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Autoren: Martine Simon (1) , Paul Andrei (1) , Cordt Grönewald (2) , Hans-Henno Dörries (2) , Gido Murra (2) , Constanze Klopfleisch (2) , Thomas Bergmann (2) , Benjamin Junge (2) (1) BAV Institut, Offenburg; (2) BIOTECON Diagnostics GmbH, Potsdam Einsatz der Real-Time PCR in der Lebensmitteldiagnostik. Abstract: Das Real-Time PCR System inklusive automatischer Probenaufarbeitung von BIOTECON Diagnostics wird vom BAV-Institut für den schnellen und sicheren Nachweis von Salmonellen in verschiedenen Lebensmitteln genutzt. The real-time PCR system including automatic sample preparation of BIOTECON Diagnostics is used by the BAV Institute for the rapid and reliable detection of Salmonella in a wide variety of foods. Text: Die Real-Time Polymerasekettenreaktion (Real-Time PCR) hat sich als sehr schnelle und zuverlässige Methode für die Detektion und Identifizierung von Pathogenen wie Salmonella in Lebensmitteln etabliert. Im Gegensatz zum klassisch-kulturellen Verfah- ren verkürzt sich die Untersuchungszeit bei Anwendung der molekularbiologischen Methode stark. Die Real-Time PCR wird daher als Schnellmethode eingesetzt, um im stetig wachsenden und vielfältiger werdenden Bereich der Lebensmittelproduktion die Sicherheit der Erzeugnisse zu garantieren. Durch die spezifische Bindung von Pri- mern und Sonden an das DNA-Zielmolekül zeichnet sich die Real-Time PCR zudem durch eine hohe Sensitivität und Spezifität aus [1] . BIOTECON Diagnostics entwickelt unter der Produktlinie foodproof ® seit mehr als 15 Jahren für die wichtigsten Lebensmittelpathogene Real-Time PCR Kits und bietet mittlerweile auch automatisierte Systemlösungen zur Probenbearbeitung für Lebens- mittellabore mit hohem Probendurchsatz an. Die Routinetauglichkeit und Robustheit der automatisierten Probenaufarbeitung von BIOTECON Diagnostics wurde in einer Kooperation mit dem BAV Institut in einer Langzeitstudie untersucht. Das BAV Institut ist eines der größten und modernsten Dienstleistungslabore für mikrobiologische Un- tersuchungen von Lebensmitteln in Deutschland mit mehr als 1000 Kunden. Neben Lebensmitteltestungen werden auch Proben aus der Pharma- und Kosmetikbranche untersucht. Die wichtigste und am häufigsten untersuchte Gruppe der pathogenen Lebensmittelerreger ist die Gattung Salmonella. Die gram-negativen Bakterien der Gattung Salmonella gehören zur Familie der Enterobacteriaceae und verursachen bei Menschen die Erkrankung der Salmonellose, eine der häufigsten durch verunreinigte Lebensmittel bedingte Erkrankung in Deutschland [2] . Im Folgenden wird der routinemäßige Nachweis von Salmonella unter Anwendung des foodproof ® Salmonella Detection Kits in Kombination mit dem foodproof ® Magnetic Preparation Kit I und dem foodproof ® RoboPrep + HT 150-8 vorgestellt. Die automati- sierte Probenvorbereitung mit PCR-Setup sowie der anschließende Erregernachweis mittels Real-Time PCR ist seit 2013 eine von MicroVal gemäß ISO 16140 sowie vom AOAC-RI zertifizierte Methode [3] , [4] .

Einsatz der Real-Time PCR in der Lebensmitteldiagnostik. · Einsatz der Real-Time PCR in der Lebensmitteldiagnostik. Abstract: Das Real-Time PCR System inklusive automatischer Probenaufarbeitung

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Page 1: Einsatz der Real-Time PCR in der Lebensmitteldiagnostik. · Einsatz der Real-Time PCR in der Lebensmitteldiagnostik. Abstract: Das Real-Time PCR System inklusive automatischer Probenaufarbeitung

Autoren:

Martine Simon(1), Paul Andrei(1), Cordt Grönewald(2), Hans-Henno Dörries(2), Gido Murra(2), Constanze Klopfleisch(2), Thomas Bergmann(2), Benjamin Junge(2)

(1) BAV Institut, Offenburg; (2) BIOTECON Diagnostics GmbH, Potsdam

Einsatz der Real-Time PCR in der Lebensmitteldiagnostik.Abstract:

Das Real-Time PCR System inklusive automatischer Probenaufarbeitung von

BIOTECON Diagnostics wird vom BAV-Institut für den schnellen und sicheren

Nachweis von Salmonellen in verschiedenen Lebensmitteln genutzt.

The real-time PCR system including automatic sample preparation of BIOTECON

Diagnostics is used by the BAV Institute for the rapid and reliable detection of

Salmonella in a wide variety of foods.

Text:

Die Real-Time Polymerasekettenreaktion (Real-Time PCR) hat sich als sehr schnelle

und zuverlässige Methode für die Detektion und Identifizierung von Pathogenen wie

Salmonella in Lebensmitteln etabliert. Im Gegensatz zum klassisch-kulturellen Verfah-

ren verkürzt sich die Untersuchungszeit bei Anwendung der molekularbiologischen

Methode stark. Die Real-Time PCR wird daher als Schnellmethode eingesetzt, um im

stetig wachsenden und vielfältiger werdenden Bereich der Lebensmittelproduktion

die Sicherheit der Erzeugnisse zu garantieren. Durch die spezifische Bindung von Pri-

mern und Sonden an das DNA-Zielmolekül zeichnet sich die Real-Time PCR zudem

durch eine hohe Sensitivität und Spezifität aus [1].

BIOTECON Diagnostics entwickelt unter der Produktlinie foodproof® seit mehr als

15 Jahren für die wichtigsten Lebensmittelpathogene Real-Time PCR Kits und bietet

mittlerweile auch automatisierte Systemlösungen zur Probenbearbeitung für Lebens-

mittellabore mit hohem Probendurchsatz an. Die Routinetauglichkeit und Robustheit

der automatisierten Probenaufarbeitung von BIOTECON Diagnostics wurde in einer

Kooperation mit dem BAV Institut in einer Langzeitstudie untersucht. Das BAV Institut

ist eines der größten und modernsten Dienstleistungslabore für mikrobiologische Un-

tersuchungen von Lebensmitteln in Deutschland mit mehr als 1000 Kunden. Neben

Lebensmitteltestungen werden auch Proben aus der Pharma- und Kosmetikbranche

untersucht. Die wichtigste und am häufigsten untersuchte Gruppe der pathogenen

Lebensmittelerreger ist die Gattung Salmonella. Die gram-negativen Bakterien der

Gattung Salmonella gehören zur Familie der Enterobacteriaceae und verursachen bei

Menschen die Erkrankung der Salmonellose, eine der häufigsten durch verunreinigte

Lebensmittel bedingte Erkrankung in Deutschland [2].

Im Folgenden wird der routinemäßige Nachweis von Salmonella unter Anwendung des

foodproof® Salmonella Detection Kits in Kombination mit dem foodproof® Magnetic

Preparation Kit I und dem foodproof® RoboPrep+ HT 150-8 vorgestellt. Die automati-

sierte Probenvorbereitung mit PCR-Setup sowie der anschließende Erregernachweis

mittels Real-Time PCR ist seit 2013 eine von MicroVal gemäß ISO 16140 sowie vom

AOAC-RI zertifizierte Methode [3], [4].

Page 2: Einsatz der Real-Time PCR in der Lebensmitteldiagnostik. · Einsatz der Real-Time PCR in der Lebensmitteldiagnostik. Abstract: Das Real-Time PCR System inklusive automatischer Probenaufarbeitung

Abb. 1

Prozentuale Darstellung der Lebensmittelproben, die im BAV-Institut mittels automa-tisierter DNA-Extraktion mit anschließender Real-Time PCR auf den pathogenen Leb-ensmittelerreger Salmonella untersucht werden.

Abb. 2

Workflow des molekularbiolo-gischen und mikrobiologisch-en Nachweises (nach ISO 6579) von Salmonella.

Material und Methoden:

Im Zeitraum Juli 2012 bis Mai 2014 wurden im BAV-Institut 28.490 Proben auf Erreger

der Gattung Salmonella untersucht. Untersucht wurden neben Fleisch- und Wurst-

proben, auch Salate, Süßspeisen, Eiscreme, Feinkost- und Fischerzeugnisse (Abb. 1).

Probenanreicherung und DNA-Extraktion:

Für die Anreicherung wurde eine 25 g Portion des Lebensmittelausgangsmaterials

mit 225 ml gepuffertem Peptonwasser vermischt und für 19 - 20 h bei 37°C inkubiert.

Anschließend wurden 8 ml der Suspension in ein Falcon-Röhrchen transferiert. Um

den hohen Durchsatz von Proben zu bewältigen, erfolgt im Labor des BAV-Instituts

die DNA-Extraktion automatisiert durch den foodproof® RoboPrep+ HT 150-8 unter

Einsatz des foodproof® Magnetic Preparation Kit I.

Nachweis von Salmonella:

Für den molekularbiologischen Nachweis des pathogenen Erregers wurde das

foodproof® Salmonella Detection Kit, basierend auf dem Einsatz von Hybridisierungs-

sonden, unter Verwendung des Roche LightCycler® 480 eingesetzt. Das Kit enthält

eine interne Amplifikationskontrolle, um die Korrektheit negativer PCR Ergebnisse

sicher zu stellen. Wie der Arbeitsablauf in Abb. 2 zeigt, ist somit inklusive Anreichung

der Proben ein PCR Ergebnis für den Nachweis von Salmonella innerhalb von 24 h

möglich. Positive Proben werden anschließend kulturell bestätigt. Mit der kulturellen

Referenzmethode ISO 6579 benötigt man für Salmonella Untersuchungen mind. 3

Tage und bei positiven Proben mind. 4 Tage.

Page 3: Einsatz der Real-Time PCR in der Lebensmitteldiagnostik. · Einsatz der Real-Time PCR in der Lebensmitteldiagnostik. Abstract: Das Real-Time PCR System inklusive automatischer Probenaufarbeitung

Abb. 3

Amplifikationskurven der De-tektion von Salmonella spp. (A) und der internen Kontrolle (B).

* Verdächtige Real-Time PCR Proben, nicht kulturell bestätigt

Tab. 1

Ergebnis der Lebensmittelun-tersuchung unter Verwendung des foodproof® Salmonella Detection Kit.

Ergebnisse:

Von den 28.490 untersuchten Lebensmittelproben zeigten insgesamt 396 Proben ein

nicht negatives Real-Time PCR Ergebnis für den Nachweis von Salmonella. Bei 237

Proben war das Ergebnis nicht auswertbar und musste somit wiederholt werden bzw.

wurde mittels der klassischen Mikrobiologie bestimmt. Dies bedeutet, dass 0.83% der

Proben nicht durch die molekularbiologischen Methode ausgewertet werden konnten.

Bei den anderen 159 Proben trat ein positives PCR Ergebnis auf. Der typische Verlauf

der Amplifikationskurven in der Real-Time PCR mit dem foodproof® Salmonella De-

tection Kit ist exemplarisch dargestellt (Abb. 3). Die in der PCR positiv getesteten Pro-

ben wurden anschließend mit der kulturellen Referenzmethode ISO 6579 untersucht.

Dabei konnte für den Großteil der Proben (n=97) das Ergebnis der PCR durch einen

positiven mikrobiologischen Befund bestätigt werden. Letztendlich konnten bei 62

Proben die positiven PCR Ergebnisse nicht kulturell bestätigt werden. Dies entspricht

einem Anteil von 0.21 % an der Gesamtprobenanzahl (Tab. 1).

A B

Monat Probeanzahl * Anzahl * in %

07/2012 1301 2 0,1508/2012 1119 5 0,4509/2012 1036 6 0,5810/2012 1151 2 0,1711/2012 1033 1 0,1012/2012 706 1 0,1401/2013 1069 3 0,2802/2013 1176 3 0,2603/2013 1530 1 0,0704/2013 1319 0 0,0005/2013 1152 1 0,0906/2013 1255 0 0,0007/2013 1304 1 0,0808/2013 1495 7 0,4709/2013 1196 3 0,2510/2013 1022 4 0,3911/2013 1401 0 0,0012/2013 980 2 0,2001/2014 1228 1 0,0802/2014 1462 5 0,3403/2014 1638 4 0,2404/2014 1471 5 0,3405/2014 1445 5 0,35

Total 28.490 62 Ø 0.21

Page 4: Einsatz der Real-Time PCR in der Lebensmitteldiagnostik. · Einsatz der Real-Time PCR in der Lebensmitteldiagnostik. Abstract: Das Real-Time PCR System inklusive automatischer Probenaufarbeitung

BIOTECON Diagnostics GmbH

Hermannswerder 17 14473 Potsdam Germany

Tel.: +49 (0)331-2300-200 Fax: +49 (0)331-2300-299

[email protected] www.bc-diagnostics.com

Korrespondenzadresse:

Diskussion:

Der Einsatz des foodproof® Salmonella Detection Kits ist nicht nur eine sehr schnelle,

sondern auch eine der sichersten Methoden um Salmonella in Lebensmitteln nach-

zuweisen.

Das American Proficiency Institute veröffentlichte eine Studie über die Anzahl falsch

positiver Testergebnisse bei Ringversuchen in der mikrobiologischen Lebensmittelun-

tersuchung. Dabei wurden Daten von 1999 - 2012 erfasst. Die Studie zeigt, dass in

diesem Zeitraum durchschnittlich 4.9 % der Salmonella spp. Proben als falsch positiv

bewertet wurden[5]. Die zwischen Juli 2012 und Mai 2014 erhobenen Daten am BAV-

Institut ergaben dagegen einen Anteil von 0.21 % nicht kulturell bestätigter Proben,

sowie einen insgesamt nicht auszuwertenden Probenanteil von unter 2 %.

Dies ergänzt die MicroVal und AOAC Validierungsdaten, welche eine relative Genau-

igkeit von 98 % für das Verfahren zeigen[3], [4]. Beide Ergebnisse unterstreichen die

Zuverlässigkeit der Real-Time PCR Methode im Lebensmittelbereich.

Fazit:

Das foodproof® Salmonella Detection Kit ist in Kombination mit dem foodproof® Mag-

netic Preparation Kit I und dem foodproof® RoboPrep+ HT 150-8 die optimale Lösung

für einen effizienten und zuverlässigen Arbeitsablauf für Dienstleistungslabore mit ho-

hen Testzahlen.

Literatur:

[1] Schneider, A.; Grönewald, C.; Fandke, M.; Kurth, B.; Barkowski, S.; Berghof-

Jäger, K.: Real-Time Detection of the Genus Salmonella with the LightCycler

System Biochemica 4/2002

[2] Robert Koch-Institut: Infektionsepidemiologisches Jahrbuch für 2012, Berlin, 2013

[3] MicroVal (2013, Certificate 2011-LR40)

[4] AOAC (AOAC-RI PTM Certificate # 120301)

[5] C. C. Snabes, D. C. Edson, S. Empson, L. D. Massey: Pathogen Detection in Food

Microbiology Laboratories: An Analysis of Proficiency Test Performance.

113th General Meeting of the American Society of Microbiology, 2013.