Einfluss der anti-entzündlichen Therapie bei Patienten mit ... · - Konjunktivitis - Keratitis - Retrobulbärneuritis - Choroiditis - Iridozyklitis Entzündliche Gelenkerkrankungen

Ruhr-Universität Bochum

Prof. Dr. med. T. Griga

Dienstort: Knappschaftskrankenhaus Dortmund

Abt.: Medizinische Klinik

Einfluss der anti-entzündlichen Therapie bei Patienten mit einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung durch den Promotor-

Polymorphismus T/C an Position –159 des CD14-Gens

Inaugural Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer

Hohen Medizinischen Fakultät

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Christian Wilkens

aus Diepholz

2009

Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr

Referent: Prof. Dr. med. T. Griga

Koreferent: PD Dr. med. C. Teschendorf

Tag der mündlichen Prüfung: 20. April 2010

Abstract

Einfluss der anti-entzündlichen Therapie bei Patien ten mit einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung durch den Promotor-Pol ymorphismus T/C an Position –159 des CD14-Gens

In der täglichen Routine werden unterschiedliche Therapieerfolge bei der anti-inflammatorischen Therapie von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen beobachtet. Endoluminale Bakterien und deren Toxine spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung einer chronisch-entzündlichen Darmerkrankung. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Analyse der Assoziation des Polymorphismus T/C an der Position –159 des CD14-Endotoxin-Rezeptor-Gens und der kumulativen Steroiddosis.

Methodik: Bei 72 Patienten mit chronisch-entzündlicher Darmerkrankung (Morbus Crohn: n = 37; Colitis ulcerosa: n = 35) wurde der Polymorphismus T/C an der Position –159 des CD14-Endotoxin-Rezeptor-Gens analysiert und mit der kumulativen Steroiddosis korreliert.

Ergebnisse: Die kumulative Steroiddosis war bei Colitis ulcerosa-Patienten mit dem TT-Genotyp signifikant höher (2447,7 ± 927,0 mg/a, n = 10) verglichen mit dem CT-Genotyp (142,3 ±142,3 mg/a, n = 13, p = 0,016) und dem CC-Genotyp (391,7 ± 272,7 mg/a, n = 9, p = 0,047). Bei Patienten mit Morbus Crohn zeigten sich keine signifikanten Unterschiede.

Zusammenfassung: Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Polymorphismus T/C an der Position –159 des CD14-Endotoxin-Rezeptor-Gens einen Einfluss auf die anti-inflammatorische Therapie von Patienten mit einer Colitis ulcerosa hat. Weitere Untersuchungen dieser prädisponierenden Gene werden neue stratifizierte Therapiewege von Patienten mit einer chronisch-entzündlichen Darmerkrankung eröffnen.

meinen Eltern in Dankbarkeit gewidmet

I

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG ......................................................................................................1

1.1 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen............................................................1

1.1.1 Morbus Crohn..........................................................................................................1

1.1.1.1 Epidemiologie...................................................................................................1

1.1.1.2 Ätiologie und Pathogenese ...............................................................................2

1.1.1.3 Pathologie .........................................................................................................3

1.1.1.4 Klinik ................................................................................................................3

1.1.1.5 Therapie ............................................................................................................7

1.1.1.6 Prognose............................................................................................................8

1.1.2 Colitis ulcerosa ........................................................................................................8

1.1.2.1 Epidemiologie...................................................................................................8

1.1.2.2 Ätiologie und Pathogenese ...............................................................................9

1.1.2.3 Pathologie .......................................................................................................10

1.1.2.4 Klinik ..............................................................................................................10

1.1.2.5 Therapie ..........................................................................................................11

1.1.2.6 Prognose..........................................................................................................11

1.1.2.7 Karzinomprophylaxe ......................................................................................12

1.2 CD14-Antigen .............................................................................................................12

1.2.1 Membrangebundenes (m) CD14-Antigen .............................................................13

1.2.2 Lösliches (s) CD14-Antigen..................................................................................14

1.3 Zielsetzung und Fragestellung ..................................................................................15

2 MATERIAL UND METHODEN.............................. ............................................17

2.1 Material .......................................................................................................................17

2.1.1 Patientenkollektiv ..................................................................................................17

2.1.2 Oligonukleotide .....................................................................................................20

II

2.1.3 Chemikalien...........................................................................................................20

2.1.4 Lösungen ...............................................................................................................21

2.1.5 Enzyme..................................................................................................................22

2.1.6 Längenstandards ....................................................................................................22

2.2 Methoden ....................................................................................................................22

2.2.1 Genomische DNA-Extraktion aus Vollblut...........................................................22

2.2.2 Reinheitsgrad- und Konzentrationsbestimmung der DNA....................................23

2.2.3 Amplifikation der genomischen DNA mit der Polymerasekettenreaktion............24

2.2.4 Spaltung der PCR-Produkte mittels des Restriktionsfragment-

Längenpolymorphismus (RFLP) ........................................................................................25

2.2.5 Agarose-Gelelektrophorese ...................................................................................25

2.2.6 Schematische Darstellung des Fragebogens..........................................................26

2.2.7 Ermittlung der kumulativen Steroiddosis..............................................................27

2.2.8 Statistik ..................................................................................................................27

3 ERGEBNISSE...................................................................................................28

3.1 Morbus Crohn ............................................................................................................28

3.1.1 Geschlecht .............................................................................................................28

3.1.2 Familienanamnese .................................................................................................28

3.1.3 Extraintestinale Manifestation...............................................................................29

3.1.4 Befallsmuster des Darmes .....................................................................................29

3.1.5 Kumulative Steroiddosis .......................................................................................29

3.2 Colitis ulcerosa ...........................................................................................................30

3.2.1 Geschlecht .............................................................................................................30

3.2.2 Familienanamnese .................................................................................................31

3.2.3 Extraintestinale Manifestationen ...........................................................................31

3.2.4 Dauer der CED ......................................................................................................31

3.2.5 Befallsmuster des Darmes .....................................................................................31

3.2.6 Kumulative Steroiddosis .......................................................................................31

4 DISKUSSION....................................................................................................33

III

5 ZUSAMMENFASSUNG .................................... ................................................38

6 LITERATURVERZEICHNIS............................... ...............................................39

IV

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Kaskade der Immunantwort bei einer gram-negativen Sepsis.

(http://www.biochem.duke.edu/Raetz/Lipid%20A1.html) ................15

Abbildung 2: Prozentuale Altersverteilung ...........................................................17

Abbildung 3: Verteilung der homo- und heterozygoten Allele ..............................18

Abbildung 4: Box-Plot über die Altersverteilung entsprechend des

Genpolymorphismus........................................................................18

Abbildung 5: Prozentuale Anteile des Gen-Codes bei Männern und Frauen mit

Morbus Crohn. ................................................................................19

Abbildung 6: Prozentuale Anteile des Gen-Codes bei Männern und Frauen mit

Colitis ulcerosa................................................................................20

Abbildung 7: Fragebogen zur Dissertation ...........................................................26

Abbildung 8: Kumulative Steroiddosis beim Morbus Crohn .................................30

Abbildung 9: Kumulative Steroiddosis bei der Colitis ulcerosa ............................32

V

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Initialsymptome der CED .....................................................................4

Tabelle 2: Extraintestinale Befallsmuster ..............................................................6

VI

Abkürzungsverzeichnis

5-ASA-Präparat 5-Aminosalicylacid-Präparat

CARD15 caspase activating recruitment domain 15

CDAI Crohn´s disease activity index

CED Chronisch entzündliche Darmerkrankung

CU Colitis ulcerosa

DGVS Deutsche Gesellschaft für Verdauungs- und Stoffwechselkrankheiten

DNA Deoxyribonucleinacid

EDTA-Blut Ethylenediaminetetraacetic acid

GPI-Anker Glykosyl-phosphatidyl-inositol-Anker

HDL High Density Lipoprotein

HLA human lymphocyte antigen

Ig Immunglobulin

IL Interleukin

LBP Lipoprotein bindendes Protein

LDL Low Density Lipoprotein

LPS Lipopolysaccharid

MC Morbus Crohn

mCD14 Membrangebundenes CD14

PAMP pathogen assoziated molecular pattern

PCR polymerase chain reaction

RFLP Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus

sCD14 lösliches CD14

SNP single nucleotid polymorphism

Taq Bakterium Thermus aquaticus

TLR Toll-like-Rezeptor

- 1 –

1 Einleitung

1.1 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen

Allen Formen der „chronisch entzündlichen Darmerkrankungen“ (CED) gemeinsam

ist eine meist in Schüben verlaufende Entzündung des Gastrointestinaltraktes. Das

Leitsymptom sind chronisch auftretende Diarrhoen (Siegenthaler 2000).

Differentialdiagnostisch finden sich infektiöse Enteritiden, medikamentös allergische

Kolitiden, pseudomembranöse Kolitiden, Strahlenkolitiden, immundefekt-assoziierte

Kolitiden oder die idiopathisch entzündlichen Darmerkrankungen (Hahn et al. 1996).

Hierbei lassen sich bei den idiopathischen Formen Morbus Crohn (MC) und Colitis

ulcerosa (CU) unterscheiden.

1.1.1 Morbus Crohn

Betrachtet man die Historie dieses Krankheitsbildes, so wurde bereits 1761 durch

Morgagni eine „ileal passion“ beschrieben. Im Jahre 1806 konnte bei einem

Patienten, der jahrelang an kolikartigen Bauchschmerzen litt, bei der Autopsie ein

verdicktes, deutlich entzündlich verändertes Ileum gefunden werden. Erst durch die

Autoren Crohn, Ginzburg und Oppenheimer fand die Erkrankung 1932 ihre heutige

Namensgebung, die sich damals insbesondere durch ihre subakute Entzündung mit

Beschränkung auf das terminale Ileum auszeichnete (Crohn et al. 1932).

1.1.1.1 Epidemiologie

Für die Inzidenz des MC konnte ein deutliches Nord-Süd-Gefälle nachgewiesen

werden, mit den höchsten Raten für skandinavische Länder. Dabei bewegen sich

die Inzidenzen gegenwärtig zwischen 1,5 und 6,1 neuen Fällen pro Jahr auf 100000

Einwohner (Hahn et al. 1996). Das Erstmanifestationsalter liegt zwischen dem 15.

und 35. Lebensjahr, wobei eine eindeutige Geschlechtspräferenz nicht

nachgewiesen werden konnte (Caspary, Bargon 1999). Allerdings zeichnet sich ein

deutlicher Einfluss von Umweltfaktoren auf die Inzidenz der Erkrankung ab, wie an

- 2 –

jüdischen Patienten gezeigt werden konnte. So haben beispielsweise

amerikanische Juden ein 4-fach höheres Erkrankungsrisiko als die übrige

amerikanische Bevölkerung, wobei in Israel lebende Juden eine der übrigen weißen

Bevölkerung ähnliche Inzidenz vorweisen (Hahn et al. 1996). Neben

sozioökonomischen Faktoren wie arm-reich, oder Stadt-Landbevölkerung scheinen

aber auch genetische Faktoren eine wesentliche Rolle zu spielen. Dabei stellt die

Erkrankung eines Verwandten ersten Grades den größten Risikofaktor dar. Man

vermutet ein heterogenes genetisches Modell (Hahn et al. 1996). Über die

diagnostische Latenz von Beginn der Symptomatik bis zur Erstdiagnose finden sich

noch unterschiedliche Ergebnisse, die sicherlich internationalen und auch

nationalen Abweichungen unterliegen. Beispielhaft zeigte eine Arbeit über die

Inzidenz der CED in der Oberpfalz, dass die mittlere Latenz im Median bei 61

Tagen liegt (Range 0 – 10 Jahre).

1.1.1.2 Ätiologie und Pathogenese

Sowohl beim MC, als auch bei der CU konnte eine definitive Ätiologie bisher nicht

nachgewiesen werden. Bezüglich der Prädisposition des MC scheinen dennoch

unterschiedliche Mechanismen Einfluss zu nehmen. Umweltfaktoren wie veränderte

Ernährungsgewohnheiten, Verstädterung der Bevölkerung, Wohlstand,

Auswanderungen, oder aber das Nord-Süd-Gefälle weisen auf einen

Zusammenhang mit dem Ausbruch der Erkrankung hin. So führt zum Beispiel eine

ausschließlich parenterale Ernährung, oder aber eine operative Ausschaltung des

entzündeten Darmabschnittes zu einer klinischen Besserung (Caspary, Bargon

1999). Im Gegensatz zur CU findet sich bei MC Patienten eine erhöhte Inzidenz bei

Rauchern (Adler 1997). Eine ähnliche Korrelation fand sich bei der Einnahme oraler

Kontrazeptiva, wobei die Einnahme die Inzidenz positiv beeinflusste. Wie bereits

erwähnt, haben genetische Konstellationen einen wesentlichen Einfluss, einen MC

zu entwickeln. Dabei ist ein polygener Erbgang sehr wahrscheinlich, wobei noch

nicht bekannt ist, in welchem Umfang mehrere Gene interagieren, damit es zur

phänotypischen Ausprägung des klinischen Krankheitsbildes kommt. Insbesondere

die HLA-Typisierung nimmt einen hohen Stellenwert in der Forschung ein. So zeigte

sich in Tiermodellen, dass sich bei einer transgenen Ratte mit dem menschlichen

- 3 –

HLA B27-Merkmal eine Kolitis entwickelte. Eine mögliche infektiöse Genese des

MC wird bis heute kontrovers diskutiert. Dennoch scheint eine Regulationsstörung

der Immunantwort das Bindeglied zwischen genetischer Disposition und

Umweltfaktoren zu sein. Durch das entstehende Missverhältnis zwischen IgA- und

IgG-, bzw. IgM-Sekretion bei MC Patienten kommt es in der Mukosa zu einer

vermehrten Aktivierung des Komplement aktivierenden Systems. Dies hat durch die

zytotoxischen Eigenschaften eine konsekutive Zerstörung von intestinalen

Epithelzellen zur Folge (Caspary, Bargon 1999). Uneinstimmig werden mögliche

Zusammenhänge mit psychosozialen Faktoren diskutiert, da überwiegend

retrospektive Daten vorliegen und somit auch bei fehlenden Kontrollstudien keine

eindeutigen Korrelationen gefunden werden konnten.

1.1.1.3 Pathologie

Im Gegensatz zur CU zeigt sich ein diskontinuierliches Befallsmuster mit so

genannten skip lesions, wobei der gesamte Gastrointestinaltrakt betroffen sein

kann. In bis zu 75% der Fälle ist das terminale Ileum das am häufigsten entzündete

Teilstück des Darmes. In dreiviertel aller Fälle ist das Rektum nicht mit befallen.

Eine isolierte Entzündung des Rektums beim MC ist nur in 2-6% der Fälle

beschrieben (Hahn et al. 1996). Typisch ist eine transmurale Entzündung der

Schleimhaut, die bis auf die Serosa übergreift. Durch die resultierenden

Ulzerationen bietet sich makroskopisch das Bild eines Pflastersteinreliefs mit

intermittierender intakter Schleimhaut. Histologisch können sich in 40 – 60% der

Fälle epitheloidzellige Granulome finden, die allerdings nicht als pathognomonisch

gelten, da sie zudem bei gastrointestinalen Krankheitsbildern wie Campylobacter

jejuni, Mykobakteriosen, Divertikulitis, Morbus Whipple, oder chronischen

Ischämiereaktionen auftreten können (Caspary, Bargon 1999).

1.1.1.4 Klinik

Zu den Leitsymptomen des MC zählen abdominelle Schmerzen, Diarrhoen,

Gewichtsabnahme, Fieber. Durch den häufigen Befall des terminalen Ileums kann

ebenfalls eine perniziöse Anämie bestehen.

- 4 –

Tabelle 1: Initialsymptome der CED

Initialsymptome Morbus Crohn

(%)

Colitis ulcerosa

(%)

Durchfälle 49,5 96,4

Blutbeimengungen 27,3 89,3

Schmerzen 86,9 81,3

Allgemeines Unwohlsein 81,7 40,2

Gewichtsverlust 59,6 38,4

Arthralgien 29,2 27,7

Fieber 24,7 20,5

Hautveränderungen 14,2 15,2

Appetitlosigkeit 18,7 11,6

Ophthalmopathien 3,8 7,1

Übelkeit 28,1 6,3

Erbrechen 20,2 4,5

Abszesse 25,8 3,6

Fisteln 39,3 3,6

Lymphknotenschwellungen 2,6 1,8

- 5 –

Aufgrund der Leitlinien der Deutschen Gesellschaft für Verdauungs- und

Stoffwechselkrankheiten (DGVS) werden fünf unterschiedliche Stadien

unterschieden:

- akuter Schub (leicht, mittelschwer, schwer), definiert durch die klinische

Symptomatik, sowie durch erhöhte Entzündungsparameter

- Chronisch aktiver Verlauf, bei Persistenz der Symptome über ein halbes Jahr

hinaus

- Steroidabhängiger Verlauf, wenn 10mg oder mehr Prednisolon für eine

anhaltende Remission notwendig sind

- Steroidrefraktärer Verlauf, wenn nach der Akuttherapie und fortgesetzter

Steroidgabe die klinische Symptomatik durch anhaltend hohe Steroidgabe

nicht zu durchbrechen ist

- Remission, mit normalisierter klinischer Symptomatik und regelhaften

Entzündungsparametern

Neben dem eigentlichen Befall des Intestinums gibt es zudem diverse

extraintestinale Manifestationen, die auf eine CED hindeuten. Allgemein werden

extraintestinale Komplikationen bei ca. 20 % der Erkrankten gefunden.

- 6 –

Tabelle 2: Extraintestinale Befallsmuster

Betroffenes Organ Befallsmuster

Haut - Erythema nodosum

- Pyoderma gangränosum

Oropharynx - Aphten

Augen - Episkleritis

- Uveitis

- Konjunktivitis

- Keratitis

- Retrobulbärneuritis

- Choroiditis

- Iridozyklitis

Entzündliche Gelenkerkrankungen - Arthritiden

- Sakroileitis

- Ankylosierende Spondylitis

Knochen - Osteoporose

- Osteomalazie

- Ischämische und aseptische

Knochennekrosen

Vaskulitiden - Vaskulitiden

- Myositiden

Bronchopulmonale

Manifestationen

- Alveolitis

- Lungenfibrose

- 7 –

Pankreas - Akute Pankreatitis

- Autoantikörper gegen exokrines

Pankreasgewebe

Leber und Gallenwege - Chronisch aktive Hepatitis

- Primär sklerosierende

Cholangitis

- Cholelithiasis

- Pericholangitis

Nieren - Glomerulonephritis

- Interstitielle Nephritis

- Nephrolithiasis

1.1.1.5 Therapie

Generell werden medikamentöse von chirurgischen Maßnahmen unterschieden.

Letztere sollten nur beim Auftreten von Komplikationen durchgeführt werden, da

eine Heilung durch die operative Entfernung eines entzündeten Teilstücks des

Darmes nicht erfolgt (Adler 1997). Zu den therapeutischen Möglichkeiten gehören

unter anderem Kortikosteroide. Sie zeigen eine immunsuppressive und

entzündungshemmende Wirkung, wodurch sowohl die frühe, als auch die späte

Phase behandelt wird. Einen weiteren festen Bestandteil in der Behandlung der

CED bilden die Aminosalicylate. Sie zeichnen sich ebenfalls durch eine

antiinflammatorische Wirkung aus. Vorteile durch die Gabe von Immunsupressiva

wie Azathioprin ergaben sich durch die Möglichkeit der Reduktion der Steroiddosis,

sowie durch eine Verbesserung eines Fistelleidens. Ein Therapieerfolg stellte sich

zumindest bei zwei Drittel der Patienten ein (Caspary, Bargon 1999). Die kurative

Behandlung der CED durch Antibiotika konnte bisher nicht belegt werden. Lediglich

in der Therapie von Komplikationen (Abszesse, Sepsis oder bakterielle

Fehlbesiedlungen) kommen sie zum Einsatz. Neben den beiden genannten

- 8 –

Therapieoptionen ist insbesondere bei Patienten mit Mangelerscheinungen auch

eine enterale Formuladiät sinnvoll (Dignass 2001).

1.1.1.6 Prognose

Aufgrund der akuten Schübe und den spontanen Remissionen handelt es sich um

einen chronisch-rezidivierenden Verlauf. Etwa 30% der Betroffenen kommen

innerhalb von 4 Monaten in eine spontane Remission. Innerhalb von 2 Jahren

beträgt die Gefahr eines erneuten Schubes ca. 50%. Die bereits in Tabelle 2

erwähnten Komplikationen führen bei rund 90% der Patienten zu mindestens einer

Operation in ihrem Leben. Dabei gibt es keinen geschlechtsspezifischen

Unterschied. Trotz einer Operation treten bei 70% der Patienten bereits nach einem

Jahr endoskopisch sichtbare Läsionen auf. Nach 5 Jahren haben rund 40% der

Patienten ein symptomatisches Rezidiv. Die Mortalitätsrate beim MC ist aufgrund

der fortschreitend verbesserten Therapien deutlich gesunken. So ist das Risiko um

das maximal 1,5 fache erhöht. Überwiegend wurden als Todesursachen die Sepsis,

Malnutrition oder eine massive Blutung, Amyloidose, postoperative Mortalität,

Gallenwegs- und Atemwegserkrankungen angegeben (Adler 1997).

1.1.2 Colitis ulcerosa

Erstmals wurde diese Form der CED 1859 durch Wilks und Moxon als

eigenständiges Syndrom beschrieben und damit die bakteriell verursachte Form

von der idiopathischen Kolitis unterschieden. Hurst beschrieb 1935 die

entsprechenden sigmoidoskopischen Veränderungen als ulzeröse Kolitis.

1.1.2.1 Epidemiologie

Für die Inzidenz der CU zeigt sich ebenfalls wie beim MC eine geographische

Abhängigkeit. So werden in Nordeuropa, Nordamerika und Australien höhere

Inzidenzen vermerkt, als in Süd- und Osteuropa, oder Asien, bzw. Südamerika

(Hahn et al. 1996). Das Erstmanifestationsalter liegt zwischen dem 20. und 40.

Lebensjahr und zeigt einen zweiten Altersgipfel zwischen dem 50. und 60.

- 9 –

Lebensjahr. Longitudinale Untersuchungen ergaben jedoch eine stabile

Inzidenzrate, im Gegensatz zum MC, wo sich eine deutliche Zunahme von

Neuerkrankungen pro 100000 Einwohner darstellt. Die ethnische Zugehörigkeit

spielt ebenfalls eine Rolle. So erkranken Schwarze deutlich seltener. Ebenso im

Kontrast zum MC steht, dass die Inzidenzrate von Emigranten konstant bleibt, statt

anzusteigen.

1.1.2.2 Ätiologie und Pathogenese

Wie auch beim MC wird auch bei der CU ein komplexes Zusammenspiel von

mehreren Faktoren vermutet. Als protektiver Umweltfaktor wurde das Rauchen

beobachtet, wobei der Pathomechanismus noch nicht näher untersucht wurde. Eine

mögliche Milchallergie im Zusammenhang mit der CU wurde diskutiert, konnte

allerdings nicht eindeutig nachgewiesen werden. Des weiteren konnte durch

parenterale Ernährung, bzw. eine passagere Ileostomie keine wesentliche

langfristige Besserung wie beim MC erreicht werden. Die Einnahme oraler

Kontrazeptiva zeigte keine wesentliche Beeinflussung bezüglich Manifestation oder

Verlauf. Auch bei der CU wird eine familiäre Häufung und damit eine genetische

Abhängigkeit beschrieben (Caspary, Bargon 1999). In einer schwedischen

Zwillingsstudie von Tysk et al. konnte 1988 nachgewiesen werden, dass die

Konkordanzrate bei CU mit 6,3% wesentlich geringer ausfiel, als bei MC mit 58,3%

(Tysk et al. 1988). Demnach scheinen beim MC genetische Faktoren stärkeren

Einfluss zu nehmen. Bezüglich der Immunpathogenese scheint es sich im

Gegensatz zum MC bei der CU um eine Autoimmunkrankheit zu handeln. Diese

These wird durch die erhöhte Koinzidenz zu anderen Autoimmunkrankheiten wie

Diabetes mellitus, Thyreoiditiden oder perniziöse Anämie unterstützt. Während die

pathologische Immunantwort beim MC eine vermehrte IgG2-Produktion hervorruft,

kommt es bei der CU zu einer Überproduktion an IgG1 und IgG3 Subklassen.

Letztere rufen eine starke Autoimmunantwort hervor.

- 10 –

1.1.2.3 Pathologie

Markant für die CU ist die sich nach proximal kontinuierlich ausbreitende

Entzündung. Dabei beginnt die Entzündung meistens im Rektum und kann sich bis

zum Caecum als so genannte Pankolitis ausbreiten. In Einzelfällen ist auch das

terminale Ileum mitbetroffen. Dieser Zustand wird dann als Backwash-ileitis

beschrieben. Makroskopisch findet sich initial eine ödematöse Schwellung, sowie

eine Friabilität. Es kann durch mechanische Reizungen zu Kontaktblutungen

kommen. Im weiteren Verlauf kommt es zu solitären Erosionen mit longitudinal

ausgerichteten und zunehmend flächenhaft konfluierenden Ulzerationen. So

genannte Pseudopolypen entsprechen dabei den verbliebenen Schleimhautinseln.

Durch rezidivierende Schübe verliert das Kolon seine Haustrierung. Histologisch ist

hauptsächlich die Mukosa, nur selten die Submukosa betroffen. Neben

Kryptenabszessen findet sich ein deutlicher Verlust an Becherzellen.

1.1.2.4 Klinik

Zu den Leitsymptomen der CU zählen weniger die abdominellen Schmerzen, als

vielmehr peranale Blutabgänge, Diarrhöen mit kleinvolumigen, schleimig-blutigen

Stuhlentleerungen, sowie Tenesmen, Fieber oder Gewichtsverlust. Teilweise wurde

aufgrund des distalen Befalls auch eine Obstipationsneigung beschrieben (Hahn et

al. 1996). Vorwiegend haben Patienten im akuten Schub jedoch bis zu 30

Stuhlentleerungen pro Tag.

Es werden drei unterschiedliche Stadien unterschieden:

- Chronisch rezidivierender Verlauf, in etwa 70% der Fälle kommt es zu

langandauernden Remissionen. Sowohl NSAR, als auch Antibiotika oder 5-

Aminosalicylate können ein Rezidiv auslösen.

- Chronisch aktiver Verlauf, es werden trotz maximaler konservativer Therapie

keine langandauernden Remissionen erreicht

- Akut-fulminante Verlaufsform (toxisches Megakolon), die durch eine akute

Perforationsgefahr gekennzeichnet ist

- 11 –

Die extraintestinalen Manifestationen gelten in gleicher Weise für die CU und

wurden bereits in Tabelle 2 aufgelistet.

Die typischen Komplikationen im natürlichen Verlauf der CU sind (Hahn et al. 1996):

- Massive Blutungen

- Stenosen und Strikturen

- Perforation im Rahmen eines toxischen Megakolons oder durch

periproktitische Abszesse, bzw. Analfisteln bedingt

- Prästomale Ileitis, Pouchitis

- Primär sklerosierende Cholangitis

- Kolonkarzinom

1.1.2.5 Therapie

Die Therapie ist wie die des MC. Die CU ist durch eine Kolektomie heilbar,

allerdings nur ratsam für Patienten mit hohem Leidensdruck, bzw. fulminantem

Krankheitsverlauf.

1.1.2.6 Prognose

Das Ausmaß der Colitis bei Erstdiagnose hat eine entscheidende prognostische

Wertigkeit. So hat erwartungsgemäß die Pankolitis bzw. das toxische Megakolon

eine deutlich schlechtere Prognose, da eine sofortige Kolektomie notwendig ist.

Nach Operation ist die CU ausgeheilt. Allerdings zeigen sich auch unter der

konservativen Therapie langjährige Remissionen. Nur 37% der Patienten stehen

nach 10 Jahren weiterhin unter einer Dauermedikation. Es findet sich eine nur leicht

erhöhte Mortalitätsrate durch die sich möglicherweise einstellenden Komplikationen

wie kolorektales Karzinom und Erkrankungen der Gallenwege (sklerosierende

Cholangitis). Eine in regelmäßigen Abständen durchzuführende endoskopische

Kontrolle ist somit zur Vorbeugung eines Karzinoms leitliniengerecht indiziert

(DGVS 2008).

- 12 –

1.1.2.7 Karzinomprophylaxe

Die Krebsvorbeugung kann medikamentös mittels der 5-ASA-Präparate erfolgen.

Darüber hinaus ist eine regelmäßige endoskopische Kontrolle unabdingbar.

Entsprechend der Leitlinien sollte bei Patienten mit subtotaler/totaler CU ab dem

achten Jahr bzw. bei einer linksseitigen CU ab dem 15. Jahr nach Diagnosestellung

jährlich eine komplette Spiegelung des Darmes erfolgen mit Stufenbiopsie-

Entnahmen. Am aussagekräftigsten sind diese Biopsien, wenn sie während einer

Remissionsphase gewonnen werden. Wenn fragliche Dysplasien entdeckt werden,

ist eine Kontrolluntersuchung innerhalb von sechs Monaten indiziert, um den

Befund zu verifizieren. Erst nach Bestätigung einer hochgradigen Dysplasie durch

einen Referenzpathologen ist die Colektomie inklusive Entfernung des Rektums

empfohlen. Bei niedriggradigen Dysplasien besteht eine relative

Operationsindikation. (DGVS 2008)

1.2 CD14-Antigen

Die CED zeichnet sich durch eine multifaktorielle Genese aus. Wie bereits eingangs

beschrieben scheinen die Immunantwort auf darmpathogene Keime, sowie die

genetischen Faktoren eine entscheidende Rolle bei der Klinik zu spielen.

Verschiedene Polymorphismen wurden dabei untersucht. Die Aufgabe des CD14-

Antigens ist in der zellulären und humoralen Immunantwort zu finden. Dabei werden

insbesondere Lipopolysaccharide (LPS) der gram-negativen Bakterien neutralisiert

um einen möglichen septischen Schock zu verhindern. Wegen dieser Fähigkeit

bezeichnet man das CD14-Antigen auch als LPS-Rezeptor, da bereits geringe LPS-

Konzentrationen durch diesen Mechanismus eine Aktivierung von Monozyten zu

Folge hat. Allerdings werden auch weitere verschiedene Faktoren von gram-

negativen oder gram-positiven Bakterien, sowie Pilzinfektionen erkannt. Folgende

Funktionen werden dem CD14-Antigen ebenfalls zugeschrieben, wodurch sich eine

universelle Einsetzbarkeit des Proteins vermuten lässt (Antal-Szalmas 2000):

- 13 –

- Regulation des programmierten Zelltodes in Monozyten

- LPS-vermittelte Knochenresorption

- Phagozytose gram-negativer Bakterien (in vitro)

- Rolle bei der Aufnahme von apoptotischen Fragmenten im Serum

Das CD14-Antigen ist ein Glykoprotein mit 356 Aminosäuren und einem 19

Aminosäuren langen N-terminalen Hauptprotein. Zu finden ist das kodierende Gen

auf dem Chromosom 5 und enthält zwei Exons. Das CD14-Gen ist somit innerhalb

eines Zytokin-Clusters in der Chromosomenregion 5q22-q32 zu finden (Klein et al.

2002). CD14 ist kein transmembranöses Protein, sondern bindet sich an die

Plasma-Membran mittels eines Glykosyl-phosphatidyl-inositol-Ankers (GPI-Anker)

(Antal-Szalmas 2000). Präsentiert wird das CD14-Antigen hauptsächlich auf den

Zellen der myeloischen Reihe wie zum Beispiel Monozyten, Neutrophile,

Makrophagen, aber auch Zellen, wie zum Beispiel B-Lymphozyten, Basophile, oder

Trophoblasten zeigen geringe Konzentrationen. Bemerkenswert ist die Tatsache,

dass frühe Formen der myeloischen Zellreihe dieses Antigen nicht aufweisen. Auch

innerhalb einer Zellpopulation finden sich je nach Einsatzort unterschiedliche CD14-

Konzentrationen auf den Zellen. Makrophagen des Peritoneums, der Pleura oder

der perivaskulären Gehirnanteile verzeichnen höhere Konzentrationen als

Makrophagen der intestinalen Mukosa, der Alveolen, oder Mikroglia.

In der Literatur werden zwei Hauptformen des CD14 unterschieden.

1.2.1 Membrangebundenes (m) CD14-Antigen

Durch die Interaktion mit dem Lipopolysaccharid-bindenden Protein (LBP) hat es

eine rund 10² bis 10³ höhere Affinität zum LPS. LBP ist ein in der Leber und der

Lunge produziertes Protein und essentiell für eine schnelle Immunantwort auf eine

Infektion mit gram-negativen Bakterien. Somit können bis zu 15 LPS-Moleküle pro

CD14-Rezeptor gebunden werden. Diese sind durch einen GPI-Anker fest mit der

jeweiligen Zelle verbunden, wodurch eine transmembranöse Verbindung nach

intrazellulär fehlt. Mittels eines Toll-like-Rezeptors (TLR) erfolgt die

Signaltransduktion nach intrazellulär, wodurch nun die Immunantwort in Form einer

- 14 –

Zytokinkaskade beginnt (Takeuchi et al. 1999). Je nach Infektionsverlauf lassen

sich unterschiedliche Konzentrationen des CD14-Antigen nachweisen. In der ersten

Stunde kommt es durch intrazelluläre Translokation eines CD14-Pools an die

Zelloberfläche zu einem deutlichen Konzentrationsanstieg um die erste LPS-

Einschwemmung abzufangen. Da die Produktion des CD14-Antigens zunächst

langsam startet, kommt es in den nächsten Stunden zu einem Konzentrationsabfall

der Oberflächenkonzentration, da die intrazellulären Speicher aufgebraucht sind

und die Halbwertzeit des Oberflächenantigens kleiner ist. Die maximale Kapazität

ist somit nach drei Tagen durch eine gesteigerte Proteinsynthese erreicht (Antal-

Szalmas 2000).

1.2.2 Lösliches (s) CD14-Antigen

Im Gegensatz zur membrangebundenen Form dient bei der löslichen Form das LBP

lediglich als Katalysator, so dass maximal zwei LPS pro sCD14 aufgenommen

werden können. Es findet seine Hauptfunktion in der Neutralisierung und

Eliminierung von LPS im Serum. Zudem zeigt sich eine Interaktion mit CD14-

negativen Zellen wie dem Endothel und Epithel, oder der glatten Muskulatur.

Das CD14-Antigen reagiert nicht nur spezifisch auf das LPS. Vielmehr erweist es

sich als ein universell einzusetzendes Molekül zum Erkennen verschiedener

Infektionen. Beispielhaft führen Mycobakterien, Klebsiellen, Borrellien,

Streptokokken, oder Treponemen ebenfalls zu einer nachfolgenden Aktivierung der

Immunantwort. Ebenso führen verschiedene Erkrankungen neben der CED zu

einem erhöhten Serumlevel des CD14-Antigens. Neben der rheumatoiden Arthritis

sei auch der systemische Lupus erythematodes, die Psoriasis, Malaria, chronische

Hepatitiden, oder HIV-Infektionen erwähnt (Antal-Szalmas 2000).

- 15 –

Abbildung 1: Kaskade der Immunantwort bei einer gram-negativen Sepsis. (http://www.biochem.duke.edu/Raetz/Lipid%20A1.html)

1.3 Zielsetzung und Fragestellung

In vorangegangenen Studien wurde nachgewiesen, dass es verschiedene Allele

des CD14-Gens gibt. An der Position -159 (bezogen auf den Translationsstart)

befindet sich ein sog. single nucleotid polymorphism (SNP) T/C an Position -159,

der die Transkriptionsrate des CD14-Gens beeinflusst. Es konnte nachgewiesen

werden, dass Patienten, bei denen das T-Allel in homozygoter Form vorliegt,

signifikant höhere Plasmakonzentrationen des sCD14 haben. In einer anderen

Studie wurden inaktive Crohn Patienten untersucht. Durch die Inaktivität wollte man

den Einfluss des möglichen Schweregrades der Erkrankung auf die CD14-

Konzentrationen möglichst gering gehalten. Dabei wurden neben endoskopischen

und radiologischen Befunden auch der Crohn´s disease activity index (CDAI)

herangezogen. Des Weiteren wurde als Einschlusskriterium auf eine vergleichbare

Medikation bei fehlender Steroideinnahme geachtet. Das Ergebnis zeigte bei

inaktiven Crohn-Patienten einen signifikant erhöhten sCD14-Plasmaspiegel im

- 16 –

Gegensatz zu den gesunden Probanden bei allen drei möglichen Genvarianten

(CC, CT, TT). Innerhalb der Crohn-Patienten fand sich kein signifikanter

Unterschied in der Höhe der Plasmakonzentration. Ganz anders verhielt sich das

Ergebnis bezüglich der membrangebundenen Variante. Hier gab es keinen

signifikanten Unterschied zwischen inaktiven Crohn-Patienten und den Probanden,

wohl aber innerhalb der Patientengruppe. Hier zeigte sich eine signifikant höhere

mCD14-Konzentration bei Patienten mit dem Genotyp CC im Gegensatz zum

Genotyp TT. Diese beiden Ergebnisse führen uns zu der Fragestellung, in wiefern

dieser Polymorphismus nicht nur Einfluss nimmt auf die jeweilige Konzentration des

CD14-Antigens, sondern möglicherweise auch auf die Therapie entscheidend

einwirkt (Griga et al. 2005). In der vorliegenden Arbeit wurde mittels retrospektiver

Analytik versucht, eine Korrelation zwischen dem SNP T/C an Position -159 des

CD14-Gens und dem Therapieverlauf bei Patienten mit einer CED zu finden.

- 17 –

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Patientenkollektiv

In dieser Arbeit wurden bei insgesamt 72 Patienten mit einer CED der SNP T/C an

Position -159 des CD14-Gens genotypisiert. Zuvor wurde entsprechend der

europäischen Gesellschaft für chronisch entzündliche Darmerkrankungen durch

klinische, endoskopische, sowie histologische Parameter die Diagnose festgelegt.

Diesen Patienten entnahmen wir mit deren Einverständnis während eines

stationären Aufenthaltes Blut zur Genotypisierung. Weitere klinische Daten aller

Patienten wurden mittels eines detaillierten Fragebogens erfasst. Alle

durchgeführten Untersuchungen erfolgten mit der Zustimmung der Patienten. Ein

positives Votum der Ethikkomission der Ruhr-Universität-Bochum liegt vor

(Registriernummern: 2022 A und 829).

männlich

weiblich

Geschlecht des Patienten

20 bis <3030 bis <40

40 bis <5050 bis <60

60 bis <7070 bis <80

80 bis <90

Gruppierung nach Alter

0%

10%

20%

30%

Pro

zen

tual

er A

nte

il

8%

6%

18%

17%

13%

6%

13%

3%

3%

11%

3% 1%

Abbildung 2: Prozentuale Altersverteilung

- 18 –

männlich

weiblich


CC CT TT

Gen-Code

10%

20%

30%

40%

Pro

zen

tual

er A

nte

il

13%

15%29%

17%

14%

13%

Abbildung 3: Verteilung der homo- und heterozygoten Allele

20

40

60

80

Alte

r de

s P

atie

nten

(Ja

hre)

CC-Allel CT-Allel TT-Allel

Abbildung 4: Box-Plot über die Altersverteilung entsprechend des Genpolymorphismus

- 19 –

Von diesen Patienten hatten 37 einen klinisch gesicherten MC. Davon waren 15

Patienten Männer und 22 Frauen mit einem Durchschnittsalter von 40,75 Jahren

(Variationsbreite 21 – 70). Die mittlere Erkrankungsdauer der Patienten betrug

14,68 Jahre (Variationsbreite 4 – 31).

männlich

weiblich


CC CT TT

Gen-Code

10%

20%

30%

40%

50%

Pro

zen

tual

er A

nte

il b

eim

Mo

rbu

s C

roh

n

10%

15%

33%

15%

18%

8%

Abbildung 5: Prozentuale Anteile des Gen-Codes bei Männern und Frauen mit Morbus Crohn.

Bei den übrigen Patienten handelt es sich um insgesamt 35 Personen mit einer

klinisch gesicherten CU. Davon waren wiederum 17 Patienten Männer und 18

Patienten Frauen mit einem Durchschnittsalter von 46,36 Jahren (Variationsbreite

20 – 82). Mit 15,76 Jahren lag die mittlere Erkrankungsdauer ähnlich hoch wie beim

MC.

- 20 –

männlich

weiblich


CC CT TT

Gen-Code

10%

20%

30%

40%

Pro

zen

tual

er A

nte

il b

ei C

olit

is u

lcer

osa

15%

15%

24%

18%

9%

18%

Abbildung 6: Prozentuale Anteile des Gen-Codes bei Männern und Frauen mit Colitis ulcerosa.

2.1.2 Oligonukleotide

CD14 Pro-F: 5’-gtgccaacagatgaggttcac-3’

CD14 Pro-R: 5’-gcctctgacagtttatgtaatc-3’

2.1.3 Chemikalien

Agarose ultra pure Gibco BRL

Borsäure: J.T. Baker

Bromphenolblau Merck

Ethidiumbromid Sigma

Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Merck

Ficoll Typ 400 Pharmacia

Magnesiumchlorid p.A. Merck

Natriumacetat J.T. Baker

- 21 –

Natriumhydroxid J.T. Baker

Nukleotide MBI-Fermentas

Xylencyanol Bio Rad

2.1.4 Lösungen

Bidestilliertes Wasser wurde zur Erstellung der Lösungen verwendet.

Ethidiumbromidfärbelösung: 0,5 mg Ethidiumbromid

ad 1000 ml 1xTBE

Ladepuffer:

für Agarosegele: 0,25% w/v Bromphenolblau

0,25% w/v Xylencyanol FF

15% w/v Ficoll (Typ 400)

Gelelektrophoreselaufpuffer (1 x TBE): 89 mM TBE

89 mM Borsäure

2 mM EDTA

Magnesiumchlorid: 50 mM MgCl2

Nukleotide: 2 mM jedes Nukleotides in

H2O

PCR-Reaktionspuffer: 16 mM (NH2) 2SO4

67 mM Tris HCl (pH 8,8)

0,01% Tween-20

Oligonukleotide: 10 pmol/µl in H2O

- 22 –

2.1.5 Enzyme

Die von den Herstellern empfohlenen Puffer und Zusätze fanden Verwendung.

Taq DNA-Polymerase: Gene Craft

Restriktionsendonuklease:

Ava II NEB

2.1.6 Längenstandards

pUC19 DNA/MspI Marker MBI Fermentas

2.2 Methoden

2.2.1 Genomische DNA-Extraktion aus Vollblut

Zur Gewinnung der genomischen DNA aus Leukozyten wurde in unserer Arbeit die

Aussalzungsmethode nach Miller, Dykes und Polesky modifiziert angewandt (Miller

et al. 1988).

Dafür wurden je Proband 5 bis 10 ml EDTA-Blut für die DNA-Isolierung verwendet.

Das Blut wurde zuvor bis zu drei Monate bei konstanten –20°C gelagert. Um die

Erythrozyten zu lysieren wurde das Blut mit destilliertem Wasser in einem 50 ml

Röhrchen auf 45 ml aufgefüllt, das Blut/Wassergemisch geschüttelt und bei 3500

rpm bei 4°C für 15 min zentrifugiert. Nach Verwerfe n des Überstandes wurde das

Sediment mit NP 40, einem schwachen Detergens, resuspensiert, gemischt und

anschließend erneut unter den oben genannten Bedingungen zentrifugiert. NP 40

lysiert die Zellmembranen der Leukozyten, ohne die Kernmembran anzugreifen. Im

weiterführenden Schritt wurde zum Aufbruch der Kernmembranen und zum

Proteinverdau das Sediment mit 3 ml TEN pH 8,2, 200 µl 10%igem SDS und 100 µl

- 23 –

Proteinase K 10 mg/ml resuspendiert und intensiv geschüttelt. Daraufhin erfolgte

die Inkubation über Nacht bei 37°C im Wasserbad. Na ch dieser Wärmebehandlung

wurden sie zur besseren Peptidfällung ca. 1 h bei 4°C gekühlt und anschließend mit

gesättigtem NaCl versetzt, das Präzipitat dann bei 3500 rpm bei 4°C 15 min

zentrifugiert und der Überstand in ca. 8 ml 100%iges Äthanol gegeben. Nach 15

min wurde die nun an der Oberfläche schwimmende DNA mit einer Pipettenspitze

in 1 ml 70%iges Äthanol überführt, abzentrifugiert und luftgetrocknet. Die DNA dann

in 200 µl TE aufgenommen und im Brutschrank bei 38°C über Nacht gelöst.

2.2.2 Reinheitsgrad- und Konzentrationsbestimmung d er DNA

Der Reinheitsgrad und die Konzentration der DNA-Proben kann durch Messung des

Absorptionsspektrums zwischen 200 bis 400 nm bestimmt und mittels einem

Spektralphotometer (Uvicon 930 Kontron) durchgeführt werden. Die Proben werden

dafür 1:200 verdünnt, in eine Quarzküvette überführt und bei Wellenlängen von

230, 260, 280 und 320 nm gemessen. Eine Abschätzung der Verunreinigung mit

Proteinen, Polysacchariden bzw. Salzen erreicht man durch die Quotienten 260/280

und 230/260. Wenn der Küvetten-Leerwert (A. bidest bei 320 nm) vom

Extinktionswert bei 260 subtrahiert erhält man die Dichte der DNA.

Eine optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm entspricht 50 µg

doppelsträngiger DNA.

Die Formel zur Berechnung der DNA-Konzentration lautet:

DNA in ng/µl = (OD 260 nm OD 320 nm) x Verdünnung x 50 µg

Von den DNA-Proben wurden Verdünnungen mit einer Konzentration von 100 ng/µl

hergestellt.

- 24 –

2.2.3 Amplifikation der genomischen DNA mit der Pol ymerasekettenreaktion

Die Polymerasekettenreaktion oder polymerase chain reaction (PCR) ist eine

schnelle und effiziente Methode, um aus wenigen DNA-Fragmenten genügend

spezifische DNA-Mengen herzustellen. Unter der Nutzung der Thermostabilität der

DNA-Polymerase des thermophilen Bakteriums Thermus aquaticus (Taq) gelang es

Mullis erstmalig, die DNA vollautomatisch und exponentiell zu vermehren (Mullis,

Faloona 1987; Mullis et al. 1986).

Mit Hilfe von spezifischen Primern (siehe 2.1.2) wurde ein 479 Basenpaare (bp)

langer Bereich des Promotors des CD14-Gens amplifiziert. Jede Amplifikation

wurde in einer Mikrotiter-Platte (Thermowell Costar) im Uno-Thermoblock

(Biometra) vorgenommen. Sämtliche Ansätze wurden unter sterilen Kautelen

pipettiert.

Für die DNA-Amplifikation wurde ein Programm gewählt, welche erst im dritten

Zyklus der PCR die endgültige Hybridisierungstemperatur des strangspezifischen

Oligonukleotid-Primers erreichte. Begonnen wurde mit 62°C und 59°C. Die

Anfangstemperatur lag um 6°C höher als die Endtempe ratur und wurde für den

zweiten und dritten Zyklus um jeweils 3°C verringer t. Die Denaturierungsphase

dauerte bei 95°C in der ersten Schleife 3 min und b ei allen anderen Schleifen 30 s.

Für die Elongationsreaktion wurde 1 min gewählt. Insgesamt wurden 25 Zyklen

durchgeführt. Der Ansatz für die PCR hatte ein Endvolumen von 10 µl.

- 25 –

PCR

DNA (100 ng/µl) 0,5 µl

10 x Taq-Puffer (Genecraft) 1 µl

dNTP 2 mM 0,1 µl

5´-Primer (10 pmol/µl) 1,0 µl

3´-Primer (10 pmol/µl) 1,0 µl

MgCl2 50 mM 0,2 µl

Taq-Enzym (5 U/µl) 0,2 µl

H20 ad 10 µl

Als Verdunstungsschutz wurde den Reaktionsansätzen ein Tropfen Mineralöl

zugesetzt.

2.2.4 Spaltung der PCR-Produkte mittels des Restrik tionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)

Mit dieser Methode kann man durch so genannte Restriktionsenzyme die DNA in

Fragmente zerschneiden. Das eingesetzte Enzym Ava II erkennt spezifisch die

Basensequenz GGWCC (wobei der Buchstabe W für A bzw. T steht). Beim

Vorhandensein des T-Allels war eine Schnittstelle für Ava II vorhanden und man

erhielt nach dem Verdau zwei Fragmente der Länge von 353bp und 144bp. Bei

Vorhandensein des C-Allels wurde das Amplifikat nicht geschnitten. Es wurden 2 U

Enzym pro µg genomischer DNA und der entsprechende Puffer bei der vom

Hersteller empfohlenen Temperatur eingesetzt. Die Inkubationszeit lag zwischen 4

und 12 h.

2.2.5 Agarose-Gelelektrophorese

Die Auftrennung der amplifizierten DNA-Fragmente erfolgte in 2%igen horizontalen

- 26 –

Agarosegelen bei 100 V in einem 1xTBE Laufpuffer. Als Längenmarker (200

ng/DNA) diente pUC 19/Msp I. Nach 15 minütigem Schwenken der Agarosegele in

mit H2O verdünnter EtBr-Lösung (1µl/ml) wurde die DNA unter UV-Licht erkennbar.

Mittels einer fest installierten Videokamera, gekoppelt mit einem Computersystem

incl. Thermodrucker, wurden die Ergebnisse dokumentiert.

2.2.6 Schematische Darstellung des Fragebogens

Neben der Genotypisierung der Patienten spielt der Fragebogen eine zentrale Rolle

in dieser Arbeit. Wichtig war, einen übersichtlichen und einfach zu bewältigenden

Fragebogen zu erstellen, um eine möglichst hohe Rückläuferquote zu erhalten. Es

wurden verschiedene Daten erhoben, wie zum Beispiel nähere Angaben zur Person

(Körpergröße, Körpergewicht, Raucher, Beginn der Darmerkrankung, Anzahl der

Krankenhausaufenthalte), Familienanamnese, Angaben zur CED (Befall welcher

Regionen, extraintestinale Manifestationen, Operationen), Medikation der letzten

drei Jahre.

Name: ____________ Vorname:_______________ Geburtsdatum:______________

O Morbus Crohn O Colitis ulcerosa Allgemeine Fragen zu Ihrer Person: Körpergröße:_________ cm Körpergewicht: _________ kg Raucher: O ja O nein Beginn Ihrer Darmerkrankung: ____________ Wie oft lagen Sie wegen Ihrer Darmerkrankung schon im Krankenhaus: _____________ Wer ist in der Familie an Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa erkrankt? O Niemand O Morbus Crohn O Morbus Crohn Vater Mutter O Colitis ulcerosa O Colitis ulcerosa O Morbus Crohn O Morbus Crohn Geschwister Großeltern O Colitis ulcerosa O Colitis ulcerosa Wissen Sie, welche Darmabschnitte bei Ihnen schon befallen waren? Bitte markieren sie die zutreffenden Regionen, oder kreuzen Sie an:

O Rektum O Sigma O re. Colon O li. Colon O terminales Ileum O Sonstige Darmabschnitte:__________________

Hatten Sie schon einmal in diesem Zusammenhang eine der folgenden Beschwerden? O Gelenkschmerzen oder Gelenkentzündungen großer Gelenke O Augenentzündungen (Iridozyklitis, Skleritis, Uveitis) O Hauterkrankungen (Pyoderma gangränosa, Erythema nodosa) O Abszesse, Fissuren oder Fisteln O Darmverengung (Stenose) Wurden Sie schon einmal bezüglich Ihrer Darmkrankheit operiert? O ja O nein Wenn ja, welche OP und wann?:_____________________________________________

Bitte tragen sie in den folgenden Monatskalendern ein, welche Dosierung Sie in den letzten drei Jahren vom entsprechenden Medikament eingenommen haben. 1. Cortisonpräparate (z.B. Decortin, SDH, Budenosid, Kortisonklysmen, oder . ________ )

2. Azathioprine (z.B. Imurek, Azafalk, oder: __________________________ ) Jan 00 Feb 00 Mrz 00 Apr 00 Mai 00 Jun 00 Jul 00 Aug 00 Sep 00 Okt 00 Nov 00 Dez 00

Jan 01 Feb 01 Mrz 01 Apr 01 Mai 01 Jun 01 Jul 01 Aug 01 Sep 01 Okt 01 Nov 01 Dez 01


3. Antibiotika (z.B. Ciprobay, Clont, oder: ___________________________ )







Abbildung 7: Fragebogen zur Dissertation

- 27 –

2.2.7 Ermittlung der kumulativen Steroiddosis

Anhand des Fragebogens wurde die kumulative Steroiddosis erhoben. Durch

Addition der angegebenen Dosis pro Zeitraum wurde die kumulative Steroiddosis

des einzelnen Patienten in mg/Jahre ermittelt.

2.2.8 Statistik

Die statistische Auswertung wurde mit Hilfe der SPSS®-Software Version 15

durchgeführt. Bindend für alle statistische Analysen war ein Signifikanzlevel von

α = 0,05. Um qualitative Eigenschaften von Gruppen beurteilen zu können wurde

der Chi-Quadrat-Test nach Pearson angewandt.

Mittels Mann-Whitney-U-Test wurden voneinander unabhängige Stichproben

miteinander verglichen. Es wird überprüft, ob zwei beprobte Grundgesamtheiten die

gleiche Lage besitzen. Die Beobachtungen aus beiden Gruppen werden kombiniert

und in eine gemeinsame Reihenfolge gebracht, wobei im Falle von Rangbindungen

der durchschnittliche Rang vergeben wird.

Mehrere voneinander unabhängige Stichproben aus derselben Grundgesamtheit

wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test überprüft.

- 28 –

3 Ergebnisse

In dieser Arbeit wurde ein SNP in der Promotor-Region (T/C an Position –159) des

CD14-Gens untersucht. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte in zwei

unterschiedlichen Gruppen. Es erfolgte jeweils eine getrennte Auswertung der

Daten bezüglich des Polymorphismus sowohl für den MC als auch für die CU.

3.1 Morbus Crohn

3.1.1 Geschlecht

Zunächst wurde untersucht, ob es innerhalb der Datenreihe einen signifikanten

Unterschied in der Verteilung bezüglich des Genotyps und des Geschlechts gibt.

Insgesamt wurden 15 Männer und 22 Frauen untersucht. Eine mögliche

Abhängigkeit des Geschlechts auf die Allelverteilung konnte nicht nachgewiesen

werden. Die männlichen Probanden hatten eine mittlere Körpergröße von 178,1

±2,6 cm, während die Frauen einen Mittelwert von 165,4 ± 3,7 cm aufwiesen. Auch

bezüglich des Gewichtes zeigten die Männer mit 82,4 ± 3,7 kg einen höheren Wert

als die Frauen mit 67,6 ± 3,3 kg. Bezüglich einer möglichen Korrelation zwischen

der Cortisondosis und der Dauer der Steroideinnahme konnten keine Unterschiede

zwischen den Geschlechtern festgestellt werden.

3.1.2 Familienanamnese

Mit dieser Fragestellung wurde untersucht, ob es einen signifikanten Unterschied

zwischen den einzelnen Genotypen bezüglich einer familiären Disposition gibt. Es

konnte herausgefunden werden, dass in dieser Studie beim MC ausschließlich bei

Patienten mit dem CC-Genotyp eine positive familiäre Disposition vorhanden ist. Es

zeigte sich eine exakte Signifikanz zwischen dem CC- und dem CT-Allel von p =

0,031 und zwischen dem CC-Genotyp und dem TT-Genotyp eine asymptotische

Signifikanz von p = 0,016.

- 29 –

3.1.3 Extraintestinale Manifestation

In der Studie wurden die Patienten zu den verschiedenen und gängigen

extraintestinalen Manifestationen befragt. Mit einbezogen wurden folgende

Gruppen:

- Arthralgien, Arthritis

- Iritis, Uveitis, Skleritis

- Pyoderma, Erythema nodosum

- Abszesse, Fisteln

- Darmstenose

- Anzahl der extraintestinalen Manifestationen

Allein Patienten mit dem Genotyp CC bilden keine Hautmanifestationen aus. Das

asymptotische Signifikanzniveau lag gegenüber dem TT-Genotyp bei 0,021. Die

übrigen Berechnungen konnten keine weiteren Abhängigkeiten zwischen dem

Polymorphismus und den extraintestinalen Manifestationen feststellen

3.1.4 Befallsmuster des Darmes

Anhand der vorliegenden Daten konnte kein Zusammenhang zwischen dem

Darmbefall von MC-Patienten und seiner CD14-Zugehörigkeit gefunden werden.

3.1.5 Kumulative Steroiddosis

Es zeigte sich bei den MC-Patienten kein signifikanter Unterschied der Steroiddosis

zwischen den Genotypen mit einer mittleren kumulativen Steroiddosis des TT-

Genotypen von 61,1 ± 45,3 mg/Jahr (n = 9) zu den Genotypen CT mit 1993,0 ±

858,7 mg/Jahr (n = 18) und CC mit 377,7 ± 214,7 mg/Jahr (n = 10).

- 30 –

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

CC CT TT

Gen-Code

kum

ulat

ive

Cor

tison

dosi

s be

i Mor

bus

Cro

hn (

mg/

Jahr

)

Abbildung 8: Kumulative Steroiddosis beim Morbus Crohn

3.2 Colitis ulcerosa

3.2.1 Geschlecht

Auch in dieser Kohorte konnte keine unterschiedliche Verteilung der Genotypen

zwischen den Geschlechtern gefunden werden. Ähnlich wie beim MC fand sich

auch bei diesem Patientenkollektiv, dass die Männer mit 178,3 cm ± 1,3 cm größer

waren als die Frauen mit 166,9 ± 1,2 cm. Somit waren die Männer mit 77,9 ± 2,3 kg

ebenfalls schwerer als die Frauen mit 65,3 ±2,3 kg.

- 31 –

3.2.2 Familienanamnese

Die zuvor beim MC festgestellte Abhängigkeit zwischen der familiären Disposition

und dem Genotyp konnte für die CU nicht nachgewiesen werden.

3.2.3 Extraintestinale Manifestationen

CU Patienten zeigten in Hinblick auf die Häufigkeit von Arthralgien eine exakte

Signifikanz zwischen dem CC-Genotyp (22,2%) gegenüber dem TT-Genotyp

(85,7%) mit p = 0,02. Demnach hat das letztgenannte Patientenklientel wesentlich

häufiger Arthralgien angegeben.

3.2.4 Dauer der CED

Die Patienten mit dem Phänotypen CC wiesen einen wesentlich länger anhaltenden

Verlauf der Erkrankung auf, als die Patienten mit dem Phänotypen TT 17,8 ± 2,8

Jahre versus 8,7 ± 1,6 Jahre). Bemerkenswert ist, dass die letztgenannte Gruppe

ein im Mittel um 4 Jahre höheres Alter der Erstmanifestation zeigte.

3.2.5 Befallsmuster des Darmes

Auch für die CU konnte keine Korrelation zwischen dem Genotyp und einer

bevorzugten Darmregion erhoben werden.

3.2.6 Kumulative Steroiddosis

Die kumulative Steroiddosis bei den CU-Patienten mit dem Genotyp TT war mit

2447,7 ± 920.0 mg/Jahr (n = 10) signifikant höher ausgefallen als beim CT-Genotyp

mit 142,3 ± 142,3 mg/Jahr, (n = 13, p = 0,016) und dem CC-Genotyp mit 391,7 ±

272,7 mg/Jahr (n=9, p=0,047).

- 32 –

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

CC CT TT

Gen-Code

kum

ulat

ive

Cor

tison

dosi

s be

i Col

itis

ulce

rosa

(m

g/J

ahr)

Abbildung 9: Kumulative Steroiddosis bei der Colitis ulcerosa

- 33 –

4 Diskussion

Die Rolle des CD14-Antigens im menschlichen Körper spiegelt sich in diversen

Aufgaben wieder. Es gehört unter anderem zu den akute Phase Proteinen und wird

entsprechend bei Entzündungen, aber auch Traumata vermehrt aus den Zellen

sezerniert, bzw. präsentiert. Dazu gehören die Monozyten, Neutrophile und

Makrophagen welche die beiden unterschiedlichen Formen, zum einen sCD14 und

zum anderen mCD14 produzieren. Deren Zuständigkeit beläuft sich vor allem

darauf, die bei einer Infektion von gram-negativen Bakterien exprimierten LPS zu

erkennen und unschädlich zu machen. Neuere Studien haben ergeben, dass das

mCD14, aufgrund seiner nicht-transmembrösen Verankerung den TLR 4 für die

Signalübertragung nach intrazellulär benötigt. Die TLR sind Pendants zu dem Toll-

Protein der Drosophila. Im Gegensatz dazu kommt es durch das sCD14 zu einer

unspezifischen Reaktion gegenüber dem LPS. Entscheidend ist zudem auch das

vorhanden sein von LBP, welches als Katalysator zwischen CD14 und LPS fungiert

und die Bindungskapazität des mCD14 um das bis zu 100 bis 1000-fache erhöhen

kann. Letztlich wurde durch Tierversuche mit Mäusen herausgefunden, dass das

CD14 sowohl pro-, als auch anti-inflammatorische Reaktionen im Körper hervorruft

(Schutt 1999). Eine erhöhte Expression des CD14 konnte bei Monozyten der

Lamina propria in den entzündeten Darmabschnitten bei CED-Patienten gefunden

werden, währenddessen Probanden mit reizlosen Darmabschnitten eine signifikant

niedrigere CD14-Expression aufwiesen (Grimm et al. 1995; Rugtveit et al. 1995).

Bei den CED-Patienten konnte eine hohe Konzentration des sCD14-Antigens

gefunden werden. Allerdings haben die homozygoten TT-Träger einen signifikant

höheren Serum-Level der löslichen Form, als die CT oder CC-Träger (Griga et al.

2005).

Wie bedeutend der Einfluss genetischer Polymorphismen ist, konnte bereits in einer

ähnlichen Arbeit herausgestellt werden, wo ein entsprechender Polymorphismus mit

dem Erkrankungsrisiko verglichen wurde. Hier zeigte sich, dass das T-Allel zudem

mit einem erhöhten Risiko einen akuten Myokardinfarkt zu erleiden assoziiert ist

(Hubacek et al. 1999). Grundlage der Untersuchungen war die Fragestellung, ob

- 34 –

eine Beeinflussung zwischen dem Risiko eines Myokardinfarktes und der

Expression des CD14-Rezeptors besteht. Unterschiede bezüglich der bekannten

Risikofaktoren (LDL/HDL, Cholesterin, BMI, Diabetes-Häufigkeit, arterielle

Hypertonie oder Rauchen) wurden zuvor ausgeschlossen. In dieser Arbeit wurde

der gleiche Polymorphismus untersucht (die Bezeichnung C(-260) → T in dieser

Arbeit bezieht sich auf den Transkriptionsstart) und ein Zusammenhang zwischen

der Infektion mit gram-negativen Bakterien und der Entwicklung einer

Arteriosklerose vermutet (z.B. durch Chlamydia pneumoniae Orfila 1998; Leinonen

et al. 1990). In der dargestellten Kaskade kommt es durch eine Komplexbildung von

CD14 mit LPS zu einer Aktivierung von Monozyten. LPS gilt als bedeutendes

Endotoxin gram-negativer Bakterien. Es wird als pathogen assoziated molecular

pattern (PAMP) bezeichnet, dessen hauptsächlicher Ligand, das Lipid A, die

Interaktion mit dem Immunsystem mediiert. Über CD14 kommt es mit LBP zu einer

Komplexbildung, wodurch eine TLR assoziierte Immunantwort beginnt. Dies hat die

Produktion proinflammatorischer Zytokine, wie IL-1, IL-6 und INF-Gamma zur Folge

(Aderem, Ulevitch 2000; Antal-Szalmas 2000; Cario, Podolsky 2000; Cario et al.

2000). Die stimulierte Produktion von Interleukinen in Endothelzellen führt zu einer

gesteigerten Adhäsion von Monozyten, Leukozyten und Thrombozyten an die

Gefäßwand. Dadurch unterstützt letztlich auch eine erhöhte CD14-Konzentration

den Prozess der Arteriosklerose. Meisel et al. (1998) konnten zeigen, dass

Patienten in der akuten Myokardinfarkt-Phase erhöhte Konzentrationen von CD14

aufwiesen. Entsprechend wird das Vorhandensein CD14-positiver Zellen in der

intestinalen Mukosa gedeutet, wo normalerweise nur CD14-negative Monozyten

vorhanden sind. Dieser Befund mag eine Rolle bei der Entwicklung von Crohn und

Colitis spielen, da lokal pro-entzündliche Zytokine und andere aktivierte Mediatoren

freigesetzt werden. Kortison kann nachweislich die Konzentration von mCD14 und

sCD14 sowohl in vitro als auch in vivo senken (Fingerle-Rowson et al. 1998).

Es wird davon ausgegangen, dass sowohl Umweltfaktoren, zusammen mit einer

genetischen Disposition zu Crohn und Colitis führen. So sind intraintestinale

Bakterien notwendige Cofaktoren, um die entsprechende Entzündungsreaktion zu

initiieren und zu unterhalten. Bakterien enthalten toxische Substanzen, die potent

genug sind, als Stimulus für eine Immunantwort zu agieren, beispielsweise das

- 35 –

LPS. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Oberfläche von intestinalen

Epithelzellen eine defensive Barriere des Immunsystems bildet. Viele epitheliale

Zellreihen exprimieren transmembranöse Rezeptoren, die als TLR benannt werden.

Die Nachweisbarkeit von intestinalem TLR2 und TLR4 ist bei Crohn- und Colitis-

Patienten signifikant erhöht, im Gegensatz zu gesunden Probanden, wobei TLR2

eine untergeordnete Rolle spielt (Cario et al. 2000). Es konnte nachgewiesen

werden, dass LPS durch die TLR´s an epithelialen Zellen eine große Anzahl an

proinflammatorischen Zytokinen freisetzt. Die Toll-Proteine dienen als

Schlüsselmoleküle, um mikrobiologische Pathogene zu erkennen und zu

neutralisieren. TLR2 und TLR4 scheinen die hauptsächlichen Moleküle zu sein,

welche die transmembranöse Signalweitergabe bei LPS-Exposition bewirken. Dies

führt nachfolgend in den Monozyten zu einer Aktivierung und Freisetzung von

Zytokinen. Mutationen führen zu einer Dysregulation der TLR-Funktion (Cario,

Podolsky 2000; Cario et al. 2000). Schließlich führt bereits die erhöhte

Konzentration der TLR´s im intestinalen Epithel und der Lamina propria zu einer

verminderten Toleranz gegenüber luminalem LPS. Durch eine

Schleimhautverletzung kann es dann zur Einschleusung von Monozyten in die

Mukosa kommen, wobei diese mittels dem vermehrt produzierten Co-Rezeptor

CD14 eine überschießende Immunantwort bei CED-Patienten hervorrufen. (Cario,

Podolsky 2000). Limitierend bei der Arbeit ist allerdings die Unklarheit, ob das

Ungleichgewicht des Immunsystems bei CED-Patienten durch die TLR-

Dysregulation in intestinalen Epithelzellen eine Folge ist, oder aber die Ursache.

In der hier vorliegenden Studie konnten signifikant höhere kumulative Steroiddosen

bei homozygoten Trägern des T-Allels bei CU Patienten gefunden werden. Im

Gegensatz dazu fanden sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den

unterschiedlichen Genotypen beim MC, eventuell verursacht durch die kleine

Anzahl an Patienten. Unser Ergebnis deutet an, dass das T-Allel und der TT-

Genotyp eventuell einen Hinweis auf die Höhe der antiinflammatorischen Therapie

geben können. Der oben genannte Polymorphismus, ebenso wie weitere Gene, die

in die Regulation der zellvermittelten Immunität eingreifen, führen zu einer

qualitativen und quantitativen Änderung der zellulären Zytokinroduktion.

Die Identifikation weiterer Gene ist noch immer eine enorme Aufgabe, weil die Rolle

- 36 –

eines bestimmten prädisponierenden Allels nur in einem kleinen Anteil von

Patienten, einer speziellen Bevölkerungsgruppe oder aber die Kombination mit

anderen prädisponierenden Allelen erst relevant ist (Helio et al. 2003; Hisamatsu et

al. 2003).

Stellvertretend dafür sei die caspase activating recruitment domain 15 (CARD 15)

genannt. Es handelt sich dabei um ein Gen in der chromosomalen Region 16q12,

und gehört zu der Familie des Apoptose-Protease aktivierenden Faktors 1

bezogenen Protein. Es wird überwiegend in Monozyten exprimiert. Die Funktion

scheint in der intrazellulären Erkennung von LPS zu sein um daraufhin den

Transkriptiondfaktor NfκB zu aktivieren. Es wurden mehr als 60 verschiedene

Sequenz-Varianten des CARD15-Gens gefunden. Dabei gibt es drei

Hauptvarianten. Es ist gezeigt worden, dass CARD15 Gen-Varianten zu einem

unterschiedlichen Risiko für die Entwicklung einer CED beitragen. Für UC konnte

das nicht bestätigt werden. Es wurde bestätigt, dass Träger homozygote bzw.

compound heterozygote Träger der drei Varianten ein wesentlich höheres Risiko

haben einen MC zu entwickeln als heterozygote Träger. Es wird postuliert, dass

wohl neben der CARD15 Mutation noch andere genetische Polymorphismen, ggf.

sogar auf anderen Genen eine Prädisposition für MC bewirken. Es konnten keine

signifikanten Unterschiede bezüglich der Therapie der CED gefunden werden (5-

ASA, Steroide, Metronidazole), (Helio et al. 2003).

Erst die Identifikation dieser prädisponierenden Gene wird zu einer therapeutischen

Konsequenz für Patienten mit einer CED führen.

Deshalb reicht die Untersuchung eines Genpolymorphismus nicht aus, um die

Prädisposition und die Schwere des Verlaufes einer CED zu verstehen. Es gilt

herauszufinden, welche Polymorphismen generell einen Einfluss auf die CED

haben. Überdies muss allerdings auch untersucht werden, ob es Interaktionen der

verschiedenen Genloki untereinander gibt. Gegebenenfalls lassen sich

Synergismen finden, die miteinander den Schweregrad der CED verstärken, oder

aber Varianten, welche mit gleicher Intensität unabhängig voneinander die

Erkrankung unterhalten. Durch die letztere These könnte zudem eine Möglichkeit

darin bestehen, dass sich die Intensität und damit die Therapie der CED von Patient

- 37 –

zu Patient unterscheidet (Gu et al. 2008; Baumgart et al. 2007).

Verschiedene chronische, aber auch akute Krankheitsbilder stehen in enger

Assoziation mit dem CD14 T/C -159 Polymorphismus. Mittlerweile wurde CD14 als

Risikofaktor in den verschiedensten Fachbereichen erkannt. Sei es die Sepsis, die

Entwicklung einer Tuberkulose, oder eines Asthma bronchiale, der akute

Myokardinfarkt, die progrediente Arteriosklerose oder aber die CED (Rosas-Taraco

et al. 2007; Lachheb et al. 2008; Rechcinski et al. 2007). In dieser Arbeit wurde

nicht nur die mögliche Ausprägung des CD14 T/C –159 Polymorphismus

untersucht, sondern auch der Einfluss auf eine mögliche Therapie dargestellt. Erst

wenn die Beeinflussbarkeit der Krankheitsausprägung durch eine suffiziente

Therapie erreicht wird, können die jetzigen Grundlagenforschungen als erfolgreich

bezeichnet werden. Sicherlich können viele Unklarheiten erst durch die

Zusammenführung diverser Arbeiten und Evaluation neuer Daten behoben werden.

Diese Arbeit dient lediglich dazu, eine Relation zwischen dem Genpolymorphismus

und seiner Ausprägung wieder zu geben.

Aufgrund unterschiedlicher Bedingungen dieser Arbeit sind die Ergebnisse nicht nur

durch die voran beschriebenen Möglichkeiten eingeschränkt zu bewerten. Da es

sich um eine retrospektive Untersuchung handelt ist insbesondere das Ausfüllen

des Fragebogens vom Erinnerungsvermögen der Patienten abhängig. Eine

prospektive Studie wäre dahingegen die bessere Methode um möglichst genau die

einzelnen Punkte zu erheben. Allerdings lassen sich Tendenzen erkennen,

aufgrund derer eine Vertiefung der Ergebnisse durch weitere Studien sinnvoll ist.

Letztlich sollten durch weitere Untersuchungen sich zufällig ergebende

Signifikanzen herausgefiltert, oder aber berechtigte Ergebnisse untermauert

werden.

- 38 –

5 Zusammenfassung

Zusammenfassende Darstellung der wichtigsten Ergebnisse dieser Dissertation:

In der vorliegenden Arbeit wurde mittels retrospektiver Analytik versucht, eine

Korrelation zwischen dem SNP T/C an Position -159 des CD14-Gens und dem

Therapieverlauf bei Patienten mit einer CED zu finden.

- Es konnten keine geschlechts-spezifischen Zusammenhänge bezüglich der

Aufteilung der Allele dargestellt werden

- Es konnte eine signifikante positive familiäre Disposition ausschließlich beim

MC für den CC-Genotyp gefunden werden

- Die extraintestinalen Manifestationen scheinen sich unabhängig von dem

Polymorphismus auszubilden

- Ebenfalls fand sich kein Zusammenhang bezüglich des Befallsmusters bei

Patienten mit CED

- Die Dauer der CED scheint allerdings durch den entsprechenden Genotyp

beeinflussbar. Entsprechend fand sich für den CC-Genotyp bei der CU, dass

die Patienten eine wesentlich länger anhaltende Erkrankungsdauer

aufwiesen

- Bezüglich der kumulativen Steroiddosis konnte festgestellt werden, dass CU

Patienten mit dem TT-Genotyp eine signifikant höhere kumulative

Steroiddosis angaben als Patienten mit dem CT- oder CC-Genotyp.

- 39 –

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Danksagung

Herrn Prof. Dr. med. Thomas Griga danke ich herzlichst für die Anregungen und

Realisierung der Promotion. Besonders dankbar bin ich für die unermüdliche

Betreuung der Arbeit.

Herrn Dr. med. Wolfram Klein danke ich insbesondere für die wertvollen Tipps

während der Erstellung der Arbeit.

Lebenslauf

Name: Christian Wilkens

Geburtsdatum: 21.09.1975

Geburtsort: Diepholz

Familienstand: ledig

Eltern: Edelhard Wilkens (geb. 21.06.1943), Verkaufsleiter

Renate Wilkens, geb. Tuchen (geb. 04.03.1947),

Chefarztsekretärin

Geschwister: Sören Wilkens (geb. 14.05.1986), Student

Schulausbildung: 1982 – 1986 Grundschulbesuch in Diepholz

1986 – 1988 Besuch der Orientierungsstufe in Diepholz

1988 – 1996 Besuch des Diepholzer Gymnasiums

Grundwehrdienst: 1995 – 1996 Einsatz als Stationsleitung der Sanitätsstaffel

In Diepholz

Studium: 1996 – 2003 Studium der Humanmedizin in Bochum

Arbeit: seit 2003 Klinik der Inneren Medizin im

Knappschaftskrankenhaus Dortmund

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