Fresenius Z Anal Chem (t983) 315 : 479- 485

Einfaches GC-MS-Verfahren zur Bestimmung von Diethylstilbiistrol und verwandter Stilbenderivate in Fleisch und Fleischprodukten*

H. W. Dtirbeck und I. Bilker

Chemiedepartment, Institut fiXr Angewandte Physikalische Chemie der Kernforschungsanlage Jiilich GmbH, Postfach 1913, D-5170 Jiilich, Bundesrepublik Deutschland

Fresenius Zeitschrift fiir

�9 Springer-Verlag 1983

Simple GC-MS-Method for the Determination of Diethylstilbestrol and Related Stilbene Derivatives in Meat and Meat Products

Summary. For the simultaneous determination of diethyl- stilbestrol (DES), dienestrol and hexestrol in specimens of animal origin a simple GC-MS-method is described based on a 3-step extraction procedure, thus being most suitable for routine purposes. Starting from a 50 g sample and making use of the multiple-ion-detection technique (MID) the limit of determination is in the order of 0.1 gg/kg. Details of the clean- up procedure, possibilities of compound identification and problems of the quantitative determination are discussed in detail.

Zusammenfassung. Ffir die simultane Bestimmung der syn- thetischen Masthilfsmittel Diethylstilb6strol, Dien6strol und Hex6strol in Lebensmitteln tierischer Herkunft wird ein einfaches GC-MS-Verfahren beschrieben, welches auf einer 3-stufigen Probenvorbereitung beruht und daher f~r Routi- nekontrollen besonders geeignet ist. Bei einer Probenmenge yon 50g und Einsatz der Multiple-Ion-Detection Technik (MID) liegt die Bestimmungsgrenze in der Gr6Benordnung von etwa 0,1~tg/kg. Einzelheiten der Probenvorbereitung, M6glichkeiten zur qualitativen Identifizierung und Probleme der Quantifizierung werden ausf~hrlich diskutiert.

Ei~fleitung

Die Verwendung von natfirlichen und synthetischen Steroid- hormonen zur Stimulation und Intensivierung der Protein- Biosynthese bei Schlachttieren (Kfilber, Gefliigel) hat in den vergangenen Jahren erheblich zugenommen. Am weitesten verbreitet sind die 6strogenwirksamen Substanzen, wobei die nicht steroidalen k6rperfi'emden Stilbenderivate sowie das Mycotoxin Zeranol besonders h/iufig zum Einsatz kommen, so dab ihnen eine spezielle Bedeutung zukommt.

Auf Grund ihrer steroidanalogen chemischen Struktur besitzen diese Substanzen neben ihrer proteinbildenden Komponente auch hormonelle Nebenwirkungen, die je nach Prfiparat mehr oder weniger stark ausgeprfigt sind und daher bei unkontrolliertem Dauergebrauch zu hormonell bedingten Schfidigungen ffihren k6nnen [ 1 - 3]. Weiterhin gibt es Hin-

* Herrn Prof. Dr. W. Fresenius zum 70. Geburtstag gewidmet Offprint requests to: H. W. Dfirbeck

weise ffir m6gliche carcinogene oder zumindest cocarcinoge- ne Nebenwirkungen der Stilb6strole [ 4 - 6], insbesonders des Diethylstilb6strols (DES) (1).

Diese Befunde haben den Gesetzgeber veranlaBt, die Verwendung von hormonwirksamen Masthilfsmitteln nur unter sehr restriktiven Randbedingungen zuzulassen oder vollstfindig zu untersagen. Beispielsweise ist der Einsatz yon DES und verwandter Stilbenderivate in der Bundesrepublik Deutschland [7] sowie in vielen L~tndern der westlichen Welt fiir alle Anwendungsgebiete ausgeschlossen, was far die zul/issigen Wirkstoffkonzentrationen in Lebensmitteln tieri- scher Herkunft de facto eine Nulltoleranz impliziert.

Die notwendigen Kontrollen dieser gesetzlichen Bestim- mungen sind allerdings mit einer Reihe von gravierenden analytischen Problemen verbunden und haben daher infolge teilweise widerspriichlicher Ergebnisse in der Vergangenheit zu einer erheblichen Rechtsunsicherheit geftihrt.

Analytisehe Erfordernisse

Die Riickstandskonzentrationen, die nach unerlaubter DES- Anwendung in Geweben und Ausscheidungsprodukten yon Schlachttieren zu erwarten sind, bewegen sich im g g /k g - ng/kg-Bereich [8,9]. Detaillierte Daten sind in Tabelle 1 zusammengefal3t. Fiir den eindeutigen Nachweis eines Ver- stol3es gegen die gesetzlichen Bestimmungen sind daher extrem niedrige analytische Nachweisgrenzen erforderlich. Ein weiteres Problem, gleichrangig in seiner Bedeutung, ergibt sich daraus, dab viele Pharmaka im tierischen Organis- mus einem intensiven Metabolismus unterliegen. Beispiels- weise werden einige synthetische Androgene vollstfindig metabolisiert I~ 0, 11 ], so dab ihre unerlaubte Anwendung nut durch die Bestimmung der entsprechenden Metabolite kon- trolliert werden kann, deren Struktur und chemische Eigen- schaften natfirlich bekannt sein mfissen.

Analytische Methoden, die eine effiziente und sichere Kontrolle der gesetzlichen Bestimmungen erm6glichen sol- len, miissen daber zwei wesentliche Kriterien erffillen:

1. hohe Nachweisempfindlichkeit (0,1 pg/kg oder besser) 2. M6glichkeit zur simultanen Erfassung mehrerer Pharmaka und ihrer Metabolite.

Ftir die Bestimmung der Stilb6strole existieren gegenwfir- tig verschiedene Verfahren, die sowohl auf biochemischen als auch auf physikalisch-chemischen Techniken beruhen.

Unter den biochemischen Methoden erreichen nur der Radioimmuntest (RIA) [12] sowie der Enzymimmuntest (EIA) die erforderliche Nachweisempfindlichkeit, die mit etwa 0,02pg/kg angegeben wird_ Allerdings besteht auf

480

Tabelle 1. Erforderliche Nachweisgrenzen zur Bestimmung yon 6strogen- wirksamen Masthilfsmitteln in Geweben und Ausscheidungsprodukten von Schlachttieren; Werte in gg/kg [9]

Muskel ~ 0,02 Fett ~ 0,05 Harn ~ 2 Kot ~ 5

Grund m6glicher Kreuzreaktionen eine gewisse Unsicherheit in der Selektivit/it und Spezifit~it dieser Verfahren, was in der Vergangenheit gelegentlich Anlal3 zu Kritik gegeben hat. Darfiberhinaus ben6tigen beide Methoden im allgemeinen ein spezifisches Antigen ffir jede nachzuweisende Substanz. Sie sind daher relativ zeitaufwendig, wenn eine Reihe ver- schiedener Substanzen in der gleichen Probe nachgewiesen werden soll. SchlieBlich bedingt die beschrfinkte Anzahl der zur Verffigung stehenden Antigene eine generelle Beschr~in- kung in der Anwendung, die immer dann berficksichtigt werden mug, wenn die Immunotests ffir ein m6glichst umfassendes Ostrogen-Monitoring eingesetzt werden sollen.

Auf der anderen Seite bieten moderne physikalisch- chemische Verfahren, wie Glascapillar-Gas-Chromatogra- phie, Capillar-Gas-Chromatographie-Massenspektrometrie und Hochdruckfl/issigkeits-Chromatographie, die M6glich- keit zur simultanen Bestimmung einer Reihe von interessie- renden Substanzen und ffihren damit zu einer erheblichen Reduzierung des Arbeitsaufwandes [13 - 15].

Allerdings mug mit aller Deutlichkeit herausgestellt wer- den, dab unter praktikablen Randbedingungen (handhab- bare Probenmengen) selbst bei Einsatz yon spezifischen Detektionssystemen, wie der multiple-ion detection (MID) in der GC-MS oder der voltammetrischen Detektion (VD) bei der HPLC, gegenw/irtig lediglich Konzentrationen bis zu einer unteren Grenze von etwa 0,1 gg/kg bestimmbar sind. Gegeniiber den Immunotests besteht daher noch immer ein Defizit in der Nachweisempfindlichkeit yon etwa einer halben Gr6Benordnung.

Nachfolgend wird fiber ein Capillar-GC-MS-Verfahren zur simultanen Bestimmung der Stilb6strole Diethylstilb- 6strol (1), Dien6strol (2) und Hex6strol (3) (vgl. Abb. 1) berichtet, welches nur eine sehr einfache Probenvorbereitung erfordert und daher ffir Routinebestimmungen besonders geeignet ist.

Probenvorbereitung

Die experimentellen Einzelheiten einer spezifischen Proben- vorbereitung werden nicht nur durch die jeweilige Substanz- klasse und die individuelle Matrix bestimmt, sondern hfingen auch in ganz entscheidendem Mage yon der Leistungsffihig- keit der nachfolgenden instrumentellen Trenn- und Nach- weisverfahren ab. Bei Einsatz moderner chromatographi- scher Verfahren mit hoher Trennleistung und Selektivitfit empfiehlt sich daher ffir die Substanzklasse der Steroide und Stilbene, die infolge ihrer chemischen Labilitgt durch unsach- gem/ige Behandlung (Temperatur, pH-Wert) leicht irrever- siblen Struktur/inderungen unterliegen k6nnen, eine sehr einfache und schonende Probenvorbereitung. Die bisher publizierten Methoden zur Bestimmung der Stilb6strole in biologischen Matrices tragen diesem Gedanken nicht hinrei- chend Rechnung [16], sondern verwenden selbst dann mehr

O,~~ OH~ Io~OH H H

(1_) (2)

HO,~~ ~OH (~

Abb. 1. Strukturformeln von Diethylstilb6strol (1); z,z-Dien6strol (2) und Hex6strol (3)

oder weniger komplizierte Aufarbeitungsverfahren, wenn ffir die qualitative und quantitative Bestimmung der Pharmaka chromatographische Hochleistungsverfahren wie beispiels- weise die Capillar-GC-MS Verwendung finden [17, 18].

Experimentelles

1. Extraktion

200 bis 250 g Fleisch werden mit einem kunststofffreien Mes- ser in kleine Wfirfel geschnitten, in einem Fleischwolf (Bosch: Typ UM 4) 4 -5 r ea l zerkleinert und homogenisiert und anschliegend in Portionen zu je 50 g aliquotiert. An den Messern haftende Gewebereste werden nach jedem Arbeits- gang mit einer Stahlpinzette entfernt und der Gesamtprobe wieder zugefiihrt. (Kunststoffhaltige Haushaltsgerfite sind aus Grfinden der positiven oder negativen Kontamination generell zu vermeiden.)

50 g Homogenat werden in ein 250 ml-Becherglas fiber- fiihrt und im Ultraschallbad (Bandelin: Typ Sonorex RK 255) unter mechanischem R/ihren mit einem Edelstahl- rfihrer zweimal mit je 70ml Ether (Qualit/it p.a.) 6min extrahiert. Die Etherphase wird jeweils abgegossen und nach Filtration fiber ein vorgereinigtes Weigbandfilter in einem Scheidetrichter gesammelt. Anschliegend wird das Homoge- nat noch 2mal mit je 10ml Ether nachgewaschen. Zur Abtrennung der sauren und phenolischen Komponenten werden die vereinigten Extrakte 2rnal mitje 30 ml 2 M NaOH ausgeschfittelt und die Etherphase verworfen. (Bei stark fetthaltigen Geweben kann die wfil3rig-alkalische L6sung 2mal mit je 20 ml n-Hexan gewaschen werden.) Nach Uber- ffihren in ein Becherglas wird zun/ichst unter Ktihlen mit ca. 15 ml konz. HC1 neutralisiert und dann mit 1 M HC1 auf p H 7 - 7 , 5 eingestellt (pH-Meter-Kontrolle). Anschliel3end wird 2mal mitje 30 ml dest. CHzC12 extrahiert und 5 min bei 9000 U/min zentrifugiert. Hierbei entsteht zwischen den bei- den L6sungsmittelschichten meistens eine dfinne gallertartige Zwischenzone, die die Trennung der flfissigen Phasen jedoch wesentlich erleichtert. Nach evtl. Filtration der organischen Phase fiber ein Weigbandfilter wird am Rotationsverdampfer unter schonenden Bedingungen (Badtemperatur max. 40 ~ C) zur Trockne eingedampft, der R~ickstand mit 4mal 2 ml dest. CHzC1 z in einen Spitzkolben fiberffihrt und nochmals zur Trockne abrotiert.

Die zur Optimierung der chromatographischen Eigen- schaften notwendige Silylierung [11] erfolgt mit J00gl

100.0- 1113

481

[!]

|

N 1038

RIC

| |

500 F::00 ?'00 800 900 1000 1100 SCAN $: 10 11:00 12:50 14:40 1S:30 18:20 20:10 TIME

Abb. 2. Capillar-GC-MS-Chromatogramm einer synthetischen Stilb6strolmischung; S~iule: 30 m Quarz-Capillare belegt mit DB-5. Chromatographi- sche Bedingungen siehe experimenteller Tell. 1 n-Docosan (C-22); 2 cis-DES; 3 Hex6strol; 4 trans-DES; 5 z,z-Dien6strol; 6 n-Pentacosan (C-25); 7 n-Hexacosan (C-26); Stilb6strole als TMS-Ether

MSTFA/Hexan (1:4; v/v) und 30min Reaktionszeit bei Zimmertemperatur. Diese Derivate sind bei kfihler Lagerung unter Feuchtigkeitsausschlul3 mindestens 1 Woche stabil.

2. Capitlar-Gas-Chromatographie - Massenspektrometrie

Geriit. Finnigan - MAT GC/MS/DS System mit Gerstel- Injektor und luftgekiihltem Septumhalter. (Gas-Chromato- graph 9610; Quadrupolmassenspektrometer 4500; Daten- system INCOS 2000.)

lonenquelle. ElektronenstoBionisation: 70 eV, 250 pA bei 150~ Quellentemperatur; zur Reduzierung der Ionenquel- lenverschmutzung werden Kathode und Multiplier erst 10 rain nach Injektion eingeschaltet (siehe Ergebnisse).

Spektrenregistrierung. Cyclischer Massenscan; die optimalen Scanzeiten und Massenbereiche ergeben sich aus den jeweili- gen Wirkstoffkonzentrationen (siehe Abschnitt Diskussion).

Sdule. 30 m Quarz-Capillare (I.D. 0,32 mm), belegt mit DB-5 (ICT - Frankfurt) in Direktkopplung ohne Restriktion. (Temperatur der Verbindung zwischen GC und MS : 250 ~ C.)

Triigergas. Helium; Sfiulenvordruck: 1,6 bar, Linearge- schwindigkeit 75 cm/s bei 200~ Sfiulentemperatur.

Temperaturprogramm. 2 min isotherm bei 80 ~ C, dann pro- grammiert mit 30 ~ C/min auf 185 ~ C, weiter mit 1,5 ~ C/rain auf 210~ und schlieBlich mit 10~ auf 300~

Injektor. Temperatur 260 ~ C.

Probenapplikation. 1 gl splitlos, 2rain nach Injektion wird der Split ge6ffnet (Splitverh/iltnis 1 : 10).

E r g e b n i s s e

Als reprfisentatives Beispiel ffir die Leistungsfghigkeit des yon uns verwendeten GC-MS-Systems sowie der experimentellen Trennbedingungen ist in Abb. 2 das Chromatogramm einer Standardmischung yon Hex6strol, DES (cis und trans) und Dien6strol (Peaks 2 - 5 ) mit charakteristischen Retentions- zeiten zwischen 12 und 16 min wiedergegeben. Die simultan eluierten und mit 1, 6 und 7 bezifferten n-Paraffine dienen als Referenzsubstanzen ffir die Bestimmung der Retentionsin- dices (vgl. Tabelle2). Die unvollst/indige Trennung des kritischen Substanzpaares trans-DES/Dien6strol (Nr. 4 und 5) resultiert aus einem pragmatischen Kompromil3 zwischen analytischer M6glichkeit und routinemfiBiger Notwendigkeit und erffillt alle erforderlichen Kriterien ffir die massenspek- trometrische Identifizierung der beiden Einzelkomponenten. Die notwendige Optimierung der Trennleistung ftir alleinige

482

|

if]

|

| N

I min I/ I I I ' I

20 25 30 35 40

Abb. 3. Capillar-Gas-Chromatogramm einer synthetischen Stilb6strolmischung. Sfiule: 30 m SE-54 Glascapillare (0,32 mm I.D.) (H. und G. J~iggi, Trogen, Schweiz); Trfigergas: Helium, Vordruck 1,2 bar, Lineargeschwindigkeit 40 cm/s bei 200~ S~iulentemperatur. Temperaturprogramm: 2 min isotherm bei 80 ~ C, dann programmiert mit 30 ~ C/rain auf 170 ~ C, welter mit 2 ~ C/min auf 220~ und schliel31ich mit 10 ~ C/min auf 280 ~ C. Substanzen wie in Abb. 2

100.0]

RIC

249

199

301

365

422

476

532

660

Retentionszeitfenster

der Stilb6strole

200 300 400 500 600 700 800 900 SCAN 3:40 5:30 7z20 9:10 11:00 12:50 14:40 16:30 TIME

Abb. 4. Capillar-GC-MS-Chromatogramm einer gewachsenen Kalbfleischprobe (Scan-Zeit 1,1 s, Massenbereich 50-450); chromatographische Bedingungen wie in Abb. 2

1 0 0 . 0 -

412

277'

' , ' 2 9 3

I iiil,A iiiii "]

r

4 ? 9

5

i ilii,A �9 i

4 7 6

iiL 67"0

6~4

8 3

7. ~ 2 0

7 : 3 ' ' 776 8 4

483

412. 123 • 0. 500

RIC

2 4 S

631

199 ~~5 ~O it I

3140 5130 7120 9 1 1 0 11100 12150 14140 IN130 TIME

Abb. 5. Capillar-GC-MS-Chromatogramm einer gewachsenen Kalbfleischprobe. Experimentelle Bedingungen wie in Abb. 4. Unterer Teil: Total- Ionen-Strom-Chromatogramm (RIC); oberer Teil: Fragmentogramm der Masse 412 mit cis-DES (scan 694) und trans-DES (scan 833)

Bestimmungen auf chromatographischer Basis IN3t sich relativ einfach durch Reduzierung der Tr/igergasgeschwin- digkeit und Variation des Temperaturprogramms erreichen (vgl. Abb. 3), fiihrt allerdings zu einer Verdopplung der Retentionszeiten und damit zu einem unn6tigen zusfitzlichen Zeitaufwand.

Tabelle 2. Retentions-Indices einiger silylierter Stilb6strole auf gepack- ten S/iulen und Glascapillaren unterschiedlicher Polarit~it (R.S.D. + 1 bei gepackten S/iulen, + 0,2 bei Capillaren, n = 5)

Substanz S~iule (Temperatur)

OV-25" OV-]01 a SE-54 b DB-5 b (240) (240) (200) (200)

cis-DES 2464 2270 2281,9 2282,3 trans-DES 2572 2370 2383,7 2382,3 Hex6strol 2551 2359 2371,4 2371,5 Dien6strol 2609 2365 2388,6 2387,3 Athinyl6stradiol

Mono-TMS 3142 c 2618 c 2616,7 d 2614,5 a Di-TMS 3111 ~ 2802 c 2802,4 d 2801,6 d

gepackte Sgule b Glascapillare ~ Temperamr 260~ d Temperamr 240~

Tabelle 3. Charakteristische Fragmentionen einiger silyl. Stilb6strole

Substanz Fragmentionen

DES 412 413 383 397 Dien6strol 410 411 395 381 Hex6strol 207 a 399 (414)

Nicht selektiv, dennoch bei entsprechender Retentionszeit spezifisch

Abbi ldung4 zeigt das typische Totalionenstrom-Chro- matogramm (RIC) (Massenbereich 50 bis 450, Cycluszeit 1,1 s) eines Kalbfleischextraktes mit einer Reihe von gesfittig- ten und unges/ittigten Fettsfiuren (in Form ihrer TMS-Ester) als Hauptkomponenten (Peaks 301,476, 631,660, 816). Die direkte Charakterisierung und Bestimmung der Stilb6strole allein aus dem Verlauf des RIC ist infolge der zu erwartenden sehr niedrigen Konzentrat ion in den meisten Ffillen allerdings unm6glich (vgl. den Retentionszeitbereich yon 1 2 - 1 6 min in Abb. 4). Orientierende Hinweise lassen sich jedoch aus den Fragmentogrammen der spezifischen Ionenmassen gewin- nen, die in Tabelle 3 zusammengestellt sind. Als demonstrati- ves Beispiel ist im unteren Teil von Abb. 5 noch einmal der RIC der gleichen Kalbfleischprobe wiedergegeben, wfihrend im oberen Teil die Intensitfiten der Masse 412 dargestellt sind, die einen positiven DES-Befund vermuten lassen (scan 694:

484

1 O O . 8 -

412

413

128.5-

412. 123 -v 8.5~0

$93

8:

8::9

413. 124 + 8. 500

. . . . . . i

RIC 693

12150 13145 14148 15135 TIME

Abb. 6. Capillar-OC-MS-Chromatogramm einer gewachsenen Kalbfleischprobe. (Retentionszeit-Ausschnitt yon 12-16min.) Scan-Zeit 1,1 s, Massenbereich 380- 420. Chromatographische Bedingungen wie in Abb. 2. Unterer Teih RIC des Massenbereichs 380 - 420; mittlerer und oberer Teil: Fragmentogramme der Massen 412 und 413 mit cis-DES (scan 693) und trans-DES (scan 829)

cis -DES und scan 833: trans-DES). Das gleichzeitige Auf- treten beider Isomeren ist eine zusfitzliche und notwendige Voraussetzung fiir diese Annahme, da bei der alkalischen Aufarbeitung grundsgtzlich mel3bare Mengen der cis-Verbin- dung entstehen, deren relativer Anteil zwischen 20 und 60 betragen kann. Pdizisere Informationen erhfilt man aus dem RIC und den Massenintensitgten, wenn bei gleicher Cyclus- zeit des Massenspektrometers nur noch der fSr Stilb6strole interessante Massenbereich (m/z 380-420) registriert wird, was zu wesentlich lLingeren Mel3zeiten der einzelnen Massen und damit zu einem signifikanten Intensit/itsgewinn fiihrt. Auszugsweise zeigt Abb. 6 ftir die gleiche Probe im unteren Teil den RIC dieses Massenbereichs und im oberen Teil die Intensitgten der Massen 412 und 413, die eine eindeutige Identifizierung yon DES erlauben. In diesem speziellen Beispiel kann der RIC auch fSr eine quantitative Bestimmung Verwendung finden.

Diskussion

1. Identifizierung der Stilb6strole

Die massenspektrometrische Identifizierung der Stilb6strole erfolgt nach verschiedenen Modifikationen, deren jeweiliger Einsatz im wesentlichen durch die Wirkstoffkonzentration,

Tabelle 4. Relative Retentionszeiten yon trans-DES, z,z-Dien6strol und Hex6strol (als TMS-Derivate) anf verschiedenen Glascapillaren; Referenzsnbstanz: Cis-DES = 1,000, (R.S.D. + 0,25 ~, n = 15)

Substanz Sw

SE-54 DB-5 cis-DES 1,000 1,000 trans-DES 1,198 1,200 Hex6strol l,173 1,176 Dien6strol 1,212 1,214

die Absolutempfindlichkeit des Massenspektrometers sowie den dynamische Bereich der AD-Wandler bestimmt wird. Da die Nachweisempfindlichkeit starken ger~itebeding- ten Schwankungen unterliegen kann, sind die nachfolgenden Konzentrationsangaben lediglich als orientierende Anhalts- punkte zu verstehen.

- Bei Konzentrationen oberhalb 2 iig/kg genfigt im all- gemeinen die cyclische Registrierung (Scanzeit ca. I s) des Gesamtmassenbereiches (m/z 50 -450 ) mit anschlieBender Zuordnung durch Fragmentographie charakteristischer Io- nenmassen und endgtiltiger Identifizierung durch Vergleich des Gesamtspektrums mit einer Spektrenbibliothek.

- Im Konzentrationsbereich zwischen 0,5 und 2 gg/kg muB der MeBbereich des Massenspektrometers bei gleicher Cy- cluszeit auf etwa 40 Masseneinheiten (m/z 380-420) redu- ziert werden, um die erforderliche Steigerung der Nachweis- empfindlichkeit zu gew/ihrleisten. Die Identifizierung der Stilb6strole erfolgt dann durch Simultanfragmentographie von 4 spezifischen Massen (z. B. m/z 383, 397, 412, 413 ffir DES) und Vergleich der relativen IntensitMen mit einem Referenzspektrum.

- Bestimmungen im Konzentrationsbereich von 0 , 5 - 0,1 gg/kg k6nnen nur noch durch Registrierung eharakteristi- scher Einzel- oder Doppelmassen (MID) bei Cycluszeiten von 4 0 0 - 8 0 0 ms durchgeffihrt werden. Ffir eine sichere Zuord- nung und Identifizierung sind hierbei jedoch neben den massenspektrometrischen Hinweisen reproduzierbare chro- matographische Kenngr6Ben als zus/itzliche Informationen erforderlich. Als besonders geeignet erweisen sich die Relati- ven Retentionszeiten (vgl. Tabelle 4; Referenzsubstanz: cis- DES), die aufgrund ihres sehr niedrigen Variationskoeffizien- ten von + 0,25 ~ eine eindeutige Absicherung der massen- spektrometrischen Daten erm6glichen. Bei DES-freien Pro- ben kann dem silylierten Extrakt eine definierte Menge yon silyliertem DES zugesetzt werden.

2. Quantitative Aspekte

Die richtige und reproduzierbare quantitative Bestimmung dutch Peakfl/ichen-Integration der spezifischen Fragmento- gramme ist besonders im pg-Bereich weitaus problematischer und zeitaufwendiger als die qualitative ja-nein-Entscheidung. Wesentliche Schwierigkeiten resultieren aus der Nichtlineari- t/it der Konzentrations-Peakfl/ichen-Korrelation sowie aus der Mengenabh/ingigkeit der substanzspezifischen Korrek- turfaktoren. Messungen fiber einen 1/ingeren Zeitraum k6n- nen zus~itzlich durch Parallelverschiebungen oder Verlaufs- /inderungen der Eichkurven erschwert werden. Ob diese experimentellen Ph/inomene gerfitespezifisch sind oder ein generelles Problem der GC-MS-Quantifizierung von Stilb- 6strolen darstellen - bedingt etwa dutch konzentrations- oder substanzabh/ingige Absorption - ist Gegenstand gegenw/irtiger Untersuchungen.

Die quantitative Auswertung der Fragmentogramme er- folgt daher vorl/iufig nicht nach der Methode des ,,Inneren Standards", sondern mit Hilfe des Eichzusatz-Verfahrens (Standardaddition). Hierbei wird einer Parallelprobe vor der Aufarbeitung eine bekannte Menge des identifizierten Wirk- stoffes zugesetzt und in identischer Weise analysiert. Durch Korrelation der statistisch abgesicherten Peakfl/ichen (R.S.D. _+ 1 5 ~ bei 100pg und _+ 7 ~ bei 500pg; n > 5) mit den zugeh6rigen Eichkurven erh/ilt man die entsprechenden Konzentrationen, die ffir die Parallelprobe noch um die zugesetzte Wirkstoffkonzentration korrigiert werden mfissen. Dieses Verfahren liefert nicht nut eine Best/itigung ffir die Richtigkeit der Methodik, sondern erm6glicht gleichzeitig auch eine st/indige (Jberprfifung der Wiederfindungsrate, die z. B. ffir DES bei dotierten Proben 9 2 - 9 8 ~o betrfigt.

485

S c h l u B b e m e r k u n g

Das beschriebene GC-MS-Verfahren erm6glicht die simul- tane Bestimmung von DES, Dien6strol und Hex6strol in Fleisch und Fleischprodukten bis zu einer Konzentration von etwa 0,1 ktg/kg bei relativen Standardabweichungen von _+ 50 ~ im 0,1 gg/kg- und + 15 ~ im 1 gg/kg-Bereich (n > 5, davon n' > 2 dotiert). Eine Verbesserung der Nachweisemp- findlichkeit kann durch repetitive 1 ixl-Injektionen bei kalter Sfiule erreicht werden, ist jedoch im allgemeinen mit einer signifikanten Reduzierung der Trennleistung, der S/iulen- stabilit/it und ihrer Lebensdauer verbunden.

Gegenw~irtige Untersuchungen erproben die Ubertrag- barkeit des Aufarbeitungsverfahrens auf glucuronid- oder sulfathaltige Gewebe und Ausscheidungsprodukte yon Schlachttieren (Leber, Niere, Ham). Nach enzymatischer Spaltung k6nnen hierbei m6glicherweise Substanzen ent- stehen, die chromatographisch und (oder) massenspektrome- trisch mit den Stilb6strolen interferieren.

Danksagung. Die Autoren sind Herrn W. Leymann, Frau B. Scheulen und Frau B. Telin filr die exakte Durchfilhrung grundlegender chromato- graphischer Untersuchungen sehr zu Dank verpflichtet.

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