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Aus der Klinik und Poliklinik für Hautkrankheiten
(Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. Michael Jünger) der Medizinischen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Einfluss der Mikroangiopathie auf die Expression der extrazellulären Matrixmoleküle
bei Patienten mit chronischer venöser Insuffizienz
Inaugural – Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Medizin (Dr. med.)
der
Medizinischen Fakultät der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
2008
vorgelegt von: Mansfeld, Enrico geb. am: 21.04.1981 in: Neubrandenburg
Dekan: Herr Prof. Dr. rer. nat. Heyo K. Kroemer
1. Gutachter: Herr Prof. Dr. med. M. Jünger
2. Gutachter: Frau Prof. Dr. med. K. Scharffetter-Kochanek
Ort, Raum: Greifswald, Seminarraum 4 des Institutes für Community Medicine,
Erdgeschoss, Fleischmannstraße 42-44
Tag der Disputation: Mittwoch, 10.09.2008
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen und Begriffe .......................................................................................................3
1. Einleitung ................................................................................................................................5
1.1 Volkskrankheit „Chronische Venöse Insuffizienz“............................................................5 1.2 Definition, Ätiologie und Pathophysiologie.......................................................................6 1.3 Mikrozirkulation/Mikroangiopathie ...................................................................................8 1.4 Klassifikation......................................................................................................................9 1.5 Die Bedeutung der extrazellulären Matrix bei CVI .........................................................11 1.6 Die extrazellulären Matrix-Moleküle im Einzelnen.........................................................13
1.6.1 Kollagene I & IV .......................................................................................................13 1.6.2 Tenascin.....................................................................................................................16 1.6.3 Fibronektin ................................................................................................................18
1.7 Zielsetzung/Fragestellung.................................................................................................21
2. Patienten, Material und Methoden .....................................................................................22
2.1 Patienten ...........................................................................................................................22 2.1.1 Patientenkollektiv ......................................................................................................22 2.1.2 Voruntersuchung und Ausschlusskriterien................................................................23 2.1.3 Untersuchungstag/Untersuchungsablauf ...................................................................23
2.2 Untersuchung der kutanen Mikrozirkulation....................................................................26 2.2.1 Laser-Doppler-Fluxmetrie (LDF)..............................................................................26 2.2.2 Transkutane Sauerstoffpartialdruckmessung (TcPO2) ..............................................27 2.2.3 Statistik ......................................................................................................................28
2.3 Immunhistochemie ...........................................................................................................29 2.3.1 Materialien.................................................................................................................29
2.3.1.1 Verwendete Antikörper ......................................................................................29 2.3.1.2 Chemikalien........................................................................................................29 2.3.1.3 Lösungen ............................................................................................................30 2.3.1.4 Geräte und sonstige Materialien.........................................................................31
2.3.2 Untersuchungsschritte Immunhistochemie ...............................................................31 2.3.2.1 Gewebebiopsien .................................................................................................31 2.3.2.2 Paraffineinbettung und Paraffinschnitte .............................................................32 2.3.2.3 Entparaffinierung................................................................................................32 2.3.2.4 HE-Färbung ........................................................................................................32 2.3.2.5 Immunhistochemie .............................................................................................32 2.3.2.6 Kontrollreaktionen..............................................................................................34 2.3.2.7 Auswertung und Fotographie der mikroskopischen Präparate...........................34
3. Ergebnisse .............................................................................................................................35
3.1 Mikrozirkulationsuntersuchungen....................................................................................35 3.1.1 Transkutaner Sauerstoffpartialdruck .........................................................................35 3.1.2 Laser-Doppler-Fluxmetrie.........................................................................................38
3.2 Auswertung der Biopsien .................................................................................................41 3.2.1 Histopathologische Beurteilung der Biopsien ...........................................................41 3.2.2 Immunhistochemische Beurteilung der Biopsien......................................................43
3.2.2.1 Kollagen I ...........................................................................................................43 3.2.2.2 Kollagen IV ........................................................................................................45 3.2.2.3 Tenascin..............................................................................................................47
1
3.2.2.4 Fibronektin .........................................................................................................49
4. Diskussion..............................................................................................................................52
4.1 Gliederung der Diskussion ...............................................................................................52 4.2 Kutane Mikroangiopathie.................................................................................................52 4.3 Extrazelluläre Matrixmoleküle.........................................................................................58 4.4 Auswirkungen der Mikroangiopathie auf die Expression der ECM-Moleküle................66
5. Zusammenfassung ................................................................................................................74
6. Literaturverzeichnis .............................................................................................................77
7. Anhang...................................................................................................................................92
8. Eidesstattliche Erklärung ....................................................................................................96
9. Danksagung...........................................................................................................................97
10. Lebenslauf ...........................................................................................................................98
2
Abkürzungen und Begriffe
Abkürzungen und Begriffe Abb. Abbildung
AU Arbitrary Unit
BM Basalmembran
bzw. beziehungsweise
CVI Chronische Venöse Insuffizienz
dest. destilliert
ECM Extrazelluläre Matrix
EGF Epidermal Growth Factor
evtl. eventuell
FGF Fibroblast Growth Factor
Fn Fibronektin
GF Growth Factor
ICAM Intracellular Adhesion Molecule
IGF Insuline-like Growth Factor
IL Interleukin
Kol I Kollagen I
Kol IV Kollagen IV
LDF Laser-Doppler-Flux
LFA Leukocyte Function-associated Antigen
mmHg Millimeter Quecksilbersäule
MMP Matrix Metalloproteinase
mRNA Messenger Ribonucleic Acid
n Anzahl
OS Oberschenkel
PCR Polymerase Chain Reaction
PDGF Platelet Derived Growth Factor
Psys Systolischer Druck
Str Stratum
TcPO2 Transkutaner Sauerstoffpartialdruck
TGF Transforming Growth Factor
TIMP Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase
Tn Tenascin
TNF Tumor Nekrose Factor
3
tw. teilweise
u.a. unter anderem
uPA Urokinase-type Plasminogen Activator
US Unterschenkel
usw. und so weiter
VCAM Vascular Cell Adhesion Molecule
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
VLA Very Late Antigen
x0,25 25. Perzentile
x0,75 75. Perzentile
z.B. zum Beispiel
4
1. Einleitung 1.1 Volkskrankheit „Chronische Venöse Insuffizienz“
Unter einer Volkskrankheit verstehen wir Krankheiten, die mit einer hohen Prävalenz in der
Bevölkerung auftreten. Befragt man junge Ärzte/innen oder sucht im Internet unter diesem
Stichwort, so ist man sich schnell einig: Arterieller Hypertonus, Koronare Herzkrankheit,
Diabetes mellitus, Adipositas oder Erkrankungen aus dem rheumatischen Formenkreis gehören
dazu. In mehreren epidemiologischen Studien weltweit (Fischer 1981; Brand et al. 1988;
Partsch 1995; Bradbury et al. 1999; Heit et al. 2001; Ruckley et al. 2002; Pannier-Fischer et al.
2003) konnte allerdings gezeigt werden, dass wir es auch bei der CVI mit einer
„Volkskrankheit“ zu tun haben. Die Tübinger Studie (Fischer 1981) zeigte 1979 als eine der
ersten Querschnittsstudien zu diesem Thema in Deutschland, das nur 14% der untersuchten
Bevölkerung keine Venenveränderungen aufwiesen. Erstaunliche 13% hatten eine
fortgeschrittene chronische venöse Insuffizienz mit Hautveränderungen und immerhin 2,7%
zeigten ein florides oder abgeheiltes Ulcus cruris.
Das jüngste Äquivalent solcher Prävalenzstudien in Deutschland ist die Bonner Venenstudie
aus dem Jahr 2003 (Rabe et al. 2003). Über 20 Jahre nach den ersten epidemiologischen
Erhebungen zur CVI bestätigte sie die hohe Prävalenz dieser Krankheit, wenngleich vor allem
in fortgeschrittenen Stadien ein Rückgang der Erkrankungshäufigkeit von 15% (Tübinger
Studie) auf 3,6% (Bonner Venenstudie) zu verzeichnen war. Dies erklärte sich vor allem aus
dem gestiegenen diagnostischen und therapeutischen Aufwand (Rabe et al. 2003). Lediglich
9% der Probanden hatten in der Bonner Venenstudie keinerlei Venenveränderungen.
Durch die Erkrankungen mit dem venösen Ulkus cruris entstanden im ehemaligen
Westdeutschland geschätzte jährliche Gesamtkosten in Höhe von 2-3 Milliarden DM. Alleine
1991 verursachte diese Krankheit ca. 2 Millionen Arbeitsunfähigkeitstage und 1,2 Millionen
Krankenhaustage (Rabe 1998).
Betrachtet man neben dem oft großen individuellen Leidensdruck den enormen
volkswirtschaftlichen Schaden, der durch die CVI verursacht wird, wird schnell klar, dass eine
weitere Forschung auf diesem Gebiet nötig ist, um den Krankheitsursachen noch besser auf den
Grund gehen zu können und die Behandlung zu optimieren.
5
1.2 Definition, Ätiologie und Pathophysiologie
Der Begriff der chronischen venösen Insuffizienz bezeichnet alle klinischen Befunde, die in
der Folge von chronischen Venenerkrankungen unterschiedlicher Ätiologie entstanden sind.
Dazu zählen neben dem Ulcus cruris venosum als Maximalform auch das Phlebödem, die
Corona phlebectatica paraplantaris, Induration, Hyperpigmentierung und Atrophie der Haut
(Mohlen 1957). Bei fortschreitendem Krankheitsprozess ist auch eine Beteiligung der
Gelenkkapsel der Knöchelregion möglich, die zusammen mit einer Schrumpfung der
Muskulatur und Fibrosierung von periachillärem Gleitgewebe zu einer kontrakten
Spitzfussstellung führen kann.
Abb. 1.1a: Atrophie blanche (Quelle: Hautklinik der Eberhard-Karls-Universität Tübingen)
Abb. 1.1b: Ulcus cruris venosum
Die Ursache für die venöse Insuffizienz liegt in einem Schaden der Venenklappen der
oberflächlichen Venen (Vena saphena magna, Vena saphena parva), des transfaszialen
Venensystems (Venae perforantes) oder der tiefen Leitvenen. Auch eine Kombination aus
diesen drei Formen wird nicht selten gesehen und führt zu einer chronischen
Rücktransportstörung des venösen Blutes aus dem Bein zum Herzen. Bei den meisten
Patienten beruht die Venenklappendysfunktion auf einer primären Varikose (suprafasziale
Form) oder dem postthrombotischen Syndrom (subfasziale Form). Eher selten findet man
angeborene Klappenagenesien, Klappendysgenesien oder dysplastische Veränderungen am
tiefen Venensystem als Ursache (Rabe et al. 2006).
6
Durch diese Veränderungen am Klappensystem kommt es in der Folge zu wiederholten
pathologischen Blutdruckspitzen in den Beinvenen, auch als „ambulatorisch venöse
Hypertonie“ bezeichnet (Partsch 1985). Das venöse Blut, welches mit Hilfe der Muskel- und
Gelenkpumpen im Bein beim Gehen Richtung Herz gepumpt werden soll, wird nun bei jedem
Schritt entgegen der physiologischen Strömungsrichtung nach distal gepresst. Dabei kommt es
neben einer venösen Hypervolämie und Hypertension auf Grund des erhöhten transmuralen
Druckes auch zur Bildung von Ödemen (Partsch 1985).
Doch die chronischen Druckerhöhungen im venösen System ziehen noch andere
Konsequenzen nach sich, die für die Entstehung des chronischen venösen Ulkus verantwortlich
gemacht werden. Aufgrund des erhöhten venösen Druckes kommt es zu einem verminderten
kapillären Perfusionsdruck. Dieser führt wiederum zu einer Akkumulation von Leukozyten in
den Kapillaren, die die Mikrozirkulation erheblich stören und zu einer lokalen Ischämie führen
(„Leukozytenfalle“) (Thomas et al. 1988). Die aktivierten Leukozyten setzen zudem
proteolytische Enzyme und toxische Sauerstoffradikale frei, welche das Kapillarendothel
schädigen und deren Permeabilität erhöhen (Smith 1992; Pascarella et al. 2005). Dadurch wird
es neben den Granulozyten auch Lymphozyten und anderen Makromolekülen verstärkt
möglich, in das umliegende Gewebe abzuwandern und eine chronische Entzündungsaktivität
zu triggern. Verschiedene Studien konnten in den vergangenen Jahren zeigen, dass dieser
Mechanismus einen großen Anteil an der Entstehung des Ulcus cruris venosum haben muss. So
konnte zum einen gezeigt werden, dass die Adhäsionsmoleküle ICAM-1, VCAM-1, LFA-1
und VLA-4, die maßgeblich an der Migration von Leukozyten in das umliegende Gewebe
beteiligt sind, im Verlauf der CVI vermehrt exprimiert werden (Weyl et al. 1996; Hahn et al.
1997; Peschen et al. 1999). Zum anderen wurde bei Versuchen in der Flusskammer
nachgewiesen, dass erhöhte Drücke zu einer vermehrten Adhäsion von Leukozyten führen
können (Spathelf 2004). Bei Patienten mit CVI fand man nach Herabhängen des Beines zudem
eine signifikant stärkere Abnahme der Leukozytenzahl im Beinvenensystem als bei gesunden
Probanden (Moyses et al. 1987).
In nicht heilenden venösen Ulzera findet man häufig noch eine weitere Abnormalität. Um die
Gefäße in den betroffenen Regionen sieht man in histologischen Schnitten fast regelhaft
sogenannte „Fibrinmanschetten“, die wahrscheinlich eine Schutzfunktion für die Gefäße vor
den erhöhten venösen Drücken darstellen (Herrick et al. 1992). Diese wurden über viele Jahre
als Hauptursache für die Entstehung des Ulkus vermutet. Sie führen zu einer Störung der
7
Diffusion von Sauerstoff in das umliegende Gewebe. Die Manschetten bestehen unter anderem
aus Fibronektin, Laminin, Tenascin, Kollagen I, III und IV und sind somit komplexe
extrazelluläre Strukturen, die nicht nur durch Diffusion der Bestandteile aus dem Blut
entstanden sein können, sondern anscheinend aktiv durch Zellen des umgebenen
Bindegewebes gebildet werden müssen (Herrick et al. 1992; Higley et al. 1995). Dafür spricht
auch, dass der Gehalt an Wachstumsfaktoren (TGF-ß1, PDGF, VEGF) in und um die
Manschetten erhöht ist (Peschen et al. 1998). In den vergangenen Jahren entstanden jedoch
Zweifel, ob die Fibrinmanschetten wirklich eine Diffusionsbarriere für Sauerstoff und andere
nutritive Moleküle darstellen (Cheatle et al. 1990).
1.3 Mikrozirkulation/Mikroangiopathie
Bei der Untersuchung von Patienten mittels Kapillarmikroskopie konnte gezeigt werden, dass
die von Partsch beschriebenen pathologischen Blutdruckspitzen im venösen Gefäßsystem auch
vor der Kapillarstrombahn nicht halt machen. Bei Messungen des Kapillardruckes in
Nagelfalzkapillaren der Großzehe bei Patienten mit CVI wurde gezeigt, dass sich der Druck,
der durch einmalige Kompression der Wade erzeugt wurde, bis in die Kapillare fortleitete. Ein
Effekt, der bei gesunden Probanden nicht zu beobachten war („ambulatorisch kapilläre
Hypertonie“) (Hahn et al. 1998).
Neben diesen Ergebnissen zeigten sich in der Kapillarmikroskopie auch erhebliche
Veränderungen in der Kapillarmorphologie der betroffenen Haut von CVI-Patienten. Mit
zunehmenden Schweregrad fand man deutlich dilatierte und elongierte Kapillaren bis hin zu
glomerulumförmigen Konfigurationen (siehe Abbildung 1.2). Auch nahm die Zahl der
Kapillaren pro Hautfläche mit zunehmenden Schweregrad der Erkrankung ab bis hin zur
nahezu vollständigen Abwesenheit in der Atrophie blanche (Franzeck et al. 1984; Hoffmann et
al. 1990; Franzeck et al. 1993; Jünger et al. 1999; Steins et al. 1999). Gleichzeitig beobachtete
man in der betroffenen Haut zum einen eine Abnahme des transkutan gemessenen
Sauerstoffpartialdruckes und zum anderen eine mittels Laser Doppler Fluxmetrie gemessene
Zunahme des totalen Blutflusses, vor allem im thermoregulativen Kompartiment der Haut
(„Luxus-Hyperperfusion“). Interessanterweise sind diese mikroangiopathischen
Veränderungen, wenn auch in geringerem Ausmaß, bereits in klinisch unauffälliger Haut am
Unterschenkel von CVI-Patienten gefunden worden, woraus sich schließen ließ, dass die
kutane Mikroangiopathie der Entstehung von trophischen Hautstörungen bei chronischer
venöser Stauung vorausgeht (Jünger et al. 2000). Der aus diesen mikroangiologischen
8
Veränderungen resultierenden Hypoxie in betroffenen Hautarealen wird ebenfalls eine
wichtige Schlüsselrolle für die Entwicklung der klinischen Hautveränderungen bis hin zum
Ulcus cruris zugesprochen.
Abb. 1.2: Kapillarmikroskopie aus dem Ulkusrandgebiet, Widmer
Stadium III; Glomerulusförmige Darstellung der Kapillaren. In
gesunder Haut sind lediglich die Scheitelpunkte der Kapillaren
punkt- bis kommaförmig zu sehen.
1.4 Klassifikation
Für die Einteilung der CVI gibt es die Klassifikation nach Widmer und die CEAP-
Klassifikation („Hawaii-Klassifikation“) (Rabe et al. 2006). Letztere teilt die Patienten nach
unterschiedlichen Parametern ein: C-Clinical Signs (Hautveränderungen), E-Etiological
Classification (congenital, primär, sekundär), A-Anatomic Distribution (oberflächliches oder
tiefes Venensystem) und P-Pathophysiological Dysfunction (Reflux, Obstruktion).
Die Nomenklatur nach Widmer teilt die CVI hingegen je nach klinischen Symptomen in 3
Klassen ein. Trotz das eine ätiologische Zuordnung der Krankheit mit ihr nicht möglich ist,
wird sie wegen Ihrer Einfachheit häufig bevorzugt.
Widmer CEAP Klinische Zeichen
I C1,C3 Corona phlebectatica paraplantaris, Phlebödem
II C4 Zusätzliche trophische Störungen mit Ausnahme des Ulcus
cruris (z.B. Dermatoliposklerose, Hyperpigmentation,
Pigmentveränderung, Atrophie blanche)
III a C5 abgeheiltes Ulcus cruris venosum
9
III b C6 florides Ulcus cruris venosum
10
1.5 Die Bedeutung der extrazellulären Matrix bei CVI
Die extrazelluläre Matrix (ECM) hat für die Forschung in den vergangenen Jahren mehr und
mehr an Bedeutung erlangt. Sie umgibt in allen Organen und Geweben die Zellen und ist aus
einer Vielzahl von Proteinen (v.a. Kollagen) und Glykoproteinen (z.B. Tenascin, Fibronektin,
Elastin) aufgebaut. Weitere wichtige Bestandteile sind Proteoglykane (z.B. Decorin, Aggrecan)
und Glykosaminoglykane (z.B. Hyaluronan, Heparansulfat, Chondroitinsulfat) (Kreis et al.
1993).
In Ihrer Aufgabe ist das gestiegene Interesse der Wissenschaft zu finden: Die ECM stellt nicht
nur einen Schutz der Zellen vor mechanischen Einflüssen dar, sondern interagiert zudem über
spezielle Rezeptoren (Integrine) mit den Zellen und gewährleistet so lebensnotwendige
Prozesse, wie z.B. Adhäsion, Differenzierung, Proliferation und Signaltransduktion von Zellen
(Gailit et al. 1994). Zudem konnte nachgewiesen werden, dass die Trennung zwischen
normalen Epithelzellen und der ECM zum programmierten Zelltod (Apoptose) führt (Frisch et
al. 1994). Zu Ihren weiteren Funktionen gehört auch die Fähigkeit, Wachstumsfaktoren und
Zytokine zu speichern und freizusetzen (Raghow 1994; Gelse et al. 2003). Für die Synthese der
ECM-Moleküle sind hauptsächlich Fibroblasten (u.a. Kollagen, Glykosaminoglykane) und zu
einem gewissen Teil auch Epithelzellen und Endothelzellen (u.a. Kollagen IV) zuständig. Die
Basalmembran, als eine spezielle Form der ECM, ist für die Adhärenz und reguläre Funktion
der Zellen essentiell. Außerdem bildet sie eine Art selektives molekulares passives Sieb
zwischen Gewebskompartimenten und verhindert so die Passage von Zellen (Yurchenco et al.
1990). Entzündungs- und Tumorzellen besitzen allerdings spezifische Mechanismen, die dieses
Sieb stellenweise zersetzen und somit durchwandern können (Barsky et al. 1984).
Um ihre Funktionen wahrnehmen zu können, herrscht in der ECM ständig eine gewisse
Dynamik zwischen Auf- und Abbau der beteiligten Moleküle. Für die Abbauprozesse sind die
sogenannten Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) zuständig. Es handelt sich um eine
wachsende Familie von nunmehr über 20 löslichen und Membran-gebundenen, Zink
abhängigen Endopeptidasen (Parks 1999). Sie sind in geringem Umfang in gesunder Haut
vorhanden und ihre Expression ist während verschiedener physiologischer und pathologischer
Prozesse, wie Entzündung, Tumor-Invasion oder Metastasierung, Gewebereparatur und
embryologischer Entwicklung hochreguliert (Mauch et al. 1994; Birkedal-Hansen 1995;
Shapiro 1998). Im aktivierten Zustand können MMPs nahezu alle extrazellulären
11
Matrixmoleküle spalten und zersetzen, wobei jede einzelne dieser Proteasen bestimmte
Substratspezifitäten, die auch mehrere Moleküle umfassen können, aufweist (Parks 1999). Sie
werden neben Keratinozyten, Fibroblasten und Makrophagen von vielen anderen Zelltypen
produziert, wobei vor allem diverse Wachstumsfaktoren und Zytokine ihre vermehrte
Expression bewirken können (z.B. TNF-alpha, IL-1, EGF) (Saarialho-Kere et al. 1994; Goetzl
et al. 1996; Esteve et al. 1998).
Für die Wundheilung ist die Proteolyse durch MMPs ein essentieller Faktor, um die Migration
von Zellen zu fördern, das Granulationsgewebe umzuformen und die Architektur der normalen
Haut wieder herzustellen (Parks 1999; Fray et al. 2003). Im Vergleich zu akuten Wunden fand
man in lipodermosklerotischer Haut von Patienten mit CVI stark erhöhte mRNA und Protein-
Level an MMP-1, MMP-2 und MMP-3 (Herouy et al. 2000; Fray et al. 2003). Gleichzeitig war
hier aber nur das mRNA und Protein-Level des MMP-Inhibitors Timp-1 und das Protein-Level
des Timp-3 (Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase) erhöht, wohingegen das mRNA und
Protein-Level des TIMP-2 im Gegensatz zu den akuten Kontrollwunden keine Steigung zeigte
(Herouy et al. 1999; Vaalamo et al. 1999). Direkt in chronischen Ulzera fand man sogar eine
totale epidermale Abwesenheit von TIMP-1 und -3 mRNA und verminderte Level an Timp-1, -
2 und -3 Protein im Vergleich zu akuten Wunden sowie erhöhte Level an MMP-1, -2, -3, -9
und -13 (Weckroth et al. 1996; Vaalamo et al. 1999; Agren et al. 2000; Herouy et al. 2000).
Aus dieser Imbalance zwischen den MMPs und ihrer Inhibitoren resultiert wahrscheinlich eine
verschlechterte Wundheilung durch unkontrollierte proteolytische Aktivität, welche
maßgeblich an der Entstehung des Ulkus und seiner Vorstufen beteiligt sein könnte. Ob die
pathologisch veränderten mikrozirkulatorischen Parameter einen Einfluss auf die
beschriebenen Veränderungen der MMPs und ECM-Moleküle haben, ist bisher nicht
Bestandteil von Untersuchungen gewesen.
12
1.6 Die extrazellulären Matrix-Moleküle im Einzelnen
1.6.1 Kollagene I & IV
Die Kollagene sind die am meisten vorkommenden Proteine der extrazellulären Matrix. Sie
sind nicht nur in allen Bindegeweben reichlich vorhanden, sondern auch im interstitiellen
Gewebe aller Organe. Ihre Hauptaufgabe wird in der Bildung eines extrazellulären Gerüstes
gesehen, welches für Stabilität und Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität von Geweben
und Organen sorgt. Insgesamt ein Viertel des Gesamtproteingewichtes bei Säugetieren wird
durch die Kollagene verursacht, die damit das quantitativ häufigste Protein in dieser Klasse
darstellen (Gelse et al. 2003).
Die Gruppe der Kollagene besteht aus 26 genetisch verschiedenen Subtypen. Bei allen findet
sich im Zentrum eine charakteristische Tripel Helix Struktur, bestehend aus drei
Polypeptidketten (alpha-Ketten). Diese können aus drei identischen Ketten bestehen
(Homotrimer), wie z.B. im Kollagen II, III und VII, oder aus 2 oder mehreren verschiedenen
Ketten (Heterotrimer), wie z.B. im Kollagen I und IV. Die Grundstruktur der alpha-Ketten ist
in allen Kollagenen gleich: Sie bestehen typenabhängig aus ca. 200 bis über 1000
Aminosäuren, wobei sich an jeder dritten Position dieser Kette die Aminosäure Glycin befindet
(X-Y-Glycin-X-Y-Glycin). Die beiden fehlenden Positionen (X und Y) sind häufig mit Prolin
(10%), Hydroxyprolin (10%) und variablen Mengen Hydroxylysin besetzt. Je nach Kollagen
Typ findet man eine unterschiedliche Anzahl von spezifischen Lysin- und Prolinresten, die
posttranslational hydroxyliert und teilweise glykosyliert werden. Daraus ergeben sich
unterschiedliche Eigenschaften, vor allem in der Stabilität der Tripel Helix Konformation
(Fleischmajer et al. 1990). In dieser Arbeit sollen die Kollagene I und IV näher betrachtet
werden.
Das Kollagen I wird in die Gruppe der klassischen „fibrillären Kollagene“ eingeordnet und ist
gleichzeitig das am besten untersuchte Kollagen. Es ist ein Heterotrimer, welches aus zwei
identischen alpha1(I)-Ketten und einer alpha2(I)-Kette besteht. Mit wenigen Ausnahmen (z.B.
hyaliner Knorpel, Glaskörper) macht Kollagen I den überwiegenden Anteil am
Gesamtkollagen der interstitiellen Bindegewebe aus, wie beispielsweise in dem der Haut, der
Sehnen oder der Cornea (Brodsky et al. 1997). Alleine im Knochen bestehen über 90% der
organischen Masse aus diesem Kollagen (von der Mark 1999). Durch seine besondere Struktur
verleiht dieses Molekül den Organen und Geweben Zugfestigkeit und gibt dem Knochen seine
13
besonderen Eigenschaften, wie hohe Belastungsfähigkeit, Druck- und Zugfestigkeit sowie
Torsionsstabilität. Je nach Gewebe oder Organ wird es von verschiedenen Zellen produziert,
die meistens mesenchymalen Ursprungs sind (u.a. Fibroblasten, Chondrozyten, Osteoblasten).
In der Haut erfolgt die Synthese hauptsächlich durch Fibroblasten (Kreis et al. 1993).
Typ IV Kollagen hingegen wird neben vielen anderen mesenchymalen Zellen zum Großteil
von endothelialen und epidermalen Zellen gebildet und stellt die wichtigste strukturelle
Komponente von Basalmembranen (lamina densa) dar. Eine seiner Hauptaufgaben wird in dem
Auffangen von Scherkräften, die z.B. in der Epidermis auftreten, gesehen (Yurchenco et al.
1990). Es ist wie Typ I Kollagen ein Heterotrimer, wobei die dominierende Form aus zwei
alpha1(IV)-Ketten und einer alpha2(IV)-Kette besteht (Hudson et al. 1993). Der wesentliche
Unterschied zwischen beiden Kollagenen liegt in dem Aufbau der Tripel Helix. Beim Kollagen
IV wird diese charakteristische Helix Struktur durch kurze, „nicht-kollagene“ Domänen
unterbrochen. Dadurch wird eine Anordnung zu fibrillären Strängen verhindert und es resultiert
eine flexible Tripel Helix, die eine netzartige Zusammenlagerung der Typ IV Kollagene in den
Basalmembranen ermöglicht. Des Weiteren kommt es durch die „nicht-kollagenen“ Domänen
zu einer besonderen intramolekulären Flexibilität und veränderten Eigenschaften in der
Proteolyse des Moleküls, da diese Regionen mögliche Angriffspunkte für Proteasen darstellen,
die in der nativen Tripel Helix Struktur nicht vorkommen (Gelse et al. 2003). Auf Grund dieser
besonderen Eigenschaften wird das Kollagen IV und seine Isoformen in eine eigene Gruppe,
die der „Basalmembran-Kollagene“, eingeordnet.
Neben den biomechanischen Aspekten gibt es aber noch andere Eigenschaften, die den
Kollagenen bei der Organentwicklung, Wundheilung und Gewebereparatur eine wichtige
Bedeutung zukommen lassen. Sie stehen über spezifische Rezeptoren, wie Integrinen,
Glykoprotein VI oder Proteoglykan Rezeptoren mit diversen Zellen und Molekülen in
Verbindung und beinflussen so auf verschiedenen Wegen die Adhäsion, das Wachstum und die
Differenzierung von Zellen sowie deren Überleben. Kollagen IV beispielsweise ist in der Lage,
unter anderem mittels Fibronektin als Mediatorsubstanz, eine feste Verankerung von
Keratinozyten an die Basalmembran zu fördern und gewährleistet darüber hinaus die Migration
und die Zellausbreitung von Keratinozyten am Wundrand (Kim et al. 1994). Die „nicht-
kollagenen“ Strukturen dieses Moleküls beeinflussen außerdem die Angiogenese und
Tumorgenese (Ortega et al. 2002). Besonders beim Kollagen I zeigt sich eine weitere
Eigenschaft der Kollagene. Sie binden eine große Anzahl an Wachstumsfaktoren und
14
Zytokinen, die sie zu bestimmten Zeitpunkten wieder freisetzen können. Dieser Effekt zeigte
sich besonders deutlich beim Knochen. Hier werden durch das Kollagen I reichlich
Wachstumshormone gespeichert, die dann, während der Zersetzung des kollagenen
Netzwerkes durch Osteoklasten, langsam wieder freigesetzt werden und diesem Abbauprozess
durch Stimulierung der Osteoblasten entgegenwirken (Bautista et al. 1990).
Bei vielen Krankheiten und Tumoren konnte in der Vergangenheit ein stark veränderter Gehalt
an Kollagenen nachgewiesen werden. Beim Ehlers-Danlos-Syndrom Typ IV sind zum Beispiel
die Gewebslevel an Kollagen I stark reduziert bzw. dieses ECM-Molekül fehlt gänzlich
(Kleinman et al. 1981). Aber auch bei Patienten mit varikösen Venen oder CVI konnten
signifikante Veränderungen im Kollagengehalt der ECM gefunden werden. So fand sich in der
ECM variköser Venen v.a. in der Intima und Media neben einer Erhöhung von Tenascin,
Laminin und Fibronektin auch ein erhöhter Gehalt an Kollagen I und IV (Kirsch et al. 1999;
Sansilvestri-Morel et al. 2003). In der Matrix variköser Venen konnte eine Überproduktion von
Kollagen I nachgewiesen werden, welche wahrscheinlich die Ursache für die enorme Rigidität
dieser Venen ist (verlorengegangene Ausdehnungsfähigkeit bei gleichzeitiger
Herunterregulierung von Kollagen III) und zusammen mit den Fibrinmanschetten einen
Schutzmechanismus gegen die gestiegenen Drücke darzustellen scheint (Sansilvestri-Morel et
al. 2003). In und um die Kapillaren von CVI Patienten wurden ähnliche Entdeckungen
gemacht. Hier konnten mehrere Forschungsgruppen perivaskulär einen erhöhten Anteil an
Kollagen IV beobachten, woraus sich insgesamt schließen ließ, dass die Basalmembran an der
Ausbildung der beschriebenen „perivaskulären Fibrinmanschetten“ beteiligt ist (Neumann et al.
1991; Tronnier et al. 1994). In lipodermosklerotischer Haut von CVI Patienten, auf der sich bei
Fortschreiten der Krankheit das Ulcus cruris venosum entwickelt, konnte gezeigt werden, dass
sich die Eigenschaften des Kollagens I bedeutend verändert haben. Es ist hier nicht nur
vermehrt vorhanden, sondern die kollagenen Fasern zeigen außerdem ein verändertes
Verhältnis von Hydroxylysyl/Lysylpyridinolinen und sind dichter gepackt als in gesunder Haut
(Herouy et al. 2000). Das fibröse Gewebe breitet sich in der betroffenen Haut zudem bis tief in
das subkutane Fettgewebe aus. Durch das verbreiterte fibröse, mit zahlreichen Kollagenfasern
durchsetzte Gerüst, kommt es dann zu der spürbaren Verhärtung dieser Haut (Greenberg et al.
1996).
15
1.6.2 Tenascin
Die Tenascin-Familie (Tn-C, Tn-R, Tn-W, Tn-X und Tn-Y) ist eine Gruppe von
Glykoproteinen, die sich untereinander sehr ähnlich sind und alle dieselbe aufeinanderfolgende
Anordnung von Domänen wie das Tn-C haben. Dieses wurde unabhängig voneinander in
mehreren Laboratorien gleichzeitig entdeckt, weswegen es unter anderem auch unter den
Namen Myotendinous Antigen, Hexabrachion oder Neuronectin bekannt ist (Jones et al. 2000).
Das Tn-C besteht aus insgesamt 6 identischen Armen mit einem Knoten am Ende, wobei
jeweils 3 dieser Arme zu einem Trimer verknüpft sind. Durch die Verknüpfung mittels
Disulfid-Bindungen entsteht aus zwei solcher Trimere das Hexamer Tn-C, welches aufgrund
der identischen Arme auch als Homohexamer bezeichnet wird (Erickson et al. 1989; Taylor et
al. 1989). Tenascin wurde erstmalig in sich entwickelnden Embryos entdeckt, wo es
hauptsächlich an den Schnittstellen zwischen Epithel und Mesenchym gefunden wurde
(Aufderheide et al. 1987; Inaguma et al. 1988; Erickson et al. 1989). Während der embryonalen
Entwicklung des ZNS, des Skelets und der Gefäße fand man in der ECM dieser Gewebe ein
sehr dynamisches Expressionsmuster. Tenascin scheint daher im Embryo eine wichtige
Funktion in der Gewebsmorphogenese zu haben (Lightner 1994).
Bei Erwachsenen kommt Tenascin nur noch in sehr geringem Umfang in der ECM vor. In der
Haut findet es sich im Stratum papillare als ein relativ dünner, teilweise diskontinuierlicher
Streifen direkt unterhalb der Basalmembran zwischen Epidermis und Dermis. Auch in der
Basalmembran von Hautgefäßen und um Hautanhangsgebilde ist Tenascin in geringen Mengen
zu finden (Mackie 1994). Ein vermehrtes Vorkommen beobachtet man während der
Wundheilung, Neovaskularisation, Hyperproliferation der Epidermis und bei Prozessen mit
vermehrtem Umbau im Gewebe (Chiquet-Ehrismann et al. 1986; Latijnhouwers et al. 1996).
Aber auch in der Tumor und Metastasen umgebenden Matrix wurde eine Hochregulierung von
Tenascin gefunden (Erickson et al. 1988). Interessanterweise konnte in der Vergangenheit ein
Zusammenhang zwischen biomechanischen Kräften (z.B. hämodynamischer Stress) und der
Expression von Tn-C gefunden werden. Die ECM und ihre Zell-Adhäsionsrezeptoren scheinen
also mechanische Signale zu detektieren und über eine intrazelluläre Signalkaskade für eine
Modulation der Zell-Adhäsions Komponenten zu sorgen, so dass sich das gesamte Zell Matrix
Gerüst an die neuen Bedingungen (z.B. erhöhter mechanischer Druck) anpassen kann (Jones et
al. 2000). Des Weiteren vermutet man auf Grund seiner erhöhten Expression, dass Tenascin in
heilenden Wunden eine regenerative und morphoregulatorische Rolle besitzt.
16
In verschiedenen Studien wurde beobachtet, dass dieses Molekül adhäsive und zusätzlich auch
anti-adhäsive Eigenschaften besitzt (Grumet et al. 1985; Lotz et al. 1989; Lightner 1994). Da
die Adhäsion nicht von allen Gruppen nachgewiesen werden konnte, vermutet man, dass die
Bindung von Zellen an Tenascin von der jeweiligen Oberfläche und Zeitdauer des Kontakts
abhängen. Hierdurch sind mögliche Konformationsänderungen und Freilegung verborgener
Adhäsionsbezirke im Tenascin Molekül denkbar, die diese Beobachtungen erklären könnten
(Lightner 1994). Eine weitere wichtige Funktion von Tenascin in der Wundheilung wird in der
Unterstützung der Zellmigration vermutet. Tenascin wird in heilenden Wunden schon früh
verstärkt gefunden und ist nach erfolgter Narbenbildung nicht mehr, bzw. nur im
physiologischen Maße, anzutreffen (Mackie et al. 1988). Es verstärkt die Migration von
Keratinozyten über permissive Substrate (u.a. Kollagen IV und Fibronektin), was
wahrscheinlich auf seine anti-adhäsiven Eigenschaften zurückzuführen ist (Kaplony et al.
1991). So ist es den Zellen möglich, sich von Ihrer Matrix zu lösen und vorwärts über das
Wundbett zu wandern.
Da man eine Erhöhung von Tenascin bisher vor allem in Umgebungen gestiegener
Proliferation gefunden hat, nahm man an, dass es selber als Wachstumsfaktor agieren könnte
(Engel 1989). Demgegenüber stehen allerdings Studien, die einen anti-proliferativen Effekt
von Tn-C auf schnell wachsende Kulturen von Fibroblasten und Keratinozyten nachgewiesen
haben (Lightner 1994). Ob Tenascin als Wachstumsfaktor oder Mitogen agiert bzw. evtl. beide
Funtionen innehält konnte bis heute nicht abschließend geklärt werden. Bei vielen Prozessen,
die in der ECM zu einer Hochregulierung von Tenascin geführt haben, wurde zeitgleich auch
eine erhöhte Expression und Aktivität von Matrix Metalloproteinasen gefunden. Daher wird
vermutet, dass Tn-C die MMP Expression und Aktivität induziert und so über die
Veränderungen in der ECM dieser Gewebe Einfluß auf die Zell-Motilität, das Wachstum,
Überleben und die Differenzierung von Zellen hat (Streuli 1999; Cowan et al. 2000).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Molekül eine wichtige Rolle während der
Wundheilung einnimmt und für die Zellmigration, das Zellwachstum und die Zelladhäsion
essenziell ist (Dandachi et al. 2001).
17
1.6.3 Fibronektin
Von dem ubiquitär vorkommenden Glykoprotein Fibronektin (Fn), auch unter dem Namen
LETS bekannt, sind bis heute über 20 Varianten gefunden worden. Diese sind, im Gegensatz
zu den Kollagenen, das Produkt aus einem einzigen Gen und entstehen durch alternatives
Spleissen der pre-mRNA (Ffrench-Constant 1995). Das Molekül hat einen relativ einfachen
Aufbau. Es besteht aus 2 ca. 250 kDa schweren, nahezu identischen Untereinheiten, die durch
kovalente Disulfidbindungen zu einem Dimer verknüpft sind. Jede dieser Untereinheiten ist
wiederum aus 3 typischen Aminosäureketten aufgebaut (Modul I, II und III), die sich in
unterschiedlicher Anzahl wiederholen (sogenannte Fn-Repeats) (Patel et al. 1987). Fibronektin
wird im Wesentlichen an 2 Orten und in 2 Arten gebildet. Zum einen als lösliches „Plasma-
Fibronektin“ (repräsentiert ca. 1% des Serum Proteins), welches durch Hepatozyten in der
Leber synthetisiert wird und zum anderen als unlösliches „Zelluläres-Fibronektin“, welches vor
allem durch Fibroblasten, aber auch Chondrozyten, Endothelzellen und Makrophagen gebildet
wird. In der ECM wird es daher vor allem in der Umgebung dieser Zellen vermehrt gefunden,
entweder in regelmäßiger Verbindung mit Kollagen, oder in Form von Fasern (Fn-
Fibrillogenese) ohne jeden Kollagen-Kontakt (Pankov et al. 2002).
Fibronektin vermittelt eine Vielzahl von Interaktionen zwischen den Zellen und der ECM, wie
z.B. Zelladhäsion, -migration und -ausbreitung. So konnte zum Beispiel in in vitro Studien die
Bindung von Fibroblasten, Endothelzellen und epidermalen Zellen an Proteine der ECM (z.B.
Heparin, Kollagen und Fibrin) durch Fibronektin vermittelt werden (Grinnell et al. 1979; Clark
et al. 1986; Horsburgh et al. 1987). In den Untereinheiten dieses Moleküls wurden in den
vergangenen Jahren mehrere spezifische Bindungsstellen gefunden, die für seine Funktionen
essenziell sind. Ein besonderes Augenmerk gilt hierbei der sogenannten RDG-Sequenz
(Arginin-Glycin-Asparaginsäure), die sich in den Untereinheiten des Moleküls an definierter
Position befindet (im Modul III10) (Pankov et al. 2002). Sie sorgt für eine Bindung am Integrin
(v.a. α5β1) und gibt dem Fibronektin so die Möglichkeit, auf Zell-Adhäsion, Wachstum und
Differenzierung Einfluß zu nehmen (Kim et al. 1992). Natürlich existieren noch andere
zellbindende Bereiche im Fn-Molekül, wobei die eben genannte RDG-Sequenz aber die am
besten untersuchte und wahrscheinlich bedeutendste darstellt (Pankov et al. 2002). Auch
wurden diverse Rezeptoren auf Zellen gefunden (z.B. Integrine, Zytoadhäsine), die Fibronektin
binden können, wobei das Integrin α5β1 eine herausragende Stellung einnimmt (Watt 2002).
Kim konnte zeigen, dass die Migration von Keratinozyten auf einer Fibronektin Matrix nur auf
dem Modul des Fibronektins, welches die RDG-Sequenz enthält, erfolgen kann und darüber
18
hinaus das Integrin α5β1 für die Wanderung dieser Zellen unabdingbar ist (Kim et al. 1992).
Auch die Migration von Fibroblasten und Endothelzellen während des Einwachsens von
Kapillaren wird durch einen erhöhten Fn-Gehalt um diese Zellen begleitet (Clark et al. 1982).
Daraus lässt sich schließen, das dieses Molekül möglicherweise eine provisorische Matrix für
die Anheftung von migrierenden Zellen darstellt, was für die Wundheilung von großer
Bedeutung ist (Wysocki et al. 1990). Bestätigt werden konnte diese Vermutung durch
Untersuchungen in der Verteilung von Fn-Rezeptoren während der Wundheilung (Toda et al.
1987; Kim et al. 1992). Weitere Bindungsstellen besitzt das Fn-Molekül für Heparin, Fibrin,
Kollagen/Gelatin, Chondroitinsulfat und Fibronektin selbst (Pankov et al. 2002).
Eine wichtige Rolle wird dem Fibronektin bei Prozessen der Wundheilung zugeschrieben.
Besonders in Bereichen erhöhter Gewebsproliferation, unterhalb der migrierenden Epidermis
und im Bereich einwandernder Fibroblasten und Endothelzellen ist es vermehrt zu finden
(Clark 1990). Diese Beobachtungen bestätigen erneut, dass es eine provisorische Matrix für die
Anheftung von migrierenden Zellen bereitzustellen scheint. Einen hohen Gehalt an Fibronektin
weisen auch die Plasma-Gerinnsel in Wunden auf. Hier vernetzt sich, unterstützt von Faktor
XIII, das Fibronektin mit dem Fibrin und kann so über seine zellulären Bindungsstellen die
Zell-Adhäsion an die ECM oder ein Einwandern von Zellen (z.B. Makrophagen) in das
Gerinnsel fördern (Pankov et al. 2002). Durch diesen Mechanismus wird wahrscheinlich
zudem die Clearance von Fibrin nach einem Trauma oder einer Entzündung gefördert. Auch
die Tatsache, das Fibronektin weit besser an denaturiertem Kollagen (=Gelatin) als an nativem
Kollagen bindet, führte zu der Vermutung, das dieses Molekül mit dafür verantwortlich ist,
denaturiertes kollagenes Material aus der ECM zu enfernen (Leikina et al. 2002). Aus
verschiedenen Studien weiß man, das Fn als direktes, vor allem aber als indirektes Opsonin (im
Sinne einer Förderung opsoniner Systeme), fungieren kann (Clark 1990). Einerseits bindet es
an ECM Bestandteile wie Fibrin, Gelatin, Aktin oder sogar Bakterien wie Staphylococcus
aureus und opsoniert diese, andernseits zum Beispiel an Gewebemakrophagen, die diese
Bestandteile dadurch leichter phagozytieren können (Pankov et al. 2002). Des Weiteren
erhöhte die Anwesenheit von Fn die Phagozytose von C3b und IgG umhüllten Partikeln durch
Monozyten, was für die indirekte Steigerung opsoniner Systeme spricht (Brown 1986).
Monozyten scheinen sich diese Eigenschaft des Fibronektins zu nutze zu machen, indem sie
beim Einwandern in entzündetes Gewebe von diesem Molekül umhüllt werden (Clark et al.
1984). Das Debridement der Wunde könnte durch Fibronektin auf diesem Wege beeinflusst
19
und beschleunigt werden, wofür auch der klinische Erfolg der Behandlung einer CVI Patientin
mit Fibronektin-haltiger Lösung spricht (Wysocki et al. 1988).
Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass es innerhalb von Wunden zu einem Fn-
Gradienten kommt, welcher sich aus der Extravasation und Koagulation von Blut, der
Sekretion aus Thrombozyten (flüssige Form) und der in situ Produktion von ortsansässigen
Zellen herleitet (feste Form) (Clark et al. 1981; Clark et al. 1983). Die gleichzeitige
Feststellung, dass das Fn-Fragment mit der zellbindenden Domäne Monozyten und
Fibroblasten anziehen und deren Bewegung fördern kann, führte zu der Vermutung, dass es
auch als eine Art chemotaktischer Faktor fungiert (Clark 1990). Die Fn-Fragmente stimulieren
neben der Zellbewegung darüber hinaus auch das Einwachsen von Fibroblasten und
Endothelzellen in die extrazelluläre Matrix eines Gewebes (Kim et al. 1992).
Durch immunhistochemische Untersuchungen und Studien an in vitro Fibroblasten konnte
gezeigt werden, dass die Fn-Matrix ein Gerüst für die Einbettung und Verknüpfung von
Kollagen bereitstellt (Keski-Oja et al. 1981; McDonald et al. 1982). Es ist durch seine direkte
Zell-Zell-Bindungsfähigkeit und der Vermittlung der Bindung von Kollagen an Zellen unter
anderem an der Wundkontraktion beteiligt, die bei akuten Wunden während der normalen
Wundheilung für eine Verkleinerung der Wundfläche verantwortlich ist. Fehlt die Fn-Matrix,
kommt es zu keiner Wundkontraktion und einer Störung im Aufbau der Kollagen-Matrix
(Clark 1990).
Direkt im Ulcus cruris sind bei Untersuchungen reduzierte Level an Fn gefunden worden, was
wahrscheinlich auf die erhöhte Proteasen Aktivitäten (MMPs) zurückzuführen ist, die man in
Wundsekreten nachgewiesen hat (Yager et al. 1996; Herouy et al. 2000). Dadurch könnte es zu
hemmenden Effekten auf die Wundheilung und sogar zu einer Art circulus vitiosus kommen,
da Fn-Fragmente angeschuldigt werden, die Sekretion von weiteren Proteasen zu stimulieren
und selbst einen zellzerstörenden Effekt zu haben (Clark 1990; Wysocki et al. 1999).
Besonders hohe Konzentrationen an Fibronektin scheinen zudem die Adhäsion von Zellen zu
verhindern, womit das Molekül ähnlich wie das Tenascin adhäsive, als auch unter bestimmten
Voraussetzungen, anti-adhäsive Eigenschaften besitzt (Yamada et al. 1984). Mit dem Abheilen
einer Wunde und der Entstehung einer neuen Basalmembran unter dem Neoepithel kommt es
zu einer Reduktion des Fibronektin Gehaltes, was die Bedeutung dieses Moleküls während der
Wundheilung untermauert (Clark et al. 1982; Loots et al. 1998).
20
1.7 Zielsetzung/Fragestellung
Die ECM besitzt neben ihren mechanischen Funktionen einen großen Einfluß auf die Zellen,
die sie umgibt. So steuert sie unter anderem Prozesse wie Migration, Chemotaxis,
Zellmorphologie, Proliferation, Differenzierung und ist sogar als Überlebensfaktor bekannt, da
sie die Apoptose supprimieren kann (Frisch et al. 1994; Raghow 1994). In mehreren Studien
wurden die Veränderungen der ECM-Moleküle zwischen Patienten verschiedener CVI-
Schweregrade und in verschiedenen Bereichen pathologisch veränderter Haut untersucht. Des
Weiteren weiß man heute, dass es in klinisch veränderter Haut, aber auch in noch nicht
betroffenen Hautarealen bei Patienten mit CVI zu pathologischen mikroangiologischen
Veränderungen kommt, die einen Einfluß auf die Genese der Hautveränderungen und des
Ulcus cruris venosum haben könnten, z. B. durch die verschlechterte Nutrition des Gewebes.
Wenig ist bisher über die Veränderungen der Expression und Verteilung von ECM-Molekülen
innerhalb eines Patienten mit CVI in ihren verschiedenen Stadien bekannt. In der
vorliegenden Studie sollten diese Parameter daher erfasst werden, indem bei jedem Patienten
mit CVI in den Widmer Stadien II und III Biopsien von Oberschenkel, Unterschenkel und
medialem Malleolus (Widmer Stadium II) bzw. Ulkusrand (Widmer Stadium III) auf die
Moleküle Kollagen I und IV, Tenascin und Fibronektin hin untersucht wurden. Zusätzlich
haben wir an diesen Biopsiestellen die Mikrozirkulation erfasst, um auch hier die
Veränderungen zwischen gesunder und kranker Haut innerhalb eines Patienten aufzeigen zu
können. Auf der Grundlage dieser Daten sollte anschließend untersucht werden, ob die
Mikrozirkulation im Zusammenhang mit Veränderungen der ECM stehen könnte.
Zusammenfassend ergeben sich folgende Fragestellungen:
- Zu welchen Veränderungen kommt es bei den extrazellulären Matrixmolekülen (Kol I
und IV, Tn, Fn) und bei der Mikrozirkulation (LDF, TcPO2) innerhalb eines Patienten
an 3 verschiedenen Untersuchungsarealen eines Beines?
- Wie verändert sich die Expression der ECM-Moleküle und die Mikrozirkulation an den
definierten Untersuchungspositionen im Vergleich zwischen den Widmer Stadien II
und III?
- Gibt es einen Zusammenhang zwischen dem Ausmaß der Mikroangiopathie und dem
Umbau der extrazellulären Matrix? Ist es möglich, dass die Mikroangiopathie direkt an
den Umbauprozessen in der ECM beteiligt ist?
21
2. Patienten, Material und Methoden 2.1 Patienten
2.1.1 Patientenkollektiv
Für die Untersuchungen wurden über die interdisziplinäre Wundsprechstunde der Klinik und
Poliklinik für Hautkrankheiten der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald 23 Patienten (15
Frauen, 8 Männer) mit chronischer venöser Insuffizienz im Stadium II (n=9) und Stadium III
(n=14) nach Widmer ausgewählt. Die Studie wurde durch die Ethikkomission der Ernst-
Moritz-Arndt-Universität genehmigt und die Untersuchungen erfolgten auf der Grundlage der
Helsinki-Deklaration. Alle Studienteilnehmer wurden ausführlich über die anstehenden
Untersuchungen und das Studiendesign aufgeklärt und willigten freiwillig schriftlich ein.
Die 14 Patienten mit Ulcus cruris venosum (10 Frauen, 4 Männer) hatten ein Durchschnittsalter
von 71,2 Jahren (von 53 bis 81 Jahre). Die durchschnittliche Ulkusfläche betrug 28,3 cm2 (2,1–
103,1 cm2). Das Durchschnittsgewicht dieser Patientengruppe lag bei 89,7 Kg (72-116 Kg), die
durchschnittliche Körpergröße bei 167 cm (154-186 cm). Das Ulkus bestand bei 6 Patienten
zum Zeitpunkt der Untersuchung seit über 5 Jahren, bei 3 Patienten seit 1-5 Jahren und bei 5
Patienten seit 6-12 Monaten. Ein Rezidivulkus lag bei 6 Patienten vor. 12 der 14 Patienten mit
Ulcus cruris hatten eine Adipositas, 7 einen arteriellen Hypertonus und 6 einen Diabetes
mellitus Typ II ohne Komplikationen. Mit Hilfe der dopplersonographischen Untersuchung
fanden wir bei allen Patienten eine Insuffizienz des oberflächlichen Venensystems und bei 9
Patienten eine Insuffizienz der tiefen Leitvenen. Bei 3 Patienten konnte in der Vorgeschichte
eine tiefe Venenthrombose in dem betroffenen Bein eruiert werden. Lediglich bei einem
Patienten dieser Gruppe war in der Vergangenheit eine operative Maßnahme (Sklerosierung)
am Venensystem durchgeführt worden.
Das Durchschnittsalter der 9 Patienten mit Widmer Stadium II (5 Frauen, 4 Männer) betrug
66,0 Jahre (von 53 bis 87 Jahre). Das Durchschnittsgewicht in dieser Gruppe war 92,9 Kg (65-
140 Kg) bei einer Durchschnittsgröße von 172,4 cm (162-189 cm). Eine Adipositas zeigten 5
der 9 Patienten und 4 litten unter einem arteriellem Hypertonus. Bei einem Patienten war ein
Diabetes mellitus Typ II bekannt. Auch in dieser Gruppe fand sich dopplersonographisch bei
allen Patienten eine Insuffizienz des oberflächlichen Venensystems. Die tiefen Leitvenen
waren bei 3 Patienten insuffizient. Eine Thrombose in dem zu untersuchenden Bein war bei
22
einem der Patienten in der Vorgeschichte zu eruieren. Operative Maßnahmen am Venensystem
(Sklerosierung) wurden wiederum lediglich bei einem der Patienten in der Vergangenheit
durchgeführt.
2.1.2 Voruntersuchung und Ausschlusskriterien
Im Rahmen der Auswahl der Patienten für diese Studie wurden neben einer ausführlichen
Anamnese eine bidirektionale Ultraschalluntersuchung der Beinvenen und eine
Photoplethysmographie zur Sicherung der Diagnose durchgeführt. Der Ausschluss einer
arteriellen Genese der Beschwerden erfolgte durch beiderseitige dopplersonographische
Messung (Typ ATL HDI 3500, Philips, Hamburg, Deutschland) des systolischen Blutdrucks
der Arteriae brachiales, dorsales pedum und tibiales posteriores. Der hieraus ermittelte cruro-
brachiale Index (Psys A. tibialis post / Psys A. brachialis) galt bei einer Größe von unter 0,9 als
Ausschlusskriterium für diese Studie.
Ausschlusskriterien waren:
- Periphere arterielle Verschlusskrankheit in der Anamnese oder cruro-brachialer
Index < 0,9
- Diabetes mellitus Typ I
- Dekompensierte Herzinsuffizienz (Stadium III und IV nach NYHA)
- Entzündliche Hauterkrankungen, die nicht auf die CVI zurückzuführen waren
- Ulzera nicht venöser oder unbekannter Genese
2.1.3 Untersuchungstag/Untersuchungsablauf
Am eigentlichen Untersuchungstag begannen wir mit der Untersuchung der kutanen
Mikrozirkulation. Dazu wurde der Patient auf einer Untersuchungsliege in Indifferenzebene
(horizontal) gelagert. Es folgte anschließend eine 10 minütige Ruhephase, um eine
ausreichende Akklimatisierung zu gewährleisten (Raumtemperatur konstant 22 + 1°C). Nach
Vermessung der Ulkusgröße (bei Stadium III nach Widmer) und des Knöchel-
/Wadenumfanges erfolgte die Anlage des Fixierungsringes für die TcPO2 Messung (Typ tina,
Radiometer, Copenhagen, Dänemark) und der Sondenhalterung für die LDFmetrie (PH 07-4,
Perimed AB, Jarfälla, Schweden). Die Messung dieser Parameter erfolgte an 3 verschiedenen
Lokalisationen (siehe Abbildung 2.1):
23
Position 1: Ulkusrand (Widmer III) oder über dem medialen Malleolus (Widmer II).
Position 2: Unterschenkel beim makroskopischen Übergang von kranker zu gesunder
Haut.
Position 3: Oberschenkel im Bereich makroskopisch gesunder Haut.
Messposition 1
Messposition 2Messposition 3
© K. Haarnagel
Abb. 2.1: Mess- und Biopsiepositionen bei Patienten mit Ulcus cruris venosum. Im Widmer
Stadium II befand sich die Messposition 1 über dem medialen Malleolus.
Um die Messpositionen exakt festhalten und die Abstände zwischen diesen ermitteln zu
können, erfolgte anschließend die Auflage eines Maßbandes auf das Bein, wobei der 0 Punkt
bei allen Patienten zwischen Digitus I und II lag. Danach wurden im rechten Winkel zum
Maßband mittels flexiblen Lineals die Distanzen zu den einzelnen Messpunkten bestimmt (y-
Wert = Entfernung vom 0 Punkt, x-Wert = Entfernung vom Maßband). Später erfolgte mittels
der Formel: ( ) ( )1212 yyxx −+− die Ermittlung der Abstände zwischen den einzelnen
Messpunkten.
Bei den Patienten des Widmer Stadiums II betrug der durchschnittliche Abstand zwischen der
Messposition 1 und 2 14,7 + 5,82 cm und zwischen der Messposition 1 und 3 59,19 + 7,34 cm.
Bei den Patienten des Widmer Stadiums III ergab sich ein durchschnittlicher Abstand zwischen
der Messposition 1 und 2 von 10,51 + 5,47 cm und zwischen der Messposition 1 und 3 von
49,88 + 7,28 cm.
Die Messung begann nach einer 30 minütigen Ruhephase, zum einen um eine ausreichende
Akklimatisierung des Patienten zu erreichen und zum anderen um die typische physiologische
24
Stabilisierungszeit für TcPO2 zu gewährleisten (siehe Kapitel 2.2.2). Die Temperatur des
Raumes betrug an den Messtagen konstant 22 + 1°C.
Im Anschluss an die Messungen erfolgte nach Entfernung der Halterungen von der Haut und
genauer Markierung dieser Stellen die Entnahme von 3 Stanzbiopsien (4 mm) in
Lokalanästhesie (Xylonest 1%) unter sterilen Bedingungen an genau diesen Messorten.
25
2.2 Untersuchung der kutanen Mikrozirkulation 2.2.1 Laser-Doppler-Fluxmetrie (LDF)
Mit der Laser Doppler Fluxmetrie ist es möglich geworden, eine kontinuierliche und nicht-
invasive Quantifizierung der Hautmikrozirkulation vorzunehmen. Erstmals durchgeführt wurde
diese Methode in Tierversuchen bereits 1972 durch Riva (Riva et al. 1972).
Das durch einen Laser produzierte monochromatische Licht wird bei der LDFmetrie durch ein
Glasfaserkabel ca. 1,5-2 mm tief in die Haut eingeleitet. Hier wird es vor allem vom
Hämoglobin der Erythrozyten und anderer sich im Messbereich bewegender Teilchen
reflektiert. Die Reflexionen des Lichtes werden über ein Glasfaserkabel zum Gerät
zurückgeleitet und mittels eines Photodetektors registriert. Da die Blutzellen während der
Messung in Bewegung sind, kommt es zu einer Frequenzverschiebung des registrierten Lichtes
(Doppler-Effekt), die proportional zur Geschwindigkeit der Blutzellen ist (Hiller et al. 1991;
Hoffman et al. 1992; Bräuer 2000). Die als Flux bezeichnete, richtungslose relative Messgröße
wird in AU (Arbitrary Units) angegeben und resultiert aus dem Produkt der Anzahl der sich
bewegenden Blutzellen im Messbereich und deren mittlerer Geschwindigkeit (Nilsson et al.
1980).
Zu bedenken ist, das bei dieser Messung auf Grund der gegebenen Eindringtiefe des
monochromatischen Lichtes nicht nur der Blutfluss der oberflächlichen, nutritiven Kapillaren
gemessen wird (Anteil am Gesamtflux nur ca. 15%). Der Großteil des gemessenen Fluxes
erfasst die Perfusion des thermoregulativen subpapillären Gefäßplexus (Jünger et al. 1994;
Wollina et al. 2006).
Für unsere Untersuchungen verwendeten wir das PeriFlux System 5000 (PF5010, Perimed AB,
Jarfälla, Schweden), welches Laserlicht mit einer Wellenlänge von 780 nm benutzt
(Eindringtiefe ca. 1,0-1,5 mm). Der Sondenkopf des Glasfaserkabels (Periflux PF 408, Perimed
AB, Jarfälla, Schweden) wurde mit einer Kunststoffhalterung (PH 07-4, Perimed AB, Jarfälla,
Schweden) und einem doppelseitig klebenden Streifen auf der gereinigten Haut fixiert. Die
LDF-Messsonden waren dabei in unmittelbarer Nachbarschaft zu den
Sauerstoffpartialdrucksonden angebracht (siehe Abbildung 2.2). Die Eichung der Sonden und
die Nullpunktbestimmung erfolgten nach den Angaben des Herstellers. Registriert und
aufgenommen wurden die Daten durch einen angeschlossenen Computer mit der Software
26
DIAdem 8.0 (Diadem National Instruments Engineering GmbH & Co KG, Aachen,
Deutschland).
2.2.2 Transkutane Sauerstoffpartialdruckmessung (TcPO2)
Auch diese Methode fand Ihre Anfänge bereits 1972 (Huch et al. 1972) und wurde seitdem
ständig weiterentwickelt. Sie basiert auf der Erkenntnis, das Kohlendioxid und Sauerstoff
durch die Haut ausgetauscht werden können, es also unter anderem zu einer Diffusion von
Sauerstoffmolekülen aus den Kapillaren zur Hautoberfläche kommt (Gerlach 1851).
Um den TcPO2 messen zu können (Periflux System 5000, PF5040, Perimeter AB, Jarfälla,
Schweden) haben wir am liegenden Patienten nach der Entfernung von Haaren und Reinigung
der Haut je einen selbstklebenden Fixierungsring (Typ tina, Radiometer, Copenhagen,
Dänemark) an den in Kapitel 2.1.3 beschriebenen Messpunkten befestigt. Um die
Diffusionsverhältnisse zu optimieren, wurde in die Fixierungsringe eine Kontaktlösung
(Contact Liquid, Radiometer Copenhagen, Dänemark) gefüllt. Mit Hilfe des in den
Fixierungsringen befindlichen Kurzgewindes konnten anschließend die mit einer für Sauerstoff
durchlässigen Membran versehenen Elektroden aufgeschraubt werden. Hierbei handelte es sich
um eine Sauerstoffelektrode vom Clark-Typ, die aus einer Silberchlorid-Anode und einer
Silberplatin-Kathode besteht. Zwischen der O2-permeablen Membran und der Elektrode
gewährleistet eine Elektrolytflüssigkeit konstante Diffusionsverhältnisse. Bei der Messung
werden nun die von den Kapillaren zur Hautoberfläche diffundierenden Sauerstoffmoleküle
(angelegte Polarisationsspannung zwischen den Elektroden ca. 500 MV) an der Silberplatin-
Kathode reduziert und erzeugen so zwischen den beiden Elektroden einen Stromfluss, der zum
Sauerstoffdruck des angrenzenden Mediums proportional ist.
Des Weiteren sind in die Elektrode ein Heizelement und ein Temperaturfühler integriert.
Hiermit wird für die Messung eine konstante Temperatur von 43°C erzeugt. Das Ziel dieser
Erwärmung ist es, eine Kapillardilatation mit maximaler Hyperämisierung der Haut zu
erreichen, um so den Sauerstoffverbrauch im Vergleich zum dadurch gestiegenen
Sauerstoffangebot vernachlässigbar klein werden zu lassen. Der TcPO2 korreliert unter diesen
Messbedingungen gut mit dem arteriellen Sauerstoffpartialdruck von untersuchten Personen,
weshalb er für eine semiquantitative Beurteilung der nutritiven Hautdurchblutung verwendet
werden kann (Huch et al. 1972). Die Eichung der TcPO2 Elektrode erfolgte vor jedem neuen
27
Messen in Zimmerluft nach den Angaben des Herstellers. Die gemessenen Werte werden in
mmHg ausgedrückt.
Pos. 1 Pos. 2
Abb. 2.2: Patientin mit Ulcus cruris nach
Anlage der Fixierringe und Sondenhalterungen
für die TcPO2 und LDF Messung.
2.2.3 Statistik
Die in den TcPO2 und LDF-Messungen erhobenen Daten wurden in MS Excel Tabellen (MS
Excel 2000, Version 9.0, Microsoft GmbH, Verl, Deutschland) eingepflegt und anschließend
mit dem Statistikprogramm SPSS (Version 12.0, SPSS GmbH Software, München,
Deutschland) weiter verarbeitet. Die Überprüfungen auf Signifikanzen erfolgte je nach
Fragestellung mit dem Mann-Whitney-Test für unverbundene und dem Wilcoxon Test für
verbundene Stichproben. Die Grafiken wurden durch SPSS generiert und in Form von Box
Plots ausgegeben. Eine Nachbearbeitung erfolgte in MS Word (MS Word 2000, Version 9.0,
Microsoft GmbH, Verl, Deutschland).
Die statistischen Berechnungen erfolgten nach Absprache und mit Hilfe von Herrn Dr. Haase
(Biomathematiker, Klinik und Poliklinik für Hautkrankheiten, Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald).
28
2.3 Immunhistochemie
2.3.1 Materialien
2.3.1.1 Verwendete Antikörper
Antikörper Firma Verdünnung
Anti-Human-Collagen I Oncogene, San Diego, USA;
Cat. No. CP17L
1:400
Anti-Human-Collagen IV Oncogene, San Diego, USA;
Cat. No. CP56
1:400
Anti-Human-Fibronektin Sigma, Saint Louis, Missouri, USA;
Cat. No. F3648
1:4000
Monoclonal-Anti-Human-
Tenascin
Sigma, Saint Louis, Missouri, USA;
Cat. No. T2551
1:4000
2.3.1.2 Chemikalien
Aqua dest. SG Wasseraufbereitung und Regeneration GmbH,
Hamburg, Deutschland
BackgroundEraser Biocarta Europe GmbH, Hamburg, Deutschland
BackgroundSniper Biocarta Europe GmbH, Hamburg, Deutschland
Diaminobenzidin (DAB) Sigma Chemical Company, St Louis, USA
Eosin (1%ig in 70% Alkohol) Merck AG, Darmstadt, Deutschland
Ethanol (96% & absolut) J.T. Baker/Mallinckrodt Baker, Deventer, Holland
Formalin Roth, Karlsruhe, Deutschland
Neoclear Merck AG, Darmstadt, Deutschland
Neomount Merck AG, Darmstadt, Deutschland
Paraffin (Histoplast) Merck AG, Darmstadt, Deutschland
Peroxidazed-1 Biocarta Europe GmbH, Hamburg, Deutschland
Salzsäure (HCl) Roth, Karlsruhe, Deutschland
Strepta Vidin-HRP Biocarta Europe GmbH, Hamburg, Deutschland
Tris-Puffer Roth, Karlsruhe, Deutschland
Universal Link Biocarta Europe GmbH, Hamburg, Deutschland
29
Xylol J.T. Baker/Mallinckrodt Baker, Deventer, Holland
2.3.1.3 Lösungen
Citratpuffer 9 ml Stammlösung A (0,1 M Zitronensäure:
21,01 g/l C6H8O7xH2O)
41 ml Stammlösung B (0,1 M Natriumcitrat:
29,41 g/l C6H5O7Na3xH2O)
ad 500 ml Aqua dest.
ph 6,0
Hämalaun (nach Mayer) 2,5 g Hämatoxylin
0,5 g Natriumjodat
125 g Chloralhydrat
125 g Aluminiumkaliumsulfat-Dodecahydrat
2,5 g Zitronensäure
ad 2500 ml Aqua dest., anschließend 14d reifen lassen
PBS 0,2 g/l KCl
0,2 g/l KH2PO4
8,0 g/l NaCl
1,44 g/l Na2HOP4x7H2O
pH 7,2-7,4
Peroxidase-Substrat Lösung 10 mg DAB Chromogen Substrate (1 Tablette)
10 ml PBS
10µl H2O2
Proteinase-K-Lösung 50 ml Proteinase-K-Puffer
3 mg Proteinase-K
Proteinase-K-Puffer 25 ml Lösung A (1 M KCl)
5 ml Lösung B (1 M Tris)
1 ml Lösung C (1 M MgCl2)
ad 500 ml Aqua dest.
Tris-Puffer 0,1 M Tris-HCl (15,76 g/l)
0,15 M NaCl (8,7 g/l)
pH 7,5
30
2.3.1.4 Geräte und sonstige Materialien
Analysenwaage BP 210S Sartorius analysis, Göttingen, Deutschland
Deckgläschen quadratisch Firma Marienfeld, Lauda-Königshofen, Deutschland
Eppendorf – Röhrchen
(0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml)
Eppendorf Research, Hamburg, Deutschland
Gewebe-Einbettautomat
(Histokinette)
MEDIS-Weber, Buseck, Deutschland
Gewebe-Ausblockstation MEDIM Histotechnologie, Gießen, Deutschland
Kamera Colorview II SIS Olympus Europa GmbH, Hamburg, Deutschland
Magnetrührer IKAMAG RET IKA-Werke GmbH & Co KG, Staufen, Deutschland
Mikrotom Leica SM 2000 R Leica Microsystems, Nussloch, Deutschland
Mikrowelle Typ M 696 Miele und Cie GmbH & Co, Gütersloh, Deutschland
Monomixer (Vortexer) Jahnke & Kunkel, IKA Labortechnik, Staufen,
Deutschland
Objektträger Superfrost Menzel, Braunschweig, Deutschland
PH-Meßgerät inoLab pH Level1 WTW, Weilheim, Deutschland
Pipettenspitzen Eppendorf Research, Hamburg, Deutschland
Schüttler Polymax 2040 Heidolph, Herdrich GmbH, Rust, Deutschland
SIS, SoftwareanalySIS Soft Imaging System GmbH, Münster, Deutschland
Streckplatte Leica HI1220 Leica Microsystems, Nussloch, Deutschland
Universalmikroskop Axioplan Zeiss, Oberkochen, Deutschland
Zentrifuge MiniSpin plus Eppendorf Research, Hamburg, Deutschland
2.3.2 Untersuchungsschritte Immunhistochemie
2.3.2.1 Gewebebiopsien
Die in der Hautklinik nach dem in Kapitel 2.1.3 beschriebenen Verfahren gewonnen
Gewebeproben wurden sofort nach der Entnahme in einer 4%igen gepufferten
Formaldehydlösung fixiert. Die weitere Bearbeitung erfolgte anschließend nach Transfer der
Proben im Institut für Anatomie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald.
31
2.3.2.2 Paraffineinbettung und Paraffinschnitte
Nach ca. 24-stündiger Fixierung in der 4%igen Formaldehydlösung erfolgte ein Auswaschen
der Fixierungslösung unter fließendem Leitungswasser (24h). Die Gewebeproben wurden
anschließend in die Histokinette überführt, wo sie zur Entwässerung für je 2 Stunden eine
aufsteigende Ethanolreihe (50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 2x absoluter Alkohol) durchliefen.
Nach je 2 weiteren Stunden in Xylolersatz (Neoclear), sowie 2 mal in Paraffin (56-58°C;
Histoplast) zur vollständigen Durchtränkung des Gewebes, wurden die Proben in unbenutztem,
frischen und filtrierten Paraffin ausgegossen (Gewebe-Einbettautomat MEDIS-Weber, Buseck,
Deutschland).
Die Herstellung der 5µm dicken Paraffinschnitte erfolgte mit einem Schlittenmikrotom.
Anschließend wurden diese auf beschichtete Objektträger aufgezogen und auf der Streckplatte
bei 38°C getrocknet.
2.3.2.3 Entparaffinierung
Zum Herauslösen des Paraffins wurden die Schnitte in Xylol gestellt (2 x 10 min) und
anschließend über eine absteigende Ethanolreihe (100%, 96%, 80%, 70%, 50% für jeweils 5
min) und Aqua dest. (5 min) rehydriert.
2.3.2.4 HE-Färbung
Zur Kontrolle der Schnittführung und der Gesamtmorphologie des Gewebes wurden vor der
Immunhistochemie von allen vorhanden Gewebeproben HE-Schnitte angefertigt. Dazu wurden
die Objektträger nach der Entparaffinierung (s.o.) in Hämalaun (1 min) gefärbt, in fließendem
Leitungswasser gebläut (10 min) und zum Abstoppen der Reaktion mit Aqua dest. gespült.
Nach der Gegenfärbung mit Eosin 1%ig (5 min) wurden die so erhaltenen Präparate durch eine
aufsteigende Alkoholreihe (2 x 96%, 100%; jeweils 5 min) und Neoclear (2x5 min) wieder
dehydriert und unter Verwendung von Neomount eingedeckelt.
2.3.2.5 Immunhistochemie
Für die immunhistochemische Färbung wurde das Biocarta-System verwendet (4plusTM
Universal Immunoperoxidase Detection System, Biocarta Europe GmbH, Hamburg,
Deutschland). Nach der Entparaffinierung erfolgte das Vorgehen nach dem Standardprotokoll
32
des Herstellers. Lediglich leichte Modifikationen wurden auf Grund langjähriger Erfahrungen
mit diesem System vorgenommen:
1. Blocken der endogenen Peroxidase (Peroxidazed 1, 5 min, 22°C).
2. Spülen in Leitungswasser (5 min) und Aqua dest. (5 min).
3. Überführen der Schnitte in Citratpuffer und hitzebeständige Objektträgerbehälter,
Kochen in der Mikrowelle (700 W, 20 min) mit Kontrolle der Füllhöhe des
Citratpuffers alle 5 min und ggf. Wiederauffüllung mit Aqua dest. Nach der
Mikrowellenbehandlung Abkühlung der Schnitte für ca. 45 min.
4. Spülen in Leitungswasser (5 min), Aqua dest. (5 min) und PBS (5 min).
5. Ziehen einer hydrophoben Barriere um den Schnitt herum (Dako Cytomation Pen,
Dakocytomation, Glostrup, Dänemark) und Blocken der nichtspezifischen
Hintergrundfärbungen (Backgrounderaser, 5 min, 22°C).
6. Abkippen des Proteinblockers und Inkubation mit dem primären Antikörper (Tn:
1:4000; Fn: 1:4000; Kol I: 1:400; Kol IV: 1:400) (12h, 4-6 °C).
7. Waschen in PBS (2x5 min).
8. Inkubation mit dem sekundären, biotinylierten Antikörper (Universal Link, 10 min,
22°C).
9. Waschen in PBS (2x5 min).
10. Inkubation mit einer konjugierten Streptavidin-Peroxidase (Streptavidin-HRP, 10 min,
22°C).
11. Waschen in PBS (2x5 min).
12. Inkubation mit Peroxidase-Substrat-Lösung (5 min, 22°C).
13. Abkippen der Lösung und zum Beenden der Reaktion Waschen in Aqua dest. (2x5
min).
14. Überführen der Schnitte in Hämalaun zur Gegenfärbung der Zellkerne (1 min, 22°C)
mit anschließendem Bläuen unter fließendem Leitungswasser (5 min).
15. Abstoppen der Färbereaktion durch Waschen in Aqua dest. (2x5 min).
Im Anschluss wurden die Schnitte zur Dehydrierung wieder durch eine Alkoholreihe geführt
(2x 96%, 100%, 2x Neoclear; jeweils 5 min) und in Neomount eingebettet.
33
2.3.2.6 Kontrollreaktionen
Bei jedem immunhistochemischen Untersuchungsgang wurden mehrere Kontrollen mitgeführt,
um:
1. eine endogene Peroxidaseaktivität,
2. unspezifische Bindungen des Detektionssystems und
3. unspezifische Bindungen des primären Antikörpers
auszuschließen. Dazu wurden (zu 1.) die Kontrollschnitte bis zur Farbentwicklung
(Arbeitsschritte 1-11 s.o.) nur mit PBS anstelle der lt. Standardprotokoll vorgeschriebenen
Reagenzien inkubiert, (zu 2.) die Kontrollschnitte anstelle des primären Antikörpers nur mit
PBS inkubiert und (zu 3.) die Kontrollschnitte anstelle des primären Antikörpers mit einem
nicht-paraffingängigen monoklonalen Antikörper (z.B. gegen β1-Integrin, Verdünnung
entspricht der des primären Antikörpers) inkubiert.
2.3.2.7 Auswertung und Fotographie der mikroskopischen Präparate
Die mikroskopische Auswertung erfolgte mit dem Universalmikroskop Axioplan in 10, 20
oder gegebenenfalls 40facher Vergrößerung. Hierbei wurden die Präparate semiquantitativ und
deskriptiv durch 2 voneinander unabhängige Untersucher in der gleichen Vergrößerung
analysiert. Besondere Aufmerksamkeit wurde der Anfärbung in den verschiedenen Schichten
der Dermis, der epidermalen und endothelialen Basalmembranen und der perikapillären
Umgebungen gewidmet. Für die deskriptive Auswertung aller Schnitte wurde zwischen
schwacher, mittlerer und starker Anfärbung differenziert. Die Veränderungen im Färbemuster
wurden zudem im Vergleich zur Anfärbung in der Oberschenkelhaut des jeweiligen Moleküles
beschrieben. Mit Hilfe der in das Mikroskop integrierten digitalen Kamera Colorview II SIS
wurden zur Veranschaulichung Bilder angefertigt, über das Programm SoftwareanalySIS
eingelesen und als jpg-Datei abgespeichert. Die weitere endgültige Bearbeitung erfolgte mit
dem Programm Corel Photo Paint (Version 7.0, Corel Corporation, Unterschleissheim,
Deutschland).
34
3. Ergebnisse
3.1 Mikrozirkulationsuntersuchungen
3.1.1 Transkutaner Sauerstoffpartialdruck
Bei den Patienten des Widmer Stadiums II lag der Median des TcPO2 an der Haut des
Oberschenkels bei 56,77 mmHg (x0,25=52,00 mmHg, x0,75=58,50 mmHg). An der
Unterschenkelhaut fand sich nur noch ein im unteren Normbereich liegender medianer Wert
von 49,14 mmHg (x0,25=41,50 mmHg, x0,75=62,49 mmHg) und in der Haut des medialen
Malleolus von 28,50 mmHg (x0,25 14,10=mmHg, x0,75=48,87 mmHg). Die Abnahme des
TcPO2 war somit zwischen Oberschenkel und Malleolus statistisch stark signifikant (p<0,01).
Der Unterschied der TcPO2 Werte zwischen Unterschenkel und medialem Malleolus war zwar
deutlich, verfehlte aber knapp das Signifikanzniveau (p=0,055).
Medialer Malleolus Unterschenkel Oberschenkel
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00 p < 0,01
p = 0,055 (n.s.) p = 0,15 (n.s.)
TcPO
2 [m
mH
g]
Abb. 3.1: Transkutaner Sauerstoffpartialdruck in mmHg bei Patienten des Widmer Stadiums II
(n=9).
35
Die Werte der Patienten im Widmer Stadium III zeigten ebenfalls eine Abnahme der
transkutanen Sauerstoffpartialdrücke und somit eine Verschlechterung der nutritiven
Versorgung der Haut zum Ulkus hin. So lag der Median in der Oberschenkelhaut bei 55,00
mmHg (x0,25=42,25 mmHg, x0,75=65,00 mmHg), in der Unterschenkelhaut bei 26,00 mmHg
(x0,25=7,75 mmHg, x0,75=46,00 mmHg) und in der Haut des Malleolus bei 7,00 mmHg
(x0,25=2,5 mmHg, x0,75=17,25 mmHg). Am Ulkusrand war der TcPO2 damit gegenüber dem
Unterschenkel signifikant (p<0,05) und gegenüber dem Oberschenkel stark signifikant
(p<0,001) erniedrigt. Des Weiteren zeigte sich bereits zwischen den Werten der
Unterschenkel- und Oberschenkelhaut ein stark signifikanter Unterschied (p<0,001).
Ulkusrand Unterschenkel Oberschenkel
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
p < 0,001
p < 0,05 p < 0,001
TcPO
2 [m
mH
g]
Abb. 3.2: Transkutaner Sauerstoffpartialdruck in mmHg bei Patienten des Widmer Stadiums
III (n=14).
36
Beim Vergleich der transkutanen Sauerstoffpartialdrücke zwischen beiden Widmer Gruppen
war ein stark signifikanter Unterschied im Bereich der Unterschenkel- und Ulkusrand- bzw.
Malleolusregion (p<0,01) festzustellen. Die nutritive Versorgungsleistung der kutanen
Zirkulation war demnach im Widmer Stadium III an diesen beiden Messpositionen stärker
beeinträchtigt als bei Stadium II Patienten. Auffällig war in beiden Gruppen die große
Streubreite der Werte im Bereich von Unterschenkel und Malleolus/Ulkusrand. Die Messwerte
der Oberschenkelhaut beider Gruppen zeigten im Vergleich einen nicht signifikanten
Unterschied (p=0,68).
OberschenkelUnterschenkelUlkusrand/ Medialer Malleolus
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Widmer II
Widmer III
p < 0,01
p < 0,01
p = 0,68 (n.s.)
TcPO
2 [m
mH
g]
Abb. 3.3: Messwerte des transkutanen Sauerstoffpartialdruckes in mmHg im Vergleich
zwischen dem Widmer Stadium II (n=9) und III (n=14).
37
3.1.2 Laser-Doppler-Fluxmetrie
Bei den Messungen der Patienten im Widmer Stadium II zeigte sich eine signifikante
Zunahme des Ruheflux in der Haut in Richtung des medialen Malleolus (p<0,05 zwischen OS
und Malleolus). In der Oberschenkelhaut wurde ein im Normbereich liegender Flux von 4,80
AU (x0,25=2,65 AU, x0,75=10,70 AU) gemessen. Die Ruhefluxe vom Unterschenkel, 8,20 AU
(x0,25=3,60 AU, x0,75=15,85 AU), und medialem Malleolus, 7,00 AU (x0,25=2,85 AU,
x0,75=17,30 AU), lagen nahe beieinander. Eine Signifikanz zwischen diesen beiden bestand
nicht (p=0,91). Die Steigerung des Fluxes zwischen Oberschenkel und Unterschenkel war zwar
deutlich, verfehlte jedoch knapp das Signifikanzniveau (p=0,051).
Medialer Malleolus Unterschenkel Oberschenkel
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
p < 0,05
p = 0,051 (n.s.)p = 0,91 (n.s.)
LDF
[AU
]
Abb. 3.4: Messwerte der Laser-Doppler-Fluxmetrie in AU der Patienten im Widmer Stadium
II (n=9).
38
In der Widmer III Patientengruppe war der Ruheflux am Ulkusrand gegenüber den anderen
beiden Messpositionen signifikant (p<0,05 gegenüber Unterschenkelhaut) bzw. stark
signifikant (p<0,001 gegenüber Oberschenkelhaut) erhöht. Mit einem Median von 45,90 AU
(x0,25=28,05 AU, x0,75=69,10 AU) lag er deutlich über den medianen LDF-Werten der
Unterschenkelhaut mit 30,60 AU (x0,25=8,55 AU, x0,75=43,25 AU) und der Oberschenkelhaut
mit 8,50 AU (x0,25=3,50 AU, x0,75=11,55 AU).
Ulkusrand Unterschenkel Oberschenkel
0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
p < 0,001
p < 0,05 p < 0,01
LDF
[AU
]
Abb. 3.5: Messwerte der Laser-Doppler-Fluxmetrie in AU der Patienten im Widmer Stadium
III (n=14).
39
Der Vergleich der LDF-Werte zwischen beiden Widmer Gruppen zeigte in der Malleolus- bzw.
Ulkusrand- und Unterschenkelregion signifikant höhere Flux-Werte bei den Patienten im
Widmer Stadium III (p<0,0001 zwischen Ulkusrand und medialem Malleolus; p<0,02
zwischen den Unterschenkelregionen). In dieser Patientengruppe fiel des Weiteren eine
wesentlich größere Streubreite der Werte in diesen Regionen auf. In der Haut des
Oberschenkels dagegen fanden sich in beiden Gruppen nahezu identische Werte.
OberschenkelUnterschenkelUlkusrand/ Medialer Malleolus
120
100
80
60
40
20
0
Widmer II
Widmer III
p < 0,0001
p < 0,02
p = 0,44 (n.s.)
LDF
[AU
]
Abb. 3.6: Vergleich zwischen den Messwerten der Laser-Doppler-Fluxmetrie in AU zwischen
den Widmer Gruppen II (n=9) und III (n=14).
40
3.2 Auswertung der Biopsien 3.2.1 Histopathologische Beurteilung der Biopsien
Alle Präparate (HE-Färbung) der Oberschenkelhaut wiesen die Charakteristika gesunder Haut
auf. So war eine normale Epidermis mit korbgeflechtartigem Stratum corneum vorhanden, und
im Stratum papillare und reticulare der Dermis fanden sich vereinzelt Kapillaren, die sich meist
kreisrund darstellten (quer zum Verlauf angeschnitten) (Abb. 3.7a).
Bei den Patienten im Widmer Stadium II zeigte sich bei der untersuchten Haut am
Unterschenkel kein wesentlicher Unterschied zu der am Oberschenkel. Die Haut des Malleolus
dagegen zeichnete sich in dieser Patientengruppe durch eine Zunahme der Schichtdicke der
Epidermis (Akanthose), bei gleichzeitiger Hyperkeratose, aus. Darüber hinaus war des öfteren
eine erhöhte Zahl an angeschnittenen Kapillaren, vor allem im Stratum papillare, zu
beobachten. Diese zeigten häufig einen geschlängelten Verlauf.
Bei den Proben der Patienten aus dem Widmer Stadium III nahm die Akanthose und
Hyperkeratose der Epidermis zum Ulkusrand hin deutlich zu. Bereits in der Unterschenkelhaut
waren neben der verdickten Epidermis (Akanthose) verbreiterte und verlängerte Reteleisten
sowie eine Zunahme von Kapillaranschnitten im Stratum papillare auffällig. In der Dermis der
Haut des Ulkusrandes waren die Reteleisten häufig stark verbreitert und verlängert sowie die
Anzahl der Kapillaranschnitte erhöht. Diese Gefäße zeigten oftmals vergrößerte Lumina, waren
länglich oder geschlängelt und wirkten wandverdickt. In einigen Präparaten war eine starke
Häufung von angeschnittenen Kapillaren zu finden, die histopathologisch eine Ähnlichkeit mit
glomerulumartigen Strukturen aufwiesen (Abb. 3.7b).
41
Abb. 3.7a: HE-Färbung an klinisch gesunder Oberschenkelhaut (10x); Normale Epidermis und vereinzelt Gefäße (↑). Normalbefund.
Abb. 3.7b: HE-Färbung am Ulkusrand, gleicher Patient wie links (10x); Kompakte Hyperkeratose, Akanthose, verlängerte Reteleisten, entzündliches Infiltrat (↑) und zahlreiche Kapillaren (→) im Stratum papillare.
42
3.2.2 Immunhistochemische Beurteilung der Biopsien
Die Darstellung der immunhistochemischen Ergebnisse erfolgt für jedes Molekül in einer
vergleichenden Darstellung zwischen den Widmer Stadien II und III nach den Regionen
Oberschenkel – Unterschenkel – medialer Malleolus/Ulkusrand. Im Anhang findet sich für
jedes Molekül zudem eine tabellarische Darstellung der immunhistochemischen Ergebnisse
(siehe Kapitel 7).
3.2.2.1 Kollagen I
In der Oberschenkelhaut zeigte sich in beiden Patientengruppen ein ähnliches
Anfärbungsmuster. In der gesamten Dermis sahen wir im Bindegewebe und im Bereich von
Nervenfasern und Gefäßanschnitten eine Färbung für Kollagen I. In der dermo-epidermalen
Junktionszone und dem oberen Anteil des Stratum papillare der Dermis war eine stärkere
Anfärbung (ein breiter, stark gefärbter Saum im Vergleich zum Rest des Präparates) zu sehen.
Die Kollagenfasern waren überwiegend horizontal (tangential zur Oberfläche) ausgerichtet
(Abb. 3.8a).
Während in der untersuchten Haut des Unterschenkels bei Patienten im Widmer Stadium II
keine wesentlichen Unterschiede zur Haut des Oberschenkels festzustellen waren, zeigten sich
in dieser Region bei Patienten des Stadiums III Veränderungen in der Immunreaktion für
Kollagen I. So war bei 3 Patienten eine schwächere Anfärbung im Stratum papillare (ein
breiter, stärker gefärbter Saum war nicht mehr abzugrenzen vom restlichen Gewebe) auffällig.
Bei 7 Patienten nahm die Breite der Schicht immunreaktiven Gewebes um die Gefäße (aber
nicht die Färbeintensität) zu. Weiterhin fiel auf, das bei der Hälfte der Patienten die Expression
von Kollagen I in der retikulären Dermis (oberer Anteil) jetzt inhomogen war, wobei die
Fasern hier scheinbar teilweise Ihre horizontale Ausrichtung verloren hatten.
Bei der immunhistochemischen Untersuchung der Haut des medialen Malleolus bzw. des
Ulkusrandes zeigten sich nun auch Veränderungen bei Patienten des Widmer Stadiums II. Bei
fast allen Patienten ergab sich eine Abnahme der Farbintensität in der dermo-epidermalen
Junktionszone und des oberen Stratum papillare (ein verstärkter Saum wie bei der
Oberschenkelhaut war nun nicht mehr zu beobachten und die Farbintensität glich der der
übrigen Dermis). Es kam bei 3 Patienten zu einer Zunahme der Färbung im Bereich der
retikulären Dermis und bei 3 weiteren Patienten zur Zunahme der Faserschicht um die
43
angeschnittenen Gefäße (Abb. 3.9). Auch in der Widmer III Patientengruppe zeigte sich bei
fast allen Patienten eine Abnahme der Färbung im Bereich des oberen Stratum papillare. Der
Verlauf der Kollagenfasern war hier horizontal, während er im unteren Teil der papillären
Dermis und großen Teilen der retikulären Dermis unregelmäßig erschien. In diesen Schichten
waren häufiger auch vertikal ausgerichtete Kollagenfasern zu finden. Außerdem war bei 9
Patienten eine stärkere Reaktion in der retikulären Dermis und bei weiteren 9 die schon in der
Unterschenkelhaut beschriebene verstärkte Faserschicht um die Gefäße zu beobachten (Abb.
3.8b).
Abb. 3.8a: Immunhistochemischer Nachweis von Kollagen I am OS, Widmer III, (10x); Überwiegend horizontal ausgerichtete Kollagenfasern, die in der papillären Dermis unterhalb der epidermalen BM stärker gefärbt sind (↑).
Abb. 3.8b: Immunhistochemischer Nachweis von Kollagen I am Ulkusrand, Widmer III, (10x); Verstärkte Anfärbung unterhalb der epidermalen BM nicht mehr zu sehen. Mehr vertikaler Verlauf der Kollagen I Fasern in der retikulären Dermis (→).
Abb. 3.9a: Immunhistochemischer Nachweis von Kollagen I am medialen Malleolus, Widmer II, (10x); Horizontaler Faserverlauf in der papillären Dermis mit verstärkter Anfärbung (↑). In der retikulären Dermis mehr vertikaler/diffuser Verlauf der Kollagenfasern mit verstärkter Faserschicht um die Gefäße (→). Zahlreiche Gefäßanschnitte.
Abb. 3.9b: Immunhistochemischer Nachweis von Kollagen I am medialen Malleolus, Widmer II, (10x - Ausschnittsvergrößerung); Verstärkte Faserschicht um die Gefäße. Zahlreiche Gefäßanschnitte und viel entzündliches Infiltrat in der papillären Dermis.
44
3.2.2.2 Kollagen IV
Das immunhistochemische Anfärbungsmuster für Kollagen IV war bei den Patienten beider
Widmer Stadien in der Oberschenkelhaut identisch. Zu beobachten war die regelhafte
Anfärbung der Basalmembran zwischen Stratum basale der Epidermis und der Dermis in Form
einer zarten Linie. Interessanterweise war in einigen Basalzellen eine supranukleäre, eher
unspezifische Immunreaktion zu erkennen. In der Dermis wiesen die Basalmembranen der
Endothelzellen angeschnittener Gefäße Kollagen IV auf (Abb. 3.10a, 3.11a).
In der untersuchten Haut am Unterschenkel waren deutliche Unterschiede in der
Immunreaktion für Kollagen IV im Vergleich zum Oberschenkel und auch zwischen beiden
Patientengruppen festzustellen. So zeigte sich eine vergleichsweise starke Färbung (sowohl
breiter als auch intensiver) im Bereich der Basalmembran zwischen Epidermis und Dermis bei
nur 4 von 9 Patienten im Stadium II aber bei allen Patienten im Stadium III. Außerdem war im
Bereich der Gefäßendothelzellen (Basalmembran und umgebende Strukturen) im Stratum
papillare und reticulare bei 5 Patienten im Widmer Stadium II und 13 Patienten im Widmer
Stadium III eine intensivere Färbung für Kollagen IV zu beobachten (Abb. 3.10b).
In der untersuchten Haut des medialen Malleolus bzw. des Ulkusrandes war in der epidermalen
Basalmembran bei allen Patienten beider Gruppen ein gleich breiter Kollagen IV positiver
Saum vorhanden, der im Vergleich zur untersuchten Unterschenkelhaut beider Gruppen
wiederum häufig stärker war. Auch die verstärkte Färbung um die Endothelzellen war in
beiden Gruppen zu finden, wobei die Kollagen IV Schicht bei den Ulkus Patienten tendenziell
etwas dicker war. Vor allem in gefäßreichen Anschnitten fand sich bei den Patienten beider
Widmer Gruppen insbesondere im Stratum papillare auch eine starke Immunreaktion in
Strukturen, die die Kapillaren umgeben. Diese stellte sich „feinflockig“ dar (Abb. 3.10c,
3.11b).
45
Abb. 3.10a: Immunhistochemischer Nachweis von Kollagen IV am OS, Widmer III, (20x); Zarte Anfärbung in der epidermalen BM.
Abb. 3.10b: Immunhistochemischer Nachweis von Kollagen IV am US, Widmer III, (10x); Starke Anfärbung der epidermalen (→) und endothelialen (↑) BM. Vermehrte Gefäßanschnitte im Str. papillare.
Abb. 3.10c: Immunhistochemischer Nachweis von Kollagen IV am Ulkusrand, Widmer III, (10x); Starke Anfärbung der epidermalen (↑) und endothelialen (←) BM. Vermehrte Gefäßanschnitte und tw. feinflockige Färbung in deren Umgebung (↔).
Abb. 3.11a: Immunhistochemischer Nachweis von Kollagen IV am OS, Widmer II, (20x); Schwache Anfärbung der endothelialen BM.
Abb. 3.11b: Immunhistochemischer Nachweis von Kollagen IV am medialen Malleolus, Widmer II, gleicher Patient wie links (20x); Starke Anfärbung der endothelialen BM.
46
3.2.2.3 Tenascin
Tenascin wurde in der Oberschenkelhaut beider Patientengruppen als schmaler, teilweise
diskontinuierlicher Saum im Stratum papillare direkt unterhalb der Basalmembran lokalisiert.
Im Bereich dermaler Gefäße und im Hüllgewebe von Nervenfasern fand sich Tenascin als
feine netzartige Struktur. Eine vergleichsweise etwas stärkere Immunreaktion wurde im
Bereich von Hautanhangsgebilden (z.B. Schweißdrüsen) gefunden. In der Epidermis kam es
gelegentlich zu einer Anfärbung der basolateralen Membranen der Basalzellen (Abb. 3.12a).
Im Widmer Stadium II war die Tenascin-Immunreaktion im Stratum papillare in allen
untersuchten Proben der Unterschenkelhaut stärker als in der Oberschenkelhaut. Tenascin war
dabei als ein dichtes, homogenes und durchgehendes, an die Basalmembran der Basalzellen
grenzendes Band, vorhanden. Außerdem fand sich eine netzartige Anfärbung im gesamten
Bereich des Stratum papillare (Abb. 3.13a). Bei den Patienten des Stadiums III war die Stärke
der Immunreaktion im Stratum papillare intensiver als bei Widmer II Patienten. Des Weiteren
war Tenascin bei diesen Patienten außer im Stratum papillare in vielen Präparaten auch im
oberen Anteil der retikulären Dermis vorhanden. Die Expression von Tenascin im Bereich der
Kapillaren war bei 5 der Patienten des Widmer Stadiums II, aber bei allen Patienten des
Widmer Stadiums III wesentlich stärker als im Vergleich zur Oberschenkelhaut (Abb. 3.12b).
Im Bereich der Drüsen und Nerven zeigten sich bezüglich der Tenascinexpression keine
Unterschiede im Vergleich beider Gruppen.
In der Haut der Malleolarregion bei Stadium II Patienten fand sich die stärkste Immunreaktion
für Tenascin im Stratum papillare, die sich aber nicht auf die retikuläre Dermis erstreckte. Im
Bereich der Gefäße nahm die Intensität der Immunreaktion weiter deutlich zu (Abb. 3.13b). In
der Ulkusrandregion der Stadium III Patienten war die Reaktionsstärke für Tenascin unterhalb
der Basalmembran und in der papillären Dermis genau so intensiv wie in der
Unterschenkelhaut dieser Patientengruppe. Gleichzeitig zeigte sich in der Ulkusrandregion nun
bei allen Patienten eine positive Reaktion im Stratum reticulare, die sich bis auf den unteren
Teil dieser Schicht erstreckte (Abb. 3.12c). Die Farbintensität im Bereich der Gefäße war bei
beiden Patientengruppen in etwa gleich stark.
Bei der Auswertung der Schnitte fiel weiterhin auf, dass die beschriebene Anfärbung im
Bereich der basolateralen Membran von Basalzellen der Epidermis in vielen Präparaten zum
Ulkusrand/Malleolus hin stärker wurde. Ansonsten kam es zu keiner Färbung der Epidermis.
47
Abb. 3.12a: Immunhistochemischer Nachweis von Tenascin am OS, Widmer III, (10x); Geringe, diskontinuierliche Anfärbung unterhalb der epidermalen BM (↑). Zarte Färbung um die Gefäße (←).
Abb. 3.12b: Immunhistochemischer Nachweis von Tenascin am US, Widmer III, gleicher Patient wie links (10x); Intensivere, kontinuierliche Anfärbung unterhalb der epidermalen BM, die netzartig bis in das obere Str. reticulare reicht (↑).
Abb. 3.12c: Immunhistochemischer Nachweis von Tenascin am Ulkusrand, Widmer III, gleicher Patient wie links (10x); starke Anfärbung im Str. papillare und reticulare. Unspezifische Färbung in der basalen Reihe.
Abb. 3.13a: Immunhistochemischer Nachweis von Tenascin am US, Widmer II, (10x); Kontinuierliche Anfärbung für Tn unterhalb der epidermalen BM. Teilweise verstärkte Färbereaktion im Str. papillare (→). Starke Färbung um die Gefäße (↑).
Abb. 3.13b: Immunhistochemischer Nachweis von Tenascin am medialen Malleolus, Widmer II, gleicher Patient wie links (10x); Starke Anfärbung unterhalb der epidermalen BM und des Str. papillare. Starke Färbung um die Gefäße (↑).
48
3.2.2.4 Fibronektin
In beiden Patientengruppen war in der Oberschenkelhaut ein relativ homogenes Färbeverhalten
in der Dermis festzustellen. Im Bereich von Hautanhangsgebilden, um Fibroblasten und an
Endothelzellen zeigte sich im Vergleich dazu eine stärkere Anfärbung (Abb. 3.14a).
In der Haut des Unterschenkels bei den Patienten im Widmer Stadium II entsprach das
Anfärbemuster dem der Oberschenkelhaut beider Gruppen (Abb. 3.16a). Im Stadium III
hingegen kam es bei der Hälfte der Patienten in dieser Region zu einer leichten Abnahme der
Farbintensität im Bereich der epidermalen Basalmembran und des oberen Stratum papillare. Im
Gegensatz dazu zeigte sich bei fast allen Patienten dieses Stadiums eine verstärkte Anfärbung
im Bereich der Gefäßendothelien und der Hautanhangsgebilde sowie bei 6 Patienten in der
retikulären Dermis, wobei das Färbemuster in dieser Hautschicht eher
aufgelockert/fragmentiert schien.
Eine geringere Reaktionsstärke der epidermalen Basalmembran und oberen papillären Dermis
zeigte sich nun ebenso in der Haut des medialen Malleolus bei Stadium II Patienten. Die
Bereiche um die Kapillaren waren in dieser Gruppe jetzt bei allen Patienten stark angefärbt
(Abb. 3.16b). Die Immunreaktion für Fibronektin zeigte in der Haut des Ulkusrandes bei
Patienten im Stadium III in der retikulären Dermis und unteren papillären Dermis bei vielen
Patienten ein grobmaschiges Muster. Bei 10 Patienten war die retikuläre Dermis zudem wie in
der Unterschenkelhaut dieser Widmer Gruppe verstärkt angefärbt. Im oberen Stratum papillare
dagegen war die Intensität schwächer. Das die Endothelzellen umgebende Gewebe zeigte eine
kräftige Anfärbung, die hier tendenziell etwas stärker als am medialen Malleolus der Widmer
II Patienten erschien (Abb. 3.15).
49
Abb. 3.14a: Immunhistochemischer Nachweis von Fibronektin am OS, Widmer III, (10x); Anfärbung in der gesamten Dermis mit etwas verstärkter Intensität um Endothelzellen (↑).
Abb. 3.14b: Immunhistochemischer Nachweis von Fibronektin am Ulkusrand, Widmer III, (10x); Abnahme der Anfärbung im Stratum papillare bei massiver Infiltration von Entzündungszellen. Deutliche kräftigere Färbung im Bereich von Gefäßen (↑).
Abb. 3.15a: Immunhistochemischer Nachweis von Fibronektin am Ulkusrand, Widmer III, (10x); Nur noch schwache Anfärbung für Fn im Stratum papillare. Intensive Färbung um Endothelzellen (↑).
Abb. 3.15b: Immunhistochemischer Nachweis von Fibronektin am Ulkusrand, Widmer III, gleicher Patient wie links, (10x); Verstärkte, inhomogene, grobmaschige/fragmentierte Anfärbung für Fn im Stratum reticulare (↑).
50
Abb. 3.16a: Immunhistochemischer Nachweis von Fibronektin am US, Widmer II, (10x); Mäßige Anfärbung dieses Moleküls in der gesamten Dermis. Etwas verstärkte Intensität um Endothelzellen (↑) vergleichbar mit der Haut des Oberschenkels.
Abb. 3.16b: Immunhistochemischer Nachweis von Fibronektin am medialen Malleolus, Widmer II, (20x); Starke Reaktion für Fn im Bereich der Endothelzellen (←). Viel entzündliches Infiltrat im Gewebe mit aufgelockerter Anfärbung für Fn (↑).
51
4. Diskussion 4.1 Gliederung der Diskussion Der Diskussionsteil folgt aus Gründen der Übersichtlichkeit in seinem Aufbau dem des
Ergebnisteils. Es werden demnach zuerst die Ergebnisse der mikroangiologischen
Untersuchungen (siehe Kapitel 3.1) diskutiert und danach die der immunhistochemischen
Untersuchungen (siehe Kapitel 3.2.2). Abschließend soll ein möglicher Zusammenhang von
Mikroangiopathie und Expression der Matrix-Moleküle Kollagen I, Kollagen IV, Tenascin und
Fibronektin anhand der gewonnenen Ergebnisse überprüft und dargestellt werden.
4.2 Kutane Mikroangiopathie In den vergangenen Jahren weltweiter intensiver Forschung auf dem Gebiet der chronischen
venösen Insuffizienz haben sich 2 Ursachen durchgesetzt, die maßgeblich an der Entstehung
der klinischen Manifestationen dieser Krankheit beteiligt sein sollen. Das ist zum Einen die
Mikroangiopathie und zum Anderen die Inflammation. Bislang konkurrierten diese beiden in
der Literatur häufig als Entstehungsursachen für die CVI – anhand der Ergebnisse dieser Studie
ist auch eine gemeinsame und gleichzeitige Einwirkung beider Faktoren auf die Genese dieser
Krankheit und ihrer kutanen Manifestiationen denkbar.
Die chronische venöse Insuffizienz stellt unter anderem eine mögliche Folge einer primären
Varikose oder eines postthrombotischen Ereignisses dar. Die dadurch gestörte Hämodynamik
führt nicht nur zu weiteren Schäden und Umbauten an den Leit- und oberflächlichen
Hautstammvenen und ihren Klappen (Kirsch et al. 1999; Badier-Commander et al. 2000;
Sansilvestri-Morel et al. 2003; Nicolaides 2005), sondern beeinträchtigt auch die kutane
Mikrozirkulation. Das venöse Blut, welches physiologischerweise beim Gehen unter Einsatz
der Muskelpumpe Richtung Herz gepumpt werden soll, wird nun auf der Grundlage defekter
Venenklappen und evtl. erhöhter Abstromwiderstände nach einem postthrombotischen Ereignis
nach distal gepresst (Partsch 1985). Hahn konnte nachweisen, dass sich die pathologischen
Druckwellen bis in die Kapillaren der Patienten fortleiten und sich diese hämodynamische
Störung bei der CVI hauptsächlich unter Einsatz der Muskel- bzw. Gelenkpumpen zeigt (Hahn
et al. 1998). Die konsekutive ambulatorische Druckerhöhung in den Hautkapillaren hat
wahrscheinlich einen großen Einfluss auf deren pathologische Veränderungen und somit auf
die kutane Mikrozirkulation.
52
In dieser Arbeit konnte der in mehreren Studien aufgezeigte Zusammenhang zwischen dem
CVI-Schweregrad und der Schwere der mikroangiopathischen Veränderungen bestätigt
werden, womit die Mikroangiopathie weiterhin als mögliches Bindeglied zwischen den
Veränderungen im venösen Gefäßsystem und der makroskopischen kutanen Manifestation in
Frage kommt (Franzeck et al. 1984; Partsch 1984; Jeggle 1996). So zeigte sich bei der TcPO2-
Messung am medialen Malleolus bzw. Ulkusrand zwischen den Patienten im Widmer Stadium
II (28,50 mmHg) und III (7,00 mmHg) ein stark signifikanter Unterschied. Diese Werte liegen
weit unter dem Normbereich (50-60 mmHg, (Franzeck 1991; Jünger et al. 1994) ) und decken
sich mit den Messungen zahlreicher anderer Autoren an Patienten verschiedener Schweregrade
in dieser Region (Franzeck et al. 1984; Neumann et al. 1984; Partsch 1984; Creutzig et al.
1987; Mannarino et al. 1988; Leu et al. 1991; Jünger et al. 2000). Auch der Unterschied des
Sauerstoffpartialdruckes in einiger Entfernung vom Ulkus (Messposition 2: Unterschenkel)
zeigte mit medianen Werten von 49,14 mmHg im Stadium II und 26,00 mmHg im Stadium III
eine stark signifikante Abnahme. Da die gemessenen Werte am Unterschenkel bei den Widmer
II Patienten im Bereich klinisch gesunder Haut und bei den Widmer III Patienten am Übergang
von krankhaft affektierter zu gesunder Haut erhoben wurden, können diese Werte als weiteres
Indiz dafür gesehen werden, dass die Mikroangiopathie der Hautdermatose vorausgeht (Jünger
et al. 1999; Steins et al. 1999; Jünger et al. 2000). Die Abhängigkeit des TcPO2 vom
Schweregrad der CVI konnte schon früh u.a. durch Mannarino nachgewiesen werden, der
vermutete, dass die durch venöse Stase hervorgerufene Hypoxie eine wichtige Rolle in der
Pathogenese der Hautläsionen spielt (Mannarino et al. 1988). Bei Untersuchungen des
transkutanen Sauerstoffpartialdruckes proximal des medialen Malleolus an gesunden
Probanden und Patienten verschiedener CVI-Schweregrade fand er eine deutliche Korrelation
zwischen dem TcPO2 und den Widmer Stadien.
Die Ursache für die Hypoxie wurde lange den perikapillären Fibrinmanschetten zugeschrieben,
die für unphysiologische Diffusionsbarrieren gehalten wurden (Burnand et al. 1982). Da mit
zunehmenden Widmer Schweregrad nicht nur die Hypoxie in betroffenen Hautarealen zunahm,
sondern auch die Stärke der Fibrinmanschetten und perikapillären Ablagerungen an
extrazellulärer Matrix, wie auch in dieser Studie gezeigt werden konnte (siehe Kapitel 3.2.2),
schien die Fibrinmanschetten-Hypothese als Ursache für die TcPO2-Abnahme sehr
wahrscheinlich. In zahlreichen späteren Untersuchungen, die u.a. zeigten, dass diese
Fibrinhüllen weder signifikante Mengen an Sauerstoff blocken, noch selber konsumieren,
53
konnte diese Theorie als Hauptursache für die erniedrigten Werte jedoch widerlegt werden
(Cheatle et al. 1990; Michel 1990; Vanscheidt et al. 1993).
Für den Abfall des TcPO2 in Abhängigkeit des CVI-Schweregrades scheint die
Kapillarrarefezierung (sowohl morphologisch als auch funktionell durch Mikrothromben)
verantwortlich zu sein, die in ihrer Ausprägung gut mit der Sauerstoffpartialdruckerniedrigung
kongruiert (Franzeck et al. 1984; Mourad et al. 1989; Hoffmann et al. 1990; Jünger et al.
2000). Die Abnahme der Hautkapillaranzahl führt zu längeren Diffusionsstrecken, welche sich
durch das häufig vorhandene Mikroödem und der Hyperkeratose in der Haut von Patienten
noch weiter vergrößern (Leu et al. 1995). Des Weiteren konnte in kapillarmikroskopischen
Studien gezeigt werden, dass bei Patienten mit CVI je nach Schweregrad Veränderungen in der
Kapillarmorphologie vorliegen, die teilweise auch in klinisch noch gesunder Haut von CVI-
Patienten zu finden waren. In nicht oder nur gering betroffenen Hautarealen zeigten sich die
Kapillaren dilatiert und elongiert bis hin zu korkenzieherförmigen, glomerulumartigen
Formationen in stärker veränderter Haut (Fagrell 1979; Fagrell 1982; Leu et al. 1991; Franzeck
et al. 1993; Jünger et al. 2000). Auch diese Veränderungen wiesen eine direkte Korrelation
zum TcPO2 auf (Franzeck et al. 1984) und sorgen auf Grund der enormen Kapillarelongation
und Glomerulumformation insbesondere in schwerer betroffenen Hautgebieten für eine hohe
Querdiffusion zwischen arteriellen und venösen Schenkeln entlang der Kapillarschlingen
(arterio-venöse Shunts), was die Nutrition der Haut weiterhin verschlechtert (Jünger 1996).
Im Ulkus und Ulkusrandbereich muss zudem ein durch Entzündungs- und Reparaturprozesse
erhöhter Sauerstoffverbrauch berücksichtigt werden (Albrecht et al. 1991). Während die
Ursache für die Rarefizierung und veränderte Morphologie der Kapillaren und Endothelzellen
durch zahlreiche Autoren in dem pathologisch erhöhten venösen bzw. kapillären Druck und
seinem mechanischen Einfluss auf diese Gefäße gesehen wird (Smith 1992; Leu et al. 1995),
vermutete Pascarella jüngst Inflammationsprozesse hinter diesen Veränderungen (Pascarella et
al. 2005). Das solche Prozesse sekundär zu einer Progredienz der Mikroangiopathie führen
können, konnte in mehreren Arbeiten belegt werden (Pappas et al. 1999; Guillet et al. 2001).
Allerdings erklären diese nicht die mikroangiologischen Veränderungen, die in dieser Arbeit
im Bereich des Unterschenkels bei Widmer II und III Patienten festgestellt wurden
(stadienabhängig gesunkener TcPO2 und gestiegener LDF; siehe Kapitel Ergebnisse 3.1). In
diesen Messbezirken klinisch gesunder, aber hämodynamisch geschädigter Haut, konnte Hahn
keine Entzündungszeichen nachweisen (Hahn et al. 1997). Dies spricht für eine primäre
54
mechanische Ursache der Mikroangiopathie, die dann das pathologische Korrelat für sekundäre
Entzündungsprozesse bildet.
Für diese Theorie sprechen auch die gemessenen LDF-Werte dieser Arbeit. Bei diesen fand
sich bereits bei den Messungen am Unterschenkel bei Widmer II (8,20 AU) und III (30,60 AU)
Patienten eine Zunahme des LDF im Vergleich zur gesunden Oberschenkelhaut dieser
Patienten. Der Flux-Anstieg war hierbei im Vergleich zwischen beiden Patientengruppen in der
Widmer III Gruppe signifikant größer. Im Bereich stärker geschädigter Haut (Ulkusrand bzw.
medialer Malleolus) fanden wir einen nochmals erhöhten Flux, der wiederum in der Widmer
III Gruppe (45,90 AU) stark signifikant größer war als in der Widmer II Gruppe (7,00 AU).
Diese, in Abhängigkeit vom Schweregrad erhöhten Fluxwerte, wurden auch in der Literatur
beschrieben (Partsch 1984; Sindrup et al. 1987; Cheatle et al. 1991; Leu et al. 1991; Mayrovitz
et al. 1994; Jeggle 1996) und spiegeln die Entdeckungen von Partsch wieder, der neben stark
reduzierten TcPO2 Werten im Ulkus Ruhefluxwerte feststellte, die den Messwerten von
gesunden Probanden unter maximaler Vasodilatation gleichkamen (Partsch 1984). Das
Missverhältnis zwischen vermehrter Perfusion und verminderter Oxygenierung beschrieb er
treffend als „hyperämische Hypoxie“, die auch bei den Patienten dieser Arbeit mit
zunehmendem Schweregrad der Erkrankung und kutanen Läsionen zu einer ineffektiven,
verschlechterten kutanen nutritiven Perfusion führte. Über die in Richtung medialen Malleolus
zunehmende „high flow hypoxia“ kann es durch die somit mangelnde nutritive Versorgung der
betroffenen Hautstellen direkt oder über andersweitige Mechanismen zum Gewebsuntergang
(Ulkus cruris) kommen.
Als Ursache für die erhöhten LDF-Werte im Krankheitsverlauf wird die entzündlich bedingte
Mehrdurchblutung („Hypodermitis“) und die Stauung des Hautplexus gesehen. Das konnte
auch in dieser Arbeit beeindruckend gezeigt werden, da mit zunehmender Nähe zum
Ulkus/medialen Malleolus, und somit zunehmender Entzündungsaktivität (Hahn et al. 1997),
der LDF gruppenabhängig stark anstieg. Auch beim Vergleich zwischen beiden Widmer
Gruppen fand sich an gleichen Messpositionen dieser Anstieg der Fluxwerte, welcher auf eine
erhöhte Entzündungsaktivität und verschlechterte mikroangiologische Situation bei Widmer III
Patienten schließen lässt. Allerdings fand sich in beiden Patientengruppen bereits am
Unterschenkel ein Anstieg des Ruhefluxes (wenngleich im Widmer Stadium II das
Signifikanzniveau verfehlt wird), was darauf hindeutet, dass auch bei diesem
mikroangiologischen Parameter primär eine mechanische Komponente die Ursache für die
55
gezeigten Veränderungen darstellt. In Frage kommen hier die mechanische Dilatation und
Elongation der Kapillaren (Chittenden et al. 1992; Malanin et al. 2004) oder eine
druckabhängige Öffnung von arteriovenösen Shunts, die in gesunder Haut unter normalen
Bedingungen nicht perfundiert werden (Schmidt et al. 1980; Schalin 1981; Reikeras et al.
1983). Auch die bei CVI-Patienten verschlechterte posturale Vasokonstriktion, die durch einige
Autoren auf den erhöhten venösen Druck zurückgeführt wird, führt wegen der abgeschwächten
präkapillären Konstriktion der Arteriolen zur Hyperperfusion der Hautkapillaren (Jünger et al.
1996; Bollinger et al. 1997).
Bei der Betrachtung der LDF Werte soll noch erwähnt sein, dass diese zu 90 % die
thermoregulative Perfusion der Haut repräsentieren, welche demzufolge von der
Mikroangiopathie mitbetroffen ist und so die regelmäßig zu messenden erhöhten Temperaturen
in der Haut von Ulkuspatienten miterklären kann (Schalin 1981; Leu et al. 1995). Die
Beurteilung der nutritiven kutanen Perfusion mittels LDFmetrie ist daher nur sehr begrenzt
möglich. Hierfür eignet sich die transkutane Sauerstoffpartialdruckmessung besser bzw. die
Kombination aus beiden Messverfahren, wie sie in unserer Arbeit benutzt wurde (Fagrell
1984).
Betrachtet man die mikroangiologischen Ergebnisse der Oberschenkelhaut (LDF: Widmer II
4,80 AU, Widmer III 8,50 AU; TcPO2: Widmer II 56,77 mmHg, Widmer III 55.00 mmHg),
stellt man fest, dass es hier keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Widmer
Gruppen gibt und diese Werte denen von gesunden Probanden entsprechen (Jünger et al.
2000). Diese Region ist von der ambulatorisch venösen Hypertonie auf Grund ihrer Lage
anscheinend nicht mehr betroffen. Es ist zwar möglich, dass defekte Venenklappen auch
oberhalb dieser Messareale lokalisiert sind, dies scheint jedoch keinen wesentlichen Einfluss
auf die Mikrozirkulation in den Kapillaren am Oberschenkel zu haben (unter anderem hier kein
Einfluss d. Wadenmuskelpumpe, Zunahme des hämodynamischen Druckes bei defekten
Klappen vor allem nach distal). Trotz das auch in jüngster Zeit immer wieder systemische
Komponenten für die Entstehung der CVI verantwortlich gemacht werden (Vanscheidt et al.
1992; Takase et al. 1999; Nicolaides 2005), sprechen diese Ergebnisse neben anderen Studien
(Pappas et al. 1995; Hahn et al. 1997; Peschen et al. 1999) gegen eine solche Genese.
Die Methode der Laser-Doppler-Fluxmetrie unterliegt teilweise großen interindividuellen
Schwankungen, die einen direkten Vergleich absoluter LDF-Werte schwierig machen können.
56
Dennoch ist sie ein häufig verwendetes Verfahren, da sie bei nicht-invasivem Vorgehen eine
gute Korrelation zu invasiven Methoden (z.B. Xenon-Clearance, Wärme-Clearance) aufwies
(Hopkins et al. 1983; Hoffman et al. 1992). Intraindividuelle Schwankungen, die bei der LDF-
Metrie bei Messungen zu verschiedenen Zeitpunkten auftreten können, haben wir durch
gleichzeitige Messung von jeweils 2 Messpunkten minimieren können.
Die TcPO2-Messwerte lassen eine bessere inter- und intraindividuelle Vergleichbarkeit zu.
Leicht abweichende Ergebnisse im Vergleich zu anderen Studien können durch unterschiedlich
Messgeräte, -temperaturen und -lokalisationen bedingt sein (Franzeck et al. 1984). Zu
bedenken ist auch, dass bei Patienten mit CVI normale und schwer geschädigte Hautareale
unmittelbar nebeneinander liegen können, was u.a. die große interindividuelle Streuung der
transkutanen Sauerstoffpartialdrücke an den Messpositionen 2 (Unterschenkel) und 3
(Ulkusrand, medialer Malleolus) erklärt (Bollinger et al. 1990).
57
4.3 Extrazelluläre Matrixmoleküle Die kutane Wundheilung ist ein komplexer biologischer Vorgang, bei dem ein geordnetes
Zusammenspiel von Zellen und der sie umgebenden extrazellulären Matrix von höchster
Bedeutung ist. Sie durchläuft auf ihrem Weg mehrere Phasen (Hämostase – Inflammation –
Granulationsgewebebildung – Epithelisierung – Narbenbildung), welche durch eine bestimmte
zeitliche und räumliche Verteilung der ECM-Moleküle charakterisiert sind. Über Zell-Matrix-
Kontakte stehen die Zellen in Kontakt mit Ihrer Umwelt und erhalten von ihr Signale, die viele
Zellfunktionen beeinflussen können und so zu einer kontrollierten Wundheilung beitragen
(Eming et al. 2000). Bei Patienten mit chronischer venöser Insuffizienz wurden in der
Vergangenheit in erkrankten Hautarealen und im Ulkus für verschiedene Moleküle teilweise
stark veränderte Expressionsmuster in der ECM gefunden. Diese können nicht nur Prozesse
wie die der Wundheilung negativ beeinflussen und zur Chronifizierung führen, sondern auch
an der Entstehung der klinischen Zeichen in der Haut bei Patienten mit CVI beteiligt sein. Wir
haben in dieser Arbeit die Verteilung der ECM-Moleküle Tenascin, Fibronektin, Kollagen I
und IV bei Patienten mit chronischer venöser Insuffizienz immunhistochemisch untersucht, da
diese eine besondere Bedeutung im Hinblick auf die Entwicklung dieser Krankheit zu haben
scheinen.
Die Verteilung der in dieser Arbeit untersuchten ECM-Moleküle in der Oberschenkelhaut war
bei Patienten im Widmer Stadium II und III identisch und entsprach der Verteilung dieser
Moleküle in gesunder Haut (Mackie et al. 1988; Raghow 1994; Latijnhouwers et al. 1996;
Pankov et al. 2002; Gelse et al. 2003). Vergleichbare Studien, in der die Verteilung der ECM-
Moleküle in klinisch und mikroangiologisch gesunder Haut bei Patienten mit CVI untersucht
wurden, liegen nach heutigem Erkenntnisstand nicht vor. Die durch verschiedene
Arbeitsgruppen vermutete systemische Entzündung, die hinter der Entstehung der chronisch
venösen Insuffizienz stehen soll, scheint somit, insbesondere in Kombination mit den im
physiologischen Bereich liegenden mikroangiologischen Parametern beider Patientengruppen
im Oberschenkelbereich, nicht vorzuliegen (Jünger et al. 1991). Entzündliche Aktivität oder
eine vermehrte Anheftung von Leukozyten an das Endothel führt, vor allem durch die daraus
resultierende Freisetzung von Zytokinen, Wachstumsfaktoren und Proteasen, zu einem Umbau
der ECM, welche sich in veränderten Mustern in den von uns untersuchten Molekülen
niedergeschlagen hätte (Raghow 1994; Parks 1999; Yager et al. 1999). Die Homöostase, die in
der ECM physiologischerweise zwischen Auf- und Abbau ihrer Moleküle herrscht, scheint in
der immunhistochemisch untersuchten Haut des Oberschenkels jedoch nicht gestört zu sein.
58
Erste Veränderungen in den Expressionsmustern für Tenascin und Fibronektin fanden sich in
der Unterschenkelhaut und waren im Ulkusrandbereich/medialem Malleolus noch deutlicher.
Die Zunahme der Expression von Tenascin und Veränderung der Verteilung von Fibronektin
im Ulkusrandbereich/medialem Malleolus im Vergleich zu gesunder Haut in beiden Widmer
Gruppen entsprach früheren Studien anderer Autoren (Latijnhouwers et al. 1996; Schild 2001).
Eine vermehrte Expression dieser beiden Matrixmoleküle konnte man ebenfalls während der
physiologischen Frühreaktion auf verwundeter Haut beobachten (Mackie et al. 1988;
Latijnhouwers et al. 1996). Tenascin und Fibronektin haben wichtige Funktionen hinsichtlich
der Anheftung, Abheftung und Migration von Zellen und sorgen für einen kontrollierten
Ablauf der Reepithelisierung. Im Verlauf der physiologischen Wundheilung sorgen Zytokine
(v.a. TGF-beta, IL-4, TNF-alpha), die teilweise aus Thrombozyten, teilweise aus Leukozyten
stammen, nicht nur für einen massiven Influx von inflammatorischen Phagozyten
(Chemotaxis), sondern auch für eine erhöhte Produktion dieser ECM-Moleküle in Fibroblasten
(Raghow 1994). Diese stellen für Entzündungszellen wie Makrophagen eine provisorische
Matrix dar, um zielgerichtet in das Blutgerinnsel zu migrieren und dieses abzubauen und
fungieren zudem als Matrix für die Fibroblastenmigration durch das Wundbett und die
Keratinozytenmigration vom Wundrand her über die Wunde (Kim et al. 1992). Gleichzeitig
sorgen Proteasen, wie die MMPs, für ein geordnetes Zusammenspiel zwischen Auf- und Abbau
der Matrix in den einzelnen Wundheilungsphasen und fördern so z.B. die zielgerichtete
Migration von Zellen. Zytokine, wie TGF-alpha (produziert von Keratinozyten, Fibroblasten
und Makrophagen) und TGF-beta (produziert u.a. von Keratinozyten, Fibroblasten,
Endothelzellen, Makrophagen und glatten Muskelzellen), führen außerdem zur Expression von
verschiedenen Integrinen, die von den Keratinozyten, Endothelzellen und anderen Zellen für
die Migration benötigt werden (Tamariz-Dominguez et al. 2002). Die durch uns festgestellte
Hochregulierung von Tenascin und Fibronektin wird durch die Entdeckung bestärkt, dass bei
Patienten mit Ulcus cruris und Dermatoliposklerose die Hochregulierung des
endothelgebundenen Integrin-Rezeptors VLA-4 nachgewiesen werden konnte, welcher
Fibronektin als Liganden besitzt (Ruiter et al. 1993; Haapasalmi et al. 1995). Nach Abheilung
einer Wunde werden diese ECM-Moleküle und Rezeptoren wieder herabreguliert und durch
persistierende ECM-Moleküle, im wesentlichen Kollagen I, ersetzt (Eming et al. 2000).
Die Ergebnisse in dieser Arbeit zeigen, dass dieser Mechanismus bei Patienten mit CVI gestört
zu sein scheint. In mehreren Studien konnte mittels PCR und anderer quantitativer Verfahren in
59
klinisch veränderter Haut von CVI-Patienten nachgewiesen werden, dass neben einer
Hochregulierung der ECM-Moleküle auch eine signifikante Zunahme der proteolytischen
Aktivität vorhanden ist. Diese Veränderungen zeigten sich nicht nur in
lipodermatosklerotischer Haut, sondern vor allem im Ulcus cruris venosum und seinem
Exsudat (Palolahti et al. 1993; Weckroth et al. 1996; Herouy et al. 1999). Die anabolen und
katabolen Prozesse in der ECM laufen somit nicht mehr geordnet ab, sondern sind dysreguliert.
Diese proteolytische Aktivität konnte in dieser Arbeit anhand der Abnahme des Fibronektins
im Bereich der papillären Dermis und seiner zunehmenden Fragmentierung in der tieferen
Dermis gezeigt werden. Dabei fiel auf, dass die Fn-Fragmentierung im Ulkusrandbereich
(Widmer III) stärker als am medialen Malleolus (Widmer II) war, was eine höhere
proteolytische Aktivität in diesem Bereich vermuten lässt. Bestätigt wird diese Vermutung
durch mehrere Arbeitsgruppen, die in ihren Arbeiten erhöhte MMP-Aktivitäten (mit
Substratspezifitäten u.a. für Kollagen I, IV und Fibronektin) und verringerte TIMP-Aktivitäten
in lipodermatosklerotischer Haut gefunden haben, ein Ungleichgewicht, welches sich am
Ulkusrand und im Ulkusexsudat noch ausgeprägter zeigte (Vaalamo et al. 1996; Vaalamo et al.
1999; Herouy et al. 2000; Fray et al. 2003).
Da die Fn-Fragmente wahrscheinlich für die Keratinozyten keine adäquate Matrix für die
Migration mehr darstellen (gestörte Adhäsion), kommt es zu einer verlangsamten
Epithelisierung und somit verschlechterten Heilung des Ulkus. Diese Hypothese konnte durch
verschiedene Studien untermauert werden, in denen durch topische Zugabe von intaktem
Fibronektin oder vor allem durch Inhibierung der Proteasen-Aktivität mittels Aprotinin eine
verbesserte Heilung der Ulzera erreicht werden konnte (Pospisilova et al. 1986; Wysocki et al.
1988). Des Weiteren wurde u.a. durch Herrick nachgewiesen, dass direkt im Ulkus intaktes
Fibronektin weitestgehend fehlt und die Proteasen-Aktivität des Ulkus-Exsudates in der Lage
ist, zugesetztes intaktes Fibronektin als auch Tenascin schnell zu zersetzen (Herrick et al. 1992;
Palolahti et al. 1993; Yager et al. 1999). Da Fn-Fragmente darüber hinaus chemotaktisch
wirksam sind, die Degranulierung von Granulozyten fördern und zudem selber proteolytische
Aktivität triggern (MMPs↑, uPA↑), ist anzunehmen, dass diese Prozesse sich teilweise selbst
unterhalten und so zum Gewebeuntergang mit Störung der Keratinozytenmigration führen
(Wachtfogel et al. 1988; Gailit et al. 1994).
Intaktes Fibronektin ist zudem in der Lage, insbesondere denaturiertes Kollagen (=Gelatin)
und Fibrin zu binden (Pankov et al. 2002). Durch diese Verbindungen wird es Makrophagen
60
möglich, diese Bestandteile zu phagozytieren und zu beseitigen (Kollagen/Gelatin-Clearance).
Zersetztes Fibronektin kann dies nicht mehr gewährleisten, was die Clearance von Fibrin, aber
auch Gelatinen, in Gegenden mit hoher proteolytischer Aktivität evtl. verschlechtert (Pankov
et al. 2002). Diese Vermutung deckt sich mit Studienergebnissen aus der Vergangenheit, dass
die Dicke von Fibrinmanschetten um Blutgefäße, die neben Fibrin auch Kollagene enthalten,
mit steigendem CVI-Schweregrad zunimmt, was die mögliche Folge einer Abbau- bzw.
Abtransportstörung sein könnte (Burnand et al. 1982; Leu et al. 1995). Auch in unserer Arbeit
kam es stadienabhängig zu einer Zunahme der ECM-Moleküle im perivaskulären Bereich. Dies
könnte daher neben der vermehrten Expression auch auf eine Abtransportstörung
zurückzuführen sein (siehe Kapitel 4.4).
Tenascin, welches bei unseren Patienten in beiden Widmer Stadien am Unterschenkel und
Ulkusrand/medialem Malleolus einer Hochregulierung unterlag, spielt ebenfalls für die
Zellmigration eine wichtige Rolle (Gailit et al. 1994; Jones et al. 2000). Dabei war es in
mehreren Studien von Lightner in vitro alleine nicht in der Lage, Keratozytenmigration
hervorzurufen, konnte dafür aber die Migration dieser Zellen auf permissiven Substraten (Fn,
Col IV) fördern (Kaplony et al. 1991; Lightner 1994). Bei Arbeiten von Kanno, Chiquet-
Ehrismann und Lotz zeigte sich sowohl in vitro als auch in vivo, dass Tenascin einerseits die
Integrin-vermittelte Anheftung von Zellen (Fibroblasten, Keratinozyten) an Fibronektin und
Laminin inhibiert und andernseits die Kraft dieser Matrix-Zell-Adhäsion vermindert (Chiquet-
Ehrismann et al. 1988; Lotz et al. 1989; Kanno et al. 1994). Dies führt laut Vermutung dieser
Arbeitsgruppen zu einer reduzierten Zell-Adhäsion an Fibronektin und ermöglicht diesen
Zellen so zu migrieren, da der Migrationsprozess ein ständiges An- und Abheften von der
Matrix erfordert.
Des Weiteren wurde in mehreren in vivo Studien und Arbeiten mit Gewebekulturen
herausgefunden, dass das Vorhandensein von Tenascin mit der Zellproliferation von
Keratinozyten korreliert (Mackie 1994; Jones et al. 2000). Dies führte zu Spekulationen
darüber, ob dieses Molekül als Wachstumsfaktor fungieren kann. Beweisend hierfür existieren
zahlreiche Studien, die eine fördernde Wirkung von Tenascin auf das Wachstum verschiedener
Zelltypen (z.B. humane Keratinozyten, Endothelzellen) belegen (Chiquet-Ehrismann et al.
1988; Engel 1989; End et al. 1992; Jones et al. 1996; Seiffert et al. 1998; Matsuda et al. 1999).
Allerdings existieren auch Studien, die einen hemmenden Effekt dieses Moleküls auf die
Zellproliferation von humanen Keratinozyten, dermalen Fibroblasten und neuronalen Zellen
61
zeigen (End et al. 1992; Lightner 1994; Probstmeier et al. 1999). Das lässt es für möglich
erscheinen, das Tenascin eine Art Wachstumskontrolle für die Zellen darstellt und somit
Geweben ermöglicht, eine Homöostase nach einer Wachstumsphase zu erreichen.
Auch unsere Studie zeigte in beiden Widmer Gruppen am Unterschenkel und Ulkus/medialem
Malleolus ein zunehmendes Vorhandensein von Tenascin unterhalb der epidermalen
Basalmembran. Zudem konnten wir bei vielen Patienten, insbesondere am Ulkusrand, eine
Akanthose (nummerische Hypertrophie) feststellen, was auf eine erhöhte proliferative Tätigkeit
in der dem Ulkus angrenzenden Epidermis schließen lässt. Diese wurde in einer
immunhistochemischen Arbeit, die den Proliferationsmarker Ki-67 verwendete, bestätigt
(Latijnhouwers et al. 1996). Somit scheint es möglich, dass Tenascin eine Rolle als
Wachstums- bzw. Proliferationsregulator spielt. Andere Autoren vermuten eher eine
Ausschüttung von Zytokinen durch proliferierende Keratinozyten (TNF-alpha, TGF-beta, IL-
1), die wiederum die Tenascin Expression fördern (Tucker et al. 1993; Rettig et al. 1994). In
Anbetracht der Tatsache, dass wir auch im Ulkusrandbereich unter der epidermalen BM eine
starke Zunahme der Tenascin Expression gefunden haben, kann angenommen werden, dass die
Proliferation der Zellen im Ulkusrand nicht gestört ist, sondern eine Störung bei der Migration
dieser Zellen vorliegt, was die Wundheilung verhindert.
Eine weitere wichtige Entdeckung wurde durch Riva und Paganelli gemacht, die feststellten,
dass radioaktiv-markierte Anti-TN-C-Antikörper in der Lage sind, eine Regression von frühen
und fortgeschrittenen Gliomen, die hohe Level an TN-C im Stroma produzieren, zu induzieren
(Paganelli et al. 1999; Riva et al. 1999). Weitere Studien belegen, dass TN-C daher wohl als
eine Art Überlebensfaktor gesehen werden kann, da auch in diesen Arbeiten die Behandlung
von glatten Gefäßmuskelzellkulturen mit TN-C entgegengerichteten Oligonukleotiden das
Wachstum dieser Zellen unterdrückte und Apoptose hervorrief (Cleek et al. 1997; Cowan et al.
2000). Dies könnte auch eine Erklärung dafür sein, warum die Expression von Tenascin in
unserer Arbeit bereits bei Patienten im Widmer Stadium II mit klinisch gesunder
Unterschenkelhaut gesteigert war. Durch die (negativen) Veränderungen in der Umgebung der
Zellen, insbesondere im mikroangiologischen Bereich, erscheint es möglich, dass dieses
Molekül bereits hier eine Art Überlebensfaktor für diese darstellt.
Das fibröse Rückgrat der extrazellulären Matrix wird durch die Kollagene gebildet (Vuorio et
al. 1990). Das gilt insbesondere für das Kollagen I, welches zu den fibrillären Kollagenen zählt
62
und universaler Bestandteil der gesunden Haut ist (Brand-Saberi et al. 1995). Während es bei
Patienten im Widmer Stadium II in gesunder Unterschenkelhaut noch zu keinen
Veränderungen in der Expression dieses Moleküls kam, zeigten sich bei den Patienten im
Stadium III bereits erste Störungen in der Expression und Ausrichtung der Kollagenfasern. Vor
allem in der retikulären Dermis fand sich teilweise eine vermehrte Expression von Kollagen I,
wobei die kollagenen Fasern langsam ihre normale Ausrichtung verloren und ein diffuseres
Bild aufzeigten. Diese Veränderungsprozesse weisen starke Ähnlichkeiten zu denen bei
Patienten mit lipodermatosklerotischer Haut auf (Herouy et al. 1999). Am medialen Malleolus
bei Widmer II- und in der Ulkusrandregion bei Widmer III Patienten zeigten sich diese
Veränderungen noch deutlicher. Das Vorhandensein von Kollagen I nahm in der papillären
Dermis unterhalb der epidermalen Basalmembran im Vergleich zur Oberschenkelhaut ab und
in der retikulären Dermis zu, während die Ausrichtung der Fasern in dieser Schicht eher diffus
erschien (im Widmer Stadium III deutlicher und häufiger sichtbar als im Widmer Stadium II).
Ein Ergebnis, welches weitestgehend mit früheren Studien an Patienten mit CVI in
verschiedenen Stadien übereinstimmt (Herouy et al. 1999; Schild 2001).
Kollagen I besitzt eine Schlüsselrolle in der Aktivierung der Kollagenase-Produktion
(insbesondere MMP-1) durch Keratinozyten. Dieses Enzym spaltet das Kollagen zu Gelatin
und hilft der Zelle so, sich von der dermalen Matrix zu trennen und eine optimale Bewegung
über die dermale und provisorische Matrix zu erreichen (Sudbeck et al. 1994; Pilcher et al.
1997). Die These der Kollagenase-Produktion (MMP-1) durch Keratinozyten passt zu der
Beobachtung in dieser Arbeit, dass in der papillären Dermis unterhalb der epidermalen
Basalmembran eine Abnahme an Kollagen I in der krankhaft veränderten Haut zu beobachten
war. Die Neuausrichtung der Fasern in der tieferen Dermis, die im Widmer Stadium III am
deutlichsten zu beobachten war, zeigt darüber hinaus einen Zusammenhang zur vermehrten
Ausschüttung von uPA und Plasminogen im Ulkusbereich auf, welche nicht nur die Expression
von Kollagenen steigern, sondern auch für eine erhöhte proteolytische Aktivität, z.B. durch
Aktivierung von Plasminogen und MMP2 (Substratspezifität u.a. für Kollagen I), sorgen
(Peschen 1999; Peschen et al. 2000; Pascarella et al. 2005). Auch hier bestätigt sich anhand
unserer Ergebnisse die Vermutung anderer Arbeitsgruppen, dass die proteolytische Aktivität
im Ulkus- bzw. Ulkusrandbereich am stärksten ist (Herouy et al. 2000). Der Ab- und Aufbau
der extrazellulären Matrix im Rahmen der Wundheilung scheint bei der CVI auf ein höheres
Maß übersteuert zu sein, d.h. es werden zwar vermehrt ECM-Moleküle synthetisiert, dafür aber
63
auch durch eine erhöhte Aktivität von Proteasen wieder abgebaut. Ein Prozess, der eine
geordnete Wundheilung verzögert bzw. unmöglich werden lässt.
Eine weitere Ursache für die vermehrte Expression der durch uns untersuchten ECM-Moleküle
könnte auch in dem gesteigerten Abbau des Kollagens zu finden sein. Dieses Molekül besitzt
die Fähigkeit, Wachstumsfaktoren und Zytokine (IGF-I, IGF-II, TGF-beta) zu binden
(Yamaguchi et al. 1990; Gelse et al. 2003). Ein Abbau des Kollagens durch den Einfluss
diverser Proteasen hätte die Freisetzung dieser GFs zur Folge und würde die Synthese von
Matrixmolekülen steigern. Das es am Ulkusrand und im Ulkusexsudat nicht an
Wachstumsfaktoren mangelt, konnte unter anderem durch Tarnuzzer, Pappas und Lagattolla
gezeigt werden (Lagattolla et al. 1995; Tarnuzzer et al. 1997; Pappas et al. 1999). Allerdings
stellen neuere Studien in Frage, ob die GFs oder Ihre Rezeptoren in diesem Umfeld überhaupt
aktiv sind, oder durch die enorme Proteasen-Aktivität inaktiviert wurden (Lagattolla et al.
1995; Agren et al. 2000; Fray et al. 2003).
Kollagen IV, welches durch seine nicht-kollagenen Domänen eine wesentlich flexiblere
Struktur als Kollagen I besitzt, ist als essenzielles Netzwerk in den meisten embryologischen
und adulten Basalmembranen zu finden. Über Integrine ist auch dieses Molekül in der Lage,
eine Anheftung an Zellen zu vermitteln und Zellfunktionen zu modulieren (Kim et al. 1994).
Dazu zählen neben dem proliferativen Potenzial auch die Fähigkeit, die Migration von Zellen
zu fördern (Kim et al. 1994; Legrand et al. 1999; Tamariz-Dominguez et al. 2002). Diese
Tatsache gibt eine Erklärung für den durch uns beobachteten Anstieg der Kollagen IV
Expression in Basalmembranen bei Patienten mit CVI. Insbesondere im Bereich des medialen
Malleolus (Widmer Stadium II) und des Ulkusrandes (Widmer Stadium III) war diese
besonders ausgeprägt. Zwar beobachtete man auch bei der Heilung akuter Wunden eine
vermehrte Expression des Kollagen IV in den Basalmembranen, diese persistierte allerdings
weniger lange als bei CVI Patienten (Tamariz-Dominguez et al. 2002).
Bei der immunhistochemischen Färbung der Haut auf Kollagen IV fiel uns zudem
hauptsächlich bei den Schnitten des Ulkusrandes des Öfteren eine „wolkenhafte“ Anfärbung
des Stratum papillare auf. Auch Schild konnte in seiner immunfluoreszenzhistochemischen
Studie in dieser Untersuchungsregion ein ähnliches Färbemuster für Kollagen IV bei Patienten
im Widmer Stadium II und III beobachten (Schild 2001). Dieses, in beiden Widmer Stadien
vor allem in gefäßreichen Schnitten vorgefundene Phänomen, könnte eine unspezifische
Färbung darstellen. Wahrscheinlicher scheint aber, wie auch von Schild postuliert, dass es sich
64
hierbei um persistierende Epitope des Kollagen IV nach proteolytischer Zersetzung handelt, da
dieses Muster nicht in der Ober- und Unterschenkelhaut beider Patientengruppen gefunden
wurde. Möglich ist dies durch die Eigenschaft von Kollagen IV, andere BM-Moleküle, wie
Entactin, Laminin oder Heparansulfat-Proteoglykane zu binden und damit Bestandteil eines
Geflechtes zu sein, in welchem seine Fragmente trotz des Abbaus verbleiben können (Schild
2001). Dies wäre darüber hinaus im Einklang mit der erhöhten Proteasen-Aktivität in diesen
Regionen bei den Widmer Stadien II und III (Herouy et al. 1999; Agren et al. 2000).
Interessanterweise zeigte neben der Hochregulierung des Tenascin auch das Kollagen IV bei
der Hälfte der Widmer II Patienten eine vermehrte Expression in den Basalmembranen klinisch
gesunder Haut am Unterschenkel. Da Kollagen IV der Basallamina die nötige Flexibilität und
Widerstandsfähigkeit verleiht, erscheint es möglich, dass die Hochregulierung in der
Unterschenkelhaut eine Anpassungsreaktion auf die veränderte Mikroumgebung (siehe Kapitel
4.4) darstellt.
Das durch uns verwendete immunhistochemische Verfahren ist ein etabliertes Verfahren und
wird seit vielen Jahren erfolgreich eingesetzt. Da das Ergebnis der Immunhistochemie
insbesondere durch Einbettungsmethoden, Fixierungsart und Fixierungsdauer beeinflussbar ist,
wurden alle Biopsien unter gleichen Bedingungen fixiert, nachbehandelt und eingebettet. Die
Antigen-Antikörper-Reaktion ist im Wesentlichen von der Temperatur, Konzentration,
Inkubationszeit und dem Reaktionsmilieu (z.B. ph-Wert) abhängig, weswegen die
immunhistochemischen Färbungen nach einem standardisierten Protokoll durchgeführt
wurden. Bei allen Präparaten wurde die gleiche Schnittdicke verwendet. Die für die
Immunhistochemie verwendeten Chemikalien stammten immer von denselben Herstellern.
Trotz regelmäßiger Prüfung und Eichung der Messinstrumente können geringe Abweichungen
bzw. Messfehler (z.B. bei Mikropipetten, Waage usw.) nicht ausgeschlossen werden, die einen
systematischen Fehler nach sich ziehen würden.
Um noch genauere Aussagen über die Quantität der extrazellulären Matrixmoleküle bei
Patienten mit CVI in verschiedenen Hautarealen zu bekommen, ist die Durchführung einer
Polymerase-Chain-Reaction (PCR) auf Protein und mRNA für zukünftige Studien zu
empfehlen.
65
4.4 Auswirkungen der Mikroangiopathie auf die Expression der ECM-Moleküle In dieser Arbeit konnte bei immunhistochemischen Untersuchungen gezeigt werden, dass es
bei Patienten mit CVI in den Widmer Stadien II und III zu Veränderungen in der Expression
der ECM-Moleküle kommt. Während alle untersuchten Matrixmoleküle in der
Oberschenkelhaut beider Patientengruppen eine Verteilung zeigten, die der von gesunder Haut
entsprach, kam es bereits in der Unterschenkelhaut stadienabhängig zu einer vermehrten
Expression von Kollagen I, IV, Tenascin und Fibronektin, die sich im Malleolus- bzw.
Ulkusbereich weiter steigerte. In gleichen Untersuchungsregionen war diese Zunahme bei
Widmer III Patienten intensiver als bei den Widmer II Patienten. Die ECM-Moleküle Kollagen
I und Fibronektin veränderten zudem, wahrscheinlich unter dem Einfluss stärker werdender
proteolytischer Aktivität, auch den Aufbau bzw. die Ausrichtung ihrer Fasern.
Doch was führt nun bei Patienten mit chronischer venöser Insuffizienz zu einer vermehrten
Expression dieser Matrixmoleküle?
Betrachtet man die Veränderungen des transkutanen Sauerstoffpartialdruckes und der Laser-
Doppler-Fluxmetrie an den Biopsiestellen, kann ein Zusammenhang zwischen der
Mikroangiopathie und der Expression der extrazellulären Matrixmoleküle hergestellt werden.
Am Oberschenkel konnte bei beiden Patientengruppen keine Mikroangiopathie nachgewiesen
werden. Auch die Matrixmoleküle zeigten hier eine Verteilung, wie sie in der Literatur in
gesunder Haut beschrieben wurde. Am Unterschenkel der Widmer II Patienten, wo eine (nicht
signifikante) Veränderung von LDF (↑) und TcPO2 (↓) zu sehen war und somit mutmaßlich
eine Verschlechterung der nutritiven Versorgung der Haut eingetreten ist, konnte bei vielen
Patienten eine vermehrte Expression von Kollagen IV und Tenascin gefunden werden. In der
Unterschenkelhaut der Widmer III Patienten waren die mikroangiologischen Veränderungen
noch stärker und somit die Nutrition der Haut noch schlechter, während sich hier in allen
untersuchten Matrixmolekülen eine Veränderung zeigte. Am medialen Malleolus bzw.
Ulkusrand zeigten sich bei beiden Patientengruppen die geringsten transkutanen
Sauerstoffpartialdrücke und die höchsten Ruhefluxwerte, wobei parallel dazu die
Expressionszunahme der ECM-Moleküle hier am Größten war. Ob nun die Zunahme der
Mikroangiopathie bzw. die daraus resultierende Verschlechterung der nutritiven Versorgung zu
der Veränderung der ECM-Moleküle beiträgt, bedarf einer genaueren Betrachtung:
66
Die Produktion der Matrixmoleküle erfolgt in der Haut zum Großteil in Fibroblasten (Koll I,
Fn, Tn), in Endothelzellen (Kol IV, Fn) und Keratinozyten (Kol IV, Tn). Eine Ausnahme bildet
das flüssige Fibronektin, welches im Blut zirkuliert und durch die Hepatozyten gebildet wird.
Einen großen Einfluß auf die Steuerung der Expression in der Haut haben Zytokine und
Wachstumsfaktoren. Hier existieren zahlreiche Studien, die eine Induktion der ECM-
Molekülexpression durch diese nachweisen konnten (z.B. Induktion der Tn-Expression in
Fibroblasten durch TGF-beta, PDGF-BB, bFGF, TNF-alpha; Induktion der Fn- und Kol-I-
Expression in Fibroblasten durch TGF-beta) (Tucker et al. 1993; Rettig et al. 1994; Tamariz-
Dominguez et al. 2002). Der Wachstumsfaktor TGF-beta wird auch als Prototyp-Zytokin für
die Entstehung der Gewebefibrose bezeichnet (Pappas et al. 1999). Ein Großteil dieser
Faktoren wird vor allem durch Thrombozyten und diverse Entzündungszellen, wie
Makrophagen oder Leukozyten, ausgeschüttet (Gailit et al. 1994; Raghow 1994). Dies würde
die vermehrte Expression der untersuchten ECM-Moleküle im Bereich des medialen Malleolus
und des Ulkusrandes erklären. In beiden Widmer Stadien konnte durch mehrere
Arbeitsgruppen mittels Immunhistochemie in diesen Regionen eine erhöhte
Entzündungsaktivität und verstärkte Aktivierung des Gefäßendothels nachgewiesen werden
(Loots et al. 1998; Peschen et al. 1999). Vor allem am Ulkusrand konnte von Hahn eine starke
Infiltration insbesondere der papillären Dermis mit Makrophagen, T-Lymphozyten und
Mastzellen gefunden werden (Hahn 1998). Diese Ergebnisse wurden in Arbeiten von Loots
und Abd-El-Aleem bestätigt (Loots et al. 1998; Abd-El-Aleem et al. 2005). Insgesamt lässt
sich aus diesen Ergebnissen auf eine erhöhte Freisetzung von GFs und Zytokinen am medialen
Malleolus und Ulkusrand schließen, die an einer vermehrten Expression der ECM-Moleküle
beteiligt sein könnten.
Allerdings scheint die entzündliche Aktivität nicht die einzige Ursache für die veränderte
Expression der Matrixmoleküle zu sein, da im Bereich klinisch gesunder Haut des Widmer
Stadiums II zwar eine vermehrte Expression von Tn und Kol IV vorliegt, aber keine
entzündliche Aktivität. Das war das Ergebnis einer Studie von Hahn, der in klinisch gesunder,
aber mikroangiologisch bereits geschädigter Haut bei CVI Patienten mit Ulkus weder eine
verstärkte Expression der endothelialen Adhäsionsmoleküle, noch eine generelle Infiltration
oder Entzündungsreaktion beobachtete. Nur selten zeigten sich in seiner Arbeit entlang stark
veränderter Kapillaren kleinere Ansammlungen von T-Lymphozyten (Hahn 1998). Auch
Peschen konnte bei CVI Patienten in klinisch gesunder Haut und der Haut mit Teleangiektasien
keine Zunahme der ICAM-1, LFA-1 und VLA-4 mRNA Level finden, wohingegen die Haut
67
mit Stasisdermatitis, Lipodermatosklerose und Ulkus im Vergleich höhere und teilweise
signifikant erhöhte Level zeigte (Peschen et al. 1999). Es kann daher vermutet werden, dass die
vermehrte Expression der ECM-Moleküle in der Unterschenkelregion in klinisch gesunder
Haut mit auf die gestörte Mikroangiopathie zurückzuführen ist.
Für einige Moleküle konnte ein Einfluss der Mikroangiopathie auf deren Expression bereits
nachgewiesen werden. Tenascin beispielsweise wurde in varikösen Venenwänden durch glatte
Muskelzellen vermehrt expremiert, nachdem man diese mechanischem Stress (Hypertension)
ausgesetzt hatte (Mackie et al. 1992). Weiterhin konnte hämodynamischer Stress in Saphenus-
Venen-Transplantaten beim Menschen die Expression von Tenascin und in Pulmonalarterien
bei Ratten die Expression von Tenascin und Typ I Prokollagen steigern (Tanaka et al. 1996;
Wallner et al. 1999). Auch der Hypoxie, die bei unseren Patienten bereits am Unterschenkel
gesehen wurde (Widmer II gering, Widmer III stärker), konnte in verschiedenen Geweben ein
Einfluss auf die Expression der ECM-Moleküle nachgewiesen werden. Dermale Fibroblasten
reagierten in einer Arbeit von Falanga auf geringe Sauerstoffspannungen in vitro mit
vermehrter Kollagen-Synthese (Falanga et al. 1993). Chen stellte bei Untersuchungen an
menschlichen Plazenten fest, dass eine prolongierte Hypoxie für diverse Veränderungen in der
ECM verantwortlich ist. So kam es unter ihr z.B. zu einer Zunahme der Kollagen IV und
Fibronektin Produktion (Chen et al. 2003).
Ob die Veränderungen in der Expression der untersuchten Matrixmoleküle in Abhängigkeit
von der Mikroangiopathie auf direkten (direkte Wirkung von Hypoxie oder Hypertension auf
Zellen) oder indirekten (vermehrte Ausschüttung bzw. Aktivierung von Zytokinen, GFs oder
MMPs unter Hypoxie) Mechanismen beruht, bleibt unklar. Bekannt ist, dass sich unter
veränderten mikroangiologischen Bedingungen wie Hypoxie und Hypertension auch die
Expression von bestimmten zellulären Mediatoren, aber auch Proteasen und ihren Inhibitoren
zu ändern scheint. Bei Untersuchungen von Claudy führte eine gesunkene Sauerstoffspannung
bei kultivierten Monozyten zu einer vermehrten Freisetzung von TNF-alpha, welches einen
mitogenen Effekt auf Fibroblasten hat, die Kollagenproduktion und Neoangiogenese fördert
und Wachstumsfaktoren und Zytokine wie TGF-beta steigert (Claudy et al. 1991). Mehrere
Arbeitsgruppen bewiesen zudem den hochregulierenden Einfluss von Hypoxie und
Hypertension auf die Proteasenaktivität (MMPs) (Badier-Commander et al. 2000; Pascarella et
al. 2005). Somit ist es denkbar, dass auch indirekte Mechanismen, z.B. vermehrte
Zytokinfreisetzung oder MMP bedingte strukturelle Veränderungen in der präexistierenden
68
ECM, unter dem Einfluss der Mikroangiopathie zu einer Veränderung in der Expression der
ECM-Moleküle führen.
Warum es in Bereichen klinisch gesunder Haut zu diesen Veränderungen kommt bzw. welche
Bedeutung ihr beigemessen werden muss, kann nur spekuliert werden. Es ist wahrscheinlich,
dass Veränderungen im Umfeld von Geweben wie der Haut durch die ECM nicht nur
wahrgenommen werden, sondern dass diese über Integrine und intrazelluläre Signale zu einer
Modulierung der Molekülexpression und Zelladhäsionskomponenten führen, um eine
Anpassung und Interaktion mit dieser veränderten Mikroumgebung zu gewährleisten.
Andernseits könnten die vermehrt expremierten Matrixmoleküle in Bereichen einer Hypoxie
auch die Grundlage für eine Verbesserung der Sauerstoffversorgung darstellen, da sie in der
Lage sind, Migration und Proliferation von Endothelzellen zu beeinflussen (siehe Kapitel 4.3).
Das Matrixmolekül Tenascin, dass wahrscheinlich auch als Überlebensfaktor fungiert, könnte
zudem für ein Überleben der Zellen (Keratinozyten, Endothelzellen usw.) in einem Umfeld
sorgen, wo die nutritive Versorgung sich verschlechtert hat (Jones et al. 2000).
Im Bereich des Ulkusrandes (Widmer III) und des medialen Malleolus (Widmer II) ist neben
der Mikroangiopathie zusätzlich eine starke Entzündungsreaktion vorhanden, was
zusammengenommen, wie diese Arbeit zeigen konnte, einen erheblichen Einfluss auf die
Expression der untersuchten Matrixmoleküle hat. Bei Untersuchungen an akuten chirurgischen
Wunden fand man während der Heilung einen ähnlichen Anstieg in der Expression der
Matrixmoleküle Tenascin und Fibronektin wie bei CVI-Patienten am Ulkusrand (Loots et al.
1998). Daraus ergibt sich die Frage, warum es bei Patienten mit Ulkus nicht ebenfalls zu einer
normalen Abheilung kommt, da die Voraussetzungen in der ECM dafür ja scheinbar erfüllt
sind. Loots entdeckte bei immunhistochemischen Untersuchungen von akuten und chronischen
Wunden (u.a. Ulcus cruris), dass normale Wunden während der einzelnen
Wundheilungsphasen ein charakteristisches Bild bezüglich Zellinfiltrat und ECM Ablagerung
zeigen. Die zu Beginn der Wundheilung aufgetretene Hochregulierung von Tn und Fn erreichte
bei akuten Wunden nach einiger Zeit wieder Level, wie sie vor der Verletzung vorgelegen
hatten. Im Gegensatz dazu blieb die Expression dieser Moleküle in der Arbeit von Loots bei
venösen Ulzera unvermindert hoch, was sie auf eine Störung des Wundheilungsprozesses mit
Arretierung in der Proliferations- und/oder Entzündungsphase zurückführte (Loots et al. 1998).
69
Anhand aller hier diskutierten Arbeiten kann vermutet werden, dass der progrediente Stimulus
auf die Zellen und ihre ECM durch Mikroangiopathie und Entzündungsreaktion bei Patienten
mit CVI im Ulkusbereich eine koordinierte, normale Wundheilung unmöglich werden lässt.
Hinzu kommt die vorrangig durch die Entzündungsreaktion getriggerte proteolytische Aktivität
(MMPs, neutrophile Elastase, uPA, Plasmin), die vor allem im Ulkusexsudat und Ulkusrand im
Vergleich zu akuten Wunden stark erhöhte Level zeigt (Vaalamo et al. 1996; Weckroth et al.
1996; Wysocki et al. 1999). Der vermehrten Expression von ECM-Molekülen steht ein
vermehrter, unkontrollierter Abbau gegenüber, womit eine Matrix geschaffen wird, die für die
Migration von Keratinozyten ungeeignet ist. Ågren bezeichnete diesen Sachverhalt auch als
„high turnover pathology“ (Agren et al. 2000).
Abschließend soll die perivaskuläre Region genauer betrachtet werden. Schon früh ist
beschrieben worden, dass es bei Patienten mit chronischer venöser Insuffizienz zur Ausbildung
sogenannter Fibrinmanschetten um die Kapillaren kommt (Burnand et al. 1982). Bei der
Auswertung unserer Präparate konnte im Bereich der klinisch gesunden Unterschenkelhaut von
Widmer II Patienten eine Zunahme von Tenascin und Kollagen IV im perivaskulären Bereich
gefunden werden. Diese war im Stadium III an der Unterschenkelhaut noch stärker, wobei hier
nun auch eine perikapilläre Expressionszunahme von Fibronektin und Kollagen I auffiel. In
den Biopsien des medialen Malleolus und Ulkusrandes waren alle 4 Matrixmoleküle
perivaskulär verstärkt vorhanden (besonders beeindruckend bei Kollagen IV und Tn), wobei
diese Expressionszunahme tendenziell im Widmer Stadium III am stärksten ausfiel. Diese
Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit Untersuchungen von Tronnier, der eine Korrelation
zwischen dem Vorhandensein der Fibrinmanschetten und der Schwere der trophischen
Hautveränderungen beobachtete (Tronnier et al. 1994).
Nach neuerem Erkenntnisstand bestehen die Fibrinmanschetten aus Fibrin, Fibronektin,
Kollagen I, III und Tenascin (Herouy et al. 2000). Zusätzlich konnte, wie auch in unserer
Arbeit zu sehen, von Brakmann am Ulkusrand eine Zunahme der Expression von Kollagen IV
im Fibrinnetzwerk des perivaskulären Bereiches gefunden werden (Brakman et al. 1992).
Tronnier bestätigte das Vorhandensein von Kollagen IV in den Manschetten
elektronenmikroskopisch und kam zu der Erkenntnis, dass die Basalmembranen ein Bestandteil
von Fibrinmanschetten sind (Tronnier et al. 1994).
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Diskrepanzen gibt es in der Literatur über deren Entstehung. Mehrere Arbeitsgruppen konnten
eine auf den erhöhten kapillären Druck zurückzuführende Schädigung des Kapillarendothels
nachweisen, was eine erhöhte Permeabilität der Gefäße zur Folge hat und so der Entstehung
von Ödemen und Fibrinmanschetten (Exsudation von Fibrinogen) Vorschub leistet (Leu et al.
1980; Leu et al. 1995; Jünger et al. 2000). In Arealen mit Entzündungsaktivität erhöht sich die
Permeabilität auf Grund diverser Mediatoren noch weiter (Ryan et al. 1977). Bereits Herrick
postulierte 1992, dass die Manschetten auf Grund ihrer vielen Bestandteile zudem aktiv
produziert werden müssen (Herrick et al. 1992). Ferguson bestätigte später diese These und
vermutete, dass das ständige Ischämie-Reperfusionstrauma (Leukozyten verstopfen im Stehen
die Kapillaren und werden dann bei Elevation des Beines aktiviert) in Kapillaren bei CVI
Patienten zu einer Aktivierung der Leukozyten führt, welche hohe Level an Zytokinen und
freien Sauerstoff-Radikalen freisetzen (Agren et al. 2000). Diese veranlassen Endothelzellen
und Fibroblasten anschließend zur Synthese von ECM-Molekülen, welche die Manschetten
bilden. Frühe Studien über die Fibrinmanschetten vermuteten, dass diese persistieren, da die
fibrinolytische Aktivität in ihnen herabgesetzt ist (Tronnier et al. 1994). Neuere Arbeiten
konnten allerdings nachweisen, dass in Fibrinmanschetten eine erhöhte Aktivität an uPA und
seinem Rezeptor zu finden sind, was auf eine erhöhte proteolytische Aktivität schließen lässt
(Wysocki et al. 1999; Herouy et al. 2000). Das deutet darauf hin, dass auch hier eine „high
turnover pathology“ vorliegt.
Die perikapillären Fibrinmanschetten lassen noch einen weiteren Zusammenhang zur
Mikroangiopathie erkennen. Der perikapilläre Anstieg von Kollagen IV und Tenascin in der
Unterschenkelhaut kann nicht auf Mediatoren aus Leukozyten oder anderen Entzündungszellen
zurückgeführt werden, da eine Entzündsaktivität hier weitestgehend fehlt (Hahn 1998). Die
kapilläre Hypertension und die Hypoxie scheinen somit, wie oben erwähnt, eine Ursache für
den Umbau der ECM zu sein. Unter Bedingungen vermehrter Zelldehnung (mechanischer
Stress) und von Hypoxie wurde zugleich eine vermehrte Expression von MMPs beobachtet
(Nicolaides 2005). Das bestärkt noch einmal die Vermutung, dass die Manschetten nicht nur
passiv entstehen, sondern wahrscheinlich eine aktive Anpassungsreaktion auf die veränderten
mikroangiologischen Bedingungen darstellen, damit Gefäße und Zellen in dieser
Mikroumgebung weiter existieren können. Außerdem könnte die Hochregulierung von
Tenascin und Kollagen IV zu einer Migration der Endothelzellen beitragen, um die
Angiogenese zu fördern und somit eine adäquate Antwort auf den hypoxischen Stimulus zu
geben. Problematisch scheint allerdings zu sein, dass mit zunehmender Schwere der
71
Erkrankung die Manschetten und ihre Bestandteile immer komplexer und dicker werden,
wodurch eine Angiogenese dann anscheinend verhindert wird (Herrick et al. 1992). Weiterhin
stehen die Manschetten im Verdacht, die Gefäße in ihren ektatischen Stellungen zu fixieren
und so zu einer weiteren Progression der CVI beizutragen (Neumann et al. 1991).
Aufbauend auf bestehenden Hypothesen über die Genese der CVI wird anhand der Ergebnisse
unserer Arbeit folgender Ablauf als möglich erachtet:
Der erhöhte venöse Druck, der bei Patienten mit CVI zu messen ist, leitet sich in der Form von
Druckwellen bis in die Kapillaren fort und führt hier über die mechanische Dilatation zu ersten
Schäden. Diese bestehen aus einer Dilatation und Elongation der Kapillaren, die bereits zu
ersten Einschränkungen in der nutritiven Versorgung der Umgebung führen (O2 ↓). Der erhöhte
venöse/kapilläre Druck und die Hypoxie führen in mikroangiopathischen Arealen darüber
hinaus zu einem ersten Umbau der extrazellulären Matrix, um sich an die veränderte
Mikroumgebung anzupassen und mögliche Schäden beheben zu können (Angiogenese).
Durch eine weitere Drucksteigerung kommt es im Verlauf durch einen verminderten
Gradienten zwischen arteriellen und venösen Schenkeln zu einer Verlangsamung des
Blutflusses in den Kapillaren. Das führt 1.) zu einer verstärkten Interaktion von Leukozyten
und Endothelzellen und 2.) zu einer temporären Verstopfung von Kapillaren durch
Leukozyten. Über verschiedene Mechanismen resultiert hieraus eine lokale Aktivierung der
Leukozyten (insbesondere neutrophile Granulozyten), die proteolytische Enzyme und reaktive
Sauerstoffspezies freisetzen. Die Folge ist eine weitere Schädigung des Endothels mit einer
erhöhten Permeabilität für nieder- und hochmolekulare Substanzen (z.B. flüssiges Fn) und eine
gesteigerte Aktivierung des Endothels. Ab diesem Punkt scheint es wahrscheinlich, dass die
progrediente Mikroangiopathie und die beginnende Entzündungsreaktion gemeinsam an der
weiteren Pathogenese beteiligt sind. Über zunehmende mechanische Einflüsse verändert sich
die Struktur der „microvascular unit“ weiter. Die Kapillaren verlieren zudem durch Sprengung
des Perizytenkorsetts regulative Funktionen (Dilatation, Torquierung). Die erhöhte
Extravasation von Fibrinogen, Fibronektin und Erythrozyten, die sich in der Folge perivaskulär
ablagern und organisieren, triggern die Entzündungsreaktion weiter. Der Körper versucht,
diese unphysiologisch abgelagerten Substanzen z.B. mit Hilfe von Makrophagen und erhöhter
proteolytischer Aktivität aus dem Gewebe zu eliminieren. Die Kombination aus erhöhtem
kapillären Druck und der Entzündungsreaktion führt zur Zerstörung oder maximalen
72
Verformung (Glomerulumform) vieler Kapillaren in den betroffenen Hautgebieten. Außerdem
sorgen Mikroangiopathie und Entzündungsreaktion gemeinsam für eine verstärkte Synthese
von ECM-Molekülen, um den Gewebeuntergängen durch Bereitstellung einer optimalen
Matrix entgegenwirken zu können. Gleichzeitig kommt es zu einer erhöhten proteolytischen
Aktivität in diesen Arealen.
Das es zu keiner Gewebereparatur, sondern zu einem totalen Gewebeuntergang kommt, kann
auf den persistierenden Stimulus zur ECM-Synthese und Proteasen-Aktivität zurückgeführt
werden. Dadurch kommt es, im Gegensatz zu akuten Wunden, zu einer „high turnover
pathology“, wobei der erhöhte Auf- und Abbau der ECM unkoordiniert abläuft und eine
Gewebsreparatur unmöglich werden lässt. Zudem kommt es zu keiner Verbesserung der
nutritiven Versorgung mehr, da die perikapillären Fibrinmanschetten nun auf Grund ihrer
zunehmenden Dicke einer Angiogenese entgegenwirken und die Kapillaren in ihren
ektatischen Stellungen fixieren. Im Ulkus wird schließlich ein Punkt erreicht, an dem die
verminderte nutritive Versorgung (Nährstoffe, Sauerstoff) und die verstärkte proteolytische
Aktivität zu einem totalen Gewebeuntergang führen. Durch die persistierenden hohen
intravasalen Drücke bleiben die Mikroangiopathie und die Entzündungsreaktion, die sich
zudem selber unterhält, bestehen und führen zur Chronifizierung dieser Krankheit.
73
5. Zusammenfassung In der vorliegenden Studie wurde bei 23 Patienten mit chronischer venöser Insuffizienz
unterschiedlicher Schweregrade (Widmer II, n=9; Widmer IIIb, n=14) die Mikrozirkulation der
Haut mittels transkutaner Sauerstoffpartialdruckmessung und Laser-Doppler-Fluxmetrie am
Oberschenkel, Unterschenkel und medialem Malleolus (im Widmer Stadium II) bzw.
Ulkusrand (im Widmer Stadium III) des betroffenen Beines erfasst. An allen Messpunkten ist
im Anschluss je eine Stanzbiopsie entnommen und immunhistochemisch auf die
extrazellulären Matrixmoleküle Kollagen I, Kollagen IV, Fibronektin und Tenascin untersucht
worden.
Die klinischen Untersuchungen der transkutanen Sauerstoffpartialdruckmessung und der Laser-
Doppler-Fluxmetrie zeigten bei beiden Patientengruppen für die Oberschenkelhaut nahezu
identische Werte, die zudem im Normbereich gesunder Probanden lagen. Die Messungen an
der Unterschenkelhaut und dem medialen Malleolus (Widmer Stadium II) bzw. dem Ulkusrand
(Widmer Stadium III) erbrachten dagegen teilweise stark pathologische Werte. So kam es in
beiden Patientengruppen bereits in der Unterschenkelhaut zu einem Abfall des TcPO2 und
einem Anstieg des Ruhefluxes. Diese Veränderungen waren bei den Patienten des Widmer
Stadiums III ausgeprägter. Am Ulkusrand bzw. medialem Malleolus zeigte sich eine weitere
Abnahme des Sauerstoffpartialdruckes und Zunahme des Ruhefluxes, welche wiederum im
Widmer Stadium III wesentlich stärker waren.
Bei der Auswertung der Hautbiopsien zeigte sich bei beiden Patientengruppen für alle
untersuchten ECM-Moleküle im Oberschenkelbereich ein gleiches Expressionsmuster, welches
darüber hinaus dem gesunder Haut entsprach. Die Matrixmoleküle Tenascin und Kollagen IV
zeigten bereits bei einigen Patienten in der gesunden Unterschenkelhaut des Widmer Stadium
II eine verstärkte Anfärbung, die im Widmer Stadium III sogar bei allen Patienten in dieser
Region zu sehen war. Eine weitere Zunahme der Expression dieser Moleküle ergab sich in der
Haut des medialen Malleolus und des Ulkusrandes, wobei die Farbintensität in dieser
Untersuchungsregion im Widmer Stadium III erneut kräftiger als im Stadium II war. Die ECM-
Moleküle Kollagen I und Fibronektin erbrachten in der klinisch gesunden Unterschenkelhaut
der Widmer II Patienten ein im Vergleich zur Oberschenkelhaut unverändertes Färbemuster.
Im Widmer Stadium III zeigte sich jedoch in dieser Untersuchungsregion neben einer
vermehrten Anfärbung eine veränderte Verteilung und Darstellung der Moleküle Kollagen I
und Fibronektin. In den Biopsien des medialen Malleolus und des Ulkusrandes kam es zu einer
74
weiteren Zunahme der Anfärbung für diese beiden Moleküle und zudem zu einem noch stärker
verändertem Verteilungs- und Expressionsmuster, welches in der Haut des Ulkusrandes am
ausgeprägtesten war. Insgesamt ließ sich für alle untersuchten Matrixmoleküle eine Steigerung
in der Expression feststellen, die nicht nur stadienabhängig war, sondern auch intraindividuell
(Zunahme vom Oberschenkel Richtung medialem Malleolus bzw. Ulkusrand innerhalb eines
Patienten) festgestellt werden konnte. Zudem war diese Expressionszunahme für die Moleküle
Tenascin und Kollagen IV bereits in klinisch gesunder, aber mikroangiologisch veränderter
Haut zu finden. Insbesondere um die angeschnittenen Gefäße war regelhaft eine vermehrte
Expression aller 4 ECM-Moleküle zu sehen, welche am medialen Malleolus und Ulkusrand am
intensivsten war.
Die Ergebnisse dieser Arbeit und die in ihr diskutierten Studien bestätigen die These, dass der
Mikroangiopathie primär eine mechanische Ursache zu Grunde liegt und sie der kutanen
Manifestation der CVI vorausgeht. Des Weiteren scheint eine systemische Komponente bei der
Genese dieser Krankheit keine Rolle zu spielen, da sowohl die mikroangiologische als auch die
immunhistochemische Situation in der Oberschenkelhaut nicht pathologisch verändert
erschienen. Mit zunehmender Verschlechterung der nutritiven Versorgung konnte eine immer
stärker werdende Expression der untersuchten Matrixmoleküle aufgezeigt werden, was für
einen Einfluss der Mikroangiopathie auf die Expression der ECM-Moleküle spricht. Bestärkt
wurde diese Vermutung durch die Entdeckung in dieser Arbeit, dass bereits in klinisch
gesunder, aber mikroangiologisch geschädigter Haut, eine verstärkte Expression einiger ECM-
Moleküle zu finden war. Die vermehrte Expression der Matrixmoleküle in Abhängigkeit von
der Mikroangiopathie könnte für Prozesse wie Neoangiogenese oder Wundheilung
verantwortlich sein, aber auch einen Schutz der Gefäße vor hohen Drücken darstellen bzw.
eine Anpassung der ECM an die veränderte Mikroumgebung gewährleisten. Das es trotzdem
zu einer progredienten Schädigung der Haut bis zum Ulcus cruris venosum im Verlaufe dieser
Krankheit kommt, kann auf die erhöhte proteolytische Aktivität, insbesondere in
lipodermatosklerotischer Haut und im Ulkusbereich, zurückgeführt werden („High turnover
pathology“). Die vermehrte proteolytische Aktivität in den genannten Arealen konnte in dieser
Studie indirekt an veränderten Darstellungsmustern der Moleküle Fibronektin und Kollagen I
beobachtet werden.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass es bei Patienten mit
CVI einen Zusammenhang zwischen der Mikroangiopathie und der Expression der ECM-
75
Moleküle zu geben scheint. Um diesen Sachverhalt weiter zu verifizieren sollten Studien
folgen, die für eine genauere Quantifizierung der untersuchten Moleküle die Methode der
Polymerase-Chain-Reaction auf Protein und mRNA verwenden. Zudem wäre es zu empfehlen,
neben der Mikroangiopathie auch die Entzündungsaktivität z.B. mittels Immunhistochemie in
den gleichen Biopsien mitzuerfassen, um der Genese der Veränderungen in der ECM noch
besser auf den Grund gehen zu können. Auch in der Zukunft sollte unbedingt eine weitere
Forschung auf dem Gebiet der extrazellulären Matrixmoleküle und ihrer Regulation bei
Patienten mit CVI erfolgen. Durch ihre wichtige Rolle in der Wundheilung könnte ein noch
besseres Verständnis für Prozesse in der ECM-Matrix zu neuen Behandlungsoptionen
beitragen.
76
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91
7. Anhang Immunhistochemische Ergebnisse (Tabellarische Form) Kollagen I Widmer II (n=9) Widmer III (n=14)
OS In beiden Widmer Stadien gleiches Färbemuster: - Relativ homogene Färbung von Bindegewebe, Nervenfasern und
Gefäßanschnitten, Ausrichtung der Fasern überwiegend horizontal (tangential zur Oberfläche).
- In der dermoepithelialen Junktionszone (oberes Stratum papillare) etwas stärkere Färbung im Vergleich zum Rest des Schnittes.
US - Kein Unterschied bei der
Anfärbung im Vergleich zur Oberschenkelhaut.
- Färbung von Kollagen I in der retikulären Dermis inhomogen mit Verlust der horizontalen Faserausrichtung(7/14).
- Zunahme der Schichtbreite immunreaktiven Gewebes um die Gefäße (7/14).
- Abnahme der in der Oberschenkelhaut beschriebenen verstärkten Anfärbung im oberen Stratum papillare (Farbintensität hier nun wie im restlichen Gewebe) (3/14).
MM/
UR
- Abnahme der in der Oberschenkelhaut beschriebenen verstärkten Anfärbung im Stratum papillare (7/9).
- Zunahme der Schichtbreite immunreaktiven Gewebes um die Gefäße (3/9).
- Zunahme der Farbintensität im Stratum reticulare (3/9).
- Abnahme der in der Oberschenkelhaut beschriebenen verstärkten Anfärbung im Stratum papillare nun bei fast allen Patienten (12/14).
- Weitere Zunahme der Schichtbreite immunreaktiven Gewebes um die Gefäße (9/14).
- Zunahme der Farbintensität im Stratum reticulare (9/14).
- Vorwiegend diffuser Faserverlauf im Stratum reticulare mit häufig vertikal ausgerichteten Fasern.
92
Kollagen IV Widmer II (n=9) Widmer III (n=14)
OS In beiden Widmer Stadien gleiches Färbemuster: - Schwache Anfärbung der Basalmembran zwischen Epidermis und Dermis in
Form einer zarten Linie. - Schwache Anfärbung der Basalmembranen der Endothelzellen in der Dermis.
US - Stärkere Färbung der epidermalen BM (4/9).
- Stärkere Färbung im Bereich der BM der Gefäßendothelien (5/9).
- Stärkere Färbung der epidermalen BM (14/14).
- Stärkere Färbung im Bereich der BM der Gefäßendothelzellen (14/14).
- In beiden Widmer Gruppen zeigte sich bei allen Patienten ein kräftiger, gleich breiter, für Kollagen IV positiver Saum in den epidermalen Basalmembranen (im Vergleich zu den epidermalen Basalmembranen der US-Haut nochmals stärker).
MM/
UR
- Starke Färbung der Basalmembranen der Kapillaren nun bei allen Patienten (9/9).
- Starke Färbung der Basalmembranen der Kapillaren bei allen Patienten (im Vergleich zum Widmer Stadium II tendenziell stärker) (14/14).
- Des Öfteren „feinflockige“ Anfärbung im Stratum papillare in kapillarreichen Schnitten (7/14).
93
Tenascin Widmer II (n=9) Widmer III (n=14)
OS In beiden Widmer Stadien gleiches Färbemuster: - Schmaler, teilweise diskontinuierlicher Saum im Stratum papillare direkt
unterhalb der BM. - Schwache Färbung im Bereich dermaler Gefäße und im Hüllgewebe von
Nervenfasern. - Im Bereich von Hautanhangsgebilden (z.B. Talgdrüsen) etwas stärkere Reaktion.
US - Dichtes, relativ homogenes, durchgehendes an die epidermale BM grenzendes Band mittlerer Farbintensität (9/9).
- Zusätzlich schwache bis mittlere netzartige Anfärbung im gesamten Stratum papillare (6/9).
- Stärkere Anfärbung im Bereich der Kapillaren (5/9).
- Dichtes, relativ homogenes, durchgehendes an die BM grenzendes Band (14/14) (im Vergleich intensivere Färbung als US Widmer II).
- Mittlere bis starke Anfärbung des gesamten Stratum papillare (14/14) und des oberen Anteils des Stratum reticulare (10/14).
- Stärkere Anfärbung im Bereich der Kapillaren (14/14).
MM/
UR
- Gleiches Färbemuster wie in der Unterschenkelregion der Widmer II Patienten im Stratum papillare mit nun vorwiegend mittlerer Farbintensität (keine Ausbreitung der Anfärbung auf das Stratum reticulare) (8/9).
- Stärkere Anfärbung im Bereich der Gefäße nun bei fast allen Patienten(8/9).
- Gleiches Färbemuster wie in der Unterschenkelregion der Widmer III Patienten.
- Zusätzlich nun mittlere bis starke Anfärbung im Stratum reticulare bei allen Patienten, die häufig bis in sehr tiefe Regionen des Schnittes reichte (14/14).
- Stärkere Anfärbung im Bereich der Gefäße nun bei fast allen Patienten (13/14).
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Fibronektin Widmer II (n=9) Widmer III (n=14)
OS In beiden Widmer Stadien gleiches Färbemuster: - Homogene Färbeverhalten in der gesamten Dermis. - Im Bereich von Hautanhangsgebilden, um Fibroblasten und Endothelzellen
etwas stärkere Anfärbung.
US - Kein Unterschied bei der Anfärbung im Vergleich zur Oberschenkelhaut.
- Leichte Abnahme der Anfärbung im oberen Stratum papillare (7/14).
- Verstärkte Anfärbung im Bereich von Endothelzellen (7/14).
- Verstärkte Anfärbung des Stratum reticulare (6/14).
- Das Färbemuster in der retikulären Dermis erschien bei einigen Patienten aufgelockert bzw. fragmentiert.
MM/
UR
- Leichte Abnahme der Anfärbung im oberen Stratum papillare (8/9).
- Starke Färbung im Bereich um die Kapillaren (9/9).
- Leichte Abnahme der Anfärbung im oberen Stratum papillare (11/14).
- Starke Anfärbung im Bereich um die Kapillaren (7/14), tendenziell etwas stärker als am medialen Malleolus im Widmer Stadium II.
- Verstärkte Anfärbung des Stratum reticulare (10/14).
- Das Färbemuster in der retikulären Dermis erschien fast regelhaft aufgelockert bzw. fragmentiert.
95
8. Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine ande-
ren als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät vorgelegt worden.
Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass eine
Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.
Dargun, Januar 2008 Enrico Mansfeld
96
9. Danksagung Bei der Planung, Durchführung und Auswertung dieser klinisch-experimentellen Arbeit haben
mich viele Personen unterstützt, denen ich an dieser Stelle gerne danken möchte.
Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr. Michael Jünger für die Überlassung des Themas. Besonderer
Dank gilt Frau Dr. Susanna Heising, die mir während aller Abschnitte dieser Arbeit immer
beratend zur Seite stand. Für die Lehrstunden in medizinischer Statistik und Unterstützung bei
der Auswertung der erhobenen Daten danke ich zudem sehr herzlich Herrn Dr. Haase.
Desgleichen gilt mein Dank den Mitarbeitern der Klinik und Poliklinik für Hautkrankheiten der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald, die trotz des stressigen Klinikalltags stets sehr
motiviert an dem klinischen Teil dieser Studie mitgewirkt haben. Insbesondere waren dies Frau
Dr. Kirstin Sippel, Frau Millie Heitmann und Frau Helene Riebe.
Diese Studie ist in Zusammenarbeit mit dem Institut für Anatomie und Zellbiologie der Ernst-
Moritz-Arndt-Universität Greifswald (Leitung: Prof. Dr. Karlhans Endlich) durchgeführt
worden. Tatkräftige Hilfe in der praktischen Durchführung des experimentellen Teils erhielt
ich hier von der liebenswerten Frau Bansemir. Ganz besonderer Dank gilt an dieser Stelle
Herrn Prof. Dr. Jürgen Giebel, der mich mit viel Geduld und Engagement durch den
experimentellen Teil dieser Arbeit begleitete. Weiterer Dank gilt Frau Dr. Bärbel Miehe.
Auch bei meiner Frau Katharina Mansfeld, meiner Familie und meinen Schwiegereltern
möchte ich mich herzlich bedanken. Mit viel Ausdauer standen diese lieben Personen mir über
die letzten Jahre zur Seite, unterstützten mich nach ihren Möglichkeiten und halfen mit
motivierenden Worten durch schwierige Zeiten. Besonders meinem Bruder, cand. ing.
Christian Mansfeld, möchte ich für die tatkräftige Hilfe bei der Bewältigung der MS Excel
Formelwelt danken.
Leider kann ich meinem Vater, der im Juni 2004 plötzlich verstarb, nicht mehr persönlich
danken. Insbesondere ihm möchte ich daher diese Arbeit widmen.
Dargun, Januar 2008 Enrico Mansfeld
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10. Lebenslauf Name Enrico Mansfeld
Geburtsdatum 21.04.1981
Geburtsort Neubrandenburg
Familienstand verheiratet
Nationalität deutsch
Schulausbildung 1987 – 1993
1993 – 1994
1994 – 1999
Arthur-Becker-Oberschule Neubrandenburg
Kooperative Gesamtschule Burg Stargard
Sportgymnasium Neubrandenburg
Abschluss: Abitur
Hochschulausbildung 2000 – 2006
09/2002
09/2003
09/2005
2005 - 2006
11/2006
seit 10/2006
Studium der Humanmedizin an der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Physikum
1. Staatsexamen
2. Staatsexamen
Praktisches Jahr, Klinkum Güstrow
3. Staatsexamen
Studiengang „Master of Science in Health Care Management” an der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Beruflicher Werdegang 2002
2002 – 2003
2002 – 2005
seit 06/2007
Studentische Hilfskraft im Schlaflabor der HNO-Klinik der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Studentische Hilfskraft in der Klinik für Allgemein-, Thorax- Gefäß- & Visceralchirurgie, Dietrich-Bonhoeffer-Klinikum Neubrandenburg
Medizinischer Fallbearbeiter der Unfallforschung in der Unfall- und Wiederherstellungschirurgie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Arzt in Weiterbildung in der Kinderabteilung des Kreiskrankenhauses Demmin
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