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Einsatz partikulärer und monolithischer Kapillaren in der

Kapillarelektrochromatographie

Vom Fachbereich C – Analytische Chemie der Bergischen Universität Wuppertal zur

Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

Dr. rer. nat.

genehmigte

DISSERTATION

von

Stefan Droste

aus Dorsten

Wuppertal 2005

Die vorliegende Arbeit entstand auf Anregung und unter Leitung von

Herrn Prof. Dr. S. Gäb

an der Bergischen Universität Wuppertal im Fachbereich C – Analytische Chemie

in der Zeit von Januar 2002 bis Juli 2005

Diese Dissertation kann wie folgt zitiert werden: urn:nbn:de:hbz:468-20050750 [http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn=urn%3Anbn%3Ade%3Ahbz%3A468-20050750]

Danksagung

An erster Stelle möchte ich mich bei meinem Doktorvater Herrn Professor Dr. S. Gäb für die

Bereitstellung des Themas bedanken. Die stete Diskussionsbereitschaft und Unterstützung

halfen gerade in den Zeiten, in denen es nicht von selbst lief.

Für die Übernahme des Korreferats und für die Beantwortung unzähliger Fragen auf dem

Gebiet der CE und CEC danke ich Herrn PD Dr. O. Schmitz.

Der mechanischen Werkstatt unter der Leitung von Herrn Brakelmann danke ich für die stets

schnelle und passgenaue Fertigung aller extravaganten Wünsche, die mir im Laufe meiner

Arbeit einfielen.

Den Massenspektrometrie-Experten Marc Schellenträger und Marc Constapel danke ich für

die oftmals aufwendige Mithilfe bei den Kopplungsversuchen der CEC mit der MS.

Bei Prof. Dr. Thorsten Benter und Dr. Klaus Brockmann bedanke ich mich für die wertvolle

Unterstützung bei allen Experimenten mit dem Eximer-Laser. Die große Flexibilität,

Diskussionsfreude und die lockeren Sprüche machten die Arbeit zum Vergnügen.

Bei Dr. Walter V. Turner bedanke ich mich für die Unterstützung bei allen Fragestellungen

zur englischen Sprache.

Frau Silke Möschter im besonderen, aber natürlich den Rest der Arbeitsgruppe danke ich für

die stete Hilfsbereitschaft, das gute Arbeitsklima und für viele Diskussion zu meiner Arbeit.

Zu guter Letzt möchte ich mich noch bei Andrea bedanken. Es war bestimmt nicht leicht,

meiner teilweise schlechten Laune mit Deiner Geduld und Zuversicht zu begegnen; what

comes around goes around.

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung .......................................................................................................................... 8

1.1 Kapillarelektrochromatographie (CEC).............................................................. 11

1.1.1 Elektroosmotischer Fluß (EOF) ........................................................................... 13

1.1.2 Vorteile der CEC.................................................................................................. 16

1.1.3 Nachteile der CEC................................................................................................ 18

1.1.4 Verschiedene Säulen in der CEC ......................................................................... 19

1.1.4.1 Open-Tubular-Kapillaren ................................................................................. 19

1.1.4.2 Gepackte Kapillaren......................................................................................... 20

1.1.5 Detektionsarten in der CEC.................................................................................. 25

1.1.5.1 CEC-UV/VIS ................................................................................................... 25

1.1.5.2 CEC-LIF........................................................................................................... 26

1.1.5.3 CEC-MS........................................................................................................... 27

2 Aufgabenstellung und Zielsetzung................................................................................ 30

3 Ergebnisse und Diskussion ............................................................................................ 31

3.1 Partikuläre Kapillaren für die CEC..................................................................... 31

3.1.1 Herstellung der Trennkapillare............................................................................. 31

3.1.1.1 Slurry Packung mit gesinterten Fritten............................................................. 31

3.1.1.2 Slurry Packung mit Querschnittsverengung und einer Fritte ........................... 33

3.1.2 Einsatz von Kapillaren mit gesinterter Fritte gegenüber konischer Verjüngung an

der Auslassseite .................................................................................................................... 36

3.1.3 Einsatz weiterer partikulärer Phasenmaterialien .................................................. 39

3.1.3.1 Trennung einer Testmischung an einer endcapped-Aminphase ...................... 40

3.1.3.2 Trennung eines Wirkstoffgemisches an einer endcapped-Aminphase ............ 47

3.1.3.3 Trennung einer PAK-Mischung an einer BS-C23-Phase................................. 50

3.1.3.4 Fazit zu den partikulär gepackten Phasen ........................................................ 50

3.2 Monolithische Kapillaren für die CEC ................................................................ 51

3.2.1 Molecular Imprinted Polymer - MIP.................................................................... 52

3.2.2 Monolithische Kapillaren auf Basis wasserlöslicher Acrylamid-Monomere ...... 56

3.2.3 Monolithen auf Silikabasis................................................................................... 62

3.2.3.1 Trennung von PAKs und UV-Detektion.......................................................... 62

3.2.3.2 Trennung von derivatisierten Wirkstoffen und LIF-Detektion ........................ 63

3.3 Einsatz der CEC-MS.............................................................................................. 69

3.3.1 Trennung von Alkylpolyglykosiden (APGs) mittels CEC-ESI-MS .................... 69

3.3.2 Entwicklung einer CEC-ES-APLI-MS-Kopplung ............................................... 73

3.3.3 Einsatz eines Silika-Monolithen in der ES-APLI- MS ........................................ 81

3.4 Limitationen der CEC ........................................................................................... 86

4 Zusammenfassung.......................................................................................................... 88

5 Experimenteller Teil ...................................................................................................... 90

5.1 Methoden zur Herstellung der Kapillaren........................................................... 90

5.2 Fluoreszenzmakierung der Wirkstoffe................................................................. 95

6 Anhang ............................................................................................................................ 96

6.1 Abbildungsverzeichnis ........................................................................................... 96

6.2 Tabellenverzeichnis................................................................................................ 97

6.3 Chemikalienliste ..................................................................................................... 98

6.4 Geräteliste ............................................................................................................. 100

7 Literaturverzeichnis..................................................................................................... 101

Abstract In this work, monolithic and particulate-packed capillaries were tested for their usefulness in

capillary electrochromatography (CEC). One problem with particulate-packed capillaries is

the formation of air bubbles, which occurs mainly at the outlet frit. For this reason, tapered

capillaries were tested, where the outlet frit is replaced by a reduction in the diameter of the

capillary. The use of an electrical arc makes the fabrication of the bottleneck reproducible.

The particles are retained by the tapered “outlet frit” and form a stable bed. Blank tests

showed that the tapered capillaries tend to form fewer air bubbles than fritted capillaries with

similar separation efficiencies.

An even better reduction in bubble formation could be achieved with monolithic capillaries.

With the Molecular-Imprinting-Polymer (MIP) approach, highly selective phases could be

synthesized. An MIP which was produced by photo-initiated polymerization with cotinine as

a template made it possible to separate the structurally related compounds cotinine, myosmine

and nicotine. Because of the high selectivity, the applicability of the MIP as solid-phase

extraction (SPE) material during sample preparation is encouraging.

Acrylamide and silica monoliths proved to be less selective, but well suited for separations of

lipophilic samples. With these capillaries, air-bubble generation was not a problem. Although

the acrylamide monoliths, which were prepared as part of this work, are based on water-

soluble monomers, the lipophilic interactions between the sample and the stationary phase

were strong enough to retain and separate a mixture of polycyclic aromatic hydrocarbons

(PAHs). Stronger lipophilic characteristics were shown by the commercially available RP-18

silica monoliths. These possessed good separation efficiencies for neutral lipophilic

substances and produced a satisfactory EOF. The acrylamide and the silica monoliths were

easily coupled to the mass spectrometer (MS). Alkyl polyglycosides (APGs) were analyzed

first by ESI-MS. While the lipophilic properties of the acrylamide phase were not strong

enough for base-line separation, the silica phase separated the APGs quite well. Only polar

substances can be ionized by ESI, but, since CEC is especially useful for the separation of

lipophilic substances, the monolithic capillaries were coupled with the recently developed

Atmospheric-Pressure-Laser Ionization (APLI). The acrylamide monolith was destroyed in

the tip area when the laser was turned on. This might have happened because the laser light

was scattered in the ionization area, which led to irradiation of the capillary tip. In the end,

this induced pyrolysis and formed a great number of nitrogen-containing fragments. These

were ionized by ESI and produced a noisy background. Separation of the PAHs was achieved

with the silica monolith. Selective soft ionization was employed, with subsequent TOF-MS

detection. With this technique, the application of CEC-MS could be extended to lipophilic

substances.

Abkürzungsverzeichnis APS AmmoniumperoxidisulfatCEC Capillary ElectrochromatographyCFFAB Continous Flow Fast Atom BombardmentDAD Diodenarray DetektorDMAA DimethylacrylamidDMAL DimethylallylaminEOF Elektroosmotischer FlussESI Electrospray IonizationHPLC High Performance Liquid ChromatographyID InnendurchmesserIPA IsopropylacrylamidLIF Laserinduzierte FluoreszenzMAA Methacrylic AcidMMA Methylmethacrylic AcidMS MassenspektrometerNSAR Nicht steroidale AntirheumatikaPAK Polyaromatische KohlenwasserstoffePDA PiperazindiacrylamidTEMED N,N,N,N-TetramethylethylendiaminTRIM [1,1,1-tris(hydroxymethyl)-propane trimethacrytlat]VSA Vinylsulfonic Acid

Einleitung 8

1 Einleitung

Die Arbeiten des Physikers KOHLRAUSCH zur Leitfähigkeit von Elektrolytlösungen führten

1897 zum KOHLRAUSCH’schen Gesetz, welches besagt, dass sich geladene Teilchen abhängig

von ihrem Masse/Ladungsverhältnis (m/z) mit unterschiedlicher Geschwindigkeit in einem

elektrischen Feld bewegen [1]. Dieser als Elektrophorese bezeichneter Effekt wurde bereits

1937 von TISELIUS zur Trennung einer Proteinmischung erfolgreich eingesetzt [2].

Da jedoch die Elektrophorese in Lösung durch die thermische Diffusion und Konvektion in

ihrer Leistungsfähigkeit stark begrenzt ist, wurde die Flachbettgelelektrophorese entwickelt.

Dabei werden Gele beispielsweise auf Polyacrylamid- oder Agarosebasis eingesetzt, an denen

nach Auftragen der Probe ein elektrisches Feld angelegt wird. Diese Methode wird heute noch

häufig zur Trennung von Aminosäuren, DNA, RNA, Peptiden und Proteinen in der

Bioanalytik verwendet [3]. Jedoch hat sie einige gravierende Nachteile:

- Aufgrund der entstehenden Joule’schen Wärme ist die üblicherweise angelegte

Spannung relativ gering; dies führt zu schlechten Trennleistungen und langen

Analysenzeiten.

- Die Detektion erfolgt meist indirekt durch Anfärbung, wodurch eine quantitative

Aussage erheblich erschwert wird.

- Die mangelnde Automatisierbarkeit und der damit einhergehende geringe

Probendurchsatz wirken sich begrenzend aus.

Um diese Probleme zu lösen, wurde die Elektrophorese zunächst in einem Rohr und später

dann in einer Kapillare durchgeführt. HJERTÉN gelang 1967 zum ersten mal eine

Zonenelektrophorese im Quarzrohr [4]. Dabei rotierte das Glasrohr um seine eigene Achse,

wodurch eine thermische Stabilisierung gewährleistet wurde. Um den Aufbau zu vereinfachen

und eine bessere Wärmeabfuhr zu erzielen, wurde eine Verringerung des Innendurchmessers

nötig. Ende der 70er Jahre nutzten MIKKERS, EVERAERTS und VERHEGGEN zunächst Glas-

und Teflonkapillaren mit Innendurchmessern zwischen 200 und 500 µm [5], bevor dann

anfang der 80er Jahre JORGENSON fused-silica Kapillaren aus der Gaschromatographie mit

Innendurchmessern zwischen 50 und 200 µm einsetzte [6-8]. Dies ermöglichte letztendlich

eine sehr effiziente Kühlung, da mit abnehmendem Innendurchmesser das Verhältnis von

Oberfläche zu Volumen verbessert wird. Dadurch ergeben sich mehrere Vorteile:

Die Neugier steht immer an erster Stelle eines Problems, das gelöst werden will. Galileo Galilei.

Einleitung 9

- Eine direkte on-column UV- und Fluoreszenzdetektion ist durchführbar und somit das

Anfärben der Analyten unnötig.

- Ein hoher Automatisierungsgrad kann erreicht werden.

- Die Wärme kann wesentlich besser abgeführt werden, was wiederum höhere

Feldstärken und damit geringere Analysenzeiten ermöglicht.

- Der Lösungsmittelverbrauch sinkt aufgrund des geringen Kapillarvolumens.

- Es sind nur kleine Probenmengen erforderlich.

JORGENSON beschäftigte sich unter anderem mit der theoretischen Beschreibung von

kapillarelektrophoretischen Trennungen [6-8]. Seine Arbeiten werden deshalb häufig als

Beginn der Kapillarzonenelektrophorese bezeichnet. Mittlerweile ist eine Vielzahl von

unterschiedlichen Methoden unter dem Oberbegriff der Kapillarelektrophorese (CE)

entwickelt worden. Einige sollen im Folgenden erläutert werden [9, 10].

Kapillarzonenelektrophorese

Die Kapillarzonenelektrophorese (CZE) ist die am weitesten verbreitete Methode in der

Kapillarelektrophorese. Die Trennung erfolgt aufgrund der unterschiedlichen

elektrophoretischen Mobilitäten geladener Analyten in einem konstanten elektrischen Feld

(~ 500 V/cm). Auch alle anderen Parameter wie Pufferstärke, pH-Wert usw. werden bei den

Messungen konstant gehalten. Neutrale Teilchen lassen sich mit dieser Methode nicht

auftrennen.

Micellare Elektrokinetische Chromatographie

Die Micellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC) wurde 1984 von TERABE

entwickelt [11]. Unter Zuhilfenahme eines Micellenbildners wird eine pseudostationäre Phase

gebildet, die eine Trennung von neutralen und geladenen Analyten ermöglicht. Bei der

MEKC handelt es sich um eine sehr leistungsstarke Analysenmethode, die allerdings eine

Kopplung mit einem massenspektrometrischen Detektor (MS) erschwert. Die Micellenbildner

wie z. B. Natriumdodecylsulfat (SDS) verschlechtern die Ionisierung der Analyten erheblich,

und es kommt zudem zu Verunreinigungen der MS-Quelle.

Kapillargelelektrophorese

Die Kapillargelelektrophorese (CGE) wird eingesetzt, um biologische Proben aus einer

komplexen Matrix zu untersuchen. Sie ist eine der wichtigsten Analysemethoden in der

Biochemie und der Molekularbiologie. Durch Automatisierung und Entwicklung von

Multikapillar(Array)-Systemen konnte der Probendurchsatz dieser Methode stark erhöht

Einleitung 10

werden. Dadurch wurde es beispielsweise möglich, das menschliche Genom wesentlich

schneller als erwartet zu sequenzieren [12].

Kapillare Isoelektrische Fokussierung

Bei der Kapillaren Isoelektrischen Fokussierung (cIEF) wird in der Kapillare mit Hilfe eines

Ampholyten ein pH-Gradient aufgebaut. Nach Anlegen einer Spannung werden Proteine

abhängig von ihrem isoelektrischen Punkt im entsprechenden pH-Bereich fokussiert. Auch

hier wurden die ersten Experimente Mitte der 80er Jahre durchgeführt. Pionier auf diesem

Feld war HJERTÉN [13-15]. Die cIEF ist eine Methode mit sehr hoher Trenneffizienz [16].

Kapillarelektrochromatographie

Bei der Kapillarelektrochromatographie (CEC) handelt es sich um eine Hybridmethode aus

HPLC und CE (siehe Abb. 1.1). Kapillaren werden mit verschiedenen stationären Phasen

gefüllt, jedoch wird der Eluent nicht mit Hilfe einer Pumpe gefördert, sondern durch das

Anlegen eines elektrischen Feldes. Die Trennung wird nun, analog zur HPLC, durch

unterschiedliche Verteilung der Analyten zwischen stationärer und mobiler Phase erreicht.

Zusätzlich können bei geladenen Ionen unterschiedliche elektrophoretische Mobilitäten zur

Trennung beitragen [17]. Im folgenden Kapitel wird die CEC ausführlicher behandelt.

Abb. 1.1: CEC als Hybridmethode aus µ-HPLC und CE

Einleitung 11

1.1 Kapillarelektrochromatographie (CEC)

Die Bandenverbreiterung in der HPLC kann durch stationäre Phasen mit geringeren

Partikeldurchmessern reduziert werden. Dadurch werden immer kleinere Bodenhöhen erreicht

[18]. Der Einfluss der Partikelgröße auf die Trennleistung eines Systems ergibt sich aus der

van-Deemter Gleichung. Danach haben, vereinfacht dargestellt, kleine Partikel eine geringere

Diffusion der Analyten im Trennsystem zur Folge. Jedoch ist auch hier eine technische

Grenze vorhanden, da der Gegendruck von Partikeln im Submikrometer-Bereich zu groß

wird. Alternativ kann die mobile Phase nicht mit Druck, sondern mit Strom durch die

Kapillare befördert werden. Bereits 1974 verglich PRETORIUS die Bodenhöhen von

druckgetriebenen gegenüber elektrisch angetriebenen Systemen [19]. Die Nutzung des

elektroosmotischen Flusses als Pumpe führt zu stark verringerten Bodenhöhen, da nicht das

für Druck typische parabolische Strömungsprofil entsteht, sondern, wie in Abbildung 1.2

dargestellt, ein charakteristisches stempelförmiges Profil [20].

Abb. 1.2: Vergleich der Strömungsprofile in CEC und HPLC

1981 zeigten JORGENSON und LUKACS die Trennung von 9-Methylanthracen und Perylen [7].

Sie verwendeten dazu eine Kapillare (I.D. 170 µm), die mit Kieselgelpartikeln

(Partikeldurchmesser 10 µm, Octadecylsilan modifiziert) gepackt war. Dies kann als

Geburtsstunde der CEC aufgefasst werden.

Seit dieser Zeit wurde die Forschung auf diesem Gebiet enorm ausgeweitet, da aufgrund der

Tatsache, dass der Gegendruck keine Rolle spielt, sehr kleine Packungsmaterialien eingesetzt

Einleitung 12

werden können. Zusätzlich können unter Hinnahme von verlängerten Analysezeiten deutlich

längere Säulen als in der HPLC verwendet werden. Man erhält so eine wesentlich größere

Anzahl an effektiven Böden und ermöglicht damit gute Trennleistungen. Ein Problem stellt

jedoch bis heute die Herstellung der Säulen dar, so dass die CEC immer noch nicht in ihrem

gesamten Potential genutzt werden kann. Da der prinzipielle Aufbau der CEC dem der

klassischen CE gleich ist (Abb. 1.1), können die Messungen mit kommerziell erhältlichen

CE-Geräten durchgeführt werden. Anstelle der freien Kapillaren werden jedoch Kapillaren

entweder gepackte oder oberflächenmodifizierte Kapillaren verwendet. Bei den Packungen

handelt es sich um Partikel wie sie aus der HPLC bekannt sind, die je nach Anwendung

unterschiedlich oberflächenmodifiziert sind. Bei den oberflächenmodifizierten Kapillaren

wird Analog zur GC eine funktionelle Gruppe an die Oberfläche der freien Kapillare

synthetisiert.

Die meisten beschriebenen Anwendungen nutzen partikulär gepackte Kapillaren mit

HPLC-typischen Phasen [21]. Bei diesen Kapillaren hat man zwei Bereiche, einen gepackten

und einen nicht gepackten Teil. Der nicht gepackte Teil an der Auslass-Seite (outlet) dient der

Detektion, da die vom Packungsmaterial verursachte Lichtstreuung eine optische Detektion

erheblich erschweren würde. Um eine Verbreiterung des Signals nach der Trennung zu

vermeiden, wird möglichst nah am Packungsende detektiert. Diese zweigeteilten Kapillaren

werden „Duplex“-Kapillaren genannt und nur dann verwendet, wenn in der Kapillare (on-

column) detektiert werden soll, nicht aber bei Kopplungen mit off-column-Detektoren wie

zum Beispiel einem Massenspektrometer.

Ein zweiter Weg ist die Verwendung von monolithischen Säulen, welche auf der gesamten

Kapillarlänge eine stationäre Phase in Form eines Polymers enthalten [22]. Diese Polymere

werden unter Freilassung eines Detektionsfensters (z.B. durch Abdecken desselben mit

Aluminiumfolie während der Durchführung einer UV-induzierten Polymerisation) in situ in

der Kapillare gebildet. Je nach Anwendung können verschiedenste Monomere zur Reaktion

eingesetzt werden, was zu einer Vielzahl von möglichen Polymeren und damit zu

unterschiedlichsten Einsatzmöglichkeiten führt.

Auch der Gebrauch von freien oberflächenmodifizierten Kapillaren (open tubular) in der CEC

ist möglich (OT-CEC) [23]. Die Kapillarwände werden dort ähnlich wie in der GC mit

stationärer Phase belegt. Der größte Nachteil der OT-CEC ist die schlechte Nachweisgrenze,

da sehr dünne Kapillardurchmesser gewählt werden müssen.

Im Folgenden soll nun auf die theoretischen Hintergründe und die für diese Arbeit

bedeutsamen Packungsarten eingegangen werden.

Einleitung 13

1.1.1 Elektroosmotischer Fluß (EOF)

Aufgrund der Verkleinerung des Querschnitts bis auf die heute üblichen Kapillardurchmesser

von 50 – 200 µm muss neben der Wanderung der Ionen im elektrischen Feld nach

KOHLRAUSCH [1] ein zweiter Wanderungseffekt, der elektroosmotische Fluss (EOF),

berücksichtigt werden. Durch die Verwendung von fused-silica Kapillaren liegt an der

Oberfläche aufgrund der dort vorhandenen Silanolgruppen eine pH-abhängige negative

Ladung vor. Dies führt zur Anziehung von positiven Ladungen aus dem in der Kapillare

befindlichen Elektrolyten. Nach STERN bildet sich eine starre Grenzschicht durch an der

Oberfläche adsorbierte Ionen aus (HELMHOLTZ-Schicht), welche von einer diffusen

Grenzschicht überlagert wird (die GOÜY - CHAPMAN Schicht). Beim Anlegen einer Spannung

entlang der Kapillare wandern die positiven Ionen der diffusen Grenzschicht in Richtung

Kathode. Durch die auftretenden Scherkräfte wird der Elektrolyt im Inneren der Kapillare

mitbewegt. So kommt es zur Ausbildung eines fast perfekt stempelförmigen Strömungsprofils

[24].

Das Potential an der Grenze zwischen starrer und diffuser Grenzschicht wird als

Zetapotential (ζ) bezeichnet. Übliche Werte für ζ liegen zwischen 0 und 100 mV, abhängig

von der Elektrolytkonzentration und dem pH Wert. ζ nimmt, wie die Ladungsdichte,

exponentiell mit der Entfernung von der Kapillarwand ab. Die Dicke der Doppelschicht ist als

δ definiert.

Nach Knox [18] berechnet sich δ als:

202cFRTrεεδ = (1)

mit εr = Dielektrizitätskonstante des Mediums

ε0 = Dielektrizitätskonstante des Vakuums

R = universelle Gaskonstante

T = absolute Temperatur

c = molare Elektrolytkonzentration

F = Faraday Konstante

Bei der Verwendung von Wasser als Lösungsmittel (εr = 80) wird ein δ von 10 nm für eine

0,001 M und 1 nm für eine 0,1 M Elektrolytlösung erhalten.

Zur Beschreibung des EOF dient eine Grundgleichung, welche Anfang 1900 durch VON

SMOLUCHOWSKI entwickelt wurde. Seine Theorie beschreibt dabei die Mobilität µeo,offen eines

Elektrolyten entlang einer geladenen Platte bei vorhandenem elektrischen Feld E als [25-27]:

Einleitung 14

ηζεεµ Wroffeneo

0, =

(2)

mit ζW = Zetapotential an der Kapillarwand

η = Viskosität des Elektrolyten

Dieses Modell ist hinreichend genau für freie Kapillaren. Da aber in der CEC die Kapillare

mit vielen Einzelpartikeln gepackt ist, an denen sich Doppelschichten ausbilden, muss hier

berücksichtigt werden, dass, wie in Abb. 1.3 gezeigt, die Partikel zur Ausbildung vieler

paralleler Mikrokanäle beitragen [28-32].

Abb. 1.3: EOF in gepackter Kapillare nach [33]

Unter Berücksichtigung der Packungsdichte, also der Durchlässigkeit der Packung, wurde

Gleichung 2 auf Grundlage der Arbeiten von OVERBEEK [27] erweitert und liefert für eine

gepackte Kapillare die Mobilität µeo,gepackt eines Elektrolyten [31]:

(3)

mit: ζP = Zetapotential an der Partikeloberfläche

σgepackt = Leitfähigkeit der gepackten Kapillare

( )offen

gepacktPrgepackteo σ

σ

ηζεεµ ⋅= 0,

Einleitung 15

σoffen = Leitfähigkeit der offenen Kapillare

Dabei ist das Verhältnis der Leitfähigkeiten von gepackter und freier Kapillare leicht messbar

und liefert eine Aussage über die Qualität der Packung. Je kleiner der Quotient ist, desto

dichter ist die Packung.

Nachfolgend wird erläutert, von welchen Größen der EOF in der CEC abhängig ist [34]. Dazu

wird eine Formel abgeleitet, welche die Faktoren, die Einfluss auf die

Wanderungsgeschwindigkeit haben, beschreibt. Im ersten Schritt soll ζP aus Gleichung 3

ersetzt werden. Es gilt, dass die Wanderungsgeschwindigkeit direkt proportional zur

elektroosmotischen Mobilität ist und somit zum Zetapotential, welches seinerseits von der

Ladungsdichte ω abhängig ist:

0εεωδζ

rp ≈ (4)

Weiterhin gilt, für die elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit eines Analyten im

elektrischen Feld:

Ev gepackteoCEC ⋅= ,µ (5)

mit vCEC = lineare Geschwindigkeit

E = elektrische Feldstärke

Die Kombination der Gleichungen 3-5 führt zu:

( )offengepacktEvCEC σσηωδ ⋅≈ (6)

Aus dieser Gleichung wird nun deutlich, dass der EOF von folgenden Faktoren abhängig ist:

- Ladungsdichte an der Oberfläche

- Elektrische Feldstärke

- Dicke der elektrischen Doppelschicht

- Viskosität des Elektrolyten (und damit Temperatur)

- Packungsdichte

Einleitung 16

Je nach Herstellungsmethode variiert die Oberflächenladung von stationären Phasen, was zu

Unterschieden im EOF führt. KNOX und GRANT stellten fest, dass der EOF in gepackten

Kapillaren geringer ist als in freien [35]. Dies hat zwei Hauptgründe: Zum einen sind die

Kanäle in einem gepackten Bett nicht axial zueinander angeordnet, was nach ihrer Schätzung

zu einer Reduzierung des EOF um 40 % führt. Des weiteren führt die Porosität der

Packungsmaterialien zu einer weiteren Reduzierung von bis zu 20 %. Der EOF in einer

gepackten Kapillare beträgt somit circa 40 – 60 % des EOFs einer freien Kapillare des

gleichen Materials. Diese Annahmen wurden von RATHORE, WEN und HORVATH bestätigt

[36]. Interessanterweise spielt die Partikelgröße erst dann eine Rolle, wenn der

Teilchendurchmesser sehr klein wird. In diesem Fall können Doppelschichten überlappen.

Dies führt zunächst zu einem parabolischen Profil und anschließend zu einem

Zusammenbruch des EOF. Theoretische Überlegungen von KNOX [18] zeigen, dass bei den

verwendeten Kapillaren von 50 bis 100 µm und einer Elektrolytkonzentration von 0,001 M

bis 0,01 M Partikeldurchmesser von ≥ 0,4 µm verwendet werden können. Knox nimmt an,

dass ein Überlappen der Grenzschichten keine Rolle spielt, solange die Partikeldurchmesser

größer oder gleich des vierzigfachen der elektrischen Doppelschicht sind. Eine ausführliche

theoretische Betrachtung des EOF gibt der Übersichtsartikel von RATHORE [34].

1.1.2 Vorteile der CEC

Die CEC versucht die Vorteile der HPLC mit denen der CE zu kombinieren. Die HPLC ist

eine der meist genutzten Methoden in der Analytik. Durch intensive Forschung in den letzten

Jahrzehnten verfügt der Analytiker heute über eine Vielzahl von verschiedenen Phasen.

Aufgrund der unterschiedlichen Wechselwirkungen der Phasen mit verschiedenen Analyten

sind die in der HPLC erhaltenen Selektivitäten recht hoch. Verglichen mit der CE ist die

Bodenzahl bei der HPLC jedoch relativ gering. Dies liegt an der großen Effizienz der CE, die

durch die geringe Diffusion und dem stempelförmigen Strömungsprofil erreicht wird. In der

HPLC sind die erreichbaren Bodenhöhen von den verwendeten Partikeldurchmessern

abhängig. Je kleiner der Durchmesser, desto kleiner ist auch die Bodenhöhe und umso größer

die Bodenzahl. In einem druckgetriebenen System wie der HPLC wird der lineare Fluss wie

folgt berechnet [18]:

LpdvHPLC φη

∆=

² (7)

Einleitung 17

mit vHPLC = lineare Geschwindigkeit

d = Partikeldurchmesser

∆p = Druckabfall entlang der Säule

φ = Gegendruckfaktor bei gepackten Säulen

η = Viskosität der mobilen Phase

L = Säulenlänge

Im Gegensatz dazu berechnet sich die Geschwindigkeit in einem elektrisch angetriebenen

System mit Hilfe der Gleichung 6. Es fällt auf, dass nur im druckgetriebenen System eine

Abhängigkeit vom Partikeldurchmesser besteht. So folgt daraus, dass in einem elektrisch

angetriebenen System auch sehr kleine Partikeldurchmesser verwendet werden können, ohne

dass die lineare Geschwindigkeit beeinträchtigt wird. So zeigten SIEFAR et al. [37], dass bei

1,5 µm Partikeldurchmesser eine Substanz nach 150 Sekunden mit 120.000 Böden eluiert

wird. Im Vergleich dazu muss man in der HPLC für 100.000 Böden bei 200 bar und 6 µm

Partikeldurchmesser eine Totzeit von 2000 Sekunden veranschlagen [38]. Des weiteren ist die

Signalverbreiterung in der CEC geringer als in der HPLC. HORVATH und LIN [39, 40] fassten

für die HPLC die einzelnen Faktoren der Signalverbreiterung zu einer Gleichung für die

Bodenhöhe H zusammen. Dies wurde von Dittmann [41] auf die CEC übertragen. Dabei

wurde gezeigt, dass der Beitrag der Eddy-Diffusion in der CEC wesentlich geringer als in der

HPLC ausfällt. Dies wird bei der Betrachtung der möglichen Weglängen und Kanalgrößen in

Packungen deutlich. In einer mit porösem, partikulärem Material gepackten Säule sind die

interpartikulären Kanäle wesentlich größer als die intrapartikulären. Daraus ergeben sich

unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten für interpartikuläre und intrapartikuläre

Strömungen bei druckgetriebenen Systemen. In der CEC ist der EOF beinahe unabhängig

vom Kanaldurchmesser, weshalb die Strömungsgeschwindigkeiten innerhalb und außerhalb

der Packung nahezu identisch sind. Deshalb findet in der CEC eine 2,5 fach geringere

Bandenverbreiterung als in der HPLC statt. Dies wurde mit Hilfe von NMR-Studien durch

TALLAREK [24] bewiesen.

Die geringere Bandenverbreiterung und somit kleineren Bodenhöhen in der CEC basieren

also nicht nur auf der Tatsache, dass generell kleinere Packungsmaterialien eingesetzt werden

können. Eine Größe, welche die Beurteilung der Bandenverbreiterung auch bei der

Verwendung von unterschiedlich großen Packungsmaterialien erlaubt, ist die reduzierte

Bodenhöhe h. Es gilt:

pdHh /= (8)

Einleitung 18

mit: h = reduzierte Bodenhöhe

H = Bodenhöhe

dp = Partikeldurchmesser

In der HPLC liegt nach einer Faustregel der optimale Wert für h um zwei. Bei der CEC

können für h jedoch Werte von eins und darunter erreicht werden. Diese verbesserten Werte

lassen auf einen sehr effizienten Massentransfer schließen [42, 43].

1.1.3 Nachteile der CEC

Ungefähr 90 % aller CEC-Applikationen nutzen Kapillaren mit Packungsmaterialien aus der

HPLC. Neben dem Vorteil, dass damit wohldefinierte und charakterisierte Phasen verwendet

werden, treten auch einige Nachteile auf. Ein Schwachpunkt dieser gepackten Kapillaren ist

ihre Tendenz, während der Messung Gasblasen zu bilden. Diese führen zum

Zusammenbrechen des Stromflusses, was gleichbedeutend mit dem Ende der Analyse ist. Die

Entstehung solcher Gasblasen kann mehrere Ursachen haben.

Temperaturerhöhung, durch nicht ausreichend abgeführte Joule’sche Wärme, verringert die

Löslichkeit von Gasen im Medium. Die Wärmeentwicklung pro Volumeneinheit ist in der

CEC ungefähr 1000 mal so groß wie in der HPLC [18], weshalb Kapillaren benötigt werden,

die circa um den Faktor 30 kleiner als HPLC Säulen sind (die Joul’sche Wärme ist

proportional zum Quadrat des Durchmessers). Ausgehend von der in der HPLC routinemäßig

verwendeten Säule mit 4,6 mm Innendurchmesser ergeben sich für die CEC Kapillaren mit

einer lichten Weite von 150 µm. Die Problematik der Wärmeentwicklung bei der CEC wurde

ausführlich von KNOX behandelt [20].

Gasblasen entstehen oftmals auch an der Grenze zwischen gepacktem und nicht gepacktem

Bereich innerhalb einer Kapillare. Wahrscheinlich kommt es hier durch EOF-Unterschiede zu

Turbulenzen, was zu Druckdifferenzen und einem Ausgasen der Lösung führt. Dies kann

durch sorgfältiges Entgasen des Puffers und durch Applikation eines Überdruckes (bis 12 bar)

auf Ein- und Auslassgefäß reduziert werden [44].

Darüber hinaus ist die reproduzierbare Erzeugung von Packungen äußerst schwierig. Selbst

mit Erfahrung sind Abweichungen von 5 bis 22 % zu erwarten [45-47]. Die Abhängigkeit der

Eddy-Diffusion von der Packungsdichte und der Packungsgröße, von KNOX als Qualität der

Packung bezeichnet [47, 48], dient hierbei als Vergleichsgröße.

In der CEC können aufgrund der kleinen Volumina keine externen Fritten verwendet werden,

weshalb meistens eine Fritte in die Kapillare „gesintert“ wird. „Sintern“ ist ein Begriff aus

der Pulvermetallurgie. Er beschreibt einen Prozess, bei dem Pulver verfestigt wird, indem es

Einleitung 19

auf dreiviertel der Schmelztemperatur erhitzt wird. Dadurch verliert es seine Korngrenzen und

bildet ein zunächst loses Netzwerk, welches mit der Zeit immer dichter wird. Aufgrund der

Analogie des Prozesses bei der Herstellung der internen Fritten in der CEC wird der Begriff

hier übernommen. Beim Sintern entstehen aufgrund einer kurzzeitigen Überhitzung, z. B. mit

Hilfe eines angelegten Widerstanddrahtes, Si-O-Si-Brücken zwischen den einzelnen Partikeln

und der Kapillarwand. Je nach Dauer und Temperatur entsteht so eine etwa 5 mm breite

interne Fritte mit zeitabhängiger Festigkeit. Bei zu kurzen Heizzeiten ist die Fritte sehr porös,

gut durchlässig, aber instabil. Bei zu langen Behandlungen kommt es durch einen

geschmolzenen Block zu einer Verstopfung der Kapillare. Zeitdauer und Temperatur des

„Sinterns“ sind vom Packungsmaterial abhängig. Beim häufigen Wechseln von

Packungsmaterialien müssen die verwendeten Parameter immer wieder neu optimiert werden,

um stabile Fritten zu erhalten.

1.1.4 Verschiedene Säulen in der CEC

In der CEC unterscheidet man grundsätzlich zwischen offene und gepackte Kapillaren.

Gepackte Kapillaren können in mit Partikeln gefüllte (partikuläre) und monolithische

Kapillaren unterteilt werden. Welche Kapillare eingesetzt wird, hat einen großen Einfluss auf

die Leistungsfähigkeit, die Möglichkeiten und auch die Probleme der Methode. Des weiteren

unterscheidet sich die Herstellung der Kapillaren fundamental, weshalb nachfolgend auf die

verschiedenen Arten genauer eingegangen werden soll.

1.1.4.1 Open-Tubular-Kapillaren Die OT-CEC hat viele Ähnlichkeiten mit der GC. Die stationäre Phase ist hier an der

Kapillarwand immobilisiert und kann mit verschiedensten Techniken (Adsorption [49],

kovalente Bindung [50], Sol-Gel [51] und andere Verfahren [52]) appliziert werden.

Auch wenn die OT-Kapillaren eine Alternative zu gepackten CEC-Kapillaren darstellen, so

ist der größte Nachteil jedoch das geringe Verhältnis von stationärer zu mobiler Phase. Die

Oberfläche der Kapillaren bleibt auch nach Behandeln der Kapillarwand wie dem Ätzen

gering. Seit der ersten OT-CEC-Analyse von Aromaten mit Octadecyl-modifizierten

Kapillaren (ID=30 µm) durch TSUDA [53] wurden Herstellung und Applikation der OT-

Kapillaren intensiv untersucht. DITTMANN und ROZING haben vor kurzem die theoretischen

Überlegungen mit den experimentellen Beobachtungen in der OT-CEC verglichen [54]. Einen

aktuellen Übersichtsartikel zum Fortschritt auf diesem Gebiet bietet KAPNISSI-

CHRISTODOULOU [55].

Einleitung 20

1.1.4.2 Gepackte Kapillaren Die gepackten Kapillaren werden in der CEC am häufigsten eingesetzt [21, 56]. Meist handelt

es sich dabei um Kapillaren, bei denen Material mit einem Partikeldurchmesser zwischen

1,5 und 5 µm als stationäre Phase verwendet wird. Der Vorteil besteht darin, dass es sich um

wohl definierte Phasen handelt, deren Eigenschaften bekannt sind. Eine zweite Art wird

monolithische Kapillaren genannt. Bei diesen Kapillaren wird ein Polymer in situ in der

Kapillare gebildet. Durch die Gleichmäßigkeit der Packung und damit auch des EOF

entstehen in monolithischen Systemen seltener Luftblasen. Ein Zurückhalten der stationären

Phase mit Fritten ist ^nicht mehr erforderlich, wodurch die Herstellung erleichtert wird. Aus

diesen Gründen werden monolithische Kapillaren als Alternative zu partikulär gepackten

Kapillaren gesehen [57, 58].

Partikulär gepackte Kapillaren

Die Partikel erfüllen in der CEC zwei Aufgaben. Zum einen sind sie für die Trennung

verantwortlich, indem sie über ihre Funktionalität (z.B. C18-Gruppen) mit dem Analyten in

Wechselwirkung treten. Zum anderen ist jedoch auch wesentlich, dass sie einen ausreichend

großen EOF erzeugen. Wie in Kapitel 1.2.1 beschrieben, entstehen an den freien

Silanolgruppen der Partikel elektrische Doppelschichten, die bei Anlegen einer Spannung

einen EOF hervorrufen. Bei den meisten Packungsmaterialien auf Silika-Basis ist dieser EOF,

wie auch in der freien Kapillare, zur Kathode gerichtet. Es ist zu beobachten, dass Phasen,

welche nicht oberflächendeaktiviert sind (z.B. Spherisorb-ODS 1 oder Hypersil), einen

zufrieden stellend großen EOF liefern [32]. Vollständig oberflächendeaktivierte Phasen

(endcapped) sind dagegen für die CEC ungeeignet. Das liegt daran, dass die Oberfläche der

Partikel wesentlich größer ist als die der Kapillarwand, und der EOF hauptsächlich von der

stationären Phase erzeugt wird.

Problematisch ist die Verwendung von Silika-Phasen bei niedrigen pH-Werten und neutralen

Analyten, da aufgrund der Protonierung der Silanol-Gruppen der EOF drastisch reduziert

wird. In solchen Fällen können so genannte Mixed-Mode-Phasen eingesetzt werden, welche

zusätzlich zur trennenden Funktionalität (z.B. C18-Gruppen) noch Sulfonsäuregruppen

enthalten. Diese sind auch bei niedrigen pH-Werten negativ geladen und erzeugen einen

ausreichend großen EOF [59].

Der EOF kann in der CEC – wie auch in der CE – umgekehrt werden, um eine anodische

Detektion zu ermöglichen. Zu diesem Zweck benötigt man eine positive Ladung auf der

Oberfläche der stationären Phase und – idealerweise – auch auf der Kapillarwand. Der EOF

Einleitung 21

bildet sich dann wie bisher beschrieben in Richtung Anode aus. Man erreicht diesen Effekt

zum Beispiel durch Einsetzen so genannter „polar embedded“ Phasen, welche oberflächennah

eine Amingruppe in ihrer Alkylkette besitzen oder durch starke Anionentauscher [60]. Der

Übersichtsartikel von EELTINK et al. [21] gibt einen sehr guten Überblick der eingesetzten

Phasen und Anwendungsgebiete.

Die häufigste Methode Kapillaren zu packen, beruht auf einer Aufschlämmung (Slurry) des

Packungsmaterials. Diese Slurry wird mit hohem Druck (ca. 600 bar) in die Kapillare

eingebracht [61]. Das Packen gelingt auch mit Hilfe von superkritischem CO2 [62, 63],

Zentrifugalkräften [64, 65] und Elektrokinetik [66]. Die einzelnen Packungstechniken werden

im Übersichtsartikel von COLON et al. verglichen [29].

Wie bereits unter den Nachteilen der CEC aufgeführt, kommt es gerade bei den partikulär

gepackten Kapillaren aufgrund der Fritten immer wieder zur Luftblasenbildung, welche die

Analysen im schlimmsten Fall unmöglich macht. Partikuläre Packungen werden deshalb

meistens nur in Systemen eingesetzt, bei denen auf Ein- und Auslassgefäß ein Druck angelegt

werden kann.

Monolithische Kapillaren

Unter Freihaltung eines Detektionsfensters wird in der Kapillare in situ ein polymeres

Netzwerk gebildet, welches als stationäre Phase dient. In der Literatur ist eine Vielzahl von

Monolithen beschrieben worden, die sich durch ihre Anwendung (z.B. Festphasenextraktion

oder Trennung) oder die eingesetzten Monomere unterscheiden. Es werden z.B. Monolithen

auf Polysaccharidbasis, Acrylamidbasis oder auch auf Silikabasis verwendet. Im Folgenden

sollen die für diese Arbeit relevanten Formen beschrieben werden. Die Aufzählung erhebt

keinen Anspruch auf Vollständigkeit. Für umfassende Informationen sei auf das Buch

„Monolithic Materials“ von SVEC hingewiesen [67].

Sol-Gel-Kapillaren

In Wasser lösliche Silikaderivate kondensieren unter Ausbildung einer festen Silikastruktur

(Gel). Bei der Herstellung von Kapillaren, die unter Zuhilfenahme dieses Sol-Gel-Prozesses

hergestellt werden, können zwei verschiedene Wege beschritten werden. So kann das Gel

einen kontinuierlichen Monolithen auf Silikabasis in der Kapillare bilden, welcher zur

stationären Phase derivatisiert wird (z.B. C18-Ketten) [68, 69], oder das Gel wird als Matrix

genutzt, in welche übliche, aus der HPLC bekannte, stationäre Phasen eingefügt werden [70].

Die Herstellung der Kapillaren für Monolithen nach dem Sol-Gel-Verfahren mit

anschließender Derivatisierung erfolgt vereinfacht nach folgendem Schema:

Einleitung 22

Zunächst wird eine hydrolytische Polykondensation von Tetra-Alkoxysilanen (z.B.

Tetramethoxysilan) in Gegenwart eines sauren Katalysators (z.B. wässrige Essigsäure) und

eines wasserlöslichen Polymers als Porogen (z.B. Polyethylengykol) durchgeführt [71, 72].

Bei dieser Reaktion kommt es durch Hydrolyse zur Bildung von Silanol-Gruppen, über die

Siloxan-Oligomere und schließlich Polymere entstehen. Zusammenfassungen zu diesem

Thema finden sich in den Übersichtsartikeln von TANAKA et al. [73, 74]. Nachdem der

Monolith hergestellt wurde, erfolgt die Derivatisierung (beispielsweise mit

Dimethyloctadecylchlorosilan, für eine RP-18-Phase), um die gewünschte Funktionalität zu

erhalten [75]. Das Polymer bietet eine große Anzahl von Derivatisierungsmöglichkeiten, so

dass auch auf einfache Weise die Richtung des EOF beeinflusst werden kann. Der Zusatz

einer Base zum Reaktionsgemisch erhöht dabei die Ausbeute des reaktiven Intermediates,

welches durch das Chlorsilan gebildet wird [75, 76].

Man unterscheidet zwei Arten von Poren im fertigen Monolithen, deren Größe im letzten

Schritt optimiert wird. Die Makroporen, welche den Monolithen durchziehen, sind für eine

gute Permeabilität verantwortlich. Die bei der Herstellung aus Mikroporen entstehenden

Mesoporen sind notwendig, um eine große Oberfläche für maximale Wechselwirkungen bzw.

um ein maximales Phasenverhältnis zwischen mobiler und stationärer Phase zu erhalten.

Während die durchgängigen Makroporen durch die Bedingungen während der Kondensation

beeinflusst werden, können die Mesoporen im Monolithen durch Austausch der flüssigen

Phase modifiziert werden [77]. Wenn eine Lösung mit einem pH-Wert größer acht verwendet

wird, so werden aus bereits vorhandenen Mikroporen Mesoporen. Diese Mesoporen besitzen

dann einen Durchmesser von ca. 10 nm [77]. Dabei ist es entscheidend, dass die Lösung einen

genau definierten und optimierten Zeitraum einwirkt, da bei zu langer Verweildauer dieser

Lösung die Mesoporen zu groß werden und somit letztendlich wieder eine unerwünschte

Oberflächenreduzierung stattfindet [75].

Derzeit werden nur wenige CEC-Applikationen mit dieser Phase durchgeführt. In der HPLC

dagegen wird sie wesentlich häufiger eingesetzt [78].

Eine weitere Verwendungsmöglichkeit des Sol-Gel-Verfahrens liegt in der Immobilisierung

der stationären Phase (z.B. 5 µm ODS 1-Partikel). Diese Kapillaren werden dann auch als

„particle loaded“ bezeichnet [79]. Sie werden entweder mit einer Slurry gefüllt, welche aus

den Sol-Gel-Ausgangssubstanzen und dem Packungsmaterial besteht [80] oder mit der

gewünschten stationären Phase gepackt und anschließend mit den Sol-Gel-Monomeren

gespült [63].

Das fertige Netzwerk verfügt über Poren, die groß genug sind, um eine Wechselwirkung

zwischen stationärer Phase und Analyten zu ermöglichen, die Partikel selbst aber

Einleitung 23

unbeweglich einschließen [79]. Für einen Übersichtsartikel zu dieser Art von Kapillaren sei

auf die Arbeit von ALLEN und EL RASSI verwiesen [79].

Monolithen auf der Basis von wasserlöslichen Acrylamid-Monomeren

Ursprünglich begann HJERTÉN mit der Herstellung von HPLC-Säulen auf diesem Gebiet [81].

Die Polymerisierung beruht auf der wässrigen Lösung eines Divinyl-Monomers (Vernetzer),

eines Monovinyl-Monomers und eines Initiators. Der Nachteil bei diesem Verfahren ist, dass

das Material hinterher schrumpft und so Totvolumina entstehen. Bei der Verwendung dieser

HPLC-Säulen muss deshalb die stationäre Phase nach dem Schrumpfen zunächst komprimiert

werden. Dadurch werden eventuell entstandene Hohlräume zur Säulenwand wieder

geschlossen.

Bei der CEC wird die Polymerisierung in einer mit 3-trimethoxysilylpropyl-Methacrylat

(Bindesilan) beschichteten Kapillare durchgeführt [67]. Das Bindesilan wird unter

Freisetzung von Methanol kovalent an der Glasoberfläche gebunden. Die Methacrylliganden

sind in der Lage, während der Polymerisation mit den Monomeren ein Copolymer zu bilden,

wodurch ein Schrumpfen verhindert wird [82]. Dafür muss bei der CEC im Gegensatz zu

Anwendungen in der HPLC noch ein Ladungsträger eingebracht werden, der zur Generierung

des EOF beiträgt. Hier liegt einer der Vorteile der wasserlöslichen Monomere. Es ist kein

Problem, in die Monomerenmischung geladene oder stark polare Substanzen einzubringen

und so eine gleichmäßige Oberflächenladung im Monolithen zu erzeugen. Als Ladungsträger

wird in den meisten Fällen Vinylsulfonsäure eingesetzt [67]. Die Porosität des Polymers wird

mit Hilfe eines Salzes wie z.B. Ammoniumacetat eingestellt. Mit steigender Konzentration

des Salzes wird die Porosität größer [83].

Die Wahl der Monomere bestimmt natürlich die Selektivität der stationären Phase. Eine

ausführliche Studie zu den Eigenschaften der Monomeren und den Konsequenzen für die

spätere Selektivität wurde von PETERS et al. durchgeführt [84, 85]. Dabei wurde die Trennung

verschiedener Benzole unter Einsatz von Copolymeren aus Ethylendimethacrylat (EDMA)

und Butylmethacrylat untersucht. Für die Selektivität der Kapillaren ist darüber hinaus die

Struktur und Morphologie des Polymers von großer Bedeutung. Von HOEGGER und FREITAG

wurden deshalb Versuche zur Strukturbildung der Polymere durchgeführt, bei denen der

Einfluss der prozentualen Anteile einzelner Monomere untersucht wurde [83]. Eine

Zusammenfassung über die Eigenschaften von Monolithen auf Acrylamid-Basis wurde von

den gleichen Autoren veröffentlicht [86].

Einleitung 24

Die Vielfalt der einsetzbaren Monomere und die individuelle Zusammensetzung für die

jeweilige Fragestellung macht eine erschöpfende Aufführung nicht möglich. Zum Einstieg sei

auch hier auf das Lehrbuch „Monolithic Materials“ [67] verwiesen.

Molecular Imprinting Polymer – Kapillaren (MIP-Kapillaren)

Unter „Molecular Imprinting“ versteht man die Herstellung von Polymeren, welche eine

individuell festlegbare Selektivität zeigen. Dabei wird ein Polymer in Gegenwart des späteren

Analyten (Templat) erzeugt. Bei Wahl geeigneter Monomere bildet sich ein Netzwerk um den

Analyten, und es entstehen hoch selektive Bindungsstellen für diese Substanz. Nach

Ausspülen des Templaten erhält man eine chromatographische Phase mit hoher Selektivität.

So können die MIPs selektiv für ein Enantiomer, eine bestimmte Substanz oder eine ganze

Substanzgruppe hergestellt werden. Die meisten MIP-Studien haben sich mit chiralen

Trennproblemen beschäftigt. Unter anderem wurden Arzneimittel [87, 88],

Aminosäurederivate und auch Zucker getrennt [89-91].

Molecular Imprinting in seiner heutigen Form wurde 1970 von TAKAGISHI und KLOTZ [92]

sowie WULFF und SARHAN [93] entwickelt. Sie berichteten in ihren Veröffentlichungen von

der Möglichkeit, ein „Chemisches Gedächtnis“ in synthetischen Polymeren zu erzeugen.

WULFF zeigte in den folgenden Arbeiten die Möglichkeit, MIPs unter Bildung von kovalenten

Bindungen zwischen stationärer Phase und Analyten zu nutzen. Anfang der 80er Jahre führte

die Gruppe um MOSBACH eine MIP-Methode mit nicht kovalenten Bindungsstellen ein [94].

Dabei entsteht die Selektivität aufgrund von nicht-kovalenten Wechselwirkungen wie zum

Beispiel Wasserstoffbrückenbindungen, ionischen oder hydrophoben Wechselwirkungen.

Diese Entwicklung weitete das Anwendungsgebiet der MIPs drastisch aus, da die Zahl der

erfassbaren Analyten wesentlich vergrößert wurde. Eine dritte Methode nutzt

Wechselwirkungen zwischen Metallionen und Chelaten [95]. In der CEC wird aber nur der

Weg von MOSBACH, Trennungen über nicht-kovalente Wechselwirkungen zu erreichen,

genutzt.

Zur Herstellung der Kapillaren für die CEC wird eine komplexe Monomerenmischung

eingesetzt. Ein Schema zur Herstellung der MIP Kapillaren ist in Abbildung 1.4 dargestellt.

Die Monomerenmischung enthält den Templaten, funktionelle Monomere und den Vernetzer,

die in einem unpolaren Lösungsmittel gelöst sind. Um eine gute Durchlässigkeit des

entstehenden Polymers zu erhalten, wird noch ein Porogen hinzugefügt. Dabei muss das

entstehende Polymer unlöslich im Porogen sein, während das Porogen die Wechselwirkungen

zwischen Templat und funktionellem Monomer nicht beeinflussen soll. In der Mischung

bilden die funktionellen Monomere mit den Templaten Komplexe. Die Stärke dieser

Einleitung 25

Komplexe entscheidet über die Selektivität der MIP-Kapillare, weshalb die Wahl geeigneter

funktioneller Monomere sehr wichtig ist. Das funktionelle Monomer muss also in der Lage

sein, nicht-kovalente Bindungen mit dem Templaten einzugehen. Am häufigsten finden

Methacrylsäure (MAA) oder Vinylpyridin Verwendung. Als Vernetzer werden oft

Ethylenglykol-dimethacrylat (EDMA) oder Trimethylolpropan-trimethacrylat (TRIM)

genutzt. Als Porogen dient häufig iso-Oktan. Die Mischung wird dann mit einem thermo-

oder photolabilen Radikalstarter (z.B. 2,2’-Azobisisobutyronitril) versetzt und in die Kapillare

gefüllt. Die Verwendung eines photolabilen Radikalstarters hat den Vorteil, dass bei niedrigen

Temperaturen (-20°C) polymerisiert werden kann. Es wurde gezeigt, dass dies einen großen

Einfluss hat und bei –20 °C reproduzierbar Kapillaren mit höherer Selektivität entstehen als

bei Raumtemperatur [96-98]. Die Kapillaren werden deshalb zunächst gekühlt und

anschließend während der Reaktionszeit mit einer UV-Lampe bestrahlt. Die verwendeten

Kapillaren müssen dementsprechend UV-durchlässig sein, was die Verwendung von

beispielsweise Teflon-ummantelten Kapillaren bedingt. Die Zeit bis zur vollständigen

Polymerisation beträgt zwischen 1 und 24 Stunden.

1.1.5 Detektionsarten in der CEC

Die Qualität einer analytischen Trennmethode wird nicht nur durch ihre Trenneffizienz

beschrieben. Wichtige Kriterien sind die Empfindlichkeit und die Nachweisgrenze.

Spektrophotometrische Detektionen, wie UV/VIS oder Laser-induzierte Fluoreszenz (LIF),

werden in der CEC am häufigsten genutzt. Die Limitationen bei Detektionen in der CEC

wurden von DITTMANN et al. diskutiert [99].

1.1.5.1 CEC-UV/VIS Beim UV/VIS-Detektor strahlt das Licht durch den Teil der Kapillare, bei der zuvor die

Polyimidschicht entfernt wurde. Das Entfernen der Polyimidschicht macht die Kapillaren

zerbrechlich. Davon abgesehen hat die UV/VIS Detektion zwei Nachteile, eine geringe

Sensitivität und die Notwendigkeit chromophorer Gruppen bei der direkten UV-Detektion.

Die geringe Sensitivität entsteht durch die eingesetzte online-Detektion und der dabei

vorhandenen geringen Weglänge der „Zelle“. Die Detektion findet meistens nach der Fritte

statt, obwohl REBSCHER und PYELL trotz unruhiger Basislinie die mögliche Detektion im

gepackten Bereich der Kapillare zeigten [101]. Um die Sensitivität zu verbessern, können zur

Vergrößerung der Weglänge die aus der CE bekannten Bubble- und Z-Zellen eingesetzt

werden [102]. Durch Zugabe von Nitrat zum Eluenten können Analyten ohne chromophore

Einleitung 26

Gruppe indirekt detektiert werden. HILDER et al. konnten eine Trennung von anionischen

Substanzen mit indirekter Detektion bei 214 nm realisieren [103]. Jedoch bereitet die

indirekte Detektion bei vielen analytischen Fragestellungen enorme Probleme [104].

Abb. 1.4: Schema zur Herstellung eines MIP-Monolithen nach [100]

1.1.5.2 CEC-LIF Die Fluoreszenzdetektion ist selektiver und sensitiver als die UV/VIS-Detektion. Die

Fluoreszenz unterliegt nicht dem Lambert-Beerschen-Gesetz, weshalb eine Erhöhung der

Intensität, beispielsweise durch Verwendung eines Lasers (laser-induzierte Fluorszenz) als

Lichtquelle, eine erhöhte Sensitivität ergibt. Die Leistungsfähigkeit der CEC in Kombination

mit der laser-induzierten Fluoreszenz zeigten YAN et al., die 16 PAKs in 10 Minuten nach

isokratischer Trennung detektierten und unter Ausnutzung der nativen Fluoreszenz bei

257 nm Nachweisgrenzen von 10-9 bis 10-11 M erreichten [105]. Da aber nur wenige Analyten

eine nutzbare native Fluoreszenz besitzen, ist oftmals eine Derivatisierung des Analyten mit

Monomerenmischung

UV -Lampe

Kapillare mit versiegelten Enden

Kapillare

Vorbereitung zur Polymerisation

auf – 20°C kühlen

UV - Bestrahlung

Spülen

CEC

Einleitung 27

einer fluoreszenz-aktiven Gruppe nötig. Dies kann die Analytik hinsichtlich der

Reproduzierbarkeit und des Probendurchsatzes sehr aufwendig machen.

1.1.5.3 CEC-MS Seitdem es gelungen ist, Analyten aus Flüssigphasen zu ionisieren, entwickelte sich das

Massenspektrometer (MS) zu einer starken Detektionsmethode. Das MS ist für die Kopplung

mit kapillarelektrophoretischen Trennmethoden ideal, da hier die Nachteile der geringen

Sensitivität und der Notwendigkeit chromophorer Gruppen nicht vorhanden sind. Die zur

Kopplung mit der CEC eingesetzten Ionisierungsmethoden werden als Atmospheric Pressure

Ionisation (API)-Methoden bezeichnet. API-Methoden sind beispielsweise die Atmospheric

Pressure Chemical Ionisation (APCI) [106], das Continuous Flow Fast Atom Bombardment

(CF-FAB) [107] die Atmospheric Pressure Photo Ionisation (APPI) und die Electrospray

Ionisation (ESI) [108].

Wenn neutrale Substanzen kapillarelektrophoretisch getrennt werden sollen, so stehen die

MEKC und als mögliche Alternative die CEC, zur Verfügung. Bei der MS-Kopplung kann

jedoch die MEKC nur unter großen Einschränkungen verwendet werden. Die in der MEKC

eingesetzten Mizellenbildner stören bei der Spraybildung, reduzieren die Ionisierungseffizienz

und belasten durch Ablagerung in der Quelle das MS [109].

Generelle Überlegungen zur Kopplung der CEC mit der MS

Die CEC-MS-Kopplung ist komplizierter als die HPLC-MS-Kopplung. Die CEC benötigt

eine elektrische Verbindung am Auslassende der Kapillare, um einen geschlossenen

Stromkreis herzustellen. Bei längeren Trennungen kann es zusätzlich zu einer Verarmung an

Elektrolyten innerhalb der Kapillare kommen [110].

Wie bereits diskutiert, stellen in partikulär gepackten Kapillaren oftmals die Auslassfritten

den Ursprungsort für Luftblasen dar [35]. Das Anlegen eines externen Druckes, wie bei den

spektralphotometrischen Messungen, ist bei der Kopplung mit der MS nicht möglich.

Als MS-Detektor wurden bereits verschiedene Systeme genutzt: doppelt fokussierende

Sektorfeld-Systeme [111], Ionen-Cyclotron-Resonanz- [112], Ionenfallen- [113], Quadropol-

[114] und Flugzeit (TOF)-Spektrometer [115], wobei die beiden letztgenannten am häufigsten

eingesetzt werden. Das Quadropol-MS bewährt sich wegen seiner geringen Kosten und

Robustheit und das TOF-MS ist wegen der schnellen Scanrate gut geeignet. Dies ist bei den

schmalen Peaks in der CE und CEC von Bedeutung.

Einleitung 28

CEC-API-Interfaces

Die ersten CEC-MS-Kopplungen wurden mit Hilfe des Continous Flow Fast Atom

Bombardment (CF-FAB) realisiert [111, 116]. Diese Technik wird aber nicht mehr eingesetzt,

da der hohe chemische Hintergrund dieser Methode besonders bei Massen < 400 Dalton

Schwierigkeiten bereitet. Besser geeignet sind ESI, APPI und APCI. Obwohl generell

möglich, gibt es zur CEC-APCI-MS Kopplung keine und zur CE-APCI-MS Kopplung nur

zwei Veröffentlichungen [117, 118].

Die wichtigste Quelle bei CEC-MS Kopplungen ist die ESI-Quelle [119]. Der ESI-Prozess

besteht aus drei Teilschritten, der Erzeugung geladener Tropfen an der Kapillarspitze des

Elektrospray Interfaces, dem Schrumpfen der Tropfen durch Verdampfen des Lösemittels und

der Ausstoß der Ionen in die Gasphase.

Der in mehreren Arbeiten untersuchte Prozess, ist in Abb. 1.5 schematisch dargestellt und

lässt sich vereinfacht wie folgt beschreiben [120] :

An der Kapillarspitze der Quelle wird eine Spannung im kV-Bereich angelegt, und das

entstehende elektrische Feld wirkt auf die Flüssigkeit. Handelt es sich bei der Kapillarspitze

um die Anode, werden elektrochemisch negativ geladene Ionen entfernt. Die positiven Ionen

wandern zum Meniskus der Flüssigkeit, wo sie sich gegenseitig abstoßen. Dadurch kommt es

zu einer Ausdehnung der Oberfläche, was zur Ausbildung der Taylor Cone führt. An der

Spitze der Cone bildet sich bei einem entsprechend großen Feld ein feines Spray. Das Spray

besteht aus kleinen geladenen Tropfen, deren Ladungsdichte durch verdampfendes Lösemittel

stetig steigt. Die Ladung im Inneren des Tropfens wird so lange größer, bis das Raleigh-

Stabilitätslimit erreicht wird und eine Coulomb-Explosion zu Tropfen von wenigen

Nanometer Größe führt. Der abschließende Ionisierungsmechanismus ist noch nicht

vollständig geklärt. Entweder enthalten die Tropfen nur noch ein Ion (Charged residue

mechanism [121]), oder die Ionen werden von kleinen, hoch geladenen Tropfen emittiert (ion

evaporation mechanism [122]).

Die Flussraten in der CEC betragen einige Nanoliter pro Minute, während ESI Quellen einen

Fluss im unteren Mikroliter-Bereich für ein stabiles Spray benötigen. Deshalb wird in der

Quelle ein zusätzlicher Flüssigkeitsstrom zugeführt. Dieser so genannte Sheath Flow muss

leitfähig sein, um den Stromkreis der CEC zu schließen. Weit verbreitet ist ein Design, bei

dem die Sheath Liquid durch eine zweite Röhre, welche die Kapillare umschließt, zugeführt

wird. Die Flüssigkeiten kommen an der Kapillarspitze in Kontakt. Eine dritte konzentrische

Röhre erlaubt das Zubringen eines Gases, wodurch das Verdampfen der Flüssigkeit erleichtert

wird [123, 124].

Einleitung 29

Abb. 1.5: Schematische Übersicht über den ESI-Prozess

Für die CEC Kopplung ist besonders ein ESI-Design geeignet, bei dem die Kapillarspitze der

ESI-Quelle geerdet ist und das Potenzial des Sprays zur Cone aufgebaut wird. Dies

ermöglicht die gleichzeitige Erdung beider Systeme [110]. Der Stromkreis des CEC-Gerätes

ist somit geschlossen und das Potenzial für das Spray vom CEC-Gerät unabhängig. Wie auch

die CF-FAB-Ionisierung ist ESI hauptsächlich zur Ionisierung von polaren Molekülen

geeignet.

Aufgabenstellung und Zielsetzung 30

2 Aufgabenstellung und Zielsetzung

Die CEC stellt eine interessante Ergänzung und Alternative zu den routinemäßig eingesetzten

Trennmethoden der CE und HPLC dar und soll in der Analytischen Chemie der Bergischen

Universität Wuppertal etabliert werden.

Dazu sollen zunächst die klassischen Kapillaren mit partikulärem Material eingesetzt werden.

Um das bekannte Problem der Luftblasenbildung an der Fritte zu reduzieren, wird eine mittels

Lichtbogen verjüngte („getaperte“) Kapillare hergestellt und verwendet. Nach Etablierung der

CEC mit bekannten, kommerziellen stationären Phasen und Trennung von neutralen

Modellsubstanzen, wie polyaromatischen Kohlenwasserstoffe (PAKs), sollen neue

Packungsmaterialien getestet werden. Unter anderem ist geplant, durch Wahl geeigneter

Phasen den EOF umzukehren und die Analyten am anodischen Ende der Kapillare zu

detektieren. Seit kurzem sind auch endcapped Aminphasen kommerziell erhältlich, weshalb in

dieser Arbeit der Einfluss eines Endcappings auf den EOF bei positiv geladenen Phasen

erstmals untersucht werden soll.

Des Weiteren wird ein Vergleich der partikulären Kapillaren mit alternativen Packungsarten

durchgeführt. Dazu werden monolithische Phasen auf Acrylamid- und Silika-Basis eingesetzt

und die Trennleistung anhand von PAKs untersucht. Um diesen Anwendungsbereich und

seine Möglichkeiten umfassend darzustellen, werden auch hochselektive Phasen auf der Basis

von Molecular-Imprinted-Polymers (MIPs) getestet. Hierbei interessiert unter anderem, ob

auch neutrale Verbindungen mit geringen Möglichkeiten zur Wasserstoffbrückenbildung, wie

Nikotin oder Cotinin, mit einer selbst hergestellten Phase getrennt werden können.

Im letzten Teil der Arbeit ist beabsichtigt, die CEC mit der Massenspektrometrie (MS) zu

koppeln, um die Vorteile der MS gegenüber den spektrophotometrischen Detektionsmethoden

auszunutzen. Wegen der geringeren Anfälligkeit zur Luftblasenbildung sollten für die MS-

Kopplung besonders die monolithischen Kapillaren geeignet sein. Zur Kopplung der

Kapillaren soll zunächst ein kommerzielles ESI-Interface eingesetzt werden. Um die Vorteile

der CEC, die besonders zur Trennung neutraler und lipophiler Teilchen geeignet ist, zeigen zu

können, soll die im Arbeitskreis entwickelte HPLC-APLI-Kopplung auf die CEC übertragen

werden. Mit dieser neuen Kopplungstechnik soll die Trennung und selektive Ionisierung einer

PAK-Mischung durchgeführt werden.

.

Ergebnisse und Diskussion 31

3 Ergebnisse und Diskussion Um einer Irritation beim Leser vorzubeugen, ist eine einheitliche Terminologie innerhalb

dieser Arbeit wichtig. Da die Wirkungsweise der Trennungen eine größere Ähnlichkeit mit

der HPLC besitzt, werden deren Begriffe zur Beschreibung von Trennungen verwendet.

3.1 Partikuläre Kapillaren für die CEC

In der CEC werden Kapillaren in den meisten Fällen mit partikulären Phasen, wie sie aus der

HPLC bekannt sind, gepackt [21]. Dies hat den Vorteil, dass man eine große Auswahl an

Phasen besitzt. Endcapped-Phasen sind jedoch nicht oder nur selten geeignet. Es ist auch

möglich die Phasen dem aktuellen Trennproblem anzupassen, jedoch ist eine reproduzierbare

Herstellung sehr kompliziert, und erfordert viel Erfahrung.

3.1.1 Herstellung der Trennkapillare

Zum Packen der Kapillare mit partikulärem Material gibt es eine Vielzahl von Methoden,

[125] von denen zwei in dieser Arbeit Verwendung fanden. Beide Methoden nutzen einen

Druckgradienten, um eine Aufschlämmung des Packungsmaterials (Slurry) in die Kapillare zu

befördern. Der Unterschied besteht darin, wie das Packungsmaterial in der Kapillare

zurückgehalten wird. Methode 1 verwendet gesinterte Fritten, Methode 2 konische

Verjüngungen.

3.1.1.1 Slurry Packung mit gesinterten Fritten Diese Methode wurde in [61] beschrieben und in dieser Arbeit leicht modifiziert, so dass eine

reproduzierbare Packung realisiert werden konnte. Einen schematischen Überblick über die

nachfolgend beschriebene Prozedur liefert Abbildung 3.1:

- Das Packungsmaterial wird mit einem geeignetem organischen Lösemittel (z. B.

Aceton oder MeOH) aufgeschlämmt. Diese Aufschlämmung wird als Slurry

bezeichnet.

- Die Slurry wird in einem Ultraschallbad beschallt, um ein Absetzen zu verhindern und

eventuell vorhandene „Verklumpungen“ zu lösen.

- An einem Ende der zu packenden Kapillare wird eine temporäre Fritte (zum Beispiel

ein Hochdruck-Inline-Filter) und an der anderen Seite eine Füllkammer befestigt. Als

Füllkammer kann z. B. eine kurze HPLC Säule eingesetzt werden (a).

- Nach Füllen der Kammer mit der Slurry werden Kapillare und Kammer in ein

Ultraschallbad gelegt und ein Druck von 600 bar appliziert. Dies muss schnell

Risiko ist die Bugwelle des Erfolges von unbekannt


geschehen, da es sonst zum Absetzen des Packungsmaterials kommt und die Kapillare

verstopft. Durch den Druckgradienten füllt sich die Kapillare mit dem

Packungsmaterial. Als Medium zum Packen der Kapillare wird Wasser verwendet.

- Zur Verbesserung der Packungsdichte wird die Kapillare eine Stunde unter Druck

beschallt. Die Kapillare ist nun komplett mit Packungsmaterial gefüllt.

- Danach werden zwei Fritten hergestellt, eine etwa 10 cm von der temporären Fritte

entfernt (Auslasseite) und eine zweite in einer Entfernung von meist 25 cm von der

Auslassseite. Das Material wird am gewünschten Punkt „gesintert“, indem mit Hilfe

eines Widerstanddrahtes bei angelegtem Druck die Kapillare lokal erhitzt wird (b).

Die gewählten Temperaturen und Zeiten sind vom Packungsmaterial abhängig. Der

Aufbau beim Sintern ist in Abbildung 3.2 gezeigt.

- Nach dem Entspannen wird die Kapillare an eine HPLC-Pumpe angeschlossen, mit

mobiler Phase gespült und die temporäre Fritte entfernt. Das Material, welches sich

zwischen gesinterter Auslassfritte und der temporären Fritte befand, wird dabei

ausgespült (c).

- Durch Entfernen der Polyimidschicht, im nun freien Bereich, wird möglichst nah an

der Fritte auf der Auslassseite ein Detektionsfenster bereitet (d).

Abb. 3.1: Schematische Herstellung von partikulär gepackten CEC-Kapillaren

Füllen der Kapillare für die CEC

Vorsäulemit Slurry

temporäre Fritte

a) b)

gesinterteFritte

c) d)

Fenster


Abb. 3.2: Aufbau zum Packen der Kapillare und Sintern der Fritten

Problematisch bei den so hergestellten Kapillaren ist die Neigung zur Bildung von Luftblasen

an der Auslassfritte [126, 127]. Ein Zusammenbrechen des Stromes macht Messungen

unmöglich, und das Ausspülen der entstandenen Gasblasen ist sehr zeitaufwendig.

Beabsichtigt man, wie in dieser Arbeit, verschieden stationäre Phasen zu verwenden, müssen

für jedes Packungsmaterial neue optimale Bedingungen gefunden werden, um stabile aber

dennoch durchlässige Fritten zu erhalten. Eine alternative Methode stellen die im Folgenden

beschriebenen, konisch zulaufenden Kapillaren (getaperten Kapillaren) dar.

3.1.1.2 Slurry Packung mit Querschnittsverengung und einer Fritte Als Alternative zu den gepackten Kapillaren mit zwei Fritten bieten sich Kapillaren an,

welche keine Fritten oder zumindest keine Auslassfritten besitzen. Eine Möglichkeit, dies zu

erreichen, sind Kapillaren mit einer Querschnittsverengung (internal taper). Sie nutzen den so

genannten „keystone“ Effekt. Durch Verringerung des Kapillardurchmessers auf das zwei- bis

dreifache des Partikeldurchmessers, bei 3 und 5 µm Material auf ~10 µm, verkeilen sich die

Partikel an der gebildeten Engstelle, und eine Fritte ist nicht mehr nötig. In der Literatur sind

Kapillare

Widerstandsdraht

Vorsäule mit Aufschlämmung


zwei Arbeiten beschrieben, die diese Kapillaren verwenden [114, 128]. Zum Verjüngen der

Kapillare wurde ein capillary-puller verwendet, der sonst zur Herstellung von Mikropipetten

oder ESI-Spitzen eingesetzt wird. Dabei wird das Glas an einer Stelle erhitzt und beim

Erhitzen auseinander gezogen, wodurch es zur gewünschten Verjüngung der Kapillare

kommt. Obwohl sich die Parameter der capillary-puller genau und reproduzierbar einstellen

lassen, erfordert die Handhabung des Pullers bei wechselnden Kapillardurchmessern

Erfahrung.

In dieser Arbeit wurde zum Verjüngen der Kapillare ein Lichtbogen eingesetzt. Die Kapillare

wird dazu in ein optisches Spleißgerät eingespannt, und ein Lichtbogen erzeugt. Durch die

hohe Temperatur des Lichtbogens schmilzt die Kapillare an der gewünschten Stelle. Es

kommt zu einer Verjüngung, die durch ein aufgebautes Okular verfolgt werden kann (siehe

Abbildung 3.3). Sobald der angestrebte Durchmesser erreicht ist, wird der Lichtbogen

abgeschaltet, und da die Kapillare sofort wieder erstarrt, kann jeder beliebige Wert zwischen 5

und 50 µm eingestellt werden.

Die in der CEC normalerweise eingesetzten Kapillaren haben einen AD von 360 µm. Und da

beim Spleißen die Polyimidschicht verbrennt, wird hinterher eine Kapillare mit einem

Innendurchmesser größer 360 µm als Bruchschutz an der labilen Stelle übergestülpt und mit

Epoxidharzkleber befestigt.

Abb. 3.3: Abbildung eines optischen Spleissgerätes mit eingespannter Kapillare


Die so vorbereitete Kapillare wird analog zur ersten Methode gepackt, lediglich die

Verwendung der temporären Fritte ist nicht mehr erforderlich. Ohne gesinterte Auslassfritte

ermöglichen diese Kapillaren eine stabile Messung, und die Entstehung von Luftblasen ist

deutlich reduziert. An der Einlassseite muss jedoch eine Fritte gesintert werden, da das

Packungsmaterial aufgrund seiner negativen Oberflächenladung bei angelegter Spannung

sonst aus der Kapillare wandern könnte.

Die Abbildung 3.4 zeigt einen schematischen Vergleich der beiden Kapillaren.

Abb. 3.4: Schematischer Vergleich zwischen verjüngter und klassischer Kapillare, oben: Originalaufnahme einer getaperten Kapillare mit Packungsmaterial links von der

Verjüngung

Vor dem Einsatz in der CEC werden die Kapillaren mit mobiler Phase konditioniert. Dazu

werden sie mehrere Stunden mit Hilfe einer HPLC Pumpe gespült. Um die Luftblasenbildung

während der Messung zu reduzieren, ist eine gute Entgasung der mobilen Phase notwendig.

Entgast wurde im Ultraschallbad, weil beispielsweise Helium die im Puffer vorkommenden

hohen Anteile an organischem Lösemittel (bis 80 % Acetonitril) austreiben würde. Aufgrund

der UV-Undurchlässigkeit der Polyimidschicht, muss diese im letzten Schritt im

Detektionsbereich entfernt werden. Standardmäßig brennt man die Polyimidschicht durch

kurzzeitiges Erhitzen (z.B. mit einem Feuerzeug) weg. Dies ist bei gepackten Kapillaren aber

unmöglich, da das Erhitzen zum Zusammenschmelzen des Packungsmaterials führen würde.

Um das zu verhindern, kann die Polyimidschicht auch mit einem Skalpell freigekratzt werden,

wobei jedoch die Bruchgefahr sehr groß ist. Deshalb wurde das Detektionsfenster während

des Spülvorgangs mit heißer, 98 %iger H2SO4 in die Polyimidschicht geätzt. Dabei wird ein

Tropfen konzentrierter Schwefelsäure auf die Spitze eines 250 °C heißen Lötkolbens

positioniert. Die heiße Schwefelsäure ätzt bei Kontakt sofort die Polyimidschicht weg. Dies

gesinterte Fritte Detektionsfenster


hat den Vorteil, dass sich die nahe liegende Packung nicht erhitzt und zusammenschmilzt. Die

so vorbereiteten Kapillaren sind für die CEC einsatzbereit.

3.1.2 Einsatz von Kapillaren mit gesinterter Fritte gegenüber konischer Verjüngung an der Auslassseite

Um die Leistungsfähigkeit der beiden Designs zu vergleichen, wurden Messungen mit

polyaromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) durchgeführt. Während sich die

Frittentechniken unterschieden, wurden die restlichen Parameter konstant gehalten, um eine

gute Vergleichbarkeit zu erzielen.

Kapillare 1 wurde nach Methode 1 (siehe Kapitel 3.1.1) gepackt. Als Packungsmaterial wurde

ODS 1 (5 µm) von Waters mit Aceton aufgeschlämmt und durch Anlegen von Druck in die

Kapillare befördert. Die gefüllte Kapillare wurde für 60 Minuten beschallt, um dann für 10

Sekunden bei 450 °C die Fritten in einem Abstand von 25 cm zu brennen. Die Kapillare hatte

eine Gesamtlänge von 35 cm und einen Innendurchmesser von 75µm. Nach dem Entfernen

der temporären Fritte wurde die Kapillare bei 100 bar Druck über Nacht mit der mobilen

Phase gespült. Als mobile Phase diente eine Mischung aus 80 % Acetonitril und 20 % 5 mM

Tris-Puffer, pH 7,5.

Das eingesetzte ODS 1-Material hatte lipophile Eigenschaften durch C18-Gruppen und war

nicht endcapped. Als EOF Marker diente Thioharnstoff. Injiziert wurde eine Mischung aus

Thioharnstoff (1), Naphthalin (2), Fluoren (3), Phenanthren (4), Fluoranthen (5) und Pyren (6)

Die Konzentrationen der PAK betrugen cirka 1mM (je 0,2 g/l). Die Injektion erfolgte

elektrokinetisch bei 5 kV für 3 Sekunden. Zur Trennung wurden 20 kV angelegt (Abb. 3.5)

und die PAKs bei 214 nm mittels eines Dioden-Array-Detektors (DAD) nachgewiesen.

Die Zuordnung der Rohdaten zu den entsprechenden Messungen kann in dieser Arbeit immer

durch die achtstellige Zahl unten links im Chromatogramm erfolgen.

Das Chromatogramm in Abbildung 3.5 zeigt, dass das Packungsmaterial eine gute Trennung

der Aromaten ermöglicht. Auch die wesentlich größere Leistungsfähigkeit gegenüber der

HPLC wird anhand der Basislinientrennung in nur 8 Minuten deutlich. Die Trennung basiert,

genauso wie in der HPLC, auf lipophilen Wechselwirkungen zwischen den C18-Gruppen der

stationären Phase und den Analyten, jedoch führt das stempelförmige Flussprofil zu einer

deutlich besseren Effizienz. Um eine Luftblasenbildung und somit einen Zusammenbruch des

Stroms zu verhindern, war es wichtig, sowohl Einlass- als auch das Auslassgefäß mit einem

externen Druck von 10 bar zu belegen.


0 2 4 6 8 10 12Retentionszeit [min]

rela

tive

Abs

orpt

ion

Abb. 3.5: Trennung einer PAK-Mischung auf einer Kapillare mit zwei gesinterten Fritten (5µm ODS 1)

Diese Messung wurde dann zum vergleich mit einer getaperten Kapillare wiederholt. Die

Packung des ODS 1-Materials erfolgte nach dem oben beschriebenen Schema. Nach

Beschallung wurde in 25 cm Entfernung von der Verjüngung eine Fritte gebrannt (450°C für

10 Sekunden) und die Kapillare oberhalb der Fritte abgeschnitten.

Die Messung wurde sonst unter identischen Bedingungen durchgeführt und das

Chromatogramm ist in Abbildung 3.6 gezeigt.

Den Abbildungen 3.5 und 3.6 ist zu entnehmen, dass die Trennleistung der beiden Kapillaren

nahezu gleich ist. Die Herstellung von druckstabilen Fritten nach Methode 1 erforderte viele

Versuche, während das Einfügen der Engstelle nach Methode 2 nur eine Minute dauerte. Bei

Arbeiten mit verschiedenen Phasenmaterialien ist das ein wichtiger Vorteil. Dem in der

Literatur beschriebenen Fazit, dass diese „Fritten“ weniger zur Bildung von Luftblasen

neigen, kann zugestimmt werden. Die Kapillaren waren ohne Auslassfritte stabiler, aber auch

hier ist im Dauerbetrieb das Anlegen von einem externen Druck vorteilhaft. Ein weiterer

Vorteil der getaperten Kapillaren liegt darin, dass das Phasenmaterial nicht durch die

Frittenbildung verändert wird. Dadurch können keine aktiven Silanolgruppen entstehen,

welche die Trennleistung herabsetzen [129]. Des Weiteren kann ein beliebiges Phasenmaterial

(zum Beispiel Polymere) verwendet werden, da anders als beim Sintern von Fritten keine

Silanolgruppen benötigt werden.

1

2

3 4 5

6

05100403



rela

tive

Abs

orpt

ion

Abb. 3.6: Trennung einer PAK-Mischung auf einer getaperten Kapillare (5µm ODS 1)

Um die Leistungsfähigkeit der CEC mit partikulär gepackten Kapillaren zu zeigen, wurde

eine Kapillare mit 3 µm Packungsmaterial (ODS 1) nach Methode 2 gefertigt und die gleiche

PAK-Mischung erneut analysiert. Die Injektion erfolgte wieder elektrokinetisch bei 5 kV für

3 Sekunden. Es wurde der gleiche Elektrolyt eingesetzt, allerdings erfolgte die Trennung bei

einer Spannung von 30 kV. Das erhaltene Chromatogramm ist in Abbildung 3.7 dargestellt.

Durch die höhere Spannung wurde die Analysezeit reduziert und aufgrund der kleineren

Partikelgrößen wurden höhere Bodenzahlen erreicht. Die Trennung der PAKs dauerte weniger

als sechs Minuten. Aufgrund der Luftblasenbildung konnten bei Verwendung von Kapillaren

mit zwei gesinterten Fritten bei 30 kV Trennspannung keine Ergebnisse erzielt werden.

Die durchgeführten Messungen haben ergeben, dass das verwendete Phasenmaterial, die

Packungsmethode und die konischen „Fritten“ sich in der CEC von PAKs bewährt haben. An

diesem Beispiel wird außerdem die Leistungsfähigkeit der CEC für lipophile, ungeladene

Substanzen deutlich.

1

2

3 4 5

6

05050411



rela

tive

Abs

orpt

ion

Abb. 3.7.: Trennung einer PAK-Mischung auf einer getaperten Kapillare (3 µm ODS 1)

Eine Übersicht über die erreichten Bodenzahlen pro m ist Tabelle 3.1 zu entnehmen.

CEC-Kapillare mit

gesinterten Fritten

CEC-Kapillare mit konischer

Verjüngung (getapert)

Substanz 5 µm ODS 1

20kV

Bodenzahl . m-1

5 µm ODS 1

20kV

Bodenzahl . m-1

3 µm ODS 1

30kV

Bodenzahl . m-1

Thioharnstoff 6,7 · 104 8,2 · 104 8,5 · 104

Naphtalin 1,2 · 105 1,2 · 105 1,5 · 105

Fluoren 9,0 · 104 9,8 · 104 1,8 · 105

Phenanthren 7,8 · 104 1,1 · 105 1,5 · 105

Fluoranthen 8,0 · 104 8,0 · 104 9,2 · 104

Pyren 5,3 · 104 7,1 · 104 7,0 · 104

Tabelle 3.1: Bodenzahlen in der CEC mit partikulärem Material

3.1.3 Einsatz weiterer partikulärer Phasenmaterialien

Im Theorieteil wurde bereits ausführlich auf die pH-Abhängigkeit des EOF eingegangen

(siehe dazu Kapitel 1.2.1). Bei niedrigen pH-Werten nimmt der EOF sehr stark ab. Für

Analyten mit einer Carboxylgruppe ist die CEC-Analyse oftmals schwierig, wenn die

elektrophoretische Mobilität der Carboxylationen in Richtung Anode größer ist als der

1

2

3 4 5

6

05120406


kathodisch gerichtete EOF und die Analyten somit nicht detektiert werden können. Eine

Lösung dieses Problems könnte darin bestehen, den pH-Wert des Elektrolyten so weit zu

verringern, dass die Carboxylfunktion der Analyten undissoziiert vorliegt. Bei Silikaphasen

führt dies aufgrund der dann ebenfalls stark ansteigenden Anzahl undissoziierter

Silanolgruppen zu so geringen EOF-Werten, dass die Analysenzeit extrem verlängert würde.

Deshalb ist es günstiger die Richtung des EOF durch positiv geladene Packungsmaterialien

umzukehren.

3.1.3.1 Trennung einer Testmischung an einer endcapped-Aminphase In dieser Arbeit wurde erstmals eine endcapped-Aminphase (e-NH2) eingesetzt. Die

Funktionalität der Phase basiert auf einer Propylamingruppe, die in einem großen pH-Bereich

über eine positive Ladung verfügt. Die in der Literatur bisher eingesetzten Phasen waren nicht

endcapped, weshalb die freien Silanolgruppen einer effektiven EOF-Umkehr

entgegenwirkten. Bei endcapped-Phasen können dagegen keine Silanolgruppen stören, und es

bildet sich ein anodisch gerichteter EOF über einen großen pH-Bereich aus. Die

Trenneigenschaften dieser Phase wurden mit einer Testmischung der in Tabelle 3.2

aufgelisteten Substanzen mit unterschiedlichen pKs-Werten untersucht.

Tabelle 3.2: Testmischung zur Charakterisierung einer endcapped-Aminphase

Um den Trennmechanismus zu untersuchen, wurden der pH-Wert, der organische Anteil und

die Ionenstärke des Elektrolyten systematisch verändert.

Eine getaperte Kapillare (25 cm gepackte Länge, 35 cm Gesamtlänge, Innendurchmesser

75 µm) wurde mit der e-NH2 Phase gepackt. Als Slurry wurden 15 mg einer 5 µm e-NH2

COOH

O2N

O2N

4,2Naproxen9

2,23,5 Dinitrobenzoesäure8

~ 9,9p - Hydroxyphenylessigsäuremethylester7

pKsStrukturNameSubstanz

OH CH2 C

O

O CH3

O

C

CH3

O-

O

Na+

H3C

COOH

O2N

O2N

4,2Naproxen9

2,23,5 Dinitrobenzoesäure8

~ 9,9p - Hydroxyphenylessigsäuremethylester7

pKsStrukturNameSubstanz

OH CH2 C

O

O CH3

O

C

CH3

O-

O

Na+

H3C


Phase in 300 µL Aceton eingesetzt. Bei allen Versuchen in diesem Kapitel erfolgte die

Injektion des Testgemisches elektrokinetisch bei –5 kV für 3 Sekunden, die Trennspannung

betrug –10 kV. Die Konzentrationen betrugen 6,0 mM für 7, 4,7mM für 8 und 4,0mM für 9.

Einfluss des pH-Wertes

Zur Trennung wurde ein Elektrolyt bestehend aus 50 % Acetonitril und 50 % 10 mM

Phosphatpuffer bei verschiedenen pH-Werten eingesetzt (Abb. 3.8). Die anodische Detektion

erfolgte mit einem DAD, wodurch die Zuordnung der Substanzen anhand ihrer

Absorptionsspektren ermöglicht wurde.

Retentionszeit [min]

0 5 10 15 20 25

08220302

rela

tive

Abs

orpt

ion

pH 8,0

pH 4,6

pH 2,2

08260301

11030300

08210303

7

9

8

7

9

8

8

9

Abb. 3.8: Trennung des Testgemisches bei unterschiedlichen pH-Werten

7 = p-Hydroxyphenylessigsäuremethylester, 8 = 3,5-Dinitrobenzoesäure, 9 = Naproxen

pH 2,2

Fast zur gleichen Zeit werden die bei diesem pH-Wert neutralen Substanzen 7 und 9 eluiert,

gefolgt von der zu 50 % negativ geladenen 3,5-Dinitrobenzoesäure (8). Die Trennung der


beiden neutralen, durch den EOF transportierten Substanzen erklärt sich durch lipophile

Wechselwirkungen mit dem Propylrest der Aminphase. Die negativ geladene Substanz 8

müsste theoretisch vor den neutralen Substanzen detektiert werden, da sich die

Wanderungsgeschwindigkeit aus der vektoriellen Addition des EOF und der eigenen

elektrophoretischen Migration ergibt. Da dies nicht der Fall ist, lässt dies auf eine starke

ionische Wechselwirkung zwischen dem Benzoat-Anion und der positiven Aminphase

schließen. Diese Wechselwirkung ist stärker als die lipophile Wechselwirkung des Naproxen

und des p-Hydroxyphenylessigsäuremethylesters, weshalb 8 als letzte Substanz eluiert wird.

Demnach sind bei dieser Phase sowohl schwache lipophile als auch starke ionische

Wechselwirkungen (bei Anionen) von Bedeutung.

pH 4,6

Bei diesem pH-Wert ist die 3,5-Dinitrobenzoesäure vollständig, das Naproxen zu mehr als

50 % deprotoniert und der p-Hydroxyphenylessigsäuremethylester liegt weiterhin neutral vor.

Die Elutionsreihenfolge p-H

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Einsatz partikulärer und monolithischer Kapillaren in der ...elpub.bib.uni-wuppertal.de/servlets/DerivateServlet/Derivate-867/dc0516.pdf · Einsatz partikulärer und monolithischer