11
ztl-ung Auffklligkeiten - neuer und ungewohnlicher Habitus der [a]-Kurven, h d e - rung des optischen Auswahlens nach Vorbehandlung der Enzympraparate, Wider- spruch in bezug auf die Unabhangigkeit der Konfiguratiomspezit von der Katalysatormenge -, die sich bei der Einwirkung der Lipaee des Samem von Chelidonium majus auf rac. Mandelsiiuremethylester ergeben, lessen sich zu- niichst mit den bieher erarbeiteten, der Konfigurationsspezifiitjit der esterspalten- den Enzyme zngrundeliegenden Gesetzlichkeiten nicht vereinbaren. Durch eine reaktionskinetische Behandlung wird der starke EinfluS sichtbar, den das Spaltungsprodukt Mandelsiiure auf den Reaktionsablauf nimmt. Die Viel- falt der Moglichkeiten, in welcher sich die stereochemische Spezifitiit darbieten kann, erfahrt erneut eine Erweiterung. Dem Verband der Chemiechen Induetrie - Fonds der Chemischen Industrie -- sprechen wir fiir die Forderung unserer Untersuchung wren aufrichtigen Dank am. .- Anschrlft: Prof. Dr. E. Bamann, bliiochen 15, Pettenkoferotr. 148, Jnatltut fik Phsrmazie md Le- bensmlttelchemle der Unlvernltlit Idtinclicn. 1795. E. Niirnberg Diinnschichtchromatographische Untersuchungen einiger pharmazeutisch verwendeter organischer Stickstoff- verbindungen Aus dem Pharmazeutischen Entwick~ungalabor8toritorium der E. Merck AG, Darmatadt Leitar: Direktor Dr. W. Ikum (Pingegangen am 12. Man 1969) Von den zahlreichen in der Analytik gebrauchlichen chromatographischen Me- thoden eignet sich das von E. entwickelte Verfahren auf der Basis rein anorganischer diinner - auf Glaaplatten aufgetragener - Schichten vorteil- haft fir die Untersuchung von Arzneimitteln. Verschiedene Autoren4) waren, von der klassischen Siiulenchromatographie ausgehend, iiber mit Aluminiumoxyd oder Kieselsaure impragnierte Papiere zur ,,offenen Saule" gelangt, d. h. zu diinnen aus anorganischen Adsorptionsmitteln und Starkekleister bestehenden Schichten. Es ist das Verdienst von E. Stahl, die verfahrenstechnischen Voraussetzungen fur diese praktische und empfindliche Methode geschaffen zu haben. Heute kijnnen diinnschichtchromatographische Analysen gut reproduzierbar unter bedingnngen durchgefiii werden. Ytandard- - 1) P. Stahl, Phsrmazie 11, 633 (1966). *) E. Stahl, Cheder-Zeitung 82, 333 (1968). 3) E. Stohl, Parfiimerie n. Kwmeti 9, 564 (1968). 4) Literatarzwarnmenatellung in den Arbeiten von E. Sk~hl'-~) enthmlten.

Dünnschichtchromatographische Untersuchungen einiger pharmazeutisch verwendeter organischer Stickstoffverbindungen

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Dünnschichtchromatographische Untersuchungen einiger pharmazeutisch verwendeter organischer Stickstoffverbindungen

ztl-ung

Auffklligkeiten - neuer und ungewohnlicher Habitus der [a]-Kurven, h d e - rung des optischen Auswahlens nach Vorbehandlung der Enzympraparate, Wider- spruch in bezug auf die Unabhangigkeit der Konfiguratiomspezit von der Katalysatormenge -, die sich bei der Einwirkung der Lipaee des Samem von Chelidonium majus auf rac. Mandelsiiuremethylester ergeben, lessen sich zu- niichst mit den bieher erarbeiteten, der Konfigurationsspezifiitjit der esterspalten- den Enzyme zngrundeliegenden Gesetzlichkeiten nicht vereinbaren.

Durch eine reaktionskinetische Behandlung wird der starke EinfluS sichtbar, den das Spaltungsprodukt Mandelsiiure auf den Reaktionsablauf nimmt. Die Viel- falt der Moglichkeiten, in welcher sich die stereochemische Spezifitiit darbieten kann, erfahrt erneut eine Erweiterung.

Dem Verband der Chemiechen Induetrie - Fonds der Chemischen Industrie -- sprechen wir fiir die Forderung unserer Untersuchung w r e n aufrichtigen Dank am. .-

Anschrlft: Prof. Dr. E. Bamann, bliiochen 15, Pettenkoferotr. 148, Jnatltut fik Phsrmazie m d Le- bensmlttelchemle der Unlvernltlit Idtinclicn.

1795. E. Niirnberg

Diinnschichtchromatographische Untersuchungen einiger pharmazeutisch verwendeter organischer Stickstoff-

verbindungen Aus dem Pharmazeutischen Entwick~ungalabor8toritorium der E. Merck AG, Darmatadt

Leitar: Direktor Dr. W. Ikum

(Pingegangen am 12. Man 1969)

Von den zahlreichen in der Analytik gebrauchlichen chromatographischen Me- thoden eignet sich das von E. entwickelte Verfahren auf der Basis rein anorganischer diinner - auf Glaaplatten aufgetragener - Schichten vorteil- haft f i r die Untersuchung von Arzneimitteln. Verschiedene Autoren4) waren, von der klassischen Siiulenchromatographie ausgehend, iiber mit Aluminiumoxyd oder Kieselsaure impragnierte Papiere zur ,,offenen Saule" gelangt, d. h. zu diinnen aus anorganischen Adsorptionsmitteln und Starkekleister bestehenden Schichten. Es ist das Verdienst von E. Stahl, die verfahrenstechnischen Voraussetzungen fur diese praktische und empfindliche Methode geschaffen zu haben. Heute kijnnen diinnschichtchromatographische Analysen gut reproduzierbar unter bedingnngen durchgefii i werden.

Ytandard-

- 1) P. Stahl, Phsrmazie 11, 633 (1966). *) E. Stahl, Cheder-Zeitung 82, 333 (1968). 3) E . Stohl, Parfiimerie n. Kwmeti 9, 564 (1968). 4 ) Literatarzwarnmenatellung in den Arbeiten von E . S k ~ h l ' - ~ ) enthmlten.

Page 2: Dünnschichtchromatographische Untersuchungen einiger pharmazeutisch verwendeter organischer Stickstoffverbindungen

Diinn+hhtdwmn&pmphi.de Un&rdungm 61 1 ZLn./M.Bd. lsds, Nr. 11

Bei verhiiltnimiil3ii geimgem apperstivem Aufwand*) W d c h t man mecha- nisch Glasplatten mit einer h h l i i m m u n g von 1 Teil Kieselgel Q ft!r DUnn- sehichtchrormrtographie nach SMl ,,Merck" * *) mit zwei Teilen Wamef. Ne~ll dem Trooknen - Lnfethaoknung der Platten iat bei den unten beeproohexien veHxdnnge- chromatographis&n Arbeitan amreichend I - haften gleichmWge &hiohten des anorganisoh A d s o r b von einer komtanten Stiirke ( e m %Op) mit geniigender PeStaght auf dem Qld. hf dieae Platten werden die IN unter suchenden Subtamen in Meageh vim aeCrw 1-50 7 (fiblieherwebe S l O y ) aufgetragen und . m h den Geaiahtqmktdn der Papiemhromatqmphie w&er behandelt. EB weden bei m fiir erete orieafierende Analpen 26xaOO mm goBe priiparierh alsssb.aifen verwendet; dind die Bedingungen, untm denen eine Auf- tmnnung und Anfhhmg der erhaltenen Flecke moglich ist, bekrmot, 8 0 werden Platten mit der Abmeeeung 2 0 0 ~ 200 mm eingeeetzt. Die erhaltenen Chromato- gramme werden photqpphiert. Nech dem Abwaachen der Kieeelgthhichten konnen die QlaapWtim beliebig oft wieder beutrichen werden. Im Rihmtn un8erer Untersuchungen iaa b h r in allen TBIlett dt Emelgel Q ,,Memlt" Crk, Maorbens eine befriedigende Trennung netih' dem duffinden geeigneter Bteigwasrgke ' iten erreicht worden.

Die augenfiilligsten Vorteile dee dibdi8cWchtchromatographhen Verfahrens nach Stahl, insbesondere gegentibcr der Papierchromatographie, sind : 1. Einfache Handh&ung der Platten und geringer raumlicher Aufwend bei Serien-

2. meine S u b k e n g e n . 3. Kurm Entwickhngdauer (normalerweise etwa 30-60 Minuten in einer Lauf-

richtung). 4. Relativ einfacG zusemmengesetzk Steigflkigkeiteeysteme ; Fortfall der Im-

priigniernng**Jl: 5. Keine Begrenzyg in der Wahl der Spriihreagenzien (ea konnen konzentrierte

MinemlsZiuren verwendet werden).

Die ersten adeorptiomcbrombgraphis&en Anwendungsbeispiele des Ver- fahrens wurden von R. Stcriht aufgeeeigt. Zuniiohst gelang die Charakteriaiernng atherischer ole ; &hermehungen iiber die Voratufen dea Chamazulena edhheen sich an. Ea wurde bereits eine verhilungachromatogaphiahe Auftrennung eines TropaskWdge&hes mit eeaigsiiuregesiittigtem Butanol erwahnt (ohne Men- tifitiernag der ftlnf abgebddeten Flmke), !asgahshnd der anderen Arbeiten waren Untemuchungen von pharmazeutischen Harzen, Balsamen, Wachsen, Teeren, Gllensiiure, Phenolen und eyklisehen Behleawamerutoffen.

analyeen. -

*) Die Q r a n d s m u n g zur Minnechi&tohmm&ographie der & h a DESAQA, OmbH., Heidelberg, enthAlt dtq erfarderliohen Hiltsmittel.

**) Kkdgel Q ist ein etandardisisrtes -parat; es enthelt KieseMure einer besthunten TeilohengMBe mwie Qip: E. Merok 80, Dermetrdt.

***) Die A n t t r e ~ q yon Mutterkornelkeloiden int ohne Formamidimp-g bequem. z. B. mit wassergeelrttigtem Bntanol und Benzol-Pyridin (6 + 4) zweidimenaional dnrchzn- filhren (unveriiffentliohte Wteilung).

Page 3: Dünnschichtchromatographische Untersuchungen einiger pharmazeutisch verwendeter organischer Stickstoffverbindungen

Es lag nahe, die AnwendungsmiZglichkeitsn fiir andere pharmazeutisch wichtige Stoffklassen, wie Amine, Aminosiiuren, Alkaloide, Glykoside, Steroide usw. im Hinblick auf die Verwendung in der Arzneimittelanalyse niiher zu studieren. Die analytische Trennung derartiger Stoffe war bisber ein wichtiges Gebiet der Papier- chromatographie. Der relativ grofie Zeitaufwand (Laufzeit 12-16, bis zu 40 Stun- den) der letzteren Methode und die Gefahr dadurch bedingter sekundarer Abbau- vorgiinge wiihrend der Analyse empfindlicher Substanzen standen vielfach der breiteren Anwendung im Rahmen von Serien-Kontrollbestimmungen entgegen. Eigene Untersuchungen lehrten, da13 mitunter bei fltissigen Arzneimitteln eine Iso- lierung des Wirkstoffes durch Ausschiittelung, oder die umsiiindliche und zeit- raubende Entionisierung von Eiweifihydrolysaten iiberfltissig ist. Schwierig- keiten bei der Auffindung geeigneter Spruhreagenzien zum Anfiirben unbekannter Substanzen konnen durch die Verwendung rein anorganischer Schichten praktisch nicht auftreten. In einem speziellen Fall hat sich die Impriigniemg der Platten mit dem zur Farbentwicklung notwendigen Reagenz als vorteilhaft erwiesen. Bei der Bereitung der Streichpaste wurde an Stelle von Wasser eine 20/,ige wiilrige Liisung von Ammoniummonovanadat p. a., NH4V03, ,,Mewkc', verwendet. Nach Entwicklung der Chromatogramme wurde mit Schwefelsiiure angespriiht, wobei das betr. Tetrazolderivat sichtbar wurde.

Im folgenden soll zunachst das Verhalten einiger organischer Stickstoffverbin- dungen unter den Bedingungen des dtinnschichtchromatogphischen Verfahrens beeprochen werden. Normalerweise fallen aminactige Verbindungen, die vielfach in Form ihrer Salze im Arzneimittel vorliegen, im Analysengang als Basen an. Werden die Basen nun auf saure Kieselgelschichten aufgetragen, so ist bei Ver- wendung der reinen organischen Solventien, wie z. B. Hexan, Tetrachlorkohlen- stoff, Benzol, Methylenchlorid, Chloroform mit 1% Alkohol oder aliphatischer Alkohole, eine Wanderung der Substanzen nicht oder in unb zu erreichen (Spezialfall der Austauschchromatographie). Dun: men kann man basisch reagierende Stoffe auf sauren Kieselgelschichten elnieren bzw. auftrennen: a) Zusatz von Alkalihydroxyd zur Streichmasse *). b) Zusatz eines Amins, z. B. Piperidin, Pyridin oder Ammoniak, zur Steig-

c) Zusatz einer Siiure (Ameisensiiure, Essigsiiure, Phosphorsiiure) zur Steigflussigkeit. d) Zusatz eines Puffersalzes zur Streichmasse oder von Pufferlosung zur Steig-

fliissigkeit.

flibsigkeit. Als Beispiele mogen folgende Substanzen angefiihrt sein :

1. Codein 2. ILVINB **)-Base - l-(2'-Pyridyl)-l-(p-bromphenyl)-3-dimethylamino-

propan.

*) Personliahe Mitteilung von Herrn Dozent Dr. E. &M. **) Hersteller: E. Merck AG, Darmstadt.

Page 4: Dünnschichtchromatographische Untersuchungen einiger pharmazeutisch verwendeter organischer Stickstoffverbindungen

tez./ei. Bd. 1‘93, Nr. 11 Ddnnachichtchromatoqraphiache Untersuchungen 613

3. K-Mcthylephedrin -1. DECENTAN@ **) - - ~ ~ l-(2-H~droxyiithyl)-4-[3-(~-chloro-lO-phenothi~zyl)-

propyl]-piperazin.

\Vie am Tabelle 1 zu erachen ist, vcrbleihcri dic: Bixsen bei Anwendung der u b lirhen unpolaren organischen Liiqungsmittel am Startpunkt. Obwohl mit Methanol rind A ~ ~ t h a n o l eine Wanderung erfolgt, kann die Trennung cines Substanzgemisches, u-ie z . R. Codein, N-Methj-lephedrin und ILVlYm * **) nicht erreichb werden. da die R-Ji-ertc sich nur unrvesentlicli voneinandcr unterscheiden.

0,3 0,26 0,4 0,6

In allen Fhllen 1ti-w!3rt 0

0,2 0 0,2 0,l 0 0,3 0,12 0 0,35 0,3 0 0,36

3 L

c d L

E ~

0,35 0,lb 0,3 0,l 0,42 0,3 0,39 0 s

0,s 0,15 0,7S 0,17 0,8 0,14 0,8 0,16

0,0 0,85 0,72 0,76

Setzt man einem Solvens, in dem die Basen nicht laufen, 8auren oder Basen {sekundares oder tertiares Amin) zu, so beachten wir eine Wandernng der auf- getragenen Substanzen in allen untorsuchten Fallen. Eine befridgende ver- tc.ilungschromatographe ;luftrennung von basischen Stoffgemischen iat auf dieRem Wege vielfach miiglich.

Die bei der Verteilungschromatographie auf Papier gebriiuohliobe Methode der Inipriignierung mit Salzen, Formamid, Paraffin mw. ist bei m h i & t p l a t t e n ii i c h t n o t w e ndi g , sie wire im ubrigen nur unter groDeren bhseiezigkeiten an- wndbar , da eine behiedigende Verteilung durch Beapruha fionderweise nicht erreicht Kerden kann. Es ist jedoch moglich, bei der Bereitnng der Eeselgelmasse basisch (oder sauer) reagierentfe Stoffe zuzusetzen und somit Schichten mit spezi- fischen Eigenschaften hcrzusttllen. 1)iesn 1fiiglichkr:it sttzt jedoch voraus, daf3 jeweils praparierte Platten niit verschieden zuaammnerigeset~zten Schichten - j(x nech Yerwendungszweck - vorratig gehalkn oder hergestellt u-erden m ~ e n . Au- prsktischen Erwagungen scheinon mir Zueiitze von baeischen Verbindungen (se- kundiire oder tertiare Smine, Ammoniak), Sauren oder Pufferwhliisungen zur Steigflikaigkeit besser geeignet zu sein. Es idt jedoch tiarauf zu trchten, daB in gewissen Fallen bei Venvendung murm Pufferliimngrn eine chemisch einheitliche,

***) Eine Kombination diosor Gtoffe Iiegt im Spezidpriiparat ILVICO@ - Saft (Merck) - der in auhreuropiiischen LLlndcrn mit einom Zusatz yon Codpin. phosphoric. irn 1hndt . l 1st - Tor.

__

.irchlv 292.,64. IJclt I1 . & I

Page 5: Dünnschichtchromatographische Untersuchungen einiger pharmazeutisch verwendeter organischer Stickstoffverbindungen

61 4 Nfhrabcra Archiv der PhUUUZk

baaiache Untersuchungssubstanz ein Stoffgemisch vortiiuschen kann, obwohl eine Zereetzung nicht stattgefunden hat. Dnrch einen Modellversuch mit Codein konnte nachgewiesen werden, daB ein Fleck der Base und der andere Fleck einem Sale (z. B. Hydrochlorid oder Phosphat) zuzuorden ist (vgl. Abb. 1). Nach kurzer Ein- wirkung der Pufferliisungen auf Codein wird rnit reinem Methanol entwickelt. Die

Codsin -base vsrsetzt mit:

Puffer 7.0

Puffer 2.0

Puffer 3.0

Puffer 4.0

Puffer 70

Codein-Base

Codeinphosphat

Abb. 1

stirker sauren Pufferlosungen ergeben die fur Salze charakteristischen Haupt- flecke (niedrige Rf-Werte); dariiber ist in Form von Vorlaufen die Anwesenheit der Base zu erkennen. Pufferlosungen pH 6, 7 nnd hoher zeigen nur noch die Flecke der Codeinbase.

Im Verlaufe der Untersuchungen organischer Stickstoffverbindungen hat sich die Anwendung von Pufferlosungen zum Steigmittelsystem gut bewahrt. Es ist auf diesem Wege moglicb, in den meisten Fallen eine gute Auftrennung von Stoff- gelnischen in reproduzierbarer Weise zu erreichen.

Page 6: Dünnschichtchromatographische Untersuchungen einiger pharmazeutisch verwendeter organischer Stickstoffverbindungen

616 ~%~./64.Bd. 1959, Nr. 11 UiinnsGhichtchromut~ap~aG.~ Untersuchungeit

Die Untersuchung eines Kombinationspraparates vom Typ ILVICO@ - Saft ,,Merck" sei als Beispiel erlautert. Es sind folgende Arzneistoffe pro 5 ml enthalten:

Codein. phosphoric. 10 mg ILVIN@ 3 *g N-Methylephedrin. hydrochloric. 7,5 mg CEBIONB (Ascorbinsaure) 50 mg Phenyldimethylpyrazolon. 150 mg Natr. salicylic. 150 mg

Probe?

Sfondurd 100 %

Probe 2

Standard 95 %

Probe 3

Standard 90 X

Probe 4

Standard 80%

Sbb. 2. Aus der Abbildung k6nnen quantitative Auwagen wegen der starken Ver- kleinerung nicht entnommen werden.

14-

Page 7: Dünnschichtchromatographische Untersuchungen einiger pharmazeutisch verwendeter organischer Stickstoffverbindungen

Archiv der NiLrnberg Pharmazie _ _ _ - -

616

Die Gehaltsbestimmungen von Ascorbinsaure, Phenyldimethylpyrazolon und Natriumsalicylat konnen am zweckmafiigsten auf maBanalytischem oder kolori- metrischem Wege ausgefuhrt werden. Codein, ILVIN@ und N-Methylephedrin- hydrochlorid werden naoh der Isolierung durch Atherausschiittelung aus natron- alkalischer Losung auf Diinnschichtplatten gebracht und mit einer Mischung von Methanol und Pufferlosung pH 4,62 (Standard-Acetatlosung ,,Merck") im Verhalt- n i s 3 + 7 entwickelt. Es hat sich in &esem Falle als giinstig erwiesen, die Steig- hohe von 10 cm auf etwa 14 cm auszudehnen, damit eine geniigende Trennung der Plecke erreicht werden kann. Die Anfarbung erfolgt durch abwechselndes Be- spruhen mit 0,5yoiger Jodlosung in Chloroform und mit dem von verschiedenen Autoren fur organische Schwefel- oder Stickstoffverbindungen empfohlenen Ka- liumjodid-Platinchlorid-chlorwasserstoff-ReagenzK). Mit Ausnahme von N-Methyl- ephedrin-hydrochlorid, dessen Farbung nach kurzer Zeit nachlaBt, sind die er- haltenen Flecke lange Zeit gut sichtbar. Etwa 10-20~0 Phenyldimethylpyrazolon fallen bei der 0. a. Ausschiittelung ebenfalls an und sind im Chromatogramm da- her sichtbar (vgl. Abb. 2).

Quantitative Aussagen sind durch die Vergleichsmethode moglich. Tragt man bekannte Mengen der reinen Standardsubstanzen auf und &fit sie neben den zu

I 3 - 1) Decenton 2~Derentonsuifbxyc 3.1 Belidrtete lts'sung

Decenton

Undefinierfes Zersetzungs pmduht

Decentonsulfoxv_d

Abb. 3

untersuchenden Priiparaten laufen, so ist nach dem Anspriihen durch Beurteilung der FleckengroBe und Intensitat der Farbung eine Abschatzung mit einer Toleranz von normalerweise f 5% moglich.

Es ist bei Verwendung des oben genannten puffersalzhaltigen Steigmittelsystems nicht erforderlich, die Vergleichssubstanzen in Form der reinen Basen aufzutragen.

Kontrolluntersuchungen von empfind- lichen Reinsubstanzen konnen schnell und bequem durchgefiihrt werden. Es ist be- obachtet worden, daB reine, waBrige (oder alkoholische) Losungen des Neurolepticums DECENTAN@ lichtempfindlich sind. Beim Aufbewahten von DECENTAN@-Losungen in farblosen GefaBen, beobachtet man neben einer signifikanten Veranderung des UV-Ab- sorptionsspektrums das Auftreten von diinn- schichtchromatographisch nachweisbaren

Abbauprodukten. Zur Bestimmung wird ein 207 DECENTAN@ enthaltendes Volu- mender Losung aufgetragen und anschlieBend mit n-Butanol-Eisessig-Wasser(4 : 1 : 1) entwickelt. Eine Steighohe von 14 cm ist in diesem Falle zu empfehlen; als Spriih-

1. R. Munier, Bull. Soo. chim. Frame 19, 852 (1952). 2. Vgl. auch Chromatographie E. Merck AB, Darmstadt, 2. Aufl.

Page 8: Dünnschichtchromatographische Untersuchungen einiger pharmazeutisch verwendeter organischer Stickstoffverbindungen

611 292./64. Bd. 1959, Nr. 11 Diinna&~bhromhgrap&che Untersuchungen

reagenz wird p-Dimethylaminobenzaldehyd-Schwefelsaure mit FeC13-Zusatz ver- wendet. Es konnte in einer DECENTAN@-Losung (100 mg Substanz in 100 ml Methanol), die eine Woche lang in einem farblosen Meflkolbchen am Penster ge- standen hatte, das Sulfoxyd des DECENTANS sowie ein weiteres Abbauprodukt nachgewiesen werden (vgl. Abb. 3).

AbschlieBend sei die Trennung von a-Aminosiiuren auf Glasplatten mit Kieselgel G ,,Merck" beschrieben. Der Nachweis von Gelatine oder Leberextrakt in pharma-

?

Abb. 4

5. cystin 6. Glutaminsiiure 7. Glykokoll 8. Histamin 1. Alanin 2. Arginin 3. Asparginsiiure 4. cyfjtein

9. Histidm 10. Isoleucin 11. Leuoin 12. Lysin 13. Methionin 14. Oxyproh 15. Phenylalanin 16. Prolin 17. Serin 18. Threonin 19. Tryptophan 20. T p ~ i n 21. Valin

zeutischen Praparaten kann nach vorausgegangener EiweiShydrolyse relativ schnell und spezifisch durchgefiihrt werden. Es ist moglich, nach der zweidimen- sionalen Methode unter Verwendung der bei analogen papierchromatographischen Analysen iiblichen Steigfliissigkeitssysteme wie Propanol-Wasser und Phenol- Wasser *) gute Trenneffekte zu erzielen.

In Abbildung Nr. 4 ist die Lage von 20 einzelnen Aminosauren und Histamin nach Entwicklung mit den 0. a. Steigflussigkeiten zusammengestellt6). Die

*) Propanol-Wasser 1 : 1; Phenol-Wasser 10 : 4. ") Ein Teil der Substanzen ist in reinster Form in der Kollektion -4minosauren ,,Jferck", Ver-

gleichssubstanzen fur Papierchromatographie, enthalten.

Page 9: Dünnschichtchromatographische Untersuchungen einiger pharmazeutisch verwendeter organischer Stickstoffverbindungen

618 NGrnberg Arcbiv der PhatmsZie

Laufstrecke betrug 12 cm in beiden Richtungen. Yon allen aufgefuhrten Sub- stamen wurden jeweih 5 y aufgetragen und nach zweifacher Wanderung mit Ninhydrin angespriiht. Werden die Aminosauren nicht einzeln aufgetragen, sondern liegt ein Gemisch - etwa in Form von hydrolysiertem EiweiB - vor, so kann man eine Identifizierung der erhaltenen Flecke durch Vergleich mit den Punkten der Standardsubstanzen (am Abb. Nr. 4) sowie mitunter auf Grund der Farbtonung der Flecke erreichen.

Abbildung Nr. 5 zeigt die Trennung eines durch saure Hydrolyse von Leber- extrakt *) erhaltenen Aminosauregemisches. Es wird eine 180 y Trockensubstanz

n-Propanol5 Wasser 5

I ‘ I

2 c Phenol 10

Wosser 4.

Abb. 5. Aminosiiuren aus Leberextrakt.

entsprechende Menge der hydrolysierten Losung aufgetragen. Eine E n t ionisie- rung wurde n ich t vorgenommen! Die resultierenden Flecke konnen folgen- den Substanzen zugeordnet werden: Alanin (l), Arginin (a), Asparaginsaure (3, violetter Fleck), Glutaminsaure (6), Glykokoll(7), Histamin (8), Histidin (9), Leucin (ll), Lysin (12), Methionin (13), Phenylalanin (15), Prolin (16, gelber Fleck), Valin (21).

Die in Klammern gesetzten Zahlen entxprechen den in Abhildung Nr. 4 auf- gefiihrten Stoffen.

*) Die Hydrolyse wurde mit 6 n-Salzsiiure p. a. in einem zugeschmolzenen Glawohrchen nach der Vorschrift von H . Zahn durchgefuhrt.

1. H . Zahn, Textilpraxis 1951, 127. 2. F. Crunaer, Papierchromatographie, 3. Aufl., Yerlag Chemie, M’einheim, 8. 34.

Page 10: Dünnschichtchromatographische Untersuchungen einiger pharmazeutisch verwendeter organischer Stickstoffverbindungen

619 a e Z . l 6 4 . B d . 1959, Nr. 11 . D ~ n ~ ~ ~ ~ ~ ~ h r c u m n t o g r ~ ~ h ~ g c h e Untersuchungen

Exprimenteller Teil*) 1. Bestimmung voncodein , I L V I N B unrl N-Methylephedriii in ILVICOS -

Eine 5 ml entsprechende Menge Saft wird genau gewogen, rnit wenig Wasser in eineii Scheidetrichter iiberfuhrt und rnit 20 ml 15yoiger Natronlauge versetzt. Es wird 4mal mit je 25 mi &her ausgeschiittelt, die vereinigten titherkchen Losungen mit 10 ml Wasser gewaschen, anschlieBend iiber friich gegliihtem Natriumsulfat getrocknet und vom L6sungsmittel befreit. Der Ruckstand wird in 10 ml Methanol gelost. 0,Ol ml dieser Lasung (entapricht 10 y Codein. phosphoric., 3 y ILVIN @ und 7,5 y Methylephedrin. hydrochloric.) wird auf eine Diinnschichtplatte, 200x200 mm, nach iYlcahl rnit Hilfe einer Blutzuckerpipette aufgetmgen. Als Standard werden entaprechende Mengen der methano ~

lischen Losungen von Codein. phosphoric., ILVIN @, Methylephedrin. hydrochloric. (100 mg/100 ml) sowie 20-25 y Phenyldimethylpyrazolon. verwendet. Steigfliissigkeit: Methanol: Puffer4,62 (Standard-Acetatpuffer ,,Merck") imVerhiiltnis 3+7. Steighohe: 14 em. Laufzeit : ca. 60Minuten. Anfiirbung :

Auswertung: Rf 0,29 - ILVIN@

Saf t m i t Codein:

O,5%ige Jodlosung in Chloroform und Kaliumjodid-Platinchloridchlor- waaserstoff-Reagenz**) im Wechsel.

R, 0,40 - Codein Rf 0,51 - N-Methylephedrin

(R, 0,7 - Phenyldimethylpyramlon) . **) Kaliumjodid-Platinchloridchlorwasserstoff-Reagenz:

Gleiche Reurnbile einer l,lyoigen wiiBrigen Kaliumjodidlosung und einer 0,135yoigen wilBrigen Platinchloridchlorwassersbfflosung werden vor Gebrauch "gemischt.

Platin(1V)-chlorwasserstoffsiiurelosung 10% (etwa 3,9% P t f z. Anal. ,,Merck".

Spriihlosung :

Chemikalien: Kaliumjodid z. Anal. ,,Merck"

Die Dosierungskontrollen werden durch Vergleich mit den in verschiedener Konzentra- tion aufgetragenen Standard-Substanzen durchgefiihrt. 2. Chromatographie einer ca. 7 Tage lang belichteten methanolischen

DECENTAN@-Losnng (100 mg DECENTAN@ in 100 ml Methanol): Eine 20 y DECENTAN@ enteprechende Menge der Untersuchungslosung wird mit

Hilfe einer Blutzuckerpipette auf eine Diinnschichtplatte, 200 X200 mm, aufgetragen. Ferner werden gleiche Mengen DECENTAN@ und Decentansulfoxyd auf die gleiche Platte gebracht. Wiihrend der Entwicklung muD die Glaskammer durch schwarzes Papier vor Licht geschiitzt werden. Steigfliissigkeit: n-Butanol : Eisessig : Wasser (4 : 1 : 1). Steighohe : 14 cm. Laufzeit: ca. 2 Stunden. Anftirbung : Folgende Xea.genziosung :

200 mg pDimethylaminobenmldehyd gelost in abgekiihlter Mischung von : 36 ml R,O und

65 ml H,SO, konz. Dazu gibt man 0,05 ml FeC1,-Losung DAB. 6.

~

*) An dieser Stelle mochte ich Herrn Hans Wimmer fur seine uinnichtige experimentelle Mitarbeit danken.

Page 11: Dünnschichtchromatographische Untersuchungen einiger pharmazeutisch verwendeter organischer Stickstoffverbindungen

620 Nihnberg Arrhiv der Pharmazie

3. Untersuchung von a) Aminosiiuren und b) EiweiBhydrolysaten:

a) 0,l g der freien Aminoslure wird in einen 100 ml fassenden MeBkolben gegeben und in ca. 95 ml 0,l n-SalzsrZure gelost. AnschlieBend wird mit 10yoiger Natronlauge neutra- lisiert (Universal-Indikatorpapier ,,Merck") und mit Wasser zur Marke aufgefiillt. 0,05 ml dieaer Gsung (entaprechend 5 y der Aminosiiuren) werden auf eine Diinnschichtplatte, 200X200 mm, nach Stah2 aufgetragen und zunachst in einer Richtung mit n-Propanol- Wwser (1 : 1) und anschlieBend mch dem Trocknen mit Phenol-Wasser (10 : 4) in der zweiten Dimension entwickelt. Die Laufzeit betriigt in beiden Richtungen insgesamt w. 6 Stunden. Die Platten werden getrooknet, mit Ninhydrin-Losung*) angespriiht und nochmals bis zur Farbentwicklung im Trockenschrank erhitzt. Die Lage der Amino- siiuren ist &us Abbildung Nr. 4 zu entnehmen.

Spruhlosung : 0,2 bis 0,3g Ninhydrin werden in OBmlMethanol, Isopropanol oder Warner- gesiittigtem n-Butanol gelost. Der Losung werden 5 ml Collidin zugesetzt .

Nachbehandlung: 1/2 bis 1 Stunde im Trockenschrank bei 80" C erwiirmen. b) 200 mg Trockenruokstand eines Leberextraktes werden in ein einseitig zugeschmol-

zenes Glasrohrohen oder eine Ampulle gegeben, mit 0,5 ml 6 n-HC1 versetzt und das GefaB zugeschmolzen. Es wird 24 Stunden lang bei 100" C hydrolysiert und der Inhalt nach dem Erkalten mit wenig Wasser in ein Reagenzglas uberfiihrt. Unter Anlegen eines schwachen Vakuums wird auf dem Wasserbad zur Troche eingedampft. tfber den Ruck- stand leitet man noch 2 Stunden lang einen angewiirmten Luststrom zur Entfernung der letzten Salzssurespuren. Da~l eingedampfte Hydrolysat wird in Wasser rnit 10% Iso- propanol aufgenommen, mit n-NaOH auf pn 7,O eingestellt, notfalls filtriert und auf ein Volumen von 10 ml gebraeht. 0,Ol ml dieser Losung (200 y Hydrolysat) wird auf eine Diinnschichtplatte nach Stuhl, 200x200 mm, gebracht und wie unter a) weiter behandelt.

Alle angefuhiten Rf-Werte stellen relative Zahlen dar; bei dieser Methode empfehlen wir, wie bei der Papierchromatographie, an Stelk der Rf-Werte die R,t-Werte (vgl. Cluo- rnatographie Merck, 2. Auflage, S. 44) anzugeben.

Znsammenfassung

Es wird die Anwendung der Diinnschichtchromatographie nach Xtahl auf phar- mazeutisch verwendete organische Stickstoffverbindungen sowie a-Aminosauren beschrieben und fur Serienanalysen empfohlen. Die verteilungschromatographische Auftrennung von Gemischen organischer Stickstoffbasen gelingt durch Zusatz von Sauren, Basen oder Puffersalzlosungen zum Steigmittelsystem. EiweiB-Hydrolyse- produkte k h n e n ohne zeitraubende Vorbehandlung bequem aufgetrennt und nach- gewiesen werden.

Es ist auf diesem Wege moglich, in kurzer Zeit bei geringem apparativem Auf- wand Kontrollanalysen von pharmazeutischen Spezialpraparaten auszufiihren und in speziellen Fallen Haltbarkeitsvoraussagen abzugeben. Auf die Vorteile des Ver- fahrens gegenuber der Papierchromatographie wird hingewiesen.

*) Ninhydrin-Losung:

Anschrift: Dr. Eberhard Niirnberg i. Fa. E. Merck AG, Darmstadt.