Effekte einer Effekte einer in vivoin vivo Behandlung mit PETN vs. ISMN bei Behandlung mit PETN vs. ISMN bei Angiotensin-II induziertem oxidativen Stress in RattenAngiotensin-II induziertem oxidativen Stress in Ratten

Matthias Oelze1, Swenja Schuhmacher1, Philip Wenzel1, Thomas Jansen1,

Dirk Stalleicken2, Huige Li3, Falk Mäthner1, Jens Kamuf1, Luise Sydow1,

and Thomas Münzel1 and Andreas Daiber1

1Universitätsklinikum Mainz, II. Med. Klinik, Abteilung für Molekulare Kardiologie, Mainz2Actavis Deutschland GmbH, Langenfeld3Johannes Gutenberg Universität, Institut für Pharmakologie, Mainz

Mit freundlicher Unterstützung von Actavis Deutschland GmbH

15. PETN-ExpertentreffenHamburg, 3./ 4. October 2008

Hintergrund II:Hintergrund II:chronische Angiotensin-II Behandlung führt zu…chronische Angiotensin-II Behandlung führt zu…

Starkem Gewichtsverlust

Anstieg der NADPH-Oxidase Aktivität

Oxidativem Stress

NOS-Entkopplung

Endothelialer Dysfunktion

Stark erhöhtem Blutdruck

Hintergrund I:Hintergrund I:PETN induziert keine Nitrat- und cross-ToleranzPETN induziert keine Nitrat- und cross-Toleranz

Wenzel, Oelze et al, . Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007

FragestellungFragestellung

I. Zeigt eine Therapie mit PETN positive

Effekte in einem Tiermodel der

Angiotensin-II (AT-II) induzierten

Hypertonie

II. Welche Effekte entstehen dazu im

Vergleich bei einer Therapie mit

Isosorbit-5-mononitrat (ISMN)

TiermodelTiermodel

Männliche Wistar Ratten (230-250 g)

Behandlung mit AT-II (1 mg/kg/d) allein oder zusammen mit PETN (15 mg/kg/d) oder ISMN (75 mg/kg/d) über subcutane osmotische Minipumpen für 7 Tage

Kontroll-Pumpen mit dem entsprechenden Lösungsmittel (DMSO für Nitrate bzw. 0,9% NaCl für AT-II)

Weight gain

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

[g]

Ctr AT-II AT-II AT-II DMSO DMSO +PETN +ISMN

*

*+

*

P < 0,05:

* vs. Ctr/DMSO

+ vs. AT-II/DMSO

Ergebnisse:Ergebnisse: Gewichtsveränderungen nach 7 Tagen BehandlungGewichtsveränderungen nach 7 Tagen Behandlung

Ergebnisse:Ergebnisse: Mitochondriale ROS und NADPH-Oxidase Aktivität im HerzMitochondriale ROS und NADPH-Oxidase Aktivität im Herz

Mit

och

on

dri

al R

OS

by

L-0

12 E

CL

[c

ou

nts

/min

] NA

DP

H-o

xidase activity

by L

ucig

enin

5 µM

EC

L [co

un

ts/min

]0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

0

2500

5000

7500

10000

12500

15000

Mitochondrial ROS

NADPH-oxidase activity

*# *# *#*#

*

P < 0,05

* vs. Ctr/DMSO

# vs. AT-II + PETN

Ctr AT-II AT-II AT-IIDMSO DMSO +PETN +ISMN

P < 0,05:

* vs. Ctr/DMSO # vs. AT-II +PETN

Mitochondrial Superoxide formation by 2-Hydroxyethidium [nM]

200

300

400

500

600

700

Ctr AT-II +PETN +ISMN

*

*#

P<0.05: * vs. Ctr; # vs. +PETN

NADPH Oxidase Activity by 2-Hydroxyethidium [nM]

200

250

300

350

400

Ctr AT-II +PETN +ISMN

*#*#

P<0.05: * vs. Ctr; # vs. +PETN

Ergebnisse:Ergebnisse: Mitochondriale ROS und NADPH-Oxidase Aktivität im HerzMitochondriale ROS und NADPH-Oxidase Aktivität im Herz

Ergebnisse:Ergebnisse:Superoxid-Produktion in der AortaSuperoxid-Produktion in der Aorta

IOD

[a

rbit

rary

un

its] [co

un

ts/min

/mg

]

0

50

100

150

200

250

300

0

50

100

150

200

250

Lucigenin [5µM] ECL

DHE staining

*# *#*

*

*

P < 0,05

* vs. Ctr/DMSO

# vs. AT-II + PETN Ctr AT-II AT-II AT-IIDMSO DMSO +PETN +ISMN

Ergebnisse:Ergebnisse: Hämoxygenase-1Hämoxygenase-1 mRNA und Protein Expression in der AortamRNA und Protein Expression in der Aorta

P < 0,05:

* vs. Ctr/DMSO # vs. AT-II +PETN

HO-1

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Ctr/DMSO AT-II/DMSO AT-II+PETN AT-II+ISMN Ctr AT-II AT-II AT-IIDMSO DMSO +PETN +ISMN

**

HO-1 mRNA

mR

NA

Ex

pre

ss

ion

(Fo

ld c

ha

ng

e)

#

HO-1

0

50

100

150

200

250

300

Ctr/DMSO

Ang-II/DMSO

Ang-II+PETN

Ang-II+ISMN

% o

f C

tr/D

MS

O

Ctr AT-II AT-II AT-IIDMSO DMSO +PETN +ISMN

*

*

*#

-Actinin -HO-1 -

kDa100

32

HO-1 Protein

Ergebnisse:Ergebnisse: Protein Expression in der AortaProtein Expression in der Aorta

P < 0,05: * vs. Ctr/DMSO

eNOS

0

50

100

150

200

Ctr/DMSO

AT-II/DMSO

AT-II+PETN

AT-II+ISMN

% o

f C

tr/D

MS

O*eNOS Ctr AT-II

DMSO DMSO

a-Actinin -eNOS -

Ergebnisse:Ergebnisse: Protein Expression in der AortaProtein Expression in der Aorta

P < 0,05: * vs. Ctr/DMSO; # vs. AT-II +PETN

eNOS

0

50

100

150

200

Ctr/DMSO

AT-II/DMSO

AT-II+PETN

AT-II+ISMN

% o

f C

tr/D

MS

O**

*eNOS

a-Actinin -

Ctr AT-II AT-II AT-IIDMSO DMSO +PETN +ISMN

eNOS -

Ergebnisse:Ergebnisse: Protein Expression in der AortaProtein Expression in der Aorta

P < 0,05: * vs. Ctr/DMSO; # vs. AT-II +PETN

eNOS

0

50

100

150

200

Ctr/DMSO

AT-II/DMSO

AT-II+PETN

AT-II+ISMN

% o

f C

tr/D

MS

O**

*eNOS

DHFR

0

50

100

150

200

Ctr/DMSO

AT-II/DMSO

AT-II+PETN

AT-II+ISMN

% o

f C

tr/D

MS

O

DHFR

*#

*

#

GTP-CH-1

0

50

100

150

200

Ctr/DMSO

AT-II/DMSO

AT-II+PETN

AT-II+ISMN

% o

f C

tr/D

MS

O

GTP-CH-1*

##

Ctr AT-II AT-II AT-IIDMSO DMSO +PETN +ISMN

eNOS -

GTP-CH-1 -

DHFR -

-Actinin -

-Actinin -

-Actinin -

Ergebnisse:Ergebnisse: eNOS Entkopplung eNOS Entkopplung

DHE-staining ± L-NAME

Ergebnisse:Ergebnisse: Endothel-abhängige und -unabhängige GefäßfunktionEndothel-abhängige und -unabhängige Gefäßfunktion

0

20

40

60

80

100

-9 -8,5 -8 -7,5 -7 -6,5 -6 -5,5

Ctr/DMSO n= 41

Ang-II/DMSO n= 57

Ang-II+PETN n= 46

Ang-II+ISMN n= 36

ACh-response%

re

lax

ati

on

Log M (ACh)

0

20

40

60

80

100

-9 -8 -7 -6 -5

Ctr/DMSO n= 43

Ang-II/DMSO n= 53

Ang-II+PETN n= 50

Ang-II+ISMN n= 34

GTN-response

% r

ela

xa

tio

nLog M (GTN)

% r

elax

atio

n

Ergebnisse:Ergebnisse: PETN vs. ISMN in PETN vs. ISMN in SSpontan pontan HHypertensiven ypertensiven RRatten (SHR)atten (SHR)

Endothel-abhängige (ACh) und –unabhängige (GTN) GefäßfunktionEndothel-abhängige (ACh) und –unabhängige (GTN) Gefäßfunktion

0

20

40

60

80

100

-9 -8,5 -8 -7,5 -7 -6,5 -6 -5,5

SHR-Ctr, n= 12

SHR+PETN, n= 12

SHR+ISMN, n= 12

WKY-Ctr, n= 7

ACh-response

% r

ela

xat

ion

Log M (ACh)

0

20

40

60

80

100

-9 -8 -7 -6 -5

SHR-Ctr, n= 12

SHR+PETN, n= 12

SHR+ISMN, n= 12

WKY-Ctr, n= 8

GTN-response

% r

ela

xat

ion

Log M (GTN)

Ergebnisse:Ergebnisse: PETN vs. ISMN in PETN vs. ISMN in SSpontan pontan HHypertensiven ypertensiven RRatten (SHR)atten (SHR)

Aortic superoxid production

P < 0,05:

* vs. Ctr/DMSO # vs. AT-II +PETN

Aorta

0

50

100

150

200

250

WKY Ctr SHR +PETN +ISMN

[co

un

ts/m

in/m

g]

Lucigenin [5µM] derived CL

*#*

Ergebnisse:Ergebnisse: PETN vs. ISMN in PETN vs. ISMN in SSpontan pontan HHypertensiven ypertensiven RRatten (SHR)atten (SHR)

Aortic superoxid production

ZusammenfassungZusammenfassung

Im Gegensatz zu ISMN normalisiert PETN Im Gegensatz zu ISMN normalisiert PETN teilweise die Gefäßfunktion und unterdrückt teilweise die Gefäßfunktion und unterdrückt oxidativen Stress in verschiedenen oxidativen Stress in verschiedenen Tiermodellen der Hypertonie Tiermodellen der Hypertonie

PETN potenziert (tendenziell) und ISMN PETN potenziert (tendenziell) und ISMN reduziert die HO-1 Expressionreduziert die HO-1 Expression

PETN Co-Therapie unterdrückt eine NOS-PETN Co-Therapie unterdrückt eine NOS-Entkopplung und steigert die Expression Entkopplung und steigert die Expression von GTP-CH-1 und DHFRvon GTP-CH-1 und DHFR

SchlussfolgerungSchlussfolgerung

Im Gegensatz zu ISMN zeigen sich in Im Gegensatz zu ISMN zeigen sich in

verschiedenen Tiermodellen der Hypertonie verschiedenen Tiermodellen der Hypertonie

positive Effekte von PETN, die sich über eine positive Effekte von PETN, die sich über eine

Aktivierung von antioxidativen Mechanismen Aktivierung von antioxidativen Mechanismen

sowie einer damit verknüpften Aufrechterhaltung sowie einer damit verknüpften Aufrechterhaltung

der Nitratwirkung erklären lassen könnten.der Nitratwirkung erklären lassen könnten.

Vielen Dank für ihre AufmerksamkeitVielen Dank für ihre Aufmerksamkeit