Dynamik der Zuckertautomerie und ihr Einfluss auf die ... · Elucidation of Structure, Bioactivity, ... „Structure and Dynamics of D-Fructose and Related AMADORI Derivatives”

Dynamik der Zuckertautomerie und ihr Einfluss

auf die Kinetik der MAILLARD-Reaktion

– Katalyse der nicht enzymatischen Bräunung –

vorgelegt von

Diplom-Lebensmittelchemiker

Martin Kaufmann

geboren in Fulda

von der Fakultät III – Prozesswissenschaften

der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften

– Dr. rer. nat. –

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender Prof. Dr.-Ing. Frank-Jürgen Methner

Gutachter Prof. Dr. Lothar W. Kroh

Gutachter Prof. Dr. Clemens Mügge

Gutachter Prof. Dr. Dr.-Ing. Thomas Henle

Gutachter Prof. Dr. Ir. MAJS (Tiny) van Boekel

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 01. März 2018

Berlin 2018

I

Kurzzusammenfassung Die MAILLARD-Reaktion wird im Allgemeinen als aminokatalysierte Zuckerabbaureaktion

verstanden. Dabei kondensiert ein primäres bzw. sekundäres Amin mit einem reduzierenden Zucker

und wird im weiteren Reaktionsverlauf zunächst unverändert wieder abgespalten. Gleichzeitig kommt

es zu Veränderungen am Zuckergrundgerüst und zu einer Färbung der Reaktionslösung. Welcher

elementare Reaktionsschritt dabei von der Aminofunktion katalysiert wird, ist bislang jedoch noch

nicht bekannt. Daneben berichten zahlreiche Publikationen von einer beschleunigten

Bräunungsreaktion in Anwesenheit diverser Carbonsäuren. Die Mehrzahl der Untersuchungen von

MAILLARD-Reaktionssystemen basiert auf dem Einsatz von Aminosäuren. Daher konnte bislang nicht

zwischen den jeweils spezifischen Einflüssen der Amino- bzw. der Carboxylfunktion auf den Verlauf

und die Kinetik der nicht enzymatischen Bräunung differenziert werden.

Um diese Frage grundlegend zu klären, wurden NMR-spektroskopische

Strukturuntersuchungen an D-Glucose, D-Tagatose sowie vor allem an Derivaten der D-Fructose

vorgenommen. Darauf aufbauend erfolgte die erstmalige systematische Durchführung selektiver

Sättigungstransfer-NMR-Experimente in Abhängigkeit der Temperatur und des pH-Wertes zur

fundamentalen Bestimmung der jeweiligen Anomerensysteme. Die Interpretation der

NMR-spektroskopischen Daten erlaubt in Kombination mit den aus der Durchführung von

Modellreaktionen erhaltenen Ergebnissen ein detailliertes Verständnis der Mechanismen der frühen

und intermediären Phase der MAILLARD-Reaktion. Die spezifischen katalytischen Einflüsse sowohl der

Amino- als auch der Carboxylfunktion wurden am Beispiel der Dynamik verschiedener

Tautomerisierungsprozesse von Zuckerderivaten erstmals konzeptionell verstanden und in einer

allgemeingültigen Theorie der Katalyse nicht enzymatischer Bräunungsreaktionen zusammengefasst.

Diese beschreibt die einzelnen Schritte der Reaktionskaskade im Wesentlichen auf Grundlage von

aufeinanderfolgenden Prozessen des Protonentransfers. Die eigentliche Katalyse besteht in einer

beschleunigten Dynamik dieses Transfers durch schwache Säuren und deren konjugierte Basen

(allgemeine Säure-Base-Katalyse), der in ausschließlicher Anwesenheit von Lösungsmitteln wie Wasser

oder Ethanol aufgrund deren extremer Säurekonstanten nur ineffizient erfolgt. Da es im Zuge der nicht

enzymatischen Bräunung unter anderem zur Bildung verschiedener Carbonsäuren kommt, handelt es

sich somit sowohl bei der Karamellisierung als auch bei der MAILLARD-Reaktion um autokatalysierte

Reaktionen. Der Einfluss der Aminofunktion ergibt sich demgegenüber durch deren Teilnahme an

kooperativen Wasserstoffbrückenbindungen sowie durch deren Beeinflussung der 𝑝𝐾𝑠-Werte

räumlich benachbarter funktioneller Gruppen.

Es konnte gezeigt werden, dass die milieuabhängige Reaktivität eines reduzierenden Zuckers

mit der Dynamik seiner Ring-Ketten-Tautomerie korreliert. In diesem Zusammenhang wird ein

Parameter präsentiert, der die Berechnung der relativen Reaktivität verschiedener Systeme

reduzierender Zucker erlaubt. Eine Reaktivitätsabschätzung von Zuckern anhand dieses Parameters

steht nicht nur im Einklang mit den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimenten, sondern

auch mit den Beobachtungen zahlreicher weiterer Publikationen. Es zeigt sich damit, dass die

Gültigkeit des Parameters nicht nur auf einfache Modellsysteme beschränkt ist, sondern ebenso für

technologische Zwecke genutzt und potentiell auch auf physiologische Systeme ausgeweitet werden

kann.

II

Abstract The MAILLARD reaction is generally known as amino catalyzed sugar degradation. During this

process, primary and secondary amines condense with the carbonyl function of a reducing sugar.

Subsequently they regenerate via elimination and hydrolysis. Simultaneously, the reducing sugar

becomes chemically modified while the color of the reaction system increases. Up to now, the catalytic

influence of the amino function is not fully understood. Aside, many researchers observed an

acceleration of browning in the presence of carboxylic acids. The majority of analyzed MAILLARD

reaction systems is based on mixtures of reducing sugars and amino acids. Thus, it was not yet possible

to differentiate between the catalytic influence of carboxyl and amino functions on the progress and

the kinetics of non-enzymatic browning reactions.

The present work concerns this question based on NMR spectroscopic investigations

respecting the structures of D-glucose and D-tagatose as well as derivatives of D-fructose.

Subsequently, the respective anomeric systems were analyzed applying selective saturation transfer

NMR experiments in dependence on temperature and pH. The interpretation of the acquired NMR

spectroscopic data in combination with the performance and analysis of model reactions permits a

detailed comprehension of the mechanisms of the early and intermediate stage of MAILLARD reaction.

Examining the dynamics of different tautomeric processes, the specific catalytic influences of amino

as well as carboxyl functions were conceptually understood for the first time. It could be shown that

the observed effects are universally valid. Hence, a novel theory of the catalysis of non-enzymatic

browning is proposed. This theory describes non-enzymatic browning reactions essentially based on

consecutive steps of proton transfer. The catalytic mechanism is due to the accelerated dynamic of

proton transfer processes via weak acids and their conjugated bases (general acid base catalysis). As a

result of their extreme acidity constants, conventional solvents such as water and primary alcohols

catalyze these dynamics only inefficiently. Since carboxylic acids are formed during non-enzymatic

browning reactions, caramelization as well as MAILLARD reaction are autocatalyzed. In contrast, amino

functions influence the kinetics of non-enzymatic browning by participating in the formation of

co-operative hydrogen bond networks as well as by altering the 𝑝𝐾𝑎 values of adjacent functional

groups.

It could be shown that the milieu dependent stability of reducing sugars is correlated with

the dynamic of their anomerization. In that context, a parameter is proposed that allows approximate

calculations of the milieu dependent reactivity of reducing sugars. Calculations of this parameter are

not only consistent with the experimental data the present work is based on, but likewise with the

observations of numerous publications. Thus, the parameter is valid regarding model reaction systems

and can as well be applied for technological as well as physiological purposes.

III

IV

Publikationen Teile dieser Arbeit wurden bereits in wissenschaftlichen Fachzeitschriften als Originalarbeiten publiziert. Diese Veröffentlichungen sind mit * gekennzeichnet und werden im Folgenden nicht mehr zitiert.

Zeitschriftenbeiträge

KAUFMANN, M.; HAASE, P. T.; MÜGGE, C.; KROH, L. W.: Milieu Dependence of Isomeric Composition of

1-Deoxy-D-erythro-hexo-2,3-diulose in Aqueous Solution Determined by High-Resolution NMR

Spectroscopy. Carbohydr. Res. 2012, 364, 15–21.

KAUFMANN, M.; HAASE, P. T.; MÜGGE, C.; KROH, L. W.: Milieu Dependence of Isomeric Composition of

D-arabino-Hexo-2-ulose in Aqueous Solution Determined by High-Resolution NMR Spectroscopy.

J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 10220–10224.

WILKER, D.; KAUFMANN, M.; KANZLER, C.; HAASE, P. T.; KEIL, C.; KROH, L. W.: Über Struktur-Wirkungs-

Beziehungen von α-Dicarbonylverbindungen. Lebensmittelchemie. 2014, 68, 143–149.

KAUFMANN, M.; MÜGGE, C.; KROH, L. W.: Theory of the Milieu Dependent Isomerisation Dynamics of

Reducing Sugars applied to D-Erythrose. Carbohydr. Res. 2015, 418, 89–97.*

KAUFMANN, M.; MÜGGE, C.; KROH, L. W.: Kohlenhydratisomerensysteme - Untersuchung mittels

dynamischer NMR-Spektroskopie. Deutsche Lebensmittel-Rundschau (DLR). 2016, 112, 94–98.*

KAUFMANN, M.; MEISSNER, P. M.; PELKE, D.; MÜGGE, C.; KROH, L. W.: Structure–Reactivity Relationship of

AMADORI Rearrangement Products compared to Related Ketoses. Carbohydr. Res. 2016, 428, 87–99.*

WEGENER, S.; KAUFMANN, M.; KROH, L. W.: Influence of L-Pyroglutamic Acid on the Color Formation

Process of Non-Enzymatic Browning Reactions. Food Chem. 2017, 232, 450–454.*

HANSCHEN, F. S.; KAUFMANN, M.; KUPKE, F.; HACKL, T.; KROH, L. W.; ROHN, S.; SCHREINER, M.: Brassica

Vegetables as Sources of Epithionitriles: Novel Secondary Products formed during Cooking. Food Chem.

2018, 245, 564–569.

KAUFMANN, M.; KRÜGER, S.; MÜGGE, C.; KROH, L. W.: Simultaneous formation of 3-deoxy-D-threo-hexo-2-ulose and 3-deoxy-D-erythro-hexo-2-ulose during the degradation of D-glucose derived AMADORI rearrangement products: Mechanistic considerations. Carbohydr. Res. 2018, 458–459, 44–51.*

KAUFMANN, M.; MÜGGE, C.; KROH, L. W.: NMR Analyses of complex D-Glucose Anomerization (submitted).*

KAUFMANN, M.; KRÜGER, S.; MÜGGE, C.; KROH, L. W.: General acid/base Catalysis of Sugar Anomerization (submitted).*

FECHNER, J.; KAUFMANN, M.; HERZ, C.; EISENSCHMIDT, D.; LAMY, E.; KROH, L. W.; HANSCHEN, F. S.: The major Glucosinolate Hydrolysis Product in Rocket (Eruca sativa L.), Sativin, is 1,3-Thiazepane-2-thione: Elucidation of Structure, Bioactivity, and Stability compared to other Rocket Isothiocyanates (submitted).

KAUFMANN, M.; SCHLINGELHOF, X. A.; MÜGGE, C.; KROH, L. W.: Tautomerization of AMADORI Rearrangement Products (in preparation).*

V

Tagungsvorträge

HAASE, P. T.; KAUFMANN, M.; KROH, L. W.:

„D-Glucosone and 1-Deoxyglucosone under MAILLARD-Conditions”

11th International Symposium on the MAILLARD Reaction, Nancy (Frankreich), 16.-20. September 2012.

KAUFMANN, M.; HAASE, P. T.; MÜGGE, C.; KROH, L. W.:

„NMR-spektroskopische Charakterisierung isomerer Zuckerabbauprodukte“

Arbeitstagung des Regionalverbandes Nordost der LChG, Berlin, 28. März 2014.

BAYER, K.; KAUFMANN, M.; HORNEMANN, A.; BECKHOFF, B.; KROH, L. W.:

„Spektroskopische Charakterisierung von Melanoidinen“


SCHLINGELHOF, X. A.; KAUFMANN, M.; MÜGGE, C.; KROH, L. W.:

„Vergleich der Isomerisierung von D-Fructose-Derivaten mittels dynamischer NMR-Spektroskopie“


KAUFMANN, M.; MÜGGE, C.; KROH, L. W.:

„Structure and Dynamics of D-Fructose and Related AMADORI Derivatives”

FoodMR 2016, Karlsruhe, 08. Juni 2016.

KAUFMANN, M.; KROH, L. W.:

„Influence of Isomerization on MAILLARD Reaction Kinetics”

Young AGErs Symposium – MAILLARD reaction in Food and in vivo, Dresden, 21-22. Juli 2016.


„Katalyse der Dynamik von Zuckertautomerien und ihr Einfluss auf die Kinetik der MAILLARD-Reaktion“

46. Deutscher Lebensmittelchemikertag, Würzburg, 25.-27. September 2017.


„Structure and Dynamics of D-Fructose and Related AMADORI Derivatives”

EuroFoodChem XIX Conference, Budapest (Ungarn), 04.-06. Oktober 2017.

VI

Poster

KAUFMANN, M.; HAASE, P. T.; MÜGGE, C.; KROH, L. W.:

„Untersuchungen zur Struktur und Isomerisierung von α-Dicarbonylverbindungen mittels

hochauflösender NMR-Spektroskopie“

42. Deutscher Lebensmittelchemikertag, Braunschweig, 16.-18. September 2013.

KAUFMANN, M.; HAASE, P. T.; KROH, L. W.; MÜGGE, C.:

„Milieu Dependence of Isomeric Composition of 1-Deoxy-D-erythro-hexo-2,3-diulose in Aqueous

Solution Determined by High-Resolution NMR Spectroscopy”

36th Discussion Meeting of the Magnetic Resonance Spectroscopy division of the German Chemical

Society (GDCh) – 'Advanced Magnetic Resonance - Methods and Applications', Berlin, 29. September

bis 02. Oktober 2014.

SCHALLSCHMIDT, K.; HALAMA, K. M. T.; KAUFMANN, M.; MÜGGE, C.; KROH, L. W.; BECKER, R.; NEHLS, I.:

„Charakterisierung flüchtiger Nitrosothiole“

9. Interdisziplinäres Doktorandenseminar der Bundesanstalt für Materialforschung und –prüfung

(BAM), Berlin, 22.-24. Februar 2015.

KAUFMANN, M.; KROH, L. W.:

„Eins für alles - MARS in der Lebensmittelanalytik“

2. Institutskolloquium des Instituts für Lebensmitteltechnologie und Lebensmittelchemie – „Moderne

Technologien und gesunde Lebensmittel“, Berlin, 20. April 2015.


„Die Theorie der milieu-abhängigen Dynamik der Isomerisierung reduzierender Zucker angewandt auf

D-Erythrose“

44. Deutscher Lebensmittelchemikertag, Karlsruhe, 14.-16. September 2015.

BAYER, K.; KAUFMANN, M.; HORNEMANN, A.; BECKHOFF, B.; KROH, L. W.:

„Characterisation of Melanoidins and their Metal Complexes applying EPR and FTIR Spectroscopic

Techniques”

9th Conference on "Instrumental Methods of Analysis – Modern Trends and Applications", Kalamata

(Griechenland), 20.-24. September 2015.

KAUFMANN, M.; MEISSNER, P. M.; PELKE, D.; MÜGGE, C.; KROH, L. W.:

„Struktur und Dynamik von D-Fructose und ausgewählten AMADORI-Derivaten“

45. Deutscher Lebensmittelchemikertag, Freising-Weihenstephan, 12.-14. September 2016.

VII

Meiner Familie

VIII

Text aus: ASMUS omnia sua SECUM portans, oder Sämmtliche Werke des Wandsbecker Bothen, 4. Theil, 1. Auflage, Wandsbeck, 1782, Seite 57.

IX

Danksagung Die vorliegende Arbeit entstand am Institut für Lebensmitteltechnologie und

Lebensmittelchemie der Technischen Universität Berlin im Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. Lothar W.

Kroh (Fachgebiet Lebensmittelchemie und Analytik) im Zeitraum von Juli 2013 bis Januar 2018. Die

Durchführung der NMR-spektroskopischen Experimente erfolgte am Institut für Chemie der

HUMBOLDT-Universität zu Berlin in der AG NMR unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Clemens Mügge.

Mein Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Lothar W. Kroh, der mir den Freiraum

schuf, eigene Forschungsansätze uneingeschränkt zu verfolgen, und mir in wissenschaftlichen

Gesprächen die Motivation gab, dabei auch unkonventionelle Ideen zu entwickeln. Gleichermaßen

ermöglichte er mir die Betreuung wissenschaftlicher Themengebiete, die weit abseits der hier

vorliegenden Arbeit angeordnet sind, sodass ich meine Erfahrungen in vielfältigen Bereichen (nicht

nur) der Lebensmittelchemie sammeln konnte.

Gleichermaßen danke ich meinem zweiten Mentor Herrn Prof. Dr. Clemens Mügge, der mir

das Vertrauen schenkte und mir freien Zugang zu allen verfügbaren NMR-Spektrometern gewährte.

Als mein Lehrmeister der NMR-Spektroskopie unterstützte und stärkte er mich in zahlreichen

fachlichen Gesprächen und vielen Stunden an den Spektrometern.

Besonders erfreut mich die Tatsache, dass die vorliegende Arbeit Schwerpunkte wichtiger

Forschungsthemen meiner beiden Mentoren vereint. Auf diese Weise habe ich einerseits viel aus

ihrem jeweiligen Erfahrungsschatz profitiert und meine Ideen andererseits in zahlreichen Diskussionen

gegenüber spitzfindigen und herausfordernden Fragen zu verteidigen lernen müssen. Vielen Dank

dafür. Das war – nicht nur für mich – immer eine ganz besondere Freude!

Herrn Prof. Dr. Ir. MAJS (Tiny) van Boekel von der Wageningen University & Research

(Niederlande) danke ich für die freundliche Bereitschaft der Begutachtung meiner Dissertation. Dies

freut mich insbesondere, da seine umfangreichen Untersuchungen zur Kinetik der nicht enzymatischen

Bräunung den Grundstein für die hier bearbeitete Fragestellung gelegt haben. Hartelijk bedankt!

Herrn Prof. Dr. Dr.-Ing. Thomas Henle von der Technischen Universität Dresden danke ich für

die kurzfristige Bereitschaft der Begutachtung meiner Dissertation. Ein besonderes Dankeschön gilt

ihm jedoch vor allem für die Unterstützung seiner Doktoranden und Post-Docs bei der Gründung der

YoungAGErs, deren inzwischen internationale Symposien zu einer nachhaltigen Vernetzung des

wissenschaftlichen Nachwuchses mit dem Schwerpunkt der MAILLARD-Reaktion ermöglichen.

Für ihre fachliche und technische Unterstützung danke ich allen Mitarbeitern der

Arbeitskreise von Herrn Prof. Dr. Kroh sowie Herrn Prof. Dr. Mügge. Vor allem ohne die technische

Unterstützung von Beate Beyerlein, Anette Berghäuser und Angela Thiesies wäre es im Laufe der Arbeit

wohl mehr als einmal zu größeren Verzögerungen gekommen. Insbesondere NMR-Spektrometer

haben vor direkten Vorgesetzten zunächst mehr Respekt als vor neuen Doktoranden.

Meinen Kollegen Alexandra Urbisch, Sandra Grebenteuch, Philipp Bruhns, Dr. Martin Doert,

Dr. Paul Haase, Dr. Clemens Kanzler und Steffen Wegener danke ich herzlich für ihre Hilfsbereitschaft

und die nette Arbeitsatmosphäre. Bei gemeinsamen Kaffeerunden und Ausflügen ist mehr als nur eine

Träne geflossen. Vor allem meiner Bürokollegin Alexandra danke ich für die gute gemeinsame Zeit.

X

Daniel Pelke, Philipp Meissner, Kai Halama, Kathrin Bayer, Xenia Schlingelhof, Teodor

Tchipilov, Sophie Krüger, Christoph Mertens und Leon Huder gilt mein Dank für ihre engagierte

Zusammenarbeit im Rahmen ihrer wissenschaftlichen Abschlussarbeiten, Forschungspraktika und

Masterarbeiten sowie als studentische Hilfskräfte. Danke für eure jeweiligen Forschungsbeiträge auch

auf Gebieten jenseits der nicht enzymatischen Bräunung.

Abschließend danke ich meiner Frau Kerstin und meinen Kindern Charlotte, Severin und

Kilian für ihre bedingungslose Unterstützung und die Freude und Abwechslung, die sie mir bereiten.

Gleichermaßen danke ich meinen Eltern und Schwiegereltern für ihren täglichen und nicht

selbstverständlichen Beistand. Die Arbeit steht auf eurem Fundament!

XI

XII

Inhaltsverzeichnis Kurzzusammenfassung ............................................................................................................................. I

Abstract ................................................................................................................................................... II

Publikationen .......................................................................................................................................... IV

Danksagung ............................................................................................................................................ IX

Inhaltsverzeichnis .................................................................................................................................. XII

Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................................................... XIV

1 Einleitung .............................................................................................................................................. 1

2 Theoretischer Hintergrund ................................................................................................................... 2

2.1 Die MAILLARD-Reaktion ................................................................................................................... 2

2.1.1 D-Fructose ............................................................................................................................... 3

2.1.1.1 Strukturen und Dynamik der D-Fructose ......................................................................... 3

2.1.1.2 Formen der Isomerisierung ............................................................................................. 6

2.1.2 Die Aminokomponenten ........................................................................................................ 8

2.1.3 AMADORI- und HEYNS-Verbindungen ....................................................................................... 8

2.1.3.1 AMADORI- und HEYNS-CARSON-Umlagerung ....................................................................... 8

2.1.3.2 Strukturen und Dynamik der AMADORI-Verbindungen .................................................. 13

2.1.4 Reaktionen von Derivaten der D-Fructose ........................................................................... 16

2.2 NMR-Spektroskopie ..................................................................................................................... 22

2.2.1 Strukturaufklärung ............................................................................................................... 22

2.2.2 Quantitative NMR-Spektroskopie (qNMR) ........................................................................... 23

2.2.3 Methoden der dynamischen NMR-Spektroskopie (DNMR) ................................................. 26

2.3 Katalyse und mathematische Modellierung der Anomerisierung .............................................. 34

3 Zielstellung ......................................................................................................................................... 40

4 Ergebnisse und Diskussion ................................................................................................................. 42

4.1 Reaktivität von Derivaten der D-Fructose ................................................................................... 42

4.1.1 Kinetik des Abbaus von D-Fructose, Aminosäuren und AMADORI-Verbindungen ................. 42

4.1.2 Kinetik der Bildung von α-Dicarbonylverbindungen ............................................................ 46

4.1.3 Kinetik der Farbentwicklung bei Reaktionen von Derivaten der D-Fructose ....................... 53

4.2 Charakterisierung der Anomerensysteme .................................................................................. 56

4.2.1 Strukturaufklärung der Anomerensysteme.......................................................................... 57

4.2.2 Dynamik der 1,2-Enolisierung .............................................................................................. 68

4.2.3 Zwischenfazit der bisherigen Ergebnisse ............................................................................. 75

4.2.4 Zusammenhang zwischen Anomerisierung und Reaktivität ................................................ 76

4.2.5 Quantitative Zusammensetzung der Anomerensysteme..................................................... 80

4.2.6 Dynamik der Anomerisierung ............................................................................................... 84

5 Zusammenfassung ............................................................................................................................ 101

XIII

6 Experimenteller Teil ......................................................................................................................... 106

6.1 Synthesen der AMADORI-Verbindungen ..................................................................................... 106

6.1.1 Synthese von N-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-L-alanin ............................................................ 106

6.1.2 Synthese von N-(1-Desoxy-D-[2-13C]fructos-1-yl)-L-alanin ................................................. 107

6.1.3 Synthese von N-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-L-prolin ............................................................ 108

6.1.4 Synthese von N-(1-Desoxy-D-[2-13C]fructos-1-yl)-L-prolin .................................................. 109

6.1.5 Synthese von N-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-glycin ............................................................... 110

6.1.6 Synthese von N-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-β-alanin ........................................................... 111

6.1.7 Synthese von N-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-γ-aminobuttersäure ........................................ 112

6.1.8 Regeneration des Ionentauschers ...................................................................................... 113

6.2 pH-konstante Modellreaktionen ............................................................................................... 113

6.2.1 Durchführung und Auswertung der UV/Vis-spektroskopischen Messungen .................... 114

6.2.2 Messung und Auswertung der Abbaukinetiken der D-Fructose......................................... 115

6.2.3 Messung und Auswertung der Abbaukinetiken der Aminosäuren .................................... 116

6.2.4 Messung und Auswertung der Abbaukinetiken der AMADORI-Verbindungen .................... 116

6.2.5 Messung und Auswertung der Kinetiken der α-Dicarbonylverbindungen ......................... 117

6.3 NMR-Spektroskopische Messungen .......................................................................................... 118

6.3.1 Strukturaufklärung ............................................................................................................. 118

6.3.2 Kalibrierung der Temperatur .............................................................................................. 119

6.3.3 Kalibrierung des pD-Wertes ............................................................................................... 120

6.3.4 Quantitative NMR-Spektroskopie (qNMR) ......................................................................... 121

6.3.5 Messung von Enolisierungsraten ....................................................................................... 121

6.3.6 Selektive Sättigungstransfer-NMR-Spektroskopie (SST-NMR) ........................................... 122

6.3.6.1 Frequenz-Sweep-Sättigungstransfer ........................................................................... 123

6.3.6.2 1H-SST-NMR ................................................................................................................. 124

6.3.6.3 13C-SST-NMR ................................................................................................................ 125

6.4 Potentiometrische Bestimmung der 𝑝𝐾𝑠-Werte....................................................................... 125

6.5 Polarimetrische Messungen ...................................................................................................... 126

6.6 Geräte ........................................................................................................................................ 126

6.7 Software .................................................................................................................................... 128

6.8 Chemikalien ............................................................................................................................... 129

Literaturverzeichnis .................................................................................................................................. i

Abbildungsverzeichnis ......................................................................................................................... xxvi

Tabellenverzeichnis .............................................................................................................................. xxx

Schemataverzeichnis ......................................................................................................................... xxxiii

Strukturenverzeichnis......................................................................................................................... xxxv

Anhang .............................................................................................................................................. xxxvi

Curriculum Vitae ................................................................................................................................... lviii

XIV

Abkürzungsverzeichnis 1-DG 1-Desoxyglucoson (1-Desoxy-D-erythro-hexos-2,3-diulose)

1D eindimensional

2D zweidimensional

3-DG 3-Desoxyglucoson (3-Desoxy-D-erythro-hexos-2-ulose)

AAF 2-Aminoacetylfuran

ACuSTiC aus dem Englischen approximated carbohydrate milieu stability time constant

für approximierte milieuabhängige Kohlenhydratstabilitätszeitkonstante

αF α-Furanose

AMV AMADORI-Verbindung

αP α-Pyranose

AS Aminosäure

AU-Programm Automationsprogramm

βF β-Furanose

βP β-Pyranose

BBI aus dem Englischen broadband inverse für Breitband invers

BBO aus dem Englischen broadband observe für Breitband beobachten

CIP CAHN-INGOLD-PRELOG

COSY aus dem Englischen correlation spectroscopy für Korrelationsspektroskopie

CU aus dem Englischen cooling unit für Kühleinheit

DAD aus dem Englischen diode array detector für Diodenarraydetektor

DEPT aus dem Englischen distortionless enhancement by polarization transfer für

Verzerrungsfreie Verstärkung durch Polarisationstransfer

DHHM Dihydrohydroxymaltol (3,5-Dihydroxy-6-methyl-2,3-dihydro-4H-pyran-4-on)

DNMR aus dem Englischen dynamic nuclear magnetic resonance für dynamische

kernmagnetische Resonanz

E Extinktion

EA Elementaranalyse

eq. Aus dem Englischen equivalents für Äquivalente

EU Europäische Union

XV

EXPNO aus dem Englischen experiment number für Experimentnummer

EXSY aus dem Englischen exchange spectroscopy für Austauschspektroskopie

FAla Fructosylalanin (N-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-L-alanin)

FBala Fructosyl-β-alanin (N-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-β-alanin)

FGaba Fructosyl-γ-aminobuttersäure (N-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-γ-aminobuttersäure)

FGly Fructosylglycin (N-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-glycin)

FID aus dem Englischen free induction decay für freien Induktionsabfall

FP Folgeprodukt

FPro Fructosylprolin (N-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-L-prolin)

FQSSST aus dem Englischen frequency sweep selective saturation transfer für

Frequenzdurchlaufselektiven Sättigungstransfer

Fru D-Fructose

GC Gaschromatographie

gem geminal

GLUC D-Glucoson (D-arabino-Hexos-2-ulose)

HAF 2-Hydroxyacetylfuran

H/D-Austausch Wasserstoff/Deuterium-Austausch

HILIC aus dem Englischen hydrophilic interaction liquid chromatography für

hydrophile Wechselwirkungsflüssigchromatographie

HMBC aus dem Englischen heteronuclear multi-bond correlation für heteronukleare

Mehrfachbindungskorrelation

HMF Hydroxymethylfurfural (5-Hydroxymethyl-2-furaldehyd)

HMQC aus dem Englischen heteronuclear multi-quantum correlation für

heteronukleare Mehrquantenkorrelation

HPLC aus dem Englischen high performance liquid chromatography für

Hochleistungsflüssigchromatographie

HSQC aus dem Englischen heteronuclear single-quantum coherence für

heteronukleare Einzelquantenkohärenz

H/T-Austausch Wasserstoff/Tritium-Austausch

Int. Integral

IR Infrarot

lb aus dem Englischen line broadening factor für Linienverbreiterungsfaktor

XVI

MW Mittelwert

NMR aus dem Englischen nuclear magnetic resonance für kernmagnetische Resonanz

NOE aus dem Englischen nuclear OVERHAUSER enhancement für Kern-OVERHAUSER

Verstärkung bzw. nuclear OVERHAUSER effect für Kern-OVERHAUSER Effekt

NOESY aus dem Englischen nuclear OVERHAUSER enhancement spectroscopy für

Kern-OVERHAUSER verstärkte Spektroskopie

OPD ortho-Phenylendiamin (1,2-Diaminobenzen)

pI isoelektrischer Punkt

pL aus dem Englischen patch level für Revisionsnummer

PROCNO aus dem Englischen processing number für Prozessierungsnummer bzw.

Bearbeitungsnummer

qNMR aus dem Englischen quantitative nuclear magnetic resonance für quantitative

kernmagnetische Resonanz

RI aus dem Englischen refractive index für Brechungsindex

RP aus dem Englischen reversed phase für Umkehrphase

SET aus dem Englischen set endpoint titration für Titration auf vorgegebenen

Endpunkt

SEXSY aus dem Englischen selective exchange spectroscopy für selektive

Austauschspektroskopie

SIR aus dem Englischen selective inversion recovery für Signalrückentwicklung nach

selektiver Inversion

SST aus dem Englischen selective saturation transfer für selektiver

Sättigungstransfer

STW Standardabweichung

STD aus dem Englischen saturation transfer difference für

Sättigungstransferdifferenz

TOCSY aus dem Englischen total correlated spectroscopy für vollständig korrelierte

Spektroskopie

UV ultraviolett

vA virtuelles Anomer

Vis aus dem Englischen visible für sichtbar

VTU aus dem Englischen variable temperature unit für variable

Temperierungseinheit

z Zentralisomer

EINLEITUNG

- 1 -

1 Einleitung Seit der Entdeckung des Prozesses der Anomerisierung von Zuckern durch die Beobachtung

und Beschreibung der Mutarotation der D-Glucose durch AUGUSTIN-PIERRE DUBRUNFAUT (1846) sind

reduzierende Zucker Bestandteil wissenschaftlicher Forschung und Diskussionen.[1] Dabei sind bei

SciFinder® zum Suchbegriff „Glucose“ bis einschließlich 2016 insgesamt über 1.25 Millionen Einträge

gelistet. Seit der Entdeckung der nicht enzymatischen Bräunung reduzierender Zucker in Anwesenheit

von Aminokomponenten durch LOUIS-CAMILLE MAILLARD (1912)[2] bildet die sogenannte

MAILLARD-Reaktion unter anderem eine Teildisziplin der Kohlenhydratchemie, deren

Publikationszahlen sich um einige Jahrzehnte zeitlich versetzt in etwa parallel zu denen der D-Glucose

entwickeln (vgl. Abbildung 1).

Abbildung 1: Zeitliche Entwicklung der Anzahl der in SciFinder® gelisteten Publikationen zu den Suchbegriffen „Glucose“ und „Maillard reaction“ seit 1856.

Der abrupte Sprung der Publikationszahlen zum Suchbegriff „Maillard reaction“ zwischen

den Jahren 1946 und 1956 ist dadurch zu erklären, dass sich der bis heute genutzte Begriff

„MAILLARD-Reaktion“ erst einige Zeit nach dem Tod von LOUIS-CAMILLE MAILLARD (1878-1936) für die

Aminocarbonylreaktion durchgesetzt hat.[3] Interessanterweise datiert eine Extrapolation der

Publikationszahlen zum Suchbegriff „Maillard reaction“ der Jahre 1956-2016 den Beginn der Forschung

in den Zeitraum um 1910 und damit nahezu exakt auf das Jahr MAILLARDs erster Publikation (1912).

Da zu beobachten ist, dass die Zunahme der Bräunung reduzierender Zucker über die Zeit in

Anwesenheit etwa von Aminosäuren größer ist als in deren Abwesenheit, wird die MAILLARD-Reaktion

im Allgemeinen als aminokatalysierter Zuckerabbau verstanden.[4] Die Kinetik der Bräunungszunahme

entspricht dabei am ehesten der einer Autokatalyse.[5] In einem gegebenen System, das als einzige

Stickstoffquelle Moleküle mit Aminofunktionen enthält, kann sich die Stoffmenge an Aminofunktionen

nicht weiter erhöhen. Daher muss der autokatalytische Verlauf der Bräunungskinetiken aus der

Bildung nicht stickstoffhaltiger katalytischer Spezies resultieren, die parallel mit den Farbpigmenten

entstehen. Wie zahlreiche Publikationen nahelegen, kann angenommen werden, dass es sich hierbei

um Carbonsäuren handelt,[6-11] die im Zuge der nicht enzymatischen Bräunung gebildet werden.[12,13]

Die MAILLARD-Reaktion ist folglich nicht nur amino-, sondern gleichermaßen carboxylkatalysiert.

Welche strukturellen und elektronischen Effekte im Einzelnen von den Amino- und Carboxylfunktionen

ausgehen und damit eine Destabilisierung bzw. Reaktivitätserhöhung der reduzierenden Zucker

bewirken, ist bisher nicht untersucht und weitestgehend unbekannt.

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"Glucose""Maillard reaction"

THEORETISCHER HINTERGRUND

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2 Theoretischer Hintergrund In diesem Kapitel sollen die chemischen und spektroskopischen Grundlagen erläutert

werden, die zum Verständnis der Arbeit relevant sind. Zu diesem Zwecke werden die derzeit

bekannten Strukturen und chemischen Eigenschaften der Zielsubstanzen erörtert und die

bestehenden Möglichkeiten diskutiert, diese gezielt zu untersuchen.

2.1 Die MAILLARD-Reaktion

Der Begriff der MAILLARD-Reaktion geht zurück auf den franko-algerischen Mediziner und

Pharmazeuten LOUIS-CAMILLE MAILLARD, der im Januar 1912 einen Bericht über die Reaktion von

D-Glucose mit Glycin publizierte.[2] Darin beschreibt er seine Beobachtung der nicht enzymatischen

Bräunung. Die später nach ihm benannte Reaktionskaskade läuft in allen Systemen ab, die neben

reduzierenden Zuckern auch Aminokomponenten enthalten. Der Reaktionsverlauf sowie die Kinetik

der MAILLARD-Reaktion sind nicht nur beeinflusst von der Art des Zuckers und der Aminokomponente,

sondern ebenso vom Wassergehalt, der Temperatur und dem pH-Wert.[14] Die MAILLARD-Reaktion

unterscheidet sich damit von der Karamellisierung, bei der Zucker in Abwesenheit von

Aminokomponenten – zumeist bei geringem Wassergehalt – einem Abbau unterliegen.[15,16]

Reaktionen im Sinne der MAILLARD-Reaktion laufen nicht nur – wie allgemein bekannt – beim

thermischen Prozessieren kohlenhydrathaltiger Lebensmittel aller Art ab, sondern ebenso in

physiologischen Systemen, wo sie mit der Genese zahlreicher Krankheiten in Verbindung gebracht

werden.[17] Da die MAILLARD-Reaktion unter physiologischen Bedingungen bspw. im menschlichen

Organismus nur bei geringer Temperatur verläuft und entsprechend langsam ist, handelt es sich

zumeist um Erkrankungen, die erst im fortgeschrittenen Lebensalter in Erscheinung treten. Darunter

zählen unter anderem Arteriosklerose, Diabetes mellitus, Urämie und Morbus ALZHEIMER.[18-21]

Aufgrund ihrer zentralen Rolle in der menschlichen Ernährung und dem menschlichen

Stoffwechsel, beschäftigt sich die Mehrzahl der Publikationen mit dem Reaktionsverhalten von

D-Glucose in MAILLARD-Reaktionssystemen.1 Mit dem Auslaufen der Verordnung (EU) Nr. 1308/2013

des Europäischen Parlaments und des Rates (Europäische Zuckermarktordnung) am 30. September

2017 und dem damit in Zusammenhang stehenden Wegfall der EU-Quoten für Isoglucose2, ist zu

erwarten, dass der Preis für Isoglucose fallen und damit ihre Verwendung in der

Lebensmittelproduktion aus wirtschaftlichen Gründen zunehmen wird.[22] Es ist daher davon

auszugehen, dass der Anteil an D-Fructose in der menschlichen Ernährung innerhalb der Europäischen

Union in den kommenden Jahren steigen wird. Die physiologische Konzentration von D-Fructose im

Blutplasma beträgt nur 1% der Konzentration der D-Glucose.[23] Trotzdem zeigen Untersuchungen der

Glycosylierung von Linsenproteinen menschlicher Augen, dass nur 80 bis 90% der

Proteinveränderungen auf die Reaktion mit D-Glucose zurückzuführen sind. Die übrigen 10 bis 20%

1 2246 Einträge bei SciFinder® zum Suchbegriff „Glucose Maillard“ gegenüber 658 Einträgen zum Suchbegriff

„Fructose Maillard“. Zeitpunkt der Suchanfrage: 06. März 2017.

2 Aus chemischer Sicht handelt es sich bei Isoglucose um ein Stärkehydrolysat, das unter Einwirkung von

Glucoseisomerase teilweise zu D-Fructose isomerisiert wird. Isoglucose ist damit ein Glucose-Fructose- bzw.

Fructose-Glucose-Sirup, der auch unter der Bezeichnung High Fructose Corn Syrup gehandelt wird.


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resultieren trotz ihrer geringen Plasmakonzentration aus der Reaktion mit D-Fructose.[24] Diese ist

damit unter physiologischen Bedingungen ca. zehnmal so reaktiv wie D-Glucose.[23] Es ist somit

absehbar, dass sich das Auftreten MAILLARD-reaktionsbedingter Alterserscheinungen mittelfristig um

einige Jahre vorverlagern wird. Gleichzeitig ist mit einem Anstieg D-Fructose-assoziierter Erkrankungen

wie der Nichtalkoholischen Fettlebererkrankung (non-alcoholic fatty liver disease) zu rechnen.[25-29]

Darüber hinaus werden auch Unverträglichkeiten wie Fructosemalabsorption in Verbindung mit

intestinaler Fructoseintoleranz[30] sowie Erkrankungen wie die hereditäre Fructoseintoleranz[31]

potentiell an Bedeutung in der Gesellschaft zunehmen. Inhalt dieser Arbeit ist vor dem Hintergrund

dieser Entwicklung die MAILLARD-Reaktion und die Karamellisierung der D-Fructose sowie die

grundlegende Untersuchung der Reaktivität verschiedener D-Fructosederivate. Im Folgenden werden

die derzeit bekannten Eigenschaften der Zielsubstanzen beschrieben.

2.1.1 D-Fructose

D-Fructose 1a gehört zur Klasse der Ketohexosen, zu der neben ihren jeweiligen

L-konfigurierten Enantiomeren auch D-Tagatose 1b, D-Sorbose 1c und D-Psicose 1d zählen (vgl.

Schema 1). D-Fructose wurde erstmals 1847 von AUGUSTIN-PIERRE DUBRUNFAUT bei Untersuchungen der

Vergärung von Zuckern entdeckt und beschrieben.3;[32] Sie ist die in Lebensmitteln am häufigsten

vorkommende Ketose.[33]

Schema 1: Strukturen der Ketohexosen D-Fructose 1a, D-Tagatose 1b, D-Sorbose 1c und D-Psicose 1d.

2.1.1.1 Strukturen und Dynamik der D-Fructose

Aufgrund ihrer Multifunktionalität ist D-Fructose dazu in der Lage, intramolekulare Halbketale

zu bilden, was zur Cyclisierung zu Pyranosen und Furanosen führt. Durch die Cyclisierung wird der

prochirale sp2-hybridisierte Carbonylkohlenstoff chiral und je zwei Epimerenpaare resultieren, die als

α- bzw. β-Anomere bezeichnet werden. Die absolute Konfiguration des α-Anomers ist dabei der

Konfiguration des höchstbezifferten chiralen Kohlenstoffatoms (hier: C-5 mit R-Konfiguration nach

CIP-Nomenklatur) entgegengesetzt. Im Falle des β-Anomers sind die jeweiligen Stereozentren

entsprechend gleichartig konfiguriert. D-Fructose kristallisiert in 2C5-β-pyranoider Struktur.4;[34] Wird

sie gelöst, findet Mutarotation statt, sodass ein Gemisch der Anomere entsteht. Dieses setzt sich aus

3 Nach ihrer Entdeckung wurde D-Fructose aufgrund ihrer optischen Aktivität ab 1860 zunächst als „Levulose“

bzw. „Lävulose“ bezeichnet[358] und bekam ihren bis heute gültigen wissenschaftlichen Namen 1890 durch EMIL

FISCHER.[359] Ihre erstmalige Kristallisation gelang JUNGFLEISCH und LEFRANC 1881.[360]

4 Dieses Konformer ist auch die in der Gasphase vorherrschende Struktur der D-Fructose.[361]


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je einer α- und β-konfigurierten Pyranose 1a(i)/1a(ii) bzw. Furanose 1a(iii)/1a(iv) zusammen (vgl.

Schema 2). Durch Öffnung des Halbketals bildet sich das offenkettige Isomer 1a(v), welches durch

Addition von Wasser prinzipiell in ein geminales Diol (gem-Diol) 1a(vi) übergehen kann, was jedoch im

Falle der Ketohexosen bislang nicht direkt nachgewiesen wurde.[35-40] Ein indirekter Nachweis konnte

jedoch durch die Beobachtung eines 16O/18O-Austauschs des Carbonyl- bzw. des jeweils anomeren

Hydroxylsauerstoffatoms in H218O erbracht werden.[41,42] Gleichermaßen konnte die Existenz des

1,2-Endiols 1a(vii) indirekt über die Beobachtung eines H/D-Austauschs am C-1 bewiesen werden.[43-45]

Schema 2: Isomerensystem der D-Fructose 1a in wässriger Lösung. *Relative Konzentration bei 20 °C.[46]

Die Konformation der β-D-Fructopyranose 1a(ii) in wässriger Lösung entspricht der im

kristallinen Zustand. Furanosen können im Gegensatz zu 6-Ringsystemen keine Sesselstrukturen

annehmen. Sie bilden sogenannte Envelope- und Twist-Konformere, die in Abhängigkeit der

Ringsubstituenten stabilisiert werden. Die Beschreibung exakter Raumstrukturen furanoider Systeme

ist seit langem Bestandteil der Forschung.[47-49] Ein Weg, diese zu bestimmen, besteht darin, die


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exocyclischen Torsionswinkel mit Hilfe der 3J(1H,1H)-Kopplungskonstanten unter Nutzung der

generalisierten KARPLUS-Beziehung zu berechnen.5;[50,51] Diese müssen im Folgenden dazu genutzt

werden, auf die endocyclischen Torsionswinkel zu schließen und damit den Phasenwinkel der

Pseudorotation P und die Puckering-Amplitude τ zu ermitteln. Aufgrund der geringen Energiebarrieren

der Pseudorotation von 5-Ringsystemen, die üblicherweise nahe 0 kJ/mol liegen und Maximalwerte

von rund 20 kJ/mol erreichen,[52] gehen die Rotamere furanoider Strukturen schon meist bei

Raumtemperatur nahezu frei ineinander über. Das geht mit einer temperaturabhängigen Änderung

der 3J(1H,1H)-Kopplungskonstanten einher.[53] Es ist daher anzunehmen, dass die Vorzugskonformation

von monomeren Furanosen keinen Einfluss auf die Reaktivität einfacher Saccharide hat. Dies sollte

jedoch nicht die prinzipielle Notwendigkeit der Konformationsanalyse infrage stellen, da die

Geometrie von Monomeren innerhalb polymerer Strukturen Einfluss auf die Struktur von

Makromolekülen nimmt. Damit ist die Kenntnis des Phasenwinkels der Pseudorotation P und der

Puckering-Amplitude τ bspw. Voraussetzung für die Strukturaufklärung der Nucleinsäuren.[54] Im

weiteren Verlauf dieser Arbeit wird die Pseudorotation der furanoiden Anomere nicht weiter

betrachtet und lediglich von je einem α- und β-furanoiden Anomer gesprochen.

Da bei der Ringinversion pyranoider Strukturen zumeist größere Energiebarrieren zu

überwinden sind, handelt es sich bei 6-Ringsystemen um vergleichsweise starre Strukturen mit

typischen Vorzugskonformationen. Als Beispiel hierfür sei noch einmal die 2C5-β-D-Fructopyranose

1a(ii) genannt. Es ist also davon auszugehen, dass auch im Falle des α-pyranoiden Anomers eine

entsprechende Struktur vorliegt. Hierzu fehlen jedoch verlässliche Literaturwerte. Frühe

Publikationen, die sich mit der Struktur der D-Fructose befassen, gehen rein argumentativ davon aus,

dass die α-Pyranose ebenfalls in Form eines 2C5-Sessels vorliegt.[40] Auch die Autoren jüngerer

Publikationen liefern keine experimentellen Hinweise auf die tatsächliche Struktur, schließen sich

jedoch der bestehenden Vermutung an.[46,55] Diese basiert in erster Linie auf der Betrachtung sterischer

Wechselwirkungen, die im Falle des 5C2-Konformers aufgrund der 1,3-diaxialen Stellung der

Hydroxylfunktionen am C-2 und C-4 stark ausgeprägt sind. Nicht beachtet wird dabei jedoch, dass

dieses Konformer über den anomeren Effekt stabilisiert ist.[56] Theoretische Arbeiten zur Konformation

der α-D-Fructopyranose zeigen, dass die Energiedifferenz der beiden Konformere bei lediglich

2.55 kJ/mol liegt, was der thermischen Energie bei 34 °C entspricht.[57] Dies ist ein Indiz dafür, dass

beide Konformere koexistieren könnten. Ebenfalls dafür sprechen die für das nah verwandte

D-Fructosamin-Hydrochlorid publizierten Kopplungskonstanten der α-Pyranose. Diese sind mit 3J(H-C-5; Ha-C-6) = 3.1 Hz und 3J(H-C-5; Hb-C-6) = 3.0 Hz zu groß für das 2C5-, jedoch zu klein für das 5C2-Konformer.[57,58] Daneben liefern auch ultraschallspektroskopische Messungen Hinweise auf eine 5C2 2C5 Ringinversion.[59-61]

Bei 20 °C bildet 1a(ii) mit 68.23% das Hauptanomer in wässriger Lösung, gefolgt von 1a(iv) mit

22.35%, 1a(iii) mit 6.24%, 1a(i) mit 2.67% und 1a(v) mit 0.50% (vgl. Schema 2).[46] Dass dieses

Gleichgewicht temperaturabhängig ist, wurde bereits im frühen 20. Jahrhundert erkannt.[62] Die

Abhängigkeit des Anomerengleichgewichts von der Konzentration der D-Fructose – und damit

5 Die Anpassung der generalisierten KARPLUS-Beziehung erfordert unter anderem die Zuhilfenahme der 1953

publizierten HUGGINS-Elektronegativitäten,[362] die als Neuberechnung der 1932 von LINUS PAULING eingeführten

Elektronegativitäten zu verstehen sind.[363] Seit 1961 sind diese zwar durch A. L. ALLREDS abermals optimierte

Werte abgelöst,[364] haben dadurch jedoch ihre Gültigkeit für die Anpassung der generalisierten

KARPLUS-Beziehung nicht verloren.


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gleichermaßen vom Wassergehalt – ist ebenso beschrieben wie dessen Abhängigkeit vom

Lösungsmittel.[55,63-66] Die Ringöffnungs- und Ringschlussraten (im weiteren Verlauf der Arbeit als

Anomerisierungsraten bezeichnet) dieses komplexen Anomerensystems werden bereits seit rund 100

Jahren untersucht. Dazu wurden zunächst polarimetrische Messungen durchgeführt und damit

Mutarotationsraten in Abhängigkeit der Temperatur und des pH-Wertes ermittelt.[67] Dabei handelt es

sich um die Summe der Geschwindigkeitskonstanten für die Ringöffnung von 1a(ii) und der Rate der

Rückreaktion. Die Rate der Rückreaktion entspricht dabei jedoch nicht der Ringschlussrate von 1a(v)

zu 1a(ii), sondern berechnet sich aus den Anomerisierungsraten aller vorhandenen Isomere mit

Ausnahme der Ringöffnungsrate von 1a(ii). In späteren Arbeiten gelang die getrennte Berechnung der

Ringöffnungsraten von 1a(ii) in Abhängigkeit der Temperatur, woraus die Aktivierungsparameter der

Ringöffnung ermittelt wurden.[68] Die Messungen fanden hierbei jedoch in Acetat-Puffer statt, sodass

die Ergebnisse mutmaßlich nicht mit denen in ungepufferter Lösung übereinstimmen. Mit der

Entdeckung der NMR-Spektroskopie durch FELIX BLOCH und EDWARD MILLS PURCELL im Jahre 19466 und

den grundlegenden Arbeiten von HARDEN MCCONNELL[69] sowie STURE FORSÉN und RAGNAR HOFFMAN[70]

wurde die Untersuchung komplexer dynamischer Isomerensysteme im thermodynamischen

Gleichgewicht möglich. Dabei wurde die Dynamik einer Vielzahl von Zuckersystemen insbesondere

durch SNYDER und SERIANNI mittels selektiver Sättigungstransfer-NMR-Spektroskopie untersucht.[71-79]

Zur Dynamik des Anomerensystems der D-Fructose hingegen liegen weiterhin nur wenige

Informationen vor. In der einzig vorhandenen Publikation werden lediglich die Anomere 1a(ii), 1a(iii)

und 1a(iv) untersucht.[80] Die dabei eingesetzten Methoden sind jedoch aus den in Kapitel 2.2.3

diskutierten Gründen nur eingeschränkt für die Untersuchung von dynamischen

Kohlenhydratsystemen nutzbar.

2.1.1.2 Formen der Isomerisierung

Unter Kapitel 2.1.1.1 wurde das dynamische Gleichgewicht der Anomere der D-Fructose 1a

diskutiert. Dabei gehen diese in (protischen) Lösungsmitteln durch intramolekulare Bildung von

Halbketalen sowie Ringinversion schnell ineinander über. Es ist daher unmöglich, eine dauerhafte

Trennung der Anomere vorzunehmen, solange sich diese in Lösung befinden. Die Anomerisierung

sowie deren Elementarschritte – Ringöffnung und Ringschluss – sind damit eine spezielle Form der

Tautomerie (Ring-Ketten-Tautomerie). Dabei bezeichnen Tautomerien nach CONRAD LAAR (1885)

gleichberichtigte Strukturformeln identischer chemischer Verbindungen, die sich durch

intramolekulare Umlagerungen ineinander überführen lassen.[81] Da der Prozess der Tautomerisierung

demnach verschiedene Erscheinungsbilder identischer Verbindungen miteinander verknüpft, sind

Tautomerien zunächst nicht als chemische Reaktionen zu verstehen. Eine wesentliche Eigenschaft der

D-Fructose besteht neben der Anomerisierung (d.h. Ringöffnung und Ringschluss) in einer weiteren

Form der Tautomerie. Hierbei handelt es sich um die Möglichkeit der Enolisierung, die sich aus der

C-H-Acidität α-ständiger Methylen- und Methingruppen in Nachbarschaft von Carbonylfunktionen

ergibt. Damit zeigen sowohl die Protonen am C-1 als auch am C-3 C-H-Acidität. Der Prozess der

Enolisierung führt neben dem 1,2-Endiol auch zum 2,3-Endiol (vgl. Schema 3).

6 Nur 6 Jahre nach der Entdeckung des Effektes der kernmagnetischen Resonanz erhielten FELIX BLOCH und EDWARD

MILLS PURCELL 1952 den Nobelpreis für Physik.[365]


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Schema 3: Thermodynamisches Gleichgewicht zwischen D-Fructose 1a und D-Glucose 2a sowie D-Mannose 2b, D-Psicose 1d und den Ketosen 3a und 3b über die jeweils tautomeren 1,2- und 2,3-Endiole.

Diese Strukturen stehen mit 1a jeweils im schnellen chemischen Gleichgewicht,7 weshalb

eine Trennung der Verbindungen streng genommen nur am absoluten Nullpunkt möglich wäre.

Folglich handelt es sich bei den Endiolen von 1a weiterhin um D-Fructose. Die Rückbildung der

Carbonylfunktion des 2,3-Endiols am C-2 kann jedoch auch zur Epimerisierung von 1a zu 1d führen.

Der bestehenden Argumentationskette folgend, handelt es sich demnach beim 2,3-Endiol sowohl um

ein Tautomer von 1a als auch um eines von 1d. D-Fructose und D-Psicose lagern sich bei

Raumtemperatur jedoch nur sehr langsam ineinander um, sodass sie mit chromatographischen

Methoden trennbar und in Reinform isolierbar sind. Man spricht daher allgemein von Isomeren. Die

Rückbildung der Carbonylfunktion kann nicht nur am C-2 erfolgen, sondern gleichermaßen am C-1 (bei

1,2-Enolisierung) bzw. am C-3 (bei 2,3-Enolisierung). D-Fructose 1a teilt sich damit ebenso ein

Tautomer mit D-Glucose 2a und D-Mannose 2b wie mit den Ketosen 3a und 3b. Obwohl es sich, der

Argumentation von CONRAD LAAR (1885) folgend, sowohl bei der Anomerisierung sowie deren

Elementarschritten – Ringöffnung und Ringschluss – als auch bei der Enolisierung um Formen der

Tautomerie handelt, müssen diese im Sinne der hier vorliegenden Arbeit streng unterschieden

werden, da die Enolisierung als Auftaktprozess für eine stoffliche Veränderung und damit streng

genommen für eine chemische Reaktion verstanden werden muss.

7 Dieser Prozess gehorcht damit der 1880 von EMIL ERLENMEYER formulierten Gesetzmäßigkeit der Instabilität von

Enolen, die je nach vorliegender Struktur „im Momente ihres Entstehens in Aldehyde umlagern“ bzw. „in Ketone

übergehen“.[366] Diese Gesetzmäßigkeit wird heute als ERLENMEYER-Regel bezeichnet.


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2.1.2 Die Aminokomponenten

Zur Untersuchung des Reaktionsverhaltens der D-Fructose 1a im Sinne der Karamellisierung im

Vergleich zu ihrer Reaktivität in MAILLARD-Systemen ist die Auswahl der Aminokomponenten von

entscheidender Bedeutung.[82] Um Gesetzmäßigkeiten des Einflusses der Aminokomponente auf das

Reaktionsverhalten der D-Fructose ableiten zu können, ist es wichtig, chemisch ähnliche Verbindungen

zu untersuchen, die sich etwa strukturell geringfügig voneinander unterscheiden, wie es bei

Homologen der Fall ist. Da aliphatische Aminosäuren von allen niedermolekularen

Stickstoffverbindungen die häufigste Gruppe in Lebensmitteln sind, wurden für diese Arbeit zunächst

L-Alanin 4a und L-Prolin 4b als Reaktionspartner für D-Fructose ausgewählt. Darüber hinaus wurde auch

das Reaktionsverhalten der homologen ω-Aminosäuren Glycin 4c, β-Alanin 4d und

γ-Aminobuttersäure 4e untersucht. Bei den Aminokomponenten (vgl. Schema 4) handelt es sich damit

um aliphatische primäre und sekundäre α- und ω-Aminosäuren, wobei Glycin sowohl in die Gruppe

der α- als auch der ω-Aminosäuren zu zählen ist.

Schema 4: Strukturen der eingesetzten Aminokomponenten L-Alanin 4a, L-Prolin 4b, Glycin 4c, β-Alanin 4d und γ-Aminobuttersäure 4e.

2.1.3 AMADORI- und HEYNS-Verbindungen

Die Kaskade der MAILLARD-Reaktion wurde von JOHN E. HODGE 1953 in eine initiale, eine

intermediäre und eine finale Phase unterteilt.[4] Die initiale Phase beschreibt dabei die

Kondensationsreaktion eines Zuckers mit einer Aminokomponente. Die intermediäre Phase fasst die

Reaktionen zusammen, die zu einem Abbau der Produkte der initialen Phase führen. Die finale Phase

beschreibt schließlich die Bildung stabiler hochmolekularer braun gefärbter Produkte, den

Melanoidinen, aus den Produkten der intermediären Phase. Bei den Abbauprodukten der intermediär

gebildeten Substanzen handelt es sich um Verbindungen, die sich gegenüber ihren Edukten durch eine

erhöhte Reaktivität auszeichnen.[83] Es ist daher davon auszugehen, dass die initialen und

intermediären Schritte der Reaktionskaskade geschwindigkeitsbestimmend für den Verlauf der nicht

enzymatischen Bräunung im Sinne der MAILLARD-Reaktion sind. Demzufolge sollte eine Einflussnahme

auf die Bräunungskinetik durch die Katalyse der ersten und zweiten Phase der MAILLARD-Reaktion

möglich sein. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich aufgrund dessen auf die Behandlung der initialen

und intermediären Phase.

2.1.3.1 AMADORI- und HEYNS-CARSON-Umlagerung

Der Begriff der AMADORI-Verbindungen umfasst die Gruppe der (N-substituierten)

1-Desoxy-1-aminoketosen, die sich in der initialen Phase der MAILLARD-Reaktion durch die

Kondensation von reduzierenden Zuckern mit Aminokomponenten bilden. Der Begriff geht zurück auf

mehrere Publikationen des italienischen Pharmazeuten und Chemikers MARIO AMADORI aus den Jahren

1925-1931,[84-86] in denen er unter anderem die Kondensationsreaktion von D-Glucose mit

para-Toluidin und para-Phenitidin beschreibt. Darin diskutiert er die Bildung von „labilen“


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N-Glucosylaminen und deren hitzeinduzierten Umsatz zu „stabilen“ SCHIFF-Basen. Weiterführende

Untersuchungen von KUHN und DANSI (1936)[87] zeigten jedoch, dass die Hydrierung der mutmaßlichen

SCHIFF-Base nicht zum entsprechenden N-substituierten Glucamin führt, sodass es sich tatsächlich nicht

um die postulierte SCHIFF-Base handeln konnte. KUHN und WEYGAND (1937) formulierten schließlich die

Bildung der N-substituierten 1-Desoxy-1-aminoketose (Isoglucosaminderivate) über die Tautomerie

des N-Glycosylamins und prägten den Begriff der AMADORI-Umlagerung.8;[88] Die so getroffene

Zuordnung des „stabilen“ Isomers des N-Glycosylamins bestätigte sich in vielen weiteren

Untersuchungen.[89-91] Da sich die hier vorliegende Arbeit mit der Bildung und dem Verhalten von

AMADORI-Verbindungen in Lebensmittelsystemen befasst, sei für die Diskussion der in der Literatur

beschriebenen Synthesestrategien auf die entsprechenden Artikel verwiesen.[92-94] Die

mechanistischen Modellvorstellungen der ungerichteten Synthese, wie sie in einfachen

MAILLARD-Reaktionssystemen abläuft, seien im Folgenden am Beispiel der D-Glucose 2a demonstriert.

D-Glucose 2a liegt in wässriger Lösung im thermodynamischen Gleichgewicht – ebenso wie

D-Fructose – als Gemisch mehrerer Anomere vor. Hierbei entfallen bei 30 °C in wässriger Lösung ca.

99.6% der relativen Anomerenkonzentration auf die pyranoiden Anomere.[95] Die folgenden

Mechanismen (Schema 5: Weg a) und Weg b)) werden aufgrund dessen am Beispiel der

Hauptanomere 4C1-α- und -β-D-Glucopyranose vorgestellt. Im ersten Reaktionsschritt kommt es zur

Bildung des „labilen“ N-Glucosylamins 5a.

Schema 5: Möglichkeiten der Bildung eines N-substituierten Glucosylamins 5a sowie der korrespon-dierenden ringoffenen protonierten SCHIFF-Base 5b aus D-Glucose 2a und einer Aminokomponente im sauren pH-Bereich. a) Protonierung des Lactolrings. b) Protonierung der anomeren OH-Funktion.

8 Isoglucosamin wurde als einfachste AMADORI-Verbindung bereits im Geburtsjahr von MARIO AMADORI 1886

erstmals von EMIL FISCHER beschrieben. Die Darstellung erfolgte hierbei jedoch über die Reduktion von

Phenylglucosazon und nicht über die erst 1937 beschriebene AMADORI-Umlagerung.[367]


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Dabei greift der unprotonierte Aminostickstoff nucleophil am C-1 Atom der D-Glucose an.

Diesbezüglich werden zwei grundsätzliche Reaktionsmechanismen voneinander unterschieden (Weg

a) und b) in Schema 5), die beide einen sauren pH-Wert erfordern. Liegt die 4C1-β-D-Glucopyranose im

sauren Milieu vor, so besteht neben der Protonierung des Lactolrings (Weg a)) auch die Möglichkeit

der Protonierung der anomeren Hydroxylfunktion (Weg b)). Dabei führt die Protonierung des

Lactolsauerstoffes zu einer Spaltung des Halbacetals durch Ringöffnung. Die Protonierung der

anomeren Hydroxylfunktion erzeugt Wasser als gute Abgangsgruppe, wobei das zurückbleibende

Carbeniumion durch die Nachbarschaft zum Ringsauerstoff resonanzstabilisiert ist (vgl. Schema 5).

Anschließend greift der elektroneutrale Stickstoff nucleophil am Carbeniumion an und bildet nach

etwaiger Abspaltung eines Moleküls Wasser das N-substituierte Glucosylamin 5a.[82] Weg a) ist dabei

äquivalent zum Mechanismus, der zur Bildung des gem-Diols der D-Glucose führt. Aus den gezeigten

Reaktionsmechanismen wird der Einfluss des pH-Wertes auf die MAILLARD-Reaktion deutlich. Da der

Zucker protoniert vorliegt, während die basische Aminofunktion elektroneutral ist, kann gefolgert

werden, dass die in Schema 5 gezeigten Mechanismen ein pH-Optimum besitzen müssen. Da die

Bildung des gem-Diols der D-Glucose jedoch nicht nur im Sauren, sondern ebenso im Basischen

erfolgen kann,[96] ist auch hier ein äquivalenter Mechanismus für die Bildung der SCHIFF-Base 5b

denkbar. Dieser geht vom acyclischen Zentralisomer der D-Glucose 2a aus (vgl. Schema 6). Die Bildung

des in den Schemata 5 und 6 gezeigten geminalen Aminols 5c steht demnach in Konkurrenz zur Bildung

des gem-Diols der D-Glucose 2a.

Schema 6: Bildung einer SCHIFF-Base 5b aus D-Glucose 2a und einer Aminokomponente über das gem-Aminol 5c im basischen pH-Bereich. Der gezeigte Mechanismus entspricht dem der Bildung des gem-Diols der D-Glucose 2a aus ihrem acyclischen Zentralisomer.

Alternativ zu den bereits gezeigten Mechanismen wird im Falle von Reaktionen mit

Aminosäuren die Möglichkeit eines konzertierten Mechanismus‘ zur Bildung von 5a diskutiert (vgl.

Schema 7).[82] Auch in diesem Reaktionsschema wird die pH-Abhängigkeit der initialen

MAILLARD-Reaktion deutlich sichtbar, da der Mechanismus von einer ungeladenen Aminosäurespezies

ausgeht, deren relative Konzentration ihr Maximum am isoelektrischen Punkt der Aminosäure zeigt.


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Schema 7: Konzertierter Mechanismus zur Bildung eines N-substituierten Glucosylamins 5a sowie der

korrespondierenden ringoffenen protonierten SCHIFF-Base 5b aus D-Glucose 2a und einer Aminosäure.

(Frei nach[82])

Zusammenfassend ist die Bildung des N-substituierten Glucosylamins 5a sowie der

korrespondierenden ringoffenen protonierten SCHIFF-Base 5b nur in pH-Bereichen möglich, in denen

die Aminofunktion der reagierenden Aminokomponente nicht protoniert vorliegt. Entsprechend ist

davon auszugehen, dass eine Bildung von 5a und 5b vornehmlich im Basischen stattfindet.

Die eigentliche AMADORI-Umlagerung erfolgt ausgehend von der ringoffenen SCHIFF-Base 5b

durch eine Imin-Enaminol-Aminoketon-Tautomerie hin zur 1-Desoxy-1-aminoketose 6, der

AMADORI-Verbindung.[83,88] Es lassen sich jedoch ebenso Mechanismen formulieren, die direkt vom

N-substituierten Glucosylamin 5a ausgehen (vgl. Schema 8).[97]

Schema 8: Mechanismus der AMADORI-Umlagerung I. (Frei nach[83,88,97])

Im Verlauf dieser Tautomerisierung muss die C-H-Bindung am C-2 gebrochen werden. Dies

kann zum einen – wie von MARIO AMADORI (s.o.) beobachtet – hitzeinduziert erfolgen. Zum anderen ist

eine Steigerung des Dissoziationsbestrebens der Bindung durch die Erhöhung des pH-Wertes in den

basischen Bereich möglich.[98] Schließlich kann die Umlagerung durch Anwesenheit von LEWIS-Säuren,

Mineralsäuren, Carbonsäuren sowie tertiären Aminen katalysiert werden.[90,99-102] Aufgrund dessen

verläuft die AMADORI-Umlagerung mit Aminosäuren autokatalytisch. Alternativ zu den hier gezeigten

weitestgehend akzeptierten Mechanismen der AMADORI-Umlagerung publizierten MICHEEL und DIJONG

(1962) die Möglichkeit eines erneuten nucleophilen Angriffs einer Aminokomponente am


- 12 -

Iminokohlenstoff von 5b. Nach anschließender Eliminierung einer Aminokomponente kommt es zur

Ausbildung eines Carbeniumions am C-1. Ein (formaler) Hydridshift vom C-2 zum C-1 und die

Rückbildung der Carbonylfunktion ergeben schließlich 6 (vgl. Schema 9).[103]

Schema 9: Mechanismus der AMADORI-Umlagerung II.[103]

Dieser Mechanismus ist jedoch insofern nicht schlüssig, als es sich bei der Zwischenstufe, die

ein Carbeniumion am C-1 trägt, ohnehin um eine mesomere Grenzform von 5b handelt. Die

Notwendigkeit einer Reaktion mit einer zweiten Aminokomponente ist damit nicht gegeben.

Verbindung 6 unterscheidet sich von 1a lediglich durch den Substituenten am C-1, sodass es

sich bei AMADORI-Verbindungen der D-Glucose 2a (bzw. D-Mannose 2b) um Derivate der D-Fructose 1a

handelt. Analog resultieren aus der Kondensation von D-Fructose 1a mit Aminokomponenten Derivate

der D-Glucose 2a und D-Mannose 2b. Diese werden nach ihrem Entdecker KURT HEYNS zumeist als

HEYNS-Verbindungen 7 bezeichnet.[104-111] Etwa zeitgleich wurden analoge Verbindungen auch von JOHN

F. CARSON beschrieben,[112,113] sodass auch der Begriff der HEYNS-CARSON-Umlagerung für den

entsprechenden Bildungsmechanismus in der Fachliteratur verbreitet ist.[114] Die Kondensation von

D-Fructose mit einer Aminokomponente führt formal betrachtet nicht nur zur

2-Desoxy-2-aminoaldose, sondern erlaubt ebenfalls die Formulierung von

2-Desoxy-2-amino-3-ketosen, die als alternative AMADORI-Verbindungen zu verstehen sind. Hinweise

auf deren Existenz liefern bspw. die Beobachtungen von SUÁREZ et al. (1989).[115]

Bei der Synthese von HEYNS-Verbindungen wurde schon früh erkannt, dass neben den

erwarteten 2-Desoxy-2-aminoaldosen auch 1-Desoxy-1-aminoketosen, d.h. AMADORI-Verbindungen,

als Nebenprodukte anfallen.[109-111] Spätere Arbeiten zeigen, dass diese aus der Reaktion von

HEYNS-Verbindungen mit Aminokomponenten hervorgehen.[116] Dabei kondensiert die

HEYNS-Verbindung 7 zunächst mit der Aminokomponente zu einer SCHIFF-Base.[112] Diese tautomerisiert

im Sinne einer LOBRY-DE-BRUYN-ALBERDA-VAN-EKENSTEIN-Umlagerung[117] und bildet nach hydrolytischer

Spaltung des Imins am C-1 die korrespondierende AMADORI-Verbindung 6 (vgl. Schema 10).


- 13 -

Schema 10: Bildung von AMADORI- 6 ausgehend von HEYNS-Verbindungen 7.

AMADORI-Verbindungen primärer Amine sind ihrerseits als sekundäre Amine zu verstehen,

sodass diese als Nucleophile mit einem weiteren Molekül eines reduzierenden Zuckers reagieren

können. Es findet dabei nach erfolgter Kondensation wiederum eine AMADORI-Umlagerung statt, wobei

im Falle der sukzessiven Reaktion zweier Moleküle D-Glucose mit einem primären Amin ein

N,N-Difructosylamin 8 resultiert (vgl. Schema 11). Dieses kristallisiert in Form eines

Morpholinderivates, welches auch als Hauptisomer in wässriger Lösung vorliegt.[118-120]

Schema 11: Bildung eines N,N-Difructosylamins 8 aus der Kondensation einer AMADORI-Verbindung 6 mit D-Glucose 2a. (Frei nach[119,121])

2.1.3.2 STRUKTUREN UND DYNAMIK DER AMADORI-VERBINDUNGEN

AMADORI-Verbindungen kristallisieren in Form ihres 2C5-β-pyranoiden Anomers 6(ii).[122-125] In

wässriger Lösung bilden sie – ebenso wie D-Fructose 1a – verschiedene Halbketale, sodass es zur

Ausbildung eines entsprechenden Anomerensystems kommt. Dabei konnten erwartungsgemäß je

zwei pyranoide 6(i)/6(ii) und furanoide Anomere 6(iii)/6(iv) sowie zum Teil auch ein nicht

hydratisiertes acyclisches 6(v),9 jedoch kein hydratisiertes acyclisches Isomer 6(vi) identifiziert

werden.[126-129] Lediglich in einer Publikation werden hohe Gehalte (rund 10%) des gem-Diols 6(vi) in

wasserfreiem DMSO beschrieben.[130] Diese Ergebnisse beruhen jedoch mutmaßlich auf

fehlinterpretierten NMR-Spektren, wobei es zu einer Verwechslung mit dem α-pyranoiden Anomer

6(i) gekommen sein muss. Das gem-Diol 6(vi) steht, sofern es tatsächlich vorliegt, immer mit seinem

nicht hydratisierten Äquivalent 6(v) im Gleichgewicht. In einem wasserfreien organischen

9 Die Beschreibung des Isomers 6(v) in der Publikation von LI et al. (2014) ist als fehlerhaft zu betrachten, da dem

Carbonylkohlenstoffatom ein Signal mit einer chemischen Verschiebung von 175 ppm zugeordnet wurde. Hierbei

handelt es sich jedoch zweifelsfrei um das Signal eines Carboxylkohlenstoffatoms.[368]


- 14 -

Lösungsmittel bedeutet dies, dass es ein Molekül Wasser eliminiert. Durch den resultierenden

Verdünnungseffekt des Wassers im organischen Lösungsmittel ist eine Rückreaktion statistisch

ausgeschlossen, sodass die Konzentration des gem-Diols 6(vi) gegen null konvergiert. Damit muss die

Konzentration von 6(v) in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel zwangsläufig größer sein als

die von 6(vi). Da kein Hinweis auf ein acyclisches nicht hydratisiertes Isomer 6(v) beschrieben wurde,

muss es sich um das α-pyranoide Anomer 6(i) handeln. Abgesehen davon ist die Existenz von 6(vi)

durch seine chemische Ähnlichkeit mit einfachen Monosacchariden prinzipiell wahrscheinlich. Da die

Neigung von Ketonen, Hydrate zu bilden, allerdings nur schwach ausgeprägt ist,[131] konnten gem-Diole

von Derivaten der D-Fructose bislang noch nicht direkt nachgewiesen werden.[126,127,132,133] Analog der

D-Fructose wurde die Existenz des Isomers 6(vi) jedoch bereits über die Beobachtung eines 16O/18O-Austauschs des Carbonyl- bzw. des jeweils anomeren Hydroxylsauerstoffatoms in H2

18O

indirekt belegt.[134]

Ähnlich wie bei D-Fructose 1a ist die Diskussion über die Konformation des α-pyranoiden

Anomers noch nicht abgeschlossen. In entsprechenden Publikationen wird die α-Pyranose lediglich

identifiziert, ihre Konformation jedoch nicht diskutiert. Einige Autoren beschreiben sie dabei als 5C2-Konformer 6(i‘),[127,135] andere als 2C5-Konformer 6(i‘‘)[136] und wieder andere stellen beide als

mögliche Konformere dar.[126,128] Darüber hinaus wird in einigen Publikationen der indirekte Nachweis

eines tautomeren 1,2-Enaminols der AMADORI-Verbindungen 6(vii) beschrieben. Der Nachweis besteht

in der Beobachtung der zeitabhängigen Abnahme der Signalintensität der Resonanzen der Protonen

am C-1, die in protischen deuterierten Lösungsmitteln wie Deuteriumoxid einem H/D-Austausch

unterliegen.[126,127] Der H/D-Austausch führt dabei zu einer schwachen lokalen Veränderung der

magnetischen Abschirmung benachbarter Kohlenstoffatome, woraus im Falle der

AMADORI-Verbindungen eine Hochfeldverschiebung der anomeren 13C-NMR-Resonanzen resultiert.[119]

Die Existenz des tautomeren 2,3-Endiols konnte auf diese Weise nicht nachgewiesen werden.[119]

Gleiches zeigen die Ergebnisse von SIMON und HEUBACH (1965), die den H/T-Austausch einer

AMADORI-Verbindung am C-1 und C-3 anhand von Radioaktivitätsmessungen untersuchten.[137] Sie

kommen dabei zu dem Schluss, dass die Enolisierung am C-1 rasch und reversibel ist, während sie sich

am C-3 irreversibel zeigt und zum Abbau der AMADORI-Verbindung durch die Eliminierung des

Aminosubstituenten führt.[137,138] Unter Berücksichtigung aller bisherigen Erkenntnisse zur Struktur der

AMADORI-Verbindungen ergibt sich für wässrige Lösungen in Analogie zu Schema 2 das in Schema 12

gezeigte Tautomerensystem.

Die relativen Konzentrationen der verschiedenen Tautomere sind vergleichbar mit denen der

D-Fructose. 6(ii) bildet mit rund 64-69% das Hauptanomer in wässriger Lösung, gefolgt von 6(iii) und

6(iv) mit je 12-15% und 6(i) mit ca. 5-6%. 6(v) liegt als Minorkomponente zu rund 1-2% vor.[119,127] Der

Einfluss der Stereokonfiguration des Kohlenstoffgerüstes auf die Isomerenverteilung wurde bisher

nicht systematisch untersucht, da AMADORI-Verbindungen zumeist nur auf Basis von D-Glucose 2a

strukturell aufgeklärt sind.[126,127,130,132,133] Lediglich HORVAT et al. (1998) beschreiben die Synthese einer

D-Galactose-basierten AMADORI-Verbindung, bei der es sich folglich um ein Derivat der D-Tagatose 1b

handelt. Dabei wurde die α-Pyranose analog zur D-Tagatose 1b als Hauptanomer identifiziert.[37,139,140]

Es zeigte sich weiterhin sowohl an Kondensationsprodukten aromatischer Amine sowie proteinogener

Aminosäuren mit D-Glucose, dass die Aminokomponente das thermodynamische Gleichgewicht der

Anomere nur marginal beeinflusst.[127,135] Sie stabilisiert die Anomere jedoch durch Ausbildung von

Wasserstoffbrücken zur anomeren Hydroxylfunktion (bei Furanosen) bzw. zur Hydroxylfunktion am

C-3 (bei Pyranosen).[94] Entsprechende Wasserstoffbrücken können über Röntgenstrukturanalysen


- 15 -

auch für kristalline AMADORI-Verbindungen nachgewiesen werden.[122-125] Weiterhin zeigen

Untersuchungen an Kondensationsprodukten von Polypeptiden mit D-Glucose, dass die Kettenlänge

des Peptids einen Einfluss auf das Konzentrationsverhältnis von Pyranosen zu Furanosen hat.[130]

Zusätzlich beschreiben ALTENA et al. (1981) eine pH-abhängige Änderung der relativen

Anomerenverteilungen,[126] die in den Arbeiten anderer Forschungsgruppen jedoch nicht gefunden

wurde.[127] Darüber hinaus wurden Signalintensitätsänderungen einzelner AMADORI-Anomere nicht

biologischer Amine in Abhängigkeit der Temperatur registriert.[135] Da diese Beobachtungen bisher

nicht systematisch untersucht wurden, liegen bis heute keine Ergebnisse zu den thermodynamischen

Eigenschaften der Anomerensysteme von AMADORI-Verbindungen vor.

Schema 12: Tautomerensystem D-Fructose-analoger AMADORI-Verbindungen 6 in wässriger Lösung. *Relative Konzentration bei 20-30 °C.[119,127]


- 16 -

NMR-Untersuchungen an AMADORI-Verbindungen 6 der D-Glucose 2a zeigen im alkalischen

Milieu eine zunehmende Linienverbreiterung für die Protonenresonanzen der furanoiden Anomere,

die auf eine pH-abhängige Beschleunigung der Mutarotation hinweist. Eine solche beschleunigte

Mutarotation konnte bislang jedoch lediglich unter der Einwirkung von Basen, nicht aber in dem für

die MAILLARD-Reaktion typischen sauren Milieu beobachtet werden.[127] Vielmehr wird die

Äquilibrierung der Anomerensysteme zweier AMADORI-Verbindungen in einer Publikation von DE GRACIA

GARCÍA MARTÍN et al. (1990) als ein langsamer Prozess beschrieben, der erst nach vier Tagen

abgeschlossen ist.10;[141] Eine systematische Untersuchung der Anomerisierung von

AMADORI-Verbindungen ist in der Literatur bislang nicht beschrieben.

2.1.4 REAKTIONEN VON DERIVATEN DER D-FRUCTOSE

Untersuchungen verschiedener MAILLARD-Reaktionssysteme haben gezeigt, dass die

Bräunungskinetik von AMADORI-Verbindungen 6 schneller ist als die entsprechender

HEYNS-Verbindungen 7.[142,143] Gleichermaßen ist – wie auch schon in Kapitel 2.1 beschrieben –

D-Fructose 1a in wässrigen Systemen reaktiver als D-Glucose 2a. Dies ist nicht nur am Beispiel der

Glycosylierung von Proteinen in physiologischen Systemen feststellbar, sondern zeigt sich auch anhand

ihrer jeweiligen Abbaukinetiken in MAILLARD-Modellreaktionen.[144,145] N,N-Difructosylaminoderivate 8

zeigen schließlich im Vergleich zu allen bisher genannten Verbindungen die größte Reaktivität[121] und

folglich auch die höchsten Bräunungsraten.[146]

Da weder reduzierende Zucker noch Aminosäuren und AMADORI- bzw. HEYNS-Verbindungen Strahlung

im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums absorbieren, muss jegliche Art von

Bräunung aus Reaktionen der verschiedenen Zuckerderivate resultieren. Im Folgenden sollen die

Hauptabbauwege von Derivaten der D-Fructose erörtert werden. Diese stellen sowohl Reaktionen im

Sinne der intermediären Phase der MAILLARD-Reaktion als auch im Sinne der Karamellisierung dar. Wie

bereits in Kapitel 2.1.1.2 beschrieben, ist die Enolisierung nicht nur als Form der Tautomerie, sondern

gleichermaßen als Auftaktprozess für Abbaureaktionen anzusehen. Dies zeigt sich eindrucksvoll in der

in Kapitel 2.1.3.2 beschriebenen Beobachtung der irreversiblen 2,3-Enolisierung von

AMADORI-Verbindungen von SIMON und HEUBACH (1965), die durch eliminative Abspaltung der

Aminokomponente zur Bildung von 1-Desoxy-D-erythro-hexos-2,3-diulose (1-Desoxyglucoson) 9a

führt.11;[137,147,148] Trotz ihres reversiblen Charakters kann jedoch auch die 1,2-Enolisierung in

Abbaureaktionen münden. Hierbei kann es zum einen zur vinylogen β-Eliminierung von Wasser

kommen, woraufhin das intermediäre Imin zur 3-Desoxy-D-erythro-hexos-2-ulose (3-Desoxyglucoson)

9b hydrolysiert wird.[147,149] Dabei wird auch die Bildung der epimeren 3-Desoxy-D-threo-hexos-2-ulose

(3-Desoxygalactoson) 9c beobachtet.[150-153] Der Mechanismus zu deren Bildung geht von 9b aus, das

zunächst ein Molekül Wasser eliminiert und es anschließend unter Konfigurationsumkehr wieder

10 Die Aminosubstituenten der untersuchten AMADORI-Verbindungen tragen hierbei keine Carboxylfunktion.

11 Prinzipiell kann eine β-Eliminierung des 2,3-Endiols eines geeigneten Derivates der D-Fructose auch in Richtung

des C-4 erfolgen, wobei es zur Bildung von 4-Desoxy-2,3-hexosdiulose[181] bzw.

1-Amino-1,4-didesoxy-2,3-hexosdiulose[185] (4-Desoxyglucoson) kommt. Dies ist insbesondere dann zu

beobachten, wenn am C-4 eine glycosidische Bindung vorliegt, sodass im Zuge der β-Eliminierung ein Zucker

abgespalten wird.[369] Im Falle D-Fructose-analoger AMADORI-Verbindungen 6 handelt es sich jedoch bei der

Aminofunktion am C-1 um die beste Abgangsgruppe, sodass lediglich die Bildung von 1-Desoxyglucoson 9a

quantitativ bedeutsam ist.


- 17 -

anlagert.[151-153] Zum anderen kann das 1,2-enolisierte Tautomer auch einem schrittweise oxidativen

Abbau unterliegen, wobei nach Hydrolyse D-arabino-Hexos-2-ulose (D-Glucoson) 9d freigesetzt

wird.[154,155] Schließlich kann theoretisch auch eine retro-AMADORI-Umlagerung mit anschließender

hydrolytischer Spaltung zur Freisetzung der korrespondierenden Aldose sowie des

Aminosubstituenten führen.12 Alle genannten Reaktionswege führen damit zur Freisetzung des

unveränderten Aminosubstituenten, der damit definitionsgemäß die Funktion eines Katalysators

einnimmt (vgl. Schema 13).[83,94]

Schema 13: Bildungswege der α-Dicarbonylverbindungen 9a-9d ausgehend von einer AMADORI-Verbindung 6.

Die α-Dicarbonylverbindungen bzw. (Desoxy-) Osone 9a-9d zeichnen sich durch eine

gegenüber reduzierenden Zuckern erhöhte Reaktivität aus.[83] Außerdem bilden sie aufgrund ihrer

zusätzlichen Carbonylfunktion zum Teil außerordentlich komplexe Anomerensysteme.[156-160] (Desoxy-)

Osone werden vorwiegend über retro-Aldolreaktionen, oxidative α-Dicarbonylspaltung, hydrolytische

12 Dieser Reaktionsweg spielt in der Realität allerdings keine Rolle.[108,111]


- 18 -

β-Dicarbonylspaltung sowie amininduzierte β-Dicarbonylspaltung abgebaut.[161] Sie gehen jedoch auch

Benzilsäure-Umlagerungen sowie STRECKER-Abbaureaktionen ein.[162,163] Im Zuge dieser Reaktionen

entstehen unter anderem Aldosen sowie α-Dicarbonylverbindungen mit verkürzter Kohlenstoffkette,

Aminozucker, Aldehyde und organische Säuren. Bei einer Vielzahl dieser intermediär gebildeten

Produkte des Zuckerabbaus handelt es sich um reaktive Moleküle. Diese kondensieren im Zuge der

finalen Phase der MAILLARD-Reaktion zu höhermolekularen chromophoren Verbindungen, die zunächst

als Huminstoffe verstanden,[164] später jedoch unter dem Begriff der Melanoidine zusammengefasst

wurden.[165] Aufgrund ihrer braunen Färbung lässt sich der Fortschritt der späten Phase der

MAILLARD-Reaktion durch photometrische Messungen verfolgen.[5,166-169] Dabei wird die Bräunung

zumeist als Extinktion bei einer Wellenlänge von 420 nm angegeben.

Neben den genannten Spaltungs- und Umlagerungsreaktionen können die cyclischen Anomere

von (Desoxy-) Osonen unter Hitzeeinwirkung auch Wasser eliminieren und ggf. aromatisiert werden.

Dabei wird 9a unter anderem zu Dihydrohydroxymaltol (DHHM) 10, Acetylformoin 11 und Isomaltol

12 umgesetzt (vgl. Schema 14).13;[170,171]

Schema 14: Mechanismen der Bildung von Dihydrohydroxymaltol (DHHM) 10, Acetylformoin 11 und

Isomaltol 12 aus den Anomeren des 1-Desoxyglucosons 9a.

Dagegen bildet sich aus 9b insbesondere 5-Hydroxymethylfurfural (HMF) 13. Der in der

Literatur weitverbreitetste Reaktionsmechanismus geht von der Enolisierung von 9b mit

anschließender vinyloger β-Eliminierung von Wasser aus. Nach Cyclisierung des 3,4-ungesättigten

13 Bei den in Schema 14 gezeigten Reaktionsmechanismen sind die in der Publikation von KAUFMANN et al. (2012)

als 1a, 1d, 1e, 1h und 1i bezeichneten Anomere des 1-Desoxyglucosons 9a mutmaßlich

reaktionsverantwortlich.[159] Bei den übrigen Anomeren 1b, 1c, 1f und 1g handelt es sich um die geminalen Diole

der Anomere 1a, 1d und 1h. Da eine Temperaturerhöhung zur Abspaltung von Wasser aus den gem-Diolen

führt,[159] können die in Schema 14 gezeigten Mechanismen auch ausgehend von den gem-Diolen formuliert

werden.


- 19 -

Intermediates zum Halbketal erfolgt die Aromatisierung des Heterocyclus‘ durch die wiederholte

Eliminierung eines Wassermoleküls. (vgl. Schema 15 (unterer Reaktionsweg)).[172,173] Mit Blick auf die

in Schema 14 gezeigten Reaktionsmechanismen ist jedoch anzumerken, dass mechanistisch betrachtet

oftmals keine Notwendigkeit besteht, Reaktionen ausgehend von acyclischen Isomeren zu

formulieren. Im Falle der α-Dicarbonylverbindungen 9a-9d liegen die acyclischen Isomere in derart

geringer relativer Konzentration vor, dass ihr direkter Nachweis bis heute aussteht.[156-160] Die

cyclischen Anomere der α-Dicarbonylverbindungen sind demnach die energieärmeren und damit

thermodynamisch stabileren Systeme. Es ist daher anzunehmen, dass die Aktivierungsenergien von

Reaktionen, die unmittelbar von cyclischen Anomeren ausgehen, geringer sind, als solche, die bei

einem cyclischen Anomer starten und durch Ringöffnung zunächst in ein acyclisches Isomer überführt

werden müssen. Somit erscheint es auch hier angemessen, einen alternativen Reaktionsmechanismus

zu formulieren, der von cyclischen Anomeren ausgeht. Zur Formulierung eines solchen

Reaktionsmechanismus bietet es sich an, die Anomere 5g und 5h aus der Publikation von KÖPPER und

FREIMUND (2003) zugrunde zu legen, die bei 27 °C 23% der relativen Anomerenkonzentration

ausmachen.[157] Wie seit langem bekannt, nehmen die relativen Konzentrationen furanoider Anomere

mit steigender Temperatur zu,[39,62,131,174,175] sodass die Konzentration der Anomere 5g und 5h unter

tatsächlichen Reaktionsbedingungen, d.h. unter Hitzeeinwirkung, deutlich erhöht sein muss.

Gleichzeitig ist die Eliminierung von Wasser aus dem gem-Diol bei erhöhter Temperatur – analog dem

Verhalten der Anomere des 1-Desoxyglucosons 9a – wahrscheinlich.[159] Der in Schema 15 (oberer

Reaktionsweg) gezeigte Reaktionsmechanismus basiert auf den obigen Überlegungen und ist zugleich

an den von WEENEN und TJAN (1992) formulierten Mechanismus angelehnt.[176]

Schema 15: Mechanismus der Bildung von 5-Hydroxymethylfurfural (HMF) 13 aus 3-Desoxyglucoson 9b. (Frei nach[172,173,176])

Die Bildung heterocyclischer Substanzen ist prinzipiell nicht nur ausgehend von

α-Dicarbonylverbindungen möglich. Einige solcher O-Heterocyclen wie HMF 13,[173,177,178]

2-Hydroxy- bzw. 2-Aminoacetylfuran (HAF bzw. AAF) 14 und 15, DHHM 10 und Maltol 16[179] können

sich in Abhängigkeit der zumeist sauren Reaktionsbedingungen jeweils auch direkt aus den

Hauptanomeren der D-Fructose 1a bzw. AMADORI-Verbindungen 6 bilden (vgl. Schema 17). Der bisher

diskutierte Mechanismus der Bildung von HAF 14, das als Abbauprodukt verschiedener Zucker (etwa


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D-Glucose 2a, D-Fructose 1a, D-Tagatose 1b, D-Sorbose 1c, D-Psicose 1d, Saccharose) im sauren Milieu

nachgewiesen werden kann,[180-183] geht demgegenüber vom acyclischen Zentralisomer der D-Fructose

1a(v) aus und verläuft über die intermediäre Bildung von 4-Desoxyglucoson.[181] Im Falle der Reaktion

von D-Sorbose 1c konnte wiederum eine Bildung von HAF 14 über den entsprechenden

1,4-Anhydrozucker nachgewiesen werden. Ein äquivalenter Reaktionsweg wird auch für die Reaktion

ausgehend von D-Tagatose 1b angenommen[180] und lässt sich unter anderem auch ausgehend vom

β-furanoiden Anomer der D-Fructose 1a(iv) formulieren (vgl. Schema 16). Dies wurde jedoch bislang

nicht vorgeschlagen. Auch die Bildung von Isomaltol 12 ist über eine geringfügige Modifizierung des

Mechanismus‘ möglich. Diese ist ebenfalls in Schema 16 dargestellt.

Schema 16: Mechanismen der Bildung von 2-Hydroxyacetylfuran (HAF) 14 und Isomaltol 12 aus β-D-Fructofuranose 1a(iv) im sauren Milieu. (Frei nach[180])

Die Bildung von AAF 15, das aus dem Abbau D-Fructose-analoger AMADORI-Verbindungen 6 in

wässriger Lösung hervorgeht, soll Literaturangaben zufolge über 1-Amino-1,4-didesoxy-2,3-

hexosdiulose erfolgen.[184,185] Die in Schema 17 gezeigte Bildung von AAF 15 wurde in Anlehnung an

den Bildungsmechanismus von Furfural aus para-substituierten Phenyl-β-D-xylopyranosiden von

SHAFIZADEH et al. (1972) bzw. aus Xylose von ANTAL JR. et al. (1991) formuliert.[186,187]

Furan- und Pyranderivate wie 13 und 16 zeichnen sich durch Absorptionsbanden mit hohen

Extinktionskoeffizienten im UV-Bereich des elektromagnetischen Spektrums aus.[188,189] Da sie bereits

in der intermediären Phase der MAILLARD-Reaktion gebildet werden, dient die photometrische

Messung der Extinktion bei 284 nm14 zur Verfolgung des Fortschrittes der „frühen“

MAILLARD-Reaktion.[190]

14 Absorptionsmaximum von HMF 13.[188]


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Schema 17: Mechanismen der Bildung von Dihydrohydroxymaltol (DHHM) 10, 5-Hydroxymethylfurfural (HMF) 13, 2-Aminoacetylfuran (AAF) 15 und Maltol 16 aus den cyclischen Anomeren einer AMADORI-Verbindung 6. (Frei nach[173,177-179,187])


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2.2 NMR-Spektroskopie

In diesem Abschnitt werden die für diese Arbeit relevanten Aspekte der kernmagnetischen

Resonanzspektroskopie (Nuclear Magnetic Resonance Spektroskopie; NMR-Spektroskopie)

vorgestellt. Diese unterteilen sich in Methoden der Strukturaufklärung sowie in Methoden der

Quantifizierung und der Analyse kinetischer und dynamischer Prozesse. Dabei werden die allgemeinen

physikalischen Grundlagen des Kernmagnetismus‘ sowie der kernmagnetischen Resonanz als bekannt

vorausgesetzt und es wird lediglich auf die Standardwerke der Fachliteratur verwiesen.[191,192]

2.2.1 STRUKTURAUFKLÄRUNG

Zur vollständigen Strukturaufklärung von Kohlenhydraten in kondensierter Phase stellt die

NMR-Spektroskopie die wichtigste spektroskopische Methode der chemischen Analytik dar.[193,194] Im

Laufe der vergangenen 60 Jahre wurden zahlreiche NMR-Experimente entwickelt, die durch die

Messung verschiedener spektraler Parameter Rückschlüsse auf die räumliche Anordnung von Atomen

innerhalb eines Moleküls und somit auf die geometrische Molekülstruktur zulassen.[195] Dabei zielen

moderne Forschungsansätze neben der Entwicklung immer stärkerer Kryomagnetsysteme,

empfindlicherer Kryoprobenköpfe und leistungsfähiger Shim-Systeme auf eine Vereinfachung von

NMR-Spektren durch Vergrößerung der spektralen Auflösung15;[196-201] sowie auf die Maximierung von

Signal/Rausch-Verhältnissen bei Verkürzung von Messzeiten16 ab.[202,203] Da die Vielzahl entwickelter

Pulsprogramme mit der Zeit unüberschaubar groß geworden ist, werden immer wieder Review-Artikel

publiziert, in denen die Vor- und Nachteile einzelner Sequenzen diskutiert und zweckmäßige

Empfehlungen für spezielle Fragestellungen formuliert werden.[193,194,204] Routinemäßig eingesetzte

NMR-Methoden bei der Strukturaufklärung von Kohlenhydratsystemen sind in erster Linie

eindimensionale 1H- und 13C-NMR-Experimente (1H, 13C und DEPT) sowie zweidimensional

homonuklear (COSY, TOCSY, NOESY, J-resolved) und heteronuklear korrelierte Experimente

(HSQC-TOCSY, HSQC, HMQC, HMBC).[193,194] Dabei finden im Bedarfsfall auch die eindimensionalen

„selektiv“-Varianten der zweidimensionalen NMR-Experimente Anwendung.[205-207] Die aus COSY- und

TOCSY-Experimenten resultierenden Spektren dienen der Ermittlung skalarer

Nachbarschaftsbeziehungen von Wasserstoffatomen und damit zur Identifizierung von

Spinsystemen.[208-210] Im Bereich der chemischen Verschiebung der Resonanzen nicht anomerer

Saccharidprotonen (ca. 3.0 bis 4.2 ppm) zeigen sich in homonuklear-korrelierten 2D-Spektren jedoch

zumeist starke Signalüberlagerungen.[194] Eine erheblich verbesserte Auflösung in der f1-Dimension

wird aufgrund der zumeist deutlich größeren Signaldispersion von X-Kernen durch die Einbeziehung

heteronuklearer Korrelationen im Rahmen von 2D-HSQC-TOCSY-Experimenten erreicht.[211,212]

NOE-Korrelationen spiegeln die Beziehung sich räumlich nahestehender Protonen wider.17 Derartige

Korrelationen treten unter anderem bei 1,3-diaxialer Stellung von Protonen in pyranoiden

15 Die Vergrößerung der spektralen Auflösung wird unter anderem durch vieldimensionale NMR-Experimente

sowie homonukleare Entkopplungstechniken erreicht.

16 Bei der Maximierung von Signal/Rausch-Verhältnissen bei gleichzeitiger Verkürzung von Messzeiten kommt

insbesondere die Verwendung von Radiopulsen im sogenannten ERNST-Winkel zum Einsatz.[239,240]

17 Die Stärke dipolarer Wechselwirkungen, die dem NOE-Effekt zugrunde liegen, nimmt mit der sechsten Potenz

des Abstandes der Dipole ab.[191,370] NOE-Signale können aufgrund dessen für Messungen von Kernabständen in

der Größenordnung bis etwa 5 Å genutzt werden.[371-374]


- 23 -

Ringsystemen auf und dienen damit der Konformationsanalyse.[213] HSQC- sowie

HMQC-NMR-Experimente liefern Informationen über direkte Bindungen zwischen X-Kernen (zumeist 13C) und Wasserstoffatomen.[214,215] Dabei lassen sich anhand von 1J(13C,1H)-Kopplungen zusätzliche

Informationen über die Konformation von Zuckeranomeren erhalten, sofern keine 13C-Entkopplung

vorgenommen wird.[157,216-220] HMBC-Experimente wiederum geben Auskunft über 1H-13C-long-range-

Beziehungen.[221] Über entsprechende Korrelationen lässt sich zum einen die Ringgröße cyclischer

Zuckeranomere und zum anderen die Sequenz glycosidischer Bindungen in Oligosacchariden

bestimmen.[159,222] Bezüglich der Strukturaufklärung von Zuckeranomeren haben auch J-resolved-

Experimente einen großen Informationsgehalt. Hierbei werden homonukleare geminale, vicinale und

long-range Kopplungskonstanten gemessen, die Auskunft über exocyclische Torsionswinkel

geben.18;[50,51,223] Daraus lassen sich insbesondere die Konformationen pyranoider Anomere ableiten

sowie pyranoide von furanoiden und bicyclischen Anomeren unterscheiden.

2.2.2 QUANTITATIVE NMR-SPEKTROSKOPIE (QNMR)

NMR-spektroskopische Messungen erlauben nicht nur die Aufklärung geometrischer

Molekülstrukturen, sondern gleichermaßen die Untersuchung kinetischer und dynamischer

Prozesse.[224-226] Grundlage der kinetischen Verfolgung chemischer Reaktionen mittels

NMR-Spektroskopie ist die Möglichkeit der simultanen relativen und absoluten Quantifizierung

mehrerer Analyten innerhalb einer Probe.[227-230] Diese Möglichkeit ist allerdings nur unter sehr

spezifischen Randbedingungen gegeben, die aufgrund dessen möglichst exakt einzuhalten sind. Die

Fachliteratur bietet detaillierte Beschreibungen der Methodik der quantitativen

NMR-Spektroskopie,[231,232] sodass im Folgenden lediglich die für diese Arbeit kritischen Grundlagen

erörtert werden. Bei der üblicherweise genutzten Technik der Puls-FOURIER-Transform

NMR-Spektroskopie werden kurze Radiopulse in der Größenordnung von etwa 10 µs zur Anregung der

Kernspins genutzt. Das Profil der Strahlungsleistung eines solchen Rechteckpulses entspricht einer

𝑠𝑖𝑛𝑐-Funktion.19 Diese Funktion geht unmittelbar aus der FOURIER-Transformation der

Rechteckfunktion hervor und hat bei 𝑥 = 0 ein Maximum und Nullstellen bei 𝑥 = −1 (2𝑡𝑝(90°))⁄

sowie 𝑥 = +1 (2𝑡𝑝(90°))⁄ . Dabei entspricht 𝑡𝑝(90°) der Dauer des 90°-Pulses [s], sodass sich ein

spektrales Anregungsfenster von ∆𝜈 = 1 𝑡𝑝⁄ ergibt. Die Leistung eines Rechteckpulses ist innerhalb

dieses Anregungsfensters demnach nicht konstant, sondern frequenzabhängig.[233] Das hat zur Folge,

dass auch der Anregungswinkel vorhandener Kernspins von ihrer jeweiligen Resonanzfrequenz

abhängt. Eine Pulsdauer von 10 µs entspricht einer Anregungsbreite von 100 kHz. Bei einem 13C-NMR-Experiment verteilen sich die Resonanzen zumeist über einen Verschiebungsbereich von

250 ppm, was bei Messungen an einem 600 MHz-NMR-Spektrometer einem Frequenzfenster von

37.5 kHz gleichkommt. Die Anregungsbreite entspricht damit nur dem rund 2.67-fachen der zu

erwartenden Signaldispersion. 13C-Kerne mit großer Differenz ihrer Resonanzfrequenz zur

Trägerfrequenz erfahren somit nicht die Leistung eines 90°-Pulses und werden entsprechend nicht

18 Zur Abschätzung exocyclischer Torsionswinkel, ausgehend von 3J(1H,1H)-Kopplungskonstanten, steht eine

Reihe von Softwaretools zur Verfügung, die auf den Publikationen von HAASNOOT et al. basieren.[50,51,375-377] Des

Weiteren existieren insbesondere für die Berechnung von Torsionswinkeln von Glycosiden,

Kohlenwasserstoffen, Peptiden und Nukleotiden online-Datenbanken, die auf optimierten KARPLUS-Funktionen

zahlreicher Publikationen der vergangenen vier Jahrzehnte basieren.[378]

19 𝑓(𝑥) = 𝑠𝑖𝑛𝑐(𝑥) =sin(𝑥)

𝑥


- 24 -

vollständig angeregt. Die Integrale ihrer entsprechenden Resonanzsignale können somit nicht

zwangsläufig für quantitative Fragestellungen genutzt werden. Betrachtet man jedoch lediglich die

Integrale von Resonanzen mit ähnlichen Frequenzabständen zur Trägerfrequenz, so erfahren die

entsprechenden Kernspins auch eine vergleichbare Anregung, sodass eine quantitative Auswertung

möglich ist. In Bezug auf die quantitative Auswertung von 1H-NMR-Spektren ist ein Arbeiten mit dieser

Einschränkung nicht notwendig. Hier verteilen sich die Resonanzen zumeist über einen

Verschiebungsbereich von rund 12 ppm, was bei Messungen an einem 600 MHz-NMR-Spektrometer

einem Frequenzfenster von 7.2 kHz entspricht. Bei einem Anregungsfenster von 100 kHz erfahren

demnach alle Protonenspins eine vergleichbare Anregung.

Nach erfolgtem 90°-Puls ist der z-Magnetisierungsvektor eines betrachteten Kerns vollständig

in die x,y-Ebene ausgelenkt. Dieser Prozess kehrt sich infolge der longitudinalen Relaxation

(𝑇1-Relaxation) um. Die Beschreibung der Regeneration der z-Magnetisierung in den ursprünglichen

Gleichgewichtszustand erfolgt nach der BLOCH-Gleichung (1).[234]

𝑑𝑀𝑧(𝑡)

𝑑𝑡= −

𝑀𝑧(𝑡) − 𝑀𝑧,𝑒𝑞

𝑇1(𝑖)

⇔𝑀𝑧(𝑡) = 𝑀𝑧,𝑒𝑞 − (𝑀𝑧,𝑒𝑞 −𝑀𝑧(0)) ∙ 𝑒𝑥𝑝 (−𝑡

𝑇1(𝑖)) (1)

Dabei ist 𝑀𝑧(𝑡) die z-Magnetisierung zum Zeitpunkt 𝑡, 𝑀𝑧,𝑒𝑞 die z-Magnetisierung im

Gleichgewichtszustand, 𝑀𝑧(0) die z-Magnetisierung zum Zeitpunkt 𝑡 = 0𝑠, 𝑡 die Zeit [s] und 𝑇1(𝑖)

die

longitudinale Relaxationszeit eines Isomers 𝑖 [s]. Aus Gleichung (1) geht hervor, dass sich die im

Gleichgewichtszustand bestehende z-Magnetisierung zum Zeitpunkt 𝑇1(𝑖)

nach einem 90°-Puls zu

63.2% wiederhergestellt hat.20 Von den in der x,y-Ebene verbleibenden 36.8% der

Gleichgewichtsmagnetisierung gehen innerhalb einer erneuten Wartezeit von 𝑇1(𝑖)

wiederum 63.2% in

z-Richtung über. Nach einer Wartezeit von 5 ∙ 𝑇1(𝑖) ist die ursprüngliche Gleichgewichtsmagnetisierung

auf diese Weise zu 99.3% regeneriert.21 Entsprechend diesen Berechnungen können NMR-Spektren

nur dann quantitativ ausgewertet werden, wenn Recyclingdelays von mindestens 5 ∙ 𝑇1(𝑖) eingehalten

werden. Problematisch dabei ist, dass Relaxationszeiten niemals a priori bekannt sind. Recyclingdelays

müssen daher im Sinne einer worst-case-Betrachtung großzügig abgeschätzt oder 𝑇1-Zeiten

experimentell ermittelt werden. Die experimentelle Bestimmung longitudinaler Relaxationsraten

erfolgt dabei etwa über die Progressive Saturation-Methode oder das Inversion Recovery-

Experiment.22;[235,236] Für das 13C-Isotop liegen 𝑇1-Zeiten üblicherweise im Bereich von 1-40 s.[237] Dabei

beträgt die Messempfindlichkeit des Kerns relativ zur Messempfindlichkeit des 1H-Isotops nur

0.017%.[238] Trotzdem ist die Nutzung der quantitativen 13C-NMR-Spektroskopie für diese Arbeit

20 𝑀𝑧(𝑇1) = (1 −

1

𝑒) ∙ 𝑀𝑧,𝑒𝑞 ≅ 0.632 ∙𝑀𝑧,𝑒𝑞

21 Regeneration der Gleichgewichtsmagnetisierung nach einem 90°-Puls in Abhängigkeit von Vielfachen der

𝑇1-Relaxationszeit, berechnet nach Gleichung (1):

𝑡 1 ∙ 𝑇1 2 ∙ 𝑇1 3 ∙ 𝑇1 4 ∙ 𝑇1 5 ∙ 𝑇1 6 ∙ 𝑇1 7 ∙ 𝑇1

𝑀𝑧(𝑡)/𝑀𝑧,𝑒𝑞 0.632 0.865 0.950 0.982 0.993 0.998 0.999

22 Im Falle dynamischer Anomerensysteme, wie sie im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, liefert das

Inversion Recovery Experiment lediglich effektive 𝑇1-Zeiten, die sich aus einer (teilweisen) Mittelung der

intrinsischen 𝑇1-Zeiten der im chemischen Austausch befindlichen Kerne ergeben.[379]


- 25 -

unerlässlich, da hauptsächlich Derivate der D-Fructose untersucht werden. Diese haben keine

anomeren Protonen, sodass eine Vielzahl der Messungen unter Zuhilfenahme der anomeren 13C-NMR-Resonanzen durchgeführt werden muss. Um 13C-NMR-Spektren mit ausreichendem

Signal/Rausch-Verhältnis zu erzielen, ist es je nach Probenkonzentration nötig, hunderte bis tausende

Einzelmessungen zu akkumulieren.[232] Dabei Recyclingdelays von mindestens 5 ∙ 𝑇1 einzuhalten, ist

nicht wirtschaftlich. 13C-NMR-Experimente werden aufgrund dessen üblicherweise unter nicht

quantitativen Bedingungen gemessen. Vielmehr ist man bestrebt, das Signal/Rausch-Verhältnis derart

zu optimieren, dass kurze Messzeiten resultieren. Hierbei bedient man sich einerseits des

ERNST-Winkels[239,240] und andererseits des Kern-OVERHAUSER-Effekts (NOE-Effekt).[241-244] Dieser bewirkt

Intensitätsänderungen einer Kernresonanz bei simultaner Sättigung der Resonanz eines benachbarten

Kerns. Der NOE-Effekt baut sich damit in Abhängigkeit der experimentellen Umsetzung der

Protonen-Breitbandentkopplung im Zuge von 13C-NMR-Experimenten auf. Die Aufbaurate des

NOE-Effektes entspricht dabei der inversen longitudinalen 13C-Relaxationszeit und kann damit als

vergleichsweise langsam betrachtet werden.[245] Die Protonen-Breitbandentkopplung dient damit

nicht nur dem Zweck der Vereinfachung von 13C-NMR-Spektren durch die Beseitigung von

heteronuklearen Spin-Spin-Kopplungen, sondern gleichermaßen einer Verbesserung des

Signal/Rausch-Verhältnisses. In Hinblick auf die 13C-NMR-Spektroskopie verfälscht der heteronukleare

OVERHAUSER-Effekt jedoch die quantitative Spektrenauswertung. Es ist daher notwendig, die

verschiedenen Techniken der Protonen-Breitbandentkopplung näher zu betrachten.

Wie bereits erwähnt, baut sich der NOE-Effekt mit einer der inversen 𝑇1-Zeit entsprechenden

Rate auf.[245] Die Sättigung der Protonen-Übergänge hingegen ist ein schneller Prozess, sodass die auf

der Protonenkopplung basierenden 13C-Multipletts unmittelbar nach dem Einschalten des

Entkopplerkanals kollabieren. Daraus ergeben sich drei mögliche Varianten der Protonen-

Breitbandentkopplung (vgl. Abbildung 2).

Die erste Variante (inverse-gated decoupling) besteht darin, den Entkopplerkanal

ausschließlich während der Detektion des freien Induktionsabfalls (free induction decay, FID)

einzuschalten. Das hat den Kollaps der 13C-Multipletts zur Folge, während sich der NOE-Effekt erst im

Laufe der Akquisitionszeit (Acquisition time) aufbaut und damit keinen Einfluss auf die Amplitude des

FID hat. Die Intensitäten der 13C-NMR-Resonanzen sind somit nicht vom NOE-Effekt verfälscht.

Weiterhin besteht die Möglichkeit der Protonen-Breitbandentkopplung während des

C:\Bruker\TopSpin3.5pl2\exp\stan\nmr\lists\pp\zgpg

1

ZE

D11

2

30m 10u D11 DELTA 4u 10u 100m

P1 ph1=[0,2..]

Go loop

30m

MC

MC loop

ZDH 1

PLW 12 PLW 13 PLW 12 PLW 13

C 13

C:\Bruker\TopSpin3.5pl2\exp\stan\nmr\lists\pp\zgig

1

ZE

D11

2

30m D1

P1 ph1=[0,2..]

Go loop

30m

MC

MC loop

ZDH 1

PLW 12

C 13

C:\Bruker\TopSpin3.5pl2\exp\stan\nmr\lists\pp\zggd

1

ZE

D11

2

30m 4u D1

P1 ph1=[0,2..]

Go loop

30m

MC

MC loop

ZDH 1

PLW 12

C 13

a) b) c)

Abbildung 2: Graphische Darstellung verschiedener Pulsprogramme zur Protonen-Breitbandentkopplung von 13C-NMR-Spektren.* a) inverse-gated decoupling, b) gated decoupling, c) power-gated decoupling. (Der Entkopplerkanal ist jeweils oben und der X-Kernkanal unten abgebildet.) *Die graphischen Darstellungen sind der Software Bruker TopSpin 3.5 pL 2 entlehnt.


- 26 -

Relaxationsdelays (gated decoupling).[246] Der Relaxationsdelay liegt in der Regel in der Größenordnung

der 𝑇1-Zeit, sodass sich der NOE-Effekt aufbauen kann. Wird der Entkopplerkanal nun vor Beginn der

Acquisition time ausgeschaltet, beinhalten die resultierenden Spektren durch den NOE-Effekt

intensivierte 13C-Multipletts. Die dritte Variante der Protonen-Breitbandentkopplung besteht

schließlich in einer Kombination der beiden erstgenannten Techniken (power-gated decoupling).[247]

Hieraus ergeben sich 13C-NMR-Spektren mit NOE-verstärkten Singuletts.

Die Durchführung quantitativer 13C-NMR-Experimente ist mit einem hohen Zeitaufwand

verbunden, der jedoch durch verschiedene Maßnahmen stark reduziert werden kann. Die erste

Möglichkeit besteht in der Dotierung der Proben mit paramagnetischen Relaxationsbeschleunigern23

(Paramagnetic Relaxation Enhancement).[248] Diese verkürzen die longitudinalen Relaxationszeiten der 13C-Kerne zum Teil drastisch, sodass auch die Recyclingdelays reduziert werden können. Damit können

unter Einhaltung der quantitativen Messbedingungen im selben Zeitraum mehr FIDs akkumuliert

werden, was zu einem verbesserten Signal/Rausch-Verhältnis führt. Da jedoch die transversale

Relaxationszeit (𝑇2) definitionsgemäß maximal den Wert der longitudinalen Relaxationszeit annehmen

kann, besteht die Gefahr einer Linienverbreiterung der Resonanzsignale.24;[192] Im Falle der

Untersuchung von Kohlenhydraten hat die Methode zudem den Nachteil, dass diese durch organische

Radikale oxidiert werden.[249] Außerdem gehen diverse Monosaccharide koordinative Bindungen mit

Metallionen ein, was zu einer Verschiebung ihrer Anomerengleichgewichte führt.[250,251] In diesem

Zusammenhang wurden auch Einflüsse von Metallionen auf Anomerisierungsraten festgestellt.[252-254]

Aufgrund dessen fiel im Rahmen dieser Arbeit die Wahl auf die alternative Maßnahme der selektiven

Isotopenmarkierung. Durch gezielte vollständige Substitution des 12C-Isotops durch das 13C-Isotop

erhöht sich die Empfindlichkeit gegenüber Messungen bei natürlicher Isotopenhäufigkeit um den

Faktor 90. Um mit Messungen bei natürlicher Häufigkeit dasselbe Signal/Rausch-Verhältnis zu erzielen,

müsste man das 8100-fache an Einzelmessungen akkumulieren. Mit einer angenommenen 𝑇1-Zeit von

20 s ergibt sich ein Recyclingdelay von mehr als 100 s. Um demnach bei natürlicher Häufigkeit dasselbe

Signal/Rausch-Verhältnis zu erlangen wie bei einem Single-Scan-Experiment mit einer Dauer von 100 s

bei vollständiger Isotopenmarkierung, wird eine Messzeit von rund 9.4 Tagen benötigt. Bei der

Untersuchung von Derivaten der D-Fructose bietet es sich dabei an, lediglich das jeweils anomere

Kohlenstoffatom C-2 zu markieren, da dieses im Wesentlichen für NMR-spektroskopische

Untersuchungen genutzt wird. Dies hat den Vorteil, dass es nicht zur Multiplettaufspaltung aufgrund

homonuklearer 13C-Spin-Spin-Kopplungen kommt.

2.2.3 METHODEN DER DYNAMISCHEN NMR-SPEKTROSKOPIE (DNMR)

NMR-spektroskopische Methoden erlauben – wie bereits in Kapitel 2.2.2 angedeutet – die

Untersuchung dynamischer sowie kinetischer molekularer Prozesse. Dabei bezieht sich der Begriff der

Dynamik auf Systeme, die sich im thermodynamischen Gleichgewicht befinden, sodass makroskopisch

betrachtet keine Konzentrationsänderungen einzelner Verbindungen feststellbar sind. Kinetische

Prozesse streben im Gegensatz dazu dem thermodynamischen Gleichgewicht entgegen. Der Prozess

23 Hierbei kann es sich sowohl um organische Radikale[380] als auch um paramagnetische

Übergangsmetallionen[248,381] handeln.

24 Mit den Beziehungen 𝑇1 ≥ 𝑇2 und 𝜈12⁄=

1

𝜋∙𝑇2𝑒𝑓𝑓 folgt für die Linienbreite eines NMR-Signals 𝜈1

2⁄≥

1

𝜋∙𝑇1.[192]


- 27 -

der Anomerisierung von Monosacchariden ist aufgrund dessen während der Mutarotation25 kinetisch

und nach vollständiger Anomerenäquilibrierung dynamisch. Die Untersuchung von

Anomerisierungsraten kann daher sowohl auf Grundlage kinetischer als auch dynamischer Messungen

erfolgen. Die verschiedenen Möglichkeiten werden im Folgenden am Anomerensystem der D-Fructose

1a veranschaulicht und diskutiert. Das Anomerensystem ist in Schema 18 dargestellt.

Schema 18: Anomerensystem der D-Fructose 1a. Dabei steht P für Pyranose, F für Furanose und z für das Zentralisomer.

Wie in Kapitel 2.1.1.1 beschrieben, kristallisiert D-Fructose 1a anomerenrein als β-Pyranose

(βP). Wird βP gelöst, bildet sich ein Gleichgewichtszustand mit den übrigen vier Isomeren aus. Die

zeitabhängigen Konzentrationsänderungen der Isomere berechnen sich nach den Gleichungen (2) bis

(6).

𝑑[𝑧]

𝑑𝑡= 𝑘𝛼𝑃,𝑧[𝛼𝑃] + 𝑘𝛽𝑃,𝑧[𝛽𝑃] + 𝑘𝛼𝐹,𝑧[𝛼𝐹] + 𝑘𝛽𝐹,𝑧[𝛽𝐹] − (𝑘𝑧,𝛼𝑃 + 𝑘𝑧,𝛽𝑃 + 𝑘𝑧,𝛼𝐹 + 𝑘𝑧,𝛽𝐹)[𝑧] (2)

𝑑[𝛼𝑃]

𝑑𝑡= 𝑘𝑧,𝛼𝑃[𝑧] − 𝑘𝛼𝑃,𝑧[𝛼𝑃] (3)

𝑑[𝛽𝑃]

𝑑𝑡= 𝑘𝑧,𝛽𝑃[𝑧] − 𝑘𝛽𝑃,𝑧[𝛽𝑃] (4)

𝑑[𝛼𝐹]

𝑑𝑡= 𝑘𝑧,𝛼𝐹[𝑧] − 𝑘𝛼𝐹,𝑧[𝛼𝐹] (5)

𝑑[𝛽𝐹]

𝑑𝑡= 𝑘𝑧,𝛽𝐹[𝑧] − 𝑘𝛽𝐹,𝑧[𝛽𝐹] (6)

Diese bilden ein System homogener linearer Differentialgleichungen der ersten Ordnung und

lassen sich in der Matrixschreibweise wie folgt formulieren (vgl. Gleichung (7)):

𝑑

𝑑𝑡

(

[𝑧]

[𝛼𝑃][𝛽𝑃]

[𝛼𝐹][𝛽𝐹])

=

(

−(𝑘𝑧,𝛼𝑃 + 𝑘𝑧,𝛽𝑃 + 𝑘𝑧,𝛼𝐹 + 𝑘𝑧,𝛽𝐹) 𝑘𝛼𝑃,𝑧 𝑘𝛽𝑃,𝑧 𝑘𝛼𝐹,𝑧 𝑘𝛽𝐹,𝑧

𝑘𝑧,𝛼𝑃 −𝑘𝛼𝑃,𝑧 0 0 0

𝑘𝑧,𝛽𝑃 0 −𝑘𝛽𝑃,𝑧 0 0

𝑘𝑧,𝛼𝐹 0 0 −𝑘𝛼𝐹,𝑧 0

𝑘𝑧,𝛽𝐹 0 0 0 −𝑘𝛽𝐹,𝑧)

∙

(

[𝑧]

[𝛼𝑃][𝛽𝑃]

[𝛼𝐹][𝛽𝐹])

(7)

Das Differentialgleichungssystem hat damit die Form 𝒚′ = 𝑨 ∙ 𝒚. Dieses lässt sich mit Hilfe

eines exponentiellen Ansatzes der Form 𝒚(𝑥) = 𝒅 ∙ 𝑒𝑥𝑝(𝜆 ∙ 𝑥) durch die Berechnung der Eigenwerte

25 Der Wortbedeutung nach beschreibt der Begriff der Mutarotation die zeitabhängige Änderung des

Drehwinkels einer Lösung einer optisch aktiven Substanz.


- 28 -

𝜆 der Matrix 𝑨 sowie ihrer entsprechenden Eigenvektoren 𝒅 lösen.[255] Unter der Randbedingung einer

relativen Konzentration der βP von 100% zum Zeitpunkt 𝑡 = 0𝑠 lassen sich geschlossene Ausdrücke

für die jeweiligen Konzentrationen sämtlicher Isomere in Abhängigkeit der Zeit formulieren. Im

Umkehrschluss bedeutet das, dass die Messung der zeitabhängigen Äquilibrierung des

Isomerensystems die Ermittlung sämtlicher Geschwindigkeitskonstanten der Matrix 𝑨 ermöglicht.

Diese Methode beschränkt sich damit nicht nur auf Messungen mittels quantitativer zeitabhängiger

NMR-Spektroskopie, sondern lässt sich auch mit Hilfe chromatographischer Trenntechniken umsetzen.

Hier ist insbesondere die gaschromatographische Analyse (GC) zu nennen.26;[35,55,65,256-260] Dabei haben

allerdings lediglich WERTZ et al. (1981) Berechnungen auf Grundlage von Gleichung (7)

vorgenommen.[259] Problematisch bei der GC-Analytik von Kohlenhydratisomeren ist, dass diese zur

Erhöhung ihrer Flüchtigkeit derivatisiert werden müssen. Hierbei handelt es sich unter anderem um

die Bildung ihrer per-O-Trimethylsilylether oder Essigsäureester in wasserfreien oder auch

wasserhaltigen organischen Lösungsmitteln.[261-263] Der Arbeitsaufwand derartiger Analysen ist

verglichen mit der Durchführung von NMR-Experimenten groß. Daneben ist die Derivatisierung der

anomeren Hydroxylfunktion von Ketosen ein sehr langsamer Prozess.[264-266] Die zu untersuchenden

Isomerensysteme können aufgrund dessen noch während der Derivatisierung anomerisieren.[131] Die

relativen Konzentrationen der Isomere sind somit sowohl von den jeweiligen

Derivatisierungsreagenzien sowie von deren zumeist organischen Lösungsmitteln beeinflusst, sodass

die zu messenden Zielgrößen bereits vor der Messung in einer unvorhersehbaren Weise modifiziert

werden. Demgegenüber erlauben NMR-spektroskopische Experimente die Messung von

Isomerensystemen ohne eine Verfälschung durch ungewollte Einflussfaktoren. Trotzdem ist die

beschriebene Vorgehensweise aus den folgenden Gründen für die Untersuchung der Anomerisierung

von Zuckern prinzipiell wenig geeignet. Wie in den Kapiteln 2.1.1.1 und 2.1.3.2 beschrieben, liegen im

Falle von Derivaten der D-Fructose zumindest fünf Isomere im dynamischen Gleichgewicht vor. Das

zentrale acyclische Isomer dieses Systems (1a(v) bzw. 6(v)) tritt dabei mit einer

Gleichgewichtskonzentration von rund einem Prozent in Erscheinung. Das bedeutet auf Grundlage des

Massenwirkungsgesetzes, dass die Ringschlussrate rund 100-mal größer ist als die Summe aller

Ringöffnungsraten. Weiterhin handelt es sich dabei nicht um das im kristallinen Zustand vorliegende

Isomer, sodass seine anfängliche Konzentration 0% beträgt. Da es den Knotenpunkt des

Isomerisierungsnetzwerkes darstellt, wird es zunächst aus einem großen Reservoir der βP 1a(ii) bzw.

6(ii) gebildet, woraufhin es mit dem 100-fachen seiner Bildungsrate cyclisiert. Es ist daher davon

auszugehen, dass die Gleichgewichtskonzentration des Zentralisomers schnell erreicht ist, während

absolute Konzentrationsänderungen aufgrund der geringen Gleichgewichtskonzentration kaum

messbar sind. Ohne die Möglichkeit einer genauen Messung der zeitlichen Änderung der relativen

Konzentration des Zentralisomers kann eine Berechnung der Anomerisierungsraten auf Grundlage von

Gleichung (7) keine genauen Ergebnisse liefern.27 Wie sich in Kapitel 4.2.6 zeigen wird, sind bereits bei

26 Polarimetrische Messungen bieten keine Grundlage für eine entsprechende Auswertung, da die gemessenen

Drehwinkel als Summenparameter der gewichteten spezifischen Drehwinkel aller vorhandenen Anomere

anzusehen sind. Eine Diskriminierung komplexer Anomerensysteme ist daher nicht möglich. Gleiches gilt für

enzymatische Reaktionen, bei denen anomerenspezifische Enzyme eingesetzt werden.[382] Mittels

infrarotspektroskopischer Messungen (IR) konnten die Hauptanomere der D-Glucose differenziert werden.[383] Es

ist jedoch davon auszugehen, dass diese Methode bei komplexeren Isomerensystemen versagt.

27 Berechnungen auf Grundlage von Gleichung (7) werden in Kapitel 4.2.6 im Rahmen polarimetrischer

Messungen trotzdem noch eine wichtige Rolle spielen.


- 29 -

Raumtemperatur die ersten zwei Sekunden nach dem Lösen von D-Fructose 1a für eine Berechnung

der Anomerisierungsraten essentiell. Mit steigender Temperatur verkürzt sich dieses Zeitfenster

entsprechend. Dem entgegen steht, dass eine NMR-Messung bei schneller Arbeitsweise kaum in einem

Zeitraum von weniger als einer Minute nach dem Lösen einer Substanz bewerkstelligt werden kann.

Da für jede Wiederholung eines solchen Experimentes kristalliner Analyt vorhanden sein muss, ist die

praktische Durchführbarkeit neben dem Zeitfaktor auch durch die begrenzte Verfügbarkeit von

Syntheseprodukten beschränkt. Hinzu kommt die Schwierigkeit der definierten Einstellung der

experimentellen Parameter wie dem pH-Wert und der Temperatur. Es bietet sich daher an,

Anomerisierungsraten im Sinne einer Relaxationsmethode zu messen.28 Klassische

Relaxationsmethoden basieren auf einer abrupten Störung des thermodynamischen Gleichgewichts

etwa durch sprunghafte Temperaturänderungen.[267] Die jeweilige Neueinstellung des

Gleichgewichtszustandes wird messtechnisch verfolgt. Die NMR-Spektroskopie bietet in Anlehnung

daran die einzigartige Möglichkeit, Störungen der Gleichgewichtsmagnetisierung zu erzeugen,

während sowohl das thermodynamische Anomerengleichgewicht als auch die Umgebungsparameter

wie Temperatur und pH-Wert unbeeinflusst bleiben. In Bezug auf Zuckersysteme lässt die Analyse der

zeitabhängigen Wiederherstellung des Magnetisierungsgleichgewichtes Rückschlüsse auf die

Anomerisierungsraten zu. Die Wiederherstellung des Gleichgewichtszustandes ist dabei jedoch nicht

nur von den Anomerisierungsraten, sondern gleichermaßen von den longitudinalen Relaxationszeiten

der betrachteten Kerne abhängig. Die zeitabhängige Änderung der z-Magnetisierung in Systemen mit

chemischem Austausch ist durch die von MCCONNELL (1958) erweiterten BLOCH-Gleichungen

gegeben.[69] Für das in Schema 18 gezeigte Isomerensystem ergeben sich die Gleichungen (8) bis (12).29

𝑑𝑀𝑧(𝑧)(𝑡)

𝑑𝑡= −

𝑀𝑧(𝑧)(𝑡) − 𝑀𝑧,𝑒𝑞

(𝑧)

𝑇1(𝑧)

+ 𝑘𝛼𝑃,𝑧 ∙ 𝑀𝑧(𝛼𝑃)(𝑡) + 𝑘𝛽𝑃,𝑧 ∙ 𝑀𝑧

(𝛽𝑃)(𝑡) + 𝑘𝛼𝐹,𝑧 ∙ 𝑀𝑧(𝛼𝐹)(𝑡)

+ 𝑘𝛽𝑃,𝑧 ∙ 𝑀𝑧(𝛽𝐹)(𝑡) − (𝑘𝑧,𝛼𝑃 + 𝑘𝑧,𝛽𝑃 + 𝑘𝑧,𝛼𝐹 + 𝑘𝑧,𝛽𝐹) ∙ 𝑀𝑧

(𝑧)(𝑡)

(8)

𝑑𝑀𝑧(𝛼𝑃)(𝑡)

𝑑𝑡= −

𝑀𝑧(𝛼𝑃)(𝑡) − 𝑀𝑧,𝑒𝑞

(𝛼𝑃)

𝑇1(𝛼𝑃)

+ 𝑘𝑧,𝛼𝑃 ∙ 𝑀𝑧(𝑧)(𝑡) − 𝑘𝛼𝑃,𝑧 ∙ 𝑀𝑧

(𝛼𝑃)(𝑡) (9)

𝑑𝑀𝑧(𝛽𝑃)(𝑡)

𝑑𝑡= −

𝑀𝑧(𝛽𝑃)(𝑡) − 𝑀𝑧,𝑒𝑞

(𝛽𝑃)

𝑇1(𝛽𝑃)

+ 𝑘𝑧,𝛽𝑃 ∙ 𝑀𝑧(𝑧)(𝑡) − 𝑘𝛽𝑃,𝑧 ∙ 𝑀𝑧

(𝛽𝑃)(𝑡) (10)

𝑑𝑀𝑧(𝛼𝐹)(𝑡)

𝑑𝑡= −

𝑀𝑧(𝛼𝐹)(𝑡) − 𝑀𝑧,𝑒𝑞

(𝛼𝐹)

𝑇1(𝛼𝐹)

+ 𝑘𝑧,𝛼𝐹 ∙ 𝑀𝑧(𝑧)(𝑡) − 𝑘𝛼𝐹,𝑧 ∙ 𝑀𝑧

(𝛼𝐹)(𝑡) (11)

28 MANFRED EIGEN, RONALD GEORGE WREYFORD NORRISH und GEORGE PORTER erhielten 1967 den Nobelpreis für Chemie

für die Untersuchung extrem schneller Reaktionen durch Gleichgewichtsstörungen mittels sehr kurzer

Energiepulse (≡ Relaxationsmethode).[384]

29 Dabei ist zu beachten, dass im Rahmen dieser Arbeit off-Resonanzeffekte[385] vernachlässigt werden. Weiterhin

gilt es zu beachten, dass in chemischem Austausch befindliche Stoffsysteme existieren können, bei denen

Kreuzrelaxationsprozesse eine Rolle spielen (vgl. NOE-Effekt). In solchen Fällen sind die in dieser Arbeit genutzten

funktionellen Zusammenhänge entsprechend anzupassen.[243,386-389] In den einschlägigen Publikationen werden

die entsprechenden Terme jedoch zumeist vernachlässigt.[268]


- 30 -

𝑑𝑀𝑧(𝛽𝐹)(𝑡)

𝑑𝑡= −

𝑀𝑧(𝛽𝐹)(𝑡) − 𝑀𝑧,𝑒𝑞

(𝛽𝐹)

𝑇1(𝛽𝐹)

+ 𝑘𝑧,𝛽𝐹 ∙ 𝑀𝑧(𝑧)(𝑡) − 𝑘𝛽𝐹,𝑧 ∙ 𝑀𝑧

(𝛽𝐹)(𝑡) (12)

Es handelt sich in diesem Fall um ein System inhomogener linearer Differentialgleichungen der

ersten Ordnung. Ein einfacher Lösungsansatz ergibt sich durch die Bildung der jeweiligen Differenzen

der Ausdrücke zum Zeitpunkt 𝑡 und 𝑡 = ∞. Dies kommt einer Eliminierung der Inhomogenität gleich.

Analog zu Gleichung (7) lässt sich das nun homogene Differentialgleichungssystem in der

Matrixschreibweise vereinfacht darstellen (vgl. Gleichung (13)).

𝑑

𝑑𝑡

(

𝑀𝑧,𝑒𝑞(𝑧) −𝑀𝑧

(𝑧)(𝑡)

𝑀𝑧,𝑒𝑞(𝛼𝑃) −𝑀𝑧

(𝛼𝑃)(𝑡)

𝑀𝑧,𝑒𝑞(𝛽𝑃)

−𝑀𝑧(𝛽𝑃)(𝑡)

𝑀𝑧,𝑒𝑞(𝛼𝐹)

−𝑀𝑧(𝛼𝐹)(𝑡)

𝑀𝑧,𝑒𝑞(𝛽𝐹)

−𝑀𝑧(𝛽𝐹)(𝑡))

= 𝑩 ∙

(

𝑀𝑧,𝑒𝑞(𝑧) −𝑀𝑧

(𝑧)(𝑡)

𝑀𝑧,𝑒𝑞(𝛼𝑃) −𝑀𝑧

(𝛼𝑃)(𝑡)

𝑀𝑧,𝑒𝑞(𝛽𝑃)

−𝑀𝑧(𝛽𝑃)(𝑡)

𝑀𝑧,𝑒𝑞(𝛼𝐹)

−𝑀𝑧(𝛼𝐹)(𝑡)

𝑀𝑧,𝑒𝑞(𝛽𝐹)

−𝑀𝑧(𝛽𝐹)(𝑡))

(13)

Diese Funktion ist vollkommen äquivalent zu Gleichung (7). Lediglich die Matrizen 𝑨 und 𝑩

unterscheiden sich voneinander. Die Matrix 𝑩 beinhaltet dabei im Gegensatz zu 𝑨 neben den

Anomerisierungsraten auch die longitudinalen Relaxationsraten der betrachteten in chemischem

Austausch befindlichen Kerne (vgl. Gleichung (14)). Die Diagonalelemente 𝑅(𝑖) der Matrix 𝑩 sind dabei

gemäß den Gleichungen (15) bis (19) definiert.

𝑩 =

(

−𝑅(𝑧) 𝑘𝛼𝑃,𝑧 𝑘𝛽𝑃,𝑧 𝑘𝛼𝐹,𝑧 𝑘𝛽𝐹,𝑧

𝑘𝑧,𝛼𝑃 −𝑅(𝛼𝑃) 0 0 0

𝑘𝑧,𝛽𝑃 0 −𝑅(𝛽𝑃) 0 0

𝑘𝑧,𝛼𝐹 0 0 −𝑅(𝛼𝐹) 0

𝑘𝑧,𝛽𝐹 0 0 0 −𝑅(𝛽𝐹))

(14)

𝑅(𝑧) =1

𝑇1(𝑧)+ 𝑘𝑧,𝛼𝑃 + 𝑘𝑧,𝛽𝑃 + 𝑘𝑧,𝛼𝐹 + 𝑘𝑧,𝛽𝐹 (15)

𝑅(𝛼𝑃) =1

𝑇1(𝛼𝑃)

+ 𝑘𝛼𝑃,𝑧 (16)

𝑅(𝛽𝑃) =1

𝑇1(𝛽𝑃)

+ 𝑘𝛽𝑃,𝑧 (17)

𝑅(𝛼𝐹) =1

𝑇1(𝛼𝐹)

+ 𝑘𝛼𝐹,𝑧 (18)

𝑅(𝛽𝐹) =1

𝑇1(𝛽𝐹)

+ 𝑘𝛽𝐹,𝑧 (19)

Die allgemeine Lösung von Gleichung (13) erfolgt analog zur Lösung von Gleichung (7).[268-274]

Diese Ausführung soll zeigen, dass die kinetische Betrachtung der Mutarotation mathematisch

gesehen dieselbe Grundlage hat wie die üblicherweise genutzten Experimente der dynamischen

NMR-Spektroskopie. Die in der Literatur beschriebenen Experimente der dynamischen

NMR-Spektroskopie unterscheiden sich demnach offenkundig auch nicht untereinander in ihrer


- 31 -

theoretischen Behandlung. Unterschiede ergeben sich lediglich durch die Art der Störung der

Gleichgewichtsmagnetisierung und damit durch die Wahl der Anfangsbedingungen.30 Hierbei

existieren formal gesehen unendlich viele Möglichkeiten. Die in der Literatur am häufigsten

anzutreffenden Varianten sind die (Selective) Exchange-Spectroscopy ((S)EXSY)31 und das Selective

Inversion Recovery-Experiment (SIR-NMR).[275-278] Eine Auswahl sinnvoller Startbedingungen sowie

Möglichkeiten, diese zu optimieren, sind der Literatur zu entnehmen.[70,268] Daneben stehen zur

Auswertung der üblichen Experimente der dynamischen NMR-Spektroskopie nicht kommerzielle

Softwaretools wie EXSYCalc[279] und CIFIT[280] zur Verfügung. Die hier dargestellte Vorgehensweise hat

den Vorteil, dass viele aufeinanderfolgende Messungen mit derselben Probe durchgeführt werden

können. Außerdem ist der jeweilige Nullpunkt einer ausgewählten Anfangsbedingung zeitlich exakter

definiert, als es bei der kinetischen Verfolgung der Anomerisierung der Fall ist. Hier stellt die Kinetik

der Solvatisierung eine gewisse Unschärfe der Startbedingung dar. Trotzdem bleiben die oben

beschriebenen Probleme bestehen, die sich aus der geringen Konzentration des Zentralisomers

ergeben. Hinzu kommt, dass die Matrix 𝑩 neben den Anomerisierungsraten auch die longitudinalen

Relaxationsraten beinhaltet. Diese müssen folglich simultan zur numerischen Berechnung der

Anomerisierungsraten iterativ ermittelt werden. Dementsprechend sind nun 13 anstelle von 8

Koeffizienten zu bestimmen. Dies kann dazu führen, dass der Iterationsprozess aufgrund schlecht

gewählter Startwerte im schlimmsten Falle nicht konvergiert oder aber große Fehlerintervalle für die

Koeffizienten resultieren.

Die meisten in der Literatur beschriebenen Messungen von Anomerisierungsraten diverser

Zuckerderivate erfolgten aus diesen Gründen mittels der selektiven Sättigungstransfer-NMR-

Spektroskopie (SST-NMR).[71-79,281] Die Idee für dieses Experiment besteht darin, die mathematische

Beschreibung des dynamischen Netzwerkes durch geschickte Beeinflussung der Magnetisierung eines

Isomers zu vereinfachen. Im speziellen Falle des in Schema 18 gezeigten Netzwerkes besteht diese

Beeinflussung in der Sättigung der Magnetisierung des anomeren Kohlenstoffatoms des

Zentralisomers. Unter Sättigung ist dabei die Zerstörung der z-Magnetisierung des entsprechenden

Kerns durch schnell aufeinanderfolgende frequenzselektive 90°-Radiopulse zu verstehen. Dies hat zur

Folge, dass 𝑀𝑧(𝑧)(𝑡) zeitlich unabhängig gleich null wird. Das führt mathematisch betrachtet zur

Entkopplung der über Gleichung (8) gekoppelten Differentialgleichungen (9) bis (12). Damit ist die

zeitliche Änderung der z-Magnetisierungen aller nicht zentralen Isomere nur noch abhängig von der

jeweiligen longitudinalen Relaxationszeit 𝑇1(𝑖) sowie der Ringöffnungsrate 𝑘𝑖,𝑧.32 Für ein nicht zentrales

Isomer 𝑖 lässt sich nun der folgende Ausdruck formulieren (vgl. Gleichung (20)).

30 Im Falle der zeitlichen Verfolgung der Mutarotation ist die Startbedingung durch die anfänglich vorhandenen

Konzentrationen der einzelnen Anomere und damit in der Regel durch das im kristallinen Zustand vorliegende

Anomer festgelegt.

31 Die quantitative Auswertung von (S)EXSY-Experimenten liefert weniger vertrauenswürdige Ergebnisse als die

entsprechender SIR-NMR-Experimente, da sie meist nur für eine einzige Mischzeit 𝜏𝑚 durchgeführt werden. Die

Berechnung der Geschwindigkeitskonstanten basiert damit lediglich auf den Daten für 𝑡 = 0𝑠 und 𝑡 = 𝜏𝑚 und

nicht auf einer zeitabhängig gemessenen Spektrenserie. Des Weiteren beansprucht ein zweidimensionales

EXSY-Experiment in Abhängigkeit der Auflösung in der f1-Dimension das bis zu 100-fache der Messzeit eines

SIR-NMR-Experimentes.

32 Zur Bestimmung von Ringöffnungsraten von Zuckeranomeren ist dabei die direkte Detektion des entsprechend

zu sättigenden anomeren Signals des Zentralisomers nicht notwendig. Eine Blindsättigung ist prinzipiell

möglich.[390] Dies ist im Vergleich zu Experimenten wie (S)EXSY und SIR-NMR ein extremer Vorteil.


- 32 -

𝑑𝑀𝑧(𝑖)(𝑡)

𝑑𝑡= −

𝑀𝑧(𝑖)(𝑡) − 𝑀𝑧,𝑒𝑞

(𝑖)

𝑇1(𝑖)

− 𝑘𝑖,𝑧 ∙ 𝑀𝑧(𝑖)(𝑡) (20)

Die Lösung dieser Differentialgleichung führt zu Gleichung (21).

𝑀𝑧(𝑖)(𝜏) =𝑀𝑧

(𝑖)(𝜏 = 0𝑠) ∙

(

1+ 𝑇1

(𝑖) ∙ 𝑘𝑖,𝑧 ∙ 𝑒𝑥𝑝(−𝜏 ∙ (1 + 𝑇1

(𝑖)∙ 𝑘𝑖,𝑧)

𝑇1(𝑖) )

1 + 𝑇1(𝑖)∙ 𝑘𝑖,𝑧

)

(21)

Dabei ist 𝜏 die Sättigungsdauer der entsprechenden NMR-Resonanz des Zentralisomers 𝑧. Der

Prozess der Sättigung wird im Folgenden zum Zwecke eines besseren Verständnisses des Experimentes

modellhaft beschrieben. Betrachtet man die z-Magnetisierung eines Kerns im Gleichgewichtszustand

und regt die entsprechende Kernresonanz mit einem 90°-Puls an, so wird der Magnetisierungsvektor

in die x,y-Ebene gedreht. Anschließend finden Relaxationsprozesse statt, die zum einen dazu führen,

dass die z-Magnetisierung ihrem Gleichgewichtszustand entgegenstrebt (longitudinale Relaxation).

Zum anderen kommt es zum zeitabhängigen Verlust der Phasenkohärenz der

Magnetisierungsvektoren in der x,y-Ebene und somit zum Verlust der Quermagnetisierung

(transversale Relaxation). Im rotierenden Koordinatensystem ist die zeitabhängige Änderung der

Quermagnetisierung durch Gleichung (22) gegeben.[192]

𝑑𝑀𝑦′(𝑡)

𝑑𝑡= −

𝑀𝑦′(𝑡)

𝑇2(𝑖)

(22)

Ist 𝑇2(𝑖) relativ zu 𝑇1

(𝑖) kurz, bedeutet dies, dass die Quermagnetisierung aufgehoben ist, bevor

sich die z-Magnetisierung regeneriert hat. Wird nun erneut mit einem 90°-Puls angeregt, werden alle

Magnetisierungsvektoren um 90° gedreht, sodass die Quer- zur z-Magnetisierung wird und umgekehrt.

Dem zuvor beschriebenen Zustand nach ist die z-Magnetisierung nun gleich null und die

Quermagnetisierung geringer als nach dem ersten Puls. Führt man diesen Prozess kaskadenartig fort,

führt dies dazu, dass sowohl die Quer- als auch die z-Magnetisierung ausgelöscht werden (vgl.

Abbildung 3). Sättigung funktioniert demnach effektiv für den Fall, dass 𝑇1(𝑖) ≫ 𝑇2

(𝑖).

Im Falle des chemischen Austauschs gelten für die Relaxationszeiten 𝑇1(𝑖) und 𝑇2

(𝑖) nach

MCCONNELL (1958) die Gleichungen (23) und (24).[69]

1

𝜏1(𝑖)=

1

𝑇1(𝑖)+1

𝜏(𝑖) (23)

1

𝜏2(𝑖)=

1

𝑇2(𝑖)+1

𝜏(𝑖) (24)

Dabei ist 𝜏(𝑖) die inverse Geschwindigkeitskonstante des dynamischen Prozesses (hier: die

Summe aller Ringschlussraten).


- 33 -

Abbildung 3: Modellvorstellung der Sättigung einer Kernresonanz für den Fall 𝑇1(𝑖)≫ 𝑇2

(𝑖). (blaue

Pfeile: z-Magnetisierung; rote Pfeile: Quermagnetisierung)

Hieraus ergibt sich, dass 𝑇1(𝑖)

immer dann sehr viel größer ist als 𝑇2(𝑖)

, wenn 𝜏1(𝑖)

sehr viel größer

ist als 𝜏2(𝑖). Das ist genau dann der Fall, wenn 𝑇2

(𝑖) sehr viel kleiner ist als 𝜏(𝑖). Mit anderen Worten

funktioniert die Sättigung in Systemen mit chemischem Austausch immer dann effektiv, wenn die

transversale Relaxationszeit sehr viel kürzer ist als die mittlere Lebensdauer des betrachteten

Zustands.[70] Bei schlecht funktionierender Sättigung muss für einen großen Unterschied zwischen 𝑇1(𝑖)

und 𝑇2(𝑖)

sowie zwischen 𝑇2(𝑖)

und 𝜏(𝑖) gesorgt werden. Aufgrund der Zusammenhänge zwischen

Korrelationszeit, Relaxationsraten, magnetischer Flussdichte und Temperatur ist dies durch eine

Erhöhung der magnetischen Flussdichte und eine Verringerung der Temperatur möglich.[282] Die größte

Effektivität liegt jedoch in der direkten Beeinflussung von 𝑇2(𝑖)

. In niederviskosen wässrigen Lösungen

ist der Verlust der Phasenkohärenz hauptsächlich Inhomogenitäten im Magnetfeld geschuldet.[191]

Durch einen gezielten Eintrag von Inhomogenitäten in das Magnetfeld – insbesondere mittels der

z- und z³-Shim-Spulen – lässt sich die Signalsättigung somit effektiv optimieren.[70]

Die in diesem Kapitel diskutierten 𝑇1-abhängigen Methoden der dynamischen

NMR-Spektroskopie beruhen in der überwiegenden Zahl möglicher Experimente auf der gezielten

Beeinflussung der z-Magnetisierung ausgewählter Isomere mit Hilfe selektiver Radiopulse. Die

Selektivität der Pulse ist jedoch nur dann gegeben, wenn die Differenz der chemischen Verschiebungen

der miteinander in chemischem Austausch stehenden Kerne ausreichend groß ist. Diese Voraussetzung

ist im Falle von Isomerengleichgewichten von Kohlenhydraten für das zentrale acyclische

Strukturisomer immer erfüllt, da dessen anomeres Carbonylkohlenstoffatom (sowie ggf. dessen

anomeres Proton) relativ zu denen der cyclischen und hydratisierten Isomere einer ausgeprägten

Tieffeldverschiebung unterliegt.[283] Dies ist auch der Grund dafür, warum die obige Diskussion

𝑇2-abhängige Methoden der dynamischen NMR-Spektroskopie (Linienformanalyse) ausschließt. Die

genannte Verschiebungsdifferenz ist derart groß, dass messbare Veränderungen der Linienform in

einem Temperaturbereich zwischen 0 und 100 °C kaum zu erwarten sind.[80] Damit befinden sich die in

dieser Arbeit untersuchten Systeme fast ausschließlich im Bereich des langsamen chemischen

Austauschs. Signalkoaleszenz tritt üblicherweise bei einer Austauschrate auf, die in etwa der


- 34 -

Frequenzdifferenz der austauschenden Kerne entspricht.[284] Im Falle von Derivaten der D-Fructose

liegt diese Frequenzdifferenz für 13C-NMR-Spektren bei Messungen an einem 600 MHz-NMR-

Spektrometer bei ca. 15 kHz, weshalb eine Berechnung von Anomerisierungsraten auf Grundlage der

totalen Linienformanalyse nicht angemessen ist. Der Einfluss der Temperatur auf die Linienform spielt

lediglich in Kapitel 4.2.1 in Zusammenhang mit der Strukturaufklärung von Derivaten der D-Fructose

eine Rolle.

2.3 Katalyse und mathematische Modellierung der Anomerisierung

Ein theoretisches Verständnis der Anomerisierung erfordert neben der mechanistischen

Formulierung der Tautomerie auch die mathematische Beschreibung des dynamischen Prozesses, die

im Einklang mit den molekularen Grundlagen steht. Der Prozess der Anomerisierung wurde durch die

Beobachtung der Mutarotation der D-Glucose erstmals im Jahr 1846 von AUGUSTIN-PIERRE DUBRUNFAUT

entdeckt und beschrieben.[1] Der chemische Hintergrund wurde jedoch erst im Verlauf der

darauffolgenden ca. 50 Jahre schrittweise vor allem durch Arbeiten von EMIL FISCHER und CHARLES JOSEPH

TANRET verstanden. THOMAS MARTIN LOWRY (1903) entdeckte schließlich die Abhängigkeit der

Geschwindigkeit der Mutarotation von der Anwesenheit von Säuren und Basen.[285] Diese Abhängigkeit

wurde von CLAUDE SILBERT HUDSON (1907) systematisch untersucht. Er beobachtete dabei, dass die

Mutarotationsrate 𝑘𝑚𝑢𝑡 sowohl mit steigender Protonen- als auch Hydroxylionenkonzentration linear

zunimmt und formulierte die sogenannte katalytische Kettenfunktion (Gleichung (25)).[286]

𝑘𝑚𝑢𝑡 = 𝐴 + 𝐵 ∙ [𝐻+] + 𝐶 ∙ [𝑂𝐻−] (25)

Dabei sind 𝐴, 𝐵 und 𝐶 entsprechende Geschwindigkeitskonstanten. Diese Berechnungsformel

ist rein empirisch und hat keine mechanistische Grundlage. HANS VON EULER et al. (1925)33 sind auf Basis

eigener Vorarbeiten zu der Überzeugung gekommen, dass der Prozess der Mutarotation von ionischen

Spezies der D-Glucose abhängen muss. Entsprechend der jeweiligen 𝑝𝐾𝑠-Werte des Ringsauerstoffs

und der anomeren Hydroxylfunktion bilden sich Kationen und Anionen der D-Glucose, deren

Konzentration vom pH-Wert abhängig ist. Diese ionischen Zuckerspezies sind im Gegensatz zu nicht

ionischen zur spontanen Ringöffnung fähig. Das Minimum der Mutarotationsrate, welches durch die

Nullstelle der ersten Ableitung von Gleichung (25) gegeben ist, entspricht unter Annahme gleicher

spontaner Öffnungsraten des Kations und Anions demnach dem isoelektrischen Punkt (𝑝𝐼) der

D-Glucose. VON EULER et al. (1925, 1926) formulieren schließlich den nach Gleichung (26) gegebenen

Ausdruck zur Beschreibung der Kinetik der Mutarotation.[287,288]

𝑘𝑚𝑢𝑡 = 𝑘0 + 𝑟𝑞2 ∙[𝐻+]

𝐾𝑠1+ 𝑟𝑞1 ∙

𝐾𝑠2[𝐻+]

(26)

Dabei entspricht 𝑘0 der Konstante 𝐴 aus Gleichung (25), 𝑟𝑞𝑖 den spezifischen

Reaktionsfähigkeiten der ionischen Zuckerspezies und 𝐾𝑠1 sowie 𝐾𝑠2 den Säurekonstanten des

Ringsauerstoffatoms und der anomeren Hydroxylfunktion. Es liegt auf der Hand, dass sich

Gleichung (26) und Gleichung (25) nicht unterscheiden, wenn für 𝐴 = 𝑘0, 𝐵 =𝑟𝑞2

𝐾𝑠1 und 𝐶 =

𝑟𝑞1∙𝐾𝑠2

𝐾𝑤 gilt.

Dabei ist 𝐾𝑤 das Ionenprodukt von Wasser. Die von VON EULER et al. aufgestellte Theorie wurde

33 ARTHUR HARDEN und HANS KARL AUGUST SIMON VON EULER-CHELPIN erhielten 1929 den Nobelpreis für Chemie für

ihre Untersuchungen der Zuckerfermentation und fermentativer Enzyme.[391]


- 35 -

aufgrund ihrer mathematischen Äquivalenz zur katalytischen Kettenfunktion zunächst nicht beachtet.

Vielmehr erweiterten JOHANNES NICOLAUS BRØNSTED und EDWARD ARMAND GUGGENHEIM (1927) HUDSONS

Funktion von 1907 zur Beschreibung des katalytischen Einflusses von Säuren und Basen.[289] Die

entsprechende Funktion zur Beschreibung der allgemeinen Säure-Base-Katalyse lässt sich in Form von

Gleichung (27) darstellen.

𝑘𝑚𝑢𝑡 = 𝑘0 + 𝑘𝐻 ∙ [𝐻+] + 𝑘𝑂𝐻 ∙ [𝑂𝐻

−] +∑𝑘𝑖 ∙ [𝐻𝐴𝑖]

𝑖

+∑𝑘𝑗 ∙ [𝐵𝑗]

𝑗

(27)

Dabei steht [𝐻𝐴𝑖] für die Konzentration einer Säure und [𝐵𝑗] für die Konzentration einer Base.

Die katalytischen Konstanten 𝑘𝑖 und 𝑘𝑗 hängen dabei nach BRØNSTED und GUGGENHEIM (1927)

exponentiell von den entsprechenden Säure- und Basenkonstanten der Katalysatoren ab.[289] Obwohl

auch diese Gleichung keinerlei mechanistische Grundlage hat, wird sie seit ihrer Formulierung bis

heute fortwährend genutzt.[290-293] Sie findet dabei nicht nur im Kontext der Anomerisierung von

Zuckern, sondern auch in anderen Bereichen der organischen Chemie Anwendung, bei denen säure-

und basenkatalysierte Prozesse eine Rolle spielen.[294] Das ist bemerkenswert, da THOMAS MARTIN LOWRY

ebenfalls 1927 die Theorie ionischer Zuckerspezies von VON EULER et al. (1925, 1926) aufgreift und um

einen entscheidenden Schritt ergänzt.[295] Dieser besteht darin, dass die ionischen Zuckerspezies nach

erfolgter Anomerisierung durch einen Protonentransfer wieder elektroneutral werden müssen. Diese

Erweiterung, die von LOWRY als elektrolytische Theorie der Katalyse bezeichnet wird, impliziert, dass

Anomerisierungsprozesse lediglich in Gegenwart von Ampholyten stattfinden können. Nach dieser

Vorstellung lässt sich der Prozess der Anomerisierung am Beispiel der β-D-Glucopyranose durch

Schema 19 beschreiben.

Schema 19: Mechanismus der Anomerisierung am Beispiel der β-D-Glucopyranose.

Trotz seiner Bemühungen, einen adäquaten Mechanismus für den Prozess der Anomerisierung

zu formulieren, nutzt auch LOWRY die katalytische Kettenfunktion zur mathematischen Beschreibung

der Mutarotation.[295] Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit erfolgt die mathematische

Modellierung der Anomerisierung auf Basis der Grundannahmen von VON EULER und LOWRY. Die

relativen Konzentrationen der verschiedenen ionischen und nicht ionischen Zuckerspezies werden

anhand der Säurekonstanten des Ringsauerstoffs 𝐾𝑠1 und der anomeren Hydroxylfunktion 𝐾𝑠2 des

entsprechenden Zuckers über das Massenwirkungsgesetz berechnet. Die Molenbrüche der vier


- 36 -

möglichen Spezies eines reduzierenden Zuckers 𝑍0, 𝑍+, 𝑍− und 𝑍± sind dabei durch die

Gleichungen (28) bis (31) gegeben.

[𝑍0] =[𝐻+] ∙ 𝐾𝑠1

[𝐻+]2 + [𝐻+] ∙ 𝐾𝑠1 + [𝐻+] ∙ 𝐾𝑠2 + 𝐾𝑠1 ∙ 𝐾𝑠2

(28)

[𝑍+] =[𝐻+]2

[𝐻+]2 + [𝐻+] ∙ 𝐾𝑠1 + [𝐻+] ∙ 𝐾𝑠2 + 𝐾𝑠1 ∙ 𝐾𝑠2

(29)

[𝑍−] =𝐾𝑠1 ∙ 𝐾𝑠2

[𝐻+]2 + [𝐻+] ∙ 𝐾𝑠1 + [𝐻+] ∙ 𝐾𝑠2 + 𝐾𝑠1 ∙ 𝐾𝑠2

(30)

[𝑍±] =[𝐻+] ∙ 𝐾𝑠2

[𝐻+]2 + [𝐻+] ∙ 𝐾𝑠1 + [𝐻+] ∙ 𝐾𝑠2 +𝐾𝑠1 ∙ 𝐾𝑠2

(31)

Auf dieser Grundlage gelten nun die folgenden Überlegungen: Mit Verweis auf Schema 19

können weder Ringöffnung noch Ringschluss von nicht ionischen Zuckerspezies ausgehen. Der

pH-abhängige Molenbruch des ungeladenen Zuckers [𝑍0] spielt demnach für

Anomerisierungsprozesse keinerlei Rolle. Weiterhin haben alle ionischen Zuckerspezies spezifische

spontane Ringöffnungsraten 𝑘𝑍+ , 𝑘𝑍− und 𝑘𝑍± . Die messbare Geschwindigkeit der Ringöffnung 𝑘𝑜𝑏𝑠

eines Zuckeranomers berechnet sich demnach mit Hilfe von Gleichung (32).

𝑘𝑜𝑏𝑠 = 𝑘𝑍± ∙ [𝑍±] + 𝑘𝑍+ ∙ [𝑍

+] + 𝑘𝑍− ∙ [𝑍−] (32)

Da davon auszugehen ist, dass der protonierte Ringsauerstoff eines Zuckeranomers eine

extrem starke, die anomere Hydroxylfunktion hingegen eine sehr schwache Säure ist, gilt für den

pH-Bereich 𝑝𝐾𝑠1 ≪ 𝑝𝐻 ≪ 𝑝𝐾𝑠2 und damit für 𝑝𝐻 ≅ 𝑝𝐼, dass der jeweilige Nenner der

Gleichungen (28) bis (31) annähernd gleich [𝐻+] ∙ 𝐾𝑠1 ist. Damit kann Gleichung (32) durch

Gleichung (33) approximiert werden.

𝑘𝑜𝑏𝑠 = 𝑘𝑍± ∙𝐾𝑠2𝐾𝑠1

+ 𝑘𝑍+ ∙[𝐻+]

𝐾𝑠1+ 𝑘𝑍− ∙

𝐾𝑠2[𝐻+]

(33)

Obwohl Gleichung (33) wiederum äquivalent zu den Gleichungen (25) und (26) ist und jeder

dieser Ausdrücke Gleichung (32) im lebensmittelrelevanten pH-Bereich nahezu perfekt approximiert,

bringt insbesondere die Verwendung von Gleichung (25) einige Probleme mit sich. Hier ergeben sich

die Konstanten 𝐴, 𝐵 und 𝐶 als Produkte der jeweiligen spontanen Ringöffnungsraten und der

Säurekonstanten. Eine Analyse der thermodynamischen Aktivierungsparameter auf Grundlage

temperaturabhängiger Messungen von 𝐴, 𝐵 und 𝐶 bringt somit stark fehlerhafte Ergebnisse.

Außerdem hat die Interpretation der Konstanten 𝐵 und 𝐶 unrealistische Konsequenzen. Berechnungen

dieser Konstanten im Falle der D-Glucose 2a führen zu dem Schluss, dass die Katalyse der Mutarotation

durch Hydroxylionen rund 40 000-mal stärker ausgeprägt ist als eine entsprechende

Protonenkatalyse.[286] Eine molekulare Grundlage für derart drastische Unterschiede ist jedoch nicht

gegeben. Gleichermaßen wenig überzeugend ist die Vorstellung einer beliebigen Steigerungsfähigkeit

der Mutarotationsrate durch eine Erhöhung der Protonen- bzw. Hydroxylionenkonzentration, die

sämtliche Approximationen von Gleichung (32) erlauben.


- 37 -

Schließlich erfordert die mathematische Beschreibung der Anomerisierung auch die

Beachtung der von BRØNSTED und GUGGENHEIM (1927) beschriebenen Katalyse durch Säuren und Basen.

Gleichung (27) besagt, dass sowohl Säuren als auch Basen die Fähigkeit besitzen, reduzierende Zucker

zur spontanen Ringöffnung zu bewegen. Das Protolysegleichgewicht einer Säure wird nur durch den

pH-Wert, nicht aber durch die Anwesenheit weiterer Säuren beeinflusst. Damit haben katalytisch

wirkende Säuren und Basen auch keinen Einfluss auf die 𝐾𝑠-Werte eines Zuckers und somit auch nicht

auf die Molenbrüche dessen ionischer Spezies. Sie können die Steigerung von Ringöffnungsraten somit

nicht durch eine Veränderung der Ionengleichgewichte erreichen, sondern lediglich durch

Einflussnahme auf deren Dynamik. Das bedeutet, dass Katalysatoren die mittlere Lebensdauer der

ionischen Zuckerspezies verkürzen. Dies geschieht durch einen Ladungsausgleich durch die

Übertragung eines Protons. Dabei bilden ionische Zuckerspezies COULOMB-Paare mit Katalysatoren

entgegengesetzter Ladung (etwa kationische Zuckerspezies in Gegenwart von Carboxylaten).34 Es ist

somit zu erwarten, dass ein Katalysator die Aktivierungsenthalpie der Zuckeranomerisierung erhöht,

da zusätzlich zum Bindungsbruch auch die COULOMB-Anziehung der Ionenpaare überwunden werden

muss. Demgegenüber kommt die beschleunigte Dynamik des Protonentransfers einer Erhöhung der

Stoßrate bzw. der Aktivierungsentropie gleich. Ob der Prozess der Ringöffnung stattfindet, hängt also

davon ab, ob genügend Aktivierungsenergie für die Überwindung der COULOMB-Anziehung und den

erforderlichen Bindungsbruch zur Verfügung steht. Hat ein entsprechendes Molekül zum Zeitpunkt

seiner Ionisierung nicht genügend innere Energie für diesen Prozess, so wird ein Katalysator durch

einen schnellen Protonentransfer für einen Ladungsausgleich sorgen, bevor eine Öffnung des Ringes

erfolgen kann. Das bedeutet, dass nicht die Ionisierung des Zuckers der geschwindigkeitsbestimmende

Schritt der Anomerisierung ist, sondern der Bruch der endocyclischen C-O-Bindung. Diese

Überlegungen werden durch quantenchemische Berechnungen von QIAN (2013) sowie PLAZINSKI et al.

(2015) gestützt.[296,297] Dass der Bruch der endocyclischen C-O-Bindung im Falle einfach geladener

Zuckerionen vor dem abschließenden Protonentransfer erfolgt, legen theoretische Berechnungen von

FENG et al. (2013) nahe.[298] Diese berechneten, dass bereits die Protonierung des Ringsauerstoffatoms

der β-D-Fructopyranose 1a(ii) zum Bruch der C-O-Bindung führt. Außerdem verlängert sich die

C-O-Bindung im Falle der α-D-Glucopyranose durch die Deprotonierung der anomeren

Hydroxylfunktion von 1.41 Å auf 1.55 Å. Als eine Folge daraus ergibt sich, dass die Anomerisierung bei

ausreichend tiefen Temperaturen durch katalytische Säuren und Basen gehemmt wird. Eine solche

Hemmung steht jedoch in Widerspruch zu Gleichung (27), die nur eine Zunahme von

Anomerisierungsraten in Gegenwart von Säuren und Basen erlaubt. Es zeigt sich dadurch, dass auch

diese Gleichung rein empirisch und mechanistisch nicht fundiert ist. Daher wird in dieser Arbeit eine

Erweiterung von Gleichung (32) genutzt, deren Herleitung im Folgenden diskutiert wird.

Der katalytische Einfluss einer Säure besteht den obigen Ausführungen nach in der

Reprotonierung der anionischen Zuckerspezies. Entsprechend dient eine Base der Deprotonierung der

kationischen Zuckerspezies. Folglich katalysiert eine Base im sauren Milieu, während eine Säure im

basischen pH-Bereich katalytisch aktiv ist. Nach BRØNSTED und GUGGENHEIM (1927) steigt die katalytische

Effizienz einer Säure (Base) mit der Zunahme ihrer Stärke.[289] Eine starke Säure (Base) wird jedoch im

basischen (sauren) Milieu, in dem ihr zu katalysierendes Substrat mit hohen Molenbrüchen vorkommt,

34 Für nicht ionische Katalysatoren wie Wasser spielt die COULOMB-Anziehung keine Rolle. Entsprechend ist davon

auszugehen, dass ionische Katalysatoren die Effizienz der Wasserkatalyse verringern, da sie die

Wahrscheinlichkeit von Wechselwirkungen ionischer Zuckerspezies mit elektroneutralen Molekülen

herabsetzen.


- 38 -

hauptsächlich in Form ihrer konjugierten Base (Säure) vorliegen, die wiederum katalytisch wenig

effizient ist und kaum Substrat vorfindet. Für eine Abschätzung des katalytischen Einflusses in

Abhängigkeit des pH-Wertes müssen daher die folgenden Fragen beantwortet werden:

1. Wie groß ist die katalytische Effizienz des Katalysators?

2. Zu welchem Prozentsatz liegt die katalytisch aktive Spezies vor?

3. Zu welchem Prozentsatz liegt die zu katalysierende Spezies vor?

Aus den Antworten zu diesen Fragen können einige grundlegende Schlüsse gezogen werden.

Zum einen gibt es für ein gegebenes Zuckeranomer für jeden pH-Wert bei konstanter Temperatur

einen optimalen Katalysator. Zum anderen müssen diejenigen Säuren und Basen den größten Einfluss

auf die Anomerisierung haben, deren 𝑝𝐾𝑠-Werte nahe des pH-Minimums von Gleichung (25) und

damit im Bereich des 𝑝𝐼 des betrachteten Zuckeranomers liegen. Für D-Fructose 1a liegt das Minimum

der Mutarotationsrate je nach Temperatur im Bereich von pH 2.5-6.5[67] und damit in der

Größenordnung der 𝑝𝐾𝑠-Werte gewöhnlicher Carbonsäuren.[299] Dies entspricht auch dem pH-Milieu

von Lebensmitteln.[16] Bezüglich des Einflusses von Aminosäuren auf die Anomerisierung von Zuckern

lässt sich weiterhin folgern, dass der katalytische Effekt der Aminofunktion aufgrund ihres hohen

𝑝𝐾𝑠-Wertes[300] zu vernachlässigen ist. Für stöchiometrische Mischungen von Zuckern 𝑍 und

Monocarbonsäuren 𝑆 bzw. einfachen Aminosäuren sind daher zur mathematischen Modellierung des

Prozesses der Anomerisierung in Anlehnung an Gleichung (32) die Molenbrüche der verschiedenen

ionischen Spezies zu beachten. Da nun insgesamt drei 𝑝𝐾𝑠-Werte relevant sind, existieren 23 = 8

verschiedene Spezies. Bei zwei dieser Spezies ist der Zucker ungeladen, weshalb diese zu ignorieren

sind. Die übrigen Spezies sind die folgenden: 𝑍−𝑆−, 𝑍−𝑆+, 𝑍±𝑆−, 𝑍±𝑆+, 𝑍+𝑆− und 𝑍+𝑆+. (Für eine

Darstellung der entsprechenden molekularen Strukturen siehe Strukturenverzeichnis.) Dabei

bezeichnet 𝑆+ die Säure und 𝑆− ihre konjugierte Base. Die Molenbrüche von 𝑍−𝑆+und 𝑍±𝑆− sowie

von 𝑍±𝑆+ und 𝑍+𝑆− sind in ihrem pH-abhängigen Verlauf jeweils paarweise linear voneinander

abhängig, sodass die spontanen Ringöffnungsraten dieser Spezies nicht differenziert werden können.

Dabei ist davon auszugehen, dass die zwitterionischen Zuckerspezies 𝑍±𝑆− und 𝑍±𝑆+ auch ohne

Einfluss eines Katalysators außerordentlich schnell anomerisieren. Eine Katalyse im Sinne des hier

beschriebenen Modells ist somit nur für die beiden Spezies 𝑍−𝑆+ und 𝑍+𝑆− zu erwarten. Der

Ladungsausgleich der Spezies 𝑍−𝑆− sowie 𝑍+𝑆+ erfolgt dagegen unter Beteiligung des Lösungsmittels.

Die entsprechenden Molenbrüche berechnen sich auf Grundlage des Massenwirkungsgesetzes nach

den Gleichungen (34) bis (37).

[𝑍−𝑆−] =𝐾𝑠1𝐾𝑠2𝐾𝑠3

[𝐻+]3+[𝐻+]2(𝐾𝑠1+𝐾𝑠2+𝐾𝑠3)+[𝐻+](𝐾𝑠1𝐾𝑠2+𝐾𝑠1𝐾𝑠3+𝐾𝑠2𝐾𝑠3)+𝐾𝑠1𝐾𝑠2𝐾𝑠3

(34)

[𝑍−𝑆+] + [𝑍±𝑆−] =[𝐻+](𝐾𝑠1𝐾𝑠2+𝐾𝑠2𝐾𝑠3)


(35)

[𝑍+𝑆−] + [𝑍±𝑆+] =[𝐻+]2(𝐾𝑠2+𝐾𝑠3)


(36)

[𝑍+𝑆+] =[𝐻+]3


(37)


- 39 -

Dabei ist 𝐾𝑠3 die Säurekonstante der katalytischen Amino- bzw. Carbonsäure. Die messbare

Geschwindigkeit der Ringöffnung 𝑘𝑜𝑏𝑠 eines Zuckeranomers in Anwesenheit einer katalytischen Säure

berechnet sich schließlich in Analogie zu Gleichung (32) mittels Gleichung (38).

𝑘𝑜𝑏𝑠 = 𝑘𝑍−𝑆− ∙ [𝑍−𝑆−] + 𝑘𝑍−𝑆+/𝑍±𝑆− ∙ ([𝑍

−𝑆+] + [𝑍±𝑆−]) + 𝑘𝑍+𝑆−/𝑍±𝑆+

∙ ([𝑍+𝑆−] + [𝑍±𝑆+]) + 𝑘𝑍+𝑆+ ∙ [𝑍+𝑆+]

(38)

Die Ausführungen dieses Kapitels zeigen, dass eine Bestimmung thermodynamischer

Aktivierungsparameter von Anomerisierungsprozessen nicht korrekt erfolgen kann, solange das

mathematische Modell des dynamischen Prozesses keine molekular-mechanistische Grundlage hat.

Im Rahmen dieser Arbeit soll gezeigt werden, dass die theoretischen Überlegungen, die zu

Gleichung (32) bzw. (38) geführt haben, mit experimentellen Daten im Einklang stehen.

ZIELSTELLUNG

- 40 -

3 Zielstellung Die Reaktionen einfacher reduzierender Zucker und deren Derivate haben entscheidende

Auswirkungen sowohl auf die Qualität von Lebensmitteln als auch auf die Genese verschiedener

altersbedingter Erkrankungen. Ein Verständnis der molekularen Grundlagen der Reaktivität als Basis

der Möglichkeit einer gezielten Beeinflussung von Reaktionen hat in diesem Zusammenhang nicht nur

Bedeutung für den Genusswert prozessierter und gelagerter Lebensmittel, sondern auch für die

Gesundheit und damit für die Qualität des Lebens allgemein. Aus diesem Grund finden sich zahlreiche

Publikationen, in denen der Fokus auf die Untersuchung der relativen Reaktivitäten verschiedener

Zucker gerichtet ist.

Weitverbreitet ist die Auffassung, dass die acyclischen Zentralisomere reduzierender Zucker

für deren Reaktivität verantwortlich sind. Entsprechend gilt die Ringöffnung cyclischer Zuckeranomere

als mutmaßlich geschwindigkeitsbestimmender Schritt chemischer Reaktionen. In Kapitel 2.1 wurde

demgegenüber hervorgehoben, dass die Formulierung der quantitativ bedeutsamen Reaktionen

reduzierender Zucker und deren Derivate vor allem aus ihren cyclischen Hauptanomeren sinnvoll ist

(vgl. dazu Schema 5 und Schema 7 sowie Schema 14 bis 17). Das führt zu der Frage, warum die

Reaktivität von D-Fructose-analogen AMADORI-Verbindungen 6 gegenüber der Reaktivität von

D-Fructose 1a laut den Berechnungen von BRANDS und VAN BOEKEL (1998, 2002) bei 120 °C um das

Zehn- bis Vierzigfache erhöht ist. Da die Anomerensysteme von 1a und 6 in ihrer Qualität und Quantität

nahezu vollständig übereinstimmen, können sich diese lediglich in der Dynamik ihrer Anomerisierung

unterscheiden. Je nach vorherrschenden Milieuparametern liegen die Ringöffnungsraten

verschiedener Zucker bei Temperaturen bis etwa 60 °C in einer Größenordnung von 0.1/s (d.h. 0.1 Hz)

und mehr. Für eine Reaktion erster Ordnung ergibt sich daraus eine Halbwertszeit von weniger als 7 s.

Für den Abbau eines Zuckers im Zuge der MAILLARD-Reaktion werden derartige

Reaktionsgeschwindigkeiten selbst bei Temperaturen über 100 °C bei weitem nicht erreicht. Damit

kann der Prozess der Anomerisierung bzgl. des thermisch induzierten Zuckerabbaus keinesfalls

geschwindigkeitsbestimmend sein.

Vor dem Hintergrund der beschriebenen Widersprüche besteht das Ziel der vorliegenden

Arbeit in der Beantwortung der folgenden Fragen:

1) Welches Anomer eines reduzierenden Zuckers ist verantwortlich für dessen Reaktivität?

2) Existiert eine Korrelation zwischen der Dynamik von Zuckertautomerien – insbesondere der

Ringöffnung – und der Kinetik nicht enzymatischer Bräunungsreaktionen?

3) Wie beeinflussen Aminosäuren die Dynamik der Anomerisierung und die Reaktivität

reduzierender Zucker?

Zur Klärung dieser Fragen ist es zunächst erforderlich, eine geeignete Auswahl an

Zielsubstanzen festzulegen. In Anlehnung an die Arbeiten von BRANDS und VAN BOEKEL (1998, 2002)

erfolgen alle Messungen vorrangig an D-Fructose 1a sowie D-Fructose-analogen

AMADORI-Verbindungen 6. Um den Einfluss von Aminosäuren auf die Dynamik der Anomerisierung

sowie die Reaktivität der Zuckerkomponente zu ermitteln, werden primäre (Glycin 4c, L-Alanin 4a) und

sekundäre (L-Prolin 4b) α-Aminosäuren sowie primäre ω-Aminosäuren (β-Alanin 4d,

γ-Aminobuttersäure 4e) eingesetzt. Diese unterscheiden sich nicht nur strukturell, sondern

ZIELSTELLUNG

- 41 -

insbesondere in ihren elektronischen Eigenschaften, die sich in den 𝑝𝐾𝑠-Werten ihrer funktionellen

Gruppen widerspiegeln. Zur Unterscheidung inter- und intramolekularer Wechselwirkungen erfolgen

alle Messungen an D-Fructose 1a in An- und Abwesenheit äquimolarer Mengen der entsprechenden

Aminosäuren 4a-4e im Vergleich zu Messungen an den entsprechenden D-Fructose-analogen

AMADORI-Verbindungen 6a-6e.

Da die Dynamik der Anomerisierung nicht nur temperatur-, sondern vor allem pH-abhängig ist,

besteht der erste Schritt dieser Arbeit in der Ermittlung der Reaktivitäten der Zielsubstanzen in

Abhängigkeit des pH-Wertes bei konstanter Temperatur. Dazu werden Lösungen der Zielsubstanzen

hergestellt und unter kontrollierten Bedingungen zur Reaktion gebracht. Der pH-Wert wird während

aller Modellreaktionen titrimetrisch auf verschiedenen Stufen konstant gehalten. Die Stufen

orientieren sich dabei am Stabilitätsmaximum der untersuchten Zuckerderivate. Dies ermöglicht eine

Differenzierung zwischen säure- und baseninduzierten Reaktionen. Die Ermittlung der Reaktivität

erfolgt anhand dreier Parameter:

1) Messung der zeitabhängigen Konzentrationsänderungen der eingesetzten Edukte

(Abbauraten) mittels HILIC-RI (für D-Fructose 1a) sowie ionenpaarchromatographischer

RP-HPLC-RI (für die Aminosäuren 4a-4e sowie die AMADORI-Verbindungen 6a-6e).

2) Messung der zeitabhängigen Konzentrationsänderungen (Bildungsraten) der

α-Dicarbonylverbindungen 9a-9d nach Derivatisierung mit ortho-Phenylendiamin mittels

RP-HPLC-DAD.

3) Messung der zeitabhängigen Extinktionszunahme (Farbbildungsrate) bei 284 nm

(UV-Bereich) und 420 nm (visueller Bereich) mittels Spektralphotometrie.

Um die erhobenen Daten zur Reaktivität der Zielverbindungen in einen Zusammenhang mit

ihren Anomerensystemen zu bringen, erfolgt parallel dazu deren vollständige NMR-spektroskopische

Charakterisierung. Diese unterteilt sich in die folgenden Punkte:

1) Vollständige Zuordnung der NMR-Signale der Anomere der Zielsubstanzen

(Strukturaufklärung und Identifikation elektronischer Effekte).

2) Bestimmung der relativen Konzentrationen der Anomere der Zielsubstanzen mittels

quantitativer NMR-Spektroskopie in Abhängigkeit der Temperatur.

3) Messung der Geschwindigkeit der reversiblen 1,2-Enolisierung der Zielsubstanzen mittels

zeitabhängiger quantitativer NMR-Spektroskopie in Abhängigkeit des pH-Wertes.

4) Messung der Dynamik der Anomerisierung der Zielsubstanzen mittels dynamischer

NMR-Spektroskopie (SST-NMR) in Abhängigkeit des pH-Wertes und der Temperatur.

Im finalen Schritt der Arbeit werden die erhobenen Daten zur Reaktivität, Struktur und

Dynamik der Anomere der untersuchten Zuckerderivate in einen gemeinsamen molekularen Kontext

gebracht und damit die oben formulierten Fragen beantwortet. Mit Blick auf die übliche Beschreibung

der MAILLARD-Reaktion als aminokatalysierter Zuckerabbau wird der Fokus dabei auf die spezifischen

Einflüsse der Amino- und Carboxylfunktion der eingesetzten Aminosäuren auf die Dynamik und

Reaktivität der Anomere der untersuchten Derivate der D-Fructose gelegt. Auf dieser Basis soll

schließlich ein Mechanismus der grundlegenden katalytischen Prozesse innerhalb der (frühen und

intermediären Phase der) MAILLARD-Reaktion formuliert werden, der die oben formulierten

Widersprüche aufhebt.

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

- 42 -

4 Ergebnisse und Diskussion Das folgende Kapitel ist in zwei Abschnitte unterteilt. Der erste Abschnitt befasst sich mit der

Messung der Reaktivitäten der D-Fructose 1a, stöchiometrischen Mischungen der D-Fructose 1a und

den Aminosäuren 4a-4e sowie der D-Fructose-analogen AMADORI-Verbindungen 6a-6e. Im zweiten

Abschnitt erfolgt die strukturelle Charakterisierung der Zielsubstanzen mittels NMR-Spektroskopie.

Diese bildet die Grundlage für die Untersuchung von dynamischen Prozessen der Tautomerensysteme.

Schließlich werden die Zusammenhänge von Struktur, Funktionalität, Dynamik und Kinetik erörtert

und die grundlegenden Einflüsse verschiedener funktioneller Gruppen auf den Verlauf der

MAILLARD-Reaktion diskutiert.Reaktivität von Derivaten der D-Fructose

Zum Vergleich der Reaktivitäten von D-Fructose 1a in An- und Abwesenheit stöchiometrischer

Mengen der Aminosäuren 4a-4e sowie der entsprechenden AMADORI-Verbindungen 6a-6e wurden

wässrige Reaktionslösungen der Analyten unter definierten Bedingungen zur Reaktion gebracht. Diese

Modellreaktionen erfolgten bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C auf jeweils sechs konstant

gehaltenen pH-Stufen im Intervall von 1.5 ≤ 𝑝𝐻 ≤ 6.5. Die ablaufenden Reaktionen wurden dabei

durch die zeitabhängige Messung der Konzentrationen der Edukte und ausgewählter

Reaktionsintermediate sowie durch UV/Vis-spektroskopische Messungen des Fortschrittes der nicht

enzymatischen Bräunung verfolgt.

4.1.1 KINETIK DES ABBAUS VON D-FRUCTOSE, AMINOSÄUREN UND AMADORI-VERBINDUNGEN

Die Verfolgung des Abbaus der D-Fructose 1a, der Aminosäuren 4a-4e und der

AMADORI-Verbindungen 6a-6e erfolgte über einen Zeitraum von je etwa sechs Stunden. Dabei wurden

den Reaktionslösungen in regelmäßigen Zeitabständen Proben entnommen und mittels HPLC-RI auf

den jeweiligen Eduktgehalt hin untersucht. Dabei zeigte sich für alle Modellsysteme ein Minimum ihrer

Reaktivität in einem Bereich von pH 2.5-4.5. Die Stabilität der Systeme ist in diesem Bereich so groß,

dass sich der prozentuale Abbau der Edukte in einer Größenordnung befindet, der der

Messunsicherheit der Quantifizierungsmethode entspricht. Die Konzentrations-Zeit-Verläufe der

einzelnen Systeme wurden mit einem Kinetikmodell erster Ordnung angepasst. Für jede der

Messreihen wurde infolge die minimale Geschwindigkeitskonstante berechnet, ab der ein Eduktabbau

sicher erkannt werden kann. Dies ist genau dann der Fall, wenn sich die modellierten Konzentrationen

zu den Zeitpunkten 𝑡𝑆𝑡𝑎𝑟𝑡 und 𝑡𝐸𝑛𝑑𝑒 um mehr als das Dreifache der Wurzel der mittleren quadratischen

Abweichung zwischen gemessenen und modellierten Werten unterscheiden. Da die Streuung der

Messwerte für alle untersuchten Abbaukinetiken ähnlich ist, wurde die Summe des Mittelwertes und

der Standardabweichung aller minimalen Geschwindigkeitskonstanten als Quantifizierungsgrenze für

die Berechnung der Geschwindigkeitskonstanten des Eduktabbaus festgelegt.35 Die entsprechenden

Abbauraten erster Ordnung (angegeben in Hz = 1/s) der D-Fructose 1a, der Aminosäuren 4a-4e sowie

35 Die minimal quantifizierbare Abbaurate der Edukte im Rahmen der durchgeführten Modellreaktionen liegt in

etwa bei 5·10-6 Hz. Für eine Reaktionsdauer von sechs Stunden entspricht dies einer Abnahme der

Eduktkonzentration um rund 10%. Das entspricht einer Streuung der Messwerte von etwa 3.3%. Diese resultiert

größtenteils aus dem Versuchsaufbau. Als Reaktionsgefäß wurde ein 100 mL Sulfierkolben verwendet, in dessen

Hälsen Wasser kondensierte und ggf. wieder nachfloss. Dabei betrug das Volumen des Kondensates ca. 1 mL. Bei

einem Reaktionsvolumen von 50 mL entspricht das bereits einer Schwankung der Konzentrationen von rund 2%.


- 43 -

der AMADORI-Verbindungen 6a-6e sind in den Abbildungen 4 bis 6 in Abhängigkeit des pH-Wertes

dargestellt. Der jeweilige Mittelwert der minimal messbaren Geschwindigkeitskonstanten ist mit einer

gestrichelten Linie gekennzeichnet, die Summe aus Mittelwert und Standardabweichung mit einer

gepunkteten. Alle Datenpunkte, die außerhalb des jeweils rot markierten Bereiches liegen, dienen im

Rahmen dieser Arbeit als Grundlage für die Beurteilung der stofflichen Reaktivitäten. Abbildung 4

verdeutlicht, dass der Verlauf der pH-Abhängigkeit der Reaktivität der D-Fructose 1a vergleichbar ist

mit dem ihrer pH-abhängigen Anomerisierung.[67] Es zeigt sich ein Maximum der Stabilität um einen

pH-Wert von etwa 3.5. Sowohl mit zu- als auch mit abnehmendem pH-Wert steigen die Abbauraten

der untersuchten Systeme an. Auffällig dabei ist, dass die Abbaurate der D-Fructose 1a in Anwesenheit

aller untersuchten Aminosäuren 4a-4e zunimmt. Mit Ausnahme von Glycin 4c steigt die Abbaurate der

D-Fructose 1a mit der Abnahme der Stärke der Carbonsäurefunktion der Aminosäuren bei den

pH-Werten 5.5 und 6.5. Der pH-abhängige Verlauf der Abbauraten der D-Fructose 1a scheint in

Anwesenheit von Glycin 4c relativ zu allen übrigen Kurven um rund eine pH-Einheit in den sauren

Bereich verschoben.

Abbildung 4: Abbauraten der D-Fructose 1a in 0.5 M Lösung in An- und Abwesenheit stöchiometrischer Mengen der Aminosäuren 4a-4e in Abhängigkeit des pH-Wertes bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C. (Die gestrichelte Linie gibt die Grenze an, ab der Abbaureaktionen messbar sind. Die gepunktete Linie gibt die Grenze an, ab der Abbauraten quantifiziert werden können. Datenpunkte oberhalb der gepunkteten Linie sind somit für quantitative Vergleiche nutzbar.)

Betrachtet man demgegenüber die in Abbildung 5 dargestellten Abbauraten der Aminosäuren

4a-4e, so ist zu erkennen, dass lediglich eine einzige Abbaurate verlässlich berechnet werden konnte.

Dies ist bemerkenswert, da sich die jeweiligen Erkennungsschwellen für Abbaureaktionen bzgl. der

D-Fructose 1a und der Aminosäuren 4a-4e kaum voneinander unterscheiden. Außerdem war mit Blick

auf die Publikation von HEYNS und NOACK (1962)[111] sowie WESTPHAL et al. (1985)[301] eher davon

auszugehen, dass die Reaktionsmischung von D-Fructose 1a mit γ-Aminobuttersäure 4e die größten

Abbauraten zeigen würde. Die in dieser Arbeit beschriebenen Experimente wurden jedoch im

Unterschied zu denen der zitierten Arbeiten unter pH-konstanten Bedingungen durchgeführt. Das hat

zur Folge, dass der pH-Wert nicht, wie sonst üblich, in einen Bereich von pH 3.5-4.5 und damit etwa in

das Reaktivitätsminimum des Zuckers abdriftet.[16,302] Die Aminocarbonylreaktion ist damit in erster

Linie vom Dissoziationsgrad der Aminofunktion abhängig. Das Dissoziationsbestreben der

untersuchten Aminosäuren lässt sich anhand ihrer jeweiligen 𝑝𝐾𝑠-Werte vergleichen. Die im Rahmen

dieser Arbeit ermittelten Säurekonstanten sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

0

3

6

9

12

15

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

Ab

bau

rate

[1

0-6

Hz]

pH-Wert

D-FructoseD-Fructose + L-AlaninD-Fructose + L-ProlinD-Fructose + GlycinD-Fructose + β-AlaninD-Fructose + γ-Aminobuttersäure

D-Fructose

D-Fructose + L-Alanin

D-Fructose + L-Prolin

D-Fructose + Glycin

D-Fructose + β-Alanin

D-Fructose + γ-Aminobuttersäure


- 44 -

Tabelle 1: 𝑝𝐾𝑠-Werte der untersuchten Aminosäuren 4a-4e.

Aminosäure 𝒑𝑲𝒔𝟏 (Carboxylfunktion) 𝒑𝑲𝒔𝟐 (Aminofunktion)

L-Alanin 2.51 9.84 L-Prolin 2.42 10.40 Glycin 2.60 9.70 β-Alanin 3.71 10.19 γ-Aminobuttersäure 4.20 10.41

Es ist zu erkennen, dass die Aminofunktion von Glycin 4c mit einem 𝑝𝐾𝑠-Wert von 9.70 die

vergleichsweise schwächste Base ist. Damit ist die Wahrscheinlichkeit einer Kondensationsreaktion für

Glycin 4c am größten. Aufgrund seiner ähnlichen 𝑝𝐾𝑠-Werte wäre jedoch zu erwarten gewesen, dass

L-Alanin 4a ein entsprechendes Reaktionsverhalten zeigt. Da dies offenkundig nicht der Fall ist,

scheinen geringfügige Änderungen der Basizität bereits einen großen Einfluss auf die Reaktion zu

haben.

Abbildung 5: Abbauraten der Aminosäuren 4a-4e in 0.5 M Lösung in Anwesenheit stöchiometrischer Mengen an D-Fructose 1a in Abhängigkeit des pH-Wertes bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C. (Die gestrichelte Linie gibt die Grenze an, ab der Abbaureaktionen messbar sind. Die gepunktete Linie gibt die Grenze an, ab der Abbauraten quantifiziert werden können. Datenpunkte oberhalb der gepunkteten Linie sind somit für quantitative Vergleiche nutzbar.)

Die 𝑝𝐾𝑠-Werte der Aminofunktionen von L-Prolin 4b und γ-Aminobuttersäure 4e sind nahezu

identisch. Trotzdem zeigen sich große Differenzen im Reaktionsverhalten der Aminosäuren in

Kombination mit D-Fructose 1a. Dies lässt sich dadurch erklären, dass der Abbau des Zuckers nicht

ausschließlich über die Bildung der HEYNS-Verbindung 7 verläuft. Der Abbau erfolgt demnach in

Konkurrenz zur MAILLARD-Reaktion teilweise im Sinne der Karamellisierung. Dies entspricht den

Beobachtungen von KATO et al. (1969), die einen Carboxylat-vermittelten Abbau von D-Fructose 1a

beobachten konnten.[10] L-Prolin 4b und γ-Aminobuttersäure 4e unterscheiden sich in der Säurestärke

ihrer Carboxylfunktionen um nahezu zwei Zehnerpotenzen. Es ist demnach wahrscheinlich, dass auch

ihre katalytischen Aktivitäten sehr verschieden sind. Die Unterschiede der Abbauraten von D-Fructose

1a in Anwesenheit der verschiedenen Aminosäuren 4a-4e sind folglich auf die verschiedenen Einflüsse

der Amino- und Carboxylfunktion zurückzuführen. Dabei bestimmen deren jeweilige 𝑝𝐾𝑠-Werte

darüber, zu welchen Anteilen die MAILLARD-Reaktion sowie die Karamellisierung zur Gesamtreaktion

beitragen.

0

2

4

6

8

10

12

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

Ab

bau

rate

[1

0-6

Hz]

pH-Wert

L-Alanin

L-Prolin

Glycin

β-Alanin

γ-Aminobuttersäure

L-Alanin

L-Prolin

Glycin

β-Alanin

γ-Aminobuttersäure


- 45 -

Die AMADORI-Verbindungen 6a-6e zeigen insbesondere bei pH-Werten größer 4 im Vergleich

zu Reaktionsmischungen von D-Fructose 1a und den Aminosäuren 4a-4e eine deutlich erhöhte

Reaktivität. Abbildung 6 verdeutlicht, dass sich das Reaktionsverhalten der AMADORI-Verbindungen mit

α-ständiger Aminofunktion 6a-6c ähnelt. Das Verhalten der beiden übrigen AMADORI-Verbindungen 4d

und 4e unterscheidet sich sowohl hiervon als auch untereinander. Da sich bereits Einflüsse der

𝑝𝐾𝑠-Werte der Aminosäuren auf die Reaktivität von D-Fructose 1a zeigten, wurden zunächst auch die

𝑝𝐾𝑠-Werte der AMADORI-Verbindungen 6a-6e bestimmt (vgl. Tabelle 2). Diese weichen mehr oder

weniger stark von bisher publizierten Literaturwerten ab, liegen jedoch zumeist in derselben

Größenordnung.[127,129,149]

Tabelle 2: 𝑝𝐾𝑠-Werte der untersuchten AMADORI-Verbindungen 6a-6e.

AMADORI-Verbindung 𝒑𝑲𝒔𝟏 (Carboxylfunktion) 𝒑𝑲𝒔𝟐 (Aminofunktion)

Fructosylalanin 2.30 8.25 Fructosylprolin 2.12 8.37 Fructosylglycin 2.54 8.31 Fructosyl-β-alanin 3.39 8.84 Fructosyl-γ-aminobuttersäure 4.07 9.13

Es ist zu erkennen, dass solche AMADORI-Verbindungen ein ähnliches Abbauverhalten zeigen,

die durch ähnliche 𝑝𝐾𝑠-Werte gekennzeichnet sind. Dabei hat die Basizität der Aminofunktion offenbar

einen größeren Einfluss auf das Reaktionsverhalten als die Säurestärke der Carboxylfunktion. Trotzdem

ergibt sich auch hier kein einheitliches Bild, das eine direkte Korrelation mit den Eigenschaften einer

einzigen funktionellen Gruppe herstellt. Ferner kann auch ein Einfluss durch den Abstand der Carboxyl-

von der Aminofunktion auf die Abbaurate der AMADORI-Verbindungen nicht ausgeschlossen werden.

Abbildung 6: Abbauraten der AMADORI-Verbindungen 6a-6e in 0.025 M Lösung in Abhängigkeit des pH-Wertes bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C. (Die gestrichelte Linie gibt die Grenze an, ab der Abbaureaktionen messbar sind. Die gepunktete Linie gibt die Grenze an, ab der Abbauraten quantifiziert werden können. Datenpunkte oberhalb der gepunkteten Linie sind somit für quantitative Vergleiche nutzbar.)

Die Analyse der Abbaukinetiken der Zielsubstanzen erlaubt qualitative Aussagen hinsichtlich

des Einflusses der 𝑝𝐾𝑠-Werte auf das Reaktionsverhalten von Derivaten der D-Fructose. Es zeigt sich

hierbei deutlich, dass die Carboxyl-vermittelte Katalyse mit abnehmender Säurestärke an Effektivität

gewinnt. Demgegenüber fördert eine geringe Basizität der Aminofunktion die Wahrscheinlichkeit von

0

10

20

30

40

50

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

Ab

bau

rate

[1

0-6

Hz]

pH-Wert

FructosylalaninFructosylprolinFructosylglycinFructosyl-β-alaninFructosyl-γ-aminobuttersäure


- 46 -

Kondensationsreaktionen. Ob die beobachtete Zunahme der Reaktivität von AMADORI-Verbindungen

ebenfalls mit einer Abnahme der Basizität korreliert oder mit dem Abstand von Carboxyl- und

Aminofunktion zusammenhängt, kann an dieser Stelle vorerst nicht beantwortet werden.

4.1.2 KINETIK DER BILDUNG VON α-DICARBONYLVERBINDUNGEN

α-Dicarbonylverbindungen gelten als Schlüsselkomponenten der intermediären Phase der

MAILLARD-Reaktion.[303,304] Wie in Schema 13 (Seite 17) gezeigt, gehen diese aus dem Abbau von

AMADORI-Verbindungen 6 hervor, wobei sich analoge Reaktionsmechanismen auch für reine D-Fructose

1a formulieren lassen. D-Glucoson 9d sowie 1- und 3-Desoxyglucoson 9a und 9b gehen dabei unter

Erhalt des Kohlenstoffgerüstes aus den tautomeren Endiolen bzw. Enaminolen von Derivaten der

D-Fructose hervor. Dabei wird in der Literatur ein katalytischer Einfluss von Carbonsäuren auf deren

Bildung diskutiert.[6,10] Es ist aus diesem Grunde von Interesse zu untersuchen, ob ein solcher Einfluss

auch für Aminosäuren nachweisbar ist. In Kapitel 4.1.1 konnte gezeigt werden, dass in den meisten

Fällen keine zeitabhängigen Änderungen der Konzentrationen der untersuchten Aminosäuren im

Rahmen der Modellreaktionen festzustellen waren. Es ist daher davon auszugehen, dass

α-Dicarbonylverbindungen in den untersuchten Reaktionsmischungen der D-Fructose 1a mit den

Aminosäuren 4a-4e hauptsächlich über Reaktionen der Karamellisierung gebildet werden und

Kondensationsreaktionen im Sinne der MAILLARD-Reaktion nur eine untergeordnete Rolle spielen. In

Analogie zu den in Kapitel 2.3 diskutierten Überlegungen zur Katalyse der Anomerisierung ist auch für

die Enolisierung davon auszugehen, dass Aminofunktionen aufgrund ihrer Protonierung im

untersuchten pH-Bereich katalytisch inaktiv sind. Da sich die 𝑝𝐾𝑠-Werte der Carboxylfunktionen der

AMADORI-Verbindungen 6a-6e kaum von denen der entsprechenden Aminosäuren 4a-4e

unterscheiden, ist ein unterschiedliches Bildungsverhalten der α-Dicarbonylverbindungen auf einen

katalytischen Einfluss des Aminostickstoffs zurückzuführen. Der Vergleich der Bildungskinetiken der

genannten α-Dicarbonylverbindungen in Modellreaktionen der AMADORI-Verbindungen 6a-6e sowie

von D-Fructose 1a im Gemisch mit den Aminosäuren 4a-4e gibt daher Auskunft über den Einfluss der

Bindung des Zuckers an die Aminosäure auf die Reaktivität des jeweiligen Systems.

Die Verfolgung der Bildung von D-Glucoson 9d sowie 1- und 3-Desoxyglucoson 9a und 9b im

Verlauf der Modellreaktionen erfolgte über einen Zeitraum von je etwa sechs Stunden. Dabei wurden

den Reaktionslösungen in regelmäßigen Zeitabständen Proben entnommen, mit

ortho-Phenylendiamin zur Bildung stabiler Chinoxalinderivate der α-Dicarbonylverbindungen

derivatisiert und mittels HPLC-DAD auf die jeweiligen Konzentrationen der MAILLARD-Intermediate hin

untersucht. Da diese Intermediate – wie in Kapitel 2.1.4 beschrieben – zahlreiche Folgereaktionen

eingehen, kann der zeitliche Verlauf der jeweiligen Konzentrationen nicht mit einer isolierten

Bildungskinetik erster Ordnung angepasst werden. Vielmehr ist die Reaktionskinetik als ein System von

parallelen Folgereaktionen zu modellieren. Dieses ergibt sich auf Grundlage von Schema 20.


- 47 -

Schema 20: System paralleler Folgereaktionen am Beispiel der Bildung und des Abbaus der α-Dicarbonylverbindungen D-Glucoson (GLUC) 9d sowie 1- und 3-Desoxyglucoson (1-DG und 3-DG) 9a und 9b. FP 1, FP 2 und FP 3 bezeichnen nicht weiter definierte Folgeprodukte.

Wie in Schema 13 (Seite 17) zu erkennen ist, unterscheiden sich die Bildungsmechanismen der

drei in Schema 20 gezeigten α-Dicarbonylverbindungen 9a, 9b und 9d nicht in ihrem ersten

Reaktionsschritt. Es erfolgt in jedem Falle die Bildung einer Enolstruktur. 1-Desoxyglucoson 9a und

3-Desoxyglucoson 9b resultieren jeweils aus einem darauffolgenden Eliminierungsschritt. Die Bildung

von D-Glucoson 9d erfolgt demgegenüber über eine stufenweise Oxidation. Hierbei handelt es sich im

Gegensatz zu den genannten Eliminierungsreaktionen um eine zumindest bimolekulare Reaktion.

Damit ist die Kinetik der Bildung von D-Glucoson 9d vom Redoxstatus der Reaktionslösung abhängig.

Das Reduktionsvermögen von Reaktionslösungen nicht enzymatischer Bräunungsreaktionen korreliert

mit der Farbentwicklung der Modellsysteme und nimmt damit zeitabhängig zu.[305,306] Es ist daher

anzunehmen, dass sich die Bildungsrate von D-Glucoson 9d mit zunehmender Reaktionsdauer

vermindert. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde der Konzentrationsverlauf von D-Glucoson 9d

in einer Reaktionsmischung von D-Fructose 1a und β-Alanin 4d bei pH 6.5 während der Aufheizphase

von Raumtemperatur auf 90 °C (und darüber hinaus) in drei unabhängigen Experimenten verfolgt.

Dabei wurde der Reaktionslösung im ersten Experiment nach erfolgter Erhitzung Maltol 16 als

Reduktionsmittel und im zweiten Experiment FREMYS Salz als Oxidationsmittel hinzugefügt. Das dritte

Experiment diente als Kontrolle ohne die Zugabe eines zusätzlichen Reaktanden. Abbildung 7 zeigt die

zeitabhängige Entwicklung der Konzentration von D-Glucoson 9d in den drei beschriebenen

Experimenten.

Abbildung 7: Zeitabhängiger Verlauf der Konzentration von D-Glucoson 9d bei der Reaktion von D-Fructose 1a mit β-Alanin 4d (je 0.5 M) bei pH 6.5 während der Aufheizphase der Reaktionslösung von Raumtemperatur auf 90 °C. Bei einer Temperatur von 90 °C erfolgte die Zugabe eines Reduktions- (Maltol) bzw. Oxidationsmittels (FREMYS Salz) (je 0.05 M). Eine dritte Reaktionslösung diente als Kontrolle. Die logarithmische Skalierung der Ordinatenachse ist zu beachten.

5

50

500

5000

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Ko

nze

ntr

atio

n v

on

D-G

luco

son

[µ

mo

l/L]

Zeit t [min]

D-Fructose + β-AlaninD-Fructose + β-Alanin + MaltolD-Fructose + β-Alanin + Fremys Salz

Zugabe des Oxidations- bzw. Reduktionsmittels

D-Fructose + β-Alanin D-Fructose + β-Alanin + Maltol D-Fructose + β-Alanin + FREMYS Salz


- 48 -

Der jeweilige Einfluss des Oxidations- und Reduktionsmittels ist anhand der Kurvenverläufe

deutlich zu erkennen. Abbildung 8 zeigt demgegenüber, dass die hinzugefügten Reaktanden keinen

Einfluss auf die Bildungskinetik von 3-Desoxyglucoson 9b haben. Gleiches gilt für die Bildung von

1-Desoxyglucoson 9a (hier nicht gezeigt).

Abbildung 8: Zeitabhängiger Verlauf der Konzentration von 3-Desoxyglucoson 9b bei der Reaktion von D-Fructose 1a mit β-Alanin 4d (je 0.5 M) bei pH 6.5 während der Aufheizphase der Reaktionslösung von Raumtemperatur auf 90 °C. Bei einer Temperatur von 90 °C erfolgte die Zugabe eines Reduktions- (Maltol) bzw. Oxidationsmittels (FREMYS Salz) (je 0.05 M). Eine dritte Reaktionslösung diente als Kontrolle. Die logarithmische Skalierung der Ordinatenachse ist zu beachten.

Wie aus den Abbildungen 7 und 8 hervorgeht, ist es nicht möglich, den zeitlichen Verlauf der

Konzentration von D-Glucoson 9d über Kinetikmodelle erster Ordnung zu beschreiben. Folglich werden

im Rahmen dieser Arbeit lediglich die Bildungsraten von 1- und 3-Desoxyglucoson 9a und 9b in

Abhängigkeit des pH-Wertes ermittelt. Schema 20 vereinfacht sich somit durch die Vernachlässigung

des rot gekennzeichneten Reaktionsweges. Die Integration der entsprechenden Konzentrations-Zeit-

Gesetze führt zu den Gleichungen (39) bis (41), die den zeitabhängigen Verlauf der Konzentrationen

des jeweiligen Eduktes sowie der Zielintermediate beschreiben.

[Fru/AMV]𝑡 = [Fru/AMV]𝑡=0𝑠 ∙ 𝑒𝑥𝑝(−(𝑘1 + 𝑘2) ∙ 𝑡) (39)

[1-DG]𝑡 =𝑘1 ∙ [Fru/AMV]𝑡=0𝑠𝑘−1 − 𝑘1 − 𝑘2

∙ (𝑒𝑥𝑝(−(𝑘1 + 𝑘2) ∙ 𝑡) − 𝑒𝑥𝑝(−𝑘−1 ∙ 𝑡)) (40)

[3-DG]𝑡 =𝑘2 ∙ [Fru/AMV]𝑡=0𝑠𝑘−2 − 𝑘1 − 𝑘2

∙ (𝑒𝑥𝑝(−(𝑘1 + 𝑘2) ∙ 𝑡) − 𝑒𝑥𝑝(−𝑘−2 ∙ 𝑡)) (41)

Betrachtet man die Vielzahl möglicher Reaktionen, die von Derivaten der D-Fructose ausgehen,

so handelt es sich bei den letztgenannten Gleichungen zweifellos lediglich um Approximationen. Da es

sich bei 1- und 3-Desoxyglucoson 9a und 9b jedoch durchaus um zwei der quantitativ bedeutsamsten

direkten Folgeprodukte handelt, ist eine Berechnung ihrer Bildungs- und Abbauraten im Sinne der

2

20

200

2000

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Ko

nze

ntr

atio

n v

on

3

-De

soxy

glu

coso

n[µ

mo

l/L]

Zeit t [min]

D-Fructose + β-AlaninD-Fructose + β-Alanin + MaltolD-Fructose + β-Alanin + Fremys Salz

Zugabe des Oxidations- bzw. Reduktionsmittels

D-Fructose + β-Alanin D-Fructose + β-Alanin + Maltol D-Fructose + β-Alanin + FREMYS Salz


- 49 -

Gleichungen (40) und (41) zulässig.36 Bemerkenswert ist zunächst, dass die Bildungsraten sowohl von

1- als auch von 3-Desoxyglucoson 9a und 9b mit zunehmender Protonenkonzentration abnehmen (vgl.

Abbildung 9 und Abbildung 10), obwohl die Raten der Anomerisierung im sauren Milieu stark

zunehmen.[67] Das ist verwunderlich, da sich der Auftaktprozess der Anomerisierung nicht von dem der

Enolisierung unterscheidet, von der aus die Bildung der α-Dicarbonylverbindungen 9a und 9b erfolgt.

Ausgehend von einer protonierten Spezies der D-Fructose 1a erfolgt die Anomerisierung im sauren

Milieu durch die Öffnung des Ringes und eine anschließende Abstraktion des überschüssigen Protons

durch Wasser. Die Basizität des Wassers reicht dabei nicht aus, ein kohlenstoffgebundenes Proton zu

abstrahieren und damit eine Enolisierung zu bewirken. Im basischen Milieu ist dagegen von

anionischen Spezies der D-Fructose 1a auszugehen. Diese stellen ihrerseits starke Basen dar, sodass es

unter Abspaltung eines kohlenstoffgebundenen Protons zur Ringöffnung kommen kann. Dieser

Prozess stellt einen alternativen Mechanismus der Ringöffnung im Zuge der Enolisierung dar. Die

entsprechenden Mechanismen zeigt Schema 21.

Schema 21: Zusammenhang von Anomerisierung und Enolisierung anionischer Spezies der D-Fructose 1a im Vergleich zur Anomerisierung kationischer Spezies der D-Fructose 1a.

Da der Mechanismus von der räumlichen Nähe des kohlenstoffgebundenen Protons zur

anomeren Hydroxylfunktion abhängig ist, erklären sich hiermit auch die größeren Bildungsraten von

3-Desoxyglucoson 9b in Modellreaktionen der D-Fructose 1a gegenüber denen von 1-Desoxyglucoson

9a. Es zeigt sich weiterhin, dass die untersuchten Aminosäuren 4a-4e einen Einfluss auf die

entsprechenden Bildungsraten haben. Dieser Einfluss macht sich insbesondere in einem pH-Bereich

von 3.5 bis 4.5 in Form einer Beschleunigung der Reaktionsraten bemerkbar. Bei einem pH-Wert von

6.5 ist allerdings eher von einer Hemmung der betrachteten Reaktionen auszugehen.

36 Da es sich bei den numerisch ermittelten Geschwindigkeitskonstanten lediglich um approximierte Werte

handelt, wird an dieser Stelle bewusst auf eine Berechnung entsprechender Standardfehler verzichtet. Diese

würden den tatsächlichen Fehler der ermittelten Raten nicht repräsentativ widerspiegeln, sondern

unterschätzen.


- 50 -

Abbildung 9: Bildungsraten von 3-Desoxyglucoson 9b in Reaktionslösungen der D-Fructose 1a in An- und Abwesenheit äquimolarer Mengen der Aminosäuren 4a-4e (je 0.5 M) in Abhängigkeit des pH-Wertes bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C.

Um dieses Verhalten zu erklären, ist die Stabilität der HEYNS-Verbindungen 7 zu betrachten,

auf die in der obigen Diskussion zum Abbau von Glycin 4c (vgl. Kapitel 4.1.1) noch nicht eingegangen

wurde. HEYNS-Verbindungen 7 lassen sich durch den katalytischen Einfluss von Carbonsäuren (etwa

Essigsäure) hydrolytisch in ihre Edukte spalten.[108,111] Es ist demnach möglich, dass ein Abbau von

Glycin 4c nicht nur aufgrund dessen geringer Basizität beobachtet werden konnte, sondern auch, da

dessen HEYNS-Verbindungen 7 am wenigsten stark zur Hydrolyse neigen. Damit besteht die

Möglichkeit, dass die Kondensation von D-Fructose 1a mit Aminosäuren zu HEYNS-Verbindungen 7 in

Konkurrenz zur Enolisierung steht. Dies kann in Analogie zu Schema 5 (Seite 9) mit Hilfe der in

Schema 22 aufgezeigten Reaktionsmöglichkeiten verdeutlicht werden.

Schema 22: Einflussmöglichkeiten der Aminofunktion einer Aminosäure auf das Reaktionsverhalten von D-Fructose 1a. *Der dargestellte Mesomeriepfeil ist als Gleichgewichtsreaktionspfeil zu verstehen.

0.0

0.2

0.4

0.6

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

Bild

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z]

pH-Wert


D-Fructose D-Fructose + L-Alanin D-Fructose + L-Prolin D-Fructose + Glycin D-Fructose + β-Alanin D-Fructose + γ-Aminobuttersäure


- 51 -

Die elektroneutrale Aminofunktion kann, ausgehend von einer kationischen Spezies der

D-Fructose 1a, drei Reaktionswege einschlagen. Davon sind die ersten beiden Wege im für diese Arbeit

relevanten pH-Bereich aus den in Kapitel 2.3 diskutierten Gründen vermutlich maßgeblich durch die

Carboxylfunktion der Aminosäure katalysiert. Dadurch ergeben sich die im Vergleich zu reinen

Reaktionsmodellen der D-Fructose 1a erhöhten Bildungsraten von 3-Desoxyglucoson 9b in Mischungen

der D-Fructose 1a mit den Aminosäuren 4a-4e im pH-Bereich der 𝑝𝐾𝑠-Werte ihrer Carboxylfunktionen.

Mit weiter steigendem pH-Wert wächst die relative Konzentration der anionischen

Aminosäurespezies, sodass der dritte Reaktionsweg an Bedeutung gewinnt und in Konkurrenz zu den

Tautomerisierungen (Weg 1 und 2) tritt. Damit wird die Bildung von 3-Desoxyglucoson 9b aus

D-Fructose 1a immer unwahrscheinlicher und muss nunmehr aus der jeweiligen HEYNS-Verbindung 7

erfolgen. Diese Reaktion steht jedoch wiederum in Konkurrenz zur hydrolytischen Spaltung der

HEYNS-Verbindungen 7. Noch deutlicher werden diese Zusammenhänge an den pH-abhängigen

Bildungsraten von 1-Desoxyglucoson 9a. Wie Abbildung 10 verdeutlicht, nehmen diese in Gegenwart

der Aminosäuren 4a-4e bei pH-Werten größer 4.5 im Vergleich zum Reaktionsmodell reiner D-Fructose

1a noch stärker ab, als es bei den Bildungsraten des 3-Desoxyglucosons 9b der Fall ist (vgl.

Abbildung 9). Dies ist dadurch zu erklären, dass eine Bildung von 1-Desoxyglucoson 9a ausgehend von

HEYNS-Verbindungen 7 mechanistisch nicht unmittelbar möglich ist.

Abbildung 10: Bildungsraten von 1-Desoxyglucoson 9a in Reaktionslösungen der D-Fructose 1a in An- und Abwesenheit äquimolarer Mengen der Aminosäuren 4a-4e (je 0.5 M) in Abhängigkeit des pH-Wertes bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C.

Die kovalente Bindung der Aminosäuren 4a-4e an den Grundkörper der D-Fructose 1a bewirkt

eine bis zu 100-fache Beschleunigung der Bildungsraten der α-Dicarbonylverbindungen 9a und 9b. Da

AMADORI-Verbindungen 6 kaum einer hydrolytischen Spaltung unterliegen[108] und auch

Kondensationsreaktionen keine Rolle spielen, ergibt sich diese Reaktivitätssteigerung aus der direkten

Bindung des Zuckers an den Aminostickstoff. Dabei ist auffallend, dass sich alle AMADORI-Verbindungen

der α-Aminosäuren 6a-6c ähnlich verhalten. Das zeigt sich insbesondere am Bildungsverhalten des

3-Desoxyglucosons 9b. Ebenso wie zuvor in Abbildung 6 (Seite 45) ist ein Minimum der Bildungsrate

im Bereich von pH 3.5-4.5 zu erkennen. Interessant ist, dass trotz einer beschleunigten Bildung des

3-Desoxyglucosons 9b im stärker sauren pH-Milieu in diesem Bereich keine Zunahme der

Bildungsraten von 1-Desoxyglucoson 9a zu verzeichnen ist. Gleichermaßen ist auch D-Glucoson 9d in

diesem pH-Bereich kaum nachweisbar, obwohl es sich in Analogie zum 3-Desoxyglucoson 9b über das

1,2-Enaminol der AMADORI-Verbindungen 6(vii) bildet. Entsprechend kann im sauren Milieu entweder

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0.03

0.06

0.09

0.12

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Bild

un

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1

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z]

pH-Wert




- 52 -

keine Oxidation des 1,2-Enaminols 6(vii) erfolgen oder es existiert ein alternativer

Bildungsmechanismus für 3-Desoxyglucoson 9b, der eine gleichzeitige Bildung von D-Glucoson 9d

ausschließt.37 Abbildung 11 zeigt weiterhin, dass die Bildungsraten von 3-Desoxyglucoson 9b,

ausgehend von AMADORI-Verbindungen der α-Aminosäuren 6a-6c, mit steigendem pH-Wert weniger

stark zunehmen als die der ω-Aminosäuren 6d und 6e. Ob dieses Verhalten die Folge einer

Carboxyl-vermittelten Katalyse oder des unterschiedlichen Abstandes von Carboxyl- und

Aminofunktion ist, lässt sich an dieser Stelle noch nicht beantworten.

Abbildung 11: Bildungsraten von 3-Desoxyglucoson 9b in Reaktionslösungen der AMADORI-Verbindungen 6a-6e (je 0.025 M) in Abhängigkeit des pH-Wertes bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C. Die logarithmische Skalierung der Ordinatenachse ist zu beachten.

Gleichermaßen ähnlich verhalten sich die AMADORI-Verbindungen der α-Aminosäuren 6a-6c in

Bezug auf die pH-abhängigen Bildungsraten des 1-Desoxyglucosons 9a, die in Abbildung 12 dargestellt

sind. Der Unterschied besteht jedoch darin, dass die Bildungsraten gegenüber denen der

AMADORI-Verbindungen der ω-Aminosäuren 6d und 6e in diesem Fall signifikant erhöht sind.

Abbildung 12: Bildungsraten von 1-Desoxyglucoson 9a in Reaktionslösungen der AMADORI-Verbindungen 6a-6e (je 0.025 M) in Abhängigkeit des pH-Wertes bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C. Die logarithmische Skalierung der Ordinatenachse ist zu beachten.

37 Die Frage, welche dieser Alternativen die wahrscheinlichere ist, wird in Kapitel 4.2.1 beantwortet.

1

5

25

125

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

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z]

pH-Wert

FructosylalaninFructosylprolinFructosylglycinFructosyl-β-alaninFructosyl-γ-aminobuttersäure

0.01

0.1

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0-6

Hz]

pH-Wert

Fructosylalanin

Fructosylprolin

Fructosylglycin

Fructosyl-β-alanin

Fructosyl-γ-aminobuttersäure


- 53 -

Das bedeutet, dass die Freisetzung der untersuchten α-Dicarbonylverbindungen 9a und 9b

nicht von denselben Faktoren abhängig ist. Da letztlich nur zwei offensichtliche Einflussfaktoren zur

Diskussion stehen, ist die Bildung einer α-Dicarbonylverbindung vermehrt von einer Carboxylkatalyse

abhängig, während die der anderen sensitiv gegenüber strukturellen Veränderungen ist. Damit

unterscheiden sich die entsprechenden Bildungsmechanismen grundlegender, als es die Analogie der

jeweiligen Enolisierungs- und Elimierungsreaktionen vermuten lässt.

4.1.3 KINETIK DER FARBENTWICKLUNG BEI REAKTIONEN VON DERIVATEN DER D-FRUCTOSE

Im vorigen Kapitel wurde bereits beschrieben, dass α-Dicarbonylverbindungen

Schlüsselintermediate der MAILLARD-Reaktion sind. Dabei ist bekannt, dass sie potente Vorstufen

sowohl von heterocyclischen Verbindungen als auch von Bräunungsprodukten darstellen.[307] Wie in

Kapitel 2.1.4 beschrieben, ist insbesondere die Bildung heterocyclischer Verbindungen auch direkt aus

den cyclischen Anomeren von Derivaten der D-Fructose möglich. Eine Vielzahl derartiger

MAILLARD-Intermediate zeichnet sich durch hohe Extinktionskoeffizienten im UV-Bereich des

elektromagnetischen Spektrums aus. Es ist daher möglich, den Verlauf der frühen sowie intermediären

MAILLARD-Reaktion anhand von Extinktionsmessungen bei einer Wellenlänge von 284 nm zu

verfolgen.[190] Da die Zunahme der Extinktion nicht auf eine einzige Reaktion zurückgeführt werden

kann, ist die entsprechende Kinetik nicht auf Grundlage von Reaktionsmechanismen modellierbar.

Vielmehr hat es sich in diesem Zusammenhang bewährt, entsprechende Kinetiken rein empirisch mit

Hilfe logistischer Verteilungsfunktionen anzupassen.[5,167] Die auf dieser Basis berechneten

Geschwindigkeitskonstanten sind demnach nicht mit denen der hier beschriebenen Abbau- und

Bildungsreaktionen zu vergleichen. Sie dienen lediglich zur Veranschaulichung der Farbentwicklung.

Da Änderungen der Extinktionen von MAILLARD-Reaktionslösungen im UV/Vis-Bereich bereits

auftreten, wenn ein Abbau der Edukte analytisch noch nicht erfassbar ist, handelt es sich hierbei um

eine sehr empfindliche Methode zur Beurteilung der relativen Reaktivitäten verschiedener

Reaktionssysteme. Im Verlauf der nicht enzymatischen Bräunung verschiebt sich die

UV/Vis-Absorption von Reaktionslösungen mehr und mehr in den Bereich größerer Wellenlängen und

damit vom UV- in den visuellen Bereich. Das macht sich in einer Färbung von farblos nach gelb über

braun bis hin zu schwarz bemerkbar. Der Verlauf der fortgeschrittenen MAILLARD-Reaktion kann somit

im visuellen Bereich des elektromagnetischen Spektrums – üblicherweise bei einer Wellenlänge von

420 nm – verfolgt werden.[5,167-169] Die Abbildungen 13 und 14 zeigen, dass die Farbentwicklung von

D-Fructose 1a durch die Anwesenheit der Aminosäuren 4a-4e deutlich beschleunigt ist. Weiterhin

entspricht der pH-Verlauf der Bräunungsraten (Extinktion bei 420 nm) im Wesentlichen dem der

Bildungsraten des 3-Desoxyglucosons 9b. Demgegenüber nehmen die Raten der Extinktionszunahme

bei 284 nm nach Durchlauf eines Minimums mit steigender Protonenkonzentration zu. Das

untermauert die in Kapitel 2.1.4 formulierten Reaktionsmechanismen, in denen die Bildung

heterocyclischer Verbindungen direkt aus den Derivaten der D-Fructose dargestellt ist. Der Einfluss der

Aminosäuren 4a-4e auf die Extinktionszunahme bei 284 nm ist stark ausgeprägt (vgl. Abbildung 13). Je

nach pH-Wert ist die Extinktionszunahme von Reaktionslösungen der D-Fructose 1a in Anwesenheit

der Aminosäuren 4a-4e bei 284 nm rund 5- bis 20-mal schneller als von Lösungen reiner D-Fructose 1a.

Die Art der Aminosäure spielt dabei nur eine untergeordnete Rolle. Für pH 6.5 ergibt sich jedoch

dieselbe Reaktivitätsreihenfolge, die auch für die Abbauraten der D-Fructose 1a beobachtet wurde.


- 54 -

Abbildung 13: Raten der Extinktionszunahme bei 284 nm (Geschwindigkeit der frühen MAILLARD-Reaktion) in Abhängigkeit des pH-Wertes für Modellreaktionen der D-Fructose 1a in An- und Abwesenheit äquimolarer Mengen der Aminosäuren 4a-4e bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C.

Ähnliches gilt für die Betrachtung der Extinktionszunahme bei 420 nm. Hier ist jedoch der

deutliche Trend einer Steigerung der Bräunungsraten mit Abnahme der Stärke der

Carbonsäurefunktion der Aminosäuren zu erkennen (vgl. Abbildung 14). Lediglich die pH-abhängige

Kurve der Bräunungsraten von Glycin 4c ist um rund eine pH-Einheit in den sauren Bereich verschoben,

wie auch schon bei den Abbauraten der D-Fructose 1a beobachtet wurde (vgl. Abbildung 4, Seite 43).

Es kann entsprechend von einer Carbonsäurekatalyse der nicht enzymatischen Bräunung ausgegangen

werden. Die Reihenfolge der Bräunungsraten entspricht der Reihenfolge der Abbauraten der

D-Fructose 1a im pH-Bereich von etwa 3.5 bis 6.5. Der Unterschied der Parameter liegt jedoch darin,

dass Änderungen der Extinktion bei 420 nm im Falle der hier vorliegenden Modellreaktionslösungen

wesentlich empfindlicher gemessen werden können als Konzentrationsänderungen der D-Fructose 1a.

Abbildung 14: Raten der Extinktionszunahme bei 420 nm (Geschwindigkeit der fortgeschrittenen MAILLARD-Reaktion) in Abhängigkeit des pH-Wertes für Modellreaktionen der D-Fructose 1a in An- und Abwesenheit äquimolarer Mengen der Aminosäuren 4a-4e bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C.

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0.002

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Hz]

pH-Wert


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0.0003

0.0006

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z]

pH-Wert

D-Fructose



D-Fructose + Glycin




D-Fructose



D-Fructose + Glycin




- 55 -

Für pH-Werte von größer als 3.5 können daher auch Bräunungsraten zum qualitativen

Vergleich der Reaktivitäten von D-Fructose 1a in An- und Abwesenheit der Aminosäuren 4a-4e dienen.

Unter den gegebenen Reaktionsbedingungen erhöhen die untersuchten Aminosäuren 4a-4e die

Reaktivität der D-Fructose 1a in äquimolaren Gemischen um einen Faktor von 1.2 bis 7.1 (im Falle der

Bräunungsraten) bzw. 1.5 bis 2.2 (im Falle der Abbauraten bei pH 6.5). Die kovalente Bindung der

Aminosäuren 4a-4e an den Grundkörper der D-Fructose 1a führt, wie die Abbildungen 15 und 16

zeigen, zu einer noch deutlicheren Erhöhung der Reaktivität.

Abbildung 15: Raten der Extinktionszunahme bei 284 nm (Geschwindigkeit der frühen MAILLARD-Reaktion) in Abhängigkeit des pH-Wertes für Modellreaktionen der D-Fructose 1a sowie der AMADORI-Verbindungen 6a-6e bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C.

Gemessen an den Bräunungsraten (Zunahme der Extinktion bei 420 nm) sind die

untersuchten AMADORI-Verbindungen 6a-6e bei pH-Werten größer 3.5 ca. 25- bis 42-fach reaktiver als

D-Fructose 1a. Ein Vergleich der jeweiligen Abbauraten bei pH 6.5 führt demgegenüber zu einer um

den Faktor 3 bis 8 erhöhten Reaktivität. Mit Ausnahme der Extinktionszunahme bei 284 nm in

Modellreaktionen der Fructosyl-γ-aminobuttersäure 6e verhalten sich alle AMADORI-Verbindungen in

Bezug auf die zeitabhängigen Veränderungen ihrer UV/Vis-Absorptionen ähnlich. Mit Verweis auf die

Bildungsraten der α-Dicarbonylverbindungen bedeutet dies, dass 1- und 3-Desoxyglucoson 9a und 9b

gleichermaßen zur Bildung heterocyclischer Verbindungen sowie von Bräunungsprodukten beitragen.

Die erhöhten Raten der Extinktionszunahme bei 284 nm im Falle von Modellreaktionen der

Fructosyl-γ-aminobuttersäure 6e lassen sich durch die Bildung diverser 2-Pyrrolidonderivate erklären,

bei denen es sich um spezifische MAILLARD-Intermediate der γ-Aminobuttersäure 4e handelt.

2-Pyrrolidon selbst zeigt zwar keine Absorption bei 284 nm, es sind jedoch zahlreiche heterocyclische

Verbindungen beschrieben, bei denen 2-Pyrrolidon als Substituent konjugierter Heterocyclen auftritt,

die entsprechende Absorptionsbanden aufweisen.[308,309]

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

Ge

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win

dig

keit

de

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M

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LAR

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eak

tio

n [

Hz]

pH-Wert

D-FructoseFructosylalaninFructosylprolinFructosylglycinFructosyl-β-alaninFructosyl-γ-aminobuttersäure

D-Fructose Fructosylalanin Fructosylprolin Fructosylglycin Fructosyl-β-alanin Fructosyl-γ-aminobuttersäure


- 56 -

Abbildung 16: Raten der Extinktionszunahme bei 420 nm (Geschwindigkeit der fortgeschrittenen MAILLARD-Reaktion) in Abhängigkeit des pH-Wertes für Modellreaktionen der D-Fructose 1a sowie der AMADORI-Verbindungen 6a-6e bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C.

Kapitel 4.1 zeigt, dass Aminosäuren einen Einfluss auf die Reaktivität der D-Fructose 1a

haben. Dabei ist in Modellreaktionen von D-Fructose 1a in äquimolaren Mischungen mit den

Aminosäuren 4a-4e eine Katalyse von Abbau- und Bräunungsreaktionen durch die Carboxylfunktion

der Aminosäuren erkennbar. Die Basizität der Aminofunktion beeinflusst demgegenüber das Ausmaß

von Kondensationsreaktionen zwischen D-Fructose 1a und den Aminosäuren 4a-4e. Die kovalente

Bindung der Aminosäuren 4a-4e an den Grundkörper der D-Fructose 1a hat eine starke Erhöhung der

Reaktivität zur Folge. Diese zeigt sich in beschleunigten Abbau-, Bräunungs- sowie Bildungsraten von

1- und 3-Desoxyglucoson 9a und 9b. Ein Vergleich der Bildungsraten der genannten

α-Dicarbonylverbindungen (vgl. Abbildungen 11 und 12, Seite 52) und den in Abbildung 16

dargestellten Bräunungsraten lässt darauf schließen, dass beide Desoxyosone 9a und 9b etwa

gleichermaßen zur Gesamtbräunung der Reaktionslösungen beitragen. Dabei ist die Bildung der

verschiedenen α-Dicarbonylverbindungen zum einen ebenfalls von einer Carboxyl-vermittelten

Katalyse abhängig, zum anderen scheint auch der räumliche Abstand zwischen Amino- und

Carboxylfunktion eine wichtige Bedeutung zu haben. Legt man die Abbauraten der Zielsubstanzen bei

pH 6.5 zugrunde, erhöhen die Aminosäuren 4a-4e die Reaktivität der D-Fructose 1a in äquimolaren

Mischungen um rund 20-120%. Die kovalente Bindung der Aminosäuren 4a-4e an den Grundkörper

der D-Fructose 1a führt zu einer drei- bis achtfachen Erhöhung der Reaktivität gegenüber

Modellreaktionen der D-Fructose 1a.

4.2 Charakterisierung der Anomerensysteme

In Kapitel 4.1 konnte gezeigt werden, dass die Reaktivität von Derivaten der D-Fructose neben

einer Katalyse durch Carbonsäuren auch von strukturellen Faktoren abhängig ist. Weiterhin stimmt

der pH-abhängige Verlauf der Abbauraten der D-Fructose 1a qualitativ mit dem pH-abhängigen Verlauf

ihrer Mutarotationsraten überein. Dabei zeigen die Kapitel 2.3 und 4.1.3, dass sowohl die

Anomerisierung als auch die Bräunung durch Carbonsäuren katalysiert werden können. Es ist demnach

im Folgenden zu klären, inwieweit die Reaktivität der D-Fructose 1a mit der Dynamik ihrer

Anomerisierung zusammenhängt. Zur Klärung dieser Frage folgt zunächst eine NMR-spektroskopische

Charakterisierung der jeweiligen Anomerensysteme. In diesem Zusammenhang ist darüber hinaus der

0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.010

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pH-Wert

D-FructoseFructosylalaninFructosylprolinFructosylglycinFructosyl-β-alaninFructosyl-γ-aminobuttersäure

D-Fructose Fructosylalanin Fructosylprolin Fructosylglycin Fructosyl-β-alanin Fructosyl-γ-aminobuttersäure


- 57 -

Einfluss des Abstandes von Amino- und Carboxylfunktion auf die Bildung der Desoxyosone 9a und 9b

zu untersuchen.

4.2.1 STRUKTURAUFKLÄRUNG DER ANOMERENSYSTEME

Die Strukturaufklärung der Anomerensysteme der D-Fructose 1a sowie der

AMADORI-Verbindungen 6a-6e erfolgte auf Basis der hochauflösenden NMR-Spektroskopie. Da 1H-NMR-Spektren der jeweiligen Analyten im Saccharidbereich (3.4-4.0 ppm)[310] stark überlagert sind

und weder D-Fructose 1a noch deren Derivate 6a-6e ein anomeres Proton tragen, dienten die

jeweiligen anomeren 13C-NMR-Signale als Ankergruppen für die Strukturaufklärung. Über

Korrelationspeaks in HMBC-Spektren wurden diese ihren angrenzenden Spinsystemen zugeordnet. Die

vollständige Aufklärung der Spinsysteme erfolgte auf Basis von COSY- und HSQC-TOCSY-Experimenten.

Kopplungskonstanten wurden mit Hilfe von J-resolved-Experimenten gemessen, auf deren Grundlage

die Konformation der jeweiligen pyranoiden Sesselstrukturen abgeleitet wurde. Die Zuordnung von 1H-13C-Konnektivitäten erfolgte mittels HSQC-Experimenten und die Ringgröße der Zuckeranomere

wurde mit Hilfe von HMBC-Spektren bestimmt.

Alle untersuchten Derivate der D-Fructose zeigen vier Signale im anomeren Bereich der 13C-NMR-Spektren. Darüber hinaus findet sich im Bereich von etwa 205-215 ppm je ein Signal, das dem

Ketokohlenstoffatom des jeweiligen acyclischen Isomers 1a(v) bzw. 6(v) zuzuordnen ist. Die anomeren 13C-NMR-Signale der furanoiden Anomere liegen bei tieferem Feld als die der pyranoiden, wobei das

Signal der β-Furanosen 1a(iv) bzw. 6(iv) bei höherem Feld liegt als das der α-Furanosen 1a(iii) bzw.

6(iii).[311,312] Die vollständige Signalzuordnung steht jeweils im Einklang mit den in den Schemata 2 und

12 gezeigten Anomerensystemen. Da jedoch keinerlei Messung in H218O durchgeführt wurde, konnten

keine Hinweise auf acyclische gem-Diole 1a(vi) bzw. 6(vi) identifiziert werden. Wie bereits in den

Kapiteln 2.1.1.1 und 2.1.3.2 diskutiert wurde, ist die Struktur der α-pyranoiden Isomere 1a(i) und 6(i)

nicht abschließend aufgeklärt. Es zeigen sich vielmehr Hinweise darauf, dass eine schnelle 5C2 2C5

Ringinversion vorliegen könnte. Wenn dies der Fall ist, muss es sich bei dem anomeren 13C-NMR-Signal

der α-Pyranose 1a(i) bzw. 6(i) um ein gemitteltes Signal beider Konformere handeln (schneller

chemischer Austausch). Solange beide Konformere in ähnlichen relativen Konzentrationen

nebeneinander vorliegen, muss eine Verringerung der Temperatur bzw. eine Erhöhung der

magnetischen Flussdichte des Hauptmagnetfeldes demnach zu einer Erhöhung der Linienbreite der

Resonanz des anomeren Kohlenstoffsignals der α-Pyranose 1a(i) bzw. 6(i) führen. Um dies zu testen,

wurden die Linienbreiten aller anomeren 13C-NMR-Signale für D-[2-13C]Fructose 1a sowie

N-(1-Desoxy-D-[2-13C]fructos-1-yl)-L-alanin 6a und N-(1-Desoxy-D-[2-13C]fructos-1-yl)-L-prolin 6b in

Abhängigkeit der Temperatur gemessen. Es zeigt sich dabei, dass die Linienbreiten mit Ausnahme der

α-Pyranosen 1a(i) und 6(i) für alle anomeren 13C-NMR-Signale nur geringfügig von der Temperatur

abhängig sind. Im Falle der D-Fructose 1a werden die chemischen Verschiebungen der anomeren 13C-NMR-Signale der α- und β-Pyranose 1a(i) und 1a(ii) mit abnehmender Temperatur zunehmend

isochron, weshalb eine exakte Messung der Linienbreiten nicht möglich ist. Qualitativ kann jedoch eine

Zunahme der Linienbreite der entsprechenden Resonanz der α-Pyranose 1a(i) beobachtet werden. Im

Falle der [2-13C]-markierten AMADORI-Verbindungen 6a und 6b ist eine präzise Messung der

entsprechenden Linienbreiten möglich. Diese sind in Abhängigkeit der Temperatur in Tabelle 3

zusammengefasst.


- 58 -

Tabelle 3: Temperaturabhängigkeit der Linienbreite der anomeren 13C-NMR-Signale der α-pyranoiden Anomere der [2-13C]-markierten AMADORI-Verbindungen 6a und 6b.

N-(1-Desoxy-D-[2-13C]fructos-1-yl)-

L-alanin 6a (pD 4.21) N-(1-Desoxy-D-[2-13C]fructos-1-yl)-

L-prolin 6b (pD 3.02)

Temperatur T [K]

Linienbreite der α-Pyranose [Hz]

MW der übrigen Isomere ± STW [Hz]

Linienbreite der α-Pyranose [Hz]

MW der übrigen Isomere ± STW [Hz]

273 8.3 2.0 ± 0.4 8.3 2.0 ± 0.2 275 8.1 1.9 ± 0.4 7.8 2.1 ± 0.3 280 5.7 1.9 ± 0.4 5.7 2.1 ± 0.3 285 4.2 1.6 ± 0.4 4.3 2.1 ± 0.4 290 3.3 1.5 ± 0.2 3.6 2.1 ± 0.4 295 2.8 1.5 ± 0.4 3.1 2.0 ± 0.4

Die in Tabelle 3 gegebenen Daten stellen den ersten NMR-spektroskopischen Beweis für die

Existenz zweier α-pyranoider Anomere von Derivaten der D-Fructose dar. Die Daten erlauben weiterhin

die Berechnung der jeweiligen Aktivierungsenthalpien für die Ringinversion auf Grundlage von

Gleichung (42).[191]

𝑘𝐴 =4𝜋𝑝𝐴𝑝𝐵

2𝛿𝜈2

Δ𝑒⇔

𝑘𝐴4𝜋𝑝𝐴𝑝𝐵

2𝛿𝜈2=1

Δ𝑒⇒ 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡.∙ 𝑘𝐴 =

1

Δ𝑒 (42)

Dabei ist 𝑘𝐴 die Geschwindigkeitskonstante für die 5C2 2C5 Ringinversion, 𝑝𝐴 (𝑝𝐵) der Molenbruch

des 5C2- (2C5-) Konformers, 𝛿𝜈 die relative chemische Verschiebung der jeweiligen anomeren 13C-NMR-Resonanzen und Δ𝑒 die durch chemischen Austausch verbreiterte Linienbreite. Da

4𝜋𝑝𝐴𝑝𝐵2𝛿𝜈2 für kleine Temperaturintervalle als konstant betrachtet werden kann, ist 𝑘𝐴 proportional

zu 1/Δ𝑒. Mit Blick auf die EYRING-Funktion[313] beeinflusst der Proportionalitätsfaktor lediglich die

Aktivierungsentropie, sodass eine approximative Berechnung der Aktivierungsenthalpien der

jeweiligen Ringinversionen auf Grundlage der in Tabelle 3 gegebenen Daten möglich ist. Für

N-(1-Desoxy-D-[2-13C]fructos-1-yl)-L-alanin 6a ergibt sich eine Aktivierungsenthalpie von

(47.7 ± 1.2) kJ/mol und für N-(1-Desoxy-D-[2-13C]fructos-1-yl)-L-prolin 6b von (53.3 ± 0.9) kJ/mol.

Damit liegt die Aktivierungsenthalpie für die 5C2 2C5 Ringinversion der α-pyranoiden Anomere der

AMADORI-Verbindungen 6a und 6b nur geringfügig über der von Cyclohexan mit einem Wert von

45.2 kJ/mol.[314] Folglich ist eine gleichberechtigte Existenz beider Konformere wahrscheinlich.

Die Tabellen 4 bis 6 fassen die spektralen Daten (chemische Verschiebungen der 1H- und 13C-NMR-Resonanzen sowie geminale und vicinale Kopplungskonstanten) der verschiedenen Derivate

der D-Fructose mit ihren jeweiligen atomaren Zuordnungen zusammen. Die Zuordnung der 13C-NMR-Resonanzen der D-Fructose 1a basiert sowohl auf Literaturwerten[37,311,315] als auch auf dem

Vergleich mit den chemischen Verschiebungen der untersuchten AMADORI-Verbindungen 6a-6e. Die

Benennung der AMADORI-Verbindungen 6 erfolgt nach der folgenden Nomenklatur: Fructosylalanin 6a

≡ FAla, Fructosylprolin 6b ≡ FPro, Fructosylglycin 6c ≡ FGly, Fructosyl-β-alanin 6d ≡ FBala und

Fructosyl-γ-aminobuttersäure 6e ≡ FGaba.


- 59 -

Tabelle 4: Chemische Verschiebungen der 13C-NMR-Resonanzen der untersuchten Derivate der D-Fructose.a,b

Isomer C-Atom

13C-Chemische Verschiebungen der Zuckergrundkörper [ppm]

D-Fructose FAla FPro FGly FBala FGaba 1a 6a 6b 6c 6d 6e

α-P

yran

ose

C-1 61.4 47.4 56.8 48.8 48.7 48.6 C-2 98.2 96.5 96.7 96.4 96.2 96.4 C-3b 70.3 70.5 70.6 70.5 70.5 70.5 C-4b 70.7 72.3 72.2 72.2 72.1 71.9 C-5 65.4 66.2 65.7 66.2 65.9 65.9 C-6 61.3 63.3 62.7 63.2 62.9 62.9

β-P

yran

ose

C-1 64.1 52.0 60.9 53.4 53.0 53.0 C-2 98.3 95.5 95.9 95.5 95.6 95.7 C-3 67.8 70.1 70.2 70.2 70.0 69.8 C-4 69.9 69.5 69.6 69.6 69.5 69.5 C-5 69.4 69.1 69.1 69.1 69.1 69.1 C-6 63.6 64.1 64.0 64.1 64.2 64.1

α-F

ura

no

se C-1 63.1 50.0 58.9 51.5 51.1 51.2

C-2 104.7 102.0 102.0 102.0 102.0 102.1 C-3 82.2 82.6 82.8 82.6 82.6 82.5 C-4 76.3 76.2 76.3 76.2 76.3 76.1 C-5 81.5 82.8 82.9 82.8 82.7 82.6 C-6 61.3 61.1 61.2 61.1 61.0 60.9

β-F

ura

no

se C-1 62.9 51.1 59.5 52.5 52.3 52.4

C-2 101.7 99.0 99.1 99.0 99.0 100.0 C-3 75.6 78.1 78.0 78.0 78.0 78.0 C-4 74.7 74.3 73.9 74.3 74.3 74.3 C-5 80.9 81.1 81.0 81.1 81.1 81.0 C-6 62.6 62.1 62.0 62.1 62.0 62.0

Acy

clis

ches

Ze

ntr

alis

om

er C-1 66.3 52.6 62.3 54.0 54.0 54.0

C-2 213.8 207.3 207.3 207.3 207.3 207.3 C-3 75.3 75.9 76.0 75.9 75.9 75.9 C-4 71.7 71.8 72.0 71.8 71.8 71.8 C-5 70.6 70.4 70.5 70.4 70.4 70.4 C-6 63.0 62.9 62.9 62.9 62.7 62.7

a Messbedingungen: 125 und 150 MHz; 0.5 M Lösungen in D2O; pD 5.0; T = 296 K; Referenziert auf

den internen Standard Aceton (δ = 30.5 ppm).

b Die Kohlenstoffatome C-3 und C-4 der α-pyranoiden Anomere sind möglicherweise

entgegengesetzt zugeordnet.


- 60 -

Tabelle 5: Chemische Verschiebungen der 1H-NMR-Resonanzen der untersuchten Derivate der D-Fructose.a

Isomer Proton

1H-Chemische Verschiebungen der Zuckergrundkörper [ppm]

FAla FPro FGly FBala FGaba 6a 6b 6c 6d 6e

α-P

yran

ose

H-C-1 3.18 3.46 3.24 - 3.18 H’-C-1 3.13 3.30 3.18 - 3.12 H-C-3 - - - - - H-C-4 - - 3.71 3.71 3.80 H-C-5 - - 3.84 3.85 - H-C-6 - - 3.72 - 3.48 H’-C-6 - - 3.89 - -

β-P

yran

ose

H-C-1 3.14 3.43 3.19 3.17 3.12 H’-C-1 3.11 3.26 3.13 3.10 3.12 H-C-3 3.57 3.59 3.58 3.56 3.54 H-C-4 3.71 3.69 3.71 3.70 3.70 H-C-5 3.82 3.80 3.83 3.82 3.82 H-C-6 3.84 3.83 3.84 3.83 3.82 H’-C-6 3.58 3.56 3.58 3.58 3.58

α-F

ura

no

se

H-C-1 3.15 3.34 3.18 3.15b 3.10 H’-C-1 3.12 3.32 3.14 3.11b 3.10 H-C-3 4.02 4.00 4.03 4.01 4.00 H-C-4 3.84 3.82 3.84 3.82 3.83 H-C-5 3.94 3.91 3.93 3.93 3.92 H-C-6 3.66 3.63 3.65 3.64 3.64 H’-C-6 3.53 3.52 3.52 3.51 3.51

β-F

ura

no

se

H-C-1 3.15 3.38 3.18b 3.15b 3.11 H’-C-1 3.10 3.29 3.15b 3.12b 3.11 H-C-3 3.86 3.86 3.86 3.83 3.83 H-C-4 3.92 3.90 3.93 3.92 3.92 H-C-5 3.70 3.65 3.71 3.69 3.69 H-C-6 3.62 3.60 3.62 3.62 3.62 H’-C-6 3.49 3.48 3.50 3.49 3.49

Acy

clis

ches

Ze

ntr

alis

om

er

H-C-1 4.23 4.44 4.28 4.27 4.25 H’-C-1 4.15 4.44 4.16 4.14 4.12 H-C-3 4.46 4.43 4.45 4.45 4.45 H-C-4 3.78b 3.76 3.78 3.77 3.77 H-C-5 3.60b 4.00b - - - H-C-6 3.65b 3.60b - - - H’-C-6 3.48b 3.48 - - -



b Exakte Werte konnten nicht ermittelt werden.


- 61 -

Tabelle 6: Geminale und vicinale homonukleare 1H-Kopplungskonstanten der untersuchten Derivate der D-Fructose.a,b

Isomer Kopplung Homonukleare 1H-Kopplungskonstanten der Zuckergrundkörper [Hz]

FAla FPro FGly FBala FGaba 6a 6b 6c 6d 6e

α-P

yran

ose

2J1,1’ -13.0 -13.9 -12.9 - -13.2 3J3,4 - - - - - 3J4,5 - - - - - 3J5,6 - - - - - 3J5,6’ - - - - - 2J6,6’ - - -12.3 - -

β-P

yran

ose

2J1,1’ -12.8 -13.4 -12.9 -12.9 Singulett 3J3,4 9.8 9.8 9.8 9.9 9.8 3J4,5 3.6 3.4 3.5 3.4 3.4 3J5,6 1.3 1.2 1.6 1.5 1.4 3J5,6’ 2.1 2.0 2.3 2.1 2.2 2J6,6’ -13.0 -12.9 -13.0 -13.0 -13.0

α-F

ura

no

se

2J1,1’ -13.0 -13.8 -12.9 -12.0c Singulett 3J3,4 4.4 4.6 4.5 4.5 4.7 3J4,5 6.4 6.6 6.6 6.5c 6.7 3J5,6 2.9 3.0 3.0 3.0 3.0 3J5,6’ 5.5 5.6 5.6 5.5 5.4 2J6,6’ -12.5 -12.5 -12.5 -12.5 -12.6

β-F

ura

no

se

2J1,1’ -13.0 -13.5 -12.8 -11.0c Singulett 3J3,4 7.6 7.8 7.5 7.5 7.6 3J4,5 7.4 7.8 7.5 7.5 7.5 3J5,6 2.8 2.8 3.0 3.0 2.9 3J5,6’ 6.2 5.8 6.2 6.0 6.0 2J6,6’ -12.4 -12.4 -12.3 -12.3 -12.3

Acy

clis

ches

Ze

ntr

alis

om

er

2J1,1’ -18.6 Singulett -18.6 -18.7 -18.6 3J3,4 1.9 1.9 1.9 1.8 1.8 3J4,5 9.3 - 9.2 9.5c - 3J5,6 - - - - - 3J5,6’ 4.0-5.0 5.9 - - - 2J6,6’ -12.0-(-13.0) -11.8 - - -



b Vorzeichen von Kopplungskonstanten wurden auf Basis von Spektrensimulationen bestimmt; alle

Vorzeichen sind in Übereinstimmung mit Literaturangaben.[127,129]

c Exakte Werte konnten nicht ermittelt werden.


- 62 -

Die in den Tabellen 4 bis 6 zusammengefassten spektralen Parameter der Derivate der

D-Fructose sind in guter Übereinstimmung mit bisherigen Literaturangaben.[126,127,129] Darüber hinaus

zeigen die 13C-NMR-Spektren von Fructosyl-β-alanin 6d und -γ-aminobuttersäure 6e zusätzliche Signale

im anomeren Verschiebungsbereich. Diese Signale sind in den obigen Tabellen nicht aufgeführt und

werden erst im Kontext der Dynamik der 1,2-Enolisierung in Kapitel 4.2.2 diskutiert.

Es gilt nun zu prüfen, ob systematische Einflüsse des Abstandes von der Amino- zur

Carboxylfunktion auf die chemischen Verschiebungen der 1H- und 13C-NMR-Resonanzen festzustellen

sind. Der größte systematische Einfluss zeigt sich für die chemische Verschiebung des C-3 sowie der

entsprechend gebundenen Protonen der jeweiligen β-pyranoiden Anomere 6(ii). Die Abhängigkeit der

entsprechenden chemischen Verschiebungen von der Anzahl der Methyleneinheiten zwischen der

Amino- und der Carboxylfunktion veranschaulicht Abbildung 17.

Abbildung 17: Abhängigkeit der chemischen Verschiebungen von C-3 und H-C-3 der β-pyranoiden Anomere 6(ii) von der Anzahl der Methyleneinheiten zwischen der Amino- und der Carboxylfunktion.

Eine Erklärung dieser Beobachtung liefert die Betrachtung der Struktur der β-pyranoiden

Anomere 6(ii). Wie in Kapitel 2.1.3.2 beschrieben, wurden Wasserstoffbrücken zwischen dem

Aminosäuresubstituenten und der Hydroxylfunktion am C-3 über Röntgenstrukturanalysen für

kristalline β-pyranoide AMADORI-Verbindungen 6(ii) nachgewiesen.[122-125] Es ergibt sich damit ein

kooperatives Bindungssystem,[316] das in Schema 23 am Beispiel von 6c(ii) dargestellt ist.

Schema 23: Bildung resonanzstabilisierter pseudocyclischer Strukturelemente durch kooperative

Wasserstoffbrücken im β-pyranoiden Anomer von Fructosylglycin 6c(ii). (erweitert nach[124])

Die dargestellten Wasserstoffbrücken sind dabei sowohl von der Amino- als auch von der

Carboxylfunktion abhängig. Dass dies der Fall ist, zeigt die 13C-NMR-Titration von RÖPER et al. (1983) im

69.7

69.8

69.9

70.0

70.1

70.2

3.53

3.54

3.55

3.56

3.57

3.58

3.59

0 1 2 3 4

Ch

emis

che

Ve

rsch

ieb

un

g (1

3C

) [p

pm

]

Ch

emis

che

Ve

rsch

ieb

un

g (1

H)

[pp

m]

Anzahl der Methyleneinheiten zwischen Amino- und Carboxylfunktion

Protonenresonanzen

Kohlenstoffresonanzen


- 63 -

pH-Bereich von 0.7 bis 11.9.38 In pH-Bereichen oberhalb des 𝑝𝐾𝑠-Wertes der Aminofunktion kommt es

zu einer Hochfeldverschiebung der Resonanz des C-3 des β-pyranoiden Anomers von Fructosylalanin

6a(ii). Gleichermaßen erfährt das Signal im sauren Milieu eine Hochfeldverschiebung.[127] Das

bedeutet, dass die kooperative Bindung zu einer partiellen Protonierung der Hydroxylfunktion am C-3

führt. Damit erhöht sich der negative induktive Effekt der Hydroxylfunktion auf das C-3, woraus dessen

Resonanz nach tiefem Feld verschoben wird. Da sowohl die Erhöhung als auch die Absenkung des

pH-Wertes eine Hochfeldverschiebung bewirken, müssen beide funktionellen Gruppen an der

kooperativen Bindung beteiligt sein. Die Stärke der entsprechenden Wasserstoffbrückenbindung zur

Hydroxylfunktion am C-3 lässt sich demnach an der chemischen Verschiebung der entsprechenden 13C-NMR-Resonanz ablesen. Ausgehend von AMADORI-Verbindungen der α-Aminosäuren 6a-6c führt

jede weitere Methyleneinheit zwischen der Amino- und der Carboxylfunktion zu einer

Hochfeldverschiebung um 0.2 ppm. Da sich der negative induktive Effekt entsprechend auch auf das

H-C-3 auswirkt, ist dies analog auch an den chemischen Verschiebungen der Protonenresonanzen zu

beobachten. Hierbei führt jede weitere Methyleneinheit zu einer Hochfeldverschiebung um 0.02 ppm.

Die Wasserstoffbrückenbindung hat nicht nur Einfluss auf die genannten chemischen

Verschiebungen, sondern beeinflusst auch die Reaktivität der AMADORI-Verbindungen. Der negative

induktive Effekt der Hydroxylfunktion am C-3 bewirkt eine Herabsenkung der Elektronendichte am C-3

bzw. H-C-3. Dies bewirkt die Verschiebung der entsprechenden NMR-Resonanzen nach tiefem Feld.

Damit einher geht jedoch auch eine Zunahme der Polarisierung der C-H-Bindung und damit eine

Erhöhung der C-H-Acidität. Die Dissoziation der C-H-Bindung führt unter Ringöffnung zum tautomeren

2,3-Endiol. Da dieser Prozess, wie in Kapitel 2.1.4 beschrieben, irreversibel ist, hat dies die Eliminierung

der Aminosäure als gute Abgangsgruppe zur Folge und es kommt zur Freisetzung von

1-Desoxyglucoson 9a. Wie Abbildung 12 (Seite 52) zeigt, ist die Bildungsrate von 1-Desoxyglucoson 9a

im pH-Bereich von 2.5 bis 6.5 für die AMADORI-Verbindungen der α-Aminosäuren 6a-6c jeweils größer

als die für die AMADORI-Verbindungen der ω-Aminosäuren 6d und 6e. Diese Beobachtungen lassen sich

demnach auf die molekulare Struktur der jeweils β-pyranoiden Hauptanomere 6(ii) zurückführen.

Damit ist davon auszugehen, dass die Unterschiede der Bildungsraten von 3-Desoxyglucoson 9b auf

einem katalytischen Einfluss der Carboxylfunktionen beruhen. In Schema 21 (Seite 49) wurde der

entsprechende Reaktionsmechanismus und dessen Abhängigkeit von der Anomerisierung bereits

dargestellt. Dieser Mechanismus kann ausgehend von jedem Anomer eines Derivates der D-Fructose

formuliert werden. Im Gegensatz dazu kann eine analoge Bildung von 1-Desoxyglucoson 9a lediglich

aus den jeweils α-konfigurierten Anomeren 1a(i) und 6(i) erfolgen, die jedoch für Derivate der

D-Fructose die Minorkomponenten der Anomerensysteme darstellen.39 Es ist demnach davon

auszugehen, dass 1-Desoxyglucoson 9a vornehmlich unter Einfluss der in Schema 23 dargestellten

Wasserstoffbrücken gebildet wird, während die Bildung von 3-Desoxyglucoson 9b an die

Anomerisierung anionischer Zuckerspezies gekoppelt ist. Diese liegen jedoch nur bei pH-Werten vor,

die höher sind als der jeweilige 𝑝𝐼 des Zuckergrundkörpers. Trotzdem zeigt Abbildung 11 (Seite 52) für

AMADORI-Verbindungen mit α-ständiger Aminofunktion 6a-6c bei einem pH-Wert von ca. 4.0 ein

Minimum der Bildungsraten von 3-Desoxyglucoson 9b. Mit zunehmender Protonenkonzentration

38 RÖPER et al. (1983) führten die 13C-NMR-Titration zum Zwecke einer erleichterten Signalzuordnung durch.

39 Überträgt man diese Gedanken auf D-Glucose 2a, so ergibt sich, dass eine 1,2-Enolisierung und damit die

Bildung von 3-Desoxyglucoson 9b nur ausgehend von β-konfigurierten Anomeren möglich ist. Das erklärt die von

HÄSELER et al. (1998) beobachtete vermehrte Bildung von HMF 13 aus β-D-Glucopyranose unter Bedingungen der

Karamellisierung gegenüber der Bildung von HMF 13 aus α-D-Glucopyranose.[392]


- 64 -

nehmen auch die Bildungsraten entgegen der oben beschriebenen mechanistischen Vorstellungen

wieder zu, während die entsprechenden Raten der AMADORI-Verbindungen mit nicht α-ständiger

Aminofunktion 6d und 6e stetig abnehmen. Dieses Verhalten lässt sich ebenso auf Grundlage der in

Schema 23 dargestellten mesomeren Grenzstrukturen des kooperativen Bindungssystems erklären.

Wie bereits diskutiert, ist die Hydroxylfunktion am C-3 aufgrund ihrer Teilnahme am kooperativen

Bindungssystem als partiell protoniert zu betrachten. Es ist daher davon auszugehen, dass ihre

vollständige Protonierung leichter erfolgen kann als die der übrigen Hydroxylfunktionen. Es handelt

sich demnach mutmaßlich um die Hydroxylfunktion mit der größten Basizität am Zuckergrundkörper.

Die Protonierung der Hydroxylfunktion führt zur Bildung von Wasser als gute Abgangsgruppe. Die

Stabilisierung des entstehenden Carbeniumions führt zur Bildung von 3-Desoxyglucoson 9b und

3-Desoxygalactoson 9c, ohne dass die Möglichkeit einer Bildung von 1-Desoxyglucoson 9a bzw.

D-Glucoson 9d besteht. Den entsprechenden Reaktionsmechanismus zeigt Schema 24 a).

Schema 24: a) Parallele Bildung von 3-Desoxyglucoson 9b und 3-Desoxygalactoson 9c aus dem β-pyranoiden Anomer von Fructosylglycin 6c(ii) über die Protonierung der Hydroxylfunktion am C-3. b) Bildung von (Z)- und (E)-3,4-Didesoxyglucoson-3-en 17a und 17b aus dem β-pyranoiden Anomer von Fructosylglycin 6c(ii) über die Protonierung der Hydroxylfunktion am C-3.

Erfolgt anstelle der Ringöffnung eine vinyloge β-Eliminierung der anomeren

Hydroxylfunktion, führt der Reaktionsmechanismus zu Derivaten des 4-Pyranons (vgl. Schema 25 a)).

Dazu zählt insbesondere 5-Hydroxy-2-methyl-4H-pyran-4-on (Allomaltol) 18, das in industriellem

Karamell nachgewiesen werden kann.[317] Ein analoger Mechanismus lässt sich darüber hinaus auch


- 65 -

ausgehend von furanoiden Anomeren formulieren. Dieser führt im Falle einer Ringöffnung ebenfalls

zu den epimeren 3-Desoxyosonen 9b und 9c oder durch vinyloge β-Eliminierung der anomeren

Hydroxylfunktion zu HMF 13 (vgl. Schema 25 b)). Eine dritte Variante führt über das aminosubstituierte

Derivat der 3,6-Anhydro-D-fructose zu 2-Aminoacetylfuran (AAF) 15 (vgl. Schema 25 c)).

Schema 25: a) Bildung von Allomaltol 18 aus dem β-pyranoiden Anomer von Fructosylglycin 6c(ii) über die Protonierung der Hydroxylfunktion am C-3. b) Bildung von HMF 13 aus dem α-furanoiden Anomer von Fructosylglycin 6c(iii) über die Protonierung der Hydroxylfunktion am C-3. c) Bildung von AAF 15 aus dem α-furanoiden Anomer von Fructosylglycin 6c(iii) über die Protonierung der Hydroxylfunktion am C-3.


- 66 -

Im Vergleich zum bisher formulierten Mechanismus der parallelen Bildung der epimeren

3-Desosxyosone 9b und 9c[151-153] kommt der in Schema 24 a) gezeigte ohne die Addition von Wasser

an eine C-C-Doppelbindung aus. Allerdings geht er mit der Anlagerung eines Protons aus dem

Lösungsmittel an das C-4 einher. Einen Hinweis auf die Gültigkeit des in Schema 24 dargestellten

Reaktionsmechanismus‘ kann damit die Beobachtung eines H/D-Austausches am C-4 bei der Reaktion

in D2O liefern. Dabei ist es sinnvoll, das entsprechende Isotopenverhältnis eines möglichst stabilen

Produktes zu analysieren. Es ist zu erwarten, dass es unter für den Mechanismus günstigen

Reaktionsbedingungen darüber hinaus zu einer vermehrten Bildung von 3,4-Didesoxyglucoson-3-en

17a und 17b kommt, das MITTELMAIER et al. (2011) als Intermediat der Isomerisierung von

3-Desoxyglucoson 9b und 3-Desoxygalactoson 9c identifizierten. Wie Schema 24 b) zeigt, bildet sich

dieses aus den jeweiligen 2,3-Enolen der SCHIFF-Basen der 3-Desoxyosone, die auch direkte Vorstufen

der epimeren 3-Desoxyosone 9b und 9c sind. (Z)-3,4-Didesoxyglucoson-3-en 17a ist wiederum als

direkte Vorstufe von HMF 13 anzusehen. Der vermutete H/D-Austausch muss somit auch HMF 13

betreffen. Um dies zu überprüfen, wurde FAla 6a in D2O gelöst (c = 0.5 M) und für mehrere Stunden

bei einem pD-Wert von 3.0 (entspricht pH 2.8) auf 87 °C erhitzt. Anschließend wurde ein 1H-NMR-Spektrum des Reaktionsgemisches gemessen. Das erhaltene Spektrum ist in Abbildung 18

dargestellt. Es ist zu erkennen, dass die Protonen am C-1, C-3 und C-4 teilweise gegen Deuterium

ausgetauscht sind. Dabei wurden rund 37% der Protonen am C-4 durch Deuterium ersetzt. Die

entsprechenden Moleküle wurden somit mutmaßlich über den in Schema 24 formulierten

Reaktionsmechanismus gebildet. Über das aus dem 1H-NMR-Spektrum ersichtliche Isotopenverhältnis

(H/D = 63/37) ist unter den gegebenen Reaktionsbedingungen ein Verhältnis des 3-Desoxyglucosons

9b zum 3-Desoxygalactoson 9c von (63 + 37/2) zu (37/2) und damit von rund 4/1 zu erwarten. Die

Deconvolution der HPLC-DAD-Signale der Chinoxaline von 9b und 9c (vgl. Abbildung 19) ergibt unter

ähnlichen Reaktionsbedingungen (pH 2.5, T = 90 °C, 3 h) ein Verhältnis von rund 4/1.

Abbildung 18: 1H-NMR-Spektrum einer 0.5 M Lösung von FAla 6a nach mehrstündiger Reaktion bei 87 °C und einem pD-Wert von 3.0 (entspricht pH 2.8). Es ist zu erkennen, dass HMF 13 als Folge des Abbaus von FAla 6a gebildet wird. Die Protonen am C-1, C-3 und C-4 unterliegen dabei einem teilweisen Deuteriumaustausch. Die relativen Flächen der NMR-Signale sind in Rot angegeben. Neben 3J(H,H)-Kopplungen sind aufgrund der Isotopenmarkierung am C-2 auch 2J(C,H)- und 3J(C,H)-Kopplungen erkennbar.

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

3.754.755.756.757.758.759.75

Inte

nsi

tät

Chemische Verschiebung δ(1H) [ppm]

2.00

x 4 0.63

0.160.06


- 67 -

Die Plausibilität des in Schema 24 a) gezeigten Mechanismus‘ wird durch die Ergebnisse der

flüssigchromatographischen Analyse der mittels ortho-Phenylendiamin derivatisierten

α-Dicarbonylverbindungen 9b und 9c weiter bestätigt. Abbildung 19 zeigt die HPLC-DAD-Signale der

jeweiligen Chinoxalinderivate von 3-Desoxyglucoson 9b und -galactoson 9c bei einer Wellenlänge von

317 nm, die bei dreistündigem Erhitzen ((90 ± 2) °C) 0.025 molarer Lösungen der

AMADORI-Verbindungen 6a-6e bei pH 2.5 gebildet wurden.

Abbildung 19: Overlay von Ausschnitten der HPLC-DAD-Chromatogramme (@ 317 nm) der AMADORI-Verbindungen 6a-6e, die in 0.025 M Lösungen für drei Stunden bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C und einem pH-Wert von 2.5 zur Reaktion gebracht wurden. Es handelt sich um die Signale der mittels ortho-Phenylendiamin derivatisierten α-Dicarbonylverbindungen 3-Desoxyglucoson 9b (Signal 1) und -galactoson 9c (Signal 2), die aus dem Abbau der AMADORI-Verbindungen 6a-6e hervorgehen.

Es ist deutlich erkennbar, dass das Verhältnis der Signale im Falle der Reaktionslösungen der

AMADORI-Verbindungen mit α-Aminofunktion 6a-6c im Vergleich zu denen mit nicht α-ständiger

Aminofunktion 6d und 6e deutlich in Richtung des 3-Desoxygalactoson-Chinoxalins verschoben ist.

Diese Beobachtung steht im Einklang mit dem in Schema 24 a) dargestellten Reaktionsmechanismus.

Da der initiale Schritt des Mechanismus‘ die Protonierung der Hydroxylfunktion am C-3 ist,

muss der Reaktionsweg mit steigender Protonenkonzentration an Bedeutung zunehmen.

Entsprechend muss sich das Verhältnis der epimeren 3-Desoxyosone 9b und 9c mit sinkendem

pH-Wert in Richtung des 3-Desoxygalactoson-Chinoxalins verschieben. Abbildung 20 zeigt die

HPLC-DAD-Signale der jeweiligen Chinoxalinderivate von 3-Desoxyglucoson 9b und -galactoson 9c bei

einer Wellenlänge von 317 nm, die bei dreistündigem Erhitzen ((90 ± 2) °C) 0.025 molarer Lösungen

von Fructosylglycin 6c bei verschiedenen pH-Werten gebildet wurden.

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

13.6 13.8 14.0 14.2 14.4

rela

tive

Ext

inkt

ion

@ 3

17

nm

Zeit t [min]

Fructosylalanin

Fructosylprolin

Fructosylglycin

Fructosyl-β-alanin


Signal 1

Signal 2


- 68 -

Abbildung 20: Overlay von Ausschnitten der HPLC-DAD-Chromatogramme (@ 317 nm) von 0.025 M Lösungen des Fructosylglycins 6c, die bei verschiedenen pH-Werten für drei Stunden bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C zur Reaktion gebracht wurden. Es handelt sich um die Signale der mittels ortho-Phenylendiamin derivatisierten α-Dicarbonylverbindungen 3-Desoxyglucoson 9b (Signal 1) und -galactoson 9c (Signal 2), die aus dem Abbau der AMADORI-Verbindung 6c hervorgehen.

Es ist deutlich zu erkennen, dass auch die in Abbildung 20 dargestellten Beobachtungen im

Einklang mit dem in Schema 24 a) gezeigten Reaktionsmechanismus stehen. Dies gilt neben

Fructosylglycin 6c auch für Fructosylalanin 6a und -prolin 6b (hier nicht gezeigt).

4.2.2 DYNAMIK DER 1,2-ENOLISIERUNG

Die bisherige Diskussion ist davon ausgegangen, dass die Rate der 1,2-Enolisierung der

AMADORI-Verbindungen mit α-ständiger Aminofunktion 6a-6c mit zunehmender

Protonenkonzentration stetig abnimmt. Um diese zuvor genutzte Hypothese zu bestätigen, wurden

die Raten der 1,2-Enolisierung für Fructosylalanin 6a und -prolin 6b in Abhängigkeit des pH-Wertes bei

Raumtemperatur gemessen. Dazu wurden je 0.5 M Lösungen der AMADORI-Verbindungen in

Deuteriumoxid vorbereitet und mittels verdünnter Lösungen von Natriumdeuteroxid und

Deuteriumchlorid in D2O auf pD-Werte zwischen 1.0 und 7.0 (insgesamt sieben Stufen) eingestellt. Im

Anschluss erfolgte die Messung quantitativer 1H-NMR-Spektren über einen Zeitraum von je 24 Tagen.

Findet eine Enolisierung der AMADORI-Verbindungen in Deuteriumoxid statt, so wird im ersten Schritt

ein C-H-acides Proton abgespalten. Beim Ablauf der entsprechenden Rückreaktion besteht aufgrund

der deutlich höheren Konzentration von Deuteronen gegenüber Protonen im Lösungsmittel eine fast

hundertprozentige Wahrscheinlichkeit der Deuterierung des entsprechenden Kohlenstoffatoms. Den

Reaktionsmechanismus zeigt Schema 26.

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

13.6 13.8 14.0 14.2 14.4

rela

tive

Ext

inkt

ion

@ 3

17

nm

Zeit t [min]

pH 1.5

pH 2.5

pH 3.5

pH 4.5

pH 5.5

pH 6.5

Signal 2

Signal 1


- 69 -

Schema 26: Mechanismus des Deuteriumaustausches am C-1 von aminosubstituierten Derivaten der D-Fructose.

Nach erfolgter einfacher Deuterierung kann eine erneute Enolisierung ablaufen. Dabei

besteht in etwa dieselbe Wahrscheinlichkeit für die Eliminierung des verbleibenden Protons und die

des Deuterons. Entsprechend ist die Reaktionsgeschwindigkeit von der einfach deuterierten

AMADORI-Verbindung hin zur zweifach deuterierten halb so groß wie von der nicht deuterierten hin zur

einfach deuterierten. Der Prozess führt auf die beschriebene Weise zu einem Intensitätsabfall

entsprechender 1H-NMR-Signale, wobei die Intensität des Restwassersignals (HDO-Signal) in gleichem

Maße zunimmt. In Übereinstimmung mit den Beobachtungen von SIMON und HEUBACH (1965) sowie

MOSSINE et al. (1999) konnte im Rahmen der in dieser Arbeit durchgeführten Experimente keine

reversible 2,3-Enolisierung beobachtet werden.[119,137] Über den Zeitraum von 24 Tagen waren lediglich

Änderungen der Intensitäten der Resonanzen der Protonen am C-1 festzustellen. Zum entsprechenden

Signal trägt sowohl die nicht deuterierte (HH) als auch die einfach deuterierte AMADORI-Verbindung

(HD) bei. Wie Schema 26 verdeutlicht, muss der Modellierung des Prozesses die Kinetik einer

Konsekutivreaktion zugrunde gelegt werden. Dabei ist die zeitabhängige Konzentration der beiden

relevanten Spezies durch die Gleichungen (43) und (44) gegeben.

[𝐻𝐻]𝑡 = [𝐻𝐻]𝑡=0𝑠 ∙ 𝑒𝑥𝑝(−𝑘𝐸𝑛𝑜𝑙 ∙ 𝑡) (43)

[𝐻𝐷]𝑡 = −2 ∙ [𝐻𝐻]𝑡=0𝑠 ∙ {𝑒𝑥𝑝(−𝑘𝐸𝑛𝑜𝑙 ∙ 𝑡) − 𝑒𝑥𝑝 (−1

2∙ 𝑘𝐸𝑛𝑜𝑙 ∙ 𝑡)} (44)

Hierbei gilt es zu beachten, dass der Responsefaktor für die Spezies HH aufgrund der

doppelten Protonenzahl genau zweimal so groß ist wie der für die Spezies HD. Die Intensität der

Protonenresonanz als Funktion der Zeit (𝐼𝑛𝑡. (𝑡)) folgt demnach Gleichung (45).

𝐼𝑛𝑡. (𝑡) = [𝐻𝐻]𝑡 +1

2∙ [𝐻𝐷]𝑡 = [𝐻𝐻]𝑡=0𝑠 ∙ 𝑒𝑥𝑝 (−

1

2∙ 𝑘𝐸𝑛𝑜𝑙 ∙ 𝑡) (45)

Mit Hilfe dieser Funktion erfolgte die nicht lineare Modellierung der Messwerte und damit

die numerische Berechnung der pD-abhängigen Raten der 1,2-Enolisierung. Diese sind in Abbildung 21

graphisch dargestellt und im Anhang tabelliert.


- 70 -

Abbildung 21: Rate der 1,2-Enolisierung von Fructosylalanin 6a und -prolin 6b in Abhängigkeit des pD-Wertes bei Raumtemperatur, gemessen mittels quantitativer 1H-NMR-Spektroskopie über einen Zeitraum von 24 Tagen. Die logarithmische Skalierung der Ordinatenachse ist zu beachten.

Es ist deutlich zu erkennen, dass die Rate der 1,2-Enolisierung wie erwartet mit steigender

Protonenkonzentration stetig abnimmt. Die oben formulierte Hypothese ist damit experimentell

bestätigt und der in Schema 24 (Seite 64) formulierte Reaktionsmechanismus untermauert.

Um zu prüfen, ob sich die Unterschiede der Bildungsraten von 3-Desoxyglucoson im

pH-Bereich größer 4.0 auf Unterschiede im Enolisierungsverhalten zurückführen lassen oder sich

aufgrund weiterer Reaktionsmechanismen ergeben, wurden im Folgenden die Raten der

1,2-Enolisierung der AMADORI-Verbindungen der drei homologen ω-Aminosäuren 6c-6e in

Abhängigkeit der Temperatur gemessen. Diese Messungen wurden bei einem pD-Wert von 4.5

durchgeführt. Das hat den Vorteil, dass keine pD-Änderungen im Verlauf der Experimente zu erwarten

sind, da sich der pD-Wert im Rahmen von MAILLARD-Modellreaktionen üblicherweise in diesem Bereich

stabilisiert. Außerdem zeigt Abbildung 21, dass die Rate der 1,2-Enolisierung im pD-Intervall von ca.

3.0 bis 5.0 relativ unempfindlich gegenüber Änderungen der Deuteronenkonzentration ist.

Ein Vergleich der Enolisierungsraten mit den Bildungsraten des 3-Desoxyglucosons 9b ist nur

für identische Temperaturen sinnvoll. Da jedoch die Abnahme der Intensität der zu beobachtenden 1H-NMR-Resonanzen bei einer Temperatur von 90 °C zu schnell ist, um sie mittels NMR-Spektroskopie

zu verfolgen, wurden die entsprechenden Enolisierungsraten im Intervall von 57-81 °C in Abhängigkeit

der Temperatur gemessen. Die für 90 °C zu erwartenden Raten wurden im Anschluss daran durch

Berechnung der thermodynamischen Aktivierungsparameter auf Grundlage der EYRING-Funktion

extrapoliert (die entsprechenden Daten befinden sich im Anhang dieser Arbeit). Abbildung 22 zeigt

eine Gegenüberstellung der Raten der 1,2-Enolisierung und der Bildungsraten des 3-Desoxyglucosons

9b für einen pH- bzw. pD-Wert von 4.5 und eine Temperatur von 90 °C.

Es liegen zwar nur je drei Datenpunkte vor, diese zeigen jedoch eine gute lineare Korrelation.

Daraus ergibt sich, dass unter den gegebenen Messbedingungen ca. jede 250.-300. 1,2-Enolisierung

die Eliminierung von Wasser zur Folge hat und zur Freisetzung von 3-Desoxyglucoson 9b führt.

5.0E-09

5.0E-08

5.0E-07

5.0E-06

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0

Rat

e d

er 1

,2-E

no

lisie

run

g [H

z]

pD-Wert

Fructosylalanin

Fructosylprolin


- 71 -

Abbildung 22: Gegenüberstellung der Raten der 1,2-Enolisierung und der Bildung von 3-Desoxyglucoson 9b für Fructosylglycin 6c, -β-alanin 6d und -γ-aminobuttersäure 6e für einen pH- bzw. pD-Wert von 4.5 und eine Temperatur von 90 °C.

Auffällig ist, dass die 13C-NMR-Spektren von Fructosyl-β-alanin 6d und -γ-aminobuttersäure

6e bislang noch nicht diskutierte Signale im anomeren Verschiebungsbereich aufweisen, die ein

anderes als das hier beschriebene Enolisierungsverhalten zeigen. Um dies zu verdeutlichen, ist in

Abbildung 23 ein Teilausschnitt des anomeren Verschiebungsbereiches eines deconvolierten 13C-NMR-Spektrums von Fructosyl-β-alanin 6d dargestellt.

Abbildung 23: Teilausschnitt des anomeren Verschiebungsbereiches eines deconvolierten 13C-NMR-Spektrums von Fructosyl-β-alanin 6d.

Der dargestellte spektrale Ausschnitt zeigt vier Signalgruppen anomerer Kohlenstoffatome.

Dabei resultieren die Signalaufspaltungen innerhalb einer Gruppe aus dem H/D-Austausch am C-1, der

jeweils zu einer Hochfeldverschiebung um ca. 0.04 ppm führt.[119] Es ist deutlich zu erkennen, dass die

0.0E+00

2.0E-06

4.0E-06

6.0E-06

8.0E-06

1.0E-05

0.0E+00

1.0E-03

2.0E-03

3.0E-03

Bild

un

gsra

te v

on

3-D

eso

xygl

uco

son

[H

z]

Rat

e d

er 1

,2-E

no

lisie

run

g [H

z]1,2-Enolisierung

Bildung von 3-Desoxyglucoson

Fru

cto

syl

-gly

cin Fru

cto

syl-

β-a

lan

in

Fru

cto

syl-

γ-am

ino

bu

tter

säu

re

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

95.295.796.296.797.297.798.2

Inte

nsi

tät

Chemische Verschiebung δ(13C) [ppm]

Difructosyl-β-alanin

β-Pyranose

α-Pyranose


- 72 -

beiden Gruppen bei höherem Feld je dasselbe Signalmuster zeigen. Dabei hat bei den meisten der

vorliegenden Moleküle noch kein H/D-Austausch stattgefunden. Einige liegen einfach, wenige

zweifach deuteriert vor. Davon abweichend verhalten sich die zwei übrigen Signalgruppen (bei

tieferem Feld). Die Intensitätsverhältnisse innerhalb der jeweiligen Signalgruppen zeigen klar, dass ein

vollständiger H/D-Austausch bei den meisten der entsprechenden Moleküle bereits stattgefunden hat

und nur noch wenige Moleküle einfach deuteriert vorliegen. Das heißt mit anderen Worten, dass

zusätzlich zu den oben beschriebenen Strukturisomeren zumindest ein weiteres vorliegen muss, das

eine stark erhöhte Rate der 1,2-Enolisierung aufweist. Auffällig dabei ist, dass die zwei vorhandenen

anomeren 13C-NMR-Signale ungefähr im Flächenverhältnis von 1:1 vorliegen. Es liegt daher der Schluss

nahe, dass es sich bei dem zusätzlich vorliegenden Molekül um eine zweifach fructosylierte

Aminosäure 8 handelt. Diese zeichnen sich durch eine ca. 7.5-fach erhöhte Rate der 1,2-Enolisierung

sowie besonders hohe Bräunungsraten aus.[119,146] Das lässt vermuten, dass derartige Verbindungen

auch zu einer besonders schnellen Umsetzung zu 3-Desoxyglucoson 9b neigen. Dieses konnte in

HSQC-TOCSY-Spektren der entsprechenden Proben auf Grundlage von Korrelationspeaks der

anomeren Protonen zu deren jeweils direkt gebundenen Kohlenstoffatomen auch zweifelsfrei

nachgewiesen werden. Dabei konnten die Isomere 5a und 5b sowie 5e-5j aus der Publikation von

KÖPPER und FREIMUND (2003) identifiziert werden.[157] Durch Bildung der Volumenintegrale ergibt sich

ein Verhältnis ihrer Konzentrationen von 18:14:3:32:14:11:4:5, was in guter Übereinstimmung mit

Literaturangaben ist.[157] Aus diesen Beobachtungen ergibt sich zum einen die Frage, warum

Difructosylaminosäuren 8 im Rahmen dieser Arbeit nur vergesellschaftet mit AMADORI-Verbindungen

mit nicht α-ständiger Aminofunktion 6d und 6e nachweisbar waren.40 Zum anderen ist zu klären,

warum Difructosylaminosäuren 8 eine gegenüber AMADORI-Verbindungen 6 erhöhte Rate der

1,2-Enolisierung aufweisen.

Der einzige offensichtliche Unterschied zwischen Mono- und Difructosylaminosäuren ist,

dass es sich im ersten Fall um ein sekundäres und im zweiten um ein tertiäres Amin handelt. Betrachtet

man die in den Tabellen 1 (Seite 44) und 2 (Seite 45) aufgeführten 𝑝𝐾𝑠-Werte, so wird deutlich, dass

der Übergang von der Aminosäure 4 zur AMADORI-Verbindung 6 mit einer Verringerung des 𝑝𝐾𝑠-Wertes

der Aminofunktion um ein bis zwei Einheiten verbunden ist. Es ist daher davon auszugehen, dass ein

ähnlicher Effekt beim Übergang von der Mono- zur Difructosylaminosäure zu beobachten ist. HIRSCH et

al. (1995) geben den 𝑝𝐾𝑠-Wert der Aminofunktion von Difructosylglycin 8c mit 5.18 ± 0.01 an.[149] Das

entspricht ausgehend von 6c einer nochmaligen Absenkung des 𝑝𝐾𝑠-Wertes um drei Einheiten

(𝑝𝐾𝑠2(4𝑐) = 9.70, 𝑝𝐾𝑠2(6𝑐) = 8.31, 𝑝𝐾𝑠2(8𝑐) = 5.18). Da die zur Strukturaufklärung nötigen

NMR-Experimente in Lösungen mit einem pD-Wert von 5.0 durchgeführt wurden, bedeutet dies, dass

ein großer Teil der Aminostickstoffatome der Difructosylaminosäuren 8 unter den vorherrschenden

Bedingungen nicht protoniert vorgelegen hat. Damit ist die Katalyse der 1,2-Enolisierung nicht

mehr – wie in Schema 21 (Seite 49) gezeigt – von der ionisierten anomeren Hydroxylfunktion abhängig,

sondern kann direkt über den Aminostickstoff vermittelt erfolgen.41 Die Basizität des

C-1-Substituenten hat damit einen großen Einfluss auf die Rate der 1,2-Enolisierung.

40 Die Klärung dieser Frage erfolgt unterhalb von Abbildung 24.

41 Aufgrund der in Kapitel 2.3 beschriebenen Überlegungen ist in diesem Fall auch von einer Aminokatalyse der

Anomerisierung auszugehen.


- 73 -

Um diese Hypothese weiter zu überprüfen, wurden die Raten der 1,2-Enolisierung der

D-Fructose 1a sowie der D-Tagatose 1b im pD-Bereich zwischen 3.0 und 5.0 bei Raumtemperatur

gemessen. Da die C-1-Substituenten in diesem Fall im Gegensatz zu den Aminofunktionen der Mono-

und Difructosylaminosäuren nicht mehr basisch reagieren,[298] war hier von einer sehr viel langsameren

Rate der Enolisierung auszugehen, die sich entsprechend auch in den gemessenen Bildungsraten von

3-Desoxyglucoson 9b äußert. Die Messungen erfolgten auf Grundlage von 13C-NMR-Spektren über

einen Zeitraum von 1064 Tagen (ca. 2.9 Jahre). Innerhalb dieses Zeitraumes konnten keine spektralen

Veränderungen der Proben nachgewiesen werden. Es ist demnach nicht möglich, Enolisierungsraten

zu berechnen. Es kann lediglich abgeschätzt werden, wie hoch die Rate maximal sein kann, ohne dass

ein Austausch innerhalb dieser Zeit zu beobachten wäre. Für diese Abschätzung kann davon

ausgegangen werden, dass ein sicherer Nachweis der Enolisierung gelungen wäre, wenn 2.5% der

vorhandenen Moleküle einen entsprechenden H/D-Austausch vollzogen hätten. Unter diesen

Randbedingungen ergibt sich eine maximal mögliche Rate der 1,2-Enolisierung von D-Fructose 1a und

D-Tagatose 1b von 2.75·10-10 Hz bzw. rund 1 je 100 Jahre. Damit ist die 1,2-Enolisierung von D-Fructose

1a zumindest um den Faktor 1000 langsamer als die der untersuchten AMADORI-Verbindungen 6a und

6b.

Dass die experimentelle Vorgehensweise nicht nur bei den AMADORI-Verbindungen 6a-6e

einsetzbar ist, sondern prinzipiell auch bei D-Fructose 1a, wurde im Vorhinein überprüft. Es ist bekannt,

dass Enolisierungsprozesse neben hohen pH-Werten sowie hohen Temperaturen auch durch

Phosphate beschleunigt werden können. Es wurde daher eine Probe von D-Fructose 1a in deuteriertem

Phosphatpuffer (pD 7.35) vorbereitet und für einige Stunden im Trockenschrank auf 80 °C erhitzt. Im

Anschluss daran wurde ein 13C-NMR-Spektrum der Probe gemessen. Wie Abbildung 24 zeigt, konnte

der erwartete H/D-Austausch hiermit zweifelsfrei nachgewiesen und die Tauglichkeit des

Experimentes bestätigt werden.

Abbildung 24: Nachweis der reversiblen 1,2-Enolisierung für D-Fructose 1a anhand der Hochfeldverschiebung anomerer 13C-NMR-Resonanzen durch den H/D-Austausch am C-1.

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

97.297.798.298.799.299.7100.2100.7101.2101.7102.2

Inte

nsi

tät

Chemische Verschiebung δ(13C) [ppm]

β-Pyranose

β-Furanose


- 74 -

Im Weiteren gilt es, die oben formulierte Frage zu beantworten, warum

Difructosylaminosäuren 8 im Rahmen dieser Arbeit nur vergesellschaftet mit AMADORI-Verbindungen

mit nicht α-ständiger Aminofunktion 6d und 6e nachweisbar waren. Wie Tabelle 2 (Seite 45) zeigt, sind

die 𝑝𝐾𝑠-Werte der α-Aminofunktionen der AMADORI-Verbindungen 6a-6c geringer als die der nicht

α-ständigen 6d und 6e. Obwohl diese Gegebenheit Kondensationsreaktionen begünstigen sollte, ist

ihre Neigung zu solchen Reaktionen offenbar nur gering ausgeprägt. Es ist daher notwendig, die in

Schema 5 (Seite 9) und Schema 6 (Seite 10) gezeigten Mechanismen der Bildung N-substituierter

Glucosylamine 5a und entsprechender SCHIFF-Basen 5b näher zu betrachten. Diese stellen den Auftakt

der Bildung von AMADORI-Verbindungen 6 dar. Es ist dabei deutlich zu erkennen, dass die Bildung von

5a und 5b eng mit der Anomerisierung der D-Glucose 2a verknüpft ist. Es kann daher davon

ausgegangen werden, dass eine Erhöhung von Anomerisierungsraten auch die Bildung von Mono- und

Difructosylaminosäuren begünstigt.

In Kapitel 4.1.1 wurde bereits beschrieben, dass der Abbau von D-Fructose 1a durch

Carbonsäuren katalysiert wird. Dabei zeigte sich deutlich, dass die Carboxyl-vermittelte Katalyse mit

abnehmender Säurestärke effektiver wird. Es stellt sich somit die Frage, ob Carbonsäuren analog auch

die Raten der Anomerisierung erhöhen. Eine Bestätigung dieser Fragestellung würde mit Blick auf die

gemessenen Raten der 1,2-Enolisierung für die homologe Reihe der AMADORI-Verbindungen mit

ω-Aminofunktion 6c-6e auch die in Schema 21 (Seite 49) verbildlichte Hypothese des mechanistischen

Zusammenhangs zwischen Enolisierung und Anomerisierung untermauern. Zu diesem Zwecke wurde

das jeweils gewichtete Mittel der Ringöffnungsraten von Fructosylglycin 6c, Fructosyl-β-alanin 6d und

Fructosyl-γ-aminobuttersäure 6e mittels selektiver 1H-Sättigungstransfer-NMR-Spektroskopie

(SST-NMR) gemessen. Dazu wurde die Resonanz des jeweiligen AB-Spinsystems des acyclischen

Zentralisomers 6(v) mit Hilfe von Softpulskaskaden verschiedener Dauer selektiv gesättigt und der

Sättigungstransfer auf die Resonanzen der überlagerten AB-Spinsysteme der cyclischen Isomere

beobachtet. Um zu prüfen, ob sich die entsprechenden Ringöffnungsraten wie erwartet voneinander

unterscheiden, wurden diese zunächst beispielhaft bei einem pD-Wert von 4.5 und einer Temperatur

von 57 °C gemessen (vgl. Abbildung 25).

Abbildung 25: Gegenüberstellung der konzentrationsgewichteten Ringöffnungsraten und der Raten der 1,2-Enolisierung von Fructosylglycin 6c, -β-alanin 6d und -γ-aminobuttersäure 6e für einen pD-Wert von 4.5 und eine Temperatur von 57 °C.

0.0E+00

2.0E-05

4.0E-05

6.0E-05

8.0E-05

1.0E-04

1.2E-04

0.00

0.03

0.06

0.09

0.12R

ate

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1,2

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[Hz]

Ko

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[H

z]

RöG

1,2-Enolisierung

Fru

cto

syl-

glyc

in

Fru

cto

syl-

β-a

lan

in

Fru

cto

syl-

γ-am

ino

bu

tter

säu

re

Ringöffnung

1,2-Enolisierung


- 75 -

Es zeigt sich eine Zunahme des konzentrationsgewichteten Mittels aller Ringöffnungsraten

mit einer Abnahme der Säurestärke der Carboxylfunktion. Dabei ist die Rate der Anomerisierung

weniger sensitiv gegenüber Änderungen des 𝑝𝐾𝑠-Wertes als die der 1,2-Enolisierung. Darüber hinaus

spielt es für die beobachtete Katalyse offenbar keine merkliche Rolle, wie groß der Abstand zwischen

der Carboxylfunktion und dem Zuckergrundkörper ist. Damit ist es wahrscheinlich, dass

AMADORI-Verbindungen nicht nur ihre eigene Anomerisierung katalysieren, sondern auch die von

vorliegenden reduzierenden Zuckern. Die beobachtete Tendenz der AMADORI-Verbindungen mit

𝑝𝐾𝑠-Werten von mehr als 3.0, mit weiteren Zuckereinheiten zu kondensieren, ist damit einerseits auf

eine katalytische Beschleunigung der Anomerisierung und andererseits auf eine effiziente

AMADORI-Umlagerung (katalysierte 1,2-Enolisierung) zurückzuführen.

4.2.3 ZWISCHENFAZIT DER BISHERIGEN ERGEBNISSE

Die Zusammenfassung der bisherigen Erkenntnisse liefert die Erklärung für die in vielen

Untersuchungen beobachtete erhöhte Reaktivität der basischen Aminosäuren L-Lysin und L-Arginin

gegenüber nicht basischen Aminosäuren.[318,319] Die 𝑝𝐾𝑠-Werte der α-Aminofunktionen der basischen

Aminosäuren (𝑝𝐾𝑠 ≅ 9.0) sind im Vergleich zu denen einfacher neutraler Aminosäuren wie L-Alanin 4a

und Glycin 4c (vgl. Tabelle 1, Seite 44) um fast eine Einheit reduziert.[14] Die in den jeweiligen

Seitenketten gebundenen Aminofunktionen haben demgegenüber 𝑝𝐾𝑠-Werte, die rund zwei bis drei

Einheiten über denen ihrer α-Aminofunktionen liegen.[33] Es ist demnach davon auszugehen, dass die

α-ständigen Aminofunktionen von L-Lysin und L-Arginin bevorzugt Kondensationsreaktionen mit

reduzierenden Zuckern eingehen.42 Dies ist von HEYNS et al. (1967) für die Kondensation von L-Lysin mit

D-Fructose 1a auch entsprechend beobachtet worden,[116] konnte bislang jedoch nicht erklärt werden.

Bei der Kondensation von D-Glucose 2a an die Aminofunktion einer Aminosäure (bspw. 4a-4e) senkt

sich deren 𝑝𝐾𝑠-Wert in der Regel um rund 1.5 Einheiten ab (vgl. hierzu Tabellen 1 und 2, Seiten 44 und

55).43;[129] Das hat drei Konsequenzen. Erstens nähert sich der 𝑝𝐾𝑠-Wert dem 𝑝𝐼 des Zuckers und damit

dem katalytischen Bereich für die Anomerisierung. Zweitens wird die 1,2-Enolisierung durch den

schwach basischen Aminostickstoff katalysiert, was die Bildung von 3-Desoxyglucoson 9b fördert. Und

drittens wird die Kondensation mit einem zweiten Molekül eines reduzierenden Zuckers erleichtert

und die AMADORI-Umlagerung durch nochmalige Herabsetzung der Basizität katalysiert. Durch den

verringerten 𝑝𝐾𝑠-Wert des Aminostickstoffs verstärken sich alle genannten Effekte im

Kondensationsprodukt. Das wiederum führt mutmaßlich zu stark erhöhten Raten der Anomerisierung,

sodass auch die Kondensation der Aminofunktionen der Seitenketten mit reduzierenden Zuckern

begünstigt wird. Aufgrund der zur glycosylierten Aminofunktion α-ständigen Carboxylfunktion ist

darüber hinaus die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zur Hydroxylfunktion am C-3 möglich, die

zusätzlich zu einer erhöhten Bildungsrate von 1-Desoxyglucoson 9a führt. Da – wie in den Kapiteln

4.1.2 und 4.1.3 gezeigt – sowohl 1- als auch 3-Desoxyglucoson 9a und 9b maßgeblich zur Bräunung

beitragen, ergibt sich aus der Kombination der beschriebenen Effekte die hohe Bräunungsaktivität des

42 Diese Aussage steht in Widerspruch zu den Untersuchungen von HEYNS und NOACK (1962), die bei ihren

Experimenten keine Bildung von Nα-Fructosyllysin beobachten konnten.[111] Dies liegt jedoch vermutlich an der

genutzten Synthesestrategie. Diese geht vom entsprechenden Hydrochlorid von L-Lysin aus. Die Umsetzung mit

D-Glucose findet dabei nicht im wässrigen Milieu, sondern in organischen Lösungsmitteln statt.

43 Demzufolge entspricht der 𝑝𝐾𝑠-Wert der ε-Aminofunktion der Nε-AMADORI-Verbindung des L-Lysins in etwa

dem 𝑝𝐾𝑠-Wert der α-Aminofunktion des L-Lysins.[149] Der 𝑝𝐾𝑠-Wert der α-Aminofunktion der

Nα-AMADORI-Verbindung des L-Lysins kann demgegenüber mit ungefähr 7.0-7.5 angenommen werden.


- 76 -

L-Lysins.[301] Diese Argumentationskette konterkariert den bisherigen wissenschaftlichen Standpunkt,

„dass ω-Aminogruppen, …, schneller als α-Aminogruppen reagieren“.[111] Bei der Formulierung dieses

Standpunktes wurde dem Einfluss der einzelnen 𝑝𝐾𝑠-Werte auf die Anomerisierung und die

AMADORI-Umlagerung nicht genügend Rechnung getragen. Das zeigt sich u.a. in Untersuchungen von

WESTPHAL et al. (1985).[301] Zur Aufklärung der Gründe der besonderen Reaktivität von L-Lysin wurde

dessen Bräunungsverhalten bei Reaktionen mit D-Glucose 2a mit dem Verhalten von Norleucin und

ε-Aminocapronsäure verglichen. Strukturell betrachtet wurde demnach in einem ersten Versuch die

α- und in einem zweiten Versuch die ε-Aminofunktion gegen ein Proton substituiert. Der Einfluss des

pH-Wertes wurde dabei vernachlässigt. Es zeigte sich eine geringe Reaktivität für Norleucin und eine

deutlich höhere für ε-Aminocapronsäure. Damit schien auch hier bestätigt zu sein, dass endständige

Aminofunktionen reaktiver sind als α-ständige. Betrachtet man jedoch die in Tabelle 7 aufgeführten

𝑝𝐾𝑠-Werte, so wird deutlich, dass die Position der Aminofunktion einen drastischen Einfluss auf die

Dissoziation der Carboxylfunktion hat.

Tabelle 7: 𝑝𝐾𝑠-Werte von Norleucin und ε-Aminocapronsäure.

Verbindung 𝒑𝑲𝒔(𝑪𝒂𝒓𝒃𝒐𝒙𝒚𝒍) 𝒑𝑲𝒔(𝜶-𝑨𝒎𝒊𝒏𝒐) 𝒑𝑲𝒔(𝜺-𝑨𝒎𝒊𝒏𝒐)

Norleucin[320] 2.79 9.53 -

ε-Aminocapronsäure[321] 4.73 - 10.21

L-Lysin[14] 2.20 8.90 10.28

Der Wegfall der α-Aminofunktion hat eine starke Verringerung der Säurestärke der

Carboxylfunktion zur Folge. Deren katalytischer Einfluss auf die Anomerisierung nimmt entsprechend

sehr stark zu. Folglich ist trotz der höheren Basizität der Aminofunktion auch mit einer beschleunigten

Bildung der AMADORI-Verbindung und daneben mit einem höheren Anteil an Reaktionen der

Karamellisierung zu rechnen. Dass die erhöhte Reaktivität von L-Lysin nicht in erster Linie von der

ε-Aminofunktion abhängig ist, zeigen auch Experimente von HIRSCH et al. (1995) und MOSSINE et al.

(1999).[119,149] Diese untersuchten jeweils das Reaktionsverhalten von Nε-(1-Desoxy-

D-fructos-1-yl)-Nα-formyl-L-lysin. Die α-Aminofunktion ist hierbei formyliert, sodass das entsprechende

Stickstoffatom seine Basizität verliert. Der 𝑝𝐾𝑠-Wert der Carboxylfunktion steigt entsprechend an,

erreicht mit einem Wert von 3.08 jedoch nicht den der AMADORI-Verbindung der ε-Aminocapronsäure

(𝑝𝐾𝑠 = 4.44). Der 𝑝𝐾𝑠-Wert der ε-Aminofunktion fällt durch die Glucosylierung von 10.6 auf 9.0.[129]

Damit ist ihre Basizität noch immer deutlich höher als die von AMADORI-Verbindungen der

α-Aminosäuren 6a-6c (vgl. Tabelle 2). Entsprechend zeigt Nε-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-Nα-

formyl-L-lysin im Vergleich zu Fructosylglycin 6c sowohl eine geringere Rate der 1,2-Enolisierung als

auch eine geringere Rate der Bildung von 3-Desoxyglucoson 9b.[119,149] Physiologisch gesehen ist dies

von großer Bedeutung, da reduzierende Zucker hier in der Regel Reaktionen mit Proteinen bzw.

Peptiden eingehen. In gewöhnlichen Peptiden stehen einem Zucker für Kondensationsreaktionen

lediglich die ω-Aminofunktionen des L-Lysins bzw. L-Arginins zur Verfügung. Die Freisetzung reaktiver

MAILLARD-Intermediate ist demnach geringer einzuschätzen, als sie für Nα-AMADORI-Verbindungen des

L-Lysins bzw. L-Arginins zu erwarten wäre.

4.2.4 ZUSAMMENHANG ZWISCHEN ANOMERISIERUNG UND REAKTIVITÄT

Die bisherige Diskussion der Ergebnisse hat gezeigt, dass die Reaktivität von Derivaten der

D-Fructose neben molekulargeometrischen Einflüssen insbesondere von den jeweiligen 𝑝𝐾𝑠-Werten

der Amino- und Carboxylfunktionen abhängig ist. Wie bereits von JOHANNES NICOLAUS BRØNSTED und


- 77 -

EDWARD ARMAND GUGGENHEIM (1927) beschrieben, trifft das auch auf die Rate der Mutarotation

reduzierender Zucker zu.[289] Diesbezüglich wurde in Schema 19 (Seite 35) gezeigt, dass die

Anomerisierung der Zucker über ionische Spezies erfolgt (vgl. dazu auch das Strukturenverzeichnis).

Dass viele Prozesse, die zur stofflichen Veränderung eines Zuckers führen, gleichermaßen von der

Bildung ionischer Zuckerspezies abhängig sind, wurde im Verlauf der vorliegenden Arbeit an vielen

Stellen erörtert. Dazu zählen Epimerisierungen (Schema 3, Seite 7), die Bildung von N-Glycosiden

(Schema 5, Seite 9 und Schema 6, Seite 10) sowie die AMADORI-Umlagerung (Schema 8, Seite 11), die

Bildung O-heterocyclischer Verbindungen (Schema 17, Seite 21), die Tautomerisierung zu Endiolen und

Enaminolen (Schema 21, Seite 49) sowie die Bildung der epimeren 3-Desoxyosone 9b und 9c

(Schema 24, Seite 64). Reaktionen reduzierender Zucker können demzufolge als Fehler oder

unwahrscheinliche Alternativen der Anomerisierung angesehen werden.44 Dabei handelt es sich bei

den ionischen Spezies, die den Abbau der Verbindung verursachen, nicht zwingend um diejenigen, die

verantwortlich für den Prozess der Anomerisierung sind. Die Deprotonierung der anomeren

Hydroxylfunktion führt zur Ringöffnung und damit zur Anomerisierung, während die Deprotonierung

einer der übrigen Hydroxylfunktionen den Auftakt für eine Abbaureaktion darstellt.

Ausgehend von diesen Überlegungen kann angenommen werden, dass Gleichung (33)

(Seite 36) nicht nur zur Beschreibung der Dynamik der Ringöffnung, sondern ebenso zur Beschreibung

der Abbaukinetik eines reduzierenden Zuckers genutzt werden kann. Die anomeren

Hydroxylfunktionen reduzierender Zucker haben von allen vorhandenen Hydroxylfunktionen die

geringsten 𝑝𝐾𝑠-Werte und damit das größte Bestreben zur Deprotonierung.[298] Betrachtet man

beispielsweise den dritten Summanden aus Gleichung (33), bedeutet dies, dass 𝐾𝑠2 im Falle der

anomeren Hydroxylfunktion von allen vorhanden Hydroxylfunktionen den größten Wert annimmt.

Damit ergibt sich für die Rate der Ringöffnung nahezu unabhängig vom pH-Wert ein konstantes

Vielfaches der Abbaurate des Zuckers. Dabei entspricht das Verhältnis der jeweiligen Raten dem

Verhältnis der Säurekonstanten der betrachteten Hydroxylfunktionen multipliziert mit dem Verhältnis

ihrer spontanen Ringöffnungs- bzw. Abbauraten. Hat die Temperatur schließlich einen ähnlichen

Einfluss auf die spontanen Ringöffnungs- und Abbauraten, ist das beschriebene Verhältnis von

Ringöffnung und Abbau darüber hinaus praktisch temperaturunabhängig.

Auf dieser Basis ergibt sich eine mathematisch begründete Korrelation von Dynamik und

Kinetik. Ein mechanistischer Zusammenhang kann wie folgt hergestellt werden: Die anomere

Hydroxylfunktion stellt nach ihrer Deprotonierung zum Alkoholat eine sehr starke Base dar. Damit ist

ein Protonenshift von weiteren Hydroxylfunktionen hin zum anomeren Alkoholat nicht

unwahrscheinlich. Einen solchen Protonenshift zeigt bspw. Schema 21 (Seite 49). Analog kann auch ein

Protonenshift vom kationischen Ringsauerstoff auf eine Hydroxylfunktion erfolgen.45 Auf dieser

Modellvorstellung beruhen u.a. die in Schema 17 (Seite 21) gezeigten Reaktionsmechanismen.

Weitere mechanistische Verknüpfungen vom Prozess der Anomerisierung mit stofflichen

Veränderungen von Zuckern zeigt Schema 27 am Beispiel der Tautomerisierung verschiedener

Anomere der D-Fructose 1a im Basischen. Entsprechende Reaktionen im sauren Milieu fasst die

Publikation von RASMUSSEN et al. (2014) zusammen.[177]

44 Vergleiche dazu auch die in den Schemata 5 und 6 (Seiten 9 und 10) gezeigte Konkurrenz der Bildung des

gem-Diols der D-Glucose 2a zur Bildung des gem-Aminols 5c.

45 Rechnungen von FENG et al. (2013) zeigen, dass die Protonenaffinität der anomeren Hydroxylfunktionen der

Anomere der D-Fructose 1a sogar geringfügig größer ist als die der entsprechenden Ringsauerstoffatome.[298]


- 78 -

Bei den in Schema 27 formulierten Abbauprodukten (insbesondere Gycerinaldehyd 19,

Glycerinsäure 20, Glyoxal 21 und Acrolein 22) handelt es sich um repräsentative Intermediate der

MAILLARD-Reaktion.[304,322-326]

Aufgrund der diskutierten Zusammenhänge zwischen dem Prozess der Anomerisierung und

dem Abbau von Zuckern kann davon ausgegangen werden, dass eine Beschleunigung der

Anomerisierung auch zu einer Instabilität des Zuckers im Allgemeinen führt. Demnach handelt es sich

bei dem acyclischen Zentralisomer eines Zuckers nicht – wie üblicherweise angenommen[327,328] – um

dessen reaktionsverantwortliche Komponente. Vielmehr tragen alle Anomere eines Zuckers zur

Reaktivität des Gesamtsystems bei, da jedes Anomer zur Ausbildung ionischer Spezies befähigt ist. Die

Reaktivität eines Zuckers korreliert, dieser Argumentation folgend, mit der Summe der Produkte der

jeweiligen Anomerisierungsraten und der relativen Konzentrationen der Anomere. Für Derivate der

D-Fructose lässt sich diese konzentrationsgewichtete Gesamtanomerisierungsrate 𝑘Σ mit Hilfe von

Gleichung (46) berechnen.

𝑘Σ = [𝛼𝐹] ∙ 𝑘𝛼𝐹,𝑧 + [𝛽𝐹] ∙ 𝑘𝛽𝐹,𝑧 + [𝛼𝑃] ∙ 𝑘𝛼𝑃,𝑧 + [𝛽𝑃] ∙ 𝑘𝛽𝑃,𝑧

+[𝑧] ∙ (𝑘𝑧,𝛼𝐹 + 𝑘𝑧,𝛽𝐹 + 𝑘𝑧,𝛼𝑃 + 𝑘𝑧,𝛽𝐹) = 2 ∙ [𝑧] ∙∑𝑘𝑧,𝑖𝑖

(46)

Dabei bezeichnet 𝑧 das acyclische Zentralisomer, 𝑘𝑖,𝑧 die Ringöffnungsraten und 𝑘𝑧,𝑖 die

Ringschlussraten. Eine Beschleunigung der Anomerisierungsraten führt auch zu einer beschleunigten

Bildung ionischer Zuckerspezies. Die Berechnung der konzentrationsgewichteten

Gesamtanomerisierungsrate 𝑘Σ ermöglicht demnach einen empfindlichen Vergleich der relativen

Reaktivitäten verschiedener Zucker – auch unter Bedingungen bei denen der Ablauf von Reaktionen

selbst noch nicht feststellbar ist. Das gewichtete Mittel der mittleren Lebensdauer der einzelnen

Isomere korreliert folglich mit der milieuabhängigen Stabilität des Zuckers. Zur vergleichenden

Berechnung der Stabilitäten wird auf Grundlage von 𝑘Σ ein neuer Parameter eingeführt. Dieser als

ACuSTiC (Approximated Carbohydrate Milieu Stability Time Constant) bezeichnete Parameter gibt an,

welche Zeit durchschnittlich vergeht, bis jedes Molekül eines Anomerensystems genau einmal ionisiert

wurde. Der ACuSTiC-Wert ergibt sich durch die Lösung des durch Gleichung (47) gegebenen Integrals

und wird somit durch Gleichung (48) beschrieben.

∫𝑘Σ ∙ 𝑑𝑡

𝑡

0

= ∫2 ∙ [𝑧] ∙∑𝑘𝑧,𝑖𝑖

∙ 𝑑𝑡

𝑡

0

= 100% (47)

𝑡 =100%

2 ∙ [𝑧] ∙ ∑ 𝑘𝑧,𝑖𝑖= 𝐴𝐶𝑢𝑆𝑇𝑖𝐶 (48)

In Kapitel 4.2.2 wurde bereits gezeigt, dass das gewichtete Mittel der Ringöffnungsraten von

AMADORI-Verbindungen der ω-Aminosäuren 6c-6e mit deren Raten der 1,2-Enolisierung korreliert, und

dass diese wiederum in direkter Verbindung zu den Bildungsraten von 3-Desoxyglucoson 9b stehen.

Im Folgenden gilt es zu überprüfen, ob die Berechnung von ACuSTiC-Werten eine Abschätzung der

relativen Stabilität verschiedener Zuckersysteme erlaubt. Dazu wurden die relativen Konzentrationen

der Anomere verschiedener reduzierender Zucker in Abhängigkeit der Temperatur und des pH- bzw.

pD-Wertes mittels quantitativer NMR-Spektroskopie bestimmt. Daraufhin erfolgte die Messung der

einzelnen Ringöffnungsraten mittels selektiver Sättigungstransfer-NMR-Spektroskopie (SST-NMR)

unter denselben Bedingungen.


- 79 -

Schema 27: Mechanistischer Zusammenhang des Prozesses der Anomerisierung und stofflichen Veränderungen reduzierender Zucker am Beispiel von Anomeren der D-Fructose 1a.


- 80 -

Als Zielsubstanzen wurden D-Fructose 1a in An- und Abwesenheit äquimolarer Mengen an

L-Alanin 4a bzw. L-Prolin 4b sowie die entsprechenden AMADORI-Verbindungen 6a und 6b ausgewählt.

Um eine verlässliche Quantifizierung zu erreichen und daneben die spezifischen Ringöffnungsraten

jedes Anomers ermitteln zu können, erfolgten die NMR-spektroskopischen Messungen auf Grundlage

der anomeren 13C-NMR-Resonanzen. Dafür war es notwendig, mit [2-13C]-markierten

Zuckergrundkörpern zu arbeiten. Um die Allgemeingültigkeit des ACuSTiC-Ansatzes zu überprüfen,

wurden darüber hinaus äquivalente Messungen für D-[2-13C]Tagatose 1b und D-Glucose 2a

durchgeführt. Die Messungen der D-Glucose 2a erfolgten dabei auf Grundlage der anomeren 1H-NMR-Resonanzen.

4.2.5 QUANTITATIVE ZUSAMMENSETZUNG DER ANOMERENSYSTEME

Die Messung der relativen Konzentrationen der Zuckerisomere erfolgte bei Temperaturen

zwischen 27 und 87 °C in einem pD-Intervall von 1.5 bis 6.5. Der Temperaturbereich orientiert sich

dabei am Fest- und Siedepunkt des Lösungsmittels (D2O). Das pD-Intervall wurde dem

lebensmittelrelevanten Bereich angepasst. Da sich der pD-Wert – wie bereits beschrieben – im Verlauf

der nicht enzymatischen Bräunung auf Werte um 4.0 absenkt[16,302] und die zu messenden

Ringöffnungsraten pD-abhängig sind, musste die Messung des pD-Wertes simultan zur Messung der

Anomerisierungsraten erfolgen. Dies ist möglich, da die chemische Verschiebung der

NMR-Resonanzen zahlreicher funktioneller Gruppen pD-abhängig ist. Daneben ist die Signallage

zusätzlich abhängig von der Temperatur.[329] Damit sind die Temperatur und der pD-Wert einer Probe

nahezu in allen zugehörigen NMR-Spektren codiert und können nach geeigneter Kalibrierung

ausgelesen werden. Da die Temperatur der Probe innerhalb des Probenkopfes des

NMR-Spektrometers mit Hilfe von Thermostaten auf etwa 0.1 K genau eingestellt und überwacht

werden kann, ist die Decodierung des pD-Wertes auf Grundlage der HENDERSON-HASSELBALCH-Funktion

für den chemischen Austausch möglich.[330] Es zeigte sich, dass das für die Probenvorbereitung

genutzte Deuteriumoxid jeglicher Hersteller Spuren von Ameisensäure enthielt. Diese hat einen

𝑝𝐾𝑠-Wert von 3.63 in H2O (vgl. Tabelle 12, Seite 97) und damit von 4.13 in D2O.[331] Entsprechend der

HENDERSON-HASSELBALCH-Funktion ist demnach je nach vorherrschender Ionenstärke mit pD-sensitiven

chemischen Verschiebungen der Kernresonanzen der Ameisensäure im pD-Bereich von rund 2.0 bis

6.0 zu rechnen.[332] Dies umfasst nahezu das gesamte pD-Intervall, für das die Messung von

Anomerisierungsraten erfolgen soll. Daneben ist der 𝑝𝐾𝑠-Wert der Ameisensäure im Bereich zwischen

0 und 100 °C kaum temperaturabhängig.[333] Die als Verunreinigung vorhandene Ameisensäure stellt

aufgrund dessen eine gut brauchbare pD-Sonde dar und wurde daher im Rahmen dieser Arbeit als

solche genutzt.

Es zeigte sich für alle untersuchten Systeme reduzierender Zucker sowie von

Zuckerderivaten, dass die relativen Konzentrationen ihrer Anomere im untersuchten Bereich nicht

abhängig vom pD-Wert sind. Demnach wurden die jeweils bei identischer Temperatur gemessenen

relativen Konzentrationen gemittelt. Anschließend wurden die relativen Konzentrationen der

cyclischen Anomere in Relation zur Konzentration des offenkettigen Zentralisomers gesetzt und die

entsprechenden Entropie- und Enthalpiedifferenzen nach Gleichung (49) berechnet.

𝐾 = exp(−∆𝐻 − 𝑇 ∙ ∆𝑆

𝑅 ∙ 𝑇) (49)


- 81 -

Dabei ist 𝐾 die jeweilige Konstante für das Gleichgewicht zwischen einem cyclischen Anomer

und dem Zentralisomer, ∆𝐻 die Enthalpiedifferenz, ∆𝑆 die Entropiedifferenz, 𝑇 die absolute

Temperatur und 𝑅 die universelle Gaskonstante. Diese Vorgehensweise wurde für (alle Derivate der)

D-Fructose 1a, 6a und 6b sowie D-Tagatose 1b genutzt. Für D-Glucose 2a musste die Berechnung der

thermodynamischen Parameter auf einem anderen Weg erfolgen.

Problematisch bei der Messung der relativen Konzentrationen der Strukturisomere der

D-Glucose 2a ist, dass ihr acyclisches Zentralisomer bei 30 °C lediglich zu rund 0.004% (d.h. 40 ppm)

vorliegt.[95] Ein direkter Nachweis entsprechender 13C-NMR-Resonanzen ist daher nur mit erheblichem

Aufwand möglich. Ein Nachweis zugehöriger 1H-NMR-Resonanzen steht bis heute aus. Die Methode

der NMR-Spektroskopie eignet sich damit nicht für die temperaturabhängige Messung von

Gleichgewichtskonstanten der D-Glucose 2a. Es zeigt sich jedoch, dass sich die relativen

Konzentrationen der einzelnen Anomere der untersuchten Zucker im relevanten Temperaturbereich

in sehr guter Näherung durch quadratische Funktionen beschreiben lassen. Daher wurden 13C-NMR-

basierte Literaturwerte der relativen Konzentrationen des acyclischen Zentralisomers der D-Glucose

2a für verschiedene Temperaturen gesucht[334] und mit Hilfe einer quadratischen Funktion modelliert.

Damit ist die relative Konzentration des acyclischen Zentralisomers in Abhängigkeit der Temperatur

näherungsweise bekannt.

Als weiteres Problem stellte sich heraus, dass bislang keinerlei 1H-NMR-Resonanzen der

furanoiden Anomere der D-Glucose 2a in der Literatur beschrieben sind. Alle bisherigen direkten

NMR-spektroskopischen Messungen der furanoiden Anomere der D-Glucose 2a basieren auf der

Detektion anomerer 13C-NMR-Resonanzen.[95,334,335] Lediglich für 3,6-Anhydro-D-glucose, die in

wässriger Lösung hauptsächlich furanoide Anomere bildet, sind 1H-NMR-Daten verfügbar.[336] Dabei

liegt die 1H-NMR-Resonanz des anomeren Protons des α-Anomers bei tieferem Feld als die des

β-Anomers. Darüber hinaus ist der Unterschied der jeweiligen vicinalen Kopplungskonstanten der

anomeren Protonen markant. Für das α-Anomer beträgt die Kopplungskonstante 4 Hz, für das

β-Anomer hingegen lediglich 1 Hz.[336] Diese Messwerte stehen im Einklang mit der allgemeinen

Beobachtung, dass die 1H-NMR-Resonanz des anomeren Protons des 1,2-cis-Anomers (hier:

α-Anomer) gewöhnlich bei tieferem Feld liegt als die des 1,2-trans-Anomers (hier: β-Anomer).[337] Dies

wird auch als die sogenannte „syn-upfield rule“ bezeichnet.46;[47,73,338] Außerdem liegt die vicinale

Kopplungskonstante des anomeren Protons der 1,2-cis-anomeren Furanose gewöhnlich bei 3-5 Hz und

die der 1,2-trans-anomeren Furanose bei 0-2 Hz.[337] In den 1H-NMR-Spektren der D-Glucose 2a

konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit zwei Resonanzen identifiziert werden, die im anomeren

Bereich des Spektrums liegen und im Einklang mit den oben beschriebenen Literaturangaben stehen.

Die entsprechenden 1H-NMR-Resonanzen zeigt Abbildung 26 für eine Temperatur von 67 °C bei pD 5.0.

Bei Temperaturen unterhalb von 37 °C ist das anomere 1H-NMR-Signal des β-furanoiden

Anomers bei einer Messfrequenz von 600 MHz nicht nachweisbar, da seine Resonanz isochron zu der

des anomeren Protons der α-Pyranose ist. Vermutlich ist dies der Grund dafür, dass bislang keine

entsprechenden Resonanzen in der Literatur beschrieben wurden.

Obwohl sowohl die relative Lage der anomeren Signale der furanoiden Anomere sowie deren

Kopplungskonstanten mit den Erwartungen übereinstimmen, ist dies noch kein Beweis für eine

46 Dabei ist das betrachtete Proton syn-ständig zur funktionellen Gruppe (etwa einer Hydroxylfunktion). Damit

handelt es sich um das 1,2-trans-Anomer.


- 82 -

korrekte Zuordnung. Es besteht noch immer die Möglichkeit, dass etwaige Verunreinigungen für die

beobachteten Resonanzen verantwortlich sind.

Abbildung 26: Anomerer Bereich des 1H-NMR-Spektrums von D-Glucose 2a bei einer Messfrequenz von 600 MHz bei 67 °C und einem pD-Wert von 5.0. Bei den mit * gekennzeichneten Signalen handelt es sich um die 13C-Satteliten der NMR-Resonanzen der pyranoiden Hauptisomere.

Um dies auszuschließen, wurde ein Sättigungstransfer-Differenz-NMR-Experiment

(STD-NMR) durchgeführt. Dabei wurde bei einer Temperatur von 87 °C und einem pD-Wert von 2.55

im Bereich der Resonanzen der Aldehydprotonen (hier: ca. 10.33 ppm) für eine Dauer von 60 s blind

gesättigt und die Differenz zu einem ohne Sättigung gemessenen Referenzspektrum gebildet. Das

somit erhaltene Differenzspektrum (vgl. Abbildung 27) zeigt deutlich, dass ein Sättigungstransfer vom

blind gesättigten Aldehydproton des acyclischen Zentralisomers auf die furanoiden und pyranoiden

anomeren Protonen erfolgte.

Abbildung 27: Sättigungstransfer-NMR-Differenzspektrum der D-Glucose 2a bei selektiver Sättigung der Protonenresonanzen bei ca. 10.33 ppm mit Hilfe einer 90° GAUSS-Softpuls-Kaskade einer Dauer von 60 s und einer spektralen Anregungsbreite von 212 Hz. Gemessen bei 600 MHz bei einer Temperatur von 87 °C und pD 2.55. Der mit * gekennzeichnete Verschiebungsbereich zeigt typische symmetrische Differenzsignale. Diese sind für Protonenresonanzen zu beobachten, für die kein Sättigungstransfer erfolgt.

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

4.85.05.25.45.65.8

Inte

nsi

tät

Chemische Verschiebung δ(1H) [ppm]

β-Furanose

α-Furanose

*

*

*

β-Pyranose

*

α-Pyranose

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

3.54.04.55.05.56.0

Inte

nsi

tät

Chemische Verschiebung (1H) [ppm]

β-Furanoseα-Furanose

α-Pyranose β-Pyranose

*


- 83 -

Die relativen chemischen Verschiebungen sowie die Kopplungskonstanten der diskutierten 1H-NMR-Resonanzen können in Kombination mit dem Ergebnis des STD-NMR-Experimentes als

hinreichender Beweis für eine direkte Identifizierung der furanoiden Anomere der D-Glucose 2a mittels 1H-NMR-Spektroskopie betrachtet werden. Entsprechend konnte nun auch die Quantifizierung der

relativen Konzentrationen der cyclischen Anomere der D-Glucose 2a in Abhängigkeit der Temperatur

erfolgen. Die Tabellen 8 und 9 zeigen die für die Zielsubstanzen berechneten thermodynamischen

Parameter zur temperaturabhängigen Beschreibung der Gleichgewichtskonstanten der

Anomerensysteme.

Tabelle 8: Thermodynamische Parameter der Anomerengleichgewichte der untersuchten Zuckersysteme. Teil 1: Enthalpiedifferenzen. Alle Werte sind in kJ/mol angegeben. Bei den angegebenen Fehlern handelt es sich um die Standardfehler der geschätzten Parameter.

z αP z βP z αF z βF

D-Fructose -22.7 ± 1.2 -33.9 ± 0.3 -17.1 ± 0.3 -20.7 ± 0.5

D-Fructose + L-Alanin -31.7 ± 2.7 -31.5 ± 0.7 -16.4 ± 0.7 -20.9 ± 0.7

D-Fructose + L-Prolin -22.2 ± 1.1 -33.3 ± 0.6 -16.0 ± 0.4 -20.0 ± 0.4

Fructosylalanin -19.3 ± 1.1 -26.4 ± 1.2 -10.5 ± 0.9 -12.3 ± 0.9

Fructosylprolin -19.8 ± 0.5 -25.9 ± 0.8 -11.1 ± 0.6 -12.8 ± 0.6

D-Tagatose -39.1 ± 0.8 -30.8 ± 1.6 -17.7 ± 0.7 -18.3 ± 0.5

D-Glucose -45.2 ± 0.6 -46.3 ± 0.3 -19.1 ± 0.8 -12.6 ± 3.2

Tabelle 9: Thermodynamische Parameter der Anomerengleichgewichte der untersuchten Zuckersysteme. Teil 2: Entropiedifferenzen. Alle Werte sind in J/(K·mol) angegeben. Bei den angegebenen Fehlern handelt es sich um die Standardfehler der geschätzten Parameter.

z αP z βP z αF z βF

D-Fructose -66.0 ± 3.9 -76.0 ± 0.9 -39.6 ± 0.9 -40.5 ± 1.5

D-Fructose + L-Alanin -95.0 ± 8.2 -68.0 ± 2.4 -37.5 ± 2.3 -41.4 ± 2.3

D-Fructose + L-Prolin -64.8 ± 3.5 -74.2 ± 2.0 -36.4 ± 1.2 -38.7 ± 1.3


Fructosylprolin -57.3 ± 1.7 -56.1 ± 2.5 -19.6 ± 1.8 -23.0 ± 1.8

D-Tagatose -89.3 ± 2.5 -74.5 ± 5.1 -47.3 ± 2.1 -41.7 ± 1.4

D-Glucose -64.3 ± 1.9 -63.4 ± 1.0 -23.9 ± 2.5 -8.7 ± 9.5

Eine Interpretation der in den Tabellen 8 und 9 aufgelisteten Werte erfolgt im Rahmen dieser

Arbeit nicht. Die Werte dienen lediglich der Berechnung relativer Konzentrationen einzelner Anomere

als Funktion der Temperatur und bilden damit die Grundlage der Berechnung von ACuSTiC-Werten. Es

soll jedoch nicht unerwähnt bleiben, dass ein Einfluss nicht kovalent gebundener Aminosäuren auf das

Anomerensystem der D-Fructose 1a nicht feststellbar ist. Es sind lediglich geringfügige Abweichungen

für das Gleichgewicht zwischen dem acyclischen Zentralisomer 1a(v) und der α-Pyranose 1a(i)

erkennbar. Die Integration der anomeren 13C-NMR-Resonanz der α-D-Fructopyranose 1a(i) ist jedoch

relativ stark fehlerbehaftet, da eine teilweise Überlagerung mit der sehr viel intensiveren 13C-NMR-Resonanz des anomeren Kohlenstoffatoms der β-D-Fructopyranose 1a(ii) vorliegt. Die

Abweichungen der entsprechenden thermodynamischen Parameter sollten daher nicht

überinterpretiert werden.


- 84 -

4.2.6 DYNAMIK DER ANOMERISIERUNG

Die Messung der Dynamik der Anomerisierung erfolgte im Rahmen der vorliegenden Arbeit

mit Hilfe der dynamischen NMR-Spektroskopie. Aufgrund ihrer in Kapitel 2.2.3 diskutierten Vorteile

gegenüber anderen Methoden, wurde dabei die selektive Sättigungstransfer-NMR-Spektroskopie

(SST-NMR) eingesetzt. Die Messung der Ringöffnungsraten der Anomere der Ketohexosen 1a und 1b

und deren Derivate 6a und 6b erfolgte unter der Ausnutzung anomerer 13C-NMR-Resonanzen. Im Falle

der D-Glucose 2a wurden wiederum die anomeren Protonenresonanzen zugrunde gelegt. Alle

Messungen erfolgten zwischen 27 und 87 °C in einem pD-Intervall von 1.5 bis 6.5, wobei Ameisensäure

als pD-Sonde genutzt wurde. Die in der Literatur übliche Auswertung der in Abhängigkeit der

Sättigungsdauer veränderten Integrale der beobachteten Kernresonanzen zur Berechnung der

Anomerisierungsraten basiert auf der Linearisierung von Gleichung (21) (Seite 32).[71] Die Messung von

Anomerisierungsraten in Abhängigkeit der Temperatur ermöglicht in einem zweiten Schritt die

Berechnung der thermodynamischen Aktivierungsparameter der Anomerisierung mit Hilfe der

EYRING-Funktion.[313] Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgt die Berechnung der

thermodynamischen Aktivierungsparameter im Unterschied dazu unmittelbar aus den Integralen der

beobachteten Kernresonanzen in Abhängigkeit der Sättigungsdauer, der Temperatur und des

pD-Wertes. Dazu wird die EYRING-Funktion in Gleichung (32) (für Modelle ohne Katalysator) bzw.

Gleichung (38) (für Modelle mit Katalysator) und diese wiederum in Gleichung (21) eingesetzt. Die

resultierende Funktion ist durch die thermodynamischen Aktivierungsparameter parametrisiert. Diese

Parameter können mit Hilfe einer nicht linearen Regression numerisch ermittelt werden und dienen

im finalen Schritt der Berechnung von ACuSTiC-Werten für beliebige pD-Werte und Temperaturen

innerhalb der jeweils untersuchten Intervalle. Die numerische Berechnung der thermodynamischen

Aktivierungsparameter der Zielsubstanzen sowie der entsprechenden Fehlerintervalle (Standardfehler

der Schätzwerte) wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit mit Hilfe des XLSTAT 2017

Statistik-Analyse Add-Ins für Microsoft Excel 2016 vorgenommen. Wie den Ausführungen in Kapitel 2.3

zu entnehmen ist, benötigt man für die Berechnungen jedoch die 𝑝𝐾𝑠-Werte der anomeren

Hydroxylfunktionen sowie der Ringsauerstoffatome der im Einzelnen untersuchten Zuckeranomere.

Eine experimentelle Messung entsprechender Dissoziationskonstanten ist hoch problematisch. Eine

NMR-Titration zur Ermittlung der 𝑝𝐾𝑠-Werte der anomeren Hydroxylfunktionen ist zwar prinzipiell

denkbar, jedoch sind die Analyten im entsprechenden pH-Bereich extrem instabil. Bei ihrem Abbau

fällt – wie oben beschrieben – der pH-Wert, sodass dieser im Zuge der Messungen nicht konstant ist.

Weiterhin ist die Rate der Anomerisierung im stark basischen pH-Bereich außerordentlich hoch, sodass

die Signallage der zu beobachtenden anomeren 13C-NMR-Resonanzen nicht mehr nur vom

Gleichgewicht ionischer und nicht ionischer Spezies, sondern gleichermaßen vom chemischen

Austausch der cyclischen Anomere mit dem acyclischen Zentralisomer abhängig ist.[339,340] Die damit

einhergehende Vergrößerung der Linienbreite der NMR-Resonanzen führte in entsprechenden

Experimenten zur Koaleszenz der anomeren 13C-NMR-Signale der cyclischen Anomere.[339,340] Damit ist

selbst die Abschätzung anomerenspezifischer 𝑝𝐾𝑠-Werte auf diese Weise nicht möglich. Im Rahmen

dieser Arbeit wurde daher zunächst das Ziel verfolgt, entsprechende 𝑝𝐾𝑠-Werte mit Hilfe kommerziell

verfügbarer Software (hier: Percepta von ACD/Labs) zu berechnen. Die Algorithmen, die der Software

zugrunde liegen (Bezeichnung: Classic- und GALAS-Algorithmus), erkennen Ether – und damit auch

Ringsauerstoffatome von Zuckeranomeren – jedoch prinzipiell nicht als ionisierbare funktionelle

Gruppen. Folglich ist eine Berechnung der zugehörigen 𝑝𝐾𝑠-Werte ausgeschlossen. Daher wurde die

Literaturrecherche ausgeweitet. Üblicherweise eingesetzte experimentelle Methoden wie

potentiometrische und kalorimetrische Titrationen ermöglichen ebenfalls keine anomerenspezifische


- 85 -

Bestimmung von 𝑝𝐾𝑠-Werten.[341] Entsprechend wurde die Recherche auf theoretische Berechnungen

von 𝑝𝐾𝑠-Werten fokussiert. Dabei sind jedoch lediglich die Dissoziationskonstanten der

Hydroxylfunktionen (nicht der Ringsauerstoffatome) der quantitativ bedeutsamen Anomere von

D-Glucose 2a und D-Fructose 1a verfügbar.[298] VON EULER et al. (1925, 1926) gingen in ihren Arbeiten

davon aus, dass das pH-Minimum der Mutarotation der D-Glucose 2a an ihrem 𝑝𝐼 liegt. Dies wäre

genau dann der Fall, wenn anionische und kationische Zuckerspezies dieselbe spontane Tendenz zur

Ringöffnung zeigen würden. Die Kenntnis des 𝑝𝐾𝑠-Wertes der anomeren Hydroxylfunktion würde über

die Messung des pH-Minimums der Mutarotationsrate somit die Berechnung des 𝑝𝐾𝑠-Wertes des

Ringsauerstoffatoms erlauben.[287,288] Ob die Prämisse identischer spontaner Ringöffnungsraten dabei

erfüllt ist, muss jedoch infrage gestellt werden. Neben theoretisch berechneten 𝑝𝐾𝑠-Werten liefern

FENG et al. (2013) allerdings auch theoretisch berechnete Protonenaffinitäten. Es zeigt sich dabei, dass

die Protonenaffinität der Ringsauerstoffatome der Anomere der D-Fructose 1a (D-Glucose 2a) in etwa

derjenigen der Hydroxylfunktion von tert-Butanol (Ethanol) entspricht. Frühere Berechnungen von

WOODS et al. (1991) liefern vergleichbare Ergebnisse.[342] Da 𝑝𝐾𝑠-Werte eng mit Protonenaffinitäten

verknüpft sind, wurde im Folgenden mit den 𝑝𝐾𝑠-Werten der genannten Alkohole gerechnet. Diese

liegen für tert-Butanol bei -2.6 und für Ethanol bei -1.94.[343,344] Für β-D-Fructopyranose 1a(ii) liegt der

𝑝𝐾𝑠-Wert der anomeren Hydroxylfunktion bei rund 12.0[298] und das Minimum der Mutarotationsrate

im pH-Bereich zwischen 2.5 und 6.5.[67] Geht man von einer Äquivalenz dieses pH-Intervalls und des 𝑝𝐼

der β-D-Fructopyranose 1a(ii) aus, so würde sich ein 𝑝𝐾𝑠-Wert im Bereich von -7.0 bis 1.0 für den

Ringsauerstoff ergeben. Der 𝑝𝐾𝑠-Wert liegt damit in einem ähnlichen Bereich wie der von tert-Butanol.

Damit ist die spontane Ringöffnungstendenz von anionischen und kationischen Zuckerspezies zwar

nicht zwangsläufig identisch, jedoch in einem ähnlichen Größenbereich.

Für die untersuchten AMADORI-Verbindungen 6a und 6b sowie für D-Tagatose 1b sind keine

Literaturwerte bezüglich der Säurekonstanten der Zuckergrundkörper verfügbar. Für die

Berechnungen der thermodynamischen Aktivierungsparameter der Anomerisierung werden daher die

entsprechenden 𝑝𝐾𝑠-Werte von D-Fructose 1a zugrunde gelegt. Die Dissoziationskonstanten der

Carboxyl- und Aminofunktionen der Aminosäuren 4a und 4b sowie der AMADORI-Verbindungen 6a und

6b sind in den Tabellen 1 (Seite 44) und 2 (Seite 45) zusammengefasst.

Als weiteres Problem ergibt sich, dass Dissoziationskonstanten im Allgemeinen

temperaturabhängig sind.[345-347] Diese Temperaturabhängigkeit ist für die Dissoziationskonstanten der

Zuckergrundkörper unbekannt und wurde im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit daher

vernachlässigt. Den Ausführungen dieses Abschnittes ist zu entnehmen, dass die im Rahmen dieser

Arbeit berechneten thermodynamischen Aktivierungsparameter nicht zwangsläufig den tatsächlich

korrekten Werten entsprechen müssen. Im Gegensatz zu früheren Arbeiten (vgl. Kapitel 2.3) basieren

die hier berechneten Parameter zwar auf einem Modell, das molekular-mechanistisch fundiert ist,

jedoch sind die zur Berechnung notwendigen Säurekonstanten und deren Temperaturabhängigkeit nur

unzureichend bekannt. Die in den nachfolgenden Tabellen zusammengefassten thermodynamischen

Aktivierungsparameter sind daher mutmaßlich in einigen Fällen nicht plausibel. Dies ist jedoch mit Blick

auf das verfolgte Ziel der Berechnung von ACuSTiC-Werten irrelevant, da das mathematische Modell

die Raten der Anomerisierung im untersuchten pD- und Temperaturbereich im Rahmen der

angegebenen Fehlertoleranzen exakt beschreibt. Es ist folglich möglich, ACuSTiC-Werte für

Temperaturen im Bereich zwischen 27 und 87 °C in einem pD-Intervall von 1.5 bis 6.5 zu intrapolieren.

Die Tabellen 10 und 11 zeigen die berechneten thermodynamischen Aktivierungsparameter

zur temperatur- und pD-abhängigen Beschreibung der Ringöffnungsraten der untersuchten Anomere.


- 86 -

Tabelle 10: Thermodynamische Aktivierungsparameter der Ringöffnung der untersuchten Zuckeranomere. Teil 1: Aktivierungsenthalpie. Alle Werte sind in kJ/mol angegeben. Bei den angegebenen Fehlern handelt es sich um die Standardfehler der geschätzten Parameter.

αP z βP z αF z βF z

∆𝐻(𝑍+)‡

D-Fructose 120.0 ± 3.9 70.7 ± 0.4 66.6 ± 1.1 74.6 ± 1.2

D-Tagatose 106.7 ± 2.1 101.0 ± 5.9 101.0 ± 4.1 92.4 ± 2.5

D-Glucose * * 13.8 ± 1.0 33.6 ± 10.2

∆𝐻(𝑍±)

‡

D-Fructose 25.8 ± 3.7 44.0 ± 0.2 18.2 ± 0.7 16.8 ± 0.6

D-Tagatose 80.8 ± 1.1 73.2 ± 1.5 48.5 ± 2.3 78.8 ± 2.0

D-Glucose 47.3 ± 2.2 24.6 ± 5.0 * *

∆𝐻(𝑍−)‡

D-Fructose 45.5 ± 14.9 * 34.9 ± 1.5 37.7 ± 1.4

D-Tagatose 37.1 ± 2.5 -16.2 ± 9.4 -17.3 ± 5.0 30.3 ± 1.1

D-Glucose -226.1 ± 6.0~ 55.5 ± 5.6 24.1 ± 0.9 19.7 ± 5.0

∆𝐻(𝑍+𝑆+)‡

D-Fructose + L-Alanin * * * *

D-Fructose + L-Prolin * * * *

Fructosylalanin * * * *

Fructosylprolin * * * *

∆𝐻(𝑍+𝑆−+𝑍±𝑆+)

‡

D-Fructose + L-Alanin 53.4 ± 6.2 67.6 ± 1.1 56.7 ± 0.7 60.3 ± 0.4

D-Fructose + L-Prolin 54.4 ± 4.7 61.0 ± 0.8 48.4 ± 0.7 53.0 ± 0.5

Fructosylalanin 38.0 ± 3.3 40.3 ± 1.8 44.5 ± 1.6 54.5 ± 2.9

Fructosylprolin 74.4 ± 3.4 63.5 ± 1.1 57.5 ± 1.1 64.8 ± 1.2

∆𝐻(𝑍−𝑆++𝑍±𝑆−)

‡





∆𝐻(𝑍−𝑆−)‡




Fructosylprolin * * 71.3 ± 0.8 69.9 ± 0.7

* Die gemessenen Daten sind von den Aktivierungsparametern unabhängig. Dies liegt daran, dass die entsprechenden ionischen Spezies im untersuchten pD-Bereich so geringe relative Konzentrationen aufweisen, dass ihr Einfluss auf die beobachteten Ringöffnungsraten nicht messbar ist.

~ Der Parameter ist nicht korrekt. Er beschreibt die Daten jedoch in einem Temperaturbereich zwischen 57 und 87 °C. Zur Berechnung von Ringöffnungsraten für Temperaturen unterhalb von 57 °C darf er nicht genutzt werden.


- 87 -

Tabelle 11: Thermodynamische Aktivierungsparameter der Ringöffnung der untersuchten Zuckeranomere. Teil 2: Aktivierungsentropie. Alle Werte sind in J/(K·mol) angegeben. Bei den angegebenen Fehlern handelt es sich um die Standardfehler der geschätzten Parameter.

αP z βP z αF z βF z

∆𝑆(𝑍+)‡

D-Fructose 182.9 ± 12.2 20.3 ± 1.2 31.9 ± 3.4 51.7 ± 3.7

D-Tagatose 123.5 ± 5.9 106.6 ± 16.5 123.2 ± 11.6 93.2 ± 7.2

D-Glucose * * -114.8 ± 3.0 -60.3 ± 29.6

∆𝑆(𝑍±)

‡

D-Fructose 79.6 ± 11.2 127.6 ± 0.7 98.0 ± 2.1 71.6 ± 1.9

D-Tagatose 233.5 ± 3.1 216.2 ± 4.1 183.2 ± 6.7 243.7 ± 5.5

D-Glucose 160.9 ± 6.2 86.6 ± 14.5 * *

∆𝑆(𝑍−)‡

D-Fructose -11.2 ± 44.4 * 3.0 ± 4.7 -10.3 ± 4.2

D-Tagatose -39.0 ± 8.0 -208.6 ± 30.3 -165.0 ± 16.5 -33.3 ± 3.4

D-Glucose -774.0 ± 17.8~ 51.9 ± 16.0 -4.3 ± 2.5 -49.1 ± 14.8

∆𝑆(𝑍+𝑆+)‡

D-Fructose + L-Alanin * * * *

D-Fructose + L-Prolin * * * *

Fructosylalanin * * * *

Fructosylprolin * * * *

∆𝑆(𝑍+𝑆−+𝑍±𝑆+)

‡

D-Fructose + L-Alanin -6.8 ± 18.1 27.8 ± 3.1 13.3 ± 2.0 19.9 ± 1.3

D-Fructose + L-Prolin -7.8 ± 13.9 6.0 ± 2.2 -14.5 ± 2.2 -4.9 ± 1.5


Fructosylprolin 46.8 ± 10.1 9.9 ± 3.1 -0.5 ± 3.3 17.7 ± 3.6

∆𝑆(𝑍−𝑆++𝑍±𝑆−)

‡





∆𝑆(𝑍−𝑆−)‡



Fructosylalanin -38.7 ± 51.5 -132.2 ± 13.1 65.6 ± 3.4 23.3 ± 3.8

Fructosylprolin * * 132.4 ± 2.6 101.1 ± 2.4

* Die gemessenen Daten sind von den Aktivierungsparametern unabhängig. Dies liegt daran, dass die entsprechenden ionischen Spezies im untersuchten pD-Bereich so geringe relative Konzentrationen aufweisen, dass ihr Einfluss auf die beobachteten Ringöffnungsraten nicht messbar ist.

~ Der Parameter ist nicht korrekt. Er beschreibt die Daten jedoch in einem Temperaturbereich zwischen 57 und 87 °C. Zur Berechnung von Ringöffnungsraten für Temperaturen unterhalb von 57 °C darf er nicht genutzt werden.


- 88 -

Vor dem Vergleich der in Kapitel 4.1 diskutierten Reaktivitäten der Zielsubstanzen mit den

auf Grundlage der Gleichgewichtskonstanten und den Ringöffnungsraten berechneten

ACuSTiC-Werten werden zunächst einige bemerkenswerte Ergebnisse der Messung der

Ringöffnungsraten in Abhängigkeit der Temperatur und des pD-Wertes beschrieben.

In Kapitel 2.3 führten die theoretischen Überlegungen zum Mechanismus der

Anomerisierung zu der These, dass Carbonsäuren bei ausreichend tiefen Temperaturen eine

Hemmung der Ringöffnung bewirken sollten. Derartige Beobachtungen wurden jedoch bisher nicht in

der Literatur beschrieben. Dies liegt offenbar daran, dass in der Vergangenheit der Großteil der

Messungen der Mutarotation polarimetrisch erfolgte. Damit wurde lediglich die Ringöffnung bzw.

Mutarotation pyranoider Anomere verfolgt. Betrachtet man etwa die pD-Abhängigkeit der

Ringöffnungsraten der β-D-Fructopyranose 1a(ii) bei einer Temperatur von 37 °C in An- und

Abwesenheit stöchiometrischer Mengen von L-Alanin 4a, so ist deutlich zu erkennen, dass die

Aminosäure eine Erhöhung der Ringöffnungsraten bewirken (vgl. Abbildung 28 a)). Betrachtet man

jedoch die Ringöffnungsraten der β-D-Fructofuranose 1a(iv) in An- und Abwesenheit stöchiometrischer

Mengen von L-Alanin 4a unter denselben Bedingungen, so wird deutlich, dass die Aminosäure die

Ringöffnung wie vermutet hemmt (vgl. Abbildung 28 b)).

Abbildung 28: Vergleich der pD-abhängigen Ringöffnungsraten von Anomeren der D-Fructose 1a in An- und Abwesenheit stöchiometrischer Mengen von L-Alanin 4a für eine Temperatur von 37 °C. a) Vergleichende Darstellung für β-D-Fructopyranose 1a(ii). b) Vergleichende Darstellung für β-D-Fructofuranose 1a(iv).

Der Vergleich der vorangestellten Abbildungen zeigt, dass die Ringöffnungsraten der

β-D-Fructofuranose 1a(iv) rund zehnfach schneller sind als die der β-D-Fructopyranose 1a(ii). Die

Ringöffnungsraten der β-D-Glucopyranose sind daneben vergleichbar mit denen der

β-D-Fructopyranose 1a(ii). Die furanoiden Anomere der D-Glucose 2a hingegen zeigen unerwartet viel

höhere Ringöffnungsraten als die furanoiden Anomere der untersuchten Ketohexosen 1a und 1b (vgl.

Abbildung 29). Dies ist eine folgenreiche Beobachtung, da die furanoiden Anomere der Aldohexosen

als extreme Minorkomponenten bislang kaum beachtet wurden. Aufgrund ihrer außerordentlich

hohen Anomerisierungsraten ist jedoch mit Verweis auf Kapitel 4.2.4 trotz ihrer geringen Molenbrüche

davon auszugehen, dass die Reaktivität der D-Glucose 2a zu einem hohen Prozentsatz von ihren

furanoiden Anomeren ausgeht.

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

Rin

göff

nu

ngs

rate

@ 3

7 °

C [

Hz]

pD-Wert

D-Fructose

D-Fructose + L-Alanina)

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

pD-Wert

D-Fructose

D-Fructose + L-Alaninb)D-Fructose


D-Fructose



- 89 -

Abbildung 29: Vergleich der pD-abhängigen Ringöffnungsraten der α-furanoiden Anomere der D-Glucose 2a, D-Fructose 1a und D-Tagatose 1b für eine Temperatur von 37 °C. Die logarithmische Skalierung der Ordinatenachse ist zu beachten.

Der pD-abhängige Verlauf der Ringöffnungsraten der AMADORI-Verbindungen 6a und 6b im

Vergleich zur D-Fructose 1a zeigt, dass die Rate der Ringöffnung und damit auch die Mutarotationsrate

der AMADORI-Verbindungen nicht – wie bei Zuckern sonst üblich – mit steigender

Protonenkonzentration wieder zunimmt, sondern vielmehr einem Minimum entgegenstrebt (vgl.

Abbildung 30). Es gibt dabei jedoch keinen Grund zu glauben, dass die Ringöffnungsrate bei noch

geringeren pD-Werten nicht wieder steigen wird und damit Gleichung (38) ihre Gültigkeit behält. Es ist

daher davon auszugehen, dass der im Sauren aufsteigende Ast der Funktion in Richtung höherer

Protonenkonzentrationen verschoben ist. Unter der Annahme, dass die spontane Ringöffnung von

Spezies mit kationischem Zuckergrundkörper für Ketosen und AMADORI-Verbindungen etwa gleich

wahrscheinlich ist, beruht die Verschiebung des Funktionsastes auf einer Absenkung des 𝑝𝐾𝑠-Wertes

der Ringsauerstoffatome der Anomere der AMADORI-Verbindungen. Da ein derartiger Effekt nicht durch

die reine Anwesenheit einer Aminosäure erklärt werden kann, muss sich dieser unmittelbar aus der

kovalenten Bindung zum Aminostickstoff ergeben. Im sauren Milieu liegt dieser Aminostickstoff zu

beinahe 100% protoniert vor. Dementsprechend ist in unmittelbarer Umgebung des

Ringsauerstoffatoms eine positive Ladung lokalisiert, die die Protonierung des Ringsauerstoffatoms

durch repulsive COULOMB-Kräfte unterbindet.47 Dies kommt einer Erhöhung der Säurestärke des

protonierten Ringsauerstoffatoms und damit einer Verringerung des entsprechenden 𝑝𝐾𝑠-Wertes

gleich. AMADORI-Verbindungen anomerisieren demnach im lebensmittelrelevanten pH-Bereich fast

ausschließlich über anionische Spezies des Zuckergrundkörpers. Somit lässt sich der Prozess durch

Protonendonoren (d.h. etwa undissoziierte Carbonsäuren bzw. protonierte Amine) katalysieren.

47 Diese COULOMB-Abstoßung muss in Abhängigkeit der räumlichen Nähe auch für die Protonierung der übrigen

Hydroxylfunktionen wirksam sein. Eine effektive Protonierung ist demnach vor allem am OH-C-3 möglich, da das

positiv geladene Stickstoffatom über die beschriebene kooperative Wasserstoffbrückenbindung für eine

Teilprotonierung der Hydroxylfunktion sorgt (vgl. Schema 23, Seite 62). Eine α-ständige Carboxylfunktion hat

aufgrund ihres geringen 𝑝𝐾𝑠-Wertes zwar keine hohe katalytische Relevanz, sorgt jedoch über die Teilnahme am

kooperativen Bindungssystem für eine erhöhte Reaktivität.

0.001

0.01

0.1

1

3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5

Rin

göff

nu

ngs

rate

@ 3

7 °

C [

Hz]

pD-Wert

D-FructoseD-TagatoseD-Glucose

D-Fructose D-Tagatose D-Glucose


- 90 -

Obwohl die Anomerisierungsraten der AMADORI-Verbindungen 6a und 6b im sauren Milieu

mehr und mehr abnehmen, steigt die Bildungsrate heterocyclischer Folgeprodukte, was in

Abbildung 15 (Seite 55) zu erkennen ist. Dies ist ein Beweis dafür, dass Reaktionen im Sinne von

Schema 17 (Seite 21) direkt aus cyclischen Anomeren von Zuckerderivaten ausgehen und damit von

der Anomerisierung entkoppelt sein können.

Abbildung 30: Vergleich der pD-abhängigen Ringöffnungsraten der β-furanoiden Anomere der D-Fructose 1a sowie des Fructosylalanins 6a und -prolins 6b für eine Temperatur von 37 °C.

Werden die Abbauraten der Zielsubstanzen zugrunde gelegt (nur für pH 6.5 möglich),

erhöhen L-Alanin 4a und L-Prolin 4b die Reaktivität der D-Fructose 1a in äquimolaren Mischungen bei

einer Temperatur von 90 °C um rund 20-50%. Die Substitution der Hydroxylfunktion am C-1 der

D-Fructose durch die entsprechenden Aminosäuren führt dagegen unter gleichen Bedingungen zu

einer sieben- bis achtfach erhöhten Reaktivität (vgl. Kapitel 4.1.1). Legt man die Bildungsrate von

3-Desoxyglucoson 9b zugrunde, so liegen die Werte leicht darüber. Bei pH 4.5 ergibt sich für die

Mischung mit L-Alanin 4a bzw. L-Prolin 4b ein Faktor von rund 2.2 und für die jeweiligen

AMADORI-Verbindungen 6a und 6b von rund 12 bis 24 (vgl. Kapitel 4.1.2). Der Wert für die Rate der

frühen MAILLARD-Reaktion, gemessen als zeitabhängige Änderung der Extinktion bei 284 nm, liegt beim

selben pH-Wert für Reaktionslösungen mit L-Alanin 4a bzw. L-Prolin 4b bei etwa 10, für die

AMADORI-Verbindungen 6a und 6b bei 28 bis 40 (vgl. Kapitel 4.1.3). Je nach zugrunde gelegtem

Parameter erhöhen L-Alanin 4a und L-Prolin 4b die Reaktivität der D-Fructose 1a bei 90 °C demnach um

einen Faktor von 1 bis 10. Fructosylalanin 6a und -prolin 6b sind rund sieben- bis 40-fach reaktiver als

D-Fructose 1a.

Es soll nun geprüft werden, ob die Gesamtanomerisierungsrate, ausgedrückt als

ACuSTiC-Wert, in ähnlicher Weise durch die (kovalent gebundenen) Aminosäuren beeinflusst wird. Die

ACuSTiC-Kurven von D-Fructose 1a in An- und Abwesenheit stöchiometrischer Mengen an L-Alanin 4a

und L-Prolin 4b sowie die der entsprechenden AMADORI-Verbindungen 6a und 6b sind dafür zunächst

für eine Temperatur von 90 °C in Abbildung 31 dargestellt.

Es ist zu erkennen, dass die nicht kovalent gebundenen Aminosäuren 4a und 4b die

Gesamtanomerisierung der D-Fructose 1a je nach pD-Wert unterschiedlich stark beeinflussen. Dabei

ist die Gesamtrate im Bereich der größten Stabilität der D-Fructose 1a (3.5 < pD < 5.5) um den Faktor

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5

Rin

göff

nu

ngs

rate

@ 3

7 °

C [

Hz]

pD-Wert

D-Fructose

Fructosylalanin

Fructosylprolin

D-Fructose

Fructosylalanin

Fructosylprolin


- 91 -

1.1 bis 3.9 erhöht. Für die entsprechenden AMADORI-Verbindungen 6a und 6b beträgt der Faktor im

selben pD-Bereich rund 4 bis 18. Damit können ACuSTiC-Werte wie erwartet der

Reaktivitätsabschätzung von Zuckern sowie deren Derivaten dienen.

Abbildung 31: ACuSTiC-Werte von D-Fructose 1a in An- und Abwesenheit stöchiometrischer Mengen an L-Alanin 4a und L-Prolin 4b sowie die der entsprechenden AMADORI-Verbindungen 6a und 6b in Abhängigkeit des pD-Wertes für eine Temperatur von 90 °C.

Dieser Abschätzung sind jedoch Grenzen gesetzt. Diese scheinen immer dann erreicht zu

sein, wenn zusätzliche Effekte auftreten, die nur für bestimmte der verglichenen Systeme spezifisch

sind. Darunter fällt beispielsweise der Einfluss des Aminostickstoffatoms von AMADORI-Verbindungen

auf die 𝑝𝐾𝑠-Werte ihrer Ringsauerstoffatome. Da ein solcher Einfluss bei D-Fructose 1a fehlt, kann eine

Abschätzung der relativen Reaktivitäten der Systeme nur auf Grundlage des „basischen Astes“ der

ACuSTiC-Funktion erfolgen. Es ist darüber hinaus nicht möglich, das korrekte Verhältnis der

Abbauraten von AMADORI-Verbindungen mit α- und nicht α-ständiger Aminofunktion zu ermitteln. Dies

liegt daran, dass die in Kapitel 4.2.1 beschriebene Bildung von Wasserstoffbrücken bei

AMADORI-Verbindungen mit α-Aminofunktion einen großen Einfluss auf die C-H-Acidität des H-C-3 und

damit auf die Bildungsrate von 1-Desoxyglusoson 9a hat. Ein Vergleich von ACuSTiC-Werten

verschiedener AMADORI-Verbindungen würde damit lediglich ihr relatives Potenzial der Bildung von

3-Desoxyglucoson 9b widerspiegeln (vgl. dazu auch Abbildung 22 (Seite 71) und Abbildung 25

(Seite 74)).

Die Extrapolation der ACuSTiC-Werte von D-Fructose 1a und D-Tagatose 1b für eine

Temperatur von 100 °C legt nahe, dass diese unter Kochbedingungen eine sehr ähnliche Reaktivität

zeigen sollten (vgl. Abbildung 32). Dies deckt sich trotz der Verwendung eines abweichenden

Reaktionsmediums mit den Beobachtungen von VAN PUTTEN et al. (2016), die die Bildung von

Furanderivaten aus Ketohexosen in mit Schwefelsäure versetztem Methanol bei 100 °C untersucht

haben.[180] Für eine Temperatur von 120 °C beobachteten VAN PUTTEN et al. (2017) dagegen eine im

Vergleich zur D-Fructose 1a erhöhte Reaktivität der D-Tagatose 1b.[183] Auch dieses Reaktionsverhalten

deckt sich mit Extrapolationen entsprechender ACuSTiC-Werte (hier nicht gezeigt).

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5

AC

uST

iC[s

]

pD-Wert

D-Fructose



Fructosylalanin

Fructosylprolin

D-Fructose



Fructosylalanin

Fructosylprolin


- 92 -

Abbildung 32: ACuSTiC-Werte von D-Fructose 1a, D-Tagatose 1b und D-Glucose 2a in Abhängigkeit des pD-Wertes für eine Temperatur von 100 °C. a) Lineare Skalierung der Ordinatenachse, mit gesonderter Ordinate für D-Glucose 2a. b) Logarithmische Skalierung der Ordinatenachse.

Abbildung 32 gibt weiterhin Auskunft über das Reaktivitätsverhältnis der untersuchten

Ketosen 1a und 1b zur D-Glucose 2a. Dabei ist zunächst auffällig, dass die Stabilitätsmaxima der

Ketosen 1a und 1b im identischen pD-Bereich liegen. Demgegenüber ist das Stabilitätsmaximum der

D-Glucose 2a um rund eine pD-Einheit in den sauren Bereich verschoben. Außerdem ist die

Gesamtanomerisierung der Ketosen 1a und 1b am Maximum der ACuSTiC-Funktion rund zehnmal so

schnell wie die der D-Glucose 2a. Mit steigendem pD-Wert gleicht sich die Rate der D-Glucose 2a denen

der Ketosen 1a und 1b an, sodass sich die Reaktivitäten bei einem pD-Wert von 5.5 nur noch um einen

Faktor von etwa 3 unterscheiden. Um zu prüfen, ob diese Werte das tatsächliche Reaktivitätsverhältnis

der Zucker widerspiegeln, wurden die Zucker bei 90 °C bei konstantem pH-Wert (pH 2, pH 5 und pH 7)

zur Reaktion gebracht und die Raten des Fortschrittes der frühen MAILLARD-Reaktion als zeitabhängige

Zunahme der Extinktion bei einer Wellenlänge von 284 nm berechnet (vgl. Abbildung 33). Dabei ist

zunächst auffällig, dass das Reaktivitätsminimum der D-Fructose 1a nicht, wie die ACuSTiC-Funktion

zeigt, bei pD 4.5, sondern bei pH 4.0 liegt. Da der pH- und der pD-Wert jedoch nicht vollkommen

äquivalent zu gebrauchen sind, ist für einen direkten Vergleich der Kurven zunächst die Umrechnung

des pD-Wertes in den pH-Wert nötig. Dies ist auf Grundlage von Gleichung (50) möglich.[348]

𝑝𝐻

𝑝𝐷=𝑝𝐾𝑊

𝐻

𝑝𝐾𝑊𝐷 ⇔ 𝑝𝐻 = 𝑝𝐷 ∙

𝑝𝐾𝑊𝐻

𝑝𝐾𝑊𝐷 (50)

Dabei gilt für 90 °C ein 𝑝𝐾𝑊𝐻 von 12.170 und ein 𝑝𝐾𝑊

𝐷 von 13.276.[349,350] Der

Proportionalitätsfaktor für die Umrechnung des pD-Wertes in den pH-Wert liegt demnach für 90 °C bei

0.9167. Damit entspricht ein pD-Wert von 4.5 (Minimum der ACuSTiC-Funktion von D-Fructose 1a bei

90 °C) einem pH-Wert von 4.1 (in etwa das Minimum der Geschwindigkeit der frühen

MAILLARD-Reaktion der D-Fructose 1a).

0

10

20

30

40

50

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

2.5 3.5 4.5 5.5 6.5

AC

uST

iC(D

-Glu

cose

) [s

]

AC

uST

iC(K

eto

sen

) [s

]

pD-Wert

a)

0.05

0.5

5

50

2.5 3.5 4.5 5.5 6.5

AC

uST

iC[s

]

pD-Wert

D-Fructose

D-Tagatose

D-Glucose

b)

D-Fructose

D-Tagatose

D-Glucose


- 93 -

Abbildung 33: Vergleich der Geschwindigkeiten der frühen MAILLARD-Reaktion, gemessen als Rate der Extinktionszunahme bei einer Wellenlänge von 284 nm, von D-Fructose 1a und D-Glucose 2a in Abhängigkeit des pD-Wertes für eine Temperatur von (90 ± 2) °C sowie Reaktivitätsverhältnisse der Zucker, berechnet auf Grundlage ihrer ACuSTiC-Werte.

Abbildung 33 ist zu entnehmen, dass das Verhältnis der ACuSTiC-Werte von D-Fructose 1a

und D-Glucose 2a für den „basischen Ast“ der Funktion in guter Übereinstimmung mit dem Verhältnis

der jeweiligen Geschwindigkeiten der frühen MAILLARD-Reaktion ist. Für den „sauren Ast“ sind

hingegen größere Abweichungen erkennbar. Da die „basischen Äste“ der im einzelnen gezeigten

Funktionen im lebensmittelrelevanten pH-Bereich liegen, kann das Fazit gezogen werden, dass die

Berechnung von ACuSTiC-Werten zur Abschätzung der Reaktivitäten von Zuckern genutzt werden

kann. Problematisch dabei ist jedoch, dass dies mit erheblichem Aufwand verbunden ist. Neben der

erforderlichen apparativen Ausstattung (NMR-Spektrometer) ist in vielen Fällen auch die Nutzung

isotopenmarkierter Zucker notwendig. Hinzu kommt, dass die Messungen in deuterierten

Lösungsmitteln erfolgen und damit unter dem Einfluss von Deuteronen anstelle von Protonen stehen.

ACuSTiC-Messungen sind demnach nicht weniger aufwändig als die Abschätzung von Reaktivitäten

etwa über Modellreaktionen. Ihr einziger Vorteil liegt in der nötigen Probenmenge, die lediglich in der

Größenordnung von einigen 10 mg liegt. Es wäre dennoch von Vorteil, eine apparativ weniger

aufwändige und schnellere Methode zur Abschätzung von Reaktivitäten nutzen zu können. Bezüglich

der Abschätzung der Reaktivität der D-Fructose 1a in Anwesenheit unterschiedlicher (Amino-) Säuren

wird im Folgenden eine solche Methode beschrieben. Es steht dabei weiterhin die Reaktivität von

D-Fructose 1a im lebensmittelrelevanten pH-Bereich bei 90 °C (annähernd Kochbedingungen) im

Vordergrund. Betrachtet man etwa das Verhältnis der ACuSTiC-Werte von D-Fructose 1a in An- und

Abwesenheit von L-Prolin 4b bei 90 °C und pD 4.0, so liegt dieses bei rund 1.3. Das Verhältnis der bei

Raumtemperatur und pD 4.0 gemessenen Ringöffnungsraten des β-pyranoiden Anomers 1a(ii) liegt im

Vergleich dazu ebenfalls bei 1.3. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass der relative Vergleich

von ACuSTiC-Werten unter Kochbedingungen durch den relativen Vergleich der Ringöffnungsraten des

Hauptanomers bei Raumtemperatur approximiert werden kann. Damit ist die Ringöffnungsrate der

β-D-Fructopyranose 1a(ii) bei Raumtemperatur ein Parameter, der zur Abschätzung der Reaktivität von

D-Fructose 1a unter Kochbedingungen herangezogen werden kann. Da D-Fructose 1a – wie bereits in

Kapitel 2.1.1.1 beschrieben – in Form des entsprechenden Anomers kristallisiert, ergibt sich prinzipiell

die Möglichkeit, entsprechende Ringöffnungsraten über die kinetische Verfolgung der Mutarotation

1

10

0.0000

0.0004

0.0008

0.0012

0.0016

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0

Re

akti

vitä

tsve

rhäl

tnis

(D-F

ruct

ose

/D-G

luco

se)

Ge

sch

win

dig

keit

de

r fr

üh

en

M

AIL

LAR

D-R

eak

tio

n [

Hz]

pH-WertD-Fructose D-Glucose

Reaktivitätsverhältnis (E284) Reaktivitätsverhältnis (ACuSTiC)

D-Fructose

Reaktivitätsverhältnis (ACuSTiC)

D-Glucose

Reaktivitätsverhältnis (E284nm)


- 94 -

zu messen. Problematisch dabei ist jedoch, dass D-Fructose 1a in wässriger Lösung aufgrund ihres

komplexen Anomerensystems auch komplexe Mutarotation zeigt.[40] Damit sind polarimetrische

Messungen zur Berechnung von Mutarotationsraten der D-Fructose 1a, wie zuletzt von COCKMAN et al.

(1987) beschrieben, streng genommen unzulässig.[35] Auf Grundlage der hier vorliegenden Arbeit sind

erstmals alle Anomerisierungsraten der Anomere der D-Fructose 1a bekannt. Damit ist die Berechnung

der zeitabhängigen Änderungen der relativen Konzentrationen aller Anomere nach dem Lösen der

D-Fructose 1a auf Grundlage von Gleichung (7) möglich. Abbildung 34 zeigt den entsprechend

berechneten Verlauf der Äquilibrierung des Anomerensystems für einen pD-Wert von 4.0 bei einer

Temperatur von 22 °C.48

Abbildung 34: Zeitabhängiger Verlauf der Äquilibrierung der Isomere der D-Fructose 1a nach dem Lösen der β-D-Fructopyranose 1a(ii) bei einer Temperatur von 22 °C und einem pD-Wert von 4.0, berechnet auf Grundlage der thermodynamischen (Aktivierungs-) Parameter der D-Fructose 1a unter Nutzung von Gleichung (7).

48 Die Berechnung der Eigenwerte und Eigenvektoren der in Gleichung (7) enthaltenen Matrix erfolgte mit Hilfe

der Matrixerweiterung „matrix.xla“ des Microsoft Excel Add-Ins XNUMBERS Ver 6.0.5.6M. Die Berechnung der

Eigenwerte erfolgte mit Hilfe der Funktion „MatEigenvalue_pow(Matrix; Iterationsschritte)“, die der

Eigenvektoren mittels „MatEigenvector_pow(Matrix; Iterationsschritte)“. Die numerische Berechnung der

speziellen Lösung von Gleichung (7) für die Anfangsbedingung 100% β-D-Fructopyranose 1a(ii) ausgehend von

der parametrisierten allgemeinen Lösung erfolgte mit Hilfe des Solver Add-Ins von Microsoft Excel.

0

20

40

60

80

100

0 500 1000 1500

rela

tive

Ko

nze

ntr

atio

n [

%]

Zeit t [sec]

[Carbonyl]

[aPy]

[bPy]

[aFu]

[bFu]

a)

0

5

10

15

20

0 500 1000 1500

rela

tive

Ko

nze

ntr

atio

n [

%]

Zeit t [sec]

[Carbonyl]

[aPy]

[aFu]

[bFu]

b)

[αP]

[αF]

[βF]0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0 50 100 150 200

[αP]

[βP]

[αF]

[βF]


- 95 -

Eine genauere Analyse der Zeitabhängigkeiten der einzelnen Konzentrationen der

β-D-Fructopyranose 1a(ii) sowie der α- und β-D-Fructofuranose 1a(iii) und 1a(iv) zeigt, dass sich deren

Verlauf mit Kinetikmodellen erster Ordnung anpassen lässt. Hinzu kommt, dass das Verhältnis von

α- zu β-D-Fructofuranose nahezu zeitlich unabhängig konstant ist. Damit ist die Auswertung

polarimetrischer Daten lediglich durch das acyclische Zentralisomer 1a(v) sowie das α-pyranoide

Anomer der D-Fructose 1a(i) verfälscht. Dies zeigt sich insbesondere anhand des zeitlichen

Konzentrationsverlaufes des acyclischen Zentralisomers 1a(v), dessen Konzentration zunächst

sprunghaft ansteigt, um anschließend einer Kinetik erster Ordnung zu folgen. Dies hat zur Folge, dass

eine Extrapolation der relativen Konzentration des acyclischen Zentralisomers zum Zeitpunkt des

Lösens unter Annahme einer einfachen Kinetik erster Ordnung zu dem fälschlichen Schluss führt (vgl.

etwa MAIER et al. (1977)[351]), dass dieses zu einem geringen Prozentsatz bereits im kristallinen Zustand

vorgelegen haben muss.

Das acyclische Zentralisomer 1a(v) sowie das α-pyranoide Anomer der D-Fructose 1a(i)

machen lediglich drei Prozent der in Lösung befindlichen D-Fructose 1a aus. Es ist daher anzunehmen,

dass der Fehler, der bei der Auswertung entsprechender polarimetrischer Daten nach einem

Kinetikmodell erster Ordnung eingegangen wird, in etwa in derselben Größenordnung liegt. Um zu

prüfen, ob eine Auswertung polarimetrischer Daten also tatsächlich zulässig ist, wurde im ersten

Schritt die spezifische Drehung der β-D-Fructopyranose 1a(ii) bestimmt. Bei einer Wellenlänge von

589 nm und einer Temperatur von (22.7 ± 1.0) °C beträgt die spezifische Rotation der

β-D-Fructopyranose 1a(ii) 𝛼𝐷22(𝛽𝑃) = (−130.77 ± 0.52)

°∙𝑚𝐿

𝑑𝑚∙𝑔, was in guter Übereinstimmung mit

Literaturwerten ist.[40,67] Die Multiplikation dieses Wertes mit der relativen Konzentration der

β-D-Fructopyranose 1a(ii) zum Zeitpunkt 𝑡 liefert den Anteil der optischen Rotation des β-pyranoiden

Anomers 1a(ii) an der Gesamtrotation der D-Fructose 1a. Die Differenz der Gesamtrotation und des

Anteils des β-pyranoiden Anomers 1a(ii) ergibt folglich das konzentrationsgewichtete Mittel der

optischen Rotationen aller übrigen Isomere. Um eine entsprechende Differenz bilden zu können,

wurde im zweiten Schritt die Mutarotationskurve der D-Fructose 1a bei (22 ± 1) °C und pH 3.7

(entspricht pD 4.0 bei 22 °C) gemessen. Im dritten Schritt muss ein passendes Kinetikmodell erstellt

werden. Hierbei wird davon ausgegangen, dass das β-pyranoide Anomer 1a(ii) im Sinne von Schema 28

mit einem virtuellen Anomer (vA), bei dem es sich um das konzentrationsgewichtete Mittel der übrigen

Isomere handelt, im dynamischen Gleichgewicht erster Ordnung steht.

Schema 28: Vereinfachtes Modell der Mutarotation der D-Fructose 1a zur Beschreibung polarimetrischer Daten.

Die zugehörigen integrierten Zeitgesetze sind durch die Gleichungen (51) und (52) gegeben.

[𝛽𝑃]𝑡 = 100% ∙(𝑘𝑣𝐴,𝛽𝑃 + 𝑘𝛽𝑃,𝑣𝐴 ∙ 𝑒𝑥𝑝(−(𝑘𝛽𝑃,𝑣𝐴 + 𝑘𝑣𝐴,𝛽𝑃) ∙ 𝑡))

𝑘𝛽𝑃,𝑣𝐴 + 𝑘𝑣𝐴,𝛽𝑃 (51)

[𝑣𝐴]𝑡 =100% ∙ 𝑘𝛽𝑃,𝑣𝐴

𝑘𝛽𝑃,𝑣𝐴 + 𝑘𝑣𝐴,𝛽𝑃∙ (1 − 𝑒𝑥𝑝(−(𝑘𝛽𝑃,𝑣𝐴 + 𝑘𝑣𝐴,𝛽𝑃) ∙ 𝑡)) (52)

Damit ergibt sich für die Zeitabhängigkeit der optischen Rotation Gleichung (53).


- 96 -

𝛼𝑡 = 𝑙 ∙ 𝑐 ∙ (𝛼𝐷22(𝛽𝑃) ∙ [𝛽𝑃]𝑡 + 𝛼𝐷

22(𝑣𝐴) ∙ [𝑣𝐴]𝑡) =100%∙𝑙∙𝑐

𝑘𝛽𝑃,𝑣𝐴+𝑘𝑣𝐴,𝛽𝑃∙ (𝑘𝑣𝐴,𝛽𝑃 ∙ 𝛼𝐷

22(𝛽𝑃) +

𝑘𝛽𝑃,𝑣𝐴 ∙ (𝛼𝐷22(𝑣𝐴) + (𝛼𝐷

22(𝛽𝑃) − 𝛼𝐷22(𝑣𝐴)) ∙ 𝑒𝑥𝑝(−(𝑘𝛽𝑃,𝑣𝐴 + 𝑘𝑣𝐴,𝛽𝑃) ∙ 𝑡)))

(53)

Dabei ist 𝑙 die Länge der Küvette in dm und 𝑐 die Konzentration der D-Fructose 1a in g/mL.

Ob eine Auswertung polarimetrischer Daten nun auf Grundlage von Schema 28 bzw. Gleichung (53)

legitim ist, kann abgeschätzt werden, indem geprüft wird, ob 𝛼𝐷22(𝑣𝐴), ausgedrückt in Form von

Gleichung (54), zeitunabhängig und damit konstant ist.

𝛼𝐷22(𝑣𝐴) =

𝛼𝑡𝑙 ∙ 𝑐

− 𝛼𝐷22(𝛽𝑃) ∙ [𝛽𝑃]𝑡

[𝑣𝐴]𝑡 (54)

Die entsprechende Berechnung von 𝛼𝐷22(𝑣𝐴) im Sinne von Gleichung (54) ergibt einen Wert

von 𝛼𝐷22(𝑣𝐴) = (−0.51 ± 1.44)

°∙𝑚𝐿

𝑑𝑚∙𝑔. Obwohl die Berechnung dieses Wertes teilweise auf Grundlage

von NMR-spektroskopischen Messungen erfolgte, stimmt der Wert mit dem anhand der

Gleichgewichtsrotation ermittelten in Höhe von 𝛼𝐷22(𝑣𝐴) = (−0.04 ± 0.01)

°∙𝑚𝐿

𝑑𝑚∙𝑔 im Rahmen der

Fehlerintervalle überein. Die konzentrationsgewichtete spezifische Rotation des virtuellen Anomers

der D-Fructose 1a ist damit bei 22 °C etwa gleich null. Gleichung (53) lässt sich entsprechend zu

Gleichung (55) vereinfachen, die lediglich abhängig von der relativen Konzentration der

β-D-Fructopyranose 1a(ii) ist.

𝛼𝑡 =100% ∙ 𝑙 ∙ 𝑐 ∙ 𝛼𝐷

22(𝛽𝑃)

𝑘𝛽𝑃,𝑣𝐴 + 𝑘𝑣𝐴,𝛽𝑃∙ (𝑘𝑣𝐴,𝛽𝑃 + 𝑘𝛽𝑃,𝑣𝐴 ∙ 𝑒𝑥𝑝(−(𝑘𝛽𝑃,𝑣𝐴 + 𝑘𝑣𝐴,𝛽𝑃) ∙ 𝑡)) (55)

Die Berechnung der Ringöffnungsraten 𝑘𝛽𝑃,𝑣𝐴 der β-D-Fructopyranose 1a(ii) ist demnach bei

Raumtemperatur uneingeschränkt durch die nicht lineare Regression polarimetrischer Daten mittels

Gleichung (55) möglich. Die milieuabhängige relative Reaktivität der D-Fructose 1a unter

Kochbedingungen kann folglich anhand einfacher polarimetrischer Messungen innerhalb kürzester

Zeit abgeschätzt werden. Im folgenden Abschnitt wird die Methode der Polarimetrie dazu genutzt, die

pH-abhängige Reaktivität der D-Fructose 1a unter Zusatz verschiedener Katalysatoren abzuschätzen

und gleichermaßen eine Charakterisierung der Katalysatoren vorzunehmen. Dabei wird der Einfluss

verschiedener funktioneller Gruppen auf die Mutarotation der D-Fructose 1a diskutiert und die in

Kapitel 2.3 hergeleitete Theorie der Anomerisierung in der Praxis überprüft.

Es wurde jeweils eine 0.5 M wässrige Lösung des zu untersuchenden Katalysators mit einem

pH-Wert im Bereich von 1.5 bis 6.5 (sechs Stufen) vorbereitet. Diese Lösung wurde anschließend dazu

genutzt, eine stöchiometrische Menge an D-Fructose 1a zu lösen. Die zeitliche Änderung des

Drehwinkels der jeweiligen Lösungen wurde über einen Zeitraum von je etwa einer Stunde

polarimetrisch verfolgt. Zunächst wurden auf diese Weise die Ringöffnungsraten der

β-D-Fructopyranose 1a(ii) in An- und Abwesenheit stöchiometrischer Mengen von L-Alanin 4a und

L-Prolin 4b ermittelt. Ein Vergleich dieser Werte mit den auf Grundlage der SST-NMR-Experimente

berechneten Ringöffnungsraten zeigt eine gute Übereinstimmung (hier nicht gezeigt) und damit eine

ebenso gute Vergleichbarkeit der Methoden. Im nächsten Schritt wurden die entsprechenden

Ringöffnungsraten zusätzlich in Anwesenheit stöchiometrischer Mengen von Glycin 4c, β-Alanin 4d

und γ-Aminobuttersäure 4e ermittelt. Um eine Berechnung der spontanen Ringöffnungsraten der

verschiedenen ionischen Spezies der β-D-Fructopyranose 1a(ii) auf Grundlage von Gleichung (38)


- 97 -

(Seite 39) zu ermöglichen, wurden die in Tabelle 1 (Seite 44) aufgeführten Säurekonstanten genutzt.

Eine genauere Analyse der Ringöffnungsraten der verschiedenen ionischen Spezies zeigt, dass diese

mit den 𝑝𝐾𝑠-Werten der jeweiligen Carboxylfunktionen im Sinne eines BRØNSTED-Plots korrelieren.[289]

Eine Korrelation mit den Dissoziationskonstanten der Aminofunktionen ist hingegen nicht gegeben.

Um diese aufgrund der Diskussion in Kapitel 2.3 erwartete Beobachtung zu verifizieren, wurden die

Ringöffnungsraten der β-D-Fructopyranose 1a(ii) anschließend in Anwesenheit von Ameisensäure,

Essigsäure, Pivalinsäure und Taurin gemessen. Diese wurden aufgrund der breiten Streuung der

𝑝𝐾𝑠-Werte ihrer Säurefunktionen ausgewählt. Die 𝑝𝐾𝑠-Werte der entsprechenden Säuren wurden

dafür zuvor mittels potentiometrischer Titration experimentell ermittelt und sind in Tabelle 12

zusammengefasst.

Tabelle 12: 𝑝𝐾𝑠-Werte der untersuchten Säuren.

Analyt 𝒑𝑲𝒔𝟏 (Säurefunktion) 𝒑𝑲𝒔𝟐 (Aminofunktion)

Taurin 1.77 9.09 Ameisensäure (eingesetzt als Natrium-Formiat) 3.63 - Essigsäure (eingesetzt als Natrium-Acetat) 4.70 - Pivalinsäure 5.01 -

Da sich keine 0.5 M Lösungen der Pivalinsäure herstellen ließen, werden ihre katalytischen

Konstanten nicht weiter berücksichtigt, obwohl sie sich qualitativ ebenfalls gut in die bestehende

Korrelation einfügen. Abbildung 35 zeigt die auf Grundlage von Gleichung (38) berechneten spontanen

Ringöffnungsraten der ionischen Spezies der β-D-Fructopyranose 1a(ii) in Abhängigkeit des

𝑝𝐾𝑠-Wertes des Katalysators für 22 °C.

Abbildung 35: Linearer Zusammenhang der logarithmierten spontanen Ringöffnungsraten der β-D-Fructopyranose 1a(ii) in Anwesenheit verschiedener Katalysatoren (L-Alanin 4a, L-Prolin 4b, Glycin 4c, β-Alanin 4d, γ-Aminobuttersäure 4e, Na-Formiat, Na-Acetat, Taurin) in Abhängigkeit von deren Säurekonstanten.

Es ist deutlich zu erkennen, dass sich trotz der funktionell verschieden substituierten

Katalysatoren (nur Carboxylfunktion, Carboxyl- und Aminofunktion, Sulfonsäure- und Aminofunktion)

BRØNSTED-Plots mit hohem Bestimmtheitsmaß entsprechend des durch Gleichung (56) gegebenen

Ausdrucks ergeben.

𝑙𝑔(𝑘) = 𝛼 ∙ 𝑝𝐾𝑠 + 𝐶 (56)

1.0E+00

1.0E+01

1.0E+02

1.0E+03

1.0E+04

1.0E+05

1.0E+06

1.0E+07

1.0E+08

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

Rin

göff

nu

ngs

rate

n d

er

ion

isch

en

Sp

ezie

s [H

z]

pKs-Wert

Taurin 4b / 4a / 4c Na-Formiat / 4d 4e Na-Acetat

𝑘𝑍−𝑆−

𝑘𝑍−𝑆+/𝑍±𝑆−

𝑘𝑍+𝑆−/𝑍±𝑆+

𝑘𝑍+𝑆+


- 98 -

Eine negative Steigung (−1 ≤ 𝛼 < 0) der Auftragung der logarithmierten Ringöffnungsraten

der ionischen Zuckerspezies gegen die 𝑝𝐾𝑠-Werte der Katalysatoren liegt laut dem BRØNSTED-Katalyse-

Gesetz bei Säurekatalyse vor. Eine positive Steigung (0 < 𝛼 ≤ 1) ergibt sich entsprechend bei der

Katalyse durch Basen. Abbildung 35 zeigt deutlich, dass die Ringöffnung anionischer Spezies der

D-Fructose 1a durch Säuren katalysiert wird, während die Ringöffnung kationischer Spezies der

Katalyse durch Basen unterliegt.49 Weiterhin ist zu erkennen, dass Säuren (Basen) keinen Einfluss auf

die Ringöffnung kationischer (anionischer) Spezies der D-Fructose 1a haben (𝛼 ≅ 0). Es ist

entsprechend davon auszugehen, dass eine Ringöffnung in diesen Fällen unter dem Einfluss von

Wasser abläuft, welches in jedem Modellsystem im Überschuss vorlag. Tabelle 13 fasst die

BRØNSTED-Parameter der untersuchten Katalyse der Ringöffnung der β-D-Fructopyranose 1a(ii)

zusammen.

Tabelle 13: BRØNSTED-Parameter der Ringöffnungsraten ionischer Spezies der β-D-Fructopyranose 1a(ii) für 22 °C.

Ringöffnungsrate der Zuckerspezies 𝜶 (Steigung) 𝑪 (Achsenabschnitt)

𝑍−𝑆− 0.05 ± 0.04 2.31 ± 0.14 𝑍−𝑆+ -0.75 ± 0.01 8.40 ± 0.04 𝑍+𝑆− 0.86 ± 0.03 0.24 ± 0.11 𝑍+𝑆+ -0.06 ± 0.03 1.69 ± 0.11

Die Frage, warum Wasser – trotz seines extremen Überschusses gegenüber den zugesetzten

Säuren – deren katalytischen Einfluss nicht überdeckt, kann anhand der erhaltenen BRØNSTED-Plots

beantwortet werden. Die 𝑝𝐾𝑠-Werte von Wasser liegen bei 22 °C nach dem Massenwirkungsgesetz

unter Einbeziehung des Ionenproduktes von Wasser bei 22 °C (𝑝𝐾𝑊𝐻(22°𝐶) = 14.0756)[349] und

dessen Dichte bei 22 °C (𝜌(𝐻2𝑂)22°𝐶 = 0.9978𝑔

𝑐𝑚3)[352] bei 𝑝𝐾𝑠1 = −1.74 und 𝑝𝐾𝑠2 = 15.82. Mit

Blick auf eine Extrapolation der BRØNSTED-Plots sind sowohl Hydronium- als auch Hydroxidionen

katalytisch zwar unvergleichbar effektiv, jedoch findet die Katalyse durch Hydroniumionen im

Basischen und die durch Hydroxidionen im Sauren statt, wo die entsprechenden Ionen nur in

geringsten Konzentrationen vorherrschen. Wasser ist demnach in neutralen pH-Bereichen trotz seines

Überschusses ein vergleichsweise ineffizienter Katalysator. Schwache Säuren sind demgegenüber zwar

katalytisch weniger aktiv, die für die Katalyse notwendigen Spezies kommen jedoch in wesentlich

höheren Konzentrationen vor, sodass im Gesamtbild eine effiziente Katalyse resultiert.

Der Schnittpunkt der BRØNSTED-Plots für die saure und basische Katalyse liegt für 22 °C bei

einem 𝑝𝐾𝑠-Wert von 5.07. Für Pivalinsäure ist der katalytische Einfluss der Carboxylfunktion

entsprechend äquivalent zum katalytischen Einfluss ihrer konjugierten Base. Da das Minimum der

Ringöffnungsrate und auch der 𝑝𝐼 der β-D-Fructopyranose 1a(ii) mit einem Wert von rund 4.7 jedoch

bei einem pH-Wert unterhalb von 5.07 liegt, überwiegt der Einfluss der sauren Katalyse. Dies wird

durch die rechtsseitig der Minima liegenden Schultern in Abbildung 36 deutlich.50 Die entsprechenden

49 Ein Einfluss der Säuren bzw. konjugierten Basen auf die zwitterionischen Zuckerspezies sollte nicht gegeben

sein, da diese ohne weiteres Zutun spontan öffnen.

50 Entsprechende Schultern, die aus einer äquivalenten Säurekatalyse resultieren, sind auch in Bezug auf die

Abbauraten von D-Fructose 1a (Abbildung 4, Seite 43), die Bildungsraten von 3-Desoxyglucoson 9b (Abbildung 9,

Seite 50), die Bräunungsraten, gemessen bei 420 nm (Abbildung 14, Seite 54), sowie die Raten der

1,2-Enolisierung (Abbildung 21, Seite 70) erkennbar. Auch im Zuge der Untersuchung der Mutarotation von

6-Desoxy-D-gluco-hepturonsäure durch CAPON und WALKER (1971)[393] sowie der Untersuchung der


- 99 -

Kurven der Ringöffnungsraten sind auf Grundlage der in Tabelle 13 gegebenen BRØNSTED-Parameter,

den 𝑝𝐾𝑠-Werten der β-D-Fructopyranose 1a(ii) (𝑝𝐾𝑠1 = −2.60 und 𝑝𝐾𝑠2 = 11.96)[298,343] sowie den

𝑝𝐾𝑠-Werten möglicher Katalysatoren mit Hilfe von Gleichung (38) (Seite 39) berechnet.

Es ist deutlich zu erkennen, dass die Höhe der Ringöffnungsrate – wie oben beschrieben (vgl.

hierzu auch Kapitel 2.3) – nicht nur von der katalytischen Effizienz des Katalysators, sondern auch von

dessen Molenbruch im jeweiligen pH-Bereich abhängig ist. Daraus ergibt sich, dass jede der in

Abbildung 36 gezeigten Kurven in einem spezifischen pH-Bereich abschnittsweise eine maximale

Ringöffnungsrate zeigt. Anders ausgedrückt ist es mit Hilfe der gefundenen Zusammenhänge möglich,

den effizientesten Katalysator für einen gegebenen pH-Wert zu errechnen.

Abbildung 36: pH-Abhängiger Verlauf der Ringöffnungsraten der β-D-Fructopyranose 1a(ii) in Anwesenheit stöchiometrischer Mengen von Katalysatoren mit verschiedenen 𝑝𝐾𝑠-Werten bei 22 °C, berechnet auf Grundlage der in Tabelle 13 gegebenen BRØNSTED-Parameter, den 𝑝𝐾𝑠-Werten der β-D-Fructopyranose 1a(ii) (𝑝𝐾𝑠1 = −2.60 und 𝑝𝐾𝑠2 = 11.96)

[298,343] sowie den 𝑝𝐾𝑠-Werten möglicher Katalysatoren mit Hilfe von Gleichung (38).

Für einen für Lebensmittel repräsentativen pH-Wert von 4.5 ergibt sich als effizientester

Katalysator beispielsweise eine Säure mit einem 𝑝𝐾𝑠-Wert von 4.22. Dieses Kriterium wird etwa von

γ-Aminobuttersäure 4e erfüllt (vgl. Tabelle 1, Seite 44). Säuren wie etwa DL-Äpfel- und Citronensäure

sind mehrprotonig und haben entsprechend mehr als einen 𝑝𝐾𝑠-Wert im lebensmittelrelevanten

pH-Bereich. Dass die Einflüsse der einzelnen Säurefunktionen auf die Ringöffnungsrate dabei additiv

sind, zeigt Abbildung 37. Hier wurden die Ringöffnungsraten zum einen polarimetrisch in Abhängigkeit

des pH-Wertes gemessen und zum anderen auf Grundlage der BRØNSTED-Parameter, der 𝑝𝐾𝑠-Werte

der β-D-Fructopyranose 1a(ii) sowie der 𝑝𝐾𝑠-Werte der DL-Äpfel- und Citronensäure[14] berechnet.

Ringöffnungsraten von Ribose-5-phosphat durch PIERCE et al. (1985)[79] ist ein entsprechender Kurvenverlauf

beobachtet worden.

0.0005

0.0025

0.0045

0.0065

1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5

Rin

göff

nu

ngs

rate

[H

z]

pH-Wert

pKs=2.5 pKs=3.0

pKs=3.5 pKs=4.0

pKs=4.5 pKs=5.0

𝑝𝐾𝑠 = 2.5

𝑝𝐾𝑠 = 3.5

𝑝𝐾𝑠 = 4.5

𝑝𝐾𝑠 = 3.0

𝑝𝐾𝑠 = 4.0

𝑝𝐾𝑠 = 5.0


- 100 -

Abbildung 37: Ringöffnungsraten der β-D-Fructopyranose 1a(ii) bei 22 °C in Anwesenheit stöchiometrischer Mengen von DL-Äpfel- und Citronensäure (jeweils gemessen und berechnet). Die Messungen erfolgten mittels Polarimetrie. Die Berechnungen erfolgten auf Grundlage der BRØNSTED-Parameter (Tabelle 13), der 𝑝𝐾𝑠-Werte der β-D-Fructopyranose 1a(ii)[298,343] sowie der 𝑝𝐾𝑠-Werte der DL-Äpfel- und Citronensäure.[14]

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden alle Messungen unter nicht gepufferten

pH-konstanten Bedingungen durchgeführt. Liegen jedoch Systeme vor, bei denen der pH-Wert im Zuge

ablaufender Prozesse nicht konstant ist, kann eine ausgeprägte katalytische Wirkung über einen

möglichst breiten pH-Bereich durch Substanzen hervorgerufen werden, deren 𝑝𝐾𝑠-Werte innerhalb

des entsprechenden Bereichs streuen. Dies kann zum einen durch eine Mischung verschiedener

Säuren oder aber durch Polysäuren erreicht werden. Dabei ist vor allem Phytinsäure zu nennen, die

eine zwölfprotonige Säure darstellt, deren 𝑝𝐾𝑠-Werte sich über einen Bereich von 1.9 bis 9.5

erstrecken.51;[353] Gleichermaßen ist eine Katalyse der Ringöffnung durch quellbare polymere

Polysäuren denkbar. Erste Vorversuche mit Pektinen und Alginaten haben einen entsprechenden

katalytischen Einfluss bereits bestätigen können (hier nicht gezeigt).

51 Ein Einfluss von Phosphaten sowohl auf die Raten der Anomerisierung als auch auf die Reaktivität von

Zuckerderivaten ist in der Fachliteratur phänomenologisch zahlreich dokumentiert,[6,7,79,394-396] wurde jedoch

bislang nicht in einen allgemeingültigen Zusammenhang mit deren 𝑝𝐾𝑠-Werten gebracht.

0.000

0.003

0.006

0.009

0.012

0.015

0.018

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

Rin

göff

nu

ngs

rate

[H

z]

pH-Wert

D-Fructose + Äpfelsäure (gemessen)D-Fructose + Citronensäure (gemessen)D-Fructose + Äpfelsäure (berechnet)D-Fructose + Citronensäure (berechnet)

D-Fructose + DL-Äpfelsäure (gemessen) D-Fructose + Citronensäure (gemessen) D-Fructose + DL-Äpfelsäure (berechnet) D-Fructose + Citronensäure (berechnet)

ZUSAMMENFASSUNG

- 101 -

5 Zusammenfassung Die vorliegende Arbeit verfolgte zunächst das Ziel zu klären, ob die Reaktivität eines

reduzierenden Zuckers auf ein spezifisches Anomer zurückgeführt werden kann. Dazu wurden in einem

ersten Schritt verschiedene Reaktionsmechanismen des Zuckerabbaus betrachtet. Die Mehrzahl dieser

Mechanismen weist die Gemeinsamkeit diverser Schritte des Protonentransfers auf. Einen analytisch

einfach zu verfolgenden Prozess, der auf einem mehrstufigen Protonentransfer basiert, stellt die

Ringöffnung bzw. Anomerisierung reduzierender Zucker dar. Unter der Voraussetzung, dass der

Protonentransfer reaktionsunabhängig immer den gleichen Gesetzmäßigkeiten folgt, erlaubt ein

genaues Verständnis des Prozesses der Anomerisierung Rückschlüsse auf den Verlauf der nicht

enzymatischen Bräunung sowohl im Sinne der Karamellisierung als auch im Sinne der

MAILLARD-Reaktion. Daraus wurde die Hypothese abgeleitet, dass die Reaktivität eines reduzierenden

Zuckers durch die Messung seiner Gesamtanomerisierungsrate abgeschätzt werden kann.

Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde zunächst ein Modell zur Beschreibung der

Dynamik der Anomerisierung erstellt, das den Prozess nicht nur mathematisch beschreibt, sondern

auch mechanistisch fundiert ist. Anschließend wurden die Gesamtanomerisierungsraten von

D-Glucose 2a, D-Tagatose 1b und D-Fructose 1a sowie D-Fructose-analoger AMADORI-Verbindungen 6a

und 6b mittels selektiver Sättigungstransfer- sowie quantitativer NMR-Spektroskopie in Abhängigkeit

des pH- bzw. pD-Wertes und der Temperatur gemessen.52 In einem parallelen Schritt wurden die

jeweiligen Zucker bzw. Zuckerderivate bei 90 °C und konstanten pH-Werten im Bereich von 1.5 bis 6.5

zur Reaktion gebracht und ihre relativen Reaktivitäten anhand verschiedener Parameter wie etwa den

Abbauraten der Edukte, Bildungsraten von Folgeprodukten sowie Bräunungsmessungen ermittelt. Es

konnte gezeigt werden, dass das Verhältnis der Gesamtanomerisierungsraten der untersuchten

Verbindungen bei 90 °C im lebensmittelrelevanten pH-Bereich (etwa 3 ≤ 𝑝𝐻 ≤ 6) in guter

Übereinstimmung mit dem Verhältnis ihrer Reaktivitäten ist. Dies trifft ebenso auf die für eine

Temperatur von 120 °C extrapolierten Gesamtanomerisierungsraten der D-Fructose 1a sowie der

D-Fructose-analogen AMADORI-Verbindungen 6a und 6b und deren Vergleich mit den von BRANDS und

VAN BOEKEL (1998, 2002) publizierten Reaktivitätsverhältnissen zu. Es ist somit anzunehmen, dass die

Reaktivität eines reduzierenden Zuckers nicht auf ein spezifisches Anomer zurückgeführt werden

kann. Vielmehr resultiert die Reaktivität des Systems primär aus der jeweiligen Ionisierbarkeit der

vorhandenen funktionellen Gruppen.

Die Ringöffnung erfolgt ausgehend von ionisierten Zuckeranomeren. Diese gehen aus einer

Protonierung des Ringsauerstoffatoms bzw. der Deprotonierung der anomeren Hydroxylfunktion

hervor. Bei dem entsprechenden Kation handelt es sich damit um eine starke Säure, beim Anion um

eine starke Base. Diese können eine Protonierung bzw. Deprotonierung der übrigen

Hydroxylfunktionen bewirken (intramolekularer Protonenshift), was die eigentlichen Abbaureaktionen

einleitet. Da es sich bei der anomeren Hydroxylfunktion um diejenige mit der größten Acidität handelt,

ist die Wahrscheinlichkeit ihrer Deprotonierung innerhalb des Moleküls am größten. Abbaureaktionen

reduzierender Zucker sind damit als unwahrscheinliche Alternativen zur Anomerisierung zu

52 In diesem Zusammenhang konnten die anomeren 1H-NMR-Resonanzen der furanoiden Anomere der D-Glucose

2a erstmals direkt und die Protonenresonanz des Aldehydprotons des acyclischen Zentralisomers erstmals

indirekt nachgewiesen werden.

ZUSAMMENFASSUNG

- 102 -

verstehen. Die Dynamik sowohl der Ringöffnung als auch des Ringschlusses steht auf diese Weise mit

der Kinetik nicht enzymatischer Bräunungsreaktionen in enger Verbindung. Bedingungen, die die

Anomerisierung und damit die Dynamik des Protonentransfers fördern, müssen folglich auch zu einer

erhöhten Reaktivität des entsprechenden Zuckers führen.

Um den Einfluss von Aminosäuren auf die Dynamik der Anomerisierung und damit indirekt

auch auf die Reaktivität reduzierender Zucker zu untersuchen, wurde die Rate der Ringöffnung der

β-D-Fructopyranose 1a(ii) im Folgenden in Anwesenheit verschiedener katalytischer Säuren bei 22 °C

in Abhängigkeit des pH-Wertes gemessen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Aminofunktionen

einfacher Aminosäuren im lebensmittelrelevanten pH-Bereich keinen messbaren Einfluss auf die Rate

der Anomerisierung haben. Vielmehr wird der Prozess der Anomerisierung durch Substanzen

katalysiert, die funktionelle Gruppen mit 𝑝𝐾𝑠-Werten im Bereich des isoelektrischen Punktes (𝑝𝐼) des

untersuchten Zuckers tragen. Wie entsprechende BRØNSTED-Plots zeigen, findet eine Katalyse dabei

sowohl säure- als auch basenvermittelt statt (vgl. allgemeine Säure-Base-Katalyse). Für

β-D-Fructopyranose 1a(ii) ist die Effizienz der sauren und basischen Katalyse für einen Katalysator mit

einem 𝑝𝐾𝑠-Wert von 5.07 bei Raumtemperatur identisch. Da jedoch der 𝑝𝐼 des Zuckeranomers mit

rund 4.7 geringfügig darunter liegt, ist die Katalyse der Anomerisierung durch Säuren in der Praxis von

höherer Relevanz als eine Katalyse durch Basen.

Unter der Annahme, dass entsprechende BRØNSTED-Plots auch für Prozesse des

Protonentransfers im Rahmen der nicht enzymatischen Bräunung näherungsweise Gültigkeit haben

(etwa für die Bildung der SCHIFF-Base aus reduzierendem Zucker und Aminosäure, für die sich

anschließende AMADORI-Umlagerung, etc.), ist der Einfluss von schwachen Säuren auf den Abbau

reduzierender Zucker hinreichend genau erklärt. Es verwundert jedoch zunächst, dass

Aminofunktionen mit üblichen 𝑝𝐾𝑠-Werten im Bereich von 9 bis 10 keinen bedeutenden Einfluss auf

Protonentransfers haben, obwohl die MAILLARD-Reaktion allgemein als aminokatalysiert gilt. Der

Aminostickstoff muss demnach einen anderweitigen Effekt ausüben.

Betrachtet man die Raten der 1,2-Enolisierung von D-Fructose 1a sowie D-Fructose-analogen

AMADORI-Verbindungen 6, so wird deutlich, dass die kovalente Bindung zum Aminostickstoff eine

Erhöhung der C-H-Acidität am C-1 zur Folge hat. Die der AMADORI-Umlagerung entsprechende

1,2-Enolsierung ist demnach nicht nur durch schwache Säuren katalysiert und damit durch

Aminosäuren autokatalysiert, sondern auch durch eine Veränderung der C-H-Acidität begünstigt, die

sich aus dem negativen induktiven Effekt des protonierten Aminostickstoffs ergibt. Hierbei handelt es

sich folglich um einen Aspekt der Reaktionskaskade, der aus dem direkten Einfluss des Aminostickstoffs

resultiert.

Die Untersuchung der Bildungskinetik von 1- und 3-Desoxyglucoson 9a und 9b, ausgehend

von den AMADORI-Verbindungen 6a-6e in Abhängigkeit des pH-Wertes, erlaubte weiterhin den Schluss,

dass die C-H-Acidität am C-3 sowie die Protonenaffinität der Hydroxylfunktion am C-3 durch den

Substituenten am C-1 über die Ausbildung kooperativer Wasserstoffbrücken beeinflusst sind. Liegen

entsprechende Wasserstoffbrückenbindungen vor, so wirkt ein verstärkter negativer induktiver Effekt

auf die C-H-Bindung am C-3 und die Bildung von 1-Desoxyglucoson 9a wird erleichtert. Gleichermaßen

ist die Protonierung der OH-C-3-Funktion begünstigt, sodass es unter anderem zur erleichterten

Bildung von 3-Desoxyglucoson 9b, 3-Desoxygalactoson 9c, HMF 13 und AAF 15 im sauren Milieu

kommt.

ZUSAMMENFASSUNG

- 103 -

Der Aminostickstoff der AMADORI-Verbindungen 6 hat weiterhin Einfluss auf die 𝑝𝐾𝑠-Werte

der Ringsauerstoffatome der einzelnen Anomere, sodass eine Katalyse der Ringöffnung durch Basen

weniger wahrscheinlich wird. Das betrifft jedoch nicht die Katalyse durch Säuren im pH-Bereich von

größer als 3.0. Wichtig für den weiteren Verlauf der MAILLARD-Reaktion ist, dass nicht nur der

Aminosubstituent Einfluss auf die 𝑝𝐾𝑠-Werte des Zuckergrundkörpers, sondern dieser gleichermaßen

rückwirkend Einfluss auf den 𝑝𝐾𝑠-Wert der Aminofunktion nimmt. Dieser fällt durch die kovalente

Bindung zum Zucker in der Regel um ca. 1.5 Einheiten. Die 𝑝𝐾𝑠-Werte gewöhnlicher

AMADORI-Verbindungen liegen damit im Bereich von ca. 8 bis 9. Der Anteil der AMADORI-Verbindungen

mit nicht protonierter Aminofunktion ist damit beim selben pH-Wert höher als der ihrer

ursprünglichen Aminosäuren. Damit erhöht sich die Wahrscheinlichkeit einer neuerlichen

Kondensation mit einem zweiten Molekül eines Zuckers. Dabei fällt der 𝑝𝐾𝑠-Wert der Aminofunktion

weiter ab und erreicht den Bereich, in dem deren katalytischer Einfluss bedeutsam wird.

Der Abbau reduzierender Zucker führt in vielen Fällen zur Bildung von Carbonsäuren.53 Dabei

handelt es sich zumeist um schwache Säuren, die entsprechend katalytisch hoch potent sind und

damit ihre eigene Bildung katalysieren. Parallel hierzu kommt es zur Bildung von Bräunungsprodukten,

sodass sich die Kinetik der Farbbildung – wie auch in der vorliegenden Arbeit geschehen – am besten

mit Hilfe einer logistischen Funktion modellieren lässt. Dabei ist die logistische Funktion mathematisch

betrachtet äquivalent zum integrierten Zeitgesetz der Autokatalyse. Folglich unterliegt die MAILLARD-

Reaktion mit fortschreitender Dauer mehr und mehr einer Katalyse im Sinne der Karamellisierung.

Ein von Reaktionsbeginn an beschleunigter Verlauf der MAILLARD-Reaktion sowie der Karamellisierung

im lebensmittelrelevanten pH-Bereich kann daher durch die Zugabe schwacher Säuren wie

Carbonsäuren und Phosphaten – vor allem Phytinsäure – erreicht werden. Als Aminokomponenten

sollten dabei Verbindungen ausgewählt werden, die zumindest eine Aminofunktion mit möglichst

schwacher Basizität – wie etwa L-Lysin – aufweisen. Zusätzlich trägt eine zur Aminofunktion α-ständige

Carboxylfunktion zu einer erhöhten Reaktivität bei, indem sie an kooperativen

Wasserstoffbrückenbindungen teilhat.

Schema 29 stellt die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse generalisiert dar,

sodass sich ein umfassendes Bild der frühen und intermediären Phase der MAILLARD-Reaktion –

beginnend bei D-Glucose 2a – ergibt. Der Fokus liegt dabei auf Reaktionsschritten, auf die schwache

Säuren und ihre konjugierten Basen einen katalytischen Einfluss haben (im Schema mit roten Pfeilen

kenntlich gemacht). Gleichermaßen sind die wichtigsten funktionellen Gruppen markiert, für die sich

im Laufe der Reaktion eine Änderung der 𝑝𝐾𝑠-Werte ergibt (mit grünen Pfeilen hervorgehoben).

Quantitative Veränderungen der Anomerensysteme (gelb-orange Pfeile) sowie Folgereaktionen (blaue

Pfeile) sind ebenfalls kenntlich gemacht.

53 Auch die beschriebenen α-Dicarbonylverbindungen sind über ihre Hydrate tautomer zu Hydroxycarbonsäuren

wie etwa Gluconsäure (tautomer zum Hydrat des D-Glucosons 9d). Daneben handelt es sich bei den Endiolen

einiger α-Dicarbonylverbindungen (solche mit Reduktonstruktur, etwa 1-Desoxyglucoson 9a und D-Glucoson 9d)

um vinyloge Carbonsäuren.

ZUSAMMENFASSUNG

- 104 -

Schema 29: Schematische Darstellung der frühen MAILLARD-Reaktion mit Fokus auf die durch schwache Säuren und deren konjugierte Basen katalysierten Schritte des Protonentransfers (rote Pfeile). Es sind die für diese Arbeit wichtigsten Positionen gekennzeichnet, deren 𝑝𝐾𝑠-Werte sich relativ zu denen der D-Glucose 2a ändern (grüne Pfeile). Weiterhin sind Veränderungen von Anomerensystemen relativ zu dem der D-Glucose 2a (gelb-orange Pfeile) sowie der Einfluss der Katalysatoren auf Abbaureaktionen kenntlich gemacht (blaue Pfeile). Auf die Darstellung der Bildung weiterer intermediärer Reaktionsprodukte – etwa 1-Desoxyglucoson 9a – wird aus Gründen der Übersichtlichkeit verzichtet.

ZUSAMMENFASSUNG

- 105 -

Katalytische Säuren und Basen beschleunigen die Anomerisierung der D-Glucose 2a, indem

sie als Protonendonoren und -akzeptoren wirken und damit einen effektiven Protonentransfer

gewährleisten. Dabei kommt es in wässriger Lösung auch zur beschleunigten Ausbildung des gem-Diols

der D-Glucose und in Anwesenheit von Aminosäuren in Konkurrenz dazu zur Bildung des gem-Aminols

5c. Dieses wird jedoch nicht nur beschleunigt gebildet, sondern gleichermaßen beschleunigt abgebaut.

Dabei kommt es zur Freisetzung von D-Glucose 2a oder alternativ zur Bildung der SCHIFF-Base 5b. Deren

Anomerisierungsdynamik – d.h. die Rate der Cyclisierung zu ihren anomeren N-substituierten

Glycosylaminen 5a – ist ebenso katalysiert wie die 1,2-Enolisierung als Auftakt für die

AMADORI-Umlagerung sowie die Bildung von 3-Desoxyglucoson 9b. Im Vergleich zur reinen

D-Fructose 1a ist die Rate der 1,2-Enolisierung der AMADORI-Verbindungen 6 durch die elektronischen

Effekte des kovalent gebundenen Stickstoffsubstituenten erhöht. Da viele Reaktionen, ebenso wie die

Anomerisierung, auf sukzessivem Protonentransfer beruhen, fördern schwache Säuren und deren

konjugierte Basen nicht nur die Ringöffnung und den Ringschluss von Zuckeranomeren – d.h. die

Bildung und den Zerfall von Halbacetalen bzw. -ketalen –, sondern auch deren Reaktivität im

Allgemeinen.

Die vorliegende Arbeit zeigt, dass sowohl die Karamellisierung als auch die

MAILLARD-Reaktion als konsekutive Säure-Base-Reaktionen verstanden werden können bzw. müssen.

Ihr Verlauf ist damit abhängig von der Dynamik des Protonentransfers, die sich insbesondere durch

schwache Säuren wie Carbonsäuren katalysieren lässt (allgemeine Säure-Base-Katalyse). Daneben

erlaubt die Kenntnis der 𝑝𝐾𝑠-Werte der Struktureinheiten, deren Ionisierung zu Abbaureaktionen

führt, das Ausmaß der entsprechenden Reaktionen im Verhältnis zu anderen Reaktionsmöglichkeiten

abzuschätzen. Da es sich bei der anomeren Hydroxylfunktion sowie dem Ringsauerstoffatom der

Anomere von Zuckerderivaten zumeist um die Struktureinheiten handelt, deren 𝑝𝐾𝑠-Werte am

wenigsten extrem sind, wirken katalytische Einflüsse hier am stärksten.

Die Untersuchung des Einflusses der Molekülgeometrie sowie verschiedener funktioneller

Gruppen auf die entsprechenden 𝑝𝐾𝑠-Werte liefert damit grundlegende Erkenntnisse zum Verlauf der

nicht enzymatischen Bräunung. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass

entsprechende Untersuchungen neben technologisch hoch entwickelten Methoden wie der

NMR-Spektroskopie auch mittels einfachster apparativer Ausstattungen wie etwa manueller

Polarimeter erfolgen können.

EXPERIMENTELLER TEIL

- 106 -

6 Experimenteller Teil Im Folgenden sind die durchgeführten Synthesen, Modellreaktionen, chromatographischen

und spektroskopischen Methoden und Parameter sowie die durchgeführten potentiometrischen und

polarimetrischen Experimente beschrieben. Außerdem sind die verwendeten Geräte,

NMR-Pulsprogramme, Chemikalien sowie die genutzte Software aufgelistet.

6.1 Synthesen der AMADORI-Verbindungen

Die Synthesen der untersuchten AMADORI-Verbindungen 6a-6e erfolgten in Anlehnung an die

von MILLS und HODGE (1976) sowie RÖPER et al. (1983) vorgeschlagenen Methoden.[127,354]

6.1.1 SYNTHESE VON N-(1-DESOXY-D-FRUCTOS-1-YL)-L-ALANIN

Die Synthese von N-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-L-alanin (Fructosylalanin) 6a erfolgte nach der

Vorschrift von RÖPER et al. (1983).[127]

M [g/mol] eq. n [mmol] m bzw. V

D-Glucose 180.16 4.0 280 50.445 g

L-Alanin 89.09 1.0 70 6.236 g

Natrium-Pyrosulfit 190.11 0.5 35 6.654 g

Methanol/Wasser

(1/1; v/v) 80 mL

Durchführung

6.236 g L-Alanin (70 mmol; 1.0 eq.) werden zusammen mit 50.445 g wasserfreier D-Glucose

(280 mmol; 4.0 eq.) und 6.654 g Natrium-Pyrosulfit (35 mmol; 0.5 eq.) in 80 mL Methanol/Wasser

(1/1; v/v) gelöst und für etwa 4.5 h bis zur leichten Gelbfärbung unter Rückfluss erhitzt. Die

Reaktionskontrolle erfolgt dünnschichtchromatographisch auf Kieselgel 60 unter Nutzung von

n-Butanol/Eisessig/Wasser (4/2/1; v/v/v) als Laufmittel und 5 mM Ninhydrinlösung in Ethanol/Wasser

(9/1; v/v) als Detektionsreagenz.

Aufarbeitung

Nach Abkühlen der Lösung wird diese mit 250 mL Ethanol/Wasser (1/1; v/v) verdünnt. Die

Aufreinigung des Produktes aus dem Filtrat erfolgt säulenchromatographisch an DowexTM 50WX8 (in

der protonierten Form). Dazu wird die Lösung zunächst auf den Kationentauscher aufgezogen.


- 107 -

Anschließend wird mit Ethanol/Wasser (1/1; v/v) (ca. zehnfaches Säulenvolumen) sowie bidest.

Wasser (ca. zehnfaches Säulenvolumen) gewaschen und mit 0.1 M wässriger ammoniakalischer

Lösung bei einer Tropfgeschwindigkeit von etwa einem Tropfen pro Sekunde eluiert. Die das Produkt

enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und anschließend

gefriergetrocknet. Es ergeben sich 3.82 g Produkt als weißer Feststoff (22% Ausbeute).

Analytische Daten

1H- und 13C-NMR: vergleiche Tabellen 4 bis 6. Elementaranalyse (EA): %N = 5.48, %C = 42.69,

%H = 6.86, %O = 44.97. Summenformel laut EA: C9H17NO7. 𝑝𝐾𝑠1 = 2.30, 𝑝𝐾𝑠2 = 8.25. HPLC-RI

(AMADORI-Methode): 𝑡𝑅 = 16.1𝑚𝑖𝑛.

6.1.2 SYNTHESE VON N-(1-DESOXY-D-[2-13C]FRUCTOS-1-YL)-L-ALANIN

Die Synthese von N-(1-Desoxy-D-[2-13C]fructos-1-yl)-L-alanin ([2-13C]Fructosylalanin) 6a

erfolgte nach der Vorschrift von MILLS und HODGE (1976).[354] Die Aufarbeitung erfolgte in Anlehnung

an RÖPER et al. (1983).[127]


D-[2-13C]Glucose 181.16 1.0 16.6 3.000 g

L-Alanin 89.09 1.1 18.6 1.660 g

Malonsäure 104.06 0.2 3.9 0.401 g

Methanol 30 mL

Durchführung

1.660 g L-Alanin (19 mmol; 1.1 eq.) werden zusammen mit 3.000 g wasserfreier

D-[2-13C]Glucose (17 mmol; 1.0 eq.) in 30 mL wasserfreiem Methanol weitestgehend gelöst und die

Suspension für 40 min unter Rückfluss erhitzt. Es werden 0.401 g Malonsäure (4 mmol; 0.2 eq.)

hinzugegeben und für weitere 170 min unter Rückfluss erhitzt. Die Reaktionskontrolle erfolgt

dünnschichtchromatographisch auf Kieselgel 60 unter Nutzung von n-Butanol/Eisessig/Wasser (4/2/1;

v/v/v) als Laufmittel und 5 mM Ninhydrinlösung in Ethanol/Wasser (9/1; v/v) als Detektionsreagenz.

Aufarbeitung

Nach Abkühlen der Suspension wird der Bodensatz abfiltriert und verworfen und das Filtrat

mit bidest. Wasser auf ein Gesamtvolumen von 150 mL ergänzt. Die Aufreinigung des Produktes aus

dem Filtrat erfolgt säulenchromatographisch an DowexTM 50WX8 (in der protonierten Form). Dazu

wird die Lösung zunächst auf den Kationentauscher aufgezogen. Anschließend wird mit


- 108 -

Ethanol/Wasser (1/1; v/v) (ca. zehnfaches Säulenvolumen) sowie bidest. Wasser (ca. dreifaches

Säulenvolumen) gewaschen und schrittweise mit wässriger ammoniakalischer Lösung aufsteigender

Konzentrationen (0.001 M; 0.01 M; 0.1 M) bei einer Tropfgeschwindigkeit von etwa einem Tropfen pro

Sekunde eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem

Druck eingeengt und anschließend gefriergetrocknet. Es ergeben sich 1.221 g Produkt als weißer

Feststoff (26% Ausbeute).

Analytische Daten


%H = 7.15, %O = 48.62. Summenformel laut EA: C9H17NO7 · 1.5 H2O.

6.1.3 SYNTHESE VON N-(1-DESOXY-D-FRUCTOS-1-YL)-L-PROLIN

Die Synthese von N-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-L-prolin (Fructosylprolin) 6b erfolgte nach der



D-Glucose 180.16 4.0 280 50.445 g

L-Prolin 115.13 1.0 70 8.059 g


Methanol/Wasser

(1/1; v/v) 80 mL

Durchführung

8.059 g L-Prolin (70 mmol; 1.0 eq.) werden zusammen mit 50.445 g wasserfreier D-Glucose

(280 mmol; 4.0 eq.) und 6.654 g Natrium-Pyrosulfit (35 mmol; 0.5 eq.) in 80 mL Methanol/Wasser

(1/1; v/v) gelöst und für etwa 4.5 h bis zur leichten Gelbfärbung unter Rückfluss erhitzt. Die




Aufarbeitung

Nach Abkühlen der Lösung wird diese mit 250 mL Ethanol/Wasser (1/1; v/v) verdünnt. Die

Aufreinigung des Produktes aus dem Filtrat erfolgt säulenchromatographisch an DowexTM 50WX8 (in

der protonierten Form). Dazu wird die Lösung zunächst auf den Kationentauscher aufgezogen.

Anschließend wird mit Ethanol/Wasser (1/1; v/v) (ca. zehnfaches Säulenvolumen) sowie bidest.


- 109 -

Wasser (ca. zehnfaches Säulenvolumen) gewaschen und mit 0.1 M wässriger ammoniakalischer

Lösung bei einer Tropfgeschwindigkeit von etwa einem Tropfen pro Sekunde eluiert. Die das Produkt

enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und anschließend

gefriergetrocknet. Es ergeben sich 8.70 g Produkt als weißer Feststoff (42% Ausbeute).

Analytische Daten


%H = 7.18, %O = 43.28. Summenformel laut EA: C11H19NO7 · H2O. 𝑝𝐾𝑠1 = 2.12, 𝑝𝐾𝑠2 = 8.37. HPLC-RI


6.1.4 SYNTHESE VON N-(1-DESOXY-D-[2-13C]FRUCTOS-1-YL)-L-PROLIN

Die Synthese von N-(1-Desoxy-D-[2-13C]fructos-1-yl)-L-prolin ([2-13C]Fructosylprolin) 6b

erfolgte nach der Vorschrift von MILLS und HODGE (1976).[354] Die Aufarbeitung erfolgte in Anlehnung

an RÖPER et al. (1983).[127]


D-[2-13C]Glucose 181.16 1.0 5.5 1.000 g

L-Prolin 115.13 1.1 6.2 0.715 g

Malonsäure 104.06 0.3 1.4 0.143 g

Methanol 15 mL

Durchführung

0.715 g L-Prolin (6.2 mmol; 1.1 eq.) werden zusammen mit 1.000 g wasserfreier

D-[2-13C]Glucose (5.5 mmol; 1.0 eq.) in 15 mL wasserfreiem Methanol weitestgehend gelöst und die

Suspension für 40 min unter Rückfluss erhitzt. Es werden 0.143 g Malonsäure (1.4 mmol; 0.3 eq.)

hinzugegeben und für weitere 140 min unter Rückfluss erhitzt. Die Reaktionskontrolle erfolgt

dünnschichtchromatographisch auf Kieselgel 60 unter Nutzung von n-Butanol/Eisessig/Wasser (4/2/1;

v/v/v) als Laufmittel und 5 mM Ninhydrinlösung in Ethanol/Wasser (9/1; v/v) als Detektionsreagenz.

Aufarbeitung


mit bidest. Wasser auf ein Gesamtvolumen von 150 mL ergänzt. Die Aufreinigung des Produktes aus

dem Filtrat erfolgt säulenchromatographisch an DowexTM 50WX8 (in der protonierten Form). Dazu

wird die Lösung zunächst auf den Kationentauscher aufgezogen. Anschließend wird mit

Ethanol/Wasser (1/1; v/v) (ca. zehnfaches Säulenvolumen) sowie bidest. Wasser (ca. dreifaches


- 110 -

Säulenvolumen) gewaschen und mit 0.1 M wässriger ammoniakalischer Lösung bei einer

Tropfgeschwindigkeit von etwa einem Tropfen pro Sekunde eluiert. Die das Produkt enthaltenden

Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und anschließend

gefriergetrocknet. Mischfraktionen werden abermals einer säulenchromatographischen Trennung

unterzogen. Es ergeben sich 0.541 g Produkt als weißer Feststoff (35% Ausbeute).

Analytische Daten

1H- und 13C-NMR: vergleiche Tabellen 4 bis 6.

6.1.5 SYNTHESE VON N-(1-DESOXY-D-FRUCTOS-1-YL)-GLYCIN

Die Synthese von N-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-glycin (Fructosylglycin) 6c erfolgte nach der



D-Glucose 180.16 3.9 268 48.315 g

Glycin 75.07 1.0 68 5.101 g


Methanol 250 mL

Durchführung

5.101 g Glycin (68 mmol; 1.0 eq.) werden zusammen mit 48.315 g wasserfreier D-Glucose

(268 mmol; 3.9 eq.) und 6.372 g Natrium-Pyrosulfit (34 mmol; 0.5 eq.) in 250 mL wasserfreiem

Methanol weitestgehend gelöst und die Suspension für 90 min unter Rückfluss erhitzt. Die




Aufarbeitung


mit 500 mL bidest. Wasser verdünnt. Die Aufreinigung des Produktes aus dem Filtrat erfolgt

säulenchromatographisch an DowexTM 50WX8 (in der protonierten Form). Dazu wird die Lösung

zunächst auf den Kationentauscher aufgezogen. Anschließend wird mit Ethanol/Wasser (1/1; v/v) (ca.

zehnfaches Säulenvolumen) sowie bidest. Wasser (ca. zehnfaches Säulenvolumen) gewaschen und

schrittweise mit wässriger ammoniakalischer Lösung aufsteigender Konzentrationen (0.001 M;

0.01 M; 0.1 M) bei einer Tropfgeschwindigkeit von etwa einem Tropfen pro Sekunde eluiert. Die das


- 111 -

Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und

anschließend gefriergetrocknet. Es ergeben sich 3.067 g Produkt als weißer Feststoff (18% Ausbeute).

Analytische Daten




6.1.6 SYNTHESE VON N-(1-DESOXY-D-FRUCTOS-1-YL)-β-ALANIN

Die Synthese von N-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-β-alanin (Fructosyl-β-alanin) 6d erfolgte nach

der Vorschrift von RÖPER et al. (1983).[127]


D-Glucose 180.16 4.0 271 48.835 g

β-Alanin 89.09 1.0 68 6.090 g


Methanol 250 mL

Durchführung

6.090 g β-Alanin (68 mmol; 1.0 eq.) werden zusammen mit 48.835 g wasserfreier D-Glucose

(271 mmol; 4.0 eq.) und 6.477 g Natrium-Pyrosulfit (34 mmol; 0.5 eq.) in 250 mL wasserfreiem

Methanol weitestgehend gelöst und die Suspension für 90 min unter Rückfluss erhitzt. Die




Aufarbeitung









anschließend gefriergetrocknet. Es ergeben sich 4.094 g Produkt als weißer Feststoff (22% Ausbeute).


- 112 -

Analytische Daten




6.1.7 SYNTHESE VON N-(1-DESOXY-D-FRUCTOS-1-YL)-γ-AMINOBUTTERSÄURE

Die Synthese von N-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-γ-aminobuttersäure (Fructosyl-γ-aminobutter-

säure) 6e erfolgte nach der Vorschrift von RÖPER et al. (1983).[127]


D-Glucose 180.16 3.9 233 42.048 g

γ-Aminobuttersäure 103.12 1.0 59 6.082 g


Methanol 250 mL

Durchführung

6.082 g γ-Aminobuttersäure (59 mmol; 1.0 eq.) werden zusammen mit 42.048 g wasserfreier

D-Glucose (233 mmol; 3.9 eq.) und 5.781 g Natrium-Pyrosulfit (30 mmol; 0.5 eq.) in 250 mL

wasserfreiem Methanol weitestgehend gelöst und die Suspension für 90 min unter Rückfluss erhitzt.

Die Reaktionskontrolle erfolgt dünnschichtchromatographisch auf Kieselgel 60 unter Nutzung von



Aufarbeitung









anschließend gefriergetrocknet. Es ergeben sich 8.370 g Produkt als gelblicher Feststoff (48%

Ausbeute).


- 113 -

Analytische Daten


%H = 7.57, %O = 46.42. Summenformel laut EA: C10H19NO7 · 1.5 H2O. 𝑝𝐾𝑠1 = 4.07, 𝑝𝐾𝑠2 = 9.13.

HPLC-RI (AMADORI-Methode): 𝑡𝑅 = 18.1𝑚𝑖𝑛.

6.1.8 REGENERATION DES IONENTAUSCHERS

Zur Regeneration des DowexTM 50WX8 Ionentauschers wird dieser in eine

chromatographische Trennsäule gefüllt, nacheinander mit 3 L bidest. Wasser, 600 mL Ethanol und

wiederum 2 L bidest. Wasser gewaschen und anschließend für 2 h in 1 N Natronlauge gerührt

(Becherglas). Der Ionentauscher wird erneut mit 3 L bidest. Wasser gewaschen und anschließend für

12 h in 2 N Salzsäure gerührt. Abschließend wird der auf diese Weise regenerierte Ionentauscher mit

bidest. Wasser neutral gewaschen.

6.2 pH-konstante Modellreaktionen

Die Abschätzung der Reaktivitäten der Zielsubstanzen erfolgte auf Grundlage von kinetischen

Untersuchungen wässriger Modellreaktionssysteme bei (90 ± 2) °C und konstantem pH-Wert auf sechs

Stufen (pH 1.5, pH 2.5, pH 3.5, pH 4.5, pH 5.5 und pH 6.5).

Durchführung von Modellreaktionen der D-Fructose

Es werden 9.008 g D-Fructose in 80 mL bidest. Wasser gelöst und der pH-Wert mittels

Salzsäure bzw. Natronlauge auf eine der sechs Stufen eingestellt. Die Lösung wird quantitativ in einen

100 mL Maßkolben überführt und mit bidest. Wasser zur Markierung ergänzt. Die

D-Fructosekonzentration der Lösung beträgt 0.5 mol/L. 50 mL dieser Lösung werden in einen 100 mL

Sulfierkolben pipettiert. Dieser ist mit einem Rückflusskühler, einem Temperaturfühler, einer

pH-Elektrode, einer Dosierspitze (Titrationsautomat) und einem Septum mit Kanüle ausgestattet. Die

Lösung wird unter Rückfluss im Ölbad auf 90 °C erhitzt und der pH-Wert mit Hilfe eines

Titrierautomaten auf den Zielwert nachgeregelt. Die Messung der Reaktionszeit wird gestartet, sobald

sowohl Temperatur als auch pH-Wert ihre Zielwerte erreicht haben. Der Reaktionslösung werden mit

Hilfe von Spritzen sodann zeitabhängig Proben (je etwa 1 mL) durch das Septum entnommen. Dabei

sind das derzeit titrierte Volumen, das entnommene Volumen, der pH-Wert sowie die Temperatur zu

protokollieren. Die Probennahme erfolgt über einen Zeitraum von 7 h im Abstand von je 30 min.

Durchführung von Modellreaktionen der D-Fructose in stöchiometrischer Mischung mit

Aminosäuren

Es wird die in Tabelle 14 aufgeführte Masse der jeweiligen Aminosäure in 80 mL bidest.

Wasser gelöst und der pH-Wert mittels Salzsäure bzw. Natronlauge auf eine der sechs Stufen

eingestellt. Es erfolgt die Zugabe von 9.008 g D-Fructose. Die Lösung wird quantitativ in einen 100 mL

Maßkolben überführt und mit bidest. Wasser zur Markierung ergänzt. Die Konzentration der Lösung

an D-Fructose und Aminosäure beträgt jeweils 0.5 mol/L. 50 mL dieser Lösung werden in einen 100 mL

Sulfierkolben pipettiert. Dieser ist mit einem Rückflusskühler, einem Temperaturfühler, einer

pH-Elektrode, einer Dosierspitze (Titrationsautomat) und einem Septum mit Kanüle ausgestattet. Die

Lösung wird unter Rückfluss im Ölbad auf 90 °C erhitzt und der pH-Wert mit Hilfe eines



- 114 -




protokollieren. Es wurden jeweils 16 Proben über einen Zeitraum von 6 bis 7 h entnommen.

Tabelle 14: Einwaagen der Aminosäuren für pH-kontrollierte Modellreaktionen in Anwesenheit stöchiometrischer Mengen an D-Fructose.

Aminosäure Einwaage [g]

L-Alanin 4.455 L-Prolin 5.757 Glycin 3.754

β-Alanin 4.455 γ-Aminobuttersäure 5.156

Durchführung von Modellreaktionen der AMADORI-Verbindungen

Es wird die in Tabelle 15 aufgeführte Masse der jeweiligen AMADORI-Verbindung in 40 mL

bidest. Wasser gelöst und der pH-Wert mittels Salzsäure bzw. Natronlauge auf eine der sechs Stufen

eingestellt. Die Lösung wird quantitativ in einen 50 mL Maßkolben überführt und mit bidest. Wasser

zur Markierung ergänzt. Die Konzentration der Lösung an jeweiliger AMADORI-Verbindung beträgt

0.025 mol/L, wobei etwaiges Kristallwasser bei der Einwaage vernachlässigt wird. Die Lösung wird in

einen 100 mL Sulfierkolben überführt. Dieser ist mit einem Rückflusskühler, einem Temperaturfühler,

einer pH-Elektrode, einer Dosierspitze (Titrationsautomat) und einem Septum mit Kanüle ausgestattet.

Die Lösung wird unter Rückfluss im Ölbad auf 90 °C erhitzt und der pH-Wert mit Hilfe eines





protokollieren. Es wurden jeweils 16 Proben über einen Zeitraum von 6 h entnommen.

Tabelle 15: Einwaagen der AMADORI-Verbindungen für pH-kontrollierte Modellreaktionen.

AMADORI-Verbindung Einwaage [g]

Fructosylalanin 0.314 Fructosylprolin 0.347 Fructosylglycin 0.297

Fructosyl-β-alanin 0.314 Fructosyl-γ-aminobuttersäure 0.332

Einstellung des Titrierautomaten

Die Einstellung, Überwachung und Regelung des pH-Wertes der Proben erfolgte mit Hilfe des DMS

Titrino 716 mit pH-Elektrode von Metrohm im SET-Mode. Als Endpunkt wurde der Ziel-pH-Wert, als

Stoppkriterium „Zeit“ und als Stoppzeit „unendlich“ eingestellt.

6.2.1 DURCHFÜHRUNG UND AUSWERTUNG DER UV/VIS-SPEKTROSKOPISCHEN MESSUNGEN

Die im Zuge der Durchführung der pH-konstanten Modellreaktionen entnommenen Proben

werden in eine Quarzküvette pipettiert und ein UV/Vis-Spektrum im Spektralbereich von 190 nm bis

1100 nm mit einer Schrittweite von 0.5 nm bei einer Scanrate von 50 nm/s aufgenommen. Es werden


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anschließend die Extinktionen bei 284 nm zur Verfolgung der frühen MAILLARD-Reaktion und bei

420 nm zur Verfolgung der fortgeschrittenen MAILLARD-Reaktion extrahiert und gegen die Zeit

aufgetragen. Die Kinetik der Extinktionszunahme wird in Anlehnung an die Arbeiten von VAIKOUSI et al.

(2008, 2009)[5,167] mit einer logistischen Funktion im Sinne einer autokatalytischen Reaktion modelliert.

Die entsprechende Funktion ist durch Gleichung (57) gegeben.

𝐸 =𝐸𝑚𝑎𝑥

1 + (𝐸𝑚𝑎𝑥𝐸0

− 1) ∙ 𝑒𝑥𝑝(−𝑘 ∙ 𝑡) (57)

Dabei ist 𝐸 die gemessene Extinktion, 𝐸𝑚𝑎𝑥 die maximal zu erreichende Extinktion,𝐸0 die

Extinktion zum Zeitpunkt 𝑡 = 0𝑠, 𝑡 die Zeit [s] und 𝑘 die Geschwindigkeitskonstante [Hz]. Die

numerische Berechnung der Parameter 𝐸𝑚𝑎𝑥, 𝐸0 und 𝑘 erfolgte im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des

XLSTAT 2017 Statistik-Analyse Add-Ins für Microsoft Excel 2016. Bei den angegebenen Fehlern handelt

es sich um die Standardfehler der geschätzten Parameter.

6.2.2 MESSUNG UND AUSWERTUNG DER ABBAUKINETIKEN DER D-FRUCTOSE


werden mit Acetonitril/Wasser (40/9; v/v) um den Faktor 50 verdünnt und mittels HILIC-RI gemessen.

Die Parameter der genutzten HPLC-Methode sind in Tabelle 16 gegeben.

Tabelle 16: Parameter der HILIC-RI-Methode zur Quantifizierung von D-Fructose.

Parameter Wert

Laufmittel Acetonitril/Wasser (95/5; v/v) Säule EC 250/3 Nucleodur® HILIC, Macharey Nagel

Flussrate 1.15 mL/min Laufzeit 10 min

Injektionsvolumen 10 µL Temperatur des Säulenofens 35 °C

Detektion und Quantifizierung Brechungsindex

Da im Rahmen der vorliegenden Arbeit lediglich die Abbauraten der D-Fructose von Interesse

sind, erfolgte ihre Quantifizierung nicht in Form von Absolutwerten. Es wurden lediglich relative

Konzentrationsänderungen gemessen und mit einer Reaktionskinetik der ersten Ordnung modelliert.

Die zugrundeliegende Funktion ist durch Gleichung (58) gegeben.

[𝐹𝑟𝑢]𝑡[𝐹𝑟𝑢]𝑡=0𝑠

=𝐼𝑛𝑡(𝑡)

𝐼𝑛𝑡(𝑡 = 0𝑠)= 𝑒𝑥𝑝(−𝑘 ∙ 𝑡) (58)

Dabei ist [𝐹𝑟𝑢]𝑡 die Konzentration der D-Fructose zum Zeitpunkt 𝑡, [𝐹𝑟𝑢]𝑡=0𝑠 die

Konzentration der D-Fructose zum Zeitpunkt 𝑡 = 0𝑠, 𝐼𝑛𝑡(𝑡) das Integral des HPLC-Peaks der D-Fructose

zum Zeitpunkt 𝑡, 𝐼𝑛𝑡(𝑡 = 0𝑠) das Integral des HPLC-Peaks der D-Fructose zum Zeitpunkt 𝑡 = 0𝑠, 𝑡 die

Zeit [s] und 𝑘 die Abbaurate der D-Fructose [Hz]. Die numerische Berechnung der Parameter

𝐼𝑛𝑡(𝑡 = 0𝑠) und 𝑘 erfolgte im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des XLSTAT 2017 Statistik-Analyse

Add-Ins für Microsoft Excel 2016. Bei den angegebenen Fehlern handelt es sich um die Standardfehler

der geschätzten Parameter.


- 116 -

6.2.3 MESSUNG UND AUSWERTUNG DER ABBAUKINETIKEN DER AMINOSÄUREN


werden mit Hexansulfonsäure (0.1 M in Wasser)/Wasser/Methanol (365/265/292; v/v/v) um den

Faktor 10 verdünnt und die Aminosäuren ionenpaarchromatographisch mittels RP-HPLC-RI gemessen.


Tabelle 17: Parameter der ionenpaarchromatographischen RP-HPLC-RI-Methode zur Quantifizierung der Aminosäuren.

Parameter Wert

Laufmittel Hexansulfonsäure (0.01 M in Wasser)/Methanol (5/2; v/v) Säule EC 250/4.6 Nucleosil® 120-5 C18, Macharey Nagel




Da im Rahmen der vorliegenden Arbeit lediglich die Abbauraten der Aminosäuren von

Interesse sind, erfolgte ihre Quantifizierung nicht in Form von Absolutwerten. Es wurden lediglich

relative Konzentrationsänderungen gemessen und mit einer Reaktionskinetik der ersten Ordnung

modelliert. Die zugrundeliegende Funktion ist durch Gleichung (59) gegeben.

[𝐴𝑆]𝑡[𝐴𝑆]𝑡=0𝑠

=𝐼𝑛𝑡(𝑡)

𝐼𝑛𝑡(𝑡 = 0𝑠)= 𝑒𝑥𝑝(−𝑘 ∙ 𝑡) (59)

Dabei ist [𝐴𝑆]𝑡 die Konzentration der Aminosäure zum Zeitpunkt 𝑡, [𝐴𝑆]𝑡=0𝑠 die

Konzentration der Aminosäure zum Zeitpunkt 𝑡 = 0𝑠, 𝐼𝑛𝑡(𝑡) das Integral des HPLC-Peaks der

Aminosäure zum Zeitpunkt 𝑡, 𝐼𝑛𝑡(𝑡 = 0𝑠) das Integral des HPLC-Peaks der Aminosäure zum Zeitpunkt

𝑡 = 0𝑠, 𝑡 die Zeit [s] und 𝑘 die Abbaurate der Aminosäure [Hz]. Die numerische Berechnung der

Parameter 𝐼𝑛𝑡(𝑡 = 0𝑠) und 𝑘 erfolgte im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des XLSTAT 2017

Statistik-Analyse Add-Ins für Microsoft Excel 2016. Bei den angegebenen Fehlern handelt es sich um

die Standardfehler der geschätzten Parameter.

6.2.4 MESSUNG UND AUSWERTUNG DER ABBAUKINETIKEN DER AMADORI-VERBINDUNGEN


werden unverdünnt für die Messung der Konzentrationen der AMADORI-Verbindungen eingesetzt. Die

Quantifizierung der AMADORI-Verbindungen erfolgt ionenpaarchromatographisch mittels RP-HPLC-RI.



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Tabelle 18: Parameter der ionenpaarchromatographischen RP-HPLC-RI-Methode zur Quantifizierung der AMADORI-Verbindungen.

Parameter Wert

Laufmittel Hexansulfonsäure (0.01 M in Wasser)/Methanol (5/2; v/v)

Säulen 1. YMC-Pack ODS-AM AM-303 AM12S05-2546WT 250 x 4.6 mm

T.D. S-5micrometer, 12 nm 2. VDS optilab ODS Hypersil 120 A 5 micrometer 15 x 4.6 mm




Da im Rahmen der vorliegenden Arbeit lediglich die Abbauraten der AMADORI-Verbindungen

von Interesse sind, erfolgte ihre Quantifizierung nicht in Form von Absolutwerten. Es wurden lediglich

relative Konzentrationsänderungen gemessen und mit einer Reaktionskinetik der ersten Ordnung

modelliert. Die zugrundeliegende Funktion ist durch Gleichung (60) gegeben.

[𝐴𝑀𝑉]𝑡[𝐴𝑀𝑉]𝑡=0𝑠

=𝐼𝑛𝑡(𝑡)

𝐼𝑛𝑡(𝑡 = 0𝑠)= 𝑒𝑥𝑝(−𝑘 ∙ 𝑡) (60)

Dabei ist [𝐴𝑀𝑉]𝑡 die Konzentration der AMADORI-Verbindung zum Zeitpunkt 𝑡, [𝐴𝑀𝑉]𝑡=0𝑠

die Konzentration der AMADORI-Verbindung zum Zeitpunkt 𝑡 = 0𝑠, 𝐼𝑛𝑡(𝑡) das Integral des HPLC-Peaks

der AMADORI-Verbindung zum Zeitpunkt 𝑡, 𝐼𝑛𝑡(𝑡 = 0𝑠) das Integral des HPLC-Peaks der

AMADORI-Verbindung zum Zeitpunkt 𝑡 = 0𝑠, 𝑡 die Zeit [s] und 𝑘 die Abbaurate der AMADORI-Verbindung

[Hz]. Die numerische Berechnung der Parameter 𝐼𝑛𝑡(𝑡 = 0𝑠) und 𝑘 erfolgte im Rahmen dieser Arbeit

mit Hilfe des XLSTAT 2017 Statistik-Analyse Add-Ins für Microsoft Excel 2016. Bei den angegebenen

Fehlern handelt es sich um die Standardfehler der geschätzten Parameter.

6.2.5 MESSUNG UND AUSWERTUNG DER KINETIKEN DER α-DICARBONYLVERBINDUNGEN


werden zur Quantifizierung der α-Dicarbonylverbindungen (3-Desoxyglucoson, 3-Desoxygalactoson,

1-Desoxyglucoson sowie D-Glucoson) mittels ortho-Phenylendiamin (OPD) derivatisiert. Hierzu werden

je 200 µL der Proben mit 200 µL 50 mM OPD-Lösung (54 mg OPD, gelöst in 10 mL Methanol/Wasser

(1/1; v/v)) versetzt und bei Raumtemperatur für mindestens 24 h unter Lichtausschluss gelagert. Die

Quantifizierung der α-Dicarbonylverbindungen als Chinoxalinderivate erfolgt mit Hilfe authentischer

Standards mittels RP-HPLC-DAD. 3-Desoxygalactoson-Chinoxalin wurde mit Hilfe eines authentischen

Standards identifiziert, jedoch als Summenparameter zusammen mit 3-Desoxyglucoson-Chinoxalin

quantifiziert. Die Parameter und der Laufmittelgradient der genutzten HPLC-Methode sind in den

Tabellen 19 und 20 gegeben.


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Tabelle 19: Parameter der RP-HPLC-DAD-Methode zur Quantifizierung der α-Dicarbonylverbindungen.

Parameter Wert

Laufmittel Methanol/Wasser Säule EC 250/4.6 Nucleosil® 120-5 C18, Macharey Nagel


Injektionsvolumen 8 bis 40 µL Temperatur des Säulenofens 35 °C

Detektion 190 bis 800 nm Quantifizierung 317 nm

Tabelle 20: Laufmittelgradient der RP-HPLC-DAD-Methode zur Quantifizierung der α-Dicarbonyl-verbindungen.

Zeit [min] Anteil Methanol [%] Anteil Wasser [%]

0 20 80 4 20 80

11 33 67 19 65 35 28 100 0 32 0 100 40 30 70 45 20 80

Die Berechnung der Bildungsraten von 1- und 3-Desoxyglucoson erfolgte auf Grundlage der

Gleichungen (40) und (41) (Seite 48). Die numerische Berechnung der Parameter 𝑘1, 𝑘2, 𝑘−1 und 𝑘−2

erfolgte im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des Solver Add-Ins von Microsoft Excel 2016.

6.3 NMR-Spektroskopische Messungen

Für die NMR-spektroskopischen Messungen wurden jeweils 0.5 M Probelösungen in 750 µL

Deuteriumoxid (D2O) hergestellt (im Falle der Proben der D-Glucose waren die Proben 0.2 M), das

durch Spuren von Ameisensäure verunreinigt war. Die Einstellung des pD-Wertes der Probelösungen

erfolgte durch die Zugabe verdünnter Lösungen von Natrium-Deuteroxid (in D2O) bzw.

Deuteriumchlorid (in D2O). Die Messung des pD-Wertes erfolgte mit Hilfe eines pH-Meters mit

Glaselektrode. Die Kalibrierung erfolgte dabei mit wässrigen Puffern (H2O). Der am pH-Meter

abgelesene Wert wird als pH*-Wert bezeichnet und entspricht nicht dem pD-Wert. Die Umrechnung

des pH*-Wertes in den pD-Wert erfolgt über eine empirisch ermittelte Korrelation, die durch

Gleichung (61) gegeben ist.[348,355,356]

𝑝𝐷 = 𝑝𝐻∗ + 0.44 (61)

6.3.1 STRUKTURAUFKLÄRUNG

Die Durchführung der im Rahmen der Strukturaufklärung der AMADORI-Verbindungen

benötigten NMR-spektroskopischen Experimente erfolgte an nicht isotopenangereicherten

Verbindungen an einem Bruker AVANCE III 500 NMR-Spektrometer (Messfrequenz für Protonen

500.13 MHz) mit einem 5 mm BBO-Probenkopf sowie einem Bruker AVANCE 600 NMR-Spektrometer

(Messfrequenz für Protonen 599.89 MHz) mit einem 5 mm BBI-Probenkopf. Als Akquisitionssoftware

dienten die TopSpin Versionen 1.3, 2.1 und 3.1 von Bruker. Die Auswertung der Spektren erfolgte mit


- 119 -

den TopSpin Versionen 3.2 pL 6 und 3.5 pL 2. Es wurden Standard Bruker-Pulsprogramme mit

verschiedenen Akquisitionsparametern genutzt. Eine Übersicht über die genutzten Pulsprogramme

sowie repräsentative Akquisitionsparameter gibt Tabelle 21.

Tabelle 21: Übersicht über die genutzten Pulsprogramme und Angabe repräsentativer Akquisitionsparameter.

NMR-Experiment Bruker

Pulsprogramm Anzahl der

Datenpunkte in f1 Anzahl der

Datenpunkte in f2 Anzahl der

Scans 1H zg bzw. zg30 64 k – 32

13C zgpg30 64 k – 15 k

DEPT dept135 64 k – 4 k

COSY cosygpqf 512 4 k 2

NOESY noesygpph 128 2 k 4

HSQC hsqcetgp 512 2 k 32

HSQC-TOCSY hsqcetgpml 512 4 k 32

HMBC hmbcgplpndqf 512 2 k 32

J-resolved jresqf 256 16 k 16

Die angegebenen chemischen Verschiebungen sind auf die jeweiligen 1H- und 13C-NMR-Resonanzen des internen Standards Aceton referenziert (𝛿( 𝐻

1 ) = 2.04𝑝𝑝𝑚bzw.𝛿( 𝐶13 ) =

30.5𝑝𝑝𝑚).

6.3.2 KALIBRIERUNG DER TEMPERATUR

Die Kalibrierung der von der variablen Temperatureinheit (variable temperature unit, VTU;

Bruker BVT 3000 Digital) eingestellten Temperatur innerhalb des NMR-Probenröhrchens erfolgte

anhand der Messung der temperaturabhängigen Differenz der chemischen Verschiebungen der 1H-NMR-Resonanzen der Hydroxyl- und Methylenprotonen von 1,2-Ethandiol.[357] Es wurde dazu eine

kommerzielle Probe von 80% 1,2-Ethandiol in DMSO-d6 verwendet. Die Kalibrierung erfolgte durch die

Messung der Probe bei verschiedenen Solltemperaturen im Bereich von 23 bis 83 °C in Intervallen von

5 K.

Durchführung

Die Solltemperatur wird mit Hilfe des Befehls „edte“ innerhalb der Software eingestellt. Nach

einer Wartezeit von 10 bis 20 min, die für die Einstellung des thermischen Gleichgewichtes benötigt

wird, erfolgt die Messung eines single-scan 1H-NMR-Spektrums. Die Verarbeitung des Spektrums

erfolgt mit einem Linienverbreiterungsfaktor lb von 5 Hz. Anschließend wird die tatsächliche

Temperatur innerhalb der Probe mit Hilfe des Automationsprogramms (AU-Programms) „calctemp“ in

der TopSpin Version 3.2 pL 6 ausgelesen. Die Auftragung der Ist- gegen die Solltemperaturen kann mit

Hilfe einer quadratischen Funktion modelliert werden, die die Daten mit einem Bestimmtheitsmaß von

1.0000 beschreibt.


- 120 -

6.3.3 KALIBRIERUNG DES PD-WERTES

Die Kalibrierung des pD-Wertes beruht in erster Linie auf der pD-abhängigen chemischen

Verschiebung der 1H-NMR-Resonanz des Methinprotons der Ameisensäure. Um eine Dekodierung des

pD-Wertes aus einem bestehenden 1H-NMR-Spektrum zu ermöglichen, wurde eine 0.5 M Probe der zu

untersuchenden Zielsubstanz in Deuteriumoxid hergestellt (0.2 M Lösungen im Falle der D-Glucose).

Dabei enthielt das verwendete Lösungsmittel in jedem Fall Ameisensäure als Verunreinigung.

Durchführung

Durch Zugabe verdünnter Lösungen von Natrium-Deuteroxid (in D2O) bzw. Deuteriumchlorid

(in D2O) wird ein pD-Wert der Probe im Bereich von 2.0 bis 6.5 eingestellt. Die Messung des pD-Wertes

erfolgt durch die Messung des pH*-Wertes mit Hilfe eines pH-Meters mit Glaselektrode, das zuvor mit

wässrigen Pufferlösungen kalibriert wurde. Der pH*- sowie der pD-Wert werden protokolliert und die

Probe in ein NMR-Probenröhrchen überführt. Die Probe wird innerhalb des NMR-Spektrometers auf

eine vorgegebene Temperatur (hier: 23 °C) temperiert und anschließend ein 1H-NMR-Spektrum der

Probe gemessen. Der Vorgang wird zur Erstellung der Kalibrierfunktion etwa zehnmal wiederholt.

Da die chemische Verschiebung der 1H-NMR-Resonanz des Methinprotons der Ameisensäure

nicht nur pD-, sondern auch in hohem Maße temperaturabhängig ist, muss die pD-Kalibrierung bei

verschiedenen Temperaturen wiederholt werden. Eine andere Möglichkeit besteht in der folgenden

Vorgehensweise. Der pD-Wert der Probe wird auf einen Wert von ca. 2.0 eingestellt. Anschließend

erfolgt die Messung von 1H-NMR-Spektren der Probe bei verschiedenen Temperaturen (hier: 23 bis

83 °C). Die Überlagerung der Spektren zeigt, dass alle gemessenen Protonenresonanzen

temperaturabhängig sind. Eine Überlagerung der in Abhängigkeit des pD-Wertes gemessenen

Spektren zeigt demgegenüber, dass viele der Protonenresonanzen der zu messenden Zuckerderivate

im Bereich von pD 2.0 bis 6.5 keine Abhängigkeit vom pD-Wert zeigen. Der Einfluss der Temperatur

auf die chemische Verschiebung kann demnach korrigiert werden, indem eine NMR-Resonanz des

Zuckerderivates gefunden wird, die eine möglichst ähnliche Temperaturabhängigkeit wie die Resonanz

der Ameisensäure zeigt. Ist die Differenz der Signale temperaturunabhängig konstant, so ist sie

lediglich abhängig vom pD-Wert. Besteht weiterhin eine geringfügige Temperaturabhängigkeit der

Differenz der Frequenzen, so kann diese polynomisch modelliert und herausgerechnet werden. Wurde

ein entsprechendes Paar von Protonenresonanzen identifiziert, erfolgt die Kalibrierung des pD-Wertes

durch die Auftragung der bei verschiedenen pD-Werten gemessenen Differenzen ihrer

Resonanzfrequenzen gegen den pD-Wert der Proben. Die nicht lineare Regression der Daten erfolgt

auf Grundlage von Gleichung (62), die auf Basis der chemischen Verschiebung im schnellen chemischen

Austausch in Kombination mit der HENDERSON-HASSELBALCH-Funktion hergeleitet werden kann.

∆𝜈 =∆𝜈𝑚𝑎𝑥 + ∆𝜈𝑚𝑖𝑛 ∙ 10

(𝑝𝐾𝑠−𝑝𝐷)

1 + 10(𝑝𝐾𝑠−𝑝𝐷) (62)

Dabei ist ∆𝜈𝑚𝑎𝑥 die maximal mögliche Differenz der zugrundeliegenden Frequenzen der

Protonenresonanzen, ∆𝜈𝑚𝑖𝑛 die minimal mögliche Differenz, ∆𝜈 die gemessene Differenz und 𝑝𝐾𝑠 der

𝑝𝐾𝑠-Wert der Ameisensäure in Deuteriumoxid. Dieser wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit

vielfach mit Werten um 4.1 bestimmt. Daraus ergibt sich mit Hilfe der durch MARTIN (1963) gegebenen

Umrechnungsfunktion ein 𝑝𝐾𝑠-Wert der Ameisensäure in H2O von 3.6, der in guter Übereinstimmung


- 121 -

mit dem im Rahmen dieser Arbeit auf Grundlage potentiometrischer Titrationen ermittelten Wert

ist.[331]

Die Berechnung von pD-Werten auf Grundlage gemessener Frequenzdifferenzen erfolgt

schließlich mit Hilfe von Gleichung (63).

𝑝𝐷 = 𝑝𝐾𝑠 − 𝑙𝑔 (∆𝜈𝑚𝑎𝑥 − ∆𝜈

∆𝜈 − ∆𝜈𝑚𝑖𝑛) (63)

6.3.4 QUANTITATIVE NMR-SPEKTROSKOPIE (QNMR)

Die theoretischen Grundlagen der quantitativen NMR-Spektroskopie wurden in Kapitel 2.2.2

näher erläutert. Die Quantifizierung relativer Anomerenkonzentrationen erfolgte im Rahmen dieser

Arbeit für sämtliche Ketosen auf Grundlage der quantitativen 13C-NMR-Spektroskopie. Dabei kamen in

jedem Fall [2-13C]-markierte Verbindungen zum Einsatz. Im Falle der D-Glucose erfolgte die

entsprechende Quantifizierung auf Grundlage der quantitativen 1H-NMR-Spektroskopie. Diese wurde

darüber hinaus auch für die Messung von Enolisierungsraten genutzt. Alle quantitativen Messungen

erfolgten an einem Bruker AVANCE 600 NMR-Spektrometer (Messfrequenz für Protonen 599.89 MHz)

mit einem 5 mm BBI-Probenkopf. Lediglich ein Teil der Messungen der Enolisierungsraten erfolgte an

einem Bruker AVANCE III 500 NMR-Spektrometer (Messfrequenz für Protonen 500.13 MHz) mit einem

5 mm BBO-Probenkopf. Es wurde in jedem Fall ein Relaxationsdelay von mindestens 5 ∙ 𝑇1 eingehalten.

Die Auswertung der NMR-Spektren erfolgt durch deren Deconvolution. Dabei werden die relevanten

NMR-Resonanzen durch LORENTZ- bzw. GAUSS-Funktionen modelliert und die Integrale der

NMR-Resonanzen durch Integration der Modellfunktionen von −∞ bis +∞ berechnet. Dies erfolgt

über den TopSpin-Befehl „dcon“.

Bei quantitativen 1H-NMR-Experimenten handelt es sich um gewöhnliche Experimente mit

verlängertem Relaxationsdelay. Die Durchführung quantitativer 13C-NMR-Experimente ist im

Folgenden näher beschrieben.

Durchführung quantitativer 13C-NMR-Experimente

Die Messung erfolgt mit dem Bruker Pulsprogramm „zgig“. Dabei handelt es sich um ein

eindimensionales NMR-Experiment mit inverse-gated decoupling. Dabei findet die

Protonenentkopplung der 13C-NMR-Resonanzen ausschließlich während der Akquisitionszeit statt, um

einen Einfluss des Kern-OVERHAUSER-Effektes auf die Signalintensitäten möglichst auszuschließen. Die

Durchführung des Experimentes beginnt mit vier dummy scans. Die nachfolgenden FIDs (etwa 1 bis 16

Einzelexperimente) werden akkumuliert. Die Messung erfolgt mit einer FID-Auflösung von 0.46 Hz pro

Datenpunkt bei einer Gesamtzahl an Datenpunkten von 128 k. Die FOURIER-Transformation erfolgt

nach einem zero filling zu insgesamt 256 k Datenpunkten und der Anwendung einer

Exponentialfunktion mit einem Linienverbreiterungsfaktor lb von 1 Hz.

6.3.5 MESSUNG VON ENOLISIERUNGSRATEN

Die Messung von Enolisierungsraten erfolgte auf Grundlage der NMR-Resonanzen C-H-acider

Protonen. Dazu wurden je 0.5 M Lösungen der Zielsubstanzen in 750 µL Deuteriumoxid hergestellt und

ihre pD-Werte durch Zugabe verdünnter Lösungen von Natrium-Deuteroxid (in D2O) bzw.

Deuteriumchlorid (in D2O) den Vorgaben entsprechend eingestellt.


- 122 -

Messungen bei Raumtemperatur

Es werden quantitative 1H-NMR-Spektren der vorbereiteten Probelösungen in regelmäßigen

Zeitabständen über einen ausreichend langen Zeitraum gemessen (hier: 24 Tage). Die Verarbeitung

der Spektren erfolgt mit Hilfe des AU-Programms „multicmd“. Die FIDs der Einzelmessungen werden

FOURIER-transformiert sowie phasen- und basislinienkorrigiert. Anschließend werden die

Integrationsgrenzen der relevanten Spektralbereiche festgelegt. Dabei handelt es sich zum einen um

die NMR-Resonanz der austauschenden Protonen und zum anderen um die Resonanz eines nicht

austauschenden Protons. Die Integration des gesamten Datensatzes erfolgt mit Hilfe des

AU-Programms „multi_integ3“. Die von der Software ausgegebene Textdatei wird in ein

Tabellenkalkulationsprogramm importiert und das Integral der NMR-Resonanz der austauschenden

Protonen ins Verhältnis zum entsprechenden Integral des nicht austauschenden Protons gesetzt. Die

nicht lineare Regression der auf diese Weise berechneten relativen Integrale als Funktion der Zeit

erfolgt auf Grundlage von Gleichung (45) (Seite 69).

Temperaturabhängige Messungen

Temperaturabhängige Messungen von Enolisierungsraten erfolgten im Rahmen dieser Arbeit

für die AMADORI-Verbindungen der homologen ω-Aminosäuren. Die Messung der Enolisierungsraten

erfolgte hierbei simultan zur Messung konzentrationsgewichteter Ringöffnungsraten. Das hierfür

geschriebene Pulsprogramm („kfm-double-1hsst“) befindet sich im Anhang dieser Arbeit. Bei dem

resultierenden Spektrum handelt es sich um eine pseudo-2D-Matrix, welche nicht unmittelbar mit

Hilfe des AU-Programms „multi_integ3“ ausgewertet werden kann. Eine zur unter „Messungen bei

Raumtemperatur“ analoge Auswertung ist jedoch möglich, wenn zunächst das AU-Programm „split2D“

auf die pseudo-2D-Matrix angewendet wird. Die eindimensionalen NMR-Experimente, aus denen sich

die pseudo-2D-Matrix zusammensetzt, werden dabei als aufeinanderfolgend nummerierte

„PROCNOs“ innerhalb des „EXPNO“ Dateiordners abgelegt. Da das in TopSpin implementierte

AU-Programm „multicmd“ lediglich die Prozessierung fortlaufend nummerierter „EXPNOs“ erlaubt,

wurde dieses entsprechend für die Prozessierung fortlaufend nummerierter „PROCNOs“ angepasst.

Das resultierende AU-Programm („mpcmd“) befindet sich im Anhang.

6.3.6 SELEKTIVE SÄTTIGUNGSTRANSFER-NMR-SPEKTROSKOPIE (SST-NMR)

Die Messung von anomerenspezifischen Ringöffnungsraten erfolgte im Rahmen der

vorliegenden Arbeit mit Hilfe der selektiven Sättigungstransfer-NMR-Spektroskopie (SST-NMR). Die

Messung der Ringöffnungsraten erfolgte für D-Fructose in An- und Abwesenheit von L-Alanin und

L-Prolin, für D-Tagatose sowie für die AMADORI-Verbindungen Fructosylalanin und -prolin auf Grundlage

ihrer anomeren 13C-NMR-Resonanzen. Dabei kamen in jedem Falle [2-13C]-markierte Verbindungen

zum Einsatz. Im Falle der D-Glucose sowie der AMADORI-Verbindungen der homologen ω-Aminosäuren

wurden die NMR-Resonanzen der Protonen am jeweiligen C-1 ausgenutzt. Alle SST-NMR-Experimente

erfolgten an einem Bruker AVANCE 600 NMR-Spektrometer (Messfrequenz für Protonen 599.89 MHz)

mit einem 5 mm BBI-Probenkopf. Es wurden in jedem Fall quantitative Messbedingungen

(Relaxationsdelay von mindestens 5 ∙ 𝑇1 sowie inverse-gated decoupling) eingehalten. Vor der

Messung der milieuabhängigen Ringöffnungsraten wurden die Proben jeweils für mindestens 12 h bei

der Zieltemperatur gelagert, um sicherzustellen, dass das thermodynamische Anomerengleichgewicht

erreicht wurde. Lediglich im Falle der AMADORI-Verbindungen der homologen ω-Aminosäuren betrug

die Lagerungszeit rund eine Stunde.


- 123 -

Im Folgenden sind die im Einzelnen genutzten experimentellen Varianten der selektiven

Sättigungstransfer-NMR-Spektroskopie näher beschrieben.

6.3.6.1 FREQUENZ-SWEEP-SÄTTIGUNGSTRANSFER

Im Falle der Messung von Ringöffnungsraten der D-Glucose mit Hilfe der selektiven

Sättigungstransfer-NMR-Spektroskopie besteht das Problem, dass die Frequenz der zu sättigenden

anomeren Protonenresonanz des acyclischen Zentralisomers unbekannt ist. Es muss folglich eine

Blindsättigung erfolgen. Dazu muss jedoch zunächst die (ungefähre) Resonanzfrequenz des

entsprechenden anomeren Protons ermittelt werden. Zu diesem Zweck wurde ein Pulsprogramm

geschrieben („kfm-1hfqssst“; siehe Anhang), welches die Grundlage für den sogenannten

Frequenz-Sweep-Sättigungstransfer bildet. Es handelt sich hierbei um ein pseudo-2D-NMR-

Experiment, das sich aus aufeinanderfolgenden 1D-Experimenten zusammensetzt. Diese Experimente

unterscheiden sich in der Radiofrequenz der zur Sättigung verwendeten 90° GAUSS-Softpuls-Kaskade.

Die Sättigungszeit beträgt dabei für jedes Experiment 45 s und das spektrale Anregungsfenster jeweils

212 Hz. Die Radiofrequenz des selektiven Pulses nimmt von Experiment zu Experiment um jeweils

50 Hz zu. Der Frequenzscan erfolgt dabei im Verschiebungsbereich der 1H-NMR-Resonanzen von

Aldehydprotonen (hier: ca. 9.3 bis 10.5 ppm). Abbildung 38 zeigt ein beispielhaftes

Frequenz-Sweep-Sättigungstransfer-NMR Spektrum einer 200 mM D-Glucoselösung in Deuteriumoxid

bei einer Temperatur von 77 °C und einem pD-Wert von 5.0. Abgebildet ist die Intensität der anomeren 1H-NMR-Resonanz der α-D-Glucofuranose in Abhängigkeit der Frequenz des selektiven Radiopulses.

Der maximale Sättigungstransfer ist für eine Frequenz von 6150 Hz zu erkennen (entspricht einer

chemischen Verschiebung von 10.25 ppm bei einer Spektrometerfrequenz von 599.89 MHz).

Abbildung 38: Frequenz-Sweep-Sättigungstransfer-NMR Spektrum einer 200 mM D-Glucoselösung in Deuteriumoxid bei einer Temperatur von 77 °C und einem pD-Wert von 5.0. Abgebildet ist die Intensität der anomeren 1H-NMR-Resonanz der α-D-Glucofuranose in Abhängigkeit der Frequenz des selektiven Radiopulses. Der maximale Sättigungstransfer ist für eine Frequenz von 6150 Hz zu erkennen (entspricht einer chemischen Verschiebung von 10.25 ppm bei einer Spektrometerfrequenz von 599.89 MHz).

Auf diese Weise lässt sich die chemische Verschiebung einer unbekannten Protonenresonanz

bei einer Messfrequenz von 600 MHz auf ca. 0.1 ppm genau bestimmen. Die Bestimmung der

entsprechend zu sättigenden Protonenresonanz muss nach Änderungen des pD-Wertes und der

Temperatur jeweils neu erfolgen. Bei Kenntnis der Resonanzfrequenz ist die Durchführung eines

regulären Sättigungstransfer-NMR-Experimentes möglich.

6150 Hz (10.25 ppm)

Radiofrequenz [Hz]

Int.


- 124 -

6.3.6.2 1H-SST-NMR

Zur Messung von Ringöffnungsraten anhand des Sättigungstransfers von

Protonenresonanzen wurden zwei Pulsprogramme geschrieben („kfm-1hsst“ und „kfm-double-1hsst“;

siehe Anhang). Diese unterscheiden sich in der Anzahl der zu sättigenden Protonenresonanzen.

Sättigung einer Protonenresonanz

Im Falle reduzierender Zucker mit anomerem Proton ist die Sättigung der entsprechenden

Resonanzfrequenz hinreichend für die Messung von Ringöffnungsraten. Es kann das Pulsprogramm

„kfm-1hsst“ genutzt werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde dieses Experiment zur

Messung der anomerenspezifischen Ringöffnungsraten der Anomere der D-Glucose verwendet. Der

Sättigungstransfer wird in Abhängigkeit der Sättigungszeiten im Intervall von 0 bis 73 s für insgesamt

16 Zeiten gemessen. Das spektrale Anregungsfenster des 90° GAUSS-Pulses beträgt 212 Hz. Die

Messung erfolgt mit einer FID-Auflösung von 0.18 Hz pro Datenpunkt bei einer Gesamtzahl an

Datenpunkten von 64 k. Die erhaltene pseudo-2D-Matrix wird nach zero filling FOURIER-transformiert,

phasen- und basislinienkorrigiert. Die Integration der relevanten NMR-Resonanzen erfolgt mit Hilfe

des AU-Programms „decon_t1“. Die Berechnung der Ringöffnungsraten erfolgt numerisch auf

Grundlage von Gleichung (21) (Seite 32).

Sättigung zweier Protonenresonanzen

Im Falle der AMADORI-Verbindungen liegt kein anomeres Proton vor. Die Messung von

Ringöffnungsraten unter Nutzung anomerer NMR-Resonanzen kann daher nur über die 13C-NMR-Spektroskopie erfolgen. Hierzu ist jedoch die Nutzung isotopenmarkierter Verbindungen

notwendig. Alternativ kann eine Messung anomerengewichteter Ringöffnungsraten über die 1H-NMR-Spektroskopie unter Nutzung der NMR-Resonanzen der Protonen am C-1 erfolgen. Hierbei

handelt es sich um ein AB-Spinsystem, dessen Protonenresonanzen sich um rund 75 Hz unterscheiden.

Es kann daher angenommen werden, dass ein selektiver Puls nur zu einer unzureichenden Anregung

beider Protonenresonanzen führen würde. Aufgrund dessen wurde ein zweites Pulsprogramm

geschrieben, bei dem durch die Schaltung zweier aufeinanderfolgender selektiver Pulse

unterschiedlicher Frequenzen beide NMR-Resonanzen des AB-Spinsystems des acyclischen

Zentralisomers alternierend angeregt und damit gesättigt werden („kfm-double-1hsst“). Der

Sättigungstransfer findet dabei auf die entsprechenden Protonenresonanzen der cyclischen Anomere

statt. Diese sind weitestgehend isochron, weshalb die Auswertung des zeitabhängigen

Sättigungstransfers lediglich anomerengewichtete Ringöffnungsraten liefert. Es zeigte sich, dass der

H/D-Austausch im Falle der AMADORI-Verbindungen der homologen ω-Aminosäuren dabei so schnell

ist, dass die Intensitätsabnahme der beobachteten Protonenresonanz nicht nur auf Grundlage des

Sättigungstransfers, sondern zu einem gewissen Anteil auch aufgrund des H/D-Austausches erfolgte.

Entsprechend wurden im Laufe eines pseudo-2D-Experimentes in regelmäßigen Abständen

Einzelexperimente eingeschoben, bei denen keine Sättigung erfolgte. Über die zeitabhängige

Änderung des Integrals ohne Sättigung lassen sich damit Enolisierungsraten ermitteln. Werden die

Integrale der unter Einfluss der Sättigung gemessenen Spektren entsprechend um den Anteil des

H/D-Austausches korrigiert, ergeben sich aus deren Abhängigkeit von der Sättigungsdauer die

anomerengewichteten Ringöffnungsraten. Der Sättigungstransfer wird in Abhängigkeit der

Sättigungszeiten im Intervall von 0 bis 12 s für insgesamt 32 Zeiten gemessen. Das spektrale

Anregungsfenster des 90° GAUSS-Pulses beträgt 60.6 Hz. Die Messung erfolgt mit einer FID-Auflösung


- 125 -

von 0.16 Hz pro Datenpunkt bei einer Gesamtzahl an Datenpunkten von 64 k. Die erhaltene

pseudo-2D-Matrix wird nach zero filling FOURIER-transformiert, phasen- und basislinienkorrigiert. Die

Integration der relevanten NMR-Resonanzen erfolgt mit Hilfe des AU-Programms „decon_t1“. Die

Berechnung von Ringöffnungsraten erfolgt numerisch auf Grundlage von Gleichung (21) (Seite 32). Die

Berechnung von Enolisierungsraten erfolgt numerisch auf Grundlage von Gleichung (45) (Seite 69).

6.3.6.3 13C-SST-NMR

Zur Messung des Sättigungstransfers von 13C-NMR-Resonanzen wurde ein Pulsprogramm

geschrieben, mit dessen Hilfe die Messung des Sättigungstransfers unter quantitativen Bedingungen

möglich ist („kfm-13csst_nonoe“; siehe Anhang). Dafür erfolgt die Protonenentkopplung der 13C-NMR-Resonanzen mittels inverse-gated decoupling. Eine Protonenentkopplung während der

selektiven Sättigung der anomeren 13C-NMR-Resonanz des acyclischen Zentralisomers der jeweils

untersuchten Ketosen ist nicht notwendig, da die 2J(13C,1H)-Kopplung lediglich im Bereich von rund 1

bis 12 Hz liegt.[191] Soll hingegen die NMR-Resonanz eines nicht quartären Kohlenstoffatoms gesättigt

werden, so kann das oben genannte Pulsprogramm nicht genutzt werden. Dies liegt darin begründet,

dass 1J(13C,1H)-Kopplungen in der Größenordnung von ca. 120 bis 220 Hz liegen.[191] Für die primären

Kohlenstoffatome des Dimethylformamids würde die Nutzung des Pulsprogrammes beispielsweise

dazu führen, dass keinerlei Sättigung erfolgen würde, da der selektive Puls das Zentrum des

Quadrupletts träfe, bei dem jedoch keine 13C-NMR-Resonanz vorliegt. In solchen Fällen kann das

Pulsprogramm auf zweierlei Weise umgeschrieben werden. Entweder es erfolgt – analog zu

„kfm-double-1hsst“ – die alternierende Schaltung selektiver Pulse unterschiedlicher Frequenzen, die

jeweils den Frequenzen der Einzelresonanzen des Multipletts entsprechen. Oder der Entkopplerkanal

für die Protonenentkopplung wird bereits vor Beginn der Sättigung eingeschaltet, sodass das

Multiplett vor Beginn der Sättigung kollabiert. Dies hat allerdings zur Folge, dass der

Kern-OVERHAUSER-Effekt Einfluss auf die Signalintensitäten nimmt. Damit dieser Einfluss für jede

Sättigungsdauer möglichst identisch ist, empfiehlt es sich dabei, den Entkopplerkanal bereits während

des Relaxationsdelays einzuschalten. Entsprechende Pulsprogramme für beide Versuchsvarianten

wurden im Rahmen dieser Arbeit zu Versuchszwecken geschrieben und befinden sich ebenfalls im

Anhang („kfm-13cdosst_nonoe“ und „kfm-13csst“).

Alle im Rahmen dieser Arbeit quantitativ ausgewerteten Experimente des

kohlenstoffbasierten selektiven Sättigungstransfers beruhen auf dem Pulsprogramm

„kfm-13csst_nonoe“. Der Sättigungstransfer wurde in den meisten Fällen in Abhängigkeit der

Sättigungsdauer im Intervall von 0 bis 73 s für insgesamt 25 Zeiten gemessen. Das spektrale

Anregungsfenster des 90° GAUSS-Pulses beträgt 212 Hz. Die Messung erfolgt mit einer FID-Auflösung

von 0.46 Hz pro Datenpunkt bei einer Gesamtzahl an Datenpunkten von 128 k. Die erhaltene

pseudo-2D-Matrix wird nach zero filling FOURIER-transformiert, phasen- und basislinienkorrigiert. Die

Integration der relevanten NMR-Resonanzen erfolgt mit Hilfe des AU-Programms „decon_t1“. Die

Berechnung der Ringöffnungsraten erfolgt numerisch auf Grundlage von Gleichung (21) (Seite 32).

6.4 Potentiometrische Bestimmung der 𝑝𝐾𝑠-Werte

Es wird eine 0.1 M Lösung der zu untersuchenden Substanz in 0.1 M Salzsäure hergestellt.

20 mL dieser Lösung werden in einem schmalen hohen Becherglas mit 25 mL bidest. Wasser versetzt

und mit Hilfe eines Titrationsautomaten mit 0.1 M Natronlauge titriert. Die Messdaten (pH-Wert gegen


- 126 -

titriertes Volumen der Maßlösung) werden automatisch registriert und als csv-Datei gespeichert. Diese

kann im Anschluss an die Messung mit einem Tabellenkalkulationsprogramm geöffnet werden. Die

erste Ableitung der Titrationskurve zeigt Maxima für die jeweiligen Äquivalenzpunkte und Minima für

die 𝑝𝐾𝑠-Werte. Die Ermittlung der 𝑝𝐾𝑠-Werte erfolgt graphisch.

6.5 Polarimetrische Messungen

Es wird die in Tabelle 22 aufgelistete Masse der entsprechenden (Amino-) Säure in 80 mL

bidest. Wasser gelöst und der pH-Wert (pH 1.5, pH 2.5, pH 3.5, pH 4.5, pH 5.5 oder pH 6.5) mit

verdünnter Salzsäure bzw. Natronlauge möglichst genau eingestellt. Die Lösung wird quantitativ in

einen 100 mL Maßkolben überführt. Es werden 4.504 g D-Fructose in ein Becherglas eingewogen und

unter kräftigem Rühren in 47.5 mL der vorbereiteten Aminosäurelösung bzw. bidest. Wasser gelöst

(ergibt 50 mL Endvolumen und damit eine Konzentration an (Amino-) Säure und D-Fructose von je

0.5 mol/L). Ein Teil dieser Lösung wird rasch in eine Polarimeterküvette überführt und ihre optische

Rotation bei einer Wellenlänge von 589 nm in Abhängigkeit der Zeit über eine Dauer von rund einer

Stunde manuell protokolliert. Der übrige Teil der Lösung wird parallel dazu genutzt, den tatsächlich

resultierenden pH-Wert sowie die Temperatur der Lösung zu messen. Auch diese werden protokolliert.

Die nicht lineare Regression der protokollierten Daten erfolgt auf Grundlage von Gleichung (55)

(Seite 96) mit Hilfe des Solver Add-Ins von Microsoft Excel 2016. Dabei werden die

Geschwindigkeitskonstanten 𝑘𝑣𝐴,𝛽𝑃 und 𝑘𝛽𝑃,𝑣𝐴 numerisch berechnet. Die Summe der beiden

Konstanten stellt die Mutarotationsrate dar. Bei 𝑘𝛽𝑃,𝑣𝐴 handelt es sich um die Ringöffnungsrate der

β-D-Fructopyranose. Diese ist der für die vorliegende Arbeit relevante Parameter.

Tabelle 22: Einwaagen der (Amino-) Säuren für polarimetrische Messungen der Ringöffnungsraten der β-D-Fructopyranose in Anwesenheit stöchiometrischer Mengen an (Amino-) Säuren.

(Amino-) Säure Einwaage [g]

L-Alanin 4.455 L-Prolin 5.757 Glycin 3.754

β-Alanin 4.455 γ-Aminobuttersäure 5.156

Taurin 6.257 Natrium-Formiat 3.401 Natrium-Acetat 4.102

6.6 Geräte

Tabelle 23: Im Verlauf der Arbeit genutzte Geräte.

Gerät Hersteller und Typ

NMR-Spektroskopie

Spektrometer (500 MHz) AVANCE III 500 mit 5 mm BBO Probenkopf mit z-Gradient, Bruker

Spektrometer (600 MHz) AVANCE 600 mit 5 mm BBI Probenkopf mit z-Gradient, Bruker

Variable Temperierungseinheit BVT 3000 DIGITAL, Bruker

Kühleinheit B – CU 05, Bruker


- 127 -

NMR-Probenröhrchen Norell® ST 500-7 (5 mm)

pH-Meter Five EasyTM FE20, Mettler-ToledoTM

pH-Elektrode BioTrode, Hamilton

Trockenschrank Köttermann® 2715

UV/Vis-Messungen

Spektralphotometer Specord® 200 Plus, Analytik Jena AG

pH-konstante Modellreaktionen

Titrationsautomat DMS Titrino 716 mit pH-Elektrode, Metrohm

pH-Elektrode Unitrode 6.0259.100, Metrohm

Polarimetrie

Polarimeter Polarimeter P1000-LED, A. KRÜSS OPTRONIC

pH-Meter inoLab pH 720 WTW series

pH-Elektrode SenTix® 81 WTW Glaselektrode

HPLC (D-Fructose)

Säule EC 250/3 Nucleodur® HILIC, Macharey Nagel

Pumpe 1100 Series G1311A Quaternary Pump, Agilent

Entgaser DG-2080-53 3-Line degasser, Jasco

Säulenofen Column Blockheater, Jones Chromatography

Detektor 1100 Series G1362A RID, Agilent

Automatischer Probengeber 1050 Series Autosampler, Hewlett Packard

HPLC (Aminosäuren)

Säule EC 250/4.6 Nucleosil® 120-5 C18, Macharey Nagel






HPLC (AMADORI-Verbindungen)

Säule

1. YMC-Pack ODS-AM AM-303 AM12S05-2546WT 250 x 4.6 mm T.D. S-5micrometer, 12 nm, YMC 2. ODS Hypersil 120 A 5 micrometer 15 x 4.6 mm, VDS optilab






HPLC (α-Dicarbonylverbindungen)

Säule EC 250/4.6 Nucleosil® 120-5 C18, Macharey Nagel

Pumpe 1100 Series G1312A Binary Pump, Agilent

Entgaser 1100 Series G1379A Degasser, Agilent


- 128 -

Säulenofen 1100 Series G1316A Thermostatted Column Compartment, Agilent

Detektor 1100 Series G1315B DAD, Agilent

Automatischer Probengeber 1100 Series G1313A ALS, Agilent

Bestimmung von 𝑝𝐾𝑠-Werten

Titrationsautomat Automatischer Titrator TitroLine® 5000, SI Analytics

pH-Elektrode A 162 2M-DIN-ID, SI Analytics

Synthesen

Gefriertrocknungsanlage Alpha 2-4, Martin Christ

6.7 Software

Tabelle 24: Im Verlauf der Arbeit genutzte Software.

Software Herausgeber

NMR-Spektroskopie

TopSpin 1.3 Bruker

TopSpin 2.1 Bruker

TopSpin 3.1 Bruker

TopSpin 3.2 pL 6 Bruker

TopSpin 3.5 pL 2 Bruker

Spektralphotometrie

WinAspect Plus Version: 4.1.0.0 Analytik Jena AG

HPLC

ChemStation Rev. A. 10.02 Agilent

Berechnung von 𝑝𝐾𝑠-Werten

Percepta (Testlizenz) ACD/Labs

Tabellenkalkulation

EXCEL 2016 Microsoft

Solver (Add-In für Microsoft Excel) Microsoft

XLSTAT 2017 Version (19.2.01) (Statistik-Analyse Add-In für Microsoft Excel 2016)

Addinsoft

XNUMBERS Ver 6.0.5.6M (Add-In für Microsoft Excel) John Beyer

„matrix.xla“ (Matrixerweiterung des Microsoft Excel Add-Ins XNUMBERS Ver 6.0.5.6M)

Foxes Team

Textverarbeitung

Word 2016 Microsoft

Zeichnen chemischer Strukturen

ChemBioDraw Ultra 14.0 PerkinElmer

Literaturverwaltung

Citavi 5 Swiss Academic Software


- 129 -

6.8 Chemikalien

Tabelle 25: Im Verlauf der Arbeit genutzte Chemikalien.

Chemikalie Hersteller Reinheit bzw. Gehalt

1,2-Ethandiol in DMSO-d6 (99.9 atom%) Sigma-Aldrich 80%

Aceton Fisher Scientific 99.99%

Acetonitril VWR Chemicals > 99.9%

Acetonitril Carl Roth ≥ 99.9%

β-Alanin Sigma-Aldrich 99%

L-Alanin Carl Roth ≥ 99%

γ-Aminobuttersäure Alfa Aesar 97%

Ammoniaklösung Merck 25%

DL-Äpfelsäure Fluka > 99%

n-Butanol Merck ≥ 99.5%

Citronensäure Carl Roth ≥ 99.5%

Deuteriumchlorid in D2O (99 atom%) Sigma-Aldrich 35%

Deuteriumoxid Sigma-Aldrich 99.9%

Deuteriumoxid Acros organics 99.9%

Deuteriumoxid Chemotrade 99.98%

Deuteriumoxid euriso-top 99.9%

Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat Merck ≥ 99.5%

Dowex® 50WX8 (200 – 400 mesh) Sigma-Aldrich –

Essigsäure VWR Chemicals 100%

Ethanol (vergällt) VWR Chemicals 99%

FREMYS Salz (Kaliumnitrosodisulfonat) Sigma-Aldrich –

D-Fructose (wasserfrei) Carl Roth > 99.5%

D-[2-13C]Fructose (99 atom%) Omicron Biochemicals 99.8%

D-Glucose (wasserfrei) Carl Roth ≥ 99.5%

D-[2-13C]Glucose (99 atom%) Omicron Biochemicals ≥ 99.9%

Glycin Fluka purum

Hexansulfonsäure Dionex 0.10 mol/L

Kaliumdihydrogenphosphat Merck ≥ 99.5%

Malonsäure Sigma-Aldrich 99%

Maltol Sigma-Aldrich ≥ 99%

Methanol VWR Chemicals ≥ 99.8%

Natrium-Acetat Merck ≥ 99%

Natrium-Deuteroxid in D2O (99 atom%) Sigma-Aldrich 30%

Natrium-Formiat Fluka > 99%

Natrium-Pyrosulfit Polskie Odczynniki Chem.-Gliwice, Polen

puriss.

Ninhydrin Fluka > 99%

ortho-Phenylendiamin Fluka ≥ 99%


- 130 -

Pivalinsäure Sigma-Aldrich 99%

L-Prolin Sigma-Aldrich ≥ 99%

Salzsäure VWR Chemicals 37%

D-Tagatose Sigma-Aldrich ≥ 98.5%

D-[2-13C]Tagatose (99 atom%) Omicron Biochemicals 99.9%

Taurin Sigma-Aldrich ≥ 99%

wässrige Natriumhydroxidlösung Bernd Kraft 0.1 mol/L

wässrige Salzsäurelösung Bernd Kraft 0.1 mol/L

1-Desoxyglucoson-Chinoxalin Synthetisiert und bereitgestellt von den Mitarbeitern des Fachgebietes Lebensmittelchemie und Analytik

(AK Prof. Kroh) des Instituts für Lebensmitteltechnologie und Lebensmittelchemie

der Technischen Universität Berlin

3-Desoxygalactoson-Chinoxalin

3-Desoxyglucoson-Chinoxalin

D-Glucoson-Chinoxalin

LITERATURVERZEICHNIS

i

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ABBILDUNGSVERZEICHNIS

xxvi

Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Zeitliche Entwicklung der Anzahl der in SciFinder® gelisteten Publikationen zu den

Suchbegriffen „Glucose“ und „Maillard reaction“ seit 1856. ..................................... 1

Abbildung 2: Graphische Darstellung verschiedener Pulsprogramme zur Protonen-

Breitbandentkopplung von 13C-NMR-Spektren.* a) inverse-gated decoupling,

b) gated decoupling, c) power-gated decoupling. (Der Entkopplerkanal ist jeweils

oben und der X-Kernkanal unten abgebildet.) *Die graphischen Darstellungen sind der

Software Bruker TopSpin 3.5 pL 2 entlehnt. ……………………………………………………………………... 25

Abbildung 3: Modellvorstellung der Sättigung einer Kernresonanz für den Fall 𝑇1(𝑖) ≫ 𝑇2

(𝑖). (blaue

Pfeile: z-Magnetisierung; rote Pfeile: Quermagnetisierung) .................................... 33

Abbildung 4: Abbauraten der D-Fructose 1a in 0.5 M Lösung in An- und Abwesenheit

stöchiometrischer Mengen der Aminosäuren 4a-4e in Abhängigkeit des pH-Wertes

bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C. (Die gestrichelte Linie gibt die Grenze an, ab

der Abbaureaktionen messbar sind. Die gepunktete Linie gibt die Grenze an, ab der

Abbauraten quantifiziert werden können. Datenpunkte oberhalb der gepunkteten

Linie sind somit für quantitative Vergleiche nutzbar.) .............................................. 43

Abbildung 5: Abbauraten der Aminosäuren 4a-4e in 0.5 M Lösung in Anwesenheit

stöchiometrischer Mengen an D-Fructose 1a in Abhängigkeit des pH-Wertes bei einer

Temperatur von (90 ± 2) °C. (Die gestrichelte Linie gibt die Grenze an, ab der

Abbaureaktionen messbar sind. Die gepunktete Linie gibt die Grenze an, ab der

Abbauraten quantifiziert werden können. Datenpunkte oberhalb der gepunkteten

Linie sind somit für quantitative Vergleiche nutzbar.) .............................................. 44

Abbildung 6: Abbauraten der AMADORI-Verbindungen 6a-6e in 0.025 M Lösung in Abhängigkeit des

pH-Wertes bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C. (Die gestrichelte Linie gibt die

Grenze an, ab der Abbaureaktionen messbar sind. Die gepunktete Linie gibt die

Grenze an, ab der Abbauraten quantifiziert werden können. Datenpunkte oberhalb

der gepunkteten Linie sind somit für quantitative Vergleiche nutzbar.) .................. 45

Abbildung 7: Zeitabhängiger Verlauf der Konzentration von D-Glucoson 9d bei der Reaktion von

D-Fructose 1a mit β-Alanin 4d (je 0.5 M) bei pH 6.5 während der Aufheizphase der

Reaktionslösung von Raumtemperatur auf 90 °C. Bei einer Temperatur von 90 °C

erfolgte die Zugabe eines Reduktions- (Maltol) bzw. Oxidationsmittels (FREMYS Salz)

(je 0.05 M). Eine dritte Reaktionslösung diente als Kontrolle. Die logarithmische

Skalierung der Ordinatenachse ist zu beachten. ...................................................... 47

Abbildung 8: Zeitabhängiger Verlauf der Konzentration von 3-Desoxyglucoson 9b bei der Reaktion

von D-Fructose 1a mit β-Alanin 4d (je 0.5 M) bei pH 6.5 während der Aufheizphase

der Reaktionslösung von Raumtemperatur auf 90 °C. Bei einer Temperatur von 90 °C

erfolgte die Zugabe eines Reduktions- (Maltol) bzw. Oxidationsmittels (FREMYS Salz)

(je 0.05 M). Eine dritte Reaktionslösung diente als Kontrolle. Die logarithmische



xxvii

Abbildung 9: Bildungsraten von 3-Desoxyglucoson 9b in Reaktionslösungen der D-Fructose 1a in

An- und Abwesenheit äquimolarer Mengen der Aminosäuren 4a-4e (je 0.5 M) in

Abhängigkeit des pH-Wertes bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C. ........................ 50

Abbildung 10: Bildungsraten von 1-Desoxyglucoson 9a in Reaktionslösungen der D-Fructose 1a in

An- und Abwesenheit äquimolarer Mengen der Aminosäuren 4a-4e (je 0.5 M) in

Abhängigkeit des pH-Wertes bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C. ........................ 51

Abbildung 11: Bildungsraten von 3-Desoxyglucoson 9b in Reaktionslösungen der

AMADORI-Verbindungen 6a-6e (je 0.025 M) in Abhängigkeit des pH-Wertes bei einer

Temperatur von (90 ± 2) °C. Die logarithmische Skalierung der Ordinatenachse ist zu

beachten. .................................................................................................................. 52

Abbildung 12: Bildungsraten von 1-Desoxyglucoson 9a in Reaktionslösungen der

AMADORI-Verbindungen 6a-6e (je 0.025 M) in Abhängigkeit des pH-Wertes bei einer

Temperatur von (90 ± 2) °C. Die logarithmische Skalierung der Ordinatenachse ist zu

beachten. .................................................................................................................. 52

Abbildung 13: Raten der Extinktionszunahme bei 284 nm (Geschwindigkeit der frühen

MAILLARD-Reaktion) in Abhängigkeit des pH-Wertes für Modellreaktionen der

D-Fructose 1a in An- und Abwesenheit äquimolarer Mengen der Aminosäuren 4a-4e

bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C. ....................................................................... 54

Abbildung 14: Raten der Extinktionszunahme bei 420 nm (Geschwindigkeit der fortgeschrittenen


D-Fructose 1a in An- und Abwesenheit äquimolarer Mengen der Aminosäuren 4a-4e

bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C. ....................................................................... 54

Abbildung 15: Raten der Extinktionszunahme bei 284 nm (Geschwindigkeit der frühen


D-Fructose 1a sowie der AMADORI-Verbindungen 6a-6e bei einer Temperatur von

(90 ± 2) °C. ................................................................................................................. 55

Abbildung 16: Raten der Extinktionszunahme bei 420 nm (Geschwindigkeit der fortgeschrittenen


D-Fructose 1a sowie der AMADORI-Verbindungen 6a-6e bei einer Temperatur von

(90 ± 2) °C. ................................................................................................................. 56

Abbildung 17: Abhängigkeit der chemischen Verschiebungen von C-3 und H-C-3 der β-pyranoiden

Anomere 6(ii) von der Anzahl der Methyleneinheiten zwischen der Amino- und der

Carboxylfunktion. ...................................................................................................... 62

Abbildung 18: 1H-NMR-Spektrum einer 0.5 M Lösung von FAla 6a nach mehrstündiger Reaktion bei

87 °C und einem pD-Wert von 3.0 (entspricht pH 2.8). Es ist zu erkennen, dass HMF

13 als Folge des Abbaus von FAla 6a gebildet wird. Die Protonen am C-1, C-3 und C-4

unterliegen dabei einem teilweisen Deuteriumaustausch. Die relativen Flächen der

NMR-Signale sind in Rot angegeben. Neben 3J(H,H)-Kopplungen sind aufgrund der

Isotopenmarkierung am C-2 auch 2J(C,H)- und 3J(C,H)-Kopplungen erkennbar. ...... 66

Abbildung 19: Overlay von Ausschnitten der HPLC-DAD-Chromatogramme (@ 317 nm) der

AMADORI-Verbindungen 6a-6e, die in 0.025 M Lösungen für drei Stunden bei einer

Temperatur von (90 ± 2) °C und einem pH-Wert von 2.5 zur Reaktion gebracht

wurden. Es handelt sich um die Signale der mittels ortho-Phenylendiamin


xxviii

derivatisierten α-Dicarbonylverbindungen 3-Desoxyglucoson 9b (Signal 1)

und -galactoson 9c (Signal 2), die aus dem Abbau der AMADORI-Verbindungen 6a-6e

hervorgehen. ............................................................................................................. 67

Abbildung 20: Overlay von Ausschnitten der HPLC-DAD-Chromatogramme (@ 317 nm) von 0.025 M

Lösungen des Fructosylglycins 6c, die bei verschiedenen pH-Werten für drei Stunden

bei einer Temperatur von (90 ± 2) °C zur Reaktion gebracht wurden. Es handelt sich

um die Signale der mittels ortho-Phenylendiamin derivatisierten

α-Dicarbonylverbindungen 3-Desoxyglucoson 9b (Signal 1) und -galactoson 9c

(Signal 2), die aus dem Abbau der AMADORI-Verbindung 6c hervorgehen. .............. 68

Abbildung 21: Rate der 1,2-Enolisierung von Fructosylalanin 6a und -prolin 6b in Abhängigkeit des

pD-Wertes bei Raumtemperatur, gemessen mittels quantitativer 1H-NMR-Spektroskopie über einen Zeitraum von 24 Tagen. Die logarithmische


Abbildung 22: Gegenüberstellung der Raten der 1,2-Enolisierung und der Bildung von

3-Desoxyglucoson 9b für Fructosylglycin 6c, -β-alanin 6d und -γ-aminobuttersäure 6e

für einen pH- bzw. pD-Wert von 4.5 und eine Temperatur von 90 °C. ..................... 71

Abbildung 23: Teilausschnitt des anomeren Verschiebungsbereiches eines deconvolierten 13C-NMR-Spektrums von Fructosyl-β-alanin 6d. ....................................................... 71

Abbildung 24: Nachweis der reversiblen 1,2-Enolisierung für D-Fructose 1a anhand der

Hochfeldverschiebung anomerer 13C-NMR-Resonanzen durch den H/D-Austausch am

C-1. ............................................................................................................................ 73

Abbildung 25: Gegenüberstellung der konzentrationsgewichteten Ringöffnungsraten und der Raten

der 1,2-Enolisierung von Fructosylglycin 6c, -β-alanin 6d und -γ-aminobuttersäure 6e

für einen pD-Wert von 4.5 und eine Temperatur von 57 °C. .................................... 74

Abbildung 26: Anomerer Bereich des 1H-NMR-Spektrums von D-Glucose 2a bei einer Messfrequenz

von 600 MHz bei 67 °C und einem pD-Wert von 5.0. Bei den mit * gekennzeichneten

Signalen handelt es sich um die 13C-Satteliten der NMR-Resonanzen der pyranoiden

Hauptisomere. ........................................................................................................... 82

Abbildung 27: Sättigungstransfer-NMR-Differenzspektrum der D-Glucose 2a bei selektiver Sättigung

der Protonenresonanzen bei ca. 10.33 ppm mit Hilfe einer 90° GAUSS-Softpuls-

Kaskade einer Dauer von 60 s und einer spektralen Anregungsbreite von 212 Hz.

Gemessen bei 600 MHz bei einer Temperatur von 87 °C und pD 2.55. Der mit *

gekennzeichnete Verschiebungsbereich zeigt typische symmetrische

Differenzsignale. Diese sind für Protonenresonanzen zu beobachten, für die kein

Sättigungstransfer erfolgt. ........................................................................................ 82

Abbildung 28: Vergleich der pD-abhängigen Ringöffnungsraten von Anomeren der D-Fructose 1a in

An- und Abwesenheit stöchiometrischer Mengen von L-Alanin 4a für eine

Temperatur von 37 °C. a) Vergleichende Darstellung für β-D-Fructopyranose 1a(ii).

b) Vergleichende Darstellung für β-D-Fructofuranose 1a(iv).................................... 88

Abbildung 29: Vergleich der pD-abhängigen Ringöffnungsraten der α-furanoiden Anomere der

D-Glucose 2a, D-Fructose 1a und D-Tagatose 1b für eine Temperatur von 37 °C. Die

logarithmische Skalierung der Ordinatenachse ist zu beachten. .............................. 89


xxix

Abbildung 30: Vergleich der pD-abhängigen Ringöffnungsraten der β-furanoiden Anomere der

D-Fructose 1a sowie des Fructosylalanins 6a und -prolins 6b für eine Temperatur von

37 °C. ......................................................................................................................... 90

Abbildung 31: ACuSTiC-Werte von D-Fructose 1a in An- und Abwesenheit stöchiometrischer

Mengen an L-Alanin 4a und L-Prolin 4b sowie die der entsprechenden

AMADORI-Verbindungen 6a und 6b in Abhängigkeit des pD-Wertes für eine

Temperatur von 90 °C. .............................................................................................. 91

Abbildung 32: ACuSTiC-Werte von D-Fructose 1a, D-Tagatose 1b und D-Glucose 2a in Abhängigkeit

des pD-Wertes für eine Temperatur von 100 °C. a) Lineare Skalierung der

Ordinatenachse, mit gesonderter Ordinate für D-Glucose 2a. b) Logarithmische

Skalierung der Ordinatenachse. ................................................................................ 92

Abbildung 33: Vergleich der Geschwindigkeiten der frühen MAILLARD-Reaktion, gemessen als Rate

der Extinktionszunahme bei einer Wellenlänge von 284 nm, von D-Fructose 1a und

D-Glucose 2a in Abhängigkeit des pD-Wertes für eine Temperatur von (90 ± 2) °C

sowie Reaktivitätsverhältnisse der Zucker, berechnet auf Grundlage ihrer

ACuSTiC-Werte. ......................................................................................................... 93

Abbildung 34: Zeitabhängiger Verlauf der Äquilibrierung der Isomere der D-Fructose 1a nach dem

Lösen der β-D-Fructopyranose 1a(ii) bei einer Temperatur von 22 °C und einem

pD-Wert von 4.0, berechnet auf Grundlage der thermodynamischen (Aktivierungs-)

Parameter der D-Fructose 1a unter Nutzung von Gleichung (7). ............................. 94

Abbildung 35: Linearer Zusammenhang der logarithmierten spontanen Ringöffnungsraten der

β-D-Fructopyranose 1a(ii) in Anwesenheit verschiedener Katalysatoren (L-Alanin 4a,

L-Prolin 4b, Glycin 4c, β-Alanin 4d, γ-Aminobuttersäure 4e, Na-Formiat, Na-Acetat,

Taurin) in Abhängigkeit von deren Säurekonstanten. .............................................. 97

Abbildung 36: pH-Abhängiger Verlauf der Ringöffnungsraten der β-D-Fructopyranose 1a(ii) in

Anwesenheit stöchiometrischer Mengen von Katalysatoren mit verschiedenen

𝑝𝐾𝑠-Werten bei 22 °C, berechnet auf Grundlage der in Tabelle 13 gegebenen

BRØNSTED-Parameter, den 𝑝𝐾𝑠-Werten der β-D-Fructopyranose 1a(ii) (𝑝𝐾𝑠1 = −2.60

und 𝑝𝐾𝑠2 = 11.96)[298,343] sowie den 𝑝𝐾𝑠-Werten möglicher Katalysatoren mit Hilfe

von Gleichung (38). ................................................................................................... 99

Abbildung 37: Ringöffnungsraten der β-D-Fructopyranose 1a(ii) bei 22 °C in Anwesenheit

stöchiometrischer Mengen von DL-Äpfel- und Citronensäure (jeweils gemessen und

berechnet). Die Messungen erfolgten mittels Polarimetrie. Die Berechnungen

erfolgten auf Grundlage der BRØNSTED-Parameter (Tabelle 13), der 𝑝𝐾𝑠-Werte der

β-D-Fructopyranose 1a(ii)[298,343] sowie der 𝑝𝐾𝑠-Werte der DL-Äpfel- und

Citronensäure.[14]..................................................................................................... 100

Abbildung 38: Frequenz-Sweep-Sättigungstransfer-NMR Spektrum einer 200 mM D-Glucoselösung

in Deuteriumoxid bei einer Temperatur von 77 °C und einem pD-Wert von 5.0.

Abgebildet ist die Intensität der anomeren 1H-NMR-Resonanz der α-D-Glucofuranose

in Abhängigkeit der Frequenz des selektiven Radiopulses. Der maximale

Sättigungstransfer ist für eine Frequenz von 6150 Hz zu erkennen (entspricht einer

chemischen Verschiebung von 10.25 ppm bei einer Spektrometerfrequenz von

599.89 MHz). ........................................................................................................... 123

TABELLENVERZEICHNIS

xxx

Tabellenverzeichnis Tabelle 1: 𝑝𝐾𝑠-Werte der untersuchten Aminosäuren 4a-4e. ....................................................... 44

Tabelle 2: 𝑝𝐾𝑠-Werte der untersuchten AMADORI-Verbindungen 6a-6e. ....................................... 45

Tabelle 3: Temperaturabhängigkeit der Linienbreite der anomeren 13C-NMR-Signale der

α-pyranoiden Anomere der [2-13C]-markierten AMADORI-Verbindungen 6a und 6b. .... 58

Tabelle 4: Chemische Verschiebungen der 13C-NMR-Resonanzen der untersuchten Derivate der

D-Fructose.a,b .................................................................................................................. 59

Tabelle 5: Chemische Verschiebungen der 1H-NMR-Resonanzen der untersuchten Derivate der

D-Fructose.a .................................................................................................................... 60

Tabelle 6: Geminale und vicinale homonukleare 1H-Kopplungskonstanten der untersuchten

Derivate der D-Fructose.a,b ............................................................................................. 61

Tabelle 7: 𝑝𝐾𝑠-Werte von Norleucin und ε-Aminocapronsäure. ................................................... 76

Tabelle 8: Thermodynamische Parameter der Anomerengleichgewichte der untersuchten

Zuckersysteme. Teil 1: Enthalpiedifferenzen. Alle Werte sind in kJ/mol angegeben. Bei

den angegebenen Fehlern handelt es sich um die Standardfehler der geschätzten

Parameter. ...................................................................................................................... 83

Tabelle 9: Thermodynamische Parameter der Anomerengleichgewichte der untersuchten

Zuckersysteme. Teil 2: Entropiedifferenzen. Alle Werte sind in J/(K·mol) angegeben. Bei


Parameter. ...................................................................................................................... 83

Tabelle 10: Thermodynamische Aktivierungsparameter der Ringöffnung der untersuchten

Zuckeranomere. Teil 1: Aktivierungsenthalpie. Alle Werte sind in kJ/mol angegeben. Bei


Parameter. ...................................................................................................................... 86

Tabelle 11: Thermodynamische Aktivierungsparameter der Ringöffnung der untersuchten

Zuckeranomere. Teil 2: Aktivierungsentropie. Alle Werte sind in J/(K·mol) angegeben.

Bei den angegebenen Fehlern handelt es sich um die Standardfehler der geschätzten

Parameter. ...................................................................................................................... 87

Tabelle 12: 𝑝𝐾𝑠-Werte der untersuchten Säuren. ............................................................................ 97

Tabelle 13: BRØNSTED-Parameter der Ringöffnungsraten ionischer Spezies der β-D-Fructopyranose

1a(ii) für 22 °C. ............................................................................................................... 98

Tabelle 14: Einwaagen der Aminosäuren für pH-kontrollierte Modellreaktionen in Anwesenheit

stöchiometrischer Mengen an D-Fructose. .................................................................. 114

Tabelle 15: Einwaagen der AMADORI-Verbindungen für pH-kontrollierte Modellreaktionen. ....... 114

Tabelle 16: Parameter der HILIC-RI-Methode zur Quantifizierung von D-Fructose. ...................... 115

TABELLENVERZEICHNIS

xxxi

Tabelle 17: Parameter der ionenpaarchromatographischen RP-HPLC-RI-Methode zur

Quantifizierung der Aminosäuren. ............................................................................... 116

Tabelle 18: Parameter der ionenpaarchromatographischen RP-HPLC-RI-Methode zur

Quantifizierung der AMADORI-Verbindungen. .............................................................. 117

Tabelle 19: Parameter der RP-HPLC-DAD-Methode zur Quantifizierung der

α-Dicarbonylverbindungen. ......................................................................................... 118

Tabelle 20: Laufmittelgradient der RP-HPLC-DAD-Methode zur Quantifizierung der α-Dicarbonyl-

verbindungen. .............................................................................................................. 118

Tabelle 21: Übersicht über die genutzten Pulsprogramme und Angabe repräsentativer

Akquisitionsparameter. ................................................................................................ 119

Tabelle 22: Einwaagen der (Amino-) Säuren für polarimetrische Messungen der Ringöffnungsraten

der β-D-Fructopyranose in Anwesenheit stöchiometrischer Mengen an (Amino-) Säuren.

...................................................................................................................................... 126

Tabelle 23: Im Verlauf der Arbeit genutzte Geräte. ....................................................................... 126

Tabelle 24: Im Verlauf der Arbeit genutzte Software. .................................................................... 128

Tabelle 25: Im Verlauf der Arbeit genutzte Chemikalien. ............................................................... 129

Tabelle 26: Geschwindigkeitskonstanten des pH-abhängigen Abbaus von D-Fructose 1a in 0.5 M

Lösung in An- und Abwesenheit äquimolarer Mengen der Aminosäuren 4a-4e bei

(90 ± 2) °C. .................................................................................................................. xxxvi

Tabelle 27: Geschwindigkeitskonstanten des pH-abhängigen Abbaus der Aminosäuren 4a-4e in

0.5 M Lösung in Anwesenheit äquimolarer Mengen an D-Fructose 1a bei (90 ± 2) °C.

....................................................................................................................................xxxvii

Tabelle 28: Geschwindigkeitskonstanten des pH-abhängigen Abbaus der AMADORI-Verbindungen

6a-6e in 0.025 M Lösung bei (90 ± 2) °C. ................................................................... xxxviii

Tabelle 29: Geschwindigkeitskonstanten der pH-abhängigen Bildung von 1- und 3-Desoxyglucoson

(1-DG und 3-DG) 9a und 9b in 0.5 M Reaktionsmodellen der D-Fructose 1a in An- und

Abwesenheit äquimolarer Mengen der Aminosäuren 4a-4e bei (90 ± 2) °C. .............xxxix

Tabelle 30: Geschwindigkeitskonstanten der pH-abhängigen Bildung von 1- und 3-Desoxyglucoson

(1-DG und 3-DG) 9a und 9b in 0.025 M Reaktionsmodellen der AMADORI-Verbindungen

6a-6e bei (90 ± 2) °C. ........................................................................................................ xl

Tabelle 31: Geschwindigkeitskonstanten der pH-abhängigen Extinktionszunahme bei einer

Wellenlänge von 284 nm für 0.5 M Reaktionsmodelle der D-Fructose 1a in An- und

Abwesenheit äquimolarer Mengen der Aminosäuren 4a-4e bei (90 ± 2) °C. ................. xli


Wellenlänge von 284 nm, berechnet für 0.5 M Reaktionslösungen der

AMADORI-Verbindungen 6a-6e bei 90 °C auf Grundlage von Messungen basierend auf

0.025 M Reaktionsmodellen der AMADORI-Verbindungen 6a-6e bei (90 ± 2) °C............ xlii

TABELLENVERZEICHNIS

xxxii


Wellenlänge von 420 nm für 0.5 M Reaktionsmodelle der D-Fructose 1a in An- und

Abwesenheit äquimolarer Mengen der Aminosäuren 4a-4e bei (90 ± 2) °C. ............... xliii


Wellenlänge von 420 nm, berechnet für 0.5 M Reaktionslösungen der

AMADORI-Verbindungen 6a-6e bei 90 °C auf Grundlage von Messungen basierend auf

0.025 M Reaktionsmodellen der AMADORI-Verbindungen 6a-6e bei (90 ± 2) °C. .......... xliv

Tabelle 35: Raten der 1,2-Enolisierung von Fructosylalanin 6a und Fructosylprolin 6b bei

Raumtemperatur in Abhängigkeit des pD-Wertes. ........................................................ xlv

Tabelle 36: Raten und thermodynamische Aktivierungsparameter der 1,2-Enolisierung der

AMADORI-Verbindungen der homologen ω-Aminosäuren 6c-6e bei pD 4.5 in

Abhängigkeit der Temperatur. ....................................................................................... xlv

SCHEMATAVERZEICHNIS

xxxiii

Schemataverzeichnis Schema 1: Strukturen der Ketohexosen D-Fructose 1a, D-Tagatose 1b, D-Sorbose 1c und D-Psicose

1d. ..................................................................................................................................... 3

Schema 2: Isomerensystem der D-Fructose 1a in wässriger Lösung. *Relative Konzentration bei 20 °C.[46]4

Schema 3: Thermodynamisches Gleichgewicht zwischen D-Fructose 1a und D-Glucose 2a sowie

D-Mannose 2b, D-Psicose 1d und den Ketosen 3a und 3b über die jeweils tautomeren

1,2- und 2,3-Endiole. ........................................................................................................ 7

Schema 4: Strukturen der eingesetzten Aminokomponenten L-Alanin 4a, L-Prolin 4b, Glycin 4c,

β-Alanin 4d und γ-Aminobuttersäure 4e. ........................................................................ 8

Schema 5: Möglichkeiten der Bildung eines N-substituierten Glucosylamins 5a sowie der

korrespondierenden ringoffenen protonierten SCHIFF-Base 5b aus D-Glucose 2a und

einer Aminokomponente im sauren pH-Bereich. a) Protonierung des Lactolrings.

b) Protonierung der anomeren OH-Funktion. ................................................................. 9

Schema 6: Bildung einer SCHIFF-Base 5b aus D-Glucose 2a und einer Aminokomponente über das

gem-Aminol 5c im basischen pH-Bereich. Der gezeigte Mechanismus entspricht dem der

Bildung des gem-Diols der D-Glucose 2a aus ihrem acyclischen Zentralisomer. ........... 10

Schema 7: Konzertierter Mechanismus zur Bildung eines N-substituierten Glucosylamins 5a sowie

der korrespondierenden ringoffenen protonierten SCHIFF-Base 5b aus D-Glucose 2a und

einer Aminosäure. (Frei nach[82]) .................................................................................... 11

Schema 8: Mechanismus der AMADORI-Umlagerung I. (Frei nach[83,88,97]) ........................................ 11

Schema 9: Mechanismus der AMADORI-Umlagerung II.[103] .............................................................. 12

Schema 10: Bildung von AMADORI- 6 ausgehend von HEYNS-Verbindungen 7. .................................. 13

Schema 11: Bildung eines N,N-Difructosylamins 8 aus der Kondensation einer AMADORI-Verbindung

6 mit D-Glucose 2a. (Frei nach[119,121])............................................................................. 13

Schema 12: Tautomerensystem D-Fructose-analoger AMADORI-Verbindungen 6 in wässriger Lösung.

*Relative Konzentration bei 20-30 °C.[119,127] .............................................................................. 15

Schema 13: Bildungswege der α-Dicarbonylverbindungen 9a-9d ausgehend von einer

AMADORI-Verbindung 6. .................................................................................................. 17

Schema 14: Mechanismen der Bildung von Dihydrohydroxymaltol (DHHM) 10, Acetylformoin 11 und

Isomaltol 12 aus den Anomeren des 1-Desoxyglucosons 9a. ........................................ 18

Schema 15: Mechanismus der Bildung von 5-Hydroxymethylfurfural (HMF) 13 aus 3-Desoxyglucoson

9b. (Frei nach[172,173,176]) .................................................................................................. 19

Schema 16: Mechanismen der Bildung von 2-Hydroxyacetylfuran (HAF) 14 und Isomaltol 12 aus

β-D-Fructofuranose 1a(iv) im sauren Milieu. (Frei nach[180]) .......................................... 20

Schema 17: Mechanismen der Bildung von Dihydrohydroxymaltol (DHHM) 10,

5-Hydroxymethylfurfural (HMF) 13, 2-Aminoacetylfuran (AAF) 15 und Maltol 16 aus den

cyclischen Anomeren einer AMADORI-Verbindung 6. (Frei nach[173,177-179,187]) ................ 21

SCHEMATAVERZEICHNIS

xxxiv

Schema 18: Anomerensystem der D-Fructose 1a. Dabei steht P für Pyranose, F für Furanose und z

für das Zentralisomer. .................................................................................................... 27

Schema 19: Mechanismus der Anomerisierung am Beispiel der β-D-Glucopyranose. ...................... 35

Schema 20: System paralleler Folgereaktionen am Beispiel der Bildung und des Abbaus der

α-Dicarbonylverbindungen D-Glucoson (GLUC) 9d sowie 1- und 3-Desoxyglucoson (1-DG

und 3-DG) 9a und 9b. FP 1, FP 2 und FP 3 bezeichnen nicht weiter definierte

Folgeprodukte. ............................................................................................................... 47

Schema 21: Zusammenhang von Anomerisierung und Enolisierung anionischer Spezies der D-Fruc-

tose 1a im Vergleich zur Anomerisierung kationischer Spezies der D-Fructose 1a. ...... 49

Schema 22: Einflussmöglichkeiten der Aminofunktion einer Aminosäure auf das Reaktionsverhalten

von D-Fructose 1a. *Der dargestellte Mesomeriepfeil ist als Gleichgewichtsreaktionspfeil zu verstehen.

........................................................................................................................................ 50

Schema 23: Bildung resonanzstabilisierter pseudocyclischer Strukturelemente durch kooperative

Wasserstoffbrücken im β-pyranoiden Anomer von Fructosylglycin 6c(ii). (erweitert

nach[124]) ......................................................................................................................... 62

Schema 24: a) Parallele Bildung von 3-Desoxyglucoson 9b und 3-Desoxygalactoson 9c aus dem

β-pyranoiden Anomer von Fructosylglycin 6c(ii) über die Protonierung der

Hydroxylfunktion am C-3. b) Bildung von (Z)- und (E)-3,4-Didesoxyglucoson-3-en 17a

und 17b aus dem β-pyranoiden Anomer von Fructosylglycin 6c(ii) über die Protonierung

der Hydroxylfunktion am C-3. ........................................................................................ 64

Schema 25: a) Bildung von Allomaltol 18 aus dem β-pyranoiden Anomer von Fructosylglycin 6c(ii)

über die Protonierung der Hydroxylfunktion am C-3. b) Bildung von HMF 13 aus dem

α-furanoiden Anomer von Fructosylglycin 6c(iii) über die Protonierung der

Hydroxylfunktion am C-3. c) Bildung von AAF 15 aus dem α-furanoiden Anomer von

Fructosylglycin 6c(iii) über die Protonierung der Hydroxylfunktion am C-3. ................ 65

Schema 26: Mechanismus des Deuteriumaustausches am C-1 von aminosubstituierten Derivaten

der D-Fructose. ............................................................................................................... 69

Schema 27: Mechanistischer Zusammenhang des Prozesses der Anomerisierung und stofflichen

Veränderungen reduzierender Zucker am Beispiel von Anomeren der D-Fructose 1a.

........................................................................................................................................ 79

Schema 28: Vereinfachtes Modell der Mutarotation der D-Fructose 1a zur Beschreibung

polarimetrischer Daten. ................................................................................................. 95

Schema 29: Schematische Darstellung der frühen MAILLARD-Reaktion mit Fokus auf die durch

schwache Säuren und deren konjugierte Basen katalysierten Schritte des

Protonentransfers (rote Pfeile). Darüber hinaus sind die für diese Arbeit wichtigsten

Positionen gekennzeichnet, deren 𝑝𝐾𝑠-Werte sich relativ zu denen der D-Glucose 2a

ändern (grüne Pfeile). Weiterhin sind Veränderungen von Anomerensystemen relativ zu

dem der D-Glucose 2a (gelb-orange Pfeile) sowie der Einfluss der Katalysatoren auf

Abbaureaktionen kenntlich gemacht (blaue Pfeile). Auf die Darstellung der Bildung

weiterer intermediärer Reaktionsprodukte – etwa 1-Desoxyglucoson 9a – wird aus

Gründen der Übersichtlichkeit verzichtet. ................................................................... 104

STRUKTURENVERZEICHNIS

xxxv

Strukturenverzeichnis

ANHANG

xxxvi

Anhang

• Geschwindigkeitskonstanten des pH-abhängigen Abbaus von D-Fructose 1a

Tabelle 26: Geschwindigkeitskonstanten des pH-abhängigen Abbaus von D-Fructose 1a in 0.5 M Lösung in An- und Abwesenheit äquimolarer Mengen der Aminosäuren 4a-4e bei (90 ± 2) °C.

Modell pH-Wert Abbaurate k [10-6 Hz]

Erkennungsschwelle k [10-6 Hz]

Standardfehler k [10-6 Hz]

D-Fructose (0.5 M)

1.62 1.37 1.90 0.57 2.59 0.00 1.01 0.30 3.52 0.00 2.32 0.67 4.51 1.20 1.76 0.52 5.50 0.57 1.38 0.41 6.50 5.83 2.14 0.63


(je 0.5 M)

1.54 1.72 1.61 0.45 2.58 0.99 2.87 0.79 3.55 1.02 2.54 0.70 4.51 0.30 2.36 0.65 5.51 2.84 2.89 0.84 6.53 8.88 2.85 0.93


(je 0.5 M)

1.50 6.42 2.56 0.81 2.53 2.75 3.74 1.12 3.56 1.58 3.08 0.91 4.51 2.03 4.04 1.24 5.51 2.54 3.07 0.96 6.50 6.82 6.13 1.96

D-Fructose + Glycin

(je 0.5 M)

1.52 3.56 2.59 0.79 2.52 0.00 4.38 1.26 3.51 0.35 3.30 0.96 4.50 0.00 4.12 1.19 5.50 4.71 1.33 0.41 6.50 13.02 3.53 1.25


(je 0.5 M)

1.52 1.66 2.28 0.68 2.52 1.61 3.85 1.13 3.50 2.88 3.39 1.02 4.51 1.68 3.53 1.04 5.50 3.65 2.09 0.64 6.50 10.23 2.12 0.65

D-Fructose + γ-Aminobutter-

säure (je 0.5 M)

1.58 1.23 1.89 0.57 2.52 0.07 2.78 0.81 3.51 1.37 3.91 1.15 4.52 3.46 2.21 0.67 5.55 4.91 3.03 0.93 6.50 11.14 2.37 0.81

ANHANG

xxxvii

• Geschwindigkeitskonstanten des pH-abhängigen Abbaus der Aminosäuren 4a-4e

Tabelle 27: Geschwindigkeitskonstanten des pH-abhängigen Abbaus der Aminosäuren 4a-4e in 0.5 M Lösung in Anwesenheit äquimolarer Mengen an D-Fructose 1a bei (90 ± 2) °C.





(je 0.5 M)

1.54 1.35 2.19 0.61 2.58 1.02 1.83 0.51 3.55 0.00 1.81 0.50 4.51 0.00 1.97 0.54 5.51 0.00 2.48 0.70 6.53 0.00 2.21 0.64


(je 0.5 M)

1.50 0.00 2.52 0.74 2.53 0.00 1.62 0.48 3.56 1.25 1.42 0.43 4.51 0.00 3.02 0.92 5.51 1.00 4.08 1.24 6.50 0.79 7.33 2.22

D-Fructose + Glycin

(je 0.5 M)

1.52 1.55 1.76 0.53 2.52 1.90 3.09 0.92 3.51 0.67 2.63 0.78 4.50 1.01 2.13 0.63 5.50 3.42 2.40 0.73 6.50 9.50 2.12 0.73


(je 0.5 M)

1.52 0.24 2.27 0.67 2.52 0.00 2.05 0.60 3.50 0.58 1.87 0.56 4.51 0.00 2.63 0.77 5.50 0.00 2.60 0.76 6.50 0.00 3.48 0.95

D-Fructose + γ-Aminobutter-

säure (je 0.5 M)

1.58 0.00 1.82 0.54 2.52 0.00 3.19 0.93 3.51 0.00 2.23 0.66 4.52 0.00 2.92 0.85 5.55 0.00 4.55 1.30 6.50 0.00 10.46 2.98

ANHANG

xxxviii

• Geschwindigkeitskonstanten des pH-abhängigen Abbaus der AMADORI-Verbindungen 6a-6e

Tabelle 28: Geschwindigkeitskonstanten des pH-abhängigen Abbaus der AMADORI-Verbindungen 6a-6e in 0.025 M Lösung bei (90 ± 2) °C.




Fructosylalanin (0.025 M)

1.69 12.02 3.28 1.02 2.56 7.55 7.83 2.29 3.64 3.91 3.21 0.95 4.58 8.96 1.38 0.44 5.65 20.41 4.88 1.63 5.52 16.86 3.89 1.26 6.52 41.08 2.20 0.94

Fructosylprolin (0.025 M)

1.62 7.55 1.84 0.57 2.71 1.43 0.95 0.28 3.77 0.59 1.23 0.35 4.60 1.55 1.96 0.57 5.56 9.07 1.95 0.60 6.51 46.92 2.78 1.25

Fructosylglycin (0.025 M)

1.57 7.26 5.82 1.43 2.64 5.79 4.35 1.29 3.78 6.09 5.04 1.49 4.74 7.60 4.26 1.29 5.71 19.73 2.51 0.85 6.32 40.43 2.58 1.20

Fructosyl-β-alanin

(0.025 M)

1.57 1.76 1.39 0.41 2.47 4.93 4.14 1.22 3.63 1.25 4.74 1.33 4.62 2.72 2.86 0.83 5.72 7.24 3.98 0.80 6.41 18.44 2.76 0.69

Fructosyl-γ-aminobutter-

säure (0.025 M)

1.53 0.03 3.30 0.93 2.55 5.29 3.19 0.98 3.47 4.51 2.94 0.87 4.52 8.68 7.27 2.16 5.52 14.72 7.42 2.28 6.46 27.28 8.46 3.25

ANHANG

xxxix

• Geschwindigkeitskonstanten der pH-abhängigen Bildung von 1- und 3-Desoxyglucoson (1-DG und 3-DG) 9a und 9b

Tabelle 29: Geschwindigkeitskonstanten der pH-abhängigen Bildung von 1- und 3-Desoxyglucoson (1-DG und 3-DG) 9a und 9b in 0.5 M Reaktionsmodellen der D-Fructose 1a in An- und Abwesenheit äquimolarer Mengen der Aminosäuren 4a-4e bei (90 ± 2) °C.

Modell pH-Wert Bildungsrate 1-DG

k [10-6 Hz] Bildungsrate 3-DG

k [10-6 Hz]

D-Fructose (0.5 M)

1.62 0.00 0.05 2.59 0.00 0.05 3.52 0.01 0.05 4.51 0.04 0.13 5.50 0.07 0.22 6.50 0.06 0.38

D-Fructose + L-Alanin (je 0.5 M)

1.54 0.01 0.05 2.58 0.01 0.05 3.55 0.04 0.08 4.51 0.05 0.32 5.51 0.06 0.43 6.53 0.02 0.48

D-Fructose + L-Prolin (je 0.5 M)

1.50 0.01 0.02 2.53 0.02 0.03 3.56 0.02 0.23 4.51 0.04 0.30 5.51 0.05 0.31 6.50 0.01 0.47

D-Fructose + Glycin (je 0.5 M)

1.52 0.00 0.03 2.52 0.02 0.06 3.51 0.04 0.18 4.50 0.05 0.25 5.50 0.03 0.28 6.50 0.01 0.26

D-Fructose + β-Alanin (je 0.5 M)

1.52 0.01 0.07 2.52 0.03 0.14 3.50 0.06 0.11 4.51 0.16 0.35 5.50 0.01 0.37 6.50 0.01 0.24


(je 0.5 M)

1.58 0.00 0.03 2.52 0.02 0.06 3.51 0.04 0.09 4.52 0.07 0.29 5.55 0.00 0.36 6.50 0.00 0.30

ANHANG

xl

Tabelle 30: Geschwindigkeitskonstanten der pH-abhängigen Bildung von 1- und 3-Desoxyglucoson (1-DG und 3-DG) 9a und 9b in 0.025 M Reaktionsmodellen der AMADORI-Verbindungen 6a-6e bei (90 ± 2) °C.

Modell pH-Wert Bildungsrate 1-DG

k [10-6 Hz] Bildungsrate 3-DG

k [10-6 Hz]


1.69 0.06 5.80 2.56 0.07 3.83 3.64 0.18 3.05 4.58 0.76 3.11 5.65 3.42 3.61 5.52 2.75 3.71 6.52 25.72 4.14


1.62 0.10 4.37 2.71 0.12 2.17 3.77 0.26 1.52 4.60 0.88 1.65 5.56 4.68 2.11 6.51 37.55 2.52


1.57 0.11 5.38 2.64 0.06 3.03 3.78 0.18 2.97 4.74 0.71 2.84 5.71 2.39 4.07 6.32 8.09 6.08

Fructosyl-β-alanin (0.025 M)

1.57 0.10 3.28 2.47 0.04 5.10 3.63 0.10 8.69 4.62 0.29 7.87 5.72 2.30 60.20 6.41 4.49 85.04


(0.025 M)

1.53 0.01 2.98 2.55 0.04 3.41 3.47 0.07 4.92 4.52 0.84 9.54 5.52 2.04 33.14 6.46 4.79 108.75

ANHANG

xli

• Geschwindigkeitskonstanten der pH-abhängigen Extinktionszunahme bei 284 nm

Tabelle 31: Geschwindigkeitskonstanten der pH-abhängigen Extinktionszunahme bei einer Wellenlänge von 284 nm für 0.5 M Reaktionsmodelle der D-Fructose 1a in An- und Abwesenheit äquimolarer Mengen der Aminosäuren 4a-4e bei (90 ± 2) °C.

Modell pH-Wert Rate der Extinktionszunahme

@ 284 nm k [Hz] Standardfehler

k [Hz]

D-Fructose (0.5 M)

1.62 0.00107 0.00004 2.59 0.00021 0.00001 3.52 0.00012 0.00001 4.51 0.00015 0.00000 5.50 0.00038 0.00001 6.50 0.00074 0.00003


1.54 0.00513 0.00029 2.58 0.00246 0.00014 3.55 0.00231 0.00013 4.51 0.00196 0.00012 5.51 0.00256 0.00015 6.53 0.00360 0.00023


1.50 0.00669 0.00029 2.53 0.00302 0.00011 3.56 0.00211 0.00011 4.51 0.00214 0.00034 5.51 0.00307 0.00034 6.50 0.00334 0.00028


1.52 0.00458 0.00016 2.52 0.00377 0.00018 3.51 0.00242 0.00014 4.50 0.00224 0.00020 5.50 0.00338 0.00021 6.50 0.00632 0.00041


1.52 0.00710 0.00022 2.52 0.00569 0.00023 3.50 0.00249 0.00014 4.51 0.00266 0.00017 5.50 0.00303 0.00019 6.50 0.00498 0.00025


(je 0.5 M)

1.58 0.00429 0.00016 2.52 0.00460 0.00023 3.51 0.00289 0.00016 4.52 0.00300 0.00019 5.55 0.00352 0.00023 6.50 0.00605 0.00020

ANHANG

xlii

Tabelle 32: Geschwindigkeitskonstanten der pH-abhängigen Extinktionszunahme bei einer Wellenlänge von 284 nm, berechnet für 0.5 M Reaktionslösungen der AMADORI-Verbindungen 6a-6e bei 90 °C auf Grundlage von Messungen basierend auf 0.025 M Reaktionsmodellen der AMADORI-Verbindungen 6a-6e bei (90 ± 2) °C.



k [Hz]


1.69 0.0205 0.0009 2.56 0.0121 0.0006 3.64 0.0071 0.0002 4.58 0.0097 0.0002 5.52 0.0160 0.0018 5.65 0.0163 0.0004 6.52 0.0629 0.0004


1.62 0.0165 0.0006 2.71 0.0081 0.0001 3.77 0.0046 0.0001 4.60 0.0056 0.0001 5.56 0.0130 0.0003 6.51 0.0594 0.0019


1.57 0.0236 0.0007 2.64 0.0103 0.0004 3.78 0.0073 0.0002 4.74 0.0068 0.0001 5.71 0.0118 0.0003 6.32 0.0295 0.0019


1.57 0.0350 0.0016 2.47 0.0236 0.0008 3.63 0.0109 0.0004 4.62 0.0079 0.0001 5.72 0.0195 0.0005 6.41 0.0340 0.0015


(0.5 M)

1.53 0.0239 0.0034 2.55 0.0158 0.0043 3.47 0.0091 0.0039 4.52 0.0203 0.0048 5.52 0.0514 0.0090 6.46 0.0646 0.0150

ANHANG

xliii

• Geschwindigkeitskonstanten der pH-abhängigen Extinktionszunahme bei 420 nm

Tabelle 33: Geschwindigkeitskonstanten der pH-abhängigen Extinktionszunahme bei einer Wellenlänge von 420 nm für 0.5 M Reaktionsmodelle der D-Fructose 1a in An- und Abwesenheit äquimolarer Mengen der Aminosäuren 4a-4e bei (90 ± 2) °C.



k [Hz]

D-Fructose (0.5 M)

1.62 0.00002 0.00004 2.59 0.00017 0.00025 3.52 0.00000 0.00001 4.51 0.00017 0.00002 5.50 0.00019 0.00001 6.50 0.00018 0.00002


1.54 0.00019 0.00001 2.58 0.00018 0.00001 3.55 0.00017 0.00001 4.51 0.00021 0.00001 5.51 0.00038 0.00001 6.53 0.00059 0.00002


1.50 0.00027 0.00002 2.53 0.00027 0.00003 3.56 0.00022 0.00002 4.51 0.00025 0.00001 5.51 0.00029 0.00003 6.50 0.00034 0.00001


1.52 0.00022 0.00002 2.52 0.00023 0.00001 3.51 0.00027 0.00001 4.50 0.00034 0.00001 5.50 0.00059 0.00003 6.50 0.00127 0.00007


1.52 0.00022 0.00002 2.52 0.00033 0.00002 3.50 0.00027 0.00001 4.51 0.00063 0.00002 5.50 0.00062 0.00003 6.50 0.00089 0.00003


(je 0.5 M)

1.58 0.00029 0.00001 2.52 0.00029 0.00002 3.51 0.00054 0.00002 4.52 0.00078 0.00004 5.55 0.00080 0.00003 6.50 0.00115 0.00003

ANHANG

xliv

Tabelle 34: Geschwindigkeitskonstanten der pH-abhängigen Extinktionszunahme bei einer Wellenlänge von 420 nm, berechnet für 0.5 M Reaktionslösungen der AMADORI-Verbindungen 6a-6e bei 90 °C auf Grundlage von Messungen basierend auf 0.025 M Reaktionsmodellen der AMADORI-Verbindungen 6a-6e bei (90 ± 2) °C.



k [Hz]


1.69 0.0024 0.0003 2.56 0.0028 0.0001 3.64 0.0047 0.0003 4.58 0.0056 0.0002 5.52 0.0062 0.0005 5.65 0.0061 0.0003 6.52 0.0078 0.0003


1.62 0.0033 0.0001 2.71 0.0032 0.0001 3.77 0.0031 0.0004 4.60 0.0046 0.0002 5.56 0.0053 0.0002 6.51 0.0086 0.0004


1.57 0.0017 0.0004 2.64 0.0015 0.0003 3.78 0.0028 0.0002 4.74 0.0026 0.0001 5.71 0.0022 0.0002 6.32 0.0061 0.0002


1.57 0.0027 0.0002 2.47 0.0042 0.0003 3.63 0.0047 0.0002 4.62 0.0049 0.0002 5.72 0.0064 0.0004 6.41 0.0076 0.0004


(0.5 M)

1.53 0.0048 0.0002 2.55 0.0032 0.0001 3.47 0.0039 0.0001 4.52 0.0039 0.0001 5.52 0.0053 0.0002 6.46 0.0078 0.0003

ANHANG

xlv

• pD-abhängige Enolisierungsraten von Fructosylalanin 6a und Fructosylprolin 6b

Tabelle 35: Raten der 1,2-Enolisierung von Fructosylalanin 6a und Fructosylprolin 6b bei Raumtemperatur in Abhängigkeit des pD-Wertes.

Substanz pD-Wert Rate der 1,2-Enolisierung

k [Hz]


0.98 1.01E-08 2.01 6.17E-08 3.00 1.10E-07 3.98 1.23E-07 5.01 1.74E-07 6.02 4.63E-07 6.99 5.91E-06


0.99 4.09E-08 2.01 1.69E-07 3.02 3.09E-07 3.99 3.54E-07 4.98 3.90E-07 5.97 6.55E-07 6.98 4.00E-06

• Temperaturabhängige Enolisierungsraten der AMADORI-Verbindungen der homologen ω-Aminosäuren 6c-6e

Tabelle 36: Raten und thermodynamische Aktivierungsparameter der 1,2-Enolisierung der AMADORI-Verbindungen der homologen ω-Aminosäuren 6c-6e bei pD 4.5 in Abhängigkeit der Temperatur.

Substanz Temperatur

T [°C] Rate der 1,2-Enolisierung

k [Hz] Thermodynamische

Aktivierungsparameter


57 3.66E-05

∆𝐻‡ = 95.7𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 63 5.37E-05

69 9.20E-05 75 1.66E-04

∆𝑆‡ = −43.1𝐽

𝐾 ∙ 𝑚𝑜𝑙

81 3.21E-04

87 5.37E-04


57 8.09E-05

∆𝐻‡ = 92.2𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 63 1.64E-04

69 3.32E-04 75 5.48E-04

∆𝑆‡ = −42.8𝐽


81 1.08E-03


(0.5 M)

57 1.12E-04

∆𝐻‡ = 91.5𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 63 2.21E-04

69 4.43E-04 75 6.16E-04

∆𝑆‡ = −42.7𝐽


81 1.45E-03

ANHANG

xlvi

• NMR-Pulsprogramme

kfm-double-1hsst

;Double-SST-NMR (01.04.2014) - Kaufmann ;1D 1H selective saturation transfer using selective excitation with a shaped pulse #include <Avance.incl> 1 ze 2 d1 4u pl0:f1 3 (p11:sp11 ph11):f1 4u (p13:sp13 ph13):f1 4u lo to 3 times c d14 pl1:f1 p1 ph1 go=2 ph31 d11 wr #0 if #0 ivc lo to 1 times td1 exit ph1=0 0 ph11=0 2 ph13=0 2 ph31=0 0 ;pl0 : 120dB ;pl1 : f1 channel - power level for pulse (default) ;sp11: f1 channel - power level for first shaped pulse ;sp13: f1 channel - power level for second shaped pulse ;p1 : f1 channel - 90 degree high power pulse ;p11: f1 channel - 90 degree shaped pulse ;p13: f1 channel - 90 degree shaped pulse ;d1 : relaxation delay; 1-5 * T1 ;d14: 4 us ;c: variabel loop counter value (d20=c*(p13+4u))

C:\Bruker\TopSpin3.5pl2\exp\stan\nmr\lists\pp\user\kfm-double-1hsst

1

ZE

2

D1

PLW 0

4u

3

P11:sp11 ph11=0,2

4u

P13:sp13 ph13=0,2

4u

VC (1)

PLW 1

D14

P1 ph1=0,0

Go loop

D11

WR0

IF0

TD1 (25)

F1

ANHANG

xlvii

;d20: saturation transfer time ;NS: 2 * n, total number of scans: NS * TD0 ;DS: 0 ;choose p11 and p13 according to desired selectivity ;the flip-angle is determined by the amplitude ;set O1 on resonance on the nucleus that is to be observed (chemical exchange)

kfm-1hsst

;SST-NMR (01.04.2014) - Kaufmann ;1D 1H selective saturation transfer using selective excitation with a shaped pulse #include <Avance.incl> 1 ze 2 d1 4u pl0:f1 3 (p13:sp13 ph13):f1 4u lo to 3 times c d14 pl1:f1 p1 ph1 go=2 ph31 d11 wr #0 if #0 ivc lo to 1 times td1 exit ph1=0 0 ph13=0 2 ph31=0 0 ;pl0 : 120dB ;pl1 : f1 channel - power level for pulse (default) ;sp13: f1 channel - power level for shaped pulse ;p1 : f1 channel - 90 degree high power pulse ;p13: f1 channel - 90 degree shaped pulse ;d1 : relaxation delay; 1-5 * T1

C:\Bruker\TopSpin3.5pl2\exp\stan\nmr\lists\pp\user\kfm-1hsst

1

ZE

2

D1

PLW 0

4u

3

P13:sp13 ph13=0,2

4u

VC (1)

PLW 1

D14

P1 ph1=0,0

Go loop

D11

WR0

IF0

TD1 (25)

F1

ANHANG

xlviii

;d14: 4 us ;c: variabel loop counter value (d20=c*(p13+4u)) ;d20: saturation transfer time ;NS: 2 * n, total number of scans: NS * TD0 ;DS: 0 ;choose p13 according to desired selectivity ;the flip-angle is determined by the amplitude ;set O1 on resonance on the nucleus that is to be observed (chemical exchange)

kfm-1hfqssst

;fQSSST-NMR (09.06.2015) - Kaufmann ;1D 1H frequency sweep selective saturation transfer using selective excitation with a shaped pulse #include <Avance.incl> 1 ze 2 d1 fq1:f1 4u pl0:f1 3 (p13:sp13 ph13):f1 4u lo to 3 times 4500 d14 pl1:f1 p1 ph1 go=2 ph31 d11 wr #0 if #0 ivc lo to 1 times td1 exit ph1=0 0 ph13=0 2 ph31=0 0 ;pl0 : 120dB ;pl1 : f1 channel - power level for pulse (default) ;sp13: f1 channel - power level for shaped pulse ;p1 : f1 channel - 90 degree high power pulse

C:\Bruker\TopSpin3.5pl2\exp\stan\nmr\lists\pp\user\kfm-1hfqssst

1

ZE

2

FQ1

D1

PLW 0

4u

3

P13:sp13 ph13=0,2

4u

(4500)

PLW 1

D14

P1 ph1=0,0

Go loop

D11

WR0

IF0

TD1 (25)

F1

ANHANG

xlix

;p13: f1 channel - 90 degree shaped pulse ;d1 : relaxation delay; 1-5 * T1 ;d14: 4 us ;NS: 2 * n, total number of scans: NS * TD0 ;DS: 0 ;choose p13 according to desired selectivity ;the flip-angle is determined by the amplitude ;define fq-List ;td1=Summe(fq-List-Eintraege) ;SPOFFS=0

kfm-13csst_nonoe

;SST-NMR (02.04.2014) - Kaufmann ;1D selective 13C saturation transfer using selective excitation with a shaped pulse ;inverse-gated Decoupling (during acquisition) --> elimination of heteronuclear NOE #include <Avance.incl> 1 ze 2 d1 4u pl0:f1 3 (p13:sp13 ph13):f1 4u lo to 3 times c d12 pl1:f1 pl12:f2 p1 ph2 go=2 ph31 cpd2:f2 d11 do:f2 wr #0 if #0 ivc

C:\Bruker\TopSpin3.5pl2\exp\stan\nmr\lists\pp\user\kfm-13csst_nonoe

1

ZE

2

D1

PLW 0

4u

3

P13:sp13 ph13=0,2

4u

VC (1)

PLW 1

D12

P1 ph2=0,0

Go loop

D11

WR0

IF0

TD1 (25)

F1

PLW 12

F2

ANHANG

l

lo to 1 times td1 exit ph2=0 0 ph13=0 2 ph31=0 0 ;pl0 : 120dB ;pl1 : f1 channel - power level for pulse (default) ;sp13 : f1 channel - power level for shaped pulse ;pl12: f2 channel - power level for CPD/BB decoupling ;p1 : f1 channel - 90 degree high power pulse ;p13 : f1 channel - 90 degree shaped pulse ;d1 : relaxation delay; 1-5 * T1 ;d11: delay for disk I/O 30m [30 msec] ;d12: delay for power switching 20u [20 usec] ;c: variable loop counter value (d20=c*(p13+4u)) ;d20: saturation transfer time ;NS: 2*n, total number of scans: NS*TD0 ;DS: 0 ;FnMODE: undefined ;cpd2: decoupling according to sequence defined by cpdprg2 ;pcpd2: f2 channel - 90 degree pulse for decoupling sequence ;look at dept135 for decoupling parameters ;define VCLIST

kfm-13cdosst_nonoe

C:\Bruker\TopSpin3.5pl2\exp\stan\nmr\lists\pp\user\kfm-13cdosst_nonoe

1

ZE

2

D1

PLW 0

4u

3

P11:sp11 ph11=0,2

4u

P13:sp13 ph13=0,2

4u

VC (1)

PLW 1

D12

P1 ph2=0,0

Go loop

D11

WR0

IF0

TD1 (25)

F1

PLW 12

F2

ANHANG

li

;DOSST-NMR (15.01.2015) - Kaufmann ;1D selective 13C double offset saturation transfer using selective excitation with a shaped pulse ;inverse-gated Decoupling (during acquisition) --> elimination of heteronuclear NOE #include <Avance.incl> 1 ze 2 d1 4u pl0:f1 3 (p11:sp11 ph11):f1 4u (p13:sp13 ph13):f1 4u lo to 3 times c d12 pl1:f1 pl12:f2 p1 ph2 go=2 ph31 cpd2:f2 d11 do:f2 wr #0 if #0 ivc lo to 1 times td1 exit ph2=0 0 ph11=0 2 ph13=0 2 ph31=0 0 ;pl0 : 120dB ;pl1 : f1 channel - power level for pulse (default) ;sp11 : f1 channel - power level for shaped pulse ;sp13 : f1 channel - power level for shaped pulse ;pl12: f2 channel - power level for CPD/BB decoupling ;p1 : f1 channel - 90 degree high power pulse ;p11 : f1 channel - 90 degree shaped pulse ;p13 : f1 channel - 90 degree shaped pulse ;d1 : relaxation delay; 1-5 * T1 ;d11: delay for disk I/O 30m [30 msec] ;d12: delay for power switching 20u [20 usec] ;c: variable loop counter value (d20=c*(p13+4u)) ;d20: saturation transfer time ;NS: 2*n, total number of scans: NS*TD0 ;DS: 0 ;FnMODE: undefined ;cpd2: decoupling according to sequence defined by cpdprg2 ;pcpd2: f2 channel - 90 degree pulse for decoupling sequence ;look at dept135 for decoupling parameters ;define VCLIST

ANHANG

lii

kfm-13csst

;SST-NMR (02.04.2014) - Kaufmann ;1D selective 13C saturation transfer using selective excitation with a shaped pulse ;with power gated decoupling #include <Avance.incl> 1 ze 2 d12 pl13:f2 d1 cpd2:f2 4u pl0:f1 3 (p13:sp13 ph13):f1 4u lo to 3 times c d14 pl1:f1 d12 pl12:f2 p1 ph2 go=2 ph31 d11 wr #0 if #0 ivc lo to 1 times td1 d11 do:f2 exit ph2=0 0 ph13=0 2 ph31=0 0 ;pl0 : 120dB ;pl1 : f1 channel - power level for pulse (default) ;sp13 : f1 channel - power level for shaped pulse

C:\Bruker\TopSpin3.5pl2\exp\stan\nmr\lists\pp\user\kfm-13csst

1

ZE

2

D12 D1

PLW 0

4u

3

P13:sp13 ph13=0,2

4u

VC (1)

PLW 1

D14 D12

P1 ph2=0,0

Go loop

D11

WR0

IF0

TD1 (25)

D11

F1

PLW 13 PLW 12

F2

ANHANG

liii

;pl12: f2 channel - power level for CPD/BB decoupling ;pl13: f2 channel - power level for second CPD/BB decoupling ;p1 : f1 channel - 90 degree high power pulse ;p13 : f1 channel - 90 degree shaped pulse ;d1 : relaxation delay; 1-5 * T1 ;d11: delay for disk I/O 30m [30 msec] ;d12: delay for power switching 20u [20 usec] ;d14: 4u ;c: variable loop counter value (d20=c*(p13+4u)) ;d20: saturation transfer time ;NS: 2*n, total number of scans: NS*TD0 ;DS: 0 ;FnMODE: undefined ;cpd2: decoupling according to sequence defined by cpdprg2 ;pcpd2: f2 channel - 90 degree pulse for decoupling sequence ;define VCLIST

• NMR-AU-Programme

mpcmd

/*** ^^A -*-C++-*- **********************************************/ /* multiprocnocmd 28.09.2015 */ /****************************************************************/ /* Short Description : */ /* Performs multiple commands on increasing procnos. */ /****************************************************************/ /* Keywords : */ /* serial acquisitions, serial processing */ /****************************************************************/ /* Description/Usage : */ /* This AU program performs multiple commands on */ /* increasing procnos. If datasets do not yet exist, the */ /* current dataset and its parameters are copied. If the */ /* data sets already exist, then the commands are */ /* executed as the datasets are. */ /* For the commands 'zg', 'go' or 'xaua' the total */ /* experiment time is estimated and printed out. */ /****************************************************************/ /* Author(s) : */ /* Name : Ulrich Braumann */ /* Organisation : Bruker BioSpin GmbH */ /* Email : [email protected] */ /* Adapted by: : Martin Kaufmann */ /****************************************************************/ /* Name Date Modification: */ /* eub 010810 derived from 'multicmd' */ /* eub 051004 dataset handling changed, VIEWDATA */ /* 12sec delay between acuisiton commands */ /* eub 060502 Delay only for acqu./ formated */

ANHANG

liv

/* eub 060810 Commandlist possible */ /* eub 060816 ExptCalc changed, delay=0 */ /* eub 070911 Abort on autospooling, missing dataset */ /* eub 071025 Processing command with autospooling */ /* possible. */ /* ge 20100127 UXNMR_SAFETY problem with spooler solved */ /****************************************************************/ /* $Id: multicmd,v 1.13 2010/01/27 08:55:12 ge Exp $ */ AUERR = multicmd(curdat); QUIT #include <inc/lcUtil> int multicmd(const char* curdat) { char Answer[PATH_MAX], Question[PATH_MAX], tmpfile[PATH_MAX]; char TempStr[PATH_MAX],TempStr2[PATH_MAX]; char* cp; int i1 = 16; char TSCmd[8][128]; char TSCmdLstDisp[256]; int TSCmdNr = 0; int TSCmdNrMax = -1; char CommandType[128] = "sendgui "; int AcquAllowed = 1; /* Help */ if (i_argc > 2 && strcmp(i_argv[2], "help") == 0) { Proc_err(DEF_ERR_OPT, "Executes up to 1-8 TOPSPIN commands on\n" "subsequent PROCNOs. For example\n" "simply 'zg'\n" "or 'rga' 'zg' 'ef' 'apk'\n" "or more complex like 'rpar PROTON proc'"); return -1; } /* check if started from experiment */ strcpy(tmpfile, ACQUPATH(0)); if (access(tmpfile, F_OK)) { Proc_err(DEF_ERR_OPT, "== ABORT multicmd ==============\n" "Program aborted! Must be started from\n" "an NMR dataset. Change to the first dataset" "and try again."); return -1; }

ANHANG

lv

/* check if autospooling is active */ sprintf(TempStr2,"%s/prop/globals.prop",PathXWinNMRDotXWinNMR()); FindLine(curdat,TempStr2,"AUTO_SPOOL",TempStr); if (strstr(TempStr,"yes")) { strcpy(TempStr,"NORMAL"); GETSTRING( "== WARNING Automatic spooling activated ===\n" "Choose procedure for 'multicmd'\n\n" "(N)ormal: Execute commands immediately\n" "--> No ACQUISITION commands like zg,rga,xaua,... allowed!\n\n" "(S)pool: Send ALL commands to the SPOOLER\n" "-->running acquisition/spooled command will delay new commands)" ,TempStr); if( TempStr[0]=='S' || TempStr[0]=='s') { sprintf(CommandType,"sendgui qu "); } else { AcquAllowed = 0; } } /* Find out how many experiments */ if (i_argc > 2) i1 = atoi(i_argv[2]); else GETINT("Enter number of experiments :", i1) if (i1 <= 0) { Proc_err(DEF_ERR_OPT, "number of experiments must be > 0"); return -1; } /* Input of the commandlist */ strcpy(Answer,"apk"); strcpy(Question,"First command (Any TOPSPIN command)"); for (TSCmdNr = 0; TSCmdNr <= 7; TSCmdNr++) { GETSTRING(Question,Answer); strcpy(Answer,strdlfws(Answer)); if (Answer[0] == 0) break; strcpy(TSCmd[TSCmdNr],Answer); /* Add '_' to front and end to search for whole word */ sprintf(Answer,"_%s_",TSCmd[TSCmdNr]); if ( AcquAllowed==0 && strstr("_zg_go_rga_xaua_ii_",Answer)!=0 )

ANHANG

lvi

{ /* Acquisition command included, abort program */ Proc_err(DEF_ERR_OPT ,"== ABORT multicmd ===============\n" "AU program does not support AUTOMATIC spooling\n" "for acquisition commands like '%s'" ,TSCmd[TSCmdNr]); return -1; } TSCmdNrMax = TSCmdNr; sprintf(Question,"Next command(#%d) or <ENTER> to end ",TSCmdNr+2); Answer[0] = 0; } if (TSCmdNrMax < 0) return 0; /* Create list with the command(s), keep the list short */ TSCmdLstDisp[0] = 0; cp = TSCmdLstDisp; for (TSCmdNr = 0; TSCmdNr <= TSCmdNrMax; TSCmdNr++) { if (strlen(TSCmdLstDisp) <= 36 || TSCmdNr == TSCmdNrMax) cp += sprintf(cp, "[%s] ", TSCmd[TSCmdNr]); else { sprintf(cp, "... [%s]", TSCmd[TSCmdNrMax]); break; } } if (!strcmp(TSCmd[0],"zg") || !strcmp(TSCmd[0],"go") || !strcmp(TSCmd[0],"xaua")) { /* Calculate experiment time for standard acquisition command */ int startProcno = procno; int expTime = 0; TIMES(i1) SETCURDATA expTime += CalcExpTime(); if (loopcount1+1 < i1) { IPROCNO SETCURDATA } END DurationToAscii(TempStr, (double)expTime); /* return to original dataset */ procno = startProcno;

ANHANG

lvii

SETCURDATA if (Proc_err(ERROPT_AK_CAN, "Run acquisition with '%s'\n" "In approx. %s\n" "On dataset '%s' procno(s) %d - %d", TSCmdLstDisp, TempStr, name, procno, procno+i1-1)) return -1; if (strcmp(TSCmd[0],"zg") == 0) strcat(TSCmd[0], " yes"); /* override UXNMR_SAFETY if set */ } else { if (Proc_err(ERROPT_AK_CAN, "Run %d command(s)\n%s\n" "On dataset '%s' procno(s) %d - %d", TSCmdNrMax+1, TSCmdLstDisp, name, procno, procno+i1-1)) return -1; } /* Loop with execution of commands */ TIMES(i1) if (TSCmdNrMax > 0) Proc_err(ERROPT_AK_NO, "On dataset '%s' %d\nRunning command(s)\n%s", name, procno, TSCmdLstDisp); for (TSCmdNr = 0; TSCmdNr <= TSCmdNrMax; TSCmdNr++) { (void)sprintf(tmpfile,"running '%s' on procno # %d", TSCmd[TSCmdNr], procno); Show_status(tmpfile); /* use 'sendgui' to allow all types of commends */ sprintf(TempStr,"%s %s",CommandType,TSCmd[TSCmdNr]); XCMD(TempStr); if (AUERR) { /* stop processing of THIS dataset if one command fails */ sleep(2); break; } } if (loopcount1+1 < i1) { IPROCNO SETCURDATA } END Proc_err(ERROPT_AK_NO, "--- multicmd finished ---"); return 0; }

CURRICULUM VITAE

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Curriculum Vitae

Der Lebenslauf ist in der online-Version aus Gründen des Datenschutzes nicht enthalten.

CURRICULUM VITAE

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CURRICULUM VITAE

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NOTIZEN

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Documents

Dynamik der Zuckertautomerie und ihr Einfluss auf die ... · Elucidation of Structure, Bioactivity, ... „Structure and Dynamics of D-Fructose and Related AMADORI Derivatives”