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Diss Leitermann 26 8format

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Frank Leitermann

Entwicklung und Optimierung eines biotechnologischenProzesses zur Herstellung mikrobieller Rhamnolipideauf Basis nachwachsender Rohstoffe

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Entwicklung und Optimierungeines biotechnologischen Prozesses zur Herstellung mikrobiellerRhamnolipide auf Basisnachwachsender Rohstoffe

von Frank Leitermann

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Universitätsverlag Karlsruhe 2008 Print on Demand

ISBN: 978-3-86644-277-1

Impressum

Universitätsverlag Karlsruhec/o UniversitätsbibliothekStraße am Forum 2D-76131 Karlsruhewww.uvka.de

Dieses Werk ist unter folgender Creative Commons-Lizenz lizenziert: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/de/

Dissertation, Universität Karlsruhe (TH)Fakultät für Chemieingenieurwesen und Verfahrenstechnik, 2008

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Entwicklung und Optimierung eines biotechnologischen

Prozesses zur Herstellung mikrobieller Rhamnolipide auf

Basis nachwachsender Rohstoffe

zur Erlangung des akademischen Grades eines

DOKTORS DER INGENIEURWISSENSCHAFTEN (Dr.-Ing.)

der Fakultät für Chemieingenieurwesen und Verfahrenstechnik der

Universität Fridericiana Karlsruhe (TH)

vorgelegte

genehmigte

DISSERTATION

von

Dipl.-Biol. (t.o.) Frank Paul Leitermann aus Albstadt-Ebingen

Referent: Prof. Dr. rer. nat. Christoph Syldatk Korreferent: Prof. Dr.-Ing. Clemens Posten Tag der mündlichen Prüfung: 22.07.2008

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Danksagung

Herrn Prof. Dr. rer. nat. Christoph Syldatk danke ich für die sehr interessante

Themenstellung, für sein Interesse am Fortgang dieser Arbeit und die konstruktive

Diskussionsbereitschaft. Für die Einräumung großer experimenteller Freiheit und die

„offene Bürotüre“ beim Auftreten von Problemen bin ich besonders dankbar.

Herrn Prof. Dr.-Ing. Clemens Posten am Institut für Bio- und Lebensmitteltechnik

Universität Karlsruhe (TH), danke ich für die freundliche Übernahme des Koreferates.

Bei Herrn Dr.-Ing. Rudolf Hausmann möchte ich mich für die engagierte Betreuung,

die konstruktiven und anregenden Diskussionen und die freundschaftliche

Unterstützung seit meiner Diplomarbeitszeit in Stuttgart und der Promotionszeit hier

in Karlsruhe bedanken.

Bei den Studienarbeitern Ina Sandig und Nico Fischer, sowie bei den Diplomanden

Veronika Holderied und Benjamin Maiser für ihre engagierte Mitarbeit.

Bei allen Mitarbeitern des Lehrstuhls für technische Biologie möchte ich mich für die

ständige Hilfsbereitschaft und freundschaftliche Atmosphäre bedanken.

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Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung ______________________________________________ 1

2 Liste der Publikationen __________________________________________ 3

3 Einleitung & Zielsetzung _________________________________________ 5

3.1 Einleitung _______________________________________________________ 5

3.2 Zielsetzung ______________________________________________________ 8

4 Grundlagen & Theorie ___________________________________________ 9

4.1 Der Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa_______________________ 9

4.2 Tenside und Biotenside ___________________________________________ 11 4.2.1 Biotenside___________________________________________________________ 14

4.3 Rhamnolipide: Eigenschaften, Biosynthese und Regulation_____________ 15 4.3.1 Biosynthese der Rhamnolipide in Pseudomonas species ______________________ 16 4.3.2 Genetische Regulation der Rhamnolipidbiosynthese __________________________ 20 4.3.3 Prozessführungsstrategien & Stand der Technik _____________________________ 22 4.3.4 Wirtschaftliche Aspekte und Anwendungsbereiche der Rhamnolipide_____________ 24

4.4 Schaum und Schaumzerstörung____________________________________ 28

4.5 ATR-FTIR Spektroskopie __________________________________________ 34 4.5.1 Multivariate Kalibrierung und PLS-Regression _______________________________ 36

5 Zusammenfassungen der Ergebniskapitel I-V_______________________ 39

5.1 Zusammenfassung Kapitel I: Stammvergleich ________________________ 40

5.2 Zusammenfassung Kapitel II: Produktspektrum_______________________ 44

5.3 Zusammenfassung Kapitel III: Substratscreening _____________________ 45

5.4 Zusammenfassung Kapitel IV: ATR-FTIR Analytik _____________________ 48

5.5 Zusammenfassung Kapitel V: Patentanmeldeschrift ___________________ 50

6 Ergebniskapitel ________________________________________________ 53

6.1 Kapitel I ________________________________________________________ 55 6.1.1 Abstract ____________________________________________________________ 56 6.1.2 Background _________________________________________________________ 57

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Inhaltsverzeichnis

6.1.3 Results _____________________________________________________________ 58 6.1.4 Discussion __________________________________________________________ 63 6.1.5 Conclusions _________________________________________________________ 64 6.1.6 Methods ____________________________________________________________ 64 6.1.7 Authors' contributions & Acknowledgements ________________________________ 67

6.2 Kapitel II________________________________________________________ 69 6.2.1 Abstract ____________________________________________________________ 70 6.2.2 Introduction__________________________________________________________ 71 6.2.3 Results and Discussion ________________________________________________ 71 6.2.4 Material & Methods____________________________________________________ 74 6.2.5 Acknowledgement ____________________________________________________ 74

6.3 Kapitel III _______________________________________________________ 75 6.3.1 Abstract ____________________________________________________________ 76 6.3.2 Introduction__________________________________________________________ 77 6.3.3 Results _____________________________________________________________ 79 6.3.4 Discussion __________________________________________________________ 84 6.3.5 Conclusions _________________________________________________________ 85 6.3.6 Methods ____________________________________________________________ 86 6.3.7 Authors' contributions & Acknowledgements ________________________________ 89

6.4 Kapitel IV _______________________________________________________ 91 6.4.1 Abstract ____________________________________________________________ 92 6.4.2 Background _________________________________________________________ 93 6.4.3 Results _____________________________________________________________ 95 6.4.4 Discussion _________________________________________________________ 100 6.4.5 Conclusions ________________________________________________________ 101 6.4.6 Materials & Methods__________________________________________________ 101 6.4.7 Authors´ contributions & Acknowledgement ________________________________ 105

6.5 Kapitel V ______________________________________________________ 107 6.5.1 Beschreibung _______________________________________________________ 108 6.5.2 Zusammenfassung ___________________________________________________ 123

6.6 Kapitel VI ______________________________________________________ 127 6.6.1 Lösungen für ein fernsteuerbares Biotechnikum ____________________________ 128 6.6.2 Automatisierte Prozesssteuerung über Rezepte ____________________________ 130 6.6.3 Fällung und Aufreinigung von Rhamnolipiden ______________________________ 131

7 Ausblick_____________________________________________________ 135

8 Literatur _____________________________________________________ 137

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Inhaltsverzeichnis

9 Anhang______________________________________________________ 145

9.1 Abbildungs und Tabellenverzeichnis _______________________________ 145

9.2 Abkürzungen___________________________________________________ 148

9.3 Formelsammlung _______________________________________________ 150

9.4 Prozessrezept Rhamnolipid-Produktionsprozess_____________________ 154

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Zusammenfassung

1

1 Zusammenfassung Rhamnolipide sind mikrobielle Biotenside, welche aus hydrophilen L-Rhamnose- und

hydrophoben β-Hydroxydecansäureuntereinheiten bestehen. Bevorzugt werden

diese Glykolipide von Bakterien der Gattung Pseudomonas, insbesondere der Art

Pseudomonas aeruginosa, auf hydrophoben C-Quellen unter wachstums-

limitierenden Bedingungen gebildet. Sie weisen sehr gute oberflächenaktive

Eigenschaften auf und sind vollständig biologisch abbaubar. Ihr Einsatzgebiet reicht

von Haushaltsreinigungsprodukten bis hin zu Kosmetik und Pharmaapplikationen.

Im Fokus dieser Arbeit stand die Entwicklung und Optimierung eines

biotechnologischen Prozesses zur Herstellung von Rhamnolipiden auf Basis von

nachwachsenden Rohstoffen. Ein Schwerpunkt lag hierbei auf der Entwicklung und

Evaluierung einer Standartprozessführung, sowie eines effizienten Screening-

Systems auf Basis eines Parallelbioreaktorsystems. Es galt zwei verschiedene

Produktionsstämme auf ihr Rhamnolipidbildungspotenzial und auf die von ihnen

gebildeten Rhamnolipid 1 : Rhamnolipid 3 Verhältnisse hin zu untersuchen. Zur

schnellen Produktanalyse sollte FTIR-Spektroskopie als alternative Analysemethode

bezüglich ihrer Eignung zur quantitativen Rhamnolipidbestimmung aus

Kultivierungsbrühen untersucht und bis zur Anwendungsreife weiterentwickelt

werden.

Als wesentliches prozessimmanentes Problem konnte die exzessive Schaumbildung

identifiziert und durch Implementierung mechanischer Schaumzerstörung gelöst

werden. In Kombination mit einer geeigneten Prozessführungsstragegie war es

hierdurch möglich Rhamnolipidmengen in Konzentrationen von über 53 g/l

bioverfahrenstechnisch herzustellen. Hierbei zeigte der Produktionstamm DSM 2874

tendenziell bessere Produktivitäten als der Referenzstamm DSM 7108. Im Verlauf

dieser Untersuchungen kamen jedoch auch neue Fragestellungen bezüglich der

Induktion der Rhamnolipidbildung auf. Eine zukünftige Betrachtung der genauen

Regulation der Rhamnolipidbildung unter molekularbiologischen Gesichtspunkten

erscheint daher erstrebenswert.

Ein durchgeführtes Substratscreening mit verschiedenen pflanzlichen Ölen ergab,

dass die Fettsäurezusammensetzung des Substrates einen Einfluss auf die

gebildeten Produktmengen hat, jedoch das Produktspektrum hiervon unbeeinflusst

bleibt. Im Unterschied hierzu ergab ein direkter Vergleich der beiden

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Zusammenfassung

2

Produktionsstämme mit demselben Substrat deutliche Unterschiede bezüglich des

gebildeten Produktspektrums, woraus geschlussfolgert werden kann, dass das

jeweilige Produktspektrum stamm- und nicht substratabhängig ist. Als alternative „in

time“ Prozessanalytik erwies sich ATR-FTIR Spektroskopie als geeignet. Die

notwendigen Analysezeiten von 36 h der herkömmlichen HPLC-Analytik konnten

durch Einsatz von ATR-FTIR Spektroskopie auf 20 Minuten reduziert werden. Auf

Basis der im Verlauf der Untersuchungen gewonnenen Erkenntnisse folgte die

weiterführende Entwicklung eines zweistufigen, ruhenden Zell Prozesses unter

Anwendung mechanischer Schaumzerstörung, zu welchem eine Patentmeldeschrift

eingereicht wurde.

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Publikationen

3

2 Liste der Publikationen Die vorliegende Dissertationsarbeit basiert auf den folgenden Publikationen und

Manuskripten:

Kapitel I*: Leitermann F, Dhariwal A, Syldatk C, Hausmann R. 2008. Production of microbial rhamnolipids by Pseudomonas strains DSM 7108 and DSM 2874, utilizing mechanical foam destruction. BMC Journal of Biological Engineering

Kapitel II*: Leitermann F, Syldatk C, Hausmann R. 2008. Proportion of Di- and Mono-Rhamnolipid production by Pseudomonas strains DSM 7108 and DSM 2874. BMC Research Notes

Kapitel III*: Leitermann F, Sandig I, Syldatk C, Hausmann R. 2008. Screening of hydrophobic Substrates for the Production of Rhamnolipids by Shaking Flask and Bioreactor Cultivations of Pseudomonas aeruginosa DSM 7108. BMC Biotechnology

Kapitel IV*: Leitermann F, Syldatk C, Hausmann R. 2008. Fast quantitative determination of microbial rhamnolipids from cultivation broths by ATR-FTIR spectroscopy. BMC Journal of Biological Engineering

Kapitel V*: Leitermann F, Hausmann R, Syldatk C; Assignat Universität Karlsruhe (TH). 2007.

Biotenside und deren Herstellung. Deutsches Patent- und Markenamt. DE 10

2007 028 030.2. Einreichungsdatum 14.06.2007:23.

* laufendes Veröffentlichungsverfahren

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Publikationen

4

Weitere Publikationen Wissenschaftliche Artikel: Dhariwal A, Mohrdieck M, Leitermann F, Arjol IM, Manresa A, Syldatk C, Janke HD, Chmiel H. 2007.

Effect of emulsified feeding of oily substrate via submerged ceramic membranes on surfactant production in Pseudomonas aeruginosa fermentation. Bioprocess Biosyst Eng (online first)

voraussichtlich 32.

Hausmann R, Vitello MP, Leitermann F, Syldatk C. 2006. Advances in the production of sponge biomass Aplysina aerophoba - A model sponge for ex situ sponge biomass production. Journal

of Biotechnology 124(1):117-127.

Brümmer F, Calcinai B, Götz M, Leitermann F, Nickel M, Sidri M, Zucht W. 2004. Overview on the sponge fauna of the Limski Kanal, Croatia, Northern Adriatic Sea. Boll. Mus. Ist. biol. Univ.

Genova. 68:219-227.

Vortrag Leitermann F. 2005. New Approaches for a Sustainable Production of Microbial Rhamnolipids. BioPerspectives10.-12. Mai 2005. Wiesbaden.

Posterpräsentationen Leitermann F, Fischer N, Hausmann R, Syldatk C. 2006. Advances on the Production of Microbial Rhamnolipids based on Vegetable Oils. VAAM Jahrestagung 19.-22. März 2006. Jena.

Leitermann F, Magario I, Janke T, Neumann A, Develter D, Chmiel H, Radel S, Syldatk C. 2004a.

New approaches for the production of rhamnolipids with Pseudomonas sp. from renewable sources. 3rd Euro Fed Lipid Congress 05.-08. September 2004. Edinburgh.

Leitermann F, Magario I, Neumann A, Radel S, Syldatk C. 2004b. New approaches for the production of rhamnolipids with Pseudomonas sp. from renewable sources. VAAM

Jahrestagung 28.-31. März 2004. Braunschweig.

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Einleitung & Zielsetzung

5

3 Einleitung & Zielsetzung

3.1 Einleitung

Nachwachsende Rohstoffe bildeten seit altersher die Grundlage vieler Produkte des

menschlichen Bedarfs. Erst der Wandel von der Agrar- zur Industriegesellschaft Mitte

des 19. Jahrhunderts, in Verbindung mit großen wissenschaftlichen Erkenntnis-

zugewinnen, änderte dies. Kohle, Erdöl und Erdgas wurden für die chemische

Synthese entdeckt und synthetische Produkte ersetzten rasch die ursprünglichen [1].

Bei Abschätzung der weltweit gegebenen geologischen Verfügbarkeit wird jedoch

deutlich, dass eine Nutzung fossiler Rohstoffe zeitlich begrenzt sein wird. Eine

deutliche Verteuerung, zumindest von Erdöl und Ergas, ist bzw. wird hiervon die

Folge sein [2]. Unabhängig davon, ob bald oder erst in fernerer Zukunft ein „peak oil“

droht, sollten heute schon intelligente Zukunftsstrategien entwickelt werden die

Versorgungssicherheit gewährleisten. Die Weiße (oder industrielle) Biotechnologie

hat das Potenzial, einen substanziellen Beitrag zur Bewältigung dieser

grundlegenden Herausforderungen für unsere industrielle Gesellschaft zu leisten.

Weiße Biotechnologie kann entsprechend einer sehr allgemeinen Definition wie folgt

definiert werden:

„White Biotechnology is the application of

nature´s toolset to industrial production”

Der Focus der Weißen Biotechnologie liegt demnach in der Herstellung von

Produkten mit biotechnischen Verfahren. Zu diesen Produkten zählen Bulk- und

Feinchemikalien, Lebensmittel sowie Lebensmittelzusatzstoffe und

Futtermitteladditive, Agrar- und Pharmavorprodukte ebenso wie auch Hilfsstoffe für

verarbeitende Industrien wie technische Enzyme und Biokraftstoffe [3]. Die in sie

gesetzten mittelfristigen Erwartungen sind hierbei, die notwendige Verbesserung der

industriellen Produktion zu ermöglichen, sowie langfristig die Erschließung

nachwachsender Rohstoffe als primäre, erdölunabhängige Basis der industriellen

Produktion und der Energiewirtschaft zu gewährleisten. Das Potenzial der Weißen

Biotechnologie liegt darin, sowohl klassisch-chemische Produktionsverfahren

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Einleitung & Zielsetzung

6

ersetzen bzw. ergänzen zu können als auch die Herstellung neuer Produkte zu

ermöglichen [4]. Einige Studien schätzen den Anteil biotechnischer Verfahren

in der Produktion verschiedener chemischer Produkte zurzeit auf ca. 5 % (Stand

2003). Bis zum Jahre 2010 wird eine Steigerung auf bis zu 20 % vorhergesagt [5];

[6]. Besonders im Bereich Grund- und Feinchemikalienproduktion könnte der Einsatz

biotechnologischer Verfahren sinnvoll sein da [4]:

• Biotechnische Verfahren sich gewöhnlich durch hohe Spezifität und

Selektivität bezüglich der Umsetzung von Substraten und des gebildeten

Produktspektrums auszeichnen.

• Biotechnische Verfahren unter milden Reaktionsbedingungen bezogen auf

Druck, Temperatur und pH-Wert durchgeführt werden können.

• Häufig nachwachsende Rohstoffe als Ausgangsstoffe verwendet werden und

damit zur viel diskutierten Nachhaltigkeit von Verfahren und Produkten

betragen können.

Der Einsatz nachwachsender Rohstoffe im chemisch-technischen Produktionssektor

ist nicht neu, wobei pflanzliche Öle mengenmäßig an erster Stelle stehen. Das

internationale Marktvolumen für natürliche Fette und Öle betrug 2003 124,6 Tonnen.

Ca. 14 % wurden als Ausgangsstoffe für chemische und technische Anwendungen

verwendet. Die eine Hälfte hiervon fand Einsatz in der Seifenherstellung, die andere

Hälfte für unterschiedliche Fett- und oleochemischen Anwendungen [7]. Tenside

stellen die wichtigste Produktgruppe der Oleochemie dar. Als Beispiel kann die

deutsche chemische Industrie angeführt werden, die mehr als ein Drittel der

verwendeten natürlichen Fette und Öle (430000 t/a) zu diesem Zweck einsetzt. Die

Hauptanwendungsbereiche liegen bei Wasch- und Reinigungsmitteln (64 %),

Kosmetik- und Pharmaprodukten (9 %), Textil- und Lederadditive (8 %), sowie eine

Vielzahl anderer Anwendungsbereiche (19 %) [1]. Von 2000 bis 2005 stieg die

Produktion von Tensiden in Westeuropa von 2,5 auf 2,9 Millionen Tonnen pro Jahr

[8]. 2004 erreichte der europäische Markt (EU 27 + Norwegen + Schweiz) für Seifen,

Reinigungs- und Pflegeprodukte ein Marktvolumen von 29,4 Mrd. € [9]. Der

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Einleitung & Zielsetzung

7

wachsende Markt, hohe Rohölpreise, Produzierbarkeit aus nachwachsenden

Rohstoffen, sowie gute biologische Abbaubarkeit lassen eine Steigerung des

Marktanteils biotechnologisch erzeugter Tenside erwarten [10]. Einige Prognose

sagen sogar einen Marktanteil der Biotenside von bis zu 10 % des Tensidmarktes in

naher Zukunft voraus [11].

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Einleitung & Zielsetzung

8

3.2 Zielsetzung

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Herstellung von mikrobiellen

Rhamnolipiden, welche die überwiegend von der Gattung Pseudomonas

produzierten Biotenside sind.

Ein Schwerpunkt hierbei lag auf der Entwicklung und Evaluierung einer

Standardprozessführung, welche es ermöglichen soll, diese Glykolipide in hohen

Konzentrationen auf nachwachsenden Rohstoffen herzustellen. Es galt für die

grundsätzlichen, prozessimmanenten Schwierigkeiten bei der biotechnologischen

Herstellung von Rhamnolipiden, wie z.B. der exzessiven Schaumbildung,

Lösungsstrategien zu finden und umzusetzen.

Eine weitere Kernaufgabe bestand darin, ein effizientes Screening-System auf Basis

eines Parallelbioreaktorsystems zu entwickeln. Hiermit sollte der Einfluss

verschiedener Pflanzenöle auf die gebildeten Produktmengen, als auch auf das

gebildete Produktspektrum untersucht werden.

Weiterhin sollten zwei Produktionsstämmen, Pseudomonas aeruginosa DSM 7108

und Pseudomonas species DSM 2874, in Hinblick auf ihr Produktbildungspotenzial

und das gebildete Produktverhältnis an Rhamnolipid 1 & 3 verglichen werden.

Zusätzlich sollte eine neue Analytik zur Detektion von Rhamnolipiden in Kulturbrühen

entwickelt und evaluiert werden. Als schnelle Prozessanalytik sollte hierzu FTIR-

Spektroskopie auf die prinzipielle Anwendbarkeit getestet und anschließend eine

quantitative Analysemethode aufgebaut werden.

Letztlich sollte auch im Verlauf der Arbeiten das neue Biotechnikum des hiesigen

Lehrstuhls aufgebaut und erweitert werden.

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Grundlagen & Theorie

9

4 Grundlagen & Theorie

4.1 Der Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa („falscher

Monade, grünspanig“) ist ein

monopolare und monotrich begeißeltes,

gram-negatives, gerades oder leicht

gekrümmtes bewegliches Stäbchen-

bakterium (0,5 – 0,8 µm x 1 – 3 µm),

welches ubiquitär verbreitetet, und

bevorzugt in terrestrischen und

aquatischen Lebensräumen auftritt [12].

Abb. 4.1 zeigt eine elektronen-

mikroskopische Aufnahme von

Pseudomonas species DSM 2874.

Entsprechend der phylogenetischen

Zuordnung in Tab. 4.1, gehört es zur Abteilung der Proteobakterien (=

Purpurbakterien) und hier zur Klasse der gamma-Proteobakterien. Es gehört zur

Ordnung der Pseudomonadales, und wurde der Familie Pseudomonadaceae

zugeordnet [12].

Tab. 4.1 Phylogenetische Zuordnung Pseudomonas aeruginosa

Domäne Bacteria

Abteilung Proteobacteria

Klasse Gammaproteobacteria

Ordnung Pseudomonadales

Familie Pseudomonadaceae

Gattung Pseudomonas

Art Pseudomonas aeruginosa (Migula, 1900)

Pseudomonas aeruginosa bildet Fluorescein und Pyocyanin als fluoreszierende

Farbstoffe. Es gehört zu den sogenannten „Krankenhauskeimen“, ist opportunistisch

pathogen und infiziert v.a. Patienten mit Immundefiziten, wie z.B.

Abb. 4.1 Elektronenmikroskopische Aufnahme von Pseudomonas aeruginosa DSM 2874. Die fädigen Strukturen zeigen Pili. Zur rechten unteren Ecke hin verlaufend, kann das Flagellum vermutete werden. (Aufnahme C. Syldatk)

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Grundlagen & Theorie

10

Transplantationspatienten nach Behandlung mit Immunsuppressiva, sowie HIV-

Patienten. Des Weiteren zeigt es sich verantwortlich für die Infektion von

Verbrennungs- und Operationswunden. Pseudomonas aeruginosa ist von Natur aus

resistent gegen eine Vielzahl von Antibiotika (R-Plasmid) [13]. Es bildet

unterschiedliche zellassoziierte und extrazelluläre Virulenzfaktoren aus [14]. Ein

schematischer Überblick dieser Faktoren ist in Abb. 4.2 aufgezeigt.

Abb. 4.2 Virulenzfaktoren von Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa verfügt sowohl über zellassoziierte Virulenzfaktoren (Flagellum, Pili Typ IV, Alginat/Biofilm, Lipopolysaccharid (LPS), Pili-unabhängige Adhesine), als auch über extrazelluläre Virulenzfaktoren (Proteasen, Hämolysine Phospholipase C & Rhamnolipide , Exotoxin A, Exoenzym S, Pyocyanin) [14].

Aufgrund der Ausbildung dieser Faktoren, sowie der potenziellen Humanpathogenität

erfolgt eine Zuordnung entsprechend der Biologischensicherheitsstufe L2 [15].

Pseudomonas aeruginosa ist ein fakultativ aerober Organismus und besitzt fünf

identifizierte aerobe terminale Oxidasen [16]. Während ein mikroaerobes Milieu das

Wachstum dieses Biofilmbildners sogar zu begünstigen scheint [17], findet

Energiegewinn und Wachstum unter anaeroben Bedingungen nur in Anwesenheit

von Stickstoff-Oxiden, wie z.B. Nitrat, als alternativen, terminalen

Elektronenakzeptoren mittels Denitrifikation statt. Wachstum findet bis zu 41°C statt,

wobei der optimale Temperaturbereich zwischen 30 -37 °C liegt [12].

Page 27: Diss Leitermann 26 8format

Grundlagen & Theorie

11

Als Kuriosum zeigt Pseudomonas aeruginosa die Fähigkeit Natriumlaurylsulfat

(SDS), einen Hauptbestandteil vieler schäumender Pflegeartikel und

Hygieneprodukte, zu verstoffwechseln. Während viele Bakterien mit dem Tod auf

vorbeugenden Hygienemaßnahmen reagieren, lässt sich P. aeruginosa von

Zahnpasta, Shampoo oder Duschgel nicht beeindrucken [18].

4.2 Tenside und Biotenside

Niedermolekulare Verbindungen, deren Moleküle einen hydrophilen (polaren) und

hydrophoben (unpolaren) Teil enthalten werden im Allgemeinen als Tenside

(englisch „surfactants“ oder „detergents“) bezeichnet. Als Folge ihres hieraus

begründeten amphiphilen Charakters, zeigen Tenside in verschiedensten

Lösungsmitteln, insbesondere in Wasser, grenzflächenaktive Eigenschaften und

lagern sich an Grenzflächen an. Dieser als Grenzflächenadhäsion bezeichnete

Vorgang führt aus thermodynamischen Gründen zu folgenden Effekten:

a) Absenkung der Grenzflächenspannung zwischen Wasser und der

angrenzenden Phase

b) Veränderung der Benetzungseigenschaften zwischen Wasser und Feststoffen

c) Ausbildung elektrischer Doppelschichten an den Grenzflächen

Entsprechend Tab. 4.2 können Tenside anhand ihres Molekülbaus und ihrer

hydrophilen Gruppen eingeteilt werden [19].

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Grundlagen & Theorie

12

Tab. 4.2 Klassifizierung von Tensiden (modifiziert, nach [19]).

Klassifizierungskriterium

hydrophilen Gruppen Beispiel hydrophil hydrophob

I. Nichtionische Tenside -OH (Alkohol)

-O- (Ether)

II. Anionische Tenside -COO- (Carboxylat)

-SO3

- (Sulfonat);

-SO4- (Sulfat)

III. Kationische Tenside R4-N+ (quartäre

Ammoniumsalze)

R3-S+ X-

(Sulfoniumsalze)

IV. Zwitterionische Tenside Aminoxide R3-N+ -O-

Lecithine

(Phospholipide)

Tenside lagern sich in einem Dispersionsmedium (z.B. Wasser) spontan zu

Aggregaten zusammen, wobei sie aufgrund ihres molekularen Aufbaus zur

Phasentrennung neigen. Schematisch ist dieser Vorgang in Abb. 4.3 dargestellt.

Schon bei niedrigen Konzentrationen bewirkt das Bestreben der Tensidmoleküle, mit

ihrem hydrophoben Molekülteil möglichst wenig Kontakt zur wässrigen Umgebung zu

haben, eine Anreicherung an den Grenzflächen und eine Änderung der

physikalischen Eigenschaften des Lösungsmittels, wie z.B. die Oberflächen-

spannung. Wird die Tensidkonzentration weiter erhöht, kommt es ab einer

bestimmten Konzentration (der sog. cmc, „critical micelle concentration“) zu einer

vollständigen Belegung der Grenzflächen. Mit dem Erreichen der

Sättigungskonzentration beginnen die Tensidmoleküle sich in der Lösung zu

Mikrostrukturen (z.B. Mizellen von lat. mica = Klümpchen, kleiner Bissen)

zusammenzulagern, und zwar derart, dass die unpolaren Molekülteile zum Inneren

der Struktur hin orientiert und damit dem Kontakt mit Wasser entzogen sind. Die

Oberflächenspannung, die zunächst durch die Einlagerung der Tensidmoleküle

zwischen die Wassermoleküle verringert wurde, verändert sich oberhalb der cmc

Page 29: Diss Leitermann 26 8format

Grundlagen & Theorie

13

praktisch nicht mehr. Über die cmc hinaus zugesetztes Tensid vermehrt zunächst

lediglich die Zahl der Mikrostrukturen [20].

Abb. 4.3 Schematische Darstellung von Tensiden in wässriger Lösung, sowie die Beeinflus-sung der Oberflächenspannung in Abhängigkeit der Tensidkonzentration.

Tenside sind in der Lage eine Vielzahl unterschiedlicher Mikrostrukturen zu bilden.

Kugelförmige, zylindrische Mizellen aber auch unregelmäßige Bilayer und Vesikel,

sowie lamellenartige Zusammenlagerungen wurden beschrieben. Die Ausbildung

dieser Strukturen wird beeinflusst vom pH-Wert, der Tensidkonzentration,

Temperatur und der Ionenstärke der Lösung [21]. In der folgenden Abbildung sind

drei für Tenside typische Mikrostrukturen schematisch dargestellt.

Abb. 4.4 Von Tensiden oberhalb der cmc ausgebildete typische Mikrostrukturen (nach [21]).

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Grundlagen & Theorie

14

4.2.1 Biotenside

Tenside biologischen Ursprungs werden als Biotenside bezeichnet und sind eine

strukturell sehr heterogene Gruppe von oberflächenaktiven Substanzen, die sowohl

von Eukaryonten als auch von Prokaryonten synthetisiert werden. Biotenside

besitzen wie auch die synthetischen Tenside eine amphiphile Molekülstruktur.

Während letztere meist nach den Eigenschaften ihrer polaren Gruppe eingeteilt

werden, erfolgt die Einordnung der Biotenside nach ihrem biochemischen Charakter.

Der hydrophile Molekülteil kann aus Mono-, Oligo- oder Polysacchariden,

Aminosäuren bzw. Peptiden oder aus Carboxylat- oder Phosphatgruppe bestehen.

Der hydrophobe Teil zeigt meist eine Zusammensetzung aus gesättigten,

ungesättigten (Hydroxy-) Fettsäuren oder Fettalkoholen. Typischer Weise werden die

Biotenside dabei in folgende Klassen unterteilt [22]:

• Phospholipide, Mono- und Diglyceride, Fettsäuren Bsp.: Phospholipide der Zellmembran, Corynomycolsäure aus

Corynebacterium lepus

• Lipopeptide und Lipoaminosäuren Bsp.: Surfactin aus Bacillus subtilis; Lysinlipid aus Agrobacterium

tumefaciens

• Polymere: Lipoproteine, Lipopolysaccharide u.a.

Bsp.: Emulsan aus Acinobacter calcoaceticus

• Glykolipide Bsp.: Sophoroselipide aus Candida bombicola; Rhamnoselipide aus

Pseudomonas aeruginosa

Auf die Rhamnoselipide (Rhamnolipide), die der größten Biotensidstoffklasse der

Glykolipde angehören und mit denen sich diese Arbeit befasst wird im folgenden

Abschnitt näher eingegangen.

Page 31: Diss Leitermann 26 8format

Grundlagen & Theorie

15

4.3 Rhamnolipide: Eigenschaften, Biosynthese und Regulation

Biotenside welche aus L-Rhamnose und überwiegend ß-Hydroxydecansäure-

Untereinheiten aufgebaut sind, werden als Rhamnolipide bezeichnet. Pseudomonas

sp., insbesondere Pseudomonas aeruginosa, sind bekannt dafür Rhamnolipide unter

wachstumslimitierenden Bedingungen auf Kohlenwasserstoffen oder anderen

hydrophoben Substraten, wie z.B. Pflanzenölen oder n-Hexan, zu bilden [22]. Der

molekulare Aufbau der bisher am häufigsten untersuchten Rhamnolipide ist in Abb.

4.5 dargestellt.

Abb. 4.5 Typische Rhamnolipide (nach [23]).

1949 beschrieben Jarvis und Johnson Rhamnolipid 3 (RL 3: L-rhamnosylrhamnosyl-

3-hydroxydecanoyl-3-hydroxydecanoat; Schmelzpunkt MP = 86 °C) als erstes

Glykolipid aus P. aeruginosa [24]. Dieses zusammen mit Rhamnolipid 1 (RL 1: L-

rhamnosyl-3-hydroxydecanoyl-3-hydroxydecanoat stellen die am häufigsten

auftretende Form der Rhamnolipide dar [23]. Das Auftreten zweier weitere

Rhamnolipide, Rhamnolipid 2 und 4, wurden bei Versuchen mit ruhenden Zellen von

Pseudomonas species DSM 2874 beobachtet [25, 26]. Yamaguchi et al. (1976)

berichteten von Rhamnolipiden, ähnlich RL 1 und RL 3, welche zusätzlich an ihren

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Grundlagen & Theorie

16

terminalen Rhamnoseeinheiten mit einer α-Decensäurekette acyliert sind

(Rhamnolipid A und B; RL A Mp = -3,2 °C bzw. RL B Mp = 84,7 °C) [27, 28]. Bis heute

wurde eine Vielzahl weiterer Rhamnolipid gefunden, welche sich v.a. in der Art ihrer

Fettsäureuntereinheiten (R2C10C10; R1C10C10; R2C10C12; R1C10C12; R1C12:1C10;

R1C12:2; R1C8:2; R1C10C12:1) unterscheiden [29, 30].

Alle Rhamnolipide zeigen sehr gute oberflächenaktive Eigenschaften. Stellvertretend

sind die Werte von Rhamnolipid 1 - 4 aus Pseudomonas species DSM 2874,

bezüglich Oberflächen-, Grenzflächenspannung und cmc in Tab. 4.3 aufgeführt.

Tab. 4.3 Grenzflächenaktive Eigenschaften von Rhamnolipiden in Wasser aus Pseudomonas species DSM 2874 [26]. * gegen n-C16.

Stamm Rhamnolipid σmin (mN/m) γmin (mN/m) cmc (mg/l)

RL 1: R1C10C10 26,0 4* 20

RL 3: R2C10C10 27,0 < 1* 10

RL 2: R1C10 25,0 < 1* 200

RL 4: R2C10 30,0 < 1* 200

Pseudomonas sp. DSM 2874

RL 1 + RL 3 mix 26,0 < 1* 20

Rhamnolipide sind durch ihre terminale Fettsäure schwache Säuren. Die

Säuredissoziationskonstante von Rhamnolipiden kann durch ihre starken

oberflächenaktiven Eigenschaften, sowie der pH- und konzentrationsabhängigen

Ausbildung verschiedener Mikrostrukturen nur schwer präzise ermittelt werden. So

ergaben sich z.B. für Rhamnolipid 1 pKs-Werte von 4,28 ± 0,16 (unterhalb der cmc)

bis hin zu 5,50 ± 0,06 (oberhalb der cmc) [31].

4.3.1 Biosynthese der Rhamnolipide in Pseudomonas species

Die Biosynthese der hydrophilen Zuckergruppen als auch der hydrophoben

Fettsäuregruppen der Rhamnolipide erfolgt de novo [32, 33]. Ausgehend von einem

Pflanzenöl (Triglycerid) als C-Quelle, wie es in dieser Arbeit hauptsächlich zur

Anwendung kam, soll exemplarisch der Biosyntheseweg der Rhamnolipide

dargestellt werden. Eine schematische Darstellung des Rhamnolipidanabolismus ist

in Abb. 4.6 dargestellt. Aufgrund der unterschiedlichen Ausgangsstoffe, in Form von

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Grundlagen & Theorie

17

Fettsäuren und Glycerol, gibt es verschiedene Biosynthesewege der

Rhamnolipidbildung. Es kann zwischen der hydrophilen Rhamnosegruppe und der

hydrophoben Hydroxydecansäuregruppe unterschieden werden. An erster Stelle

steht die Hydrolyse der Triacylglyceride mittels zelloberflächengebundener oder ins

Medium ausgeschiedener Lipasen, da diese nicht membrangängig sind. Lipasen sind

Esterasen (Acylhydrolasen), die oftmals Serin im aktiven Zentrum haben und erst an

der Wasser-Lipid-Grenzschicht aktiv werden. Die entstehenden langkettigen

Fettsäuren werden durch Permeasen in die Zelle transportiert, kurzkettige Fettsäuren

(vermutlich in der ungeladenen und protonierten Form) und das entstandene

Glycerol diffundieren passiv durch die Membran [13].

Der Abbau der Fettsäuren erfolgt in mehreren Schritten. Zunächst erfolgt eine ATP-

abhängige Aktivierung der Säure mittels der Fettsäure-Coenzym-A-Lingase. Die so

aktivierte Fettsäure durchläuft nun mehrmals den so genannten β-Oxidationszyklus,

wobei in jedem Durchlauf die Fettsäurekette um 2 C-Einheiten verkürzt und ein

Acetyl-CoA Molekül gebildet wird. Dies geschieht bis zum vollständigen Abbau der

Fettsäure [34].

Zur Fettsäuresynthese des hydrophoben Teils, erfolgt nun eine Carboxylierung des

Acetyl-CoAs, mittels eines biotinabhängigen Enzymkomplexes (Acetyl-CoA-

Carboxylase), zu Malonyl-CoA. Die Biosynthese der langkettigen Fettsäuren erfolgt

an einem Acyl-Carrier-Protein (ACP), welches ähnlich wie Coenzym A eine reaktive

SH-Gruppe besitzt. Die aus CO2 eingebaute Carboxygruppe wird in den

nachfolgenden Kondensationsreaktionen wieder als CO2 abgespalten. In drei

Schritten und unter Aufwendung von zwei NADPH, erfolgt dann die Reduktion der β-

C=O-Gruppe über 3-Hydroxyacyl- und die Enoyl-ACP-Stufe zur Acyl(CH2)-Gruppe.

Dabei verbleibt die wachsende Fettsäure als reaktiver Thioester an die Thiolgruppe

des ACP gebunden. Dies wiederholt sich bis sich ein C10-Körper gebildet wurde.

Dieser wird nun nicht vollständig zum Decanoyl-ACP umgewandelt, sondern

verbleibt in der β-hydroxylierten Form als β-Hydroxydecanoyl-ACP. Durch

Veresterung zweier β-Hydroxydecanoyl-ACP-Moleküle entsteht die Vorstufe des

hydrophoben Molekülteils der Rhamnolipide, β-Hydroxydecanoyl-β-hydroxydecanoyl-

ACP bzw. CoA, wobei noch ungeklärt ist welche Form gebildet wird [32-35].

Die Zuckersynthese des hydrophilen Rhamnoseteils kann auf zwei Arte erfolgen.

Zum einen kann das bei der Triglyceridspaltung entstandene Glycerol, nach

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Grundlagen & Theorie

18

Aktivierung mittels ATP, auf Stufe des Glycerinaldehyd-3-phosphat in die

Gluconeogenese eintreten. Zum anderen können die in der β-Oxidation gewonnenen

Acetyl-CoA Einheiten mit Hilfe des Glyoxylatzyklus in C4-Dicarbonsäuren

umgewandelt werden. Die so gebildete Oxalsäure wird unter Energieverbrauch

mittels einer PEP-Carboxylase zu Phosphoenolpyruvat umgewandelt, und in die

Gluconeogenese eingeschleust. Am Ende entsteht Glucose-1-phosphat. In der Regel

erfolgt die Umwandlung der Zuckerbausteine auf der Stufe der nukleosidaktivierten

Zucker. Ausgehend von einer Desoxy-Thymidindiphospho-D-Glucose erfolgt

schließlich die Bildung einer aktivierten Thymidin-diphospho-Rhamnose [35, 36].

Die Bildung von Rhamnolipid 1 erfolgt nun durch glykosidische Verknüpfung von β-

Hydroxydecanoyl-β-hydroxydecanoyl-ACP bzw. CoA mit einer Thymidin-diphospho-

Rhamnose durch die Rhamnosyltransferase A, wobei TDP sowie ACP/CoA

abgespalten wird. Wird durch die Rhamnosyltransferase B eine weitere Thymidin-

diphospho-Rhamnose-Einheit angehängt, entsteht Rhamnolipid 3 [37]. Über die

Synthese von Rhamnolipid 2 und Rhamnolipid 4 ist bisher wenig bekannt. Aller

Wahrscheinlichkeit nach wird ihre Synthese ähnlich der von RL 1 + 3 verlaufen,

wobei jedoch von einer β-Hydroxydecanoyl-Einheit ausgegangen wird. Ob die

Verknüpfung der Rhamnoseeinheiten ebenfalls von den Rhamnosyltransferase A + B

katalysiert wird, oder ob andere Rhamnosyltransferasen diese Reaktionen vermitteln,

ist bisher nicht bekannt. Eine Bildung aus RL 1 bzw. RL 3 durch enzymatische

Abspaltung der peripheren β-Hydroxydecanoyl-Einheit ist prinzipiell denkbar, jedoch

unter energetischen Gesichtspunkten unwahrscheinlich.

Die physiologische Funktion der Rhamnolipide ist noch nicht vollständig geklärt, und

verschiedene Ursachen für ihre Synthetisierung sind denkbar. Eine offensichtliche

Funktion der Rhamnolipide scheint die Verbesserung der biologischen Verfügbarkeit

von hydrophoben Substraten zu sein [38, 39]. Gleichfalls scheinen sie eine wichtige

Rolle für Pseudomonas aeruginosa bei der Ausbildung von Biofilmen und bei der

Anhaftung/Ablösung von Oberflächen zu spielen [40]. Eine weitere Funktion der

Rhamnolipide kann in ihren bakteriostatischen Eigenschaften begründet sein, die

Pseudomonas aeruginosa einen ökologischen Selektionsvorteil gegenüber

Nahrungskonkurrenten verschaffen kann [41].

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Grundlagen & Theorie

19

Abb. 4.6 Schematische Darstellung der Rhamnolipidbiosynthese auf Pflanzenölen (modifiziert nach [32, 34, 35, 37]).

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Grundlagen & Theorie

20

4.3.2 Genetische Regulation der Rhamnolipidbiosynthese

Die Expression von Virulenzfaktoren, zu denen auch die Rhamnolipide gehören,

sowie die Ausbildung von Biofilmen unterliegen in P. aeruginosa der Kontrolle eines

zelldichteabhängigen, interzellulärem Kommunikationsystems, welches als „Quorum

Sensing System“ (QS) bezeichnet wird [42].

Pseudomonas aeruginosa verfügt über zwei hierarchisch angeordnet QS-Systeme,

das übergeordnete Las-System, sowie das dem ersteren untergeordneten Rhl-

System. Eine grafische Darstellung der beiden Systeme ist in Abb. 4.7

wiedergegeben.

Abb. 4.7 Quorum Sensing Systeme von P. aeruginosa und deren Interaktion (nach [43]).

Das Enzym LasI (kodiert durch das lasI Gen) bildet den Autoinducer N-(3-

oxododecanoyl)-L-Homoserinlacton (auch PAI-1, 3OC12-HSL oder OdDHL genannt).

PAI-1 wird aktiv (MexAB-OprM Pumpe) aus der Zelle ausgeschleusst. Bei Erreichen

eines extrazellulären Konzentrationsschwellenwertes kommt es zu einer Bindung von

PAI-1 an LasR, welches anschließend zu einer positiven Regulierung der lasI

Promotorregion und damit zu einer stärkeren Expression von lasI, sowie einer

verstärkten Bildung von PAI-1 führt. Zusätzlich kommt es zu einer positiven

Regulation des rhlR Promotors. Wird das RhlR Protein nun durch den zweiten

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Grundlagen & Theorie

21

Autoinducer N-butanoyl-L-Homoserinlacton (auch PAI-2, C4-HSL oder BHL genannt)

aktiviert, kommt es in Folge dessen zu einer Expressionsaktivierung des für die

Bildung von PAI-II zuständigen rhlI Gens, sowie zur Hochregulierung der für die

Bildung der Rhamnosyltransferasen zuständigen Gene (rhlA und rhlB).

Interessanterweise ist PAI-I in der Lage RhlR zu inhibieren, was bedeutet das die

Interaktion der beiden QS-Systeme nicht nur auf Transkriptionsebene, sonder auch

auf posttranskriptionaler Ebene stattfindet [44]. Versuche von Pearson et al. zeigten,

dass das Las-System deutlich träger als das Rhl-System auf die Aktivierung durch

ihre jeweiligen Autoinducer reagiert [45]. Dies ist in ihrer Membrangängigkeit

begründet. Während PAI-II frei über die Zellmembran diffundieren kann, und sich

innerhalb von 30s einen Konzentrationsgleichgewicht einstellt, scheint bei PAI-I

aktive Transportvorgänge für den Membrantransport zuständig zu sein, welche sich

in einer Gleichgewichtseinstellung von bis zu 5 min und einem

Konzentrationsunterschied von 3:1 über der Membran zeigen.

Rhamnolipide sind spezielle Metabolite. Ihre Bildung geht einher mit dem Einsetzen

der stationären Wachstumsphase. Der aufwärts von rhlA gelegene Promotorbereich

verfügt mutmaßlich über einen Typ σ70 bzw. σ54 Promotor, welcher durch

Umweltsignale, wie z.B. Stickstoffverfügbarkeit reguliert wird [46]. Bei Versuchen mit

ruhenden Zellen von Pseudomonas species DSM 2874 verursachte die Zugabe einer

Stickstoffquelle eine Inhibierung der Rhamnolipidbildung [25]. Einen weiteren

positiven Effekt auf die Bildung von Rhamnolipiden konnte auch durch die

Limitierung von Mg-, Ca-, K-, Na-, Fe-Ionen erreicht werden [47].

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Grundlagen & Theorie

22

4.3.3 Prozessführungsstrategien & Stand der Technik

Im Wesentlichen kommen vier Prozessführungsstrategien für die biotechnologische

Rhamnolipidproduktion in Frage. Die gebildete Produktmenge als auch die

Produktzusammensetzung hängen dabei von verschiedenen Faktoren, wie z.B. dem

verwendeten Stamm, dem Substrat, sowie den Kultivierungsbedingungen ab. Was

die Prozessführung betrifft, kommen absatzweise (batch) bzw. absatzweise

Fermentationen mit Zufütterung (fed-batch) am häufigsten zur Anwendung für die

Rhamnolipidproduktion [22]. Allen Prozessführungsstrategien ist gemein, dass sie

eine stationäre Wachstumsphase erreichen und unter wachstumslimitierenden

Bedingungen ablaufen. Des Weiteren ist eine besser Produktbildung zu erwarten,

wenn es im Prozessverlauf zu einer Limitierung von zumindest einer

Nährsalzkomponente (z.B. der N-Quelle) kommt [26].

Eine ebenfalls gut untersuchte Methode zur Rhamnolipidherstellung beruht auf einer

zweistufigen Prozessführung und Verwendung von ruhenden Zellen [25]. Hierbei

dient die erste Prozessstufe der Biomassebildung. In der zweiten Prozessstufe

erfolgt unter wachstumslimitierten Bedingungen die eigentliche Rhamnolipid-

produktion. Die höchsten mit dieser Prozessführung erreichten Rhamnolipid-

konzentrationen lagen bei 45 g/l Rhamnolipid [23]. Eine zweistufige Prozessführung

kombiniert aus den beiden oben beschriebenen Methoden, bei der sowohl in der 1.

als auch in der 2. Prozessstufe Produkt gebildet wird, ist ebenfalls funktionell

(Publikation V). Gleichfalls beschrieben sind kontinuierliche Fermentationsverfahren,

mit volumetrischen Produktivitäten zwischen 0,007 - 2 g/l·h Rhamnolipid [48, 49].

Immobilisierte Zellen in einer semi-kontinuierlichen Prozessführung zeigten

Produktbildungraten von 43 mg/lh [22]. Eine umfangreiche Übersicht

unterschiedlichster Verfahren zur mikrobiellen Rhamnolipidherstellung ist in Tab. 4.4

aufgezeigt.

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Grundlagen & Theorie

23

Tab. 4.4 Verfahrensübersicht zur mikrobiellen Herstellung von Rhamnolipiden. * aus [22]. Abkürzung n.b. = nicht bekannt.

Prozesstyp Stamm C-Quelle [g/l] RL [g/l]

Y p/s X

[g/l] Y p/x t [h]

Pv [g/lh]

Referenz

S/Batch/Fed-batch P. a. Glycerol [30] 2,50 0,08 n.b. n.b. 96,00 0,03 Jarvis & Johnson 1949

S/Batch/Fed-batch P. a. Glycerol [30] 2,00 0,07 n.b. n.b. 120,00 0,02 Hauser & Karnovsky 1954

S/Batch/Fed-batch P.a. Glycerol [10] 1,00 0,10 1,47 0,68 192,00 0,01 Santa Anna et al., 2002

S/Batch/Fed-batch P. a. KY 4025 n-Paraffin [90] 8,50 0,09 n.b. n.b. 144,00 0,06 Itoh et al., 1971; Itoh & Suzuki, 1972

S/Batch/Fed-batch P. sp. n-Paraffin [50] 14,00 0,28 n.b. n.b. 120,00 0,12 Yamaguchi et al. 1976

S/Batch/Fed-batch P. sp. MUB n-C14/15 [20] 2,90 0,15 3,40 0,85 48,00 0,06 Wagner et al., 1983*

S/Batch/Fed-batch P. sp. DSM 2874 n-C14/15 [80] 12,80 0,16 21,0 0,61 180,00 0,07 Wagner et al., 1984*; Syldatk et al.,

1985a

S/Batch/Fed-batch P. a. UI 29791 Maisöl [75] 46,00 0,61 12,0 3,83 192,00 0,24 Linhardt et al., 1989; Daniels et al.,

1988*

S/Batch/Fed-batch P.a. UG 2 Maisöl [12,75] 2,10 0,17 n.b. n.b. 384,00 0,01 Mata-Sandoval et al., 2001*

S/Batch/Fed-batch P.a. PTCC1637 Maisöl [250] 12,50 0,05 n.b. n.b. 120,00 0,10 Tahzibi et al, 2004

S/Batch/Fed-batch P. a. 44T1 Olivenöl [20] 7,65 0,38 6,00 1,28 72,00 0,11 Robert et al. 1989

S/Batch/Fed-batch P. a. 44T1 Olivenöl [20] 9,00 0,45 n.b. n.b. 120,00 0,08 Parra et al. 1990*

S/Batch/Fed-batch P.a. J4 Olivenöl [100] 3,60 0,04 n.b. n.b. 138,50 0,03 Wei et al, 2005

S/Batch/Fed-batch P. a. DSM 7107 & 7108 Sojaöl [125] 78,00 0,62 n.b. n.b. 167,00 0,47 Giani et al. 1997

S/Batch/Fed-batch P. a. DSM 7107 & 7108 Sojaöl [163] 112,00 0,69 n.b. n.b. 264,00 0,42 Giani et al. 1997

S/Batch/Fed-batch P.a. LBI Sojaöl (Abfall)

[10] 11,72 1,17 1,48 7,91 144,00 0,08 Nitschke et al., 2005a

S/Batch/Fed-batch P.a. DS10-129 Sojaöl [6] 4,31 0,72 8,00 0,53 288,00 0,01 Rahman et al, 2002

S/Batch/Fed-batch P.a. BYK-2 KCTC

18012P Fischöl [25] 17,00 1,47 5,30 3,20 216,00 0,08 Lee et al., 2004

S/Batch/Fed-batch P.a. BYK-2 KCTC

18012P Fischöl [30,2] 22,70 0,75 6,10 3,72 264,00 0,09 Lee et al., 2004

S/Batch/Fed-batch P.a.IFO 3924 Ethanol [55] 32,00 0,58 3,40 9,41 168,00 0,19 Matsufuji et al. 1997*

S/Batch/Fed-batch P.a.IFO 3924 Ethanol [65] 32,00 0,49 n.b. n.b. 192,00 0,17 Nakata et al. 1998

S/Batch/Fed-batch P.a. S2 Glucose [40] 6,06 0,15 2,62 2,31 480,00 0,01 Chen et al., 2007a

S/Batch/Fed-batch P.a. S2 Glucose [40] 2,40 0,06 n.b. n.b. 141,20 0,02 Chen et al., 2007b

S/Batch/Fed-batch P.a. S2 Glucose [40] 5,30 0,13 n.b. n.b. 53,00 0,10 Chen et al., 2007b

Prozesstyp Stamm C-Quelle [g/l] RL [g/l]

Y p/s X

[g/l] Y p/x t [h]

Pv [g/lh]

Referenz

Batch ruhende Zellen P. sp. DSM 2874 n-C14 [80] 18,50 0,23 5,00 3,30 280,00 0,07 Syldatk et al. 1984*

Batch ruhende Zellen P. sp. DSM 2874 n-C14/15 [40] 10,00 0,25 5,00 2,00 168,00 0,06 Syldatk et al. 1985b

Batch ruhende Zellen P. sp. DSM 2874 Sojaöl [40] 7,50 0,18 5,00 1,50 168,00 0,04 Syldatk et al. 1985b

Batch ruhende Zellen P. sp. DSM 2874 Glycerol [40] 8,50 0,21 5,00 1,70 168,00 0,05 Syldatk et al. 1985b

Batch ruhende Zellen P. sp. DSM 2874 Glucose [20] 4,50 0,11 5,00 0,90 168,00 0,03 Syldatk et al. 1985b

Fed-batch ruhende

Zellen P. sp. DSM 2874 Ölsäure [198] 45,00 0,23

10,0

8 4,46

1080,0

0 0,04 Trummler et al., 2003

Prozesstyp Stamm C-Quelle [g/l] D[1/h] Y p/s X

[g/l] Ps

[g/g*h]

Pv [g/lh]

Konti P.a. DSM 2659 Glucose [20] 0,14 0,05 2,40 0,06 0,13 Gruber et al., 1993

Konti P.a. DSM 2659 Glucose [20] 0,05 0,08 2,50 0,03 0,007 Gruber et al., 1993

Konti P.a. DSM 2659 Glucose [20] 0,18 0,15 13,3 0,04 0,55 Gruber et al., 1993

Konti P.a. DSM 2659 Glucose [20] 0,10 0,15 7,70 0,04 0,29 Gruber et al., 1993

Konti P.a. DSM 2659 Maisöl [40] 0,10 0,48 0,80 0,06 2,00 Ochsner et al, 1996*

Semi-Konti

immobilisiert P. sp. DSM 2874 n.b. n.b. n.b. n.b. 0,02 0,04 Siemann & Wagner, 1993*

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Grundlagen & Theorie

24

4.3.4 Wirtschaftliche Aspekte und Anwendungsbereiche der Rhamnolipide

Qualitativ lassen sich die in Kapitel 3.1 erwähnten wirtschaftlichen Prognosen durch

eine Sichtung der Patent- und Publikationslage der vergangen 20 Jahre verifizieren.

Abb. 4.8 gibt exemplarisch die Ergebnisse einer Patent- und Publikationssuche über

20 Jahre nach den Stichworten „Rhamnolipid“ und „Biosurfactants“ in den

Datenbanken der European Patent Office und der Literaturechercheplattform ISI web

of knowledge, wieder (http://ep.espacenet.com; http://portal.isiknowledge.com). Geht

man davon aus, dass Rhamnolipide auch dem Stichwort der „Biosurfactants“

zuzuordnen sind, wird weiter deutlich, dass Rhamnolipide die am meisten

publizierten und patentierten Biotenside zu sein scheinen.

Lang und Wullbrandt bestimmten die Produktionskosten biotechnologisch

hergestellter Rhamnolipide im Fermentationsmaßstab von 20 – 100 m3 zu 20 – 5 US

$/kg [50]. Im Gegensatz hierzu liegen die Herstellungskosten synthetischer Tenside

wie Ethyloxylat oder Alkylpolyglucosid bei 1 – 3 US $/kg. Eine weitere

Kostensenkung bei der Herstellung von Rhamnolipiden in Kombination mit einem

weiter steigenden Erdölpreis, könnte deshalb zu einer Ausweitung ihrer Nutzung

führen.

Zurzeit scheint es nur zwei Firmen zu geben, die Rhamnolipide kommerziell

herstellen. Dabei handelt es sich um die Firma Jeneil Biosurfactant Co.,LLC (400 N.

Dekora Woods Blvd. August, Saukville, WI 53080, USA), sowie die Rhamnolipid

Inc.(25 Second Street Suite 340,St. Petersburg, Fl 33701,USA). Über die genauen

Abb. 4.8 Anzahl an neueren Patente und Publikationen zu den Stichworten „Rhamnolipid“ und „Biosurfactants“. Stand November 2007. (Quellen: European Patent Office (EPO) (http://ep.espacenet.com); ISI web of knowledge

(http://portal.isiknowledge.com)).

Jahr

1990 1995 2000 2005 2010

Anz

ahl P

aten

te

0

10

20

30

40

50

Anz

ahl P

ublik

atio

nen

0

20

40

60

80Patente Rhamnolipid [47] Patente Biosurfactants [123] Publikationen Rhamnolipid [411] Publikationen Biosurfactants [606]

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Grundlagen & Theorie

25

Herstellungsverfahren ist nichts bekannt, außer dass sie biotechnologisch mit Hilfe

von Pseudomonas species Stämmen produziert werden.

Der aktuelle Marktpreis rangiert von 200 US $/kg für eine 20 %

Rhamnolipidformulierung technischer Qualität (Jeneil JBR 425) bis hin zu 6000 US

$/kg für ein >99% reines Gemisch aus Rhamnolipid 1 & 3 (Jeneil JBR 599)

(persönliche Kommunikation D. Develter, Leiter F & E, Ecover N.V., Belgien).

Im größten bekannten Maßstab von 17 m3 wurden Rhamnolipide von der Hoechst

AG hergestellt, bis diese 1999 mit dem französischen Chemiekonzern Rhône-

Poulencin fusionierte und hierauf die Rhamnolipidproduktion eingestellt wurde [51].

Die potenziellen Applikationenbereiche von Rhamnolipiden sind vielseitig. Einen

groben Überblick versucht die folgende Aufstellung zu geben:

• Umweltsanierung

In der biologischen Bodensanierung, v.a. in Böden die mit organischen Stoffen

wie z.B. Mineralölprodukten kontaminiert sind, führt die Zugabe von

Rhamnolipiden zu einem verbesserten Abbau, da sie die biologische

Verfügbarkeit dieser meist hydrophoben Substanzen deutlich verbessern [52].

Beispielsweise erhöhen Rhamnolipide die Mobilisierung von Hexadecan und

Phenantren in kontaminierten Böden besser als chemische Tenside wie SDS

oder Tween 80 [53].

• Tertiäre Erdölförderung

Die für die Bodensanierung beschriebenen Eigenschaften der Rhamnolipide

lassen sich prinzipiell auch für die Erdölförderung nutzen. Diese vor allem in

den 1970er und 1980er erdachte Anwendung zur tertiären Erdölförderung

wurde aber bisher, vermutlich aus Kostengründen, noch nicht im

großindustriellen Maßstab umgesetzt. Publikationen zu diesem Thema in den

letzten Jahren zeigen jedoch, dass diese Art der potenziellen Anwendung

immer noch von Relevanz ist [54, 55].

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Grundlagen & Theorie

26

• Haushalts- und Reinigungsprodukte

Rhamnolipide werden bereits heute in Haushaltsreinigern eingesetzt. Als

Beispiel sei der Glas- und Flächenreiniger der belgischen Firma Ecover N.V.

(Industrieweg 3, 2390 Malle, Belgien) genannt, welcher vergleichbare

Reinigungswirkung wie konventionelle Reiniger erzielt. Das Produkt ist

umweltfreundlich, sowie rasch und vollständig biologisch abbaubar.

Rhamnolipid wirkt hierbei synergetisch in Kombination mit weiteren Tensiden

(persönliche Kommunikation D. Develter, Leiter F & E Ecover N.V.)

• Kosmetik

Inzwischen werden Rhamnolipide ebenfalls in Kosmetikprodukten eingesetzt.

Als Anwendungen sind zu nennen sogenannte „Anti-aging“-Produkte,

Augencremes, Körperlotionen, Wund- und Heilsalben wie auch Duschgels und

Babyreinigungstücher. Hauptgründe hierin Rhamnolipide einzusetzen sind die

guten Tensideigenschaften, z.B. für die Emulsionsbildung in Cremes, sowie

ihre antibakteriellen/fungizide Wirksamkeit in Kombination mit einer guten

Verträglichkeit (http://www.aurorabeautylabs.com; [27, 56]).

• Medizin

Auch für pharmazeutische Präparate finden sich Einsatzbereiche für

Rhamnolipide aufgrund ihrer antimykotischen/antibakteriellen/bakterio-

statischen Eigenschaften [57, 58]. Beispielsweise konnte eine antimikrobielle

und antiadhesive Wirkung gegen Mycobacterium tuberculosis nachgewiesen

werden [59]. Untersuchungen von Stipcevic et al. zeigten, das Rhamnolipide

auch zu einer beschleunigten Abheilung von Brandwunden führen [60].

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Grundlagen & Theorie

27

• Lebensmittelverfahrenstechnik

Die eben genannten Eigenschaften, können auch bei der Beschichtung von

Lebensmittel bzw. Lebensmittelverpackungen Verwendung finden. Auch für

die Verbesserung der Eigenschaften von Backerzeugnissen, in Bezug auf

Stabilität, Textur, Härte, Form, Volumen etc., können Rhamnolipide eingesetzt

werden [61]. Die Verwendung als Emulgator ist ebenfalls denkbar [62].

Weiterhin kann aus Rhamnolipiden durch Biotransformation oder chemische

Hydrolyse L-Rhamnose gewonnen werden [63]. Diese wiederum dient als

Ausgangssubstanz für 2,5-Di-methyl-4-hydroxyfuran-3-on, eines der süßesten

Aromen das bekannt ist, und eine natürliche Aromakomponente von Ananas-

und Erdbeeraroma ist [64].

• Landwirtschaft

Auf ihren antimykotischen Eigenschaften beruht der Einsatz von

Rhamnolipiden als Bestandteil des Biofungizids ZONIXTM™ (Jeneil Bio-

surfactant Company, 400 N. Dekora woods Blvd. Saukville, WI 53080, USA).

Die Zulassung erfolgte 2004. Der Anwendungsbereich ist die Kontrolle und

Vermeidung von pflanzenpathogenen Pilzen im Gartenbau und der

Landwirtschaft. (Quelle: US Environmental Protection Agency;

http://www.epa.gov/pesticides/biopesticides/ ingredients/product/prod_110029

.htm).

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Grundlagen & Theorie

28

4.4 Schaum und Schaumzerstörung

Eines der Hauptprobleme bei der biotechnologische Produktion von Rhamnolipiden,

stellt im Allgemeinen die exzessive Schaumbildung dar. Die Ursache hierfür liegt in

der Notwendigkeit einer aeroben Prozessführung, welche meist durch Begasung mit

Luft oder O2 standardmäßig erfolgt, in Kombination mit der Bildung eines sehr

oberflächenaktiven Produktes.

Als Schaum wird ein disperses System

aus Gas und Flüssigkeit bzw. Gas und

Feststoff bezeichnet, wobei der

Volumenanteil der Gasphase überwiegt.

Wird eine reine Flüssigkeit begast, bildet

sich eine aus Blasen aufgebaute

Sprudelschicht, die in sich

zusammenfällt sobald die Begasung

aufhört. In Anwesenheit grenzflächen-

aktiver Substanzen, welche die

Grenzflächenspannung verringern und

der Oberfläche viskoelastisches Verhalten verleihen, kommt es zur Ausbildung von

stabilen Schaumlamellen (siehe Abb. 4.9). Die Stabilität des gesamten Schaumes

wird dabei von der Beschaffenheit des Oberflächenfilms der die Gasblase umgibt

entsprechend der Stabilität der Einzellamelle bestimmt. Tenside reichern sich

aufgrund ihres ambiphilen Charakters in der Oberfläche an. Dabei ändert sich die

Grenzflächenspannung σ mit der Raumphasenkonzentration c in Abhängigkeit der

GrenzflächenbelegungΓ . Dies lässt sich mit einem thermodynamischen Gibbs-

Ansatz beschreiben (2.1):

(1.1) Γ−=⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

⋅⋅ TcdTRd

lnσ

Mit R die allgemeine Gaskonstante

T die Absoluttemperatur

Abb. 4.9 Schematische Darstellung der Schaumbildung durch eingebrachte Luft in eine tensidhaltige, wässrige Lösung.

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Grundlagen & Theorie

29

Als Gibbs-Effekt wird der Sachverhalt bezeichnet, dass die Tensidgesamtmenge je

Lamellenabschnitt auch bei vergrößerter Oberfläche konstant bleibt, und das hierbei

die Spannung auch nach der Einstellung des stofflichen Gleichgewichts höher ist als

im ungedehnten Zustand. Die Tenside verleihen der Lamelle somit elastische

Eigenschaften [65].

Als kennzeichnende Größe von Gas/Flüssigkeitssystemen kann der Gasanteil

herangezogen werde (1.2):

(1.2) )( FLG

G

VVV+

Mit VG = Gasvolumen

VFL = Flüssigkeitsvolumen

Wie in Abb. 4.10 gezeigt, lassen sich

zwei Schaumarten unterscheiden. Direkt

über der Flüssigkeit liegt Kugelschaum

mit einem hohen Flüssigkeitsanteil vor

((1 – φ) = 0,54 ≤ φ ≤ 0,74), wobei φ für

den Gasanteil steht). Die Schwerkraft

sowie Verdunstung führen zu einer

Drainage des Schaums, so dass sich

der anfängliche Kugelschaum zu

Polyederschaum wandelt. Schaum-

zerstörung resultiert aus Lamellen-

zerstörung und lässt auf folgende Grundprinzipien zurückführen [65]:

• Beschleunigung der Drainage

• Minimierung der Lamellendicke

• Minimierung der Tensidgrenzflächenbelegung

• Reduktion der gesamten Tensidmenge im Schaum

Grundsätzlich lässt sich Schaum auf chemische, thermische und mechanische

Weise bekämpfen. Ein detaillierter Überblick hierzu ist in Tab. 4.5 aufgeführt.

Abb. 4.10 Charakterisierung von Schaum

anhand des Gasanteils φ [65].

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Grundlagen & Theorie

30

Tab. 4.5 Unterschiedliche Schaumzerstörungsmethoden im Überblick nach [65].

Verfahren Wirkprinzip Anwendungsgebiet Vorteile/Nachteile

Chemische Schaumzerstörung

Zugabe von Chemikalien zum Reaktormedium Aufsprühen der Chemikalien nach Bedarf

Lokale Verminderung der Grenzflächen-spannung Beschleunigtes Ausdünnen der Lamellen durch Spreitung der Schaumbrecher auf der Lamel-lengrenzfläche und Mitreißen grenzflächen-naher Flüssigkeit. Verdrängen schaumstabilisierender Substan-zen aus der Grenzfläche Beschleunigte Drainage Verminderung der Grenzflächenelastizität Ausbildung von starren Mischfilmen Herabsetzen elektrostatischer Abstoßung

Problemschäume, d.h. hohe Gasdurchsätze, geringe Blasengrößen, hohe Tensidkonzentration

+ sehr wirkungsvoll + geringer apparativer Aufwand + Verhinderung der Schaumbildung - Rückgang des Stoffübergangs um bis zu 50% - Kontamination des Produktes, aufwendige Reinigung - Umweltprobleme bei der Entsorgung - teuer

Gefrieren Abkühlen der Schäumerlösung unter die Schmelztemperatur - hoher Energiebedarf

Thermische Schaumzerstörung

Erwärmen durch Kontakt mit Heizflächen oder Dampf Mikrowellen Infrarotstrahlung Warmluftappli-kationen

Verdampfen von Lamellenflüssigkeit Beschleunigte Drainage durch Viskositäts-erniedrigung Direkter Bruch von Schaumlamellen Mikrowellen erhitzen den ganzen Schaum auf einmal, v.a. die Plateauränder

Schaumfraktionierung, Destillation, thermisch stabile Medien

+ universell - Verkrustung an den Wärmetauschern - Verunreinigung des Mediums - hoher Energiebedarf - nur begrenzt in der Biotechnologie einsetzbar

Rotierende Einbauten

Aufbringen von Scherkräften, Beschleunigungskräften, Zentrifugalkräften, Corioliskräften Schaumverdichtung durch Trennung in Gasphase und Sekundärschaum Abgeschleuderte Flüssigkeit zerstört Lamellen

Schäume niedriger Viskosität

+ universell + erzeugt häufig fließfähigen Sekundärschaum - hohe Investitionskosten - schnell bewegte Teile - Erzeugung von Sekundärschau kann zum Fluten führen

Zyklone Flotationsschäume

Zentrifugen, Vakuumzentri-fugen mit Zwangsführung

Beschleunigung der Drainage in den Lamellen durch Zentrifugalkräfte, Scherbeanspruchung Beschleunigung der Lamellenaustrocknung Stoßvorgänge Hochviskose, feinblasige

Schäume; Lebensmitteltechnik

+ Hoher Mengendurchsatz - Hoher Energieverbrauch zur Vakuumerzeugung - schwierige Reinigung - hohe Investitionskosten

Ultraschall Starke Druckwechsel, Kavitation Höherviskose Schäume, Filmemulsionen, flüssigkeitsreiche Kugelschäume

- geringe Wirksamkeit

Schaumsirenen, Pfeifen, Hörner

„periodische Zerstörungskräfte“ Induzierte Resonazschwingungen Rayleighscher Strahlungsdruck Schallwind erzeugt Turbulenzen Oberflächenwellen

- hohe Lärmbelastung - hoher Energieverbrauch

Ejektor mit Prall-platte Bescheunigungskräfte

Düsen und Mem-brane

Druckwechsel im Schaum beim Pressen durch die Düse oder Membrane

Flüssigkeitsprays Dispergieren mit rotierender Scheibe Tropfenbereg-nung mit Brausen

Zerschlagen von Lamellen Störung von Adsorptionsschichten durch schnell aufgesogene Flüssigkeit

+geringe Investitionskosten + wenig bewegliche Teile - Flüssigkeitsanteil im Schaum wird erhöht - für grobblasige Schäume

Mechanische Schaumzerstörung

Poröse Materialien

Koaleszenzförderung durch ruhende Einbauten Mechanische Energie wird durch Druckverlust erbracht

Niedrigviskose Schäume

+ geringe Investitionskosten + auch für kleinblasige Schäume + keine beweglichen Teile + weitgehend Wartungsfrei - für geringen Schaumanfall

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Grundlagen & Theorie

31

Chemische Antischaummittel sind im Allgemeinen extrem oberflächenaktive

Substanzen mit begrenzter Wasserlöslichkeit, wie z.B. Silikonöl. Sie lassen sich dann

einsetzten, wenn hierdurch die Produktqualität, bzw. in der Biotechnologie zusätzlich

der Produktionsorganismus, nicht negativ beeinflusst werden. Aus letzterem Grund

scheidet auch die thermische Schaumzerstörung für die Anwendung bei

biotechnologischen Produktionsprozessen weitestgehend aus, zudem sie sich auch

im Vergleich zu den anderen Methoden als ineffektiv erwiesen hat. Im industriellen

Maßstab kommt am häufigsten die mechanische Form der Schaumzerstörung zur

Anwendung. Sie basiert auf der Scherbeanspruchung oder Zentrifugal-

beschleunigung der Schaumlamellen, Druckwechselwirkungen innerhalb des

Schaumzerstörers, sowie der Aufprallwirkung des gebildeten, verdichteten

Sekundärschaums gegen den Primärschaum bzw. die Behälterwand [66].

Eine Vielzahl von Methoden zur mechanischen Schaumkontrolle wurde bisher

entwickelt. Hierzu zählen:

• Injektoren, Ejektoren, Blenden – hier wird der Scherbeanspruchung

eine plötzliche Druckentspannung überlagert, damit die Blase zer-

bersten.

• Zentrifugen, Zyklone – es wird der Zentrifugalkraft eine Scherbean-

spruchung überlagert.

• Zerstörung des Primärschaums durch Beregnen mit arteigener

Flüssigkeit.

• Rotierende Scheiben, Schaufelräder, Rührer – die Scherbeanspruch-

ung wird durch schnelle Druckwechsel unterstützt.

Rotierenden, mechanischen Schaumzerstören ist gemein, dass sie eine

Mindestgeschwindigkeit benötigen um wirksam zu werden. Zu hohe Drehzahlen

bewirken hingegen eine verstärkte Bildung von kleinblasigem Sekundärschaum,

welcher wiederum zu einer Schaumstabilisierung im System führt [67]. Eine

exemplarische Übersicht verschiedener mechanischer Schaumzerstörungssysteme

geben die Abb. 4.11 und Abb. 4.12 wieder:

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Grundlagen & Theorie

32

Abb. 4.11 Fundafom™ - Systems (Sartorius Stedim Systems GmbH, Schwarzenberger Weg 73 – 79, 34212 Melsungen, Deutschland) zur Schaum/Gasseparation wie es am Lehrstuhl für Technische Biologie der Universität Karlsruhe (TH) eingesetzt wird. A: Reaktordeckel Biostat Cplus mit integriertem Fundafom-System. B: Funktionsprinzip.

Abb. 4.12 Einfache Schaumzerstörungsrührer wie sie am Lehrstuhl für Technische Biologie der Universität Karlsruhe (TH) eingesetzt werden. A: Installationsprinzip auf der Rührerachse. B & C: Hohlblattrührer. D: 4-Blatt-Lochrührer. E: 4-Blatt-Rührer. F & G: Scheibenrührer mit unterschiedlichen Schaumeinlässen. H: Kommerziell erhältlicher Schaumzerstörer FoamDisk™ (Sartorius Stedim Systems GmbH, Schwarzenberger Weg 73 – 79, 34212 Melsungen, Deutschland).

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Grundlagen & Theorie

33

Die Vorteile des in Abb. 4.11 gezeigten Fundafom-Systems liegen in den guten

Maßstabsvergrößungsmöglichkeiten, sowie der von der Rührerdrehzahl des

Reaktorrührers unabhängigen Drehzahleinstellung. Als Nachteil können die

Investitionskosten als auch die mangelnde Maßstabsverkleinerungsmöglichkeiten

gesehen werden. In der Größenordung von Klein- und Laborreaktoren stellen daher

die Schaumzerstörungsrührer, wie sie in Abb. 4.12 gezeigt sind, eine Alternative dar.

Sie sind kostengünstig und lassen sich ohne Probleme in bestehende

Reaktorsysteme integrieren. Als Nachteil ist anzusehen, dass die Drehzahl nicht

unabhängig vom Reaktorrührer eingestellt werden kann.

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Grundlagen & Theorie

34

4.5 ATR-FTIR Spektroskopie

Zur Kontrolle von Bioprozessen werden üblicherweise nur wenige Prozessparameter,

wie z.B. pH, pO2, Temperatur, CO2 und O2 kontinuierlich gemessen und geregelt.

Zusätzliche Informationen die zur Prozessführung benötigt werden, basieren auf

Daten die aus diskontinuierlichen Probenahmen gewonnen werden. Die endgültigen

Analyseergebnisse weisen meist eine erhebliche Zeitverzögerung zur Probennahme

auf. Alternativen, zu den meist angewendeten langsamen, naßchemischen

Analysemethoden, welche oft auf enzymatischen Reaktionen oder Trenntechniken

wie HPLC beruhen, sind daher wünschenswert [68].

Eine Alternative hierzu können verschiedene spektroskopische Methoden darstellen.

Sie haben das Potenzial rasche und befriedigende Lösungen für Routineanalysen zu

liefern. Eine Vielzahl von Substanzen können mittels spektroskopischer Methoden

identifiziert, charakterisiert und quantifiziert werden [69].

Eine weit verbreitete und gut etablierte spektroskopische Methode ist die „Fourier

Transformations Infrarot Spektroskopie“, kurz FTIR-Spektroskopie. Für die

quantitative Analyse von komplexen Analyt/Matrix Kombinationen verlangt diese

Methode jedoch einiges an Erfahrung und Zeit. Nach Etablierung einer quantitative

Analysemethode, liefert diese Ergebnisse mit geringen Analysezeiten und kann als

Ersatz, z.B. für langwierige HPLC Methoden, angewendet werden [70].

Ein allgemeines Problem der Anwendung der IR-Spektroskopie liegt in der starken

IR-Absorption des Wassers. Da biologische Prozesse in wässrigen Systemen

ablaufen, kann dies teilweise problematisch für die Analyse sein, v.a. wenn die IR-

Messung in Transmission durchgeführt wird. Um auch in wässrigen Systemen

Messungen durchzuführen zu können, ist es notwendig, die Absorption des Wassers

so gering als möglich zu halten, was durch eine Trocknung der Probe oder

Verringerung der Probentransmissionsstrecke erreichbar ist.

Eine elegante Lösung hierzu liefert die ATR-FTIR-Spektroskopie (Abgeschwächte

Totalreflexions – FTIR – Spektroskopie). Der schematische Aufbau eines ATR-FTIR-

Spektrometers ist in Abb. 4.13 wiedergegeben.

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Grundlagen & Theorie

35

Abb. 4.13 Schematische Darstellung eines FTIR-Spektrometers mit ATR-Probenkammer.

Ein ATR-FTIR-Spektrometer besteht aus folgenden Komponenten:

Einer thermischen Strahlungsquelle die eine Strahlungscharakteristik vergleichbar

einem planckschen Strahler hat. In der IR-Spektroskopie kommen heute hierfür

erhitzte Siliziumcarbid-Stäbe, sogenannte Globare, zum Einsatz.

Der Strahlengang besteht aus einer Anordnung von parabolen und planen Spiegeln,

die die Strahlung der Quelle auf das Interferometer fokussiert. Dieses besteht aus

einem Strahlenteiler, und erzeugt aus dem einen von der Strahlungsquelle

kommenden Strahl zwei Strahlen. Ein Strahl wird hierbei auf einen fixen Spiegel

gelenkt, der andere trifft auf einen beweglichen Spiegel, bevor die beiden Strahlen

wieder vereinigt werden. Infolgedessen weisen die beiden Strahlenhälften beim

Rekombinieren auf dem Strahlenteiler eine Wegdifferenz auf. Konstruktive

Interferenz, d.h. maximalen Strahlungsfluss am Interferometerausgang wird nun für

eine bestimmte Wellenlänge genau dann erhalten, wenn die Wegdifferenz des

Strahls der auf den beweglichen Spiegel trifft, ein ganzzahliges Vielfaches des ersten

Strahls ist. Für alle anderen Wellenlängen aus dem breitbandigen IR-Spektrum der

IR-Quelle, erhält man eine destruktive Interferenz, d.h. eine Abnahme des

Detektorsignals Dieses wird minimal bei einer Wellenlängenverschiebung um ein

ungerades Vielfachen einer halben Wellenlänge. Als Referenzstrahlungsquelle, zur

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Grundlagen & Theorie

36

Bestimmung des Ortes des beweglichen Interferometerspiegels, kommt meist ein

HeNe-Laser mit definierter Wellenlänge (λ = 633 nm) zum Einsatz.

Der sich in seinen Intensitätswellenlängenmaxima kontinuierlich verändernde Strahl

wird nun in einem Winkel größer seinem Totalreflexionswinkel, in das interne

Reflexionselement (ATR-Kristall) geleitet. Hinter der reflektierenden Grenzfläche

bilden sich nun evaneszente (dahinschwingende) Lichtwellen aus. Diese dringen

hierbei einige Wellenlängen tief in das optisch dünnere Medium (wässrige Probe)

ein. Die einfache Eindringtiefe des IR-Strahls beträgt in Abhängigkeit der

verwendeten Wellenlänge nur 1 – 5 µm. Hierbei kommt es zu wellenlängen-

spezifischen Absorptionserscheinungen an den Probenmolekülen, die

charakteristischen chemischen Gruppen zugeordnet werden können. Die so

veränderte Strahlungsenergie wird anschließend von einem Strahlungsdetektor in

elektrische Signale umgewandelt. Das so vom Detektor erfasste Signal

(Interferogram), ist somit die Intensität der IR-Strahlung in Abhängigkeit von der

Auslenkung des beweglichen Interferometerspiegels. Das so gemessene elektrische

Signal wird anschließend mittels eines Computers einer Fourier-Transformation

unterzogen. Die Grundidee hinter dieser Transformation ist, dass jedes Signal als

Summe einer Folge von sinusförmigen Signalen gesehen werden kann, wobei jeder

Sinus eine unterschiedliche Amplitude und Phase besitzt. Jeder dieser Sinusse

repräsentiert eine einzelne Frequenz bzw. ein Frequenzband. Aus der Summe der

Sinusse kann aus dem über die Zeit erfassten Detektorsignal das entsprechende

Frequenzspektrum rekonstruiert werden. Man erhält das sogenannte

Einkanalspektrum der Probe, in welchem nun dargestellt wird, mit welcher Intensität

die einzelnen Frequenzen vertreten sind.

4.5.1 Multivariate Kalibrierung und PLS-Regression

Im Unterschied zur univariaten Kalibration, bei welcher die maximale Absorption

einer Probe bei einer einzelnen, definierten Wellenlänge als Korrelationskriterium für

die Kalibrierung herangezogen wird, findet bei der multivariaten Kalibration eine

Vielzahl von spektralen Informationen aus einem Wellenlängenbereich Eingang in

die Kalibration. In der Praxis hat sich als Kalibrationsmethode hierfür die sogenannte

„Partial Least Square (PLS-Regression) bewährt, welche dazu dient große

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Grundlagen & Theorie

37

Datenmengen zu reduzieren und durch möglichst wenige Faktoren zu beschreiben.

Zur Durchführung einer PLS-Regression für eine bestimmte Substanz müssen die

Substanzspektren mit den entsprechenden Konzentrationswerten einer

Referenzanalytik verglichen werden. Änderungen die in beiden Datensätzen

auftreten, müssen erkannt und miteinander verknüpft werden. Hierfür werden

zunächst beide Datensätze in Form einer Datenpunktmatrix niedergeschrieben (Abb.

4.14).

Abb. 4.14 Umwandlung von Spektral- und Konzentrationsdaten in Matrixschreibweise. In diesem Beispiel wurden zunächst M Kalibrationsproben vermessen. In einem weiteren Schritt wurden alle N Wellenzahlen der gemessenen Spektren zeilenweise in eine (M, N)-Matrix geschrieben. Diese Matrix entspricht der spektralen Datenmatrix X. Analog wurden alle L Komponentenwerte in eine (M, L)-Konzentrationsdatenmatrix Y geschrieben. [71]

Die so erhaltene Spektraldatenmatrix X

und die Konzentrationsdatenmatrix Y

werden anschließend in ihre

Eigenvektoren faktorisiert, d.h. es findet

eine Zerlegung der jeweiligen

Datenmatrix in eine Faktorenmatrix

(Loading-Matrix) und eine Matrix der

Faktorengewichte (Score-Matrix) statt

(Abb. 4.15). Die nun folgende Faktorenanalyse ist eine Varianzanalyse, bei der die

Unterschiede der Datensätze betrachtet und in Faktoren wiedergegeben werden. Der

erste Faktor spiegelt einen möglichst großen Teil der Gesamtvarianz wider, der

Abb. 4.15 Faktorisierung einer Spektral-datenmatrix. [71]

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Grundlagen & Theorie

38

zweite Faktor einen möglichst großen Teil der verbleibenden Varianz usw. Mit

zunehmender Faktorenzahl werden immer geringere Veränderungen in der

Datenstruktur erklärt. Die Anzahl an verwendeten Faktoren (Rang) ist von zentraler

Bedeutung für die Qualität eines PLS-Modells. Niedere Faktoren charakterisieren

daher zumeist die für die spätere Auswertung wichtigen Veränderungen der

spektralen Strukturen.

Abb. 4.16 Schematische Darstellung des Ergebnisses einer Faktorisierung. [72]

Bei einer zu geringen Zahl an ausgewählten Faktoren wird die spektrale Struktur nur

ungenügend repräsentiert und man spricht von einem sogenannten „underfitting“.

Auch die Auswahl einer zu großen Anzahl an Faktoren führt zu einer

Verschlechterung der PLS-Modells, da hierbei die störenden Anteile des spektralen

Rauschens mit in die Regression aufgenommen werden. Dies wird als „overfitting“

bezeichnet. Bei Erstellung einer Kalibration wird nun mittels des PLS-Algorithmus X-

und Y-Matrix in Korrelation zueinander zu setzten. In einem nächsten Schritt werden

die Scores der X- und Y-Matrix iterativ so verändert, dass sie möglichst identische

Werte aufweisen und gleichzeitig möglichst geringe Abweichungen von den

ursprünglichen Werten aufweisen. Die optimale Anzahl an Faktoren bzw. des

verwendeten Ranges wird anschließend empirisch mittels einer Kreuzvalidierung

bestimmt, wobei das PLS-Modell mit dem kleinsten PRESS (Predictive Residual

Error Sum of Squares: Summe über die Quadrate aller Vorhersagefehler) als das

„beste“ Modell angesehen werden kann.

Für detaillierte Erläuterungen zur multivariaten Kalibration und PLS-Regression sei

auf die für dieses Unterkapitel verwendete Originalliteratur verwiesen [71, 73].

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39

5 Zusammenfassungen der Ergebniskapitel I-V

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Zusammenfassung Kapitel I

40

5.1 Zusammenfassung Kapitel I: Stammvergleich

Originaltitel: Production of microbial rhamnolipids by Pseudomonas strains DSM 7108 and DSM 2874, utilizing mechanical foam destruction.

Verschiedene Spezies der Gattung Pseudomonas sind bekannt dafür unter

wachstumslimitierten Bedingungen auf hydrophoben C-Quellen Rhamnolipide zu

produzieren. Als erschwerender Faktor bei der biotechnologischen Herstellung dieser

Biotenside ist an erster Stellen das exzessive Schaumbildungsvermögen der

Kulturbrühe in Kombination mit der Notwendigkeit aerober Prozessbedingungen

aufzuführen. Die folgende Abb. 5.1 zeigt das Ausmaß der Schaumbildung bei einer

Fermentation nach einsetzender Rhamnolipidbildung und konventioneller Begasung

mittels eines Begasungsrings.

Abb. 5.1 Schaumbildung während einer konventionell begasten Fermentation in einem 5 L Glasreaktor mit Pseudomonas species DSM 2874 auf Sonnenblumenöl nach ca. 72 h.

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Zusammenfassung Kapitel I

41

Zielsetzung war die Implementierungsmöglichkeiten und Eignung mechanischer

Schaumzerstörung bei der biotechnologischen Herstellung von Rhamnolipiden zu

untersuchen. Des Weiteren wurde eine vergleichende Studie zweier bekannter

Rhamnolipidproduktionsstämme, DSM 7108 und DSM 2874, durchgeführt.

Ausgehend von klassischer Schüttelkolbenkultivierung erfolgte eine Maßstabs-

vergrößerung von 500 ml Kleinst- bis hin zu 5 L Laborbioreaktoren.

Hierbei konnte gezeigt werden, dass der Einsatz mechanischer Schaumzerstörung

bei der mikrobiellen Herstellung von Rhamnolipiden eine deutlichen Reduzierung

bzw. einen vollständigen Verzicht von chemischen Antischaummitteln zur

Prozesskontrolle ermöglicht. Gleichzeitig ergab sich, dass das verwendete

chemische Antischaummittel sich hemmend auf die Rhamnolipidbildung auswirken

kann. Eine Vermeidung führte zu einer deutlichen Steigerung der Produktivität an

Rhamnolipid.

Vorversuche mit den beiden Stämmen zeigten, dass zwei Pseudomonas species

stark unterschiedlich auf gleiche Umgebungsbedingungen reagieren können.

Während DSM 7108 hohe Mengen an Rhamnolipid produzierte, zeigte DSM 2874

auf demselben Medium eine drastisch reduzierte Rhamnolipidbildung, dafür eine

verstärkte Polysacchrid/Alginat-Bildung, die mit einer starken Viskositätszunahme

der Kulturbrühe einherging und zum Prozessabbruch führte (Abb. 5.2).

Abb. 5.2 Viskosität über den Prozessverlauf bei einer Bioreaktorkultivierung mit DSM 2874 auf dem Ausgangsmedium.

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Zusammenfassung Kapitel I

42

In vergleichenden Schüttelkolbenversuchen ergaben sich Rhamnolipid-

konzentrationen von durchschnittlich 400 mg/l für DSM 7108 bzw. 50 mg/l für DSM

2874. Diese Werte lagen um das 100 – 1000 fache unter den in den

Bioreaktorversuchen erhaltenen Produktkonzentrationen. Eine Viskositätszunahme

des Mediums bei DSM 2874 konnte nur in den Versuchen im Reaktor beobachtet

werden.

Ursächlich hierfür ist wahrscheinlich eine Regulationsänderung von der durch

Umgebungsbedingungen beeinflussten „Quorum Sensing“ regulierten Induktion der

Rhamnolipidbildung hin zur vom selben System kontrollierten Polysaccharid-

/Alginatbildung. Zukünftige Untersuchungen auf molekularbiologischer Ebene sind

daher für ein besseres Verständnis der Induktion der Rhamnolipidbildung notwendig

und inzwischen im Rahmen eines Folgeprojektes beantragt. Nach einer Halbierung

der Puffer- und Makronährsalzkonzentration erreichte der im Schüttelkolben

schlechtere Stamm DSM 2874 im 5 L Bioreaktor 53,6 g/l Rhamnolipid. Eine

Viskositätszunahme des Mediums wurde nicht mehr beobachtet. Mit maximal 41 g/l

Rhamnolipid im Bioreaktor lag die gebildete Rhamnolipidmenge des im

Schüttelkolben um das 8-fache besseren Stammes DSM 7108 um mehr als 20%

niedriger. Zusammenfassend könne aus den Experimenten folgende Schluss-

folgerungen gezogen werden:

1. Der Einsatz von Pseudomonas species DSM 2874 als Produktionsstamm

zur Rhamnolipidherstellung macht eine Anpassung der Medien-

zusammensetzung erforderlich, obwohl dieser Stamm derselben Spezies

angehört und gleiche Kultivierungsanforderungen zu erwarten wären.

2. Abhängig von der Medienkonzentration wechselt Pseudomonas species

DSM 2874 entweder zu einer Induktion der Rhamnolipidbildung oder zu

einer Polysaccharid-/Alginatbildung.

3. Schüttelkolbenversuche sind nur bedingt für ein Screening auf

Hochleistungsstämme zur Rhamnolipidherstellung geeignet. Qualitative

Aussagen sind zwar möglich, quantitative Aussagen über zu erreichende

Maximalkonzentrationen sind jedoch nur durch Versuche im Bioreaktor zu

erreichen. Ursache hierfür ist die Regulation der Rhamnolipidbildung über

zwei „Quorum Sensing“-Systeme.

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Zusammenfassung Kapitel I

43

4. Die mit dem Stamm DSM 7108 in einer Patentschrift beschriebenen

Höchstmengen an Rhamnolipid von 78 g/l bzw. 112 g/l konnten im

Labormaßstab nicht reproduziert werden.

5. Der Stamm DSM 2874 zeigte nach Anpassung der Medienzusammen-

setzung im Labormaßstab das Potenzial höhere Rhamnolipidmengen als

DSM 7108 zu bilden.

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Zusammenfassung Kapitel II

44

5.2 Zusammenfassung Kapitel II: Produktspektrum

Originaltitel: Proportion of Di- and Mono-Rhamnolipid production by Pseudomonas strains DSM 7108 and DSM 2874.

Bei einer typischen Kultivierung ist das Einsetzen der Bildung von Rhamnolipiden in

der Regel mit dem Übergang von der Wachstumsphase zur stationären Phase zu

beobachten. Ergänzend zu der ersten Publikation wurde bei dieser Studie detailliert

auf das von den beiden Pseudomonas-Stämmen DSM 7108 und DSM 2874

gebildete Produktspektrum an Mono- (RL 1) und Di-Rhamnolipid (RL 3)

eingegangen. Im direkten Vergleich zeigten die beiden Stämme bezüglich der

gebildeten Rhamnolipidspezies deutliche Unterschiede. Während das gebildete

Produktspektrum des Stammes DSM 2874 nahezu äquivalente Mengen an Mono-

und Di-Rhamnolipid enthielt, zeigte DSM 7108 die Tendenz, Di-Rhamnolipid

bevorzugt zu bilden. Auch bei näherer Betrachtung des gebildeten Produktspektrums

über den Prozessverlauf konnten deutliche Unterschiede bezüglich der

Produktbildung der beiden Stämme aufgedeckt werden. Nach anfänglich bevorzugter

Mono-Rhamnolipidbildung bei DSM 7108 in Verhältnissen von 1 : 1,2 bzw. 1 : 1,5

(w/w) RL3 zu RL1, konnte im Verlauf 250 h eine signifikante Änderung bei der

Produktbildungskinetik hin zu Di-Rhamnolipid beobachtet werden. RL3:RL1-

Verhältnisse von bis zu 3,4 : 1 (w/w) konnten bestimmt werden. Hingegen zeigte der

Stamm DSM 2874 über die Kultivierungszeit betrachtet keine deutlichen Änderungen

bezüglich des gebildeten Produktspektrums. Die anfänglichen RL3:RL1-Verhältnisse

von 1,2 : 1 bis 1,3 : 1 (w/w) änderten sich nur tendenziell zum Ende der Kultivierung

hin zu Verhältnissen von 1 : 1 – 1 : 1,3 (w/w).

Hieraus kann die Schlussfolgerung gezogen werden, dass das gebildete

Produktspektrum unter vergleichbaren Kultivierungsbedingungen stammspezifisch

ist. Neben der maximal gebildeten Gesamtmenge an Rhamnolipid, könnte für eine

potenzielle industrielle Applikation je nach gewünschtem Endprodukt die

Produktionsstammselektion auch in Hinblick auf das gebildete Produktspektrum von

hoher Relevanz sein.

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Zusammenfassung Kapitel III

45

5.3 Zusammenfassung Kapitel III: Substratscreening

Originaltitel: Screening of hydrophobic Substrates for the Production of Rhamnolipids by Shaking Flask and Bioreactor Cultivations of Pseudomonas aeruginosa DSM 7108.

Im Fokus dieser Untersuchungen stand die Entwicklung eines auf einem

Parallelbioreaktor mit integrierter mechanischer Schaumzerstörung basierenden

Screening-Systems zur Optimierung eines Prozesses zur Herstellung mikrobieller

Rhamnolipide. Abb. 5.3 zeigt das verwendete Bioreaktorsystem sowie die Position-

ierung des mechanischen Schaumzerstörungsrührer.

Abb. 5.3 Links: Für das Screening verwendetes Parallelreaktorsystem während eines Versuchslaufs. Rechts: Rührerachse mit montiertem mechanischen Schaumzerstörer sowie den zwei konventionellen 6-Blatt Rushton-Rührern zur Reaktordurchmischung.

Des Weiteren wurde ein „klassisches“ Schüttelkolben- einem Bioreaktor-Screening-

Konzept gegenüber gestellt, um qualitative als auch quantitative Aussagen über die

jeweilige Methode treffen zu können. Im Rahmen dieser Experimente sollten sieben

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Zusammenfassung Kapitel III

46

Pflanzenöle und ein Fischöl auf ihre Eignung als Substrat in einem

Rhamnolipidproduktionsprozess, sowie ihr Einfluss auf das gebildete

Produktspektrum untersucht werden.

Es stellte sich heraus, dass der Stamm DSM 7108 in der Lage ist, alle Substrate zu

nutzen und induziert wird, Rhamnolipide zu bilden. Die einzige Ausnahme stellte das

Fischöl dar, welches in den Bioreaktorversuchen, nicht jedoch in den

Schüttelkolbenversuchen, umgesetzt werden konnte. Generell wurden mit den

Substraten der ersten und zweiten Gruppe (hoher Ölsäure bzw. Linolsäureanteil im

Triglycerid) die höchsten Endkonzentrationen an Rhamnolipid von durchschnittlich

25,4 g/l bzw. 30,6 g/l erreicht. Eine Maximalmenge an Rhamnolipid, bezogen auf das

gesamte Screening, von 39,8 g/l wurde in einer Bioreaktorkultivierung mit

Sonnenblumenöl (Gruppe 2) erreicht. Ein direkter Vergleich der

Schüttelkolbenkultivierungen mit den Bioreaktorkultivierungen ergab, dass bei

letzteren mit Pflanzenölen durchschnittlich die 52 – 68-fache Mengen an

Rhamnolipid gebildet wurden. Auch die spezifischen Produktivitäten zeigten um das

5,5 -10-fache höhere Werte. Dies kann als Indiz für eine deutlich gesteigerte

Induktion der Rhamnolipidsynthese unter den Kultivierungsbedingungen im

Bioreaktor angesehen werden. Ursache hierfür könnte das Erreichen höhere

Biomassekonzentrationen sein, welche wiederum direkten Einfluss auf die „Quorum

Sensing“ regulierte Rhamnolipidsynthese haben. Zusätzliche Faktoren wie z.B.

bessere Sauerstoffversorgung, Reaktor-Durchmischung sowie pH-Regulation könnte

ebenfalls zu einer gesteigerten Produktion bei tragen. Ein Einfluss auf das gebildete

Produktspektrum durch die verschiedenen Substrate konnte hingegen nicht

beobachtet werden.

Zusammenfassend könne aus den Experimenten folgende Schlussfolgerungen

gezogen werden:

1. Die Etablierung eines Screening-Systems zur Herstellung mikrobieller

Rhamnolipide auf Basis eines Parallelbioreaktorsystems konnte erfolgreich

umgesetzt werden.

2. Der Einsatz mechanischer Schaumzerstörungsrührer in Kleinstreaktoren

erwies sich als erfolgreich.

Page 63: Diss Leitermann 26 8format

Zusammenfassung Kapitel III

47

3. Qualitativ sind die Ergebnisse aus Schüttelkolben- und Bioreaktor-

Screeningansätzen weitestgehend vergleichbar. Quantitativ sind jedoch

deutliche Unterschiede erkennbar.

4. Bezogen auf eine Maßstabsvergrößerung sind Aussagen über zu erwartende

Produktkonzentrationen mittels eines Screenings in Kleinstreaktoren deutlich

besser zu treffen als über einen Schüttelkolbenansatz (vgl. Publikation I).

5. Bezüglich der getesteten Substrate kann generell die Aussage getroffen

werden, dass pflanzliche Öle mit einem hohen Anteil an ein- und zweifach

ungesättigten C-18 Fettsäuren im verwendeten Triglycerid am besten für die

Herstellung von Rhamnolipiden geeignet sind. Pflanzenöle mit einem hohen

Linolsäureanteil zeigen hierbei tendenziell leicht höhere Produktbildungs-

mengen als solche mit einem hohen Ölsäureanteil.

6. Ein Einfluss der Substrate auf das gebildete Produktspektrum konnte nicht

nachgewiesen werden.

Page 64: Diss Leitermann 26 8format

Zusammenfassung Kapitel IV

48

5.4 Zusammenfassung Kapitel IV: ATR-FTIR Analytik

Originaltitel: Fast Quantitative Determination of Microbial Rhamnolipids from Cultivation Broths by ATR-FTIR Spectroscopy.

Im Fokus dieser Untersuchungen stand die Entwicklung einer alternativen

Analysemethode mittels ATR-FTIR Spektroskopie zur quantitativen Bestimmung von

Rhamnolipiden aus Kultivierungsbrühen. Als wesentlicher Vorteil dieser

Analysemethode gegenüber einer konventionellen Analytik mittels HPLC wurde eine

deutliche Reduktion der Analysenzeiten erwartet. Durch die Notwendigkeit bei der

HPLC-Analyse mehrere Extraktions-, Evaporations- und Derivatisierungsschritte vor

der eigentlichen Messung durchzuführen, liegen zwischen der Probenahme und dem

Analyseergebnis mitunter 24 – 36 h. Erste Experimente zur Quantifizierung mittels

ATR-FTIR zeigten, dass nur ein Extraktionsschritt zur Entfernung der hydrophoben

Substrate (Pflanzenöle) mittels Hexan notwendig ist, um verwertbare

Analysenspektren zu erhalten. Der Zeitbedarf von der Probenahme bis hin zum

Analysenergebnis konnte hierdurch auf 20 Minuten reduziert werden. Generell

zeigten sich sehr gute Reproduzierbarkeiten bei der wiederholten Aufnahme

einzelner Probenspektren. Korrelationen von mehr als 99,9 % Genauigkeit wurden

erreicht. Absorptionsintensitätsänderungen des Gesamtspektrums bzw. einzelner

Gruppenabsorptionsfrequenzen, wie sie z.B. durch Grenzflächenanlagerung der

Analyten oder Evaporation eintreten können, konnten nicht beobachtet werden. Ein

standardisiertes Probenaufarbeitung und Auftragungsprotokoll wurde erstellt. Zum

Aufbau einer Spektrendatenbank wurden 80 Referenzspektren aus neun

verschieden Rhamnolipidfermentationen erfasst. Anschließend wurden mittels

multivariater Kalibration Kalibrationsmodelle zur quantitativen Rhamnolipid-

bestimmung entwickelt und mittels Kreuz- bzw. Testset-Validierung auf ihre

Belastbarkeit hin getestet. Die stabilsten Vorhersageergebnisse lieferte hierbei die

charakteristische, jedoch nicht spezifischen Gruppen zuordenbare „fingerprint“-

Region im Wellenzahlbereich 900 – 1200 cm-1. Die für Rhamnolipide typischen

Gruppenabsorptionsbanden der C-H Streckschwingungen (2921 cm-1, 2855 cm-1)

Page 65: Diss Leitermann 26 8format

Zusammenfassung Kapitel IV

49

und der Esterbindungen (1730 cm -1) zeigten dagegen schlechtere Resultate.

Verglichen mit der HPLC-Referenzanalytik ergaben sich für Rhamnolipid 1,

Rhamnolipid 3 und Rhamnolipid gesamt (RL 1 + RL 3) für die Wurzel der mittleren

Fehlerquadrate der Kreuzvalidierung (RMSECV: Root Mean Square Error of Cross

Validation) Werte von 0,496 g/l (RL1), 1,49 g/l (RL 3) sowie 2,06 g/l (RL gesamt)

ermittelt. Die Bestimmungskoeffizienten R2 lagen hierbei in einem Bereich von 95,6 –

96,1. Testsetvalidierungen gegen unabhängige Probenspektren einer weiteren

Kultivierung ergaben durchschnittliche Vorhersagefehler im Bereich von 0,28 g/l –

0,59 g/l (RMSEP: Root Mean Square Error of Prediction).

Verglichen mit der konventionellen HPLC-Analytik sind die Messgenauigkeiten,

sowie die messtechnisch bedingten Nachweisgrenzen der ATR-FTIR Methode

schlechter. Diese Nachteile werden jedoch durch die deutlich kürzeren Analysezeiten

als auch durch den größeren Konzentrationsmessbereich kompensiert. Potenzielle

Verbesserungen der Vorhersagegenauigkeiten sind bei einer Ausweitung der

Referenzspektrendatenbank zu erwarten. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse,

dass die erstellte ATR-FTIR Methode zur quantitativen, „in time“ Bestimmung von

Rhamnolipiden aus Kultivierungsbrühen sehr gut geeignet ist.

Page 66: Diss Leitermann 26 8format

Zusammenfassung Kapitel V

50

5.5 Zusammenfassung Kapitel V: Patentanmeldeschrift

Original Titel: Biotenside und deren Herstellung.

Im Verlauf der zuvor beschriebenen experimentellen Arbeiten wurde die Idee einer

neuartigen mehrstufigen Prozessführung zur biotechnologischen Herstellung von

Rhamnolipiden unter Einsatz von mechanischer Schaumzerstörung entwickelt. Diese

basiert auf der Kombination des beschriebenen „Fed-batch“-Prozesses mit einem

Ruhenden-Zell-Kultivierungsansatz. Im Unterschied zum klassischen ruhenden

Zellverfahren, bei welchem die erste Prozessstufe nur der Biomassebildung dient

und erst in der folgenden stark wachstumslimitierten Prozessstufe die eigentliche

Produktbildung stattfindet, verfolgt der hier beschriebene Verfahrensansatz die

Strategie, dass sowohl in der ersten als auch in den folgenden Prozessstufen hohe

Mengen an Produkt gebildet werden. Abb. 5.4 zeigt eine vereinfachte schematische

Darstellung dieses Prozesses.

Abb. 5.4 Vereinfachte schematische Darstellung eines mehrstufigen Prozesses mit integrierter mechanischer Schaumzerstörung zur Herstellung von Rhamnolipiden.

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Zusammenfassung Kapitel V

51

Dies konnte erreicht werden, indem zwei verschiedene Medienzusammensetzungen

eingesetzt wurden. Während in der ersten Prozessstufe ein nährsalzreiches

Mineralsalzmedium verwendet wird und sich die limitieren, rhamnolipidbildungs-

induzierenden Bedingungen erst nach Abschluss der Wachstumsphase einstellen,

wird in der folgenden Prozessstufe ein, verglichen mit dem ersten Medium, um das

zehnfache an Makronährsalzen reduziertes Medium eingesetzt, welches nach einer

kurzen regenerativen Phase direkt zu nährstofflimitierenden Produktionbedingungen

führt. Eine durchgeführte Literaturrecherche ergab überraschenderweise keinerlei

Hinweise auf biotechnologische Prozesse zur Herstellung von Rhamnolipiden bzw.

Biotensiden, die statt chemischer eine mechanische Schaumzerstörung einsetzen.

Das hier vorgestellte Verfahren wurde zur weiteren Überprüfung dem Technologie

Lizenz Büro der Baden-Würrtembergischen Hochschulen GmbH (TLB) vorgestellt.

Die Erfindungshöhe wurde dort so hoch eingestuft, dass eine Patentanmeldung

aussichtsreich erschien. Entsprechend wurde eine Patentanmeldeschrift verfasst und

am 14.06.2007 unter dem Aktenzeichen DE 10 2007 028 030.2 beim Deutschen

Patent- und Markenamt eingereicht.

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Zusammenfassung Kapitel V

52

Page 69: Diss Leitermann 26 8format

53

6 Ergebniskapitel

Page 70: Diss Leitermann 26 8format

54

Page 71: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel I

55

6.1 Kapitel I

Production of microbial rhamnolipids by Pseudomonas

strains DSM 7108 and DSM 2874, utilizing mechanical foam

destruction.

F. Leitermann1, A. Dhariwal2, C. Syldatk1, R. Hausmann1

1Chair of Technical Biology, Research University Karlsruhe, 76131 Karlsruhe, Germany

2Gesellschaft für umweltkompatible Prozeßtechnik mbH i.L., 66123 Saarbrücken, Germany

Status: running title, BMC Journal of Biological Engineering

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Kapitel I

56

6.1.1 Abstract

Background Several species of the genus Pseudomonas are known to produce rhamnolipids

under growth limiting conditions on hydrocarbons and other hydrophobic C-sources.

However, for the biotechnological production of rhamnolipids, a severely limiting

factor is the pronounced foaming of the cultivation broth.

Results In this work, it could be shown that exclusive mechanical foam destruction led to

significantly increased productivities of rhamnolipids as compared to the state-of-the-

art, that comprises the application of anti-foaming agents. Starting from shaking flask

cultures, a scale-up to 500 ml and to 5 l bioreactor cultivations was carried out. The

maximum concentrations obtained were of 41 g/l for Pseudomonas aeruginosa strain

DSM 7108 and 54 g/l for Pseudomonas spp. strain DSM 2874.

Conclusions Mechanical foam destruction provides several advantages for the production of

rhamnolipids. Especially a clear enhancement of the productivity was achieved.

Page 73: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel I

57

6.1.2 Background

Surface-active compounds are of wide economic interest. Today, bulk quantities of

surfactants are chemically synthesized. However, by 2010, surface-active

compounds produced by microorganisms, so-called biosurfactants, are predicted to

gain 10 % of the surfactant market [11]. Biosurfactants containing L-rhamnose and β-

hydroxydecanoic acid units are termed rhamnolipids. Pseudomonas spp., especially

P. aeruginosa, are known to produce rhamnolipids under growth-limiting conditions

on hydrocarbons and other hydrophobic C-sources [22]. This production is

dependant on a complex quorum-sensing cell-to-cell signalling system, the rhl

system [74, 75].

Several types of rhamnolipids have been described [25, 26, 28-30, 50]. Rhamnolipid

1 (L-rhamnosyl-3-hydroxydecanoyl-3-hydroxydecanoate: R1C10C10) and

rhamnolipid 3 (L-rhamnosylrhamnosyl-3-¬hydroxy¬decanoyl-3-hydroxydecanoate:

R2C10C10) are the most common rhamnolipids produced by P. aeruginosa [23].

The exact type and composition of rhamnolipids produced depend on several factors,

like type of substrate, cultivation conditions and the strain used. For biotechnological

production purposes of rhamnolipids, four methods have been described [22]. The

most widely reported method is the batch, respectively the fed batch cultivation of

Pseudomonas sp. under growth limiting conditions. The maximum product

concentration reported by this mode was 78 - 112 g/l, claimed by Giani et al. [51] in a

patent, with insufficient technical details given. A second method applies resting cells

in a batch process, with rhamnolipid end concentrations of approximately 18.5 g/l

[25]. Continuous cultivation strategies have also been described, with productivities

between 0.007 – 2 g/l·h [48, 49]. Immobilized cells in a semi-continuous process

displayed a maximum rhamnolipid production rate of 43 mg/l·h [22].

A general problem of rhamnolipid production is the excessive foam formation. Foam

reduces the effective working space of a bioreactor, and hence its economic

performance. In principle, chemical and mechanical methods of foam destruction are

applicable [76]. An advantage of chemical foam destruction is its convenient

applicability. However, down stream processing can be negatively affected by the

anti-foam agents. Hence, the use of mechanical foam destruction has the advantage

of not adding adulterating compounds [65]. However, the current stat-of-the-art in

Page 74: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel I

58

rhamnolipid production comprises the application of anti-foam agents. The aim of this

study was to investigate the applicability of mechanical foam destruction for the

production of rhamnolipids. The expected benefit was a higher productivity combined

with an enhanced purity of the raw product. For the present studies, the

Pseudomonas spp. strains DSM 7108 and DSM 2874 have been chosen.

6.1.3 Results

Fatty acid composition of the sunflower oil The analysis of the fatty acids of the applied sunflower oil resulted in a typical

composition for sunflower oil. The twice unsaturated linoleic acid (C18:2) represented

the major compound of the fatty acid moiety with 59.7 %, followed by the single

unsaturated oleic acid (C18:1) with 28.4 %. The saturated stearic acid (C18) and

palmitic acid (C16) represent 3.8 % and 6.4 % of the fatty acid fraction. In amounts

below 1 %, other fatty acids were detected.

Shaking flask experiments Rhamnolipid production with the strains DSM 7108 and DSM 2874 was first

examined in shaking flasks, for preliminary characterization of the strains. After 100

h, the bio dry weight contents (BDW), oil contents, and rhamnolipid concentrations

were determined. Both strains consumed about 145 g/l of oil in the cultivation time of

100 h. Whereas DSM 7108 produced about 400 mg/l rhamnolipids, DSM 2874

produced only 50 mg/l. Also, the accumulated mean bio dry weight of DSM 2874 of

about 9 g/l was lower as compared to DSM 7108, with 16 g/l. Hence, the conversion

efficiency of DSM 7108 for the offered substrate was markedly higher, and thus the

further process development was focused on that strain.

500 ml scale cultivation with DSM 7108 In a next step, comparative studies regarding the use of anti-foam agents, trace

element additions and substrate concentrations were performed in a 500 ml scale in

a six-fold parallel bioreactor. Fig. 6.1 shows the oil, bio dry weight, and rhamnolipid

concentrations during the optimal cultivation of sunflower oil with DSM 7108.

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Kapitel I

59

Fig. 6.1 Oil content, bio dry weight and rhamnolipid concentration during a 500 ml scale cultivation of DSM 7108 on sunflower oil with mechanical foam destruction. The arrow indicates the feeding time of additional 125 g/l of substrate.

The increase in bio dry weight shows two distinct phases. An intense growth could be

observed until 50 h, a biomass dry weight of 12.5 g was reached. At 40 h of

cultivation, 125 g/l sunflower oil were fed. Thereafter, the biomass content increased

until 112 h and reached up to 22 g/l BDW. The onset of rhamnolipid production was

at 40 h and continued until the termination of the process at 207 h. The total

rhamnolipid end concentration was 29.4 g/l. This corresponds to 35.9 g/l if the

extraction efficiency is considered.

5 l scale cultivations with DSM 7108 As in the 500 ml scale, the main problem in the cultivation process was to overcome

the excessive foam formation. Two mechanical devices for foam destruction were

tested. Fig. 6.2 summarizes the anti-foam use and corresponding rhamnolipid

productivities of four different cultivations.

Page 76: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel I

60

Fig. 6.2 Antifoam utilization and rhamnolipid end concentrations of four cultivations with DSM 7108 in a 5 l scale bioreactor. Cultivation 1 with 4 blade Rushton stirrer for mechanical foam destruction. Cultivation 2 with 4 blade Rushton stirrer and adapted aeration and mixing speed. Cultivation 3 with a commercial foam destruction stirrer (foam disc™) non optimized. Cultivation 4 with commercial foam destruction stirrer (foam disc™) and adapted mixing speed and aeration rate.

First, foam control was performed essentially by addition of anti-foam agents.

Additionally, a Rushton stirrer was placed in the headspace of the reactor for

mechanical foam destruction. In this cultivation about 128 ml/l defoaming agent had

to be applied. A rhamnolipid concentration of 9.3 g/l was achieved. In a next

experiment, the aeration rate was reduced and the stirrer rate was manually

regulated according to the foam height till the point of foam dwindling. The minimum

aeration rate was 0.1 vvm, and the maximum stirrer speed was 950 rpm. These

adaptations allowed a reduction of the anti-foam dosage down to 9 ml/l whereas the

concentration of rhamnolipids produced increased to 23.7 g/l. In a third run, a

commercial mechanical foam destruction device (foam disc) was used. 5 ml/l of anti-

foam was required and the rhamnolipid content increased to 38.6 g/l. In a fourth run,

after adaptation of the stirrer speed to 650 - 800 rpm while reducing the aeration rate

Page 77: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel I

61

to 0.036 – 0.045 vvm, no anti-foam was needed. In total, 41.1 g/l rhamnolipid was

produced. In all experiments, no deteriorating influence of the anti-foaming agent on

the cells was observable. Microscopic investigations showed typical fast moving

Pseudomonas cells, and, an oxygen demand in the range of 5.8 and 11 mmol/l·h was

observed at the end of the processes. This indicated an active culture.

Cultivation of DSM 7108 with a commercial foam destruction stirrer In Fig. 6.3 a 5 l scale

cultivation (cultivation 4)

with a commercial foam

destruction stirrer is

presented exemplarily. The

time course profiles of cell

growth, rhamnolipid and

substrate concentrations are

shown in Fig. 6.3 A. It

shows that rhamnolipid

production commenced

essentially at the transition

point from the growth to the

stationary phase, before 70

h process time. Due to the

appearance of rhamnolipid,

the foaming of the

cultivation broth strongly

increased. This was a

critical process phase.

However, the foam height

could be kept stable without

adding anti-foam by the use

of the mechanical foam

destruction device. The

rhamnolipid production

Fig. 6.3 Cultivation 4, a 5 l scale production of rhamnolipids with DSM 7108. A: Oil content, bio dry weight and rhamnolipid concentration over the process. B: Acid and base feed and, in addition, the oxygen uptake rate (OUR) and the carbon dioxide evolution rate (CER) over the process is shown. The arrow indicates the feeding time of additional 125 g/l of substrate.

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Kapitel I

62

continued until the end of the process at 261 h, at which time a final concentration of

41.1 g/l was achieved. Considering the extraction efficiency, the resulting rhamnolipid

concentration was about 50.1 g/l. Cell growth was insignificant during the culture time

from 70 to 261 h. In this time interval a mean bio dry weight concentration of about

15 g/l was reached. Sunflower oil was rapidly consumed and 125g/l were replenished

after 40 h. At the end of the process, approximately 165 g/l of the substrate were

utilized. Fig. 6.3 B displays the oxygen uptake rate (OUR), carbon dioxide evolution

rate (CER), acid and base dosage. After 2 h, an increase of the OUR and CER was

observed, indicating the end of the lag phase. At about 49 h process time, a

maximum OUR and CER value of respectively 32 mmol/l·h, and 22 mmol/l·h, was

measured. An adaptation of the process parameters by decreasing the aeration rate

from 0.26 – 0.13 vvm, and increasing the stirrer speed up to 930 rpm, in the interval

of 46 h to 66 h, without getting oxygen limitation, became necessary. At 5 h, an

automatic dosage of acid for pH regulation started and went on for 94 h. After 119 h

an addition of base until the end of the process was necessary.

Comparative rhamnolipid production with Pseudomonas aeruginosa DSM 2874 Comparative experiments to those described for the strain DSM 7108 were

performed with strain DSM 2874. 500 ml scale cultivations with this strain and

medium 1 under similar process conditions used for DSM 7108, showed deviant

results to the results achieved with DSM 7108 mainly in two points. First, the overall

production of rhamnolipids was lower; second, there was a very pronounced increase

in the kinematic viscosity to a value of 45 mm2/s of the medium (normally 2 – 5

mm2/s), severely hindering sample analysis. However, when the salt concentration

was halved (medium 2) a total rhamnolipid concentration of 30.1 g/l (500 ml scale)

and 53.6 g/l (5 l scale) had accumulated after 279 h of cultivation time. A rhamnolipid

concentration of about 36.7 g/l respectively 65.3 g/l resulted, if the extraction

efficiency is accounted for. Given that in the shaking flask experiments rhamnolipid

production by strain DSM 2874 was only a fraction of that produced by strain DSM

7108, it is remarkable that in the 5 L scale experiment the corresponding productivity

was about 25 % higher.

Page 79: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel I

63

6.1.4 Discussion

According to the process reported by Giani et al., high rhamnolipid end

concentrations of up to 112 g/l were expected by using DSM 7108 [51]. In contrast,

the maximum rhamnolipid concentration achieved in this study, with this strain, was

of about 41 g/l, respectively 50 g/l if the extraction efficiency is accounted for.

Considering that rare rhamnolipid species were not detected by the applied analytical

method, the total amount of rhamnolipids possibly could have been slightly higher.

Nevertheless, the productivities claimed with DSM 7108 by Giani et al. in their patent

application could not be confirmed [51].

In all cultivations, no deteriorating influence of the used anti-foam agent on the cells

was observable. However, a significant influence on rhamnolipid productivity was

evident. A possible explanation is the interfacial active properties of the defoaming

agent. Chen and Zhu (2005) report that in the presence of rhamnolipid, P.

aeruginosa growing on hexadecane had a much smaller half-saturation coefficient,

Ks, as compared to that in the absence of rhamnolipid, indicating a higher affinity of

P. aeruginosa to hexadecane in the presence of rhamnolipid [77]. This was partially

attributed to an increase of the cell surface hydrophobicity, owing to the adsorption of

rhamnolipid. This would increase the direct physical contact between the cells and

the poorly soluble substrate. Hence, the interfacial properties of defoaming agents

might also enhance the accessibility of hydrophobic substrates and therefore reduce

the stimulus to produce rhamnolipid. As a consequence for the biotechnological

production of rhamnolipid the conclusion might be drawn that a low emulsification

grade of the substrate could lead to higher rhamnolipid productivities.

The experiments with P. aeruginosa DSM 2874 showed that different Pseudomonas

strains react considerably different to the same environmental conditions. Whereas

DSM 7108 was induced to produce rhamnolipids, DSM 2874 switched to excessive

polysaccharide secretion, along with an increased medium viscosity and reduced

rhamnolipid productivity. The quorum sensing regulatory mechanism, that, depending

on the environmental conditions, induces either polysaccharide or rhamnolipid

formation, could be an explanation therefore [78]. When these effects were absent,

the strain DSM 2874 produced a maximum rhamnolipid concentration of 53.6 g/L,

respectively 65.3 g/l. This fact highlights that the quorum sensing regulatory

mechanism leading to the induction of the rhamnolipid formation is not understood

Page 80: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel I

64

well enough to the point that it could be reliably explored in a biotechnological

process. Further work on the genetic and regulatory mechanisms for the rhamnolipid

production will be necessary to understand these complex interrelations.

6.1.5 Conclusions

The utilization of mechanical foam destruction significantly enhanced the

rhamnolipids production in comparison to the utilization of chemical anti-foaming

agents. The two Pseudomonas strains responded remarkably different to the same

cultivation conditions concerning their behaviour of producing rhamnolipids. Hence,

the application of a new, even close related production strain, for an established

rhamnolipid production process with Pseudomonas spp. will made a validation of the

process, especially media composition necessary. Further work on the regulatory

mechanism leading to the induction of the rhamnolipid formation will be necessary to

understand the complex quorum sensing interrelations involved.

6.1.6 Methods

Microorganism Pseudomonas aeruginosa DSM 7108 and Pseudomonas sp. DSM 2874 were

obtained from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures

(Braunschweig, Germany).

Media For seed cultures LB medium containing 5 g/l NaCl was used [79]. For the cultivation

processes, two Ca-free mineral salt media were used. Medium 1 consisted of 0.1 M

sodium phosphate buffer, pH 6.5 to which were added 0.5 g MgSO4 x 7 H2O, 1 g KCl

and 15 g NaNO3 per liter [51]. Medium 2 was obtained by diluting medium 1 with

equal amount of deionized water. A trace elements solution was added to the media

as described below. It contained 2 g sodium citrate x 2 H2O, 0.28 g FeCl3 x 6 H2O,

1.4 g ZnSO4 x 7 H2O, 1.2 g CoCL2 x 6H2O, 1.2 g CuSO4 x 5 H2O and 0.8 g MnSO4 x

H2O per liter.. All chemicals were of analytical grade. As a C-source, food-grade

sunflower oil was used.

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Kapitel I

65

Cultivation conditions 25 ml seed cultures were prepared in 100 ml shaking flasks. These cultures were

incubated for 12 h at 30 °C and 110 rpm in an incubation shaker (HT Infors Multitron

II), until an optical density at 580 nm (OD580) of 3.0 - 4.6 was reached (Amersham

Biosciences Ultrospec 1100pro). Shaking flask and bioreactor cultures were

inoculated with 10 ml/l of the seed cultures. Shaking flask experiments were

performed in 500 ml flasks with 100 ml of mineral salt medium 12.5 g sunflower oil,

and a single addition of 300 µL of trace elements solution. These flasks were

incubated under the same conditions as the seed cultures. The bioreactor

cultivations were performed in a 5 l bioreactor (Biostat B5, Sartorius BBI systems

GmbH Melsungen, Germany) with an initial media volume of 2 l and 125 g plant oil.

An exhaust air analyzer (EGAS-L, Sartorius BBI systems GmbH Melsungen,

Germany) was utilized. Small scale bioreactor cultivations were performed in a 500

ml six fold bioreactor system (Sixfors, INFORS GmbH Einsbach, Germany) with 200

ml initial media volume and 12.5 g plant oil. In all experiments, the temperature was

set to 30 °C. Mixing speed for the 500 ml scale system was adjusted in a range of

800 – 1100 rpm and for the 5 l system in a range of 600 – 930 rpm, depending on the

pO2 value. In all bioreactor cultivations 125 g/L substrate additional were added after

approximately 40 h of process time and one ml per litre of the trace elements solution

was added after 0; 20; 40; 70; 120 h of process time. The reactor systems were

equipped with additional self-manufactured 4 blade Rushton stirrers with a height to

width blade geometry of 1:1 for mechanical foam destruction.

For the 5 l cultivation system, a commercially available foam destruction stirrer (foam

disk; Sartorius BBI systems GmbH Melsungen, Germany) was likewise tested. For

chemical defoaming, Contraspum™ A4050 (Zschimmer&Schwarz GmbH & Co KG

Chemische Fabriken, Lahnstein, Germany) was used. The processes were controlled

and recorded by a personal computer system with the process software’s MFCSwin

(Sartorius BBI systems GmbH Melsungen, Germany), respectively with Iris (INFORS

GmbH Einsbach, Germany).

Page 82: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel I

66

Sampling protocol For oil separation and cell washing, 5 ml of cultivation broth were mixed with 5 ml of

hexane in a pre-weighed 15 ml screw cup and centrifuged at 7500 g at 15 °C for 15

minutes. 2x 1.5 ml of the upper phase, containing hexane and oil, were transferred in

pre-weighted 2 ml cups and the hexane was evaporated at 60 °C in a thermo mixer.

Afterwards, the cups were dried for 24 h at 100 °C and the oil contend was

determined by weighing. 3 ml of the lower phase were transferred and acidified with

85 % H3PO4 to pH 2 - 3. Ethyl acetate (4 ml) was added to the aqueous phase for the

extraction of the rhamnolipids. After mixing, the suspension was centrifuged at 7500

g at 4 °C for 15 min. 2x 1.5 ml of the upper phase were transferred to 2 ml cups and

the ethyl acetate was evaporated at 60 °C in a thermomixer for 24 h. For bio dry

weight (BDW) determination, the biomass pellet gained after the first extraction step

was dried for 48 h at 100 °C and weighed. All plastic cups were heated for 48 h at

100 °C until their weights were constant. All samples were analyzed in duplicate.

Rhamnolipid determination The quantitative determination of rhamnolipid 1 and rhamnolipid 3 was carried out by

HPLC analysis. A rhamnolipid 1 standard was produced for the calibration of the

HPLC device by enzymatic hydrolysis of rhamnolipid 3 [23] and purified by

chromatography. As the stationary phase, fine silica gel was used, and as the mobile

phase, a chloroform-methanol solution (75:25) was utilized. The RL 3 standard with a

purity grade of 97.3 % was purchased from Hoechst AG (Frankfurt, Germany).

For UV-detection, the rhamnolipids were derivatized into esters of

bromophenacylbromide. This was done by the use of a 1:1 (v/v) derivatisation

solution of 40 mM 4-bromophenacylbromide and 20 mM triethylammonia in

acetonitrile [80]. The rhamnolipid contents of the samples were analyzed after

redissolving each pellet in 1.5 ml of acetonitrile. A rhamnolipid content in the range of

0.1 - 1 mM was obtained by adequate dilution with acetonitrile. 1 ml of this solution

was mixed with 200 µL of the derivatization agent. The derivatisation reaction took

place at 60 °C for 90 min. Subsequently, the rhamnolipids were separated in a

reverse phase C18 column (Supelcosil LC-18, Supelco/Sigma-Aldriche cooperation

Bellefonte, Pennsylvania, USA) on an HPLC device (Agilent 1100 series, Agilent

Technologies GmbH, Germany) with a linear gradient of acetonitrile-water, and

Page 83: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel I

67

monitored by a UV-detector at 265 nm. Solvent A consisted of 95:5 H2O/acetonitrile

(v/v), solvent B was composed of 95:5 acetonitrile/H2O (v/v). For the evaluation of the

single step extraction, the biomass pellet and the hexane phase were extracted

twice, while the water phase was extracted three times. This evaluation showed that

approximately 82 % of the rhamnolipid were recovered in a single ethyl acetate

extraction step.

GC-Fatty acid methyl ester determination For the characterization of the sunflower oil that was used as substrate, a fatty acid

methyl ester (FAME) gas chromatography analysis was performed by use of the

TMSH-esterification method according to Butte [81].

Kinematic viscosity The kinematic viscosity of the cultivation broth was determined by the use of

Ubbelohde Viscometers (Schott AG, Mainz, Germany) type 0c and type Ic. Triple

measurements of each sample were performed at 30 °C.

6.1.7 Authors' contributions & Acknowledgements

FL, CS & RH coordinated the work in this project, gave intellectual courtesy and were

involved in the writing work. AD participated for the 5 L cultivations. FL performed all

experiments and made the analysis presented in this publication.

We thank the FNR e.V. (Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V.) for funding,

the industrial project partners Sartorius AG, Ecover Belgium and Henkel AG for

technical support, and our academic partners Dr. Rosenau (University of Düsseldorf),

Prof. Dr. Chmiel and PD Dr. Janke (UPT, Gesellschaft für umweltkompatible

Prozesstechnik mbH i.L., Saarbrücken) and the group of Dr. Behrensmeier

(Forschungszentrum Karlsruhe) for lively discussions.

Page 84: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel I

68

Page 85: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel II

69

6.2 Kapitel II

Proportion of Di- and Mono-Rhamnolipid production by Pseudomonas strains DSM 7108 and DSM 2874.

F. Leitermann, C. Syldatk, R. Hausmann

Chair of Technical Biology, Research University Karlsruhe, 76131 Karlsruhe, Germany

Status: running title, BMC Research Notes

Page 86: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel II

70

6.2.1 Abstract

Several species of the genus Pseudomonas are known to produce rhamnolipids

under growth limiting conditions on hydrocarbons and other hydrophobic C-sources.

In this study two Pseudomonas strains, DSM 2874 and DSM 7108, have been

compared with respect to the production kinetics of mono- and di-rhamnolipid. A shift

in the relation of RL3 and RL1 for P. aeruginosa DSM 7108 was detected. While it

initially produced mainly mono-rhamnolipid, di-rhamnolipid was the dominant species

at the end of the processes. In contrast, the strain DSM 2874 tends to produce equal

quantities of mono- and di-rhamnolipids.

Page 87: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel II

71

6.2.2 Introduction

Biosurfactants, including rhamnolipids, are expected to gain an increasing

importance in the surfactants market and, up to 10 % of the surfactant market are

estimated by Nitschke et al. (2005) for the future [11]. Different strains of

Pseudomonas produce rhamnolipids under growth-limiting conditions on

hydrocarbons and other hydrophobic C-sources, like seed oils or n-hexane [22].

These rhamnolipids are typically composed of one or two L-rhamnose respectively

one or two β-hydroxydecanoic acid moieties. Fig. 6.4 shows the structures of mono-

rhamnolipid (L-rhamnosyl-3-hydroxydecanoyl-3-hydroxydecanoate: R1C10C10) termed

RL1 and di-rhamnolipid (L-rhamnosylrhamnosyl-3-hydroxydecanoyl-3-

hydroxydecanoate: R2C10C10) termed RL3, the most common rhamnolipids produced

by P. aeruginosa [23].

Fig. 6.4 Two common rhamnolipids [23].

In this study two Pseudomonas strains, DSM 2874 and DSM 7108, have been

compared with respect to the production kinetics of mono- and di-rhamnolipid. The

last-mentioned strain was obtained by Giani et al. (1997) via mutagenesis of a P.

aeruginosa strain isolated from a water sample [51]. It was selected in order to

increase the L-rhamnose production. The rhamnose was gained by hydrolysis of the

produced rhamnolipids. In contrast, DSM 2874 is a wild type strain isolated by

Syldatk et al. [25]. These strains, have been chosen, as DSM 7108 is known to be

the best rhamnolipid-producing strain [51] and DSM 2874 was used for comparison.

6.2.3 Results and Discussion

An exemplary rhamnolipid production process in respect of the characteristic time

courses of substrate, bio dry weight, and, rhamnolipid concentrations is presented in

Fig. 6.5.

Page 88: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel II

72

Fig. 6.5 Characteristic time courses of substrate, bio dry weight, and, rhamnolipid concentrations for a 5 l scale production of rhamnolipids with DSM 2874. The arrow indicates the feeding time of additional 125 g/l of substrate.

In a typical cultivation the rhamnolipid production commenced essentially at the

transition point from the growth to the stationary phase. Due to the appearance of

rhamnolipid, the foaming tendency of the fermentation broth strongly increased. The

rhamnolipid production continued until the end of the cultivation at which time a final

concentration of about 50 g/l was achieved.

Fig. 6.6 shows the RL 3 to RL 1 ratio (w/w) in dependence of process time. A shift in

the relation of RL3 and RL1 occurred during the processes. Surprisingly, the strain P.

aeruginosa DSM 7108, which was specifically selected for rhamnose production,

initially, the dominantly produced rhamnolipid species was mono-rhamnolipid,

containing one rhamnose moiety only.

Page 89: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel II

73

Fig. 6.6 Time course of the ratios of rhamnolipid 3 (RL3) to rhamnolipid 1 (RL1) for Pseudomonas spp. DSM 7108 and DSM 2874 cultivations.

The initial RL3:RL1 ratios were between 1:1.2 and 1:1.5. Only in the time course of

several days of cultivation this ratio was inversed. Ratios of 3.4:1 to 2.7:1 resulted.

To explain these different kinetics two explanations are possible. One is that in strain

DSM 7108 much more rhamnose is available for the synthesis of di-rhamnolipide in

comparison to DSM 2874. A second possibility is that the enzyme activity of

rhamnosyltransferase 2 (RhlC) is higher. This enzyme links an activated rhamnose

molecule to a mono-rhamnolipid unit [33]. In contrast, the wild type strain DSM 2874

produced initially more di-rhamnolipid than mono-rhamnolipid. The ratio started at

about 1.2:1 to 1.3:1 and slightly decreased to 1:1.3 to 1:1.0 at the end. Concluding,

the analysis of the rhamnolipid RL3:RL1 ratios revealed a shift in the predominant

product species in the time course of the cultivation. While DSM 7108 showed a

tendency to form di-rhamnolipid, DSM 2874 mainly tends to produce equal quantities

of mono- and di-rhamnolipids. Therefore the current view that the produced

composition of rhamnolipids is specific for each strain for a given medium has to be

reviewed.

Page 90: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel II

74

6.2.4 Material & Methods

Both strains, DSM 7108 and DSM 2874, were obtained from the German Collection

of Microorganisms and Cell Cultures (Braunschweig, Germany). Incubations of the

strains were performed in a in a 5 l bioreactor (Biostat B5, Sartorius BBI systems

GmbH Melsungen, Germany) respectively in a 500 ml bioreactor system (Sixfors,

IFORS GmbH Einsbach, Germany) according to Giani et al. [51]. However, the

medium for the incubation of DSM 2874 was modified by two fold dilution. As C-

source food-grade sunflower oil was used. The rhamnolipid analysis was carried out

according to Schenk et al. [80].

6.2.5 Acknowledgement

We acknowledge the FNR e.V. (Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V.) for

funding of this work.

Page 91: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel III

75

6.3 Kapitel III

Screening of hydrophobic Substrates for the Production of Rhamnolipids by Shaking Flask and Bioreactor Cultivations of

Pseudomonas aeruginosa DSM 7108 Frank Leitermann, Ina Sandig, Christoph Syldatk, Rudolf Hausmann

Chair of Technical Biology, Research University Karlsruhe, 76131 Karlsruhe, Germany

Status: running title, BMC Biotechnology

Page 92: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel III

76

6.3.1 Abstract

A number of species of the genus Pseudomonas are known to produce rhamnolipids

under growth limiting conditions on hydrocarbons and other hydrophobic C-sources.

Especially the Pseudomonas aeruginosa strain DSM 7108 was reported to produce

comparatively high amounts of rhamnolipids. For a screening of potential renewable

C-sources for the production of microbial rhamnolipids, several different plant oils

and fish oil were examined.

Starting from shaking flask cultivations, an adaptation to a 500 ml bioreactor parallel

bioreactor system was carried out. The maximum concentrations of rhamnolipid

obtained from shaking flask were 0.8 g/l and for the bioreactor experiments up to 40

g/l. Oils with single and twice unsaturated fatty acids were found to be the most

suitable substrates. An induction of a variable rhamnolipid spectrum by the different

applied substrates could not be identified, but a general shift of the rhamnolipid 3 to

rhamnolipid 1 ratio throughout the processes was observed.

Seven widely-used plant oils and fish oil were evaluated for the production of

rhamnolipids with Pseudomonas aeruginosa DSM 7108. It was found that all plant

oils in principle are suitable substrates. However, fish oil proved to be non-suitable.

The comparison of bioreactor and shaking flask results showed that qualitative and

quantitative limitations of the latter cultivation type proved to be significant.

Page 93: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel III

77

6.3.2 Introduction

Surfactants of microbial origin are termed biosurfactants in contrast to conventional

surfactants. Biosurfactants are characterized by high efficiency and a good biological

degradability. Today the industrial utilization of such biosurfactants is rather limited

as a result of the insufficient economy of the bioprocesses applied [82]. However,

biosurfactants have a remarkable commercial potential as surfactants are the most

important products of the industrial oleochemistry. Due to their high efficiency, an

increasing market share of microbial produced surfactants can be expected, if the

production costs can be reduced. Correspondingly, biosurfactants are expected to

gain 10 % of the surfactant market in the near future [83].

Biosurfactants containing L-rhamnose and β-

hydroxydecanoic acid moieties are termed rhamnolipids.

Pseudomonas spp., especially Pseudomonas

aeruginosa, are known to produce rhamnolipids under

growth-limiting conditions on hydrocarbons and other

hydrophobic C-sources, like seed oils or n-hexane [22].

Fig. 6.7 shows the most common rhamnolipids produced

by P. aeruginosa: mono-rhamnolipid or rhamnolipid 1 (L-

rhamnosyl-3-hydroxydecanoyl-3-hydroxydecanoate: RL

1; Rha:C10:C10) and di-rhamnolipid, also termed

rhamnolipid 3 (L-rhamnosylrhamnosyl-3-hydroxy-

decanoyl-3-hydroxydecanoate: RL 3; Rha:C10:C10) [23].

Several approaches for the production of rhamnolipids on

different seed oils as substrate have been reported

[22][82]. However, various strains and cultivation

conditions have been employed. These results can only conditionally be compared

with respect to process strategies, production rates and efficiencies.

Therefore, the aim of this study was the comparison of different hydrophobic

substrates for the production of rhamnolipids, starting from a classical shaking flasks

approach, due to their ease of handling.

Shaking flasks cultivations are generally used in the biotechnological industry as a

means to performed bioprocess development and optimization, as a large number of

Fig. 6.7 The chemical structure of rhamnolipid 1 and rhamnolipid 3, two

common rhamnolipids [23]

Page 94: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel III

78

parallel experiments is performed to determine optimal medium composition or to find

a suitable microbial strain. As outstanding decisions are taken based on the

experimental results, suitable and reproducible experimental conditions are crucial.

However, screening projects in shaking flasks risk unwanted development if not

failure, when operating conditions are not fully comparable. A lack of oxygen supply,

irregular pH adjustment and mixing efficiency may cause such conditions. Especially

sensitive to the operation conditions is the yields of special bioproducts which

depend on the physiological status of the microbial production strains. The

production of rhamnolipid by P. aeruginosa is a marked example for such a situation.

This is a result of the biosynthesis pathway of rhamnolipids being closely

interconnected to the central metabolism by the biosyntheses of activated sugars and

fatty acids. Equally, a close interconnection to the biosynthesis pathways of various

other metabolites exists. Especially, this applies to the biosynthesis of polymers such

as lipopolysaccharid (LPS), polyhydroxyalkanoates (PHA), alginate, and possibly

also to exopolysaccarides [33, 84]. According to this, the regulation of rhamnolipid

biosynthesis at the transcriptional level is very complex. The production of

rhamnolipids is regulated by quorum-sensing responses. However, the causal chain

on the gen respectively enzyme level is still uncertain. In practice, the rhamnolipid

production is induced by growth limiting conditions. As an implication rhamnolipid

yields obtained by P. aeruginosa vary significantly in dependence of the achieved cell

density [37].

Therefore, this study aims at the comparison of the qualitative and quantitative

screening results of shaking flasks versus bioreactor screenings of different

substrates for the production of rhamnolipids by the strain P. aeruginosa DSM 7108.

Page 95: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel III

79

6.3.3 Results

Characterization and selection of the used substrates The resulting fatty acid compositions of the used substrates are summarized in Tab.

6.1. All of the substrates have a high proportion of unsaturated fatty acids. Tab. 6.1 Major fatty acid composition of the used substrates. Measured in equivalent fatty acid methyl esters. * data from supplier.

Group

I Group

II

fatty acids HOS 90+

HOS 80+

rapeseed oil corn oil sunflower

oil soy

bean oil linseed

oil fatty acids fish oil

compounds w/w [%]

w/w [%]

w/w [%]

w/w [%]

w/w [%]

w/w [%]

w/w [%] compounds* w/w

[%] Myristic acid 14:0 0 0 0.1 0 0.1 0.1 0 14:0 3.8 Palmitic acid 16:0 3 3.6 4.6 1.2 6 10.9 4.9 16:1 n7 5.9 Stearic acid 18:0 0 0 0 0 3.5 3.3 3.3 18:0 5.1 Oleic acid 18:1 92.3 83.7 63 32.5 24.4 23.2 16.1 18:1 n9/n7 17.9

Linoleic acid 18:2 3.2 10.4 21 64.3 64.8 55.7 29.1 18:2 n6 1.7 Linolenic acid 18:3 0.1 0.9 10.3 1.3 0.1 5.7 46.1 20:1 n9/n7 2.9 Arachidic acid 20:0 0.2 0.3 0.6 0.5 0.3 0.4 0.1 20:4 n6 2 Behenic acid 22:0 0.8 0.7 0.3 0.2 0.6 0.4 0.1 20:5 n3 7.6 Eruaic acid 22:1 0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 22:5 n3 1.6

Lignoceric acid 24:0 0.4 0.3 0.1 0.2 0.2 0.2 0.1 22:6 n3 21.3

As expected, four groups of substrates could be differentiated according to their fatty

acid compositions. High oleic acid sunflower oils (HOS 90+; HOS 80+) and rapeseed

oil were representatives for oils mainly composed of single unsaturated oleic acids

(group I). In contrast the major fatty acid compound of conventional sunflower, corn,

and, soy bean oil was linoleic acid, a twice unsaturated fatty acid (group II). In linseed

oil the dominant fatty acid was the threefold unsaturated linolenic acid. Fish oil with

docosahexaenoic acid (C22:6n-3), a omega-3 fatty acid, as major fatty acid

compound, was assigned as a fourth type of a substrate.

Screening of different substrates in shaking flasks Rhamnolipid production on different substrates with P. aeruginosa DSM 7108 was

initially examined in shaking flask experiments. The accumulated bio dry weights

(BDW) ranged from 2.0 to 6.8 g/l, whereas the lowest amounts were found on soy

bean oil and the highest amounts on sunflower oil. About 32 g/l (HOS 90+) to 103 g/l

(soy bean oil) of substrate were utilized. In these experiments fish oil became solid

Page 96: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel III

80

and was not emulsified. Therefore, the substrate concentration could not be

determined. No rhamnolipid and no bio mass could be detected. The highest

rhamnolipid concentrations, about 0.8 g/l, were produced on soy bean oil respectively

rapeseed oil, whereas the lowest concentration, about 0.3 g/l, was found with linseed

oil as substrate. The total rhamnolipid concentrations and the bio dry weight

dependant specific productivities (Pp/x) are shown in Fig. 6.8.

Fig. 6.8 Shaking flask screening with DSM 7108 on seven plant oils and fish oil. Summarized results of total rhamnolipid concentration and the bio dry weight dependant specific productivity after 144 h.

Concentrations of 0.49 and 0.56 g/l were detected for substrate group I respectively

group II. With linseed oil 0.31 g/l rhamnolipid resulted. The highest specific

productivity (Pp/x) of about 1.3 mg/g·h was determined when applying substrates of

the second group. Substrates of the first group resulted in values of about 0.96

mg/g·h. Linseed oil specific productivities were the lowest of the plant oils tested,

about 0.31 mg/g·h.

Screening of different substrates in 200 ml bioreactor cultivations The results for the achieved concentrations of rhamnolipid in 200 ml bioreactor

cultivations and the respective Pp/x values in dependence of the substrate type are

shown in Fig. 6.9. Further process values are listed in Tab. 6.2 Summarized results

Page 97: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel III

81

of the bioreactor cultivations with DSM 7108. The results of the bioreactor cultivations

for the performance comparison with the respective shaking flask screening are

subdivided in the next paragraphs, according to the fatty acid compositions of the

substrates as described above.

Tab. 6.2 Summarized results of the bioreactor cultivations with DSM 7108

number of Substrate S RL3/RL1 µmax Process

processes consumed (g/l)

BDW X (g/l) RL (g/l) YP/S YP/X ratio

(w/w) Pv (g/lh)

(h-1)

Group I

HOS 90+ 2 183.5 ± 58.8 16.0 ± 1.0 23.3 ± 5.3 0.10 ± 0.01 1.50 ± 0.42 3.4 : 1 0.10 ± 0.03 0.30 ± 0.04

HOS 80+ 3 116.9 ± 30.0 16.5 ± 3.0 27.1 ± 10.2 0.25 ± 0.15 1.74 ± 0.9 3.3 : 1 0.11 ± 0.05 0.19 ± 0.09

rapeseed oil 2 146.8 ± 80.7 13.3 ± 0.2 27.4 ± 15.6 0.30 ± 0.25 2.10 ± 1.15 5.5 : 1 0.12 ± 0.08 0.40 ± 0.21

Group II

corn oil 2 210.9 ± 5.2 17.8 ± 0.2 28.8 ± 3.8 0.10 ± 0.01 1.60 ± 0.19 3.6 : 1 0.11 ± 0.01 0.23 ± 0.02

sunflower oil 2 130.6 ± 24.6 18.0 ± 1.3 34.6 ± 7.4 0.30 ± 0.11 1.90 ± 0.27 2.6 : 1 0.16 ± 0.02 0.22 ± 0.16

soy bean oil 2 203.6 ± 14.3 17.4 ± 0.5 27.8 ± 2.8 0.10 ± 0.01 1.60 ± 0.11 4.2 : 1 0.11 ± 0.01 0.24 ± 0.03

linseed oil

linseed oil 2 100.6 ± 28.5 12.6 ± 1.6 21.1 ± 1.8 0.2 ± 0.05 1.7 ± 0.06 5.4 : 1 0.1 ± 0.01 0.24 ± 0.04

fish oil

fish oil 3 121.8 ± 56.5 16.1 ± 1.7 8.1 ± 2.8 0.07 ± 0.05 0.52 ± 0.19 3.3 : 1 0.04 ± 0.02 0.35 ± 0.05

Fig. 6.9 Bioreactor screening with DSM 7108 on seven plant oils and fish oil. Summarized results according to total rhamnolipid concentration and the specific productivity.

Page 98: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel III

82

Cultivations with plant oils with single unsaturated fatty acids The bioreactor cultivations on plant oils with single unsaturated fatty acids as major

fatty acid compound, were done with high oleic acid sunflower oils HOS 90+, HOS

80+ and rapeseed oil. The maximum specific growth rates lay between 0.19 – 0.4 h-1,

whereas the lowest was observed on HOS 80+ and the highest on rapeseed oil. The

mean bio dry weights in the stationary phase for rapeseed oil were 13.3 g/l, whereas

for the HOS sunflower oils BDW of 16 – 16.5 g/l were reached. On average 149 g/l of

the provided substrates were used. The onset of rhamnolipid production was after a

process time of 37.5 – 45 h. Total rhamnolipid concentrations in between 23.3 – 27.4

g/l were achieved. This corresponds to 28.4 – 33.4 g/l if the extraction efficiency is

considered. The second highest rhamnolipid concentration of the whole screening,

with 38.4 g/l was found in a single process with rapeseed oil. On average 25.4 g/l

rhamnolipid were produced on these substrates, which was about the 52-fold amount

compared to the shaking flask cultivation. A Pp/x of 7.23 mg/g·h was determined. For

this group an average rhamnolipid 3 : rhamnolipid 1 (RL 3 : RL 1) ratio of 4.1 : 1

(w/w) could be determined, whereas the mean volumetric productivity was

Pv = 0.11 g/l·h.

Cultivations with plant oils with twice unsaturated fatty acids Six bioreactor cultivations with sunflower oil, corn oil, and soy bean oil, containing

mostly twice unsaturated fatty acid moieties were performed. The mean specific

growth rates varied in a range of 0.22 h-1 for sunflower oil and 0.24 h-1 for soy bean

oil. Similar mean BDWs during the stationary phase of about 18 g/l for sunflower oil,

17.8 g/l for corn oil and 17.4 g/l for soy bean oil were detectable. On average 182 g/l

substrate were utilized in these processes. On soy bean and corn oil the oil

consumptions were very homogenous and were located in a range of 204 – 211 g/l,

whereas the mean consumption for sunflower oil was 131 g/l. Rhamnolipids were first

detected after a process time of 39 – 65.5 h. In total 27.8 – 34.6 g/l rhamnolipid were

produced. Considering the extraction efficiency, this corresponds to 33.9 – 42.2 g/l.

The highest rhamnolipid concentration in the screening, of 39.8 g/l was found in a

single process on sunflower oil. On average 30.6 g/l rhamnolipid were produced on

these substrates, which was about the 55-fold amount compared to the shaking flask

cultivation. A Pp/x of 7.12 mg/g·h resulted. The average rhamnolipid RL 3 : RL 1 ratio

Page 99: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel III

83

at the end of the processes was 3.5 : 1 (w/w). With an average production rate of Pv

= 0.13 g/l·h, these substrates showed the highest rates of this screening.

Cultivations with linseed oil Linseed oil, with the three fold unsaturated linolenic acid as major fatty acid

compound, was applied in two processes. A mean BDW of 12.6 g/l was achieved.

The average specific growth rate was determined to 0.24 h-1. At the end of the

processes on average 101 g/l linseed oil were consumed. During the processes the

first occurrence of rhamnolipid was observed at the 37.5 h. Compared to the shaking

flask cultivation a 68-fold higher rhamnolipid concentration of 21.1 g/l was achieved

which corresponds to 25.73 g/l, if the extraction efficiency is considered. A Pp/x of

7.29 mg/g·h was achieved. An average RL 3 : RL 1 ratio of 5.4 : 1 (w/w) at the end of

the process was determined. The mean production rate was about 0.1 g/l·h.

Cultivations with fish oil Three cultivations were performed with fish oil as substrate. During the processes a

mean specific growth rate of 0.35 h-1 was achieved. In the stationary phase, an

average bio dry weight (BDW) content of 16.1 g/l was determined. 122 g/l substrate

were consumed. The onset of rhamnolipid production was after 37.5 – 63 h. In total

8.1 g/l rhamnolipid were accumulated. This corresponds to 9.9 g/l if the extraction

efficiency is considered. The average rhamnolipid ratio of RL 3 : RL 1 at the end of

the processes was 3.3 : 1 (w/w). A Pp/x of 2.22 mg/g·h resulted. The mean production

rate on this substrate was determined to Pv = 0.04 g/l·h.

Rhamnolipid formation and product spectrum In all bioreactor cultivations the onset of rhamnolipid formation was approximately in

the range of 37.5 to 63 hours of the process. This coincided with the transition of the

growth to the stationary phase.

Fig. 6.10 shows the relation (w/w) of rhamnolipid 3 and 1. A proportional shift

occurred over the processes. At the onset of the rhamnolipid formation in cultivations

with P. aeruginosa DSM 7108 the dominant produced rhamnolipid species was

rhamnolipid 1. The initial RL 3 : RL 1 ratios were distributed between 0.6 – 1.3 : 1

Page 100: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel III

84

(w/w). During the processes this ratio shifted towards rhamnolipid 3 with ratios of 3.3

– 5.4 : 1 (w/w).

Fig. 6.10 Average rhamnolipid ratios of rhamnolipid 3 (RL 3) to rhamnolipid 1 (RL 1) for all bioreactor cultivations in terms of process time.

6.3.4 Discussion

As a general result it was shown that DSM 7108 utilizes all of the provided

substrates, independent of their fatty acid composition. Nevertheless a clear

tendency is that oils belonging to group I and II are the most suitable. A possible

explanation is the substrate specifities of the lipolytic enzymes, for example of LipA.

Hence the availability of the cleavage products might be influenced.

In the bioreactor cultivations more than three times higher biomass concentrations

were achieved as compared to the shaking flask cultivations. Quantitatively,

rhamnolipid concentrations in the shaking flask experiments, about 0.56 g/l, proved

to be only a fraction of the comparable amounts gained in bioreactor cultivations,

about 31 g/l. This clearly highlights the limitations of shaking flask screening

Page 101: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel III

85

experiments for rhamnolipid production. Especially in view of the cell densities, that

are probably essential for a quorum sensed strong induction of the rhamnolipid

synthesis, a bioreactor screening seems to be the more appropriated approach. The

specific productivity of the biomass achieved in the bioreactor cultivations were

significantly higher as compared to the shaking flasks. Interestingly, the mean

specific productivity was comparably high, about 7 mg/g·h, for all plant oils except the

fish oil. This is evidence that the induction of the rhamnolipid biosynthesis is more

pronounced under these conditions. Additionally, the lipA expression is indirectly

quorum sensing regulated [85, 86]. Therefore, the availability of the fatty acids and

glycerol is probably cell density dependent.

However, the qualitative conclusions of shaking flask and bioreactor cultivations on

the most suitable substrates are similar, except for the fish oil. In this case no

rhamnolipid formation was found in the shaking flasks.

The ratios of rhamnolipid 3 and 1 showed a shift towards RL3 at the end of the

cultivations. However, they were independent of the substrates. This correlates with

the results reported by Passeri et al. [32] and Rehm et al. [33] who found that the

fatty acids of rhamnolipids originate from a de novo synthesis, not from intermediates

of the ß – oxidation cycle.

6.3.5 Conclusions

Seven widely-used plant oils and fish oil were evaluated for the production of

rhamnolipids with Pseudomonas aeruginosa DSM 7108. It was found that all plant

oils in principle are suitable substrates. However, fish oil proved to be non-suitable.

The comparison of bioreactor and shaking flask results showed that qualitative and

quantitative limitations of the latter cultivation type proved to be significant.

In view the quorum sensing signal systems of P. aeruginosa [74]; [14], the conclusion

might be drawn, that the cell density plays an essential role for maximum induction of

rhamnolipid synthesis. This is reflected by the relatively low PP/X values of shaking

flasks as compared to bioreactor cultivations.

Page 102: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel III

86

6.3.6 Methods

Microorganism Pseudomonas aeruginosa DSM 7108 was obtained from the German Collection of

Microorganisms and Cell Cultures (Braunschweig, Germany). The strain was stored

as glycerol stock culture at -80°C.

Media For seed cultures a LB medium containing 5 g/l NaCl was used [79].

For the bioreactor cultivations a Ca-free mineral salt media was used. The medium

used was according to Giani et al. [51] with 0.5 g/l MgSO4 x 7 H2O, 1 g/l KCl and 15

g/l NaNO3, except that a 0.1 M sodium phosphate buffer pH 6.5 was applied. The

phosphate buffer was separately autoclaved from the other salts. A sterile filtered

trace elements solution consisted of 2 g/l sodium citrate x 2 H2O, 0.28 g/l FeCl3 x 6

H2O, 1.4 g/l ZnSO4 x 7 H2O, 1.2 g/l CoCL2 x 6H2O, 1.2 g/l CuSO4 x 5 H2O and 0.8 g/l

MnSO4 x H2O was added to the media as described below. All chemicals were of

analytical grade.

As C-source three types of sunflower oils (HOS 90+, HOS 80+, conventional

sunflower oil), linseed oil, rapeseed oil, corn oil, and soy bean oil (all by courtesy of

Dr. B Schlüter, Unternehmensberatung und Dienstleistung im vor- und

nachgelagerten Bereich der Landwirtschaft, Bornheim, Germany) of technical/food

grade were used. High oleic acid sunflower oils (HOS 90+; HOS 80+) and rapeseed

oil are representatives for oils mainly composed of single unsaturated fatty acids. In

contrast conventional sunflower, corn and soy bean oil are oils composed of twice

unsaturated fatty acids and linseed oil is composed mainly of threefold unsaturated

fatty acids. Additionally, a fish oil, DHA20TG (by courtesy of Dr. Krumbholz, KD-

Pharma Bexbach GmbH, Bexbach, Germany), with docosahexaenoic acid (C22:6n-

3), a omega-3 fatty acid, as major fatty acid compound, was utilized. The substrates

were characterized by GC FAME analysis.

Cultivation conditions For the seed cultures of the bioreactor cultures, 25 ml LB medium was inoculated

with 100 µl of a glycerol stock culture in a 100 ml shaking flask. This culture was

Page 103: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel III

87

incubated for 12 h at 30 °C and 140 rpm in an incubation shaker (HT Infors Multitron

II), until an optical density at 580 nm (OD580) of 2.5 – 3.0 was reached (Amersham

Biosciences Ultrospec 1100pro).

For shaking flask experiments, 250 ml shaking flasks, without baffles, were

supplemented with 100 ml of the formerly described mineral salt medium. The

concentration of nutrient salts in this medium was decreased to the tenth part,

whereas the buffer concentration of 0.1 M was unchanged. This was essential in

order to achieve growth-limiting conditions. 125 g/l of substrate were added.

Subsequently, the flasks were seeded by 1 ml of the seed culture and incubated at

30 °C at 150 rpm. 100 µl trace elements solution were added after 0; 20; 40; 70 h.

Daily, the pH was checked and adjusted by addition of 4 M NaOH or H3PO4, if

necessary. The flask experiments were carried out in duplicates.

The bioreactor cultivations were performed in a 500 ml parallel bioreactor system

(Sixfors, IFORS GmbH Einsbach, Germany) with a utilized volume of 228 ml (200 ml

medium + 2x 14 ml substrate). The main cultures were inoculated with 2 ml of the

seed culture. Temperature was thermostatically maintained at 30 °C. While the

processes, the pH was controlled and maintained at 6.5. Additional 14 ml of

corresponding substrate were added after approximately 40 h of process time. 200 µl

of the trace element solution were added after 0; 20; 40; 70; 120 h of process time.

For mechanical foam destruction, the reactors were equipped with additional 4 blade

Rushton stirrers with a blade geometry of 1:1. For chemical defoaming

Contraspum™ A4050 (Zschimmer&Schwarz GmbH & Co KG Chemische Fabriken,

Lahnstein, Germany) was used. Until the onset of foaming, the air flow rate was

maintained at 20 l/h and mixing speed was set to 800 rpm. Subsequently, the

aeration rate was set to 6 l/h and the mixing speed was increased to 1100 rpm. The

processes were controlled and recorded by a personal computer system with the

process software Iris (INFORS GmbH Einsbach, Germany).

Sampling protocol For oil separation and cell washing, 5 ml of the cultivation broth were mixed with 5 ml

of hexane in a pre-weighed 15 ml screw cup and centrifuged at 7500 g at 15 °C for

15 minutes. 2 x 1.5 ml of the upper phase, containing hexane and oil, were

transferred in pre-weighted 2 ml cups and the hexane was evaporated, at 60 °C in a

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Kapitel III

88

thermo mixer. Afterwards, the cups were dried for 24 h at 100 °C and the oil contend

was determined by weighing. Subsequently, 3 ml of the lower phase were transferred

and acidified with 85 % H3PO4 to pH = 2 - 3. For the extraction of the rhamnolipids 4

ml of ethyl acetate were added. After mixing, the suspension was centrifuged at 7500

g at 4 °C for 15 minutes. 2 x 1.5 ml of the upper phase were transferred in 2 ml cups

and the ethyl acetate was evaporated at 60 °C in a thermo mixer for 24 h. The

residue was dissolved in an appropriate amount of acetonitrile, and the rhamnolipid

content of the samples were analysed by HPLC. For bio dry weight determination,

the biomass pellet gained after the first extraction step was dried for 48 h at 100 °C

and weighed. All cups used were previously heated for 48 h at 100 °C until their

weights were constant. All samples were analyzed in duplicates.

Rhamnolipid determination The quantitative determination of rhamnolipid 1 and rhamnolipid 3 was carried out by

HPLC analysis according to Schenk et al. [80]. Rhamnolipid 1 standard was

produced by enzymatic hydrolysis of rhamnolipid 3 [23], and purified by column

chromatography. As the stationary phase, fine silica gel was used, and as the mobile

phase chloroform-methanol (75:25) was utilized. The rhamnolipid 3 standard, with a

purity grade of 97.3 % was purchased from Hoechst AG (Frankfurt, Germany).

For the evaluation of the applied single step extraction, an extended extraction

protocol was used. For that purpose, the biomass pellet and the hexane phase were

extracted twice, while the water phase was extracted three times. This evaluation

showed that approximately 82 % of the rhamnolipid were gained in a single ethyl

acetate extraction step.

GC-Fatty acid methyl ester determination For the characterization of the used as substrates, a fatty acid methyl ester (FAME)

gas chromatography analysis was performed by use of the TMSH-esterification

method according to Butte [81].

Page 105: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel III

89

6.3.7 Authors' contributions & Acknowledgements

F.L., C.S. & R.H. coordinated the work in this project, gave intellectual courtesy and

were involved in the writing work. I.S. & F.L. performed the experiments and made

the analysis presented in this publication.

We thank the FNR e.V. (Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V.) for funding,

the industrial project partners Sartorius AG, Ecover Belgium and Henkel AG for

technical support, and our academic partners Dr. Rosenau (University of Düsseldorf),

Prof. Dr. Chmiel and PD Dr. Janke (UPT, Gesellschaft für umweltkompatible

Prozesstechnik mbH i.L., Saarbrücken) and the group of Dr. Behrensmeier

(Forschungszentrum Karlsruhe) for lively discussions.

Page 106: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel III

90

Page 107: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel IV

91

6.4 Kapitel IV

Fast Quantitative Determination of Microbial Rhamnolipids from Cultivation Broths by ATR-FTIR Spectroscopy Frank Leitermann, Christoph Syldatk, Rudolf Hausmann

Chair of Technical Biology, Research University Karlsruhe, 76131 Karlsruhe, Germany

Status: prepared for publication, BMC Journal of Biological Engineering

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Kapitel IV

92

6.4.1 Abstract

Background Vibrational spectroscopic techniques are becoming increasingly important and

popular, because they have the potential of providing rapid and convenient solutions

to routine analytical problems. A variety of substances can be characterized,

identified and also quantified rapidly.

Results A fast ATR-FTIR (Attenuated Total Reflectance Fourier Transform Infrared

Spectroscopy) in time technique has been applied, that is suitable to quantify the

concentrations of microbial rhamnolipids in a typical cultivation process. While the

usually applied HPLC analysis requires an extensive and time consuming multi step

extraction protocol for sample preparation the ATR-FTIR-method allows the

quantification of the rhamnolipids within 20 minutes. Accuracies in between 0.5 g/l –

2.1 g/L for the different analytes were determined by cross validation of the

calibration set. Even better accuracies in between 0.28 g/l – 0.59 g/l were found for

independent test samples of an arbitrarily selected cultivation.

Conclusions ATR-FTIR was found to be suitable for the rapid analysis of rhamnolipids in a

biotechnological process with a good reproducibility in sample determination and a

sufficient accuracy. As the accuracy of the calibration algorithm is dependant on the

number of known samples involved its accuracy will further increase with time.

Page 109: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel IV

93

6.4.2 Background

Biotechnology production processes are an increasingly important manufacturing

route for products, ranging from bulk chemicals like ethanol to high value proteins

[87]. The control of these bioprocesses is still suboptimal. Usually only a few

parameters, like pH, pO2 and temperature, are monitored online. All additional

information required must be gained by analysis of individual samples. Typical

assays, often base upon enzymatic reactions or separation techniques such as high

performance liquid chromatography (HPLC) [88]. Therefore, the analysis results often

will be available only with a significant time delay.

Hence, vibrational spectroscopic techniques that provide rapid and convenient

solutions to routine analytical problems are becoming increasingly adopted. A variety

of substances can be characterized, identified and also quantified rapidly in parallel

from a single sample spectrum [89]. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) is

a reliable and well recognized method [90]. For a complex analyte-matrix

combination, like it occurs in fermentations broths, the adaptation of the FTIR

technique needs extensive experience and time. Nevertheless, once a method has

been established, it allows for relatively fast assays of compounds, where the

alternative quantitative analysis (e.g. HPLC methods) can be time consuming.

Attenuated total reflection infrared Fourier transform spectroscopy (ATR-FTIR) is a

FTIR variety, which allows to determine organic substances in aqueous solutions

[91]. ATR-FTIR involves the collection of radiation reflected from the interfacial

surface between aqueous solution and a reflection element (ATR crystal). In this

crystal evanescent waves penetrate from the crystal to the aqueous solution and are

absorbed by substances in this solution [73, 92]. Concerning the analysis of

biosurfactants several spectroscopic methods for the characterization, identification

and quantification have been reported [31, 93-95].

Biosurfactants are microbial produced surface active compounds [96]. Glycolipid

biosurfactants consisting of rhamnose sugars and aliphatic chains moieties are called

rhamnolipids. Several variations of these rhamnolipids are known [22]. Rhamnolipids

produced by P. aeruginosa strains are often composed of one or two L-rhamnose

and respectively one or two β-hydroxydecanoic acid moieties. They are termed

Page 110: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel IV

94

rhamnolipid 1 (L-rhamnosyl-3-hydroxydecanoyl-3-hydroxydecanoate) and

rhamnolipid 3 (L-rhamnosylrhamnosyl-3-¬hydroxy¬decanoyl-3-hydroxydecanoate)

[23].

The objective of the presented work is to highlight the range of application given by

utilizing an ATR-FTIR method for the monitoring of a biotechnological process for the

production of microbial rhamnolipids. Additional the potential of this method for

achieving structural information and identification purposes concerning rhamnolipids

was investigated.

Page 111: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel IV

95

6.4.3 Results

Characterization and interpretation of the absorbance spectrum of rhamnolipid 3

An ATR-FTIR spectrum of pure rhamnolipid 3 in water was recorded, as shown in

Fig. 6.11. For a better understanding of the IR spectrum, subsequently the dominant

absorbance bands were correlated to the according group absorbance frequencies.

Fig. 6.11 ATR-FTIR spectra of rhamnolipid 3 in water (89 mg/ml). It was tried to allocate conspicuous absorption to corresponding characteristic group absorptions from literature.

The broad negative bands at about 3300 cm-1 and 1640 cm-1 result from a higher

water concentration in the reference spectrum (pure water) relative to the aqueous

sample, and are attributed to hydrogen bonding and O-H stretching of water. The

double bands at 2921 and 2855 cm-1 derive from symmetric C-H stretching vibrations

of aliphatic groups, like represented in the hydroxydecanoic acid chain tails of

rhamnolipid 3. A C=O stretching band at 1730 cm-1 is characteristic for ester bonds

and carboxylic acid groups. In the fingerprint region of the spectrum, the area in

between 1200 – 1460 cm-1 represents C-H and O-H deformation vibrations, typical

for carbohydrates as for example in the rhamnose units of the molecule. The lower

Page 112: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel IV

96

range of the fingerprint region below 1200 cm-1 represents different kinds of C-H, C-O

and CH3 vibrations, that can’t be allocated closer [73].

Basic investigations for the applicability of ATR-FTIR

Rhamnolipids are surface active compounds, and, therefore, absorbance effects at

the interfacial surface of the ATR crystal to liquid phase must be expected. In respect

of the small volume of the sample, 20 µl, even evaporation may affect the

absorbance intensity of the spectra and influence the quantification of the analytes.

Hence, time dependant spectra, of the samples, were recorded for comparison. Fig.

6.12 shows 4 spectra of the same sample, recorded in time intervals of 2 minutes.

Neither intensity changes of single bands nor an overall intensity change of the

absorbance spectrum were observed. Therefore evaporation and interfacial

absorbance effects were not relevant for all practical purposes.

Fig. 6.12 Investigation of adsorption and evaporation effects in the ATR cell in a time range of 8 minutes.

For verification of the reproducibility of the method two samples of the cultivation

broth were prepared and measured twice. The corresponding spectra are shown in

Fig. 6.13. The comparison of the corresponding spectra only showed minimal

diversities, relating to the spectra intensities. For the first sample a correlation above

99.99 %, and for the second sample a correlation of 99.96%, was found.

Page 113: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel IV

97

Fig. 6.13 The figure displays four spectra of two fermentation derived samples, after double application. A comparison of the corresponding two spectra of each sample, showed correlations of above 99.9 %.

Quantification of rhamnolipids by ATR-FTIR

For establishing of multivariate calibration methods, a spectra set of about 80

samples, derived from 9 different rhamnolipid fermentations, was recorded. Using

this spectra set, in a first step, three independent calibrations for rhamnolipid 1 and

rhamnolipid 3, as well as the combined rhamnolipid 1 and 3 content, were set up. All

calibrations were evaluated and optimized by cross validation, according to their

determination coefficients R2, RMSECV and utilized ranks. The results for the

reference versus the predicted values are displayed in Figure 4. By an applied rank

of five, similar determination coefficients R2 from 95.56 to 96.07 were calculated for

all three analytes. For rhamnolipid 1 and rhamnolipid 3 a RMSECV of 0.496 g/L

respectively 1.49 g/L was determined. For the total rhamnolipid 1 and 3 in the

samples an error of 2.06 g/L was found. For the calibration purposes of all three

analytes, a single frequency area from 900 – 1200 cm-1 was selected. As

mathematical pre-treatment for rhamnolipid 1 and rhamnolipid 3 the first derivative

Page 114: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel IV

98

with the subtraction of a straight line and for rhamnolipid total the first derivative,

results in the highest determination coefficients and lowest prediction errors.

In a second step, the evaluation of the prediction error of the established calibration

models versus an independent test samples set, from an arbitrarily selected

fermentation process, were investigated by test set validations. The results are

displayed in Fig. 6.14. At a rank of 5, for rhamnolipid 1 a determination coefficient R2

of 87.88 and a RMSEP of 0.278 g/L were calculated. When considering a rank of 5,

the optimized correlation for rhamnolipid 3 responds with a R2 of 99.43 and a RMSEP

of 0.441 g/L. For the total rhamnolipid content a R2 of 99.31 and a RMSEP of 0.586,

at a rank of 5, were found. Similar to the cross validated models, the best results

were found by restricting of a single frequency area from 900 – 1200 cm-1. Also the

similar mathematical pre-treatments, as described above, were responding the best

results.

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Kapitel IV

99

Fig. 6.14 Quantification of rhamnolipids. Cross validation and test set validation results.

Page 116: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel IV

100

6.4.4 Discussion

The spectrum of pure rhamnolipid 3, as shown in Figure 1, indicates characteristic

absorption bands at 2921 and 2855 cm-1 derived from symmetric C-H and a C=O

stretching band at 1730 cm-1. Gartshore et al. [93] suggested the correlation of a

single peak area when analysing artificial prepared samples of three biosurfactants,

lecitin, cholesterol laurate, and, spiculi sporic acid. The peak utilized in this study was

in between 1720 - 1770 cm-1. Unlike these spectroscopic experiments, the

calibrations derived from the cultivation samples showed the best correlations for the

quantitative determination of rhamnolipids when the fingerprint regions of the spectra

were utilized. This could be explained by the complexity of the analyte-matrix of real

cultivation samples. Besides rhamnolipids, a great variety of additional substances,

like plant oil, fatty acids, buffer salts or ester compounds, were present, which

influence the absorption intensities in the spectrum area of the three characteristic

bands upon 1700 cm-1. Hence, the unapparent information comprised in the

fingerprint area of the spectra, was found to be most suitable for selective,

quantitative determinations of rhamnolipids.

Overall the ATR-FTIR assays, showed a good reproducibility. Even suspected

interfacial or evaporation effects could not be observed, as can be seen from the

consecutive spectra shown in Figures 2 and 3. The differentiation of rhamnolipid 1,

rhamnolipid 3 and the total rhamnolipid was possible.

By cross validation, predictive errors in between 0.496 g/l to 2.06 g/l were determined

which are adequate for a fast in time analysis. Similar or even better results, with

predictive errors from 0.278 g/l to 0.586 g/l, were obtained by test set validation of

independent cultivation samples. Accounting for the highest rhamnolipid 1 value in

Figure 4, resulted from a possible outlier, the derived correlation error seems to be

even lower. Besides, it has been shown that reliable correlations could be found,

despite different fermentation conditions with respect to the substrates. An

improvement of the accuracy and stability of the correlations, by expansion of the

calibrations data sets with samples from additional cultivations, is expected. Besides

that, the major advantage of an ATR-FTIR compared to a HPLC quantification of

rhamnolipids, is the time needed. Whereas HPLC data is available after

Page 117: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel IV

101

approximately 24 h, caused by multiple extractions, evaporation and derivatisation

steps, ATR-FTIR provide process values within 20 minutes.

6.4.5 Conclusions

ATR-FTIR was found to be very appropriated for the rapid analysis of rhamnolipids in

a biotechnological process with a sufficient accuracy and a good reproducibility.

Further improvements of the quantification accuracy can be expected by expansion

of the calibration data set with samples from additional cultivations. By opening a

“spectroscopic eye” into bioprocesses for the production of microbial rhamnolipids, in

time ATR-FTIR monitoring makes rapid process characterization and process control

much easier. Future objectives for the modifications of the utilized ATR-FTIR

technique towards an online in situ measurement system, seem to be very promising.

6.4.6 Materials & Methods

Microorganism Pseudomonas aeruginosa DSM 7108 was obtained from the German Collection of

Microorganisms and Cell Cultures. The strain is stored as glycerol stock culture at

-80 °C.

Media For seed cultures a LB medium containing 5 g/l NaCl was used [97]. For the

bioreactor cultivations a Ca-free mineral salt medium was used. The medium is

based upon a 0.1 M sodium phosphate buffer pH 6.5 supplemented with 0.5 g/l

MgSO4 x 7 H2O, 1 g/l KCl and 15 g/l NaNO3 (modified, according to [51]). The

phosphate buffer was separately autoclaved from the other salts. A sterile filtered

trace elements solution consisted of 2 g/l sodium citrate x 2 H2O, 0.28 g/l FeCl3 x 6

H2O, 1.4 g/l ZnSO4 x 7 H2O, 1.2 g/l CoCL2 x 6H2O, 1.2 g/l CuSO4 x 5 H2O and 0.8 g/l

MnSO4 x H2O was added to the media as described below. All chemicals were of

analytical grade. As C-source three types of sunflower oils (HOS 90+, HOS 80+,

conventional sunflower oil), linseed oil, rapeseed oil, corn oil soy bean oil (all by

courtesy of Dr. B Schlüter, Unternehmensberatung und Dienstleistung im vor- und

nachgelagerten Bereich der Landwirtschaft, Bornheim, Germany) and fish oil (by

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Kapitel IV

102

courtesy of Dr. Krumbholz, KD-Pharma Bexbach GmbH, Bexbach, Germany) of

technical/food grade were used.

Cultivation conditions

For the inoculums of the bioreactor cultures, 25 ml LB medium was inoculated with

100 µl of a glycerol stock culture in a 100 ml shaking flask. This culture was

incubated for 12 h at 30 °C and 140 rpm in an incubation shaker (HT Infors Multitron

II), until an optical density at 580 nm (OD580) of 2.5 – 3.0 was reached (Amersham

Biosciences Ultrospec 1100pro). With 2 ml of this seed culture the main cultures

were inoculated. The cultivations were performed in a 500 ml parallel bioreactor

system (Sixfors, IFORS GmbH Einsbach, Germany) with 214 ml (200 ml media + 14

ml plant oil) initial volume. The temperature was controlled and maintained at 30°C.

During the process, the pH was controlled and maintained at 6.5. Additional 14 ml

substrate was added after approximately 40 h of process time. One ml per liter of the

trace element solution was added at distinct process times (t = 0; 20; 40; 70; 120 h).

The reactors were equipped with additional 4 blade Rushton stirrers with a blade

geometry of 1:1 for mechanical foam destruction. For chemical defoaming

Contraspum™ A4050 (Zschimmer&Schwarz GmbH & Co KG Chemische Fabriken,

Lahnstein, Germany) was used. The processes were controlled and recorded by a

personal computer system with the process software Iris (INFORS GmbH Einsbach,

Germany).

Sampling protocol The quantifications of bio dry weight, oil and rhamnolipid contents, were performed

conform the extraction protocol shown in Fig. 6.15.

Page 119: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel IV

103

Fig. 6.15 Proceeding for the sample extraction from culture broths.

For oil and cell separation, 5 ml of cultivation broth was mixed with 5 ml of hexane

and centrifuged at 7500 g at 15 °C for 15 minutes. 200 µl of the lower phase was

used for the ATR – FTIR analysis, as described below. For HPLC reference analysis,

3 ml of the lower phase were transferred and acidified with 85% H3PO4 to pH = 2 - 3.

4 ml of ethyl acetate were added for the extraction of the rhamnolipids. After mixing,

the suspension was centrifuged at 7500 g at 4°C for 15 minutes. 2x 1.5 ml of the

upper phase were transferred in 2 ml cups and the ethyl acetate was evaporated at

60°C in a thermo mixer for 24 h and processed as described in the HPLC section.

ATR FTIR spectroscopy Attenuated Total Reflectance (ATR) Fourier transform infrared spectra were collected

with a bench-top spectrometer (Tensor 27, Bruker Optics GmbH, Ettlingen,

Germany), equipped with a liquid nitrogen cooled, linear LN-MCT-Photovoltaic

detector (Kolmar Technologies, Inc., Newburyport, USA) and a BioATR II cell

Page 120: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel IV

104

(Harrick Scientific Products, Inc., Pleasantville, USA). The Bio-ATR II cell was purged

by a continuous flow of dried air to minimize water vapour in the IR-beam path. The

ATR cell was temperature stabilized at 25 °C by a refrigerated circulator bath

(HAAKE DC30-K20, Thermo Haake GmbH, Karlsruhe, Germany) to avoid water

signals in the IR-sample spectrum resulting from temperature shifts between

reference and sample measurement. Before the measurement the crystal of the ATR

cell was washed several times with 20 µl H20. Cleanliness of the ATR-crystal was

controlled by the measurement of a baseline of the water covered crystal before and

after washing.

As reference spectrum water was measured. Then the cell was washed twice with 20

µl sample and the actual sample measurement was performed. Both for reference

and sample measurement 64 interferograms were averaged resulting in an overall

scanning time of about 1 minute. Spectra were recorded in a range from 850 – 4000

cm-1 at a resolution of 4 cm-1 and with an aperture of 6 mm. Data storage, spectra

processing, substance comparison and the quantitative analysis of the spectra were

done with the software OPUS 5.5 (Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Germany).

Data analysis The recorded FT-IR spectra together with the results from HPLC reference analysis

were analyzed using partial least-squares (PLS) regression. PLS calibration

development, including cross- and test-set validation were performed with the

QUANT 2 module of the OPUS 5.5 software, according to the multivariate calibration

techniques described by Conzen [71]. Multiple mathematical pre-treatments were

iteratively applied and for evaluation of the fits of the correlations to the reference

HPLC data, the determination coefficients R2 were calculated. Additionally, the

predictive abilities of the correlation methods were proofed by calculation of two

types of prediction errors. For validation within the whole calibration set, cross

validations, with one leave out sample, were applied, and the root mean square

errors of cross validation (RMSECV) were determined.

The evaluation of the predictive quality of an established calibration model applied on

an independent test samples set from an arbitrarily selected fermentation process

was done by test set validations and calculation of the root mean square error of

prediction (RMSEP). All errors were calculated for different numbers of PLS factors.

Page 121: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel IV

105

During the establishing of the calibration models, spectra were checked for outliners

by visual inspection of principal component score plots. The final correlations were

selected accordant the lowest prediction errors and used PLS ranks versus highest

R2 values, to obtain confidential and stable calibration models.

Reference rhamnolipid determination by HPLC The ATR-FTIR analysis was calibrated and validated using HPLC as reference

method. A rhamnolipid 1 standard was produced for the calibration of the HPLC

device by enzymatic hydrolysis of rhamnolipid 3 [23] and purified by chromatography.

As the stationary phase fine silica gel was used and as the mobile phase a

chloroform-methanol 75:25 was utilized. The rhamnolipid 3 standard with a purity

grade of 97.3 % was purchased from Hoechst AG (Frankfurt, Germany).

For UV-detection, the rhamnolipids were derivatized into esters of

bromophenacylbromide. This was done by the use of a 1:1 (v/v) derivatisation

solution of 40 mM 4-bromophenacyle bromide and 20 mM triethylammonia in

acetonitrile [80]. The rhamnolipid content of the samples was analyzed after

redissolving the pellet in 1.5 ml of acetonitrile. A rhamnolipid content of approximately

0.1 - 1 mM was achieved by appropriate dilution. 1 ml of this solution was mixed with

200 µl of the derivatization agent. The derivatisation reaction took place at 60 °C for

90 min. Subsequently the rhamnolipids were separated in a reverse phase C18

column (Supelcosil LC-18, Supelco/Sigma-Aldriche cooperation Bellefonte,

Pennsylvania, USA) on an HPLC device (Agilent 1100 series, Agilent Technologies

GmbH, Germany) with a linear gradient of acetonitrile-water, and finally detected by a

UV-detector at 265 nm. Solvent A consisted of 95:5 H2O/acetonitrile (v/v), solvent B

was composed by 95:5 acetonitrile/H2O (v/v).

6.4.7 Authors´ contributions & Acknowledgement

F.L., C.S. & R.H. coordinated the work in this project, gave intellectual courtesy and

were involved in the writing work. F.L. performed the experiments and made the

analysis presented in this publication.

We thank the FNR e.V. (Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V.) for funding,

the industrial project partners Bruker Optics GmbH, Sartorius AG, Ecover Belgium

and Henkel AG for technical support, and our academic partners Dr. Rosenau

Page 122: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel IV

106

(University of Düsseldorf), Prof. Dr. Chmiel and PD Dr. Janke (UPT, Gesellschaft für

umweltkompatible Prozesstechnik mbH i.L., Saarbrücken) and the group of Dr.

Behrensmeier (Forschungszentrum Karlsruhe) for lively discussions.

Page 123: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel V

107

6.5 Kapitel V

Biotenside und deren Herstellung. Frank Leitermann, Christoph Syldatk, Rudolf Hausmann

Lehrstuhl für Technische Biologie, Universität Karlsruhe (TH)

Mitverfasser: Patentanwalt Claus Peter Pietruk

Status: Eingereicht, Deutsches Patent- und Markenamt

Page 124: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel V

108

6.5.1 Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft das oberbegrifflich Beanspruchte und befasst sich

somit mit der Herstellung von Biotensiden.

Als Tenside werden typisch jene Verbindungen bezeichnet, die einerseits einen

hydrophilen und andererseits einen hydrophoben Teil enthalten. Dies macht sie in

einer Vielzahl von Anwendungen sehr nützlich; die allgemein bekannteste

Anwendung für Tenside dürften Waschmittel sein, bei denen mit Wasser aus

Kleidungsstücken und dergleichen fetthaltige Substanzen ausgewaschen werden

sollen. Dabei treten typisch Grenzflächen zwischen Wasser- und Öl- bzw. Fettphase

auf, an denen die Tenside wirken. Es sei darauf hingewiesen, dass es eine Vielzahl

weiterer, z. B. kosmetischer, pharmazeutischer, aber auch generell technischer

Anwendungen für Tenside gibt, die neben den Waschmitteln grot3e Bedeutung

haben, zum Beispiel das Entfetten von Bauteilen.

Wichtige Biotenside sind die Rhamnolipide. Diese können in geeignet aufgereinigter

Form auch bei der Behandlung von Hautkrankheiten wie Verbrennungen, Psoriasis,

Ekzemen oder atopischer Dermatitis eingesetzt werden; die Aufbereitung umfasst im

Regelfall die teuere Entfernung von bei der Biotensidproduktion typisch zugesetzten

chemischen Schaumzerstörern wie beispielsweise Silikonölen.

Daneben ist es möglich, Rhamnolipide auch weiterzuverarbeiten, wie etwa zur

Produktion von Rhamnose, einer 6-Deoxyhexose, die synthetisch noch nicht

Ökonomisch herstellbar ist, sondern extrahiert oder auf andere Weise biologisch

hergestellt werden muss, um die Rhamnose als wichtigen synthetischen Baustein

der Feinchemie herzustellen.

Hinsichtlich der Bezeichnung der Rhamnolipide R1 bis R4 wird nicht nur auf Lang

und Trowitzsch-Kienast verwiesen, sondern auch auf die EP 0 575 908. Dass

daneben noch weitere, typisch in geringerem Umfang produzierte und/oder auf

anderen Wegen und daher seltener erhaltene Derivate existieren, sei erwähnt.

Page 125: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel V

109

Es ist bekannt, Tenside auf biologischem Wege herzustellen, indem

tensidproduzierenden Mikroorganismen Umgebungsbedingungen angeboten

werden, unter welchen die Mikroorganismen besonders effizient Tenside

produzieren. Die Biotensidproduktion hat den Vorteil, dass die Produktion unter

Verwendung nachwachsender Rohstoffe als Mikroorganismen-Nährstoffe

durchgeführt werden kann.

Prinzipiell ist es so, dass eine Vielzahl von Tensiden bereits biologisch herstellbar ist,

vergleiche insbesondere das Buch „BIOTENSIDE“ von S. Lang und W. Trowitzsch-

Kienast, 1. Auflage 2002, Teubner-Verlag; auf die dortigen Literaturzitate

insbesondere zu Übersichtszwecken wird explizit hingewiesen. Eine wichtige Gruppe

von Biotensiden sind Rhamnolipide.

Aus der US-PS 5,658,793 ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Rhamnose

bekannt. L-Rhamnose kann durch Hydrolyse des Biotensids Rhamnolipid hergestellt

werden. Das bekannte Verfahren verwendet Bakterien des Typus Pseudomonas

aeruginosa. Es wird dort angegeben, dass mit Pseudomonas aeruginosa DSM7107

und Pseudomonas aeruginosa DSM7108 Rhamnolipide in einer Konzentration von

70 - 120 g/l Kulturlösung erzeugbar sind. Auf die prioritätsgleiche EP 0 575 908 B1

wird hingewiesen.

Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Rhamnose ist bekannt aus dem US-

Patent 4,933,281. Dort wird die Verwendung von Kulturmedien, die Pflanzenöle

enthalten, beschrieben. Es wird angegeben, wie sich die Rhamnoseproduktion im

Laufe eines

Ansatzes verhält.

Hingewiesen sei auch auf den Aufsatz „RHAMNOSE AND RAHMOLIPIDE

BIOSYNTHESIS BY PSEUDOMONAS AERUGINOSA" von G. Hauser und M.

Karnovsky, The Journal of Biological Chemistry 1957, und auf die DE 196 54 942 B4,

betreffend „Rhamnolipid-Alginatpolymer-Komplexe“ deren mikrobielle Herstellung mit

dafür geeignete Mikroorganismen und ihre Anwendung". Dort wird auf ein

Pseudomonas aeruginosa-Bakterium mit der Hinterlegungsnummer

Page 126: Diss Leitermann 26 8format

Kapitel V

110

DSM 10554 verwiesen. Die Kultivierung des Bakteriums soll in Schrägagar-Röhrchen

oder auf Agar-Platten in einer Nährbouillon angegebener Zusammensetzung

erfolgen. Als Kohlenstoffquelle sollen eine oder mehrere pflanzliche Öle, bevorzugt

Rapsöl, verwendet werden oder Abfälle aus der Margarine-Produktion.

Verwiesen sei auch auf den Aufsatz von W. Sabra et al. in „Microbiology", Band 148,

Nr. 10, Seiten 3195-3202 vom Oktober 2002, betreffend „PHYSIOLOGICAL

RESPONSES OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA PA01 T0 OXIDATIVE STRESS

IN CONTROLLED MICRORAEROBIC AND AEROBIC CULTURES".

Außerdem wird verwiesen auf den Aufsatz „PRODUCTION OF

MICROBIALBIOSURFACTANTS FROM SOY MOLASSES“ von D. Solaiman et al.,

veröffentlicht am 21. August 2005 in „Society of Industrial Microbiology Annual

Meeting", Seite 75.

Auch der Aufsatz „RHAMNOLIPID SURFACTANT PRODUCTION AFFECTS

BIOFILM ARCHTITECTURE IN PSEUDOMONAS AERUGINOSA PAOI“ von M.E.

Davey et al., J. Bacteriol, Februar 2003, 185 (3): 1027-1036 sei zitiert.

Aus der US-PS 4,628,030 ist ein „PROCESS FOR THE PRODUCTION OF

RHAMNOLIPIDS" bekannt, bei dem Pseudomonas in einem wässrigen Medium

kultiviert wird. Es soll eine zumindest zweifache Begrenzung von essentiellen

Wachstumssubstanzen erfolgen.

Die US-PS 5,077,206 betrifft ein weiteres Verfahren zur Herstellung L-Rhamnose.

Ein Verfahren zur biotechnischen Produktion von Rhamnolipiden, die die

Pseudomonas-Spezies DSM2874 einsetzt, ist aus der US 4,814,272 bekannt.

Es ist prinzipiell wünschenswert, biologische Substanzen mit hoher Ausbeute in

hoher Reinheit bei geringem Aufwand mit preiswerten Medien und Nährsubstraten

produzieren zu können. Die vorstehend zitierten Dokumente zeigen, dass bei der

Produktion von Biotensiden, insbesondere von Rhamnolipiden als besonderen

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Kapitel V

111

Biotensiden, noch Verbesserungen möglich sind. Wünschenswert wäre hier,

zumindest partiell an wenigstens einem Aspekt Verbesserungen zu gewährleisten.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Neues für die gewerbliche

Anwendung bereitzustellen.

Die Lösung dieser Aufgabe wird in unabhängiger Form beansprucht. Bevorzugte

Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen angegeben.

.

Die vorliegende Erfindung schlägt somit in einem ersten Grundgedanken ein

Verfahren zur Biotensidherstellung vor, wobei biotensiderzeugende Mikroorganismen

in einem Nährsubstrat bewegt werden, bei welchem vorgesehen ist, dass das

Nährsubstrat im Überschuss verwendet und eine mechanische Schaumzerstörung

durchgeführt wird.

Es wurde überraschenderweise gefunden, dass ein Nährsubstrat-Überschuss bei

Biotensiden die Produktion ohne Zusatz signifikanter Mengen an Entschäumer oder

Schaumzerstörungsmittel erlaubt, indem einfach eine mechanische

Schaumzerstörung ermöglicht wird, ohne eine hohe Produktion zu gefährden.

Das Biotensidherstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist besonders

geeignet zur Herstellung von Rhamnolipiden. Es werden bevorzugt zumindest die

Rhamnolipide R1 und/oder R3 hergestellt; bezüglich der Nomenklatur für die

Rhamnolipide wird explizit auf den Aufsatz Trummler, K, Effenberger, F, Syldatk, C,:

„An integrated microbial/enzymatic process for production of rhamnolipids and L-(+)-

rhamnose from rapeseed oil with Pseudomonas sp. DSM 28742" in European

Journal of Lipid Science and Technology 105(10):563-571, 2003 hingewiesen.

Es ist möglich, Rhamnolipide mit einem Verhältnis von R1 zu R3 < 0,5, bevorzugt um

oder unter 0,3 herzustellen. Dies kann vorteilhaft sein, wenn es gewünscht ist, das im

Übermaß produzierte Rhamnolipid in besonders hoher Konzentration zu gewinnen.

Ein Rhamnolipid-Rohprodukt mit einem Verhältnis von R1 / R3 < 0,5 kann zum

Beispiel unter anderem erzeugt werden mit dem Mikroorganismenstamm DSM 7108

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Kapitel V

112

und in der ersten Stufe einem Medium enthaltend 0,1 M NaP04-Puffer, 15 g/l NaN03,

1 g/l KCl und 0,5 g/l MgS04 x 7H20 im Ansatz 1:1, verwendet bei 250 g/l Pflanzenöl

und mit einem Medium mit 0,1 M NaP04-Puffer, 1,5 g/l NaN03; 0,1 g/l KC1 und 0,05

g/l MgS04 x 7H20 in einer Verdünnung 1:10 in der zweiten Stufe; diese Bedingungen

führen zur bevorzugten Produktion des Rhamnolipides 3. Spurenelemente werden

dabei jeweils 0, 20, 40, 70 und 120 Stunden nach Ansatz zugegeben.

Ein Verhältnis von R1 zu R3 < 1,5 kam zum Beispiel unter Verwendung von

Pflanzenölen als Nährsubstrat und dem Stamm DSM 2874 erreicht werden. Der

Mikroorganismenstamm DSM 2874 kann dabei mit einem Medium aus 0,05 M

NaP04-Puffer, 7,5 g/l NaN03, 0,5 g/l KC1 sowie 0,25 g/l MgS04 x 7H20 verwendet

werden, das als Medium/Halbe verwendet wird. Eine Spurenelement Zugabe erfolgt

hier in den ersten 70 Stunden bedarfsorientiert. Die bisherigen Untersuchungen der

Anmeldung weisen darauf hin, daß das Spektrum der gebildeten Produkte weniger

stark durch die Wahl des Pflanzenöls oder anderen Nährsubstrates beeinflusst zu

sein scheint und stärker durch den geeigneten Mikroorganismenstamm. Die

Selektion des gewünschten Rhamnolipides kann demgemäß durch Auswahl des

geeigneten Mikrobenstammes erfolgen. Es wird einzuschätzen sein, daß andere

Mikrobenstämme zu unterschiedlichen Produktionen verschiedener Biotenside

führen werden. Die Medien sind jeweils auf die Anforderungen der Mikrobenstämme

in per se bekannter Weise anzupassen. Die Produktion in diesem Verhältnis kann

dann vorteilhaft sein, weil eine Aufreinigung signifikant einfacher ausfällt. Die

Vereinfachung der Aufreinigung ist dabei ohnehin schon deshalb gegeben, weil eine

mechanische, typisch eine rein mechanische Schaumzerstörung ermöglicht wird. Die

Rhamnolipidproduktion erfolgt in einem besonderen Verhältnis der produzierten

Rhamnolipide zueinander, weil die Verfahrensführung dies ermöglicht.

Als Mikroorganismen können, insbesondere wenn Rhamnolipide produziert werden,

Pseudomonas-Stämme eingesetzt werden. Die Einsetzbarkeit der Stämme

DSM7108, DSM7108 oder DSM2874 sei explizit erwähnt.

Das Nährsubstrat, das heißt die Kohlenstoffquelle für die Mikroorganismen, wird

typisch und bevorzugt ein öliges Nährsubstrat sein. Dies kann möglicherweise zwei

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Kapitel V

113

Ursachen besitzen, die alleine oder gemeinsam wirken können; das Vorhandensein

weiterer oder anderer Ursachen sei durch die nachfolgende Erklärungsvorschläge

aber nicht ausgeschlossen. Es wird zum Einen davon ausgegangen, dass gerade in

diesem (öligen)Nährsubstrat die Verwendung eines im Überschuss vorhandenen

Nährsubstrates die Zerstörung von Mikroorganismen durch die mechanische

Bewegung derselben in und mit dem Nährsubstrat bei der Schaumzerstörung

verhindert. Mit anderen Worten wird dadurch, dass ein Überschuss und damit ein

größeres Volumen an Nährsubstrat vorhanden ist, die zerstörerische Reibung der

Mikroorganismen aneinander in den Scherfeldern, wie sie bei mechanischer

Schaumzerstörung auftreten, vermutlich genauso verringert wie durch

Kavitationseinwirkung. Dies scheint erst recht in öligen Nährsubstraten zu gelten.

Wiewohl diese Erklärung keinesfalls als wissenschaftlich abgesichert betrachtet

werden kann, spricht Vieles dafür, dass sie zutreffend ist. Insbesondere bei den

typisch höher viskosen Nährsubstraten ist die Zerstörung der Mikroorganismen durch

mechanische Schaumzerstörung vermutlich von allenfalls marginaler Bedeutung und

typisch wohl vollkommen zu vernachlässigen. Als öliges Nährsubstrat können

Pflanzenöle in Reinform oder als Gemisch eingesetzt werden, erwähnt sei

diesbezüglich insbesondere Sonnenblumenöl, Sojaöl, Maisöl, Olivenöl und/oder

Weizenkeimöl und/oder Gemische davon. Der Umstand, dass das Verfahren nicht

sonderlich spezifisch für das Nährsubstrat insbesondere hinsichtlich der Wahl eines

Pflanzenöls ist, hat dahingehend Vorteile, dass einerseits jeweils sehr günstige Öle

eingesetzt werden können, dass aber zugleich auch nichtreine Gemische, Reststoffe

aus der Produktion usw. einsetzbar werden. Ein weiterer Grund für den positiven

Einfluss eines Substratüberschusses kann darin gesehen werden, dag womöglich

gerade in einer großen Ölmenge ein Teil der gebildeten Biotenside, insbesondere

Rhamnolipide, abgefangen wird, d.h. dass es zu einer Pseudo-Insitu-

Produktentfernung kommt und die Biotenside gegebenenfalls gebunden werden,

wodurch die Konzentration an Rhamnolipiden in freier Lösung, die von

Pseudomonas wahrgenommen wird, reduziert wird, was eine weitere Produktion

stimulieren kann.

Es scheint besonders bevorzugt, dass der Überschuss an Nährsubstrat ein

Überschuss an öligem Nährsubstrat ist. Es wird davon ausgegangen, dass die

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Kapitel V

114

höhere Viskosität öliger Substanzen Scherkräfte auf die Mikroorganismen insgesamt

verringert.

In einer bevorzugten Variante wird ein derart großer Überschuss an öligem

Nährsubstrat verwendet, dass zumindest 30

g/l öliges Nährsubstrat vorhanden sind.

Die mechanische Schaumzerstörung wird bevorzugt so eingestellt, dass sich ein

Gasvolumenanteil über 20 % ergibt. Es wird also ein gewisses Gasrestvolumen in

der Produktionsmasse belassen. Diese kann auch über 33 % betragen, bevorzugt

liegt der Gasvolumenanteil um oder über 50 %.

Es wird bevorzugt, wenn die Nährsubstanz-Mikroorganismen-Schaummasse in der

Produktionsphase fließfähig ist. Typisch können Viskositäten und/oder

Schaumblasengrößen etwa von geschlagener Sahne oder dem Schaum von

ordnungsgemäß gezapften Guiness Bier eingestellt werden. Die Mediumviskositäten

liegen bei 2 bis 8 cST, die Blasengrößen lassen sich auf 1 bis 2 mm Durchmesser

abschätzen. Es ist ausreichend, eine Biotrockenmasse um oder unter 10 g/l in dem

Nährmittel-Mikroorganismus-Volumen zu halten, entsprechend einer Biofeuchtmasse

von etwa 25 um 48 g/l. In der ersten Prozessstufe werden mit DSM 7108

Biotrockenmassen von Ca. 15 g/l entsprechend einer Biofeuchtmasse und 72 g/l

erreicht und mit DSM 2874 Ca. 10 g/l Biotrockenmasse, jeweils auf geeigneten

Medien.

Die Nährsalzkonzentration und/oder die Pufferkonzentration wird in einer

bevorzugten Variante gering gehalten, und zwar typisch so weit reduziert, dass keine

oder eine allenfalls geringe Schleimbildung auftritt. Schleimbildung ist für die

Biotensidbildung kontraproduktiv, da die Zellen an Stelle von und/oder zusätzlich zu

Biotensiden andere Substanzen, die zur Schleimbildung führen, typisch

Polysaccharide, produzieren müssen. Durch Reduktion der Puffer- und/oder

Nährsalzkonzentration kann dies unterbunden werden. Es ist einsichtig, dass die

tatsächlichen Konzentrationen von Puffer- und/oder Nährsalzmedium abhängig von

der Nährsubstanz und/oder den Biotensiden und/oder den Mikroorganismen sein

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Kapitel V

115

wird; der Fachmann wird aber typisch auf einfache Weise feststellen können, wann

die Nährsalz- beziehungsweise Pufferkonzentration so weit verringert ist, dass keine

oder nur noch eine nicht störende Schleimbildung auftritt.

Typisch wird ein Ansatz gewählt mit einer auf Medium-Halbe reduzierten Puffer-

und/oder Nährsalzkonzentration.

Die mechanische Schaumzerstörung kann unter Verwendung üblicher mechanischer

Schaumzerstörer geschehen, die eine schaumzerstörende Platte umfassen werden.

Es sei betont, dass diese Scherkräfte in der Flüssigkeit erzeugen, dies aber wider

Erwarten insbesondere die Rhamnolipidproduktion bei der Biotensidherstellung nicht

beeinträchtigt.

In einer besonders bevorzugten Variante werden die in einem Ansatz verwendeten

Mikroorganismen recycliert. Durch den zumindest weitgehenden, typisch

vollständigen Verzicht auf chemische Schaumzerstörungsmittel ist dies möglich,

ohne dass in nachfolgenden Produktionszyklen die Rhamnolipid- beziehungsweise

allgemeiner die Biotensidproduktion durch Entschäumermittelreste gestört wäre.

Bei der Recyclierung werden die Zellen abgeerntet, das heißt von den produzierten

Biotensiden, in einer bevorzugten Variante von den produzierten Rhamnolipiden,

getrennt und regeneriert. Die Abtrennung der Zellen kann durch Zentrifugieren

erfolgen. Es sei darauf hingewiesen, dass die Recyclierung deshalb besonders

bevorzugt ist, weil einerseits in erheblichem Maße Kosten für die Entsorgung der

Zellen nach einem Produktionsdurchlauf gespart werden und zum anderen Kosten

der Neuanzucht; zugleich ist eine Verunreinigung durch fremde Mikroorganismen im

Regelfall kaum zu befürchten, da die Produktionsbedingungen so gesteuert werden

können, dass kaum fremde Bakterien und dergleichen wachsen können. Die

Regenerationsphase für die Zellen erfolgt typisch in einem um Makroelemente

reduzierten Mineralsalzmedium. Bevorzugt ist die Reduktion um mindestens einen

Faktor 10, besonders bevorzugt einen Faktor 20. Die regenerierten Zellen werden

dann typisch einer weiteren Rhamnolipidproduktionsphase zugeführt.

Schutz wird auch für ein nicht aufgereinigtes Rohprodukt mit einem besonders

geringen Anteil von RL1 bezogen auf RL3 beansprucht.

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Kapitel V

116

Dieses Rhamnolipid-Rohprodukt ist bevorzugt frei von chemischen

Antischaummitteln.

Es ist bevorzugt, wenn das Mineralsalzmedium eine Maximalkonzentration von 0,5

bis 1 M Phosphatpuffer bei einem PH-Wert zwischen 6,3 und 6,8 aufweist; höhere

Salzkonzentrationen führen, womöglich auf Grund von osmotischem Stress, zu

verstärkter Polysaccharid, was im Hinblick auf die schlechtere Biotensidausbeute

nicht gewünscht ist.

Es sei erwähnt, dass die abgeernteten Zellen bevorzugt im Minimalsalzmedium

resuspendiert werden. Es gelingt mit der Erfindung, obwohl die mikrobielle Biotensid-

, insbesondere Rhamnolipidproduktion einen aeroben Fermentationsprozess

darstellt, bei dem ein Sauerstoffeintrag durch Begasung notwendig ist, während das

gewünschte Produkt, nämlich die Rhamnoselipide, starke grenzflächenaktive

Eigenschaften aufweisen, die dadurch bedingte typisch exzessive Schaumbildung

des Prozesses signifikant besser als bislang bekannt zu kontrollieren und zugleich

die Produktion signifikant zu erhöhen beziehungsweise hochzuhalten. Die

Produktionen liegen typisch über den wissenschaftlich maximal abgesicherten 47 g/l

Rhamnoselipid; darauf, dass die US 5,658,793 noch höhere Konzentrationen

behauptet, sei hingewiesen, obgleich die dort angegebenen Konzentrationen nicht

wissenschaftlich fremdverifiziert wurden.

Die Aufbereitung nach der erfindungsgemäßen Produktion ist vereinfacht, da keine

oder nur wenige schwer abtrennbare Substanzen zugegeben werden müssen, die

eine Vielzahl Extraktionsschritte, wie Kristallisation oder chromatographische Schritte

erforderlich machen. Daß Antischaummittel nicht oder nur in geringen Mengen

eingesetzt werden, erleichtert die Aufarbeitung, die je nach gewünschtem

Reinheitsgrad eine Extraktion, eine Fällung, eine Chromotagraphie und Kristallisation

erfordert, wobei diese Schritte sich aber leichter und besser durchführen lassen,

wenn Antischaummittel, die ebenfalls oberflachenaktive Eigenschaften aufweisen,

abwesend sind; dies gilt beispielsweise bei Fällung beziehungsweise Kristallisation.

Zudem führen bestimmte Antischaummittel zu einer drastisch reduzierten

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Kapitel V

117

Rhamnolipidbildung, ohne direkt ein Absterben der Kulturen zu bewirken. Es wird

davon ausgegangen, daß dies bedingt sein könnte dadurch, daß ein

Antischaummittel zumindest partiell die Rhamnolipidfunktion übernimmt, d.h. die

Emulgierung eines hydrophoben Substrates und somit die Notwendigkeit für die

Mikroorganismen, insbesondere für Pseudomonas, reduziert wird Biotenside,

insbesondere Rhamnolipide zu bilden, um an das Substrat zu gelangen. Zudem sind

typisch erhältliche Antischaummittel ohnehin nur bedingt einsetzbar.

Die Verwendung einer mechanischen Schaumzerstörung macht es möglich, eine

Schaumbildung nicht nur zuzulassen, sondern auch zu kontrollieren, was zu einer

stark vergrößerten Austauschfläche zwischen Gas und Flüssigkeit fuhrt und somit

sehr kleine Begasungsraten ermöglicht. Die Verwendung eines feinblasigen

fließfähigen Schaumes ist besonders bevorzugt.

Die mechanische Schaumzerstörung kann bei sehr hohen Drehzahlen erfolgen. In

einem 5 l Kleinfermenter wurde mit einer Drehzahl von 650 bis 850 Umdrehungen

pro Minute gearbeitet und einer mechanischen Schaumzerstörung durch eine

Foamdics, d.h. einer Schaumscheibe. Hier sollte eine Mindestdrehzahl von 650

Umdrehungen pro Minute gegeben sein. Es hat sich gezeigt, daß für andere

Fermenter andere, auch höhere Drehzahlen nötig und vorteilhaft sind; es ist

beispielsweise abzusehen, daß zum Beispiel ein Produktionsfermenter mit einer

Schaumzentrifuge, nämlich einer Fundafoam-Schaumzentrifuge verwendet werden

kann, wobei die Drehzahl hier 800 Umdrehungen pro Minute vermutlich betragen

wird.

In einer besonders bevorzugten Variante wird die Zudosierung von Spurenelementen

bedarfsorientiert vorgenommen. Es wird typisch ein Bedarf in dieser Phase anhand

eines Abfallens der Sauerstoffaufnahmerate/Kohlendioxidbildungsrate sowie einer

Bestimmung des Anstiegs des Gelöstsauerstoffs ermittelt. Dies kann kontinuierlich

oder zu bestimmten Prozesszeiten erfolgen, wobei insbesondere in der eigentlichen

Produktionsphase eine Kontrolle zu vorgegebenen Prozesszeiten, beispielsweise

alle 50 bis 60 Stunden, erfolgen kann; hier sei insofern darauf hingewiesen, dass der

Prozess so geführt werden kann, dass nach einer gegebenenfalls erforderlichen

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Kapitel V

118

anfänglichen Adaptionsphase (Lag-Phase) eine exponentielle Wachstumsphase

auftritt und danach die eigentliche Produktionsphase, die beiden ersten Phasen, das

heißt die Adaptionsphase und die exponentielle Phase werden typisch eine Zeit von

40 bis 60 Stunden nach Ansatz benötigen, während die Ernte nach etwa 270

Stunden erfolgen kann. Diese Zeiten werden bei der Verwendung der bevorzugten

Mikoororganismus-Recyclierung gegebenenfalls verkürzt sein. Ein geeignetes

Antischaummittel, das, sofern nötig, zugegeben werden kann, ist Contraspum A4050

der Firma Zschimmer & Schwarz GmbH.

Die Erfindung wird im Folgenden nur beispielsweise anhand der Figuren

beschrieben. In dieser ist dargestellt durch

Abb. 6.1 Zweistufiger Prozess zur biotechnologischen Produktion von Rhamnolipiden

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Kapitel V

119

Rhamnolipid Sixfors 1

0,005,00

10,0015,0020,0025,0030,0035,0040,00

0 50 100 150 200 250

Prozesszeit[h]

R[g/

L]RL3 RL1 RL_total

Sixfors 1: R1/R3

0,0

0,5

1,0

1,5

0 50 100 150 200

Prozesszeit[h]

RL1/

RL3

Abb. 6.2 der zeitliche Verlauf der Produktion der Rhamnolipide R1 und R3 mit ruhenden Zellen in frischem Mineralsalzmedium bei Resuspension eingefrorener Zellen zum Zeitpunkt T = 0

2 step Process RL ratio

Process time in h

0 100 200 300 400 500

RL1

/RL3

ratio

0,0

0,5

1,0

1,5Process 11Sixfors 1Sixfors 2

First process Resting Cell process

Abb. 6.3 Verlauf des Verhältnisses von R1 zu R3 in einem zweistufigen Verfahren jeweils für die erste Stufe und für die nachfolgende Stufe mit ruhenden Zellen;

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Kapitel V

120

Abb. 6.4 Wachstumsphasen von Zellkulturen in einem Zelldichte-Zeitdiagramm.

Nach Abb. 6.1 wird in einem mehrstufigen Prozess Biotensid mit Mikroorganismen

hergestellt, indem in einem geeigneten Produktionsgefäß ein Nährsubstrat mit

Mikroorganismen und einem Nährmedium versetzt wird, eine mechanische

Entschäumung durchgeführt wird, wahrend die Biotenside produziert werden, die

nach Beendigung der Produktionsphase erhaltenen Mikroorganismen abzentrifugiert

werden, wobei die produzierten Biotenside im nicht-aufgebrauchten, im Überschuss

vorhandenen Nährsubstrat verbleiben, während die Biomasse in einer Menge von bis

zu 75 g/l Biofeuchtmasse einer Regenerationsstufe mit ruhenden Zellen in einem

makroelementreduzierten Mineralsalzmedium zugeführt wird, um nach der

Regenerierung neuerlich für die Produktion eingesetzt zu werden.

Im Einzelnen läuft dabei das Verfahren wie folgt ab:

Als Mikroorganismen werden Pseudomonas aeruginosa Mikroorganismen

eingesetzt; in Versuchen haben sich als besonders geeignet erwiesen die Stämme

DSM7108, DSM7107 sowie DSM2874; es ist aber einzuschätzen, dass andere

Stämme und andere Mikroorganismen, die für die Rhamnolipidproduktion bekannt

sind, in gleicher Weise vorliegend einsetzbar sind.

Die Mikroorganismen werden mit einem Phosphatpuffer mit maximal 0,05 bis 0,1 M

bei einem pH-Wert von 6,3 bis 6,8 im stets deutlichen Überschuss eines

Pflanzenölsubstrates angezüchtet. Während einer etwa 40- bis 60stündigen

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Kapitel V

121

Anzuchtphase wird dabei zunächst ein exponentielles Wachstum bewirkt, in dem

sich die Zellen nach einer anfänglichen stationären Phase sehr schnell teilen und

dabei das Nährmedium schnell aufbrauchen. Dies ist in Abb. 6.4 dargestellt.

Während dieser Phase erfolgt die Spurenelement-Zudosierung bedarfsorientiert,

wobei der Bedarf durch Bestimmung von zumindest einer Größe aus Abfall der

Sauerstoffaufnahmerate, Anstieg der Kohlendioxidbildungsrate und/oder Anstieg des

gelösten Sauerstoffs ermittelt wird. Dies geschieht in den ersten 60 Stunden

kontinuierlich, während danach entsprechende bedarfskorrelierte Größen zu festen

Prozesszeiten bestimmt werden.

Nach der exponentiellen Wachstumsphase folgt die stationäre Produktionsphase, die

in etwa bis zu 270 bis zu 280 Stunden nach Ansatz andauert. In dieser Phase erfolgt,

wie Abb. 6.2 zeigt, eine besonders intensive Rhamnolipidproduktion. Während der

gesamten Prozesszeit, das heisst sowohl bei der eigentlichen Produktionsphase als

auch während der Wachstums- beziehungsweise Anzuchtphase erfolgt eine

mechanische Entschäumung.

Während dieses ersten Prozesses ändert sich das Verhältnis von R1 zu R3, das

heißt der produzierten Rhamnolipide zueinander gemäß Abb. 6.3.

Nach Ablauf der Produktionszeit erfolgt die Abtrennung der Biomasse durch

Zentrifugieren. Der verbleibende Überstand enthält ein Rhamnolipid-Gemisch-

Rohzustand mit einem Rhamnolipidgemisch, welches kein Antischaummittel enthält.

Die Rhamnolipidkonzentration ist zugleich hoch.

Die abgeernteten Zellen werden in einer zweiten Prozessstufe bei einer

Konzentration von Ca. 50 g/l Biofeuchtmasse entsprechend ca. 10 g/l

Biotrockenmasse in einem reduzierten Medium regeneriert und können dann erneut

zur Rhamnolipidproduktion verwendet werden. Dies verringert die Menge an zu

entsorgenden organischen Materialien. Die Zellen werden in einem um den Faktor

10 bis 20 makroelementreduzierten Mineralsalzmedium für einige Stunden

regeneriert, bevor sie in eine neuerliche Produktionsphase eintreten. Während dieser

erneuten Produktionsphase wird in einem Verhältnis Rhamnolipid 1 zu Rhamnolipid

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Kapitel V

122

3 gebildet, welches dem Verhältnis am Ende der ersten Prozessstufe vergleichbar

und damit zum Teil verringert ist. Die in der ersten Prozessstufe beschriebenen

Bildungsverschiebungen von Rhamnolipid 1 zu Rhamnolipid 3 treten nicht mehr auf.

Die somit erhaltenen Rhamnolipidkonzentrationsverläufe sind demnach gegenüber

nicht-recyclierten Zellen verschieden. Es sei im übrigen darauf hingewiesen, dass

schon in der ersten Stufe des vorgeschlagenen zweistufigen Prozesses eine

Rhamnolipidproduktion in erheblichen Ausmaß erfolgt, was einen wesentlichen

Unterschied zu einer klassischen runden Zellprozess darstellt, bei dem in der Regel

nur in der ersten Prozessstufe Biomasse produziert wird.

Es sei betont, dass die Abernte/Regenerierung von Zellen mehrfach wiederholt

werden kann und dass dabei kaum eine Kontamination mit fremden

Mikroorganismen befürchtet werden muss.

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Kapitel V

123

6.5.2 Zusammenfassung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Biotensidherstellung, wobei biotensid-

erzeugende Mikroorganismen in einem Nährsubstrat bewegt werden. Hierbei ist

vorgesehen, dass das Nährsubstrat im Überschuss verwendet und eine

mechanische Schaumzerstörung durchgeführt wird.

Patentansprüche

1. Verfahren zur Biotensidherstellung, wobei biotensiderzeugende Mikro-

organismen in einem Nährsubstrat bewegt werden, dadurch gekennzeichnet,

dass das Nährsubstrat im Überschuss verwendet und eine mechanische

Schaumzerstörung durchgeführt wird.

2 . Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet,

dass das Biotensidherstellungsverfahren als Rhamnolipidherstellungs-

verfahren durchgeführt wird.

3. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet,

dass als Rhamnolipide zumindest die Rhamnolipide R1 und/oder R3

hergestellt werden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch

gekennzeichnet, dass Rhamnolipide mit einem Verhältnis R1 zu R3 < 0,5,

bevorzugt < 0,3 hergestellt werden.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn-

zeichnet, dass als Mikroorganismen Pseudomonas-Stämme verwendet

werden.

6. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet,

dass als Pseudomonas-Stämme zumindest einer der Stämme DSM7108 oder

DSM 2874 eingesetzt wird.

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Kapitel V

124

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn-

zeichnet, dass ein öliges Nährsubstrat verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch

gekennzeichnet, dass ein Öliges Nährsubstrat auf Pflanzenbasis,

insbesondere ein Pflanzenöl, insbesondere zumindest ein Öl ausgewählt aus

Sojaöl, Sonnenblumenöl, Maisöl und/oder Weizenkeimöl eingesetzt wird

und/oder Gemische davon.

9 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch

gekennzeichnet, dass ein Überschuss aus öligem Substrat eingesetzt wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch

gekennzeichnet, dass zumindest 30 g/l öliges Nährsubstrat eingesetzt werden.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn-

zeichnet, dass ein Gasvolumenanteil > 20 %, bevorzugt Über 33 %,

insbesondere bevorzugt um oder größer als 50 % gewählt wird.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch

gekennzeichnet, dass die Nährsubstanz-Mikroorganismen-Schaummasse in

der Produktionsphase fließfähig ist.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch

gekennzeichnet, dass der Nährsubstanz-Mikroorganismen-Schaummasse

keine chemischen Schaumzerstörer zugesetzt werden.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch

gekennzeichnet, dass es in der ersten Prozessstufe mit wenigstens 15 g/l

Biotrockenmasse entsprechend 72 g/l Biofeuchtmasse und/oder in der zweiten

Prozessstufe mit wenigstens 10 g/l Biotrockenmasse entsprechend ca. 48 g/l

Biofeuchtmasse durchgeführt wird.

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Kapitel V

125

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch

gekennzeichnet, dass eine Puffer- und/oder Nährsalzkonzentration so weit

reduziert ist, dass eine allenfalls geringe Schleimbildung auftritt.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch

gekennzeichnet, dass mit einer auf Medium-halbe reduzierten Puffer- oder

Nährsalzkonzentration gearbeitet wird.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch

gekennzeichnet, dass die mechanische Schaumzerstörung mit einem

scherkrafterzeugenden Rührer durchgeführt wird.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch

gekennzeichnet, dass die in einem Produktionsdurchlauf verwendeten

Mikroorganismen recycliert werden.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch

gekennzeichnet, dass die Zellen zum Recyclieren von produzierten

Biotensiden, insbesondere produzierten Rhamnolipiden getrennt werden und

die so geernteten Zellen in einem zumindest um Makroelemente reduzierten

Mineralsalzmedium regeneriert werden.

20. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet,

dass die Zellen in einem um einen Faktor von zumindest 10, bevorzugt 20

reduzierten Mineralsalzmedium regeneriert werden, bevorzugt ohne

signifikantes Zellwachstum auszulösen.

21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch

gekennzeichnet, dass die regenerierten Zellen einer weiteren Rhamnolipid-

produktionsphase zugeführt werden.

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Kapitel V

126

22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch

gekennzeichnet, dass ein mehrstufig ruhender Zell-Prozess durchgeführt wird,

bei dem sowohl in einer ersten als auch in einer zweiten Stufe Rhamnolipide in

signifikanter Menge produziert werden.

23. Rhamnolipidhaltiges Rohprodukt mit einem Rhamnolipidverhältnis der

Rhamnolipide R1 zu R3 von ≥ 0,25.

24. Rohprodukt nach dem vorherigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass es

frei von chemischen Antischaummitteln ist.

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Kapitel VI

127

6.6 Kapitel VI

Zusätzliche Ergebnisse und Konstruktionen

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Kapitel VI

128

6.6.1 Lösungen für ein fernsteuerbares Biotechnikum

Neben den wissenschaftlichen Fragestellungen galt es im Rahmen dieser Promotion

ein neues Biotechnikum am hiesigen Lehrstuhl aufzubauen, welches den lokalen

Gegebenheiten entspricht. Im Unterschied zur Industrie verfügen wissenschaftliche

Forschungsinstitutionen selten über ausreichend Mitarbeiter oder die Möglichkeiten

eines Schichtbetriebes zur dauerhaften Überwachung und Kontrolle von

Bioprozessen. Insbesondere bei Prozessen mit einer Laufzeit von mehr als einer

Woche kann dies unter Umständen problematisch sein. Betrachtet man die

notwendigen Arbeitsvorgänge einer Bioreaktorkultivierung fällt auf, dass lokale

Präsenz nur zum Kultivierungsstart, den Probenahmen und der Ernte unumgänglich

sind. Während des Prozesslaufs beanspruchen Arbeiten wie Prozesskontrolle und

Regulation von Prozessparametern die meiste Zeit. Daher können Optionen zur

Fernprozesskontrolle zu einer Verbesserung der Prozessüberwachung als auch zu

einer Erleichterung der Mitarbeiter führen. Mit dieser Zielsetzung erfolgte der

Technikumsaufbau.

Nahezu alle aktuellen kommerziell erhältlichen Bioreaktorsysteme verfügen

inzwischen über digitale Schnittstellen zur Datenaufzeichnung sowie für

Steuerungsaufgaben. Verfügbare Softwarelösungen des Herstellers, liefern

hinreichende Möglichkeiten zur Reaktorkontrolle und Datenaufzeichnung auf lokaler

Ebene. Die Aufgabe bestand nun darin, unterschiedliche Bioreaktorsysteme mit

unterschiedlicher Prozessleitsoftware in einem Technikumsnetzwerk zusammen

zufassen und einen externen Zugriff, vergleichbar dem lokalen, auf dieses Netzwerk

zu ermöglichen. Als Ergebnis dieser Aufgabenstellung entstand das in Abb. 6.5

gezeigte Netzwerk. Das aktuelle Netzwerk erlaubt den gleichzeitigen Zugriff auf zehn

Bioreaktoren. Hierdurch können von außen online Prozessdaten abgerufen und

Regelparameter angepasst werden. Zusätzlich visuelle Informationen zum Status der

Glasreaktoren können durch die Übertragungen zweier Web-Kameras erhalten

werden. Dies ermöglicht vor allem bei der Produktion von Biotensiden

Schäumungstendenzen frühzeitig zu erkennen und geeignete Anpassungen der

Rührerdrehzahl bzw. der Begasungsrate durchzuführen, bevor eine automatische

Zudosierung von Antischaummitteln erfolgt.

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Kapitel VI

129

Abb. 6.5 Schematische Darstellung des aufgebauten Technikumsnetzwerkes.

Die Bioreaktoren werden simultan von zwei Prozessleitrechnern gesteuert, welche in

die lokale Netzwerkdomäne des Lehrstuhls eingebunden sind. Automatische

Datenbackups auf dem Domainserver sind möglich. Der externe Zugriff auf das

Technikumsnetzwerk erfolgt über eine VPN-client abgesicherte Internetverbindung

von einem beliebigen PC aus.

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Kapitel VI

130

6.6.2 Automatisierte Prozesssteuerung über Rezepte

Die kommerziell erhältlich Prozessleitsoftware MFCSwin

2.1 SP5 für Sartorius Bioreaktorsysteme bietet die

Möglichkeit über verschiedene Programmmodule

Prozessabläufe und Onlineberechnungen zu

programmieren. Diese werden in sogenannten Rezepten

zusammengefasst und ermöglichen es, einen Prozess

automatisiert und standardisiert ablaufen zu lassen. Um

diese Vorteile auch für die biotechnologische Produktion

von Rhamnolipiden nutzen zu können, wurde die im

Rahmen dieser Arbeit entwickelte Prozessführung in ein

entsprechendes Rezept übertragen. Eine grobe

schematische Darstellung des aus 8 Operationsphasen

und 15 Unterphasen bestehenden Rezeptes ist rechts in

Abb. 6.6 dargestellt. Eine detaillierte Aufstellung der

verschiedenen Prozessparameter und der Unterphasen ist

dem Anhang zu entnehmen.

Abb. 6.6 Programmschema der zu einem Rezept umgesetzten Prozessführung

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Kapitel VI

131

6.6.3 Fällung und Aufreinigung von Rhamnolipiden

Im Verlauf dieser Arbeit wurden neue Methoden zur Fällung und Aufreinigung von

Rhamnolipiden aus Kultivierungsbrühen entwickelt. Eine Methode, um

mikrobiologisch hergestellte Rhamnolipide zu gewinnen, ist ihre Extraktion aus dem

Kultivierungsansatz mit organischen Lösungsmitteln entsprechend dem zuvor

vorgestellten Probenahmeprotokoll. Ausgehend von diesem in seiner Konsistenz und

Aussehen „honigartigen“ Rohextrakt, wurden verschiedene Versuche unternommen

um Rhamnolipide in fester Form zu erhalten. Anfängliche Fällungsversuche in

wässriger Phase mit Ansäuerung auf pH = 2 und Kühlen auf 4° C führten zwar zu

einem Ausfallen der Lösung, nach anschließender Filtration und Trocknung stellte

sich jedoch immer wieder der viskose flüssige Zustand ein. Eine Wiederholung der

Versuche mit reinem, kommerziell erhältlichem Rhamnolipid 3 in fester Form zeigte

dasselbe Ergebnis. Mit der Annahme, dass Wasser die Bildung von Rhamnolipid in

fester Form stört, wurde eine umgekehrte Vorgehensweise untersucht, bei der die

Fällung in organischer Phase durchgeführt wurde. Eine Übersicht über das hierbei

angewandte Fällungs- und Aufreinigungsprotokoll ist in Abb. 6.7 wiedergegeben.

Ausgegangen wurde hierbei von dem kommerziellen Rhamnolipidextrakt Jeneil JBR

425. Der Anteil an Rhamnolipid 1 und 3 dieses Produktes liegt bei ca. 20 % (w/w),

die anderen 80 % bestehen aus Wasser und einem nicht näher definierbaren Anteil,

welcher vermutlich aus organischen Komponenten wie Antischaummittel und

Substratrückständen besteht.

In einem ersten Schritt wurde 1 l Ausgangslösung durch eine 1 : 10 (v/v) Verdünnung

des Ausgangsextraktes mit VE-Wasser hergestellt. Anschließend wurde die Lösung

mit konzentrierter Schwefelsäure auf pH = 2 angesäuert, was zu einer Protonierung

der Carboxylgruppen der Rhamnolipide und zu einer Prezipitation führte. Zum

weiteren Herabsetzen der Löslichkeit und zum Absetzen wurde die Lösung auf 4° C

abgekühlt und für 24 h bei dieser Temperatur belassen. Das Prezipitat wurde

anschließend durch Filtration über einen Cellulose-Faltenfilter abgetrennt, und für

weitere 24 h unter dem Abzug getrocknet. Das anfänglich feste Fällungsprodukt ging

hierbei wieder in einen hochviskosen, flüssigen Zustand über. Dieser Rückstand

wurde mehrfach mit kleinen Mengen an Ethylacetat eluiert (1/200 des Volumens der

Ausgangslösung). Das Ethylacetat wurde in einem 2 l Rundkolben gesammelt.

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Kapitel VI

132

Abb. 6.7 Fällung von Rhamnolipiden in organischer Phase.

Nun wurde so lange Hexan zugegeben bis eine leichte Trübung der Lösung eintrat.

Anschließend wurde die Lösung im Wasserbad auf 40° C erhitzt, wodurch die

Trübung verschwand. Erneut wurde Hexan bis zum Einsetzen einer Trübung

zugegeben, die Lösung langsam auf 4° C abgekühlt und bei dieser Temperatur für

24 h belassen. Das erhaltene Prezipitat wurde erneut filtriert und unter dem Abzug

getrocknet. Als Ergebnis wurde ein festes, weißes Filterpellet erhalten, welches

jedoch noch einen leichten Gelbstich hatte. Daher wurde das Pellet mit gekühltem

Hexan gewaschen und erneut getrocknet. Hierdurch konnte der Gelbstich entfernt

werden. Anschließend wurde das Pellet vom Filter gekratzt, zerkleinert und zur

weiteren Evaporation von Lösungsmittelresten für 2 h bei 4 mbar und 50° C in einen

Rotationsverdampfer verbracht.

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Kapitel VI

133

Genauere Untersuchungen für das

Fällungsprodukt ergaben einen

Schmelzpunkt von 86 °C, welcher

charakteristisch für Rhamnolipid 3 ist

[24]. Wie die in Abb. 6.8 gezeigten

Ergebnisse einer qualitativen Dünn-

schichtchromatographie konnte in der

Probe ebenfalls nur Rhamnolipid 3

nachgewiesen werden (Abb. 6.8,

Färbemethoden nach [98, 99]. Mittels

einer HPLC-Analyse (nach [80]) wurde

ebenfalls nachgewiesen, dass die Probe

überwiegend aus Rhamnolipid 3, sowie

geringen Spuren Rhamnolipid 1 besteht.

Mit dem angewendeten Fällungs- und

Aufreinigungsprotokoll konnte so

Rhamnolipid in fester Form gewonnen

werde. Gleichzeitig zeigte sich, dass eine selektive Fällung von Rhamnolipid 3

auftrat. Dieser Effekt könnte zukünftig zur Trennung der beiden Rhamnolipidspezies

1 und 3 eingesetzt werden. Ausgehend von diesen Voruntersuchungen bestehen

Entwicklungsmöglichkeit hin zu einer vollständigen Produktaufarbeitung für den in

dieser Arbeit vorgestellten Rhamolipidproduktionsprozess.

Abb. 6.8 DC einer Lösung des Prezipitats gegen Jeneil JBR 425 als Standard. Links: Mit Anisaldehyd-Reagenz angefärbter Zuckerrest. Rechts: Mit Ammoniummolybdat-Reagenz

angefärbter Fettsäurerest.

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Kapitel VI

134

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Ausblick

135

7 Ausblick

Ein im Verlauf dieser Arbeit als wesentlich identifiziertes Problem ist das genaue

Verständnis der Induktion der Rhamnolipidbildung in Pseudomonas species.

Wichtige Fragestellungen hierbei wären:

• Welche spezielle Faktoren führen zur Rhamnolipidinduktion, welche

induzieren Alginat/Polysaccharidbildung/Pigmentbildung und hemmen die

Rhamnolipidbildung?

• Ist die Induktion der Alginat/Polysaccharidbildung reversibel?

• Wie ändert sich das Proteinexpressionsmuster im jeweiligen Fall?

• Welcher Einfluss kann hierbei durch die Zugabe der Autoinducer PAI-1/PAI-2

genommen werden?

Die im Rahmen eines Folgeprojektes hierzu beantragte molekular-

biologischen/systembiologischen Ansätze sollen die im Rahmen dieser Arbeit

entwickelte Screening-Plattform ergänzen und Antworten auf die oben aufgeführten

Fragen liefern.

Erst jetzt besteht die Möglichkeit mit vertretbarem zeitlichem Aufwand weitere

Produktionsstämme, Mediumskomponenten oder Prozessparameter bezüglich ihres

Einflusses auf die Rhamnolipidbildung effektiv zu untersuchen und Proben aus

vollwertigen Bioreaktorkultivierungsprozessen zu erhalten. Screening-Versuche mit

neuen und genetisch modifizierten Produktionsstämmen werden auf Basis des hier

vorgestellten Screening-Systems inzwischen durchgeführt. Auch eine Vergrößerung

des Prozessesmaßstabs auf einen 30 l Bioreaktor ist aktueller Forschungs-

gegenstand.

Durch kontinuierliche Erweiterung der IR-Spektrenreferenzdatenbank, ist eine

zusätzliche Verbesserung der Vorhersagegenauigkeit der ATR-FTIR Analytik zu

erwarten. Zukünftige Untersuchungen zur Implementierung einer ATR-FTIR-Sonde

direkt in den Bioreaktor könnte zur in vitro Erfassung von IR-Spektren und eventuell

sogar zu einer online ATR-FTIR-Prozessanalytik führen, welche ganz neue

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Ausblick

136

Einsichten zum Rhamnolipidbildungsprozess und Möglichkeiten der Prozesskontrolle

liefern könnte.

Auf dem Gebiet der im Anschluss des Bioprozesses folgenden Produktaufarbeitung,

v.a. im Bereich scale up und Formulierung der Produkte in Rein- und Festform,

besteht noch ein deutlicher Entwicklungsbedarf.

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Page 159: Diss Leitermann 26 8format

Literatur

143

Page 160: Diss Leitermann 26 8format

Anhang

144

Page 161: Diss Leitermann 26 8format

Anhang

145

9 Anhang

9.1 Abbildungs und Tabellenverzeichnis

Abb. 4.1 Elektronenmikroskopische Aufnahme von Pseudomonas aeruginosa DSM 2874. Die fädigen

Strukturen zeigen Pili. Zur rechten unteren Ecke hin verlaufend, kann das Flagellum vermutete

werden. (Aufnahme C. Syldatk) ______________________________________________________ 9 Abb. 4.2 Virulenzfaktoren von Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa verfügt sowohl

über zellassoziierte Virulenzfaktoren (Flagellum, Pili Typ IV, Alginat/Biofilm, Lipopolysaccharid (LPS),

Pili-unabhängige Adhesine), als auch über extrazelluläre Virulenzfaktoren (Proteasen, Hämolysine

Phospholipase C & Rhamnolipide , Exotoxin A, Exoenzym S, Pyocyanin) [14]. ________________ 10 Abb. 4.3 Schematische Darstellung von Tensiden in wässriger Lösung, sowie die Beeinflussung der

Oberflächenspannung in Abhängigkeit der Tensidkonzentration. ___________________________ 13 Abb. 4.4 Von Tensiden oberhalb der cmc ausgebildete typische Mikrostrukturen (nach [21]). _____ 13 Abb. 4.5 Typische Rhamnolipide (nach [23]). __________________________________________ 15 Abb. 4.6 Schematische Darstellung der Rhamnolipidbiosynthese auf Pflanzenölen (modifiziert nach

[32, 34, 35, 37])._________________________________________________________________ 19 Abb. 4.7 Quorum Sensing Systeme von P. aeruginosa und deren Interaktion (nach [43]). ________ 20 Abb. 4.8 Anzahl an neueren Patente und Publikationen zu den Stichworten „Rhamnolipid“ und

„Biosurfactants“. Stand November 2007. (Quellen: European Patent Office (EPO)

(http://ep.espacenet.com); ISI web of knowledge (http://portal.isiknowledge.com)). _____________ 24 Abb. 4.9 Schematische Darstellung der Schaumbildung durch eingebrachte Luft in eine tensidhaltige,

wässrige Lösung. ________________________________________________________________ 28 Abb. 4.10 Charakterisierung von Schaum anhand des Gasanteils φ [65]._____________________ 29 Abb. 4.11 Fundafom™ - Systems (Sartorius Stedim Systems GmbH, Schwarzenberger Weg 73 – 79,

34212 Melsungen, Deutschland) zur Schaum/Gasseparation wie es am Lehrstuhl für Technische

Biologie der Universität Karlsruhe (TH) eingesetzt wird. A: Reaktordeckel Biostat Cplus mit

integriertem Fundafom-System. B: Funktionsprinzip. ____________________________________ 32 Abb. 4.12 Einfache Schaumzerstörungsrührer wie sie am Lehrstuhl für Technische Biologie der

Universität Karlsruhe (TH) eingesetzt werden. A: Installationsprinzip auf der Rührerachse. B & C:

Hohlblattrührer. D: 4-Blatt-Lochrührer. E: 4-Blatt-Rührer. F & G: Scheibenrührer mit unterschiedlichen

Schaumeinlässen. H: Kommerziell erhältlicher Schaumzerstörer FoamDisk™ (Sartorius Stedim

Systems GmbH, Schwarzenberger Weg 73 – 79, 34212 Melsungen, Deutschland). ____________ 32 Abb. 4.13 Schematische Darstellung eines FTIR-Spektrometers mit ATR-Probenkammer. _______ 35 Abb. 4.14 Umwandlung von Spektral- und Konzentrationsdaten in Matrixschreibweise. In diesem

Beispiel wurden zunächst M Kalibrationsproben vermessen. In einem weiteren Schritt wurden alle N

Wellenzahlen der gemessenen Spektren zeilenweise in eine (M, N)-Matrix geschrieben. Diese Matrix

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Anhang

146

entspricht der spektralen Datenmatrix X. Analog wurden alle L Komponentenwerte in eine (M, L)-

Konzentrationsdatenmatrix Y geschrieben. [71]_________________________________________ 37 Abb. 4.15 Faktorisierung einer Spektraldatenmatrix. [71] _________________________________ 37 Abb. 4.16 Schematische Darstellung des Ergebnisses einer Faktorisierung. [72]_______________ 38 Abb. 5.1 Schaumbildung während einer konventionell begasten Fermentation in einem 5 L

Glasreaktor mit Pseudomonas species DSM 2874 auf Sonnenblumenöl nach ca. 72 h. _________ 40 Abb. 5.2 Viskosität über den Prozessverlauf bei einer Bioreaktorkultivierung mit DSM 2874 auf dem

Ausgangsmedium. _______________________________________________________________ 41 Abb. 5.3 Links: Für das Screening verwendetes Parallelreaktorsystem während eines Versuchslaufs.

Rechts: Rührerachse mit montiertem mechanischen Schaumzerstörer sowie den zwei konventionellen

6-Blatt Rushton-Rührern zur Reaktordurchmischung. ____________________________________ 45 Abb. 5.4 Vereinfachte schematische Darstellung eines mehrstufigen Prozesses mit integrierter

mechanischer Schaumzerstörung zur Herstellung von Rhamnolipiden. ______________________ 50 Abb. 6.1 Zweistufiger Prozess zur biotechnologischen Produktion von Rhamnolipiden _________ 118 Abb. 6.2 der zeitliche Verlauf der Produktion der Rhamnolipide R1 und R3 mit ruhenden Zellen in

frischem Mineralsalzmedium bei Resuspension eingefrorener Zellen zum Zeitpunkt T = 0 ______ 119 Abb. 6.3 Verlauf des Verhältnisses von R1 zu R3 in einem zweistufigen Verfahren jeweils für die erste

Stufe und für die nachfolgende Stufe mit ruhenden Zellen; _______________________________ 119 Abb. 6.4 Wachstumsphasen von Zellkulturen in einem Zelldichte-Zeitdiagramm.______________ 120 Abb. 6.5 Schematische Darstellung des aufgebauten Technikumsnetzwerkes. _______________ 129 Abb. 6.7 Fällung von Rhamnolipiden in organischer Phase. ______________________________ 132 Abb. 6.8 DC einer Lösung des Prezipitats gegen Jeneil JBR 425 als Standard. Links: Mit Anisaldehyd-

Reagenz angefärbter Zuckerrest. Rechts: Mit Ammoniummolybdat-Reagenz angefärbter

Fettsäurerest.__________________________________________________________________ 133 Fig. 6.1 Oil content, bio dry weight and rhamnolipid concentration during a 500 ml scale cultivation of

DSM 7108 on sunflower oil with mechanical foam destruction. The arrow indicates the feeding time of

additional 125 g/l of substrate. ______________________________________________________ 59 Fig. 6.2 Antifoam utilization and rhamnolipid end concentrations of four cultivations with DSM 7108 in

a 5 l scale bioreactor. Cultivation 1 with 4 blade Rushton stirrer for mechanical foam destruction.

Cultivation 2 with 4 blade Rushton stirrer and adapted aeration and mixing speed. Cultivation 3 with a

commercial foam destruction stirrer (foam disc™) non optimized. Cultivation 4 with commercial foam

destruction stirrer (foam disc™) and adapted mixing speed and aeration rate._________________ 60 Fig. 6.3 Cultivation 4, a 5 l scale production of rhamnolipids with DSM 7108.__________________ 61 Fig. 6.4 Two common rhamnolipids [23]. ______________________________________________ 71 Fig. 6.5 Characteristic time courses of substrate, bio dry weight, and, rhamnolipid concentrations for a

5 l scale production of rhamnolipids with DSM 2874. The arrow indicates the feeding time of additional

125 g/l of substrate. ______________________________________________________________ 72

Page 163: Diss Leitermann 26 8format

Anhang

147

Fig. 6.6 Time course of the ratios of rhamnolipid 3 (RL3) to rhamnolipid 1 (RL1) for Pseudomonas spp.

DSM 7108 and DSM 2874 cultivations. _______________________________________________ 73 Fig. 6.7 The chemical structure of rhamnolipid 1 and rhamnolipid 3, two common rhamnolipids [23] 77 Fig. 6.8 Shaking flask screening with DSM 7108 on seven plant oils and fish oil. Summarized results

of total rhamnolipid concentration and the bio dry weight dependant specific productivity after 144 h.80 Fig. 6.9 Bioreactor screening with DSM 7108 on seven plant oils and fish oil. Summarized results

according to total rhamnolipid concentration and the specific productivity. ____________________ 81 Fig. 6.10 Average rhamnolipid ratios of rhamnolipid 3 (RL 3) to rhamnolipid 1 (RL 1) for all bioreactor

cultivations in terms of process time. _________________________________________________ 84 Fig. 6.11 ATR-FTIR spectra of rhamnolipid 3 in water (89 mg/mL). It was tried to allocate conspicuous

absorption to corresponding characteristic group absorptions from literature.__________________ 95 Fig. 6.12 Investigation of adsorption and evaporation effects in the ATR cell in a time range of 8

minutes. _______________________________________________________________________ 96 Fig. 6.13 The figure displays four spectra of two fermentation derived samples, after double

application. A comparison of the corresponding two spectra of each sample, showed correlations of

above 99.9 %. __________________________________________________________________ 97 Fig. 6.14 Quantification of rhamnolipids. Cross validation and test set validation results. _________ 99 Fig. 6.15 Proceeding for the sample extraction from culture broths. ________________________ 103 Tab. 4.1 Phylogenetische Zuordnung Pseudomonas aeruginosa ____________________________ 9 Tab. 4.2 Klassifizierung von Tensiden (modifiziert, nach [19]). _____________________________ 12 Tab. 4.3 Grenzflächenaktive Eigenschaften von Rhamnolipiden in Wasser aus Pseudomonas species

DSM 2874 [26]. * gegen n-C16. _____________________________________________________ 16 Tab. 4.4 Verfahrensübersicht zur mikrobiellen Herstellung von Rhamnolipiden.________________ 23 Tab. 4.5 Unterschiedliche Schaumzerstörungsmethoden im Überblick nach [65]. ______________ 30 Tab. 6.1 Major fatty acid composition of the used substrates. Measured in equivalent fatty acid methyl

esters. * data from supplier. ________________________________________________________ 79 Tab. 6.2 Summarized results of the bioreactor cultivations with DSM 7108 ___________________ 81

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Anhang

148

9.2 Abkürzungen °C Grad Celsius (v/v) Volumenanteil pro Gesamtvolumen (w/w) Gewichtsanteil pro Gesamtgewicht Abb. Abbildung ACP Acyl-Carrier-Protein AF Antifoam (engl. Antischaummittel) ATR abgeschwächte Totalreflexion BDW Bio dry weight (engl. Biotrockenmasse) bzw. beziehungsweise cmc kritische Mizellkonzentration C-Quelle Kohlenstoffquelle DSM Bezeichnung für Mikroorganismen, die bei der DSMZ hinterlegt sind DSMZ Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,

Braunschweig Fig. Abbildung (engl. Figure) FTIR-Spektroskopie Fourier Transformations Infrarot Spektroskopie g Gramm Gl. Gleichung h Stunde HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatografie IR Infrarot l Liter LPS Lipopolysaccharid M Molarität [Mol/l] mg 10-3 Gramm min Minute ml 10-3 Liter mM Millimol pro Liter Mp Schmelzpunkt (°C) Mrd. Milliarden NL Normliter Gas OD 580 optische Dichte bei einer Wellenlänge von 580 Nanometer P Produkt pks Säure Dissoziationskonstante PLS Partial Least Square pO2 Gelöstsauerstoff Ps spezifische Produktivität Pseudomonas sp. Pseudomonas species Pv volumetrische Produktivität QS Quorum sensing RL Rhamnolipid rpm Rotationen pro Minute Rx Rhamnoseeinheit S verbrauchtes Substrat t Zeit t/a Tonnen pro Jahr Tab. Tabelle v.a. vor allem X Biomasse Y p/s Produktausbeutekoeffizient bezogen auf den Substratverbrauch

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Anhang

149

Y p/x Produktausbeutekoeffizient bezogen auf die Biomasse z.B. zum Beispiel γ Grenzflächenspannung (mN/m) μm Mikrometer (10-6 Meter) σ Oberflächenspannung (mN/m)

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Anhang

150

9.3 Formelsammlung

Bilanzen Allgemeine Massenbilanzgleichung für einen Bioprozess:

[ ]∫∫ ⋅+⋅−⋅= dVrcFcF

dt

dVcdiausauseinein

i

mit

ci = Konzentration einer Komponente i im System oder im Zulauf (Index „ein“) oder

im Ablauf (Index „aus“)

F = Volumenstrom des Zu- oder Ablaufs (Indiziert wenn ungleich)

ri = Reaktionsgeschwindigkeit der Komponente i

V = Reaktionsvolumen

t = Zeit

für ein Zulaufverfahren (fed-batch) fällt der Ablaufterm weg (Faus = 0) und es ergibt

sich:

( ) VrcFdtdcV

dtdVc

dtVcd

ieinein ⋅+⋅=⋅+⋅=⋅ mit einFdt

dV=

Da in den Kultivierungen bei dieser Arbeit nur eine diskrete und keine kontinuierliche

Zufütterung statt fand, fallen entsprechend einer absatzweise Prozessführung nach

diesem Zufütterungszeitpunkt sowohl der Zu- als auch der Ablaufterm weg, es gilt:

( )i

i rVdtVcd

⋅=

Da V als konstant angenommen wird ergibt sich für die Konzentrationsbilanz:

⎥⎦⎤

⎢⎣⎡=lhgr

dtdc

ii

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Anhang

151

Hieraus lassen sich ableiten:

Wachstumsgeschwindigkeit rx: ⎥⎦⎤

⎢⎣⎡=lhgr

dtdc

XX mit cX = Biomassekonzentration

Spezifische Wachstumsgeschwindigkeit (synonym: spezifische Wachstumsrate):

⎥⎦⎤

⎢⎣⎡=hc

r

x

x 1μ oder xx cr ⋅= μ

Mit cx = xi der Biomassekonzentration x zum zugehörigen Zeitpunkt ti ergibt sich für

einen Wachstumsverlauf entsprechend einer Monod-Kinetik gilt in einer exponen-

tiellen Wachstumsphase für die maximale spezifische Wachstumsrate:

( )01max0

1

01

01max ln

lnlntt

xx

ttxx

t

ttt −⋅=⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⇒

−−

== μμμ

oder gleichbedeutend: )(

001max ttexx −⋅⋅= μ

Des Weiteren lässt sich hieraus die Verdoppelungszeit td bzw. die minimale

Verdoppelungszeit td, min berechnen:

μ)2ln(

=dt bzw. max

min,)2ln(

μ=dt

mit x = 2x0

Substrataufnahmerate

⎥⎦⎤

⎢⎣⎡=lhgr

dtdc

SS mit cS = Substratkonzentration

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Anhang

152

Produktbildungsrate

⎥⎦⎤

⎢⎣⎡=lhgr

dtdc

PP mit cP = Substratkonzentration

Berechnete Ausbeutekoeffizienten Y

Für das Verhältnis von Biomassezuwachs zur Substrataufnahme:

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡ΔΔ

⇒=gg

cc

rr

YS

X

S

XSX /

Für das Verhältnis von Produktbildung zur Substrataufnahme:

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡ΔΔ

⇒=gg

cc

rr

YS

P

S

PSP /

Für das Verhältnis von Produktbildung zur Biomassebildung:

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡ΔΔ

⇒=gg

cc

rr

YX

P

X

PXP /

Volumetrische Produktivität

⎥⎦⎤

⎢⎣⎡=lhgrP pv

spezifische Produktivität bezogen auf die Biomasse

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡⋅=

ghg

crP

XPS

1

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Anhang

153

Abgasberechnungen

[ ][ ]

2

2

0, 20950,0003

8,314 0,08314

1,013

273,15

O

CO

ges

yy

J barLRmolK molK

p bar

T T C

=

=

⎡ ⎤ ⎡ ⎤= =⎢ ⎥ ⎢ ⎥⎣ ⎦ ⎣ ⎦=

= ° + Indizes

α = Zuluft

ω = Abluft

yx = Molenbruch der jeweiligen Gaskomponente x

Volumenbezogene Sauerstoffaufnahmerate QO2 = OUR (oxygen uptake rate)

[ ]

[ ] [ ]2 2

2 2 22 2

1min1 min

G gesO CO

O OO CO

F

LV p bary y molQO y y

barL y y LV L R T KmolK

α

α αα ω

ω ω

• ⎡ ⎤×⎢ ⎥ ⎛ ⎞− − ⎡ ⎤⎣ ⎦= × − × =⎜ ⎟ ⎢ ⎥− −⎡ ⎤ ⎣ ⎦⎝ ⎠× ×⎢ ⎥⎣ ⎦

Volumenbezogene Kohlendioxidbildungsrate QCO2 = CER (carbondioxide evolution rate)

[ ]

[ ] [ ]2 2

2 2 22 2

1min1 min

G gesO CO

CO COO CO

F

LV p bary y molQCO y y

barL y y LV L R T KmolK

α

α αω α

ω ω

• ⎡ ⎤ ×⎢ ⎥ ⎛ ⎞− − ⎡ ⎤⎣ ⎦= × × − =⎜ ⎟ ⎢ ⎥− −⎡ ⎤ ⎣ ⎦⎝ ⎠× ×⎢ ⎥⎣ ⎦

Respiratorischer Quotient:

2

2

QOQCORQ =

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Anhang

154

9.4 Prozessrezept Rhamnolipid-Produktionsprozess

1. Operation: Vorbereitung

Parameterphase: Variables on

2. Operation: Fermentationsbedingungen

Parameterphase: Controller

3. Operation: Batch-Phase

Parameterphase: Calculations on

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Anhang

155

Parameterphase: Alarm an

Parameterphase: Batch-Sync

Parameterphase: Manuelle Haltephase

4. Operation: Fed-Batch-Phase

Externe Parameterphase: Feed

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Anhang

156

5. Operation: Ernte

Parameterphase: Alarm aus

Parameterphase: Ernteparameter

6. Operation: Ende

Parameterphase: Controller off

Parameterphase: Calculations off

Parameterphase: Variables off

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