Doping mit Hormonen

Wilhelm SchänzerInstitut für BiochemieDeutsche Sporthochschule Köln

Berlin 4. November 2005

Doping mit Hormonen Dopingdefinition der WADA

Artikel 1 Definition von Doping

Doping ist definiert als ein Verstoß gegen die Anti-Doping-Regeln wie sie in Artikel 2.1 bis 2.8 ausgewiesen sind.

Artikel 2 Verstöße gegen die Anti-Doping-Regeln

2.1 Die Anwesenheit einer verbotenen Substanz, deren Metaboliten oder eines Markers in einer dem Athleten entnommenen Probe

2.2 Die Anwendung bzw. der Versuch der Anwendung einer verbotenen Substanz oder einer verbotenen Methode

Zuständigkeit für den weltweiten Anti-Doping-Kampf

bis 31.12.2003 IOC Internationales Olympisches Komitee ab 1.1.2004 WADA Welt Anti-Doping Agentur

2.3 Verweigerung der Abgabe einer Probe nach Aufforderung zur Dopingkontrolle

2.4 Abwesenheit bei Kontrollen außerhalb des Wettkampfes einschließlich Verstöße gegen der Aufenthaltsmeldepflicht

2.5 Betrug oder der Versuch eines Betruges bei der Dopingkontrolle

2.6 Besitz von verbotenen Substanzen oder verbotenen Methoden

2.7 Weitergabe jeglicher verbotenen Substanz oder verbotenen Methode

2.8 Anstiftung, Mitbeteiligung, Unterstützung oder Ermutigung zur Anwendung oder zum Versuch einer Anwendung einer verbotenen Substanz oder verbotenen Methode

Doping mit Hormonen Dopingdefinition der WADA

Doping mit Hormonen Dopingliste der WADA

Verbotene Substanzen und MethodenVerbotene Substanzen und Methodenwährendwährend des Wettkampfes des Wettkampfes

S1 Anabole WirkstoffeS1 Anabole Wirkstoffe Anabol androgene Steroide Andere anabole Wirkstoffe

S2 PeptidhormoneS2 Peptidhormone S3 ß2-Agonisten S4 Substanzen mit anti-estrogener Wirkung S5 Diuretika u.a. maskierende Substanzen

S6 StimulanzienS6 StimulanzienS7 NarkotikaS8 CannabinoideS9 Glucocorticosteroide

M1 Verbesserung des Sauerstofftransports M1 Verbesserung des Sauerstofftransports Blutdoping künstliche Sauerstoffträger

M2 Manipulationen M3 Gendoping

Verbotene Substanzen in bestimmten SportartenVerbotene Substanzen in bestimmten SportartenAlkohol, Beta-Blocker

Doping mit Hormonen Dopingliste der WADA

Verbotene Substanzen und MethodenVerbotene Substanzen und Methodenaußerhalbaußerhalb des Wettkampfes des Wettkampfes

S1 Anabole WirkstoffeS1 Anabole Wirkstoffe Anabol androgene Steroide Andere anabole Wirkstoffe

S2 PeptidhormoneS2 Peptidhormone S3 ß2-Agonisten S4 Substanzen mit anti-estrogener Wirkung S5 Diuretika u.a. maskierende Substanzen

S6 StimulanzienS6 StimulanzienS7 NarkotikaS8 CannabinoideS9 Glucocorticosteroide

M1 Verbesserung des Sauerstofftransports M1 Verbesserung des Sauerstofftransports Blutdoping künstliche Sauerstoffträger

M2 Manipulationen M3 Gendoping

Doping mit Hormonen Dopingliste der WADA

Verbotene Substanzen und MethodenVerbotene Substanzen und Methoden währendwährend und außerhalb und außerhalb des Wettkampfesdes Wettkampfes

S1 Anabolic Agents S1 Anabolic Agents Anabolic androgenic Steroide (AAS)

a. Exogenous * AAS, including:bolasterone; boldenone; boldione; calusterone; clostebol; danazol;dehydrochloromethyl-testosterone; delta1-androstene-3,17-dione;delta1-androstenediol; delta1-dihydro-testosterone;desoxymethyltestosterone; drostanolone; ethylestrenol;fluoxymesterone; formebolone; furazabol; gestrinone;4-hydroxytestosterone; 4-hydroxy-19-nortestosterone; mestanolone;mesterolone; metenolone; methandienone; methandriol;methyldienolone; methyl-1-testosterone; methylnortestosterone;methyltrienolone; methyltestosterone; mibolerone; nandrolone; 19-norandrostenediol; 19-norandrostenedione; norbolethone; norclostebol;norethandrolone; oxabolone; oxandrolone; oxymesterone; oxymetholone;quinbolone; stanozolol; stenbolone; tetrahydrogestrinone; trenbolone andother substances with a similar chemical structure or similar biological effect(s).b. Endogenous ** AAS:androstenediol (androst-5-ene-3β,17β-diol); androstenedione (androst-4-ene-3,17-dione); dehydroepiandrosterone (DHEA); dihydrotestosterone;testosterone.

Doping mit Hormonen Dopingliste der WADA

Verbotene Substanzen und MethodenVerbotene Substanzen und Methoden währendwährend und außerhalb und außerhalb des Wettkampfesdes Wettkampfes

S2 Hormones and Related SubstancesS2 Hormones and Related Substances

The following substances, including other substances with a similar chemical structure or similar biological effect(s), and their releasing factors, are prohibited:

1. Erythropoietin (EPO)2. Growth Hormone (hGH), Insulin-like Growth Factors (e.g. IGF-l),

Mechano Growth Factors (MGFs)3. Gonadotrophins (LH, hCG), (prohibited in males only)4. Insulin5. Corticotrophins

Unless the Athlete can demonstrate that the concentration was due to aphysiological or pathological condition, a sample will be deemed to contain aProhibited Substance (as listed above) where the concentration of the ProhibitedSubstance or its metabolites and/or relevant ratios or markers in the Athlete’sSample so exceeds the range of values normally found in humans that it isunlikely to be consistent with normal endogenous production.

Doping mit Hormonen TUE - Therapeutic Use Exemptions

Therapeutische Ausnahmeregelung (TUE)Therapeutische Ausnahmeregelung (TUE)

Abbreviated TUE- Only for glucocorticosteroids by non-systemic routes (local routes of administration) and for - beta-2 agonists (formoterol, salbutamol, salmeterol and

terbutaline) by inhalationStandard TUE- For any treatment involving a substance or method on the Prohibited List that is not admissible for an abbreviated TUE.

The criteria are:¨    The athlete would experience significant health problems without taking the

prohibited substance or method,¨    The therapeutic use of the substance would not produce significant

enhancement of performance, and¨    There is no reasonable therapeutic alternative to the use of the otherwise

prohibited substance or method.

z.B. für Insulin – keine TUE für Testosteron

Weltweite DopingkontrollenIOC/WADA akkreditierte Laboratorien

Weltweite DopingkontrollenIOC/WADA akkreditierte Laboratorien

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000 Training

Wettkampf

Weltweite DopingkontrollenIOC/WADA akkreditierte Laboratorien

Weltweite DopingkontrollenIOC/WADA akkreditierte Laboratorien

Positive A-Proben

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

160,0

180,0

Po

sitv

e p

ro 1

0.00

0 K

on

tro

llen

1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004

A. StimulantienB. NarkotikaC. Anabole WirkstoffeD. DiuretikaE. PeptidhormoneF. Masking AgentsG. Beta Blocker

2004 Statistik WADA

0

200

400

600

800

1000

1200weltweit 2004

169.187 Kontrollen

2.909 Adverse Analytical Finding

Doping mit Hormonen

TUE ?

TUE ?

2004 Statistik IOC/WADA Anabole Androgene Steroide

IOC Statistik1998-2000Report der positiven A-ProbenWADA Statistik2004

1998-2000 Ergebnisse 2004Total: 2772 % 1191 %Testosteron 952 34 392 33Nandrolon 877 32 339 28Stanozolol 348 13 226 19Methandienon 213 7,7 63 5,3Metenolon 141 5,1 22 1,8Mesterolon 62 2,2 18 1,5Methyltestosteron 59 2,1 32 2,7Boldenon 48 1,7 19 1,6DHEA 14 0,5 22 1,8Fluoxymesteron 12 0,4 0 0Oxymetholon 11 0,4 4 0,3Clostebol 9 0,3 10 0,84-Androstenedion 8 0,3 3 0,3Methandriol 4 0,1 1 0,1Oxandrolon 3 0,1 3 0,3

Testosteron Prohormone 3 0,1 17 1,4Oxymesteron 2 0,1 0 0Danazol 3 0,1 0 0Norandrostenedion 1 0,04 0 0Formebolon 1 0,04 0 0Dihydrotestosteron 1 0,04 0 0Drostanolon 1 0,04 5 0,4Trenbolon 1 0,04 1 0,1Norethandrolon 1 0,04 0 0delta-1-Androstendion 0 0 9 0,8delta-1-Testoteron 0 0 4 0,3Boldion 0 0 3 0,3

Doping mit Hormonen

Peptidhormone

Positive Befunde – IOC/WADA Statistik

Jahr Kontrollen HCG EPO/NESP HGH

1992 84.088 1 0 01993 89.166 4 0 01994 93.680 3 0 01995 93.938 9 0 01996 96.454 4 0 01997 106.561 5 0 01998 105.250 12 0 01999 118.259 20 0 02000 117.314 12 0 02001 125.701 16 9 02002 131.373 19 12 02003 151.210 14 51 / 7 02004 169.187 24 38 0

Doping mit Hormonen 2004 Statistik IOC/WADA Peptidhormone

Untersuchungsmaterial

Substanzgruppe bzw. Methode Untersuchungsmaterial

S1 Anabol Androgene Steroide Urin

S2 Peptidhormone Urin (EPO, HCG)

Blut (HGH, Insulin)

S3 ß2-Agonisten Urin

S4 Substanzen mit anti-estrogener Wirkung

Urin

S5 Diuretika u.a. Maskierende Substanzen

Urin

S6 Stimulanzien Urin

S7 Narkotika Urin

S8 Cannabinoide Urin

S9 Glucocorticosteroide Urin

M1 Verbesserung des Sauerstofftransports Blut / Urin

M2 Manipulationen Urin

M3 Gendoping ?

Verbotene Substanzen in bestimmten Sportarten

Alkohol Blut

Beta-Blocker Urin

Doping mit Hormonen

Synthetische Steroide – NachweisMetandienon - Metabolismus

Doping mit Hormonen

10

9

8

7

6

54

32

1

CH3

CH3

HHO

CH3

OH

HHO

OH

CH3

HHO

CH3

CH3

CH3

O

OH

OH

CH3

HHO

OH

O

CH3

H

O

O

CH3

R

OH

O

CH3

OH

OH

O

CH3

Synthetische Steroide – NachweisMetandienon - Analyse

Doping mit Hormonen

Massenspektrum nach GC/MS-Analyse

GC Gaschromatograhie - MS Massenspektrometrie

100 200 300 400

20

40

60

80

100

73

91105130

143

159 196

216

268 301 343

358

419448

m/z-->

Molekülion448

H

CH3

O143

O Si(CH3)3

( SiCH3)3

Masse [m/e]

Intensität

IOC-Regel: Testosteron VerbotT/E >6

KonzentrationcT / cEpi = ca. 1

O

H

OH

H

OH

Epitestosteron

OH

H

O

H

OH

Testosteron

Konzentration

Testosteron

O

H

OH

Epitestosteron

O

H

OH

Testosteron

cT / cEpi > 4

Positiv ?Positiv ?

IOC-Regel: Testosteron Verbot

Testosteron-Nachweis

01.02.03.04.05.06.0

0 5 10 15 20

Tag

T/E-Quotient

Positiver Befund aufgrund individueller Referenzwerte

Doping mit Hormonen

13C/12C-Isotopenverhältnisse in der Natur

-80 -60 -40 -20 0

Natural gas

Petroleum

Coal

Animals

C3-Plants

C4-Plants

Land-air-carbon

Sea-air-carbon

Sea carbon

Referenzgas CO2

Isotopenverhältnis-MassenspektrometrieDoping mit Hormonen

Isotopenverhältnis-MassenspektrometrieDoping mit Hormonen

13C/12C-Isotopenverhältnisse

[ ]

Synthetische anabol androgene Steroidhormonewie Testosteron und Nandrolon sowie derenVorhormone

-27 bis -32

Urinär ausgeschiedene Steroidhormonmetaboliten„Europäer“

„Amerikaner“(Ernährung auf Maisbasis)

[ ]-22 bis -25

[ ]-18 bis -22

Isotopenverhältnis-MassenspektrometrieDoping mit Hormonen

13C/12C-Bestimmung von Testosteronnach oraler Gabe von 40 mg AndriolR

23.724.3

28.6 28.8

-22

-24

-26

-28

-30

Pers.A

Pers.B

Pers.C TestosteronSTD

29.5

23.6

Pers.CT/E 18.0 T/E 8.0

nach Testosteron Anwendung

Pers.C 0h

[ ]Abweichung in

Isotopenverhältnis-MassenspektrometrieDoping mit Hormonen

Cholesterol

Pregnenolon Progesteron Pregnandiol

pregnenolon progesteronPregnantriol17-Hydroxy- 17-Hydroxy-

DHEA

Androsteron

Etiocholanolon

5 -Androstandiol

5ß-Androstandiol

Metaboliten Steroid-Synthese

Androstendion

Testosteron

(Leber)

-32

-31

-30

-29

-28

-27

-26

-25

-24

-23

-22

-21

-20

-19

-18

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Difference ERC - Androsteron

AN

DR

OS

TE

RO

N

Doping mit Hormonen Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie

Referenzgruppe

Kontrollproben

Differenz Endogenes Referenz-Steroid minus Androsteron

An

dro

ster

on

O

O

C

ONandrolondecanoat

C 28 H 44 O 3

Fettsäurerest(C-10 = Decansäure)

OH

O

O

HOH

Norandrosteron

Metabolismus

O

OH

Glucuronsä ure

Metabolismus

Hydrolyse im Körper

OH

HO

O

O

ProhormonNorandrostendiol

ProhormonNorandrostendion

Norsteroide und KörperpassageDoping mit Hormonen

Nandrolon

O

O

C

ONandrolondecanoat

C 28 H 44 O 3

Fettsäurerest(C-10 = Decansäure)

OH

O

O

HOH

Norandrosteron

Metabolismus

O

OH

Glucuronsä ure

Metabolismus

Hydrolyse im Körper

OH

HO

O

O

ProhormonNorandrostendiol

ProhormonNorandrostendion

Norsteroide und KörperpassageDoping mit Hormonen

Nandrolon

Norsteroide und KörperpassageDoping mit Hormonen

Sind Prohormone wirksam ?

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

time [hr]

con

c. [

ng

/ml]

Plasma concentrations of unconjugated nandrolone after administration of a 100 mg ND capsule (n=8)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8

time [hr]

con

c. [

ng

/ml]

Plasma concentrations of unconjugated nandroloneafter administration of a 25 mg ND lozenge (n=8).

Norandrostendion

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

time [hr]

con

c. [

ng

/ml]

0

1

2

3

4

5

6

0 1 2 3 4 5 6 7 8time [h]

con

c [n

g/m

l]

Plasma concentrations of unconjugated nandrolone after administration of a 100 mg NDdiol capsule (n=8))

Plasma concentrations of unconjugated nandroloneafter administration of a 25 mg NDiol sublingual tablets (n=8).

Norandrostendiol

Lit: Conversion of 4-Norandrostenedione, 4-Norandrostenediol and 5-Norandrostenediol to Nandrolone in Human Subject.Schrader, Y., Schänzer, W. Recent advances in doping analysis (12). Sport und Buch Strauß, Köln (2004), 2005 in press

Norandrosteron – Bestimmung Quantitative Bestimmung da Grenzwert 2 ng/ml Urin

Störfaktoren

- physiologische Werte: NA < 2 ng/ml

- Schwangerschaft: NA > 2 ng/ml

- Norethisteron: NA > 2 ng/ml

- 19-Demethylierung von Androsteron NA > 2 ng/ml

- kontaminierte Nahrungs- ergänzungsmittel NA > 2 ng/ml

Norsteroide und KörperpassageDoping mit Hormonen

Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie

IRMS Norandrosterone

-2,0

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 20,0

Norandrosterone [ng/ml] corr.

del

ta v

alu

e (A

nd

r - N

A)

Doping mit Hormonen

Doping mit Hormonen

mit 19-Norsteroiden kontaminierte Nahrungsergänzungsmittel

Kontaminiertes Creatinprodukt in Deutschland

Deklarierter Inhalt : Creatin + Dextrose

Nicht deklarierte Prohormone: 4-Norandrostendion 4,4 µg/Tablette 4-Norandrostendiol 10,9 µg/Tablette

2 Stunden nach Anwendung von 2 Tabletten: im Urin Norandrosteron: 19,8 ng/ml

Nahrungsergänzungsmittel - Doping

Doping mit Hormonen

Positive nutritional supplements in relation to the total number of supplements purchased in different countries

country no. of productsno. of

positivespercentage of positives

Netherlands 31 8 25.8 %

Austria 22 5 22.7 %

UK 37 7 18.9 %

USA 240 45 18.8 %

Italy 35 5 14.3 %

Spain 29 4 13.8 %

Germany 129 15 11.6 %

Belgium 30 2 6.7 %

France 30 2 6.7 %

Norway 30 1 3.3 %

Switzerland 13 - -

Sweden 6 - -

Hungary 2 - -

Geyer, H., Parr, M.K., Mareck, U., Reinhart, U., Schrader, Y., Schänzer, W.: Analysis of non-hormonal nutritional supplements for anabolic-androgenic steroids - Results of an international study. Int J Sports Med, 25, (2004) 124-129

Nahrungsergänzungsmittel - Doping

1

10

100

1000

10000

100000

0 50 100 150 200 250

Norandrosterone ng/ml

Time [h] after administration

2000 4000

2 ng/ml Norandrosterone

Norandrosteron-AusscheidungDoping mit Hormonen

Positiver Urintest mit Norandrosteron 10 ng/ml

Nandrolonester Depotform

Prohormon19-Norsteroid

Kontaminiertes Product

Ausscheidungskinetik von NA - verschiedende Applikationsformen

Designer-SteroideDoping mit Hormonen

Tetrahydrogetrinon (THG)

O

H5C2OH

C CHH

H2/Palladium

O

H5C2OH

CH2H

CH3

Gestrinon Tetrahydrogestrinon

Designer-SteroideDoping mit Hormonen

Strategien, um neue Designer-Steroide zu erkennen

- Infos aus Athletenkreisen usw.

- Steroidprofiling (Massenspektrometrie)

- Monitoring des Schwarzmarktes (Literatur, Internet, Chats)

- Übersichtsanalysen mittels Massenspektrometrie

- Screening auf MS-Fragmente typisch für AAS

- Synthese möglicher modifizierter AAS

- Bio-Assays für Androgenaktivität

PeptidhormoneDoping mit Hormonen

Nachweismethoden

- EPO (Erythropoietin)

Methode F.Lasne (Paris)

- HGH (Wachstumshormon)

Methode C. Straburger (Berlin)

Olympische Spiele Athen 2004

WM Ski Oberstdorf 2005

Neuproduktion von Antikörpern (WADA)

- Insulin (synthetische) WADA research project Cologne

- LH (rekombinant) WADA research project Sydney

Wirkung von EPO (ErythropoietinWirkung von EPO (Erythropoietin))

O -Überschuß 2

O -Mangel 2

Niere

+- Epo

Knochenmark

Bildung vonErythrozyten

Blut

Erythropoietin O 2

Ekblom and Berglund(J.Intern.Med. 229, 1991, p125)maximal exercise

Work time, sec 500 to 583VO2max , l/min 4,52 to 4,88

Erythropoietin - EPODoping mit Hormonen

Fuc FucoseGlcNAc AcetylglucosaminMan MannoseGal GalactoseSal Sialinsäure

Arg-N GlcNAc GlcNAc

Eiweißkette

ManMan

Man

GlcNAc

GlcNAc

GlcNAc

Gal

Gal

Gal

Sal

Sal

GlcNAc Gal Sal

GlcNAc Gal GlcNAc Gal SalProt.

Kohlenhydratkette

Fuc

Repeats

EPO (Erythropoietin): Peptidhormon (Glykoprotein), 165 Aminosäuren, 4 Zuckerketten, Zuckeranteil ca. 40% Molekulargewicht ca. 34.000

SialinsäureN-Acetylneuraminsäure

R =

O

H

OH

N

H

C

O

H3C OH

H

H

H

H

COOH

R

CH OH

CH OH

CH2OH

EPO – Beispiel einer ZuckerketteDoping mit Hormonen

Erythropoietin - Urintest

IEF PATTERN

5.21

4.42

3.77

pH

EPO UrintestLasne F, de Ceaurriz J

BB 100% 34% 28% 95%5.21

4.42

3.77

pH

Doping mit Hormonen

Erythropoietin - Urintest

Darbepoetin (NESP)

5.21

4.42

3.77

pH

Olympische Winterspiele 2002 Salt Lake City

3 Athleten werden der Anwendung eines neuenEPO-Präparates - Darbepoetin (NESP) überführt

Produktinformation derFirma Ambgen zu Darbepoetin (Aranesp®)www.ambgen.com

Doping mit Hormonen

Erythropoietin - Urintest

Darbepoetin (NESP)

5.21

4.42

3.77

pH

EPO UrintestLasne F, de Ceaurriz J

5.21

4.42

3.77

pH

Doping mit Hormonen

Doping mit Hormonen Erythropoietin - Gendoping

Genetic Doping with erythropoietin cDNA in primatemuscle is detectableFrancoise Lasne, Laurent Martin, Jacques de Ceaurriz,Thibaut Larcher, Philippe Moullier, and Pierre ChenuaudMOLECULAR THERAPY Vol. 10, No. 3, September 2004

a) rhEPO from CHO cells (1)and BHK cells (2)

b) physiological EPO fromhuman urine (3)macaque serum (4, 5)

c) EPO from macaque serum after gene transfer (6, 7)

5 6

Doping mit Hormonen

mögliche “zukünftige“ Problemfelder

- neue EPO-Varianten (z.B. CERA, Dynepo)

- SARMs (selektive Androgenrezeptormodulatoren)

- Gendoping

Dopinganalytik Neuentwicklungen

Plasmaexpander - Dextran

Synthetische Insuline - LC-MS-MS

Fremdbluttransfusion

Status - Wachstumshormon

Neue EPO-PräparateDynepoCERA

Gendoping

Dopinganalytik Neuentwicklungen