Aus dem Institut für Tierernährung und Stoffwechselphysiologie

der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

Einfluss einer Ballaststoff-Zulage

(Citrus- bzw. Weizenfaser) auf die Bioverfügbarkeit von

Quercetin beim wachsenden Schwein

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades

der Agrar- und Ernährungswissenschaftlichen Fakultät

der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

vorgelegt von

M.Sc. Birga Müller-Siegwardt

aus Kiel

Kiel 2009

Gedruckt mit Genehmigung der Agrar- und Ernährungswissenschaftlichen

Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

Dekan: Prof. Dr. Latacz-Lohmann

1. Berichterstatter: Prof. Dr. Wolffram

2. Berichterstatter: Prof. Dr. Wisker

Tag der mündlichen Prüfung: 10. Februar 2009

Die Dissertation wurde mit dankenswerter Unterstützung des Bundesministeriums

für Bildung und Forschung angefertigt.

für Harald und meinen Vater

PER ASPERA AD ASTRA

I. Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung .......................................................................................... 1

2. Literaturübersicht .............................................................................. 3

2.1 Einordnung, Struktur und Biosynthese von Flavonoiden ....................... 3

2.2 Vorkommen und Aufnahme von Flavonoiden mit der Nahrung ............ 6

2.3 Biologische Effekte von Flavonoiden im menschlichen bzw. tierischem Organismus.............................................................................................. 8

2.3.1 Flavonoide als Antioxidantien ............................................................ 9

2.3.2 Einfluss auf Enzyme, Signaltransduktion und Genexpression.......... 13

2.4 Bioverfügbarkeit von Quercetin und Rutin ........................................... 15

2.4.1 Intestinale Absorptionsmechanismen................................................ 16

2.4.2 Metabolisierung und Ausscheidung.................................................. 20

2.4.3 Plasmatransport und Gewebeverteilung............................................ 23

2.5 Ballaststoffe und Rohfaser .......................................................................... 26

2.5.1 Definition und Klassifikation von Ballaststoffen und Rohfaser ....... 26

2.5.1.1 Nicht-Stärke Polysaccharide (NSP) .............................................. 27

2.5.2 Physikalisch-chemische Eigenschaften der Ballaststoffe ................. 29

2.5.2.1 Wasserbindungskapazität .............................................................. 29

2.5.2.2 Adsorptionseigenschaften ............................................................. 29

2.5.2.3 Fermentierbarkeit .......................................................................... 30

2.5.3 Wirkungen von Ballaststoffen im GIT von Monogastriden.............. 30

2.5.3.1 Magen-Darm-Motilität und Transitzeit ......................................... 31

2.5.3.1.1 Magenentleerung.................................................................... 31

2.5.3.1.2 Einfluss auf die Transitzeit der Digesta durch den Dünn- und Dickdarm................................................................................ 32

2.5.4 Intestinale Mikroflora........................................................................ 34

2.5.4.1 Beeinflussung der mikrobiellen Dichte und -Zusammensetzung durch die Aufnahme von Ballaststoffen beim Schwein ................ 35

3. Material und Methoden...................................................................37

3.1 Bioverfügbarkeitsstudien am Schwein.................................................. 37

3.1.1 Versuchstiere und Fütterung ............................................................. 37

3.1.2 Versuchsdurchführung ...................................................................... 39

3.1.3 Analytik............................................................................................. 40

3.1.3.1 Futtermittelanalysen ...................................................................... 40

3.1.3.2 Probenaufarbeitung ....................................................................... 41

3.1.3.3 HPLC-Methode ............................................................................. 41

3.1.3.4 Kalibrierung, Nachweisgrenze und Wiederfindung...................... 42

3.1.4 Pharmakokinetische Parameter ......................................................... 46

3.1.4.1 Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve (AUC) .................... 46

3.1.4.2 Relative Bioverfügbarkeit ............................................................. 46

3.2 In vitro-Fermentationsstudien mit Schweinefaeces als Inokulum ........ 47

3.2.1 Versuchstiere und Diäten .................................................................. 47

3.2.2 Simulierte Magen-Dünndarm-Verdauung......................................... 47

3.2.3 Inokulum ........................................................................................... 49

3.2.4 In vitro-Fermentation ........................................................................ 50

3.3 Statistik.................................................................................................. 52

3.3.1 In vivo-Bioverfügbarkeitsstudien am Schwein ................................. 52

3.3.2 In vitro-Fermentationsstudien mit Schweinefaeces als Inokulum .... 53

4. Ergebnisse .......................................................................................54

4.1 Bioverfügbarkeitsstudien ...................................................................... 54

4.2 In vitro-Fermentationsstudien ............................................................... 63

5. Diskussion .......................................................................................65

6. Zusammenfassung...........................................................................77

7. Summary .........................................................................................79

8. Literaturverzeichnis.........................................................................80

II. Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Grundstruktur von Flavonoiden........................................................ 3

Abbildung 2: Struktur der Unterklassen von Flavonoiden ..................................... 4

Abbildung 3: Hydroxylierungs-, Methylierungs- und Glykosylierungsmuster

verschiedener Flavonole ................................................................... 5

Abbildung 4: Postulierte Absorptions- und Metabolisierungsprozesse von

Quercetin-Glukosiden im Dünndarm.............................................. 20

Abbildung 5: Fraktionen und Komponenten der Ballaststoffe ............................ 27

Abbildung 6: Eichgeraden zur quantitativen Bestimmung von Quercetin,

Isorhamnetin und Tamarixetin........................................................ 44

Abbildung 7: Chromatogram eines Standards und einer Plasmaprobe vom

Schwein aus der SMF-Gruppe 150 min nach Verabreichung von

165,4 µmol Quercetin /kg KGW als Aglykon ................................ 45

Abbildung 8: Gesamtflavonolkonzentrations-Zeit-Kurven nach oraler Gabe einer

äquivalenten Dosis von 165,4 µmol Quercetin /kg KGW nach

Aglykon- bzw. Rutin-Applikation. ................................................. 56

Abbildung 9: Konzentrations-Zeit-Verläufe von Quercetin und

Quercetinmetaboliten nach oraler Gabe von 165,4 µmol

Quercetin/kg KGW als Aglykon zur SMF-, CF- und WF-Ration .. 59

Abbildung 10: Kummulative Gasbildung bei der in vitro-Fermentation der

enzymatisch vorbehandelten Versuchsrationen.............................. 64

III. Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Vorkommen von Flavonoiden in pflanzlichen Nahrungsmitteln............ 7

Tabelle 2: mögliche Effekte verschiedener Ballaststoffquellen auf den GIT........ 33

Tabelle 3: Chemische Zusammensetzung der Versuchsdiäten .............................. 38

Tabelle 4: Chemische Zusammensetzung der eingesetzten Citrus- bzw.

Weizenfaser ........................................................................................... 38

Tabelle 5: Fasergehalte der vorverdauten Rationen............................................... 48

Tabelle 6: Zusammensetzung des Inkubationsmediums (IM) ............................... 50

Tabelle 7: Vergleich der pharmakokinetischen Parameter der

Gesamtflavonolkonzentration (Quercetin + Isorhamnetin + Tamarixetin)

nach einer einmaligen Gabe von 165,4 µmol Quercetin/kg KGW als

Aglykon (QA) oder Rutin (R). .............................................................. 57

Tabelle 8: Vergleich der pharmakokinetischen Parameter von Quercetin (Q),

Isorhamnetin (I) und Tamamrixetin (T) nach einer einmaligen Gabe

von 165,4 µmol Quercetin/kg KGW als Aglykon zu den jeweiligen

Testmahlzeiten. .................................................................................... 60

Tabelle 9: Vergleich der pharmakokinetischen Parametervon Quercetin (Q),

Isorhamnetin (I) und Tamarixetin (T) nach einer einmaligen Gabe von

165,4 µmol Quercetin /kg KGW aus Rutin zu den jeweiligen

Testmahlzeiten. .................................................................................... 61

Tabelle 10: Ergebnisse der in vitro-Fermentationsversuche nach Inkubation der

vorverdauten Rationen mit Schweinefaeces als Inokulum.................. 63

IV. Abkürzungsverzeichnis ADF Acid Detergent Fiber ADL Acid Detergent Lignin AEC Adenylate Energy Charge AOAC Association of Analytical Communities AP-1 Aktivator-Protein-1 AUC Area under the curve CF Citrusfaser COMT Catechol-O-Methyltransferase CYP Cytochrom P450 DE Deutsches Edelschwein DGE Deutsche Gesellschaft für Ernährung DL Deutsche Landrasse DNA Desoxyribonucleic Acid EC Enzyme Comission Number g Gravidationsbeschleunigung GIT Gastrointestinaltrakt HPLC High Performance Liquid Chromatography HSF Hitze-Schock-Faktoren I Isorhamnetin I.E. Internationale Einheiten IM Inkubationsmedium JNK c-Jun-N-terminalen-Kinasen KBE Koloniebildende Einheiten KGW Körpergewicht LDL Low Density Lipoprotein LPH Laktase-Phloridzin-Hydrolase MAP mitogen-aktivierte Proteinkinasen MRPs Multidrug-Resistent-Associated-Proteins NADPH Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat NDF Neutral Detergent Fiber NF-κB Nuklear-Transkriptions-Faktor-Kappa B NSP Nicht-Stärke-Polysaccharide PAPS 3’-Phosphoadenosin-5’-Phophosulfat

Q Quercetin Q3G Quercetin-3-O-ß-D-Glucuronid R Rhamnetin R2 Bestimmtheitsmaß RNA Ribonucleic Acid ROS Reaktive Sauerstoff Spezies SGLT1 Sodium depend glucose transporter 1 SMF Schweinemastfutter SULT Phenol-Sulfotransferase TM Trockenmasse T Tamarixetin TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor- α UGT UDP-Glukuronoyltransferase UV Ultraviolettstrahlung VDLUFA Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und

Forschungsanstalten WF Weizenfaser XF Rohfaser

Einleitung

1

1. Einleitung

Hinsichtlich des steigenden Gesundheitsbewusstseins und einer zunehmenden

Nachfrage der Verbraucher nach sogenannten „Functional Foods“ und den damit

verbundenen positiven Marktentwicklungen ist die Lebensmittelindustrie bestrebt,

die Entwicklung weiterer funktioneller Produkte voranzutreiben. „Functional

Foods“ beinhalten funktionelle „Wirkstoffe“, wie z. B. sekundäre

Pflanzeninhaltsstoffe und Ballaststoffe, welchen gesundheitsfördernde Effekte

zugeschrieben werden.

Quercetin gehört zu den Flavonoiden und wird als sekundärer Pflanzeninhaltsstoff

höherer Pflanzen von Mensch und Tier mit der Nahrung aufgenommen. Den zu

den polyphenolischen Verbindungen gehörenden Flavonoiden werden zahlreiche

biologische Effekte zugesprochen. Insbesondere das antioxidative Potential, die

Interaktionen mit einer Vielzahl von Enzymsystemen und die Beeinflussung von

Signaltransduktionskaskaden und Genexpressionen wirken protektiv auf

chronische Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Krebs und Arthritis, aber auch auf

neurodegenerative Erkrankungen wie Morbus Alzheimer und Morbus Parkinson.

Voraussetzung für die postulierten Wirkungen in vivo ist eine ausreichend hohe

systemische Verfügbarkeit der Flavonoide. Vorhergehende Untersuchungen

zeigten, dass die Nahrungs- bzw. Futtermittelzusammensetzung einen Einfluss auf

die orale Bioverfügbarkeit des Quercetins ausübt.

Ballaststoffe wirken präventiv auf ernährungsbedingte Krankheiten wie Diabetes

mellitus, Adipositas, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Obstipationen, Divertikulose

bzw. Divertikulitis und Kolonkarzinome und sind aufgrund dieser Vielzahl an

gesundheitsfördernden Effekten ebenfalls Bestandteile von „Functional Foods.

Ziel dieser vorliegenden Arbeit war es, am Modelltier Schwein zu prüfen, ob der

Zusatz von löslichen und unlöslichen Ballaststoff-Komponenten, der sich an einer

täglichen Ballaststoffaufnahme in der Humanernährung orientierte, zu einem

kommerziellen Schweinemastfutter, die orale Bioverfügbarkeit von Quercetin aus

Einleitung

2

unterschiedlichen Quercetinquellen (Aglykon, Rutin) über Modulationen der

Magen-Darm-Motilität und/oder der gastrointestinalen Mikroflora beeinflusst.

Literaturübersicht

3

2. Literaturübersicht

2.1 Einordnung, Struktur und Biosynthese von Flavonoiden

Flavonoide gehören zu den mehr als 8000 polyphenolischen Verbindungen,

welche als sekundäre Inhaltsstoffe im Pflanzenreich gebildet und über Früchte,

Gemüse und Getränke aufgenommen werden (Urquiaga & Leighton 2000). Sie

stellen die größte Gruppe der Polyphenole dar (Harborne & Williams 2000) und

besitzen eine Drei-Ring-Grundstruktur (Abb.1), welche aus zwei Benzolringen

(A und B) bestehen, die über drei C-Atome miteinander verbunden sind. Diese

bilden mit Sauerstoff den heterozyklischen C-Ring und komplettieren so das

C6-C3-C6 (Diphenylpropan) -Flavon-Skelett.

O

A

B

C

1

2

3

45

6

7

8

1`

2`

3`

4`

5`

6`

Abb. 1: Grundstruktur von Flavonoiden (modifiziert nach Beecher 2003)

Je nach Sättigungs- und Oxidationsgrad des C-Rings können Flavonoide in die

Unterklassen Flavanone, Flavanole, Flavanonole, Flavone, Flavonole,

Anthocyanidine und Isoflavone eingeordnet werden (Abb.2). Wie in der

Abbildung 3 am Beispiel der Flavonole dargestellt, sind innerhalb der

Unterklassen weitere Differenzierungen aufgrund von Hydroxylierung,

Glykosylierung und Methylierung am Ringsystem möglich (Robards et al. 1999).

Literaturübersicht

4

O

O

O

OH

Flavanone

Flavanole

O

OHO

O

O

Flavanonole Flavone

O

OOH

O

OH

+

Flavonole Anthocyanidine

O

O

Isoflavone

Abb. 2: Struktur der Unterklassen von Flavonoiden

Literaturübersicht

5

Abb. 3: Hydroxylierungs-, Methylierungs- und Glykosylierungsmuster verschiedener Flavonole

Zu den häufigsten Vertretern der Flavonole, welche sich durch eine

Doppelbindung zwischen C-Atom 2 und 3 sowie eine 4-Oxo-Gruppe und einer

Hydroxylgruppe an Position C-3 auszeichnen, zählen Quercetin, Kaempferol,

Myricetin und Isorhamnetin. Flavonoide kommen in Pflanzen überwiegend als

Glykoside mit D-Glukose, D-Galaktose, L-Rhamnose, D-Xylose, L-Arabinose

oder auch mit Disacchariden wie Rutinose vor, die überwiegend ß- glykosidisch

an das Flavonoid-Aglykon gebunden sind. Die Bindung des Zuckerrestes erfolgt

bevorzugt an der C- 3-Position (Herrmann 1988, 1990, Williams & Harborne

1994). Die Glykosylierung erhöht u. a. die Löslichkeit der Flavonoide im

wässrigen Millieu und reduziert die Reaktivität gegenüber freien Radikalen

(Urquiaga & Leighton 2000).

Flavonole R1 R2 R3

Quercetin OH H H

Kaempferol H H H

Isorhamnetin OCH3 H H

Myricetin OH OH H

Isoquercitrin OH H Glucose

Spiraeosid OH Glucose H

Rutin OH H Rutinose

O

OOR3

R

HO

OH

OH

R2

1

Literaturübersicht

6

2.2 Vorkommen und Aufnahme von Flavonoiden mit der Nahrung

Flavonoide kommen praktisch in allen höheren Pflanzen vor und werden deshalb

kontinuierlich in geringen Mengen mit der Nahrung z. B. über Früchte, Gemüse,

Getreide, Nüsse, Gewürze, Tee und Wein aufgenommen (Hertog & Katan 1998,

Verhoeyen et al. 2002). In vielen Nahrungspflanzen sind Flavonole die quantitativ

bedeutendste Gruppe der Flavonoide, wobei Quercetinglykoside wiederum die

Hauptfraktion bilden (Hermann 1976, 1988, 1991). Mehr als 179 verschiedene

Quercetinglykoside sind in der Literatur beschrieben worden (Williams &

Harborne 1986). Hohe Flavonoidgehalte (>30 mg/kg Frischsubstanz) lassen sich

z. B. in Zwiebeln, Grünkohl, Brokkoli, grünen Bohnen, Sellerie, Erdbeeren, Äpfel

und Aprikosen nachweisen. Zwiebeln haben mit 280 bis 490 mg/kg

Frischesubstanz den höchsten Quercetingehalt (Hertog et al. 1992a, Crozier et al.

1997, Hollman & Arts 2000). Doldengewächse, wie z. B. Sellerie und Pastinaken

beinhalten überwiegend das Flavon Luteolin und seine glykosidischen Formen

(Herrmann 1976, 1988, 1991). Die meisten Blüten verdanken ihre Färbung den

Anthocyanidinen, die man ebenfalls überwiegend in glykosidischer Form

(Anthocyanine) in Beerenobst wie Holunder, Schwarze Johannesbeere, Blau- und

Brombeeren vorfindet (Mazza & Miniati 1993, Herrmann 1995, Eder 1996).

Zitrusfrüchte weisen überwiegend Flavanone auf, Isoflavone findet man in

Legumniosen wie Sojabohnen und Flavanole in Tee, Wein und Obst (Bravo

1998). Flavanonole sind nur in geringen Mengen in Pflanzen enthalten

(Rasmussen & Miller Breinholt 2003). Eine kleine Übersicht über die in

pflanzlichen Nahrungsmitteln vorkommenden Flavonoide enthält Tabelle 1.

Literaturübersicht

7

Tab.1: Vorkommen von Flavonoiden in pflanzlichen Nahrungsmitteln

Flavonoidklasse Hauptflavonoid (Aglyka)

Vorkommen in Nahrungsmitteln

Flavonole Quercetin, Kaempferol, Myricetin

Zwiebeln, Brokkoli, Äpfel, Tee

Flavone Apigenin, Luteolin Petersilie, Thymian, Sellerie

Flavanone Naringenin, Hesperedin Citrusfrüchte

Flavanole Epicatechin, Gallocatechin Epigallocatechingallat

grüner Tee, Äpfel, Kakao

Anthocyanidine Cyanidin Kirschen, Trauben

Isoflavone Genistein, Daidzein Sojabohnen, Leguminosen

Da Flavonoide die Pflanze u. a. vor UV-B Bestrahlung schützen (Li et al. 1993),

treten die höchsten Konzentrationen in der Blattepidermis sowie in Blüten und

Früchten auf (Herrmann 1990, Shirley 1996). Eine gesteigerte UV-B Bestrahlung

induziert bei Pflanzen die Synthese von Flavonoiden (Shirley 1996, Treutter

2005). Der Flavonoidgehalt in pflanzlichen Nahrungsmitteln ist nicht konstant,

sondern wird u. a. durch genetische, saisonale und klimatische Faktoren sowie

durch den Reifegrad zum Erntezeitpunkt und die Lagerung beeinflusst. Des

Weiteren kommt es bei der Verarbeitung, wie z. B. Konservierung, Kochen und

Braten zu Verlusten (Hertog et al. 1992a, Patil et al. 1995, Price et al. 1997,

Aherne & O`Brien 2002). Nicht nur aufgrund dieser Fakten ist eine Bestimmung

der täglichen Aufnahme von Flavonoiden über die pflanzlichen Nahrungsmittel

schwierig. Da international unterschiedliche Präferenzen und Verzehrs-

gewohnheiten in den Bevölkerungen existieren und teilweise nur geringe

Kenntnisse über die Flavonoidgehalte in einigen Lebensmitteln bestehen, lässt

sich eine allgemein gültige Aussage über die Flavonoidaufnahme nicht treffen

Literaturübersicht

8

(Aherne & O`Brien 2002, Rasmussen & Miller Breiholt 2003). Hollman & Katan

(1999) schätzten die tägliche Flavonoidaufnahme beim Menschen auf ein paar

hundert Milligramm. Untersuchungen in verschiedenen Ländern ergaben

wesentlich geringere tägliche Flavonoidaufnahmen, die im Bereich von 20 mg

(Vereinigten Staaten, Dänemark, Finnland) bis über 70 mg (Holland) lagen

(Beecher 2003). Hertog et al. (1993) untersuchten die Verzehrsgewohnheiten der

niederländischen Bevölkerung und ermittelten in den relevanten Lebensmitteln

die vorherrschenden Flavonol- (Quercetin, Kaempferol, Myricetin) und

Flavonkonzentrationen (Luteolin, Apigenin). Letztere Studie zeigte, dass die

täglichen Flavonol- und Flavonaufnahmen hier bei durchschnittlich 23 mg lagen,

wobei Quercetin mit 16 mg das dominierende Flavonol ausmachte. Hauptquellen

der Flavonoide waren Schwarztee mit 48 %, Zwiebeln und Äpfel mit 29 % bzw.

7 %. Die Untersuchung von Linseisen et al. (1997) ermittelte eine tägliche

Flavonoid-Aufnahme von ca. 54 mg bei der bayerischen Bevölkerung. Die

Flavonolmenge lag bei ca. 12 mg, von denen ebenfalls Quercetin mit 10,3 mg den

Hauptteil ausmachte.

2.3 Biologische Effekte von Flavonoiden im menschlichen bzw. tierischem Organismus

Ergebnisse, die vornehmlich aus in vitro, ex vivo und Tierstudien stammen,

weisen auf eine Vielzahl gesundheitsfördernder Effekte von Flavonoiden hin.

Dazu zählen u. a. antiinflammatorische, antiallergische, antimikrobielle,

antivirale, antithrombotische und antimutagene bzw. antikarzinogene Wirkungen

(Kandaswami & Middleton 1994). Eine herausragende Rolle spielt dabei das

antioxidative Potential von Flavonoiden, das im Zusammenhang mit Herz-

Kreislauferkrankungen, Krebs und Arthritis, aber auch mit neurodegenerativen

Erkrankungen wie Morbus Alzheimer und Morbus Parkinson diskutiert wird

(Diplock et al. 1998, Behl & Moosmann 2002).

Literaturübersicht

9

2.3.1 Flavonoide als Antioxidantien

Auch unter physiologischen Bedingungen werden im Stoffwechsel aerob lebender

Organismen reaktive Sauerstoffverbindungen (ROS) kontinuierlich gebildet und

erfüllen u. a. bei der Bekämpfung von Infektionen, bei der Regulation des

Zellwachstums und bei Signaltransduktionen wichtige Aufgaben (de Groot 1994,

Halliwell 1997). Exogene Faktoren wie z. B. Nikotinkonsum, UV-Strahlung und

Luftverunreinigungen führen zu einer verstärkten Bildung von ROS, die aufgrund

ihres hohen Reaktionsvermögens u. a. zu Schädigungen von Lipiden, Proteinen

und DNA führen können. Zum Schutz verfügt der Organismus über enzymatische

und nichtenzymatische Abwehrmechanismen. Superoxiddismutasen, Katalasen

und Glutathionperoxidasen sind u. a. Bestandteil des enzymatischen

Schutzsystems. Bei den nichtenzymatischen Antioxidantien kann einerseits

zwischen hydrophilen und lipophilen, andererseits zwischen endogenen und

exogenen Substanzen unterschieden werden. So zählen Ascorbin- und Harnsäure

zu den hydrophilen Antioxidantien, während z. B. Ubiquinon, Carotinoide,

Flavonoide und Vitamin E (α-Tocopherole) zu den lipophilen Antioxidantien

gezählt werden. Glutathion und Harnsäure sind endogene Antioxidantien,

während Ascorbinsäure (z. B. beim Menschen), Carotinoide, Tocopherole und

Flavonoide über die Nahrung aufgenommen werden (Kandaswami & Middleton

1994). Bei einem Ungleichgewicht zwischen Bildung und Abbau von ROS

zugunsten der Bildung entsteht „Oxidativer Stress“. Oxidativer Stress schädigt

u. a. durch Oxidation ungesättigter Fettsäuren Zellmembranen, was zu

Dysfunktionen und Zelllysis führen kann. Des Weiteren beeinflussen ROS sowohl

Strukturproteine als auch Enzyme in ihren Funktionen und schädigen das Erbgut

(Sies 1986, Halliwell & Gutteridge 1999). Oxidativer Stress kann dadurch

begünstigend auf Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Krebs, Diabetes mellitus,

Osteoporose und Arthritis wirken und wird auch mit neurodegenerativen

Erkrankungen wie Morbus Alzheimer und Morbus Parkinson in Verbindung

gebracht (Sies 1993, Behl & Moosmann 2002, Scalbert et al. 2005). An dieser

Stelle muss allerdings klar zum Ausdruck gebracht werden, dass das hohe

Literaturübersicht

10

antioxidative Potential von Flavonoiden überwiegend unter extremen und

unphysiologischen in vitro-Bedingungen nachgewiesen wurde. Phenolische

Hydroxylgruppen der Flavonoide können als Elektronendonatoren radikalische

ROS „abfangen“. Des Weiteren führt eine Doppelbindung des C-Ringes bei den

Flavonen und Flavonolen zusätzlich zu einer Elektronen-Delokalisierung (Youdim

et al. 2002). Sowohl die Anzahl als auch die Positionen der Hydroxylgruppen der

Flavonoide sind für das antioxidative Potential von Bedeutung. Die höchste

antioxidative Kapazität weisen Flavonoide mit vier bis sechs Hydroxylgruppen

auf, wobei die Anordnung in der 3` und 4`-Position des B-Ringes und eine

Hydroxlgruppe am C-3 des C-Ringes häufig mit einer starken Fähigkeit zum

Abfangen von Superoxid-, Peroxyl-, Alkoxyl- und Hydroxylradikale verbunden

ist. Flavonoide mit Hydroxyl- bzw. Methoxylgruppen an den Positionen 3, 5 und

7 der Ringe A und C weisen eine geringere antioxidative Aktivität auf.

Glykosilierungen in Position 3 (z. B. Rutin) führen zu einer deutlichen Minderung

der Fähigkeit, freie Radikale abzufangen (Rice-Evans et al. 1995, Pietta 2000).

Flavonoide sind nicht nur in der Lage, direkt als Radikalfänger zu fungieren,

sondern besitzen auch die Fähigkeit, Übergangsmetalle wie Kupfer und Eisen zu

chelatieren und somit indirekt antioxidativ zu wirken (Thompsen & Williams

1976, Kühnau 1976). Aufgrund ihres amphiphilen Charakters sind Flavonoide in

der Lage, sowohl in wässrigen als auch in lipophilen Kompartimenten zu wirken.

So konnten in vitro-Studien zeigen, dass Flavonoide, insbesondere die Flavonole,

Flavanole und Isoflavane, die Oxidation von Low-Density-Lipoproteinen (LDL)

hemmen. Oxidierte LDL spielen die Schlüsselrolle in der Pathogenese

arteriosklerotischer Veränderungen. Die Oxidation der LDL erfolgt nicht nur

durch den Einfluss freier Radikale, sondern ebenfalls durch zelluläre

Dioxygenasen wie der 15-Lipooxygenase. Da Silva et al. (1998) zeigten in ihrer

Studie, dass Quercetinglykoside und Quercetinaglykon eine Lipoyxgenase-

induzierte LDL-Oxidation effizienter hemmen können als Ascorbinsäure und

Vitamin E. Neben den Lipoxygenasen werden auch andere Enzyme, die zur

Bildung von ROS führen wie z. B. die NADPH-Oxidase, Xanthinoxidase,

Cyclooxygenasen und Myeloperoxidase, durch Flavonoide gehemmt (Tauber et

Literaturübersicht

11

al. 1984, Pincemail et al. 1988, Pietta 2000). Flavonoide können in ihrer

Eigenschaft als Radikalfänger endogene antioxidative Schutzmechanismen des

Organismus unterstützen. Das lipophile Vitamin E schützt Zellmembranen vor

den oxidativen Angriffen radikaler Verbindungen und wird dabei selbst zum

Radikal, welches aber im Vergleich zu den Lipidperoxyl-Radikalen

reaktionsträger ist und mit Hilfe von Vitamin C und Glutathion wieder regeneriert

wird (Van Acker et al. 1993). Flavonoide können die Oxidation von

α-Tocopherol in LDL hemmen, indem sie selbst oxidiert werden und können

zudem zur Regenerierung des α- Tocopheroxylradikal beitragen (Torel et al.

1986, De Whalley et al. 1990, Frankel et al. 1993, Bravo 1998, Zhu et al. 1999).

Die ex vivo-Untersuchung von Van Acker et al. (2000) an α-Tocopherol-armen

Lebermikrosomen zeigte, dass Flavonoide die antioxidative Funktionen des

α-Tocopherols in Membranen übernehmen können.

Die Metabolisierung von Quercetin durch Methylierung oder Konjugation mit

Glucuroniden oder Sulfaten senkt die antioxidative Aktivität (Prior 2003). Shirai

et al. (2001) haben u. a. Quercetin-3-O-ß-D-Glucuronid (Q3G) bezüglich der

Hemmung der Lipidperoxidation an einem Biomembranmodell untersucht. Die

Ergebnisse dieser Studie ergaben, dass Q3G eine durch ROS induzierte

Fettsäureperoxidation hemmen kann, jedoch eine signifikant geringere Wirkung

im Vergleich zum Quercetinaglykon aufweist. Auch Da Silva et al. (1998)

konnten in ihrer Rattenstudie einen hemmenden Einfluss von

Quercetinmetaboliten auf eine mit Kupfer induzierte Lipidperoxidation

nachweisen.

Im Rahmen der systemischen Verfügbarkeit von Flavonoiden ist zu beachten,

dass Flavonoide - zumeist in vitro - eine hohe Bindungsaffinität zu Albumin

zeigen (Dufour & Dangles 2005). So werden mehr als 98 % des Quercetins an

Albumin gebunden (Gugler at al. 1975). Es stellt sich somit die Frage, ob

proteingebundenes Quercetin bzw. proteingebundene Quercetinmetaboliten

ebenfalls antioxidative Eigenschaften besitzen. Neuere Studien mit bovinen und

humanen Serumalbuminen belegen, dass eine kovalente Bindung mit Quercetin

und seiner Derivate und Konjugate die Fähigkeit, LDL-Partikel vor Oxidationen

Literaturübersicht

12

zu schützen, beibehalten. Jedoch ist die Proteinbindung mit einer Abnahme der

antioxidativen Aktivität verbunden (Janisch et al. 2004, Rohn et al. 2004, Dufour

et al. 2007).

Darüberhinaus sei darauf hingewiesen, dass eine Vielzahl von Studien mit

kontroversen Ergebnissen vorliegen. Beispielsweise konnten Ishikawa et al.

(1997) durch eine Supplementierung mit Tee-Flavonoiden einen Anstieg der

LDL-Resistenz gegenüber Oxidationen nachweisen, wohingegen Princen et al.

(1998) durch einen Konsum von Grün- und Schwarztee keinen Effekt auf die

LDL-Oxidation verzeichnen konnten.

Wie schon mehrfach erwähnt, beruht der Großteil der beschriebenen

antioxidativen Fähigkeiten von Flavonoiden und der daraus postulierten

gesundheitsfördernden Effekte auf den menschlichen und tierischen Organismus

auf in vitro-bzw. ex vivo-Untersuchungen. Bei der Übertragung dieser Ergebnisse

auf die in vivo-Situation muss vor allem die Bioverfügbarkeit (s. 2.4)

berücksichtigt werden. Zudem existieren zur Zeit nur wenige Studien, die sich mit

den antioxidativen Fähigkeiten der im systemischen Kreislauf zirkulierenden

Flavonoidmetaboliten befasst haben. In epidemiologischen Studien von Hertog et

al. (1994, 1995) konnte gezeigt werden, dass die Höhe der täglichen

Flavonoidaufnahme eine signifikante inverse Beziehung zu der Sterblichkeit an

Herz-Kreislauf-Erkrankungen zeigte. Hinsichtlich postulierter antikarzinogener

Effekte von Flavonoiden konnte jedoch kein Einfluss der Flavonoidaufnahme auf

das Gesamtkrebsrisiko bzw. auf das Auftreten von Darm- und Lungenkrebs

nachgewiesen werden (Hertog et al. 1994).

Grundsätzlich ist ein Vergleich verschiedener Studienergebnisse aufgrund

unterschiedlicher Versuchsanordnungen und Versuchsbedingungen schwierig und

die Übertragbarkeit auf die tatsächliche in vivo-Situation zur Zeit nur sehr

eingeschränkt möglich. Abschließend ist noch zu erwähnen, dass Polyphenole

nicht nur antioxidative, sondern unter bestimmten Bedingungen (z. B. der

pH-Wert in Geweben) sogar prooxidative Effekte aufweisen (Morgan et al. 1997,

Literaturübersicht

13

Decker 1997, Miura et al. 1998). Als Prooxidantien schädigen sie DNA,

Kohlenhydrate oder Proteine (Aruoma et al. 1997). Sie induzieren jedoch u. a.

auch Apoptosen und verhindern das Tumorwachstum (Lambert et al. 2005).

2.3.2 Einfluss auf Enzyme, Signaltransduktion und Genexpression

Die in einer Vielzahl von Untersuchungen postulierten neuroprotektiven,

cardioprotektiven und chemopräventiven Eigenschaften von Flavonoiden können

nur teilweise durch direkte antioxidative Wirkungsmechanismen zurückgeführt

werden. So halten es Autoren einiger Studien für unwahrscheinlich, dass

Flavonoide in ihrer antioxidativen Funktion als Elektronen-Donatoren in der Lage

sind, Effekte auf zellulärer Ebene zu erzielen (Spencer et al. 2001, Schroeter et al.

2001). Diese Aussage wird dadurch gestützt, dass oral aufgenommene Flavonoide

intensiv metabolisiert werden und durch Phase I - und Phase II-Reaktionen in

Darmmucosa und Leber die Konzentrationen der Flavonoide und deren

Metaboliten in vivo im Plasma und in Organen wesentlich geringer sind als z. B.

die Konzentration etablierter Antioxidantien wie Ascorbinsäure und α-Tocopherol

(Halliwell et al. 2000, Abd El Mohsen et al. 2002). Vielmehr scheinen biologische

Effekte der Flavonoide und deren Metaboliten auf Interaktionen mit

Schlüsselenzymen, Transportern, Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren und mit

Effekten auf die Genexpressionen zu beruhen (Middleton et al. 2000, Wadsworth

et al. 2001, Gupta & Panda 2002). Flavonoide und ihre Metaboliten üben

modulierende Effekte auf verschiedene Proteinkinasen wie z. B.

Phosphatidylinositol-3-Kinase, Tyrosin-Kinasen, Proteinkinase-C und

verschiedene Mitogen-aktivierte-Proteinkinasen (MAP) aus. Die inhibitorischen

Effekte auf diese Enzyme wirken sich auf den Phosphorylierungsstatus von

Schlüsselmolekülen aus, welche einen Einfluss auf die Steuerung wichtiger

Zellfunktionen wie z. B. Proliferationen, Differenzierungsvorgänge und

Apoptosen haben und/oder modulierende Effekte auf Genexpressionen ausüben

(Signaltransduktionswege). Am Ende solcher Signaltransduktionswege stehen

Literaturübersicht

14

Transduktionsfaktoren, welche sich an die Promoterregionen der Zielgene binden

und so die Transkription beeinflussen (van den Berg et al. 2001). Zu den

redoxsensitven Transkriptionsfaktoren zählt man den Nuklear-Transkriptions-

Faktor κB (NF- κB), der für die Transkription von Genen verantwortlich ist, die

entzündliche Prozesse bzw. Krankheiten wie Arthritis, Asthma, Atheriosklerose,

AIDS und Krebs auslösen können (Chen et al. 1999). Die Aktivierung von NF-

κB kann durch Flavonoide (Quercetin) gehemmt werden (Musonda & Chipman

1998). Nair et al. (2006) zeigten, dass eine durch Quercetin induzierte Hemmung

von NF- κB zu einer verminderten Expression des Tumor-Nekrose-Faktor-α

(TNF-α) in CD4+ T-Zellen und CD14+ Monocyten führt. TNF-α ist als

proinflammatorisches Cytokin bei chronischen Entzündungserkrankungen

involviert. Auch beeinflussen Flavonoide Aktivator-Protein-1 (AP-1), Hitze-

Schock-Faktoren (HSF), die zur Klasse der MAP-Kinasen gehörenden p38-

mitogenaktivierte Proteinkinase (p38-MAPK) und die c-Jun-N-terminalen-

Kinasen (JNK), welche alle an der Induktion von Genen beteiligt sind, die

modulierend auf Differenzierung, Proliferation, Apoptose und Zellalterung wirken

(Ishikawa & Kitamura 2000, Schroeter et al. 2001, Youdim et al. 2002). Ebenso

können die zur Familie der ABC-Transporter gehörenden „Multidrug-Resistent-

Associated-Proteins“ (MRPs) wie MRP1, MRP4 und MRP5 durch Flavonoide

gehemmt, bzw. die in Tumorgeweben vermehrte Expression dieser Transporter

durch den Einsatz von Polyphenolen vermindert werden (Mei et al. 2004, Wu et

al. 2005, Munoz et al. 2007). In vitro- und in vivo-Studien haben sowohl

hemmende als auch induzierende Effekte von Flavonoiden auf verschiedene

Cytochrom P450-Isoenzyme gezeigt (Trela & Carlson 1987, Obermeier et al.

1995). Die Induktion der Isoenzyme CYP1A1 und CYP1A2 wird mit

verschiedenen Krebsformen in Verbindung gebracht (Kawajiri et al. 1993). Die

Studie von Zhai et al. (1998) ergab, dass einige Flavonoide mit hoher

Wirksamkeit und Selektivität die CYP1A Isoenzyme kompetitiv hemmen und

somit zur Krebsprävention beitragen könnten. Zudem können Flavonoide den

Arachidonsäuremetabolismus in vielfacher Weise modulieren und infolgedessen

Entzündungsprozesse beeinflussen. Flavonoide beeinflussen des Weiteren

Literaturübersicht

15

Enzyme wie z. B. Glutathion S-Transferase, Malat-Dehydrogenase, Pyruvat-

Kinase, RNA- und DNA-Polymerase, Topoisomerase, HIV-1-Proteinase und

HIV-1-Integrase (Middeleton et al. 2000).

Abschließend sei erwähnt, dass auch die in diesem Abschnitt aufgeführten Effekte

ebenfalls überwiegend aus in vitro-Studien abgeleitet sind und zumeist Aglyka in

unphysiologischen Konzentrationen eingesetzt wurden (Kroon et al. 2004).

2.4 Bioverfügbarkeit von Quercetin und Rutin

Die postulierten gesundheitsfördernden Effekte setzen eine ausreichend hohe

Bioverfügbarkeit voraus. Die Bioverfügbarkeit eines Stoffes umfasst die

Absorption aus dem Gastrointestinaltrakt (GIT), die systemische Verteilung und

Metabolisierung sowie die Ausscheidung. Da sich die vorliegende Arbeit mit dem

Flavonol Quercetin beschäftigt, wird im Folgenden auf die Bioverfügbarkeit

dieses Flavonols näher eingegangen.

Gugler et al. (1975) konnten in ihrer Humanstudie nach oraler Applikation von

4 g Quercetinaglykon weder im Plasma noch im Urin messbare Konzentrationen

von Quercetin und/oder seiner Metaboliten nachweisen. Man ging davon aus, dass

weniger als 1 % der verabreichten Dosis absorbiert wurde. Spätere

Untersuchungen an ileostomierten Probanden ergaben nach Aufnahme von

gedünsteten Zwiebeln eine Bioverfügbarkeit von 52 % für Quercetinglykoside, für

das Aglykon 24 % und für Rutin 17 % (Hollman et al. 1995). In einer weiteren

Folgestudie an Probanden mit intaktem Darm zeigte sich, dass die

Bioverfügbarkeit von Quercetin aus Äpfeln und Quercetin-3-O-Glukorhamnosid

(Rutin) um 30 % geringer war als die Bioverfügbarkeit von Quercetin aus

Zwiebeln. Hollman et al. (1997) schlossen daraus, dass die Art des gebundenen

Zuckerrestes eine bedeutende Rolle bei der Absorption und damit auf die

Bioverfügbarkeit der Flavonole spielt. Weiter nahm man an, dass das frühe

Auftreten der maximalen Plasmakonzentrationen nach Aufnahme der

Literaturübersicht

16

zwiebelhaltigen Mahlzeit für eine Absorption der Quercetinglykoside im vorderen

Dünndarm sprechen könnte und dass Quercetinaglyka aus ß-Glukosiden erst nach

vorhergehender mikrobieller Deglykosilierung im Dickdarm absorbiert werden

können. Weitere in vivo-Untersuchungen an Menschen und Tieren konnten diese

Ergebnisse bestätigen (Manach et al. 1997; McAnlis et al. 1999; Hollman et al.

1999; Graefe et al. 2001; Cermak et al. 2003).

Die Untersuchungen zeigen, dass je nach beobachteter Spezies und

Ausgangssubstanz Unterschiede in der systemischen Verfügbarkeit von Quercetin

bestehen. Ueno et al. (1983) ermittelten nach Applikation einer Einmaldosis von

2,3 mg/kg Körpergewicht (KGW) radiaktiv markiertem Quercetin bei der Ratte

eine Absorption von 20 %, wohingegen Graf et al. (2005) nach einer oralen Gabe

von 7,6 mg Quercetin-4’-O-Glucosid pro kg KGW lediglich 6 % der Dosis in der

systemischen Zirkulation nachweisen konnten. Die Untersuchungen von Chen et

al. (2005) ergaben sogar eine 48 %ige Bioverfügbarkeit von Quercetin nach oraler

Applikation des Aglykons (10 mg/kg KGW). Die Bioverfügbarkeitsstudie von

Ader et al. (2000) am Schwein ergab nach oraler Verabreichung von 50 mg

Aglyka/kg KGW über das Futter eine 17 %ige systemische Verfügbarkeit. Neben

den Erkenntnissen, dass die Bioverfügbarkeit vom Glykosylierungsmuster, der

Flavonoidquelle und Spezies abhängig ist, zeigten die Untersuchungen von

Cermak et al. (2003), Lesser et al. (2004) und Tamura et al. (2007) auch einen

Einfluss der Nahrungs- bzw. Futtermittelzusammensetzung auf die orale

Bioverfügbarkeit von Quercetin.

2.4.1 Intestinale Absorptionsmechanismen

Lange Zeit ging man davon aus, dass die oral aufgenommen polaren und damit

wasserlöslichen Flavonoid-Glykoside im oberen Darmtrakt nicht bzw. nur sehr

spärlich absorbiert werden können und erst nach bakterieller enzymatischer

Hydrolyse in den tieferen Darmabschnitten freigesetzten lipophilen Aglyka passiv

absorbiert werden bzw. weiteren Metabolisierungsprozessen unterliegen (Griffiths

Literaturübersicht

17

& Barrow 1972, Bokkenheuser et al. 1987, Manach et al. 1995, 1997).

Humanstudien von Hollman et al. (1995, 1996b, 1999) zeigten, dass maximale

Plasmakonzentrationen von Quercetinäquivalenten bereits innerhalb einer halben

Stunde nach oraler Aufnahme von Quercetin-Glukosiden bzw. erst nach sechs

Stunden nach Applikation des Glukorhamnosids detektiert werden konnten. Als

Erklärung für die bessere Absorption und damit höhere relative Bioverfügbarkeit

des Quercetins aus dem Glukosid wurde der aktive Transport des Glukosids über

den in der Bürstensaummembran des Dünndarms lokalisierten Na+-

Glukosetransporter SGLT1 (Sodium depend glucose transporter 1) postuliert.

Diese Hypothese stützte sich auf die Untersuchungen von Mizuma et al. (1993,

1994), welche zeigten, dass bei der Ratte ß-Glukoside und ß-Galaktoside des

p-Nitrophenols und ß-Napthols mittels des SGLT1 transportiert werden. Auch die

Studien von Gee et al. (1998, 2000) an umgestülpten Darmsäckchen weisen auf

eine Interaktion zwischen Quercetin-3-Glukosid, Quercetin-4’-Glukosid, nicht

aber von Quercetin-3,4’-Diglukosid und dem SGLT1 hin. Diese Studien zeigten

ferner, dass Quercetin-Glukoside während des Absorptionsvorganges bzw. im

Cytosol Deglykosilierungs- und Konjugationsprozessen unterliegen und das

freigesetzte Aglykon aufgrund des lipophilen Charakters passiv in die Enterozyten

diffundieren kann. Walgren et al. (2000b) konnten erstmals den direkten Na+ -

abhängigen Transport von Quercetin-4’-Glukosid sowohl an humanen CaCo-2-

Zellen als auch an SGLT1 transfizierten Hamsterovarzellen (G6D3-Zellen)

nachweisen. Die Aufnahme konnte durch Glukose und Phloridzin gehemmt

werden. Außerdem ergab diese Studie, dass Quercetin-4’-Glukosid über den in

der apikalen Bürstensaummembran lokalisierten Multidrug Resistance Accociated

Protein 2 (MRP2) resezerniert wird, was eine verringerte Nettoabsorption zur

Folge hat. Dies könnte eine mögliche Erklärung dafür sein, dass in früheren

Experimenten keine Absorption von Quercetin-4’-Glukosid mittels des SGLT1

nachgewiesen werden konnte (Walgren et al. 2000a, b). Studien von Ader et al.

(2001), Wolffram et al. (2002) sowie Cermak et al. (2004) zeigten, dass neben

Quercetin-4’-Glukosid (Spiraeosid) ebenfalls Quercetin-3-Glukosid

(Isoquercitrin), nicht aber Quercetin-3-O-Galaktosid, Quercetin-3-O-

Literaturübersicht

18

Glukorhamnosid oder Quercetinaglykon, die Na+-abhängige-Glukoseaufnahme

über den nur im Jejunum exprimierten SGLT1 hemmen können. Die Beteiligung

des SGLT1 an der Absoprtion der genannten Quercetinmonoglukoside könnte

auch deren höhere Bioverfügbarkeiten im Vergleich zum Aglykon und

komplexeren Quercetinglykosiden erklären (Hollman et al. 1999, Crespy et al.

2001, Cermak et al. 2003).

Die Position und die Art des gebundenen Zuckermoleküls spielen für die

Deglykosylierung und Absorption im GIT eine entscheidende Rolle (Day et al.

1998). Wie bereits eingangs erwähnt, ging man davon aus, dass aufgrund des

Fehlens körpereigener Enzyme eine Spaltung von ß-glykosidischen Verbindung

nicht möglich sei, sondern erst die mikrobiellen Enzymsysteme im distalen

Darmtrakt eine Spaltung dieser Verbindung ermöglichen. Mittlerweile sind jedoch

drei ß-Glukosidasen bei Säugetieren identifiziert, die eine Rolle bei der

Metabolisierung von Flavonoiden spielen. Zwei dieser Enzyme sind

membrangebunden. Die lysosomale Glukocerebrosidase (EC 3.2.1.62), welche

Glukosylceramide hydrolysiert, und die Laktase-Phlorizin-Hydrolase (EC

3.2.1.108; LPH), die im Dünndarm primär für die Hydrolyse der Laktase

verantwortlich ist. Das dritte Enzym ist eine cytosolische ß-Glukosidase (EC

3.2.1.21), welche überwiegend in Leber, Nieren und Dünndarm von Säugetieren

lokalisiert ist und u. a. an der Detoxifikation von Xenobiotika beteiligt ist (Hays et

al. 1996, Day et al. 1998). Ioku et al. (1998) wiesen in ihren Untersuchungen eine

ß-Glukosidase-Aktivität im Dünndarmtrakt der Ratte nach, wobei die ß-

Glukosidase des Jejunums die größte Aktiviät aufwies. Die hydrolytische

Effizienz wurde an verschiedenen Quercetinmonoglukosiden sowie an Rutin

untersucht. Es zeigte sich, dass Quercetin-4’-Glukosid das bevorzugte Substrat

der ß-Glukosidase war, die gegenüber Rutin nur eine geringe Affinität aufweist.

Day et al. (1998) kamen ebenfalls zum Ergebnis, dass die ß-Glukosidase eine

hohe Affinität gegenüber Quercetin-4’-Glukosid aufweist. Des Weiteren konnte

auch hier bestätigt werden, dass u. a. Quercetin-3,4’-Diglukosid, Quercetin-3-

Glukosid und Rutin keine Substrate der hepatischen- als auch der intestinalen ß-

Glukosidasen sind. Mit Ausnahme der LPH handelt es sich bei den oben

Literaturübersicht

19

genannten ß-Glukosidasen um intrazelluläre Enzyme, was eine intakte Aufnahme

von Flavonoid-Glukosiden in die Enterozyten voraussetzt. Die LPH ist ein

bürstensaummembranständiges Enzym mit zwei katalytischen Zentren, wobei

eines die Hydrolyse von Laktose und das zweite Zentrum in die Deglykosilierung

hydrophober Substrate wie Phlorizin involviert ist. Überraschenderweise weist

das Laktase-Zentrum eine höhere Glukosidase-Aktivität auf und ist überwiegend

für die Hydrolyse der Flavonoid-Glukoside verantwortlich (Morand et al. 2000,

Day et al. 2000). Day et al. (2000) zeigten, dass die LPH aus dem Dünndarm von

Schafen u. a. Quercetin-4’-Glukosid, Quercetin-3-Glukosid und Quercetin-3,4’-

Diglukosid, nicht aber Rutin deglykosilieren. Die bei der luminalen Hydrolyse

entstehenden Aglyka gelangen per Diffusion in die Enterozyten.

Konjugationsprozesse mit Glukuroniden und Sulfaten mit anschließender basaler

Sekretion halten den Konzentrationsgradienten für die passive Aufnahme der

Aglyka aufrecht (Day et al. 2000). In Übereinstimmung mit den oben

beschriebenen Ergebnissen aus den Bioverfügbarkeitsstudien mit oraler

Rutinapplikation und der Erkenntnis, dass Rutin weder Substrat der LPH noch der

cytosolischen ß-Glukosidasen ist und keine körpereigenen ß-Rhamnosidasen

existieren, passieren nicht absorbierte Quercetin-Glykoside und insbesondere

Quercetin-Rutinoside unverändert den Dünndarm und unterliegen im Dickdarm

der mikrobiellen Hydrolyse und Degradation (Hollman et al. 1995, Scalbert &

Williamson 2000, Németh et al. 2003). Mögliche Absorptions- und

Meabolisierungsprozesse von Quercetin-Glukosiden im Dünndarm sind aus der

Abbildung 4 zu entnehmen.

Literaturübersicht

20

Glukosideapikal

basal

cytosolischeß-Glukosidase

Konjugation3

4

1

SGLT1 MRP2

LPH

2 Aglyka

Konjugation

3

4

Diffusion

Glukuronide/Sulfate

5

?

Abb. 4: Postulierte Absorptions- und Metabolisierungsprozesse von Quercetin-Glukosiden im Dünndarm (modifiziert nach Murota & Terao 2003)

1: Quercetin-Glukoside werden aktiv über den SGLT1 absorbiert und im Folgenden durch die cytosolische ß-Glukosidase hydrolisiert oder über den MRP-2 wieder ins Lumen resezerniert. 2: Quercetin-Glukoside werden durch die luminale LPH hydrolisiert und das Aglykon gelangt passiv per Diffusion in die Epithelzellen. 3: Quercetinaglykon wird in der Mucosa durch UDP-Glukuronyltransferasen und/oder Phenol-Sulfotransferasen in konjugierte Metaboliten konvertiert. 4/5: Konjugierte Metaboliten gelangen in die Vena portae (4) oder werden ins Lumen abgegeben (5). LPH, Laktase-Phloridzin-Hydrolase; SGLT1, Sodium dependent glucose transporter 1; MRP-2, Multidrug Resistance Associated Protein 2.

2.4.2 Metabolisierung und Ausscheidung

Die im Darmepithel aufgenommenen bzw. nach Hydrolyse in den Enterozyten

freigesetzten Aglyka unterliegen Phase-I- und Phase-II-

Metabolisierungsvorgängen. Cytochrom P450-Monooxigenasen sind an

Hydroxylierungs- und Demethylierungsreaktionen von Flavonolen beteiligt.

Literaturübersicht

21

Voraussetzung für die Hydroxylierungen ist das Fehlen bzw. das Vorhandensein

einer Hydroxylgruppe am B-Ring. Zwei und mehr Hydroxylierungen des B-Ring

verhindern weitere Hydroxylierungsvorgänge. Demethylierungen werden

überwiegend an der 4’-Position, weniger an der 3’-Position beobachtet (Nielsen et

al. 1998, Williamson et al. 2000). Es ist jedoch nicht davon auszugehen, dass mit

der Nahrung aufgenommene Flavonoide in vivo einem ausgeprägten Phase-I-

Metabolismus unterliegen, da diese bereits Hydroxylgruppen in der

Ausgangsform enthalten und empfänglich für Phase-II-Konjugationen sind (Day

et al. 2004). Im Falle von Quercetin spielen insbesondere Konjugationen der

Hyxdroxylgruppen mit Glukuronsäuren, Sulfaten und Methylgruppen eine Rolle.

Die Catechol-O-Methyltransferase (COMT) methyliert Flavonole überwiegend in

Leber und Niere (Tilgmann & Ulmanen 1996), wird aber ebenfalls in den

Enterozyten exprimiert (Piskula & Terao 1998a). Die Methylierung des

Quercetins scheint bei Ratten im Vergleich zum Menschen eine stärkere Rolle zu

spielen. In der Humanstudie von Manach et al. (1998) konnte 3’-Methylquercetin

in einer Konzentration von 0.1-0.2 µmol/l im Plasma nachgewiesen werden, was

nur 20-30 % der Gesamtquercetinkonzentration entsprach. Bei Ratten hingegen

findet man überwiegend methylierte Quercetinmetabolite, v. a. Isorhamnetin in

Plasma (ca. 70 %), Galle und Urin, da die COMT bevorzugt die 3’-Position

(Isorhamnetin) im Vergleich zur 4’-Position (Tamarixetin) zu methylieren scheint

(Manach et al. 1995, 1996, Williamson et al. 2000).

Die UDP-Glukuronyltransferasen (UDPGT, UGT) - im Besonderen aus der

Familie der UGT1A - katalysieren die Konjugation der Flavonoide mit

Glukuronsäuren in Dünndarm, Leber und Niere.

Die Phenol-Sulfotransferasen (P-PST, SULT) bilden eine kleine Gruppe von

cytosolischen Enzymen, die Sulfatreste auf Hydroxylgruppen übertragen. Die

Sulfotransferasen aus den Familien der SULTA1 und SULTA3 weisen

überwiegend in der Leber bzw. im Kolon hohe Aktivitäten auf (Scalbert &

Williamson 2000). Auf den Umfang der Konjugationen wird später eingegangen

(s. S. 24).

Literaturübersicht

22

Wie bereits angedeutet, existieren hinsichtlich der möglichen

Konjugationsreaktionen enzym- und speziesspezifische Unterschiede. Bei Mensch

und Ratte werden überwiegend methylierte Sulfat- und Glukuronidkonjugate des

Quercetins nachgewiesen (Morand et al. 1998, Piskula & Terao 1998b),

wohingegen bei Schweinen keine Sulfatkonjugate und bei Katzen keine

Quercetinsglukuronidate gefunden wurden (Gibson & Skett 1994).

Die Quercetinmetaboliten werden zum Teil wieder ins Darmlumen resezerniert

oder gelangen über die Vena portae zur Leber, unterliegen dort weiteren

Konjugationen durch hepatische Phase-I- und Phase-II-Enzyme, bevor sie über

die systemische Zirkulation ihre Zielgewebe erreichen bzw. über die Galle wieder

ins Dünndarmlumen sezerniert und reabsorbiert werden können (Morand et al.

1998, Crespy et al. 1999, Day et al. 2004). Murota & Terao (2005) konnten in

einer Rattenstudie neben den in der Lymphe üblicherweise enthaltenden Lipiden

und/oder lipidhaltigen Verbindungen Quercetinkonjugate, aber kein Aglykon

nachweisen. Die höchsten lymphatischen Konzentrationen an Quercetin-

konjugaten (2,54 ± 0,43 µmol/l) konnten bereits eine halbe Stunde nach

Infusionsbeginn ermittelt werden.

Flavonole, die über den enterohepatischen Kreislauf wieder ins Dünndarmlumen

abgegeben und nicht reabsorbiert werden, erreichen zusammen mit den im

Dünndarm nicht absorbierten Flavonoiden, wie z. B. Rutin, das Kolon, wo sie

einer intensiven mikrobiellen Verstoffwechselung unterliegen. Das Kolon enthält

ca. 1012 Mikroorganismen/cm3, welche ein enormes katalytisches und

hydrolytisches Potential aufweisen. Mit ihren ß-Glucosidasen, ß-Rhamnosidasen

und Esterasen sind sie in der Lage glykosidische Bindungen bzw. Esterbindungen

zu hydrolysieren. Einige Bakterienarten sind ausschließlich nur zur

Verstoffwechselung des Zuckerrestes befähigt. So setzt z. B. Enterococcus

casseliflavus den Zuckerrest des Quercetins-3-Glukosids zu Formiat, Acetat und

Laktat um. Das Aglykon wird nicht weiter umgesetzt. Dieses kann im Kolon

absorbiert werden, oder von anderen Mikroorganismenarten durch Spaltung des

Flavonoid-Grundgerüstes durch z. B. Clostridium orbiscindens und Eubacterium

Literaturübersicht

23

ramulus zu hydroxylierten Phenolsäuren abgebaut werden (Kühnau 1976,

Heilmann & Merfort 1998a,b, Hollman & Katan 1998, Braune et al. 2001,

Schoefer et al. 2003, Blaut et al. 2003). Als Hauptabbauprodukt des Aglykons aus

Quercetinglukuroniden, -glykosiden und auch aus -rutinosiden entsteht u. a.

3,4-Dihydroxyphenylessigsäure, welche zum Teil zu 3-Hydroxyphenylessigsäure

umgesetzt wird. Diese beiden Phenylessigsäuren gelangen in die systemische

Zirkulation. 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure wird in der Leber zu 3-Methoxy-4-

Hydroxyphenylessigsäure umgewandelt und zusammen mit

3-Hydroxyphenylessigsäure und 3,4 Dihydroxyphenylessigsäure über den Urin

ausgeschieden (Jaganath et al. 2006). Des Weiteren wurden noch Mono-

Hydroxyhippursäuren im Urin der Probanden nachgewiesen.

Die Tierstudie von Ueno et al. (1983) mit radioaktiv markierten Quercetin ergab,

dass bei der Spaltung des Flavon-Skeletts als Hauptabbauprodukt des A-Ringes

2,4,6-Trihydroxybenzoesäure entsteht, welche bis zu Kohlendioxid oxidiert wird.

Auch Walle et al. (2001) stellten in ihrer Humanstudie fest, dass sowohl nach

oraler als auch intravenöser Applikation von radioaktiv markiertem Quercetin,

Kohlendioxid als Hauptmetabolit (23 % bis 81 %) bei der Verstoffwechselung des

Flavonols gebildet und mit der Atemluft abgegeben wird. In Urin und Faeces der

Probanden konnten unabhängig von der Applikationsart nur <10 % der

applizierten Menge des [14C]-Quercetins wieder gefunden werden.

Nicht alle Flavonoidmetaboliten, die das Kolon erreichen unterliegen auch einem

Abbau. Die Abwesenheit von Hydroxylgruppen an den Positionen 5, 7 und/oder

4’ oder die Methylierung an diesen Positionen können das Flavonoid vor der

mikrobiellen Ringspaltung schützen (Rice-Evans 2001).

2.4.3 Plasmatransport und Gewebeverteilung

Die absorbierten Flavonole, die in den Blutkreislauf gelangen, zirkulieren zum

überwiegenden Teil nicht in freier Form, sondern weisen umfangreiche

Interaktionen mit Plasmaproteinen auf (Boulton et al. 1998, Janisch et al. 2004,

Literaturübersicht

24

Papadopoulou et al. 2005, Martini et al. 2008). Die in vitro-Untersuchung von

Boulton et al. (1998) mit radioaktiv markiertem [14C] Quercetin zeigte, dass das

Quercetinaglykon zu 99,4 % an humanes Serumalbumin gebunden wurde. Ein

geringer Anteil des Quercetins wurde an α1-Glykoprotein gebunden bzw. fand

sich in den Low-Density-Lipoproteinen (LDLs) wieder. Janisch et al. (2004)

untersuchten das Bindungsverhalten zwischen humanem Serumalbumin und

Quercetinkonjugaten und stellten fest, dass auch Quercetinkonjugate in

Abhängigkeit von der Konjugationsart unterschiedliche Affinitäten zum humanen

Serumalbumin aufweisen und Bindungen eingehen (Quercetin-3’-Sulfat =

Quercetin ≥ Quercetin-7-Glukuronid > Quercetin-3-Glukuronid = Quercetin-3-

Glukosid > Isorhamnetin-3-Glukuronid > Quercetin-4’-Glukuronid). Die Affinität

zwischen den verschiedenen Flavonoiden und den Plasmaproteinen wird u. a.

durch die Hydrophobie der Verbindung, die An- bzw. Abwesenheit funktioneller

Gruppen sowie die sterischen Anordnung bestimmt (Diniz et al. 2008).

Beispielsweise erhöht sich die Affinität zum bovinen Serumalbumin mit

steigender Anzahl von Hydroxylgruppen am B-Ring, wohingegen die Substitution

von Glykosiden am C-Ring zu einer verminderten Affinität führt (Xiao et al.

2008).

Im Anschluss an die Absorption findet die systemische Verteilung im Organismus

statt. Mullen et al. (2002) untersuchten die Flavonolmetaboliten im Plasma und

die Gewebeverteilung nach oraler Aufnahme von radioaktiv markiertem [14C]

Quercetin-4’-Glukosid bei Ratten. Nach 60 min konnten ca. 94 % der

Gesamtradioaktivität im GIT in Form von 18 verschiedenen methylierten,

glukuronierten und/oder sulfatierten Quercetinkonjugaten wiedergefunden

werden. Im Vergleich zu denen im Darmtrakt nachgewiesenen Mengen an

Quercetinkonjugaten fanden sich nur noch geringe Mengen der Metaboliten in

Plasma (2,8 %), Leber (1,2 %), Nieren (0,8 %) und im Muskelgewebe (1,4 %)

wieder. Nur im Darm und in der Leber wurden geringe Mengen an freiem

Quercetin detektiert. In Plasma und Nieren wurden hingegen nur Konjugate

(Glukuronide/Sulfate) nachgewiesen. In einer weiteren Studie wurden innerhalb

Literaturübersicht

25

von 2 Stunden 85 % des applizierten [14C] Quercetin-4’-Glukosids in Form von

mehr als 20 Metaboliten im Darmtrakt nachgewiesen. Lediglich 6 % erreichten

die systemische Zirkulation und Zielorgane, vor allem Leber und Nieren. Fünf

Stunden nach der Aufnahme fanden sich in Darm, Leber und Nieren überwiegend

Quercetindiglukuronide wieder, wohingegen im Plasma glukuronidierte Sulfate

und methylierte Quercetinderivate zirkulierten (Graf et al. 2005). De Boer et al.

(2005) untersuchten in einer Langzeitstudie die Gewebeverteilung von Quercetin

bzw. der Quercetinmetaboliten in zwölf Organen bei Ratten. Die Tiere erhielten

über einen Zeitraum von 11 Wochen eine 0,1 bzw. 1 % quercetinangereicherte

Diät, was einer Dosis von 50 bzw. 500 mg/kg KGW entsprach. Die höchsten

Konzentrationen von Quercetin sowie den methylierten Quercetinmetaboliten

Isorhamnetin und Tamarixetin konnten - abgesehen vom Plasma - in den Lungen

nachgewiesen werden (3,98 bzw. 15,3 nmol/g Gewebe). Die geringsten

Konzentrationen wiesen Gehirn, weißes Fettgewebe sowie die Milz auf. Bieger et

al. (2008) untersuchten nach chronischer Applikation (4 Wochen) von Quercetin

(50 mg/kg KGW/Tag) die Verteilung des Flavonols in Organen und Geweben

beim Schwein. Die höchsten Gesamtflavonolkonzentrationen wurden in

Dünndarm, Leber und Nieren nachgewiesen. Wesentlich niedrigere

Konzentrationen wurden in Muskulatur, Lunge, Gehirn und Fett bestimmt. Bei

den Metaboliten handelte es sich in allen untersuchten Geweben überwiegend um

Quercetinkonjugate (67 - 98 %). In den Geweben konnten im Gegensatz zum

Plasma regelmäßig Gehalte von dekonjugiertem Quercetin nachgewiesen werden,

die ca. 30 - 100 % der Gesamtkonzentration ausmachten. Dieser hohe

Aglykonanteil korrelierte jedoch nicht mit der spezifischen Aktivität der

ß-Glucuronidase in den entsprechenden Geweben. Diese Ergebnisse lassen darauf

schließen, dass auch bei einer Langzeitapplikation das zugeführte Flavonol

umfangreich metabolisiert und eleminiert wird und keine nennenswerten

Anreicherungen von Quercetin in den untersuchten Geweben beim Schwein

stattfinden (Bieger et al. 2008).

Literaturübersicht

26

2.5 Ballaststoffe und Rohfaser

2.5.1 Definition und Klassifikation von Ballaststoffen und Rohfaser

Die Bezeichnung „Ballaststoffe“ ist uneinheitlich und unterliegt bis zum heutigen

Tage weiteren Definitionsversuchen (Cummings & Stephen 2007). Ursprünglich

stammt der Begriff „Ballaststoff“ aus einer Zeit, in der diese Stoffgruppe als

überflüssige und unerwünschte Nahrungsbestanteile galten (Huth & Cremer 1977,

Thomas 1980, Elmadfa & Leitzmann 2004). Trowell (1977) definierte

Ballaststoffe als Rückstände von Pflanzenzellen, die bei der Hydrolyse mit

menschlichen Verdauungsenzymen nicht abgebaut werden können. Heutzutage

definiert man Ballaststoffe als heterogene Zusammensetzung aus Struktur- und

Nicht-Struktur-Polysacchariden und Lignin, welche nicht durch

Verdauungsenzyme des GIT abgebaut werden können (Mosenthin et al. 2001,

Souffrant 2001). Eine anerkannte „chemische“ Definition für Ballaststoffe lautet

„die Summe aller pflanzlichen Nicht-Stärke-Polysaccharide (NSP) plus Lignin“

(Mosenthin et al. 2001, Elmadfa & Leitzmann 2004).

Der Begriff „Rohfaser“ wurde im Bereich der Tierernährung geprägt und findet

bis heute Verwendung. Die „Weender-Analyse“ kann lediglich die

Gerüstsubstanzen Cellulose, einen Teil der Hemicellulosen und Lignin als

Rohfaser sowie die N-freien Extraktstoffe, die u. a. auch lösliche Faseranteile

beinhalten, erfassen. Zur besseren Differenzierung der Kohlenhydrate wurde von

Van Soest 1973 ein neues Analyseverfahren mittels Kochens des entsprechenden

Futtermittels mit neutraler und schwefelsaurer Detergenzienlösung eingeführt.

Begriffe wie Neutral Detergent Fiber (NDF), Acid Detergent Fiber (ADF) und

Acid Detergent Lignin (ADL) wurden geprägt (Abb. 5). Allerdings wird der

Hemicellulosegehalt lediglich grob geschätzt. Lösliche Faserbestandteile werden

nicht erfasst und sind Bestandteile des „organischen Restes“.

Literaturübersicht

27

Abb. 5: Fraktionen und Komponenten der Ballaststoffe (Souffrant 2001)

XF = Rohfaser; NDF = neutrale Detergetienfaser; ADF = saure Detergentienfaser; NSP = Nicht-Stärke-Polysaccharide

Eine differenziertere Betrachtung der Ballaststoffe in Nahrungsmitteln bzw.

Futtermitteln ermöglichen Methoden wie die AOAC-Methode nach Prosky et al.

(1985) oder die Komponenten-Analyse nach Englyst et al. (1994) bzw. nach

Theander et al. (1994).

Grundsätzlich bleibt festzuhalten, dass der „Ballaststoffgehalt“ um ein Vielfaches

höher als der „Rohfasergehalt“ eines Nahrungsmittels ist (Eastwood et al. 1980).

Beim Getreide macht der Rohfaserwert nur 1/4 bis 1/5 des Ballaststoffgehaltes

aus, bei Gemüse mehr als die Hälfte (Thomas 1980).

2.5.1.1 Nicht-Stärke Polysaccharide (NSP)

Als Nicht-Stärke-Polysaccharide (NSP) werden alle pflanzlichen Polysaccharide

mit Ausnahme der Stärke bezeichnet. Gemäß der bereits erläuterten chemischen

Definition stellen NSP den Hauptbestandteil der „Ballaststoffe“ dar. Zu den NSP

gehören komplexe Kohlenhydratverbindungen wie Cellulose, Hemicellulose und

Pektine sowie ß-Glucane, Pentosane, Mannane, Galaktane und Xyloglucane

(Jeroch et al. 1999, Grieshop et al. 2001). Sie können kovalent gebundene Nicht-

Ballaststoffe

XF NDF ADF NSP

-Cellulose

-Lignin

-(Hemicellulose)

-Cellulose

-Lignin

-Hemicellulose

-Cellulose

-Lignin

-Cellulose

-Pektin

-ß-Glucane

-Pentosane

-Xylane

Literaturübersicht

28

Kohlenhydratbestandteile wie Phenolsäuren, Proteine und Lignin enthalten (De

Lange 2000). Des Weiteren werden unter chemischen Gesichtspunkten ebenfalls

Pflanzengummis und -schleime sowie Algenpolysaccharide zu den NSP gerechnet

(Cummings & Stephen 2007). NSP werden dem Organismus über Cerealien, Obst

und Gemüse zugeführt. Aufgrund ihrer physiko-chemischen Eigenschaften

(s. 2.5.2) können NSP u. a. die Magen- und Darmmotilitäten, die Passagezeiten

der Ingesta sowie Verdauungs- und Absorptionsprozesse beeeinflussen (Bach

Knudsen 2001, Wenk 2001). NSP können aufgrund ihrer ß-glykosidischen

Bindungen nicht durch endogene Enzyme des Dünndarms abgebaut und

absorbiert werden, sondern werden durch die gastrointestinale Mikroflora

fermentiert. Bereits im Dünndarm kann eine mikrobielle Spaltung von NSP

stattfinden, jedoch ist der Dickdarm Hauptort der mikrobiellen Hydrolyse

(Graham et al. 1986, Pluske et al. 1999).

Die Löslichkeit der NSP ist von der chemischen Struktur abhängig (Dänicke

1999, Englyst & Englyst 2005). Cellulose1 gehört zu den unlöslichen-, Pektine2

dagegen zu den löslichen NSP. So liegt beispielsweise die Verdaulichkeit

unlöslicher NSP aus Weizen- bzw. Haferflocken im porcinen Dickdarm zwischen

46 bis 86 %, die der löslichen NSP bei über 92 % im Darmtrakt (Bach Knudsen &

Canibe 1997).

1 Cellulose: Cellulose ist im Pflanzenreich die am häufigsten vorkommende Gerüstsubstanz. Cellulose ist ein lineares, unverzweigtes Makromolekül, welches aus bis zu 10000 1,4-ß-glykosidisch verbunden Glucosemonomeren besteht. Lange Ketten aus Glucosemolekülen aggregieren und bilden kristalline Strukturen, die als Mikrofibrillen bezeichnet werden. Diese Mikrofibrillen sind Bestandteil pflanzlicher Zellwände und werden von einer Matrix anderer Zellwandbestandteile wie Hemicellulosen und Pektinen umgeben (Thomas 1980, Theander et al. 1989). 2 Pektine: Pektine sind komplexe Polysaccharide und kommen vorwiegend als Calcium- oder Magnesiumsalze in Primärwänden und Mittellamellen in Zellwänden von zweikeimblättrigen Pflanzen vor (Aspinall 1970, Selvendran 1984). Obst und Gemüse zählen zu den pektinreichen Nahrungsmitteln, während nur geringe Pektingehalte in Getreiden und Leguminosen nachzuweisen sind (Drochner et al. 2004). Nebenprodukte aus der Lebensmittelindustrie wie Apfeltrester oder Citrusschalen enthalten bis zu 72-88 % Pektine in der Fasertrockensubstanz (Thibault & Ralet 2001).

Literaturübersicht

29

2.5.2 Physikalisch-chemische Eigenschaften der Ballaststoffe

2.5.2.1 Wasserbindungskapazität

Die Wasserbindungskapazität hängt von der Partikelgröße, der Partikelstruktur

sowie der chemischen Zusammensetzung des Präparates ab (Rey & Labuza 1981,

Wallingford & Labuza 1983). Während Cellulose Wasser aufgrund des

faserhaltigen Grundgerüstes mit feinen kapillarartigen Hohlräumen bindet, bilden

lösliche Ballaststoffe kolloidale Lösungen oder Gele und verändern die

Fließeigenschaften (rheologische Verhalten) und die Viskosität von Lösungen.

Die Fähigkeit, Gele auszubilden, hängt von der Länge der Polymere, der freien

Beweglichkeit der Seitenketten, der Verknäuelung und der intermolekularen

Vernetzung ab (Huth et al. 1980, Schulze & Bock 1993). Die durch die

Wasserbindung bedingte Quellung von Ballaststoffen führt zur Volumen- und

Gewichtsvergrößerung des Chymus bzw. der Faeces, was sich u. a. auf die

Magen- und Darmmotilität und damit auf die Transitzeit des Chymus durch den

GIT auswirken kann (Thomas 1980, Bach Knudsen 2001, Elmadfa & Leitzmann

2004).

2.5.2.2 Adsorptionseigenschaften

Eine weitere physiko-chemische Eigenschaft von Ballaststoffen ist die Fähigkeit

zur Bindung organischer Stoffe, wobei das Adsorptionsvermögen löslicher

Ballaststoffe (Pektine) weitaus höher ist als das der unlöslichen Ballaststoffe

(Cellulose). Beispielsweise werden Gallensäuren und Cholesterol an Pektine

gebunden und so dem enterohepatischen Kreislauf entzogen (Birkner & Kern

1974, Selvendran et al. 1987, Elmadfa & Leitzmann 2004).

Aufgrund der funktionellen Gruppen (beispielsweise die Carboxylgruppen der

Uronsäuren bei Pektinen) sind einige Ballaststoffe in der Lage, Kationen wie

Eisen, Calcium, Kupfer und Zink zu binden (Elmadfa & Leitzmann 2004). Die

Kationen-Austausch-Kapazität der Pektine ist u. a. vom pH-Wert, der Löslichkeit,

Literaturübersicht

30

der Anzahl freier Carboxylgruppen und vom Veresterungsgrad abhängig (Zelter

1999, Drochner et al. 2004).

2.5.2.3 Fermentierbarkeit

Der überwiegende Teil der Ballaststoffe - insbesondere NSP, resistente Stärke und

nicht verdauliche Oligosaccharide - wird aufgrund der schlechten Löslichkeit

bzw. des Fehlens endogener Enzyme im Magen und Dünndarm von

Monogastriden nicht verdaut und erreicht zusammen mit weiteren nicht verdauten

Nahrungsbestandteilen und endogenen Substraten den Dickdarm (Rérat 1978,

Jeroch et al. 1999, Wenk 2007). Die überwiegend anaerobe Mikroflora des

Intestinaltraktes fermentiert diese Substrate hauptsächlich zu flüchtigen Fettsäuren

wie Essig-, Propion- und Buttersäure sowie Milchsäure, Ammoniak, Wasserstoff,

Methan und Kohlendioxid. Der Grad und die Geschwindigkeit des Abbaus

werden u. a. durch den Ballaststofftyp (z. B. Lignifizierungsgrad, Löslichkeit), die

physikalische Form und durch die Darmflora beeinflusst. Die unlöslichen

Ballaststoffe wie Cellulose werden nur geringfügig durch mikrobielle Enzyme

abgebaut (Bach Knudsen 2001, Elmadfa & Leitzmann 2004), wo hingegen

lösliche Ballaststoffe wie Pektine zu über 90 % durch die Darmbakterien im

Intestinaltrakt fermentiert werden können (Drochner et al. 2004). Der Einfluss

ballaststoffreicher Diäten/Rationen auf die gastrointestinale Mikroflora und die

mikrobiellen Fermentationsprozesse sowie deren physiologischen Auswirkungen

auf den Magen- und Darmtrakt werden im folgenden Kapitel näher betrachtet.

2.5.3 Wirkungen von Ballaststoffen im GIT von Monogastriden

Da die vorliegende Arbeit auf der Hypothese basiert, dass lösliche bzw. unlösliche

Ballaststoffe durch Beeinflussung der Magen-Darm-Motilität und damit der

Transitzeit des Chymus durch den GIT und/oder aufgrund von Änderungen der

Literaturübersicht

31

gastrointestinalen Mikroflora die Bioverfügbarkeit der eingesetzten Flavonole

beeinflussen könnten, werden im Folgenden nur diese Aspekte näher betrachtet.

2.5.3.1 Magen-Darm-Motilität und Transitzeit

Zahlreiche Human- und Tierstudien haben sich mit den möglichen Auswirkungen

der Aufnahme von unterschiedlichsten Ballaststoffquellen und -mengen auf die

Magen-Darm-Motilität und damit einhergehenden Veränderungen der Transitzeit

der Digesta im GIT beschäftigt. Allerdings sind die Ergebnisse dieser Studien oft

widersprüchlich und schwer interpretierbar.

2.5.3.1.1 Magenentleerung

Aufgrund der bereits erläuterten physiko-chemischen Eigenschaften der löslichen

und unlöslichen Ballaststoffe wurden in mehreren Studien mögliche Einflüsse auf

die Magenentleerung nach Ballaststoffaufnahmen untersucht. Die Ergebnisse der

Studien von Rainbird & Low (1986a, b) am Schwein zeigten, dass insbesondere

die Verfütterung des stark viskositätssteigernden Guar Gums in Höhe von 40 g/kg

TM zu einer Diät zu einer verzögerten Magenentleerung der flüssigen Phase der

Ingesta führte, während der Trockenmasseabfluss weniger bzw. gar nicht

beeinflusst wurde. Die Zulage der gleichen Menge an Citruspektin führte in

diesen Studien jedoch zu keiner viskositätsbedingten Verzögerung der

Magenentleerung. Der Einsatz natürlicher, löslicher Ballaststoffe wie Haferkleie

und -mehl zeigten ebenfalls einen Trend zu einer verzögerten Magenentleerung

der flüssigen Phase beim Schwein (Johansen et al. 1996). Guerin et al. (2001)

konnten bei der Verfütterung einer zuckerrübenpulpehaltigen und damit

pektinreicher Ration eine verzögerte Magenentleerung sowohl der flüssigen als

auch der festen Phase beobachten. Im Gegensatz zu den Ergebnissen der hier

erwähnten Studien, die entweder eine tendenzielle bzw. signifikant verzögerte

Magenentleerung nach dem Verzehr löslicher Ballaststoff-Komponenten

aufwiesen, konnte in der Studie von Potkins et al. (1991) eine Beschleunigung der

Literaturübersicht

32

Magenentleerung nach der Substitution von Gerste mit Guar Gum oder Pektin

beim Schwein (50g/kg Diät TM) beobachtet werden.

Ähnlich kontroverse Ergebnisse zeigten sich auch in Humanstudien. Flourie et al.

(1985) und Sandhu et al. (1987) verzeichneten bei einer Pektinzulage von 10 bis

15 g pro Mahlzeit eine Verzögerung in der Magenentleerung sowohl nach

Aufnahme von flüssigen als auch von festen Mahlzeiten. Keinen Einfluss auf die

Magenentleerung konnte bei der Aufnahme von 4,5 g Guar Gum bei einer

halblöslichen niederkalorischen Diät (200 ml) in der Humanstudie von van

Nieuwenhoven et al. (2001) beobachtet werden.

Unlösliche Ballaststoffe wie Cellulose oder Weizenkleie üben in der

überwiegenden Anzahl der betrachteten Studien kaum bzw. keine signifikanten

Effekte auf die Magenentleerung aus (Rainbird & Low 1986b, Wilfahrt et al.

2007). Abweichend von diesen Ergebnissen zeigte sich in der Studie von Guerin

et al. (2001) nach Aufnahme von Weizenkleie eine signifikant schnellere

Magenentleerung, und der Einsatz von aufgereinigter Cellulose äußerte sich in

einer verzögerten Magenentleerung der festen und flüssigen Phase der Digesta

beim Schwein

Grundsätzlich lässt sich aus den Beobachtungen schließen, dass nicht allein der

Gehalt an löslichen Ballaststoffen in einer Diät, sondern Faktoren wie Textur und

Menge der aufgenommenen Mahlzeit, Partikelgröße und andere

Nahrungsbestandteile (z. B. Lipide) in der Diät/Ration einen Einfluss auf die

Magenentleerung ausüben (Johansen & Bach Knudsen 1994).

2.5.3.1.2 Einfluss auf die Transitzeit der Digesta durch den Dünn- und Dickdarm

Auch hinsichtlich einer möglichen Beeinflussung auf die intestinalen

Transitzeiten in Dünn- und Dickdarm nach der Aufnahme ballaststoffreicher

Diäten liegen unterschiedliche Studienergebnisse vor. Die überwiegende Anzahl

der Untersuchungen zeigen bei steigenden Zulagen unlöslicher Ballaststoffe wie

Weizenkleie eine Minderung der durchschnittlichen Retentionszeit der Digesta im

porcinen Darmtrakt (Potkins et al. 1991, Le Goff et al. 2002, Wilfart et al. 2007).

Literaturübersicht

33

Auch auf den gesamten Magen- und Darmtrakt bezogen tendieren steigende

Gehalte von Weizenfaser dazu, die Passagerate der Digesta zu beschleunigen. Im

Gegensatz hierzu ergaben die Untersuchung von Owusu-Asiedu et al. (2006), dass

der Einsatz von 7 % Cellulose zu einer Diät die Passagerate der Digesta durch den

Dünndarm um 18 % signifikant verlängerte. Bezogen auf den gesamten GIT hatte

Cellulose jedoch keinen Einfluss auf die totale Retentionszeit der Digesta im

Vergleich zur Kontrolldiät.

Bei der Betrachtung möglicher Effekte löslicher Ballaststoffkomponenten auf die

Transitzeit ergab die Zulage von Zuckerrübenpulpe zu einer Schweineration keine

Auswirkungen (Le Goff et al. 2002). Stasse-Wolthuis et al. (1980) verglichen in

ihrer Humanstudie u. a. ebenfalls den Einsatz pektinreicher Nahrungsmittel

(Gemüse, Früchte) vs. isoliertem Citruspektin (9 g/Tag) mit identischen Gehalten

an Polygalakturonsäuren. Die Gemüse-Früchte-Diät verkürzte die

durchschnittliche intestinale Transitzeit um 13 Stunden, wohingegen die

Aufnahme des isolierten Citruspektins keinen Einfluss auf die Transitzeit hatte.

Auch Hillman et al (1983) konnten keine signifikante Beeinflussung der

Transitzeit nach der Aufnahme von 12 g isoliertem Citruspektin pro Tag

beobachten. Einen Überblick über mögliche Effekte verschiedener

Ballaststoffquellen auf den GIT beim Tier ist der Tabelle 2 zu entnehmen.

Tab. 2: mögliche Effekte verschiedener Ballaststoffquellen auf den GIT (modifiziert nach Wenk 2007)

mögliche Effekte verschiedener Ballaststoffquellen auf den GIT Ballaststoff-

Quelle verzögerte

Magenentleerung Sättigung Verkürzung

der faecalen Transitzeit

steigende mikrobielle Aktivitäten

Cellulose * * *** - Pektin/Guar **** *** * **** Früchte/Gemüse ** ** * **** Unlösl. B. * * **** *

- keinen Einfluss * gering ** mittel *** relevant ****erheblich

Literaturübersicht

34

Abschließend ist anzumerken, dass die Digestapassage durch den gesamten GIT

hauptsächlich durch die Retentionszeit im Dickdarm determiniert wird, welche

von der Abbaubarkeit, der Wasserbindungskapazität der noch nicht abgebauten

Faserbestandteile und der mikrobiellen Masse abhängig ist (Mosenthin et al.

2001).

2.5.4 Intestinale Mikroflora

Die Mikroflora schützt den GIT u. a. vor der Besiedlung pathogener Keime,

stimuliert das intestinale Immunabwehrsystem und liefert aus

Fermentationsprozessen unverdaulicher Nahrungsbestandteile und endogenen

Substanzen Nährstoffe bzw. organische Verbindungen wie die kurzkettige

Fettsäuren Essig-, Butter- und Propionsäure sowie Milchsäure, Aminosäuren und

Vitamine für den Wirt. Ebenfalls entstehen während des Fermentationsprozesses

geringe Gehalte an Succinat, Formiat, verschiedene Gase (Wasserstoff,

Kohlendioxid, Methan, Schwefelwasserstoff, Ammoniak) und Wärme

(Macfarlane & Gibson 1997, Stevens & Hume 1998, Snel et al. 2002).

Zu den obligaten Darmkeimen beim Schwein zählen Escherichia coli,

Enterococcus spp., Lactobacillus spp., Keime der Bacteroides-Prevotella-

Porphyromonas-Gruppe, Bifidobacterium spp. und Clostridium spp. (Beckmann

& Rüffer 1999). Prinzipiell ist eine steigende Besiedlungszunahme vom

proximalen zum distalen Darmtrakt festzustellen. Im Magen und proximalen

Dünndarm werden lediglich 103 bis 105 KBE/g Digesta vorgefunden, wohingegen

die Keimzahlen im Caecum und Kolon die höchsten Werte mit ca. 1010 - 1012

Keime/g Darminhalt mit mehr als 500 verschiedenen Spezies erreichen (Moore et

al. 1987). Auch der GIT des Menschen, im Besonderen das Kolon, ist von einer

Vielzahl von Mikroorganismen besiedelt. Den überwiegenden Anteil der

Mikroflora bilden Bakterien mit ebenfalls über 500 verschiedenen Spezies und

erreichen im Kolon bis zu 1012 KBE/g Darminhalt. Zu den vorherrschenden

Gattungen der bis zu 99 % anaeroben Bakterien zählt man Bacteroides,

Literaturübersicht

35

Eubacterium, Bifidobacterium, Peptostreptococcus und Fusobacterium (Berg

1996, Salminen et al. 1998, Bourlioux et al. 2003).

2.5.4.1 Beeinflussung der mikrobiellen Dichte und -Zusammensetzung durch die Aufnahme von Ballaststoffen beim Schwein

Die Mikrobiota wird in ihrer Zusammensetzung und Funktion u. a. durch die

Verfügbarkeit von Substanzen, den pH-Wert, die Temperatur, das Redoxpotential,

die Osmolarität und mikrobielle Interaktionen beeinflußt (Pluske et al. 2001). Die

Mikroflora kann hinsichtlich ihrer Dichte und Zusammensetzung ebenfalls durch

die Zulage von Ballaststoffen in Diäten bzw. Rationen modifiziert werden. Varel

& Pond (1985), Moore et al. (1987), und Varel et al. (1988) konnten eine

Modulation der bakteriellen Flora durch die Verfütterung ballaststoffreicher

Diäten (Luzernemehl) verzeichnen, welche sich in einem Anstieg der

cellulolytischen Bakterienpopulationen, die bis zu 10 % der gesamten Mikroflora

ausmachten und hauptsächlich durch Bacteroides succinogenes und

Ruminococcus flavefaciens im Dickdarm wachsender Schweine repräsentiert

wurden, manifestierte. Owusu-Asiedu et al. (2006) berichten, dass eine zusätzliche

Aufnahme von Guar Gum einen Anstieg der Gesamtzahlen der Anaeroben und

der Aeroben, Lactobacilli, Enterobacteria und Clostridia und der Bifidobacteria

und Enterococci verursachen. Im Gegensatz dazu führte der Einsatz von Cellulose

zu einem Anstieg der Populationen der Bifidobacteria und der Enterobacteria und

der Gesamtzahl der Anaeroben und Enterococci, jedoch nicht der Aeroben,

Lactobacilli und Clostridia. Gleichzeitig konnte mit dem Anstieg cellulolytischer

Bakterien auch eine gesteigerte Aktivität dieser Spezies festgestellt werden (Varel

et al. 1982, 1984, Varel 1987). Jensen & Jørgensen (1994) untersuchten die

mikrobiellen Aktivitäten anhand der ATP-Konzentrationen, des AEC-Wertes

(Adenylate Energy Charge)3 und des pH-Wertes im Verdauungstrakt. Die Tiere,

die eine ballaststoffreichere (Erbsenfaser) Diät erhielten, zeigten eine gesteigerte

3 Der AEC-Wert ist definiert als (ATP + 0.5 ADP) / (ATP + ADP + AMP) und beschreibt den Umsatz von ATP (Atkinson & Walton 1967)

Literaturübersicht

36

mikrobielle Aktivität im Vergleich zu den Tieren, die eine ballaststoffarme, auf

Stärke basierende Diät erhielten. Im Caecum und Kolon waren die höchsten

mikrobiellen Aktivitäten (hohe AT-Konzentration und AEC-Wert, niedriger pH-

Wert) zu verzeichnen. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die Fermentation,

insbesondere von unlöslichen Ballaststoffen überwiegend im Caecum und Kolon

stattfindet. Ein Anstieg der Gesamtzahl an Mikroorganismen/g TM in Faeces

konnte nicht beobachtet werden.

Material und Methoden

37

3. Material und Methoden

3.1 Bioverfügbarkeitsstudien am Schwein

3.1.1 Versuchstiere und Fütterung

Die Studie wurde mit insgesamt 18 männlich kastrierten Hybridschweinen (DL ×

DE; Versuchsgut Hohenschulen der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel) mit

einem Anfangsgewicht von 20,9 ± 0,5 kg in drei aufeinander folgenden

Durchgängen mit jeweils 6 Schweinen durchgeführt. Die Tiere wurden in

Einzelbuchten ohne Einstreu bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 - 70 %

und einer Raumtemperatur von 22 bis 24 °C gehalten. Nach einer fünftägigen

Eingewöhnungsphase, in der die Tiere ein handelsübliches Schweinmastfutter

(Schweinmastfutter Kombi, J. Aug. Plambeck, 24582 Brügge) erhielten, wurden

die Tiere in drei Fütterungsgruppen mit gleichen mittleren Körpermassen

eingeteilt. Die Grundlage der drei Rationen stellte das o. g. kommerzielle

Schweinmastfutter dar, welches im Wesentlichen aus Weizen, Gerstenfuttermehl,

Roggenkleie, Gerste, Raps- und Sojaextraktionsschroten bestand. Die

Kontrollgruppe (SMF) erhielt ausschließlich das o. g. Schweinemastfutter. Den

beiden anderen Diäten wurden zusätzlich zum Schweinemastfutter 10 %

Citrusfaser (CF) (Herbacel AQ Plus Citrus Fibre-F, Herbafood Ingredients

GmbH, Werder) bzw. 10 % Weizenfaser (WF) (Vitacel® Weizenfaser WF 400, J.

Rettenmaier & Söhne GmbH + Co. KG, Rosenberg) als gereinigte Faserquellen

zugesetzt. Die Fütterung der Tiere erfolgte zweimal täglich (7:00 und 16:00 Uhr)

bei restriktiver Futterzuteilung (80 % der ad libitum-Futteraufnahme), um ein zu

schnelles Wachstum während des Versuches zu verhindern und um die

vollständige Aufnahme der entsprechenden Versuchsdiäten zu gewährleisten.

Nach analytischen Untersuchungen und Angaben der Hersteller enthielt die

Citrusfaser einen Ballaststoffgehalt von 88 - 93 %, wovon 20 % auf lösliche

Ballaststoffe entfielen. Die Weizenfaser wies einen Ballaststoffgehalt in Höhe von

Material und Methoden

38

97 % auf, wovon 95 % auf die unlöslichen Ballaststoffe entfielen. Die

unlöslichen Ballaststoffe der Weizenfaser setzten sich aus 74 % Cellulose, 26 %

Hemicellulose und maximal 0,5 % Lignin zusammen.

Die eigenen Untersuchungen zur chemischen Zusammensetzung der eingesetzten

Rationen (Tab. 3) und der einzelnen Faser-Komponenten (Tab. 4) erfolgte mittels

Weender-Futtermittelanalyse und nach der Methode von Van Soest et al. (1991).

Tab. 3: Chemische Zusammensetzung der Versuchsdiäten (% der Trockenmasse)

SMF1) CF2) WF3) Rohprotein 19,04 17,69 17,17 Rohfett 2,40 2,18 2,18 Rohasche 5,66 5,27 5,15 Rohfaser 6,00 11,07 13,12 NDF4) aschefrei 23,20* 28,40 30,73 ADF5) 10,13 15,67 17,86 Stärke 37,83 34,20 34,09 weitere Inhaltsstoffe des Schweinemastfutters: 0,50 % Phosphor, 0,70 % Calcium, 0,15 % Natrium, 0,90 % Lysin. Zusatzstoffe: 10.000 I. E. Vitamin A, 1.200 I. E. Vitamin D3, 80 mg α-Tocopherolacetat, 15 mg Kupfer, 500 FTU-3-Phytase; Umsetzbare Energie: 12,6 MJ ME/kg. * mit Termamyl-Behandlung 1) SMF = 100 % Schweinemastfutter (Kontrollration) 2) CF = 100 % SMF + 10 % Citrusfaser 3) WF = 100 % SMF + 10 % Weizenfaser 4) NDF = Neutral Detergent Fiber (Cellulose, Lignin , Hemicellulose) 5) ADF = Acid Detergent Fiber (Cellulose, Lignin) Tab. 4: Chemische Zusammensetzung der eingesetzten Citrus- bzw. Weizenfaser (% der Trockenmasse)

Citrusfaser Weizenfaser Rohprotein 5,49 0,35 Rohfett 0,22 0,15 Rohasche 1,71 0,57 Rohfaser 56,68 77,16 NDF1) aschefrei 75,16 98,52 ADF2) 65,57 87,41 Stärke 1,51 0,39

1) NDF = Neutral Detergent Fiber (Cellulose, Lignin, Hemicellulose) 2) ADF = Acid Detergent Fiber (Cellulose, Lignin)

Material und Methoden

39

Nach einer zweiwöchigen Adaptionsphase wurde jedem Tier durch eine erfahrene

Operateurin ein Verweilkatheter (einlumiger Katheter der Firma COOK®, C-TPN-

9.5-90-REDO) in die Vena jugularis implantiert, um eine stressfreie

Blutprobenentnahmen zu ermöglichen. Die Tiere wurden zunächst sediert und für

die Narkose-Infusion (1000 mg Ketamin + 200 mg Azaperon ad 500ml NaCl

Infusionslöung) ein Venenverweilkatheter in eine Ohrvene installiert. Das

Operationsgebiet wurde zusätzlich lokal anästhesiert (10 ml Lidocain 2%). Unter

möglichst sterilen Bedingungen erfolgte die stumpfe Präparation der Vena

jugularis. Der Katheter wurde nach Eröffnen der Jugularvene und Ligatur des

cranialen Gefäßabschnittes so weit in Richtung caudal eingeführt, dass sein Ende

in der Vena cava cranialis im Bereich vor dem rechten Vorhof zum liegen kam.

Der Katheter wurde im Gefäß und im umliegenden Gewebe befestigt, bevor er

subkutan zwischen die Schulterblätter geführt wurde. Systemisch erfolgte eine

prophylaktische Antibiose sowie Analgetikatherapie über 3 Tage und die Wunde

wurde mit antiseptischem Sprühverband und Wundauflage versorgt. Zum Schutz

der Wunde und des Katheters wurde den Tieren ein Mäntelchen aus Segeltuch mit

Klettverschluss-Öffnungen für den Zugang zu den Kathetern angelegt. Um die

Durchgängigkeit der Katheter zu gewährleisten, wurden diese dreimal täglich mit

einer heparinisierten isotonischen Kochsalzlösung (500 I. E. Heparin-Na/ml 0,9 %

NaCl) gespült. Wasser stand den Tieren über Nippeltränken zur freien Aufnahme

zur Verfügung.

3.1.2 Versuchsdurchführung

Nach einer einwöchigen Rekonvaleszenz im Anschluss an die Operation wurde

den Tieren mit einer morgendlichen Testmahlzeit (200 g der entsprechenden

Diäten) eine einmalige Dosis der Testsubstanz (Quercetinaglykon bzw. Rutin)

verabreicht. Jedes Tier erhielt beide Quercetinquellen in einem zeitlichen Abstand

von 24 Stunden, um eine vollständige bzw. weitgehende Elimination nach oraler

Applikation zu gewährleisten (Ader et al. 2000). Die Dosierung des

Material und Methoden

40

Quercetinaglykons bzw. Rutins (50 mg Quercetinaglykon/kg KGW bzw. 101 mg

Rutin/kg KGW) wurde so gewählt, dass jeweils eine äquimolare Dosis von

Quercetin (165,4 µmol/kg KGW) aufgenommen wurde. Die erste Blutentnahme

erfolgte unmittelbar vor der Aufnahme der Testmahlzeit (Zeitpunkt t = 0). Bis

zum Zeitpunkt t = 300 min erfolgte die Blutentnahme in halbstündigem Abstand.

Weitere Blutproben wurden zu den Zeitpunkten 360, 480, 720 und 1440 min

entnommen. Bei jeder Blutentnahme wurden die ersten 2-3 ml Blut über den

Katheter verworfen. Im Anschluss wurden 8 ml Blut entnommen und in

Li-Heparinröhrchen (Sarstedt AG & Co, Nümbrecht) überführt. Durch sofortige

Zentrifugation (Zentrifuge: 3K12, Sigma) für 10 min bei 2000 × g und 4 °C wurde

das Plasma gewonnen, aliquotiert (2 ml) und bei - 70 °C bis zur weiteren Analyse

gelagert. Das entnommene Blutvolumen wurde durch isotonische Kochsalzlösung

(B. Braun Melsungen AG, Melsungen) ersetzt und abschließend 2 ml

heparinisierte isotonische Kochsalzlösung (500 I. E. Heparin-Na/ml NaCl) in den

Katheter instilliert, um Gerinnungsprozesse im Katheter zu vermeiden.

3.1.3 Analytik

3.1.3.1 Futtermittelanalysen

Die Trockenmassebestimmungen und Rohnährstoffanalysen erfolgten nach der

Weender–Futtermittelanalyse gemäß den VDLUFA-Methoden (Naumann &

Bassler 1976). Die Analysen der NDF-, ADF- und ADL-Gehalte wurden nach der

Methode von Van Soest et al. (1991) durchgeführt. Des Weiteren wurden die

eingesetzten Rationen auf einen möglichen Flavonoidgehalt nach der analytischen

Methode von Hertog et al. (1992b) untersucht. Die Futterkomponenten wiesen

keine nennenswerten Gehalte an Quercetin auf (Daten nicht gezeigt).

Material und Methoden

41

3.1.3.2 Probenaufarbeitung

Die Aufarbeitung der Plasmaproben erfolgte in modifizierter Form nach Morand

et al. (2000). 980 µl der aufgetauten Plasmaproben wurden mit 130 µl Essigsäure

(0,583 mol/l) versetzt, um das pH-Optimum (4,5 - 6,2) der eingesetzten

ß-Glucuronidase/Sulfatase (Type H-1 aus Helix pomatia, 7300 bzw. 130 U/ml,

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) einzustellen. Da mit der

verwendeten HPLC-Analysemethode Konjugate von Quercetin und der zu

erwartenden Metaboliten nicht direkt erfasst werden, wurden den angesäuerten

Proben 75 µl der o. g. Enzymmischung zugeführt, um konjugierte Formen

vollständig in Aglyka zu überführen. Als interner Standard wurde dem Gemisch

20 µl einer methanolischen Rhamnetinlösung (1 mg/20 ml Methanol; Rotichrom®

HPLC, Carl Roth GmbH, Karlsruhe) hinzugefügt. Nach gründlicher

Durchmischung (Vortex) des Ansatzes wurde dieser für 60 min in einem 37 °C

warmen Schüttelwasserbad inkubiert. Anschließend wurden durch Zusatz von

3 ml Aceton (J.T. Baker, Deventer, Holland) lösliche Proteine präzipitert und die

Proben zunächst für 20 min auf einem Horizontalschüttler gründlich durchmischt

und anschließend für 45 min bei 4000 × g und 4 °C zentrifugiert (Zentrifuge: 5810

R, Eppendorf). Der Überstand wurde bei 45 °C und einem partiellen Vakuum bis

zur Trockene eingedampft (SPD 2010 SpeedVac® System). Die Proben wurden

durch Zugabe von 200 µl Methanol (J.T. Baker, Deventer, Holland) resuspendiert

und für 15 min in ein Ultraschallbad verbracht. Im Anschluss wurden 77,5 µl

Aqua bidest und 22,5 µl HCl (32 %, Merck KGaA, Darmstadt) zugegeben und die

unlöslichen Bestandteile mittels einer Tischzentrifuge (Zentrifuge: 5415 C,

Eppendorf) bei 14.000 U/min abzentrifugiert. Vom verbliebenen Überstand

wurden 200 µl für die HPLC-Analyse verwendet.

3.1.3.3 HPLC-Methode

Zur Trennung und Darstellung des in den Plasmaproben enhaltenen Quercetins

und seiner methylierten Metaboliten Isorhamnetin und Tamarixetin wurde eine

Material und Methoden

42

leicht modifizierte Form der Methode von Hollmann et al. (1996a) verwendet.

Hierbei nutzt man die Fähigkeit der Flavonole, mit dreiwertigen Aluminiumionen

fluoreszierende Komplexe zu bilden. Über einen Autosampler (AS-2057 Plus,

Jasco, Gross Umstadt, Deutschland) wurden jeweils 30 µl der Proben in die

HPLC-Anlage injiziert. Als stationäre Phase diente eine „Reversed-Phase“-

Trennsäule (C-18 Kromasil 100, 250 × 4 mm, Partikelgröße: 5 µm, Jasco),

welcher eine Vorsäule (C-18 Inertsil ODS-2, 10 × 4 mm, Partikelgröße: 5 µm,

Jasco) vorgeschaltet war. Die mobile Phase bestand aus einem Gemisch aus

Natrium-Dihydrogen-Phosphat-Monohydrat-Puffer (0,025 mmol/l, pH 2,4; Merck

KGaA, Darmstadt), Acetonitril (J.T. Baker, Deventer, Holland) und Methanol in

einem Volumenverhältnis von 68:27:5. Der pH-Wert des Fließmittels lag bei 2,9

und die Flussrate betrug 1 ml/min. Die Nachsäulenderivatisierung

(Komplexierung mit Al3+) erfolgte in einem Kapillarreaktor (geflochtene

Teflonkapillare, Innendurchmesser 0,5 mm, Länge 3 m) mittels einer

methanolischen Aluminiumnitratlösung (1 mmol/l Aluminiumnitrat in 7,2 %iger

Essigsäure; Fluka, Taufkirchen), die mit einer Flussrate von 0,4 ml/min über ein

„low-dead-volume“-T-Mischstück zugeführt wurde. Säulen und Reaktor waren in

einem 30 °C warmen Säulenofen untergebracht. Die Detektion der gebildeten

Komplexe erfolgte mit Hilfe eines Fluoreszenzdetektors (920-FP, Jasco) bei einer

Anregungswellenlänge von 422 nm und einer Emissionswellenlänge von 485 nm.

Die Identifikation der Flavonole erfolgte anhand der Retentionszeiten durch den

Vergleich mit entsprechenden Standardsubstanzen. Die Peakflächen wurden mit

Hilfe der Borwin Chromatography Software (Version 1.50, Jasco Co. Ltd., Japan)

ausgewertet.

3.1.3.4 Kalibrierung, Nachweisgrenze und Wiederfindung

Zur Erstellung der Eichgeraden (Abb. 6) für Quercetin, Isorhamnetin und

Tamarixetin (Rotichrom® HPLC, Carl-Roth GmbH, Karlsruhe) wurden 960 µl

natives Schweineplasma mit 20 µl der jeweiligen methanolischen Standardlösung,

welche alle drei Substanzen enthielt, versetzt. Zusätzlich wurden auch hier 20 µl

Material und Methoden

43

des internen Standards Rhamnetin zugegeben. Um vergleichbare Bedingungen

wie im Versuchsansatz zu schaffen, erfolgte die Aufarbeitung auf exakt dieselbe

Weise wie bei den Plasmaproben aus den Versuchen (s. 3.1.3.2). Das für die

Standardreihen verwendete Plasma enthielt keine nachweisbaren Mengen der

relevanten Flavanole. Die Auswertung erfolgte anhand der relativen Peakflächen,

wobei für die Berechnung der Quercetin- bzw. Isorhamnetingehalte die relativen

Flächen (Fläche Quercetin bzw. Isorhamnetin/Fläche Rhamnetin) genutzt wurde.

Die Berechnung der Tamarixetinkonzentration in den Proben erfolgte dagegen

anhand der absoluten Peakflächen von Tamarixetin, da Tamarixetin im Vergleich

zu Quercetin, Isorhamnetin und Rhamnetin (die eine vergleichbare Stabilität bei

der Probenaufarbeitung zeigen) wesentlich stabiler ist und daher Rhamnetin in

diesem Fall als interner Standard ungeeignet ist. Für jede der drei Substanzen

ergab sich eine lineare Konzentrationsabhängigkeit (Abb. 6). Die Wiederfindung

der verwendeten Testsubstanzen aus nativen Schweineplasma betrug für

Quercetin 83 bzw. 101 %. Die Wiederfindung für Isorhamnetin und Tamarixetin

betrugen 87 bzw. 83 %. Die Nachweisgrenze der Flavonole lag bei 0,01 µmol/l

Plasma. Es wurden lediglich Peaks ausgewertet, die mindestens fünfmal so hoch

wie der Mittelwert des „Basisrauschens“ waren.

Material und Methoden

44

0 100 200 300 400

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6A

y = 0,002x R2 = 0,9931

------- y = 0,0046x R2 = 0,9863

Konzentration (ng/ml)

rela

tive

Pea

kflä

che

Q/R

und

I/R

0 100 200 300 400

0

1.0×106

2.0×106

3.0×106

4.0×106

B

y = 9816x R2 = 0,9786

Konzentration (ng/ml)

T (µ

V×

s )

Abb. 6: Eichgeraden zur quantitativen Bestimmung von (A) Quercetin (durchgezogene Linie) und Isorhamnetin (gestrichelte Linie) und (B) Tamarixetin. Mittelwerte und Standardabweichungen von 6 Bestimmungen. (R2 = Bestimmtheitsmaß; Q/R = Peakfläche Quercetin/Peakfläche Rhamnetin; I/R = Peakfläche Isorhamnetin/Peakfläche Rhamnetin; T = Tamarixetin)

Material und Methoden

45

0 10 20 30 40

-5.0×104

0

5.0×104

1.0×105

1.5×105

2.0×105

2.5×105

3.0×105

3.5×105 A

1

2

3

4

t (min)

µV

0 10 20 30 40

-2.5×104

2.5×104

7.5×104

1.3×105

1.8×105

2.3×105

2.8×1051

2

3

4

B

t (min)

µV

Abb. 7: Chromatogram eines Standards (A) und einer Plasmaprobe (B) vom Schwein aus der SMF-Gruppe 150 min nach Verabreichung von 165,4 µmol Quercetin/kg KGW als Aglykon. 1 = Quercetin, 2 = Isorhamnetin, 3 = Tamarixetin, 4 = Rhamnetin als interner Standard

Material und Methoden

46

3.1.4 Pharmakokinetische Parameter

3.1.4.1 Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve (AUC)

Die Bioverfügbarkeit gehört zu den beschreibenden Parametern in der

Pharmakokinetik. Sie ist eine Messgröße für den Anteil eines Wirkstoffes, der in

die systemische Zirkulation gelangt und wird anhand der Fläche unter der

Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve (AUC) mittels der Trapezregel berechnet.

Folgende Formel lag den Berechnungen zugrunde:

Trapezfläche = (tn-1-tn) × (cn + cn+1) / 2

Durch Addition aller Trapezflächen unter einer Plasmaspiegelkurve, die sich über

einen Zeitraum von 0 bis 24 h erstreckte, erhält man die Gesamtfläche

(AUC(0-24h)). Durch Addition der Einzel-AUCs von Quercetin, Isorhamnetin und

Tamarixetin erhielt man die Gesamt-AUC:

Gesamt-AUC = AUCQuercetin + AUCIsorhamnetin + AUCTamarixetin

Die Berechnung der AUCs und die graphische Darstellung der Konzentrations-

Zeit-Kurven erfolgte mit Hilfe des Computerprogramms GraphPadPrism 4

(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA, Version 4.01).

3.1.4.2 Relative Bioverfügbarkeit

Zur Berechnung der Relativen Bioverfügbarkeit wurden die Gesamt-AUCs (s. o.),

die nach Applikation des Rutins bzw. nach Quercetinaglykon-Applikation in der

CF- und WF-Fütterungsgruppen erhalten wurden, auf die Gesamt-AUC nach

Quercetinaglykon-Applikation in der SMF-Ration bezogen, die als 100 % gesetzt

wurde.

Material und Methoden

47

3.2 In vitro-Fermentationsstudien mit Schweinefaeces als Inokulum

3.2.1 Versuchstiere und Diäten

Jeweils im Anschluss an den zweiten und dritten Durchgang der

Bioverfügbarkeitsstudien (s. 3.1) wurden Kotproben von insgesamt 12 Tieren für

die nachfolgend beschriebene in vitro-Fermentationsstudie gesammelt. Die Tiere

erhielten durchgehend die gleichen Rationen (s. 3.1.1) und die Fütterung erfolgte

weiterhin zweimal täglich (7:00 und 16:00 Uhr) bei restriktiver Futterzuteilung.

Die Versuchstiere erreichten zum Zeitpunkt der Kotprobenentnahmen ein

durchschnittliches Lebendgewicht von 25,1 ± 0,6 kg.

3.2.2 Simulierte Magen-Dünndarm-Verdauung

Die in vitro-Fermentationsstudien mit Schweinefaeces als Inokulum wurden nach

der Methode von Bindelle et al. (2007) durchgeführt. Als Substrate wurden die

unter Abschnitt 3.1.1 vorgestellten Rationen verwendet. Vor der eigentlichen

Fermentation wurden zur Simulierung von Verdauungsvorgängen im Magen- und

Darmtrakt die Futtermittel einer Pepsin-Pankreatin-Behandlung nach der Methode

von Boisen und Fernández (1997) unterzogen. Die entsprechenden Substrate

wurden auf 1 mm gemahlen und jeweils 2 g mit 100 ml Phosphatpuffer (0,1 mol/l;

pH 6) und 40 ml HCl (0,2 mol/l) in 300 ml-Erlenmeyerkolben verbracht. Die

Einstellung des pH-Wertes von 2 erfolgte durch die Zugabe von HCl oder NaOH

(Konzentration 1 mol/l). Um das Bakterienwachstum zu unterdrücken wurden den

Lösungen 2 ml einer Chloramphenicol-Lösung (0,5 g Chloramphenicol/ 100 ml

Ethanol, Sigma C-0378) zugefügt. Im Anschluss erfolgte die Zugabe von 4 ml

frischer Pepsin-Lösung (71,43 g/l porcines Pepsin; 0,7 FIP-U/mg; Merck KGaA,

Darmstadt). Die Kolben wurden verschlossen und für 2 h bei 39 °C in ein leicht

schüttelndes Wasserbad inkubiert. Im Anschluss an die Pepsin-Hydrolyse wurden

Material und Methoden

48

40 ml eines Phosphatpuffers (0,2 mol/l; pH 6,8) und 20 ml einer NaOH-Lösung

(0,6 mol/l) hinzugefügt und ein pH-Wert von 6,8 mittels HCl (1 mol/l) bzw.

NaOH (1 mol/l) eingestellt. Des Weiteren wurden 2 ml einer frischen Pankreatin-

Lösung (100 g/l Pankreatin; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) zugeführt

und die geschlossenen Kolben nochmals für 4 h bei 39 °C im Schüttelwasserbad

inkubiert. Nach Filtration durch ein Nylontuch (Porengröße: 50 µm; Ankom

Technology, Macedon, NY, USA) mit Hilfe einer Vakuumpumpe wurden die

festen Rückstände mit 2 x 25 ml Ethanol (95 %) und 2 x 25 ml Aceton (99,5 %)

gewaschen und für 24 h bei 60 °C im Trockenofen getrocknet. Um genügend

Material für die in vitro-Fermentationsversuche und die Bestimmung des

Rohfasergehaltes (Weender Analyse und der Methode von Van Soest et al. 1991)

zu erhalten, wurden die Rückstände aus mehreren Vorverdauungsansätzen

gepoolt. Tabelle 5 zeigt den Fasergehalt der bei den in vitro-

Fermentationsversuchen eingesetzten Rationen nach simulierter Magen-

Dünndarm-Verdauung.

Tab. 5: Fasergehalte der vorverdauten Rationen1) (% der Trockenmasse) SMF2) CF3) WF4) Rohasche 7,27 7,43 6,90 Rohfaser 23,47 27,09 28,64 NDF5) aschefrei 77,93 78,48 79,59 ADF6) 36,39 39,91 40,87

1) vorverdaute Rationen durch eine Pepsin-Pankreatin-Behandlung 2) SMF = 100 % Schweinemastfutter (Kontrollration) 3) CF = 100 % SMF + 10 % Citrusfaser 4) WF = 100 % SMF + 10 % Weizenfaser 5) NDF = Neutral Detergent Fiber (Cellulose, Lignin, Hemicellulose) 6) ADF = Acid Detergent Fiber (Cellulose, Lignin)

Material und Methoden

49

3.2.3 Inokulum

Zur Herstellung des Inokulums wurde frischer Kot von jedem Tier gesammelt und

sofort unter anaeroben Bedingungen in verschließbaren Gefäßen (Best. Nr.:

60.9922.212PC; Sarstedt AG & Co, Nümbrecht) bis zur weiteren Aufbereitung in

einem 39 °C warmen Wasserbad aufbewahrt. Für die Aufarbeitung wurden der

Kot eines jeden Tieres innerhalb einer jeden Gruppe unter ständiger CO2-

Begasung gemixt und 25 g Faeces in Plastikbeutel (Seward Medical Stomacher®

400 Bags, London, UK) überführt. 60 ml eines vorgewärmten (39 °C)

Inkubationsmediums wurden mit dem Kotgemisch für 60 s intensiv vermischt

(Stomacher® Lab Blender 400; Seward Medical, London, UK), um faserassozierte

Bakterien in Lösung zu bringen (Merry & MacAllan 1983). Das Faecesgemisch

wurde durch ein grobes Baumwolltuch in eine vorgewärmte Thermoskanne

filtriert und das Filtrat mit Inkubationsmedium auf eine Endkonzentration 0,05 g

Faeces/ml Inkubationsmedium eingestellt. Die für das Inkubationsmedium

verwendeten Reagenzien (Mengen-, Spuren-, Puffer-, Resazurin- und

Reduktionslösungen, Tab. 6) wurden gemäß der VDLUFA-Methoden (Naumann

& Bassler 1976) beschriebenen Methode zur Bestimmung der Nettoenergie-

Laktation-Gasbildung nach dem Hohenheimer Futterwerttest hergestellt. Die für

die Reagenzien und Lösungen benötigten Chemikalien wurden von der Firma

Merck KGaA aus Darmstadt bezogen. Alle Lösungen wurden mit destilliertem

Wasser angesetzt.

Material und Methoden

50

Tab. 6: Zusammensetzung des Inkubationsmediums (IM) Konzentration eingesetzte Menge/

Fütterungsgruppe NaHCO3 416 mmol/l

(NH4)HCO3 50,6 mmol/l 250 ml/l IM1)

Na2HPO4 40,2 mmol/l

KH2PO3 45,6 mmol/l

MgSO4 × 7 H2O 2,4 mmol/l

250 ml/l IM2)

Spurenelementlösung3) - ad. 0,12 ml/l IM

Reduktionslösung4) - ad. 61,78 ml/l IM

Resazurinlösung5) - ad. 1,2 ml/l IM

1) Pufferlösung 2) Mengenelementlösung 3) Spurenelementlösung (g/100 ml): 13,2 (CaCl2 × 2 H20); 10,0 (MnCl2 × H20);

1,0 (CoCl2 × 6 H20); 8,0 (FeCl3 × 6 H20) 4) Reduktionslösung: 47,5 ml H20; 2 ml NaOH (1mol/l); 285 mg (Na2S × 7 H20) 5)Resazurinlösung (mg/100 ml):100 mg Resazurin

3.2.4 In vitro-Fermentation

Zur Bestimmung der mikrobiellen Aktivität des Inokulums bzw. der

Fermentierbarkeit der vorbehandelten Futterproben wurde der Hohenheimer-

Futterwert-Test (HFT) verwendet (Menke & Steingass 1988). Diese Methode

erlaubt die Einschätzung der Fermentierbarkeit einer Probe anhand der

kumulativen Gasbildung. Von den enzymatisch behandelten Rationen (s. 3.2.2)

wurden 200 mg in 39 °C vorgewärmte Kolbenprober überführt und mit jeweils

30 ml des gruppenspezifischen Inokulums (s. o.) versetzt. Die mit Substrat und

Inokulum befüllten Kolben werden in einen 39 °C ± 0,5 °C temperierten

Rotorschrank verbracht. Die Volumenablesung erfolgte 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 30, 36

und 48 h nach Inkubationsbeginn. Innerhalb einer Versuchsgruppe bzw. Ration

wurde eine fünffach- Bestimmung durchgeführt. Zusätzlich wurden von jeder

Gruppe drei Ansätze ausschließlich mit 30 ml des entsprechenden Inokulums,

Material und Methoden

51

d. h. ohne Substratzusatz, mitgeführt. Die hierbei gebildeten Gasvolumen werden

als Blindwerte (B(t)) bezeichnet und bei der Ermittlung der Gasvolumen (s. 3.2.5)

abgezogen. Das bei der in vitro-Fermentation gebildeten Gasvolumen Vcorr (t) (ml/

g TM) zum Zeitpunkt t (h) einer jeden Probe wurden um die Volumina der

Inokula und Blindwerte zum Zeitpunkt t korregiert und nach folgender Formel

berechnet:

Vcorr (t) =

Vcorr (t) (ml/g TM) = korregierte Gasvolumen

V(t) (ml) = Gesamtvolumen (Inokulum + Gas) zum Zeitpunkt t

V0 (ml) = Volumen des Inokulums zum Zeitpunkt t0

B(t) (ml Gas / ml Inokulum) = durchschnittl. Gasproduktion der Blindwerte zum Zeitpunkt t/ml Inokulum und W

W (g TM) = Substratmenge

Die maximale, kumulative Gasproduktion sowie die kinetischen Parameter der

Gasbildung wurden mittels einer modifizierten Gompertz-Funktion (Zwietering et

al. 1992) ermittelt. Die Gompertz-Funktion wird zur Modellierung sigmoidaler

Wachstumsprozesse verwendet. Das modifizierte Modell unterstellt, dass das

Substratangebot das Wachstum in einer logarithmischen Beziehung limitiert

(Schofield et al. 1994):

V = VF exp {-exp [1 + (µm e / VF) (λ – t)]}

V (ml) = kumulative Gasproduktion

VF (ml) = theoretische Maximum der Gasproduktion

µm (ml/h) = maximale Rate der Gasproduktion (Wendepunkt im Verlauf der Gasbildungskurve

λ (h) = lag-Zeit: Zeit bis zum Beginn der Gasbildung

t (h) = Fermentationsdauer

V (t) – V0 – B(t) × V0

W

Material und Methoden

52

Die Dauer der exponentiellen Phase wurde mit Hilfe der geschätzten Parameter

aus der modifizierten Gompertz-Funktion wie folgt ermittelt:

exponentielle Phase (h) = log Phase = VF / (µme) {1-ln [3-√5) / 2]}.

Die Zeit vom Beginn der Fermentation bis zur maximalen Rate der Gasproduktion

wurde nach der folgenden Formel berechnet:

Zeit vom Zeitpunkt 0 bis zum Wendepunkt (TIP, h) = λ + (log Phase / 2).

3.3 Statistik

3.3.1 In vivo-Bioverfügbarkeitsstudien am Schwein

Die Regressionsgeraden bei der Bestimmung der Eichgeraden (Abb.6) wurden mit

Hilfe von Excel (Microsoft Office, Version 2003) erstellt. Ergebnisse sind im

Allgemeinen als Mittelwerte mit den dazugehörigen Standardfehlern dargestellt.

Die statistische Auswertung der pharmakokinetischen Parameter AUC, cmax und

tmax der Einzel- und Gesamtflavonole erfolgte mittels einer zweifaktoriellen

Varianzanalyse mit den Faktoren Diät, Quercetinquelle und deren Interaktion

mittels der General Linear Model-Prozedur. Es wurde eine Signifikanzgrenze von

p < 0,05 gewählt.

An dieser Stelle sei erwähnt, dass sich im Ergebnisteil die Werte für cmax und tmax

in den graphischen Darstellungen der Konzentrations-Zeit-Verläufe von den

Werten in den Tabellen unterscheiden können. Grund dafür ist, dass bei den

Konzentrations-Zeit-Verläufen die Mittelwertskurven, in den Tabellen dagegen

die Mittelwerte der individuellen, maximalen Plasmakonzentrationen (cmax)

dargestellt sind. Dies gilt sinngemäß auch für die Darstellung der tmax-Werte.

Material und Methoden

53

3.3.2 In vitro-Fermentationsstudien mit Schweinefaeces als Inokulum

Die Kurvenanpassung und die erhobenen Parameter (s. 3.2.5) nach Gompertz

wurden mittels einer einfaktoriellen Varianzanalyse und einem anschließendem

Vergleich der Gruppenmittelwerte nach Student-Newman-Keuls analysiert. Es

wurde eine Signifikanzgrenze von p < 0,05 gewählt. Die statistischen

Berechnungen und graphische Darstellung der kumulativen Gasbildung wurden

mittels der Programme GraphPadPrism 4 (GraphPad Software Inc., San Diego,

CA, USA, Version 4.01) und SAS (SAS Institute, Inc. 8.0) durchgeführt.

Ergebnisse

54

4. Ergebnisse

4.1 Bioverfügbarkeitsstudien

Die im Folgenden dargestellten Konzentrations-Zeit-Verläufe wurden nach

enzymatischer Behandlung der Plasmaproben mit ß-Glucuronidase/Sulfatase

erstellt, da ohne vorhergehende enzymatische Hydrolyse kein freies Quercetin

oder freie Quercetinmetabolite im Jugularvenenblut nachgewiesen werden

können. Sowohl bei der Aglykon- als auch bei der Rutinapplikation konnten im

Plasma neben konjugiertem Quercetin die 3’- und 4’- Methylether des Quercetins

Isorhamnetin und Tamarixetin als Metaboliten detektiert werden. Abbildung 8

zeigt die Gesamtflavonolkonzentrations4-Zeit-Verläufe nach oraler Applikation

der beiden Quercetinquellen Quercetinaglykon (A) und Rutin (B) mit den

entsprechenden Diäten (Schweinemastfutter SMF, Citrusfaser CF und

Weizenfaser WF) über einen Zeitverlauf von 24 Stunden.

Nach Aufnahme des Aglykons lagen bei den eingesetzten Rationen die

maximalen Plasmakonzentrationen (cmax) im Bereich von 1,23 ± 0,21 bis 1,53 ±

0,15 µmol/l. Diese Werte traten 156 ± 36 bis 215 ± 31 min (tmax) nach Aufnahme

der Testmahlzeiten auf. Weder bezüglich cmax noch tmax ergaben sich dabei

signifikante Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen. Der statistische

Vergleich der applizierten Quercetinquellen innerhalb einer Fütterungsgruppe

ergab signifikante Unterschiede in allen pharmakokinetischen Parametern (p <

0,05). Nach Applikation von Rutin konnte bei allen Diäten erst nach 150 min ein

langsamer Anstieg der Gesamtflavonolkonzentration verzeichnet werden. Zudem

wurden wesentlich niedrigere Konzentrationen als nach Applikation des Aglykons

erreicht. Die maximalen Plasmakonzentrationen lagen hier zwischen 0,56 ± 0,12

und 0,68 ± 0,18 µmol/l und wurden erst 400 ± 74 bis 500 ± 48 min nach

Aufnahme der Testmahlzeiten erreicht. Die Absorption von Quercetin aus Rutin

erfolgte also wesentlich später und in einem deutlich geringeren Umfang. Als

4 Summe der Plasmakonzentrationen von Quercetin, Isorhamnetin und Tamarixetin

Ergebnisse

55

Maß für die Bioverfügbarkeit dient die Fläche unter der Konzentrations-Zeit-

Kurve (AUC s. 3.1.4.1). Die Gesamt-AUC5 nach der Aufnahme des Aglykons war

ca. 3mal so groß wie nach der Applikation des Rutins (p < 0,05). Die

Rationszusammensetzung zeigte hingegen keinen Einfluss auf die

Bioverfügbarkeit der Gesamtflavonole (Abb. 8).

Setzt man die Gesamt-AUC der SMF-Ration nach Gabe des Aglykons als 100 %,

war die relative Bioverfügbarkeit in der WF-Ration mit 105 % am höchsten. Die

höchste systemische Verfügbarkeit nach der Rutinapplikation wurde mit 38 % in

der SMF-Ration erzielt.

Zusammenfassend lässt sich für die Gesamtflavonol-Konzentration festhalten,

dass die Rationszusammensetzung keinen signifikanten Einfluss auf die

pharmakokinetischen Parameter ausübte. Dagegen ergaben sich für alle erhobenen

pharmakokinetischen Parameter signifikante Unterschiede zwischen der

Applikation von Quercetin und Rutin. Die entsprechenden Mittelwerte mit

Standardfehlern sind der Tabelle 7 zu entnehmen.

5 Summe der AUCs von Quercetin, Isorhamnetin und Tamarixetin

Ergebnisse

56

0 250 500 750 1000 1250 15000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8 SMFCFWF

A

Zeit (min)

Pla

smak

onze

ntra

tion

(µm

ol/l)

0 250 500 750 1000 1250 15000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8SMFCFWF

B

Zeit (min)

Plas

mak

onze

ntra

tion

(µm

ol/l)

Abb. 8: Gesamtflavonolkonzentrations-Zeit-Kurven nach oraler Gabe einer äquivalenten Dosis von 165,4 µmol Quercetin /kg KGW als Aglykon (A) bzw. als Rutin (B). Mittelwerte mit Standardfehler.

Tab. 7: Vergleich der pharmakokinetischen Parameter der Gesamtflavonolkonzentration1) (Quercetin + Isorhamnetin + Tamarixetin) nach einer einmaligen Gabe von 165,4 µmol Quercetin/kg KGW als Aglykon (QA) oder Rutin (R).

Parameter Behandlung Schweinemastfutter-Ration

(n = 6) Citrusfaser-Ration

(n = 5) Weizenfaser-Ration

(n = 6) QA R QA R QA R

cmax2) 1,23a

± 0,21 0,56b ± 0,12

1,47a ± 0,32

0,68b ± 0,18

1,53a ± 0,15

0,56b ± 0,11

tmax

3) 190a ± 31

500b ± 48

156a ± 36

400b ± 74

215a ± 31

456b ± 24

Gesamt-AUC4) 751a ± 116

285b ± 78

608a ± 71

274b ± 54

787a ± 73

265b ± 55

Relative Bioverfügbarkeit5) 100 38 81 37 105 35

Mittelwerte mit Standardfehler a, b Werte innerhalb einer Reihe, die keinen gemeinsamen Buchstaben tragen, unterscheiden sich signifikant (p < 0,05) 1) nach Behandlung der Plasmaproben mit ß-Glucuronidase/Sulfatase 2) cmax [µmol/l] = maximale Plasmakonzentration 3) tmax [min] = Zeit zwischen Applikation und Erreichen der cmax 4) Gesamt-AUC [min × µmol/l] = Summe der AUCs (Quercetin+Isorhamnetin+Tamarixetin) von 0 bis 24 Stunden 5) Relative Bioverfügbarkeit [%] = Quercetinaglykon der SMF-Ration = 100%

57 Ergebnisse

Ergebnisse

58

Konjugiertes Quercetin trat sowohl nach Aglykon- als auch nach der

Rutinapplikation als Hauptmetabolit bei allen Rationen auf (s. Abb. 9 und Tab. 8,

9). Die Aufnahme des Aglykons über die Testmahlzeiten resultierte in maximalen

Quercetinkonzentrationen von 1,07 ± 0,19 bis 1,30 ± 0,28 µmol/l, die 156 ± 36 bis

215 ± 31 min nach Aufnahme erreicht wurden. Der Anteil der konjugierten,

methylierten Formen von Quercetin Isorhamnetin und Tamarixetin an der

Gesamtflavonolkonzentration betrugen maximal 8 bzw. 13 %. Dieses Verhältnis

spiegelt sich auch bei der Betrachtung der Flächen unter den Kurven (AUC)

wider: Relativ gesehen zur Gesamtfläche unter den Kurven (Gesamt-AUC =

Summe der AUC von Quercetin, Isorhamnetin und Tamarixetin) lag der Anteil

von Isorhamnetin bei 8 bis 9 %, der des Tamarixetins bei 9 bis 13 %. Die relative

AUC von Quercetin betrug zwischen 79 und 82 %. Bezogen auf die Gesamt-AUC

entfiel auf die methylierten Formen ein Anteil von 18 bis 21 %. Die Ergebnisse

der Varianzanalyse zeigten nach Applikation des Quercetinaglykons bei der AUC

von Tamarixetin in der CF-Ration einen signifikanten Rationseffekt (p < 0,05).

Die Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve war geringer im Vergleich zu den

anderen Fütterungsgruppen. Des Weiteren zeigte sich ein Trend hinsichtlich eines

früheren Auftretens der maximalen Plasmakonzentration von Tamarixetin (tmax) in

der CF-Ration nach Aufnahme des Aglykons. Weitere Signifikanzen zwischen

den Rationen konnten nicht ermittelt werden. Die pharmakokinetischen Parameter

der Metaboliten nach Aglykonapplikation über die verschiedenen Rationen sind

Tabelle 8 zu entnehmen.

Ergebnisse

59

0 250 500 750 1000 1250 15000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6QuercetinIsorhamnetinTamarixetin

A

Zeit (min)

Plas

mak

onze

ntra

tion

(µm

ol/l)

0 250 500 750 1000 1250 15000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6QuercetinIsorhamnetinTamarixetin

B

Zeit (min)

Plas

mak

onze

ntra

tion

(µm

ol/l)

0 250 500 750 1000 1250 15000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6QuercetinIsorhamnetinTamarixetin

C

Zeit (min)

Plas

mak

onze

ntra

tion

(µm

ol/l)

Abb. 9: Konzentrations-Zeit-Verläufe von Quercetin, Isorhamnetin und Tamarixetin nach oraler Gabe von 165,4 µmol Quercetin/kg KGW als Aglykon zur SMF-Ration (A), CF-Ration (B) und WF-Ration (C). Mittelwerte mit Standardfehler.

Tab. 8: Vergleich der pharmakokinetischen Parameter von Quercetin (Q), Isorhamnetin (I) und Tamamrixetin (T) 1) nach einer einmaligen Gabe von 165,4 µmol Quercetin/kg KGW als Aglykon zu den jeweiligen Testmahlzeiten.

Parameter Behandlung Schweinemastfutter-Ration

(n = 6) Citrusfaser-Ration

(n = 5) Weizenfaser-Ration

(n = 6) Q I T Q I T Q I T

cmax2) 1,07

± 0,19 0,09

± 0,01 0,10

± 0,02 1,30

± 0,28 0,08

± 0,01 0,11

± 0,03 1,29

± 0,13 0,10

± 0,01 0,16

± 0,02

tmax3) 165

± 22 385 ± 69

285 ± 39

156 ± 36

240 ± 72

162 ± 39

215 ± 31

275 ± 30

370 ± 77

AUC4) 597 ± 93

63 ± 11

91 ± 12

500 ± 60

51 ± 5

57* ± 6

621 ± 58

66 ± 4

100 ± 11

Mittelwerte mit Standardfehler * signifikanter Unterschied bei T zwischen den Rationen für jeweiligen Parameter (p < 0,05) 1) nach Behandlung der Plasmaproben mit ß-Glucuronidase/Sulfatase 2) cmax [µmol/l] = maximale Plasmakonzentration 3) tmax [min] = Zeit zwischen Applikation und Erreichen der cmax 4) AUC [min × µmol/l] = Fläche unter der Plasmaspiegelkurve von 0-24 Stunden

60

Ergebnisse

Tab. 9: Vergleich der pharmakokinetischen Parametervon Quercetin (Q), Isorhamnetin (I) und Tamarixetin (T) 1) nach einer einmaligen Gabe von 165,4 µmol Quercetin /kg KGW aus Rutin zu den jeweiligen Testmahlzeiten.

Parameter Behandlung Schweinemastfutter-Ration

(n = 6) Citrusfaser-Ration

(n = 5) Weizenfaser-Ration

(n = 6) Q I T Q I T Q I T

cmax2) 0,48

± 0,11 0,03 ± 0

0,05 ± 0,01

0,60 ± 0,17

0,03 ± 0

0,06 ± 0,01

0,48 ± 0,10

0,04 ± 0,01

0,05 ± 0,01

tmax3) 500

± 48 440 ± 59

520 ± 40

435 ± 70

420 ± 75

450 ± 61

456 ± 24

552 ± 72

486 ± 71

AUC4) 228 ± 68

23 ± 3

34 ± 7

220 ± 46

21 ± 3

33 ± 5

204 ± 44

26 ± 5

35 ± 6

Mittelwerte mit Standardfehler 1) nach Behandlung der Plasmaproben mit ß-Glucuronidase/Sulfatase 2) cmax [µmol/l] = maximale Plasmakonzentration 3) tmax [min] = Zeit zwischen Applikation und Erreichen der cmax 4) AUC [min × µmol/l] = Fläche unter der Plasmaspiegelkurve von 0-24 Stunden

61

Ergebnisse

Ergebnisse

62

Nach Applikation von Rutin lag die Plasmakonzentration von Quercetin bei 0,48

± 0,11 bis 0,60 ± 0,17 µmol/l und wurde erst 435 ± 70 bis 500 ± 48 min nach

Aufnahme erreicht. Die maximalen Plasmakonzentrationen der methylierten

Quercetinmetaboliten Isorhamnetin und Tamarixetin lagen mit 0,03 ± 0 bis 0,04 ±

0,01 bzw. 0,05 ± 0,01 bis 0,06 ± 0,01 µmol/l deutlich niedriger im Vergleich zum

konjugierten Quercetin. Die auf die verschiedenen Metaboliten anfallenden

Anteile an der Gesamt-AUC spiegeln die gleichen Verhältnisse wie nach Gabe

des Aglykons wider. Die relative AUC von Quercetin lag bei 77 bis 80 %, auf die

methylierten Formen entfiel ein Anteil von 20 bis 29 %.

Die statistischen Auswertungen ergab keine Signifikanzen bei den erhobenen

pharmakokinetischen Parametern zwischen den drei Fütterungsgruppen. Die

ermittelten Parameter nach Rutinapplikation sind der Tabelle 9 zu entnehmen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass nach Applikation einer einmaligen Dosis

von 165,4 µmol Quercetin/kg KGW in Form von Quercetinaglykon oder Rutin zu

einer „Kontrolldiät“ oder zu ballaststoffangereicherten Rationen jeweils

konjugiertes Quercetin als Hauptmetabolit nachgewiesen werden konnte. Als

weitere Metaboliten wurden konjugiertes Isorhamnetin und Tamarixetin

detektiert. Dabei wurde das Verhältnis der nachgewiesen Metaboliten zueinander

weder durch die Quercetinquelle noch durch die Rationszusammensetzung

beeinflusst. Des Weiteren zeigten sich innerhalb jeder Fütterungsgruppe nach

oraler Aufnahme des Aglykons statistisch signifikant höhere Bioverfügbarkeiten

im Vergleich zur Rutin-Applikation. Mit Ausnahme der nach der Aglykon-

Applikation signifikanten Unterschiede des pharmakokinetischen Parameters

AUC bei Tamarixetin in der CF-Gruppe konnten zwischen den verschiedenen

Diäten keine weiteren Signifikanzen ermittelt werden.

Ergebnisse

63

4.2 In vitro-Fermentationsstudien

Tabelle 10 zeigt die kumulative Gasproduktion und die kinetischen Parameter aus

den in vitro-Fermentationsversuchen. Als Substrat wurden in den Untersuchungen

die „Faserkomponente“ der jeweiligen Ration verwendet, die durch eine

simulierte Magen- und Dünndarmverdauung erhalten wurde (s. 3.2.2). Die

Inokulation wurde mit Faeces der Tiere aus den jeweiligen Fütterungsgruppen

vorgenommen. Die Parameter wurden mittels einer modifizierten Gompertz-

Funktion (Zwietering et al. 1992) ermittelt, die auch in anderen in vitro-

Fermentationsstudien angewendet wurde (Piva et al. 2002, Liu et al. 2002).

Tab.10: Ergebnisse der in vitro-Fermentationsversuche nach Inkubation der vorverdauten Rationen mit Schweinefaeces als Inokulum.

Ration Variable SMF (n=10) CF (n=10) WF (n=10) VF

1) 115,7 ± 10,2a 229,6 ± 3,3b 159,5 ± 12,1c µm 2) 7,8 ± 1,4a 16,2 ± 0,4b 9,6 ± 0,4c λ 3) 4,5 ± 0,6a 3,4 ± 0,2b 6,0 ± 0,6c log-Phase 4) 13,1 ± 1,5a 10,3 ± 0,2b 11,9 ± 0,4c TIP 5) 11,1 ± 1,2a 8,5 ± 0,3b 11,9 ± 0,4c R2 6) 0,997 0,994 0,995

Mittelwerte mit Standardfehler Werte in einer Reihe ohne gemeinsamen Buchstaben p < 0,0001 1) VF [ml] = maximale Gasproduktion 2) µm [ml/h] = maximale Gasproduktionsrate 3) λ [h] = Zeitpunkt des Auftretens von µm 4) log-Phase [h] = Dauer der exponentiellen Phase 5) TIP [h] = Zeit vom Beginn der Fermentation bis zu erreichen von µm 6) R2 = Bestimmtheitsmaß Die maximale Gasproduktion (VF) ist ein Indikator für die Fermentierbarkeit der

im Magen- und Darmtrakt unverdaulichen Bestandteile der eingesetzten Rationen.

Für die maximale Gasbildung ergab sich die Reihenfolge CF > WF > SMF

(s. Tab.10, Abb. 10). Die maximale Rate der Gasproduktion (µm) war in der CF-

Ration doppelt so hoch im Vergleich zur SMF-Ration und lag um fast 40 % höher

Ergebnisse

64

als der µm-Wert der WF-Ration. Die Dauer der exponentiellen Phase war in der

SMF-Ration mit 13,10 ± 1,50 h am längsten, gefolgt von der WF- und CF-Ration

mit 11,90 ± 0,44 bzw. 10,29 ± 0,19 Stunden. Die Zeit vom Beginn der

Fermentation bis zur maximalen Rate der Gasproduktion (TIP) war mit 8,53 ± 0,3

Stunden in der CF-Ration am kürzesten, gefolgt von der SMF- und der WF-

Ration mit 11,08 ± 1,22 bzw. 11,93 ± 0,44 Stunden. Für alle Parameter ergaben

sich signifikante Unterschiede zwischen allen Versuchsgruppen (p > 0,0001). Die

kumulativen Gasbildungen und die Gasbildungskurven sind der Abbildung 10

dargestellt.

Zusammengefasst zeigen die Resultate, dass in der CF-Ration ein deutlich

höheres Fermentationspotential im GIT vorlag. Allerdings ist diese Aussage nur

eingeschränkt für die CF-Ration gültig, da in der vorliegenden Untersuchung die

jeweilige Fermentierbarkeit der anderen Ration nicht überprüft wurde.

0 10 20 30 40 500

50

100

150

200

250

CFWFSMF

Zeit (h)

Gas

prod

uktio

n (m

l Gas

/g T

M)

Abb.10: Kummulative Gasbildung bei der in vitro-Fermentation der enzymatisch vorbehandelten Versuchsrationen. Als Inokulum wurde Faeces von Tieren aus den entsprechenden Fütterungsgruppen verwendet. Die Kurven wurden anhand einer modifizierten Gompertz-Funktion berechnet. Mittelwerte mit Standardfehler.

Diskussion

65

5. Diskussion

Das Flavonol Quercetin wird als sekundärer Pflanzeninhaltsstoff von Mensch und

Tier mit der Nahrung aufgenommen. Eine Vielzahl von in vitro-Untersuchungen

sprechen dem Quercetin gesundheitsfördernde Effekte zu, welche nach oraler

Aufnahme in vivo nur durch eine ausreichende systemische Verfügbarkeit

realisiert werden können. Zu den Faktoren, die die Bioverfügbarkeit oral

aufgenommener Substanzen beeinflussen können, zählt u. a. die physikalisch-

chemische Beschaffenheit der Nahrung bzw. die Interaktion mit anderen

Nahrungskomponenten. In der vorliegenden Arbeit wurde daher der Einfluss einer

moderaten Zulage an löslichen (Citrusfaser) und unlöslichen (Weizenfaser)

Ballaststoffen auf die systemische Verfügbarkeit des Quercetins aus

verschiedenen Quercetinquellen (Aglykon und Rutin) untersucht. Da aus früheren

Untersuchungen (Hollman et al. 1999, Cermak et al. 2003) bekannt ist, dass

insbesondere die Verfügbarkeit von Quercetin aus Rutin sehr gering ist, wurde bei

beiden Quercetinquellen eine äquivalente Dosis Quercetin in Höhe von 165,4

µmol/kg KGW (entspricht 50 mg Quercetinaglykon bzw. 101 mg Rutin/kg KGW)

gewählt. Die Zulage der löslichen bzw. unlöslichen Ballaststoff-Komponenten in

Höhe von 10 % orientierte sich an einer im Humanbereich noch möglichen

täglichen Aufnahme. Aufgrund der anatomischen und physiologischen

Ähnlichkeiten zwischen Mensch und Schwein (Stevens 1988, Almond 1996)

wurden für die Bioverfügbarkeitsstudien Schweine als Versuchstiere gewählt. Zur

Charakterisierung der Fermentationsabläufe in vivo wurden zusätzlich in vitro-

Untersuchungen zum Umfang und der Geschwindigkeit der Fermentation der

„Faserkomponente“ (unverdaute Rückstände nach simulierter Magen- und

Dünndarmverdauung) der jeweiligen Rationen durch die entsprechend über drei

Wochen adaptierte Darmflora durchgeführt.

Übereinstimmend mit vorhergehenden Untersuchungen (Gee et al. 2000, Crespy

et al. 2001) konnte auch in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass

unabhängig von der Quercetinquelle kein freies Quercetin oder freie

Diskussion

66

Quercetinmetaboliten, sondern ausschließlich konjugierte Derivate in der

systemischen Zirkulation nachweisbar waren, was für eine umfangreiche

Konjugation in der Dünn- bzw. in der Dickdarmmucosa sowie in der Leber

spricht (First-Pass-Effekt). Aufgrund der bereits beschriebenen

Speziesunterschiede (s. 2.4.2) hinsichtlich möglicher enzymatischer

Konjugationsreaktionen lässt sich vermuten, dass es sich bei den konjugierten

Derivaten im Plasma überwiegend um Glucuronide handelt, da bei Schweinen

keine Sulfatkonjugate aufzutreten scheinen (Caldwell 1982). Eine diesbezügliche

Differenzierung der eigenen Daten wurde allerdings nicht durchgeführt, da die

Dekonjugation im Rahmen der Analyse mit einem Gemisch aus ß-Glucuronidase

und Sulfatase durchgeführt wurde (s. 3.1.3.2). Konjugiertes Quercetin stellte

unabhängig von der applizierten Quercetinquelle und der aufgenommen Ration

mit einem Anteil von ca. 80 % den Hauptmetaboliten. Als weitere Metaboliten

mit einem jeweiligen Anteil von ca. 10 % konnten die konjugierten 3’- und 4’-

Methylether des Quercetins Isorhamnetin und Tamarixetin identifiziert werden.

Die Befunde zum Profil der aufgetretenen Plasmametaboliten nach oraler

Applikation von Quercetin stimmen mit den Untersuchungen von Ader et al.

(2000) und Cermak et al. (2003) überein. Ein Vergleich des Metabolitenmusters

zwischen verschiedenen Spezies zeigt, dass bei der Ratte deutlich höhere

Konzentrationen methylierter Metaboliten - im Besonderen von Isorhamnetin -

auftreten (50 - 70 % der Gesamtkonzentration im Plasma), was sich durch eine

höhere Aktivität der COMT bei der Ratte im Vergleich zum Schwein erklären

ließe (de Boer et al. 2005, Morand et al. 2000).

In Abhängigkeit der applizierten Quercetinquelle ergaben sich in der vorliegenden

Arbeit, wie auch in der Untersuchung von Cermak et al. (2003), nach oraler

Applikation des Aglykons signifikant höhere Gesamtflavonolkonzentrationen

(Quercetin + Isorhamnetin + Tamarixetin) im Plasma und eine höhere systemische

Verfügbarkeit im Vergleich zur Aufnahme von Rutin. Das wesentlich spätere

Auftauchen von Quercetinmetaboliten in der systemischen Zirkulation nach

Applikation von Rutin im Vergleich zur Aufnahme des Quercetinaglykons

bestätigt die Schlussfolgerung, dass freies Quercetin bereits im Dünndarm

Diskussion

67

absorbiert wird, wohingegen Quercetin aus Rutin erst nach mikrobieller

Hydrolyse des Glykosids in den distalen Darmabschnitten (Ileum, Kolon)

freigesetzt und absorbiert werden kann (Manach et al. 1995, Hollman et al. 1997,

Erlund 2000, Morand et al. 2000, Graefe et al. 2001, Cermak et al. 2003).

Die wesentlich geringere Bioverfügbarkeit von Quercetin aus Rutin im Vergleich

zum Quercetinaglykon spricht für eine geringere Absorptionskapazität bzw. für

einen raschen mikrobiellen Abbau von Quercetin im Dickdarm. Während keine

vergleichenden Untersuchungen zur Absorptionskapazität von Quercetin in

verschiedenen Darmabschnitten vorliegen, belegen zahlreiche Untersuchungen

einen umfangreichen mikrobiellen Abbau von Quercetin im Dickdarm (Kühnau

1976, Heilmann & Merfort 1998a,b, Hollman & Katan 1998, Braune et al. 2001,

Walle et al. 2001, Schoefer et al. 2003, Blaut et al. 2003).

Die statistischen Analysen der vorliegenden Bioverfügbarkeitsstudie ergaben

einen Unterschied in der AUC (signifikant niedrigere AUC) und einen Trend für

ein frühzeitigeres Auftreten des cmax für den Quercetinmetaboliten Tamarixetin in

der CF-Ration nach Applikation des Aglykons. Da diese Ergebnisse nur nach

Aufnahme des Aglykons, nicht aber nach Rutinapplikation zu verzeichnen waren,

lässt sich dieser Befund möglicherweise auf eine im Dünndarmbereich lokalisierte

Modifikation zurückführen. Das frühe Auftreten von Tamarixetin im Plasma in

der CF-Ration im Vergleich zur WF-Gruppe ist theoretisch durch eine bevorzugte

Bildung dieses Metaboliten im Vergleich zu Isorhamnetin zu erklären,

wohingegen die geringere AUC durch eine rasche Elimination von Tamarixetinin

der CF-Gruppe bedingt sein könnte. Ob und wie allerdings die moderate Zulage

von Citrusfaser die entsprechenden zugrunde liegenden Mechanismen beeinflusst,

ist vollständig unklar. Nach dem derzeitigen wissenschaftlichen Kenntnisstand ist

eine schlüssige Erklärung dieser Beobachtungen derzeit nicht möglich. Bei der

Interpretation dieses Befundes hinsichtlich einer biologischen Signifikanz sollte

auch bedacht werden, dass es sich bei Tamarixetin um einen minoren Metaboliten

von Quercetin handelt, der beim Menschen (Graefe et al. 2001) und teilweise

auch bei der Ratte nicht im Plasma detektiert werden konnte (de Boer et al. 2005).

Diskussion

68

Der Einfluss von Ballaststoffen auf die Bioverfügbarkeit von Quercetin wurde

bisher nicht systematisch beim Schwein untersucht. Somit ist ein direkter

Vergleich der in der vorliegenden Arbeit erhobenen Befunde mit publizierten

Daten nicht möglich. Die Studie von Tamura et al. (2007) gibt Hinweise darauf,

dass die Aufnahme pektinhaltiger Rationen die Bioverfügbarkeit von Quercetin

aus Rutin bei Mäusen beeinflussen kann. Die Tiere erhielten über zwei Wochen

eine mit 5 % Pektin bzw. Cellulose und 0.5 % Rutin angereicherte Diät. Die

Untersuchung ergab signifikant höhere Plasmakonzentrationen von Quercetin und

Isorhamnetin bei den Tieren, die die pektinhaltige Diät erhielten.

Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Bioverfügbarkeitsstudien beim

Schwein zeigten, dass eine 10 % Zulage von Citrus- bzw. Weizenfaser als lösliche

bzw. unlösliche Ballaststoff-Komponenten zu einer handelsüblichen

Schweinemastfutter-Ration unabhängig von der eingesetzten Quercetinquelle

(Aglykon, Rutin) keinen Einfluss auf die orale Bioverfügbarkeit von Quercetin

hatte. Hinsichtlich dieses Resultates können folgende Hypothesen formuliert

werden:

1) die 10 %ige Zulage an löslichen bzw. unlöslichen Ballaststoff-

Komponenten (CF- bzw. WF-Ration) zur SMF-Ration hatten keinen

Einfluss auf die Magen-Darm-Motilität und/oder auf die gastrointestinale

Mikroflora

2) aufgrund des hohen Faser- bzw. Ballaststoffgehaltes in der SMF-Ration

haben sich mögliche Auswirkungen einer Faserzulage auf die

Digestapassage und/oder die Mikroflora und damit auf die

Bioverfügbarkeit des Quercetins zwischen den Rationen nicht mehr

deutlich abgebildet

3) der Ballaststoffgehalt einer Ration bzw. Diät hat grundsätzlich keinen

Einfluss auf die Bioverfügbarkeit von Quercetin aus verschiedenen

Quercetinquellen beim Schwein.

Diskussion

69

Die in der Literatur beschrieben möglichen Einflüsse einer höheren Zufuhr an

löslichen und unlöslichen Faser- bzw. Ballaststoffen-Komponenten auf die

Motilität des GIT sowie auf die Mikroflora ließen mögliche Veränderungen in der

Bioverfügbarkeit von Quercetin aus unterschiedlichen Quercetinquellen

vermuten, die im Folgenden diskutiert werden.

Einfluss des Ballaststoffgehaltes und der chemischen Natur von Ballaststoffen

Ergebnisse aus der Literatur deuten darauf hin, dass die Aufnahme löslicher

Ballaststoffe (wie z. B. Guar Gum, Pektine) aufgrund der viskositätssteigernden

Eigenschaften, die Magenentleerung verzögern und die Magen- und

Dünndarmpassage verlangsamen können (Jenkins et al. 1978, Flourie et al. 1985,

Sandhu et al. 1987, Johansen et al. 1996). Des Weiteren resultiert ein Anstieg der

Viskosität u. a. in einer verminderten Durchmischung des Darminhaltes und

erschwert die Diffusion und Absorption von Nährstoffen durch die Darmmucosa

(Low 1985, Häglund et al. 1988). Diese Beobachtungen lassen eine Verzögerung

und möglicherweise eine Abnahme der systemischen Verfügbarkeit des

Quercetins nach oraler Aufnahme von Quercetin mit der CF-Ration aufgrund der

oben genannten Auswirkungen einer gesteigerten Viskosität vermuten. Bei einem

Vergleich der Ergebnisse der vorliegenden Studie mit den Resultaten einer unter

nahezu identischen Bedingungen durchgeführten Studie zur Bioverfügbarkeit von

Quercetin aus verschiedenen Quellen (Cermak et al. 2003) fällt auf, dass die

maximalen Quercetinkonzentrationen nach Applikation von Rutin bereits nach

210 min, in der vorliegenden Arbeit jedoch erst nach 500 min bei der SMF-Ration

auftraten. Die maximalen Konzentrationen von Quercetin und seiner methylierten

Metaboliten waren in beiden Studien ähnlich. Eine Gegenüberstellung der NDF-

Gehalte der eingesetzten Rationen ergab, dass der NDF-Gehalt der SMF-Ration

dieser Arbeit mit 23 % doppelt so hoch wie in der Studie von Cermak et al.

(2003) lag. Eine Beeinflussung der Magen- und Darmmotilität durch den NDF-

Gehalt der Ration scheint jedoch unwahrscheinlich, da bei einer verzögerten

Magen-Darm-Passage die maximalen Quercetinkonzentrationen auch nach

Applikation des Aglykons zu einem späteren Zeitpunkt zu erwarten wäre, was

Diskussion

70

jedoch nicht der Fall war. Bezüglich der unterschiedlichen tmax -Zeiten zwischen

den beiden oben genannten Studien sei auch darauf hingewiesen, dass den

Ergebnissen der Untersuchung von Cermak et al. (2003) lediglich Daten von zwei

Tieren zugrunde lagen und Ergebnisse aus Humanstudien mit tmax-Werten für

Quercetin von 6 bis 9 Stunden nach Aufnahme von Rutin mit den hier erhobenen

Resultaten übereinstimmen (Hollman et al. 1997, Hollman et al. 1999, Graefe et

al. 2001).

Möglicherweise konnten in der vorliegenden Arbeit zwischen den Diäten keine

Unterschiede in der systemischen Verfügbarkeit von Quercetin gezeigt werden, da

bereits die Kontroll-Ration (SMF-Ration) mit 23 % einen hohen NDF-Gehalt

aufwies und so Unterschiede zwischen den Rationen durch die 10 %ige

Faserzulage relativ gering waren (s. Tab. 3). Andererseits kann die weitgehende

Übereinstimmung der ermittelten Bioverfügbarkeiten (AUC) in der vorliegenden

Studie mit den von Cermak et al. (2003) publizierten Daten aus Versuchen, die

mit einem NDF-Gehalt von nur 12 % in der Ration durchgeführt wurden,

dahingehend interpretiert werden, dass beim Schwein auch größere Unterschiede

im NDF-Gehalt der Rationen die Bioverfügbarkeit von Quercetin aus den beiden

unterschiedlichen Quellen (Aglykon bzw. Rutin) nicht beeinflussen.

Die Übertragbarkeit der in diesen Bioverfügbarkeitsstudien am Schwein

eingesetzten Rationen bezüglich des Ballaststoff- bzw. Fasergehalts auf den

Humanbereich ist kritisch zu bewerten. Die von der Deutschen Gesellschaft für

Ernährung (DGE) empfohlene tägliche Zufuhr an Ballaststoffen für Erwachsene

liegt bei 30 g, was bei einer geschätzten TM-Aufnahme von 500 g einem

Ballaststoffgehalt von 6 % entspricht. Diversen Studien zufolge liegt die

geschätzte tatsächliche Ballaststoffaufnahme mit unter 20 g pro Tag zum Teil

deutlich unter diesen Empfehlungen (Park et al. 2005).

Untersuchungen, die den Ballaststoffgehalt bzw. die -zusammensetzung der in der

vorliegenden Schweinestudie eingesetzten Rationen bestimmten, wurden zwar

nicht durchgeführt, grundsätzlich kann aber davon ausgegangen werden, dass der

Diskussion

71

Ballaststoffgehalt um ein Vielfaches höher als der Rohfasergehalt ist (Eastwood et

al. 1980) und dass bei Getreide der Rohfaserwert nur 1/4 bis 1/5 des

Ballaststoffgehaltes ausmacht (Thomas 1980). Auf Basis dieser Annahmen sowie

aus Berechnungen anhand der chemischen Zusammensetzung der eingesetzten

Rationen (s. Tab. 3), lag der geschätzte Ballaststoffgehalt in der Kontroll-Ration

(SMF-Ration) bei ca. 35 %. Damit übersteigt der Ballaststoffgehalt allein schon in

der nicht-faserangereicherten SMF-Ration das 6fache der empfohlenen sowie

einer realisierbaren Ballaststoffaufnahme in der Humanernährung. Auch ist

anzumerken, dass grundsätzlich nicht allein der Ballaststoffgehalt, sondern

Einflussfaktoren wie Textur und Menge einer Mahlzeit, die Partikelgröße sowie

weitere Nahrungsbestandteile wie beispielsweise Lipide in einer Ration/Diät die

Digestapassage durch den GIT beeinflussen können (Wrick et al. 1983, Johansen

& Bach Knudsen 1994). In diesem Zusammenhang ist insbesondere von

Bedeutung, dass zur Ermittlung der Bioverfügbarkeit von Quercetin in der

aktuellen Studie lediglich eine quercetinhaltige „Testmahlzeit“ von 200g

appliziert wurde. Die dabei erzielte moderate Füllung des Magens bzw. Darms

war möglicherweise nicht ausreichend, um Effekte auf die Digestapassage

erfassen zu können. Zudem scheinen viskositätssteigernde Eigenschaften löslicher

Ballaststoffe speziesabhängig zu sein. So sind beim Schwein Effekte aufgrund des

insgesamt längeren Dünndarms und des höheren Mikrobenbesatzes geringer als

beispielsweise beim Geflügel (Dierick 1989, Haberer & Schulz 1998, Dänicke

1999). Die Viskositätssteigerung der Digesta durch die in dieser Studie

eingesetzten Citrusfaser war daher möglicherweise nur gering ausgeprägt und

hatte daher keinen Einfluss auf die Bioverfügbarkeit von Quercetin. Auch in der

Literatur finden sich Studien, die nach der Aufnahme von Citruspektin keinen

Einfluss auf die Magenentleerung bzw. auf die Passagerate der Digesta im

Darmtrakt beobachten konnten. Rainbird & Low (1986b) vermochten durch die

Zulage von Citruspektin (40 g/kg Diät) zu einer Basaldiät keine

viskositätsbedingte Verzögerung der Magenentleerung beim wachsenden Schwein

feststellen. Auch in den Humanstudien von Stasse-Wolthuis et al. (1980) und

Diskussion

72

Hillman et al. (1983) führte die tägliche Aufnahme von 9 bzw. 12 g isoliertem

Citruspektin zu keiner signifikanten Beeinflussung der Transitzeit.

In Anbetracht zahlreicher Befunde, dass höhere Gehalte unlöslicher Ballaststoffe

(wie z. B. Weizenfaser, Cellulose) in der Ration zu einer Beschleunigung der

Digestapassage durch den gesamten GIT führen (Potkins et al. 1991, Le Goff et al.

2002, Wilfart et al. 2007), wobei hauptsächlich die Dickdarmpassage bescheunigt

ist, könnte die Zulage von Weizenfaser insbesondere die Verfügbarkeit von

Quercetin nach oraler Applikation von Rutin reduzieren, da Quercetin aus Rutin

erst im Dickdarmbereich freigesetzt und absorbiert wird (s. 2.4.1). Allerdings gibt

es auch Untersuchungen, die durch die Zulage unlöslicher Ballaststoffe keinen

Einfluss auf die Digestapassage beobachten konnten. Owusu-Asiedu et al. (2006)

untersuchten, ob steigende Anteile löslicher bzw. unlöslicher Ballaststoffe in einer

Ration die Passage der Digesta durch den GIT beim Schwein modulieren. Einer

auf Getreide, Sojamehl und Getreidestärke basierenden Basaldiät wurden jeweils

7 % Guar Gum als löslicher bzw. Cellulose als unlöslicher Ballaststoff zugefügt

und die Digestapassage durch den Dünndarm und den gesamten GIT bestimmt.

Dabei zeigte sich, dass sowohl der Zusatz des löslichen als auch des unlöslichen

Ballaststoffes zwar die Passagerate der Digesta durch den Dünndarm um 26 bzw.

18 % signifikant verlängerte, bezogen auf den gesamten GIT erhöhte jedoch

lediglich die Ration mit Guar Gum als löslicher Ballaststoff die totale

Retentionszeit der Digesta signifikant um 14 % (Basaldiät 24,5 h; Guar Gum-Diät

28 h). Die Ration mit Cellulose als unlösliche Ballaststoffquelle hatte dagegen

keinen Einfluss auf die totale Retentionszeit der Digesta (24,6 h) im Vergleich zur

Basaldiät.

Einfluss der Ballaststoffe auf die gastrointestinale Zusammensetzung der

Mikroflora

Zum einen kann die intestinale Mikroflora die Bioverfügbarkeit von Quercetin

positiv zum anderen aber auch negativ beeinflussen. Wird Quercetin in Form von

Glykosiden erst nach mikrobieller Deglykosylierung im Dickdarm freigesetzt und

Diskussion

73

absorbiert (z. B. bei Verwendung von Rutin), so könnte eine Steigerung der

deglykosylierenden, mikrobiellen Aktivität zu einer Steigerung der

Bioverfügbarkeit von Quercetin führen. Andererseits ist bekannt, dass Quercetin

auch umfangreich durch Mikroorganismen abgebaut wird (Aura et al. 2002), was

wiederum die absorbierte Menge von Quercetin und damit seine Bioverfügbarkeit

reduzieren könnte. Die Mikroflora kann hinsichtlich ihrer Dichte und

Zusammensetzung durch die Zulage von Ballaststoffen zu Diäten bzw. Rationen

modifiziert werden. Einen Anstieg der mikrobiellen Populationen durch die

Aufnahme gereinigter Ballaststoffe erklären Drew et al. (2002) mit einer erhöhten

Digesta-Viskosität und einem Rückgang der Nährstoffverdaulichkeit. Eine

verminderte Nährstoffverdaulichkeit ist mit einem steigenden mikrobiellem

Substratangebot verbunden. Die Kombination eines erhöhten Substratangebotes

und einer verlagsamten Passagerate geht mit einer gesteigerten Besiedlung mit

Mikroorganismen einher (Wagner & Thomas 1978). Owusu-Asiedu et al. (2006)

untersuchten den Einfluss löslicher und unlöslicher Ballaststoffe (Guar Gum bzw.

Cellulose) hinsichtlich möglicher Modifizierungen der ilealen Mikroflora beim

wachsenden Schwein. Die Untersuchungen zeigten einen Anstieg der

Populationen der Gesamtzahlen von Anaerobier und Aerobier sowie der

Lactobacilli, Enterobacteria, Clostridia, Bifidobacteria und Enterococci durch die

zusätzliche Aufnahme des löslichen Ballaststoffes Guar Gum. Der Einsatz der

unlöslichen Ballaststoffquelle (Cellulose) führte zu einem Anstieg der

Populationen der Bifidobacteria und der Enterobacteria und der Gesamtzahl der

Anaerobier und Enterococci, jedoch nicht der der Gesamtzahl der Aerobier,

Lactobacilli und Chlostridia. Varel et al. (1982, 1984, 1987) zeigten in ihren

Studien ebenfalls einen Anstieg der cellulolytischen Bakterien sowie eine

gesteigerte Aktivität dieser Species nach Verfütterung ballaststoffreicher Diäten

(mit Luzernemehl angereicherte Rationen) an wachsende Schweine.

Unter Zugrundelegung dieser Erkenntnisse hätte man in dieser Studie bei der

Verfütterung der CF-Ration einen Anstieg in der Population der Clostridia und

anderer Mikroorganismen erwarten können, welche in der Lage sind,

Flavonoidgrundgerüste zu spalten (Schoefer et al. 2003) und somit die

Diskussion

74

Bioverfügbarkeit von Quercetin zu reduzieren. Der Zusatz von Weizenfaser hätte

u. a. zu einer Populationsverschiebung zugunsten der Enterococci und einer

Vielzahl anderer Bakterienstämme führen können, welche durch ihre

ß-Glucosidasen und ß-Rhamnosidasen die meist ß-O-glycosidischen Bindungen

des Zuckerrestes an das Flavonolgrundgerüst abspalten und metabolisieren

können (Schneider et al. 1999). Dieses hätte sich bei der Applikation von Rutin in

einer gesteigerten Bioverfügbarkeit von Quercetin und seiner methylierten

Metaboliten manifestieren können.

Die Mikroflora fermentiert die mit der Nahrung aufgenommen Ballaststoffe

überwiegend zu den kurzkettigen Fettsäuren Essig-, Butter- und Propionsäure.

Des Weiteren geht die Fermentation mit der Bildung von Kohlendioxid, Methan

und Wasserstoff einher. Die Aufnahme ballaststoffreicher Diäten führt zu einer

Intensivierung von Fermentationsprozessen im Dickdarm (Bolduan et al. 1991,

Bach Knudsen et al. 1993, Drochner et al. 2004, Anguita et al. 2006). Pektine

fördern im Ileum und Kolon die mikrobielle Fermentation und werden selbst in

großem Umfang post-ileal metabolisiert (Drochner et al. 2004). Aufgrund der

geringeren mikrobiellen Besiedlung werden praececal nur zwischen 10 - 15 % der

Pektine fermentiert (Kerler 2002), während im Kolon bis zu 90 % der Pektine

mikrobiell abgebaut werden (Drochner 1991). Die Fermentierbarkeit der

Cellulose und damit die Bildung von Fermentationsprodukten ist in Abhängigkeit

des Lignifizierungsgrades im Kolon wesentlich geringer als die der Pektine

(Glitsø et al. 1999, Bach Knudsen 2001). Die in den in vitro-Fermentationsstudien

eingesetzten vorverdauten Rationen in der vorliegenden Arbeit enthielten nahezu

identische Fasergehalte (s. Tab. 5), unterschieden sich jedoch hinsichtlich der

Geschwindigkeit der Fermentationsprozesse sowie in den gebildeten Gasmengen

signifikant voneinander. Daraus lässt sich ableiten, dass die Zulage löslicher bzw.

unlöslicher Ballaststoff-Komponenten zu der SMF-Ration Änderungen in der

Zusammensetzung, der Dichte und/oder der Aktivitäten der gastrointestinalen

Mikroflora hervorgerufen haben könnte. Unter den jeweils vorherrschenden

Bedingungen bezüglich der mikrobiellen Population wurden die Faserfraktionen

Diskussion

75

der entsprechenden Diät am schnellsten und umfangreichsten in der CF-Ration,

gefolgt von der WF- und der SMF-Ration fermentiert. Hieraus könnte man

schließen, dass tatsächlich auch in vivo Unterschiede bezüglich des Umfangs und

der Geschwindigkeit der Fermentation vorgelegen haben, die allerdings keinen

Einfluss auf die Bioverfügbarkeit von Quercetin hatten. Anzumerken ist, dass in

der vorliegenden in vitro-Fermentationsstudie eine rektale Kotprobenentnahme

erfolgte, was nur einen geringen tierexperimentellen Aufwand erforderte. Hierbei

muss berücksichtigt werden, dass innerhalb der einzelnen Darmsegmente eine

unterschiedliche bakterielle Besiedlung vorherrscht und sich dieses in

Abhängigkeit des Entnahmeortes des Inokulums auf den in vitro-

Fermentationsablauf auswirken könnte (Robinson et al. 1981, Moore et al. 1987).

Die in vitro-Fermentation kann somit lediglich eine Annäherung an die in vivo-

Verhältnisse darstellen.

Zusammenfassung und Ausblick

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier erhobenen Resultate hinsichtlich

der höheren Bioverfügbarkeit von Quercetin nach oraler Applikation des

Aglykons im Vergleich zur Aufnahme von Rutin mit den bereits in der Literatur

beschriebenen Befunden übereinstimmen. Obwohl anhand von Literaturdaten eine

Beeinflussung der Digestapassage sowie der mikrobiellen Populationen durch den

Zusatz von löslichen- und unlöslichen Ballaststoff-Komponenten belegt ist, zeigte

der in der vorliegenden Studie gewählte Ansatz keine Auswirkungen einer

Faserzulage auf die Bioverfügbarkeit von Quercetin aus verschiedenen

Quercetinquellen beim Schwein. Damit bleibt die Frage offen, ob die

durchgeführten diätetischen Maßnahmen nicht ausreichend waren, um

Veränderungen in der Magen-Darm-Motilität bzw. bei der Fermentation zu

erzielen, oder ob entsprechende Veränderungen vorlagen, jedoch kein Einfluss auf

die Bioverfügbarkeit von Quercetin besteht.

In zukünftigen Studien sollte im Sinne einer besseren Übertragbarkeit der

Resultate auf den Humanbereich eine ballaststoffärmere, beispielsweise auf Stärke

basierende Kontroll-Diät gewählt werden. Des Weiteren sollte in künftigen

Diskussion

76

Studien die Digestapassage anhand des Einsatzes nichtabsorbierter Marker (z. B.

TiO2) gemessen werden. Auch die Messung der Viskosität des Chymus sowie

Untersuchung über mögliche Veränderungen in der Zusammensetzung und Dichte

der mikrobiellen Populationen in verschiedenen Darmsegmenten erscheinen

sinnvoll, um erhobene Befunde besser interpretieren zu können.

Abschließend muss auch erwähnt werden, dass trotz der bereits beschrieben

anatomischen und physiologischen Ähnlichkeiten zwischen Schwein und Mensch

Unterschiede in der mikrobiellen Besiedlung im Magen- Darmtrakt vorliegen

(Johansen & Bach Knudsen 1997), die sich möglicherweise auf die

Bioverfügbarkeit von Quercetin auswirken und die Übertragbarkeit der

Ergebnisse aus Versuchen am Schwein auf den Menschen erschweren könnte.

Zusammenfassung

77

6. Zusammenfassung

Die orale Bioverfügbarkeit des Quercetins wird durch die Nahrungs- bzw.

Futtermittelzusammensetzung beeinflusst. Der vorliegenden Arbeit lag die

Hypothese zu Grunde, dass Ballaststoffe aufgrund ihrer physiko-chemischen

Eigenschaften die Magen-Darm-Motilität und/oder die gastrointestinale

Mikroflora modulieren und somit die Bioverfügbarkeit der Flavonole beeinflussen

könnten. Hierzu wurde am Modelltier Schwein in einer Bioverfügbarkeitsstudie

der Einfluss moderater Zulagen löslicher und unlöslicher Ballaststoffe zu einer

Diät auf die systemische Verfügbarkeit des Quercetins aus verschiedenen

Quercetinquellen (Aglykon und Rutin) nach einer jeweils einmaligen oralen

Applikation in Höhe von 165,4 µmol Quercetin/kg KGW untersucht. Des

Weiteren wurden die eingesetzten und vorverdauten Rationen hinsichtlich ihrer

Fermentierbarkeit in in vitro-Fermentationsstudien mit Schweinefaeces als

Inokulum untersucht.

Es konnte gezeigt werden, dass der Zusatz von 10 % löslicher bzw. unlöslicher

Ballaststoff-Komponenten in Form von Citrus- bzw. Weizenfaser zu einem

kommerziellen Schweinemastfutter keinen Einfluss auf die systemische

Verfügbarkeit sowie die Pharmakokinetik von Quercetin ausübte. Wie Ergebnisse

vorhergehender Untersuchungen gezeigt haben, konnte auch in dieser Studie

konjugiertes Quercetin (77 - 82 %) sowie die 3’- und 4’-methylierten Metaboliten

des Quercetins (Isorhamnetin bzw. Tamarixetin) in konjugierter Form identifiziert

werden. Weder die Quercetinquelle noch die Rationszusammensetzung hatten

Einfluss auf das Flavonolmuster im Plasma. Unabhängig von den Rationen waren

die relativen Bioverfügbarkeiten von Quercetin nach Gabe des Aglykons

signifikant höher als nach Applikation von Rutin. Die in vitro-

Fermentationsstudien mit Schweinefaeces als Inokulum ergaben, dass zunächst in

vitro die Fermentationsprozesse in der CF-Ration am intensivsten ablaufen. Aus

den Ergebnissen kann gefolgert werden, dass in der vorliegenden Studie entweder

keine Veränderung der Digestapassage und/oder der fermentativen Prozesse

Zusammenfassung

78

vorlagen, oder dass entsprechende Veränderungen keinen Einfluss auf die

Bioverfügbarkeit von Quercetin beim Schwein haben. Eine Übertragbarkeit der

Befunde auf den Menschen ist nur eingeschränkt möglich.

Summary

79

7. Summary

Recent studies have indicated substantial effects of dietary composition on the

oral bioavailability of the flavonol quercetin. Thus the aim of the present study

was to investigate the impact of dietary fibre - with their specific physico-

chemical characterisitics known to influence gastrointestinal motility and /or gut

microflora - on the systemic availability of the two flavonols quercetin and rutin.

Pigs were fed with a commercial pig diet (SMF-ration) whereas two rations were

supplemented either 10 % soluble (citrus fibre, CF-ration) or insoluble (wheat

fibre, WF-ration) type of fibre. Pigs received a single oral dose of 165,4 µmol

quercetin/kg body weight (equivalent to 50 mg/kg) provided quercetin aglycone

and rutin as part of their respective diet, respectively. Furthermore the in vitro

fermentability of the enzymatically pretreated diets were analysed using the

inoculum from pigs fed the respective diet.

The present results indicate that in comparison to the SMF-ration, the fibre-

enriched diets had no significant influence on the oral bioavailability and the

pharmacokinetic of quercetin. In concordance with previous results, we have

showed that conjugated quercetin (77 - 82 %) and the conjugated 3’- and 4’-

methylethers isorhamnetin and tamarixetin were the main metabolites. With

respect to the total area under the curve (AUC) there were no differences in the

relative ratios among quercetin and quercetin metabolites within the quercetin

sources and diets. Furthermore the systemic availability of quercetin from

quercetin aglycone was considerably higher than from rutin. The results from in

vitro-fermentationstudy of the basal and the fibre-enriched diets using faecal as

inoculum demonstrated that the CF-ration yielded the fastes and highest gas

production. The results of the present study indicate that probably no changes in

the digesta passage and/or in the fermentative process exist or that these changes

seem not to influence the oral bioavailability of quercetin in the pig. It should be

kept in mind that the transferability of these results on humans are only limited.

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Danksagung

Ein herzliches Dankeschön an:

Herrn Prof. Dr. Siegfried Wolffram für die Überlassung der Promotionsarbeit und die zu jeder Zeit gewährte Unterstützung und Betreuung bei der Anfertigung dieser Arbeit.

Herrn Dr. Ralf Blank für die Hilfe bei der Versuchsplanung und im Besonderen für die stetige Bereitschaft auch in frühen Morgenstunden an diversen Wochenenden mir bei der Blutabnahme behilflich zu sein sowie der ausgezeichneten Unterstützung bei der Auswertung der Versuchsdaten.

Frau Dr. Silvia Wein für die zahlreich gelungen OP’s zur Implantierung der “richtigen” Katheter und die 24-stündige Einsatzbereitschaft für das Wohl der Tiere während aller Versuchsdurchgänge.

Das Spitzen-OP-Team bestehend aus Jane, Norma, Miriam und den zahlreichen fleißigen Hiwis im Stall und der TA’s, ohne die die OP’s und die Blutprobenentnahmen nicht möglich gewesen wären.

Miriam und Sabine für Ihre “Fingerfertigkeiten” bei der rektalen Kotprobenentnahmen unter Gefährdung von Leib und Seele (gut, dass es im Stall Fenster gab…).

Petra Schulz für die “Einweihung” in die Geheimnisse der HPLC-Analyse und bei der tatkräftigen (und “früh”zeitigen) Unterstützung bei der Aufarbeitung der zahlreichen Plasmaproben.

Maike Jürgensen, die bei “HPLC-Notfällen” mir stets behilflich zur Seite stand und mich über die “Feen-Tätigkeiten” im Labor aufgeklärt hat.

Wiebke Kühl für die tatkräftige Unterstützung bei den in vitro-Fermentationsversuchen und den heilenden Fähigkeiten, die ich in Anspruch nehmen durfte.

Anne, Uschi, Moni, Wiebke, Petra, Maike und Jessi, die u. a. für mich die Analysen der Futtermittelproben durchgeführt haben und im Besonderen zu der familiären Atmosphäre im Institut beigetragen haben. Ich werde mich immer gerne an meine Doktorandenzeit bei Euch zurück erinnern!

Allen Doktoranden für die stetige Hilfsbereitschaft mich in der Durchführung meiner Arbeit zu unterstützen und auch mit tröstenden Worten, Umarmungen und Gesprächen mir zur Seite standen, wenn es mal nicht so lief, wie ich es mir vorgestellt hatte.

Frau Käseberg für die Versorgung mit allem Notwendigen, was ein Doktorand zur Fertigstellung seiner Dissertation so benötigt.

Marga, Heinz, Herbert und “meiner großen Freundin” Ruth für die fortwährende Anteilnahme und Ermutigungen während der gesamten Studien- und Promotionszeit.

Meinem Vater, Ute - und ein besonders herzlicher Dank an Harald - für die vor allem moralische und finanzielle Unterstützung sowie das große Interesse und die tätkräftigen Hilfestellungen an der praktischen Durchführung dieser Doktorarbeit. Ich freue mich, dass Ihr stolz auf mich seid!

Lebenslauf

Birga Müller-Siegwardt, geboren am 01. Juli 1971 in Kiel Schul- und Berufsausbildung 1977 – 1988 Grund- und Realschule

Abschluss: mittlere Reife 1988 – 1991 Sozialwirtschaftliches Fachgymnasium am Königsweg in Kiel

Abschluss: Abitur 08/1991 – 06/1994 Ausbildung zur Sozialversicherungsfachangestellten mit

Schwerpunkt Krankenversicherung bei der Gmünder Ersatzkasse in Neumünster

01/2009 – 02/2009 Qualifikation zur Qualitätsmanagementbeauftragen bei der FAW in Kiel

Hochschulstudium 10/1999 – 03/2002 Veterinärmedizin an der FU Berlin 04/2002 – 08/2006 Agrarwissenschaften an der Agrar- und

Ernährungswissenschaftlichen Fakultät der CAU zu Kiel Promotion 09/2006 – 02/2009 am Institut für Tierernährung und Stoffwechselphysiologie der

Agrar- und Ernährungswissenschaftlichen Fakultät der CAU zu Kiel

Praktikum und Nebentätigkeiten 04/2002 – 03/2004 Wissenschaftliche Hilfskraft am Institut für Tierzucht und

Tierhaltung der Agrar- und Ernährungswissenschaftlichen Fakultät der CAU zu Kiel

04/2002 – 09/2005 Wissenschaftliche Hilfskraft am Institut für Tierernährung und

Stoffwechselphysiologie der Agrar- und Ernährungs-wissenschaftlichen Fakultät der CAU zu Kiel

07/2004 – 10/2004 Landwirtschaftliches Praktikum auf einem milchwirtschaftlichen

Betriebshof Berufstätigkeiten 07/1994 – 09/1999 Sozialversicherungsfachangestellte bei der Gmünder Ersatzkasse

in Neumünster 09/2006 – 08/2008 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut für Tierernährung

und Stoffwechselphysiologie der Agrar- und Ernährungs-wissenschaftlichen Fakultät der CAU zu Kiel