4. Analyse yon biologisehem Material 317

Elektrometrische Methode zur Bestimmung der Cholinesterase (CE)-Aktivi- t~it (A) mit automatischer Registrierung. V. L ROZE~G~T, V. G. SM~nEvi und I. G. S~.RBiK [1]. Es wird erstrebt, den Anwendungsbereich der e]ektrometrisehen CE-A-Bestimmung den verschiedensten Bedingungen gemg6 zu erweitern, wobei das pH yon der Zeit immer linear abhgngig sein sell. Die selbstregistrierende Methode wird zura Studium der Reaktionskinetik und des Einflusses verschiedener Inhibitoren (I) auf CE herangezogen. -- Arbeitsweise. Die OE-Reaktion wird in einer Kfivette ausgef'dhrt, die mit Ultrathermostat TC-15 auf 25~ gehalten wird. Man bereitet das Bebriitungsgemiseh (BG) aus den erforderliehen Mengen physio- logiseher L6sung, PufferlSsung, Enzym und Aeetyleholin-hydroehlorid (AC-HC1)- L5sung, leitet die Reaktion dureh Zusatz yon Substrat oder Enzym ein, registriert die Dynamik der zeitliehen pH-fs mit Glaselektrode und pH-Meter LPU-01 laufend auf dem Papierstreifen eines EPP-09M3-Sehreibapparats. Der Tangens des ~Neigungswinkels des linearen Kurvenbeginns gegen die Zeitachse dient als MaB der Enzymreaktionsgesehwindigkeit. Dureh Aufzeichnung der pH- Dynamik im BG ohne Enzym miBt man die Gesehwindigkeit der spontanen AC- Hydrolyse. Empfindliehkeit: Eine pH-~uderung um 0,i E bewirkt einen Auf- zeichnungsaussehlag yon 11,6 ram. -- Ergebnlsse. 1. Brauchbarlceit verschiedener Pu]]ersysteme. Tris-Puffer ~ a) Salz- oder b) Essigsiure ist das vorteilhafteste, da die Kurve der CE-l~eaktion (a) zwisehen pH 8,15 und 7,25 bzw. (b) bei loll 8,30--7,35 linear verl~uft. Die Puffereharakteristik yon BG h~ngt nieht nur veto Puffer allein, sondern aueh yon den Komponenten der biologischen CE-Quelle ab. AuBerdem haben Tris-Puffersysteme den Vorzug vor Medinal-Phosphatpuffer, dab sie dem Zusatz soleher Kationen zu BG nieht im Wege stehen, die durch Phosphat gef~llt werden wiirden. Tris -~ Salz- oder Essigs~ure gestattet ferner, die Endkonzentration des Puffers -- demnach aueh die Pufferkapazit~t yon BG -- in recht weiten Grenzen zu variieren. Hierbei bleibt die pH-_~derung wihrend der CE-Reaktion lang genug linear. Am vielseitigsten geeignet sind a) Tris-Salz- s~iure, 2.10 -3 bis 1.10-eM (pH8,1) und b) Tris-Essigs~iure, 2.10 -a bis 1.10-2M (pH 8,1). Eicbkurven zeigen, dab die Abh~ngigkeit des pH-Wertes yon der zu- gesetzten Essigs~uremenge in reeht weiten Grenzen linear ist. Solche Eiehkurven werden immer benutzt, wenn A in Standardeinheiten auszudriieken ist. -- 2. Ein- ]lu[3 der Enzymkonzentration au/ die CE-Reaktlonsgeschugndigkeit. Als CE-Quellen dienen Pferdeserum, gereinigte Serum-CE und Rattenhirn-Homogenat. Die Hydro- lysegeschwindigkeit yon AC w~ehst linear bei 5--8facher ErhShung der Enzym- konzentration. -- 3. Ein/lufl der Substratkonzentration. Die elektrometrische Methode erlaubt, die Reaktionsgesehwindigkeit schon zu Beginn der Reaktion festzustellen. Die CE-A l~6t sieh in sehr weitem Konzentrationsbereich des Sub- strats verfolgen. Km ist fiir gereinigte Serum-CE 1,5.10 -a M. -- d. Bestimmung der GeschwindigkeitsIronstante der CE-Hemmung unter dem Ein]lufl irreversibler I. Als letztere dienen die O-~thyl-S-alkylmethylthiophosphate LG-56 und LG-63. -- Aus/i~hrung. CE wird mit verschiedenen I-Konzentrationen neben Tris-HC1-Puffer bei 25~ bebrfitet. Naeh bestimmC~n Intervallen werden BG-Proben in eine ~mperaturkonstante Kfivette gebraeht, in die man vorher die Elektroden des pH-Meters eingetaueht sowie physiologische LSsung und AC-LSsung eingefiillt hat. Man rfihrt, registriert die Dyaamik der pH-~nderungen und bewertet die CE-A in jeder Probe naeh dem Tangens des Neigtmgswinkels der Geraden gegen die Zeitachse. Die resultierende bimolekulare Geschwindigkeitskonstante der CE-

2,303 A 0 Hemmung ist K s -- t [I] " lg ~ (A0, At ~ CE-A ohne I bzw. t rain naeh Be-

ginn der Bebl~itung mit I; [I] Konzentration yon I). -- Es zeigt sieh, dab die Absolutwerte der Gesehwindigkeitskonstanten der Hemmung yon gereinigter

318 Bericht: Spezielle analytische Methoden

Serum-CE mit den Literaturwerten zusammenfallen. (Tabellen trod Diagramme im Original.) 1. Bioehimija (Mosk.) 81, 1111--1116 (1966) [Russisch]. (Mit engl. Zus.fass.)

Lehrst. f. Bioehem. d. L Med. Inst. ,,L P. Parlor", Leningrad (UdSSR). P. HAAs

Die Bestimmung der Konzentration yon hydrolytischen Enzymliisungen: ~-Chymotrypsin, Trypsin, Papain, Elastase, Subtilisin und Aeetyleholin- esterase. ~ . L. B ~ ] ) ~ undMitarb. [1]. Enzymkonzentrationen ]assert sich all- gemein durch die Bestimmung der Katalysegeschwindigkeiten ermitteln, dureh Titrations~nalysen lassen s~ch aui3erdem Aussagen fiber die chemische Konstitution und fiber stSehiometrisehe ehemisehe Reaktionen sowie fiber aktive Stellen im Enzym ableiten. In dieser ausffihrliehen ])bersiehtsarbeit werden die einfaehen und genauen Methoden ffir die direkte Bestimmung der aktiven H~ftstellen durch Titration aufgeffihrt. AuBerdem werden die Reaktionsmechanismen kinetisch ab- gehandelt. Als spezifische Substrate eiguen sieh besonders gut ffir Trypsin p-Nitro- phenyl-N2-benzyloxycarbonyl-L-Lysinat, ffir Papain p-/qitrophenyl-N-benzyloxy- earbonyl-T.-tyrosinat, ffir Subtilisin 1N-Trans-Cinnamoylimidazol, ffir Elastase das weniger spezifisehe Substrat Di~thyl-p-nitrophenylphosphat und fiir die Aeetyl- cholinesterase o-Nitrophenyldimethylcarbamidat. Kinetisch werden die Einflfisse yon Verunreinigungen, die immer noch bei dem am besten zu erhaltenden Enzym wie ~-Chymotrypsin zwischen 20--30~ abgeleitet und diskutiert. Die StSchio- metrie der Reaktion wird dutch Hemmstoffe der Organophosphate abgeleitet. Ins- gesamt sind !12 Literaturste]len angegeben. 1. J. Amer. Chem. Soe. 88, 5890--5913 (1966). Div. Biochem., Dept. Chem.;

Northwestern Univ., Evaston, Ill. (USA). U. GER~a~D~

Elektrophorese yon Glucose-6-phosphatdehydrogenase: Eine neue Teehnik. !V~. C. ~ATTAZZI, L. :F. BER:[~bTI, G. I~IOREL~I und P. M. MA~vccI [1]. Zur elektro- phoretischen Trennung eignet sich Celluloseacetat in Gelform (Ce]logel). Als Puffer- 15sung werden 1 1 0,075 M Trispuffer, der 0,004 Mol J~DTA enthi~lt, mit 250 ml 0,075 ~ Citronensi~urel5sung vermiseht, so dab ein pi t yon 7,5 vorliegt. Die Cello- ge]streifen werden in 50~ Methanol aufbewahrt und vor Gebraueh mit der PufferlSsung ges~ttigt. Die Streifen mfissen dann frei yon Methanol sein. 1,5 ~l H~molysat werden am kathodischen Tell des Streffens aufgetragen und die Auf- trennung innerhalb yon 3 h bei 4 mA pro Streffen und bei 190 V durchgeffihrt. Kurz vor Beendigung der Auftrennung wird die Entwiekleriliissigkeit angesetzt, die aus 1,25 ml 1 M Tris-Salzs~urepuffer yore pH 8,6, 0,1 ml TPN (10 mg/ml), 0,15 ml G6P (25 mg/ml), 0,25 ml MTT-Tetrazolium (2 mg/ml), 0,25 ml Phenazin- methosulfat (2 mg/ml) und 0,10 ml Kobaltchlorid (0,5 M) besteht. Diese 2,1 ml reichen ffir 5 Streifen aus, wobei die Streffen 5 see in diese LSsung getaucht werden. Bei 37~ wird 20 rain inkubiert, dabei treten blaue Banden auf. Die Reaktion wird dann durch 10~ FormaldehydiSsung abgebroehen. Mit dieser )~ethode konnten die Isoenzyme yon G6PD gut aufgetrennt werden. 1. Nature 218, 79 -- 80 (1967). Dept. Human Genetics, Umv. Leiden (Niederlande).

U. G ~ R D ~

Elektrophoretische Methode zur quantitafiven Bestimmung der Isofermente der Laetatdehydrogenase auf Agar. Ju. A. JV~KOV ~md V.V. ALA~CEV [1]. -- Arbeitsweise. Der Agar wird auf 0bjekttr~ger (26• ram) in dfinner Schicht (2 ram) aufgetragen, 15 rain auf 4~ gekiihlt und 0,005 m] Serum werden in eine kieine Spalte aufgetragen. Die Lofermente werden in 2 h bei 50 V und 40--45 mA unter Verwendung eines Medinal/Veronal-Puffers, pH 8,6 (10,3 g •edinal, 1,84 g