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Aus dem Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin
(Direktor Univ.- Prof. Dr. med. M. Nauck)
der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Einfluss bariatrischer Chirurgie auf das Metabolom des Urins
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Medizin
(Dr. med.)
der
Universitätsmedizin
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
2012
vorgelegt von
Arne Jungnickel
geb. am 17.11.1983
in Halle/Saale
________________________________________________________________________________________ 2
Dekan: Prof. Dr. med. dent. R. Biffar
1. Gutachter: Prof. Dr. med. H. Wallaschofski
2. Gutachter: Prof. Dr. med. W. Gronwald (Regensburg)
Ort, Raum: Klinik und Poliklinik für Innere Medizin A, Ferdinand-Sauerbruch- Straße, 17475 Greifswald, Seminarraum O0.65
Tag der Disputation: Dienstag, 25. Juni 2013
________________________________________________________________________________________ 3
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG 5
1.1. Adipositas und bariatrische Chirurgie 5
1.2. Metabolomik 11
2. METHODEN 13
2.1. Patientenkollektiv 13
2.2. Bestimmung der Metabolitenprofile mittels NMR-Spektrometrie von Urin 15
2.3. Statistische Methoden 16
3. ERGEBNISSE 21
3.1. Deskriptive Statistik 21
3.2. Metabolomik 25
4. DISKUSSION 33
4.1. Deskriptive Statistik 33
4.2. Metabolomik 33
4.3. Stärken und Limitationen der Studie 39
5. ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 42
6. LITERATURVERZEICHNIS 44
7. ANHANG 50
7.1. Eidesstattliche Erklärung 50
7.2. Danksagung 51
________________________________________________________________________________________ 4
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
BMI Body-Mass-Index
BPD Biliopankreatische Diversion
DModX Distance to the Model
FID Aufnahme des zeitabhängigen Signals in der Empfängerspule (Free Induction Decay)
GDM Genetisch determinierter Metabotyp
GIP Gastric Inhibitory Peptide
GLP-1 Glucagon-like-peptide-1
HOMA-IR Homeostatic model assessment of insulin resistance
NMR Kerspinresonanzspektroskop (Nuclear magnetic resonance spectroscopy)
OPLS Orthogonal partial least squares
OPLS-DA Orthogonal partial least squares discriminant analysis
PC Hauptkomponente (Principal component)
PCA Hauptkomponentenanalyse (Principal component analysis)
PLS Partial least squares
PLS-DA Partial least squares discriminant analysis
ppm Parts per million
RD Relaxationsverzögerung (Relaxation delay)
TSP Natriumtrimethylsilylpropionat
VIP-Plot Variable importance in the projection-Plot
WHO Weltgesundheitsorganisation (World Health Organization)
________________________________________________________________________________________ 5
1. Einleitung
1.1. Adipositas und bariatrische Chirurgie
Adipositas ist eine chronische Erkrankung multifaktorieller Genese. In der Verantwortung
finden sich genetische Faktoren genauso wie Gewohnheiten in der Nahrungsaufnahme
und körperlichen Aktivität sowie soziale und kulturelle Faktoren (1). In Deutschland zeigen
Studien, dass 6,3 % der drei- bis 17-jährigen (2) und 12,9 % der über- 18-jährigen von
einer Adipositas betroffen sind (3). Weltweit gehen Schätzungen von rund 500 Millionen
Betroffenen aus, wobei die Tendenz über die letzten drei Jahrzehnte als steigend
beobachtet worden ist (4). Frauen sind von dieser Epidemie häufiger betroffen als
Männer. Abbildung 1 zeigt die geschätzte Prävalenz der Adipositas Grad I bei Frauen
weltweit im Jahr 2010.
Abbildung 1: Geschätzte Prävalenz Adipositas Grad I (BMI ≥ 30 Kg/m²), Frauen, Alter 15+, 2010 Quelle: WHO Global Infobase: International Comparisons
Eine Einteilung der Schwere der Erkrankung geschieht nach der
Weltgesundheitsorganisation (engl. World Health Organization [WHO]) anhand des Body-
Mass-Index (BMI) in Kg/m² entsprechend Tabelle 1.
________________________________________________________________________________________ 6
Tabelle 1: Einteilung der Adipositas nach Body-Mass-Index (BMI). *: Adipositas Grad III wird in der Literatur auch bezeichnet mit Adipositas permagna oder morbide Adipositas. Tabelle nach: WHO, 2000. Obesity: preventing and managing the global epidemic. Report of a WHO Consultation. In WHO Technical Report Series.
Kategorie nach WHO BMI in Kg/m2
Normalgewicht 18,5 – 24,9
Übergewicht 25 – 29,9
Adipositas Grad I 30 – 34,9
Adipositas Grad II 35 – 39,9
Adipositas Grad III* ≥40
Auf Grund sozialer Stigmata und persönlicher Unzufriedenheit sind Adipöse psychisch
und emotional belastet (3). Weiterhin wird eine Zunahme der Prävalenz für Krankheiten
wie Bluthochdruck, kardiovaskuläre Erkrankungen, Lipidstoffwechselstörungen,
Insulinresistenz und Typ 2 Diabetes mellitus, Gallenblasenerkrankungen, Schilddrüsen-
und Nebenschilddrüsenfehlfunktion, Schlaganfall, obstruktives Schlafapnoe-Syndrom,
Steatosis hepatis und degenerative Gelenkerkrankungen beobachtet (1,5–7). Darüber
hinaus wird eine Assoziation zu Malignomen beschrieben. So wird in einem Artikel von
Calle und Kollegen (8) Adipositas für 14 % der männlichen und 20 % der weiblichen
Krebstoten in einem Zeitraum von 25 Jahren in den USA verantwortlich gemacht.
Insgesamt kann in den genannten Adipositas-bedingten Morbiditäten eine Ursache für die
verminderte Lebenserwartung in Personen mit Adipositas gesehen werden (9).
Neben den persönlichen Folgen stellt die Adipositas ein großes
gesundheitsökonomisches Problem dar. Erkrankungen assoziiert mit Übergewicht und
Adipositas verursachten im Jahr 2002 geschätzte direkte Kosten in Höhe von 4 854
Millionen EUR und stellten damit 2,1 % der Gesamtausgaben im Gesundheitswesen der
Bundesrepublik Deutschland dar. Indirekte Kosten, verbunden z.B. mit
Produktivitätsausfall durch Invalidität oder Tod, beliefen sich auf geschätzte 5 019
Millionen EUR (3).
Behandlungsversuche der morbiden Adipositas sowie des Übergewichtes beinhalten den
Versuch einer Herbeiführung von Verhaltensänderungen – gesteigerte körperliche
Aktivität, Reduzierung der täglich aufgenommenen Kalorien zusätzlich zu einer generellen
Umstellung des Diätplans – erreicht durch psychosoziale/psychotherapeutische
________________________________________________________________________________________ 7
Interventionen, Ernährungsberatung und Physiotherapie (10). Zusätzlich gibt es die
Option der Therapie mit Medikamenten wie Orlistat und - im Prinzip als Ultima ratio - die
irreversible Möglichkeit der bariatrischen Chirurgie.
Da bisherige Studien zeigen konnten, dass die bariatrische Chirurgie aktuell die
effektivste Methode ist, einen zügigen, langanhaltenden und vor allem relevanten
Gewichtsverlust herbeizuführen, hat sie sich in vielen Zentren als bevorzugte Therapie zur
Behandlung morbider Adipositas durchgesetzt (10–12). Dabei sind bariatrische
Maßnahmen kosteneffektiv gegenüber der konservativen Behandlung oder keiner
Behandlung (13). Bei Komorbidität mit z.B. Diabetes mellitus ist Kosteneffektivität in
mehreren Studien international deutlich belegt worden (14–16), so auch namentlich für
Deutschland (17).
Aktuelle Leitlinien legitimieren alle Patienten zur bariatrischen Chirurgie, welche in nicht-
chirurgischen Modalitäten keinen Behandlungserfolg erzielen konnten, von Adipositas
Grad III betroffen sind oder mindestens Adipositas Grad II und eine schwere,
„adipositasassoziierte Folge-/Begleiterkrankung aufweisen“ (6).
Analog zur Zunahme des Anteils übergewichtiger und adipöser Menschen an der
Gesamtbevölkerung nimmt die Nachfrage nach bariatrischer Chirurgie in Deutschland,
wie auch global, exponentiell zu (6,18). So wurden im Jahr 2008 weltweit nahezu 350 000
bariatrische Eingriffe vorgenommen (10). Dabei sind die am häufigsten durchgeführten
Verfahren das variable Magenband mit einem Anteil von 42 %, der Roux-en-Y
Magenbypass mit einem Anteil von 39 % und die Bildung eines Schlauchmagens mit
einem Anteil von 5 % (19). Standardmäßig werden diese Verfahren heute laparoskopisch
durchgeführt (6).
Die in der bariatrischen Chirurgie benutzten Operationsmethoden lassen sich nach den
Hauptmechanismen ihrer Wirkung grob einteilen in restriktive und malabsorptive
Verfahren sowie Mischformen aus Beidem. Den primär restriktiven Verfahren ist gemein,
dass durch eine starke Verkleinerung des Magens die Nahrungszufuhr limitiert werden
soll und sich gleichzeitig ein Sättigungsgefühl früher einstellt. Zu den heute üblichen
primär restriktiven Verfahren gehören der Magenballon, das variable Magenband und die
Bildung eines Schlauchmagens. Zu den Verfahren mit überwiegend malabsorptiver
Komponente gehören die „Biliopankreatische Diversion nach Scopinaro“ und der distale
________________________________________________________________________________________ 8
Magenbypass. Beide Verfahren stellen Außenseiter dar und zählen nicht zu den aktuell
gängigen Verfahren (6). Mechanismus der malabsorptiven Verfahren ist eine späte
Vermischung der Verdauungssäfte aus Galle und Pankreas mit der aufgenommenen
Nahrung. Dadurch kommt es zu einer späteren und reduzierten Aufnahme von
Energieträgern aus der Nahrung, vor allem von Fett (18).
Zu den gängigen Kombinationsverfahren gehören der bereits erwähnte Roux-en-Y
Magenbypass und die biliopankreatische Diversion mit/ohne Duodenalswitch. Die
Kombinationsverfahren sollen die Vorteile der restriktiven Maßnahmen mit denen der
malabsorptiven vereinen, sind aber in der Durchführung schwieriger und auch
komplikationsbelasteter als die rein restriktiven Verfahren (10,18).
Die Fähigkeit, zu einem Gewichtsverlust zu führen, ist bei den erwähnten Verfahren
unterschiedlich. In einem systematischen Review von Padwal und Kollegen (10) konnten
folgende Werte anhand von 2 600 Patienten ermittelt werden: Im Vergleich zur
konservativen Behandlung wurde bei der biliopankreatischen Diversion ein Verlust um
11,2 Kg/m2, der Schlauchmagenbildung um 10,1 Kg/m2, dem Roux-en-Y Magenbypass
um 9,0 Kg/m2 und dem adjustierbaren Magenband um 2,4 Kg/m2 innerhalb eines Jahres
nach Operation beobachtet. Konservative Behandlung schloss Diäten und Diäten in
Verbindung mit Sportprogrammen ein.
Hormonelle Beeinflussung spielt bei allen Verfahren eine Rolle. So verändert die
Schlauchmagenbildung durch ihren hohen Anteil an reseziertem Magengewebe die
Wirkung des Hormons Ghrelin. Dies wird vor allem darauf zurückgeführt, dass bei der
Entfernung von ca. 4/5 des Magens auch 80 % der Ghrelinrezeptoren verloren gehen
(18). Ghrelin wird für eine Vermittlung von Hungergefühl im Zentralnervensystem
verantwortlich gemacht (20). Wird, wie bei den Kombinationsverfahren und den
überwiegend malabsorptiven Verfahren, die Nahrungspassage durch große Teile des
Magens sowie Duodenums ausgeschaltet, hat dies u.a. einen Einfluss auf das Glukagon-
like-peptide-1 (GLP-1) und das Gastric-inhibitory-peptide (GIP). Diese befinden sich
ebenfalls in der Diskussion um ihren Anteil an der Genese der Adipositas und des
Diabetes mellitus. GLP-1 und GIP sind verantwortlich für ca. 50 % der postprandialen
Insulinsekretion (21,22). Die hormonellen Veränderungen werden auch als Ursache
diskutiert, warum die bariatrische Chirurgie einen frühzeitigen positiven Einfluss auf den
________________________________________________________________________________________ 9
Verlauf metabolischer Folgeerkrankungen wie Typ 2 Diabetes mellitus und Hypertonie
nimmt.
So benötigten in einer Studie von Kiong und Kollegen (23) über 50 % der Patienten
innerhalb von vier Wochen nach dem Roux-en-Y Magenbypass keine antidiabetische
Medikation mehr. Diese Veränderung trat auf, bevor sich signifikanter Gewichtsverlust
einstellte. Darüber hinaus wurde eine signifikante Verringerung der Insulinresistenz 15
Tage nach Biliopankreatischer Division nach Scopinaro beobachtet (24). Nach
Magenbypassoperation kommt es postprandial zu einem Anstieg der Inkretine, namentlich
GLP-1 und GIP. Diese Veränderungen wurden nicht nach einem allein durch Diät
erreichten äquivalenten Gewichtsverlust gesehen (25). Außerdem gleicht sich der
Inkretin-vermittelte Effekt auf die Insulinausschüttung - bei Typ 2 Diabetes mellitus-
Patienten abgeschwächt - dem schlanker Kontrollen innerhalb eines Monats nach
Magenbypass-Operation an (26). Weiterhin wird von einer Senkung der Hypertonie und
systemischer Entzündungsmarker (wie das C-reaktive Protein) innerhalb der ersten vier
Wochen nach adjustierbarem Magenband, Roux-en-Y Magenbypass und
Schlauchmagenbildung berichtet (27,28). Für Roux-en-Y Magenbypass wurde bereits
nach einer Woche post-operativ eine Verringerung der diastolischen und systolischen
Blutdruckwerte beobachtet, ohne dass es in diesem Zeitraum zu signifikantem
Gewichtsverlust gekommen war (29). Ferner wurde in Nagetiermodellen des Roux-en-Y
Magenbypasses ein anhaltender Gewichtsverlust und eine verringerte
Nahrungsaufnahme beobachtet, obwohl die Tiere bei einer hochkalorischen Diät gehalten
wurden (30). Auch für durch Schlauchmagenbildung operierte Nagetiere konnte ein
anhaltender Gewichtsverlust in Verbindung mit reduzierter Nahrungsaufnahme
beobachtet werden. Selbst als sich die Nahrungsaufnahme der nicht-operierter Kontroll-
Tiere anglich, nahmen die operierten Tiere nicht an Gewicht zu (31). Dies legt nahe, dass
bariatrische Chirurgie auch das Verhalten bei der Nahrungsaufnahme beeinflusst. So
konnte gezeigt werden, dass Patienten postoperativ weniger hungrig und früher satt sind
(32), dass sie eine veränderte Geschmackswahrnehmung haben (33,34) und eine
reduzierte Präferenz für Nahrung mit hoher Energiedichte aufweisen (35). Der Einfluss auf
Appetit und Sättigungsgefühl konnte in einer prospektiven, doppelblinden Studie von
Karamanakos und Kollegen für den Roux-en-Y Magenbypass und die
Schlauchmagenbildung dokumentiert werden (36).
________________________________________________________________________________________ 10
Die Patienten in dieser Arbeit wurden entweder mit der Bildung eines Schlauchmagens
oder dem Roux-en-Y Magenbypass operativ behandelt.
Dabei wird die Schlauchmagenbildung standardmäßig laparoskopisch durchgeführt. Das
gastrokolische Band (Ligamentum gastrocolicum) wird magennah durchtrennt. Das große
Netz (Omentum majus) wird nicht entfernt. Über den Mund wird eine 32 - 44
French/Charr-Magensonde in den Magen eingeführt und kleinkurvaturseitig platziert.
Diese dient als Kalibrierung und Leitstruktur. Danach wird ab Beginn des netzfreien
Anteils der großen Kurvatur begonnen, mit dem Klammernahtgerät in Richtung His-Winkel
zu resezieren. Antrum und Pylorus werden erhalten, große Kurvatur und Fundus werden
entfernt. Der resezierte Magenanteil sollte ein Volumen von mindestens 500 ml
aufweisen. Der verbleibende Schlauchmagen sollte nur noch ein Füllungsvolumen von
100-150 ml aufweisen (6,18). Abbildung 2, links illustriert dies schematisch.
Abbildung 2. Links: Bildung eines Schlauchmagens. Antrum und Pylorus werden erhalten, große Kurvatur und Fundus werden entfernt. Rechts: Roux-en-Y Magenbypass. Jejunum wird direkt an den Magenpouch anastomosiert, der Rest-Magen verbleibt in Situ. Hier Seit-zu-Seit-Anastomose zwischen alimentärer und biliopankreatischer Schlinge. Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. med. Th. Hüttl (37).
Der Roux-en-Y Magenbypass wird ebenfalls standardmäßig laparoskopisch durchgeführt.
Dazu wird der Magen unterhalb des Ösophagus mit dem Klammernahtgerät durchtrennt.
Dabei wird kleinkurvaturseitig ein Stück Magenanteil mit Volumen von ~30 ml
(Magenpouch) belassen. Der größere, von der Nahrungspassage ausgeschlossene
________________________________________________________________________________________ 11
Magenrest, verbleibt an ursprünglicher Stelle. Die Rekonstruktion der Nahrungspassage
erfolgt nach Roux-en-Y. Dazu wird der Dünndarm distal des Treitz-Bandes (Ligamentum
suspensorium doudeni) durchtrennt und der aborale Schenkel mit Hilfe des
Klammernahtgerätes an den Magen-Pouch anastomosiert. Anschließend wird eine End-
zu-Seit oder Seit-zu-Seit Anastomose zwischen alimentärer und biliopankreatischer
Schlinge geschaffen, um ein Zusammentreffen der Gallen- und Pankreassekrete mit der
Nahrung zu ermöglichen. Die Länge der biliopankreatischen Schlinge beträgt in der Regel
50 bis 100 cm und die der alimentären Schlinge 100 bis 250 cm (6,18). Abbildung 2,
rechts zeigt eine schematische Übersicht.
Insgesamt muss erwähnt werden, dass die vollständigen Mechanismen, die zu den
beeindruckenden Ergebnissen der o.g. Maßnahmen führen, noch Gegenstand der
Forschung sind. Der Gewichtsverlust allein kann diese Veränderungen nicht erklären.
1.2. Metabolomik
Der Begriff Metabolomik umfasst die Identifikation und Quantifizierung aller
Stoffwechselprodukte (Metabolite) einer Zelle, eines Gewebes, eines Organs oder eines
gesamten Organismus unter verschiedenen Bedingungen zu einem bestimmten
Zeitpunkt. Das Metabolom bezeichnet die Gesamtheit aller Metabolite einer Probe. Es ist
dynamisch und repräsentiert das Antwortverhalten auf einen, die jeweilige Entität
betreffenden, Stimulus (38). Es ist wie ein Fingerabdruck z.B. einer Zelle in einer
bestimmten Situation und kann genutzt werden, um Veränderungen zu klassifizieren, um
sie in anderen Zellverbänden zu detektieren oder um nachzuweisen, dass bestimmte
Einflüsse bestehen oder nicht mehr bestehen.
Bestimmt wird das Metabolom aus Körperflüssigkeiten wie Plasma und Urin oder aus
Extrakten von Zellverbänden und Organen.
Zur Messung nach Auftrennung werden massenspektrometrische Verfahren oder das
Kernspinresonanzspektroskop (engl. nuclear magnetic resonance [NMR] spectroscopy)
verwendet.
In einer Studie konnte gezeigt werden, dass ein spezifischer adipöser, aus dem Urin
gemessener Metabotyp existiert. In dieser Arbeit wurden 15 männliche Patienten mit
________________________________________________________________________________________ 12
einem BMI ≥ 40 mit zehn altersgematchten normalgewichtigen männlichen Kontrollen
verglichen. Zur Messung wurde ein Kernspinresonanzspektroskop verwendet. Anhand
vierer Metabolite (Hippursäure, Trigonellin [N-Methylnicotinat], 2-Hydroxyisobutyrat und
Xanthin) konnte deutlich zwischen der adipösen und der schlanken Kontrollgruppe
unterschieden werden. Weiterhin unterzogen sich zwei adipöse Patienten einem
bariatrischen Eingriff, dem Roux-en-Y Magenbypass und der Biliopankreatischen
Diversion. Mit dem einsetzenden Gewichtsverlust glich sich der Metabotyp dem der
schlanken Kontrollgruppe an (39). Meines Wissens ist die Arbeit von Calvani et al. aktuell
die einzige, welche die Auswirkungen der bariatrischen Chirurgie auf das Metabolom
untersucht.
Da restriktive und malabsorptive Mechanismen nicht ausschließlich für den Erfolg der
bariatrischen Chirurgie verantwortlich sind, soll mit einem Metabolomik-Ansatz untersucht
werden, ob frühzeitige (bis 13 Tage nach Operation) Veränderungen im Urin feststellbar
sind. In einer aktuellen Publikation unserer Arbeitsgruppe (40) konnte gezeigt werden,
dass genetische Polymorphismen, die stoffwechselregulierende Gene betreffen und die
für Enzyme und Transportproteine codieren, zu einem spezifischen und differenzierbaren
metabolischen Phänotyp führen, welcher im Urin gemessen werden konnte. Dies wurde
als „genetisch determinierter Metabotyp“ (GDM) bezeichnet. Es ist vorstellbar, dass ein
GDM für Adipositas existiert, der durch eine erfolgreiche bariatrische Chirurgie
beeinflussbar ist.
Die Untersuchung einer frühen postoperativen Wirkung der bariatrischen Chirurgie auf
das Metabolom des Urins geschieht auch mit dem Ziel, in Zukunft Metabolite identifizieren
zu können, welche zu diesem erwarteten Unterschied assoziiert sind. Damit könnten
Stoffwechselwege aufgedeckt werden, die den bisher fehlenden Anteil am Gelingen der
bariatrischen Chirurgie erklären. Letzten Endes könnte dies zur Entwicklung weniger
invasiver chirurgischer Eingriffe oder sogar spezifischer und individueller
Pharmakotherapie der morbiden Adipositas und ihrer metabolischen Begleiterkrankungen
führen. Die Frage, ob bariatrische Chirurgie bereits nach einem kurzen Zeitraum einen
Einfluss auf das Urin-Metabolom hat, ist der erste Schritt auf diesem Weg.
________________________________________________________________________________________ 13
2. Methoden
2.1. Patientenkollektiv
Aus den chirurgischen und internistischen Akten des städtischen Krankenhauses Dresden
Neustadt wurden die Metadaten von 53 Patienten entnommen, welche sich im Zeitraum
von 2009 bis einschließlich 2010 dort einer bariatrischen Operation unterzogen hatten.
Die Patienten hatten ihre Einwilligung zur Nutzung ihrer Daten zu Forschungszwecken zu
Beginn der Therapie gegeben. Die Patienten gaben Blut und Urin ab, nah vor der
Operation, zeitnah nach der Operation sowie in einem Zeitraum von 70 bis 120 Tagen,
150 bis 240 Tagen und 326 bis 410 Tagen nach der Operation. Zusätzlich wurden zu
diesen Untersuchungszeitpunkten anthropometrische Daten erhoben. Die Urinproben
wurden im Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin der Universität
Greifswald analysiert.
Das Patientenkollektiv besteht aus 40 weiblichen Patienten mit einem Durchschnittsalter
zum Operationszeitpunkt von 45 Jahren (± 10 Jahre) und 13 männlichen Patienten im
Alter von 51 Jahren (± 8 Jahre), insgesamt 53 Patienten mit durchschnittlichem Alter von
47 Jahren (± 10 Jahre) zum Zeitpunkt der Operation.
Die Patienten wurden nach zwei verschieden Methoden operiert. 41 Patienten - 30
Frauen und elf Männer - bekamen laparoskopisch einen Schlauchmagen angelegt. Bei
zwölf Patienten - zehn Frauen und zwei Männern - wurde laparoskopisch ein Roux-en-Y
Magenbypass angelegt. Die Entscheidung zur Art der Operation erfolgte nach vorheriger
Aufklärung und Empfehlung durch den Patienten. Siehe hierzu Abbildung 3.
________________________________________________________________________________________ 14
Abbildung 3: Diagramm des Patientenkollektivs mit durchschnittlichem Alter ± Standardabweichung
Das durchschnittliche Gewicht der Patientinnen (w) vor der Operation beträgt 138,38 Kg
(± 25,42 Kg), der BMI 49,79 Kg/m² (±8,66 Kg/m²). Das durchschnittliche Gewicht der
Patienten (m) beträgt 156,65 Kg (± 26,47), der BMI 49,45 Kg/m² (± 7,54 Kg/m²), ebenfalls
vor der Operation. Hierzu gibt Tabelle 2 einen Überblick.
Tabelle 2: Gewicht und Body-Mass-Index (BMI) der Patienten vor Operation
Kilogramm BMI in Kg/m²
Gesamt 142,95 ± 26,65 49,71 ± 8,32
Frauen 138,38 ± 25,42 49,79 ± 8,66
Männer 156,65 ± 26,47 49,45 ± 7,54
Aus dem Patientenkollektiv von 53 Patienten mit anthropometrischen Daten und
Urinproben wurden anthropometrische Daten von 51 Patienten für die Erstellung der
deskriptiven Statistik verwendet. Die Daten von zwei Patienten wurden wegen
Unvollständigkeit von der Analyse ausgeschlossen. Urinproben von 50 Patienten wurden
für den Vergleich des Metabolomik-Ansatzes präoperativ versus postoperativ verwendet.
Die Urinproben von drei Patienten konnten wegen Unvollständigkeit - entweder Fehlen
der präoperativen Probe oder der postoperativen Probe - nicht untersucht werden und
wurden von der Analyse ausgeschlossen.
53 Patienten47 ± 10 Jahre53 Patienten47 ± 10 Jahre
13 Männer51 ± 8 Jahre13 Männer
51 ± 8 Jahre
N = 10Roux-en-Y
Magenbypass
N = 10Roux-en-Y
Magenbypass
N = 30Schlauch-
magen
N = 30Schlauch-
magen
N = 11Schlauch-
magen
N = 11Schlauch-
magen
N = 2Roux-en-Y
Magenbypass
N = 2Roux-en-Y
Magenbypass
40 Frauen45 ± 10 Jahre40 Frauen
45 ± 10 Jahre
53 Patienten47 ± 10 Jahre53 Patienten47 ± 10 Jahre
13 Männer51 ± 8 Jahre13 Männer
51 ± 8 Jahre
N = 10Roux-en-Y
Magenbypass
N = 10Roux-en-Y
Magenbypass
N = 30Schlauch-
magen
N = 30Schlauch-
magen
N = 11Schlauch-
magen
N = 11Schlauch-
magen
N = 2Roux-en-Y
Magenbypass
N = 2Roux-en-Y
Magenbypass
40 Frauen45 ± 10 Jahre40 Frauen
45 ± 10 Jahre
________________________________________________________________________________________ 15
2.2. Bestimmung der Metabolitenprofile mittels NMR-Spektrometrie von
Urin
Präparation von Urinproben für NMR-Analyse
Die Urinproben wurden nach Entnahme auf -80°C gefroren und in diesem Zustand bis zur
Analyse belassen. Für die spektroskopische Analyse wurden 450 µl Urin mit 50 µl
Phosphatpuffer versehen, um den Urin pH-Wert bei 7,0 (+/- 0,35) zu stabilisieren. Dieser
Puffer besteht aus 0,1 % Natriumtrimethylsilylpropionat (TSP), Kaliumdihydrogenphosphat
(KH2PO4), 1,5 M und Natriumazid (NaN3) 3mM aufgelöst in Deuteriumoxid (D2O).
Die Probenverarbeitung und -messung muss in hohem Maß reproduzierbar sein, um die
spektroskopischen Daten statistisch auswerten zu können. Um dies zu erreichen, wurde
die Qualität der NMR-Spektren kontrolliert. Anhand der Überprüfung von Linienbreite und
Signal-Rausch Verhältnis des TSP-Signals, der Bestimmung des Mittleren Fehlers der
Kreatininkonzentration und der Phasenkorrektur ausgesuchter Signale wurde die Qualität
der NMR-Spektren beurteilt.
1H-NMR spektroskopische Analyse von Urinproben
Die Urinspektren werden an einem NMR-Spektrometer AVANCE-II 400 (Bruker BioSpin
GmbH, Rheinstetten, Deutschland) aufgezeichnet. Das NMR-Gerät verfügt über einen
supraleitenden Magneten mit einer Feldstärke von 9,4 Tesla, was einer
Resonanzfrequenz im 1H-NMR-Spektrum von 400 MHz entspricht.
Die Proben werden über einen Liquidhandler (Gilson) der NMR-Durchflusszelle zugeführt
(Flow-Injection-NMR). Die Urinproben werden bei einer Temperatur von 300 K (26,85°C)
unter Berücksichtigung einer standardisierten 1D 1H-NMR Pulssequenz mit
Unterdrückung des Wassersignals (NOESYPRESAT) [RD − P(90o) − 4µs − P(90o) − tm −
P(90o) – Aufnahme des zeitabhängigen Signals in der Empfängerspule (Free Induction
Decay)] gemessen. Der 90° Puls beträgt 9,4 µs.
________________________________________________________________________________________ 16
Die Relaxationsverzögerung (RD), Mischdauer tm und Akquisitionszeit werden
entsprechend auf 4 s, 100 ms und 3,96 s eingestellt. Daraus resultiert eine Zyklusdauer
von ca. 8 s.
Nach Aufzeichnung von vier Dummy-scans werden jeweils 32 FID-scans in eine
Spektrengröße (td) von 32k Datenpunkten bei einer Spektrenbreite (sw) von 20,689 ppm
akkumuliert
Vor der Fourier-Transformation wurde auf den FIDs eine exponentielle Multiplikation von
lb = 0,3 Hz angewandt. Alle Spektren wurden mit dem Programm TOPSPIN2.1 (Bruker
Biospin) prozessiert und anschließend zur statistischen Analyse in MATLAB transferiert.
2.3. Statistische Methoden
Deskriptive Statistik
Abbildung 4: Diagramm der anthropometrischen Daten von Patienten eingeflossen in deskriptive Statistik
Analog Abbildung 4 flossen aus dem Patientenkollektiv die Daten von 51 Patienten in die
deskriptive Statistik ein. Ausgewertet und dargestellt wurden Daten bezüglich des
Gewichtsverlaufs in Kilogramm, des Verlaufs des Body-Mass-Index, des Verlaufs der
51 Patienten51 Patienten
13 Männer13 Männer
N = 9Roux-en-Y
Magenbypass
N = 9Roux-en-Y
Magenbypass
N = 29Schlauch-
magen
N = 29Schlauch-
magen
N = 11Schlauch-
magen
N = 11Schlauch-
magen
N = 2Roux-en-Y
Magenbypass
N = 2Roux-en-Y
Magenbypass
38 Frauen38 Frauen
53 Patienten53 Patienten
Ausschluss:N = 2; unvollständiger
Datensatz
Ausschluss:N = 2; unvollständiger
Datensatz
51 Patienten51 Patienten
13 Männer13 Männer
N = 9Roux-en-Y
Magenbypass
N = 9Roux-en-Y
Magenbypass
N = 29Schlauch-
magen
N = 29Schlauch-
magen
N = 11Schlauch-
magen
N = 11Schlauch-
magen
N = 2Roux-en-Y
Magenbypass
N = 2Roux-en-Y
Magenbypass
38 Frauen38 Frauen
53 Patienten53 Patienten
Ausschluss:N = 2; unvollständiger
Datensatz
Ausschluss:N = 2; unvollständiger
Datensatz
________________________________________________________________________________________ 17
Gewichtsabnahme und des Übergewichtsverlustes in Prozent jeweils über den
Beobachtungszeitraum. Übergewichtsverlust in Prozent wurde berechnet als
[100×(Körpergewicht vor der Operation – aktuelles Körpergewicht)/Übergewicht].
Übergewicht wurde berechnet als Differenz zwischen Körpergewicht vor der Operation
und einem Körpergewicht korrespondierend zu einem BMI von 25 Kg/m² des jeweiligen
Patienten.
Darstellung und Auswertung erfolgte mit Microsoft Excel 2007. Die Daten sind dargestellt
als Mittelwert ± Standardabweichung.
Metabolomik
Die Rohspektren wurden in das Programm MATLAB (Mathworks, Natich, MA, USA)
eingelesen und es erfolgte die Skalierung auf TSP (-0,2 – 0,2 ppm) und Kreatinin (3,03 –
3,07 ppm). Danach wurden die NMR Spektren im ppm Bereich von 0,5 – 9,5 auf 250
Buckets reduziert, welches einer Bucketweite von 0,036 ppm entspricht. Jedes Bucket
erhält den Wert des absoluten Integrals des Spektrumbereiches, welches es repräsentiert.
Für die Analysen wurden die Buckets (112 - 128), welche das Wassersignal enthalten,
ausgeschlossen, insgesamt sind somit 233 Buckets in die Analysen eingeflossen. Die
anschließenden multivariaten Auswertungen erfolgten mit dem Programm SIMCA-P+ 12.0
(Umetrics AB, Umeå, Schweden).
Multivariate Analysen wurden genutzt, um präoperative Spektren und postoperative
Spektren innerhalb der ersten 13 Tage nach der Operation zu vergleichen. In Abbildung 5
ist ein genereller Workflow für die Analysen mit SIMCA-P+ dargestellt.
Die X Matrix setzt sich zusammen aus den Buckets sowie Geschlecht und Alter der
Probanden zum Zeitpunkt der bariatrischen Operation. Die Daten wurden Pareto-skaliert
(Skalierungsgewicht für Spalte k = 1/ √Standardabweichung von k). Pareto-Skalierung
repräsentiert einen Mittelweg zwischen keiner Skalierung und Skalierung auf die Varianz
und ist geeignet für spektroskopische Daten.
Die Hauptkomponentenanalyse (PCA - principal component analysis) wurde genutzt, um
einen Überblick über die Daten zu erlangen. Die PCA ist eine statistische Methode, die
________________________________________________________________________________________ 18
Abbildung 5. Auswertungs-Workflow für Metabolomikdaten in Anlehnung an Eriksson et al (41).
der Dimensionenreduktion von komplexen Datensätzen dient (42). Bei der Modellbildung
werden aus den Originalvariablen (X Matrix) neue Variablen ermittelt, die orthogonal
zueinander und damit unkorreliert sind. Diese Variablen werden als Hauptkomponenten
(PC - principal component) bezeichnet und stellen linear Kombinationen der
Daten aufbereiten- Auswahl der X Variablen: Alter, Geschlecht, 233 Buckets
- Skalierung der X Variablen: Pareto scaling: Gewicht = 1/sqrt(STD)
- Auswahl der Beobachtungen und Definition der Y Variable:
Prä-OP vs. Post-OP(1-13T))
Datengenerierung- Erstellung und Einlesen der 250 Buckets
Datenübersicht- Deskriptive Statistik der Rohdaten: Histogramm (Verteilung), Scatterplot- PCA (principal component analysis)
Evaluation des Modells- Modelübersicht: R2/Q2 Plot, X/Y Plot
- Ausreißerdetektierung: t1/t2 Plot, Distance to Model X-Block Contribution (DmodX) plot, Hotelling's T2Range plot
- Residuen: DmodX Plot, Residual Normal Probability Plot
- Score Plot
- Variablen Plots: Loading, PLS Regressionskoeffizienten, VIP
- Validierung durch PLS Permutation
Berechnung des Modells- PCA- PLS-DA (partial least squares - discriminant analysis) mit Crossvalidierung- OPLS-DA (orthogonal PLS-DA) mit Crossvalidierung
Annahme des Modells ?
Validierung des Modells- Anwendung des Modells auf neue Daten- Prädiktion Plot- Klassifizierungstabelle
JA
NEIN
Daten aufbereiten- Auswahl der X Variablen: Alter, Geschlecht, 233 Buckets
- Skalierung der X Variablen: Pareto scaling: Gewicht = 1/sqrt(STD)
- Auswahl der Beobachtungen und Definition der Y Variable:
Prä-OP vs. Post-OP(1-13T))
Datengenerierung- Erstellung und Einlesen der 250 Buckets
Datenübersicht- Deskriptive Statistik der Rohdaten: Histogramm (Verteilung), Scatterplot- PCA (principal component analysis)
Evaluation des Modells- Modelübersicht: R2/Q2 Plot, X/Y Plot
- Ausreißerdetektierung: t1/t2 Plot, Distance to Model X-Block Contribution (DmodX) plot, Hotelling's T2Range plot
- Residuen: DmodX Plot, Residual Normal Probability Plot
- Score Plot
- Variablen Plots: Loading, PLS Regressionskoeffizienten, VIP
- Validierung durch PLS Permutation
Berechnung des Modells- PCA- PLS-DA (partial least squares - discriminant analysis) mit Crossvalidierung- OPLS-DA (orthogonal PLS-DA) mit Crossvalidierung
Annahme des Modells ?
Validierung des Modells- Anwendung des Modells auf neue Daten- Prädiktion Plot- Klassifizierungstabelle
JA
NEIN
________________________________________________________________________________________ 19
Originalvariablen dar. Im Verlauf der PCA erhält jeder Datenpunkt neue Koordinaten,
welche Scores T genannt werden.
X = TPT → T = XP (Matrixschreibweise)
P - Loadingmatrix.
Die Loadings P geben an, welche Variablen die PCs beeinflussen und wie die Variablen
korreliert sind. In der Regel erklären wenige erste PCs den größten Teil der Variation in
der X Matrix, so dass höhere PCs ohne Verlust an Information für die nachfolgenden
Analysen weggelassen werden können (= Dimensionenreduktion).
Eine Erweiterung der PCA stellt die PLS (PLS - partial least squares - discriminant
analysis) und orthogonal PLS-DA (OPLS) dar. Beide Methoden werden dazu eingesetzt,
um die Abhängige Y aus X vorherzusagen und können auch zur Diskriminanzanalyse
genutzt werden (PLS-DA, OPLS-DA). Während bei der PCA in die Berechnung der PCs
nur die Information aus der X Matrix einfließen, wird bei der PLS auch die Information aus
der Y Matrix (Abhängigen) verwendet. Die Scores für beide Matrizen
X = TPT → T = XP
Y = UQT → U = YQ
P, Q - Loadingmatrizen,
werden so gewählt, dass sie maximal miteinander korrelieren. Bei der Interpretation des
PLS Modells werden zusätzlich zu den Loadings sogenannte Weights (deutsch:
Gewichte)
W = r(X,U)
C = r(Y,T),
welche die Korrelation zwischen X und U(Y) oder Y und T(X) angeben, herangezogen.
Dadurch, dass das PLS Verfahren jedoch unidirektional ist, können die ermittelten PCs
auch Variationen in X erfassen, die unkorreliert zu Y sind. OPLS stellt eine Erweiterung
der generellen PLS dar, welche die X Variation in zwei Teile aufteilt. Der 1. Teil ist linear
assoziiert mit Y und stellt den prädiktiven Teil des Modells dar. Der 2. Teil modelliert die X
Variation, welche unabhängig von Y ist.
________________________________________________________________________________________ 20
PLS-DA/OPLS-DA Modelle wurden anhand von 70 Spektren ermittelt. Die
Prädiktionsleistung der Modelle wurde mittels 3-facher Crossvalidierung geschätzt. Die
verbliebenen Spektren wurden zur Validierung der Modelle genutzt.
________________________________________________________________________________________ 21
3. Ergebnisse
3.1. Deskriptive Statistik
Gewichtsverlauf in Kilogramm
Vor der Operation betrug das durchschnittliche Gewicht 143,44 ± 26,68 Kg. Nach der
Operation zeigt sich eine kontinuierliche Senkung auf durchschnittlich 96,93 ± 17,93 Kg.
Männer hatten, im Vergleich zu Frauen, wie erwartet, ein höheres Ausgangsgewicht.
Abbildung 6 illustriert die absoluten Gewichtsverläufe für männliche sowie weibliche
Patienten und die Gesamtheit.
Abbildung 6: Gewichtsverlauf in Kilogramm Körpergewicht, dargestellt als Mittelwert. Blau: Gewichtsverlauf Männer, Rot: Gewichtsverlauf Frauen, Grün: Gewichtsverlauf Gesamtheit. N gibt die Anzahl an Patienten an, welche zum jeweiligen Datenpunkt untersucht wurden.
N=13
N=12
N=8
N=10N=9
N=38N=34
N=13N=26
N=18
N=51
N=46
N=21
N=36N=27
80
100
120
140
160
180
prä Op post OP1-13
post OP70-120
post OP150-240
post OP326-410
Tage
Kg
Männer Frauen Gesamt
________________________________________________________________________________________ 22
Gewichtsverlauf Prozentual
Prozentual stellt sich der Gewichtsverlust ebenfalls kontinuierlich dar. Dargestellt wird dies
in Abbildung 7. Nach 326 bis 410 Tagen wiegen die Patienten durchschnittlich 68,88 ±
6,11 Prozent ihres Ursprungsgewichts. Das entspricht einer Gewichtsabnahme von 31,12
± 6,11 Prozent innerhalb eines Jahres. Hierbei ist zu erkennen, dass Männer und Frauen
im gleichen Maße abnehmen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurde in Abbildung 7 auf
die Kennzeichnung der Gruppenstärke verzichtet. Diese kann jedoch aus Tabelle 3
entnommen werden.
Abbildung 7: Gewichtsverlauf in Prozent, dargestellt als Mittelwert. Blau: Gewichtsverlauf Männer, Rot: Gewichtsverlauf Frauen, Grün: Gewichtsverlauf Gesamtheit.
Tabelle 3: Anzahl der Probandendatensätze zum jeweiligen Zeitraum
Zeitraum Anzahl Frauen Anzahl Männer Anzahl Gesamt
Prä OP 38 13 51
Post OP 1-13 Tage 34 12 46
Post OP 70-120 Tage 13 8 21
Post OP 150-240 Tage 26 10 36
Post OP 326-410 Tage 18 9 27
65
70
75
80
85
90
95
100
prä Op post OP1-13
post OP70-120
post OP150-240
post OP326-410
Tage
Proz
ent
Männer Frauen Gesamt
________________________________________________________________________________________ 23
Verlauf Body-Mass-Index
Der BMI betrug vor der Operation durchschnittlich 49,78 ± 8,39 Kg/m² für die gesamte
Patientengruppe. Er fällt über die bereits erwähnten Zeiträume hinweg auf einen
durchschnittlichen Wert von 33,36 ± 5,54 Kg/m² ab. Das entspricht einer
durchschnittlichen Abnahme von 16,42 ± 5,54 Kg/m² innerhalb eines Jahres. Abbildung 8
illustriert dies.
Abbildung 8: Verlauf des BMI in Kg/m², Daten dargestellt als Mittelwert. Blau: BMI-Verlauf Männer, Rot: BMI-Verlauf Frauen, Grün: BMI-Verlauf Gesamt. Übergewichtsverlust in Prozent
Abbildung 9 stellt den Verlust des Übergewichtes der einzelnen Gruppen über die Zeit
dar. Nach einem Zeitraum von 326-410 Tagen nach der Operation zeigt sich, dass die
Patienten durchschnittlich 67,22 ± 16,74 Prozent ihres Übergewichts verloren haben.
Auch hier ist kein Unterschied zwischen Männern und Frauen zu sehen.
Tabelle 4 fasst die Verläufe der genannten vier Rubriken als Zahlenwerte zusammen.
30
35
40
45
50
55
prä Op post OP1-13
post OP70-120
post OP150-240
post OP326-410
Tage
Kg/
m²
Männer Frauen Gesamt
________________________________________________________________________________________ 24
Abbildung 9: Verlorenes Übergewicht über die Zeit in Prozent. Daten dargestellt als Mittelwert. Blau: Verlauf Männer, Rot: Verlauf Frauen, Grün: Verlauf Gesamt
Tabelle 4: Verlauf von Gewicht in Kilogramm, Körpergewicht in Prozent, Verlauf des Body-Mass-Index (BMI) und Entwicklung des Übergewichtsverlustes (% EWL: % Excess-Weight-Loss = Übergewichtsverlust) während des Beobachtungszeitraumes. Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung.
prä OP post OP [Tage]
1-13 70-120 150-240 326 - 410
Kg Männer 156,65 ± 26,47 144,11 ± 19,79 127,68 ± 30,75 110,40 ± 19,55 103,56 ± 16,12
Frauen 138,92 ± 25,54 134,51 ± 25,62 111,25 ± 23,82 104,72 ± 19,92 93,66 ± 18,3
Gesamt 143,44 ± 26,68 137,02 ± 24,39 117,51 ± 27,17 106,29 ± 19,71 96,96 ± 17,93
Kg % Männer 100 94,89 ± 1,11 79,33 ± 7,33 72,32 ± 6,26 69,91 ± 7,85
Frauen 100 96,03 ± 1,67 82,24 ± 4,35 74,00 ± 5,66 68,37 ± 5,22
Gesamt 100 95,73 ± 1,61 81,13 ± 5,68 73,53 ± 5,79 68,88 ± 6,11
BMI Männer 49,45 ± 7,54 45,79 ± 6,06 40,28 ± 8,38 35,44 ± 5,79 33,00 ± 4,86
Frauen 49,89 ± 8,75 48,40 ± 8,71 40,47 ± 6,92 36,85 ± 6,51 33,54 ± 5,98
Gesamt 49,78 ± 8,39 47,72 ± 8,12 40,40 ± 7,3 36,46 ± 6,27 33,36 ± 5,54
% EWL
Männer 0 11,05 ± 2,64 42,87 ± 17,05 59,93 ± 18,85 66,78 ± 18,91
Frauen 0 8,31 ± 3,58 38,51 ± 14,18 54,39 ± 14,09 67,44 ± 16,13
Gesamt 0 9,02 ± 3,55 40,17 ± 15,07 55,93 ± 15,47 67,22 ± 16,47
0
10
20
30
40
50
60
70
80prä OP post OP
1-13Tpost OP 70-120T
post OP 150-240T
post OP 326-410T
Proz
ent Ü
berg
ewic
htsv
erlu
st
Tage
Männer Frauen Gesamt
________________________________________________________________________________________ 25
3.2. Metabolomik
Fragestellung : Vergleich von prä-operativen Spektren und post-operativen
Spektren innerhalb der ersten 13 Tage nach der Operation
Basierend auf allen 100 Spektren wurde initial eine PCA berechnet, um einen Überblick
über die Daten zu erlangen und Ausreißer zu identifizieren. Das PCA Modell benötigt 7
PCs, um 95 % der Varianz in X zu erklären (R2X = 0,951) und besitzt eine
Vorhersagbarkeit von 83 % (Q2X = 0,828) (Abbildung 10, links). Bereits mit Hilfe des
ersten PCA Modells erhalten wir eine gute Separation zwischen prä- und post-operativen
Proben (Abbildung 10, rechts).
Distance to the model (DModX) und Hotellings T2 Diagramme wurden genutzt, um
Ausreißer zu identifizieren (Abbildung 11). Die DmodX einer Beobachtung ist proportional
zu seiner Residuen-Standardabweichung. Werte oberhalb des zweifachen kritischen
Wertes werden als Ausreißer definiert. Hotellings T2 stellt eine multivariate Variante des
Student’s T-Test dar. Werte oberhalb des 99 % Bereiches werden als Ausreißer
identifiziert. Basierend auf beiden Maßen wurden insgesamt 10 Spektren von den
weiteren Analysen ausgeschlossen.
Die verbliebenen 90 Spektren wurden zur multivariaten Analyse verwendet, um den
Abbildung 10. Links: PCA Modelübersicht. R2: erklärter Anteil der Varianz in der X Matrix; Q2: erklärter Anteil der Varianz in der X Matrix vorhergesagt durch das Modell nach 3-facher Crossvalidierung. Rechts: PCA T1/T4 Score-Plot für prä- und post-operative Proben. Die Ellipse präsentiert den Hotellings T2 Bereich zum Signifikanzniveau 0,05.
-3000,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7]Comp No.
R2X(cum) Q2(cum)
-200
-100
0
100
200
300
400
0 500 1000 1500
t[4]
t[1]
Prä-OP Post-OP(1-13T)
-3000,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7]Comp No.
R2X(cum) Q2(cum)
-200
-100
0
100
200
300
400
0 500 1000 1500
t[4]
t[1]
Prä-OP Post-OP(1-13T)
________________________________________________________________________________________ 26
Abbildung 11. Oben: Distance to the model (DModX) Plot. Werte oberhalb des 2-fachen kritischen Wertes (─) sind Ausreißer. Unten: Hotellings T2 Plot.
Zusammenhang zwischen dem Metabolitenprofil und dem operativen Status zu erfassen.
70 Spektren wurden dabei zur Berechnung der Modelle und 20 Spektren zur Evaluation
der ermittelten Modelle genutzt.
Abbildung 12. Links: PLS-DA Modelübersicht. R2: erklärter Anteil der Varianz in der Y Matrix; Q2: erklärter Anteil der Varianz in der Y Matrix vorhergesagt durch das Modell nach 3-facher Crossvalidierung. Rechts: PLS-DA T1/T2 Score-Plot für prä- und post-operative Proben. Die Ellipse präsentiert den Hotellings T2 Bereich zum Signifikanzniveau 0,05. Die Richtung der Separierung zwischen beiden Klassen ist durch den grünen Pfeil gekennzeichnet.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0D
Mod
X[7]
(Nor
m) 2x D-Crit(0,05)
0
20
40
60
80
100
T2R
ange
[1 -
7]
Spektrum
T2Crit(95%)T2Crit(99%)
D-Crit(0,05)
1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
8990
11
1218
19 20
30
78100
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0D
Mod
X[7]
(Nor
m) 2x D-Crit(0,05)
0
20
40
60
80
100
T2R
ange
[1 -
7]
Spektrum
T2Crit(95%)T2Crit(99%)
D-Crit(0,05)
1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
8990
11
1218
19 20
30
78100
Prä-OP Post-OP(1-13T)
-400
-200
0
200
400
600
-600 -400 -200 0 200
t[2]
t[1]
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0R2Y(cum) Q2(cum)
[1] [2] [3] [4]Comp No.
Prä-OP Post-OP(1-13T)
-400
-200
0
200
400
600
-600 -400 -200 0 200
t[2]
t[1]
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0R2Y(cum) Q2(cum)
[1] [2] [3] [4]Comp No.
________________________________________________________________________________________ 27
Abbildung 13. PLS-DA Weight Plot für die 1 und 2 Komponente. Die Richtung der Separierung zwischen beiden Klassen aus Abbildung 12 ist durch den grünen Pfeil gekennzeichnet.
Das PLS-DA Modell enthält 4 signifikante PCs und erklärt 91 % (R2X = 0,914) der Varianz
in X und 81 % (R2Y = 0,813) in Y. Die Vorhersagbarkeit von Y liegt bei 69 % (Q2Y =
0,687) (Abbildung 12). Wie zu erwarten, wird die Separation zwischen prä- und post-
operativen Spektren hauptsächlich durch die Komponente 1 und 2 getragen (Abbildung
12, rechts). Im zugehörigen Weight Plot (Abbildung 13) wird sichtbar, dass mehrere
Buckets (z.B. b20, b49, b50) sich in Richtung der Separierung der beiden Klassen
befinden und diese somit maßgeblich zur Separierung beitragen. Um weiterhin
abzuklären, welche Spektrumbereiche entscheidend für die Separierung sind, wurden der
VIP (Variable Importance in the Projection) Plot und Koeffizienten Plot genutzt (Abbildung
14).
w*c[1]
-0,6
-0,4
-0,2
-0,0
0,2
0,4
-0,45 -0,40 -0,35 -0,30 -0,25 -0,20 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10
w*c
[2]
b20
alter_opb1b2b3b4b5b6b7b8b9b10b11b12b13b14b15b16b17
b18b19
b21b22b23b24b25b26b27
b28b29b30b31b32b33b34b35
b36b37b38b39b40 b41b42b43b44 b45
b46b47
b48
b49b50
b51
b52b53
b54
b55 b56b57
b58
b59b60
b61b62
b63b64b65b66b67
b68b69
b70
b71
b72b73
b74
b75
b76b77
b78
b79
b80b81
b82
b83 b84b85b86b87
b88b89
b90b91b92
b93b94b95b96
b97
b98b99
b100
b101
b102b103
b104b105b106b107b108b109
b110b111b129b130b131
b132b133
b134b135b136b137b138b139b140b141b142b143b144b145b146b147b148b149b150b151b152b153b154b155b156b157b158b159b160b161b162b163b164b165b166b167b168b169b170b171b172b173
b174b175b176b177b178b179b180b181b182b183b184
b185b186b187b188b189
b190b191
b192
b193
b194b195
b196b197
b198
b199
b200b201b202b203
b204b205
b206b207b208b209b210b211b212
b213b214b215b216b217b218
b219b220b221b222b223b224
b225b226b227b228b229b230b232
b233b234b235b236b238b239
b240b241b242b243b244b245b246b247b248b249b250
w*c[1]
-0,6
-0,4
-0,2
-0,0
0,2
0,4
-0,45 -0,40 -0,35 -0,30 -0,25 -0,20 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10
w*c
[2]
b20
alter_opb1b2b3b4b5b6b7b8b9b10b11b12b13b14b15b16b17
b18b19
b21b22b23b24b25b26b27
b28b29b30b31b32b33b34b35
b36b37b38b39b40 b41b42b43b44 b45
b46b47
b48
b49b50
b51
b52b53
b54
b55 b56b57
b58
b59b60
b61b62
b63b64b65b66b67
b68b69
b70
b71
b72b73
b74
b75
b76b77
b78
b79
b80b81
b82
b83 b84b85b86b87
b88b89
b90b91b92
b93b94b95b96
b97
b98b99
b100
b101
b102b103
b104b105b106b107b108b109
b110b111b129b130b131
b132b133
b134b135b136b137b138b139b140b141b142b143b144b145b146b147b148b149b150b151b152b153b154b155b156b157b158b159b160b161b162b163b164b165b166b167b168b169b170b171b172b173
b174b175b176b177b178b179b180b181b182b183b184
b185b186b187b188b189
b190b191
b192
b193
b194b195
b196b197
b198
b199
b200b201b202b203
b204b205
b206b207b208b209b210b211b212
b213b214b215b216b217b218
b219b220b221b222b223b224
b225b226b227b228b229b230b232
b233b234b235b236b238b239
b240b241b242b243b244b245b246b247b248b249b250
________________________________________________________________________________________ 28
Abbildung 14. Oben: PLS-DA VIP (Variable Importance in the Projection) Plot. Unten: PLS-DA Koeffizienten Plot.
Der VIP Plot fasst die Bedeutung der Buckets hinsichtlich ihrer Fähigkeit X und Y zu
erklären zusammen. VIP Werte > 1 deuten auf bedeutende Buckets hin, während Buckets
mit VIP Werten < 0,5 in der Regel als unbedeutend erachtet werden können. Der Bereich
zwischen 0,5 und 1 wird als Graubereich angesehen. Der Koeffizienten Plot beschreibt
präziser als der Weight Plot, welche Buckets zur Vorhersage der Klasse beitragen. Unter
Berücksichtigung aller drei Angaben (Weights, VIP, Koeffizienten) wurden mehrere ppm-
Bereiche sichtbar, welche für die Separierung wichtig sind (Abbildung 14, grau hinterlegt).
-0,003
-0,002
-0,001
0,000
0,001
Coe
ffCS[
2]
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
b1 b10
b20
b30
b40
b50
b60
b70
b80
b90
b100
b110b130
b140
b150
b160
b170
b180
b190
b200
b210
b220
b230
b240
b250VI
P[4]
Buckets
-0,003
-0,002
-0,001
0,000
0,001
Coe
ffCS[
2]
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
b1 b10
b20
b30
b40
b50
b60
b70
b80
b90
b100
b110b130
b140
b150
b160
b170
b180
b190
b200
b210
b220
b230
b240
b250VI
P[4]
Buckets
________________________________________________________________________________________ 29
Abbildung 15. Oben: OPLS-DA T1/T2 Score-Plot für prä- und post-operative Proben. Die Ellipse präsentiert den Hotellings T2 Bereich zum Signifikanzniveau 0,05. Unten: zugehöriger S-Plot.
Das entsprechende OPLS-DA Modell liefert vergleichbare Ergebnisse. Das OPLS-DA
Modell enthält eine prädiktive und vier orthogonale Komponenten. Die kumulierte erklärte
Varianz beträgt 92 % (R2X = 0,922) in X und 85 % (R2Y = 0,852) in Y. Die
Vorhersagbarkeit liegt bei 69 % (Q2Y = 0,690). Der zum OPLS Modell zugehörige S-Plot
(Abbildung 15) stellt eine Möglichkeit der Visualisierung der Ergebnisse dar. Der S-Plot
gibt sowohl die Magnitude, d.h. die Stärke der Assoziation, als auch die Reliabilität an.
Weisen Buckets eine niedrige Magnitude auf, deutet dies auf Rauschen und somit auf
eine falsche Assoziation hin.
Die PLS-DA sowie OPLS-DA Modelle identifizieren ähnliche Buckets, die zur Separierung
der beiden Gruppen notwendig sind. Die ppm-Bereiche sind in Tabelle 5 dargestellt.
Prä-OP
Post-OP(1-13T)
to[2
]
t[1]
100
200
300
400
500
600
-200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200
-0,6
-0,5
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,40,5
-0,15 -0,10 -0,05 -0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45
p(co
rr)[1
]
w*c[1]
SEX((1) MäSEX((2) Fralter_opb1b2b3b4b5b6b7b8b9b10
b11b12b13b14
b15b16b17
b18b19
b20
b21
b22b23b24
b25b26b27b28
b29b30b31
b32b33b34b35
b36b37b38b39
b40
b41b42b43b44
b45
b46
b47
b48 b49b50b51
b52 b53b54
b55
b56
b57b58
b59b60
b61b62
b63
b64
b65
b66b67
b68
b69
b70b71
b72
b73
b74
b75
b76b77
b78
b79
b80
b81
b82
b83b84
b85b86
b87b88b89
b90b91b92
b93b94b95
b96
b97
b98b99
b100
b101
b102b103
b104b105b106b107b108
b109
b110
b111b129b130b131
b132
b133
b134b135
b136b137b138b139b140
b141b142
b143b144b145b146b147b148b149b150b151b152b153b154b155b156b157b158b159b160b161b162b163
b164b165b166
b167
b168b169
b170
b171b172
b173
b174b175b176
b177
b178b179
b180b181
b182
b183
b184
b185
b186
b187b188b189
b190b191
b192
b193
b194
b195
b196b197
b198
b199
b200
b201b202
b203
b204b205
b206
b207b208
b209b210
b211b212
b213
b214b215b216
b217
b218
b219b220
b221
b222
b223 b225
b226b227b228b229
b230
b231
b232 b233
b234b235
b236
b237
b238b239
b240
b241
b242b243
b244b245b246b247b248b249
b250
b224
MAGNITUDE
RELIAB
ILITÄTPrä-OP
Post-OP(1-13T)
to[2
]
t[1]
100
200
300
400
500
600
-200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200to
[2]
t[1]
100
200
300
400
500
600
-200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200
-0,6
-0,5
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,40,5
-0,15 -0,10 -0,05 -0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45
p(co
rr)[1
]
w*c[1]
SEX((1) MäSEX((2) Fralter_opb1b2b3b4b5b6b7b8b9b10
b11b12b13b14
b15b16b17
b18b19
b20
b21
b22b23b24
b25b26b27b28
b29b30b31
b32b33b34b35
b36b37b38b39
b40
b41b42b43b44
b45
b46
b47
b48 b49b50b51
b52 b53b54
b55
b56
b57b58
b59b60
b61b62
b63
b64
b65
b66b67
b68
b69
b70b71
b72
b73
b74
b75
b76b77
b78
b79
b80
b81
b82
b83b84
b85b86
b87b88b89
b90b91b92
b93b94b95
b96
b97
b98b99
b100
b101
b102b103
b104b105b106b107b108
b109
b110
b111b129b130b131
b132
b133
b134b135
b136b137b138b139b140
b141b142
b143b144b145b146b147b148b149b150b151b152b153b154b155b156b157b158b159b160b161b162b163
b164b165b166
b167
b168b169
b170
b171b172
b173
b174b175b176
b177
b178b179
b180b181
b182
b183
b184
b185
b186
b187b188b189
b190b191
b192
b193
b194
b195
b196b197
b198
b199
b200
b201b202
b203
b204b205
b206
b207b208
b209b210
b211b212
b213
b214b215b216
b217
b218
b219b220
b221
b222
b223 b225
b226b227b228b229
b230
b231
b232 b233
b234b235
b236
b237
b238b239
b240
b241
b242b243
b244b245b246b247b248b249
b250
b224
MAGNITUDE
RELIAB
ILITÄT
________________________________________________________________________________________ 30
Tabelle 5. Identifizierte Buckets und die entsprechenden ppm-Bereiche.
Bucket ppm-Bereich
b18 – b21 1,112 – 1,256
b48 – b54 2,192 – 2,444
b76 – b79 3,200 – 3,344
b84 – b89 3,488 – 3,704
b97 – b102 3,956 – 4,172
b192/b193 7,376 – 7,448
b198/b199 7,592 – 7,664
b204/b205 7,808 – 7,880
Die Prädiktionsleistung beider Modelle ist gleich. Wie in Abbildung 16 sichtbar, wurde von
den 20 Spektren, welche zur Evaluation der Modelle genutzt wurden, ein Spektrum
Abbildung 16. Vorhergesagte Klassenzugehörigkeit für Spektren im Evaluationsdatensatz basierend auf PLS-DA (links) und OPLS-DA (rechts). Als Grenzwert zur Klassifizierung wurde 0,5 verwendet. Spektrum 83 (eingekreist) wurde in beiden Modellen falsch vorhergesagt.
falsch klassifiziert. Insgesamt wurden somit 95 % der Spektren richtig zugeordnet
(Fisher-Exakt-Test: p = 0,00006).
Bei näherer Betrachtung der Originalspektren werden die Unterschiede deutlich.
Abbildung 17 zeigt die mittleren NMR-Spektren für präoperative und postoperative Proben
und geht näher auf die entscheidenden ppm-Bereiche ein. In den Bereichen 1,20-1,24,
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
77 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 91 92 93 94 95 96 97 98 99
OPL
S-D
A: Y
Pred
PS[1
]
Spektrum
PLS-
DA:
YPr
edPS
[4]
Prä-OP Post-OP(1-13T)
0,0
0,5
1,0
1,5
77 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 91 92 93 94 95 96 97 98 99
Spektrum
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
77 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 91 92 93 94 95 96 97 98 99
OPL
S-D
A: Y
Pred
PS[1
]
Spektrum
PLS-
DA:
YPr
edPS
[4]
Prä-OP Post-OP(1-13T)
0,0
0,5
1,0
1,5
77 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 91 92 93 94 95 96 97 98 99
Spektrum
________________________________________________________________________________________ 31
2,1-2,5, 3,2-3,6, 4,1-4,2, 7,40-7,45 und 7,6-7,7 zeigt sich eine Hochregulation, während in
den Bereichen 7,5-7,6 und 7,8-7,9 eine Herunterregulation zu verzeichnen ist.
________________________________________________________________________________________ 32
Abbildung 17. Mittlere NMR-Spektren für prä-operative (schwarz) und post-operative (rot) Urinproben (unten). PPM-Bereiche, die sich zwischen beiden Gruppen unterscheiden (A – E), wurden zusätzlich einzeln abgebildet (Mittelwert plus 95 % Konfidenzintervall, oben).
ppm
0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.5
1.161.181.201.221.241.262.102.202.302.402.503.23.33.43.53.64.114.154.197.47.57.67.77.87.9
A
A
B C D E
B C D E
ppm
0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.5
1.161.181.201.221.241.26 1.161.181.201.221.241.26 1.161.181.201.221.241.262.102.202.302.402.50 2.102.202.302.402.50 2.102.202.302.402.503.23.33.43.53.6 3.23.33.43.53.64.114.154.19 4.114.154.19 4.114.154.197.47.57.67.77.87.9 7.47.57.67.77.87.9
A
A
B C D E
B C D E
________________________________________________________________________________________ 33
4. Diskussion
4.1. Deskriptive Statistik
Nach bariatrischer Chirurgie verlieren Männer und Frauen kontinuierlich an Gewicht. Ein
Gewichtverlust von 43,57 ± 10,94 Kg und eine damit einhergehende Reduktion des BMIs
von 15,09 ± 3,65 Kg/m² innerhalb eines Jahres entspricht den bereits publizierten
Ergebnissen (10,43) und den Erwartungen aktueller Leitlinien (6). Anhand des Verlaufs
des prozentualen Gewichtsverlustes ist erkennbar, dass keine geschlechts-spezifischen
Unterschiede in der Gewichtsentwicklung bestehen. Dies ist die erste Studie, die zeigen
konnte, dass es keine Geschlechtsunterschiede hinsichtlich der Entwicklung nach
bariatrischer Chirurgie gibt.
Der in Studien zur bariatrischen Chirurgie zur Beschreibung der Effektivität oft genutzte
Übergewichtsverlust fällt in dieser Arbeit mit 67,22 ± 16,74 Prozent Übergewichtsverlust
nach ca. einem Jahr ebenfalls im Rahmen publizierter Ergebnisse aus (18,36,43).
Insgesamt sind die Beobachtungen zum Gewichtsverlauf eine weitere Dokumentation der
Wirksamkeit bariatrischer Chirurgie im Zeitraum eines Jahres.
4.2. Metabolomik
In der vorliegenden Arbeit konnten anhand multivariater Analysen Änderungen im
Metabolitenprofil vor und nach bariatrischer Operation nachgewiesen werden. Bei
genauer Betrachtung der 1H-NMR Urin-Spektren fällt nach dem bariatrischem Eingriff eine
Hochregulation in den ppm-Bereichen 1,20-1,24; 2,1-2,5; 3,2-3,6; 4,1-4,2; 7,40-7,45 und
7,6-7,7 sowie eine Herabregulation in den ppm-Bereichen 7,5-7,6 und 7,8-7,9 ppm auf.
Mit Ausnahme der hier vorgestellten Ergebnisse untersuchte bisher nur eine Studie (39)
die Auswirkung von bariatrischer Chirurgie auf ein im Urin bestimmtes Metabolom. Diese
Arbeit beschäftigte sich hauptsächlich mit den Unterschieden in Urin-Spektren zwischen
adipösen Personen (mittlerer BMI = 49,58 ± 8,3 Kg/m²; N=15) und schlanken
Kontrollpersonen (mittlerer BMI = 24,63 ± 1,9 Kg/m²; N=10). Dabei wurden vier Metabolite
identifiziert (Hippursäure, Trigonellin, 2-Hydroxyisobutyrat und Xanthin), welche
hauptsächlich zur Unterscheidung der zwei Gruppen beitrugen. Von diesen Metaboliten
________________________________________________________________________________________ 34
leistete Hippursäure den deutlichsten Beitrag zur Unterscheidung. Die Gruppe der
Patienten und der Kontrollen unterscheiden sich in der Arbeit von Calvani und Kollegen
allerdings nicht nur im BMI deutlich, sondern auch in Bezug auf ihre Insulinresistenz
(mittlerer HOMA-IR-Score [Homeostatic model assessment of insulin resistance] Adipöse:
12,92 ± 11,49; Kontrollen: 1,24 ± 0,39). Die gefundenen Unterschiede im Metabolom
könnten somit sowohl auf die Insulinresistenz als auch auf die Anthropometrie zurück zu
führen sein. Die Hypothese, dass die Insulinresistenz einen Teil der gefundenen
Ergebnisse bedingt, wird durch Studien bestärkt, welche teilweise die von Calvani et al.
gefundenen Metabolite (namentlich Hippursäure und Trigonellin) mit einem Diabetes
mellitus-Status in Tiermodellen und Menschen assoziiert haben (39,44).
Hippursäure ist ein Metabolit der Benzoesäure. Diese kann von einer Reihe Darmflora-
assoziierter Bakterien aus aromatischen Verbindungen hergestellt werden (45,46). In den
Mitochondrien wird Benzoesäure mit Glycin konjugiert und als Hippursäure mit dem Urin
ausgeschieden. Dabei ist Hippursäure ein normaler Bestandteil des Urins (47).
Physiologisch treten erhöhte Urin-Werte im Rahmen einer vermehrten Aufnahme von
phenolquellenhaltiger Nahrung, wie z.B. Tee, Wein und Fruchtsaft, auf (48). Niedrige
Hippursäure-Werte im Urin konnten dahingegen mit einem adipösen Phänotyp im
Nagetiermodel assoziiert werden (49). Darüber hinaus wurden niedrige Hippursäure-
spiegel im Urin von Typ 2 Diabetes mellitus Nagetiermodellen (50) sowie bei Typ 2
Diabetes mellitus-Patienten gefunden (44). Ebenso wird von einer inversen Assoziation
zwischen Hippursäure und Blutdruck beim Menschen berichtet (51).
Zusätzlich zur Diskrimination zwischen schlanken Kontrollen und adipösen Personen
wurden in der Arbeit von Calvani und Kollegen zwei Patienten bariatrischer Chirurgie
zugeführt. Ein Patient bekam einen Roux-en-Y Magenbypass, der andere Patient
unterzog sich einer Biliopankreatischen Diversion. Von diesen zwei Patienten wurden
Urinproben vor der Operation, 30 Tage sowie 90 Tage nach der Operation gewonnen und
mittels 1H-NMR spektroskopisch untersucht. Bei den Spektren von beiden Patienten ist im
Verlauf der Nachbeobachtungsperiode eine deutliche Hochregulation im ppm-Bereich von
Hippursäure (7,5-7,88 ppm) zu sehen. Auch in der vorliegenden Arbeit konnte dieser
ppm-Bereich identifiziert werden. Allerdings findet sich in dieser Arbeit im Kontrast zu
Calvani und Kollegen post-operativ eine Herabregulation in diesem Bereich. Mehrere
________________________________________________________________________________________ 35
Gründe können für diesen Unterschied verantwortlich sein: die Gewinnung der post-
operativen Urinprobe erfolgte in der Arbeit von Calvani und Kollegen (39) wesentlich
später als in der gegenwärtigen Arbeit. Es ist nicht auszuschließen, dass zu einem
Abnahmezeitpunkt 30 Tage nach Operation oder später auch in dem hier untersuchten
Patientenkollektiv eine Hochregulation zu finden wäre. Zukünftige Studien und
Untersuchungen werden benötigt, um dies zu klären. Neben dem Abnahmezeitpunkt kann
auch die Fallzahl ein entscheidender Grund für diesen Unterschied sein. Während Calvani
und Kollegen (39) nur zwei Patienten untersuchten, fand die vorliegende Untersuchung an
insgesamt 45 Patienten statt.
Wie oben erwähnt, war es Calvani und Kollegen gelungen, neben Hippursäure weitere
Metabolite zu identifizieren, die sich signifikant zwischen adipösen und schlanken
Personen unterschieden, sowie sich nach der Operation im Spektrum nachweisbar
veränderten. Bei diesen Metaboliten handelte es sich zusätzlich um Trigonellin, 2-
Hydroxyisobuthyrat und Xanthin. Im Vergleich dazu sind in dieser Arbeit keine auffälligen
Änderungen in diesen Metaboliten entsprechenden ppm-Bereichen sichtbar. Unsere
Ergebnisse lassen auf weitere Metabolite schließen, die Veränderungen durch die
bariatrische Operation unterworfen sind.
Die Patienten in dieser Arbeit wurden im Zeitraum von 2009 bis 2010 nacheinander
operiert. Sie alle unterscheiden sich in Bezug auf ihr Geschlecht und Alter, ihre
Komorbidität mit entsprechender Medikation, ihren sozialen Hintergrund sowie
persönliche Nahrungsgewohnheiten. In einer Studie konnte gezeigt werden, dass eine
Lebensstiländerung wie die Umstellung der Ernährung zu einer Änderung der mikrobiellen
Besiedlung des Darmes führt und dass sich diese auf das Metabolom des Menschen
auswirkt (52). Siehe hierzu z.B. auch „Metabolischer Effekt von Zartbitter-Schokolade auf
Energie, mikrobielle Besiedlung des Darmes sowie Stress-assoziierten Stoffwechsel in
frei-lebenden Probanden“ von Martin und Kollegen (53). Darüber hinaus wird vermutet,
dass die Darmflora eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Adipositas spielt. So ist sie
über verschiedene Mechanismen wie Energieaufnahme oder Fettspeicherung an der
Regulation des Stoffwechsels beteiligt (54–56). Es gibt Hinweise, dass
Lipopolysaccharide der Darmbakterien über das Endocannabinoidsystem die Physiologie
des Fettgewebes beeinflussen (57). Neben Umweltfaktoren beeinflussen auch genetische
________________________________________________________________________________________ 36
Merkmale des Wirts die Fülle und Diversität der mikrobiellen Besiedlung des Darmes
(58,59).
Die Gemeinsamkeit aller Patienten ist das Übergewicht und die Tatsache der
bariatrischen Operation. Dazu wurden zwei verschiedene Methoden, der Roux-en-Y
Magenbypass als gemischt malabsorptives und restriktives Verfahren und die
Schlauchmagenbildung als Vertreter der rein restriktiven Verfahren, angewendet. Die
Analysen ergaben, dass Alter und Geschlecht keine zusätzliche Information zur
Unterscheidung von prä- und post-operativen Proben liefert. Aufgrund der Fallzahlen war
es leider nicht möglich, beide Operationsmethoden hinsichtlich einer unterschiedlichen
Entwicklung des Metabolitenprofils zu untersuchen. Untersuchungen weisen jedoch
darauf hin, dass die Fähigkeit der beiden genannten Verfahren zum Gewichtsverlust zu
führen, auf unterschiedlichen Mechanismen beruht (36,60). Die Schlauchmagenbildung
führt im Vergleich zum Roux-en-Y Magenbypass zur stärkeren Senkung der Nüchtern-
Ghrelin-Spiegel als auch postprandialer Ghrelin-Spiegel (36,61), sowohl nach drei (61),
als auch zwölf Monaten (36). Ghrelin ist ein peripheres appetitanregendes
gastrointestinales Hormon, welches hauptsächlich aus Zellen des Magens sezerniert wird
(62). Die Verabreichung von Ghrelin stimuliert die Nahrungsaufnahme sowohl bei
Nagetieren als auch beim Menschen über eine vermehrte hypothalamische Expression
des appetitanregenden Neuropeptids Y (63,64). Ghrelin wird eine Rolle bei der Initiation
der Nahrungsaufnahme zugeschrieben, da beobachtet worden ist, dass Ghrelin-Spiegel
preprandial kontinuierlich ansteigen und postprandial proportional zur Kalorienaufnahme
sinken (65). Interessanterweise ist Adipositas verbunden mit niedrigen Ghrelin-Spiegeln
(66) und zusätzlich mit einer schwachen postprandialen Ghrelin-Suppression (60). Nach
Diät-induziertem Gewichtsverlust steigen Ghrelin-Spiegel, während sie nach
Gewichtsverlust erreicht durch Magenbypass sinken (67). Der Effekt des Roux-en-Y
Magenbypasses könnte in einer Verhinderung des Ghrelinanstiegs nach Bypass-Chirurgie
bestehen (36). Allerdings existieren widersprüchliche Berichte bzgl. des Einflusses des
Magenbypasses auf den Ghrelinspiegel (36).
Sowohl Schlauchmagenbildung als auch Roux-en-Y Magenbypass führen post-operativ
zu einer deutlichen Steigerung der Ausschüttung des Hormons Peptid YY, sowohl basal
als auch postprandial (36,61). Peptid YY wird postprandial aus intestinalen endokrinen L-
________________________________________________________________________________________ 37
Zellen im distalen Darm freigesetzt und inhibiert am Nucleus arcuatus im
Zentralnervensystem die Freisetzung des Neuropeptids Y (68). Beim Menschen induziert
eine intravenöse Infusion des Peptids YY ein Gefühl der Sättigung, reduziert die
Nahrungsaufnahme (68,69) und inhibiert die gastrointestinale Motilität sowie die
Sekretionsleistung des Pankreas (70,71). Studien konnten einen niedrigeren Peptid YY-
Spiegel bei morbid-adipösen im Vergleich zu schlanken Kontrollen beobachten (69,72).
Zusätzlich ist bei morbid-adipösen der physiologische Anstieg der Peptid YY-
Konzentration als Antwort auf eine Mahlzeit abgeschwächt (73).
Mittels einer visuellen Analogskala zur Einschätzung des Appetits konnten Karamanakos
und Kollegen post-operativ eine Senkung des Appetits sowohl für die
Schlauchmagenbildung als auch den Roux-en-Y Magenbypass beobachten. Der Verlust
des Appetits war größer für Patienten nach Schlauchmagenbildung. Bei beiden
Untersuchungsgruppen stieg der Appetit über einen Zeitraum von zwölf Monaten wieder
an, blieb aber für Schlauchmagen-Patienten niedriger. Ausgangswerte wurden von beiden
Gruppen nach zwölf Monaten nicht wieder erreicht (36).
Die Eigenschaft, dass die Schlauchmagenbildung zusätzlich zur Erhöhung des Peptid YY-
Spiegels den Ghrelin-Spiegel senkt, wird für die bessere Effektivität im Vergleich zum
Roux-en-Y Magenbypass, einen Gewichtsverlust zu erreichen, sowie den Appetit zu
senken, verantwortlich gemacht (36). Ein hoher Ghrelin-Spiegel vermindert die
anorektische Wirkung des Peptids YY und des Glucagon-like Peptide 1 (GLP-1) im
Tiermodel (74).
Bei Typ 2 Diabetes mellitus-Patienten konnte nach Roux-en-Y Magenbypass eine
deutliche Verbesserung des Blutzuckerspiegels beobachtet werden (11,12,43). In der
frühen post-operativen Phase können viele Patienten normale Nüchtern-Blutzucker-Werte
erreichen, ohne dass bis dahin ein signifikanter Gewichtsverlust eingetreten ist (23,24,75).
Hierbei wird angenommen, dass hauptsächlich Veränderungen des GLP-1 Spiegels dafür
verantwortlich sind (61). GLP-1 ist ein Hormon, das aus endokrinen L-Zellen des distalen
Darmes in Reaktion auf Nahrungsaufnahme in das Blut freigesetzt wird (76). Die
Hauptwirkung dieses Hormons besteht in einer postprandialen Stimulation der
Insulinsekretion bei zeitgleicher Inhibition der Glukagonsekretion (76). Ferner limitiert es
die gastrointestinale Motilität und Sekretion (76). Zusätzlich scheint GLP-1 eine
________________________________________________________________________________________ 38
regulierende Funktion auf Appetit und Nahrungsaufnahme zu haben, womit einer defekten
postprandialen GLP-1 Antwort ein Anteil an der Genese der Adipositas zugeschrieben
wird (76). In präklinischen wie klinischen Studien konnte beobachtet werden, dass
anhaltende GLP-1 Rezeptor-Aktivierung mit Gewichtsverlust assoziiert ist (77). GLP-1
erhöht im Nagetiermodel die Menge der Langerhans-Inseln durch Stimulation der
pankreatischen β-Zellproliferation und Induktion der Inselzellneogenese (78). Außerdem
begünstigt GLP-1 die Differentiation von exokrinen Zellen oder unreifen Inselzellvorläufern
zu einem differenzierten β-Zell-Phänotyp (78). Peterli und Kollegen konnten in einer
prospektiven, randomisierten Studie zeigen, dass sich sowohl post Roux-en-Y
Magenbypass als auch post Schlauchmagenbildung die GLP-1 Antwort auf eine Test-
Mahlzeit deutlich verbesserte; im Sinne eines erhöhten postprandialen GLP-1 Anstiegs
(61). Patienten mit Roux-en-Y Magenbypass hatten sowohl eine Woche als auch drei
Monate post-operativ höhere durchschnittliche GLP-1 Werte als Patienten mit
Schlauchmagen. Bei beiden war jedoch der Anstieg signifikant. Sowohl der Roux-en-Y
Magenbypass als auch die Schlauchmagenbildung konnten post-operativ den HOMA-IR
Score deutlich senken. Allerdings hatten Patienten mit Roux-en-Y Magenbypass drei
Monate post-operativ einen niedrigeren HOMA-IR Score als Patienten mit
Schlauchmagen. Letztgenanntes wird von den Autoren mit der Beobachtung in
Verbindung gebracht, dass der Roux-en-Y Magenbypass die postprandiale GLP-1
Dynamik stärker beeinflusst als der Schlauchmagen. Warum der Roux-en-Y
Magenbypass die GLP-1 Dynamik mehr beeinflusst als der Schlauchmagen ist noch
Gegenstand der gegenwärtigen Diskussion.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass eher die schlechtere bzw. fehlende Dynamik der
genannten Hormone in Reaktion auf Stimuli charakteristisch für Adipositas ist als die
absoluten Konzentrationen.
Vorstellbar ist, dass die erwähnten, im Serum gemessenen Beobachtungen eine
Auswirkung auf das Metabolom des Urins haben. Jedoch lässt sich zurzeit keine Aussage
bzgl. einer Verbindung der Hormone mit der Erscheinung der Spektren treffen. Eine
Arbeit, die die Auswirkungen bariatrischer Operationen auf das Metabolom des Serums
untersucht, könnte hier vielleicht Signaturen dieser Hormone entdecken.
________________________________________________________________________________________ 39
4.3. Stärken und Limitationen der Studie
Stärken
Die präsentierte Arbeit untersuchte zum ersten Mal an einem großen Patientenkollektiv
die Auswirkungen von bariatrischer Chirurgie auf das Metabolom des Urins.
Alle Patienten wurden aus einem Behandlungszentrum mit Schwerpunkt Adipositas
rekrutiert und vom selben chirurgischen Team operiert. So ist eine gleichbleibende Art
und Qualität der Operation gewährleistet. Damit wird eine Fehlermöglichkeit, die sich z.B.
aus verschieden großen Resektatstücken bei der Schlauchmagenbildung oder der Größe
des Pouches bei dem Roux-en-Y Magenbypass ergibt, stark minimiert. Da der
Rekrutierungszeitraum mit elf Monaten relativ kurz war, wird der Einfluss von Variablen
wie Operateure, Änderungen der Operationsmethode oder Nachsorge auf die
Untersuchungsergebnisse minimiert. Der Roux-en-Y Magenbypass und die
Schlauchmagenbildung sind etablierte und häufige Verfahren. Zudem haben sie eine
ähnliche Wirksamkeit bezogen auf Gewichtsverlust und Komorbidität, obwohl sie sich in
der Operationsmethodik deutlich unterscheiden. Die Schlauchmagenbildung zählt zu den
neueren Verfahren und gewinnt rapide an Bedeutung, da sie vergleichsweise
einfach/leicht zu erlernen und anzuwenden ist und keine Änderung der Architektur des
Magen-Darm Traktes nach sich zieht. Damit sind Untersuchungen wie Gastroskopie,
endoskopische retrograde Cholangiopancreaticographie im weiteren Leben des Patienten
nicht ausgeschlossen. Die Patienten dieser Arbeit haben sich überwiegend der
Schlauchmagenbildung unterzogen, womit auch der Anteil der Beobachtungen
überwiegend auf dieses Procedere zurückzuführen sein wird. Damit wurde in dieser Arbeit
ein an Bedeutung gewinnendes Verfahren mit der innovativen Methode der Metabolomik
untersucht.
Mit der Bestimmung des Metaboloms via 1H-NMR-Spektroskopie aus dem Urin kann
quantitativ das gesamte Metabolom in einem Durchgang gemessen werden. Eine
Messung für die hier vorgestellte Arbeit dauerte ca. 20 Minuten.
________________________________________________________________________________________ 40
Urin ist leicht und vor allen Dingen nicht-invasiv zu gewinnen, was einen Vorteil birgt in
Bezug auf Akzeptanz bei Patienten/Probanden. Bei der Gewinnung von Serum werden
viele kleine Moleküle während des Gerinnungsprozesses freigesetzt, die das Spektrum
beeinflussen können. Bei der Gewinnung von Plasma ist die Natur des verwendeten
Antikoagulans zu bedenken, die ihrerseits das Metabolom beeinflussen kann. Diese
beiden Einschränkungen treffen für Urinproben nicht zu.
Limitationen
Die vorliegende Arbeit stellt keinen Beweis für Veränderungen im Urin-Metabolom speziell
nach einer bariatrischen Operation dar. Die beschriebenen Veränderungen und
Gemeinsamkeiten können auch Ausdruck eines ganz allgemeinen post-operativen Status
nach größeren und invasiveren Eingriffen sein. In so einem Fall wären die Beobachtungen
evtl. Ausdruck von post-operativem Stress. Veränderungen, die sich speziell nach
bariatrischer Operation ergeben, sieht man gegebenenfalls erst nach einem längeren
Zeitraum, wenn der Organismus Zeit hatte, sich an die neue Situation zu adaptieren. Um
diese Thesen zu überprüfen, müsste diese oder eine ähnliche Studie weitergeführt
werden, welche einen längeren Zeitraum sowie mehr Mess-Zeitpunkte beinhaltet. So
könnten eine Dynamik im Sinne einer Änderung der Spektren detektiert werden. Darüber
hinaus können die Veränderungen auch durch den beachtlichen Gewichtsverlust
innerhalb kürzester Zeit (10 % Gewichtsverlust in 13 Tagen) bedingt sein oder durch post-
operative Medikamente wie z.B. Schmerzmittel, Narkotika, Anästhetika und Heparin
beeinflusst werden.
Wie bereits oben diskutiert, wurden die Patienten dieser Arbeit nach zwei Methoden
operiert. Elf Patienten bekamen einen Roux-en-Y Magenbypass und 40 Patienten
unterzogen sich einer Schlauchmagenbildung. Somit sind zwei verschiedene OP-
Methoden unterschiedlich schwer gewichtet. Die daraus resultierende Vermischung
verschiedener Effekte mag eine Identifikation spezieller Unterschiede schwierig machen.
Eine Arbeit mit einem größeren und operationsmethodisch ausgeglichenen
Patientenkollektiv könnte hierzu Aussagen treffen und evtl. Unterschiede im Metabolom
des Urins zwischen den beiden Operationsgruppen zeigen.
________________________________________________________________________________________ 41
Das vorgestellte Patientengut wurde nicht getrennt nach Diabetiker und Nicht-Diabetiker
analysiert. Eine getrennte Untersuchung könnte evtl. Unterschiede im Veränderungsprofil
des Metaboloms aufzeigen. Die Wirkung bariatrischer Chirurgie auf die Verbesserung
eines Diabetes mellitus ist auch nach kurzen post-operativen Zeiträumen dokumentiert
(23,24).
________________________________________________________________________________________ 42
5. Zusammenfassung und Ausblick
Adipositas ist medizinisch und sozioökonomisch ein weltweit an Bedeutung gewinnendes
Problem. Bariatrische Chirurgie hat sich als effektivste Möglichkeit zur Behandlung
morbider Adipositas erwiesen. Dabei ergeben sich deutliche Verbesserungen des
diabetischen Stoffwechsels bereits kurz nach dem Eingriff, bevor ein signifikanter
Gewichtsverlust eingetreten ist. Die Mechanismen, die dazu führen, sind dabei noch nicht
vollständig aufgeklärt. Ziel der Arbeit war es, mit Hilfe des Metabolomikansatzes
herauszufinden, ob bariatrische Chirurgie einen Einfluss auf das Metabolom des Urins
hat. Dazu wurden Urinproben von 50 Patienten jeweils prä-operativ und bis zu 13 Tage
post-operativ mittels 1H-NMR untersucht und mit Hilfe von multivariaten statistischen
Methoden analysiert. Dabei konnte deutlich zwischen prä- und post-operativen Proben
unterschieden werden. PLS-DA und OPLS-DA Modelle waren in der Lage, 95 % der
Spektren richtig in prä- und post-operativ zu klassifizieren. Zur Unterscheidung trugen in
erster Linie die Buckets b20, b49 und b50 bei. Bei Betrachtung der gemittelten Spektren
fielen eine Heraufregulation in den ppm-Bereichen 1,20-1,24, 2,1-2,5, 3,2-3,6, 4,1-4,2,
7,40-7,45 und 7,6-7,7 sowie eine Herabregulation in den ppm-Bereichen 7,5-7,6 und 7,8-
7,9 jeweils post-operativ auf. Bariatrische Chirurgie verändert somit das Metabolom des
Urins.
Den Variationen im Spektrum liegen Metabolite zu Grunde, deren Identifikation
Rückschlüsse auf Stoffwechselprozesse erlauben. Diese können wiederum
Erklärungsansätze für den Gewichtsverlust und die Stoffwechselbeeinflussung in Folge
einer bariatrischen Chirurgie liefern. Dieses bessere Verständnis der
pathophysiologischen Vorgänge könnte weiterhin zur Entwicklung weniger invasiver
chirurgischer Eingriffe oder spezieller, individueller pharmakologischer Therapien führen,
zielgerichtet auf Gewichtsverlust und Remission des Diabetes mellitus. Weiterhin könnte
Metabolomik bei der Entscheidung über die OP-Methode helfen. Dazu müsste es
gelingen, aus einem großen Patientenkollektiv mit mehreren OP-Methoden im Urin z.B.
einen Prädiktor zu finden, welcher Gewichtsverlust und Resolution von Komorbidität für
einen individuellen Patienten vorhersagt.
Insgesamt befindet sich die Metabolomikforschung noch in den Anfängen. Im Besonderen
gilt dies für die Dokumentation des Einflusses chirurgischer Eingriffe auf das Metabolom
________________________________________________________________________________________ 43
des Urins. Weitere Studien mit einem größeren Patientenkollektiv und alternativen
Fragestellungen könnten hier zu einem Erkenntnisgewinn führen.
________________________________________________________________________________________ 44
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75. Cummings DE, Overduin J, Foster-Schubert KE, Carlson MJ. Role of the bypassed proximal intestine in the anti-diabetic effects of bariatric surgery. Surg Obes Relat Dis. 2007;3(2):109-115.
76. Holst JJ. The physiology of glucagon-like peptide 1. Physiol. Rev. 2007;87(4):1409-1439.
77. Baggio LL, Drucker DJ. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 2007;132(6):2131-2157.
78. Drucker DJ. Glucagon-like peptides: regulators of cell proliferation, differentiation, and apoptosis. Mol. Endocrinol. 2003;17(2):161-171.
________________________________________________________________________________________ 50
7. Anhang
7.1. Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine
anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät, keiner anderen wissenschaftlichen
Einrichtung vorgelegt worden.
Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass
eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.
Greifswald, den 25. Juni 2013 ___________________________________
Arne Jungnickel
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7.2. Danksagung
Ich danke Herrn Prof. Dr. med. H. Wallaschofski für die Überlassung des Themas und die
Unterstützung bei der Bearbeitung.
Frau PD Dr. rer. med. N. Friedrich danke ich für die Erstellung der Biostatistik und Ihre
hilfreichen Korrekturen und Anregungen zur Fertigstellung der Arbeit.
Ich danke Frau Dr. rer. med. K. Budde für die NMR-Spektroskopie der Urinproben und
Ihre Erläuterungen zum Verständnis dieser Methode.
Mein Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. med. T. Lohmann, Chefarzt der Medizinischen Klinik
Industriestraße des städtischen Krankenhauses Dresden-Neustadt, für die klinische
Zusammenarbeit bei der Erstellung der Patientendaten seiner Klinik und die Kooperation
mit dem Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin der Universitätsmedizin
Greifswald. Insbesondere danke ich dem Stationsarzt Dr. med. T. Wolf für seine
zuvorkommende Unterstützung während der Datensammlung in Dresden.
Meinem Bruder danke ich für wiederholte Logis in Dresden und für seine Excel-Expertise.
Schließlich danke ich meinen Eltern herzlich für die Ermöglichung meines Studiums.
Ihnen widme ich diese Arbeit.