Klin. Wschr. 56, 493-496 (t978) Klinische Wochen-

schfiff © Springer-Verlag 1978

Originalien

Digoxinbestimmung mit Enzymimmunoassay und Radioimmunoassay

H. Mfiller, H. Brftuer, G. F6rster und M. Reinhardt Klinik und Poliklinik ffir Nuklearmedizin (Direktor: Prof, Dr. Dr. E.H, Graul) im Radiologiezentrum der Philipps-Universit/it Marburg/Lahn (Direktoren: Prof. Dr. Dr. E.H. Gram und Prof. Dr. F, Hess)

Determination of Digoxin by Enzyme Immunoassay and Radioimmunoassay

Summary. The results of parallel determinations of digoxin in the sera of non selected patients (n=104) by enzyme immunoassay (EMIT-EIA) and radioim- munoassay (J-125 labeled RIA) were compared with each other. The determinations revealed considerably different concentrations ; the values determined by EIA were statistical lower (for EIA 1.09 +_0.99 ng/ml, for RIA 1.34+_ 1.01 ng/ml, p <0.01). In sera with hemoly- sis and in sera of patients with hyperlipidemia and uremia false-negative results were found by EIA. Af- ter elimination of these sera an exact concordation of the values of both the methods was obtained (for EIA 1.12_+1.01 ng/ml, for RIA 1.12+- 1.02 ng/ml, r = 0.95).

Key words: Determination of digoxin - Enzyme im- munoassay -- Radioimmunoassay - Hemolysis - Hyperlipidemia - Uremia - Hyperbilirubinemia.

Zusammenfassung. Digoxin-Konzentrationen in Pa- tientenseren wurden parallel mittels Enzymimmu- noassay (EMIT-EIA) und Radioimmunoassay (RIA, 12 sj markiert) bestimmt und die Ergebnisse miteinan- der verglichen. Im unselektierten Patientenmaterial (n = 104) bestanden teilweise erhebliche Bestimmungs- unterschiede; die mit dem EIA gemessenen Konzen- trationen waren signifikant kleiner (1,09 +0,99 ng/ml f/Jr EIA, 1,34+ 1,0t ng/ml ffir RIA, p <0,01). Hfimo- lytische, lip/imische und urfimische Seren hatten falsch negative Ergebnisse im EIA; nach Elimination dieser Seren resultierte eine gute Ubereinstimmung der MeB- werte mit beiden Methoden (1,12+1,01 ng/ml ffir EIA, 1,12+_ 1,02 ng/ml ffir RIA, r=0,95, n=63).

Sonderdruckanfragen an: Priv.-Doz. Dr. H. Mfiller (Adresse s. nach Lit,)

Sehliisselwiirter: Digoxinbestimmung - Enzymim- munoassay - Radioimmunoassay - H/imolyse - Hyperlip/imie -- Ur/imie - Hyperbilirubin/imie.

Die bisher entwickelten Methoden zur quantitativen Digoxinbestimmung im Serum [1, 2] erfahren gegen- wfirtig eine Erg/inzung durch ein vorwiegend noch im Experimentierstadium befindliches Verfahren, den Enzymimmunoassay (EIA) [3, 4]. Wie der in den letz- ten Jahren auch in der Klinik Anwendung gefundene Radioimmunoassay (RIA) beruht der neue Test auf dem Prinzip der immunspezifischen Antigen-Antik6r- perbindung; anstatt der Radioaktivitfit wird die Akti- vitfit eines Enzyms gemessen. Dem EIA haften somit nicht die Probleme der Strahlenbelastung f/ir das La- borpersonal, der Kontamination, der Bereitstellung eines SzintillationsmeBger/ites und des Erwerbes einer Umgangsgenehmigung ffir radioaktive Stoffe an. Der EIA ist mit einem Spektrophotometer durchffihrbar. Die relativ einfache Anforderung an die Laborausrii- stung und der verh/iltnism~iBig kurze Zeitaufwand ffir die Testdurchffihrung tassen den EIA nicht nur f/jr die Klinik, sondern auch ffir die Praxis interessant erscheinen.

In der vorliegenden Arbeit sollen fiber erste eigene Erfahrungen mit dem EIA zur Digoxinbestimmung in Patientenseren und fiber den Vergleich mit dem RIA berichtet werden.

Methodik

E1A. Wir arbeiteten mit einem EMIT-Enzymimmunoassay 1, der auf dem Enzym Glukose-6-phosphatdehydrogenase basiert, das an

i Fa. Syva, USA. Vertretung in der BRD: Gilford Instruments GmbH, Dfisseldorf. Herrn P. Porkert gilt unser Dank ffir die erwie- sene Beratung und Unterstfitzung

494 H. Miiller et al. : EIA und RIA fiir Digoxin

Digoxin kovalent gebunden ist. Der vom Substrat Glukose-6-phos- phat abgespaltene Wasserstoff wird mit NAD zu NADH2 umge- setzt. 1]ber die Digoxin-Antik6rperbindung wird das Enzym inakti- viert. Zwischen der Digoxinkonzentration im Serum und der En- zymaktivit/it besteht eine direkte Proportionalit/it.

Die Testvorschrift der Herstellerfirma wurde bis auf eine Ab- weichung befolgt: Aus 6konomischen Grfinden wurde nut die H/ilfte der empfohlenen Enzym- und Antik6rperkonzentrationen eingesetzt; das Bestimmungsergebnis ~inderte sich dadurch nicht. Die Proben fiir die Eichkurve wurden 3fach, die Patientenseren 2fach angesetzt. Bei einer Ergebnisdifferenz des Doppelansatzes yon mehr als 10% wurde das entsprechende Serum erneut der Testprozedur unterzogen. Die Testdurchfiihrung erfolgte in Ein- weg-Halb-Mikroktivetten aus Polystyrol 2.

Die auf der NADH2-Bildung beruhende Extinktionsfinderung wurde unmittelbar nach Beginn der Inkubation und am Ende der- selben im konstanten Zeitintervall fiir jede Probe bei 334 mn in einem Vitatron-Photometer 3 mit digitaler Ausgabe gemessen. Die Differenz beider Extinktionsmessungen galt als Parameter fiir die Digoxinkonzentration in der jeweiligen Serumprobe, Die endgfil- tige Digoxinangabe in ng/ml ffir jedes Patientenserum erfolgte als Mittelwert eines Doppelansatzes; die Digoxinkonzentration wurde an einer Eichkurve abgelesen, die sich aus der logarithmischen Auftragung der Extinktionsdifferenzen gegen die Digoxin-Standard- konzentrationen ergab.

RIA, In dem yon uns als Referenztest verwendeten Radioimmu- noassay 4 diente 12sj als Tracer. Die Separation am Ende der Inku- bation geschah nach der Charcoal-Technik. Der Testablauf erfolgte gemgB der Vorschrift des Herstellers. Von jedem Patientenserum wurden Doppelans~tze angefertigt. Die Radioaktivit~it wurde im automatischen Probenwechsler bf 5000 der Fa. Berthold-Friesecke gemessen; die vorgegebene MeBzeit wurde so gew~hlt, dab fiir den Eichstandard 4 ng/ml eine Impulszahl yon mehr ats 2000 aufge- sammelt wurde. Die Digoxinkonzentration ffir jeden Einzelansatz wurde an einer Eichkurve abgelesen, die sich aus der linearen Auftragung der prozentualen Komplexbindung des Tracers zu den Digoxin-Standardkonzentrationen ergibt. Die definitive Digoxin- angabe in ng/ml fiir jedes Patientenserum erfolgte als Mittelwert des Doppelansatzes.

Die Serumkonzentrationen von H~moglobin, Kreatinin, Bili- rnbin und Lipiden wurden photometrisch unter Verwendung yon Testsubstanzen der Fa. Merck, Darmstadt, bestimmt (Merckotest Bilirubin, Kreatinin, Gesamtlipide).

Ergebn i s se

Die MeBergebnisse f~r die 104 Patientenseren sind in Abbildung 1 wiedergegeben; jeder Punkt reprgsen- tiert ein untersuchtes Patientenserum als Mittelwerts- angabe fiir die ermittelten Digoxinkonzentrationen im RIA (Abszisse) und im EIA (Ordinate). In verhfilt- nism/iBig vielen FNlen besteht eine beachtliche Ab- weichung zwischen den Bestimmungsergebnissen bei-

2 Fa. W. Sarstedt, Nfimbrecht 3 Die Messung erfolgte in den Behringwerken/Marburg. Herrn Dr, B. Mfiller danken wir bestens ftir sein Engagement und seine Unterstfitzung 4 Fa. Schwarz-Mann, Division of Becton, Dickinson&Company, USA. Vertretung in der BRD: Becton, Dickinson GmbH, Heidel- berg. Den Herren A. Gonzales und E. Lang danken wit freundlichst ffir ihre Hilfsbereitschaft und ihr Entgegenkommen

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KONFIDENZINTERVFILL 9fi,O PROZENT

Abb. 1. Vergleichende Digoxinbestimmung mittels RIA und EtA an Hand von 104 unselektierten Patientenseren. (y=0,34+ 0,786x; r = 0,802)

der Methoden an ein und demselben Serum. Beispiels- weise werden bis zu 2 ng Digoxin im RIA fiir 8 Seren gemessen, wfihrend fiir diese der EIA kein Digoxin anzeigt (s. Anordnung der MeBpunkte auf der Ab- szisse). Andererseits ermittelt in anderen Ffillen der EIA h6here Digoxinspiegel als der RIA, z.B. 1,8 ng im EIA und nur 0,9 ng im RIA oder 3 ng im EIA und 2 ng im RIA. Der Vergleich aller 104 Serumbe- stimmungen in beiden Testen ergibt eine durchschnitt- lich niedrigere Konzentrationsbestimmung im EIA (~+s fiir EIA 1,086_+0,989, ffir RIA 1,338+1,009). Im t-Test besteht zwischen beiden Bestimmungsme- thoden ein signifikanter Unterschied ihrer Megwerte bei Vorgabe eines 95%igen Vertrauensbereiches; der Korrelationskoeffizient betr~gt 0,802.

Um eine Erkl/irung ftir die Bestimmungsdifferen- zen zu finden, fiihrten wir Wiederfindungsuntersu- chungen in primfir digoxinfreiem h/imolytischem, ik- terischem, ur/imischem und lip/imischem Serum mit dem EIA durch, indem wir allen Ans/itzen eine mitt- lere Digoxinkonzentration yon 1,25 ng pro ml Serum zusetzten (Tabelle 1). Dabei ergab sich eine Digoxin- wiederfindung von 97% im ikterischen Serum und von 35% im ur~mischen; im h~molytischen und lip- ~imischen Serum war dagegen kein Digoxin meBbar. Daraufhin wurden alle 104 Patientenseren auf ihren Gehalt an H/imoglobin, Kreatinin, Bilirubin sowie Gesamtlipiden fiberprfift und jene Seren vonder Aus- wertung ausgeschlossen, die folgende Konzentratio- nen fiberstiegen : Hb 0,5 mg-%, Kreatinin 1,2 mg-%, Gesamtbilirubin 1,0 mg-%, Gesamtlipide 1000 mg-%

H. Mtitler et al. : EIA und RIA ftir Digoxin

Tabelle 1. Experimentelle Digoxin-Wiederfindung mittels EIA bei Seren mit abnormer Zusammensetzung

Serum Digoxin- Digoxin- Zugabe von Wiederfindung 1,25 ng/ml in ng/ml

h~imolytisch 0 nicht bestimmbar (HB 6,2 g-%) (over range)

h/imolytisch + nicht bestimmbar (HB 6,2 g-%) (over range)

hyperlip/imisch 0 nicht bestimmbar (Gesamtlipide 3200 mg-%) (over range)

hyperlip/imisch + nicht bestimmbar (Gesamtlipide 3200 mg-%) (over range)

udimisch 0 0 (Kreatinin 8,5 rag-%)

ur[imisch + 0,44 (=35,2%) (Kreatinin 8,5 mg- %)

hyperbilirubin/imisch 0 0 (Gesamtbilirubin 10,3 mg-%)

hyper biliru bin/imisch + 1,21 (=97%) (Gesamtbilirubin 10,3 rag-%)

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~o~-- i'.oo ~'.oo 3'.00 4'.0o 5'.00 ~'.co RIH

KONFIDENZINTEF~VFILL 95.0 PBOZENT

Abb. 2. Vergleich der Digoxinbestimmung mittels RIA und EIA an Hand von 63 selektierten Patientenseren (Elimination h/imo- lytischer, hyperlipgmischer, ur~imischer und hyperbitirubin/imischer Seren). (y=0,001 +0,948x; r=0,953)

(n =41). Abbildung 2 veranschaulicht das statistische Ergebnis. Der Streubereich ist wesentlich schmaler als in Abbildung 1, die extremen Unterschiede zwi- schen der Digoxinbestimmung im RIA und der Null- anzeige im EIA fallen fort. Nach Selektion weisen jetzt beide Mel3reihen keinen Mittelwertsunterschied

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mehr auf ()?_+s ffir EIA 1,117+_1,013, ffir RIA 1,117+_1,017); entsprechend ergibt sich auch im t- Test kein signifikanter Unterschied. Der Korrelations- koeffizient betr/igt 0,953.

Diskussion

Digoxinbestimmungen im Patientenserum gewinnen insbesondere f/Jr Problemffille (Patienten mit einge- schr~inkter Nierenfunktion, alte Patienten, unzuver- 1/issige Medikamenteinnahme, Verdacht auf Digita- lisintoxikation, Herzschrittmacherpatienten) zuneh- mend an Interesse. Die meisten derartigen Serum- untersuchungen werden z.Z. mit dem RIA durchge- ffihrt. Der in Entwicklung befindliche EIA ist alterna- tiv interessant wegen einiger Vorteile (keine besondere Anforderung an die Laborausr/Jstung, keine Strahlen- exposition, keine Kontamination, keine erforder- liche Umgangsgenehmigung ffir radioaktive Stoffe). Publikationen fiber Anwendung und Erfahrungen mit dem EIA zur Digoxinbestimmung sind noch sp~irlich. In einer Mitteilung [5] wird fiber eine gute Korrelation von RIA und EIA an Hand yon 158 Patientenseren berichtet (r =0,90-0,94); in der Regel waren die Digo- xinbestimmungen mit dem EIA etwas h6her. Wie aus den Diagrammen ersichtlich, wichen dennoch einige Bestimmungen im EIA und RIA erheblich ab: 1,t und 2,6, 3 und 1,7, 5,9 und 3,2 ng Digoxin pro ml Serum.

Wir konnten nicht generell eine optimale Konkor- danz der mit beiden Methoden gewonnenen Mel3- werte ffir alle Seren best[itigen (r=0,80, signifikan- ter Mittelwertsunterschied zu Ungunsten des EIA). Wiederfindungsanalysen deckten falsch negative Er- gebnisse im h/imolytischen und urfimischen sowie im lip~imischen Serum auf. Erst die Elimination derarti- ger Seren mit abnormer Zusammensetzung (erh6hter Gehalt an Hb, Kreatinin, Lipiden und Bilirubin) ffihrte zu einer Verbesserung der Statistik und zu einer guten Ubereinstimmung der parallel gemessenen Digoxin- Serumkonzentrationen (r=0,95, keine signifikante Mittelwertsdifferenz).

Die falsch negativen Ergebnisse im EIA dtirften u.E. Folge einer Beeinflussung der Extinktion durch die angeffihrten abnormen Serumbestandteile sein. In- wieweit noch Begleitmedikamente st6rende Interfe- renzeffekte verursachten-entweder auf die Extink- tion oder auf die Stabilit/it des Digoxin- Antik6rper- komplexes, kann z.Z. nicht ausgeschlossen werden und muB Gegenstand weiterer Untersuchungen blei- ben (Herzpatienten erhielten zus~tzlich Metoprolol, Chinidin, Prajmaliumbitartrat, Furosemid, Diaze- pam, lipfimische Patienten Clofibrat, ur/imische und ikterische Furosemid, Cephazolin und Diazepam).

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Fiir die freundliche kollegiale Unterstiitzung danken wit Herrn Prof. Dr. H. Hardewig, kardiologische Abteilung der Medizini- schen Klinik der Philipps-Universit/it Marburg/Lahn, den Assisten- ten derselben Klinik und der Medizinischen Poliktinik der Phitipps- Universit/it Marburg/Lahn sowie den Herren Dr. R. Schafft und Dr. R. Meysing im Sanatorium Wicker, Bad Wildungen.

Ffir die mathematische Bearbeitung danken wir den Herren K. Christ und Dipl-Phys. H.-W. Ridder, Abt. f/Jr EDV der Klinik und Poliklinik ffir Nuklearmedizin der Philipps-Universit/it Mar- burg/Lahn sowie den Herren des Rechenzentrums der Philipps- Universit~it Marburg]Lahn.

Literatur

1. Bodem, G., H.J. Gilfrich: Methoden zur Bestimmung yon Digo- xin und Digitoxin im Blut und ihre klinische Bedeutung. Klin. Wschr. 51, 57 (1973)

2. Butler, V.P. : Assays of digitalis in the blood. Progr. Cardiovasc. Dis. 14, 571 (1972)

3. Chang, J.J., C.P. Growl, R.S. Schneider: Homogeneous enzyme immunoassay for digoxin. Clin. Chem. 21, 967 (1975)

4. Engvall, E., P. Perlmann: Enzym-linked immunosorbent assay, ELISA~ J. Immunol. 109, 129 (1972)

5. Sun, L., V. Spiehler: Radioimmunoassay and enzyme immu- noassay compared for determination of digoxin. Clin. Chem. 22, 2029 (1976)

Eingegangen am 5. Februar 1977 Angenommen am 17. Oktober 1977

Priv.-Doz. Dr. H. Miiller BahnhofstraBe 7 D-3550 Marburg/Lahn Bundesrepublik Deutschland