die Bestimmung von Proteinkonzentrationen erfolgte nach der Methode von Bradford

(Bradford, 1976). Dabei wurden 5-20 µl der zu analysierenden Proteinlösung mit PBS auf

800 µl aufgefüllt, mit 200 µl Protein-Färbereagenz (Biorad, München) gemischt und für

10 min bei RT inkubiert. Durch Messung der Absorption bei 595 nm konnte die

Proteinkonzentration indirekt über eine Eichgerade ermittelt werden. Die Eichkurve wurde

durch Messung von BSA-Lösungen bekannter Konzentration erstellt.

6.4.2 Herstellung von Gesamt-Proteinextrakten aus eukaryontischen Zellen

Zur Herstellung eines Gesamtzellextraktes aus Säugerzellen wurden die Zellkulturplatten

zweimal mit 5 ml kaltem PBS gewaschen und die Zellen mit Hilfe eines Zellkulturspatels in

1 ml PBS abgeschabt und in ein Reaktionsgefäß überführt. Nach Pelletieren der Zellen durch

kurzes Abzentrifugieren in einer Tischzentrifuge (Centrifuge 5415 D, Eppendorf, Hamburg)

wurden diese je nach Plattengröße in 50-500 µl Zell-Lysispuffer resuspendiert. Nach

zehnminütiger Lyse der Zellen auf Eis wurde das Lysat für 10 min bei 4 °C und 11.000 Upm

in einer Heraeus Sepatech Biofuge B Zentrifuge (Heraeus, Hanau) zentrifugiert. Der

proteinhaltige Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bei -80 °C gelagert.

6.4.3 Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Mit der denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese konnten Proteine entsprechend

ihrer Größe aufgetrennt werden. Dabei wurden Gele verwendet, die sich aus einem unteren

Methoden

106

Trenngel unterschiedlicher Prozentigkeit und einem oberen 5 % igen Sammelgel

zusammensetzten. In der folgenden Tabelle ist die Zusammensetzung der Trenngele und des

Sammelgels angegeben:

Trenngel 8 % 10 % 12 % 15 % Sammelgel 5 %

40 % Acrylamid 2,4 ml 3 ml 3,75 ml 4,5 ml 40 % Acrylamid 650 µl

Lower-Tris pH 8,8 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml Upper-Tris pH 6,8 1,25 ml

20 % APS 45 µl 45 µl 45 µl 45 µl 20 % APS 15 µl

TEMED 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl TEMED 6 µl

ddH2O 6,6 ml 6 ml 5,25 ml 4,5 ml ddH2O 3 ml

Zum Gießen der Gele und für die Elektrophorese wurden Mini-PROTEAN 3-Apparaturen

(Biorad, München) benutzt. Die zu analysierenden Proteinproben wurden vor dem Auftragen

auf das Gel mit 3 x Lämmli-Probenpuffer versetzt und für 5 min bei 95 °C denaturiert. Die

Gelelektrophorese erfolgte bei 80-120 V und wurde beendet, sobald das Bromphenolblau im

Probenpuffer den unteren Gelrand erreicht hatte.

6.4.4 Western-Blot und immunologischer Nachweis von Proteinen auf Membranen

Die durch SDS-PAGE aufgetrennten Proteine (siehe 6.4.3) wurden mit einer Semi-Dry

Blotapparatur vom Typ Fastblot B-44 (Biometra, Göttingen) auf eine Protran BA 85-

Nitrozellulosemembran (Schleicher&Schüll, Dassel) transferiert. Dafür wurden sechs auf die

Gelgröße zugeschnittene Whatman 3MM Papiere (Whatman, Mainstone, USA) und die

Nitrocellulosemembran in Western-Transferpuffer getränkt. Anschließend wurden drei der

angefeuchteten Whatman 3MM Papiere auf die Anode der Apparatur gelegt. Darauf folgten

die äquilibrierte Nitrozellulosemembran, das Proteingel und drei weitere befeuchtete

Whatman-Papiere. Nach Beseitigung eventuell eingeschlossener Luftblasen wurde die

Kathodenplatte aufgelegt. Der elektrophoretische Transfer der Proteine aus dem Gel auf die

Membran erfolgte für 30 min bei 350 mA.

Nachdem die Proteine auf die Nitrocellulosemembran transferiert worden waren, wurde diese

kurz mit PBS-T gewaschen. Zur Blockierung aller möglichen unspezifischen Antikörper-

bindungsstellen auf der Membran folgte eine Inkubation über Nacht bei 4 °C in 5 %

Magermilchpulver in PBS-T. Nach kurzem Waschen der Membran mit PBS-T wurde der in

PBS-T verdünnte Primärantikörper zugegeben und für 1 h bei RT inkubiert. Anschließend

Methoden

107

wurde ungebundener Primärantikörper durch dreimaliges Waschen der Membran mit PBS-T

für je 15 min bei RT entfernt. Es folgte eine Inkubation des in PBS-T verdünnten HRP-

gekoppelten Sekundärantikörpers für 25-45 min bei RT. Danach wurde nicht gebundener

Sekundärantikörper durch dreimaliges Waschen mit PBS-T für je 20 min beseitigt. Für die

Detektion der Protein-Antikörper-Komplexe wurde das ECL-Reagenz verwendet, welches für

eine Minute auf die Membran gegeben wurde. Danach wurde ein Röntgenfilm (Fuji Super RX)

für 30 s bis 5 min bei RT aufgelegt und dieser anschließend mit einem Röntgenfilmentwickler

(Kodak X-OMat 1000) entwickelt.

6.4.5 Bakterielle Expression und Aufreinigung von His6-Tag-Fusionsproteinen

Der pET-Expressionsvektor wurde in den E. coli Stamm BL21 (DE3) pLysS transformiert

und auf LB-Platten mit Kanamycin (50 µg/ml) ausplattiert. Von diesen Platten wurde ein

Einzelklon in 60 ml LB-Medium mit Kanamycin (50 µg/ml) gegeben und über Nacht bei

37 °C geschüttelt. Am nächsten Morgen wurden 1050-1500 ml LB-Medium mit Kanamycin

(50 µg/ml) mit 45-60 ml Vorkultur versetzt und bis zum Erreichen einer OD600 von 0,8 bei

37 °C geschüttelt. Sobald die passende optische Dichte erreicht war, wurden den Kulturen zur

Induktion der Genexpression 1M IPTG (Endkonzentration: 1,5 mM) zugesetzt und diese für

5 h bei 16 °C (für das Sox4-Peptid) oder für 4 h bei 37°C (für das Sox11-Peptid) geschüttelt.

Anschließend wurde die Bakteriensuspension für 15 min bei 4 °C und 5.000 Upm

zentrifugiert (Zentrifuge RC 5B Plus, Rotor SLA 3000, Sorvall). Das Bakterienpellet wurde

in 7 ml Puffer A pro 100 ml Kultur resuspendiert und über Nacht bei RT unter Schütteln

lysiert. Es folgte die Zentrifugation (Zentrifuge RC 5B Plus, Rotor SLA 1500, Sorvall) des

Bakterienlysats für 45 min bei 8.500 Upm. Währenddessen wurden 4-5 ml Ni2+-NTA-

Agarose (50 % v/v; Qiagen, Hilden) zweimal mit je 10 ml Puffer A gewaschen. Anschließend

wurde der Überstand des Bakterienlysats zu der gewaschenen Ni2+-NTA-Agarose gegeben

und mindestens 4 h bei RT rotiert. Nach erneutem Zentrifugieren (30-40 min, RT, 2.000 Upm

in der Eppendorf Centrifuge 5810 R, Hamburg) wurde das Ni2+-NTA-Agarose-Pellet fünfmal

mit je 26 ml Puffer B pH 8,0 und dreimal mit je 26 ml Puffer B pH 6,6 gewaschen. Die

Elution der über den His6-tag gebundenen Proteine erfolgte viermal mit je ca. 3 ml Puffer B

pH 4,5.

Die Expression und Aufreinigung der His6-Tag-Proteine konnten auf einem denaturierenden

SDS-Polyacryamidgel kontrolliert werden. Dazu wurde das Proteingel nach der Elektro-

Methoden

108

phorese für mindestens 1 h bei RT in Coomassie-Färbelösung geschwenkt. Zur Entfernung

des nicht gebundenen Farbstoffes wurde das Gel in Entfärbelösung gewaschen.

Die Eluate wurden mehrmals über Nacht bei 4 °C gegen PBS dialysiert. Anschließend wurde

die Proteinkonzentration der Dialysefraktionen vermessen und 1,5 mg des Proteins zur

Herstellung polyklonaler Antikörper in Meerschweinchen, Kaninchen bzw. Ratten nach

Standardprotokoll verwendet (Pineda-Antikörper-Service, Berlin).

6.5 HISTOLOGISCHE METHODEN

6.5.1 Gewebepräparation

Die Embryonen wurden im gewünschten Entwicklungsstadium per Kaiserschnitt aus dem

Bauchraum der Mutter entnommen und auf Eis in PBS präpariert. Je nach Alter wurden die

Embryonen 2-4 h oder über Nacht bei 4 °C in 4 % PFA in PBS fixiert. Für eine bessere

Penetration des Fixativs wurden ältere Embryonen enthauptet und gehäutet.

Mäuse im postnatalen Entwicklungsstadium wurden über ihren Blutkreislauf mit einem

Fixativ perfundiert. Dafür wurden die Tiere durch Injektion einer Ketamin-Rompun-

Mischung betäubt und anschließend ihr Brustkorb geöffnet. Nach Freilegung des Herzens

wurde eine Kanüle in die linke Herzkammer eingeführt. Als erstes wurde eine 0,9 % NaCl-

Lösung mit Heparin (1:1000) in den Blutkreislauf gespült. Durch einen Schnitt in die Vena

cava konnten Blut und Lösungen nach Passage durch den Körperkreislauf abfließen. Nach

Durchspülen mit 0,9 % NaCl-Lösung ohne Heparin erfolgte die Fixierung des Gewebes mit

4 % PFA in PBS. Anschließend wurden die gewünschten Gewebe herauspräpariert und über

Nacht in 4 % PFA in PBS bei 4 °C nachfixiert.

Die Präparation der Huhn-Embryonen erfolgte 24 h bzw. 48 h nach dem Elektroporations-

ereignis. Anschließend wurde das Gewebe für ca. 1 h mit 4 % PFA in PBS fixiert.

Zur Herstellung von Gefrierschnitten wurden die Huhn-Embryonen nach dem Fixiervorgang

etwa zweimal für die Dauer von 15 min, die Maus-Embryonen mindestens viermal (15 min)

und die postnatalen Gewebe mindestens sechsmal (30 min) in PBS auf Eis gewaschen.

Danach erfolgte die Inkubation der Gewebe über Nacht bis 3 Tage in 30 % Sucrose in PBS

bei 4 °C. Anschließend wurden die Gewebe in Gefriermedium (Jung HistoService, Nussloch)

eingebettet, auf Trockeneis eingefroren und bei -80 °C gelagert. Mit dem Cryostat CM 3050 S

(Leica Microsystems, Nussloch) wurden 10-14 µm Gefrierschnitte angefertigt, auf

HistoBond-Adhäsions-Objektträger (Jung HistoService, Nussloch) aufgeschmolzen und für

Methoden

109

mindestens 2 h bei RT getrocknet. Dann wurden die Objektträger in Gefrierboxen bei -80 °C

gelagert.

Zur Herstellung von Paraffinschnitten wurden die postnatalen Gewebe nach dem Fixieren für

mehrere Tage in Leitungswasser bei 4 °C gewaschen. Währenddessen erfolgte ein

mehrmaliger Austausch der Flüssigkeit. Anschließend wurde das Gewebe in einer

aufsteigenden Ethanolreihe (30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, jeweils mindestens 2,5-4,5 h)

dehydriert. In 70 % Ethanol konnte das Gewebe bis zum Einbetten in Paraffin bei 4 °C

gelagert werden. Für die Paraffineinbettung wurde das Gewebe 20-30 min in 90 % Ethanol,

zweimal für jeweils 20-30 min in 96 % Ethanol, zweimal für jeweils 20-30 min in reinem

Ethanol und dreimal für jeweils 20-30 min in Xylol inkubiert. Danach wurde das Gewebe

dreimal (20-30 min, 30-60 min und 60 min bis über Nacht) mit flüssigem Paraffin (bei ca.

60 °C) infiltriert und in Paraffin eingebettet. Die Paraffinblöcke konnten bis zur weiteren

Verwendung bei RT gelagert werden. Die Herstellung von 10 µm Paraffinschnitten und die

immunhistochemischen und histologischen Färbungen auf diesen Schnitten wurden in der

Arbeitsgruppe von S. Baader am Institut für Anatomie und Zellbiologie (Bonn) durchgeführt.

6.5.2 In situ Hybridisierung

Die in situ Hybridisierung wurde auf 14 µm Gefrierschnitten (siehe 6.5.1) durchgeführt. Die

Schnitte wurden in der Gefrierbox aufgetaut und die Objektträger anschließend zum

Befeuchten jeweils mit ca. 1 ml Hybridisierungspuffer ohne Dextransulfat und ohne Yeast-

RNA überschichtet. Die DIG-markierte cRNA wurde 5 min bei 95 °C denaturiert und sofort

wieder auf Eis gestellt. Nach einer Verdünnung der Sonde in Hybridisierungspuffer (1:100)

wurde diese nochmals 10 min bei 70 °C denaturiert und anschließend auf Eis gelagert. 120 µl

der denaturierten Sonde wurden auf die Objektträger gegeben und mit einem Deckglas

bedeckt. Die Hybridisierung erfolgte in einer mit 50 ml Waschlösung getränkten feuchten

Kammer im Hybridisierungsofen bei 68 °C über Nacht. Am nächsten Tag wurde das Gewebe

zweimal für jeweils 30 min mit vorgewärmtem Waschpuffer bei 68°C in einer Küvette

gewaschen. Anschließend wurden die Schnitte zweimal für je 30 min in MABT-Puffer bei RT

inkubiert. Die Objektträger wurden in eine mit H2O befeuchtete Kammer gelegt, mit 350 µl

MABT-Puffer überschichtet und für 1 h bei RT belassen. Zum Blockieren wurden die

Schnitte mit 350 µl 20 % FKS in MABT (Blockierlösung) für 1 h bei RT in der feuchten

Kammer inkubiert. Währenddessen wurde der DIG-markierte und AP-konjugierte Antikörper

(Roche Diagnostics, Mannheim) in Blockierlösung verdünnt (1:3000) und 1 h auf Eis gestellt.

Methoden

110

Nach Entfernen der Blockierlösung von den Objektträgen wurden diese anschließend mit

120 µl der Antikörperlösung überschichtet, mit einem Deckglas bedeckt und über Nacht bei

RT in der feuchten Kammer inkubiert. Tags darauf wurden die Objekkträger in eine Küvette

mit MABT-Puffer überführt und für 1 h bei RT belassen. Die Schnitte wurden in die feuchte

Kammer gelegt und zweimal mit je 350 µl AP-Puffer bei RT gewaschen. Anschließend

wurden 120 µl der Färbelösung (4,5 µl NBT und 3,5 µl BCIP (Roche) pro ml AP-Puffer) auf

die Objektträger gegeben und mit einem Deckglas abgedeckt, wodurch die Bildung

unspezifischer Präzipitate durch Luftkontakt verhindert werden sollte. Die Färbung erfolgte in

der feuchten Kammer über mehrere Stunden bis über Nacht im Dunkeln bei RT. Zum

Abstoppen der Farbreaktion wurden die Schnitte in eine Küvette mit PBS überführt und

zweimal für jeweils 5 min in PBS gewaschen. Es folgte eine Refixierung mit 4 % PFA in PBS

über Nacht im Dunkeln bei 4 °C in der feuchten Kammer. Zum Schluß wurden die Schnitte

mit Glycerol-Gelatine (GG-1, Sigma, München) eingedeckt.

6.5.3 Immunhistochemie auf Gefrierschnitten

Die Objektträger mit den 10 µm Gefrierschnitten (siehe 6.5.1) wurden nach dem Auftauen mit

PAP-Stift (PAP penDako, Hamburg) umrandet und zweimal für 5 min mit PBS gewaschen.

Kam später ein muriner monoklonalen Primärantikörper zum Einsatz, wurden die Schnitte in

10 mM Citratpuffer (pH 6,0) für 3 min bei 300 Watt in einer Mikrowelle gekocht, auf Eis

abgekühlt, kurz mit H20 gespült und zweimal für je 5 min in PBS gewaschen. Anschließend

wurden sowohl das Mikrowellen-behandelte als auch das unbehandelte Gewebe zur

Permeabilisierung für 10 min in PBS mit 0,1 % Triton-X100 bei RT inkubiert und einmal für

5 min mit PBS gewaschen. Zum Blockieren wurde das Gewebe mit 10 % FKS/ 1 % BSA in

PBS in einer feuchten Kammer für 1–2 h bei RT inkubiert. Der Primärantikörper wurde mit

10 % FKS/ 1 % BSA in PBS verdünnt und das Gewebe mit 250 µl dieser Lösung

überschichtet. Es folgte eine Inkubation über Nacht bei 4 °C in einer feuchten Kammer.

Nachdem überschüssiger Primärantikörper durch sechsmaliges Waschen mit PBS für je

10 min entfernt worden war, wurden 250 µl einer Verdünnung des jeweiligen

Sekundärantikörpers mit 10 % FKS/ 1 % BSA in PBS auf das Gewebe gegeben und in der

feuchten Kammer für 1,5 h bei RT inkubiert. Die Sekundärantikörper waren zur

Signaldetektion mit einem Cy2-, Cy3- (Dianova, Hamburg) oder Alexa-Fluoreszenzfarbstoff

(Molecular Probes, Göttingen) konjugiert. Durch sechsmaliges Waschen mit PBS für jeweils

10 min wurde überschüssiger Sekundärantikörper entfernt. Anschließend erfolgte eine

Methoden

111

Kernfärbung durch eine Inkubation für 1–2 min mit DAPI (1:1000 in PBS, Sigma, München).

Nachdem das Gewebe für 5 min in PBS gewaschen worden war, wurde dieses mit Mowiol

(Calbiochem/Merck Biosciences, Bad Soden) eingedeckt. Nach Aushärten wurden die Proben

mit einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop (DMIRB, Leica Microsystems, Bensheim) und

einer gekühlten SPOT-CCD-Kamera (Diagnostic Instruments, Michigan, USA) oder einem

konfokalen Mikroskop TCS SL (Leica Microsystems, Bensheim) dokumentiert.

6.5.4 TUNEL-Färbung

Zur Detektion apoptotischer Zellen wurde eine TUNEL-(terminal dUTP nick end labeling)-

Färbung mit dem ApopTag Red Kit (#S7165, Serologicals/QBiogene, Heidelberg) auf 10 µm

Gefrierschnitten (siehe 6.5.1) durchgeführt. Dafür wurde das Gewebe aufgetaut und die

Objektträger mit einem PAP-Stift (PAP pen, Dako, Hamburg) umrandet. Danach folgte ein

fünfminütiger Waschschritt mit PBS und eine Permeabilisierung für 10 min mit 0,5 % Triton-

X100 in PBS bei RT. Nach Spülen der Objektträger für 5 min mit PBS wurden diese in eine

vorgekühlte Mischung aus Ethanol/Eisesseig (2:1) gegeben und für 5 min bei -20 °C inkubiert.

Nach zweimaligem Waschen für je 5 min in PBS wurden pro Objektträger 75 µl

Equilibrations-Puffer aufgetragen und für etwa 10 min bei RT darauf belassen. Nach

Entfernen dieser Lösung wurde das Gewebe mit 55 µl verdünnter TdT (Terminale

Desoxynukleotid-Transferase)-Enzymlösung überschichtet und mit einem Plastik-Deck-

gläschen überdeckt, um eine gleichmäßige Verteilung der Lösung zu gewährleisten und ein

Austrocknen zu verhindern. Die TdT-Reaktion wurde für 1 h bei 37 °C in der feuchten

Kammer durchgeführt. Zum Abstoppen der Reaktion wurden die Träger in einem

Stop/ Wasch-Puffer für 15 s geschwenkt, weitere 10 min bei RT inkubiert und 3 x 5 min in

PBS bei RT gewaschen. Danach wurden 65 µl einer anti-DIG-Antikörperverdünnung auf die

Objektträger aufgetragen und mit einem Plastik-Deckgläschen überdeckt. Der Antikörper war

direkt mit dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin konjugiert. Die Inkubation der

Antikörperlösung erfolgte für 2 h bei RT in der feuchten Kammer. Danach wurde 4 x 5 min

mit PBS gewaschen, kurz mit DAPI (1:1000 in PBS, Sigma, München) gegengefärbt und das

Gewebe mit Mowiol (Calbiochem/Merck Biosciences, Bad Soden) eingedeckt.

Methoden

112

6.6 GENERIERUNG TRANSGENER MÄUSE

Für die Generierung sogenannter Knockout-Mäuse wird ein Rekombinations-Konstrukt in

embryonale Stammzellen (ES-Zellen) eingebracht. Nach der homologen Rekombination

(Doetschman et al., 1987; Thomas and Capecchi, 1987) werden die mutanten ES-Zellen per

Mikroinjektion in Blastozysten transferiert (Bradley et al., 1984).

6.6.1 Elektroporation embryonaler Stammzellen mit dem Transgen-Konstrukt

Zum Einbringen des transgenen Konstruktes wurden 7-8 x 107 embryonale Stammzellen

(Linie V6.5; C57BL/6J x 129Sv) mit 800 µl PBS vermischt und in einer 4 mm

Elektroporationsküvette mit 10-20 µg linearisierter DNA elektroporiert. Die hierfür

verwendete DNA wurde Endotoxin-frei präpariert (EndoFree Plasmid Maxi-Kit, Qiagen). Die

Elektroporation erfolgte mit Hilfe des Elektroporations-Impulsgenerators (Dr. Fischer,

Heidelberg) bei 300 V mit einer Impulslänge von 2 ms. Nach der Elektroporation wurden die

ES-Zellen auf 3 gelatinierte 10 cm Feeder-Zell-Platten verteilt und bei 37 °C inkubiert. Durch

Zusatz von Geneticinsulfat (G418; 400 µg/µl) und Ganciclovir (2 µM) zum ES-Zell-Medium

konnte eine Positiv- und Negativselektion der ES-Zellen erreicht werden. Die unter diesen

Bedingungen wachsenden ES-Zell-Einzelklone wurden in 96-Well-Schalen verteilt, bei 37 °C

inkubiert und anschließend bei -80 °C eingefroren.

Zur Selektion wurde DNA der ES-Zell-Einzelklone per Southern-Blot (siehe 6.3.10) auf

homologe Rekombinationsereignisse untersucht. Rekombinante ES-Zellklone wurden

aufgetaut und expandiert. Die Präparation der ES-Zell-DNA für die spätere Analyse erfolgte

durch Lyse der ES-Zell-Einzelklone in der 96-Well-Schale mit je 50 µl ES-Lysispuffer pro

Well bei 55 °C über Nacht in einer feuchten Kammer. Am nächsten Tag wurden die lysierten

Zellen mit 5 µl 8 M LiCl und 100 µl reinem Ethanol pro Vertiefung versetzt und mindestens

1 h bei 4 °C inkubiert. Nach Zentrifugation für 30 min bei 3500 Upm und 4 °C in einer

Eppendorf Centrifuge 5810 R (Eppendorf, Hamburg) wurden die Zellen dreimal mit je 100 µl

70 % Ethanol gewaschen. Nach jedem Waschschritt wurde 10 min bei 3500 Upm und 4 °C

zentrifugiert. Zum Schluß wurde die ES-Zell-DNA bei RT getrocknet und anschließend in

50-60 µl 1 mM Tris-HCl pH 8,5 über mehrere Stunden unter Schütteln gelöst.

Methoden

113

6.6.2 Blastozysteninjektion

Die Injektion der positiv gescreenten ES-Zellen in Blastozysten von Mäusen der Linie

C57BL/6J wurde von M. Bösl am Max-Planck-Institut für Neurobiologie (Martinsried)

durchgeführt. Die daraus erhaltenen chimären Tiere, die das mutierte Allel an die

Nachkommen weitergaben, wurden als Gründer der Maus-Linie verwendet.

6.7 IN OVO ELEKTROPORATION IN DEN HUHN-EMBRYO

Für die in ovo Elektroporation im Huhn-Embryo wurden befruchtete Eier von der Firma

Lohmann (Cuxhaven) bezogen. Enstprechend der Stadieneinteilung nach Hamburger und

Hamilton (Bellairs and Osmond, 2005) wurden die Eier liegend bei 37,8 °C und unter

gelegentlichem Wenden in einer feuchten Kammer inkubiert, bis sie das gewünschte Stadium

erreicht hatten. Um Embryonen der Stadien HH10 bis HH11 zu erhalten, erfolgte eine ca. 43-

44 stündige Inkubation der Eier. Zunächst wurde mit einer Nadel (1,1 mm x 40 mm) in die

Spitze des Eis gestochen und mit einer 10 ml Spritze etwas Eiweiß abgesaugt. Anschließend

wurde mit einer Schere ein kleines Loch in die Eischale geschnitten. Mit einer

dünngezogenen Glaskapillare (1 mm Durchmesser) wurde die mit Fast Green versetzte DNA

in den Zentralkanal des Embryos injiziert. Zwei Elektroden wurden um den Embryo platziert

und die DNA mit einem BTX ECM Elektroporationsgerät (50 ms, 30 V) in den Huhn-

Embryo eingebracht. Nach der Elektroporation wurde das Ei-Fenster mit Parafilm ver-

schlossen und für weitere 24 oder 48 h bei 37,8 °C in einer feuchten Kammer inkubiert.

Anschließend erfolgte die Präparation der Huhn-Embryonen (siehe 6.5.1).

Abkürzungsverzeichnis

115

7 Abkürzungsverzeichnis

α Anti

Abb. Abbildung

aff.-pur. affinitätsgereinigt

Amp Ampicillin

Anw. Anwendung

AP Alkalische Phosphatase

APS Ammoniumperoxosisulfat

ATP Adenosin-5´-triphosphat

BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat-p-Toluidinsalz

bp Basenpaare

BSA Rinderserumalbumin

cAMP 3´,5´-Cyclo-Adenosin-Monophosphat

cDNA komplementäre DNA

CH cerebelläre Hemisphäre

µCi Mikrocurie

CMV Cytomegalievirus

CP Kortikalplatte

cpm gezählte Zerfälle pro Minute (counts per minute)

CRE cAMP responsive element

cRNA komplementäre RNA

d Tag(e)

DAPI 4´,6´-Diamin-2´-phenylindol-dihydrochlorid

DCN tiefe cerebelläre Kerne

DIG Digoxygenin

DMEM Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium

DMSO Dimethyl-sulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

DNase Desoxyribonuklease

dNTP Desoxyribonukleosid-5´-triphosphat

dpc Tag post coitum der embryonalen Entwicklung

DTT Dithiothreitol

ECM Extracelluläre Matrix

EDTA Etylendiamin-tetraacetat

EGL externe Körnerzellschicht

EGTA Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-tetraessigsäure

ENS enterisches Nervensystem

ES-Zellen embryonale Stammzellen

FKS Fötales Kälberserum


116

FP Bodenplatte

h Stunde

HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N´-2´-ethansulfonsäure

HH-Stadium Entwicklungsstadium nach Hamburger und Hamilton

His6-Tag Polypeptid aus 6 Histidin Aminosäuren

HMG-Box high-mobility-group-DNA-Bindedomäne

HRP Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase)

IgG, IgM Immunglobuline der Subklasse G oder M

IGL interne Körnerzellschicht

IOC Olivenkernkomplex

IPTG Isopropyl-b-D-thiogalactopyranosid

IRES Internal ribosome entry site

IZ Intermediärzone

kb Kilobasenpaare

kDa Kilodalton

LB Luria broth

mA Milliampere

MES 2-N-Morpholino-ethansulfonsäure

mg, µg Milligramm, Mikrogramm

ML Molekularschicht

ml, µl Milliliter, Mikroliter

M, mM, µM molar, millimolar, mikromolar

mm, µm Millimeter, Mikrometer

mRNA Boten-RNA (messenger-RNA)

MZ Marginalzone

NBT Nitro Tetrazolium Blue Chloride NES Kernexport-Signal (nuclear export signal)

NLS Kernlokalisierungssignal (nuclear localization signal)

nM nanomolar

nm Nanometer

NP-40 Nonidet P40

ODx optische Dichte bei x nm

ORF offenes Leseraster (open reading frame)

p0, p1, p2, p3-Domänen neuronale progenitor-Domänen der ventralen VZ

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung

PC Purkinjezellschicht

PCN präcerebelläre Kerne

PCR Polymerase Kettenreaktion (Polymerase chain reaction)

PEI Polyethylenimin

PFA p-Formaldehyd

pMN Motoneuron-progenitor-Domäne


117

PNS peripheres Nervensystem

Pol. Polymerase

Ref. Referenz

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease

RP Deckplatte

PP Präplatte

Pr. Primer

PS piale Oberfläche

RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse Transkription PCR

SDS Natrium-Dodecylsulfat

SDS-PAGE denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese

SOX SRY-like box protein

SP Subplatte

SRY sex determing region on Y chromosome

SSC Natriumsalz-Citrat-Puffer(sodium salt citrate)

SVZ Subventrikulärzone

TAE Tris/ Essigsäure/ EDTA

TBE Tris/ Borsäure/ EDTA

TBS Tris-gepufferte Salzlösung

TdT Terminale Desoxynukleotid-Transferase

TE Tris-Puffer mit EDTA

TEMED Tetramethyl-ethylen-diamin

tg Transgen

Tm Hybridisierungstemperatur

Tris Tris-hydroxymethyl-aminomethan

TUNEL terminal dUTP nick end labeling

Tween-20 Polyoxyethylen-sorbitanmonolaureat

TSchG Tierschutzgesetz

UTR untranslatierte Region

Upm Umdrehungen pro Minute

V0, V1, V2, V3-Interneuronen ventraler neuronaler Subtyp

Verd. Verdünnung

Vol Volumen

VZ Ventrikulärzone

wt Wildtyp

ZNS Zentrales Nervensystem

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Publikationen

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Publikationen

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Sox11 transcription factors. Mol Cell Biol 28, 4675-87.

Präsentationen



ataxia. 7th Göttingen Meeting of the German Neuroscience Society, Göttingen, Poster.



ataxia. 8th Meeting of the UK Glial Club, London, Poster.

Lebenslauf

141

Lebenslauf

Persönliche Daten _________________________________________________________________________________________________________________

Name: Melanie Hoser

Geburtsdatum und Ort: 07.08.1976 in Donauwörth

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: ledig

Schulbildung _________________________________________________________________________________________________________________

1983-1987 Grundschule Donauwörth

1987-1988 Hauptschule Donauwörth

1988-1997 Gymnasium Donauwörth

1997 Erwerb der Allgemeinen Hochschulreife

Studium und studienbegleitende Tätigkeiten _________________________________________________________________________________________________________________

1997-2004 Studium der Biologie, Universität Würzburg

1999 Diplom-Vorprüfung

2001-2002 Biochemisches Praktikum am CNRS-IPBS in Toulouse

2003 Diplom-Hauptprüfung

2003-2004 Diplomarbeit am Institut für Biochemie der Universität

Würzburg

Etablierung von Expressionssystemen und

Charakterisierung von FMRP, dem Krankheitsgenprodukt

des Fragilen-X Syndroms

2004 Diplom in Biologie

Promotion _________________________________________________________________________________________________________________

2004-2008 Dissertation am Lehrstuhl für Biochemie und

Pathobiochemie der FAU Erlangen-Nürnberg

Die Rolle der SoxC-Proteine in der

Mausembryogenese

Danksagung

143

Danksagung

Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Michael Wegner für die Überlassung des

spannenden Themas, für die hervorragende Betreuung während der gesamten Zeit der

Doktorarbeit und nicht zuletzt für die Durchsicht der Arbeit.

Herrn Prof. Dr. Andreas Burkovski danke ich für die freundliche und bereitwillige

Übernahme der Zweitberichterstattung an der Naturwissenschaftlichen Fakultät II der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg.

Ein besonders großer Dank geht an PD. Dr. Elisabeth Sock und PD. Dr. Claus Stolt für die

immer hilfsbereite Unterstützung bei allen Fragen und Problemen, die sich während dieser

Zeit ergaben und für das Korrekturlesen der Arbeit.

Danke auch an Prof. Dr. Stephan Baader für die großartige Zusammenarbeit beim GFAP-

Sox4-Mausprojekt.

Bei Michaela Potzner bedanke ich mich für die vielen schönen „Tee“-Stunden auf der Treppe,

für die sehr gute Zusammenarbeit, für die Freundschaft, die sich während der Zeit im Labor

entwickelt hat und natürlich auch für das Korrekturlesen der Arbeit.

Bei den Arbeitskollegen aus Labor 2 bedanke ich mich herzlich für die vielen lustigen

Stunden im Labor und die jederzeit große Hilfsbereitschaft und Unterstützung im Laboralltag.

An PD. Dr. Claus Stolt ein großes Danke schön für die allseits vorhandene Diskussions-

bereitschaft und die unermüdliche Hilfe bei Fragen um die Technik.

Dr. Silke Schreiner und Simone Hillgärtner danke ich herzlich für die Durchführung aller

Arbeiten in der ES-Zellkultur.

Allen Kollegen der Arbeitsgruppe danke ich für die sehr gute Zusammenarbeit und das

hervorragende Arbeitsklima.

Ein besonderer Dank geht an Simon Otter für das Verständnis und die großartige

Unterstützung während dieser Zeit.

Zum Abschluß möchte ich mich bei meiner Familie für all das danken, was sie mir im Leben

ermöglicht haben.

Documents

Die Rolle der SoxC-Proteine in der Mausembryogenese · Die Rolle der SoxC-Proteine in der Mausembryogenese Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität