Dissertation Herstellung und Untersuchung eines kollagenen ...¶rberDissertation.pdf · Dissertation Herstellung und Untersuchung eines kollagenen Knorpelersatzmaterials aus porcinen

Dissertation

Herstellung und Untersuchung eines kollagenen

Knorpelersatzmaterials aus porcinen Menisken

Der technischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Grades

D O K T O R - I N G E N I E U R

vorgelegt von

Ludwig Körber

aus Schwabach

Als Dissertation genehmigt

von der Technischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 05. Dezember 2014

Vorsitzende des Promotionsorgans:

Prof. Dr.-Ing. habil. Marion Merklein

Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Rainer Buchholz

Prof. Dr.-Ing. Aldo Boccaccini

Prof. Dr. med. Nicole Rotter

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich allen Danken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Rainer Buchholz für die Möglichkeit am Lehrstuhl für

Bioverfahrenstechnik meine Promotion durchführen zu können. Interessante Diskussionen und

Denkanstöße auch über Projektgespräche hinaus ermöglichten das Gelingen dieser Arbeit.

Bei Frau Prof. Nicole Rotter möchte ich mich ganz besonders für Begutachtung meiner Arbeit

bedanken und vor allem auch dafür, dass meine Prüfung letztlich noch im Dezember stattfinden

konnte. Mein besonderer Dank gilt auch Herrn Prof. Paul Fröba für den Prüfungsvorsitz und vor allem

dafür, dass er sich kurzfristig bereit erklärt hat als Prüfungsvorsitzender einzuspringen. Ebenso

möchte ich mich auch bei Herrn PD Kolja Gelse bedanken, dass er als fachfremden Prüfer dabei sein

konnte. Herrn Prof. Aldo Boccaccini danke ich für die Begutachtung meiner Arbeit als dritter

Gutachter.

Ein ganz besonderer Dank geht auch an Herrn Dr. Roman Breiter für seine stets offen Tür bei allen

möglichen oder unmöglichen Problemen die im Laufe einer Promotion auftreten können. Vielen

Dank auch für die oft anstrengenden und scheinbar endlosen dabei aber immer gewinnbringenden

und daher entscheidend zum Gelingen dieser Arbeit beitragenden Diskussionen zum Thema oder

auch über alles Mögliche darüber hinaus. Gerade solche Gespräche zeigen häufig neue Sichtweisen

auf und geben Anregungen welche letztlich sooo wichtig sind!

Bedanken möchte ich mich auch bei meinen Kooperationspartner Frau Dr. Schwarz. Frau Prof. Rotter

und Herrn Dipl. Biol. Alexander Elsässer vom Forschungslabor der HNO Uniklinik Ulm sowie bei Herrn

PD Dr. med. Kolja Gelse von der Unfallchirurgie in Erlangen.

Neben allen bisher genannten gilt mein Dank natürlich auch allen Mitarbeitern und Kollegen am

Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik wobei besonders

…… meine studentischen Hilfskräfte, Bachelor- und Masterarbeiter Julia Mauer, Katharina Tluczynski,

Rebecca Rösch, Sarah Kolberg, Linda Schaller, Khalida Mansouri, Denise Niederkorn und Pasqual

Reithmeyer,

…. meine Co-Doktoranden Juliane Richter, Stefan Ringgeler, Konstantin Präbst, Tobias Weidner, Björn

Sommerfeldt, Matthias Schirmer, Martin Heining und alle die ich hier aus Platzgründen leider weg

lassen muss,

….. allen technischen Mitarbeitern der Lehrstühle für Bioverfahrenstechnik und für medizinische

Biotechnologie, hier besonders Sabine Lessig, Christine Friedl, Annette Amtmann, Wolfgang Hubert,

Gerhard Prölß und Hans Birkel,

….. Herrn Dr. Andreas Perlick der durch seine offene und direkte Art mit seiner gekonnten Art zu

Formulierungen gepaart mit einem feinen Wortwitz einen nicht zu unterschätzenden Beitrag lieferte,

…… sowie natürlich an das gesamte Sekretariat für die Unterstützungen bei allen organisatorischen

Angelegenheiten, und davon gab es reichlich, ohne Euch würde das Chaos regieren, hervorzuheben

sind.

Allen meinen Freunden außerhalb des Labors, die mir den Rückzug vom „ganz normalen Wahnsinn“

in die Realität ermöglichte und so für stets neue Motivation sorgt.

Größter Dank gilt natürlich auch meinen Eltern, die es mir überhaupt erst ermöglicht haben diesen

Weg zu gehen.

Last but not least geht ein ganz besondere Dank am meine liebe Frau Silke Schwarz die mit mir alle

Höhen und Tiefen durchgemacht hat und mich im Laufe der Zeit regelmäßig auf den Boden der

Tatsachen zurückgeholt hat, was oft auch umgekehrt bitter nötig war. Danke!

Inhaltsverzeichnis

Seite I

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ..................................................................................................................................... I

Zusammenfassung ................................................................................................................................... V

Abstract .................................................................................................................................................. IX

1 Einleitung ......................................................................................................................................... 1

2 Stand des Wissens ........................................................................................................................... 3

2.1 Meniskus ................................................................................................................................. 3

2.1.1 Embryonalentwicklung des Meniskus ............................................................................. 4

2.1.2 Vaskularisierung und Meniskusstruktur .......................................................................... 4

2.2 Extrazelluläre Matrix des Meniskus ........................................................................................ 6

2.2.1 Kollagene des Meniskus .................................................................................................. 7

2.2.2 Kollagenstruktur .............................................................................................................. 8

2.2.3 Proteoglykane des Meniskus ........................................................................................... 9

2.2.4 Glykosamioglykane ........................................................................................................ 10

2.3 Meniskuszellen ...................................................................................................................... 11

2.3.1 Kollagensynthese ........................................................................................................... 12

2.3.2 Proteoglykansynthese ................................................................................................... 13

2.3.3 Zellrezeptoren und Zelloberflächenstrukturen ............................................................. 15

2.3.4 Biochemische Stimuli .................................................................................................... 17

2.3.5 Interaktion von Meniskuszellen mit Komponenten der extrazellulären Matrix ........... 20

2.3.6 Zellmigration .................................................................................................................. 21

2.4 Meniskusverletzungen .......................................................................................................... 24

2.5 Therapieansätze bei Meniskusverletzungen ......................................................................... 25

2.6 Meniskusersatzmaterialien ................................................................................................... 26

2.6.1 Trägermaterialbasierte Ersatzmaterialien ..................................................................... 27

2.6.2 Trägermaterialfreie Selbstorganisation von Meniskusersatzgewebe ........................... 29

2.7 Anforderungen an Bioimplantate für den Meniskusersatz ................................................... 30

3 Zielsetzung ..................................................................................................................................... 32

4 Material und Methoden ................................................................................................................ 34

4.1 Probenmaterial ...................................................................................................................... 34

4.1.1 Porcines Meniskusgewebe ............................................................................................ 34

4.1.2 Bovines Meniskusgewebe ............................................................................................. 35

4.2 Isolierung und Amplifikation primärer boviner Meniskusfibrochondrozyten ...................... 35

4.2.1 Zellisolierung ................................................................................................................. 36

Inhaltsverzeichnis

Seite II

4.2.2 Bestimmung von Zellzahl und Zellvitalität .................................................................... 36

4.2.3 Bestimmung der minimal notwendigen Zellzahl zur Amplifikation in Monolayer ........ 36

4.2.4 Amplifikation boviner Meniskusfibrochondrozyten im Monolayer .............................. 37

4.2.5 Trypsinieren ................................................................................................................... 37

4.2.6 Kryokonservieren boviner Meniskusfibrochondrozyten ............................................... 37

4.3 Dezellularisierung von porcinem Meniskusgewebe - Prozessieren ...................................... 38

4.4 Histologie und Immunohistologie ......................................................................................... 39

4.4.1 Probenvorbereitung ...................................................................................................... 40

4.4.2 Paraffinschnitte ............................................................................................................. 40

4.4.3 Entparaffinieren und Rehydrieren ................................................................................ 40

4.4.4 Hämatoxylin-Eosin Färbung ........................................................................................... 40

4.4.5 Alcianblau Färbung ........................................................................................................ 41

4.4.6 Kombinierte Hämatoxylin-Alcianblau Färbung ............................................................. 41

4.4.7 Immunohistologie ......................................................................................................... 41

4.5 Quantifizierung des Anteils an denaturiertem Kollagen wD .................................................. 42

4.5.1 Enzymatischer Verdau ................................................................................................... 42

4.5.2 Salzsäureaufschluss ....................................................................................................... 43

4.5.3 Colorimetrische Hydroxyprolinbestimmung ................................................................. 43

4.6 DNA-Quantifizierung ............................................................................................................. 44

4.6.1 Photometrische Quantifizierung in Gewebeproben ..................................................... 44

4.6.2 Fluorometrische DNA-Quantifizierung - Hoechst-Assay bei besiedelten Proben ......... 44

4.7 Quantitative Bestimmung von Glykosaminoglykanen .......................................................... 45

4.7.1 Bestimmung in Gewebe ................................................................................................ 45

4.7.2 Bestimmung in neugebildeter extrazellulärer Matrix ................................................... 45

4.8 Quantitative Bestimmung von alpha-galactosyl Epitopen .................................................... 46

4.8.1 Probenvorbereitung - Gewebe homogenisieren ........................................................... 46

4.8.2 Probenvorbereitung Primärantikörper Inkubation ....................................................... 46

4.8.3 Beschichten der Mikrotiterplatten ................................................................................ 46

4.8.4 Durchführung ................................................................................................................ 47

4.8.5 Berechnung der Hemmung von M86 ............................................................................ 47

4.9 Elektronenmikroskopie ......................................................................................................... 47


4.9.2 Rasterelektronenmikroskopie ....................................................................................... 48

4.9.3 Transmissionselektronenmikroskopie ........................................................................... 48

4.10 Prüfen auf Sterilität gemäß EN ISO 11737-1 ......................................................................... 48

Inhaltsverzeichnis

Seite III


4.10.2 Durchführung ................................................................................................................ 49

4.11 Prüfen auf in vitro Zytotoxizität gemäß EN ISO 10993-5 ....................................................... 49

4.11.1 Testzellen ....................................................................................................................... 49

4.11.2 Vorkultur ........................................................................................................................ 50

4.11.3 Herstellung wässriger Eluate ......................................................................................... 50

4.11.4 Durchführung ................................................................................................................ 50

4.11.5 Sensibilisierung des Testsystems ................................................................................... 51

4.11.6 Bestimmung der Stoffwechselaktivität - MTS-Assay ..................................................... 51

4.11.7 Berechnung der Zellvitalität .......................................................................................... 51

4.11.8 Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester Propidium Jodid Färbung .................... 52

4.12 Besiedelungsexperimente ..................................................................................................... 52

4.12.1 Vorkultur boviner MFC .................................................................................................. 52

4.12.2 Sterilisierung der Kollagenscaffolds .............................................................................. 53

4.12.3 Besiedelung der Kolalgenscaffolds ................................................................................ 53

4.12.4 Bestimmung der Flächenzelldichte adhärierter Zellen ................................................. 54

4.12.5 Verwendete Medien und Kultivierung .......................................................................... 54

5 Ergebnisse...................................................................................................................................... 56

5.1 Histologische, biochemische und elektronenmikroskopische Untersuchungen .................. 56

5.1.1 Entfernung von Zellen und Zellbestandteilen aus porcinem Meniskusgewebe ........... 56

5.1.2 Entfernen von Glykosaminoglykanen ............................................................................ 59

5.1.3 Anteil an denaturiertem Kollagen wD ............................................................................ 60

5.1.4 Elektronenmikroskopie ................................................................................................. 61

5.2 Biologische Prüfungen auf Sterilität und in vitro Zytotoxizität ............................................. 62

5.2.1 Prüfen auf Sterilität gemäß EN ISO 11737-1 ................................................................. 63

5.2.2 Prüfen auf in vitro Zytotoxizität nach EN ISO 10993-5(2009) ....................................... 63

5.3 In vitro Revitalisierung mit primären bovinen Meniskusfibrochondrozyten ........................ 66

5.3.1 Isolierung primärer boviner Menisksufibrochondrozyten ............................................ 66

5.3.2 Minimal notwendige Startzellzahl für die Amplifikation in Monolayer ........................ 67

5.3.3 Besiedelungsexperimente ............................................................................................. 67

5.3.4 Einfluss von Kulturmedien und Medienzusätzen auf die Synthese extrazellulärer Matrix

und Zellmigration .......................................................................................................................... 73

5.3.5 Einfluss der Kollagenstruktur auf die Zellmigration ...................................................... 88

6 Fehlerbetrachtung ......................................................................................................................... 90

7 Diskussion ...................................................................................................................................... 93

Inhaltsverzeichnis

Seite IV

7.1.1 Rückstände von Zellen und Zellbestandteilen ............................................................... 93

7.1.2 Glykosaminoglykan Restgehalte .................................................................................... 95

7.1.3 Auswirkungen des Herstellungsverfahrens auf das Kollagennetzwerk ........................ 97

7.1.4 Untersuchung der Matrixintegrität ............................................................................... 97

7.2 Biologische Prüfungen ........................................................................................................... 98

7.2.1 Mikrobielle Reinheit ...................................................................................................... 98

7.2.2 In vitro Zytotoxizität ...................................................................................................... 99

7.3 In vitro Revitalisierung mit primären bovinen Meniskusfibrochondrozyten ...................... 101

7.3.1 Isolierung und Amplifikation boviner Meniskusfibrochondrozyten ............................ 101

7.3.2 Besiedelbarkeit, Proliferation und Zellvitalität ............................................................ 102

7.3.3 Einfluss von Kulturmedien und Medienzusätzen auf die Neusynthese extrazellulärer

Matrix und Zellmigration ............................................................................................................. 105

7.3.4 Einfluss der superfiziellen Schicht auf die Zellmigration ............................................. 112

7.4 Bewertung der Kollagenmatrix ............................................................................................ 113

8 Literatur ....................................................................................................................................... 115

Abbildungsverzeichnis .............................................................................................................................. I

Tabellenverzeichnis ................................................................................................................................. V

Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................................................... VI

Anhang ................................................................................................................................................... IX

Zusammenfassung

Seite V

Zusammenfassung

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, porcines Meniskusgewebe durch einen nasschemischen Prozess

zu reinigen. Unter Erhalt des natürlichen 3D Kollagennetzwerkes sollten nicht kollagene

Gewebebestandteile so weit entfernt werden, dass das resultierende Matrixmaterial biokompatibel

ist und daher ohne inflammatorische Reaktionen hervorzurufen als Transplantatmaterial in der

Humanchirurgie Anwendung finden kann. Das Material sollte außerdem seine Chondrokonduktivität

nicht verlieren, durch xenogene (bovin) Meniskusfibrochondrozyten revitalisierbar sein, Zellmigration

sowie eine Neubildung meniskusspezifischer extrazellulärer Matrixkomponenten durch die bovinen

Meniskusfibrochondrozyten begünstigen.

Die Untersuchungen der Kollagenmatrix zeigen, dass mit dem siebenstufigen Reinigungsprozess

(siehe Kapitel 4.3) unter Erhalt der natürlichen 3D Kollagenstruktur zelluläre Bestandteile, nicht

kollagene Komponenten (Glykosaminoglykane GAG) und Keime so weit reduziert werden, wie es für

ein Transplantatmaterial notwendig ist. Entscheidend verantwortlich sind dafür zwei alkalische

Behandlungen mit 1 N NaOH sowie je eine Behandlung in 1 M Guanidiniumchlorid und 5 %

Wasserstoffperoxid.

Histologisch sind keine Zellen nachweisbar und die biochemischen Analysen zeigen, dass der

DNA-Gehalt bis unter die Nachweisgrenze von 0,06 ng/mg reduziert werden konnte. Die für die

antigenen Eigenschaften tierischen Gewebes verantwortlichen entzündungsrelevanten

Determinanten (α-Gal-Epitope) konnten um einen Faktor größer als 2,56∙102 abgereichert werden.

Aussagen hinsichtlich möglicher immunologischer Reaktionen lassen sich anhand dieser Ergebnisse

nicht treffen. Letztendlich kann die Qualität der Kollagenmatrizes nur im Tierversuch verlässlich

analysiert werden. Daher besteht hinsichtlich der α-Gal Entfernung weiterer Optimierungsbedarf.

Der GAG-Gehalt nimmt signifikant um 61,37 % ab, wodurch zelluläre Komponenten leichter entfernt,

das Gewebes aufgelockert und potentielle Migrationswege für Zellen freigelegt werden können.

GAG-Restgehalt werden auch positiv bewertet, da offensichtlich GAG und Proteoglykane die

Biokompatibilität begünstigten.

Der Anteil an denaturiertem Kollagen (wD) ändert sich durch das Herstellungsverfahren gegenüber

dem in nativem Gewebe nicht signifikant. Sowohl rasterelektronenmikroskopische, als auch

transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen belegen den Erhalt der 3D Kollagenstruktur

und damit der Matrixintegrität.

Für eine erste biologische Beurteilung der Kollagenmatrix wurde ein in vitro Zytotoxizitätstestsystem

nach ISO-Standards (EN ISO 10993-5:2009 ) durchgeführt, welches durch Serumentzug zusätzlich

sensibilisiert wurde. In diesem Testsystem sind gemäß ISO-Standards selbst nach Sensibilisierung

Zusammenfassung

Seite VI

keine zytotoxischen Effekte der Kollagenmatrix auf verschiedene Indikatorzellen (murine

Fibroblastenzelllinie L929, selbst isolierte primäre bMFC und primäre hBMSC), festgestellt worden.

Für Besiedelungsversuche mit xenogenen Zellen wurden primäre bovine Meniskusfibrochondrozyten

isoliert unter optimalen Kulturbedingungen für die erforderliche Zellzahl amplifiziert. Eine

standardisierte Vorgehensweise nach der Zellisolierung bei der Amplifikation sollte bekannte, durch

Expansion in 2D Kultur bedingte Dedifferenzierungen der bMFC vermeiden oder so weit als möglich

zu verringern und zudem die Reproduzierbarkeit und auch die Vergleichbarkeit von Ergebnissen

untereinander gewährleisten.

Alle Besiedelungsversuche belegen eine sehr gute Akzeptanz und mit bis zu 112 d Kultivierungsdauer

die langfristige Revitalisierbarkeit der prozessierten Kollagenmatrix. Bei den verwendeten Medien

konnten deutliche Unterschiede festgestellt werden. Es zeigten sich signifikante Unterschiede

hinsichtlich des Zellwachstums und der Matrixsynthese der bMFC.

Kultivierungen in DMEM/Ham`s F12 mit den migrationsfördernden Wachstumsfaktoren HGF und

PDGF-AB konnten die in der Literatur geschilderte, gesteigerte Proliferation und auch die Förderung

der Migration aufgrund abnehmender Zellzahl sowie nicht beobachteter Matrixsynthese nicht

bestätigen. Offensichtlich fehlen den Zellen in diesem Medium essentielle Mediumzusätze, die

Zellwachstum und vor allem EZM Neusynthese unterstützen. Für weitere Versuche müssten weitere

Mediumzusätze eingesetzt werden, um das Zellwachstum und die Matrixsynthese zu fördern.

Wird DMEM/Ham`s F12 Medium 10 % FBS zugesetzt, wurde auch nach 42 d keine signifikante de

novo EZM Synthese beobachtet. Es bildete sich eine bis zu 50 µm dicke Schicht aus Zellen und neuem

Gewebe. Histologisch war nur geringe GAG Bildung und immunohistologisch nur geringe Bildung von

Kollagen Typ I und Aggrecan nachweisbar. Kollagen Typ II war nicht nachweisbar. Nach 14 d konnte

Migration einzelner Zellen entlang der Kollagenfasern bis zu 400 µm in die Kollagenmatrix hinein

histologisch belegt werden.

Die Besiedelungsexperimente mit NHChondroDiff Medium zeigen im Vergleich zu DMEM/Ham`s F12

mit 10 % FBS und DMEM/Ham`s F12 mit den migrationsfördernden Wachstumsfaktoren HGF und

PDGF-AB, dass vor allem das zur Kultivierung verwendete Medium eine entscheidende Rolle spielt.

Bei Kultivierung in NHChondroDiff Medium konnten reproduzierbar bereits nach 14 d ausgeprägte

Matrixsynthese sowie Zellmigration beobachtet werden. Während der ersten 70 d nimmt die Dicke

neugebildeten Gewebes auf der Kollagenmatrix kontinuierlich bis ca. 300-400 µm zu und bleibt dann

innerhalb des Beobachtungszeitraums von 112 d konstant. Zudem sind Zellen über 400 μm weit in

das Gewebe migriert wobei die Migration entlang der Kollagenfasern beobachtet wird. Auch

migrierte bMFC bilden im Inneren des Scaffolds neue EZM. Die Migration, hängt von der Ausrichtung

und Dichte der Kollagenfasern ab. Die Neubildung extrazellulärer Matrix und Zellmigration belegen

Zusammenfassung

Seite VII

wiederum die chondrokonduktiven Eigenschaften der Kollagenmatrix. Immunohistologisch konnte

die de novo Synthese aller für Meniskusknorpel typischen EZM–Bestandteile, wie Aggrecan, Kollagen

Typ I und Kollagen Typ II nachgewiesen werden. Bei der Quantifizierung des Hydroxyprolingehalts als

Maß für die Kollagenbildung und des Chondroitinsulfatgehalts als Maß für die Bildung der

Glykosaminoglykane ergab sich ein gleichbleibender Anteil bezogen auf die neugebildete

Gewebemasse und mit deren Anwachsen dementsprechend eine kontinuierliche Steigerung. Die

ausgeprägte Neusynthese von EZM scheint allerdings die Zellmigration zunehmend zu inhibieren, so

dass die Zellen in der Matrix dann fixiert und immobilisiert vorliegen. Die oberflächliche

Gewebeschicht mit neu synthetisierter EZM behindert offensichtlich die Versorgung der

einwandernden Zellen nicht, das diese weiterhin EZM synthetisieren. Insgesamt liefert die

Kultivierung in NHChondroDiff sehr gute Ergebnisse hinsichtlich de novo Matrixsynthese sowie eine

deutlich stimulierte Zellmigration und Proliferation zu Beginn der Kultivierung. Vermutete

Nährstofflimitierungen bei steigender Kulturdauer (>56 d) könnten durch entsprechende Anpassung

des Medienvolumens mit steigender Kulturdauer oder auch kürzere Wechselintervalle in weiteren

Arbeiten vermieden oder deutlich vermindert werden.

Kultivierungen in definierten Medien mit migrationsfördernden Wachstumsfaktoren und den

Metabolismus steigernden Zusätzen ergab wie beabsichtigt eine verlangsamte EZM Neubildung und

einen verbesserte Zellmigration aufgrund verminderter Immobilisierung. Die de novo-Matrixsynthese

auf den besiedelten Scaffolds ist in allen Versuchen in vergleichbarer Weise beobachtbar und auch

nach bis zu 52 d deutlich geringer als in NHChondroDiff Medium. Immunohistologische Färbungen

zeigen deutlich die Bildung von Kollagen Typ I. Im Vergleich dazu konnte nur eine geringe Synthese

von Kollagen Typ II und von Aggrecan beobachtet werden. In allen DMEM-Medienvariationen ist die

Zellmigration im Vergleich zu DMEM/Ham`s F12 mit 10% FBS bereits nach 14 d gesteigert und mit

der in NHChondroDiff vergleichbar.

Signifikante Unterschiede hinsichtlich der Zellmigration wurden bei Scaffolds mit superfizieller

Schicht festgestellt. Bei Proben mit superfizieller Schicht konnten keine Zellen durch die superfizielle

Schicht in das Innere des Gewebes migrieren. Diese wird vermutlich durch das dichte Netzwerk

zufällig angeordneter Kollagenfasern behindert, das diesen Gewebebereich auszeichnet. Dagegen

konnten bei Scaffolds ohne superfizielle Schicht stets Zellmigration in unterschiedlichem Ausmaß

entlang von Kollagenfasern beobachtet werden.

Die Kollagenmatrix bietet für einen langfristig erfolgreichen Ersatz von Meniskusgewebe essentielle

Eigenschaften, indem Zellen und Zellbestandteile und nicht kollagene Gewebebestandteile unter

Erhalt der natürlichen 3D Gewebestruktur aus dem Meniskusgewebe entfernt wurden. Wie alle

Untersuchungen zeigen, besitzt die Kollagenmatrix in vitro sehr gute chondrokonduktive

Zusammenfassung

Seite VIII

Eigenschaften und eine ausgezeichnete biologische Verträglichkeit. Daher bietet sich die

Kollagenmatrix als vielversprechende Alternative zu bisherigen Ersatzmaterialeien an.

Zusammenfassung

Seite IX

Abstract

The aim of the present work was to decellularize porcine meniscus cartilage with a novel chemical

process, removing non-collagenous matrix components, without affecting the natural 3D collagen

structure in order to generate an innovative chondroconductive bioimplant. To evaluate the new

matrix cell removal, levels of immunological relevant α-Gal epitopes, denatured collagen,

glycosaminoglycans and DNA were measured in native and decellularized porcine meniscus cartilage.

Possible cytotoxic effects of the matrix in vitro were examined by measuring the vitality of different

indicator-cells using MTS assay. Chondroconductivity and cellular compatibility were investigated by

seeding decellularized meniscus cartilage biomatrices with primary bovine meniscal cells (bMFC).

After the decellularization process HE-stainings demonstrated that cells were removed completely.

Further investigations showed a number of additional outcomes. The DNA content was verified to be

below the quantification limit of 0.06 ng/mg. The immune-response-provokoing α-Gal epitopes were

reduced by a factor more than 2.56∙102. The quantity of glycosaminoglycanes was decreased by

approximately 61.37 %. Through the process the scaffold had become more porous and potential

migration pathways for cells were made uncovered. The denaturation level of the collagen seems to

be of minor importance, as no significant increase in content of denatured collagen could be

detected. Further supporting the preservation of the desired 3D structure, electron microscopy of

decellularized cartilage showed no significant difference in the D-periodicity, when compared to

native cartilage. Through the abovementioned methods of analysis, decellularized meniscus cartilage

was shown to possess the desired properties.

Initial biological investigations, in line with ISO-Standards (EN ISO 10993-5:2009), showed no

significant influence of the scaffold on cell growth and metabolism. This could be seen in comparison

to non-cytotoxic controls (ThinCert PET membranes), and remained the case, even after

sensibilisation of different indicator cells (L929 cells, bMFC and human bone marrow stemm cells). In

contrast, cells which were incubated in a 10 % DMSO solution (positive control), with a

corresponding culture medium, clearly reflected the cytotoxic effects of DMSO on growth and

vitality. To verify the bactericide and fungicide effect of the decellularization process, microbiological

analysis according to ISO 11737-1:2006 + AC:2009 showed no detectable germs or microorganisms

on decellularized meniscus cartilage.

Throughout seeding experiments of decellularized matrices with bMFC demonstrated a very good

acceptance of the scaffold, and the capability to revitalize the matrix long-term. When cultivating

seeded scaffolds in different media, significant differences in the production of extracellular matrix

(ECM), and cell growth-rate were recorded.

Zusammenfassung

Seite X

Cultivation in DMEM/Ham`s F12 with the cell migration stimulating growth factors HGF and PDGF-AB

failed to support the increased proliferation, migration and matrix synthesis described in current

literature. In this case, essential additives for cell growth and ECM synthesis were concluded to be

overlooked.

Cultivation in DMEM/Ham`s F12 Medium with 10 % fetal bovine serum (FBS) showed no significant

de novo ECM synthesis, even after 42 d. A layer of cells and tissue up to 50 µm thick was observed.

Histologically GAG synthesis was barely detectable. Immunohistochemically, collagen type I and

aggrecan were scarce, and no collagen type II was evident. After 14 d a smaller number of lone cells

migrated up to 400 µm into the matrix, along the collagen fibrils. Overall, despite low concentration

of essential additives and cell migration, the chondroconductive properties of the scaffold were

confirmed directly through de novo ECM synthesis.

Seeding experiments with NHChondroDiff, an undefined media, further emphasized the significance

of cultivation media. After 14 d of cultivation in NHChondroDiff media, noticable matrix synthesis as

well as cell migration could be observed. During the first 70 d the thickness of newly synthesized

tissue on the collagen matrix increased up to approximately 300-400 µm. This remained constant

within 112 d. Moreover, cells migrated along the collagen fibers, up to 400 μm into the tissue. De

novo synthesis of typical ECM components like aggrecan, collagen type I and collagen type II were

identified immunohistochemically, implying the cells began synthesizing ECM. Considering cell

migration is largely dependent on the orientation and density of the collagen fibers, the observed cell

migration and matrix synthesis provide additional evidence for the collagen matrix as a

condroconductor. The amount of hydroxyproline, as a measure of collagen synthesis, was constant,

corresponding to the production of new tissue. This was also the case for chondroitin sulfate levels as

a measure of GAG synthesis. With ongoing accumulation of new tissue the amount of hydroxyproline

and the amount of chondroitin sulfate increased. The observed synthesis of de novo ECM seems to

inhibit cell migration, causing the cells to become immobilized in the matrix. The nutrient supply to

migrated cells was not affected by the de novo matrix on the scaffold`s surface. Over all, significant

promotion cultivation of de novo matrix synthesis as well as stimulation of cell migration and

proliferation was observed, proving NHChondroDiff as an advantageous medium.

Cultivation in defined media (DMEM as basis), with migration-stimulating growth factors und

metabolism stimulating additives resulted, as expected, in impaired de novo ECM synthesis. This, in

turn, increased cell migration. De novo matrix synthesis was comparable, even after 52 d, exhibiting a

significant lower synthesis than observed during cultivation in NHChondroDiff. Immunohistochemical

staining showed notable collagen type I synthesis, with collagen type II and aggrecan being barely

present. After 14 d, compared to cultivation in DMEM/Ham`s F12 with 10% FBS, increased cell

Zusammenfassung

Seite XI

migration was observed, comparable to NHChondroDiff. To sum it up, cultivation in defined media

offer the possibility to learn more about the effects of various additives on bMFC.

An additional factor influencing cell migration was made apparent when observing scaffolds with the

superficial layer of the meniscal cartilage. When the superficial layer was present, cells were not able

to migrate into the matrix, where they previously could. Conversely, cell migration into the matrix

was observed in experiments where the superficial layer was missing. It was persumed, that cell

migration was prevented by the tight mesh of randomly oriented collagen fibers, typical for this

tissue zone.

To conclude, decellularized collagen grafts appear to offer essential properties for meniscus

replacement. Through the described decellularization process, cells and their components, as well as

non collagenous components of the meniscus tissue were removed, whilst preserving the tissues´s

three dimensional collagen structure. Furthermore, in vitro investigations proved the collagen grafts

to be suitable chondroconductors, with excellent biological compatibility. On the whole, decllularized

meniscus grafts provide a very promising alternative to existing materials.

Einleitung

Seite 1

1 Einleitung

Der Bedarf an Gewebeersatzmaterialien für die Humanchirurgie ist stark ansteigend. Jährlich führt

die Behandlung muskuloskelettaler Verletzungen zu hohen zweistelligen Millionenbeträgen an

direkten medizinischen Kosten und zusätzlich erheblichen volkswirtschaftlichen Beeinträchtigungen

und Kosten. Für betroffene Patienten sind die persönlichen Belastungen durch eingeschränkte

Mobilität einhergehend mit reduzierter Lebensqualität noch weit größer.

Verschiedene traumatisch oder degenerativ bedingte Ursachen führen zu Knieverletzungen.

Betroffen sind die Patella, die Kreuzbänder, der artikuläre Gelenkknorpel selbst und häufig auch die

Menisken. Speziell Meniskusverletzungen, welche auch immer häufiger bei jungen Leuten zu den

häufigsten Folgen von Freizeit-, Sport- und Arbeitsverletzungen gehören stellen besondere

wissenschaftliche und medizinische Herausforderungen dar. Die Inzidenz von Meniskusverletzungen

in den Industrieländern liegt bei 66 Fällen pro 100.000 Einwohnern, wovon bei 61 Patienten eine

partielle oder totale Meniskektomie durchgeführt werden muss [1]. Jährlich werden in Europa mehr

als 400.000, in den USA sogar über 600.000 chirurgische Eingriffe am Meniskus durchgeführt [2-4].

Bis in die neunzehnhundert Fünfziger Jahre wurden die faserknorpeligen Menisken als funktionslos

angesehen und nach Läsionen meist total entfernt. Erst vor etwa 60 Jahren wurde erkannt, dass

Meniskusgewebe ein hochspezialisierter, vitaler und funktioneller Bestandteil des Kniegelenks ist.

Die Menisken sind halbmondförmige, im Querschnitt keilförmige, faserknorpelige Gewebe welche

zwischen den Femurkondylen und dem Tibiaplateau im lateralen und medialen Kompartiment des

Kniegelenks liegen [1, 5-6]. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Kraftverteilung und

-übertragung, Stabilisation, Dämpfung, sowie beim Schutz des artikulären Knorpels in den

Kniegelenken [1, 7]. Wie alle Knorpelgewebe weist auch der Meniskus kein, bzw. nur ein sehr

geringes intrinsisches Regenerationsvermögen auf [1-2, 8-9].

Da die Mehrzahl der Meniskusläsion nicht gewebeerhaltend versorgt werden kann, stellen die totale

oder subtotale Meniskektomie gerade bei jüngeren und aktiven Patienten eine präarthrotische

Deformität dar, die unbehandelt innerhalb kurzer Zeit zu einer Chondromalzie führt [1, 10]. Der

aktuelle Trend bei Meniskusverletzungen ist, intaktes Gewebe wann immer möglich zu erhalten [11].

Trotz eines steten chirurgischen Fortschritts gilt bei Meniskusverletzungen jedoch die

arthroskopische partielle Meniskektomie als Goldstandard. Als Folge von Meniskektomien entstehen

durch direkten Knorpel-auf-Knorpelkontakt des Gelenkknorpels konsekutiv degenerative

Veränderungen des Gelenkknorpels mit fortschreitender Osteoarthritis [1, 12-13]. Gerade bei jungen

Patienten ist somit ohne adäquates Meniskusersatzmaterial die Notwendigkeit eines künstlichen

Kniegelenkes abzusehen. Hinsichtlich Vermeidung bzw. Verzögerung von Osteoarthritis sowie einer

bestmöglichen Wiederherstellung der Funktion des Kniegelenks ist der Ersatz geschädigten

Einleitung

Seite 2

Meniskusgewebes daher von hoher Relevanz, weshalb bereits seit längerem neue

Meniskusersatzkonzepte erforscht werden[10].

Verschiedenste Ersatzmaterialien wie frische und konservierte allogene Spendergewebe (nur in den

USA), synthetische und biologische Polymere, Hydrogele, trägermaterialfreie Implantate hergestellt

durch Selbstorganisation geeigneter Zellen, Komponenten extrazellulärer Matrix sowie

gewebebasierte Materialien wurden bisher untersucht [1]. In den Neunzehnhundert neunziger

Jahren wurden resorbierbare, dreidimensionale Gerüstmaterialien (Scaffolds) entwickelt, von denen

nur das Collagen Meniscus Implant CMI™, heute Menaflex™ (Ivy Sports Medicine GmbH), hergestellt

aus bovinem Kollagen Typ I, und ActifitTM (Orteq® Sports Medicine), hergestellt aus Polyester und

Polyurethan auf dem Markt angeboten werden. Dem Menaflex™-Material wurde am

14. Oktober 2010 aufgrund eines unzureichenden Nachweises der Wirksamkeit von der US-FDA (FDA

Report: "Review of the Regen Menaflex®: Departueres from Process, Procedure, and Practices leave

the basis for a review decision in question" 2010) die Zulassung entzogen. Die spärliche Datenlage

[14-15] zu dem ActifitTM-Material deutet auf eine geringe Akzeptanz hin.

Bis heute ist noch keine zufriedenstellende, geschweige denn optimale Behandlung von

Meniskusschäden möglich und eine degenerative Veränderung im Kniegelenk nach

Meniskusverletzung kann nach wie vor kaum verhindert werden [1, 9, 16-17].

Eine sinnvolle Alternative könnten dezellularisierte Kollagenmatrizes aus porcinem Meniskusgewebe,

hergestellt durch ein neuartiges, nasschemisches Verfahren sein [18]. Um das in der Humanchirurgie

jedoch auch bei hoher Analogie xenogener Gewebe grundsätzlich zu erwartenden Risiko

immunologischen Abwehrreaktionen zu senken müssen alle immunologisch relevanten

Determinanten entfernt werden Dabei soll die fibrilläre, kollagene Struktur des Meniskus mit seinen

mechanischen und chondrokonduktiven Eigenschaften weitgehend erhalten bleiben. Derartige

Kollagenmatrizes würden bei sehr guter Plastizität über sehr gute mechanische Eigenschaften

verfügen und für Zelladhäsion, -migration und -differenzierung optimale Bedingungen

bieten - entscheidende Parameter für eine erfolgreiche Gewebeintegration. Durch eine vollständige

Revitalisierbarkeit dieser Kollagenmatrizes sollte langfristig die Möglichkeit der Resorption und des

dauerhaften Ersatzes mit körpereigenem Gewebe gegeben sein. Auch sind Anwendungen in der

regenerativen Medizin etwa als azelluläres Trägermaterial für den Einsatz bei zellbasiertem Meniskus

Tissue Engineering denkbar.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, durch einen nasschemischen Prozess aus porcinem

Meniskusgewebe eine Kollagenmatrix herzustellen und die Eignung der Kollagenmatrix als

Meniskusersatzmaterial mittels verschiedener Experimente und durch Besiedelungsexperimente mit

xenogenen Zellen zu untersuchen.

Stand des Wissens

Seite 3

2 Stand des Wissens

2.1 Meniskus

Alle Säugetiere, mit Ausnahme der Microchiroptera besitzen in den Kniegelenken mit dem Menschen

vergleichbare Menisken, wobei die Meniskusform mit der Kniegelenkfunktion untrennbar einher

geht. Der humane Meniskus weist, im Vergleich zu anderen Säugern, eine hohe Analogie mit den

Menisken bewegungsarmer Haustierformen wie Schaf oder Schwein auf [19-20].

Menisken gehören zu den Binde- und Stützgeweben. Sie bestehen aus Wasser und einem speziellen

Zelltyp, den Meniskusfibrochondrocyten, welche von einer selbst synthetisierten, hochspezialisierten

extrazellulären Matrix aus Kollagen und Proteglykanen umgeben sind [1]. Im Gegensatz zu allen

weiteren Knorpelgeweben sind die Menisken ebenso wie der Gelenkknorpel, nicht von einer

Knorpelhaut, dem Perichondrium, umgeben [5, 7]. Neben den faserknorpeligen Menisken kommen

im Körper zwei weitere Knorpeltypen vor: hyaliner Knorpel und elastischer Knorpel [7].

Im lateralen und im medialen Kompartiment des Kniegelenks liegen zwischen dem Tibiaplateau und

den Femurkondylen die beiden halbmond-, im Querschnitt keilförmigen Menisken, siehe Abbildung

1.

Abbildung 1: Links: Anteriore Ansicht des Kniegelenks. Rechts: Ansicht von Oben auf das Tibiaplateau. Lage der

Menisken im Kniegelenk zwischen Tibia und Femur. Die kreuzend verlaufenden Bänder stabilisieren das

Kniegelenk. Aus [1].

Die Menisken bedecken etwa 70 % der Gelenkfläche. Im Gelenkspalt liegen sie, nur am Vorderhorn

und am Hinterhorn, sowie lateral durch Verwachsung mit der Synovialmembran fixiert und dennoch

Stand des Wissens

Seite 4

flexibel beweglich, vor [1]. Sie gleichen die Inkongruenz der Gelenkoberflächen aus, vergrößern die

Druckübertragungsfläche und sorgen für eine gleichmäßige Belastungsverteilung und

Druckübertragung [21]. Neben der Stabilisierung des Kniegelenkes dienen sie auch der

Stoßabsorption und damit der Dämpfung [22-23]. Etwa 55 % der auftretenden Belastungen des

Kniegelenkes werden durch die Menisken übertragen, wodurch die Kompressionskräfte und

Scherkräfte auf den Gelenkknorpel und den subchondralen Knochen vermindert werden [24-26].

2.1.1 Embryonalentwicklung des Meniskus

Embryologisch bilden sich die Menisken aus undifferenziertem, mesenchymalem Füllgewebe. Im

Fötus lassen sie sich bereits ab der 8. Woche als Kondensation mesenchymaler Zellen innerhalb des

Kniegelenks nachweisen [5, 20]. Zu diesem Zeitpunkt bestehen die Menisken größtenteils aus

Fibroblasten mit einem geringen Anteil an extrazellulärer Matrix und haben bereits den Kontakt zu

den Gelenkfortsätzen (Kondylen) weitgehend verloren. Mit Beginn der ersten Willkürbewegungen

des embryonalen Kniegelenks ab dem 3. Monat erfolgt die weitere Ausdifferenzierung des Gewebes.

Im Zuge fortschreitender Embryonalentwicklung nimmt der Kollagenanteil der extrazellulären Matrix

zu und die gerichtete Orientierung der Kollagenfasern bildet sich aufgrund mechanischer Stimuli

durch Bewegungen des Kniegelenks aus [5, 27-28]. Diese einzigartige Orientierung der

Kollagenfasern gibt dem Meniskus seine charakteristischen Materialeigenschaften.

2.1.2 Vaskularisierung und Meniskusstruktur

Im Gegensatz zu nicht vaskularisiertem hyalinem und elastischem Knorpel sind die Menisken

zunächst nach der Geburt noch vollständig vaskularisiert. Die Vaskularisation der Menisken findet

über die Gefäße der Gelenkkapsel statt, die zentripetal die Menisken durchsetzen. Ab dem zweiten

Lebensjahr bildet sich eine avaskuläre Zone, bis beim Erwachsenen nur noch etwa 10-30 % des

lateralen, mit der Synovia verwachsenen Bereiches des Meniskusgewebes vaskularisiert sind.

Aufgrund der Vaskularisierung erfolgt die zonale Einteilung des Meniskus eines Erwachsenen, siehe

Abbildung 2. Die gut vaskularisierte, kapselnahe rot-rote Zone, die wenig vaskularisierte, mittlere

rot-weiße-Zone und die zentrale, avaskuläre weiß-weiße-Zone [1, 4, 29].

Stand des Wissens

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Abbildung 2: Schematische Darstellung der Vaskularisierung und zonalen Einteilung des Meniskus. R-R: rot-rote

Zone (gut vaskulariert); R-W: rot-weiße Zone (schwach vaskularisiert); W-W: weiß-weiße Zone (avaskulär). Die

Synovia ist nicht dargestellt. Aus [29].

Um die Funktionen im Kniegelenk erfüllen zu können, besitzt der Meniskus eine einzigartige

dreidimensionale Struktur und Orientierung der Kollagenfasern. Abbildung 3 zeigt schematisch die

strukturelle, dreidimensionale Anordnung des Kollagennetzwerkes.

Abbildung 3: Synoptische Darstellung der dreidimensionalen Kollagenstruktur des Meniskus im Querschnitt. (1)

superfizielle Schicht, (2) lamellare Schicht, (3) innere Schicht aus circumferentialen Kollagenfaserbündeln. Aus

[30].

Man unterscheidet drei verschiedene Schichten im Grundaufbau der Menisken. Die superfizielle

Schicht auf der tibialen und femoralen Seite des Meniskus besteht aus einer dünnen, dicht gepackten

Schicht zufällig angeordneter dünner Kollagenfasern. Daran schließt sich direkt eine lamellare Schicht

aus zufällig orientierten Kollagenfasern an, wobei in den periphären, anterioren und posterioren

3 2 1

3

2

1

Stand des Wissens

Seite 6

Bereichen die Fasern radiär orientiert sind. Die inneren Bereiche des Meniskuskörpers bestehen aus

circumferential verlaufenden Fasern mit einem kleinen Teil radiär verlaufender Verbindungsfasern

[30-31].

2.2 Extrazelluläre Matrix des Meniskus

Meniskusgewebe kann, wie jedes Gewebe, als Kompositmaterial mit einer Flüssigphase, bestehend

aus Wasser und Elektrolyten, und einer Festphase, die extrazelluläre Matrix (EZM) bestehend aus

Kollagen, Proteoglykanen (PG), Glykosaminogylkanen (GAG) und nichtkollagenen Proteinen

angesehen werden [7]. Abbildung 4 gibt einen schematischen Überblick über zelluläre Komponenten

und Matrixkomponenten des Meniskus.

Abbildung 4: Schematisches Diagramm zur Darstellung der zellulären Komponenten und der

Matrixkomponenten von Meniskusgewebe. O: äußere Zone (rot-rot); I: innere Zonen (rot-weiße und

weiß-weiße Zone); S: Superfizielle Schicht. Modifiziert nach [3].

Biochemische Analysen zeigen, dass die EZM des humanen Meniskus zu ca. 72 % aus Wasser und ca.

26-27 % aus organischer Substanz besteht [32]. Die verbleibenden 1-2 % des Meniskusgewebes

bestehen aus Meniskuszellen. Bezogen auf die Trockenmasse macht Kollagen mit ca. 90 %, gefolgt

von GAG (ca. 0,8 %), Elastin (< 1 %) und Adhäsionsglykoproteinen (< 1 %) den Hauptbestandteil der

EZM aus [1, 4, 6]. Mit unter 1 % sind Adhäsionsglykoproteine unentbehrliche Bestandteile der EZM,

da sie als Verbindung zwischen EZM Komponenten und den Zellen fungieren. Im humanen Meniskus

sind Fibronektin, Thrombospondin und Kollagen Typ VI die wichtigsten Adhäsionsglykoproteine [6,

33].

Stand des Wissens

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In der Literatur werden von Alter und Spezies abhängig leicht variierende Werte für die

Zusammensetzung der EZM des Meniskus angegebenen [32, 34-35]. Nakano et al. geben für porcines

Meniskusgewebe, bezogen auf die Trockenmasse, einen GAG-Gehalt von 2-3 % und einen

Kollagengehalt von 76-93 % an [36]. Ungeachtet leicht variierender Werte weisen humanes, bovines,

ovines und porcines Meniskusgewebe sowohl strukturell als auch hinsichtlich der Zusammensetzung

der EZM eine sehr hohe Analogie auf [35].

2.2.1 Kollagene des Meniskus

Auf Grund von Struktur und biologischer Funktion werden die Kollagene, die am häufigsten

vorkommenden Strukturproteine des Körpers grob in zwei Klassen unterteilt: Fibrillen bildendende

Kollagene und Netz bildende Kollagene [37]. Mindestens 20 unterschiedliche Kollagentypen mit

wenigstens 38 genetisch unterschiedlichen α-Polypeptidketten wurden bisher identifiziert [7]. Der

häufigste Kollagentyp, Typ I [38] ist in Knochen, Haut, Faserknorpel, Perikard, Bändern, Sehnen und

einigen weiteren Geweben zu finden. Danach ist Kollagen Typ II, welches ausschließlich in

Knorpelgewebe vorkommt, der zweithäufigste Kollagentyp [39].

Mit einem Anteil von bis zu 90 % bezogen auf die Trockenmasse stellt Kollagen die wichtigste

fibrilläre Komponente der EZM des Meniskus dar [1, 35]. Die Kollagenfibrillen haben im

Meniskusgewebe zwei primäre Funktionen. Die Zugfestigkeit und Stärke des Meniskus, essentiell für

die Funktion im Kniegelenk (siehe Kapitel 2.1) beruht auf dem hohen Kollagengehalt und der

einzigartigen Kollagenstruktur. Ferner fungiert das Kollagennetzwerk als Antagonist zu dem

Schwelldruck, hervorgerufen durch die hohe Wasserbindefähigkeit der in das Kollagennetzwerk

eingebetteten Proteoglykane [7].

Im Meniskus kommen verschiedene Kollagen Typen (Typ I, II, III, IV, V, VI, XVIII und weitere) vor,

wobei variierende Anteile in den verschiedenen Zonen des Gewebes zu finden sind. In

Meniskusgewebe dominiert Kollagen Typ I [4]. Hieraus resultieren die fibrösen und knorpeligen

Eigenschaften des Meniskus [2]. In Tabelle 1 ist eine Zusammenfassung der Fibrillen bildenden

Kollagentypen des Meniskus aufgeführt.

Stand des Wissens

Seite 8

Tabelle 1: Zusammenfassung der fibrillen bildenden Kollagentypen des Meniskus und der jeweiligen -

Polypeptidketten. Aus [7].

Kollagentyp Organisation der -Polypetidketten

Typ I

Typ II

Typ V

Typ VI

Typ IX

Typ X

Typ XI

[α1(I)]2 α2(II)

[α1(II)]3

[α1(V)]2 α2(V)

α1(VI) α2(VI) α3(VI)

α1(IX) α2(IX) α3(IX)

[α1(X)]3

α1(XI) α2(XI) α3(XI)

Für bovines Meniskusgewebe konnten Cheung et al zeigen, dass in der rot-roten Zone Kollagen Typ I

mit annähernd 80 % (bezogen auf das Trockengewicht) dominiert. Die weiteren Kollagentypen liegen

bei unter 1 %. In der weiß-weißen Zone liegt der Kollagengehalt bei ca. 70 % wovon 60 % auf

Kollagen Typ II und 40 % auf Kollagen Typ I entfallen [40].

2.2.2 Kollagenstruktur

Kollagen ist ein stabförmiges, hochgradig strukturell organisiertes Molekül. Jedes Kollagenmolekül

besteht aus drei parallelen, linksdrehenden etwa 1.000 Aminosäurereste umfassenden

α-Polypeptidketten, welche zu einer rechtsdrehenden Tripel-Helix zusammengelagert sind [41-42].

Die α-Polypetidketten weisen eine spezifische Wiederholungssequenz aus dem, je nach Kollagentyp,

variabel wiederkehrenden Muster des Tripeptids Gly-X-Y auf [37]. Glycin steht an jeder dritten

Position der -Polypeptidkette, Prolin ist häufig in X-Position und posttranslational entstandenes

Hydroxyprolin in Y - Position zu finden, wodurch das Triplett Gly-Pro-Hyp in der Aminosäuresequenz

der α-Ketten dominiert [42-44]. Das Auftreten von Glycin an jeder dritten Stelle sowie von Prolin,

Hydroxyprolin als auch Hydroxylysin ermöglicht die dichte Packung der unelastischen tripelhelikalen

Struktur wodurch die charakteristische Zugfestigkeit resultiert [45-47]. Die Ringstruktur von Prolin

und Hydroxyprolin halten die α-Ketten gestreckt, und nur Glycin kann als kleinste Aminosäure im

Zentrum der Tripelhelix liegen. Jede α-Kette besitzt am N- und C-terminalen Ende eine 25

Aminosäuren umfassende Telopeptidsequenz ohne tripelhelikale Konformation. Diese Telopeptide

spielen eine bisher nicht exakt bestimmte, aber wichtige Rolle bei der Fibrillenbildung [7].

Stand des Wissens

Seite 9

Abbildung 5: Struktureller Aufbau und Hierarchie von Kollagenfasern. Aus [48].

Die Fibrillenbildung erfolgt extrazellulär indem tripelhelikale Kollagenmoleküle weiter

polymerisieren. Kollagenfibrillen haben einen Durchmesser von 10 bis 200 nm, abhängig vom

Kollagentyp, und weisen eine typische, 67 nm D-Periodizität auf, welche durch die versetzte

Anordnung benachbarter Kollagenmoleküle entlang der Achse entsteht. Abbildung 5 zeigt den

strukturellen Aufbau und die Hierarche von Kollagenfasern. Stabilisiert werden Kollagenfibrillen

durch inter- und intramolekulare Wasser- und Wasserstoffbrücken und vor allem auch durch

kovalente intermolekulare cross-links.

2.2.3 Proteoglykane des Meniskus

Proteoglykane (PG) sind große, stark negativ geladene und hoch glykosilierte Moleküle. Neben

Kollagen stellen PG den Hauptbestandteil der EZM des Meniskus dar [7, 49]. Sie bestehen aus einem

zentralen Kernprotein an welches GAG-Seitenketten (Chondroitinsulfat und Keratansulfat) kovalent

gebunden sind, siehe Abbildung 6.

Aggrecan ist das häufigste, bedeutendste und am besten untersuchte PG in allen Knorpelgeweben

[50]. Aggrecan ist über ein link-Protein nicht kovalent durch Wasserstoffbrücken an Hyaluronsäure,

ebenfalls zu den GAG gehörend, gebunden und bildet so im Gewebe große Aggregate [50]. Durch die

negativ geladenen Sulfat- und Carboxylgruppen der GAG-Seitenketten der PG, welche 90 % der

Masse ausmachen, resultiert im Gewebe ein hoher osmotischer Schwelldruck der zu einem

Wassereinstrom in das Gewebe führt. Im Kollagennetzwerk resultiert so ein hyperhydratisiertes Gel,

welches dem Meniskus seine Elastizität verleiht [36, 51]. Den PG kommt damit eine wichtige

Funktion bei der Wasserretention und -aufnahme zu. Weiterhin übernehmen sie Aufgaben bei der

Elekrolytkontrolle [50].

Stand des Wissens

Seite 10

Abbildung 6: Schematische Darstellung der Lage und Interaktion von Aggrecan mit Chondrozyten und weiteren

Komponenten der extrazellulären Matrix [52].

Wie Abbildung 6 zeigt, besitzen verschiedene PG wie Decorin, Biglykan, Neurocan, Brevican, CD44,

etc. ferner auch wichtige Funktionen bei einer ganzen Reihe von Zell-MatrixInteraktionen. Als

-struktureller Bestandteil der EZM wirkt Aggrecan vermittelnd bei Zell-Zell- und bei

Zell-Matrix-Interaktionen. Co-Expression von Miniaggrecan und von link-Proteinen stabilisiert

Zell-Substrat Interaktionen [53]. Nach Zugabe von Hyaluronsäure in Gegenwart von Aggrecan konnte

bei Chondrozyten hohe Expressionsraten von link-Proteinen erhalten werden, wodurch die

Zelladhäsion verbessert wurde [50].

2.2.4 Glykosamioglykane

Glykosaminoglykane (GAG) sind lange, unverzweigte Polysaccharide aus wiederholenden

Disaccharid-Einheiten aus einer alternierenden Uronsäure und acetylierten Aminozuckern. Jede

Disaccharid-Einheit trägt ein bis drei negative Ladungen in Form von COO-/SO42--Gruppen. Abhängig

von den sich wiederholenden Disaccharid-Sequenzen und der Zahl und Lage der Sulfatreste erfolgt

die Einteilung in vier Hauptgruppen: (1) Chondroitinsulfat und Dermatansulfat, (2) Heparansulfat und

Heparin, (3) Keratansulfat und (4) Hyaluronsäure [52].

Chondroitinsulfat (20 kDa) besteht aus der sich wiederholenden Disaccharideinheit Glucuronsäure

und N-acetylgalactosamin mit einer Sulfatgruppe pro Disaccharid. Keratansulfat besteht aus der sich

Stand des Wissens

Seite 11

wiederholenden Disaccharideinheit Galaktose und N-acetylglucosamin, ebenfalls mit einer

Sulfatgruppe pro Disaccharid. Hyaluronsäure (102-104 kDa) ist nicht sulfatiert und ist aus sich

wiederholenden Disaccharideinheiten von N-acetylglucosamin und Glucuronsäure aufgebaut [52].

2.3 Meniskuszellen

Meniskusszellen sind ebenso wie Chondrozyten embryologisch mesodermalen Ursprungs (vergleiche

Kapitel 2.1.1) und ein hochspezialisierter, terminal differenzierter Zelltyp [7]. Morphologisch stellen

Meniskuszellen keine einheitliche Population dar und es sind ebenso wie bei der Kollagenstruktur

und der Zusammensetzung der EZM zonale Unterschiede vorhanden [54]. Zellen der oberflächlichen

Schichten besitzen eine oval bis fusiforme Morphologie (ähnlich den Fibroblasten), während Zellen

der tieferen Zonen rund bis polygonal erscheinen (ähnlich den Chondrozyten bspw. aus hyalinem

Knorpel). Aufgrund der gleichzeitigen Synthese von Kollagen Typ I (wie Fibroblasten) und von

Kollagen Typ II (wie Chondrozyten), siehe Kapitel 2.3.1, besitzen Meniskuszellen sowohl deutliche

Ähnlichkeiten mit Chondrozyten als auch mit Fibroblasten, da sie wie Fibroblasten überwiegend

Kollagen Typ I produzieren. Durch die dadurch entstandene Schwierigkeit der eindeutigen

Klassifikation hat sich terminologisch der Begriff Meniskusfibrochondrozyten (MFC) durchgesetzt um

dieser Einzigartigkeit Rechnung zu tragen. MFC weisen zonale Unterschiede in der Morphologie auf

und werden wie Chondrozyten von einer territorialen Matrix geschützt [4]. Es gibt drei

unterschiedliche Zelltypen welche während der Embryonalentwicklung zunächst auch zonal keine

morphologischen Unterschiede zeigen. Mit fortschreitender Entwicklung bilden sich phänotypisch

unterschiedliche Zellen aus, die zudem in Anzahl und topographischer Lokalisation variieren.

Abbildung 7 gibt einen Überblick über Einteilung und Lokalisation der MFC im humanen Meniskus.

Stand des Wissens

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Abbildung 7: Schematische Darstellung der regional variierenden Zellpopulationen des humanen Meniskus.

Rechts: Zellen im äußeren, vaskularisierten Bereichen (rot-rote Zone) sind spindelförmig mehr

fibroblasten-ähnlich, Zellen der rot-weißen und der weiß-weißen Zone sind chondrozyten--ähnlich, allerdings

phenotypisch unterschiedlich. Die Zellen der superfiziellen Schicht sind klein und rund. Aus [1].

Fibrochondrozyten aus dem inneren Bereich des Meniskus sind rund bis oval und zeigen eindeutig

zellassoziierte Matrix mit einem hohen perizellulären Proteoglykangehalt. Sie bilden überwiegend

Kollagen Typ I und auch zu einem geringeren Anteil Kollagen Typ II sowie Aggrecan. Im Vergleich

dazu bilden Chondrozyten aus hyalinem Knorpel nur Kollagen Typ II und Aggrecan [55].

Fibroblasten ähnliche Zellen weisen keine zellassoziierte Matrix auf und finden sich in den peripheren

Regionen des Meniskus. Dieser Zelltyp besitzt lange Zellfortsätze, mit welchen die Zellen

untereinander und in Kontakt mit der Matrix stehen [1]. Die dritte Zellpopulation im Meniskus

befindet sich in der superfiziellen Schicht, welche als "superficial zone meniscus cells“ bezeichnet

werden. Diese Zellen besitzen keine Zellfortsätze und sind von ovaler, spindelartiger Form. Van der

Bracht et al. gehen davon aus, dass in dieser Zone möglicherweise spezielle Progenitorzellen mit

regenerativem Potential zu finden sind, da sie aus diesem Bereich CD 34 positive Zellen nachweisen

konnten welche ebenfalls in der vaskularisierten Zone des Meniskus gefunden wurden und mit

Gewebehomöostase und Regeneration in Verbindung gebracht werden [1-2].

2.3.1 Kollagensynthese

Im endoplasmatischen Retikulum (ER) der Zelle werden die Kollagen α-Ketten als präpro-α-Ketten

synthetisiert. Nach Abspaltung von Signalpeptiden erfolgen komplexe posttranslationale

Modifizierungen des Prokollagens, wie die enzymatische Hydroxylierung von Prolin und Lysinresten

mit Ascorbat als essentiellem Reduktionsmittel und Co-Faktor [42, 56-57]. Die Zusammenlagerung

Stand des Wissens

Seite 13

von drei α-Ketten zu einer Tripelhelix findet im Lumen des ER statt, am C-Terminus beginnend und

zum N-Terminus fortschreitend. Währenddessen werden auch inter- und intramolekulare

Disulfidbindungen gebildet. Abbildung 8 zeigt schematisch die intrazelluläre Bildung von Prokollagen

und die extrazelluläre Entstehung einer Kollagenfibrille aus Tropokollagen.

Abbildung 8: Schematische Darstellung der intrazellulären Bildung von Prokollagen und der extrazellulären

Entstehung einer Kollagenfibrille aus Tropokollagen. Aus [48].

Nach Bildung der Tripelhelix wird das Prokollagen über Exozytose in den Extarzellularraum sezerniert,

wo die C- und N-terminalen Propeptide abgespalten werden. Durch self-assembly lagern sich die

Kollagenmoleküle zu Fibrillen zusammen, wobei die Fibrillen über kovalente cross-links verstärkt

werden [58]. Für die Ausbildung kovalenter cross-links werden zwei Wege beschrieben.

Posttranslational werden spezifische Lysinreste durch die Lysyl-Hydroxylase hydroxyliert, woraufhin

Aldehyde gebildet, oder aber Aldehyde werden aus Lysinresten durch die Lysyl-Oxidase gebildet

werden. Art, Bildungsweg und Anzahl der cross-links des Kollagens sind wichtig für die physikalischen

und mechanischen Eigenschaften eines Gewebes und damit letztlich auch des Meniskus [7, 59-60].

2.3.2 Proteoglykansynthese

Neben Kollagen sowie weiteren, die Zellen umgebenden EZM Komponenten werden von

Meniskusfibrochondrozyten (siehe Kapitel 2.3) auch die Proteoglykanmoleküle der EZM synthetisiert.

Stand des Wissens

Seite 14

Die Synthese von Aggrecan, vereinfacht schematisch dargestellt in Abbildung 9, gehört zu den am

besten untersuchten [7, 50].

Abbildung 9: Schematische Darstellung der Synthese von Proteoglykanmolekülen, Hyaluronsäure und

link-Proteinen durch Chondrozyten und der extrazellulären Zusammenlagerung [61].

Das Kernprotein wird über den normalen sekretorischen Weg im endoplasmatischen Retikulum in

dem Oligosaccharide addiert und GAG Ketten initiiert werden ausgeschleust. Über den Golgi-Apparat

wird dann das Kernprotein weitergeleitet, wo weitere Elongationen und komplexe posttranslationale

Modifizierungen der GAG Ketten stattfinden. Spezifische Serinreste werden an lange GAG Ketten

gebunden. Diese Ketten werden dann durch eine Sulfotransferase sulfatiert. Nach der Sulfatierung

wird das Aggrecanmolekül aus der Zelle ausgeschleust. Die Zusammenlagerung der Polysaccharid

Ketten erfolgt durch sequentielle Aktivität verschiedener Glycosyltransferasen nach keinem

festgelegten Mechanismus und ohne direkte genomische Kontrolle [7].

Nach der Sekretion von Aggrecan hängt die Bildung höherer Aggregate von der Hyaluronsäure- und

link-Protein Synthese ab. Wie bereits in Kapitel 2.2.3 beschrieben, bestehen zwischen der Synthese

von Aggrecan, Hyaluronsäure und link-Proteinen komplexe Zusammenhänge die bisher noch nicht

vollständig untersucht sind [50]. Obwohl das link-Protein, Aggrecan und Hyaluronsäure Produkte

unterschiedlicher Gene sind, werden sie doch meist parallel synthetisiert, wobei die Synthese von

der Zelle unabhängig regulierte werden kann. Die Zusammenlagerung von link-Protein, Aggrecan und

Hyaluronsäure erfolgt extrazellulär, vermutlich unter Einbeziehung von Bereichen abseits der

perizellulären Matrix [7, 61]. Die Synthese und Expression von Aggrecan geht mit dem Erhalt des

Stand des Wissens

Seite 15

gewebespezifischen Phänotyps einher und gilt als Biomarker für den Differenzierungszustand von

Knorpelzellen [7, 61-62].

2.3.3 Zellrezeptoren und Zelloberflächenstrukturen

Entscheidend für Zelladhäsion, Gewebebildung, Integrität sowie Regeneration, auch in Bezug auf

Tissue Engineering Applikationen, ist die Interaktion von Zellen mit der sie umgebenden EZM. Wie

alle Zelltypen besitzen auch Meniskusfibrochondrozyten Zelloberflächenrezeptoren über welche sie

mit der sie umgebenden EZM interagieren. Durch diese Interaktionen können die Zellen

Veränderungen in der EZM, etwa Deformationen durch mechanische Stimuli oder auch Änderungen

der Zusammensetzung, verursacht durch Abbau bzw. Degeneration der Matrix, wahrnehmen [7].

Man geht davon aus, dass sich Chondrozyten aufgrund der niedrigen metabolischen Aktivität nur bis

zu einem bestimmten Grad an Veränderungen anpassen können. Aus diesem Grund ist das

Regenerationsvermögen von Knorpelgewebe stark eingeschränkt, Läsionen heilen nicht und führen

zu einer beeinträchtigten Funktionalität des Gewebes [7]. Es ist anzunehmen, dass diese Aussage

bezüglich Zellen aus hyalinem Knorpel auch auf Meniskuszellen und Meniskusgewebe zutrifft.

Grundsätzlich werden zwei Gruppen von Zellrezeptoren für die Matrixinteraktion unterschieden:

Nicht-Integrine und Integrin-Rezeptoren. Neben den Rezeptoren für Matrixinteraktionen sind auf

bovinen MFC eine Reihe weiterer immunphänotypischer Oberflächenmerkmale (Epitope), allen

voran die cluster of differentiation (CD-Moleküle), oder im Fall tierischer Zellen bspw. α-Galaktosyl

Epitope (siehe Kapitel 2.3.3.3) vorhanden.

2.3.3.1 Nicht-Integrin Rezeptoren

Zu dieser Gruppe gehören Proteoglykane, die cluster of differentiation CD 36 und CD 44, Annexin

sowie einige Laminin-bindende Proteine, wobei die Proteoglykane der Syndekan Familie und CD 44

am besten untersucht sind. Proteoglykane der Syndekan Familie sind Transmembranproteoglykane

bestehend aus einer zytoplasmatischen Domäne, einer hydrophoben Membranregion und aus einer

variablen extrazellulären Domäne [63]. Die Variabilität der extrazelluläre Domäne beruht auf

unterschiedlichen GAG-Seitenketten (Chondroitinsulfat und Keratansulfat) und ist hauptsächlich für

die Unterschiede innerhalb der Syndekan Gruppe verantwortlich [64]. Neben der Fähigkeit an

Kollagen, Fibronektin und Thrombospondin zu binden, können diese Rezeptoren zusätzlich

Wachstumsfaktoren binden [65]. Diese Kolokalisation der Bindung von EZM Molekülen und von

Wachstumsfaktoren ermöglicht Rezeptoren der Syndekan Familie Signalkomplexe mit anderen

Rezeptoren zu kombinieren [63].

CD 44, ein Glykoprotein der Zelloberfläche, ist neben der Bindung an Kollagen Typ I und Kollagen

Typ II der wichtigste Rezeptor für Hyaluronsäure (HA). Somit ist CD 44 für die Interaktion von

Stand des Wissens

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Chondrozyten mit der EZM und für die Retention von Proteoglykanaggregaten in die Matrix

entscheidend [66]. Für eine anschauliche Darstellung der Lage und Funktion von CD 44 siehe

Abbildung 6, Kapitel 2.2.3.

Annexin V ist ein Oberflächenrezeptor bei Chondrozyten, der an die Telopeptidregion und das

C-Propeptid von Kollagen Typ II bindet [67]. Zudem kann er mit Kollagen Typ X interagieren. Es wird

angenommen, dass Annexin V als Rezeptor zur Mechanotransduktion fungiert [68].

2.3.3.2 Integrin Rezeptoren

Integrine gehören zu einer großen Familie von Glykoproteinen. Sie sind heterodimere Rezeptoren für

adhäsive Proteine, die eine Vielzahl verschiedener Funktionen beeinflussen. Jedes Integrin Molekül

besteht aus einer alpha und einer beta Untereinheit und weist eine intrazelluläre sowie eine

extrazelluläre Domäne auf. Vermittelt durch die extrazelluläre Domäne erkennen Integrine eine

Vielzahl von EZM Proteinen, wie Kollagen, Fibronektin, Thrombospondin und Laminin des Knorpels.

Die intrazelluläre Domäne interagiert mit intrazellulären Signalmolekülen und dem Zytoskelett. Durch

diese Besonderheiten können Integrine Signale in beide Richtungen, intrazellulär als auch

extrazellulär weiterleiten und fungieren somit als wichtige Brücke zwischen der EZM und

intrazellulären Signalwegen [7]. Chondrozyten exprimieren eine ganze Reihe verschiedener Integrine

für die Bindung an die EZM. Über α1β1, α2β1 und α10β1 Integrine vermittelt, adhärieren

Chondrozyten beispielsweise an Kollagen Typ II und Kollagen Typ VI der EZM [69]. Das

Expressionsmuster von Integrinen kann durch verschiedene Wachstumsfaktoren wie insulin-like

growth factor (IGF-I) und transforming growth factor-β (TGF-β) reguliert werden [69].

2.3.3.3 Alpha-Galaktosyl Epitope

Alpha-Galaktosyl (α-Gal) Epitope (Galα1-Galβ1-4Glc NAc-R oder Galα1-3Galβ1-3Glc NAc-R) sind

einzigartige Kohlenhydratstrukturen, welche im Menschen und in Menschenaffen fehlen. Sie werden

normalerweise aus Glykolipiden und Glykoproteinen in Neuweltaffen, Prosimiae und bei allen

nicht-primaten Mammaliern durch das Enzym α-1-3 galaktosyltransferase (α-1,3 GT) synthetisiert.

Als Zelloberflächenstrukturen werden die α-Gal Epitope, siehe Abbildung 10 (rote Markierung), auf

der Zellmembran von Zellen aller Gewebe, auch des Meniskus, exprimiert. Es wurden zwei Typen von

α-Gal Epitope beschrieben welche sich lediglich in der Art der glykosidischen Bindung (β1-2 bzw.

β1-3) entweder an Stickstoff gebundene Kohlenhydratketten (Abbildung 10 links) oder

Glycolipid-Ceramid (Abbildung 10 rechts) gebundene Pentahexoside unterscheiden. Dabei besteht

aufgrund der unterschiedlichen Bindung kein Unterschied hinsichtlich der Immunogenität [70]. In

Menschen, Menschenaffen und Altweltaffen fehlen α-Gal Epitope vollständig aufgrund einer

Inaktivierung des Gens der α-1,3 GT im Lauf der Evolution. Stattdessen finden sich im Serum von

Stand des Wissens

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Menschen natürlicherweise vorkommende Immunglobuline IgM und IgA Isotypen von anti-Gal

Antikörpern [71-73]. Diese anti-Gal Antikörper machen etwa 1 % der zirkulierenden Immunglobuline

aus und reagieren hochspezifisch mit α-Gal Epitopen [72].

Abbildung 10: Struktur von alpha-Gal Epitopen auf N-gebundenen Kohlenhydratketten mammaler

Glykoproteine (links) und auf Glykolipiden (rechts). Modifiziert aus [70].

Das Vorkommen natürlicher anti-Gal Antikörper mit hoher Spezifität sowie die Expression von α-Gal

Epitopen auf Zellen aller Gewebe lassen diesen Kohlenhydratstrukturen eine besondere klinische

Bedeutung bei der Transplantation xenogener Gewebe und Organe zukommen [72, 74]. Bereits 1998

konnte von Stone gezeigt werden, dass die Implantation nicht dezellularisierten, porcinen

Meniskusgewebes in Makaken zu einer vielfachen Erhöhung der anti-Gal Aktivität und einer starken

entzündlichen, zellulären Reaktion von T-Lymphozyten und Makrophagen innerhalb der Implantate

führte [74]. Solche hyperakuten oder chronischen Abstoßungsreaktionen stellen eine zu beachtende

Barriere bei der Verwendung porcinen Gewebes als Bioimplantat dar [70, 72, 74].

2.3.4 Biochemische Stimuli

Für die Knorpelbildung sind neben chondrokonduktiven Trägermaterialien vor allem auch

chondroinduktive Stimuli durch nicht gebundene, lösliche Substanzen wie bspw. Wachstumsfaktoren

und Metabolismus steigernde Substanzen ausschlaggebend. Schumann definierte

Stand des Wissens

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Chondroinduktivität wie folgt: "Chondroinduktivität beschreibt die Eigenschaft einer nicht

gebundenen Substanz die Knorpelbildung positiv zu beeinflussen" [75]. Wird diese Definition zu

Grunde gelegt, können somit alle Wachstumsfaktoren, Hormone sowie weitere, die Knorpelbildung

verbessernden Substanzen wie Insulin, Dexamethason, L-Prolin, Na-Ascorbat, Na-Pyruvat etc. als

chondroinduktiv bezeichnet werden. Wachstumsfaktoren und Hormone haben verschiedenste

Auswirkungen auf Zellproliferation, -differenzierung und Matrixsynthese von Chondrozyten. Sie

kontrollieren den Metabolismus von Chondrozyten und beeinflussen somit auf autokrine oder

parakrine Weise durch anabole oder katabole Effekte die Knorpelhomöostase [76-78].

2.3.4.1 Wachstumsfaktoren

Wachstumsfaktoren sind die bedeutendsten biochemischen Stimuli für Meniskusfibrochondrozyten.

Eine enorme Vielzahl von Arbeiten beschäftigen sich mit den Effekten unterschiedlicher

Wachstumsfaktoren auf Meniskusfibrochondrozyten bei unterschiedlichen Kulturbedingungen [1-2,

16, 79]. Tabelle 2 gibt die ausgeübten Effekte ausgewählter Wachstumsfaktoren auf MFC

verschiedener Spezies (bovin, human, ovin, leporin) sowie die der Untersuchung zu Grunde

liegenden Kulturbedingungen (Monolayer = zweidimensional, auf einem Scaffold oder

Gewebeexplantat = dreidimensional) wieder.

Stand des Wissens

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Tabelle 2: Überblick über ausgewählte Wachstumsfaktoren und die auf Meniskuszellen ausgeübten Effekte der

Wachstumsfaktoren. Aus [1]. ↑ beschreibt einen positiven Effekt = Steigerung; ↓ beschreibt einen negativen

Effekt = Verringerung.

Wachstums- faktor

Effekt Kulturbedingungen

TGF-β

Proliferation ↑↓

Kollagensynthese ↑↑

GAG/Proteoglykan Synthese ↑↑

SZP Sekretion ↑

Kontraktion ↑

Monolayer

Monolayer, +Scaffold, -Scaffold; Explantat

Monolayer, +Scaffold, -Scaffold; Explantat

Monolayer, Scaffold

Scaffold

B-FGF Proliferation ↑↑↑

Kollagensynthese ↑

GAG/Proteoglykan Synthese ↑

Monolayer, Scaffold

Monolayer, Scaffold

Monolayer, Scaffold

PDGF-AB

Proliferation ↑↑



Kontraktion ↑

Migration ↑↑

Monolayer, Scaffold, Explantat

Monolayer, Scaffold

Monolayer, Explantat

Scaffold


IGF-I

Proliferation ↑

Kollagensynthese ↑↓


Migration ↑

Monolayer, Scaffold

Monolayer, Scaffold

Explantat

Monolayer

EGF Proliferation ↑


Migration ↑

Monolayer

Monolayer

Monolayer

HGF Proliferation ↑↑

Migration ↑↑



In allen Fällen zielt die Verwendung anaboler Wachstumsfaktoren im Bereich des Meniskus Tissue

Engineering auf die Stimulation von Meniskuszellen zur Proliferation, Migration und hauptsächlich

auf die de novo Synthese extrazellulärer Matrix ab. Die zentrale Wirkung anaboler

Wachstumsfaktoren ist daher die Erhaltung des spezifischen Phänotyps sowie des spezifischen

Differenzierungszustandes unter in vitro Bedingungen [1]. Weniger Beachtung bei der Kultivierung

von Meniskuszellen oder Chondrozyten findet die Verwendung von Wachstumsfaktoren mit

kataboler Wirkung, wie beispielsweise Interleukin-1 (IL-1), tumor necrosis factor α (TNF-α), IL-17,

IL-18 und leukemia inhibitory factor (LIF). IL-6 kann sowohl anabole als auch katabole Effekte haben.

Katabol wirkende Wachstumsfaktoren werden zumeist nur mit degenerativen Veränderungen von

Knorpelgewebe in Verbindung gebracht [7].

Stand des Wissens

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2.3.4.2 Chondroinduktive Stimuli

Neben den in Kapitel 2.3.4.1 vorgestellten Wachstumsfaktoren bedarf eine langfristig erfolgreiche in

vitro Kultivierung von Zellen aus Knorpelgewebe einer Reihe weiterer chondroinduktiver Stimuli [80-

81]. Besondere Beachtung bei der in vitro Kultivierung von Meniskuszellen (wie auch bei

Chondrozyten) liegt auf Erhalt oder Rückerlangung eines gewebetypischen

Differenzierungszustandes sowie der Neusynthese knorpelspezifischer extrazellulärer Matrix [1, 82-

83]. So sind für die Kollagensynthese der Zusatz von L-Prolin als Basis für die Hydroxyprolinbildung

und von Na-Ascorbat als Reduktionsmittel und Cofaktor zur Bildung von Hydroxyprolin bedeutsam

[57]. Na-Pyruvat dient als leicht verfügbare, zusätzliche Energiequelle. Das Hormon Insulin bewirkt

aufgrund seiner Effekte im Bereich des Zellmetabolismus bei der Regulation von Transkription und

Translation von mehr als 2.000 Genen [84] sowie als Schlüsselenzym im Kohlenhydratstoffwechsel

eine gesteigerte Metabolisierungsrate und damit Biosynthese [76] auch bei Knorpelzellen. Weiterhin

ist auch Dexamethason aufgrund seiner vielfältigen molekularen, genomischen und

nichtgenomischen Wirkung beispielsweise durch Eingreifen in die Signaltransduktion bei

Transkriptionsfaktoren für den Metabolismus und die Biosynthese bedeutsam [77-78].

2.3.5 Interaktion von Meniskuszellen mit Komponenten der extrazellulären Matrix

Neben synthetischen Matrizes werden für den Meniskusersatz überwiegend Matrizes biologischen

Ursprungs, hauptsächlich aus Komponenten der extrazellulären Matrix eingesetzt. Studien haben

gezeigt, dass verschiedenste zelluläre Reaktionen abhängig von der Zusammensetzung der

umgebenden EZM ausgelöst werden können [3]. Eine steigende Zahl von Hinweisen zeigt zudem,

dass über dynamische Interaktionen von Meniskuszellen mit Wachstumsfaktoren auch die

Mikrostruktur des verwendeten Matrixmaterials eine essentielle Rolle bei der Regulation des

Verhaltens der Zellen auf der jeweiligen Matrix spielt [63, 85-86]. Dabei sind vor allem EZM

Bestandteile nativen Gewebes, wie Kollagen Typ I und Typ II, sowie die Glykosaminoglykane

Hyaluronsäure (HA) und Chondroitinsulfat (CS), auch in Kombination zu nennen.

In vivo Studien zeigten bei intraartikulärer Injektion von Hyaluronsäure nach Meniskusläsionen einen

positiven therapeutischen Effekt, dessen exakter Mechanismus bisher allerdings unklar ist [87-88].

Vermutlich beruht dieser Effekt überwiegend auf der Eigenschaft von HA die viscoelastischen

Eigenschaften der Synovialflüssigkeit zu bestimmen [89]. Freymann et al. konnten in vitro zeigen,

dass hohe HA Konzentrationen (25 %) in Verbindung mit humanem Serum (10 %) einen positiven

Effekt auf humane Meniskuszellen hinsichtlich meniskusspezifischer EZM-Bildung unter 3D

Bedingungen ausüben [90]. In vitro Studien mit humanen und ovinen Meniskuszellen zeigten leicht

gesteigerte mitogene Aktivität, und längerfristig (bis 28 d) jedoch eine reduzierte Wachstums- und

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Proliferationsrate sowie schlechte Zelladhäsion [3]. Obwohl kein direkter Vergleich zwischen den

einzelnen Studien vorhanden ist könnte man zu der Aussage verleitet werden, dass die Art und

Weise wie HA den Zellen zur Verfügung gestellt wird die zelluläre Antwort beeinflusst und

demzufolge die unterschiedliche Ergebnisse der verschiedenen Studien erklären kann [3].

Kollagen Typ I ist das weitest verbreitet und aufgrund seiner Verfügbarkeit sowie der einfachen

Wiederherstellung am besten untersuchte EZM Molekül. Neben seiner bedeutenden Funktion als

Strukturprotein spielt Kollagen Typ I eine wichtige Rolle bei der Zelladhäsion und Ausbreitung [63,

91]. Es enthält, wie auch Fibronectin oder Laminin, für die Zelladhäsion bedeutende

Erkennungssequenzen in Form spezifischer Aminosäuresequenzen (RGD: Arginin-Glycin-Asparagin)

[63]. Als Konsequenz hieraus und aufgrund seiner mechanischen Eigenschaften beeinflusst Kollagen

die Zelldifferenzierung und Zellbewegungen [92-94].

Kompositmatrizes aus Kollagen Typ I oder Typ II und Glykosaminoglykanen wie Hyaluronsäure oder

Chondroitinsulfat zeigen vielversprechende Eigenschaften, da ausgeprägte Zelladhäsion und

Neusynthese extrazellulärer Matrix beobachtet wurde. Ungeachtet unterschiedlicher

Zusammensetzungen der Kompositmatrizes aus verschiedenen Kollagentypen und Chondroitinsulfat,

Aggrecan oder Hyaluronsäure, ist es naheliegend die Reaktionen von Meniskuszellen einerseits auf

die Matrizes an sich aber auch wie Untersuchungen zeigen auf die Zusammensetzung der

Kompositmatrix zurückzuführen [3].

2.3.6 Zellmigration

Die Beweglichkeit von Zellen ist ein mehrstufiger, komplexer Prozess, welcher verschiedenste

physiologische Vorgänge und damit zusammenhängende Funktionen unter einer perfekten

Koordination erfordert [95]. Zellmigration spielt eine entscheidende Rolle bei vielen verschiedenen

biologischen Phänomenen. Bereits in der Embryogenese ist die Zellmigration ein wiederkehrendes

Thema bei morphogenetischen Prozessen während der Gastrulation bis zur Entwicklung von

Geweben, Organen und des Nervensystems [96]. Im Erwachsenenalter spielt die Zellmigration eine

essentielle Rolle bei der Angiogenese, Immunantworten und auch bei der Wund - und

Gewebeheilung nach Traumata [95]. Eine Deregulation der Zellmigration kann je nach Lokalisation

fortschreitende mentale Entwicklungsstörungen, Artherosklerosen oder metastasierende Tumoren

zur Folge haben [95].

Die exakten Mechanismen der Motilität spezifischer Zellen werden von der Genetik und der Summe

vieler externer Stimuli bestimmt. Sowohl die extrazelluläre Matrix als auch Wachstumsfaktoren und

gelöste Botenstoffe bieten der Zelle Signale, welche die Zellen über Rezeptoren und Kopplung

intrazellulärer Effektoren koordinieren [97-100]. Der Phosphoinositol-3-phosphat Weg (PI3K), die

Stand des Wissens

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mitogen activated protein kinase (MAPK) und Phospholipase C-ʎ kann neben einer Vielzahl weiterer

Nebenwege von Zellen selektiv genutzt werden um physikochemische Änderungen in der Zelle

hervorzurufen. Beispielsweise kann die Aktivierung von Myosin mittels Myosin-Kinase über das

Actinmyosin Skelett die Kontraktion von Zellen bewirken [101-103]. Auch das in einigen Zellen

vorkommende kontraktile α-smooth muscle actin spielt eine wichtige Rolle bei der Zellmigration

[104].

Das klassische Modell der Zellmigration auf zweidimensionalen Flächen beschreibt verschiedene

physikochemische Ereignisse:

1. Polarisation des Zellkörpers in Richtung des Stimulus in einen führenden und einen

folgenden Pol

2. Ausbildung von Lamellipodien am führenden Pol

3. Regulierung der Adhäsion am Substrat sowohl am führenden als auch am folgenden Pol.

4. Ablösung am folgenden Pol vom Substrat (Detachment)

5. Kontraktion des Zellkörpers

6. Adhäsion am folgenden Pol und Ablösung am führenden Pol um die Zelle vorwärts zu bringen

(Translokation)

7. Protrusion am führenden Pol und Adhäsion des führenden Pols [95, 105].

Eine schematische Darstellung des klassischen Modells der Zellmigration unter zweidimensionalen

Bedingungen ist in Abbildung 11 zu sehen.

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Abbildung 11: Schematische Darstellung des klassischen Modells einer unter zweidimensionalen Bedingungen

migrierenden Zelle. Aus [96].

In vivo müssen Zellen die Fähigkeit besitzen auch in einer dreidimensionalen (3D) Umgebung etwa

einer dicht gepackten extrazellulären Matrix zu migrieren. Die Mehrzahl der Studien zur Zellmigration

erfolgte unter zweidimensionalen Bedingungen. Das aufgestellte Modell der Actin-Polymerisation zur

Ausbildung von Lamellipodien ist jedoch nicht universell. Es repräsentiert nur einen von mehreren

Mechanismen der Zellmobilität in einer 3D Umgebung [106]. Die verschiedenen Modi der

Zellmigration in 3D sind stark von den physikalischen Eigenschaften der jeweiligen Matrix abhängig

und können je nach Bedingung zwischen unterschiedlichen Modi wechseln [106]. Morales beschreibt

prinzipiell zwei unterschiedliche Strategien der Zellmigration in dreidimensionalen Matrizes:

proteolytische Entfernung von Barrieren und amöboide Lokomotion [95].

Bei einigen Zellen und unter bestimmten Bedingungen besteht die Möglichkeit der Zellbewegungen

in dreidimensionalen Matrizes durch Sekretion proteolytischer Enzyme, wie MT1-MMP (aus der

Familie der Matrixmetalloproteasen) am führenden Pol [95, 107]. Durch enzymatischen Verdau

werden somit Migrationswege von der Zelle selbst frei gelegt.

Daneben scheinen Zellen auch Protease-unabhängige Mechanismen entwickelt zu haben um

Barrieren in dreidimensionalen Matrizes zu umgehen. Studien migrierender Zellen in 3D

Kollagenmatrizes zeigen die Mehrzahl der migrierenden Zellen entlang von Kollagenfibrillen [105,

108]. Fibbi et al. beschreiben beispielsweise Zellmigration von Chondrozyten in Kollagen Typ I

Matrizes bzw. auch in einem Kollagen Typ I Gel. Dabei dienen die Kollagenfibrillen als Substrat zur

Stand des Wissens

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Adhäsion und die Zelle, natürlich abhängig von Zelltyp und von der Art und den Eigenschaften der

Matrix, bewegt sich entlang der Fasern vergleichbar mit Bewegungen wie unter zweidimensionalen

Bedingungen fort. Von Kambic et al. wurde in einer in vivo Studie zu Meniskusersatz in einem

caninen Modell gezeigt, dass binnen einen Jahres nach Setzen eines Defektes und Reimplantation

des avitalisierten Explantats in das Meniskusgewebe dieses avitalisierte Explantat durch

Körpereigene Zellen revitalisiert wurde [104]. Unklar blieb die Herkunft der Zellen. Jedoch konnte

gezeigt werden, dass die Mehrzahl der eingewanderten Zellen den Marker für α-smooth muscle actin

exprimierten [104]. Kambic et al. beschreiben die Expression von α-smooth muscle actin als Beleg für

Regenerationsprozesse, was in diesem Fall die Einheilung des avitalisierten Implantats in das intakte

Meniskusgewebe anzeigen würde [104].

2.4 Meniskusverletzungen

Meniskusverletzungen gehören zu den häufigsten Folgen von Freizeit-, Sport- und

Arbeitsverletzungen. Traten Meniskusläsionen zunächst vor allem nach dem vierzigsten oder

fünfzigsten Lebensjahr bedingt durch degenerative Veränderungen auf, so sind in jüngerer Zeit

vermehrt auch Verletzungen bei jüngeren Personen (< 30 a) aufgrund immer neuer

Hochrisikosportarten zu beobachten. Aber auch bei älteren Personen treten aufgrund gesteigerter

Freizeitaktivität [4, 20, 109] häufiger Meniskusverletzungen auf. Nach Wirth et al. lassen sich

Meniskusverletzungen in verschiedene Formen einteilen [12]:

frische Unfallrisse (primär traumatisch)

aufgrund verminderter Widerstandsfähigkeit (degenerativ traumatisch)

rein degenerativ (Spontanlösung)

posttraumatische Spätschäden (sekundäre Degeneration)

Traumatische Verletzungen treten meist bei jüngeren Personen infolge indirekter Traumata im Alltag

auf. Im Gegensatz dazu treten spontane Läsionen ohne echte traumatische Anamnese bedingt durch

degenerative Veränderungen vor allem ab dem vierzigsten bis fünfzigsten Lebensjahr auf. Sekundäre

Meniskusschäden sind auf vorausgegangene Läsionen etwa der Kreuzbänder zurückzuführen, wobei

diese in allen Altersstufen auftreten können [12].

Eine akzeptierte Klassifikation von Meniskusverletzungen erfolgt aufgrund der Morphologie von

Meniskusrissen, welche aus systematischen Beobachtungen der operativ am häufigsten zu

beobachtenden Rissformen resultiert. Einen Überblick über die häufigsten Verletzungen zeigt

Abbildung 12.

Stand des Wissens

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Abbildung 12: Darstellung verschiedener Meniskusrisstypen: Längsriss, Korbhenkelriss, Radiärriss, Lappenriss,

Horizontalriss. Aus [110].

Aufgrund der fehlenden Spontanheilungsfähigkeit des Meniskus stellen daher alle in Abbildung 12

gezeigten Rissformen, natürlich abhängig von Schweregrad, potentielle Indikationen für Resektionen

und damit für einen notwendigen Gewebeersatz dar [110].

2.5 Therapieansätze bei Meniskusverletzungen

Erste Berichte zu Meniskustherapien datieren auf 1865/66. In diesen Berichten wird sowohl die

Behandlung von Meniskusverletzungen durch Meniskusresektionen als auch durch Meniskusnaht

beschrieben [12, 111]. Da Meniskusgewebe lange Zeit als funktionslos angesehen wurde, setzte sich

zunächst nur die Meniskektomie durch. Durch eine steigende Anzahl publizierter Spätergebnisse

nach Meniskektomien mit dem Ergebniss deutlich gesteigerter Arthroseraten wurde so die

Bedeutung der Menisken erkannt und die Forderung nach alternativen Therapiemethoden sowie die

Suche nach geeigneten Ersatzmaterialien gewann zunehmend an Bedeutung [1, 20, 111]. Aufgrund

dieser Entwicklungen fanden und finden bis in die Gegenwart in der klinischen Praxis bei

Meniskusläsionen je nach Einstufung der Verletzung verschiedene Therapieformen Anwendung.

Stand des Wissens

Seite 26

Bei der konservativen Meniskusbehandlung werden lediglich kleine Längsrisse im durchbluteten

Bereich des Meniskusgewebes durch Vernarbung ausheilen. Dazu sind eine Ruhigstellung des

Kniegelenks über vier Wochen sowie ein Gipsverband notwendig [12].

Die häufigsten Therapieformen bis in die 1960er Jahre sind die totale Meniskektomie, die Entfernung

des Meniskus einschließlich der durchbluteten Randzone, und die subtotale Meniskektomie unter

Erhalt der basalen Ansatzzone [12, 110].

Im Vergleich zu einer subtotalen Meniskektomie werden bei einer partiellen Meniskektomie nur im

Bereich der Läsion betroffene Gewebeanteile entfernt. Nicht betroffene Gebeabteile werden

bestmöglich erhalten [20, 111].

Wenig Beachtung fand bis etwa 1980 die Meniskusnaht. In diesem Verfahren wird eine Refixation vor

allem älterer, randständiger Längsrisse möglich. Eine steigende Anzahl klinischer Studien

dokumentieren die Möglichkeit der erfolgreichen Meniskusnaht [12].

Der aktuelle Trend in der Meniskustherapie liegt klar auf dem Erhalt des Gewebes, wann immer

möglich [11]. Doch trotz eines steten chirurgischen Fortschritts, besteht nur bei einer sehr geringen

Anzahl aller Läsionen die Möglichkeit einer konservativen Therapie oder der vollständigen

Gewebeerhaltung [111]. In der Mehrzahl aller Fälle sind Naht oder Resektionen geschädigten

Gewebes nötig [111-112]. Um im Falle von unvermeidbaren partiellen oder totalen Meniskektomien

gravierende konsekutive Spätfolgen zu vermeiden oder so weit wie möglich zu verzögern, ist die

Suche nach einem adäquaten Meniskusersatzmaterial Gegenstand vieler Forschungsarbeiten [1, 9,

16, 83, 113-114].

2.6 Meniskusersatzmaterialien

Da nicht jeder Meniskusriss gewebeerhaltend versorgt werden kann, steht bereits seit Ende des

zwanzigsten Jahrhunderts die Suche nach geeigneten Materialien für den Ersatz von

Meniskusgewebe im Fokus der Meniskustherapie [1, 10]. Der Meniskusersatz verfolgt im

Wesentlichen drei Ziele: Schmerzlinderung, Arthroseprävention und Wiederherstellung der

Gelenkbiomechanik [10]. Zur Verfügung stehen dabei autologe Spendergewebe, frische und

konservierte allogene Spendergewebe (nur in den USA), synthetische und biologische Polymere,

Hydrogele, trägermaterialfreie Implantate hergestellt durch Selbstorganisation geeigneter Zellen,

Komponenten extrazellulärer Matrix sowie gewebebasierte Materialien [1, 10].

Stand des Wissens

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2.6.1 Trägermaterialbasierte Ersatzmaterialien

Ein häufig verfolgter Ansatz ist die prinzipielle Möglichkeit Meniskusgewebe durch geeignete,

azelluläre dreidimensionale Matrizes oder Scaffolds, welche als Leitschiene für patienteneigene

Zellen nach Implantation dienen sollen zu ersetzen. Eine Erweiterung dieser Möglichkeit ist, diese

dreidimensionalen Matrizes vor Implantation mit geeigneten autologen oder allogenen Zellen in vitro

zu revitalisieren um ein vitales Implantatmaterial einzusetzen [1, 9, 16]. Man kann Matrizes in vier

große Klassen einteilen:

1. Synthetische Polymere

2. Hydrogele

3. Matrizes aus EZM Bestandteilen

4. Gewebebasierte Materialien

Synthetische Polymere, wie Polyurethan, Polycaprolactan, Polymilchsäure Polyglykolsäure und

Polymilch-co-glycolsäure bieten Vorteile, wie nahezu unbegrenzte Verfügbarkeit, die Möglichkeit der

Steuerung von Poren- und Fasergröße, der Geometrie und der mechanischen Eigenschaften. Die

Nachteile dieser Materialien liegen in der geringen intrinsischen Fähigkeit einer Wechselwirkung mit

dem Körper [115-117]. Künstliche Transplantate wie Dacron oder Teflon zeigen häufig

Materialversagen und eine Synovitis aufgrund von Abrieb [118]. Auch durch die Verwendung von mit

Meniskuszellen besetzten Trägermatrizes aus Fibrin, Polyglykolsäure oder Kollagen I und II konnte

kein dem natürlichen Meniskus mechanisch gleichwertiges Gewebe hergestellt werden [119-120].

Auch synthetische Hydrogele, wie poly-N-isopropyl Acrylamid oder natürliche Hydrogele wie Alginate

oder Polyvinyalkohol wurden auf ihre Eignung als Meniskusersatzmaterial hin untersucht. Aufgrund

des hohen Wassergehaltes (oft über 90 %), der Konsistenz und verschiedener Arten von cross-links

besitzen Hydrogele eine gelartige Konsistenz bei sehr geringer mechanischer Festigkeit. Oft wurden

Hydrogele in Verbindung mit Zellen und Wachstumsfaktoren untersucht [121-122]. Aufgrund der

mechanischen Eigenschaften (besonders die Federkraft) und der Bioaktivität (speziell in Bezug auf

Förderung von EZM Synthese und Erhalt eines spezifischen Phänotyps von Zellen) müssen Hydrogele

weiter verbessert werden [1].

Unter Matrizes aus EZM Bestandteilen werden Materialien, hergestellt aus Komponenten der EZM

wie Kollagen Typ I, Typ II oder Hyaluronsäure zusammengefasst. Für die Herstellung derartiger

Matrizes werden entsprechende Gewebe zunächst desintegriert, gereinigt und später Matrizes aus

den gereinigten Makromolekülen, auch in Kombination, geformt [1]. Durch das "Collagen Meniskus

Implantat" (CMI), auch Menaflex™ Implantat, haben Materialien aus EZM Bestandteilen klinisch die

meiste Aufmerksamkeit erhalten. Das CMI, hergestellt aus bovinen Achillessehnen, ist ein

dreidimensionales Netzwerk aus Kollagen Typ I welches in Form gepresst und mit Aldehyden

Stand des Wissens

Seite 28

quervernetzt wird [123-124]. Trotz anfänglich positiver Resultate weist die CMI Matrix signifikante

Nachteile auf. CMI stellt keine Option nach einer totalen Meniskektomie dar und auch die technisch

anspruchsvolle Verankerung des Implantats limitiert zusätzlich die Anwendung [1]. Zusätzlich wurden

nach Implantation Degeneration, Schrumpfung und Forminkongruenz der CMI Matrix beschrieben

[125-126]. Auch zeigten Untersuchungen im Tiermodell positivere Ergebnisse nach Implantation

wenn die CMI Matrix mit autologen Zellen vorbesiedelt wurde, obwohl die ursprüngliche Anwendung

ohne Vorbesiedelung beabsichtigt war [127]. Die US-FDA hat aufgrund eines unzureichenden

Nachweises der Wirksamkeit (FDA Report: "Review of the Regen Menaflex®: Departueres from

Process, Procedure, and Practices leave the basis for a review decision in question" 2010) am 14.

Oktober 2010 die Zulassung entzogen und das Produkt vom Markt genommen [1].

In einer letzten Kategorie für Meniskusersatzmaterialien können gewebebasierte Materialien

zusammengefasst werden. In dieser Kategorie werden prozessierte, vollständige Gewebe wie "small

intestinal submucosa" (SIS), frische oder konservierte allogene Spendergewebe, dezellularisierte

Gewebe oder EZM und auch Seide zusammengefasst. Die Hypothese bei der Verwendung derartiger

Materialien ist, dass sie ebenso wie Matrizes aus EZM Bestandteilen eine dem natürlichen System

sehr nahekommende Mikroumgebung für Zellbesiedelung Migration und Matrixbildung aufweisen

[1]. Besonders positiv kann bei gewebebasierte Materialien angesehen werden, dass diese häufig

eine hohe geometrische Ähnlichkeit und Bioaktivität aufweisen. Allerdings beeinflussen einige

Herstellungsmethoden die mechanische Integrität des Gewebes und auch die Verfügbarkeit ist nicht

immer gegeben [1].

Die Mehrzahl der genannten Möglichkeiten für Meniskusersatzmatrizes sind derzeit noch

Gegenstand von Forschungsarbeiten. In der klinischen Anwendung oder vermarktungsnahe ist nur

ein geringer Teil der bisher untersuchten Meniskusersatzmaterialien. Tabelle 3 listet

anwendungsnahe, bzw. in der klinischen Anwendung befindliche Meniskusersatzmaterialien auf.

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Tabelle 3: Anwendungsnahe, bzw. in der klinischen Anwendung befindliche Materialien für den

Meniskusersatz.

Hersteller Produkt Beschreibung Markt Kosten

Orteq® Sports

Medicine, London, UK

Actifit™ Aus PE

(resorbierbar) und

PU halbmondförmig,

konisch (wie CMI)

CE-

Konformitätszeichen

2008; Aufnahme in das

D-DRG-System

beantragt.

2000 €;

Nicht im D-DRG

(2011), aber

beantragt

ReGen Biologics,

Hackensak, NJ, USA;

nach Insolvenz (Mai

2011) Ivy Sports

Medicine GmbH,

Gräfelfing

Menaflex™,

CMI, oder

ReGen CS

(FDA),

früher

CMI®

Reines Kollagen I,

vernetzt und

verpresst.

CE-

Konformitätszeichen

2000;

FDA zog 2010 die

Zulassung von 2008

zurück

1.560 € (2007);

Im D-DRG-System

(5-812.c-f)

Active Implants, D NUsurface® Kevlar®-verstärktes

Polycarbonaturethan

(PCU)

Augenblicklich klinische

Studien;

Markteinführung 2015

Keine Angabe

RTI Biologics Allograft Prozessiertes

Allograft

Markteinführung 2011 $3.000 (2007)

Diverse Gewebebanken Allograft $3.000 –$ 4.000

CryoLife Inc., Marietta,

Ga, USA

Allograft Cryokonserv.

Allograft

Kürzlich vom Markt

genommen

Ehemals $4.900

(2007)

2.6.2 Trägermaterialfreie Selbstorganisation von Meniskusersatzgewebe

Das Paradigma des Tissue Engineering wurde traditionell immer als die Kombination von Zellen,

Zellstimuli (biochemisch und/oder mechanisch) und Trägermaterialien definiert. Die kombinierte

Anwendung dieser drei Elemente beschreibt den klassischen Ansatz der Geweberegeneration [1].

In den vergangenen Jahren wurde zudem an der Möglichkeit geforscht in vitro durch

Selbstorganisation und Matrixbildung geeigneter Zellen trägermaterialfreie Implantate für die

funktionelle Regeneration von Knorpel, Faserknorpel, Gefäßen und der Retina herzustellen [1].

Abbildung 13 zeigt vereinfacht die prinzipielle Vorgehensweise bei der Herstellung von

Meniskusersatzgewebe durch Selbstorganisation geeigneter Zellen.

Stand des Wissens

Seite 30

Abbildung 13: Vereinfachte schematische Darstellung der prinzipiellen Vorgehensweise bei der Herstellung

eines Meniskusersatzmaterials durch Selbstorganisation geeigneter Zellen. Modifiziert nach [1].

Für die Regeneration des Faserknorpels wie den Meniskus gehen einige Ansätze mittels

Selbstorganisation dazu über, Meniskusersatzmaterial mit quantifizierbaren mechanischen

Eigenschaften durch Kultivierung artikulärer Chondrozyten, Meniskusfibrochondrozyten, auch in

Co-Kultur, mit sehr hohen Zelldichten und in Gegenwart geeigneter Stimuli herzustellen [128-130].

Studien mit bovinen Meniskuszellen und Zellen aus artikulärem Knorpel konnten zeigen, dass unter

dem Einfluss des Wachstumsfaktors TGF-β und des Enzyms Chondroitinase-ABC dreidimensionale,

meniskusförmige Konstrukte mit einer messbaren mechanischen Belastbarkeit erhalten werden

konnten [128, 131].

Zusammenfassend ist bis heute noch kein optimales Ersatzmaterial für eine zufriedenstellende,

geschweige denn optimale Behandlung von Meniskusschäden gefunden und eine degenerative

Veränderung im Kniegelenk nach Meniskusverletzung kann nach wie vor kaum verhindert werden [1,

16].

2.7 Anforderungen an Bioimplantate für den Meniskusersatz

Wie bereits in Kapitel 2.6 beschrieben gibt es eine Vielzahl verschiedener Ansätze zur Regeneration

von Meniskusgewebe. Besondere Bedeutung kommt gewebebasierten Implantatmaterialien ohne

zelluläre Komponenten und ohne lösliche Bestandteile zu [1]. Derartige azelluläre, biologische

Ersatzmaterialien (Bioimplantate) ohne lösliche Substanzen fallen unter das Medizinproduktegesetz

(MPG) und werden als Medizinprodukte eingestuft [132-133]. Menisksubioimplantate sollen im

Körper die Aufgabe und Funktion des ursprünglichen Meniskusgewebes übernehmen und

körpereigenen Zellen als Leitschiene dienen um ein vitales Implantat zu erhalten. Die rechtliche

Stand des Wissens

Seite 31

Grundlage für Medizinprodukte im europäischen Raum stellt die Richtlinie 93/42/EWG dar. Das MPG

setzt diese Richtlinie in nationales Recht um. Die zuständigen Bundesoberbehörden sind das

Bundeinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte und das Deutsche Institut für medizinische

Dokumentation und Information [134].

Medizinprodukte sind laut 93/42/EWG, Artikel 1 (2) a definiert als „alle einzeln oder miteinander

verbunden verwendete Instrumente, Apparate, Vorrichtungen, Stoffe oder andere Gegenstände,

einschließlich der für ein einwandfreies Funktionieren des Medizinprodukts eingesetzten Software,

die vom Hersteller zur Anwendung für Menschen für folgende Zwecke bestimmt sind:

Erkennung, Verhütung, Überwachung, Behandlung oder Linderung von Krankheiten;

Erkennung, Überwachung, Behandlung, Linderung oder Kompensierung von Verletzungen

oder Behinderungen;

Untersuchung, Ersatz oder Veränderung des anatomischen Aufbaus oder eines

physiologischen Vorgangs;

Empfängnisregelung, und deren bestimmungsgemäße Hauptwirkung im oder am

menschlichen Körper weder durch pharmakologische oder immunologische Mittel noch

metabolisch erreicht wird, deren Wirkungsweise aber durch solche Mittel unterstützt

werden kann“.

Alle Medizinprodukte werden nach den Regeln in Anhang IX der Richtlinie 93/42/EWG in vier

Risikokategorien eingeteilt, I (I s für sterile Medizinprodukte und I m für Produkte mit Messfunktion),

IIa, IIb und III. Bioimplantate für den Meniskusersatz werden, da sie länger als 30 Tage im Körper

verbleiben sollen entsprechend Richtlinie 93/42/EWG der Risikokategorie III zugeordnet. Wie für

Bioimplantate zur Knochenregeneration oder im Bereich der Herzchirurgie etwa zum Ersatz von

Herzklappen, sind auch an Bioimplantate für den Meniskusersatz besondere Anforderungen zu

stellen. Grundlegenden Anforderungen gemäß MPG und Medizinprodukterverordnung sind die

biologischen Verträglichkeit, bzw. die biologische Sicherheit. Um sicherzustellen, dass die

grundlegende Anforderung der biologischen Sicherheit erfüllt werden, beschreibt die ISO Norm

10993, abhängig von der Risikokategorie, unterschiedliche Sicherheitsprüfungen.

Darüber hinaus sollten Meniskusbioimplantate eine Reihe weiterer Eigenschaften aufweisen [1, 16].

Stichpunktartig können folgende Eigenschaften aufgezählt werden:

hohe Analogie zu dem zu ersetzenden Gewebe (morphologisch und struturell)

stabile Fixierung im Gelenkspalt;

chondrokonduktive Eigenschaften;

Verfügbarkeit;

gute chirurgische Handhabung;

Lagerfähigkeit;

ethisch unbedenklich

Zielsetzung

Seite 32

3 Zielsetzung

Der Stand des Wissens mit einer Vielzahl an Forschungsansätzen zeigt auf, dass bis heute noch kein

adäquates Meniskusersatzmaterial gefunden ist und keine zufriedenstellende, geschweige denn

optimale Behandlung von Meniskusschäden möglich ist. Degenerative Veränderungen im Kniegelenk

nach Meniskusverletzung können nach wie vor kaum verhindert werden. Da noch kein optimales

Meniskusersatzmaterial gefunden ist, stellt der Meniskusersatz bislang ein ungelöstes Problem dar.

Seit 2006 wird am Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik der Universität Erlangen-Nürnberg im Bereich

des Knorpelersatzes speziell für Meniskusgewebe geforscht. Im Rahmen dieser Arbeiten wurde ein

Verfahren zur Herstellung von Bioimplantaten aus Knorpelgewebe entwickelt.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch einen nasschemischen Prozess eine dreidimensionale,

chondrokonduktive Kollagenmatrix aus porcinen Menisken herzustellen und die Matrix mit

xenogenen Zellen zu besiedeln. Porcines Gewebe wurde gewählt, weil es im Gegensatz zu humanem

Gewebe in großen Mengen zur Verfügung steht und somit dem hohen Bedarf Rechnung tragen

würde. Zudem zeichnet porcines Gewebe eine hohe Analogie zu humanem Gewebe aus, was sich bei

Transplantate, z.B. Herzklappen, schon in der Praxis bewährt.

Bei dem Einsatz xenogener Gewebe in der Humanchirurgie ist jedoch auch bei hoher Analogie

grundsätzlich mit immunologischen Abwehrreaktionen zu rechnen. Um dieses Problem zu verringern,

müssen alle immunologisch relevanten Determinanten, vor allem alle zellulären Komponenten des

porcinen Meniskus und die sie einbettende extrazelluläre Matrix (EZM), bestehend aus

Proteoglykanen, Hyaluronsäure und anderen Glykoproteinen, effektiv entfernt werden. Letztlich soll

eine hochgereinigte Kollagenmatrix, die nicht zytotoxisch und biokompatibel ist, resultieren. Das

oberste Ziel ist es, diese nicht kollagenen EZM und Gewebe Komponenten so zu entfernen, dass die

fibrilläre, kollagene Struktur des Meniskus mit seinen mechanischen und chondrokonduktiven

Eigenschaften weitestgehend erhalten bleibt.

Aus biologischer und medizinischer Sicht sollte die Matrix für eine bestmögliche Gewebeintegration

in vivo chondrokonduktive Eigenschaften besitzen. Die Kernfragestellung dieser Arbeit war daher, ob

die hergestellte Kollagenmatrix mit xenogenen, also artfremden primären Zellen besiedelbar und

damit revitalisierbar ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden aufgrund der Verfügbarkeit tierische Zellen

bovinen Ursprungs verwendet. In einem in vitro Modell sollte deshalb mit primären bovinen

Meniskusfibrochondrozyten (bMFC) die Chondrokonduktivität, d.h. die Eigenschaft der

Kollagenmatrix, die Zellmigration und die Bildung neuer, spezifischer Knorpelmatrix zu fördern

nachgewiesen und damit die Eignung als Bioimplantat gezeigt werden. Mit bMFC besiedelte Matrizes

sollten auf de novo Synthese knorpelspezifischer extrazellulärer Matrix (EZM) und Migration boviner

Zielsetzung

Seite 33

MFC in die Matrix hinein untersucht werden. Abschließend sollte auf Grundlage der gewonnenen

Ergebnisse eine biologische Bewertung der Kollagenmatrix vorgenommen werden um die Eignung

der Matrix als Meniskusersatzmaterial zu beurteilen.

Material und Methoden

Seite 34

4 Material und Methoden

4.1 Probenmaterial

Im Rahmen dieser Arbeit wurde als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Kollagenmatrizes porcines

Meniskusgewebe (siehe Kapitel 4.1.1) und für die Zellisolierung bovines Meniskusgewebe (siehe

Kapitel 4.1.2) verwendet.

4.1.1 Porcines Meniskusgewebe

Das porcine Meniskusgewebe stammte von Tieren im Alter zwischen sechs und acht Monaten und

wurde von einem örtlichen Schlachthof (Erlangen) bezogen. Es wurde nur Gewebe von Tieren

verwendet welche für den menschlichen Verzehr geeignet waren. Aus entfleischten Kniegelenken

wurden der laterale und der mediale Meniskus mittels Skalpell entnommen und anhaftendes

Bindegewebe mechanisch entfernt. Bis zur weiteren Verwendung wurde das Gewebe bei -24°C in

0,9 % NaCl gelagert.

4.1.1.1 Probenvorbereitung für die Matrixherstellung

Aus porcinem Meniskusgewebe wurden im Bereich des Vorderhorns, des Hinterhorns und der Pars

Intermedia mittels einer 6 mm Biopsiestanze Gewebezylinder mit 5,6 mm Ø und 3-7 mm Höhe

ausgestanzt, siehe Abbildung 14. Daraus wurden mittels einer selbstgebauten Schneidehilfe, siehe

Abbildung 15, zylindrische Gewebeproben (Scaffolds) mit ca. 1 mm Dicke und einer

Querschnittsfläche von A = 0,25 cm2 geschnitten.

Abbildung 14: Lateraler porciner Meniskus (a) mit ausgestanzten Gewebezylindern (b), (c) Biopsiestanze.

a b

c


Seite 35

Abbildung 15: Schneidehilfe (a) zum Schneiden von Kollagenscaffolds (d). b) Rasierklinge, c) Pinzette, e)

Uhrglas.

4.1.2 Bovines Meniskusgewebe

Das bovine Meniskusgewebe für die Zellisolierung wurde aus ungeborenen Rinderföten (neunter

Trächtigkeitsmonat), die unmittelbar nach dem Schlachten der Muttertiere vom lokalen Schlachthof

Erlangen bezogen wurden, in einem Zeitrahmen von 3-5 h nach dem Schlachten entnommen. Da die

Entnahme in einem Nebenbereich des Schlachthofs nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt

werden konnte, wurde das entnommene Gewebe sofort für ca. 30-60 s in 25 ml 70 % Ethanol

überführt und damit gespült. Danach wurde das Gewebe unter der Clean Bench in sterile 0,9 %

NaCl-Lösung überführt.

4.2 Isolierung und Amplifikation primärer boviner Meniskusfibrochondrozyten

Für Revitalisierungsexperimente mit der Kollagenmatrix wurden primären bovine

Meniskusfibrochondrozyten (bMFC) isoliert und Kollagenmatrizes mit bMFC besiedelt. Durch diese

Versuche können Aussagen zu Chondrokonduktivität und biologischer Verträglichkeit der

Kollagenmatrix in vitro getroffen werden. Gleichzeitig sollte so die Akzeptanz der Kollagenmatrix

durch primäre xenogene Zellen und damit die xenogene Übertragbarkeit gezeigt werden.

b

c

d

a

e


Seite 36

4.2.1 Zellisolierung

Bovine Menisken wurden, wie in Kapitel 4.1.2 beschrieben, entnommen und unter sterilen

Bedingungen zunächst in 25 ml 0,9 % NaCl nochmals gewaschen. Um sicher zu stellen, dass nur

Meniskusfibrochondrozyten (MFC) isoliert wurden, musste zunächst Gewebe mit anderen Zellen (z.B.

die bindegewebige Gelenkkapsel) entfernt werden. Hierzu wurde zunächst in einer Petrischale mit

Basalmedium, um Austrocknung zu vermeiden, anhaftendes Bindegewebe sowie die superfizielle

Schicht und die weiß-weiße Zone des Meniskus großzügig entfernt und verworfen. Alle Zellen

wurden somit nur aus der rot-roten und der rot-weißen Zone isoliert. Das entsprechende Gewebe

wurde mit einem Skalpell in ca. 2∙2∙2 mm3 große Stücke zerkleinert, welche in ein 50 ml Falcontube

(Fa. BD) überführt und gewogen wurden. Dem Gewicht entsprechend

(3 g Gewebe < 8 ml; 3 g Gewebe > 16 ml) wurde Verdaumedium (siehe Anhang) zugegeben und die

Proben für 16 h unter ständigem Schütteln (Orbitalschüttler, Heidolph Polymax 1040, 50 rpm) im

Inkubator (37°C, 5 %CO2, 16,5 %O2, 95 % Luftfeuchtigkeit, FA. Binder LB 210) verdaut. Nach dem

Verdau wurden die Zellen über ein Zellsieb (BD Falcon, 100 µm Porengröße) von Geweberückständen

getrennt. Das Eluat mit den Zellen wurde zentrifugiert (5 min, 1.200 rpm) und der Überstand

verworfen. Das Zellpellet wurde in 1 ml Standardkulturmedium (siehe Anhang) resuspendiert und

Zellzahl sowie Vitalität mittels Trypanblaufärbung, siehe Kapitel 4.2.2, bestimmt.

4.2.2 Bestimmung von Zellzahl und Zellvitalität

Nach Trypanblaufärbung wurden durch Auszählen im Hemocytometer die Lebendzellzahl (Nlebend) und

die Zahl toter Zellen (Ntot) bestimmt. 80 µl Zellsuspension werden mit 20 µl 0,1 % Trypanblau-Lösung

(0,1 % Trypanblau in phosphate buffered saline (PBS)) versetzt und im Hemocytometer ausgezählt.

Der Mittelwert der lebenden Zellen wird ermittelt. Die Zellzahl der Zellsuspension und die

Vitalität L wird mit den Gleichungen 1.1 und 1.2 berechnet. Für die Berechnung müssen der

Verdünnungsfaktor Vf (10) und der Volumenfaktor der Zählkammer (104) berücksichtigt werden.

∙Vf∙10 (1.1)

L lebend

lebend tot (1.2)

4.2.3 Bestimmung der minimal notwendigen Zellzahl zur Amplifikation in Monolayer

Hinsichtlich einer maximalen Zellausbeute bei geringen Startzellzahlen, ohne die Zellen zu

untersplitten, wurden Wachstumskurven mit unterschiedlichen Startzellzahlen [Zellen/cm2]

durchgeführt um die optimale Startzellzahl zu bestimmen. In 12-Well Platten (BD-Falcon) wurden je

Well (A = 3,8 cm2) definierte Startzellzahlen (1∙103, 2,5∙103,5∙103, 7,5∙103, 12,5∙103,15∙103) ausgesät.


Seite 37

Nach 15 h, 30 h, 45 h und 60 h wurden die Zellen trypsiniert (siehe Kapitel 4.2.5) und die Zellzahl wie

in Kapitel 4.2.2 beschrieben, bestimmt.

4.2.4 Amplifikation boviner Meniskusfibrochondrozyten im Monolayer

Zur Amplifikation wurden kryokonservierte Zellen für 2 min im Wasserbad bei 37°C aufgetaut und

dann sofort in 175 cm2 Zellkulturflaschen (5∙103 Zellen/cm2; Greiner BioOne) überführt und mit

52,5 ml Standardkulturmedium (siehe Anhang) im Inkubator kultiviert. Aufgrund der starken

Verdünnung von DMSO (1:512) beim Überführen von 1 ml Zellsuspension (10 %DMSO) in 52,5 ml

Medium ist die Abtrennung von DMSO nicht nötig. Alle 2-3 d erfolgte ein Medienwechsel bis nach ca.

8 d 80-90 % Konfluenz erreicht waren.

4.2.5 Trypsinieren

Bei 80-90 % Konfluenz wurde das Kulturmedium abgezogen, der Zellrasen mit PBS gespült, dieses

abgezogen und verworfen. Nach Zugabe von Trypsin/EDTA-Lösung (4,5 ml, 0,25 % Trypsin/0,02 %

EDTA, Biochrom pro 175 cm2 Flasche) wurden die Zellen 10 min im Inkubator inkubiert. Die Ablösung

der Zellen wurde nach 10 min mikroskopisch kontrolliert. Größere Zellaggregate wurden durch

leichtes Klopfen vereinzelt. Die Zellen wurden nun abzentrifugiert (1200 rpm, 5 min, RT), das

Zellpellet in 1 ml Medium resuspendiert und die Zellzahl wie in Kapitel 4.2.2 beschrieben, bestimmt.

4.2.6 Kryokonservieren boviner Meniskusfibrochondrozyten

Nach Erreichen von 80–90 % Konfluenz (Passage 0) wurden die bMFC, wie in Kapitel 4.2.5

beschrieben, trypsiniert, zentrifugiert und das Zellpellet in 1 ml 40 % Medium (siehe Anhang)

resuspendiert. Die Zellzahl wurde, wie in Kapitel 4.2.2beschrieben, bestimmt. Durch weitere Zugabe

von 40 % Medium wurde eine Zellzahl von 2∙106 Zellen/ml eingestellt. Nun wurde mit 20 % DMSO

Medium (siehe Anhang) 1:1 auf eine Zellzahl von 1∙106 Zellen/ml verdünnt. Auf Grund der

zytotoxischen Wirkung von DMSO wurde nun zügig 1 ml Zellsuspension in 2 ml Kryoröhrchen

(Greiner BioOne) überführt und in auf Eis vorgekühltem Isopropanol bei –20°C schonend eingefroren.

Nach 5–10 h wurden die Zellen bis zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert. Die Vorgehensweise

bei allen weiteren Zelltypen (L929 und humane Knochenmarkstammzellen) war identisch.


Seite 38

4.3 Dezellularisierung von porcinem Meniskusgewebe - Prozessieren

Die Entfernung nichtkollagener Bestandteile der extrazellulären Matrix (EZM), Dezellularisierung und

Sterilisierung von Scaffolds aus porcinem Meniskusgewebe erfolgte nach einem zum Patent

angemeldeten, neuartigen nasschemischen Verfahren [135]. Bei diesem selbst entwickelten

Herstellungsverfahren wird in mehreren aufeinander folgenden Schritten mit alkalischen Lösungen,

Ethanol, Lösungen chaotroper Salze und oxidierenden Lösungen eine pathogen-, und zellfreie

Kollagenmatrix ohne entzündungsauslösende Bestandteile unter bestmöglichem Erhalt der

natürlichen 3D Kollagenstruktur hergestellt. Die Durchführung erfolgte in 0,5 L PE Gefäßen unter

ständigem Schütteln. Die Abfolge der einzelnen Schritte ist in Tabelle 4 aufgeführt.


Seite 39

Tabelle 4: Überblick über die Schritte des nasschemischen Verfahrens und deren Wirkung auf das Gewebe.

Verfahrensschritt Wirkung

Vorbehandlung H2Odeion.

- 24 h in 0,5 L H2Odeion. bei Raumtemperatur (RT) im Überkopfschüttler (ÜK), Wechsel stündlich während der ersten 10 h

- Nach 2 und 4 h für 5 min Ultraschallbad (Bandelin Sonorex Super 10 P Digital: 20°C, 9 % x 10)

Entfernung von Blut und wasserlöslichen Gewebebestandteilen, osmotisches Aufbrechen von Zellen

1. Alkalische Behandlung

- 2,5 h in 0,15 L einer 1 M NaOH, RT, ÜK

- Nach 1 h und nach 2 h für 4 min Ultraschallbad

Dekontamination und Denaturierung nichtkollagener Gewebebestandteile, Blut, Viren, Bakterien, DNA und RNA sowie inflammatorischer Bestandteile, wie α-Gal Epitope

Waschschritt

- 24 h in 0,5 L H2Odeion., RT, ÜK - Wechsel stündlich während der ersten 8 h

Auswaschen der Behandlungslösung und denaturierter Gewebebestandteile

Ethanol Behandlung

- 3 h in 0,2 L 70 % Ethanolabsolut bei 40°C auf einem

Horizontalschüttler

Entfettung sowie Entfernung lipophiler Substanzen

Waschschritt siehe oben

Guanidiniumchlorid (GuHCl) Behandlung

- 96 h in 0,2 L einer 1 M Guanidiniumchloridlösung und

0,05 M NaAC in Inkubationspuffer bei 4°C auf einem

Horizontalschüttler

Glykosaminoglykanentfernung


Wasserstoffperoxid Behandlung

- 48 h in 5 % H2O2 bei 4°C auf einem Horizontalrüttler

- 10 min Ultraschallbad vor Abtrennung der H2O2 Lösung

Zusätzliche Inaktivierung sowie Denaturierung nichtkollagener Bestandteile


2. Alkalische Behandlung

- 2,5 h in 0,15 L einer 1 M NaOH, RT, ÜK

- Nach 1 h und nach 2 h für 4 min Ultraschallbad

Sterilisierung, Sicherheitsschritt und weitere Denaturierung verbliebener, nichtkollegener EZM Bestandteile


Nach dem Prozess können die Kollagenmatrizes bis zur weiteren Verwendung in 0,9 % NaCl Lösung

bei -24°C gefroren gelagert werden.

4.4 Histologie und Immunohistologie

Sowohl zur Untersuchung der hergestellten Kollagenmatrix, als auch zur Auswertung mit bMFC

revitalisierter Kollagenscaffolds wurden histologische und immunohistologische Färbungen

durchgeführt.


Seite 40

4.4.1 Probenvorbereitung

Proben von nativen, von prozessierten und von besiedelten Kollagenmatrizes wurden in 3 ml 4 %

gepuffertem Formalin für 48 h bis 96 h im Dunkeln bei 4°C fixiert. Nach der Fixation wurden die

Proben in einer aufsteigenden EtOH-Reihe jeweils 1-2 h dehydriert. So können sie bei RT bis zur

weiteren Verarbeitung gelagert werden. Die dehydrierten Proben wurden anschließend in einer

automatischen Citadelle am Nikolaus-Fibiger-Zentrum für Molekulare Medizin der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg weiter entwässert und nach einem Xylolschritt

(Intermedium) mit Paraffin getränkt (siehe Anhang). Die paraffinierten Proben wurden danach in

Paraffin eingebettet um Paraffinschnitte anzufertigen.

4.4.2 Paraffinschnitte

An einem halbautomatischen Rotationsmikrotom (Fa. Laica) wurden von den eingebetteten Proben

Paraffinschnitte angefertigt. Damit eine ebene Schnittfläche resultiert und um Schnitte aus einem

repräsentativen Bereich der Probe zu erhalten wurden die Proben zuerst in 10-20 µm Schritten

getrimmt. Nach dem Trimmen wurden Schnitte von 5 μm Dicke angefertigt und in ein Wasserbad

(T = 40°C) zum Strecken überführt. Nach dem Strecken (3-5 Minuten) wurden die Schnitte auf

Objektträgern (Super Frost plus®, Menzel-Gläser) aufgebracht. Nun wurden die Schnitte über Nacht

bei 56°C getrocknet und können so vor dem Färben bei RT mehrere Jahre gelagert werden. Sowohl

vor histologischen, als auch vor immunohistologischen Färbungen müssen die Schnitte

entparaffiniert und rehydriert werden.

4.4.3 Entparaffinieren und Rehydrieren

Als Vorbereitung für histologische und immunohistologische Färbungen wurden die Paraffinschnitte

je 3 min in Xylol (X1, X2, X3) entparaffiniert und in einer absteigenden Ethanolreihe (100 %, 100 %,

96 %, 90 %, 80 %, 70 %, 50 %, H2Odeion., je 1-2 min) rehydriert.

4.4.4 Hämatoxylin-Eosin Färbung

Die Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbung ist eine schnelle Übersichtsfärbung. Mit Hämalaunlösung sauer,

nach Mayer, werden Zellkerne dunkelblau bis schwarz gefärbt. Alle anderen Gewebestrukturen, z.B.

Zytoplasma und EZM werden durch Eosin G-Lösung in verschiedenen Nuancen rötlich gefärbt. Die

Durchführung erfolgte nach Herstellervorgaben der Firma Carl Roth GmbH. Die einzelnen

Arbeitsschritte sind im Anhang, Punkt Arbeitsschritte, aufgeführt. Die gefärbten Schnitte wurden in

einer aufsteigenden Ethanolreihe dehydriert und nach Xylol als Intermedium mit Eukitt eingedeckelt.


Seite 41

4.4.5 Alcianblau Färbung

Mittels Alcianblau, einem basischen Farbstoff werden saure, sulfatierte Mucopolysaccaride

angefärbt. In saurem Milieu (pH 1-2,5) bindet Alcianblau an die negativ geladenen sauren,

sulfatierten Seitengruppen der Glykosaminoglykane (GAG), wodurch diese blau gefärbt werden. Die

Durchführung ist wie folgt:

Entparaffinierte, rehydrierte Schnitte 3 min in 3 % Essigsäure,

1 % Alcianblau in 3 % Essigsäure gelöst, 30 min

3 % Essigsäure, 1 min,

dest. H2O, 2 min

Die gefärbten Schnitte werden in einer aufsteigenden Ethanolreihe dehydriert und nach Xylol als

Intermedium mit Eukitt eingedeckelt.

4.4.6 Kombinierte Hämatoxylin-Alcianblau Färbung

Die Hämatoxylin-Alcianblau Kombinationsfärbung wurde als Übersichtsfärbung bei besiedelten

Kollagenscaffolds durchgeführt. Mit Hämatoxylin werden die Zellkerne (dunkel gefärbt) dargestellt.

Mit Alcianblau werden saure, sulfatierte GAG (blau gefärbt) dargestellt. Der Ablauf der Färbung ist im

Anhang aufgeführt. Nach dem Färben wurden die gefärbten Schnitte in einer aufsteigenden

Ethanolreihe dehydriert und nach Xylol als Intermedium mit Eukitt eingedeckelt.

4.4.7 Immunohistologie

Immunohistologische Färbungen (IHC) dienten dem spezifischen Nachweis der de novo Synthese

knorpelspezifischer Bestandteile extrazellulären Matrix durch bMFC. Kollagen Typ I, Kollagen Typ II

und Aggrecan wurden nach der LSAB-Methode über das LSAB+ System–HRP (Dako), nach

Herstellervorgaben angefärbt. Vor der Durchführung mussten alle Reagenzien auf Raumtemperatur

(RT) gebracht werden. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde mit der H2O2-enthaltenden

Blocklösung (Dako) inaktiviert, während unspezifische Bindung der Antikörper mit 20 %

Schweineserum in 0,05 M Tris-HCl (Dako) geblockt wurden.

4.4.7.1 Immunohistologische Färbung von Kollagen Typ I

Zum Nachweis der de novo Synthese von Kollagen Typ I wurde zur Epitopdemaskierung zunächst ein

Proteinase K Verdau (5 min, RT) durchgeführt. Danach werden ca. 20-30 µl Primärantikörper

(ab34710-rabbit polyclonal collagen I, Fa. Abcam) 1:100 verdünnt auf die Schnitte gegeben und

30 min bei RT in einer Feuchtekammer im Dunkeln inkubiert. Zur Vermeidung unspezifischer

Bindungen wurde stets eine Isotype, rabbit IgG 1 1:1500 verdünnt, mitgeführt. Nach 30 min wurde


Seite 42

ein biotinylierter Sekundärantikörper zugegeben und mit dem Dako Detektionssystem detektiert. Die

Zellkerne wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt und die gefärbten Schnitte mit einem wässrigen

Eindeckmedium (Aquatex) feucht eingedeckelt. Die einzelnen Schritte der exakten Durchführung sind

im Anhang aufgeführt.

4.4.7.2 Immunohistologische Färbung von Kollagen Typ II

Um neugebildetes Kollagen Typ II nachzuweisen wurde zur Epitopdemaskierung ein Hyaluronidase

Verdau (15 min bei 37°C) gefolgt von einem Pronase Verdau (15 min bei 37°C) durchgeführt. Danach

wurden ca. 20-30 µl Primärantikörper, II-II6B3 (Developmental Studies Hybridoma Bank) 1:4000

verdünnt auf die Schnitte gegeben und 2 h bei RT in einer Feuchtekammer im Dunkeln inkubiert. Als

Isotype wurde mouse IgG 1 (Dako) 1:1000 verdünnt, mitgeführt. Die Detektion und alle weiteren

Schritte erfolgen wie in Kapitel 4.4.7.1 beschrieben. Die einzelnen Arbeitsschritte sind im Anhang

aufgeführt.

4.4.7.3 Immunohistologische Färbung von Aggrecan

Für die Aggrecan Färbung wurde zur Epitopdemaskierung ein Chondroitinase ABC Verdau (30 min,

RT) durchgeführt. Danach wurden ca. 20-30 µl Primärantikörper, polyclonal anti-aggrecan (Millipore)

1:100 verdünnt auf die Schnitte gegeben und 30 min bei RT in einer Feuchtekammer im Dunkeln

inkubiert. Als Isotype wurde normal rabbit IgG (Santa Cruz Biotechnology) 1:100 verdünnt,

mitgeführt. Die Detektion und alle weiteren Schritte werden wie in Kapitel 4.4.7.1 beschrieben

durchgeführt. Für die exakte Durchführung siehe Anhang.

4.5 Quantifizierung des Anteils an denaturiertem Kollagen wD

Natives Meniskusgewebe und Proben der prozessierten Kollagenmatrix wurden nach der Methode

von Bank und Krikken et al. [136] enzymatisch aufbereitet um auf molekularer Ebene denaturierende

Effekte des Herstellungsverfahrens auf das Kollagen zu untersuchen. Nach Säurehydrolyse wurde

durch den Hydroxyprolin-Assay der Anteil an denaturiertem Kollagen, wD, quantitativ bestimmt.

Mittels Hydroxyprolin-Assay erfolgte ferner die quantitative Bestimmung von Hydroxyprolin in der

neugebildeten Zellschicht besiedelter Kollagenmatrizes. Der Hydroxyprolingehalt, wH, diente als Maß

für die Kollagenbildung, wobei nicht zwischen Kollagen Typ I und Typ II unterschieden wurde.

4.5.1 Enzymatischer Verdau

Scaffolds aus nativem und prozessiertem porcinen Meniskusgewebe wurden in 1,5 ml Eppendorf

Reaktionsgefäßen mit 500 µl α-Chymotrypsin-Lösung (1 mg α-Chymotrypsin/ml Inkubationspuffer)


Seite 43

bei 37°C im Wärmeschrank für 20-24 h inkubiert. Die Enzymlösung wurde vor jedem Verdau frisch

hergestellt. α-Chymotrypsin spaltet selektiv nur entwundene, nicht tripelhelicale Polypeptidketten

auf der Carboxylseite aromatischer sowie unpolarer Aminosäuren. Nach Inkubation im

Wärmeschrank (20-24 h, 37°C) wurden die Proben für 5 min bei 10.000 rpm zentrifugiert um die

verdauten Fragmente des denaturierten Kollagens aus der Matrix zu lösen.

4.5.2 Salzsäureaufschluss

Nach Zentrifugation wurde der Überstand S, in welchem sich die Fragmente des verdauten Kollagens

befinden, mit einer Pasteurpipette vom intakten, unverdauten Rückstand R getrennt. Die Fraktion S

wurde in säure- und hitzebeständige Reaktionsgläser überführt und gewogen. Nun wurde der

Überstand im Verhältnis 1:1 mit 12 M HCl versetzt (Endkonzentration 6 M HCl). Der Rückstand R

wurde ungewogen ebenfalls direkt in säure- und hitzebeständige Reaktionsglässer überführt und mit

1 ml 6 M HCl versetzt. Die mit HCl versetzten Fraktionen S und R wurden nun für 18-24 h bei 121°C

im Heizblock inkubiert. HCl spaltet hydrolytisch die Peptidbindungen wodurch die Aminosäuren des

Kollagens freigesetzt werden.

4.5.3 Colorimetrische Hydroxyprolinbestimmung

Die Bestimmung des Hydroxyprolingehaltes erfolgte nach der von Berginski durchgeführten Methode

[137]. Diese Methode stützt sich auf die nach Stegemann und Stalder modifizierte Arbeit von

Woessner und eignet sich für Proben mit niedrigem Hydroxyprolingehalt [138-139].

Im Anschluss an die Säurehydrolyse werden 50 µl Hydrolysat entnommen, in 1,5 ml Eppendorf

Reaktionsgefäße überführt und mit 450 µl NaOH/Citratpuffer neutralisiert. Hieraus werden 250 µl

entnommen, in Analysenglässer überführt und mit 4,75 ml Citratpuffer (pH = 6) verdünnt. Von dieser

Verdünnung wird 1 ml entnommen und in saubere Analysengläser überführt. Nun wird

Hydroxyprolin durch Zugabe von 0,5 ml Chloramin-T-Lösung schrittweise bei RT über

Pyrrolincarboxylsäure und Pyrrol-2-Carbonsäure zu Pyrrol oxidiert. Die Inkubationsdauer beträgt

20 min Durch Zugabe von 0,5 ml Perchlorsäure (6,2 M) wird die Oxidation nach 12 min

Inkubationsdauer gestoppt. Mit p-Dimethylaminobenzaldehyd (DMBA), in

Ethylenglykolmonoethylether als Lösungsvermittler gelöst, bildet Pyrrol nach Zugabe von 0,5 ml

DMBA-Lösung während der Inkubation für 20 min bei 60°C ein Chromophor, welches ein

Absorptionsmaximum bei 565 nm aufweist. Das Chromophor wird nach Abkühlen auf RT

photometrisch bestimmt. Die Berechnung des Hydroxyprolingehalts in den jeweiligen Proben erfolgt

über eine Hydroxyprolin Kalibriergerade (siehe Anhang).


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4.6 DNA-Quantifizierung

Zur DNA-Quantifizierung wurden zwei Methoden durchgeführt. In Vorarbeiten zeigte sich, dass bei

identischen Proben mit beiden Methoden vergleichbare Ergebnisse erzielt werden konnten. Um die

Entfernung genomischer DNA durch das Herstellungsverfahren zu quantifizieren wurde eine

photometrische Methode durchgeführt. Zur Bestimmung der Zellzahl auf besiedelten

Kollagenmatrizes über den DNA-Gehalt wurde eine fluoreszenzbasierte Methode durchgeführt.

4.6.1 Photometrische Quantifizierung in Gewebeproben

Photometrisch wurde der DNA-Gehalt in nativem Meniskusgewebe und in prozessierten

Kollagenscaffolds nach Isolierung genomischer DNA mittels DNeasy Blood & Tissue Kit (Fa. Qiagen)

bestimmt. Etwa 25 mg Gewebe (Feuchtgewicht) wurden in 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäße

eingewogen, 180 µl ATL Puffer sowie 20 µl Proteinase K Lösung zugegeben und über Nacht bei 56°C

verdaut. Anschließend wurde nach Herstellervorgaben, einzelne Schritte siehe Anhang, die DNA

isoliert. Die Quantifizierung erfolgte mittels Nanoquantplatte (Fa. Tecan) photometrisch bei

260 nm/280 nm. Bei 260 nm wird die Extinktion der Basen der DNA und bei 280 nm die Extinktion

aromatischer Aminosäurereste gemessen.

4.6.2 Fluorometrische DNA-Quantifizierung - Hoechst-Assay bei besiedelten Proben

Die quantitative Erfassung der Proliferation boviner MFC auf der Kollagenmatrix erfolgte über den

DNA-Gehalt als Maß für die Zellzahl/-dichte. Die prozessierte Kollagenmatrix ist nachweisbar

vollständig frei von DNA, daher muss jegliche nachgewiesene DNA von den bMFC stammen. Nach

7 d, 21 d und 35 d Kultivierungsdauer wurde der DNA-Gehalt besiedelter, in Standardkulturmedium

und in chondrogenem Medium kultivierter Scaffolds nach der Methode von Kim et al. [140]

bestimmt. Mit 8 pg DNA pro Chondrocyt [141] wurde die Zellzahl/-dichte über eine Standardkurve

aus Lachssperma-DNA berechnet. Die Proben wurden in 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäßen nach

Zugabe von 1 ml Proteinase K Lösung (0,5 mg/ml in 30 mM Tris-HCl) über Nacht bei 56°C verdaut.

Nach dem Verdau wurden die Proben 5 min bei 6.000 rpm zentrifugiert. Aus dem Überstand wurden

100 µl entnommen, mit 400 µl TNE Puffer verdünnt, 500 µl 2x Hoechst Lösung (2 µl Hoechst Stock in

10 ml TNE) hinzugegeben und 20 min bei RT inkubiert. Triplets wurden nach der Inkubation am Plate

Reader (Tecan, Infinite M200 Pro) bei 356 nm Excitation und 456 nm Emission gemessen.


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4.7 Quantitative Bestimmung von Glykosaminoglykanen

Die quantitative Bestimmung saurer, sulfatierter Glykosaminoglykane (GAG) erfolgte sowohl in

nativem Meniskusgewebe und in prozessierten Kollagenscaffolds, als auch in der durch bMFC

neugebildeten extrazellulären Matrix. Nach der Methode von Barbossa et al. [142] wurde mit Hilfe

des Farbstoffes 1,9-Dimethylmethylenblau der GAG-Gehalt, wG, bestimmt. Der wG wird ausgedrückt

in Chondroitinsulfatäquivalenten angegeben, da mit Chondroitinsulfat (CS), siehe Anhang, kalibriert

wurde.

4.7.1 Bestimmung in Gewebe

Proben nativen Gewebes (10-25 mg) und der Kollagenmatrix (10-25 mg) wurden 48-72 h lyophilisiert

(CHRIST LOC-1 ALPHA 1-4), auf der Feinwaage gewogen und in 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäße

überführt. Diese Proben wurden nun mit je 1 ml Verdaupuffer (50 µg/ml Proteinase K gelöst in

100 mM K2HPO4, pH 8) versetzt und über Nacht bei 56°C verdaut. Nach dem Verdau wurde die

Proteinase K bei 90°C für 10 min im Heizblock (Kleinfeld Labortechnik BT 100) inaktiviert.

Anschließend wurden die Proben bei 10.000 rpm 5 min zentrifugiert. Aus dem Überstand wurden

500 µl entnommen, in Amicon Ultrafree-Filter (Millipore) überführt und 5 min bei 5.000 rpm

zentrifugiert um DNA und Gewebereste abzutrennen. Aus dem Eluat wurden nun für eine

Doppelbestimmung zweimal je 100 µl Probenlösung entnommen und in zwei 1,5 ml Eppendorf

Reaktionsgefäße überführt. Zu den 100 µl Probenlösung wurden nun je 1 ml DMMB-Lösung gegeben

30 min bei 1.100 rpm geschüttelt um den Komplex zwischen DMMB und den GAG zu bilden. Nach

der Komplexierung wurde der fein suspendierte DMMB-GAG-Komplex bei 12.000 g 10 min

zentrifugiert und der Überstand mit überschüssigem Farbstoff verworfen. Um zu Dekomplexieren

wurden 1 ml Dekomplexierungslösung zugegeben und wieder für 30 min bei 1.100 rpm geschüttelt.

Danach wurde die Extinktion bei 656 nm gemessen.

4.7.2 Bestimmung in neugebildeter extrazellulärer Matrix

Um Aussagen sowohl über den zeitlichen Verlauf als auch über mögliche zeitabhängige Änderungen

der EZM-Synthese in Bezug auf die Gehalte der gebildeten Matrixbestandteile, sowie der

Syntheseleistung boviner MFC zu treffen wurde der CS-Gehalt als Maß für die GAG-Bildung

bestimmt. Die neugebildete Matrix wurde manuell mechanisch bestmöglich von der Kollagenmatrix

entfernt, für 48-72 h lyophilisiert, gewogen und der CS-Gehalt wie bereits in Kapitel 4.7.1

beschrieben, bestimmt.


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4.8 Quantitative Bestimmung von alpha-galactosyl Epitopen

In der prozessierten Kollagenmatrix und in nativem Gewebe als Referenz, wurde zur Überprüfung des

Reinigungserfolgs die Entfernung von α-Gal Epitopen quantitativ mittels indirektem

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt.

4.8.1 Probenvorbereitung - Gewebe homogenisieren

Als Probenmaterial wurden Scaffolds aus nativem Gewebe und, wie in Kapitel 4.3 beschrieben,

prozessierte Kollagenscaffolds verwendet. Vorbereitend wurden 40-50 mg (Feuchtgewicht)

Probenmaterial abgewogen, in Stücke von ca. 1∙1∙1mm3 vorzerkleinert und in ein 2 ml Eppendorf

Reaktionsgefäß gegeben. Nun wurden je nach Gewicht 80-100 µl PBS und eine 7 mm Stahlkugel

zugegeben. Mit einem TissueLyser (Fa. Qiagen, TissueLyser LT) wurden die Proben unter

mehrmaligem kurzem Kühlen (ca. 10 s) des Einsatzes in flüssigem Stickstoff insgesamt 60 min bei

50 Hz homogenisiert. Anschließend wurde das homogenisierte Gewebe gepoolt und mit PBS auf eine

Konzentration von 200 mg Gewebe/ml PBS gebracht. So sind die Proben bis zur weiteren

Verwendung lagerbar bei -20°C.

4.8.2 Probenvorbereitung Primärantikörper Inkubation

Die homogenisierten Proben wurden in 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäßen mit Blockpuffer (PBS mit

1 % Bovines Serum Albumin (BSA)) 1:1 Verdünnungsstufen (siehe Anhang) hergestellt. Als

Positivkontrolle wurden bei jedem Test Verdünnungen der murinen Fibroblastenzellinie L 929

mitgeführt. Als Negativkontrolle wurde 1 ml Blockpuffer und 100 µl Antikörper - Lösung mitgeführt.

Zu jeder Verdünnung wurden nun 100 µl primär Antikörper (α-Gal Epitope, mAb (M86)), 1:100

verdünnt gegeben. Nach Zugabe des Primärantikörpers wurden die Proben in einem

Überkopfschüttler (Fa. Kisker, Rotator RS-24) bei 7 rpm über Nacht bei 4°C inkubiert.

4.8.3 Beschichten der Mikrotiterplatten

In 96 Well ELISA-Mikrotiterplatten (Microlon high binding, Greiner BioOne) wurden pro Well 50 µl

Antigen-Lösung (Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R, 5 µg/ml in Bicarbonat/Carbonat Puffer gelöst) pipettiert

und bei 4°C über Nacht inkubiert. Um Verdunstung zu vermeiden wurden die Platten mit einer

Klebefolie (Bio-seal, Greiner BioOne) abgedeckt. Nach Inkubation über Nacht wurde mit 200 µl

Waschpuffer (PBS mit 0,01 % Tween 20) pro Well 5 min unter schütteln (300-400 rpm) gewaschen.

Nach verwerfen des Waschpuffer wurden 200 µl Blockpuffer (PBS mit 1 % BSA) pro Well zugegeben,

die Platten mit Klebefolie abgedeckt und 2 h bei 37°C inkubiert. Danach wurde erneut zweimal mit


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Waschpuffer gewaschen. Die beschichteten Platten wurden nun für den ELISA-Test verwendet oder

konnten abgedeckt bei -20°C gefroren für bis zu 4 Wochen gelagert werden.

4.8.4 Durchführung

Nach Inkubation mit dem Primärantikörper wurden die Proben 5 min bei 13.000 rpm zentrifugiert.

Anschließend werden 50 µl Tripletts aus dem Überstand von Positivkontrolle (PK), Negativkontrolle

(NK) und der Proben sowie Blockpuffer als Referenz in gecoatete Platten pipettiert. Die abgedeckten

Platten wurden 1 h bei RT schüttelnd (300-400 rpm) inkubiert. Danach wurde dreimal mit 200 µl

Waschpuffer 5 min unter Schütteln gewaschen und der Waschpuffer verworfen. Nun wurde pro Well

50 µl Sekundärantikörper (Goat anti-mouse IgM, pAb) in einer 1:1.000 Verdünnung zugegeben,

abgedeckt, 1 h unter Schütteln bei RT inkubiert und danach viermal mit 200 µl Waschpuffer

gewaschen. Zur Detektion der Antikörperbindung wurden 50 µl Tetramethylbenzidin (TMB) Substrat

(TMB A und TMB B, 1:1) zugegeben, abgedeckt und 20 min schüttelnd bei RT inkubiert. Als

Stopplösung wurden 50 µl 2 M H2SO4 pro Well zugegeben. Die Extinktion wird nach dem Stoppen bei

450 nm photometrisch am Plate Reader (Infinite M200 Pro, Tecan) gemessen.

4.8.5 Berechnung der Hemmung von M86

Die Hemmung des Primärantikörpers M86, welche den prozentualen Anteil der Antikörper angibt die

an die Antigene der Proben gebunden haben, wird wie folgt berechnet. Die Extinktion der

Negativkontrolle (NK) wird als 100 % Bindung der Primärantikörper an die beschichtete Platte

gesetzt. Die Bindung (x %) der Antikörper an die Platte in den Proben lässt sich wie folgt berechnen:

Ex nk on =

x

Ex nk onProbe (1.3)

Auf die Hemmung der Primärantikörper kann aus der Bindung an die beschichtete Platte

rückgeschlossen werden:

Hemmung = 1-x (1.4)

4.9 Elektronenmikroskopie

Zur Untersuchung der Auswirkungen des Herstellungsverfahrens auf die 3D Struktur des

Kollagennetzwerkes wurden Rasterelektronen- (REM) und Transmissionselektronen- (TEM)

mikroskopische Aufnahmen nativen Gewebes und prozessierter Kollagenscaffolds angefertigt. Die

elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden an der zentralen Einrichtung für


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Elektronenmikroskopie der Universität Ulm mit freundlicher Unterstützung von Prof. Dr. Paul

Walther angefertigt.


Für beide Untersuchungsmethoden wurden Proben in phosphatgepuffertem 2,5 % Glutaraldehyd mit

1 % Saccharose (pH 7,3) für 2 h bei RT fixiert. Nach 2 h wurden die Proben kurz mit PBS gespült und

mit 2 % Osmiumtetroxid 2 h bei RT nachfixiert. Anschließend wurde kurz mit PBS gespült und in einer

aufsteigenden Ethanolreihe (50 %, 70 %, 90 %, 96 %, 100 %, 100 %) dehydriert.

4.9.2 Rasterelektronenmikroskopie

Dehydrierte Proben wurden zunächst überkritisch getrocknet und, um die Leitfähigkeit herzustellen,

mit Gold-Palladium besputtered (Au-Pd, 20 nm). Die Aufnahmen wurden an einem Zeiss DSM 962

Rasterelektronenmikroskop angefertigt.

4.9.3 Transmissionselektronenmikroskopie

Für TEM-Aufnahmen wurden dehydrierte Proben zunächst in EPON eingebettet und nun von den

eingebetteten Proben Ultradünnschnitte von 70 nm Dicke angefertigt. Die Ultradünnschnitte wurden

mit Blei-Citrat nachgefärbt und in einem Zeiss Transmissionselektronenmikroskop 10 (Fa. Zeiss) bei

80 kV Beschleunigungsspannung untersucht.

4.10 Prüfen auf Sterilität gemäß EN ISO 11737-1

Um die bakterizide und fungizide Wirkung des nasschemischen Verfahrens zu belegen und die

Sterilität prozessierter Kollagenscaffolds zu zeigen, wurden in Anlehnung an EN ISO

11737-1:2006 + AC:2009, mikrobiologische Untersuchungen durchgeführt. Dazu wurde die Zahl

lebensfähiger Keime in nativem Gewebe und in prozessierten Kollagenscaffolds unter Verwendung

von drei unterschiedlichen Kulturmedien bestimmt. Blutagar Platten (Merck) wurden zum Nachweis

anspruchsvoller Mikroorganismen und ihrer hemolytischen Eigenschaften, Standard-I-Agar (Merck)

Platten für weitere anspruchsvolle pathogene Keime und Sabouraud-Agar Platten (4 %, Merck) zum

Nachweis von Pilzen oder Sporen benutzt.


Natives Gewebe wurde unmittelbar vor der Durchführung, wie in Kapitel 4.1.1.1 beschrieben, unter

unsterilen Bedingungen vorbereitet. Kollagenscaffolds wurden, wie in Kapitel 4.3 beschrieben,


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prozessiert wobei alle abschließenden Spülschritte nach der NaOH-Behandlung unter sterilen

Bedingungen durchgeführt wurden. Alle Proben wurden vor Durchführung der Keimzahlbestimmung

nicht gelagert.

4.10.2 Durchführung

Unter sterilen Bedingungen wurden 10 g Gewebe in ca. 3∙3∙3 mm3 Stücke zerkleinert und für 10 min

in 10 ml steriler 0,9 % NaCl unter ständigem Schütteln (100 rpm), um anhaftende Keime abzulösen,

inkubiert. Von dieser Lösung, 100, wurden 10-2 und 10-4 Verdünnungen hergestellt und nun jeweils

100 µl der 100, 10-2 und 10-4 Verdünnung in Tripletts auf den in Kapitel 4.10 genannten Nährmedien

ausplattiert. Von prozessierten Kollagenscaffolds wurden keine Verdünnungen hergestellt. 10 g

zerkleinertes Probenmaterial wurde eingewogen und in 5 ml steriler 0,9 % NaCl (um einen

Verdünnungseffekt zu reduzieren) 10 min unter ständigem Schütteln (100 rpm) inkubiert. Die

beimpften Platten wurden 48 h bei 37°C inkubiert und dann durch Auszählen koloniebildender

Einheiten ausgewertet.

4.11 Prüfen auf in vitro Zytotoxizität gemäß EN ISO 10993-5

Die Prüfung auf in vitro Zytotoxizität nach ISO-Standard EN ISO 10993-5:2009 stellt einen

bedeutendes Kriterium für die Beurteilung von Bioimplantatmaterialien dar [143]. Mit dieser

Methode sollte untersucht werden, ob prozessiertes Matrixmaterial zytotoxische Bestandteile,

entstanden durch das Herstellungsverfahren oder zytotoxische Rückstände von

Behandlungslösungen, enthält. Die Zytotoxizität wurde über die Stoffwechselaktivität (MTS-Assay)

eines subkonfluenten Zellrasens nach 24 h Inkubationszeit in Gegenwart wässriger Eluate

(Zellkulturmedium als Elutionsmittel, 24 h und 72 h Extraktionszeit) der Kollagenmatrix bestimmt.

Nach ISO-Standard 10993-5:2009 belegen Zellvitalitäten zwischen 100 % und 71 % keine, zwischen

70 % und 51 % leichte und unter 50 % starke zytotoxische Effekte. Für die Positivkontrolle (PK)

wurden 10 % DMSO zugegeben und für die Negativkontrolle (NK) wurden wässrige Extrakte von

Thin-Certs® (Greiner BioOne) mitgeführt.

4.11.1 Testzellen

Testzellen waren die murine Fibroblastenzelllinie L929 (DSMZ-No: ACC-2), selbst isolierte primäre

bMFC (P1) und primäre hBMSC (P1, human bone marrow stemm cells, mit freundlicher

Unterstützung der HNO Uniklinik Ulm).


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4.11.2 Vorkultur

Alle verwendeten Testzellen wurden kryokonserviert bei -80°C gelagert. Zur Vorkultur wurden stets

5∙103 Zellen/cm2 in 175 cm2 Zellkulturflaschen (Greiner BioOne) überführt und mit 52,5 ml des

jeweiligen Mediums im Inkubator (Binder, LB 210) bis 80-90 % Konfluenz amplifiziert. Tabelle 5 gibt

einen Überblick über die verwendeten Medien und die jeweiligen Medienzusätze.

Tabelle 5: Verwendete Kultivierungsmedien und Medienzusätze.

Zelltyp Medium + Medienzusätze

bMFC

DMEM/Ham`s F12 (Biochrom)

+ 1 % L-Glutamin (Biochrom)

+ 1 % P/S (Biochrom)

+ 10 %, 5 %, 2 % und 0 % FBS superior (Biochrom)

hBMSC

DMEM (Gibco)

+ 1 % Na-Pyruvat (Biochrom)




L 929

RPMI 1640 (Gibco)




4.11.3 Herstellung wässriger Eluate

Sterile Kollagenscaffolds und parallel dazu die Negativkontrollen wurden für 24 h und für 72 h in 1 ml

des jeweiligen Zellkulturmediums als Elutionsmittel bei unterschiedlichen Serumkonzentrationen im

Inkubator inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde das Elutionsmedium abgezogen und je 200 µl

des Elutionsmediums zu den Testzellen gegeben.

4.11.4 Durchführung

Bei 80-90 % Konfluenz (P1) wurden die Testzellen, wie in Kapitel 4.2.5 beschrieben, abtrypsiniert

zentrifugiert, das Zellpellet in 1 ml Medium resuspendiert und, wie in Kapitel 4.2.2 beschrieben, die

Zellzahl bestimmt. Durch Medienzugabe wurde eine Zellsuspension mit 5∙104 Zellen/ml hergestellt

und von dieser 200 µl in ein Well einer 96 Wellplatte (BD-Falcon) pipettiert. So resultierte eine

Zellzahl von 1∙104 Zellen pro Well. Nun wurden die Zellen in den 96 Wellplatten 24 h im Inkubator

inkubiert. Nach 24 h Inkubation wurde das Medium abgezogen und verworfen. Von dem wie in

Kapitel 4.11.3 hergestellten Elutionsmedium wurden nun je Well 200 µl zugegeben und die Zellen


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weitere 24 h im Inkubator inkubiert. Als PK wurden 200 µl Medium mit 10 % DMSO zugegeben und

mitgeführt. Je Probe erfolgt eine 4-fach Bestimmung.

4.11.5 Sensibilisierung des Testsystems

Zur Erfassung auch eventuell vorhandener, schwach zytotoxischer Bestandteile oder Rückstände

erfolgte eine Optimierung des Testsystems durch Sensibilisierung. Dies wurde durch

Nährstofflimitierung in Form von teilweisem oder vollständigem Serumentzug und daraus

resultierender Sensiblisierung der Testzellen erreicht. Die Durchführung erfolgte wie in Kapitel 4.11.4

beschrieben. Jedoch wurden sensibilisierte Testzellen in dem jeweiligen Medium mit reduziertem

bzw. serumfreiem Medium resuspendiert, in 96 Wellplatten ausgesät und nun für 24 h inkubiert.

Auch die Eluate der Proben wurden in serumfreiem oder Medium mit reduziertem Serumanteil, wie

in Kapitel 4.11.3 beschrieben, hergestellt. Die Bestimmung der Stoffwechselaktivität erfolgte nach

der Vorgehensweise wie in Kapitel 4.11.6.

4.11.6 Bestimmung der Stoffwechselaktivität - MTS-Assay

Die Bestimmung der Stoffwechselaktivität erfolgte mittels CellTiter 96® AQueous One Solution Cell

Viability Assay (MTS-Assay, Promega) nach Herstellervorgaben bei NK, PK und Probe. Nach 24 h

Kultivierung in Elutionsmedium wurde dieses abgezogen und verworfen. Nun wurden 100 µl neues

Medium und 20 µl MTS-Reagenz zugegeben. Als Blank wurde in leeren Wells nur Medium mit

MTS-Reagenz mitgeführt. Nach 2 h Inkubation bei 37°C wurde die Extinktion bei 490 nm

(Meßwellenlänge) sowie bei 660 nm (Referenzwellenlänge) gemessen (Infinite M200 Pro, Tecan).

4.11.7 Berechnung der Zellvitalität

Die Zellvitalität (vit.) wird als relativer Wert bezogen auf die bei jedem Test mitgeführte

Negativkontrolle angegeben. Bei gleicher Zellzahl in allen Wells führt eine Abnahme der Anzahl

lebender Zellen zu einer Abnahme der Gesamtaktivität der mitochondrialen Dehydrogenase in der

Probe. Wie durch die Extinktion bei 490 nm gezeigt, korreliert diese Abnahme direkt mit der Menge

an gebildetem Formazan. Zum Berechnen der Verringerung der Stoffwechselaktivität im Vergleich

zur Negativkontrolle wird folgende Gleichung angewendet:

E 0,ExtraktE 0,

(1.5)

Dabei sind:

E 490,Extrakt der Mittelwert der gemessenen Extinktion des 100 % Extrakts von Probe bzw.

Positivkontrolle


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E 490,NK der Mittelwert der gemessenen Extinktion der Blindproben.

Je kleiner die Zellvitalität umso höher ist das zytotoxische Potenzial des Prüfgegenstandes.

4.11.8 Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester Propidium Jodid Färbung

Die CFDA-SE/PI-Färbung ist eine Doppelfärbung mit den Fluorochromen

Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester (CFDA-SE) und Propidium Jodid (PI). Vitale Zellen

werden von toten Zellen am Fluoreszenzmikroskop optisch unterschieden. CFDA-SE wird in lebenden

Zellen durch intrazelluläre cytoplasmatische Esterasen deacetyliert, wobei als Hydrolyseprodukt grün

fluoreszierendes Carboxyfluorescein entsteht [144-145]. PI, ein polares Molekül, wird nur von

nekrotischen Zellen mit defekter Plasmamembran aufgenommen [146] und bindet an DNA und RNA

[147].

Mit Fluoreszenzfärbung der Testzellen über CFDA-SE/PI erfolgte in ersten Versuchen zunächst eine

qualitative Auswertung. Nach 24 h Inkubation wurde das Medium von den Proben abgezogen, 3 ml

CFDA–SE–Lösung (9 µM in PBS) pro Well hinzupipettiert und 7 min bei 37°C inkubiert. Danach wird

die CFDA–SE–Lösung verworfen und die Zellen 15 min in 3 ml Kulturmedium inkubiert. Nach 15 min

wurde das Kulturmedium abpipettiert und 3 ml PI–Lösung (1 µg PI/ml Kulturmedium) pro Well

zugegeben. Die Proben wurden nun für 2-3 min bei RT inkubiert und dann am Fluoreszenzmikroskop

(Nikon Ti-Eclipse) optisch ausgewertet.

4.12 Besiedelungsexperimente

Besiedelungsexperimente prozessierter Kollagescaffolds mit bMFC stellten neben den rein

histologischen, elektronenmikroskopischen und biochemischen Untersuchungen sowie der Prüfung

auf Sterilität und in vitro Zytotoxizität ein weiteres, entscheidendes Beurteilungskriterium hinsichtlich

der biologischen Verträglichkeit und chondrokonduktiver Eigenschaften der Kollagenmatrix dar.

4.12.1 Vorkultur boviner MFC

Für eine ausreichende Zellzahl und um identische Startbedingungen zu schaffen, wurden die Zellen

generell nach der Isolierung zunächst im Monolayer bis 80-90 % Konfluenz amplifiziert, Passage 0

(P0). Nun wurden die Zellen kryokonserviert und bei -80°C gelagert. Für die Besiedelungsexperimente

sowie für Zytotoxizitätsbestimmungen wurden die Zellen ein weiteres Mal bis 80-90 % Konfluenz

amplifiziert, Passage 1 (P1). Diese Vorgehensweise sollte zudem sicherstellen, dass wie in der

Literatur bei Chondrozyten beschriebene, durch Expansion in Monolayer bedingte

Dedifferenzierungen mit dem Verlust des spezifischen Phänotyps [148-149] sowie Änderungen der


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Genexpression und der Sekretion knorpelspezifischer extrazellulärer Matrix [150-151] [152]

verringert wurden. Zudem garantiert diese standardisierte Vorgehensweise reproduzierbare

Ergebnisse bei Besiedelungsexperimenten der Kollagenmatrix.

4.12.2 Sterilisierung der Kollagenscaffolds

Die, wie in Kapitel 4.3 beschrieben, prozessierten Kollagenscaffolds wurden präventiv vor den

Besiedelungsexperimenten mit 70 % Ethanolunvergällt sterilisiert. Die Scaffolds wurden unter der Clean

Bench in 24-Well-Platten (BD-Falcon) vereinzelt und für 1 h mit 1 ml 70 % Ethanolunvergällt bei RT

inkubiert. Anschließend wurde der Ethanol abgezogen und verbleibende Reste 1,5 h bei RT

abgedampft. Nun wurden die Scaffolds in 1 ml Kulturmedium (siehe Anhang) über Nacht im

Inkubator inkubiert. In Medium können sterilisierte Scaffolds auch bei -20°C bis zu 6 Monate gelagert

werden.

4.12.3 Besiedelung der Kolalgenscaffolds

Um Kollagenscaffolds (Kapitel 4.12.2) mit bMFC zu besiedeln wurden je fünf sterile Scaffolds, wie in

Abbildung 16 gezeigt, ohne Überlappung in ein Well einer 24-Wellplatte (BD-Falcon) nebeneinander

angeordnet. Anschließend wurde 1 ml Zellsuspension (5∙106 Zellen/ml) zugegeben. Zur Zelladhäsion

wurden die Proben nun für 1 h im Inkubator inkubiert. Längere Inkubationszeiten waren nicht

sinnvoll, da aufgrund der hohen Zellzahl/ml bereits nach 1 h ein Absinken des pH Werts durch

Lactatbildung anhand eines beginnenden Farbumschlags des Indikators beobachte wurden.

Abbildung 16: Links: Schematische Darstellung der Anordnung von Kollagenscaffolds in einem Well einer 24-

Wellplatte zur Besiedelung mit bMFC. Rechts: Aufnahme von Scaffolds vor der Besiedelung.

Nach einer Stunde wurden die besiedelten Scaffolds in eine 12-Wellplatte vereinzelt und mit 1 ml

Medium überschichtet. So werden die besiedelten Scaffolds im Inkubator bis zu 112 d kultiviert.


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4.12.4 Bestimmung der Flächenzelldichte adhärierter Zellen

Auf Kollagenscaffolds wurde die Flächenzelldichte adhärierter Zellen nach 1 h Adhäsionszeit durch

Auszählen, wie in Kapitel 4.2.2 beschrieben, im Well verbleibender Zellen mittels Hemocytometer

bestimmt.

4.12.5 Verwendete Medien und Kultivierung

Die Untersuchung des Einflusses von Nährmedienzusammensetzung und von Zytokinen auf das

Verhalten und die Interaktion von bMFC auf den Kollagenscaffolds hinsichtlich Zellmigration und

Bildung einer Regeneratmatrix erfolgte mit unterschiedlichen Kulturmedien über verschiedene

Zeiträume. Tabelle 6 gibt einen Überblick über die zur Kultivierung besiedelter Scaffolds

verwendeten Medien, Medienzusätze und den Kultivierungszeitraum.


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Tabelle 6: Übersicht über verwendete Kultivierungsmedien, Medienzusätze und Kultivierungszeiträume.

Medium Zusätze Kultivierungszeitraum

DMEM/Ham‘s F12 (Biochrom) 0 %, 10 %, 20 % FBS

1 % P/S

1 % L–Glutamin

bis 56 d

NHChondroDiff; (Miltenyi Biotech) 1 % P/S bis 112 d

DMEM/Ham‘s F12 (Biochrom) 1 % P/S

1 % L–Glutamin

PDGF–AB 10 ng/ml

bis 56 d

DMEM/Ham‘s F12 (Biochrom) 1 % P/S

1 % L–Glutamin

HGF 10 ng/ml

bis 56 d

DMEM (4,5 g/l D-Glucose; Biochrom) mit Metabolismus fördernden Zusätzen und TGFβ1

1 % P/S

1 % L–Glutamin

1 mM Na-pyruvat

L–Prolin 40 µg/ml

40 µg/ml Ascorbat-2-Phosphat

10-7 M Dexamethason

Insulin 6,25 µg/ml

TGF–β1, 10 ng/ml

bis 52 d

DMEM (4,5 g/l D-Glucose; Biochrom) mit Metabolismus fördernden Zusätzen TGFβ1 und HGF

HGF 10 ng/ml bis 21 d

DMEM (4,5 g/l D-Glucose; Biochrom) mit Metabolismus fördernden Zusätzen TGFβ1 und PDGF–AB

PDGF–AB 10 ng/ml (HGF) bis 21 d

DMEM (4,5 g/l D-Glucose; Biochrom) mit Metabolismus fördernden Zusätzen TGF-β1, HGF und PDGF–AB

HGF 10 ng/ml

PDGF–AB 10 ng/ml (HGF)

bis 21 d

Die Kultivierung besiedelter Scaffolds in den unterschiedlichen Medien erfolgte in ersten Versuchen

zunächst in statischer Kultur. Bei weiteren Experimenten erfolgte die Kultivierung auf einem

Orbitalschüttler, wobei während der ersten 14 d die Scaffolds alle 5 d gewendet wurden um eine

gleichmäßige Besiedelung zu gewährleisten.

Ergebnisse

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5 Ergebnisse

Der Ergebnisteil gliedert sich in drei Abschnitte. Zunächst werden in Kapitel 5.1 die Ergebnisse der

histologischen, biochemischen und elektronenmikroskopischen Untersuchungen der Kollagenmatrix

gezeigt. Im zweiten Abschnitt, Kapitel 5.2, werden Ergebnisse erster biologischer Prüfungen der

gereinigten Kollagenmatrix auf Sterilität und auf in vitro Zytotoxizität dargestellt. Der Fokus dieser

Arbeit liegt auf in vitro Besiedelungsexperimenten der Kollagenmatrix mit primären bovinen

Meniskusfibrochondrozyten (bMFC), siehe Kapitel 5.3. Die Ausgangsfragestellung war hier, ob die

hergestellte Kollagenmatrix mit xenogenen, also artfremden primären Zellen besiedelbar und damit

revitalisierbar ist. In einem in vitro-Modell sollte deshalb mit primären bovinen

Meniskusfibrochondrozyten (bMFC) die Chondrokonduktivität, d.h. die Eigenschaft der

Kollagenmatrix, die Zellmigration und die Bildung neuer Knorpelmatrix zu fördern nachgewiesen und

damit die Eignung als Bioimplantat gezeigt werden.

5.1 Histologische, biochemische und elektronenmikroskopische Untersuchungen

Anhand histologischer, biochemischer und elektronenmikroskopischer Untersuchungen wurden

zunächst an unbesiedelten Proben der hergestellten Kollagenmatrix wichtige Anforderungen wie die

Dezellularisierung, die Entfernung inflammatorischer und nichtkollagener Gewebebestandteile,

sowie Erhalt der 3D Kollagenstruktur untersucht.

5.1.1 Entfernung von Zellen und Zellbestandteilen aus porcinem Meniskusgewebe

Vermittelt über Zelloberflächenstrukturen stellen tierische Zellen die Hauptursache für

Abstoßungsreaktionen dar [72, 153-154]. Aus diesem Grund ist die bestmögliche Entfernung von

Zellkomponenten wie DNA [155] sowie inflammatorischer Zellbestandteile wie die alpha Galactosyl

(α-Gal) Epitope [72] der Zellmembran unter bestmöglichem Erhalt der 3D Gewebestruktur ein

wichtiger Schritt bei der Herstellung von Bioimplantaten. Daher ist die Untersuchung der

Dezellularisierung ein bedeutender Validierungsschritt, wodurch zudem erste Hinweise auf die

biologische Verträglichkeit der Kollagenmatrix gewonnen werden können.

5.1.1.1 Dezellularisierung von porcinem Meniskusgewebe

Mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbte Paraffinschnitte nativen und prozessierten Gewebes zeigen

qualitativ die Zellentfernung aus dem Gewebe. In nachfolgender Abbildung 17 a und b sind

HE-Färbungen zur Darstellung von extrazellulärer Matrix (EZM, rot) und Zellkernen (dunkel) zu sehen.

Ergebnisse

Seite 57

Abbildung 17: Hämatoxylin-Eosin Färbung von nativem (a) und prozessiertem (b) porcinem Meniskusgewebe

zur Darstellung extrazellulärer Matrix (rötlich/rot) sowie der Zellkerne (dunkelblau/schwarz). Der

Maßstabsbalken entspricht 100 µm.

Wie Abbildung 17 a zeigt, sind in nativem Gewebe gleichmäßig verteilt dunkel angefärbte Zellkerne

eindeutig erkennbar. Die dichte EZM aus Kollagen und Proteoglykanen ist rot angefärbt. Abbildung

17 b zeigt, dass nach dem Prozess in der Kollagenmatrix keine Zellkerne färbbar sind. Die rot gefärbte

EZM des prozessierten Gewebes scheint im Vergleich zu nativem Gewebe aufgrund der besser

erkennbaren Kollagenfaserstruktur aufgelockert. Die HE-Färbung zeigt somit die vollständige

Zellentfernung sowie eine Auflockerung der Kollagenmatrix nach dem Reinigungsprozess.

5.1.1.2 Quantitative Bestimmung des DNA-Gehaltes

Bereits die in Kapitel 5.1.1.1 gezeigten Ergebnisse der Histologie belegen qualitativ keine färbbaren

Zellkerne in prozessiertem Meniskusgewebe. Um die Dezellularisierung auch quantitativ zeigen zu

können wurde der DNA-Gehalt in prozessiertem Gewebe und nativem Gewebe als Referenz

bestimmt.

Tabelle 7: DNA-Gehalt [µg DNA/mg Gewebe Feuchtgewicht] in nativem und prozessiertem porcinem

Meniskusgewebe. Die Fehler entsprechen den Konfidenzintervallen (P = 95 %. N = 8 (nativ);

N = 10 (prozessiert)).

Probe natives porcines

Meniskusgewebe prozessierte Kollagenmatrix

DNA-Gehalt 0,28 ± 0,11 µg/mg < 0,06 ng/mg

In nativem Meniskusgewebe kann, wie Tabelle 7 zeigt, ein DNA-Gehalt von 0,28 ± 0,11 µg DNA/mg

Gewebe (Feuchtgewicht) bestimmt werden. Dahingegen kann in prozessiertem Gewebe keine DNA

nachgewiesen werden. Somit kann gezeigt werden, dass durch den Prozess das Gewebe

dezellularisiert wird und auch der DNA-Gehalt bis unter die Nachweisgrenze (0,06 ng/mg) signifikant

reduziert wird.

a b

Ergebnisse

Seite 58

5.1.1.3 Bestimmung der inflammatorischen alpha-Galactosyl Epitope

Das auf allen tierischen Zellen exprimierte α-Gal Epitop, vergleiche Kapitel 2.3.3.3, stellt eine

immunologische Barriere bei der Verwendung von xenogenem Gewebe als Bioimplantat dar [72].

Unbehandeltes, oder unvollständig gereinigtes porcines Gewebe würde daher hyperakute oder

chronische Abstoßungsreaktionen hervorrufen [156]. Daher ist der quantitative Nachweis von α-Gal

Epitopen mittels einem enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in nativem und prozessiertem

Gewebe ein wichtiges Kriterium zur Bewertung der prozessierten Kollagenmatrix.

Abbildung 18: Quantitative Bestimmung von Galα1,3-Galβ1-4-GlcNAc-R (α-Gal Epitope) bei der murinen

Fibrosarcomazellinie L929 (Positivkontrolle) im Vergleich zu nativem und prozessiertem porcinem

Meniskusgewebe. Daten eines ELISA Inhibierungsassay, angegeben in % Inhibierung der Bindung von M 86

Antikörpern an α-Gal Epitope. Die Fehlerbalken entsprechen dem Konfidenzintervall (P = 95 %; N = 6 für L 929;

N = 6 für nativ und N = 9 für prozessiert). IC50 steht für die „Concentration at 50 % inhibition“.

Abbildung 18 zeigt die quantitative Bestimmung von α-Gal Epitopen in nativem und prozessiertem

porcinem Meniskusgewebe im Vergleich zu unterschiedlichen Zellkonzentrationen der murinen

Fibroblastenzelllinie L929 (Positivkontrolle). Die Daten werden als % Hemmung der Bindung von

M 86 Antikörpern an α-Gal Epitope angegeben. Für einen qualitativen Vergleich ist der IC50 mit

angegeben. Bei einer methodisch bedingten maximalen Gewebekonzentration von 200 mg ml-1

konnte in nativem Gewebe eine Hemmung von 62,2 ± 14,2 % bestimmt werden. Die in prozessiertem

Gewebe bei einer Gewebekonzentration von 200 mg ml-1 bestimmte maximale Hemmung von

8,65 ± 5,01 % entspricht der Hemmung nativen Gewebes mit einer Gewebekonzentration von unter

1,0E+04 1,0E+05 1,0E+06 1,0E+07

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0,1 1 10 100 1000

Zellkonzentration L929 ml-1

Hem

mu

ng

von

M 8

6 [

%]

Gewebekonzentration [mg ml-1]

natives Gewebe

prozessiertes Gewebe

L929

IC 50

Ergebnisse

Seite 59

0,78 mg∙ml-1. Dies entspricht einer Abreicherung um einen Faktor größer als 2,56∙102. Die Ergebnisse

zeigen, dass in porcinem Gewebe natürlicherweise vorhandenen α-Gal Epitope signifikant entfernt

wurden und damit die Gefahr von Abstoßungsreaktionen signifikant reduziert wurde.

5.1.2 Entfernen von Glykosaminoglykanen

Die Entfernung von Glykosaminoglykanen (GAG) legt einerseits Diffusionswege frei, wodurch

inflammatorische Gewebebestandteile auch im Inneren des Gewebes besser entfernt werden

können und somit eine bessere Aufreinigung möglich wird. Andererseits wird die dichte

Kollagenmatrix aufgelockert. Dies soll eine Revitalisierung auch im Inneren des Gewebes durch

Freilegen potentieller Migrationswege für Zellen begünstigen. Daher sollte unter bestmöglichem

Erhalt der 3D Kollagenstruktur auch die GAG so weit wie möglich entfernt werden.

5.1.2.1 Qualitativer Glykosaminoglykannachweis in nativem und prozessiertem Meniskusgewebe

Mittels Alcianblau (AB) Färbung wurde qualitativ die GAG-Entfernung aus der Kollagenmatrix gezeigt.

Die Ergebnisse sind in Abbildung 19 a (natives Gewebe) und b (prozessiertes Meniskusgewebe) zu

sehen.

Abbildung 19: Alcianblau-Färbung zur Darstellung saurer, sulphatierter GAG (blau) (dunkelblau/schwarz) von

nativem (a) und prozessiertem (b) Meniskusgewebe. Die in nativem Gewebe vorhandenen GAG sind blau

angefärbt, in prozessiertem Meniskusgewebe können keine GAG angefärbt werden. Der Maßstabsbalken

entspricht 100 µm.

Wie Abbildung 19 b zeigt, ist bei prozessiertem Gewebe nach AB-Färbung, im Vergleich zu der in

Abbildung 19 a deutlichen Blaufärbung von nativem Gewebe, keine Blaufärbung zu erkennen. Die

AB-Färbung zeigt somit qualitativ eine signifikante Entfernung der GAG durch den Prozess aus dem

Meniskusgewebe an. Wie bereits bei der HE-Färbung (vgl. Abbildung 17 b) erscheint auch hier das

prozessierte Gewebe weniger dicht und deutlich aufgelockert.

a b

Ergebnisse

Seite 60

5.1.2.2 Quantitative Bestimmung des Glykosaminoglykan Gehaltes

Neben Zellen und Zellbestandteilen wurde auch der GAG-Gehalt, wG [µg CS/mg Gewebe],

ausgedrückt in Chondroitinsulfatäquivalenten in prozessiertem Meniskusgewebe und in nativem

Meniskusgewebe (Referenz) mittels Dimethylmethylenblau-Assay (DMMB-Assay) quantitativ

bestimmt. Der wG wird ausgedrückt in Chondroitinsulfatäquivalenten angeben, da mit

Chondroitinsulphat (CS) dem mit bis zu 18 mg/g (Trockengewicht) [36] am häufigsten

vorkommenden GAG in Meniskus kalibriert wurde, siehe Kapitel 4.7.1.

Tabelle 8: Glykosaminoglykangehalt, wG, ausgedrückt in Chondroitinsulfatäquivalenten [µg CS/mg Gewebe] in

prozessiertem und in nativem Gewebe (Referenz). Die Fehler entsprechen den Konfidenzintervallen (P = 95 %,

N = 15).



GAG-Gehalt, wG

[µg CS/mg Gewebe] 11,0 ± 2,65 4,25 ± 0,34

Tabelle 8 zeigt die Ergebnisse des DMMB-Assay zur quantitativen Bestimmung saurer, sulphatierter

GAG. In nativem Referenzgewebe konnten durchschnittlich 11,0 ± 2,65 µg CS/mg Gewebe bestimmt

werden. Der hohe Fehler bei nativen Proben ist auf die inhomogene Verteilung der GAG im Meniskus

[6] zurückzuführen. Bei prozessiertem Gewebe konnten 4,25 ± 0,34 µg CS/mg Gewebe bestimmt

werden. Diese Ergebnisse zeigen eine signifikante Reduzierung der GAG um 61,37 %.

5.1.3 Anteil an denaturiertem Kollagen wD

Eines der Hauptziele des Herstellungsverfahrens war es, die 3D Kollagenstruktur bestmöglich zu

erhalten und eine Denaturierung des Kollagens zu vermeiden. So sollten die ursprünglichen

biomechanischen Gewebeeigenschaften und damit die Stabilität so weit wie möglich erhalten

bleiben. Daher wurde der Anteil an denaturiertem Kollagen, wD, in prozessiertem und in nativem

Gewebe (Referenz) mittels des Hydroxyprolin-Assay, siehe Kapitel 4.5, bestimmt.

Tabelle 9: Anteil an denaturiertem Kollagen, wD [%], in prozessiertem und in nativem Gewebe (Referenz). Die

Fehler entsprechen den Konfidenzintervallen (P = 95 %. N = 17 nativ, N = 19 prozessiert).



Anteil an denaturiertem Kollagen, wD [%]

4,72 ± 0,52 5,15 ± 0,83

In Tabelle 9 sind die Ergebnisse des Hydroxyprolin-Assay dargestellt. Bei nativem Gewebe kann ein

wD von 4,27 ± 0,52 % und bei prozessiertem Gewebe ein wD von 5,15 ± 0,83 % bestimmt werden. Der

Ergebnisse

Seite 61

Vergleich von prozessiertem mit nativem Gewebe zeigt keinen signifikanten Anstieg des wD nach dem

Prozess. Die Ergebnisse belegen, dass durch das nasschemischen Verfahrens keine signifikante

Zunahme des wD gegenüber dem nativen Gewebe resultiert.

5.1.4 Elektronenmikroskopie

Zusätzlich zu histologischen und biochemischen Untersuchungen wurden mittels

elektronenmikroskopischer Aufnahmen die Auswirkungen des Herstellungsverfahrens auf die

Kollagenstruktur des Gewebes untersucht. Im Hinblick auf das Ziel des Erhalts der natürlichen 3D

Kollagenstruktur wurden daher rasterelektronenmikroskopische (REM) und

transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Aufnahmen von nativem Gewebe und von der

dezellularisierten Kollagematrix angefertigt um die strukturelle Organisation und 3D Anordnung der

Kollagenfibrillen und Faserbündel zu zeigen.

Rasterelektronenmikroskopie (REM)

Vermehrte Spaltung intermolekularer cross-links [7] zwischen Kollagenfibrillen und -fasern führt zu

deutlichen strukturellen Änderungen, welche in einer Änderung der biomechanischen Eigenschaften

und damit einer reduzierten mechanischen Belastbarkeit resultieren. Durch

rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen können strukturellen Änderungen dargestellt werden.

Abbildung 20: REM-Aufnahmen von nativem (a) und prozessiertem (b) procinem Meniskusgewebe zur

Darstellung der 3D Anordnung der Kollagenfibrillen. Quer getroffene (#), dicht gepackten Fibrillen und

Faserbündel, längs (*) verlaufende Fibrillen und Faserbündel.

Die REM-Aufnahmen von nativem Gewebe und der prozessierten Kollagenmatrix, Abbildung 20 a und

b, zeigen keine Unterschiede in der Orientierung und Struktur des Kollagennetzwerkes. Bei beiden

Proben ist die einzigartige Anordnung von Kollagenfibrillen und -fasern ein einem 3D Netzwerk

deutlich erkennbar. Relativ zur Schnittrichtung sind abhängig von der morphologischen Orientierung

#

*

#

*

Ergebnisse

Seite 62

(vgl. Kapitel 2.1.2) sowohl quer (#) getroffene, dicht gepackten Fibrillen und Faserbündel, als auch

längs (*) verlaufende Fibrillen und Faserbündel zu sehen. Diese Aufnahmen zeigen, dass durch das

Herstellungsverfahren keine darstellbaren Auswirkungen auf die natürliche, Orientierung und 3D

Struktur des Kollegennetzwerkes hervorgerufen werden.

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

Die oben gezeigten Ergebnisse der REM-Aufnahmen zeigen keine Auswirkungen auf die Orientierung

und 3D Struktur des Kollagennetzwerkes. Zusätzlich wurde die charakteristische, D-periodische

Bänderung der Kollagenfibrillen [7, 59] anhand von TEM Aufnahmen untersucht und ausgewertet.

Abbildung 21: TEM-Aufnahmen von nativem (a) und prozessiertem (b) procinem Meniskusgewebe. Darstellung

der charakteristischen D-periodischen Bänderung von ca. D = 67 nm der Kollagenfibrillen.

Abbildung 21 a und b zeigen TEM-Aufnahmen nativer (a) und prozessierter (b) Proben. In nativen

Proben (a) weisen die Kollagenfibrillen eine D-Periodizität von 63,96 ± 6,42 nm, in prozessierten (b)

Proben von 64,29 ± 3,75 nm auf. Im Vergleich besteht somit kein signifikanter Unterschied in der

D-Periodizität der Kollagenfibrillen bei nativen und prozessierten Proben im Vergleich zu aus der

Literatur bekannten Werten von ca. D = 67 nm in nativem, hydriertem [59-61, 157] bzw. 64-65 nm in

fixierten, dehydrierten [62, 158] Kollagenfibrillen [157-158]. Neben der natürlichen Orientierung und

3D Struktur zeigen sich auch anhand von TEM-Aufnahmen keine darstellbaren Auswirkungen des

Herstellungsverfahrens auf das Kollagen.

5.2 Biologische Prüfungen auf Sterilität und in vitro Zytotoxizität

In ersten biologischen Untersuchungen erfolgte zunächst eine Prüfung der prozessierten

Kollagenmatrix auf lebensfähige Keime. Um die Kollagenmatrix auf in vitro Zytotoxizität zu prüfen,

Ergebnisse

Seite 63

wurden weiterhin Experimente nach ISO-Standards mit verschiedenen Testzellen durchgeführt.

Durch Nährstofflimitierung erfolgte zusätzlich eine Sensibilisierung des Zytotoxizitätstestsystems.

5.2.1 Prüfen auf Sterilität gemäß EN ISO 11737-1

Um die bakterizide und fungizide Wirkung des Prozesses zu belegen und die Sterilität der

Bioimplantate zu zeigen, wurden in Anlehnung an EN ISO 11737-1:2006 + AC:2009 mikrobiologische

Untersuchungen durchgeführt. Dabei wird die Zahl lebensfähiger Keime in nativem Gewebe und

vergleichend in prozessiertem Gewebe bestimmt. Blutagar Platten dienen zum Nachweis

anspruchsvoller Mikroorganismen und ihrer hemolytischen Eigenschaften, Standard-I-Agar Platten

für weitere anspruchsvolle pathogene Keime sowie Sabouraudagar Platten zum Nachweis von Pilzen

oder deren Sporen. In Tabelle 10 sind die bestimmten Keimzahlen aufgeführt.

Tabelle 10: Keimzahlen von nativem und prozessiertem Meniskusgewebe [cfu g-1

Gewebe].

Agar cfu g-1 natives Gewebe cfu g-1 prozessiertes Gewebe

Blutagar 0,67∙102 ± 0,25∙102 0

Standard-I-Agar 0,86∙102 ± 0,22∙102 0

Sabouraudagar 0 0

Natives Gewebe zeigt eine Keimbelastung von 0,67∙102 ± 0,25∙102 cfu∙g-1 an γ-hemolytischen sowie

0,86∙102 ± 0,22∙102 cfu∙g-1 an anspruchsvollen Mikroorganismen aber keine nachweisbaren Keime aus

dem Taxa der Fungi. Bei der Untersuchung von prozessiertem Gewebe konnten auch nach bis zu 72 h

Inkubationszeit auf keinem verwendeten Nährmedium lebensfähigen Keime nachgewiesen werden.

5.2.2 Prüfen auf in vitro Zytotoxizität nach EN ISO 10993-5(2009)

Bei der Validierung von Meniskusbioimplantaten ist die Prüfung auf in vitro Zytotoxizität ein

entscheidender Schritt. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit Untersuchungen zur Zytotoxizität

gemäß EN ISO 10993-5:2009 durchgeführt. Mit Kulturmedium als Extraktionsmittel wurden wässrige

Extrakte (24 h und 72 h Extraktionszeit) der Kollagenmatrix hergestellt und ein subkonfluenter

Zellrasen verschiedener Testzellen für 24 h mit diesen Extrakten inkubiert, siehe Kapitel 4.11.4. Nach

24 h wurde mittels MTS-Assay der Einfluss des gewonnenen Eluats auf die Stoffwechselaktivität der

Testzellen, murine Fibroblastenzelllinie L929 (DSMZ-No.: ACC-2), selbst isolierter primäre bMFC und

primäre humane bone marrow stemm cells (hBMSC) bestimmt.

Ergebnisse

Seite 64

Nach ISO-Standard belegen Zellvitalitäten zwischen 100 % und 71 % keine, zwischen 70 % und 51 %

leichte und unter 50 % starke zytotoxische Effekte. Für eine übersichtlichere Darstellung sind die

Ergebnisse nach 24 h und 72 h Inkubationszeit getrennt dargestellt.

Zusätzlich zu Vorgaben der Norm wurde zur Sensibilisierung der Testzellen mit verschiedenen

Serumkonzentrationen (Nährstofflimitierung durch teilweisen und vollständigen Serumentzug; 0 %,

2 %, 5 % und 10 % Serumgehalt) gearbeitet.

Abbildung 22: In vitro Zytotoxizität zur biologischen Beurteilung von Medizinprodukten nach ISO-Standards

(ISO 10993-5). Zellvitalität [%], bezogen auf die Negativkontrolle (NK), primärer hBMSC, L929 und primärer

bMFC als Indikatorzellen um mögliche zytotoxische Effekte der Meniskusmatrix nach 24 h Inkubation der

Matrix in Zellkulturmedium (0 %, 2 %, 5 % und 10 % Serumgehalt) als Extraktionsmittel zu bestimmen.

Sensibilisierung des Testsystems durch Nährstofflimitierung über reduzierte Serumzugabe. Positivkontrolle (PK)

10 % DMSO. NK: Thin Cert® (Greiner BioOne). Die Fehlerbalken entsprechen den Konfidenzintervallen (P=95 %.

N=6).

Die gemessenen Zellvitalitäten nach 24 h Inkubation der Testzellen in Gegenwart von wässrigem

Extrakt der Kollagenmatrix und der Positivkontrolle, siehe Abbildung 22, bezogen auf eine

Negativkontrolle liegen für alle Testzellen zwischen 91,71 ± 2,13 % und 122,6 ± 3,67 %. Nach

Sensibilisierung des Testsystems durch Nährstofflimitierung, siehe Kapitel 4.11.5, ist vor allem der

Serumeinfluss auf die bMFC auffällig. Mit 122,6 ± 3,67 % ist bei serumfreiem Extraktionsmedium die

Vitalität im Vergleich zu 91,71 ± 2,13 % bei einer Serumkonzentration von 10 % deutlich höher.

0

20

40

60

80

100

120

140

NK PK Sample 0% FBS

Sample 2% FBS

Sample 5% FBS

Sample 10% FBS

Vit

alit

ät [

%]

Extrakt

24 h hBMSC

L 929

bMFC

nich

t zyto

toxisch

leich

t zyto

toxisch

zytoto

xisch

Ergebnisse

Seite 65

Sowohl bei den L929 als auch bei den hBMSC fällt dieser Effekt geringer aus. Im Vergleich dazu zeigt

10 % DMSO als Positivkontrolle mit bestimmten Zellvitalitäten im Bereich zwischen 12,36 ± 2,48 %

(bMFC) und 40,41 ± 4,26 % (hBMSC) auf alle Testzellen eine stark zytotoxische Wirkung.

Die gemessenen Zellvitalitäten für die untersuchten Testzellen nach 72 h Extraktion mit

verschiedenen Serumkonzentrationen sind in Abbildung 23 zu sehen.

Abbildung 23: In vitro Zytotoxizität zur biologischen Beurteilung von Medizinprodukten nach ISO-Standards

(ISO 10993-5). Zellvitalität [%], bezogen auf die Negativkontrolle (NK), primärer hBMSC, L929 und primärer

bMFC als Indikatorzellen um mögliche zytotoxische Effekte der Meniskusmatrix nach 72 h Inkubation der

Matrix in Zellkulturmedium (mit 0 %, 2 %, 5 % und 10 % Serumgehalt) als Extraktionsmittel zu bestimmen.

Sensibilisierung des Testsystems durch Nährstofflimitierung über reduzierte Serumzugabe. Positivkontrolle (PK)

10 % DMSO. NK: Thin Cert® (Greiner BioOne). Die Fehlerbalken entsprechen den Konfidenzintervallen (P=95 %.

N=6).

Wie in Abbildung 23 zu sehen ist, ergeben sich nach 72 h Extraktion für alle Testzellen Vitalitäten

zwischen 94,83 ± 2,89 % und 113,03 ± 5,59 %. Auch hier wird der Einfluss der Serumkonzentration

auf die bMFC deutlich. Bei 10 % Serumgehalt kann für bMFC eine Vitalität von 94,83 ± 2,89 % und bei

serumfreiem Medium eine Vitalität von 112,02 ± 3,55 % bestimmt werden. Auch bei den hBMSC wird

dieser Effekt sichtbar, wenn auch nicht so ausgeprägt. Bei den L929 kann der Effekt nicht beobachtet

werden. Bei 10 % DMSO als Positivkontrolle können im Vergleich zu den Extrakten der

Kollagenmatrix Vitalitäten zwischen 8,03 ± 1,50 % (bMFC) und 38,33 ± 3,69 % (hBMSC) für alle

Testzellen bestimmt werden.

0

20

40

60

80

100

120

140

NK PK Sample 0% FBS

Sample 2% FBS

Sample 5% FBS

Sample 10% FBS

Vit

alit

ät [

%]

Extrakt

72 h hBMSC

L 929

bMFC

nich

t zyto

toxisch

leich

t zyto

toxisch

zyto

toxisch

Ergebnisse

Seite 66

Selbst mit sensibilisierten Zellen nach Nährstofflimitierung konnten weder nach 24 h noch nach 72 h

zytotoxische Effekte festgestellt werden. Die Vitalitätsraten, bezogen auf eine Negativkontrolle,

belegen bei allen verwendeten Indikatorzellen stets hohe Zellvitalitäten und damit keine

zytotoxischen Effekte des Matrixmaterials.

5.3 In vitro Revitalisierung mit primären bovinen Meniskusfibrochondrozyten

Der Fokus dieser Arbeit lag auf in vitro Revitalisierungsexperimenten der Kollagenmatrix mit

primären bovinen Meniskusfibrochondrozyten (bMFC). Für Besiedelungsversuche wurden zunächst

primäre bMFC aus bovinem Meniskusgewebe isoliert und unter 2D Kulturbedingungen (Monolayer)

amplifiziert. Nach Amplifikation in 2D Kultur wurden in Revitalisierungsexperimenten die

Kollagenmatrizes mit den bMFC besiedelt.

5.3.1 Isolierung primärer boviner Menisksufibrochondrozyten

Für die Zellgewinnung wurden, wie in Kapitel 4.2.1 beschrieben, bMFC aus vorzerkleinerten bovinen

Menisken ungeborener Kälber enzymatisch durch Kollagenase Typ II Verdau über Nacht isoliert und

die Ausbeute in Zellen∙g-1 Gewebe (Feuchtgewicht) bestimmt. Bei der Zellisolierung wurde einmal

14 h nur schwach und einmal 14 h schwach + 2 h stark geschüttelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11

dargestellt.

Tabelle 11: Zellausbeute nach Isolation aus bovinen Menisken [Zellen∙g-1

Gewebe (Feuchtgewicht)].

Probe Gewebeeinwaage [g] Zellausbeute [Zellen g-1]

Schütteldauer /intensität

Ø der Zellausbeute

Meniskus 1 4,06 4,71∙105 14 h schwach

4∙105 Meniskus 2 2,43 3,29∙105 14 h schwach


+ 2 h stark 1,17∙106


+ 2 h stark

Aus Meniskus 1 und Meniskus 2 konnten nach 14 h Collagenaseverdau bei moderatem Schütteln

durchschnittlich 4∙105 Zellen g-1 isoliert werden. Von Meniskus 3 und Meniskus 4 konnten nach 16 h

Verdau, wobei die ersten 14 h analog zu Meniskus 1 und Meniskus 2 erfolgten, nach weiteren 2 h

unter starkem Schütteln mit durchschnittlich 1,17∙106 Zellen∙g-1 signifikant mehr Zellen isoliert

werden.

Ergebnisse

Seite 67

5.3.2 Minimal notwendige Startzellzahl für die Amplifikation in Monolayer

Um ein Untersplitten der bMFC zu vermeiden und hinsichtlich einer maximalen Zellzahl (bei 80-90 %

Konfluenz) ausgehend von niedrigen Startzellzahlen (Zellen pro cm2) wurde, wie in Kapitel 4.2.3

beschrieben, die minimal notwendige Startzellzahl für die Amplifikation von bMFC bestimmt. Dazu

wurden Wachstumskurven mit unterschiedlichen Startzellzahlen (Zellen∙cm-2) aufgenommen.

Abbildung 24: Wachstumskurve boviner MFC mit unterschiedlichen Startzellzahlen [Zellen∙cm-2

] zur

Bestimmung der minimal notwendigen Starzellzahl.

Abbildung 24 zeigt die Wachstumskurve boviner MFC bei verschiedenen Startzellzahlen. Bei

Startzellzahlen < 5∙103 Zellen cm-2 konnte während der Kultivierungsdauer von 60 h kein Wachstum

festgestellt werden. Startzellzahlen ≥ 5∙103 Zellen cm-1 zeigen nach einer lag-Phase von ≥ 30 h ein mit

der Startzellzahl zunehmendes Wachstum wobei bei 15∙103 Zellen cm-1 nach 60 h mit 9∙105 Zellen ml-

1 die höchste Zellzahl bestimmt wurde. Für die Amplifikation boviner MFC in Monolayer wurde 5∙103

Zellen cm-1 als minimal notwendige Startzellzahl festgelegt, da bereits nach 60 h ein deutlicher

Anstieg der Zellzahl bestimmt werden konnte.

5.3.3 Besiedelungsexperimente

Anhand von Besiedelungsexperimenten mit primären bMFC wurde in einem in vitro Modell die

Revitalisierbarkeit der Kollagenmatrix mit xenogenen Zellen untersucht. Gleichzeitig wurde die

Chondrokonduktivität, d.h. die Eigenschaft der Kollagenmatrix die Zellmigration und die Bildung

neuer Knorpelmatrix positiv zu beeinflussen gezeigt. Besiedelte Matrizes wurden hinsichtlich des

Mediumeinflusses auf die de novo Synthese knorpelspezifischer EZM und der Migration/dem

1,0E+00

2,0E+05

4,0E+05

6,0E+05

8,0E+05

0 20 40 60

Zellz

ahl [

Z/cm

-2]

Zeit [h]

1,0E+03

2,5E+03

5,0E+03

7,5E+03

1,0E+04

1,3E+04

1,5E+04

Ergebnisse

Seite 68

Einwachsen boviner MFC in die Matrix untersucht. Gleichzeitig geben diese langfristigen

Revitalisierungsexperimente Aufschluss darüber, ob langfristig toxische Effekte auftreten können.

Auf Basis dieser Ergebnisse kann eine biologische Bewertung der Kollagenmatrix vorgenommen und

die Eignung als Bioimplantat diskutiert werden.

5.3.3.1 Besiedelbarkeit

Aus vergleichbaren Arbeiten von Kooperationspartnern und aus eigenen Vorarbeiten mit

Kollagenmatrizes, hergestellt aus porcinem Septumknorpel welche mit primären humanen

Septumchondrozyten besiedelt wurden [62, 159], ist bekannt, dass die Besiedelung von

Kollagenscaffolds mit hohen Zelldichten von 5∙106 Zellen/ml besonders erfolgreich ist. Auch um die

Proliferation der bMFC zeigen zu können wurde zunächst die Anzahl initial auf den Kollagenmatrizes

nach 1 h adhärierter boviner MFC bestimmt und aus der Zellzahl die Flächenzelldichte, wie in Kapitel

4.12.4 beschrieben, berechnet. In Tabelle 12 sind die Ergebnisse dargestellt.

Tabelle 12: Ergebnisse der Bestimmung initial nach 1 h adhärierter Zellen. Zellzahl verbliebener Zellen pro Well

und Zellzahl pro Kollagenscaffold. Die Flächenzelldichte pro Kollagenscaffold wurde aus der Zellzahl berechnet.

Ansatz Zellen Well-1 Zellen Scaffold-1

1 1,56∙106 6,88∙105

2 1,69∙106 6,62∙105

3 1,41∙106 7,18∙105

4 1,71∙106 6,59∙105

Ø Zellen Well-1 1,59∙106

6,82∙105 Ø NZellen Scaffold-1

Flächenzelldichte 2,72∙106 ± 0,11∙106 Z cm-2

Durchschnittlich verbleiben nach Vereinzeln der Scaffolds nach 1 h Adhäsionszeit 1,59∙106 Zellen im

Well zurück. Bei einer zugegebenen Startzellzahl von 5∙106 Zellen adhärieren somit bei homogener

Zellverteilung durchschnittlich 6,82∙105 Zellen Scaffold-1. Bei einem durchschnittlichen, mikroskopisch

bestimmten, Zelldurchmesser von 10 µm, ergibt sich bei der Fläche des Scaffolds von A = 24,63 mm2,

eine vollständige, mehrschichtige Zelladhäsion mit einer Flächenzelldichte von

2,72∙106 ± 0,11∙106 Z∙cm-2.

Neben der Zahl adhärierter Zellen nach 1 h wurde die längerfristige Revitalisierbarkeit der

Kollagenmatrix mit bMFC untersucht indem besiedelte Scaffolds bis zu 42 d in DMEM/Ham`s F12

Medium mit 10 % FBS und in chondrogenem Medium (NHChondroDiff, Fa Miltenyi Biotech) kultiviert

wurden. Abbildung 25 a-f zeigen Hämatoxylin-Alcianblau Kombinationsfärbungen zur Darstellung von

Ergebnisse

Seite 69

Zellkernen (dunkelblau/schwarz gefärbt) und GAG (blau gefärbt) nach 0 d, 14 d, 28 d und 42 d

Kultivierung in DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS.

Abbildung 25: Hämatoxylin-Alcianblau gefärbte Paraffinschnitte (Schnittdicke = 5 µm) von Kollagenmatrizes

besiedelt mit primären bMFC nach 0 d (a), 14 d (b), 28 d (c) und 42 d (d) Kultivierung in DMEM/Ham`s F12

Medium mit 10 % FBS. Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm.

Wie Abbildung 25 a-d zeigen, ist bei Kultivierung in DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS beginnend mit

einer homogenen Zellschicht nach 1 h Adhäsionszeit, siehe Abbildung 25 a, über den gesamten

Kultivierungszeitraum bis zu 42 d (Abbildung 25 d) auf der Kollagenmatrix histologisch eindeutig

Zellwachstum nachweisbar. Abbildung 25 d zeigt, dass auch nach 42 d nur eine Schichtdicke von ca.

50 µm sowie eine geringe Neusynthese von EZM beobachtet werden kann.

Parallel wurden mit bMFC besiedelte Kollagenmatrizes in NHChondroDiff Medium kultiviert. Die

Ergebnisse der Kultivierung sind in den Abbildung 26 a-c gezeigt.

a b

c d

Ergebnisse

Seite 70

Abbildung 26: Hämatoxylin-Alcianblau gefärbte Paraffinschnitte (Schnittdicke = 5 µm) von Kollagenmatrizes

besiedelt mit primären bMFC nach 14 d (a), 28 d (b) und 42 d (c). Kultivierung in NHChondroDiff Medium. Der


Bei Kultivierung in NHChondroDiff Medium zeigte sich auf der Kollagenmatrix, wie in Abbildung

26 a-c zusehen ist, bereits nach 14 d ausgeprägtes Zellwachstum und signifikante EZM Neusynthese.

Nach 42 d wurden auf den Kollagenmatrizes durchschnittliche Schichtdicken aus Zellen und

neugebildeter EZM von ca. 300 µm festgestellt. Regelmäßiges, manuelles Wenden alle 5 d während

der ersten 14 d der Kollagenmatrizes ergab bei Kultivierung unter dynamischen Bedingungen auf

einem Orbitalschüttler eine optimale, gleichmäßige Besiedelung der Matrizes (siehe Anhang,

Abbildung 47).

5.3.3.2 Zellvitalität

Die Vitalität der bMFC auf der Kollagenmatrix ist mittels stoffwechselbasierten Methoden nicht

quantifizierbar. Bestimmungen der Stoffwechselaktivität boviner MFC auf der Kollagenmatrix mittels

MTT- und MTS-Assay lieferten durch die Kollagenmatrix bedingte, statistische, nicht-systematisch

fehlerhafte und damit nicht korrigierbare Ergebnisse [160]. Die Darstellung vitaler Zellen auf der

Kollagenmatrix erfolgte daher durch eine Ausschlussmethode rein qualitativ mittels

CFDA-SE/PI-Färbung (Lebend-/Tot-Doppelfärbung). Besiedelte Kollagenmatrizes wurden in

DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS und NHChondroDiff Medium bis zu 21 d kultiviert.

c b a

Ergebnisse

Seite 71

Abbildung 27: CFDA-SE/PI- lebend -tot Doppelfärbung zur Darstellung der Vitalität boviner MFC auf

Kollagenmatrizes nach 0 d, 7 d und 21 d Kultivierungsdauer. Kultivierung in DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS

(a-c) und NHChondroDiff Medium (d-f).

Abbildung 27 a-f zeigen CFDA-SE/PI-lebend-tot Doppelfärbungen boviner MFC auf Kollagenmatrizes

zur qualitativen Darstellung der Zellvitalität nach 0 d, 7 d und 21 d Kultivierungsdauer bei Kultivierung

in DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS und NHChondroDiff Medium. Bei beiden verwendeten Medien

wurden während des beobachteten Zeitraumes nur vereinzelt rot fluoreszierende, avitale Zellen

beobachtet werden. Besonders bei Kultivierung in NHChondroDiff Medium ist zunehmender

Kulturdauer eine deutliche Zunahme der Autofluoreszenz des Kollagens zu beobachten. Die

a

c

b

f

e

d

Ergebnisse

Seite 72

zunehmende Autofluoreszenz kontinuierlich neugebildeten Kollagens überlagert die grüne

Fluoreszenz vitaler Zellen, sodass eine Unterscheidung zwischen Zellen und Kollagenmatrix mit der

Kultivierungsdauer nicht mehr möglich wird.

Der Rückschluss auf die Zellvitalität erfolgte daher bei Kultivierungszeiten über 21 d über die

qualitative und quantitative de novo Synthese knorpelspezifischer EZM sowie über die Bestimmung

der Zellzahl als Funktion der Zeit, siehe Kapitel 5.3.3.3 und Kapitel 5.3.4.3.

5.3.3.3 Zellproliferation

Ebenso wie die Zellvitalität, vergleiche Kapitel 5.3.3.2, war auch die Zellproliferation mittels des

stoffwechselbasierten MTT- und des MTS-Assay nicht quantifizierbar. In Gegenwart der

Kollagenmatrix konnten anhand der Stoffwechselaktivität keine Aussagen bezüglich Zellzahl oder

Proliferation getroffen werden.

Da der DNA–Gehalt der Kollagenmatrix unter der Nachweisgrenze von 0,06 ng/mg liegt, siehe Kapitel

5.1.1.2, wurde die Proliferation boviner MFC auf der Kollagenmatrix über den DNA–Gehalt (8 pg DNA

pro Chondrocyt [141]), als Maß für die Zellzahl/-dichte ermittelt. Untersuchungen zur Proliferation

boviner MFC fanden mit besiedelten Matrizes welche in DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS und

NHChondroDiff Medium über einen Kultivierungszeitraum bis zu 35 d kultiviert wurden, statt.

Abbildung 28: Flächenzelldichte besiedelter Kollagenmatrizes als Funktion der Kultivierungszeit. Kultivierung in

DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS und NHChondroDiff Medium. N = 4-7. Die Fehlerbalken entsprechen der

Standardabweichung.

Abbildung 28 zeigt die Proliferation boviner MFC auf der Kolagenmatrix über eine Kultivierungsdauer

von 35 d bei Kultivierung in DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS und NHChondroDiff. In DMEM/Ham`s

8,96E+05 8,64E+05 1,04E+06

2,72E+06

2,27E+06

4,64E+06

4,96E+06

0,E+00

1,E+06

2,E+06

3,E+06

4,E+06

5,E+06

6,E+06

0 7 14 21 28 35

Fläc

hen

zelld

ich

te [

Z cm

-2]

Kultivierungszeit [d]

DMEM/HAM`s F12 mit 10% FBS

NHChondroDiff

Ergebnisse

Seite 73

F12 mit 10 % FBS fiel die Flächenzelldichte von 2,72∙106 ± 0,11∙106 Z/cm2 nach 7 d zunächst auf

0,896∙106 ± 0,33∙106 Z/cm2 und stieg nach 35 d wieder, nicht signifikant, auf 1,04∙106 ± 0,28∙106 Z/cm2

an.

In NHChondroDiff Medium ergab sich eine signifikant höhere Flächenzelldichte aufgrund einer

höheren Proliferationsrate. Wie in DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS sinkt in den ersten sieben Tagen

zunächst die Zellzahl leicht auf 2,27∙106 ± 0,31∙106 Z/cm2 ab, steigt nach 35 d deutlich auf

4,96∙106 ± 0,31∙106 Z/cm2 an. Die Ergebnisse zeigen im Vergleich zur Verwendung von DMEM/Ham`s

F12 mit 10 % FBS als Kulturmedium eine signifikant gesteigerte Proliferation boviner MFC auf der

Kollagenmatrix bei Verwendung von NHChondroDiff Medium als Kulturmedium. Auch steigt bei

Kultivierung in NHChondroDiff Medium die Zellzahl zwischen Tag 7 und Tag 21 stark und nach Tag 21

nur noch langsam an.

5.3.4 Einfluss von Kulturmedien und Medienzusätzen auf die Synthese extrazellulärer

Matrix und Zellmigration

Die Untersuchung des Einflusses von Nährmedienzusammensetzung und von Zytokinen auf die

Zellmigration und die Bildung einer Regeneratmatrix erfolgte mit unterschiedlichen Kulturmedien.

DMEM/Ham`s F12 und NHChondroDiff Medium, welche sich bereits bei Versuchen zur

Besiedelbarkeit, Zellvitalität und Proliferation als geeignete Kultivierungsmedien herausstellten,

sowie mit definierten Medien mit metabolismus- sowie migratioinsfördernden und

chondroinduktiven Zusätzen [79-81, 161-163]. Die Kultivierung besiedelter Scaffolds erfolgte unter

dynamischen Bedingungen bis zu 112 d. Diese Experimente zeigen einerseits die

chondrokonduktiven Eigenschaften der Kollagenmatrix und erlauben zudem auch erste Erkenntnisse

über die Akzeptanz und Interaktion xenogener Zellen mit der Kollagenmatrix bei längerfristigen in

vitro Revitalisierungsexperimenten.

5.3.4.1 Kultivierung in Dulbecco`s Modified Eagle Medium/Ham`s F12 mit 10 % FBS

Bereits in ersten Experimenten zur Revitalisierbarkeit wurden besiedelte Kollagenmatrizes in

DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS bis zu 42 d kultiviert. Innerhalb von 42 d bildete sich auf den

Kollagenmatrizes eine bis zu 50 µm dicke Schicht aus Zellen und neugebildeter EZM, siehe Kapitel

5.3.3.1, ein direkter Nachweis chondrokonduktiver Eigenschaften des Marixmaterials. Histologische

und immunohistologische Ergebnisse der qualitativen Auswertung hinsichtlich der Neusynthese

extrazellulärer Matrix und Zellmigration sind in Abbildung 29 a-d gezeigt.

Ergebnisse

Seite 74

Abbildung 29: Immunohistologische- sowie Hämatoxylin-Alcianblau gefärbte Paraffinschnitte

(Schnittdicke = 5 µm) besiedelter Kollagenmatrizes nach Kultivierung in DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS. a)

42 d, IHC Kollagen Typ I-Färbung, Gegenfärbung der Zellkerne mit Hämatoxylin. b) 42 d, IHC Aggrecan-Färbung,

Gegenfärbung der Zellkerne mit Hämatoxylin. c) 42 d, IHC Kollagen Typ II-Färbung, Gegenfärbung der Zellkerne

mit Hämatoxylin. d) 14 d Hämatoxylin-Alcianblau-Färbung. Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm.

Immonohistologisch war eine geringe Bildung von Kollagen Typ I, siehe Abbildung 29 a, und

Aggrecan, siehe Abbildung 29 b nachweisbar. Kollagen Typ II, das von bMFC in wesentlich geringerem

Maße als Kollagen Typ I gebildet wird [2, 40] war, wie Abbildung 29 c zeigt, nicht nachweisbar.

Bereits nach 14 d kann eine Migration einzelner Zellen entlang der Kollagenfasern bis zu 400 µm in

die Kollagenmatrix hinein histologisch belegt werden, siehe Abbildung 29 d. Eine Matrixbildung

migrierter Zellen findet nicht statt.

5.3.4.2 Kultivierung in Dulbecco`s Modified Eagle Medium /Ham`s F12 mit Wachstumsfaktoren

Da die genaue Zusammensetzung von fötalem bovinem Serum (FBS) und des NHChondroDiff

Mediums nicht bekannt ist wurde für die Untersuchung des Einflusses matrixsynthese- und

migrationsfördernder Wachstumsfaktoren auf bovine MFC, Hepatocyte growth factor (HGF), Platelet

derived growth factor-AB (PDGF-AB) nach [1, 161], definierte Minimalmedien verwendet. Besiedelte

Kollagenmatrizes wurden in DMEM/Ham`s F12 mit genannten Wachstumdfaktoren, wie in Kapitel

b a

c d

Ergebnisse

Seite 75

4.12.5 Tabelle 5 beschrieben, kultiviert. Zur Kontrolle wurden besiedelte Kollagenmatrizes in

Serumfreiem Medium ohne Wachstumsfaktoren kultiviert. Die Ergebnisse nach 14 d, 28 d und 56 d

sind in Abbildung 30 a-i zu sehen.

Abbildung 30: Hämatoxylin-Alcianblau gefärbte Paraffinschnitte (Schnittdicke = 5 µm) mit bMFC besiedelter

Kollagenmatrizes nach 14 d (a,d,g), 28 d (b,e,h) und 56 d (c,f,i) Kultivierungsdauer in DMEM/Ham`s F12 mit

10 ng ml-1

HGF (a-c), 10 ng ml-1

PDGF-AB (d-f) und serumfrei (g-i). Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm.

Sowohl bei Kultivierung in DMEM/Ham`s F12 mit 10 ng ml-1 HGF, als auch in DMEM/Ham`s F12 mit

10 ng ml-1 PDGF-AB und in serumfreiem Medium waren nach14 d nur wenige Zellen nachweisbar,

siehe Abbildung 30 a, d und h. Auch im weiteren Kulturverlauf sind nach 56 d nur noch einzelne

dunkel gefärbte Zellkerne und damit Zellen nachweisbar. Auch eine kontinuierliche Zellschicht ist

nicht zu erkennen, siehe Abbildung 30 b-i. Weiterhin ist zu keinem Zeitpunkt eine Blaufärbung

neugebildeter EZM (GAG) zu sehen.

c b

i h g

f e

a

d

Ergebnisse

Seite 76

Sowohl mit HGF, Abbildung 30 a als auch mit PDGF-AB, Abbildung 30 d sind nach 14 d einige, in die

Matrix migrierte Zellen zu sehen. Nach 28 d Kultivierung, Abbildung 30 b und e sind weniger Zellen

im Gewebe nachweisbar. In serumfreiem Medium sind nach 14 d, 28 d und 56 d nur sehr wenige

Zellen und sehr vereinzelt bzw. kaum migrierte Zellen nachweisbar.

5.3.4.3 Kultivierung in NHChondroDiff Medium

NHChondroDiff Medium stellte sich bereits bei ersten Experimenten zur Proliferation und zu

langfristigen Kultivierungen als sehr gut geeignetes Medium für die Kultivierung besiedelter

Kollagenmatrizes heraus. Die längsten Kultivierungen mit bis zu 112 d erfolgten daher in

NHChondroDiff Medium.

Abbildung 31: IHC gefärbte Paraffinschnitte (Schnittdicke = 5 µm) besiedelter Kollagenmatrizes nach 28 d (a),

70 d (b) und 98 d (c) Kultivierungsdauer in NHChondroDiff Medium. Kollagen Typ I-Färbung, Zellkerne sind mit

Hämatoxylin dunkel gegengefärbt. Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm.

Abbildung 31 zeigt repräsentative Abbildungen von Kollagen Typ I-IHC gefärbten Paraffinschnitten

besiedelter Scaffolds nach 28 d, 70 d und 98 d Kultivierungsdauer. Während der ersten 70 d nimmt

die Dicke neugebildeten Gewebes bei Kultivierung in NHChondroDiff auf dem Scaffold kontinuierlich

bis ca. 300 µm zu und bleibt dann innerhalb des Beobachtungszeitraums von 98 d konstant. Zu allen

Beobachtungszeitpunkten kann Kollagen Typ I Bildung durch die bMFC immunohistologisch

nachgewiesen werden. Da die Kollagenmatrix selbst auch aus Kollagen Typ I besteht, ist diese auch

angefärbt.

a b c

Ergebnisse

Seite 77

Abbildung 32: Paraffinschnitte (Schnittdicke = 5 µm) mit bMFC besiedelter Kollagenmatrizes nach 70 d

Kultivierungsdauer in NHChondroDiff Medium. IHC-Färbung von a) Aggrecan, b) Kollagen Typ I und c) Kollagen

Typ II. Die Zellkerne sind mit Hämatoxylin gegengefärbt. Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm.

Immunohistologisch konnte, wie Abbildung 32 a-c zeigen, qualitativ während der gesamten

Kultivierungsdauer die de novo Synthese aller für Meniskusknorpel typischen EZM-Bestandteile, wie

Aggrecan, siehe Abbildung 32 a, Kollagen Typ I, siehe Abbildung 32 b, und Kollagen Typ II, siehe

Abbildung 32 c, nachgewiesen werden. Die IHC-Färbung von Aggrecan, Abbildung 32 a, zeigt, dass die

Kollagenmatrix selbst nicht gefärbt ist, durch die bMFC in der Schicht Aggrecan gebildet wird. In

Abbildung 32 b ist wie bereits bei Abbildung 31 beschrieben Kollagen Typ I Bildung nachweisbar.

Abbildung 32 c belegt die Kollagen Typ II Synthese durch die bMFC. Hier zeigt sich, dass die Matrix

selbst wie erwartet nur sehr schwach angefärbt wurde, aber auch die Schicht auf der Matrix nicht

homogen gefärbt ist. Eine deutliche Färbung ist vor allem in einem ca. 100-200 µm dicken, direkt an

die Kollagenmatrix grenzenden Zone erkennbar. Die der Matrix abgewandte Zone der Schicht ist

nicht gefärbt.

Aufgrund einer Schichtdicke von 100-300 µm war es bei Kultivierung in NHChondroDiff Medium

möglich die neugebildete Matrix mechanisch von der Kollagenmatrix abzutrennen und den

Hydroxyprolingehalt als Maß für die Kollagensynthese sowie den Chondroitinsulfatgehalt als Maß für

die GAG-Bildung in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer zu bestimmen. Die quantitative

Bestimmung neugebildeter GAG, ausgedrückt in Chondroitinsulfatäquivalenten (CS), und des

Hydroxyprolingehaltes erfolgte nach 21 d, 35 d und 49 d Kultivierungsdauer. Die Bestimmung zu

unterschiedlichen Zeitpunkten erlaubt Aussagen bezüglich des Anteils der beiden Parameter bezogen

auf die Gewebemasse sowie bezüglich der Zunahme über die Zeit, bezogen auf eine Probe.

a c b

Ergebnisse

Seite 78

Abbildung 33: Gehalt saurer sulfatierter GAG [µg CS] Scaffold-1

nach 21 d, 35 d und 49 d, ausgedrückt in

Chondroitinsulfatäquivalenten, als Funktion der Kultivierungszeit. NHChondroDiff Medium. Die Fehlerbalken

entsprechen den Konfidenzintervallen (P = 95 %, N = 6 - 8).

Abbildung 33 zeigt die GAG-Synthese der bMFC als Funktion der Zeit. Wie aufgrund der

histologischen Ergebnisse, vergleiche Kapitel 5.3.3.1 und Kapitel 5.3.4.3, erwartet konnte innerhalb

der Kultivierungsdauer von bis zu 49 d eine kontinuierliche Steigerung des GAG-Gehaltes pro Probe

belegt werden. Bereits nach 21 d konnten 64,3 ± 14,1 µg CS/Scaffold bestimmt werden. Nach 35 d ist

eine weitere signifikante Zunahme messbar und nach 49 d Kultivierungsdauer wurden 153,2 ± 22,4

µg CS/Scaffold bestimmt. Diese Ergebnisse zeigen klar die Stoffwechselaktivität der bMFC auf der

Kollagenmatrix.

6,43E+01

1,17E+02

1,53E+02

0

50

100

150

200

21 35 49

m C

S [µ

g] S

caff

ol-1


Ergebnisse

Seite 79

Abbildung 34: GAG-Gehalt nach 21 d, 35 d und 49 d (wG; m CS [µg]/m Gewebe [mg]) in der neugebildeten

Matrix bezogen auf die Gewebemasse, ausgedrückt in Chondroitinsulfatäquivalenten, als Funktion der

Kultivierungszeit. NHChondroDiff Medium. Die Fehlerbalken entsprechen den Konfidenzintervallen (P = 95 %,

N = 6-8).

Abbildung 34 zeigt den GAG-Gehalt, wG (µg CS/mg Gewebe), in der neugebildeten Matrix bezogen

auf die Gewebemasse als Funktion der Zeit. Wie erwartet bleibt der durchschnittliche

Chondroitinsulfatgehalt wCS, von 82,64 ± 25,56 µg CS/mg Gewebe, im neugebildeten Gewebe

unabhängig von der Zunahme der Schichtdicke über 21 d bis 49 d Kultivierungsdauer konstant. Die

Ergebnisse belegen zusammen mit den Untersuchungen der Proliferation die Vitalität der bMFC auf

den Kollagenmatrizes sowie die besondere Eignung von NHChondroDiff Medium für die Kultivierung

boviner MFC auf der Kollagenmatrix.

Bei der quantitativen Bestimmung der Kollagensynthese wurde nicht zwischen Kollagen Typ I und

Typ II unterschieden. Analog zur GAG-Synthese wurden mittels Hydroxyprolin-Assay nach 21 d, 35 d

und 49 d Kultivierungsdauer die Hydroxyprolingehalte (wH) als Maß für die Kollagenbildung

bestimmt.

83,28

90,85

73,78

0

20

40

60

80

100

120

140

21 35 49

m C

S [µ

g] m

g G

eweb

e -1


Ergebnisse

Seite 80

Abbildung 35: Hydroxyprolingehalt, wH [µg Hyp] Scaffold-1

nach 21 d, 35 d und 49 d als Maß für die

Kollagensynthese als Funktion der Kultivierungszeit. NHChondroDiff Medium. Die Fehlerbalken entsprechen

den Konfidenzintervallen (P = 95 %, N = 6-8).

Abbildung 35 zeigt die Zunahme des Hydroxyprolingehalts als Maß für die Kollagensynthese boviner

MFC über die Zeit. Analog zur GAG-Bildung und aufgrund der histologischen Ergebnisse, vergleiche

Kapitel 5.3.3.1 und Kapitel 5.3.4.3, erwartet konnte innerhalb der Kultivierungsdauer von bis zu 49 d

eine kontinuierliche Steigerung des Hydroxyprolin-Gehaltes pro Probe belegt werden. Bereits nach

21 d konnten 12,1 ± 4,62 µg Hyp/Scaffold bestimmt werden. Nach 35 d ist eine deutliche Zunahme

messbar und nach 49 d Kultivierungsdauer wurden 37,9 ± 23,6 µg Hyp/Scaffold bestimmt. Wie

bereits der GAG-Quantifizierung zeigen diese Ergebnisse klar die Stoffwechselaktivität der bMFC

sowie die Synthese von Kollagen durch die bMFC auf der Kollagenmatrix.

12,10

22,15

37,93

0

10

20

30

40

50

60

70

21 35 49

m H

yp [

µg]

Sca

ffo

ld-1


Ergebnisse

Seite 81

Abbildung 36: Hydroxyprolingehalt, wH [µg Hyp], in der neugebildeten Matrix bezogen auf die Gewebemasse

nach 21 d, 35 d und 49 d als Funktion der Kultivierungszeit. NHChondroDiff Medium. N = 6-8. Die Fehlerbalken

entsprechen den Konfidenzintervallen, P = 95 %.

Abbildung 36 zeigt den wH [µg Hyp/mg Gewebe] in der neugebildeten Matrix als Funktion der

Kultivierungsdauer. Der durchschnittliche Hydroxyprolingehalt, wH, in Abhängigkeit der

Gewebemasse, von 15,10 ± 6,38 µg Hyp/mg Gewebe, im neugebildeten Gewebe bleibt unabhängig

von der Zunahme der Schichtdicke über 21 d bis 49 d konstant. Auch die Bestimmung des

Hydroxyprolingehaltes belegen zusammen mit der Bestimmung des GAG-Gehaltes und den

Untersuchungen der Proliferation die Vitalität der bMFC auf den Kollagenmatrizes sowie die

besondere Eignung von NHChondroDiff Medium für die Kultivierung boviner MFC auf der

Kollagenmatrix.

Neben signifikanter Proliferation, der Bildung einer Schicht aus neuem Gewebe auf der

Kollagenmatrix, siehe Kapitel 5.3.3.1, Kapitel 5.3.3.2 und Kapitel 5.3.3.3, wurde bei Kultivierung in

NHChondroDiff Medium bereits nach 14 d eine ausgeprägte Migration der bMFC in die

Kollagenmatrix entlang der Kollagenfasern beobachtet, siehe Abbildung 37 a und b. Die Zelldichte

nimmt im Inneren der Matrix somit mit der Zeit zu.

15,74 14,60 14,95

0

5

10

15

20

25

30

21 35 49

m H

yp [

µg]

mg

Gew

ebe

-1


Ergebnisse

Seite 82

Abbildung 37: Paraffinschnitte besiedelter Scaffolds nach a) 14 d und b) 70 d Kultivierung in NHChondroDiff

Medium. Hämatoxylin-Alcianblau Kombinationsfärbung. Nach 14 d ist eine ausgeprägte Zellmigration ohne

Matrixbildung entlang der Kollagenfasern zu beobachten. Nach 70 d ist auch bei allen migrierten Zellen im

Inneren des Scaffolds eine signifikante Matrixbildung beobachtbar. Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm.

Bereits nach 28 d ist um alle migrierten Zellen EZM-Bildung beobachtbar. Nach 70 d ist wie Abbildung

37 b zeigt und im Weiteren zeitlichen Verlauf bis zu 112 d um alle migrierten Zellen, auch im Inneren

der Kollagenmatrix, signifikante EZM Neubildung belegbar. Diese Ergebnisse zeigen, dass durch den

Prozess Migrationswege in die Matrix freigelegt wurden und einen Migration von Zellen in die

Kollagenmatrix möglich war. Zudem belegen diese Ergebnisse die sehr guten chondrokonduktiven

Eigenschaften der Kollagenmatrix.

5.3.4.4 Kultivierung in Dulbecco`s Modified Eagle Medium mit Metabolismus fördernden

Zusätzen und Wachstumsfaktoren

Die zu prüfende Hypothese war, ob durch eine zu schnelle EZM Neubildung eine Migration weiterer

Zellen behindert wird. Vier weitere getestete, definierte Medien beruhen auf einem modifizierten

Medium das auch die chondrogene Differenzierung von Stammzellen fördert [80-81]. Sie enthalten

den Wachstumsfaktor Transforming growth factor-beta1 (TGF-β1) und aufgrund seiner vielfältigen

molekularen, genomischen und nichtgenomischen Wirkung durch Eingreifen in die

Signaltransduktion bei Transkriptionsfaktoren [78] [77] den Metabolismus steigerndes

Dexamethason und Insulin [76], Na-Pyruvat, sowie die Kollagenbildung förderndes L-Prolin und

Ascorbat-2-phosphat. Zusätzlich wurden die migrationsfördernden Wachstumsfaktoren Hepatocyte

growth factor (HGF) [79, 161], Platelet derived growth factor-AB (PDGF-AB) [79, 161, 163] auch in

Kombination zugegeben.

5.3.4.5 Kultivierung in Dulbecco`s Modified Eagle Medium mit TGF-β1

Für den Wachstumsfaktor TGF-β1 werden in der Literatur verschiedene fördernde Effekte bei der

Synthese knorpelspezifischer EZM Bestandteile wie Kollagen und Proteoglykane beschrieben und

b

a

Ergebnisse

Seite 83

keine direkten migrationsfördernden Effekte [1]. Als Referenz und im Hinblick auf EZM Synthese

erfolgten Kultivierungen besiedelter Kollagenmatrizes auch in modifiziertem Medium nach Buxton et.

al. nur mit Zugabe von 10 ng∙ml-1 TGF-β1 über einen Zeitraum bis zu 52 d. Die Ergebnisse der

Hämatoxylin-Alcianblau - und der IHC-Färbungen sind in Abbildung 38 dargestellt.

Abbildung 38: Paraffinschnitte (Schnittdicke = 5 µm) besiedelter Kollagenmatrizes nach Kultivierung in DMEM

mit TGF-β1. a-c: Hämatoxylin-Alcianblau Kombinationsfärbung a) 14 d, b) 28 d, c) 52 d. d-f: IHC-Färbung nach

42 d Kultivierungsdauer von d) Aggrecan, e) Kollagen Typ I und f) Kollagen Typ II. Die Zellkerne sind mit

Hämatoxylin gegengefärbt und erscheinen dunkelblau bis schwarz. Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm.

Die Hämatoxylin-Alcianblau Kombinationsfärbung besiedelter Kollagenmatrizes, siehe Abbildung

38 a-c, zeigt eine über die Zeit zunehmende Bildung einer Schicht aus Zellen und extrazellulärer

Matrix. Bereits nach 14 d (Abbildung 38 a) sind bis zu 300 µm tief im Inneren der Kollagenmatrix

Zellkerne migrierter Zellen gefärbt. Auch nach 28 d (Abbildung 38 b) und nach 52 d (Abbildung 38 c)

sind bis maximal ca. 400 µm in der Kollagenmatrix Zellkerne migrierter Zellen gefärbt. Auffallend ist,

dass alle migrierten Zellen stets entlang von Kollagenfasern gefunden werden. Nach 14 d Kultivierung

ist eine maximal 30 µm dicke Zellschicht auf der Oberfläche der Kollagenmatrix zu beobachten,

welche nach 52 d auf etwa 100 µm Dicke anwächst. Obwohl für den Wachstumsfaktor TGF-β1 keine

migrationsfördernde Wirkung beschrieben ist [1], konnte in DMEM mit TGF-β1 und Metabolismus

steigernden Zusätzen Zellmigration beobachtet werden. Um migrierte Zellen ist keine

EZM-Neubildung beobachtbar.

a b c

e d f

Ergebnisse

Seite 84

Nach 42 d Kultivierung zeigt sich in der IHC-Färbung eine intensive braune Aggrecan-Färbung

(Abbildung 38 a) und intensive rote Kollagen Typ I-Färbung (Abbildung 38 b) in der ca. 100 µm dicken

Schicht aus Zellen und EZM. Die Kollagenmatrix selbst ist in der Aggrecan-Färbung kaum, bei der

Kollagen Typ I-Färbung ebenfalls intensiv rot gefärbt. Die Kollagen Typ II-Färbung (Abbildung 38 c) ist

nur sehr schwach ausgeprägt.

5.3.4.6 Kultivierung in Dulbecco`s Modified Eagle Medium DMEM mit TGF-β1 und HGF

Für eine gesteigerte Zellmigration wurde dem modifizierten Medium nach Buxton et. al. zusätzlich zu

TGF-β1 der migrationsfördernde Wachstumsfaktor HGF (10 ng∙ml-1) zugesetzt [161]. Die Kultivierung

erfolgte bis zu 21 d. In Abbildung 39 a und b sind die Ergebnisse nach 14 d und 21 d Kultivierung

dargestellt.

Abbildung 39: Paraffinschnitte (Schnittdicke = 5 µm) besiedelter Kollagenmatrizes nach a) 14 d und b) 21 d

Kultivierung in DMEM mit TGF-β1 und HGF. Hämatoxylin-Alcianblau Kombinationsfärbung. Der Maßstabsbalken

entspricht 100 µm.

Nach 14 d Kultivierung ist eine ca. 50 µm dicke und nach 21 d Kultivierung eine stellenweise bis zu ca.

150 µm dicke Zellschicht zu beobachten, siehe Abbildung 39 a und b. Weiterhin sind einige in die

Matrix migrierte Zellen zu sehen. Auffällig ist die Migrationsrichtung entlang der Kollagenfasern

(Abbildung 39 b). Zwischen 14 d (Abbildung 39 a) und 21 d (Abbildung 39 b) ist ein deutlicher

Unterschied erkennbar. Nach 14 d (Abbildung 39 a) sind nur wenige Zellen in der Matrix färbbar,

wohingegen nach 21 d mehr Zellen in der Matrix zu beobachten sind. Allerdings fällt auf, dass sich die

Matrix der 14 d kultivierten Probe von der Matrix der 21 d kultivierten Probe unterscheidet. Wie die

Schnitte zeigen ist sind die Kollagenfaserbündel der 14 d Probe im Schnitt quer getroffen während

die Kollagenfaserbündel der 21 d Probe im Schnitt längs getroffen sind. Abbildung 39 b zeigt, dass

bMFC entlang der Kollagenfasern migriert sind. Die in der Matrix beobachteten, migrierten Zellen,

zeigen im Vergleich zu den auf der Matrix angefärbten Zellen eine langgestreckte Morphologie

a b

Ergebnisse

Seite 85

während die Zellen in der Schicht eine mehr runde Morphologie zeigen. Eine Matrixbildung um

migrierte Zellen ist nicht beobachtbar.

Die Ergebnisse der IHC-Färbungen von Aggrecan, Kollagen Typ I und Kollagen Typ II sind in Abbildung

40 a-c dargestellt.


mit TGF-β1 und HGF. IHC-Färbung von a) Aggrecan, b) Kollagen Typ I und c) Kollagen Typ II, nach 21 d

Kultivierung. Die Zellkerne sind mit Hämatoxylin gegengefärbt und erscheinen dunkelblau bis schwarz. Der


Nach 21 d Kultivierung ist eine stellenweise bis zu ca. 150 µm dicke Zellschicht auf der Kollagenmatrix

zu beobachten, siehe Abbildung 40 a-c. Abbildung 40 a zeigt eine schwache Aggrecan-Färbung der

Zellschicht nach 21 d Kultivierung. Die Matrix ist kaum angefärbt. Hingegen ist die Kollagen

Typ I-Färbung nach 21 d intensiv rot. Sowohl die Zellschicht als auch die Matrix selbst sind deutlich

angefärbt wobei die Schicht gleichmäßig gefärbt ist. Im Falle der Kollagen Typ II-Färbung ist kaum

eine Färbung zu erkennen, welche im Vergleich im Vergleich zur Kultivierung in modifiziertem

Medium ohne HGF (siehe Kapitel 5.3.4.5) geringer ausfällt.

5.3.4.7 Kultivierung in Dulbecco`s Modified Eagle Medium DMEM mit TGF-β1 und PDGF-AB

Analog zu vorhergehendem Kapitel wurden Experimente mit modifizierten Medium nach Buxton et.

al. welchem der migrationsfördernde Wachstumsfaktor PDGF-AB (10 ng∙ml-1) [79, 161, 163]

zugesetzt wurde. Abbildung 41 a und b zeigt die Ergebnisse der Hämatoxylin-Alcianblau

Kombinationsfärbung nach 14 d und 21 d Kultivierung.

a b c

Ergebnisse

Seite 86


Kultivierung in DMEM mit TGF-β1 und PDGF-AB. Hämatoxylin-Alcianblau Kombinationsfärbung. Der


Bei Kultivierung in modifiziertem Medium mit TGF-β1 und PDGF-AB ist nach 14 d eine ca. 50 µm dicke

und nach 21 d eine ca. 100 µm dicke Zellschicht zu beobachten. Weiterhin sind nach 14 d (Abbildung

41 a) und nach 21 d (Abbildung 41 b) Kultivierung einige bis zu ca. 200 µm (Abbildung 41 b) in die

Matrix migrierte Zellen zu beobachten. Auffällig ist auch hier die Migrationsrichtung entlang der

Kollagenfasern (Abbildung 41 b). Wie bereits bei Experimenten mit modifiziertem Medium welchem

der Wachstumsfaktor HGF zugesetzt wurde fällt auf, dass sich die Matrix der 14 d kultivierten Probe

von der Matrix der 21 d kultivierten Probe hinsichtlich der Kollagenfaserorientierung unterscheidet.

Nach 21 d Kultivierung sind weniger quer getroffene Kollagenfaserbündel und mehr längs

geschnittene Kollagenfaserbündel zu erkennen entlang welcher Zellmigration beobachtet wird. Die

Zellkerne der migrierten Zellen zeigen eine langgestreckte Morphologie während im Vergleich die

Zellkerne der Zellen in der Schicht eine mehr runde Morphologie zeigen. Eine Matrixbildung um

migrierte Zellen ist nicht beobachtbar.


42 a-c dargestellt.

a b

Ergebnisse

Seite 87


mit TGF-β1 und PDGF-AB. IHC-Färbung von a) Aggrecan, b) Kollagen Typ I und c) Kollagen Typ II, nach 21 d



Abbildung 42 b zeigt die intensive IHC-Färbung von Kollagen Typ I nach 21 d Kultivierung. Die

IHC-Färbung von Kollagen Typ II (Abbildung 42 c) und Aggrecan (Abbildung 42 a) ist im Vergleich dazu

sehr schwach ausgeprägt. Nach 21 d ist eine homogene Zellschicht mit ca. 100 µm Dicke zu

beobachten. Die Ergebnisse sind vergleichbar mit der Kultivierung in modifizierten DMEM mit HGF

(siehe Kapitel 5.3.4.6).

5.3.4.8 Kultivierung in Dulbecco`s Modified Eagle Medium DMEM mit TGF-β1, HGF und PDGF-AB

Weiterhin wurden HGF und PDGF-AB auch in Kombination (je 10 ng∙ml-1) in Kombination mit

modifizierten Medium nach Buxton et al. eingesetzt [80]. Die Kultivierungsdauer betrug ebenfalls

maximal 21 d. Die Ergebnisse der Hämatoxylin-Alcianblau Kombinationsfärbung nach 14 d und 21 d

Kultivierung zeigt Abbildung 43 a und b.


Kultivierung in DMEM mit TGF-β1, HGF und PDGF-AB. Hämatoxylin-Alcianblau Kombinationsfärbung. Der


b a

a b

c

Ergebnisse

Seite 88

In Abbildung 43 a ist nach 14 d Kultivierung eine ca. 50 µm dicke Zellschicht und in Abbildung 43 b

nach 21 d stellenweise bis 100 µm dicke Zellschicht zu sehen. Weiterhin sind einige in die Matrix

migrierte Zellen zu beobachten wobei auch hier die Migrationsrichtung entlang der Kollagenfasern

auffällt. Wie bereits vorangegangene Experimente mit modifiziertem DMEM und

migrationsfördernden Wachstumsfaktoren gezeigt hatten ist auch hier keine Matrixbildung bei

migrierten Zellen zu beobachten.


44 a-c zu sehen.


mit TGF-β1,HGF und PDGF-AB. IHC-Färbung von a) Aggrecan, b) Kollagen Typ I und c) Kollagen Typ II, nach 21 d



Der spezifische Nachweis neugebildeter EZM mittels IHC-Färbung nach 21 d ergab auch hier eine

gleichmäßige, intensive Kollagen Typ I-Färbung, siehe Abbildung 44 b. Sowohl die die Aggrecan -

(Abbildung 44 a) als auch die Kollagen Typ II-Färbung (Abbildung 44 c) zeigen eine sehr schwache

Färbung hauptsächlich an der Oberfläche der Zellschicht.

In allen verwendeten Medienvariationen ist die Zellmigration im Vergleich zu DMEM/Ham`s F12 mit

10% FBS durch die Zusätze gesteigert und mit der in NHChondroDiff vergleichbar (siehe Abbildung

37 a und b). HGF (siehe Kapitel 5.3.4.6) stimuliert die Zellmigration erheblich und dahingehend, dass

auch in dichteren Zonen der Kollagenmatrix Zellen mit einer langestreckten Morphologie, wie sie für

Chondrozyten beschrieben wird [95, 105], zu finden sind. PDGF-AB hatte weder einen hemmenden,

noch einen fördernden Einfluss.

5.3.5 Einfluss der Kollagenstruktur auf die Zellmigration

In den bisher beschriebenen Experimenten zeigte sich, dass Zellmigration stets entlang von

Kollagenfasern der aufgelockerten Kollagenmatrix beobachtet wurde, wobei Kollagen als Substrat zur

Zelladhäsion dient [95]. Da Meniskusgewebe, wie in Kapitel 2.1.2 beschrieben, ein heterogenes

c b a

Ergebnisse

Seite 89

Gewebe mit zonalen Unterschieden in der Kollagenstruktur ist [31], wurde der Einfluss der dicht

gepackten superfiziellen Schicht des Meniskus auf die Zellmigration untersucht. Die Kultivierung

erfolgte in NHChondroDiff Medium über einen Zeitraum bis zu 28 d. Als Referenz wurden Matrizes

ohne superfizielle Schicht mitgeführt. Die Ergebnisse nach 28 d Kultivierung sind in Abbildung 45

dargestellt.

Abbildung 45: Paraffinschnitte besiedelter Scaffolds mit und ohne superfizielle Schicht nach28 d Kultivierung in

NHChondroDiff. Hämatoxylin-Alcianblau Kombinationsfärbung. a) Scaffold ohne superfizielle Schicht; b) und c)

Scaffolds mit superfizieller Schicht. Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm.

Signifikante Unterschiede wurden bei Scaffolds ohne superfizielle Schicht und mit superfizieller

Schicht bezüglich des Einflusses der Kollagenstruktur auf die Zellmigration festgestellt. Wie Abbildung

45 a zeigt kann bei Kollagenmatrizes ohne superfizielle Schicht Zellmigration entlang der

Kollagenfasern beobachtet werden (vergleiche auch Kapitel 5.3.3 und Kapitel 5.3.4). Bei

Kollagenmatrizes mit superfizieller Schicht, siehe Abbildung 45 b und c ist eine eindeutige Trennung

zwischen der Matrix und der neugebildeten Zellschicht zu beobachten. Obwohl die Zellen auf der

Matrix adhärieren EZM bilden kann selbst in NHChondroDiff Medium keine Zellmigration beobachtet

werden.

c b a

Fehlerbetrachtung

Seite 90

6 Fehlerbetrachtung

Da im Rahmen dieser Arbeit keine neuen Messmethoden entwickelt wurden und prinzipielle

Messungenauigkeiten verwendeter Laborgeräte wie Analysenwaage, Pipetten Messgefäße oder

Spektralphotometer bzw. Plate-Reader hinreichen bekannt sind sollen umfangreiche

Fehlerbetrachtung hier nicht Gegenstand sein. Die meisten angewendeten Methoden sind seit

Langem etabliert und können anhand von Erfahrungswerten abgeschätzt und vermieden werden.

Vielmehr führen auch kleinere Abweichungen bei der Handhabung und Durchführung von Methode

zu nicht systematischen Fehlern. Die Varianz von ermittelten Messwerten wurde durch die

Anwendung der Standardabweichung bei Probenzahlen weniger N = 5 und die Berechnung von

Konfidenzintervallen bei Probenzahlen größer N = 5 angegeben. Im Folgenden soll daher auf

mögliche Unsicherheiten bei ausgewählten Methoden eingegangen werden.

Photometrische Messungen

Vorausgesetzt wird bei photometrischen Messungen, dass nur Messwerte die innerhalb des

Kalibrierbereiches und nicht an den unteren oder oberen Detektionsgrenzen liegen verwendet

werden. Neben dem Gerätefehler liegen bei photometrischen Messungen die Hauptfehler bei

Verdünnungs- und bzw. oder Pipettierfehlern.

Bei allen im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten photometrischen Messungen erfolgten daher

stets Doppel - bis Vierfachbestimmungen je Probe, bei mindestens N = 4 Parallelproben. Aufgrund

der daraus resultierenden hohen Anzahl an Messwerten werden für alle Messungen die Mittelwerte

mit den entsprechenden Konfidenzintervalle bei P = 0,95 angegeben. Bei der Auswertung, z.B. bei

photometrischen DNA-Quantifizierungen wurden die Nachweisgrenzen (0,06 ng/mg für DNA

Bestimmungen) beachtet.

Bestimmung der Zellzahl

Bestimmungen der Zellzahl bei Wachstumskurven oder für die Herstellung definierter

Zellsuspensionen erfolgten durch mehrfaches Auszählen von vier Großquadraten einer

Neubauerzählkammer nach Trypanblau-Färbung der Zellen. Für repräsentative Ergebnisse ist auf die

Vermeidung von Zellagglomeraten sowie die Probenahme aus gut resuspendierten und

durchmischten Zellsuspensionen zu achten. Entsprechende Verdünnungen wurden anhand von

Erfahrungswerten und des Erwartungshorizonts angepasst.

Bei allen Versuchen wurde nur mit Zellsuspensionen weiter gearbeitet, welche bei

Vitalitätsbestimmungen mit Trypanblau-Färbung mindestens 95 % Vitalität zeigten.

Fehlerbetrachtung

Seite 91

Reproduzierbarkeit bei Verwendung von Primärzellen

Im Gegensatz zu Experimenten mit etablierten Zelllinien sind bei Experimenten mit primären Zellen

deutlich, beispielsweise durch mögliche Vorkultur zur Amplifikation und damit die Passagenzahl

beeinflusste, unterschiedliche Ergebnisse zu erwarten welche die Reproduzierbarkeit der

Experimenten beeinflussen und die Vergleichbarkeit erschweren oder nicht erlauben. Um für alle

Experimente identische Startbedingungen zu schaffen, wurden die isolierten primären bovinen

Meniskusfibrochondrozyten (bMFC) generell nach der Isolierung zunächst im 2D Kultur bis 80-90 %

Konfluenz amplifiziert, Passage 0 (P0). Anschließend wurden die bMFC kryokonserviert und bei -80°C

gelagert. Für die Revitalisierungsexperimente sowie für Zytotoxizitätsbestimmungen wurden die

Zellen ein weiteres Mal bis 80-90 % Konfluenz amplifiziert, Passage 1 (P1). Diese Vorgehensweise

stellt zudem sicher, dass wie in der Literatur bei Chondrozyten beschriebene, durch Expansion in

Monolayer bedingte Dedifferenzierungen mit dem Verlust des spezifischen Phänotyps [148-149]

sowie Änderungen der Genexpression und der Sekretion knorpelspezifischer extrazellulärer Matrix

[150-151] [152] verringert wurden. Zudem garantierte diese standardisierte Vorgehensweise

reproduzierbare Ergebnisse bei Besiedelungsexperimenten der Kollagenmatrix.

Entnahme der Kollagenmatrizes aus dem Meniskusgewebe

Bei der Herstellung von, im Rahmen dieser Arbeit, mehr als 1.000 verwendeten Scaffolds aus

Meniskusgewebe wurde, wie in Kapitel 4.1.1.1 beschrieben, im Bereich des Vorderhorns, des

Hinterhorns und der Pars Intermedia mittels einer Biopsiestanze Gewebezylinder ausgestanzt. Aus

diesen Gewebezylindern (siehe Abbildung 14) wurden die Scaffolds geschnitten, nachdem durch

Entfernen der unebenen Oberfläche zunächst eine ebene Schnittfläche des Gewebezylinders

resultierte. Da Meniskusgewebe von Natur aus eine sehr heterogene Struktur mit zonalen

Unterschieden hinsichtlich Größe und Orientierung der Kollagenfasern aufweist [31], ergaben sich

daher von der ursprüngliche Lokalisation der Probe im Gewebe abhängige Unterschiede in der

Kollagenstruktur. Durch diese Art der Probenvorbereitung erhielt man Kollagenmatrizes die sich in

ihrer 3D Orientierung der Kollagenstruktur teilweise deutlich voneinander unterschieden hatten. So

erhielt man Scaffolds die eine dicht gepackte Struktur aufweisen und Scaffolds die eine aufgelockerte

Struktur aufwiesen.

Histologische und immunohistologische Auswertung von Paraffinschnitten besiedelter

Kollagenmatrizes

Bedingt durch die Heterogenität des Meniskusgewebes wurden, wie bereits in vorangegangenem

Punkt beschrieben, Kollagenmatrizes mit zonalen Unterschieden in der Kollagenstruktur für

Revitalisierungsexperimente verwendet. Diese strukturellen Unterschiede sind besonders auch bei

der Betrachtung und Auswertung histologischer und immunohistologischer Färbungen von

Fehlerbetrachtung

Seite 92

Paraffinschnitten hinsichtlich Zellmigration in die Kollagenmatrix auffällig. So wurde beobachtet, dass

bei Proben welche überwiegend quer geschnittene, dicht gepackte Kollagenfasern erkennen ließen,

im Vergleich zu identischen Proben welche überwiegend parallel geschnittene locker gepackte

Kollagenfasern erkennen ließen, ein deutlicher Unterschied bei der Zellmigration festgestellt werden

konnte. Die beobachteten Unterschiede sind demnach hauptsächlich auf die natürlichen,

strukturellen Unterschiede der Kollagenmatrizes zurückzuführen.

Bei der Herstellung von Paraffinschnitten wurde zudem sehr darauf geachtet, dass bei allen Proben

zunächst durch Trimmen eine ebene Schnittfläche erhalten wurde und auch, dass alle Schnitte aus

den zentralen Bereichen der Probe angefertigt wurden und keine Schnitte aus beispielsweise aus

Randbereichen stammten und dann mit Schnitten aus dem inneren Bereich verglichen wurden. Vor

dem Überführen der Schnitte auf den Objektträger wurde zudem darauf geachtet, dass die Schnitte

sich im Wasserbad gestreckt hatten und keine erkennbaren Falten aufwiesen in welche sich bei den

angewendeten Färbemethoden Farbstoff ansammeln kann und so zu falsch positiven Färbungen

führt.

Quantifizierung von alpha-Gal Epitopen mittels ELISA

Bei der Quantifizierung von alpha-Gal Epitopen mittels ELISA ist auf eine sehr gute Homogenisierung

der Gewebeproben zu achten. Dabei ist der entscheidende Punkt, dass die Epitope so gut wie

möglich zugänglich gemacht werden um eine bestmögliche Bindung der Antikörper zu gewährleisten.

Auch ist die geeignete Probenverdünnung zu beachten. Je größer die Verdünnungsstufen werden,

umso größer ist auch der statistische Fehler.

In vitro Zytotoxizitätsbestimmungen

Die in vitro Zytotoxizitätsbestimmungen wurden im 96-Well Format durchgeführt. Als besonders

entscheidender Faktor ist die Zellzahl zu nennen. Es ist stets darauf zu achten, dass in alle Wells eine

identische Zellzahl ausgesät wird da prinzipiell die Stoffwechselaktivität der Zellen bestimmt wird

wobei die der Werte der Proben und der Positivkontrolle auf die Negativkontrolle bezogen werden.

Um die prinzipielle Vergleichbarkeit zu gewährleisten und um sinnvolle Aussagen treffen zu können

ist daher darauf zu achten Schwankungen der Zellzahl zu vermeiden. Da bei der praktischen

Durchführung während der Belegung der Platten Schwankungen der Zellzahlen pro Well

unvermeidbar waren konnten sich diese in den bestimmten Stoffwechselaktivitäten wiederspiegeln.

Diskussion

Seite 93

7 Diskussion

Aufgrund des geringen bzw. fehlenden intrinsischen Heilungsvermögens von Meniskusgewebe ist die

funktionelle und dauerhafte Rekonstruktion durch geeignete Ersatzmaterialien von besonderem

Interesse [9, 164-165]. Speziell aufgrund eines potenzierten Verletzungsrisikos mit einer Vielzahl

möglicher Verletzungen im Bereich des Kniegelenks zeigen jährlich mehr als 400.000 chirurgische

Eingriffe am Meniskus in Europa [2] und jährlich sogar über 600.000 [1, 3-4, 8] Eingriffe am Meniskus

in den USA die besondere Relevanz von Meniskusverletzungen. Obwohl bereits in den

neunzehnhundert sechziger Jahren die besondere Bedeutung der Menisken als vitaler und

funktioneller Bestandteil des Kniegelenks erkannt wurde und auch trotz intensiver

Forschungsaktivitäten im Bereich des Meniskusersatzes mit vielen verschiedenen Ansätzen ist bisher

kein geeignetes Ersatzmaterial gefunden worden [1]. Dies zeigt auch die Tatsache, dass der Erhalt

intakten Meniskusgewebes den aktuellen "Goldstandard" in der klinischen Praxis darstellt [11].

7.1.1 Rückstände von Zellen und Zellbestandteilen

Zellen und Zellbestandteile tierischen Gewebes stellen nicht nur bei der Transplantation von Organen

sondern auch bei Transplantation tierischen Gewebes eine immunologische Barriere dar, die zu

akuten, hyperakuten zellulären oder chronischen Abstoßungsreaktionen führen kann [72, 166].

Daher ist hinsichtlich einer beabsichtigten Anwendung der Kollagenmatrix in der Humanchirurgie die

bestmögliche Entfernung aller zellulären Komponenten erforderlich. Im Rahmen dieser Arbeit

wurden für den Nachweis der Zellentfernung aus der Meniskusmatrix sowohl qualitative Methoden

(Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbungen von Paraffinschnitten) als auch quantitative Methoden, wie

photometrische DNA-Quantifizierung und Quantifizierungen immunologisch relevanter

Determinanten (α-Gal Epitope) mittels enzyme linked immunosorbent assay ELISA durchgeführt.

Histologische Untersuchungen der Kollagenmatrix und nativen Gewebes mittels HE-Färbung von

Paraffinschnitten, siehe Abbildung 15 a und b Kapitel 5.1.1.1, zeigen eine vollständige

Dezellularisierung. In der Kollagenmatrix waren im Gegensatz zu nativem Meniskusgewebe keine

Zellkerne färbbar. Zudem zeigen die histologischen Untersuchungen auch eine morphologisch

beobachtbare Auflockerung der Kollagenmatrix. Diese Auflockerung soll eine Besiedelung und

Revitalisierung der Kollagenmatrix mit Zellen begünstigen [18, 62]. Die Behandlung mit deionisiertem

Wasser (H2Odeion. 24 h) führt zum Quellen des Gewebes und bewirkt osmotisch die Zerstörung von

Zellen. Ferner führt die im nächsten Schritt eingesetzte, stark denaturierend wirkende 1 N

NaOH-Lösung durch Sorption überschüssiger OH- Ionen an das Kollagen zu starkem Quellen des

Gewebes [167]. Durch Behandlung mit 1 N NaOH werden so Zellen weiter zerstört, was zu

Diskussion

Seite 94

Denaturierung von Zellbestandteilen wie Membranen, RNA bis zum Freisetzen von DNA führt. Zudem

werden nichtkollagene Gewebebestandteile wie Proteoglykane denaturiert, mobilisiert [168], und

können so leichter durch Spülschritte mit H2Odeion. entfernt werden. Darauf ist auch die bereits in der

Histologie morphologisch beobachtbare Auflockerung der dichten extrazellulären Matrix (EZM)

zurückzuführen.

Die Ergebnisse der DNA-Quantifizierung bestätigen die Ergebnisse der Histologie. Es zeigte sich, dass

durch den Herstellungsprozess die DNA vollständig entfernt wurde. Der DNA-Gehalt nahm von

0,28 ± 0,11 µg DNA/mg Gewebe (Feuchtgewicht) auf Gehalte unter der Nachweisgrenze von

0,06 ng/mg ab, siehe Kapitel 5.1.1.2, Tabelle 7. Stableton et al. erreichte mit einer enzymatischen

Dezellularisierungsmethode ebenfalls bei porcinem Meniskusgewebe nur DNA-Gehalte von

2,0 ± 0,5 ng/mg (Feuchtgewicht, ausgehend von 40,0 ± 9,7 ng/mg) [169]. Welche Auswirkungen DNA

Reste in biologischen Implantatmaterialien haben, kann bisher nicht eindeutig beantwortet werden.

Untersuchungen kommerziell erhältlicher biologischer Gerüstmaterialien (porcine small intestinal

submucosa [Oasis®], humane Dermis [Alloderm™], porcine Dermis [Zimmer collagen repair patch]

etc.) von Gilbert et al. [155] ergaben, dass bei allen Materialien der Großteil der DNA durch das

Herstellungsverfahren reduziert wurde aber alle Materialien niedrige Restgehalte, typischerweise als

kleine Fragmente von weniger als 300 Basenpaaren aufwiesen. Da trotz dieser nachweisbaren DNA

Reste alle untersuchten Materialien erfolgreich klinisch angewendet werden, gehen die Autoren

davon aus, dass durch DNA bedingte Effekte höchst unwahrscheinlich sind. Die klinische Praxis zeigt

demzufolge die Verträglichkeit von Biomaterialien trotz DNA-Restgehalten [170]. Im Gegensatz dazu

berichten Zheng et al. [171] von entzündlichen Reaktionen im Tiermodell nachdem Scaffolds,

hergestellt aus porcine small intestinal submucosa (SIS), welche nachweisbare porcine

Zellbestandteile (DNA nachgewiesen mittels nested PCR) enthielten, implantiert wurden. Nachdem

die Frage möglicher entzündlicher Reaktion hervorgerufen durch DNA-Restgehalte in Bioimplantaten

nicht eindeutig beantwortet werden kann und auch keine regulatorischen Vorgaben bezüglich des

DNA-Restgehalts existieren, ist daher davon auszugehen, dass eventuell in der Kollagenmatrix

vorhandene DNA-Gehalte von unter 0,06 ng/mg keine inflammatorischen Reaktionen hervorrufen

und sich nicht negativ auf die biologische Verträglichkeit des Matrixmaterials auswirken.

Untersuchungen zeigen, dass DNA Fragmente ebenso wie nicht quervernetzte EZM Moleküle auch,

nach Implantation in vivo einer rapiden Degradation durch enzymatischen Abbau unterliegen [172-

173].

Für die antigenen Eigenschaften des Knorpels sind vor allem die α-Gal-Epitope der

Oberflächenglycokonjugate porciner Zellen verantwortlich [71, 73]. Evolutionär bedingt exprimieren

Altweltaffen und Menschen den natürlichen anti-Gal-Antikörper, der für hyperakute oder chronische

Diskussion

Seite 95

Abstoßung nach Transplantation porciner Organe und Gewebe verantwortlich zeichnet. Daher ist die

Quantifizierung der α-Gal-Epitope besonders wichtig um Aussagen hinsichtlich der Antigenität der

Kollagenmatrix treffen zu können. Die Ergebnisse des α-Gal Tests mittels indirektem ELISA mit dem

Antikörper M 86 zeigt Abbildung 18, Kapitel 5.1.1.3. Für einen qualitativen Vergleich wird der IC50

angegeben [174]. Bei einer Gewebekonzentration von 200 mg∙ml-1 konnte in nativem Gewebe eine

Hemmung von 62,2 ± 14,2 % bestimmt werden. Durch den Prozess wurde die Anzahl der stark

immunogenen α-Gal Epitope in der Kollagenmatrix so weit verringert, dass bei einer

Gewebekonzentration von 200 mg∙ml-1 eine maximale Hemmung von 8,65 ± 5,01 % bestimmt

werden konnte. Diese entspricht der Hemmung nativen Gewebes mit einer Gewebekonzentration

von unter 0,78 mg∙ml-1 wodurch letztlich eine Abreicherung der α-Gal Epitope um einen Faktor

größer als 2,56∙102 erreicht werden konnte. Aussagen hinsichtlich möglicher immunologischer

Reaktionen der Kollagenmatrix bei Anwendung in der Humanchirurgie lassen sich anhand dieser

Ergebnisse nicht treffen [71, 73, 154, 175]. Letztendlich könnte die Qualität der Kollagenmatrizes nur

im Tierversuch verlässlich analysiert werden. Daher besteht hinsichtlich der Zielstellung einer

vollständigen α-Gal Entfernung, welche keine α-Gal vermittelten Abstoßungsreaktionen erwarten

lässt, weiterer Optimierungsbedarf des Prozesses etwa durch Intensivierung der alkalischen

Behandlung, mittels Ultraschalleintrag oder längerer Einwirkzeit der NaOH-Lösung, wobei der

schädigende Einfluss berücksichtigt werden muss. Zu prüfen wäre auch, ob möglicherweise bereits

eine Intensivierung der Spülschritte mit H2Odeion durch Temperaturerhöhung oder Ultraschalleintrag

ausreicht.

7.1.2 Glykosaminoglykan Restgehalte

Die Glycosaminoglykane (GAG) der extarzellulären Matrix des Meniskusgewebes behindern ein

Entfernen zellulärer und inflammatorischer Determinanten. Daher wurde der GAG-Gehalt nativen

Gewebes und der Kollagenmatrix sowohl qualitativ mittels Alcianblau-Färbung als auch quantitativ

mittels des Dimethylmethylenblau-Assay (DMMB-Assay) bestimmt. Die Abnahme der GAG

Konzentration ist also ein Maß für den Reinigungsfortschritt, zudem zeigen die GAG im Gegensatz zu

Kollagen eine deutlich geringere Resistenz gegenüber den Prozesslösungen [176]. So werden die GAG

durch 1 N NaOH-Lösung hydrolysiert [168] aber auch gezielt durch Guanidiniumchlorid (1 M, 96 h)

extrahiert [34, 36]. Weiterhin erfolgt durch die beabsichtigte Entfernung der GAG eine Auflockerung

des Gewebes, wodurch potentielle Migrationswege für Zellen freigelegt werden können und eine

Revitalisierung, auch im Inneren der Matrix begünstigt, werden soll.

Die histologische Auswertung der Kollagenmatrix ergab im Vergleich zu nativem Gewebe keine

Blaufärbung, siehe Abbildung 19 b Kapitel 5.1.2.1. Anhand dieser Ergebnisse liegt der Schluss nahe,

Diskussion

Seite 96

dass die GAG, wie beabsichtigt, nahezu vollständig eliminiert wurden. Wie bereits die HE-Färbung

gezeigt hatte (siehe Kapitel 5.1.1.1 und Kapitel 7.1.1) erscheint die Kollagenmatrix auch in der

Alcianblau-Färbung aufgelockert. Dieser Effekt ist neben der Entfernung der hochmolekularen

Proteoglykane, wie Aggrecan auch auf die Entfernung niedermolekularer Proteoglykanen, wie

Biglycan und Decorin zurückzuführen. In nativem Gewebe sind beide Arten von Proteoglykanen über

eine hohe Anzahl von Wasserstoffbrückenbindungen an Kollagen Typ I und Typ VI gebunden und

stabilisieren so die Kollagenfasern [177-179]. Die Extraktion führt daher zu einer Auflockerung des

Kollagennetzwerkes.

Die quantitative GAG Bestimmung ergab in Bezug auf den Reinigungserfolg bei GAG eine geringere

Abnahme als bei zellulären Komponenten, wobei eine signifikante Reduzierung der GAG um 61,37 %

erreicht werden konnte. Die Ergebnisse, siehe Tabelle 8 Kapitel 5.1.2.2, zeigen, dass in nativem

Referenzgewebe durchschnittlich 11,0 ± 2,65 µg CS/mg Gewebe, während in der Kollagenmatrix

durchschnittlich 4,25 ± 0,34 µg CS/mg Gewebe bestimmt werden konnten. Mit einem enzymatischen

Verfahren erreichten Stapleton et al. [169] ebenfalls bei porcinem Meniskusgewebe eine

vergleichbare Abnahme um 59,4 % (30,3 auf 12,3 mg/g).

Ob die Reduzierung der GAG um 61,37 % ausreicht und der GAG Restgehalt von 38,63 %

möglicherweise entzündliche Reaktionen hervorrufen kann lässt sich auch anhand der Literatur nicht

eindeutig beantworten. Dies könnten nur entsprechende in-vivo Studien zeigen. Wie

Untersuchungen ähnlicher EZM basierter Biomatrizes von Badylak et al. zeigen, werden Restgehalt

an GAG in Bioimplantaten aber als durchaus äußerst positiv eingestuft, da offensichtlich die

Biokompatibilität begünstigten [170, 180-181]. GAG und Proteoglykane bieten wichtige Erkennungs-

und Adhäsionssequenzen für einwandernde Zellen und können darüber hinaus auch

Wachstumsfaktoren binden, speichern und wieder an Zellen abgeben [170, 180-182]. Im Gegensatz

zu einer reinen Kollagenmatrix sollte ein Matrixmaterial mit GAG Restgehalten zudem ein

gesteigertes Wasserbindevermögen aufweisen [36, 51-52], wodurch ein derartiges Matrixmaterial

dem natürlichen Gewebe ähnlichere mechanische Eigenschaften aufweisen müsste. Dies wäre

gerade auch für stark biomechanisch beanspruchte Gewebe, wie dem Meniskus bedeutsam. Daher

kann auch aus diesem Grund ein GAG Restgehalt als positiv angesehen werden. Um diese Hypothese

zu beweisen, wären allerdings eingehende Untersuchungen der mechanischen Eigenschaften des

Matrixmaterials nötig, welche im Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt werden konnten. Letztlich

würden derartige Untersuchungen die mechanischen Eigenschaften des Matrixmaterials zeigen. Da

das Matrixmaterial in vivo von körpereigenen Zellen besiedelt werden soll, ändern sich mit der Zeit

auch die mechanischen Eigenschaften des Matrixmaterials.

Diskussion

Seite 97

7.1.3 Auswirkungen des Herstellungsverfahrens auf das Kollagennetzwerk

Mit dem Ziel der Herstellung einer dreidimensionalen, chondrokonduktiven Kollagenmatrix unter

Erhalt der nativen Morphologie sowie der natürlichen 3D Kollagenstruktur des ursprünglichen

Meniskusgewebes, um also die biomechanischen Eigenschaften der Kollagenmatrix möglichst wenig

zu reduzieren, war die Messung des Anteils an denaturiertem Kollagen, wD, wichtig. Der wD spiegelt

denaturierende Einflüsse des Herstellungsverfahrens auf die Kollagenmatrix wieder, wodurch die

Qualität der Kollagenmatrix charakterisiert und Rückschlüsse auf die Schädigung der Kollagenfasern

getroffen werden können.

Die Bestimmung von wD, siehe Tabelle 9 in Kapitel 5.1.3, ergab, dass der Anteil an denaturiertem

Kollagen in der Kollagenmatrix durch das Herstellungsverfahren gegenüber dem in nativem Gewebe

nicht signifikant erhöht wurde. Bei der Herstellung der Kollagenmatrix, wie in Kapitel 4.3

beschrieben, wurden 1 N NaOH-Lösung, 70 % EtOH, 1 M GuHCl und 5 % H2O2 Lösung verwendet. Für

70 % EtOH sind in der Literatur keine Auswirkungen auf Kollagen beschrieben. Auch für die

eingesetzte 1 M GuHCl und 5 % H2O2 Lösung war aus vergleichbaren Arbeiten bekannt, dass bei den

eingesetzten Behandlungszeiten und Konzentrationen keine schädigenden Einflüsse auf das Kollagen

zu erwarten sind [183-185]. Lediglich bei der Behandlung mit 1 N NaOH-Lösung müssen zwei

gegenläufige Effekte berücksichtigt werden. Die angestrebte Solubilisierung der GAG und der

zellulären und inflammatorischen Bestandteile des Meniskusgewebes wird durch Einwirkzeit und

Konzentration von Natronlauge erhöht, gleichzeitig werden aber Kollagenfasern abhängig von

Konzentration und Einwirkdauer der NaOH Lösung geschädigt [167, 176]. Wie die Ergebnisse zeigen,

konnten keine denaturierenden Einflüsse festgestellt werden. Meniskusgewebe besteht zu mehr als

90 % aus Kollagen Typ I, welches stark quervernetzte, dicke Kollagenfibrillen und Faserbündel bildet

[7, 22, 30]. Aus der dichten Packung zu Faserbündeln resultierte eine geringe Oberfläche für den

Angriff von Hydroxidionen, wodurch bei kurzen Einwirkzeiten zunächst nur Denaturierungen an der

Oberfläche der Kollagenfasern stattfinden können, welche in Relation zum Gesamtkollagen nur

gering ausfallen. Zudem ist zu erwarten, dass denaturiertes, solubilisiertes Kollagen ebenso wie

solubilisierte Zellbestandteile und bspw. GAG durch die Spülschritte mit H2Odeion. ausgewaschen

werden und somit nicht bestimmt werden konnten. Diese Annahme könnte durch zusätzliche

Untersuchungen der Spüllösungen etwa auf Hydroxyprolin überprüft werden.

7.1.4 Untersuchung der Matrixintegrität

Um neben der Untersuchung auf molekularer Ebene durch Bestimmung des Anteils an denaturiertem

Kollagen den Erhalt der Matrixintegrität zusätzlich auf Mikrometer- und Nanometerskala zu

Diskussion

Seite 98

visualisieren, wurden sowohl rasterelektronenmikroskopische (REM), als auch

transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Aufnahmen der Kollagenmatrix sowie des nativen

Gewebes (Referenz) angefertigt.

REM-Aufnahmen (Kapitel 5.1.4) der Kollagenmatrix, siehe Abbildung 20 b, zeigen im Vergleich zu

Aufnahmen nativen Gewebes, siehe Abbildung 20 a keine Unterschiede in der 3D

Kollagenfaseranordnung. Da keine strukturellen Änderungen erkennbar sind, wurde offensichtlich

die 3D Anordnung der Kollagenfibrillen und Fasern bis in den µm Bereich durch das

Herstellungsverfahren nicht beeinflusst. Wie für Meniskusgewebe beschrieben [31], sind zu Fasern

und Faserbündel zusammengelagerte Kollagenfibrillen darstellbar. Eine drastische Verschlechterung

der biomechanischen Eigenschaften des Matrixmaterials wie es eine steigende Zahl nicht

quervernetzter Kollagenfibrillen zur Folge hätte [7], ist daher nicht zu erwarten. Bestätigt wurden

diese Ergebnisse auch auf nm-Skala durch TEM-Aufnahmen, siehe Kapitel 5.1.4. Wie Aufnahmen der

Kollagenmatrix, siehe Abbildung 21 b im Vergleich zu Aufnahmen nativen Gewebes, siehe Abbildung

21 a zeigen, beträgt die D-Periodizität der Fibrillen in nativem Gewebe 63,96 ± 6,42 nm, in der

Kollagenmatrix 64,29 ± 3,75 nm. Somit besteht zwischen nativem Gewebe und der Kollagenmatrix

kein signifikanter Unterschied. Die in der Literatur beschriebene, charakteristische Hodge-Petruska

D-Peridizität von 67 nm in hydrierten Proben oder nativem Gewebe [59, 186] bzw. von 64-65 nm in

dehydrierten, fixierten Proben [158] konnte auch in der Kollagenmatrix bestimmt werden und bleibt

daher während des Prozesses erhalten. Sowohl die REM- als auch die TEM-Aufnahmen belegen den

Erhalt der 3D Kollagenstruktur und damit der Matrixintegrität durch das Herstellungsverfahren.

7.2 Biologische Prüfungen

7.2.1 Mikrobielle Reinheit

Sterilität ist eine grundlegende Anforderung an Bioimplantate. Um die bakterizide und fungizide

Wirkung des Prozesses zu belegen und die Sterilität des Matrixmaterials zu zeigen, wurden in

Anlehnung an EN ISO 11737-1:2006 + AC:2009 mikrobiologische Untersuchungen durchgeführt.

Dabei wurde die Zahl lebensfähiger Keime in nativem Gewebe und vergleichend in prozessiertem

Gewebe bestimmt. Blutagar Platten dienen zum Nachweis anspruchsvoller Mikroorganismen und

ihrer γ-hämolytischen Eigenschaften, Standard-I-Agar Platten für weitere anspruchsvolle pathogene

Keime sowie Sabouraudagar Platten zum Nachweis von Pilzen oder deren Sporen.

Natives Gewebe zeigt eine Keimbelastung von 0,67∙102 ± 0,25∙102 cfu∙g-1 an γ-hämolytischen sowie

0,86∙102 ± 0,22∙102 cfu∙g-1 an anspruchsvollen Mikroorganismen aber keine nachweisbare Keime aus

Diskussion

Seite 99

dem Taxa der Fungi. Bei der Untersuchung des Matrixmaterials konnten, wie erwartet, keine

lebensfähigen Keime (0 cfu∙g-1) nachgewiesen werden, siehe Tabelle 10 Kapitel 5.2.1. Der

Reinigungsprozess, siehe Kapitel 4.3 besteht aus Waschschritten mit in der Analytik, Medizin und

Lebensmitteltechnik anerkannten Chemikalien zur Entfernung von nicht kollagenen Komponenten

der EZM und Zellen. Gleichzeitig führen die verwendeten Chemikalien (70 % EtOH, 5 % H2O2 und 1 N

NaOH-Lösung) auch zur Inaktivierung von pathogenen Keimen [18, 62, 187-188].

7.2.2 In vitro Zytotoxizität

Eine grundlegende Anforderung an Bioimplantate ist neben der Keimfreiheit, dass das Material selbst

nicht toxisch wirkt und zudem keine toxischen Rückstände etwa von Lösungen, welche für die

Herstellung verwendete werden, im Matrixmaterial zurück bleiben. Um eventuell vorhandene

zytotoxische Effekte der Kollagenmatrix nachzuweisen, wurde daher dieses Material mit

Kulturmedium eluiert (24 h und 72 h Extraktionszeit), siehe Kapitel 4.11.3, und der Einfluss des

gewonnenen Eluats auf die Stoffwechselaktivität (MTS-Assay) einer murinen Fibroblastenzelllinie

L929 (DSMZ-No.: ACC-2), selbst isolierter primärer bMFC und primärer hBMSC (human bone marrow

stemm cells) nach ISO-Standards geprüft [143]. Es ist allgemein bekannt, dass sich ein reduzierter

Serumgehalt im Kulturmedium direkt auf die Stoffwechselaktivität von Zellen auswirkt. Zellen welche

in serumfreiem Medium oder mit Serumkonzentrationen unter 10 % kultiviert werden, reagieren

deutlich sensibler auf verschiedenste äußere Einflüsse, z.B. in Kulturmedium gelöste Substanzen.

Daher kann durch reduzierte Serumzugabe oder vollständigen Serumentzug das

Zytotoxizitätstestsytem dahingehend sensibilisiert werden, dass die Testzellen empfindlicher auf

potentiell extrahierte Substanzen reagieren als bei höheren Serumkonzentrationen und somit ein

sensibleres Testsystem darstellen.

Die Untersuchungen zur Zytotoxizität ergaben, dass sowohl nach 24 h als auch nach 72 h

Extraktionszeit, siehe Kapitel 5.2.2, für alle Zelltypen auch nach Sensibilisierung des Testsystems

durch Serumentzug (10 %, 5 %, 2 % und 0 % Serum) keine auswaschbaren zytotoxischen Bestandteile

der Kollagenmatrix nachweisbar waren.

Nach 24 h Extraktionszeit wurden bei Gewebeproben für alle untersuchten Testzellen gemäß ISO

Standards mit 10 % Serum Zellvitalitäten [%] zwischen 91,71 ± 2,13 % (bMFC) und 100,58 ± 4,15 %

(hBMSC) bestimmt, siehe Abbildung 22. Die Ergebnisse spiegeln somit keine zytotoxischen Effekte

der Eluate der Kollagenmatrix wieder.

Einen signifikanten Unterschied hierzu zeigt die Positivkontrolle (PK, 10 % DMSO). Die gemessenen

Zellvitalitäten zwischen 12,36 ± 2,48 % (bMFC) und 40,41 ± 4,25 % (hBMSC) belegen die erwartete

Diskussion

Seite 100

toxische Wirkung von DMSO. Aufgrund der signifikanten Unterschiede in den Zellvitalitäten der PK

(12,36 % für bMFC, 20,12 % für L929 und 40,41 % für hBMSC) zeigt sich eine unterschiedlich starke

Wirkung von DMSO auf die Testzellen. Dass DMSO auf unterschiedliche Zellen unterschiedliche

Wirkungen zeigen kann, wurde bereits beschrieben [189]. Die bMFC zeigen mit der niedrigsten

Vitalität die höchste Empfindlichkeit gegenüber DMSO, die hBMSC aufgrund der höchsten Vitalität

die geringste Empfindlichkeit, während die Empfindlichkeit der L929 gegenüber DMSO zwischen den

bMFC und den hBMSC liegt. Somit kann ein Testsystem mit bMFC als das gegenüber DMSO

empfindlichste betrachtet werden.

Auch nach Sensibilisierung des Testsystems konnten bei Gewebeproben Zellvitalitäten zwischen

95,69 ± 3,66 % (L929) und 122,6 ± 3,67 % (bMFC) bestimmt werden, siehe Abbildung 22. Interessant

ist, dass nach Sensibilisierung des Testsystems bei bMFC Vitalitäten von 91,71 % (bei 10 % Serum im

Eluat) und 122,64 % (bei serumfreiem Eluat) ermittelt wurden. Bei der Zelllinie L929 und den hBMSC

konnte kein signifikanter Unterschied der Zellvitalitäten nach Sensibilisierung festgestellt werden. Die

ermittelte geringere Zellvitalität bei steigender Serumkonzentration könnte aus einen bereits

mehrfach beschriebenen, positiven Einfluss von EZM-Molekülen (GAG oder Kollagen) bzw.

Molekülfragmenten auf Meniskuszellen resultieren [1, 3, 86]. Wie die Ergebnisse der GAG

Bestimmung, siehe Kapitel 5.1.2.2, und die Ergebnisse der Bestimmung des Anteils an denaturiertem

Kollagen, siehe Kapitel 5.1.3 zeigen, sind nicht alle GAG (4,25 ± 0,34 µg CS/mg Gewebe Restgehalt)

entfernt worden und auch denaturiertes Kollagen (5,15 ± 0,8 %) ist in der Kollagenmatrix enthalten.

Durch die Extraktion mit Kulturmedium können diese EZM-Komponenten eluiert werden und bei

Inkubation in Gegenwart der bMFC in serumfreiem Medium einen fördernden Einfluss auf den

Zellmetabolismus zeigen. Diese Wirkung kann möglicher weise durch den Einfluss von Serum

überlagert werden und ist daher erst nach Sensibilisierung erkennbar. Scheinbar üben EZM-Moleküle

aus Meniskusgewebe auch spezifisch auf Meniskuszellen einen positiven Einfluss aus welcher aber

erst in einem sensibilisierten Testsystem beobachtbar ist.

Nach 72 h Extraktion ergaben sich ähnliche Werte der Zellvitalität, wie nach 24 h Extraktion. Die

gemessenen Zellvitalitäten im Bereich zwischen 94,8 ± 2,89 % und 113,03 ± 5,59 % und spiegeln im

Vergleich zur PK keine zytotoxischen Effekte der Kollagenmatrix wieder. Auch nach 72 h wurde bei

der PK eine unterschiedliche Sensibilität der Testzellen gegenüber DMSO festgestellt, siehe

Abbildung 23. bMFC besitzen die höchste Sensibilität gegenüber DMSO und hBMSC die geringste.

Der Einfluss der Serumkonzentration auf bMFC, wird wie nach 24 h auch nach 72 h deutlich. Bei

Medium mit 10 % Serum lag die Vitalität bei 94,8 ± 2,89 %, während serumfrei eine Vitalität von

112,02 ± 3,55 % bestimmt wurde. Die Eluate zeigen keine zytotoxischen Effekte und auch hier

scheinen eluierbare EZM-Bestandteile aus Meniskusgewebe einen positiven Einfluss auf den

Diskussion

Seite 101

Zellmetabolismus spezifisch der bMFC zu haben. Denkbar wäre, dass dieser Effekt besonders auf

GAG Fragmenten (bspw. Hyaluronsäure) beruht, welche vermittelt über Zelloberflächenstrukturen,

wie den CD 44 Cluster (vergleiche Abbildung 6, Kapitel 2.3.3) einen positiven Einfluss auf den

Zellmetabolismus ausüben, wie er bereits in anderen Untersuchungen für Hyaluronsäure [190-191].

Bei L929 und hBMSC wurde dieser Effekt auch nach 72 h Extraktionszeit nicht beobachtet. Dies lässt

vermuten, dass dieser Effekt spezifisch für bMFC gilt.

7.3 In vitro Revitalisierung mit primären bovinen Meniskusfibrochondrozyten

Die Revitalisierungsexperimente sollten die chondrokonduktiven Eigenschaften, sowie die

biologische Verträglichkeit der Kollagenmatrix demonstrieren, um eine erste biologische Beurteilung

hinsichtlich einer geplanten Anwendung als Implantatmaterial treffen zu können. Die Verwendung

xenogener Zellen (bovine Meniskusfibrochondrozyten) sollte die Akzeptanz xenogener Zellen zeigen,

dass diese Zellen nicht nur oberflächlich adhärieren, sondern in die Matrix einwandern und dass sie

in der Kollagenmatrix neue, knorpelspezifische EZM Komponenten synthetisieren. Da für die

Revitalisierungsexperimente sowohl definierte als auch nicht definierte Kulturmedien mit

unterschiedlichen Zusätzen verwendet wurden, konnte der Einfluss des Mediums auf Zellmigration

und de novo Synthese von EZM untersucht werden.

7.3.1 Isolierung und Amplifikation boviner Meniskusfibrochondrozyten

Für Revitalisierungsexperimente der Kollagenmatrix wurden aus bovinem Meniskusgewebe (von

ungeborenen Tieren, neunter Trächtigkeitsmonat) primäre bovine Meniskusfibrochondrozyten (MFC)

isoliert. Die ZellIsolierung erfolgte nach leicht modifizierten Protokollen von Pangborn et al. und

Gunja et al. [82, 162]. Nach 14 h Inkubation des Meniskusgewebes in Verdaumedium (0,3 %

Collagenase Typ II in DMEM/Ham`s F12) konnten bei ca. 350 rpm 4∙105 Zellen∙g-1 Gewebe isoliert

werden, siehe Tabelle 11. Eine signifikant bessere Zellausbeute ergab sich nach 14 h Inkubation bei

ca. 350 rpm gefolgt von 2 h Inkubation bei ca. 1050 rpm. Hier konnten mit durchschnittlich 1,17∙106

Zellen g-1 Gewebe um ca. den Faktor 3 mehr Zellen isoliert werden. Durch das intensivere Schütteln

wird eine deutlich effektivere Durchmischung erreicht wodurch, die Zellablösung verbessert wird und

zudem können abgelöste Zellen auch besser aus der Matrix heraus transportiert werden. Allerdings

gilt zu beachten, wenn bei Zellisolierungen mit einer Protease gearbeitet wird, nicht nur die

perizelluläre Matrix sondern auch die Zellen selbst angegriffen werden können [192].

Um ein Untersplitten der Zellen zu vermeiden, erfolgte die Bestimmung der minimal notwendigen

Startzellzahl. Die Bestimmung, siehe Abbildung 24 Kapitel 5.3.2, ergab 5∙103 Zellen/cm2 als optimale

Diskussion

Seite 102

Aussaatdichte in 2D Kultur. Nach einer lag-Phase von ca. 30 h konnte bei 5∙103 Zellen/cm2 und allen

höheren Startzellzahlen (7,5∙103, 1∙104, 1,25∙104 und 1,5∙104 Zellen/cm2) Wachstum beobachtet

werden. Bei Startzellzahlen unter 5∙103 Zellen/cm2 konnte auch nach 60 h kein Wachstum festgestellt

werden. Durch die zu geringe Zelldichte und damit einer zu geringen Konzentration spezifischer,

parakriner Wachstumsfaktoren [193] ergaben Zellzahlen unter 5∙103 Zellen/cm2 kein Wachstum.

Möglicherweise könnten ein längerer Beobachtungszeitraum Aufschluss über eine verlängerte

lag-Phase bei niedrigen Startzellzahlen geben. Denkbar wäre auch durch eine höhere Serumzugabe

das Defizit parakriner Wachstumsfaktoren auszugleichen.

Wie vergleichbare Arbeiten von Schwarz et al. zeigten [62, 159], waren für Besiedelungsexperimente

hohe Zellzahlen erforderlich, weshalb die bMFC nach Isolation zunächst in 2D Kultur amplifiziert

wurden. Die Amplifizierung der bMFC in 2D Kultur erfolgte nach den beschriebenen Parametern von

Bhargava et al., Mueller et al., Pangborn et al. und Gunja et al. in DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS,

1 % P/S und 4 mM L-Glutamin [79, 82, 120, 162]. Um aus der Literatur bekannte Dediffernzierungen

der bMFC mit dem Verlust des spezifischen Phänotyps [149-150, 152, 194], Änderungen des

Zytoskeletts [82, 195], sowie Änderungen der Genexpression bedingt durch Expansion in 2D Kultur zu

vermeiden, oder so weit wie möglich zu verringern, und um dennoch hohe Zellpopulationen zu

erzielen, wurde nach der Isolierung standardisiert vorgegangen. Bovine MFC wurden nach der

Isolierung mit der bestimmten minimal notwendigen Startzellzahl von 5∙103 Zellen/cm2 in 175 cm2

Zellkulturflaschen bis ca. 80-90 % Konfluenz amplifiziert und dann kryokonserviert gelagert. Für alle

Revitalisierungsexperimente wurden daher bMFC nur ein weiteres Mal bis zu 80-90 % Konfluenz in

175 cm2 Zellkulturflaschen amplifiziert und nun sofort für die Besiedelung der Kollagenmatrizes

verwendet. Grundsätzlich kann bei Arbeiten mit Primärzellen durch eine standardisierte Vorkultur

die Reproduzierbarkeit und auch die Vergleichbarkeit von Ergebnissen untereinander sichergestellt

werden.

7.3.2 Besiedelbarkeit, Proliferation und Zellvitalität

Für vergleichende Revitalisierungsexperimente der Kollagenmatrix wurden zur reproduzierbaren

Herstellung der mehr als 1.000 während dieser Arbeit verwendeten Proben Scaffoldscheiben aus

dem inneren Bereich des Vorder-, des Hinterhorns und der Pars Intermedia, mit und ohne

superfizielle Schicht, von 5,6 mm Ø (6 mm Biopsiestanze) und einer Dicke von 1 mm präpariert, siehe

Abbildung 15. Diese Scaffoldscheiben wurden mit den Testzellen besiedelt bzw. revitalisiert.

Reproduzierbare Besiedelungsergebnisse ergaben sich bei gleichzeitiger Besiedelung von 5 Scaffolds

in einer 24-Wellplatte mit hohen Zelldichten von 5∙106 Zellen∙ml-1. Da Arbeiten mit primären

humanen Chondrozyten und Kollagenmatrizes, hergestellt nach einem entsprechend modifizierten

Diskussion

Seite 103

Verfahren aus porcinem Septumknorpel [62, 159] vergleichbare Ergebnisse ergaben, zeigt sich, dass

die unterschiedlichen aber mit dem gleichen Verfahren hergestellten Materialien vergleichbar sind.

Nach einer mittleren Adhäsionszeit von 1 h waren durchschnittlich je Scaffold 6,81∙105 ± 0,28∙105

Zellen adhäriert, vergleiche Kapitel 5.3.3.1. Bei einem durchschnittlichen, mikroskopisch

gemessenen, Zelldurchmesser von 10 µm, ergab sich so bei der Fläche eines Scaffolds von

A = 24,63 mm2, eine vollständige, mehrschichtige Zelladhäsion mit einer Flächenzelldichte von

2,72∙106 ± 0,11∙106 Zellen∙cm-2. Bei höheren Zellzahlen (>5∙106 Zellen∙ml-1) und längeren

Adhäsionszeiten (>1 h) wären keine signifikant besseren Ergebnisse zu erwarten, da bereits bei

5∙106 Zellen∙ml-1 nach 1 h eine pH Änderung in den sauren Bereich durch Farbumschlag des

Indikators beobachtet wurde. Daraus kann abgeleitet werden, dass bereits nach 1 h Limitierungen

der Zellen auftreten, die bei längerer Inkubation vermutlich zum Ablösen der Zellen von der

Kollagenmatrix führen können, da Zellen auf negative äußere Einflüsse, wie bspw. Toxine oder

Limitierungen durch Änderungen der Morphologie (bspw. kugelige Morphologie), welche bei

adhärent wachsenden Zellen zumeist mit einer Ablösung vom Substrat einhergeht, reagieren.

Die Untersuchung der langfristigen Revitalisierbarkeit erfolgte durch Kultivierung besiedelter

Scaffolds in DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS und in NHChondroDiff Medium um gleichzeitig auch

Aussagen über ein geeignetes Kultivierungsmedium treffen zu können. In beiden Medien konnten

besiedelte Scaffolds über einen Zeitraum bis zu 42 d erfolgreich kultiviert werden, siehe Kapitel

5.3.3.1 Abbildung 25 und Abbildung 26. Daher sind prinzipiell beide Medien für eine längerfristige

Kultivierung geeignet. Ergänzend zu den in Kapitel 7.2.2 diskutierten Ergebnissen der

Untersuchungen auf in vitro Zytotoxizität zeigen auch diese Revitalisierungsexperimente nach einem

direkten Kontakt der bMFC mit der Kollagenmatrix über 42 d keine toxischen Eigenschaften der

Matrix, welche zu einem Ablösen oder Absterben der Zellen nach längerer Kontaktzeit führen

könnten. Bei beiden Medien konnten deutliche Unterschiede festgestellt werden. Bereits nach 14 d,

mit der Kultivierungsdauer zunehmend, zeigten sich signifikante Unterschiede hinsichtlich des

Zellwachstums und der Matrixsynthese auf dem Scaffold. Während in DMEM/Ham`s F12 mit 10 %

FBS nach 14 d nur eine Schichtdicke von ca. 20 µm aus Zellen und neugebildeter EZM beobachtet

wurde, konnte in NHChondroDiff nach 14 d eine um den Faktor 5 gesteigerte Schichtdicke von ca.

100 µm beobachtet werden. Über den Kulturverlauf nimmt zwar die Schichtdicke auch in

DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS nach 42 d auf ca. 50 µm, wohingegen in NHChondroDiff nach 42 d

ca. 250-300 µm beobachtet wurden, vergleiche Kapitel 5.3.3.1. Dieser signifikante Unterschied muss

darauf zurückzuführen sein, dass in NHChondroDiff, einem handelsüblichen Medium für die

chondrogene Differenzierung von Stammzellen, neben FBS für das Zellwachstum und die

Matrixsynthese essentielle, aber vom Hersteller nicht genannte Zusatzstoffe enthalten sind. Auf Basis

Diskussion

Seite 104

der Literatur ist anzunehmen, dass zusätzlich zu FBS Metabolismus und Matrixsynthese fördernde

Zusätze wie bspw. Na-Pyruvat, das Hormon Insulin, und Zytokine wie TGF-β, HGF, b-FGF, etc. [79-80,

162, 196] enthalten sind.

Die Vitalität boviner MFC auf der Kollagenmatrix war mittels stoffwechselbasierten Methoden (MTT-

und MTS-Assay) nicht quantifizierbar. Bestimmungen der Stoffwechselaktivität boviner MFC auf der

Kollagenmatrix lieferten durch die Kollagenmatrix bedingte, statistische, nicht-systematisch

fehlerhafte und damit nicht korrigierbare Ergebnisse [160]. Die Darstellung vitaler Zellen auf der

Kollagenmatrix erfolgte daher durch eine Ausschlussmethode rein qualitativ mittels

CFDA-SE/PI-Färbung (Lebend-/Tot-Doppelfärbung). Wie die Abbildung 27 a-f zeigen, waren in beiden

Medien vitale, grün fluoreszierende Zellen darstellbar. Die Zellen weisen zudem eine typische

Morphologie auf, was auf eine hohe Vitalität schließen lässt. Änderungen der Zellmorphologie sind

generell ein eindeutiger Hinweis auf toxische Substanzen bzw. ungeeignete Kulturbedingungen oder

Limitierungen. Vereinzelte, rot fluoreszierende, tote Zellen sind auf mechanische Beanspruchungen

während des Färbevorgangs zurück zu führen. Auffällig bei Abbildung 27 a-f ist, dass bei einer

Exzitation von 490 nm die Kollagenmatrix selbst eine starke Autofluoreszenz mit einer Emission im

Bereich von 520 nm zeigt [197]. Darauf beruht die bei alle Abbildungen auftretende deutliche, grüne

Hintergrundfärbung. In NHChondroDiff Medium führt die Autofluoreszenz neugebildeten Kollagens

zudem dazu, dass nach 21 d die Fluoreszenz der Zellen durch die starke Autofluoreszenz

neugebildeten Kollagens überlagert wird, wodurch die Zellen mit steigender Kultivierungsdauer nicht

mehr eindeutig darstellbar wären. Der Rückschluss auf die Zellvitalität erfolgte daher über die

qualitative und quantitative de novo Synthese knorpelspezifischer EZM, sowie über die Bestimmung

der Zellzahl als Funktion der Zeit.

Die Proliferation (Bestimmung der Flächenzelldichte) boviner MFC auf der Kollagenmatrix wurde

über den DNA Gehalt, 8 pg DNA pro Chondrocyt [198], als Maß für die Zellzahl untersucht. Wie bei

vergleichbaren Arbeiten von Schwarz et. al. [159] ebenso wie bereits die histologische Auswertung

zeigte (vergleiche Abbildung 25 und Abbildung 26), konnte ein signifikanter Unterschied zwischen

den Medien festgestellt werden, siehe Abbildung 28. In DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS fiel die

Flächenzelldichte von 2,72∙106 ± 0,11x106 Z/cm2 nach 7 d zunächst signifikant auf

0,896∙106 ± 0,33∙106 Z/cm2 und stieg nach 35 d wieder, nicht signifikant, auf 1,04∙106 ± 0,28∙106 Z/cm2

an. In NHChondroDiff Medium ergab sich eine signifikant höhere Flächenzelldichte aufgrund einer

höheren Proliferationsrate. Wie in DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS sinkt in den ersten 7 d die Zellzahl

aber nur leicht auf 2,27∙106 ± 0,31∙106 Z/cm2 ab, steigt nach 35 d deutlich auf 4,96∙106 ± 0,31∙106

Z/cm2 an. Das Absinken der Zellzahl bei beiden Medien in den ersten 7 d ist vermutlich auf zwei

Ursachen zurückzuführen. Da adhärente Zellen sich ablösen müssen um zu proliferieren, wurden

Diskussion

Seite 105

vermutlich teilende Zellen bei der Kultivierung auf dem Orbitalschüttler ab geschert, sodass diese

Driften und nach der Teilung neben dem Scaffold auf dem Gefäßboden sedimentierten und

adhärieren. Abhängig von der EZM-Synthese kann es auch zum Ablösen durch mechanische

Einwirkung beim Umsetzen bzw. bei der Handhabung während der Probenahme kommen. Die

höhere EZM-Neusynthese in NHChondroDiff Medium unterbindet diese Effekte mit der Zeit, da sich

eine dicke Zellschicht aus neugebildeter EZM ausbildet, in die die Zellen eingebettet sind und folglich

weder durch Proliferation noch durch mechanische Einwirkungen abgetragen werden können.

Auffällig ist, dass die Zellzahl bei Kultivierung in NHChondroDiff ebenso wie in DMEM/Ham`s F12 mit

10 % FBS nach 21 d im Vergleich zu 35 d nicht signifikant ansteigt. Diese Beobachtung könnte ein

Indiz für eine reduzierte Proliferation und daher für eine Reversion der Dedifferenzierung bei 3D

Kultivierung in chondrogenem Medium sein. Dies wird auch durch die Hypothese von Homicz et al.

[148] gestützt, dass bei Chondrozyten in 3D Kultur nach einer initialen Phase der Proliferation und

geringer Matrixproduktion aufgrund gesteigerter Matrixproduktion und adäquater Zelldichte die

Proliferationsrate sinkt, während die Matrixproduktion zunimmt.

7.3.3 Einfluss von Kulturmedien und Medienzusätzen auf die Neusynthese extrazellulärer

Matrix und Zellmigration

Für Revitalisierungsexperimente von Kollagenmatrizes sind für Untersuchungen der

chondrokonduktiven Eigenschaften und für eine fundierte Beurteilung der biologischen

Verträglichkeit eine möglichst homogene Besiedelung mit bMFC sowie die Neubildung

knorpelspezifischer EZM besonders bedeutsam. Wie aus der Literatur zu entnehmen ist, haben

neben den verwendeten Trägermaterialien vor allem die zur Kultivierung verwendeten Medien und

Zusätze einen erheblichen Einfluss auf die Matrixneubildung und Zellmigration [2, 79-80, 161, 163,

199-200]. Daher wurde in weiteren Experimenten der Einfluss von Nährmedienzusammensetzung

und Zytokinen auf Zellmigration und die Bildung einer Regeneratmatrix mit unterschiedlichen

Kulturmedien näher untersucht. Untersucht wurden DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS und

NHChondroDiff Medium, welche sich bereits bei Versuchen zur längerfristigen Revitalisierbarkeit,

Zellvitalität und Proliferation als geeignete Kultivierungsmedien herausstellten, sowie definierte

Medien mit migrationsfördernden und chondroinduktiven Zusätzen.

7.3.3.1 Kultivierung in Dulbecco`s Modified Eagle Medium /Ham`s F12 mit 10 % FBS

Bei Kultivierung in DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS wurde auch nach 42 d keine signifikante de novo

EZM Synthese beobachtet, siehe Abbildung 29 a-d. Innerhalb von 42 d bildete sich eine bis zu 50 µm

dicke Schicht aus Zellen und neuem Gewebe. Histologisch war eine geringe GAG Bildung und

Diskussion

Seite 106

immunohistologisch nur geringe Bildung von Kollagen Typ I und Aggrecan nachweisbar. Kollagen

Typ II, das von bMFC in wesentlich geringerem Maße als Kollagen Typ I gebildet wird [2, 40] konnte

nicht nachgewiesen werden. Nach 14 d konnte Migration einzelner Zellen entlang der Kollagenfasern

bis zu 400 µm in die Kollagenmatrix hinein histologisch belegt werden, siehe Abbildung 29 d. Durch

Entfernen von Zellen und nichtkollagener Bestandteile wurde die Kollagenstruktur aufgelockert,

wodurch potentielle Migrationswege entlang der Fasern freigelegt wurden und Zellen migrieren

können. Eine Matrixbildung migrierter Zellen wurde nicht beobachtet. Die beobachtete Zellmigration

zusammen mit der geringen EZM-Synthese aufgrund fehlender und in Serum nur in zu geringer

Konzentration enthaltener chondroinduktiver Bestandteile, sind ein direkter Nachweis der

chondrokonduktiven Eigenschaften des Matrixmaterials [75].

7.3.3.2 Kultivierung in Dulbecco`s Modified Eagle Medium /Ham`s F12 mit Wachstumsfaktoren

Für eine möglichst homogene Besiedlung und für eine Steigerung der Zellmigration erfolgten

Kultivierungen in DMEM/Ham`s F12 mit HGF und PDGF-AB. Die von Bhargava et al. beschriebene

Förderung der Zellmigration durch HGF und PDGF–AB konnte in diesen Versuchen nicht bestätigt

werden [79, 161]. Bereits nach 1 d ultivierung können, ähnlich der ultivierung in DMEM/Ham’s

F12 mit 10 % FBS, Zellen beobachtet werden, die bis zu 200 µm ins Gewebe migriert sind, siehe

Abbildung 30 a und d. Allerdings wird bereits nach 28 d Kultivierung eine Aussage aufgrund der

sinkenden Zellzahl schwierig. Die von Pangborn und Athanasiou, Kasemkijwattana et al. und

Bhargava et al. geschilderte, gesteigerte Proliferation konnte aufgrund abnehmender Zellzahl nicht

bestätigt werden [79, 201-202]. Offensichtlich fehlen den Zellen essentielle Mediumzusätze, die das

Zellwachstum und vor allem die EZM Neusynthese unterstützen.

Auch die in der Literatur [79, 201-202] beschriebene Förderung der Matrixsynthese durch HGF und

PDGF-AB konnte nicht bestätigt werden. Wie aus Abbildung 30 a-i deutlich wird, wurde bei den

durchgeführten Besiedlungsversuchen bei keinem verwendeten Medium und zu keinem Zeitpunkt

eine Neubildung von EZM beobachtet. Weiterhin ist anzumerken, dass in der Literatur nur die

Kultivierung über kürzere Zeiträume (bis zu 96 h bei Kasemkijwattana et al. und 24 h bei Bhargava et

al.) und im Falle von Kasemkijwattana et al. und Bhargava et al. eine Kultivierung in 2D - Kultur

beschrieben wird [79, 202]. Bei Pangborn und Athanasiou wird von einer wesentlich höheren

Flächenzelldichte (3,5∙108 Zellen/cm2) auf Scaffolds aus Polyglutaminsäure (PGA) ausgegangen,

womit ein direkter Vergleich nicht möglich ist [162].

Eine Möglichkeit für weitere Versuche ist die von Bhargava et al. beschriebene Kombination beider

Wachstumsfaktoren, welche die Migration der Zellen in das Gewebe verbessern könnte [161].

Diskussion

Seite 107

Außerdem müssen weitere Mediumzusätze eingesetzt werden, um das Zellwachstum zu fördern und

die Matrixsynthese zu unterstützen.

7.3.3.3 Kultivierung in NHChondroDiff Medium

Die Besiedelungsexperimente mit NHChondroDiff Medium zeigen, dass neben den

Materialeigenschaften wie Porenraum, Architektur, Grundsubstanz des Matrixmaterials und

mechanische Eigenschaften [93-94, 203] vor allem das zur Kultivierung verwendete Medium eine

entscheidende Rolle spielt.

Im Gegensatz zu Kultivierung in DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS oder mit HGF und PDGF-AB (siehe

Kapitel 7.3.3.1 und Kapitel 7.3.3.2) konnte bei Kultivierung in NHChondroDiff Medium reproduzierbar

bereits nach 14 d ausgeprägte Matrixsynthese sowie Zellmigration beobachtet werden. Nach 28 d

konnte eine etwa 100 µm dicke Schicht aus Zellen und neugebildeter Matrix beobachtet werden,

siehe Abbildung 31 a. Während der ersten 70 d nimmt die Dicke neugebildeten Gewebes auf der

Kollagenmatrix kontinuierlich bis ca. 300-400 µm zu und bleibt dann innerhalb des

Beobachtungszeitraums von 112 d konstant. Wie in Abbildung 37 a und b (siehe Kapitel 5.3.4.3) zu

erkennen ist, sind zudem Zellen über 400 μm weit in das Gewebe migriert. Auch migrierte bMFC

bilden im Inneren des Scaffolds neue EZM. Zusammen mit den in Kapitel 7.3.2 diskutierten

Ergebnissen bezüglich Proliferation boviner MFC auf der Kollagenmatrix zeigen diese Ergebnisse, dass

NHChondroDiff Medium sehr gut für die Kultivierung boviner MFC auf Kollagenscaffolds geeignet ist.

Die Neubildung extrazellulärer Matrix und Zellmigration belegen wiederum die chondrokonduktiven

Eigenschaften der Kollagenmatrix.

Wie bereits bei besiedelten Scaffolds, welche in DMEM/Ham’s F12 mit FBS oder mit

Wachstumsfaktoren (siehe Kapitel 7.3.3.1 und 7.3.3.2) kultiviert wurden, nahegelegt wird, wurde

auch bei diesen Proben Migration eindeutig entlang der Kollagenfasern beobachtet. Bedingt durch

die Herstellung der Scaffolds, wurde das Gewebe aus derselben Zone des Meniskus verwendet. Da

der Meniskus allerdings auch in derselben Zone eine von außen nach innen sehr heterogene

Kollagenstruktur aufweist [31, 204], konnte nicht sichergestellt werden, dass alle verwendeten

Scaffolds eine homogene Kollagenstruktur hatten. Daraus erklären sich auch die zu jedem Zeitpunkt

beobachteten, signifikanten Unterschiede bei der Zellmigration. Während bei Scaffolds nach 14 d

und 42 d Kultivierung eine dichtgepackte Kollagenstruktur zu erkennen ist, zeigt ein besiedeltes

Scaffold, welches 70 d kultiviert wurde, eine orthogonal zur Oberfläche verlaufende, aufgelockerte

Struktur der Kollagenfasern, siehe Abbildung 37 b. Da alle Scaffolds stets in einem Arbeitsgang

prozessiert wurden, müssen Unterschiede in der Kollagenstruktur in der heterogenen Struktur des

Meniskus begründet sein und sind somit keine Folge des Dezellularisierungsprozesses. Somit ist die

Diskussion

Seite 108

Migration, ebenso wie die Matrixsynthese und die Proliferation bei Kultivierung in NHChondroDiff

sehr deutlich ausgeprägt, hängt aber von der Ausrichtung und Dichte der Kollagenfasern ab.

Weiterhin ist bereits nach 28 d um alle migrierten Zellen EZM Bildung beobachtbar. Im weiteren

zeitlichen Verlauf bis zu 112 d nimmt die EZM Neubildung von migrierten Zellen zu, Zellmigration

findet jedoch nicht mehr statt. Nachteilig auf die Zellmigration wirkt sich die bei Kultivierung in

NHChondroDiff Medium zunehmend de novo synthetisierte EZM aus, welche die Zellen fixiert und

immobilisiert. NHChondroDiff Medium eignet sich folglich aufgrund der Stimulierung der

Matrixsynthese besser für die Revitalisierung der Scaffolds mit bMFC als DMEM/Ham’s F12 mit FBS

oder Wachstumsfaktoren.

Immunohistologisch konnte qualitativ während der gesamten Kultivierungsdauer die de novo

Synthese aller für Meniskusknorpel typischen EZM–Bestandteile, wie Aggrecan, Kollagen Typ I und

Kollagen Typ II nachgewiesen werden. Die IHC–Färbung von Kollagen Typ I weist zu allen Zeitpunkten

die Bildung von meniskusspezifischem Kollagen Typ I in der Zellschicht und auch um in das Gewebe

migrierte Zellen nach (siehe Abbildung 31 a-c Kapitel 5.3.4.3). Die IHC–Färbung von Aggrecan ergab

vergleichbare Ergebnisse (siehe Abbildung 32 a). Abbildung 32 c zeigt eine IHC–Färbung von Kollagen

Typ II, welche vor allem in dem direkt an das Scaffold angrenzenden Bereich der Zellschicht und um

in das Scaffold migrierte Zellen sehr ausgeprägt ist. Eine plausible Erklärung hierfür stellt die in der

Literatur beschriebene De– und Redifferenzierung von Knorpelzellen dar [2, 150, 152, 194, 205].

Während der Amplifizierung der Zellen in 2D Kultur dedifferenzieren diese, wodurch es zu einer

Erhöhung der Kollagen Typ II–Expression kommen kann [205]. Daher wurde zunächst EZM mit einem

erhöhten Anteil Kollagen Typ II gebildet. Bei 3D Kultivierung in NHChondroDiff Medium über einen

längeren Zeitraum kann eine Redifferenzierung der bMFC erfolgen, ähnlich Chondrozyten [159, 194,

205], und damit die verminderte Bildung von Kollagen Typ II. Bestärkt wird diese Hypothese dadurch,

dass die ab etwa 70 d Kultivierung gebildete Zellschicht kaum Kollagen Typ II enthält und weniger

intensiv gefärbt ist, während im äußerem Bereich der Zellschicht Kollagen Typ I nachweisbar ist. Die

braune Färbung von neugebildetem Kollagen Typ II , siehe Abbildung 32 c, um in das Gewebe

migrierte Zellen nach 70 d Kultivierung begründet sich dadurch, dass die Zellmigration nur zu Beginn

der Kultivierung stattfindet, also bevor Redifferenzierung erfolgt, da eine weitere Zellmigration durch

die bereits diskutierte Immobilisierung der Zellen aufgrund der ausgeprägten Matrixsynthese

verhindert wird. Die migrierten Zellen sind folglich zunächst dedifferenziert und bilden vermehrt

Kollagen Typ II, welches einmal synthetisiert, nicht wieder resorbiert wird und somit auch nach 70 d

Kultivierung noch nachweisbar ist. Zur genauen Überprüfung der IHC-Ergebnisse müssten genauere

Untersuchungen der Genexpression mittels PCR durchgeführt werden.

Diskussion

Seite 109

Aufgrund einer Schichtdicke von 100-300 µm war es möglich die neugebildete Matrix mechanisch

vom Scaffold abzutrennen und den Hydroxyprolingehalt (Hyp-Gehalt) als Maß für die

Kollagensynthese und den Chondroitinsulfatgehalt als Maß für die GAG-Bildung in Abhängigkeit von

der Kultivierungsdauer zu bestimmen. Bei der Quantifizierung des Hydroxyprolingehalts wurde nicht

zwischen Kollagen Typ I und Typ II unterschieden. Die Untersuchungen ergaben einen

gleichbleibenden Anteil von 15,1 ± 6,38 µg Hyp/mg Gewebe bezogen auf die neugebildete

Gewebemasse, siehe Abbildung 36. Mit dem Anwachsen neugebildeter EZM konnte

dementsprechend eine kontinuierliche Steigerung des Hydroxyprolingehalts von 12,1 ± 4,62

µg Hyp/Scaffold nach 21 d auf 37,9 ± 23,6 µg Hyp/Scaffold nach 49 d bestimmt werden, siehe

Abbildung 35. Die Bestimmung des Chondroitinsulfatgehalts als Maß für die Bildung von GAG ergab

analoge Ergebnisse. Es konnte ein gleichbleibender Anteil von 82,64 ± 25,56 µg CS/mg Gewebe

bezogen auf die neugebildete Gewebemasse, siehe Abbildung 34, und mit dem Anwachsen

neugebildeter EZM eine kontinuierliche, signifikante Steigerung von 64,3 ± 14,1 µg CS/Scaffold nach

21 d auf 153,2 ± 22,4 µg CS/Scaffold nach 49 d bestimmt werden, siehe Abbildung 33. Wie bereits in

Kapitel 7.3.2 diskutiert, zeigen diese Untersuchungen zusammen mit den Ergebnissen der

Zellproliferation, sie Kapitel 5.3.3.3, die Zellvitalität der bMFC auf der Kollagenmatrix über die Zeit.

Insgesamt liefert die Kultivierung in ChondroDiff sehr gute Ergebnisse hinsichtlich der de novo

Matrixsynthese, sowie eine deutlich stimulierte Zellmigration zu Beginn der Kultivierung. Die

beobachtete Bildung spezifischer EZM Bestandteile mit steigender Kultivierungsauer (>35 d, siehe

Abbildung 29) weisen auf eine Redifferenzierung der bMFC hin. Die geringere Proliferation ebenso

wie die Beobachtung, dass die Schichtdicke ab ca. 70 d konstant blieb, weißen zudem auch auf eine

mögliche Nährstofflimitierung der Zellen bei Kultivierungszeiten über 70 d hin. Diese naheliegende

Hypothese sollte in weiterführenden Untersuchungen überprüft werden. Durch entsprechende

Anpassung des Medienvolumens mit steigender Kulturdauer oder auch kürzere

Medien-Wechselintervalle könnten derartige Nährstofflimitierungen in weiteren Arbeiten vermieden

oder deutlich vermindert werden.

7.3.3.4 Kultivierung in definierten Medien mit Metabolismus fördernden Zusätzen und

Wachstumsfaktoren

Aufbauend auf den Ergebnissen der Kultivierung in ChondroDiff wurde getestet, ob über eine

Verlangsamung der EZM Neubildung die Zellmigration aufgrund verminderter Immobilisierung

verbessert werden kann. Daher wurde in weiteren Versuchen geprüft, wie man mit definierten

Medienzusätzen und Zytokinen das Migrationsverhalten und die EZM–Synthese gleichzeitig steuern

kann. Ziel sollte sein, die EZM–Neubildung zu verlangsamen und die Migration zu stimulieren. Für die

Steuerung des Migrationsverhaltens und der EZM–Synthese ist es nötig, alle Bestandteile des

Diskussion

Seite 110

Mediums kontrollieren zu können. Das ChondroDiff Medium, dessen Zusammensetzung vom

Hersteller nur teilweise bekannt geben wird, ist daher nicht gut geeignet. Dagegen sollten definierte

Medien (siehe Kapitel 4.12.5) mit migrationsfördernden und Metabolismus steigernden Zusätzen

eingesetzt werden.

Die Ergebnisse nach 14 d Kultivierung in definiertem Medium sind mit den Ergebnissen nach

ultivierung in DMEM/Ham’s F12 mit 10 % FBS vergleichbar. Es ist eine dünne Schicht aus Zellen und

neugebildeter EZM zu erkennen (siehe Abbildung 38). Zudem sind einige, bis zu 200 µm tief entlang

von Kollagenfasern in das Gewebe migrierte Zellen beobachtbar. Nach 28 d Kultivierung konnten

eine etwa 100 µm dicke Zellschicht sowie einige, bis zu ca. 500 µm tief in das Gewebe migrierte

Zellen beobachtet werden. Wie bereits diskutiert, ist die Kollagenstruktur der bestimmende Faktor

für die Zellmigration. Somit können aufgrund unterschiedlicher Strukturen der Scaffolds keine

sicheren Aussagen zu den Einflüssen verschiedener Wachstumsfaktoren auf die Zellmigration

getroffen werden.

Da auch nach 28 d keine Matrixbildung um migrierte Zellen zu beobachten ist, werden die Zellen

aufgrund der verlangsamten Matrixbildung nicht immobilisiert und damit die Zellmigration durch

Einsatz von modifiziertem DMEM erleichtert.

Im Vergleich zu DMEM/Ham’s F12 mit FBS oder Wachstumsfaktoren, siehe Kapitel 7.3.3.1 und

Kapitel 7.3.3.2, konnte die EZM–Synthese und Zellmigration deutlich gesteigert werden. Zudem

wurde im Gegensatz zu ChondroDiff Medium durch modifiziertes DMEM eine verlangsamte

Neubildung extrazellulärer Matrix erreicht. Die von Pangborn und Athanasiou [162, 201]

beschriebene, proliferationsfördernde Wirkung von TGF–β konnte in diesen Versuchen bestätigt

werden, da ein eindeutiges Wachstum der bMFC und EZM–Neubildung auf den Scaffolds beobachtet

werden konnte. Auch die in der Literatur beschriebene Wirkung von TGF–β, die Matrixbildung zu

erhöhen und die chondrogene Differenzierung der Zellen zu fördern wird, in dieser Arbeit bestätigt

[80-81, 162, 199, 201].

Die IHC–Färbung zeigte zunächst die räumlich homogene Bildung von Kollagen Typ I. Im Vergleich

dazu fällt die Intensität der Kollagen Typ II Färbung sehr schwach aus, was auf eine geringe Synthese

von Kollagen Typ II hinweist, siehe Abbildung 38 e und f. Allerdings ist die immunohistologische

Färbung von Aggrecan, siehe Abbildung 38 d, auf der Außenseite der Zellschicht intensiver, als auf

der dem Scaffold zugewandten Seite. Dieses Ergebnis wird unterstützt durch die von Verdonk et al.

beschriebene Redifferenzierung humaner MFC einhergehend mit erhöhter Expression von Aggrecan

bei Kultivierung unter 3D Bedingungen [205]. Die geringe Intensität der Aggrecanfärbung der

neugebildeten EZM-Schicht von Scaffolds, die in definiertem Medium kultiviert wurden im Vergleich

Diskussion

Seite 111

zu NHChondroDiff Medium beruht vermutlich auf einer geringeren Konzentration an

Wachstumsfaktoren oder auf nur im NHChondroDiff vorhandenen Mediumkomponenten.

Um die Zellmigration weiter zu stimulieren und eine möglichst homogene Besiedelung der

Kollagenmatrix zu ermöglichen, wurden die migrationsfördernden Wachstumsfaktoren HGF und

PDGF–AB, einzeln sowie in Kombination eingesetzt. Da diese Versuche nur für einen Zeitraum von

21 d durchgeführt wurden, sind für eine bessere Vergleichbarkeit mit der Kultivierung in ChondroDiff

Medium Experimente über einen längeren Zeitraum anzustreben.

Die Kultivierung in modifiziertem DMEM mit HGF ergab sowohl eine Förderung der Zellmigration, als

auch die Neubildung von EZM, sie Kapitel 5.3.4.6. Nach 21 d Kultivierung in modifiziertem DMEM mit

HGF kann im Vergleich zu modifiziertem DMEM ohne HGF eindeutiges Zellwachstum und eine

vergleichbare Zellmigration in das Gewebe beobachtet werden, wobei die Zellen entlang von

Kollagenfasern bis zu 400 μm in das Gewebe einwandern (siehe Abbildung 39 b). Die von Bhargava et

al. beschriebene, migrations– und proliferationsfördernde Wirkung von HGF konnte auch in diesen

Versuchen gezeigt werden [79, 161]. Im Vergleich zur Kultivierung in modifiziertem DMEM ohne HGF

konnte kein signifikanter Unterschied in Bezug auf Stimulation der Matrixsynthese beobachtetet

werden. Somit ist es wahrscheinlich, dass die Bildung extrazellulärer Matrix auf die Wirkung von

TGF–β zurückzuführen ist (vergleiche Kapitel 5.3.4.5).

Die Ergebnisse nach Kultivierung in modifiziertem DMEM mit PDGF–AB sind ähnlich der Kultivierung

in modifiziertem DMEM mit HGF. Es sind Zellen zu erkennen, die bis zu etwa 300 μm weit in das

Gewebe eingewandert sind. Das Ergebnis wird ebenfalls durch die von Bhargava et al. beschriebene,

migrationsfördernde Wirkung von PDGF–AB belegt [79, 161]. Im Vergleich zur Kultivierung mit HGF

fallen jedoch weniger, in das Gewebe migrierte Zellen auf. Die Kollagenstruktur dieser Scaffolds sieht

mikroskopisch dichtgepackter aus und erschwert, wie bereits diskutiert, ein Einwandern der Zellen,

siehe Kapitel 7.3.3.3. Somit lässt sich bei diesen Experimenten der Einfluss von PDGF–AB nicht

eindeutig vom Einfluss der Gewebestruktur abgrenzen. Folglich wären auch hier

Besiedelungsversuche mit Scaffolds aus exakt identischen Bereichen denkbar, um Unterschiede

zwischen den beiden migrationsfördernden Wachstumsfaktoren noch besser herauszustellen. Eine

erhöhte Stimulation der Matrixsynthese im Vergleich zur Kultivierung in modifiziertem DMEM ohne

migrationsfördernde Wachstumsfaktoren ist auch hier nicht zu beobachten, weswegen die

Neubildung extrazellulärer Matrix vermutlich überwiegend auf TGF–β zurückzuführen ist. Die in der

Literatur beschriebene Unterstützung der Matrixsynthese durch PDGF–AB [162, 201-202] kann somit

nicht eindeutig bestätigt werden. Versuche mit Medium ohne TGF–β könnten hierüber Aufschluss

geben.

Diskussion

Seite 112

IHC–Färbungen besiedelter Scaffolds in modifiziertem DMEM mit migrationsfördernden

Wachstumsfaktoren zeigen, ähnlich den Ergebnissen nach Kultivierung in modifiziertem DMEM ohne

migrationsfördernde Wachstumsfaktoren, auch nach Kultivierung mit HGF oder PDGF–AB eine

homogene Verteilung von Kollagen Typ I in der neugebildeten Zellschicht, siehe Abbildung 42 b und

Abbildung 44 b. Weiterhin sind Kollagen Typ II und Aggrecan nachweisbar, wobei die Färbungen,

ebenso wie bei modifiziertem DMEM mit Metabolismus fördernden Zusätzen ohne

migrationsfördernde Wachstumsfaktoren schwach ausgeprägt sind, was im Vergleich zu den

Ansätzen mit ChondroDiff Medium vermutlich auf geringere Konzentrationen an Wachstumsfaktoren

und weiteren Metabolismus fördernden Zusätzen beruht.

Die Kultivierung in modifiziertem DMEM mit einer Kombination beider Wachstumsfaktoren erzielte

ebenfalls gute Ergebnisse, zeigt allerdings im Vergleich zu modifiziertem DMEM mit HGF, siehe

Kapitel 5.3.4.6) keine signifikanten Unterschiede. Auch nach Kultivierung mit Metabolismus

fördernden Zusätzen und einer Kombination von HGF und PDGF–AB wurden nach 21 d bis zu ca.

300 μm weit in das Gewebe migrierte Zellen gefunden. Auch bei der de novo Synthese von EZM sind

keine erkennbaren Unterschiede zu beobachten. Nach 21 d Kultivierung ist die Zellschicht auf etwa

100 μm Dicke angewachsen und durch IHC–Färbung können Kollagen Typ I, Typ II und Aggrecan in

der neugebildeten Matrix nachgewiesen werden. Die geringe Intensität der IHC–Färbungen ist auch

hier auf die verlangsamte Matrixsynthese aufgrund geringerer Konzentration an Wachstumsfaktoren

zurückzuführen.

Zusammenfassend lohnt sich der Einsatz einer Kombination migrationsfördernder

Wachstumsfaktoren nicht, da die Ergebnisse mit der Kultivierung von bMFC in modifiziertem DMEM

mit HGF vergleichbar sind. In Bezug auf Zellmigration konnte die Kombination beider

Wachstumsfaktoren keine entscheidenden Vorteile gegenüber dem Einsatz von lediglich HGF

erzielen, womit der Einsatz eines weiteren Wachstumsfaktors unnötig erscheint.

7.3.4 Einfluss der superfiziellen Schicht auf die Zellmigration

Bei Besiedelungsexperimenten mit Scaffolds ohne superfizielle Schicht, wurde bei allen verwendeten

Kultivierungsmedien Zellmigration in unterschiedlichem Ausmaß entlang von Kollagenfasern

beobachtet, siehe Kapitel 7.3.3.1, Kapitel 7.3.3.2, Kapitel 7.3.3.3 und Kapitel 7.3.3.4. Wie in den

vorherigen Kapiteln beschrieben, wurde nur die Migration entlang von Kollagenfasern beobachtet.

Um diese Beobachtungen eingehender zu untersuchen, wurden Besiedelungsversuche mit Scaffolds

durchgeführt, bei denen die superfizielle Schicht vorhanden war. So konnte der Einfluss der

Kollagenstruktur auf die Zellmigration weiter deutlich gezeigt werden.

Diskussion

Seite 113

Signifikante Unterschiede wurden bei Scaffolds mit superfizieller Schicht festgestellt. Wie Abbildung

45 b und c zeigt, konnten keine Zellen durch die superfizielle Schicht in das Innere des Gewebes

migrieren. Die superfizielle Schicht des Meniskus besteht aus einem dicht gepackten Netzwerk

zufällig angeordneter dünner Kollagenfasern, während die inneren Bereiche des Meniskus aus

circumferential verlaufenden Fasern mit einem kleinen Teil radiär verlaufender Verbindungsfasern

bestehen [4, 31]. Wie die Ergebnisse zeigen, adhärieren die Zellen auf der superfiziellen Schicht.

Aufgrund der dicht gepackten, superfiziellen Schicht des Meniskus konnten keine Zellen in das Innere

der Probe migrieren. Zudem war auch bei Kultivierung in NHChondroDiff Medium keine stabile

Verbindung zwischen Zellschicht und Scaffold in Form von in das Scaffold hineinreichender

neusynthetisierter EZM möglich. Dadurch kann durch das Schneiden mit dem Mikrotom die

neugebildete Zellschicht leicht von der Oberfläche des Scaffolds abgetrennt werden. Diese

Ergebnisse bestätigen die Aussage, dass lockeres Gewebe und günstig ausgerichtete Kollagenfasern

die Migration der Zellen in das Gewebe unterstützen. Für weitere Versuche wäre es folglich denkbar,

die Struktur der Kollagenfibrillenbündel im Meniskus gezielt zu nutzen und Scaffolds herzustellen, bei

denen die Ausrichtung der Kollagenfasern die Migration der Zellen in das Gewebeinnere erleichtert.

Weiterhin sollte bei Besiedelung ganzer Menisken ein Auflockern der Oberfläche, z.B. durch

mechanische oder enzymatische Verfahren, in Erwägung gezogen werden, um ein Einwandern von

Zellen zu verbessern.

7.4 Bewertung der Kollagenmatrix

Alle im Rahmen dieser Arbeit bisher beschriebenen und diskutierten Ergebnisse demonstrieren die

besondere Qualität der Kollagenmatrix. Es konnte gezeigt werden, dass unter Erhalt der natürlichen

3D Kollagenstruktur Keime, zellulären Bestandteile und entzündungsrelevante Determinanten so

weit reduziert werden, wie es für ein Transplantatmaterial notwendig ist. Die Kollagenmatrix weist

eine deutlich aufgelockerte Struktur auf, die eine Zellbesiedelung begünstigt und in vivo somit die

laterale Gewebeintegration verbessern kann [159, 206]. Toxizitätsbestimmungen nach Vorgaben

internationaler Standards (ISO 10993-5:2009) belegen non-zytotoxische Eigenschaften der

Kollagenmatrix.

Die Besiedelungsversuche mit primären bMFC belegen eine sehr gute Akzeptanz von primären

xenogenen Zellen und mit bis zu 112 d Kultivierungsdauer die langfristige Revitalisierbarkeit der

Kollagenmatrix. Die chondrokonduktiven Eigenschaften der Kollagenmatrix und damit die besondere

Qualität und Eignung der Kollagenmatrix als Bioimplantat werden belegt durch die Neusynthese

meniskusspezifischer EZM, hohe nachgewiesene Zelldichten sowie Zellmigration in die Matrix. Auch

Diskussion

Seite 114

innerhalb der Kollagenmatrix gewährleistet die aufgelockerte, natürliche 3D Struktur eine adäquate

Nährstoffversorgung.

Aus biologischer Sicht besitzt die hergestellte Kollagenmatrix, wie alle Untersuchungen belegen, in

vitro sehr gute chondrokonduktive Eigenschaften und eine ausgezeichnete biologische

Verträglichkeit. Aufgrund der bisher erhobenen Daten ist davon auszugehen, dass wesentliche

Voraussetzungen für eine erfolgreiche Gewebeintegration geschaffen wurden. Im Falle einer

Transplantation ist deshalb zu erwarten, dass kaum matrixbedingte gesundheitliche

Beeinträchtigungen auftreten, die Kollagenmatrizes schnell und effektiv durch körpereigene Zellen

besiedelt und durch extrazelluläre Matrix modifiziert werden kann.

Literatur

Seite 115

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Verzeichnisse

Seite I

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Links: Anteriore Ansicht des Kniegelenks. Rechts: Ansicht von Oben auf das Tibiaplateau.

Lage der Menisken im Kniegelenk zwischen Tibia und Femur. Die kreuzend verlaufenden Bänder

stabilisieren das Kniegelenk. Aus [1]. .............................................................................................. 3

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Vaskularisierung und zonalen Einteilung des Meniskus.

R-R: rot-rote Zone (gut vaskulariert); R-W: rot-weiße Zone (schwach vaskularisiert); W-W:

weiß-weiße Zone (avaskulär). Die Synovia ist nicht dargestellt. Aus [29]. ...................................... 5

Abbildung 3: Synoptische Darstellung der dreidimensionalen Kollagenstruktur des Meniskus im

Querschnitt. (1) superfizielle Schicht, (2) lamellare Schicht, (3) innere Schicht aus

circumferentialen Kollagenfaserbündeln. Aus [30]. ........................................................................ 5

Abbildung 4: Schematisches Diagramm zur Darstellung der zellulären Komponenten und der

Matrixkomponenten von Meniskusgewebe. O: äußere Zone (rot-rot); I: innere Zonen (rot-weiße

und weiß-weiße Zone); S: Superfizielle Schicht. Modifiziert nach [3]. ............................................ 6

Abbildung 5: Struktureller Aufbau und Hierarchie von Kollagenfasern. Aus [48]. ................................. 9

Abbildung 6: Schematische Darstellung der Lage und Interaktion von Aggrecan mit Chondrozyten und

weiteren Komponenten der extrazellulären Matrix [52]. ............................................................. 10

Abbildung 7: Schematische Darstellung der regional variierenden Zellpopulationen des humanen

Meniskus. Rechts: Zellen im äußeren, vaskularisierten Bereichen (rot-rote Zone) sind

spindelförmig mehr fibroblasten-ähnlich, Zellen der rot-weißen und der weiß-weißen Zone sind

chondrozyten--ähnlich, allerdings phenotypisch unterschiedlich. Die Zellen der superfiziellen

Schicht sind klein und rund. Aus [1]. ............................................................................................. 12

Abbildung 8: Schematische Darstellung der intrazellulären Bildung von Prokollagen und der

extrazellulären Entstehung einer Kollagenfibrille aus Tropokollagen. Aus [48]. .......................... 13

Abbildung 9: Schematische Darstellung der Synthese von Proteoglykanmolekülen, Hyaluronsäure und

link-Proteinen durch Chondrozyten und der extrazellulären Zusammenlagerung [61]. .............. 14

Abbildung 10: Struktur von alpha-Gal Epitopen auf N-gebundenen Kohlenhydratketten mammaler

Glykoproteine (links) und auf Glykolipiden (rechts). Modifiziert aus [70]. ................................... 17

Abbildung 11: Schematische Darstellung des klassischen Modells einer unter zweidimensionalen

Bedingungen migrierenden Zelle. Aus [96]. .................................................................................. 23

Abbildung 12: Darstellung verschiedener Meniskusrisstypen: Längsriss, Korbhenkelriss, Radiärriss,

Lappenriss, Horizontalriss. Aus [110]. ........................................................................................... 25

Abbildung 13: Vereinfachte schematische Darstellung der prinzipiellen Vorgehensweise bei der

Herstellung eines Meniskusersatzmaterials durch Selbstorganisation geeigneter Zellen.

Modifiziert nach [1]. ...................................................................................................................... 30

Abbildung 14: Lateraler porciner Meniskus (a) mit ausgestanzten Gewebezylindern (b), (c)

Biopsiestanze. ................................................................................................................................ 34

Abbildung 15: Schneidehilfe (a) zum Schneiden von Kollagenscaffolds (d). b) Rasierklinge, c) Pinzette,

e) Uhrglas. ..................................................................................................................................... 35

Abbildung 16: Links: Schematische Darstellung der Anordnung von Kollagenscaffolds in einem Well

einer 24-Wellplatte zur Besiedelung mit bMFC. Rechts: Aufnahme von Scaffolds vor der

Besiedelung. .................................................................................................................................. 53

Abbildung 17: Hämatoxylin-Eosin Färbung von nativem (a) und prozessiertem (b) porcinem

Meniskusgewebe zur Darstellung extrazellulärer Matrix (rötlich/rot) sowie der Zellkerne

(dunkelblau/schwarz). Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm. ................................................. 57

Verzeichnisse

Seite II

Abbildung 18: Quantitative Bestimmung von Galα1,3-Galβ1-4-GlcNAc-R (α-Gal Epitope) bei der

murinen Fibrosarcomazellinie L929 (Positivkontrolle) im Vergleich zu nativem und prozessiertem

porcinem Meniskusgewebe. Daten eines ELISA Inhibierungsassay, angegeben in % Inhibierung

der Bindung von M 86 Antikörpern an α-Gal Epitope. Die Fehlerbalken entsprechen dem

Konfidenzintervall (P = 95 %; N = 6 für L 929; N = 6 für nativ und N = 9 für prozessiert). IC50 steht

für die „Concentration at 50 % inhibition“. ................................................................................... 58

Abbildung 19: Alcianblau-Färbung zur Darstellung saurer, sulphatierter GAG (blau)

(dunkelblau/schwarz) von nativem (a) und prozessiertem (b) Meniskusgewebe. Die in nativem

Gewebe vorhandenen GAG sind blau angefärbt, in prozessiertem Meniskusgewebe können

keine GAG angefärbt werden. Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm. ..................................... 59

Abbildung 20: REM-Aufnahmen von nativem (a) und prozessiertem (b) procinem Meniskusgewebe

zur Darstellung der 3D Anordnung der Kollagenfibrillen. Quer getroffene (#), dicht gepackten

Fibrillen und Faserbündel, längs (*) verlaufende Fibrillen und Faserbündel. ............................... 61

Abbildung 21: TEM-Aufnahmen von nativem (a) und prozessiertem (b) procinem Meniskusgewebe.

Darstellung der charakteristischen D-periodischen Bänderung von ca. D = 67 nm der

Kollagenfibrillen. ............................................................................................................................ 62

Abbildung 22: In vitro Zytotoxizität zur biologischen Beurteilung von Medizinprodukten nach ISO-

Standards (ISO 10993-5). Zellvitalität [%], bezogen auf die Negativkontrolle (NK), primärer

hBMSC, L929 und primärer bMFC als Indikatorzellen um mögliche zytotoxische Effekte der

Meniskusmatrix nach 24 h Inkubation der Matrix in Zellkulturmedium (0 %, 2 %, 5 % und 10 %

Serumgehalt) als Extraktionsmittel zu bestimmen. Sensibilisierung des Testsystems durch

Nährstofflimitierung über reduzierte Serumzugabe. Positivkontrolle (PK) 10 % DMSO. NK: Thin

Cert® (Greiner BioOne). Die Fehlerbalken entsprechen den Konfidenzintervallen (P=95 %. N=6).

....................................................................................................................................................... 64

Abbildung 23: In vitro Zytotoxizität zur biologischen Beurteilung von Medizinprodukten nach ISO-

Standards (ISO 10993-5). Zellvitalität [%], bezogen auf die Negativkontrolle (NK), primärer

hBMSC, L929 und primärer bMFC als Indikatorzellen um mögliche zytotoxische Effekte der

Meniskusmatrix nach 72 h Inkubation der Matrix in Zellkulturmedium (mit 0 %, 2 %, 5 % und

10 % Serumgehalt) als Extraktionsmittel zu bestimmen. Sensibilisierung des Testsystems durch

Nährstofflimitierung über reduzierte Serumzugabe. Positivkontrolle (PK) 10 % DMSO. NK: Thin

Cert® (Greiner BioOne). Die Fehlerbalken entsprechen den Konfidenzintervallen (P=95 %. N=6).

....................................................................................................................................................... 65

Abbildung 24: Wachstumskurve boviner MFC mit unterschiedlichen Startzellzahlen [Zellen∙cm-2] zur

Bestimmung der minimal notwendigen Starzellzahl..................................................................... 67

Abbildung 25: Hämatoxylin-Alcianblau gefärbte Paraffinschnitte (Schnittdicke = 5 µm) von

Kollagenmatrizes besiedelt mit primären bMFC nach 0 d (a), 14 d (b), 28 d (c) und 42 d (d)

Kultivierung in DMEM/Ham`s F12 Medium mit 10 % FBS. Der Maßstabsbalken entspricht

100 µm........................................................................................................................................... 69

Abbildung 26: Hämatoxylin-Alcianblau gefärbte Paraffinschnitte (Schnittdicke = 5 µm) von

Kollagenmatrizes besiedelt mit primären bMFC nach 14 d (a), 28 d (b) und 42 d (c). Kultivierung

in NHChondroDiff Medium. Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm. ......................................... 70

Abbildung 27: CFDA-SE/PI- lebend -tot Doppelfärbung zur Darstellung der Vitalität boviner MFC auf

Kollagenmatrizes nach 0 d, 7 d und 21 d Kultivierungsdauer. Kultivierung in DMEM/Ham`s F12

mit 10 % FBS (a-c) und NHChondroDiff Medium (d-f). ................................................................. 71

Verzeichnisse

Seite III

Abbildung 28: Flächenzelldichte besiedelter Kollagenmatrizes als Funktion der Kultivierungszeit.

Kultivierung in DMEM/Ham`s F12 mit 10 % FBS und NHChondroDiff Medium. N = 4-7. Die

Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung. .................................................................. 72

Abbildung 29: Immunohistologische- sowie Hämatoxylin-Alcianblau gefärbte Paraffinschnitte

(Schnittdicke = 5 µm) besiedelter Kollagenmatrizes nach Kultivierung in DMEM/Ham`s F12 mit

10 % FBS. a) 42 d, IHC Kollagen Typ I-Färbung, Gegenfärbung der Zellkerne mit Hämatoxylin. b)

42 d, IHC Aggrecan-Färbung, Gegenfärbung der Zellkerne mit Hämatoxylin. c) 42 d, IHC Kollagen

Typ II-Färbung, Gegenfärbung der Zellkerne mit Hämatoxylin. d) 14 d

Hämatoxylin-Alcianblau-Färbung. Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm. ............................... 74

Abbildung 30: Hämatoxylin-Alcianblau gefärbte Paraffinschnitte (Schnittdicke = 5 µm) mit bMFC

besiedelter Kollagenmatrizes nach 14 d (a,d,g), 28 d (b,e,h) und 56 d (c,f,i) Kultivierungsdauer in

DMEM/Ham`s F12 mit 10 ng ml-1 HGF (a-c), 10 ng ml-1 PDGF-AB (d-f) und serumfrei (g-i). Der

Maßstabsbalken entspricht 100 µm.............................................................................................. 75

Abbildung 31: IHC gefärbte Paraffinschnitte (Schnittdicke = 5 µm) besiedelter Kollagenmatrizes nach

28 d (a), 70 d (b) und 98 d (c) Kultivierungsdauer in NHChondroDiff Medium. Kollagen Typ

I-Färbung, Zellkerne sind mit Hämatoxylin dunkel gegengefärbt. Der Maßstabsbalken entspricht

100 µm........................................................................................................................................... 76

Abbildung 32: Paraffinschnitte (Schnittdicke = 5 µm) mit bMFC besiedelter Kollagenmatrizes nach

70 d Kultivierungsdauer in NHChondroDiff Medium. IHC-Färbung von a) Aggrecan, b) Kollagen

Typ I und c) Kollagen Typ II. Die Zellkerne sind mit Hämatoxylin gegengefärbt. Der

Maßstabsbalken entspricht 100 µm.............................................................................................. 77

Abbildung 33: Gehalt saurer sulfatierter GAG [µg CS] Scaffold-1 nach 21 d, 35 d und 49 d, ausgedrückt

in Chondroitinsulfatäquivalenten, als Funktion der Kultivierungszeit. NHChondroDiff Medium.

Die Fehlerbalken entsprechen den Konfidenzintervallen (P = 95 %, N = 6 - 8). ............................ 78

Abbildung 34: GAG-Gehalt nach 21 d, 35 d und 49 d (wG; m CS [µg]/m Gewebe [mg]) in der

neugebildeten Matrix bezogen auf die Gewebemasse, ausgedrückt in

Chondroitinsulfatäquivalenten, als Funktion der Kultivierungszeit. NHChondroDiff Medium. Die

Fehlerbalken entsprechen den Konfidenzintervallen (P = 95 %, N = 6-8). .................................... 79

Abbildung 35: Hydroxyprolingehalt, wH [µg Hyp] Scaffold-1 nach 21 d, 35 d und 49 d als Maß für die

Kollagensynthese als Funktion der Kultivierungszeit. NHChondroDiff Medium. Die Fehlerbalken

entsprechen den Konfidenzintervallen (P = 95 %, N = 6-8). .......................................................... 80

Abbildung 36: Hydroxyprolingehalt, wH [µg Hyp], in der neugebildeten Matrix bezogen auf die

Gewebemasse nach 21 d, 35 d und 49 d als Funktion der Kultivierungszeit. NHChondroDiff

Medium. N = 6-8. Die Fehlerbalken entsprechen den Konfidenzintervallen, P = 95 %. ............... 81

Abbildung 37: Paraffinschnitte besiedelter Scaffolds nach a) 14 d und b) 70 d Kultivierung in

NHChondroDiff Medium. Hämatoxylin-Alcianblau Kombinationsfärbung. Nach 14 d ist eine

ausgeprägte Zellmigration ohne Matrixbildung entlang der Kollagenfasern zu beobachten. Nach

70 d ist auch bei allen migrierten Zellen im Inneren des Scaffolds eine signifikante Matrixbildung

beobachtbar. Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm. ............................................................... 82

Abbildung 38: Paraffinschnitte (Schnittdicke = 5 µm) besiedelter Kollagenmatrizes nach Kultivierung

in DMEM mit TGF-β1. a-c: Hämatoxylin-Alcianblau Kombinationsfärbung a) 14 d, b) 28 d, c) 52 d.

d-f: IHC-Färbung nach 42 d Kultivierungsdauer von d) Aggrecan, e) Kollagen Typ I und f) Kollagen

Typ II. Die Zellkerne sind mit Hämatoxylin gegengefärbt und erscheinen dunkelblau bis schwarz.

Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm. ...................................................................................... 83

Verzeichnisse

Seite IV

Abbildung 39: Paraffinschnitte (Schnittdicke = 5 µm) besiedelter Kollagenmatrizes nach a) 14 d und b)

21 d Kultivierung in DMEM mit TGF-β1 und HGF. Hämatoxylin-Alcianblau Kombinationsfärbung.

Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm. ...................................................................................... 84


in DMEM mit TGF-β1 und HGF. IHC-Färbung von a) Aggrecan, b) Kollagen Typ I und c) Kollagen

Typ II, nach 21 d Kultivierung. Die Zellkerne sind mit Hämatoxylin gegengefärbt und erscheinen

dunkelblau bis schwarz. Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm................................................ 85


21 d Kultivierung in DMEM mit TGF-β1 und PDGF-AB. Hämatoxylin-Alcianblau

Kombinationsfärbung. Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm. ................................................. 86


in DMEM mit TGF-β1 und PDGF-AB. IHC-Färbung von a) Aggrecan, b) Kollagen Typ I und c)

Kollagen Typ II, nach 21 d Kultivierung. Die Zellkerne sind mit Hämatoxylin gegengefärbt und

erscheinen dunkelblau bis schwarz. Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm. ............................ 87


21 d Kultivierung in DMEM mit TGF-β1, HGF und PDGF-AB. Hämatoxylin-Alcianblau

Kombinationsfärbung. Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm. ................................................. 87


in DMEM mit TGF-β1,HGF und PDGF-AB. IHC-Färbung von a) Aggrecan, b) Kollagen Typ I und c)

Kollagen Typ II, nach 21 d Kultivierung. Die Zellkerne sind mit Hämatoxylin gegengefärbt und

erscheinen dunkelblau bis schwarz. Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm. ............................ 88

Abbildung 45: Paraffinschnitte besiedelter Scaffolds mit und ohne superfizielle Schicht nach28 d

Kultivierung in NHChondroDiff. Hämatoxylin-Alcianblau Kombinationsfärbung. a) Scaffold ohne

superfizielle Schicht; b) und c) Scaffolds mit superfizieller Schicht. Der Maßstabsbalken

entspricht 100 µm. ........................................................................................................................ 89

Abbildung 46: Der siebenstufige Reinigungsprozess zur Herstellung von Meniskusimplantaten aus

porcinem Meniskusgewebe. Zwischen den Schritten, am Ende jeder Behandlung mit

Chemikalien, wird sechs mal im Abstand von einer Stunde und dann noch einmal vor dem

nächsten Prozessschritt mit vollentsalztem Wasser gespült. ........................................................ IX

Abbildung 47: Übersichtsaufnahme eines Hämatoxylin - Alcianblau gefärbten Paraffinschnitts

(Schnittdicke = 5 µm) eines besiedelten Scaffolds nach 56 d Kultivierung in NHChondroDiff

Medium. ..................................................................................................................................... XXIV

Abbildung 48: Übersichtsaufnahme eines Hämatoxylin-Alcianblau gefärbten Paraffinschnitts

(Schnittdicke = 5 µm) eines besiedelten Scaffolds nach 70 d Kultivierung in NHChondroDiff

Medium. ..................................................................................................................................... XXIV

Verzeichnisse

Seite V

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Zusammenfassung der fibrillen bildenden Kollagentypen des Meniskus und der jeweiligen

-Polypeptidketten. Aus [7]. ........................................................................................................... 8

Tabelle 2: Überblick über ausgewählte Wachstumsfaktoren und die auf Meniskuszellen ausgeübten

Effekte der Wachstumsfaktoren. Aus [1]. ↑ beschreibt einen positiven Effekt = Steigerung; ↓

beschreibt einen negativen Effekt = Verringerung. ...................................................................... 19

Tabelle 3: Anwendungsnahe, bzw. in der klinischen Anwendung befindliche Materialien für den

Meniskusersatz. ............................................................................................................................. 29

Tabelle 4: Überblick über die Schritte des nasschemischen Verfahrens und deren Wirkung auf das

Gewebe. ........................................................................................................................................ 39

Tabelle 5: Verwendete Kultivierungsmedien und Medienzusätze. ...................................................... 50

Tabelle 6: Übersicht über verwendete Kultivierungsmedien, Medienzusätze und

Kultivierungszeiträume. ................................................................................................................ 55

Tabelle 7: DNA-Gehalt [µg DNA/mg Gewebe Feuchtgewicht] in nativem und prozessiertem porcinem

Meniskusgewebe. Die Fehler entsprechen den Konfidenzintervallen (P = 95 %. N = 8 (nativ);

N = 10 (prozessiert)). ..................................................................................................................... 57

Tabelle 8: Glykosaminoglykangehalt, wG, ausgedrückt in Chondroitinsulfatäquivalenten

[µg CS/mg Gewebe] in prozessiertem und in nativem Gewebe (Referenz). Die Fehler

entsprechen den Konfidenzintervallen (P = 95 %, N = 15). ........................................................... 60

Tabelle 9: Anteil an denaturiertem Kollagen, wD [%], in prozessiertem und in nativem Gewebe

(Referenz). Die Fehler entsprechen den Konfidenzintervallen (P = 95 %. N = 17 nativ, N = 19

prozessiert). ................................................................................................................................... 60

Tabelle 10: Keimzahlen von nativem und prozessiertem Meniskusgewebe [cfu g-1 Gewebe]. ............ 63

Tabelle 11: Zellausbeute nach Isolation aus bovinen Menisken [Zellen∙g-1 Gewebe (Feuchtgewicht)].

....................................................................................................................................................... 66

Tabelle 12: Ergebnisse der Bestimmung initial nach 1 h adhärierter Zellen. Zellzahl verbliebener

Zellen pro Well und Zellzahl pro Kollagenscaffold. Die Flächenzelldichte pro Kollagenscaffold

wurde aus der Zellzahl berechnet. ................................................................................................ 68

Verzeichnisse

Seite VI

Abkürzungsverzeichnis

g Gramm/Gewichtskraft

mg Milligramm

pg Pikogramm

L Liter

ml Milliliter

µl Mikroliter

cm Zentimeter

mm Millimeter

µm Mikrometer

nm Nanometer

min Minuten

h Stunden

d Tage

rpm Umdrehungen pro Minute

M Molar

mM Millimolar

µM Mikromolar

N Normal

3D dreidimensional

2D zweidimensional

Au Gold

α-Gal Galα1-3Galβ1-4Glc NAc-R

AB Alcianblau

bMFC bovine Meniskusfibrochondrozyten

BSA bovines Serum Albumin

CMI Collagen Meniscus Implant

CS Chondroitinsulfat

CD cluster of differentiation

CFDA-SE Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester

cfu colony forming units

DMSO Dimethylsulfoxid

DSMZ Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkultur

D-DRG System Deutsches Krankenkassen Abrechnungssystem

DMMB 1,9 Dimethylmethylenblau

DMEM Dubelcco’s modified eagle medium

DNA Desoxyribonukleinsäure

DMBA p-Dimethylaminobenzaldehyd

EZM extrazelluläre Matrix

ER endoplasmatisches Reticulum

EGF epidermal growth factor

EWG Europäische Wirtschaftsgemeinschaft

ELISA enzym-linked Immunosorbent assay

EPON Einbettmittel

EtOH Ethanol

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

FBS Fötales bovines Serum

b-FGF b-fibroblast growth factor

Verzeichnisse

Seite VII

GAG Glykosaminoglykan

Gly Glycin

GT Glykosyltransferase

GndHCl Guanidiniumchlorid

HGF hepatocyte growth factor

HYP Hydroxyprolin

HA Hyaluronsäure

H2Odeion deionisiertes Wasser

hBMSC human bone marrow stemm cells

HE Hämatoxylin Eosin

H-AB Hämatoxylin-Alcianblau

HCl Salzsäure

H2O2 Wasserstoffperoxid

IGF-I insulin-like growth factor I

IgM Immunglobulin M

IgA Immunglobulin A

IL Interleukin

IHC Immunohistochemisch

IC inhibitory concentration

ISO Internationale Organisation für Normierung

kDa kilo Dalton

kV Kilo Volt

L929 murine Fibroblastenzellinie

LIF leukemia inhibitory factor

LSAB labeled-strept-avidin-biotin

MFC Meniskusfibrochondrozyten

MAPK mitogen activated protein kinase

MMP Matrixmetalloproteasen

MPG Medizinproduktegesetz

M86 Antikörper M86

MTS 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2- (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium

Na Natrium

NaCl Natriumchlorid

NaAC Natriumacetat

NaOH Natriumhydroxid

N Anzahl

NK Negativkontrolle

PG Proteoglykan

Pro Prolin

PU Polyurethan

PE Polyethylen

PBS phospahte buffered saline

PDGF-AB platelet derived growth factor AB

PK Positivkontrolle

pH pH-Wert

Pd Palladium

P/S Penicillin/Streptomycin

P Passage

PI Propidium Jodid

Verzeichnisse

Seite VIII

PCR polymerase chain reaction

r-r rot-rot

r-w rot-weiß

RTI Firmenname

RT Raumtemperatur

R Rückstand

RNA Ribonukleinsäure

REM Raster Elektronenmikroskop

SIS small intestinal submucosa

S Überstand

TGF-β transforming growth factor β

TNF zumor nekrosis factor

TEM Transmissionselektronenmikroskop

US-FDA Amerikanische Food and Drug Association

ÜK Überkopfschüttler

Vit. Vitalität

wD Anteil an denaturierten Kollagen

w-w weiß-weiß

wG Glykosaminoglykan Anteil

X Xylol

Verzeichnisse

Seite IX

Anhang

Siebenstufiger Reinigungsprozess

Abbildung 46: Der siebenstufige Reinigungsprozess zur Herstellung von Meniskusimplantaten aus porcinem

Meniskusgewebe. Zwischen den Schritten, am Ende jeder Behandlung mit Chemikalien, wird sechs mal im

Abstand von einer Stunde und dann noch einmal vor dem nächsten Prozessschritt mit vollentsalztem Wasser

gespült.

natives Meniskusgewebe

hypo - osmotische Behandlung H2O, 24 h, RT

1. alkalische Behandlung 1 N NaOH, RT, 1,5 h

Entfettung 70 % EtOH, 3 h, 40°C

GndHCl - Behandlung 1 M, 96 h, 4°C

H2O2 - Pathogen Inaktivierung

5 % H2O2, 48 h, 4°C

2. alkaline Behandlung 1 N NaOH, RT, 4 h

Waschen H2O, 24 h, RT Kollagenmatrix

Verzeichnisse

Seite X

Medien, Puffer und Lösungen

Basalmedium

Komponente Bezugsquelle Qualität Zugabe für 500 ml

DMEM/Ham`s F12 Biochrom - 490 ml L-Glutamin Biochrom 200 m, low endotoxin 5 ml Penicillin/Streptomycin Biochrom 104U/ml / 104 µg/ml 5 ml

Verdaumedium zur Isolierung boviner MFC

Komponente Firma Reinheit Zugabe für 200 ml

DMEM/Ham`s F12 Biochrom - 196 ml Collagenase Typ II Biochrom 190 U/mg 0,3 % L-Glutamin Biochrom 200 m, low endotoxin 2 ml Penicillin/Streptomycin Biochrom 104U/ml / 104 µg/ml 2 ml

Standardkulturmedium für bMFC


DMEM/Ham`s F12 Biochrom - 440 ml L-Glutamin Biochrom 200 mM, low

endotoxin 5 ml

Penicillin/Streptomycin Biochrom 104U/ml / 104 µg/ml 5 ml Fötales Bovines Serum Biochrom Superior 50 ml

Standardkulturmedium für L929


RPMI 1640 Gibco - 440 ml L-Glutamin Biochrom 200 mM, low

endotoxin 5 ml


Standardkulturmedium für hBMSC


DMEM Gibco - 435 ml L-Glutamin Biochrom 200 mM, low

endotoxin 5 ml

Na-pyruvat Biochrom 100 mM für die Zellkultur

5 ml


Verzeichnisse

Seite XI

NHChondroDiff Medium (CD+)


NHChondroDiff Miltenyi - 99 ml Penicillin/Streptomycin Biochrom 104U/ml / 104 µg/ml 1 ml

Minimalmedium mit Hepatocyte growth factor (HGF)



endotoxin 5 ml

Penicillin/Streptomycin Biochrom 104U/ml / 104 µg/ml 5 ml HGF Biochrom Human HGF (CHO),

rekombinant 5 µg

Minimalmedium mit PDGF-AB



endotoxin 5 ml

Penicillin/Streptomycin Biochrom 104U/ml / 104 µg/ml 5 ml PDGF-AB Biochrom Human PDGF-AB,

rekombinant 5 µg

Definiertes chondrogenes Medium mit Transforming growth factor-β1 (TGF- β1) (CD++)


DMEM Biochrom - 490 ml L-Glutamin Biochrom 200 m, low endotoxin 5 ml Penicillin/Streptomycin Biochrom 104U/ml / 104 µg/ml 5 ml TGF-β1 Biochrom Human TGF-β1,

rekombinant 5 µg

Insulin Biochrom für die Zellkultur 3,125 mg Na-pyruvat Biochrom 100 mM für die

Zellkultur 5 ml

L-Prolin Sigma Aldrich für die Zellkultur geeignet

2 mg

Dexamethason Sigma Aldrich ≥ 97 %, für die Zellkultur

10-7 M

Ascorbat-2-Phosphat Sigma Aldrich für die Zellkultur geeignet

2 mg

Verzeichnisse

Seite XII

Definiertes chondrogenes Medium mit migrationsfördernden Wachstumsfaktoren


CD++ Siehe oben - 500 ml HDF Biochrom Human HGF (CHO),

rekombinant 5 µg

PDGF-AB Biochrom Human PDGF-AB, rekombinant

5 µg

Die Wachstumsfaktoren HGF und PDGF-AB wurden sowohl einzeln, als auch in Kombination zugegeben

40 % Medium



endotoxin 5 ml


20 % DMSO Medium


DMEM/Ham`s F12 Biochrom - 390 ml L-Glutamin Biochrom 200 m, low endotoxin 5 ml Penicillin/Streptomycin Biochrom 104U/ml / 104 µg/ml 5 ml DMSO Carl Roth GmbH 100 ml

Phospahte Buffered Saline (PBS)

Komponente Firma Reinheit Konzentration [g l-1]

NaCl Carl Roth GmbH 99,9 % Cellpure 8 g KCl Applichem für die Zellkultur 0,2 g Na2HPO4 Applichem für die Zellkultur 1,15 g KH2PO4 Applichem für die Zellkultur 0,2 g

Einstellen des pH auf 7,4 mit 1M HCl

Trypanblau


PBS s.o. s.o. 90 ml Trypanblau Sigma Aldrich Lösung 0,4 %, für die

Zellkultur, steril filtriert 10 ml

Verzeichnisse

Seite XIII

Inkubationspuffer (IKP)

Komponente Firma Qualität Konzentration [g l-1]

Tris-HCl Carl Roth GmbH 99,8 %, p.a. 15,76 g EDTA Carl Roth GmbH 99 % für die Biochemie 0,185 g 2-Iodacetamid Merck Zur Synthese 0,29225 g Pepstatin A AppliChem Keine Angabe 0,01 g

Einstellen des pH auf 7,3 mit 1M NaOH

Guadiniumchlorid-Lösung


IKP s.o. s.o. Guanidiniumchlorid Carl Roth GmbH 99,5 % für die

Biochemie 95,53 g

Na-Acetat Carl Roth GmbH ≥ 98,5 %, reinst, wasserfrei

4,1 g

Guanidiniumchlorid und Na-Acetat abwiegen und auf 1000 ml mit IKP auffüllen

alpha-Chymotrypsin Lösung (1 mg/ml)


IKP s.o. s.o. α-Chymotrypsin Merck Keine Angabe 10 mg

Citratpuffer (pH 6)

Komponente Firma Reinheit Konzentration [g l-1]

Zitronensäure x 1H2O Merck p. a. 50 g Eisessig Carl Roth GmbH 100 % 12 ml Na-Acetat x 3 H2O Merck p. a. 120 g NaOH Carl Roth GmbH ≥ 99 % 34 g

pH 6

NaOH/Citratpuffer


Citratpuffer s.o. s.o. 200 ml NaOH Carl Roth GmbH ≥ 99 % 4,4 g

Chloramin-T-Lösung

Komponente Firma Qualität Zugabe für 15 ml

Chloramin-T x 3H2O Merck p. a. 0,212 g VE Wasser 3 ml 2-Ethoxyethanol Merck p. a. 4,5 ml Citratpuffer 7,5 ml

Verzeichnisse

Seite XIV

DMBA-Lösung


4-Dimethylamino Benzaldehyd

Carl Roth GmbH p. a. 3 g

2-Ethoxyethanol Merck p. a. 15 ml

Proteinase K Verdaupuffer


K2HPO4

Proteinase K Verdaulösung


Proteinase K Carl Roth GmbH p. a. 500 µg Verdaupuffer 10 ml

Formiat-Lösung


Ethanolabsolut Carl Roth GmbH absolut 12,5 ml 1 M Guanidiniumchlorid-Lösung (in VE H2O)

Carl Roth GmbH 50 ml

Na-Formiat Sigma Aldrich Keine Angabe 0,5 g Ameisensäure 0,5 ml

pH 3, mit VE H2O auf 250 ml auffüllen

Instabile DMMB-Lösung


1,9-Dimethylmethylenblau (DMMB)

Sigma Aldrich < 20 % H2O 8 g

Ethanolabsolut Carl Roth GmbH absolut 12,5 ml Na-Formiat Sigma Aldrich Keine Angabe 0,5 g Ameisensäure 0,5 ml

pH 3, mit VE H2O auf 250 ml auffüllen

Stabile DMMB-Lösung pH 3


Formiat - Lösung 250 ml Instabile DMMB - Lösung

250 ml

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Seite XV

Dekomplexierungslösung


Na-Acetat Carl Roth GmbH ≥ 98,5 %, reinst, wasserfrei

2,05 g

Propan-1-ol 12,5 ml Na-Formiat Sigma Aldrich Keine Angabe 0,5 g Guanidiniumchlorid Carl Roth GmbH 99,5 % für die

Biochemie 191,06 g

pH 6,8, mit VE H2O auf 450 ml auffüllen

Bicarbonat/Carbonat Puffer


Na2CO3 Carl Roth GmbH ≥ 99,8 %, p.a., wasserfrei

2,332 g

NaHCO3 Merck z. Analyse 7,476 g

Blockpuffer


Bovines Serum Albumin

Sigma Aldrich Keine Angabe 10 g

PBS 1000 ml

Waschlösung


Tween 20 Sigma Aldrich 0,1 ml PBS 1000 ml

TNE Puffer


Tris Carl Roth GmbH p. a. 1,21 g EDTA Carl Roth GmbH 99 % für die Biochemie 0,37 g NaCl Merck z. Analyse 175,32 g HCl Carl Roth GmbH 37 % 300 ml VE H2O 700 ml

TBST


Tris–HCl Carl Roth GmbH 99,8 %, p.a. 7,88 g NaCl Merck z. Analyse 8,77 g Tween20 Sigma Aldrich 1 ml

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Seite XVI

Gepuffertes Formalin


Na2HPO4∙2H2O Merck z. Analyse 1,95 g NaH2PO4 Merck z. Analyse 0,47 g Formalin Sigma 36-40 % 25 ml

Verzeichnisse

Seite XVII

Arbeitsschritte und Verdünnungen

Paraffineinbettung

Proben 2-4 Tage in ca. 3 ml gepuffertem Formalin bei 4°C im Dunkeln fixieren

Proben in Einbettkassetten überführen

Dehydrieren (ca. 1-1,5 h) in 50 %, 70 % und 80 % Ethanolvergällt

Alle weiteren Schritte finden in einer automatischen Citadelle statt

Lösung Einwirkdauer Temperatur

80 % Ethanol 1 h Raumtemperatur (RT) RT RT RT RT RT RT

60°C 60°C

96 % Ethanol 1 h 96 % Ethanol 1 h 100 % Isopropanol 1 h 100 % Isopropanol 2 h Xylol 1 h Xylol 2,2 h Paraffin 3 h Paraffin 2 h

Nach Durchlaufen der Citadelle Proben aus der Einbettkassette entnehmen und in Paraffin

einbetten

Entparaffinieren und rehydrieren

Schnitte entparaffinieren 3 x 5 min Xylol

Schnitte in absteigender EtOHvergällt Reihe (100,100,96,90,70,50, VE H2O, je 2 min) rehydrieren

Hämatoxylin-Eosin Färbung

Rehydrierte Schnitte 5-10 min Färben mit Hämalaunlösung sauer nach Mayer

Kurz mit Aqua dest. spülen

15 min in fließendem Leitungswasser bläuen

2 min mit Aqua dest. spülen

1-5 min inkubieren in Eosin G-Lösung (Zugabe von 1 Tropfen Eisessig pro 100 ml Lösung)

Kurz mit Aqua dest. abspülen

Entwässern über aufsteigende Alkoholreihe

Zwischenschritt mit Intermedium (Xylol)

Eindecken mit Eukitt®

Kombinierte Hämatoxylin-Alcianblau Färbung

Rehydrierte Schnitte 3 min 3 % Essigsäure

30 min Alcianblaulösung (10 g/l Alcianblau 8 GX, Firma Carl Roth in 3 % Essigsäure gelöst)

3 min 3 % Essigsäure


5 min Färben mit Hämalaunlösung sauer nach Mayer


Verzeichnisse

Seite XVIII

10 min in fließendem Leitungswasser bläuen

Entwässern über aufsteigende Alkoholreihe

Zwischenschritt mit Intermedium (Xylol)

Eindecken mit Eukitt®

Immunohistologische Kollagen Typ I Färbung

Rehydrierte Schnitte spülen TBST Puffer

Mit Dako Penn (Silikonstift) umranden (verhindert Verlaufen der Lösungen)

Epitopdemaskierung: Proteinase K Verdau 5 min RT (ready to use, Dako)

Spülen TBST Puffer

Peroxidaseblock (Dual Endogenous Emzyme Block - Dako)

Spülen TBST

Schweine Serum Block (1 ml Schweineserum (Dako) in 4 ml 0,05 M Tris HCl) 30 min in

Feuchtkammer, abklopfen nicht spülen!; während dieser Zeit die Antikörper Verdünnungen

vorbereiten

Primärantikörper (Abcam®, ab34710 rabbit polyclonal; 1:100 in Ab diluent von Dako)/Isotype

(Dako negative control rabbit immunglobulin fraction; 1:1500 in Ab diluent) 30 min

Inkubation in Feuchtkammer

Spülen TBST

Sekundärantikörper: Biotinylated Link (Dako) 20 min in Feuchtkammer

Spülen TBST

Streptavidin Horse radish peroxidase

Substrat-Chromogen-Lösung (DAB: 4 min, AEC: 10 min)

Spülen VE H2O

Hämatoxylin (3 min)

Spülen VE H2O

Bläuen in fließendem Leitungswasser (10 min)

Mit Aquatex eindeckeln

Immunohistologische Kollagen Typ II Färbung



Epitopdemaskierung: 1 % Hyaluronidase (Sigma Aldrich) 15 min bei 37 °C; spülen mit TBST

Puffer; 0,2 % Pronase (Millipore, aus Streptomyces griseus) 15 min bei RT

Peroxidaseblock (Dual Endogenous Emzyme Block, Dako)

Spülen TBST



vorbereiten

Primärantikörper (Developmental Studies Hybridoma Bank, II-II6B3, mouse monoclonal;

1:4000 Verdünnung in 1 %BSA in 0,05 M Tris-HCl); Isotype (Dako negative control mouse

IgG1; 1:1000 Verdünnung in 1 %BSA in 0,05 M Tris-HCl) 2 h Inkubation in Feuchtkammer

Spülen TBST

Verzeichnisse

Seite XIX

Sekundärantikörper: Biotinylated Link (Dako) 20 min

Spülen TBST

Streptavidin Hrp


Spülen mit VE H2O


Spülen mit VE H2O



Immunohistologische Aggrecan Färbung



Epitopdemaskierung: Chondroitinase ABC (Sigma Aldrich) 30 min bei RT in Feutkammer

Peroxidaseblock (Dual Endogenous Emzyme Block, Dako)

Spülen TBST



vorbereiten

Primärantikörper (Millipore™, anti-aggrecan AB1031, rabbit polyclonal; 1:100 Verdünnung in

Ab diluent von Dako); Isotype (Santa Cruz Biotechnology, normal rabbit IgG; 1:100

Verdünnung in Ab diluent von Dako) 30 min Inkubation in Feuchtkammer

Spülen TBST

Sekundärantikörper: Biotinylated Link (Dako) 20 min

Spülen TBST

Streptavidin Hrp


Spülen mit VE H2O


Spülen mit VE H2O



DNA Isolierung nach Hersetllervorgabe (QIAGEN: DNeasy® Bloo & Tissue Kit)

Gewebeproben (≤ 25 mg) zerkleinern und in 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäße überführen

180 µl ATL Puffer und 20 µl Proteinase K Lösung zugeben

Vortexen und bei 56°C über Nacht inkubieren

Nach Inkubation vortexen, 200 µl AL Puffer zugeben, vortexen und 10 min bei 56 °C

inkubieren

200 µl EtOH (96-100 %) zugeben, vortexen

Proben in DNeasy mini spin column überführen, in 2 ml Sammeltube geben und 1 min bei

8.000 rpm zentrifugieren

Sammeltube erneuern und 500 µl AW1 Puffer zugeben, 1 min bei 8.000 rpm zentrifugieren

Verzeichnisse

Seite XX

Sammeltube erneuern und 500 µl AW2 Puffer zugeben, 3 min bei 13.000 rpm zentrifugieren,

Sammeltube und Eluat verwerfen

Spin column in ein neues Sammeltube überführen

DNA eluieren: Zugabe von 200 µl AE Puffer, 1 min bei RT inkubieren und 1 min bei 8.000 rpm

zentrifugieren

Für eine höhere Ausbeute kann der letzte Schritt wiederholt werden

Quantifizierung mittels Tecan Nanoquant Platte, Absorptionsmessung bei 260/280 nm

Gewebeverdünnungen ELISA

Verdünnung 0 1:1 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256

Gewebe- konzentration [mg∙ml-1]

200 100 50 25 12,5 6,25 3,125 1,5625 0,78125

Zellzahl L929 [∙106]

2 1 0,5 0,25 0,125 0,625 0,3125 0,15625 0,078125

Verzeichnisse

Seite XXI

Kalibriergeraden

Hoechst Assay

DNA Konzentration Stocklösung [µgDNA∙mlPuffer-1]: 1 µg∙ml-1

Verdünnungsstufen Kalibration:

Verdünnung 0 1:1 1:4 1:8 1:16 1:24 1

DNA Gehalt [µg∙ml-1]

1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,03125 0

1,7E+04

9,0E+03

5,3E+03

2,3E+03 1,7E+03

1,6E+03

y = 17187x R² = 0,9854

0,0E+00

2,0E+03

4,0E+03

6,0E+03

8,0E+03

1,0E+04

1,2E+04

1,4E+04

1,6E+04

1,8E+04

2,0E+04

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20

Emis

sio

n [

-]

DNA-Gehalt [µg]

Verzeichnisse

Seite XXII

DMMB-Assay

Chondroitinsulfat (CS) Konzentration Stocklösung [µgCS∙mlPuffer-1]: 150 µg∙ml-1


Verdünnung 0 1:0,75 1:1 1:3 1:6 1:15 1

CS Gehalt [µg∙ml-1]

150 100 75 50 25 10 0

0,6284

0,5296

0,4233

0,3043

0,2375

0,1471

y = 0,0035x + 0,1402 R² = 0,974

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

0 50 100 150 200

Ab

sorp

tio

n6

56

nm

[-]

µg CS / ml Puffer

Verzeichnisse

Seite XXIII

Hydroxyprolin-Assay

Hydroxyprolin (Hyp) Konzentration Stocklösung [µgHyp∙mlPuffer-1]: 10 µg∙ml-1


Verdünnung 0 1:0,75 1:1 1:3,33 1:5 1:10 1

Hyp Gehalt [µg∙ml-1]

10 7,5 5 3 2 1 0

0

0,12558

0,25466

0,3802

0,62682

0,9115

1,33836 y = 0,1303x - 0,0109

R² = 0,9959

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 2 4 6 8 10 12

Ab

s 5

60

nm

[-]

mHyp [µg]

Verzeichnisse

Seite XXIV

Übersichtsaufnahmen Histologie

Abbildung 47: Übersichtsaufnahme eines Hämatoxylin - Alcianblau gefärbten Paraffinschnitts

(Schnittdicke = 5 µm) eines besiedelten Scaffolds nach 56 d Kultivierung in NHChondroDiff Medium.

Abbildung 48: Übersichtsaufnahme eines Hämatoxylin-Alcianblau gefärbten Paraffinschnitts

(Schnittdicke = 5 µm) eines besiedelten Scaffolds nach 70 d Kultivierung in NHChondroDiff Medium.

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Dissertation Herstellung und Untersuchung eines kollagenen ...¶rberDissertation.pdf · Dissertation Herstellung und Untersuchung eines kollagenen Knorpelersatzmaterials aus porcinen