190 W. ~EISNEIr U. I-I. U~LIG:

132 (1961). -- 5 D~E]tOWZAn, F., u. D. KLAMA~: Honatsh. Chem. 82, 470 (1951). -- 6 EB]~m~:~s, E. : Wasserbestimmung mit Karl-Fischer-LSsung. Weinheim/Bergstr. : Verlag Chemie 1958. -- ~ HENNAI~T, C., et F. VI]~]~LET: Chim. Anal. (Paris) 44, 61 (1962); vgl. diese Z. 198, 307 (1963) . - s/-IIsF~TA, C., and J. BOMSTEI~:Anal. Chem. 35, 65 (1963) ; vgl. diese Z. 204, 287 (1964).-- 9 I~LA~ANN, D. : Honatsh. Chem. 88, 719 (1952) ; vgl. diese Z. 139, 137 (1953). -- lo LITW~ENKO, M., D. M. AL]~KSAN~)~OYA U. V. B. ~eO])AJLO: ~. Anal. Chim. 16, 226 (1961); vgl. diese Z. 189, 223 (1962). -- 11 LomLL. g.: Anal. Chem. 32, 1166 (1960); vgl. diese Z. 180, 459 (1961). -- 12 MITC~ELn, g,, and I). M. SM~T~: Chemical Analysis, Vol. V, Aquametry, pp. 369--371. New York: Intersci. 1948. -- ~a 0MBOLY, Cs., u. E. DERS~: Acta Pharm. Hung. 32, 88 (1962). -- x~ PESER, M., et 1%. WXnLEMA~T: Bull. Soc. Chim. France 1948, 479. -- ~ SAw~]L P. :Analyst 82, 269 (1957) ; vgl. diese Z. 160, 307 (1958). -- is STArVe, C. R., and S. S~GG~A: Anal. Chem. 28, 1971 (1956); vgl. diese Z. 158, 230 (1957). -- x7 Tm~EI~TEV, A. P., S. J. OBTEM~m~A~SKAJA, M.M. BUI~LANOYA. U. T .E . VLASOVA: ~. Anal. Chim. 17, 900 (1962); vgl. diese Z. 198, 386 (1963). -- ~s UsA- ~OVlS, U., u. K. JATSlmmSKI~: ~. Ob~5. Chim. 11, 957 (1941). -- ~9 VOGEI~, A. I . : Elementary Praet. Org. Chem., Part II , p. 504, Longmans, London: Green. 1957.

I. SIMONY~ Vereinigte Heft- und N~hrmitte]werke, Gfitekontroll-Laboratorium Budapest X. K ereszturi ut 30/38 (Ungarn)

Eine automatische Methode zur Bestimmung proteolytischer Enzyme W. REISNER und H. UHLIG

Enzymlaboratorien der l~Shm & Haas GmbH., Darmstadt

Eingegangen am 27. Jul i 1965

Summary. An automated method is described for the determination of proteolytic enzymes, especially for the analysis of a large number of tests with comparable origin. The accuracy of this system, compared with conventional methods, can be indicated as satisfactory. Tho time factor in analyses has been greatly reduced.

Die B e s t i m m u n g der p r o t o o l y t i s c h e n A k t i v i t s in u m f a n g r e i c h e a Ver -

suchs re ihen oder die V e r f o l g u n g de r B i l d u n g y o n P r o t e i n a s e n in in-

dus t r i e l l en IZul turansi~tzen v o n M i k r o o r g a n i s m e n is t m i t e i n e m groBen

Z e i t a u f w a n d v e r b u n d e n . D a die A n a l y s e n f e h l e r be i H a n d m e t h o d e n

a u B e r d e m y o n B e a r b e i t e r zu B e a r b e i t e r s chwanken , prfif~en wi r d ie

MSgl i chke i t en e iner a u t o m a t i s c h e n Arbe i t swe i se .

Das P r i n z i p de r B e s t i m m u n g p r o t e o l y t i s e h e r E n z y m e n a e h der M e t h o d e vo l l K v ~ r r z ~ u n d ih re r A b w a n d l u n g n~ch I{AGI~IAI~Aaa, b e r seh ien uns

d a z u gee igne t . N a e h A b b a u des S u b s t r a t s - - m e i s t Casein - - w e r d e n

h ie rbe i die t r ieh loress igs i iu re lSs l iehen P r o t e i n b r u c h s t f i c k e d u r c h Messung

de r E x t i n k t i o n bei 275, 280 bzw. 660 n m b e s t i m m t .

Automatische Bestimmung proteolytischer Enzyme 191

Grunds~tzlieh ist auch die Verwendung anderer Substrate, wit z .B . tIamoglobin, mSglich. W~LL~NF~LS 6 konnte jedoch anhand von Ak- t ivi ta tskurven zeigen, dab im Bereieh yon p H 6--8 bei der enzymatischen t Iydrolyse yon Casein in den meisten Fallen mehr farbstoffbildende Abbauprodukte entstehen als bei H/imoglobin. Eine Ausnahme bildet das nich~ aktivierte Papain, welches aber gerade in diesem Bereieh ein aul~ergew6hnliches Aktiviti~tsminimum aufweist. Die Voraussetzungen ffir eine automatische Arbeitsweise sind: 1. Die exakte Dosierung von Enzym, Substrat und Reagentien. 2. Eine gute Trennung der einzelnen Analysen voneinander. 3. Kontinuierliche Abtrennung der triehloressigsaurel6slichen Peptide. 4. Kontinuierliehe quanti tat ive Messung der Abbauprodukte. Die technischen Neuentwieklungen zur Automatisierung yon Analysen- methoden, wie z. B. die verschiedenen Apparaturen zur automatischen Best immung von Aminosi~uren, bieten sich fiir ein solehes Verfahren an. Einige der aufgezeigten Probleme, namlich die exakto Dosicrung, Trennung der Einzclanalysen und kontinuicrliche Messung waren schon bei dem Verfahren yon STEIN U. Moo]~]~ 5 in den Aminoana]ysatoren gel6st worden. Ein besonderes Problem bildet jedoch die kontinuierliche Filtration. Ein 1964 neu entwickeltes kontinuierliehes Filter in Verbindung mit den Elementen des AutoAnalyzers 2 der Teehnieon Inst ruments Corp., Chauncey, N. Y., sehien die vollkommene technische L6sung der auto- matischen Proteinasebes~immung zu erm6glichen.

Experimenteller Teil Nach Spaltung yon Casein durch proteolytische Enzyme wird das Reaktionsgemisch mit Trichloressigs~ture gefallt. Die TCE-16slichen Peptide werden abfiltriert und naeh Reaktion mit Folin-Reagens colori- metrisch bei 660 nm quant i ta t iv bestimmt. Spaltung, Fallung, Filtration, Anfarbung und Messuag erfolgen im Autoanalysator.

Reagentien 1. CaseinlSsung. 1,2~ LSsung yon Casein nach I-IAM~mSTE~, welche auf den gewfinschten pit-Weft eingestellt wurde und einen Zus~tz yon Tris- oder Phosphor- puffer enth~lt. 2. 0,3 m Trichloressigs(ture. 3. Pu//erlSsung /iir Folin-Reagens. Enth~lt 3o/0 Natriumhydroxid und 5,5~ Na- triumhydrogencarboa~t. 4. Phenolreagens nach FoLI~ und CIOCALTEU, auf ein Achtel verdfinnt.

EnzymlSsung Alle L6sungen und Verdiinmmgsl6sungen yon Enzymprobea werden filtriert. Die Erh6hung der optischen Dichte, welche durch die Reagentien (Substrat, Folin- l~e~gens) bereits ohne Enzymeinwirkung hervorgerufen wird, driickt sich durch die

192 W . I~:EIS~EI:I, u . I~. UI-ILIG:

Lage der Basislinie aus. Sie wird bei der vorliegenden MeDhode au~omat~soh kom- pensierD. Eine weitere ErhShung der Basislinie (Blindwer~) kann duroh 1%lin-positive Sub- s~anzen, wie z. B. Amine und aromatisohe Aminos/~uren, verursaoht werden, die mi~ dem Enzym in das System gelangen. Man muff sich daher bei Versuohsreihen dutch S~ichproben mit erhitzten L6sungen der Enzympr/iparaDe iiberzeugen, dab dieso frei yon solohen ,,Enzymblindwerten" sind. Diese Prfifung is~ vor allem dann notwendig, wenn es sich um EnzymlSsungen sehr geringer Aktivit~t handelD, bei welohen duroh die erforderMchen hohen Ein- waagen gr6Bere l~engen ~o]ln-positiver Substanzen die Ergebnisse beeinflussen kSnnen. Treten ]~nzymblindwerte in geringem Umf~ng ~uf, so kSD~en sic in der Pr~xis meis~ens dan~ ~ernaehl~ssigt werden, wenn die Enzymproben und das zugehSrige Standard-Enzympr~para~ unter &hnlichen Bedingungen gewon~en wurden; Fehler werden zum gr56ten Tell ausgeglichen.

A pparatur und Methode Zur automatisohen Bestimmung der proteolytische~ Enzyme verwendeten wit einen AutoAnalyzer der Fa. Teoiniicon Instruments Corp., Chuuncey, N.Y., bestehend aus folgenden Get,ten: Probennehmer ]i~r 40 ProbeR. Der Probennehmer wurde auf die niedrigste Analysen- frequenz -- 20 Proben/Std -- eingestellt und nur jede zweite 0ffnung des Proben- tellers besohickt. Mehrkanal-Proportionierpumpe mit zwei Geschwindigkeitea und TygomPumpen- sohl/~uohen. Dialysator fiir 37 ~ C, verwendet als Thermostat. Im Thermosta~ea wurden zwei hin~ereinandergeschalteto Doppelmisch-Schlangen befestigt. Daduroh wurdo eine Verweflzeit yon etwa 6 rain erreicht. Kont~nuierliche~ Eilter. Der t~ilterstreife~vorsohub des kontinuierlichen Filters wurde auf Geschwindigkeit 3 (4,5 ore/rain) oingestellt.

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Abb. 1. l~llel]scheraa zur automatischen Bestimmung proteolytischer Enzyme

Automatisehe Bestimmung proteolytiseher Enzyme 193

Zweistrahl-Durchflufl-Colorimeter mit 15mm Zyliuderkiivette. Filter 660nm; Blende 9; 0~ Regler etwa 60; 100~ Regler: 600--680. Kompen~atlons-Linieuschreiber, 10 mV, 250 mm Sclu'eibbrei~e. B~sis-Linie 98 bis 100~ Die Einzelger~te waren durch Tygon-Verbindungssehlt~uche (1/s"• gemt~B FlieBsehema (Abb.1) miteinander verbunden. Mit Ausnahme der beiden im Thermostaten befindlichen zwei Doppelmiseh- Schlangen wurden alle vier Einzelmisch-Sehlangen sowie alle noehmals tiber die Pumpe geffihrten Leitungen auf einer Grundplatte aus Plexiglas* lest montiert. Die Leitungen, welehe auf dieser Platte befestigt waren, wurden zum grSBten Tell aus passendem Glasrohr angefertigt. Die l~Iengen der zu transportierenden LSsungen sind dutch die Quersohaitte der Pumpensehl&uche festgeleg~ (Ang~ben siehe FlieB- schema, Abb.1). Dutch die Pumpe wird kontinuierlieh eine bestimmte Menge Subs~rat transportiert und dieses dutch ein R-Stiiek mit einem Capillarrohr duroh Luf~ unterteilt. Der Probennehmer (a) entnimmt aus dem Probenbeeher eine bestimmte ~r der zu untersuchenden Enzyml6sung und fiihrt sie der uaterteflten Subsbrat16sung fiber ein normales 1-[-Stiiek zu. Umnittelbar darauf erfolgt die lY[isehung in eiaer Einzel- miseh-Seblange (b). Das Reaktionsgemisch kommt nun in den Thermostaten (c) und re~giert in zwei hinterein~ndergesehalteten Doppelmiseh-Sehlangen bei 37 ~ C. Uber ein auf der Ausgangsseite des Thermostaten ~ufgesetztes T-Stfiok wird die ]:[auptmenge der Luftblasen abgepumpt (d), wobei dieser Leitung unterwegs zur besseren Funktion kontiauierlioh eine kleine )J[enge ~r (e) zugefiihrt wird. Die Entfernung der Luftblasen kurz vor dem Filter ist notwendig, da dureh zu viel Luft in der MAschkammer des Soh~umen verst~rkt wird. Die ]~aup~menge des Reaktionsgemisehes (/) wird nun dem kontinuierliehen Filter zugefiihrt. Vonder anderen Seite wird in den Misoh-Bloek Triehloressigs~ure (g) gepumpt. Des Pr&- cipltat wird dutch den vorbeitran~portierten Filterpapierstreifen (h) laufend entfernt. Das abgepumpte Filtrat (i) wird hinter der Pumpe nochmals mit Luft gleicbma[~ig unterteilt. D~nn wird mit dem alkalisehen Puffer gemischt und scMie21ieh das Folin-Reagens zugefiihrk Die Farbontwickhmg geht in einer Doppelmiseh- Schlange (k) oder zwei hinteroinander geschalteten Einzelmisoh-Sohlangen vet sioh. Die Fltissigkeit wird im Colorimeter fiber ein T-Stiick entliiftet, lOassiert dann die Zylinderkiivette und wird schlieBlioh abgepumpt (1). Die vom Colorimeter ge- messene optische DicMe wird veto Schreiber registriext.

Eichkurve Die bei den konven t ione l l en Methoden i ibl iche E ichung m i t einer S tan- da rd-Tyros in l6sung i s t bei der vor l iegenden Methode n ich t durchf i ihrbar , da sich jede ~ - lde rung der Sch lauchvo lumina u n d der Lt~nge der Misch- schlangen im T h e r m o s t a t e n au f das Ergebn i s auswirk t . W i r h a b e n dahe r als Bezugsbas is jewefls gu t hal~bare, bei - - 2 0 ~ auf- bewahr t e Enzym~rockenpr i ipa ra t e ve rwende t , deren Wirksamkei$ yon H a n d m i t e iner der e ingangs z i t i e r t en Metho4en bes t imm~ un4 in regelmi~Bigen Abs t t inden nachkont roUier t wurde. Der p t t - W e r t der beschr iebenen au toma t i s chen Methode wi rd jeweils dem p H - W e r t der ve rwende ten konven t ione l l en Methode angepaBt .

* Eingetrages Warenzeiehen der HShm & Haas GmbH, Darmstadt. z. analy~. Chem., Bd. 215 13

194 W. REISNER U. l~. UHLIG:

Die Aufstellung einer Eichkurve mit den vom Schreiber aufgezeichne~en ExtinkUonem kann daan in folgender Weise vorgenommen werden: Man schickt fil$rier~e L6sungen verschieden abges~ufter Konzentrationen des Standard-Enzympr~paratcs fiber den Analysator und liest die Extinktiomea an den Scheitelpunkten der vom Schreiber av~fgezeichneten Kurven ab (Abb. 2).

~,3~

Abb. 2. Aufzeichnungen des l~egistriergerKtes ffir eine ]Eichkurve

Die Doppelbestimmungen zeigen gute Ubereinstimmung. Dann multi- pliziert man die yon Hand best immte Enzymwirksamkeit des Standard- Enzympr/~parates - - ausgedrfickt in Eiaheiten je Milligramm Pr/~parat - - mi t der angewendeten Konzentrat ion (in mg/ml) und errechnet so die Enzymeinheiten im Milliliter. Diese beiden Daten werden nun auf einem Millimeterpapier gegenein- ander aufgetragen und die Punkte zu einer Eichkurve verbunden. Die Enzyme ergeben mit nieht zu grof~en Km-Werten in diesen Konzen- trationsbereichen nahezu eine Gerade. Ffir die Analyse einer best immten Versuchsreihe sollte man jeweils ein S~andard-Enzympr/~parat verwenden, welches aus mSglichst /thnlichen t~ohstoffen und bci Mikroorganismen auBerdem aus dem gleichen Mikro- organismus gewonnen wurde*

Auswertung der Ergebnisse Nach dem Ablesen der vom Schreiber aufgezeichneten Extinktionen der zu untersuchenden Pr/iparate liest man auf der Eichkurve die Enzym- einheiten im Milliliter ab. Die Wh'ksamkeit der zu untersuchenden Proben errechne~ man dutch Division dieser Werte dm-ch die angewandte Konzentrat ion (in mg/ml).

* Bei den fiir die besohriebene ~ethode durchgefiihrten Untersuchungen wurden Proteinase-Pr/~parate aus verschiedenen Mikroorganismen sowie Pankreaspr~parate der Fa. RShm & Haas GmbH, Darmstadb, verwendet.

Automatische Bestimmung proteoty~ischer Enzyme 195

Bestimmung der optimalen Substrat/conzentration

Die ffir Aktivit~tsbestinnnungen nStige optimale Substratkonzentration kann auch mit Hilfe der kontinuierlichen Methode durehgeffihrt werden. Anstatt eines Substratstromes mit konstanter Konzentration wird ein solcher mit kontinuierlich vers Konzentration zugeffihrt. Dieser Substratgradient wird in einem geeigneten Gefiil~ erzeugt; die jeweilige Konzentration wird dutch Bestimmung tier optimalen Dichte einer parallel laufenden Farbstoffverdfinnnng ermittelt 1.

Feststellung des optimalen pH-Bereiches Bei unbekanrtten Enzymen kann (lurch leichte Abwandlung der be- schriebenen Versuchsanordnung das pH-Optimum des proteolytischen Abbaues festgestellt werden. Dazu wird eine t~eihe yon gepufferten Substratl6sungen verschiedenen pH-Wertes angesaugt, die jewefls nach Erreichen der konstanten Extinktion dem System zugeffihrt wird.

Diskussion

Von den verschiedenen Methoden zur Bestimmung proteolytischer Enzyme (Bestimmung der durchschnittlichen Molekfilgr61]e, der frei- gesetzten Amino- oder Carboxylgruppen, des 16slichen Anteils nach Zusatz yon F/~llungsmittein) waren nut wenige zur automatischen Be- stimmung geeignet. In erster Linie boten sich solehe Methoden an, bei welchen die Vergnderur~gen durch Farbreaktionen sichtbar gemacht werden kSnnen. Auf diesem Prinzip beruhen die in groBem Umfang verwendeten Me- thoden zur Bestimmung des reaktionsfi~higen Tyrosins und Tryptophans mit dem Reagens nach FOLI~ und CZOCALTnU. Wit haben fiir die beschriebene Methode Casein als Substrat gewihlt, und zwar einmal wegen der guten Wirksamkeit der meisten Proteinasen auf Casein, zum anderen wegen seiner relativ geringert Neigung zum Schiiumen beim Mischen mit Trichloressigs~ure im kontinuierlichen Filter. Die Verdoppeltmg der Aztalysenfrequenz yon 10 auf 20 Bestimmungen pro Stunde ist meist mit einer Verringerung der Genauigkeit verbunden, da eine bestimmte Zeit notwendig ist, damit die yore Schreiber aug gezeichneten Kurve~ exakte Scheitelpunkte zeigen. Die vorliegende An- ordnung wurde in einigen tausend Untersuehungen geprfift. Es wurde festgestellt, dab die Schwankungsbreite innerhalb eines Tages im allgemeinen J: 2~ nieht fibertraf. Aber auch Kontrollanalysen, welche art verschiedenen Tagen durch- gefiihrt wurden, wichen kaum starker ab, da jede geringffigige ~xnderung in dem Leitungssystem durch die Eichkurve ausgeglichen wurde.

13"

196 Berieht: Analyse organischer Stoffe

Tro tz der gu ten E ignung dieser Methode zur au toma t i s ehen B e s t i m m u n g d a r f aber n ich t f ibersehen werden, dab d a m i t n u t eine sehr spezielle Seite des proteolytAschen A b b a u s gemessen wird ~, so dab m a n keineswegs d a m i t al lein den p rak t i schen W e r t eines P ro t e inase -P r~pa ra t e s bes t im- men ka~m. Dies k a n n nu r d u t c h gleiehzeit ige Anwend tmg verschiedener Me thoden geschehen, aus deren Ergebn~ssen ein umfassendes Bi ld des A b b a u s zu e rha l ton ist .

Zusammen la s sung

Es wird eine Methode zur au toma t i s ehen B e s t i m m u n g yon pro teo- ly t i schen E n z y m e n besehrieben, welehe besonders zur Un te r suehung grol~er Versuchsreihen yon P r o b e n verg le ichbaren Ursprungs geeignet ist. Die Genau igke i t dieser Methode i s t im Vergleich zu konven t ione l l en ~ e t h o d e n als sehr gu t zu bezeichnen. Die Anzah l der je Tag durch- f f ihrbaren Ana lysen e rh6ht sich d a d u r c h auBerordent l ich .

L i t e ra tu r 11~A~c]LW.: Vortrag, Technicon Symposium 1964, Frankfur~ a.M. -- ~F;ER- I~ARI, A., F.M. R~sso-ALEsI, and J.M.K]~LLu Anal. Chem. 81, 1710 (1959); vgl. diese Z. 178, 452 (1960/61). - - 3a HAGr~ARA, B.: Ann. Rep. Sci. Works Osaka Univ. 2, 35 (1954) . - 3b HACI~A~A, B., u. Mitarb.: J. Bioehem. Tokyo 45, 185, 251, 305 (1958). -- a Kv)uTZ, ]~. : g. Gem Physiol. 80, 291 (1947). - - a ST]~Y~, W.H. , and S. MOORE: 5. Biol. Chem. 211, 907 (1954). - - 6W~L]~FELs, K.: Bioehem. Z. 321, 189 (1950).

DipI.-Chem. W. I~EISNER, RShm & Haas GmbH, Biochemisehe Abteilung 61 Damst~dt , Mainzer Stral~e 42

Bericht iiber die Fortschritte der analytischen Chemie

III. Analyse organischer Stoffe

1. E l e m e n ~ a r a n a l y s e

Fiir die Mikro-CH-Bestimmung benutzen S. M I z u K ~ und T. IEKI 1 ein Gemisch yon Silber und Maugandioxid als Oxydationskatalysator in 6 cm langer, auf 550~ erhitzter, gekSrnter Schieht anstelle yon CuO, Co30 a 2 oder dem thermisehen Zer- setzungsprodukt yon AgMnO 4 a. Der Katalysator ist im Luftstrom voll wirksam, besitzt eine auBerordentlich lange Lebensdauer und lal~t sich regenerieren. Die benutzte Apparatur nimmt nur wenig Raum ein. Ein fiber einen Widerstand regel- barer Vibrator erzeug~ den Lufts~rom, der naeh Passieren yon Natronasbes~- und Mg(C104)2-RShrehen in das 25 em lange Verbrennungsrohr eintritt. Der bewegliehe Ofen fiber dem Substanzschiffchen ist wie fiblich angeordnet, der s~arre, 10 cm lange Ofen beheizt die zwisehen Quarzwolle eingebettete Katalysatorsehicht auf 550~