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Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur anti-retroviralen Vakzinierung im Friend-Virus-Modell Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften an der Fakultät für Chemie und Biochemie der Ruhr-Universität Bochum angefertigt in der Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie Arbeitsgruppe PD Dr. med. Oliver Wildner vorgelegt von Diplom-Biochemikerin Wibke Bayer aus Hagen Bochum, Dezember 2007

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Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur anti-retroviralen Vakzinierung im

Friend-Virus-Modell

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

an der Fakultät für Chemie und Biochemie

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt in der

Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie

Arbeitsgruppe PD Dr. med. Oliver Wildner

vorgelegt von

Diplom-Biochemikerin Wibke Bayer

aus Hagen

Bochum, Dezember 2007

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I

Success consists of going from failure to failure without loss of enthusiasm.

Winston Churchill

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Abkürzungsverzeichnis

II

Abkürzungsverzeichnis

Ad5 Adenovirus Typ 5 AdV Adenovirus AEC Aminoethylcarbazol AIDS Aquired Immunodeficiency Syndrome APC Allophycocyanin

BAC bacterial artificial chromosome BSA bovines Serum-Albumin

CAR Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor CFSE Carboxyfluoresceinsuccinimidylester CMV Cytomegalovirus CpG-ODN CpG-Sequenz enthaltendes Oligodeoxynukleotid CTL cytotoxische T-Lymphozyten

DC Dendritische Zelle DNA Desoxyribonukleinsäure d p.i. Tage nach Belastungsinfektion

Env envelope

FCS fetales Kälberserum FITC Fluoresceinisothiocyanat FFU focus forming units F-MuLV Friend Murine Leukemia Virus FV Friend Virus

Gag group antigen GM-CSF Granulozyten-Macrophagen Kolonie-stimulierender Faktor gp Glykoprotein

HAART Hoch-aktive anti-retrovirale Therapie HBsAg Hepatitis B-Virus Oberflächenantigen HIV Humanes Immundefizienzvirus HPV Humanes Papilloma-Virus HRP Horseraddish-Peroxidase HSV Herpes simplex-Virus HTLV Humanes T-Zell-Leukämie-Virus

i.d. intradermal i.m. intramuskulär i.p. intraperitoneal i.v. intravenös IC infektiöse Zentren ICP intrazelluläres Protein IL Interleukin

kb Kilobasen

MHC major histocompatibility complex MVA Modifiziertes Vakzinia-Virus Ankara MV Masernvirus

OD optische Dichte

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Abkürzungsverzeichnis

III

PCR Polymerase-Kettenreaktion PE Phycoerythrin p.i. nach Infektion poly(I:C) Polyriboinosin-Polyribocytidinsäure

RNA Ribonukleinsäure RPE Rhodamin-Phycoerythrin RSV Respiratorisches Syncytialvirus RT Raumtemperatur

SFFU spleen focus forming units SFFV Spleen Focus Forming Virus SIV Affen-Immundefizienzvirus (simian immunodeficiency virus)

TAP transporter associated with antigen processing TLR Toll-like-Rezeptor TM Transmembrandomäne Treg regulatorische T-Zelle

vp virale Partikel

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Inhaltsverzeichnis

IV

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis II

Abbildungsverzeichnis VII

Tabellenverzeichnis VIII

1. Einleitung 1

1.1 Retroviren......................................................................................................................... 1 1.1.1 Humanes Immundefizienz-Virus .............................................................................. 1 1.1.2 Friend-Virus .............................................................................................................. 6

1.2 Adenovirale Vektoren ...................................................................................................... 7 1.3 Herpesvirale Vektoren.................................................................................................... 10 1.4 Immunisierungsstrategien .............................................................................................. 12

2. Zielsetzung 15

3. Material und Methoden 17

3.1 Material .......................................................................................................................... 17 3.1.1 Geräte ...................................................................................................................... 17 3.1.2 Verbrauchsmaterialien ............................................................................................ 18 3.1.3 Chemikalien ............................................................................................................ 18 3.1.4 Enzyme.................................................................................................................... 20 3.1.5 Reagenzsysteme ...................................................................................................... 21 3.1.6 Puffer und Lösungen ............................................................................................... 21 3.1.7 Medien..................................................................................................................... 23

3.1.7.1 Medien für die Kultur eukaryontischer Zellen................................................. 23 3.1.7.2 Medien für die Bakterienkultur ........................................................................ 24

3.1.8 Plasmide .................................................................................................................. 24 3.1.9 Oligonukleotide....................................................................................................... 26 3.1.10 Standards ............................................................................................................... 28 3.1.11 Peptide................................................................................................................... 28 3.1.12 Antikörper und Tetramere..................................................................................... 28 3.1.13 Bakterien ............................................................................................................... 29 3.1.14 Zelllinien ............................................................................................................... 29 3.1.15 Viren...................................................................................................................... 30 3.1.16 Versuchstiere......................................................................................................... 30

3.2 Methoden........................................................................................................................ 30 3.2.1 Molekularbiologische Arbeitsmethoden ................................................................. 30

3.2.1.1 PCR .................................................................................................................. 30 3.2.1.2 Agarose-Gelelektrophorese von DNA ............................................................. 31 3.2.1.3 Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen ...................................................... 31 3.2.1.4 TA-Klonierung ................................................................................................. 31 3.2.1.4.1 Anhängen eines überhängenden Adenosin ................................................... 31 3.2.1.4.2 TA-Klonierung .............................................................................................. 31 3.2.1.5 Ligation von DNA-Fragmenten ....................................................................... 31 3.2.1.6 Transformation von Bakterien ......................................................................... 31 3.2.1.6.1 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien............................................... 31 3.2.1.6.2 Transformation chemisch kompetenter Bakterien ........................................ 32 3.2.1.6.3 Herstellung elektrokompetenter Bakterien.................................................... 32 3.2.1.6.4 Transformation elektrokompetenter Bakterien ............................................. 32

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Inhaltsverzeichnis

V

3.2.1.7 Plasmid-Isolation im analytischen Maßstab (Mini-Prep)................................. 32 3.2.1.8 Plasmid-Isolation im präparativen Maßstab (Maxi-Prep) ................................ 33 3.2.1.9 Restriktion ........................................................................................................ 33 3.2.1.10 DNA-Fällung.................................................................................................. 33 3.2.1.11 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) von Proteinen.................... 33 3.2.1.12 Western Blot................................................................................................... 34

3.2.2 Zytologische Methoden........................................................................................... 34 3.2.2.1 Kultivierung von Zelllinien.............................................................................. 34 3.2.2.2 Zellen einfrieren und auftauen ......................................................................... 35 3.2.2.3 DNA-Transfektion von Zellen mittels Calcium-Phosphat-Methode ............... 35 3.2.2.4 DNA-Transfektion von Zellen mittels Lipofektion ......................................... 35 3.2.2.5 Luciferase-Assay.............................................................................................. 35 3.2.2.6 Virus-Aufreinigung .......................................................................................... 35 3.2.2.6.1 Aufreinigung von Adenoviren ...................................................................... 35 3.2.2.6.2 Aufreinigung von Herpesviren...................................................................... 36 3.2.2.7 Titerbestimmung .............................................................................................. 36 3.2.2.7.1 TCID50........................................................................................................... 36 3.2.2.7.2 Titerbestimmung über optische Dichte ......................................................... 36

3.2.3 Immunologische Methoden..................................................................................... 37 3.2.3.1 Vakzinierungen ................................................................................................ 37 3.2.3.2 Belastungsinfektion.......................................................................................... 37 3.2.3.3 Palpation der Milz ............................................................................................ 37 3.2.3.4 Blutentnahme ................................................................................................... 37 3.2.3.5 Bestimmung der Viruslast ................................................................................ 38 3.2.3.5.1 Bestimmung der Plasma-Virämie ................................................................. 38 3.2.3.5.2 Immuncytochemische Bestimmung der Viruslast in der Milz im infectious center- (IC-) Assay....................................................................................................... 38 3.2.3.5.3 Bestimmung der Viruslast in der Milz durch quantitative PCR.................... 39 3.2.3.6 Bestimmung der humoralen Immunantwort .................................................... 39 3.2.3.6.1 Bindende Antikörper ..................................................................................... 39 3.2.3.6.2 Neutralisierende Antikörper .......................................................................... 40 3.2.3.7 Bestimmung der zellulären Immunantwort...................................................... 40 3.2.3.7.1 Tetramerfärbung............................................................................................ 40 3.2.3.7.2 Proliferationstest............................................................................................ 41

4. Ergebnisse 42

4.1 Herstellung der Impfvektoren ........................................................................................ 42 4.1.1 Herstellung der adenoviralen Impfvektoren............................................................ 42 4.1.2 Herstellung der herpesviralen Impfvektoren........................................................... 47

4.2 Impfungen mit Env- und Gag-kodierenden adenoviralen Vektoren .............................. 49 4.2.1 Ermittlung der geeigneten Route der Vektor-Applikation...................................... 49 4.2.2 Einfluss von Zytokin-Koexpression auf den Impferfolg......................................... 49 4.2.3 Vergleich homologer und heterologer Impfstrategien ............................................ 51

4.2.3.1 Bestimmung der Immunprotektion durch homologe und heterologe Vakzinierungen ............................................................................................................ 51 4.2.3.2 Charakterisierung der Immunantwort auf homologe und heterologe adenovirale Vakzinierungen ............................................................................................................ 54

4.2.4 Einfluss der Vorbehandlung des zu injizierenden Muskels mit Cardiotoxin auf den Impferfolg......................................................................................................................... 57 4.2.5 Einfluss der Koexpression von viralen fusogenen Membranproteinen auf den Impferfolg......................................................................................................................... 58

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Inhaltsverzeichnis

VI

4.2.6 Einfluss der Koapplikation von TLR-Liganden auf den Impferfolg....................... 59 4.2.7 Beurteilung von Env-Fusionsproteinen für die Vakzinierung ................................ 60

4.3 Impfungen mit Env- und Gag-kodierenden Herpes simplex-Viren ............................... 62 4.3.1 Vergleich replikations-kompetenter und –defekter HSV-Vektoren........................ 62 4.3.2 Vergleich des Immunschutzes nach Vakzinierung mit replikations-defekten HSV-Vektoren und mit replikations-kompetenten HSV-Vektoren unter gleichzeitiger Aciclovir-Behandlung ...................................................................................................... 64

5. Diskussion 66

6. Zusammenfassung 73

7. Referenzen 74

8. Dissertationsbezogene bibliografische Daten 89

Publikationen................................................................................................................ 89 Präsentationen .............................................................................................................. 90

9. Lebenslauf 91

10. Danksagung 92

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Abbildungsverzeichnis

VII

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1.1 Weltweite Verbreitung der HIV-Infektion 2006 ..................................................... 2

Abb. 1.2 HIV-Genom............................................................................................................. 3

Abb. 1.3 Genomaufbau von F-MuLV und SFFV .................................................................. 6

Abb. 1.4 Splenomegalie nach FV-Infektion........................................................................... 6

Abb. 1.5 Schematischer Aufbau des Genoms des humanen Ad5 .......................................... 8

Abb. 1.6 Struktur des AdV-Virion ......................................................................................... 8

Abb. 1.7 Bindung von Ad5 an Zielzelle................................................................................. 9

Abb. 1.8 Genom von HSV-1................................................................................................ 11

Abb. 3.1 Immunisierungsschema ......................................................................................... 37

Abb. 3.2 MHC I- und -II-Tetramere .................................................................................... 40

Abb. 4.1 AdEasy-System ..................................................................................................... 42

Abb. 4.2 Env- und Gag-kodierende AdV............................................................................. 43

Abb. 4.3 Zytokin-kodierende AdV ...................................................................................... 44

Abb. 4.4 Env-Fusionsprotein-kodierende AdV.................................................................... 46

Abb. 4.5 HSVQuik-System.................................................................................................. 47

Abb. 4.6 Herpesvirale Impfvektoren.................................................................................... 48

Abb. 4.7 Ermittlung der geeigneten Route der Vektor-Applikation .................................... 49

Abb. 4.8 Einfluss von Zytokin-Koexpression auf den Impferfolg in C57BL/6-Mäusen..... 50

Abb. 4.9 Einfluss von Zytokin-Koexpression auf den Impferfolg in CB6F1-Mäusen ........ 50

Abb. 4.10 Vergleich homologer und heterologer Prime-Boost-Vakzinierungen von

C57BL/6- und CB6F1-Mäusen .................................................................................... 52

Abb. 4.11 Einfluss der Vakzinierung auf den FV-induzierten Krankheitsverlauf............... 53

Abb. 4.12 Einfluss der Vakzinierung auf die späte Phase der Infektion.............................. 54

Abb. 4.13 Nachweis FV-spezifischer CD4+ und CD8+ T-Zellen im Proliferationstest ....... 55

Abb. 4.14 nachweis Epitop-spezifischer CD4+ T-Zellen durch MHC II-Tetramerfärbung. 55

Abb. 4.15 Nachweis bindender und neutralisierenderAntikörper........................................ 56

Abb. 4.16 Einfluss der Vorbehandlung des injizierten Muskels mit Cardiotoxin ............... 57

Abb. 4.17 Einfluss der Koexpression von viralen fusogenen Membranproteinen auf den

Impferfolg............................................................................................................................. 58

Abb. 4.18 Einfluss der Koapplikation von TLR-Liganden auf den Impferfolg................... 60

Abb. 4.19 Env-Fusionsproteine für die Vakzinierung ......................................................... 61

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Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

VIII

Abb. 4.20 Neutralisierende Antikörper-Antwort auf pIX-Env-Fusionsprotein-exprimierende

AdV .............................................................................................................................. 62

Abb. 4.21 Vergleich des durch replikations-kompetente und –defekte HSV-Vektoren

vermittelten Schutzes ................................................................................................... 63

Abb. 4.22 Überleben nach Vakzinierung mit replikations-kompetenten oder -defekten

HSV-Vektoren.............................................................................................................. 64

Abb. 4.23 Einfluss von Aciclovir-Behandlung auf den durch HSV-Vektoren vermittelten

Immunschutz in der frühen und späten Infektionsphase.............................................. 65

Tabellenverzeichnis

Tabelle 4.1 Klonierungsstrategien zur Herstellung der Env- und Gag-kodierenden

adenoviralen Impfvektoren ................................................................................ 43

Tabelle 4.2 Klonierungsstrategien zur Herstellung der Zytokin-exprimierenden

adenoviralen Impfvektoren ................................................................................ 44

Tabelle 4.3 Klonierungsstrategien zur Herstellung der Env-Fusionsprotein-exprimierenden

adenoviralen Impfvektoren ................................................................................ 44

Tabelle 4.4 Klonierungsstrategien zur Herstellung der herpesviralen Impfvektoren .......... 48

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Einleitung

1

1. Einleitung

1.1 Retroviren

Das erste Retrovirus wurde Anfang des 20. Jahrhunderts beschrieben, als Peyton Rous das

nach ihm benannte onkogene Rous-Sarkom-Virus in zellfreien Extrakten aus Geflügelsarko-

men identifizierte [1]. In den darauf folgenden Jahren wurden eine Vielzahl weiterer Retrovi-

ren entdeckt, darunter das Simian Foamy-Virus [2], das Friend-Virus [3] und das Feline Leu-

kämie-Virus [4]. Anfang der 1980er Jahre wurde mit dem Humanen T-Zell-Leukämie-Virus

(HTLV) [5] das erste humanpathogene Retrovirus beschrieben. Weltweit sind heute etwa 20

Millionen Menschen mit HTLV-1 infiziert, von denen etwa 4 % nach oft langer Latenzphase

von 40 bis 60 Jahren an einer T-Zell-Leukämie erkranken [6].

Die Familie der Retroviridae umfasst die sieben Genera der α-, β-, γ-, δ- und ε-Retroviren

sowie der Lentiviren und der Spumaviren. Retroviren kommen überwiegend bei Wirbeltieren

vor, wo sie teils schwerwiegende Erkrankungen wie Immundefizienzen und Tumor-

erkrankungen verursachen. Neben exogenen Retroviren, die einen vollständigen Infektions-

zyklus mit Freisetzung infektiöser Viruspartikel durchlaufen, gibt es endogene Retroviren, die

in allen Zellen eines Organismus ins Genom integriert sind und vertikal über die Keimbahn-

zellen übertragen werden, die Genome dieser Viren weisen häufig große Deletionen auf [7].

Retroviren sind umhüllte RNA-Viren mit einer Größe von 80-100 nm, die zwei Kopien linea-

rer Positivstrang-RNA von etwa 10 kb Länge enthalten und über ein DNA-Intermediat repli-

zieren. Nach der Infektion einer Wirtszelle wird das RNA-Genom durch das viruseigene En-

zym Reverse Transkriptase in ein doppelsträngiges DNA-Molekül umgeschrieben, das in den

Zellkern transportiert und durch die virale Integrase in das Wirtsgenom integriert wird [7].

1.1.1 Humanes Immundefizienz-Virus

Kurz nach der Entdeckung der humanpathogenen Retroviren HTLV-1 und HTLV-2 wurde

1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency

syndrome) Erkrankten isoliert, das zunächst als Humanes T-Zell-Leukämie-Lymphoma-

Virus-III oder Lymphadenopathie-assoziiertes Virus bezeichnet wurde [8]. Nach Angaben der

Weltgesundheitsorganisation waren 2007 weltweit 33,2 Millionen Menschen mit HIV infi-

ziert und 2,1 Millionen starben an den Folgen von HIV/AIDS [9;10]. Mehr als die Hälfte der

HIV-Infizierten lebt im subsaharischen Afrika, wo die Seroprevalenz in manchen Gegenden

bei ~35 % liegt, etwa ein Viertel der HIV-Infizierten lebt in Süd-/Südost-Asien (Abb. 1.1) [9].

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Einleitung

2

Abb. 1.1 Weltweite Verbreitung der HIV-Infektion 2007 Etwa 33,2 Millionen Menschen waren im Jahr 2007 mit HIV infiziert. Mehr als die Hälfte der Infizierten lebt im subsaharischen Afrika, ein weiterer großer Teil der Infizierten lebt in Süd-/Südost-Asien [9]. Man unterscheidet die beiden Typen HIV-1 und HIV-2, welche jeweils zahlreiche Subtypen

und Intersubtypen umfassen, die in den Gruppen M, N und O (HIV-1) bzw. A-H (HIV-2) zu-

sammengefasst werden. Bei der HIV-Infektion handelt es sich um eine Zoonose, wobei die

beiden Typen HIV-1 und HIV-2 in den Affen-Immundefizienzviren (SIV) der Schimpansen

(Pan troglodytes troglodytes; SIVcpz) bzw. der Halsbandmangaben (Cercocebus atys atys;

SIVsmm) unterschiedliche Ursprünge haben. Die verschiedenen Virusgruppen stammen je-

weils aus voneinander isolierten Affen-Populationen und sind auf separate Übertragungser-

eignisse zurückzuführen [11;12]. Die Ausbreitung von HIV-1 und HIV-2 und auch der Sub-

gruppen ist unterschiedlich, Infektionen mit HIV-1/N- und HIV-1/O sind weitestgehend auf

Gabun und Kamerun beschränkt [13;14], wohingegen die Gruppe M-Viren weltweit pande-

misch verbreitet sind [15;16]. HIV-2 ist generell weniger verbreitet als HIV-1, die meisten In-

fizierten sind in Westafrika zu finden [17;18]. Die HIV-Pandemie wurde erst Anfang der

1980er Jahre wahrgenommen, jedoch konnte retrospektiv eine Serumprobe eines Patienten

aus Kinshasa aus dem Jahr 1959 als seropositiv identifiziert werden [19]. Genetische Analy-

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Einleitung

3

sen haben ergeben, dass die erste Übertragung des HIV-1/M-Vorläufers auf den Menschen

Anfang der 1930er Jahre stattgefunden hat [20].

HIV gehört zu den Lentiviren, das komplexe Genom hat eine Länge von etwa 9,8 kb, es ko-

diert die viralen Strukturproteine Gag, Pol und Env sowie die regulatorischen Proteine Tat

und Rev und die akzessorischen Proteine Vif, Vpr, Vpu (bzw. Vpx bei HIV-2) und Nef (Abb.

1.2).

Ψ

Abb. 1.2 Genom von HIV-1 Das HIV-Genom hat eine Länge von etwa 9,8 kb. Es enthält LTR- (long terminal repeat-) Regionen an den Ge-nom-Enden und das Verpackungssignal Ψ und kodiert neben den Strukturproteinen Gag, Pol und Env die akzes-sorischen und regulatorischen Proteine Vif, Vpr, Vpu, Rev, Tat und Nef. Das env-kodierte Hüllprotein gp120 vermittelt die Adsorption des Virus an das auf Helfer-T-

Zellen, Monocyten und Makrophagen exprimierte Oberflächenprotein CD4 [21;22] Zur Fusi-

on mit der Zellmembran ist die Interaktion mit den Chemokinrezeptoren CCR5 oder CXCR4

als Korezeptor notwendig. In der akuten Phase der HIV-Infektion nutzen die Viren CCR5 als

Korezeptor, was die Infektion von Makrophagen, dendritischen Zellen und Gedächtnis-CD4+

T-Zellen erlaubt [23-25]. Es kommt zu einer massiven Depletion von CD4+ CCR5+ T Zellen

im Mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe und potentiell irreversiblen Schädigung der

CD4+ T-Zell-mediierten Immunfunktionen. In der chronischen Phase der HIV-Infektion ent-

stehen Virus-Mutanten, die den Korezeptor CXCR4 nutzen, was nun zu einer Infektion von

ruhenden, naiven CD4+ T-Zellen und einer systemischen Depletion von CD4+ T-Zellen führt

[25-27]. Dies führt zu Immundefizienz und damit verbundenen opportunistischen Infektionen

und Malignomen.

Zwar gibt es die Möglichkeit, durch eine antivirale Kombinationstherapie aus meist zwei

nukleosidischen Reverse Transkriptase-Inhibitoren und einem Proteasehemmer bzw. einem

nicht-nukleosidischen Reverse Transkriptase-Inhibitor und eventuell einem Fusions- oder In-

tegrase-Inhibitor die HIV-Infektion über längere Zeit zu kontrollieren, jedoch kann die Infek-

tion nicht vollständig eliminiert werden, so dass es in den meisten Fällen nach längerer The-

rapie auf Grund von Resistenzbildung dennoch zur erneuten Ausbreitung des Virus und zur

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Einleitung

4

Erkrankung kommt. Die antivirale Kombinationstherapie ist mit zum Teil erheblichen Ne-

benwirkungen verbunden, was häufig zu Therapieabbrüchen führt, und verursacht des Weite-

ren erhebliche Kosten, weshalb sie einem Großteil der HIV-Infizierten nicht zugänglich ist

[28]. Daher ist die Entwicklung eines effektiven präventiven Impfstoffes von herausragender

Bedeutung. Ein effektiver HIV-Impfstoff sollte neutralisierende Antikörper induzieren, die

gegen möglichst viele primäre Virusisolate reaktiv sind, um die Primärinfektion und die Vi-

rusausbreitung zu verhindern. Weiterhin sollte der Impfstoff auch spezifische zytotoxische

CD8+ T-Zellen induzieren, um die Elimination infizierter Zellen zu ermöglichen [29]. Die

Entwicklung eines solchen Impfstoffes wird durch zahlreiche Herausforderungen erschwert.

Das Virusgenom zeigt eine Hypervariabilität sowohl in infizierten Personen als auch inner-

halb von Populationen, die durch schnelle Replikation, durch die virale Reverse Transkriptase

bedingte hohe Mutationsraten [30] sowie durch Rekombinationen verursacht wird. Das Hüll-

protein von HIV besitzt eine dichte Glykosylierung, was die Bildung von neutralisierenden

Antikörpern erschwert. Da HIV eine persistierende Infektion etabliert, muss die Immunant-

wort innerhalb eines engen Zeitfensters die Infektion verhindern. Weiterhin konnte bislang

nicht geklärt werden, welche HIV-Antigene sich für die Ausbildung einer effektiven Immun-

antwort eignen [29].

Die Entwicklung einer effektiven HIV-Vakzine wird außerdem durch das Fehlen eines geeig-

neten Kleintiermodells erschwert. Nur Schimpansen sind permissiv für eine HIV-1-Infektion,

jedoch ist die Viruslast im Plasma von mit primären HIV-Isolaten infizierten Schimpansen

sehr niedrig und die Tiere entwickeln in der Regel auch nach langer Zeit keine AIDS-

Symptomatik, weshalb die Relevanz dieses Tiermodells kontrovers diskutiert wird [31;32].

Hinzu kommen ethische und finanzielle Gründe, die gegen die Verwendung von Schimpansen

für Vakzinierungsstudien sprechen [33]. Mäuse sind nicht permissiv für eine HIV-Infektion,

daher kann in Vakzinierungsexperimenten in Mäusen nur die Immunantwort charakterisiert

werden. Es gibt aber artifizielle Modelle, in denen immundefiziente Mäuse mit humanen

Leukozyten rekonstituiert werden [34;35]. Dies erlaubt die Testung von antiviralen Agenzien

und Vakzinen, das Modell hat aber den Nachteil, dass die Effizienz der Repopulation variie-

ren kann und nur jeweils eine begrenzte Anzahl an Tieren zur Verfügung steht [33]. Für zahl-

reiche Studien wurde die Infektion von Rhesus-Makaken mit SIV genutzt, dieses Modell hat

den Vorteil, dass einige SIV-Isolate in Makaken AIDS verursachen und ein ähnlicher Infekti-

onsverlauf zu beobachten ist [36;37]. Neben strukturellen Unterschieden zwischen SIV und

HIV ist auch die Korezeptor-Verwendung unterschiedlich, was die Interpretation von Vakzi-

nierungsstudien erschweren kann. Dieses Problem kann durch die Verwendung von chimären

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Einleitung

5

SIV (SHIV), welche die HIV-Env-Glycoproteine exprimieren, umgangen werden [38-42].

Die Kinetik der Reduktion CD4+ T-Zellen kann aber auch bei der Infektion mit diesen SHIV

schneller sein als bei der HIV-Infektion im Menschen [43]. Zusätzlich ist der Vergleich ver-

schiedener Impfstrategien auf Grund meist niedriger Tierzahlen und des heterogenen geneti-

schen Hintergrundes der Makaken erschwert [33]. Daher werden Vakzinierungsstudien auch

in anderen Infektionsmodellen durchgeführt, ein nützliches Modell für eine retrovirale Infek-

tion ist die Infektion von Mäusen mit dem Friend-Virus (FV) [3]. Zwar ist die Pathogenese

dieser Infektion anders, doch gibt es Ähnlichkeiten in der Immunreaktion und es lassen sich

verschiedene Vakzine in genetisch identischen Tieren vergleichen, weshalb aus solchen Stu-

dien Schlüsse auf die für eine effektive Vakzinierung notwendigen Erfordernisse gezogen

werden können [44-46].

Das letztendliche Ziel der Impfstoffentwicklung ist eine HIV-Vakzine, welche die Infektion

durch das weite Spektrum der weltweit auftretenden HIV-Isolate verhindert und darüber hin-

aus auch in Entwicklungsländern anwendbar ist. Jedoch würde auch eine Vakzine, welche die

Viruslast senkt und das Fortschreiten zu AIDS verlangsamt, einen signifikanten Einfluss auf

die HIV-Epidemie haben [29]. Eine Vielzahl von Impfstrategien wurde bislang für die HIV-

Vakzinierung evaluiert, darunter Peptid- und Protein-Subunit-Vakzine, DNA- und virale Vek-

toren sowie verschiedene Kombinationen aus diesen, von denen einige zur Zeit in klinischen

Studien getestet werden. Hier konnte ein auf gp120 basierender Proteinimpfstoff keinen

Schutz vor nachfolgender HIV-Infektion zeigen [47], was vermutlich darauf zurückzuführen

ist, dass Proteinimpfstoffe kaum die Ausbildung zellulärer Immunität induzieren. Auch DNA-

Impfstoffe alleine führten in klinischen Phase I-Studien zu eher geringen Immunantworten

[48;49]. Häufig verwendete virale Vektoren basieren auf Vakzinia- oder Adenoviren, meis-

tens werden auf dem modifizierten Vakziniavirus Ankara (MVA) bzw. auf humanem Adeno-

virus Typ 5 (Ad5) basierende Vektoren verwendet. Die MVA-basierenden Vektoren wurden

in einer Phase I-Studie evaluiert und führten hier zu eher geringen Immunantworten [50].

Ad5-basierende Vektoren führten in einer Phase I-Studie zu sowohl humoraler als auch zellu-

lärer Immunantwort [51]. In einer groß angelegten multinationalen Phase IIb-Studie hingegen

wurde zum Test des Konzepts eine HIV-Gag, -Pol und -Nef kodierende Ad5-basierende Vak-

zine evaluiert, die ausschließlich zelluläre Immunität, und nicht wie die meisten für Infekti-

onskrankheiten zugelassenen Impfstoffe neutralisierende Antikörper, induzieren sollte. Dieser

als STEP-Studie bekannte Versuch wurde vorzeitig abgebrochen, nachdem eine Zwischen-

analyse keinen Schutz vor HIV-Infektion belegen konnte [52]. In einer heterologen Prime-

Boost-Kombination von DNA mit viraler Boost-Immunisierung ließen sich im Tiermodell

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Einleitung

6

viel versprechende Immunantworten erreichen [53], die Vakzinierung mit einer DNA-Prime-

und Ad5-Boost-Immunisierung soll demnächst in der klinischen Phase IIb-Studie PAVE 100

getestet werden, die aber bis zur vollständigen Auswertung der STEP-Studie vorerst aufge-

schoben wurde [54].

1.1.2 Friend-Virus

Das Friend-Virus (FV) gehört

zu den γ-Retroviren, es ist ein

immunsuppressiver retroviraler

Komplex, der aus dem repli-

kationsdefekten, pathogenen

Spleen Focus Forming Virus

(SFFV) sowie dem replika-

tions-kompetenten, nicht-pa-

thogenen Helfervirus Friend

Murine Leukemia Virus

(F-MuLV) besteht [3]. Beide

Viren besitzen einfache retro-

virale Genome (Abb. 1.3), jedoch enthält das Genom des SFFV mehrere Deletionen [55], auf

Grund derer das SFFV replikations-defekt und zur Replikation auf das Helfervirus F-MuLV

angewiesen ist. Die Deletion im Env-Protein ist dar-

über hinaus für die Pathogenität des SFFV verant-

wortlich. Das trunkierte Env-Protein ist in der Lage,

an der Oberfläche der infizierten Zelle mit dem E-

rythropoietin-Rezeptor zu interagieren und diesen zu

aktivieren. Diese konstitutive Aktivierung führt zu

einer polyklonalen Proliferation der infizierten E-

rythroblasten und daraus resultierend zur Entwick-

lung einer Erythroleukämie und Splenomegalie

(Abb. 1.4; [56]). Die Suszeptibilität für die FV-

Infektion hängt von verschiedenen genetischen Fak-

toren ab. Der MHC-Haplotyp bedingt die Fähigkeit,

potente zelluläre Immunantworten gegen FV zu

Abb. 1.4 Splenomegalie nach FV-Infektion Auf Grund der durch die konstitutive Akti-vierung des Erythropoietin-Rezeptors verur-sachten Proliferation der Erythroblastenentwickeln suszeptible Mäuse nach der In-fektion eine Splenomegalie (Infektionsver-lauf von links nach rechts) [56].

Ψ

Ψ

Abb. 1.3 Genomaufbau von F-MuLV und SFFV F-MuLV und SFFV besitzen einfache retrovirale Genome, die ausden für Env, Gag und Pol kodierenden Bereichen sowie LTR-Regionen bestehen. Im Genom von SFFV finden sich sieben Deletio-nen.

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Einleitung

7

entwickeln, wobei man zwischen den resistenten (H2b) und suszeptiblen Haplotypen unter-

scheidet (H2d>H2a) [57], das Resistenzgen rfv3 hingegen hat Einfluss auf die humorale Im-

munantwort gegen FV [57;58]. Das Resistenzgen fv2 beeinflusst die FV-Infektion direkt. Fv2

kodiert eine trunkierte Form der zellulären Kinase Stk (sf-Stk), welche die Interaktion des

SFFV-Env mit dem Erythropoietin-Rezeptor vermittelt [59;60]. In Abwesenheit der sf-Stk

(Fv2r/r) kann keine Interaktion und somit keine konstitutive Proliferation von Erythroblasten

stattfinden, infizierte Mäuse entwickeln weder Leukämie noch Splenomegalie. Zwei in Bezug

auf die FV-Suszeptibilität prototypische Mausstämme sind C57BL/6 und BALB/c. Mäuse des

Stamms C57BL/6 (H2b/b, Fv2r/r, Rfv3r/r) entwickeln nach der Infektion weder Leukämie noch

Splenomegalie [61]. BALB/c-Mäuse (H2d/d, Fv2s/s, Rfv3s/s) hingegen können keine effektive

zelluläre und humorale Immunantwort hervorbringen und entwickeln innerhalb kurzer Zeit

nach der Infektion Leukämie und Splenomegalie und auch Infektionen mit geringsten Men-

gen FV verlaufen innerhalb weniger Wochen tödlich.

Ähnlich wie andere Retroviren wirkt FV immunsuppressiv durch die Induktion von regulato-

rischen T-Zellen (Treg) [61]. Daher sind auch die resistenten Mausstämme nicht in der Lage,

die Infektion vollständig auszuräumen, die zunächst entwickelte zelluläre Antwort wird durch

die Treg-Zellen unterdrückt und die Mäuse bleiben persistierend infiziert.

Bislang wurden attenuiertes bzw. replikations-defektes F-MuLV, rekombinante Vakziniavi-

ren, sowie Protein- und Peptidvakzine für die Vakzinierung gegen FV evaluiert [44;56;62-

66]. Die Vakzinierungsstudien wurden meist in Hybridmäusen von mittlerer FV-

Suszeptibilität durchgeführt, und es ließen sich mit all diesen Vakzinierungsstrategien relativ

gute Ergebnisse erzielen. Es zeigte sich jedoch, dass mit rekombinanten Vakziniaviren ge-

impfte suszeptible Hybridmäuse zwar gegen die FV-induzierte Erkrankung geschützt waren

[65], die Tiere waren jedoch nicht in der Lage, eine persistierende Infektion zu beseitigen

[67]. Die einzige Vakzine, welche die höchst suszeptiblen BALB/c-Mäuse gegen FV-

induzierte Erkrankung schützt, ist attenuiertes F-MuLV [68].

1.2 Adenovirale Vektoren

Adenoviren (AdV) wurden erstmals 1953 nach Isolation aus adenoidem Gewebe und Rachen-

sekret respiratorisch erkrankter Personen isoliert [69]. Aufgrund ihres Wirtsspektrums wird

die Familie der Adenoviridae, die derzeit über 100 verschiedene, serologisch unterscheidbare

Virustypen umfasst, in die vier Gattungen Aviadenoviren der Vögel, Atadenoviren der Repti-

lien, Siadenoviren der Amphibien und Mastadenoviren, zu denen die Adenoviren der Säuger,

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Einleitung

8

einschließlich der bis heute bekannten 51 verschiedenen humanen Serotypen gehören, unter-

teilt. Die humanpathogenen AdV werden anhand ihres onkogenen Potenzials im immunkom-

petenten Versuchstier und einer Reihe weiterer Merkmale, wie der Fähigkeit zur Hämaggluti-

nation, ihrem GC-Gehalt und Sequenzhomologien des viralen Genoms, in die Subgenera A

bis F eingeteilt [70]. AdV verursachen sowohl lytische als auch persistierende Infektionen

und sind mit einer Vielzahl klinischer Symptome assoziiert. Die Krankheitsbilder umfassen

dabei okuläre, respiratorische und gastroenterale Erkrankungen, Zystitis, Harnwegsinfektio-

nen, Hepatitis und Meningoenzephalitis. In seltenen Fällen kann bei immunsupprimierten

Personen eine Infektion mit Adenoviren zum Tode führen. AdV sind nicht-umhüllte Viren

mit 80-100 nm großen ikosaedrischen Kapsiden, die ein lineares doppelsträngiges DNA-

Genom von etwa 34-44 kb Länge bei humanen AdV beinhalten. Zu den am ausführlichsten

untersuchten Adenoviren gehö-

ren die nahe verwandten Seroty-

pen 2 und 5 (Ad2 und Ad5) der

Subgruppe C. Die Genome von

Ad2 und Ad5 enthalten neun

Transkriptionseinheiten, die für

etwa 40 verschiedene regulatori-

sche und strukturelle Proteine

und zwei nicht translatierte

RNAs kodieren (Abb. 1.5) [70].

Das Fiber-Protein, welches aus

einer Schaft- und einer globulä-

ren Kopf-Region besteht und an

Fiberprotein (IV)

Hexonprotein (II)

Coreprotein (V)

Protein IIIa

Core-Protein (VII)

Protein IX

Lineares DNA-Genom

Protein VI

Protein VIII

Terminales Protein

Pentonbasisprotein (III)

Abb. 1.6 Struktur des AdV-Virion AdV besitzt ein nicht-umhülltes, ikosaedrisches Kapsid, dessenEcken durch das Penton-Basis-Protein gebildet werden, auf demdas Fiber-Protein sitzt.

Abb. 1.5 Schematischer Aufbau des Genoms des humanen Ad 5 Das Genom hat eine Länge von etwa 36 kb, es enthält neun Transkriptionseinheiten, die für etwa 40 verschiede-ne regulatorische und strukturelle Proteine sowie zwei nicht-translatierte RNAs (VA) kodieren.

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Einleitung

9

den durch das Penton-Basis-

Protein gebildeten Ecken des

Kapsids sitzt (Abb. 1.6), ver-

mittelt die Adsorption an den

auf der Zielzelle lokalisierten

Rezeptor (Abb. 1.7) [71]. Der

zelluläre Rezeptor ist für viele

humane AdV-Typen der Cox-

sackie-Adenovirus-Rezeptor

(CAR), einige Typen nutzen

hingegen andere Oberflächen-

moleküle wie CD46. Nach der

Bindung an diesen primären Rezeptor findet eine Interaktion von Penton-Basis-Protein und

Integrinen auf der Zelloberfläche statt, worauf die Internalisierung des Virus in die Zielzelle

folgt (Abb. 1.7) [71]. Adenoviren können sich teilende, aber auch post-mitotisch ruhende Epi-

thelzellen des Hals-, Nasen-, Rachenraumes, der Lunge und des Verdauungstraktes infizieren.

Adenovirale Vektoren werden häufig als Gentransfervektoren eingesetzt. Sie haben die Vor-

züge, dass sie relativ große Transgenkassetten aufnehmen und eine Vielzahl verschiedener

Zelltypen mit hoher Effizienz transduzieren können und man sie mit einfachen Mitteln in

großen Mengen und hohen Konzentrationen herstellen kann [72]. Man unterscheidet bei ade-

noviralen Vektoren zwischen den Vektoren der ersten und zweiten Generation sowie den Gut-

less-Vektoren und onkolytischen Vektoren. Adenovirale Vektoren der ersten Generation ent-

halten Deletionen der essentiellen E1- und optional der E3-Genregion, wodurch die Vektoren

ihre Replikationskompetenz in den meisten Zellen verlieren. Die Transgenkapazität der E1-

/E3-deletierten Vektoren beträgt etwa 8,2 kb [73]. In den adenoviralen Vektoren der zweiten

Generation wurden weitere Deletionen der E2- und E4-Region eingeführt, wodurch die

Transgenkapazität auf etwa 14 kb erhöht werden und die Attenuierung verbessert werden

konnte [74]; durch die fehlende Spätgenexpression konnte bei diesen Vektoren auch die Im-

munantwort gegen transduzierte Zellen verringert werden. Die Verpackung der Vektoren der

ersten und zweiten Generation wird durch trans-komplementierende Zelllinien ermöglicht.

Gutless-Vektoren fehlen alle kodierenden Bereiche des Genoms, sie enthalten lediglich die

Sequenzelemente, die für die Genomreplikation und –Verpackung nötig sind. Die Transgen-

kapazität der Gutless-Vektoren beträgt bis zu 27 kb. Zur Verpackung dieser Vektoren ist ein

Helfervirus notwendig, dass außer der E1-Funktion alle zur Replikation notwendigen regula-

Ad5

αV CAR

Nukleus

Mikrotubuli

H+

Endosom

2

1Bindung

Internalisierung

FiberknobPenton-Basis-Protein

Abb. 1.7 Bindung von Ad5 an Zielzelle Ad5 bindet zuerst mit dem Fiber-Protein an den Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor (1.), das Penton-Basis-Protein interagiert dannmit Integrinen auf der Zelloberfläche (2.), was zur Internalisierungdes Virus führt.

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10

torischen Elemente und Strukturgene enthält [75]. Onkolytische Vektoren hingegen sind an-

ders konstruiert, sie sollen Tumorzellen möglichst selektiv lysieren. Dies wird dadurch er-

reicht, dass man essentielle Gene unter die Kontrolle Tumor- bzw. Gewebe-spezifischer Pro-

motoren stellt, durch die Deletion eines essentiellen Gens, dessen Funktion durch einen De-

fekt der Tumorzelle komplementiert wird, oder durch eine Veränderung des Tropismus [76-

80].

Adenovirale Vektoren wurden als Vakzinvektoren für zahlreiche Infektionen evaluiert, unter

anderem als Vakzine gegen HIV, Ebola, Influenza und Tuberkulose [51;81-83]. Das bislang

sowohl für gentherapeutische Ansätze als auch für Vakzinierungen am häufigsten verwendete

Adenovirus ist das humane Ad5 [72;84;85]. Auf Grund der hohen Seroprävalenz dieses Typs

sind in den letzten Jahren seltener vorkommende Typen wie Ad11, Ad35 und Ad49 mit ver-

stärktem Interesse als Vakzinvektoren eingesetzt worden [86-89]. Auch für die Tumortherapie

können andere Typen sehr interessant sein, da viele primäre Tumore CAR nur in sehr gerin-

gem Maß oder gar nicht exprimieren [90]. Die gegen den Vektor gerichtete Immunität ist

auch bei wiederholten Injektionen relevant, so haben einige Publikationen gezeigt, dass die

heterologe Kombination von DNA- und AdV-Vakzine bzw. von zwei immunologisch distink-

ten AdV zu einer Verbesserung des Impferfolges führen kann [91-95].

1.3 Herpesvirale Vektoren

Herpesviren sind umhüllte DNA-Viren von 150 bis 200 nm Durchmesser mit linearen DNA-

Genomen von 120 bis 250 kb Länge. Die Herpesviren lassen sich auf Grund ihrer Pathogeni-

tät, ihres Zelltropismus sowie ihrer Vermehrungseigenschaften in die drei Unterfamilien α-, β-

und γ-Herpesviren einteilen, welche sich wiederum in mehrere Genera unterteilen. Es gibt

acht humanpathogene Herpesviren sowie eine Vielzahl tierpathogener Herpesviren, die unter-

schiedliche Krankheitsbilder hervorrufen können. Das Genom der meisten Herpesviren ent-

hält terminale bzw. terminale und interne Wiederholungssequenzen und enthält zwischen 70

und 200 zum Teil überlappende Gene. Alle Herpesviren kodieren neben Strukturproteinen

auch für Enzyme, die an Nukleinsäuremetabolismus, DNA-Synthese und Proteinprozessie-

rung beteiligt sind, und können eine latente Infektion in ihrem natürlichen Wirt etablieren.

Das humane Herpes-simplex-Virus-1 (HSV-1) gehört zu den α-Herpesviren, das Genom hat

eine Länge von etwa 160 kb, das in die beiden nicht-repetitiven Bereiche UL und US sowie

terminale und interne Wiederholungssequenzen unterteilt werden kann (Abb. 1.8), und ko-

diert etwa 90 Proteine, von denen 38 nicht essentiell sind. Die Gene lassen sich nach der Ki-

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netik ihrer Transkription in die drei Klassen der α- (immediate early-), β- (early-) und γ- (la-

te-) Gene einteilen, ihre Expression erfolgt in einer von viralen Proteinen regulierten Kaskade.

HSV-1 zeichnet sich durch einen weiten Wirtszelltropismus und schnellen Replikationszyklus

aus und kann auch sich nicht teilende Zellen infizieren. Während der Infektion werden die

Struktur und der Metabolismus der Wirtszelle gravierend beeinflusst, so wird die in der

Abb. 1.8 Genom von HSV-1 Das Genom von HSV-1 hat eine Länge von etwa 160 kb, es enthält die beiden nicht-repetitiven Bereiche UL und US sowie die terminalen und internen Wiederholungssequenzen a, b, b’, a’, c’ und c. infizierten Zelle vorhandene zelluläre RNA degradiert, die Transkription zellulärer Gene inhi-

biert, zelluläre Proteine werden degradiert oder selektiv stabilisiert und einige zelluläre Prote-

ine werden zu neuen Aufgaben umgeleitet [70;96;97]; diese Veränderungen führen schließ-

lich zum Tod der infizierten Zelle. HSV-1 kodiert für eine Reihe von Proteinen, welche die

Detektion und Zerstörung der infizierten Zelle durch das Immunsystem verhindern. So binden

virale Proteine Komplement-Komponenten oder Immunglobuline [98;99], verhindern die Prä-

sentation von Epitopen auf MHC I- und II-Molekülen [100;101], oder blockieren intrazellulä-

re Signaltransduktionswege, welche die Aktivierung von Immunzellen und eine antivirale

Antwort vermitteln würden [99;102-104].

Herpesvirale Vektoren werden häufig als onkolytische Vektoren für die Tumortherapie oder

wegen ihrer hohen Transgenkapazität als Gentransfervektoren genutzt. Herpesvirale Vektoren

haben die Vorteile, dass sie je nach Vektortyp sehr hohe Transgenkapazitäten bieten, auf

Grund ihrer genetischen Komplexität die Generierung verschiedener attenuierter, onkolyti-

scher Viren erlauben und in sensorischen Ganglia und anderen Neuronen lebenslange Latenz

etablieren können [105]. Onkolytische, für die Replikation in teilungsaktiven Zellen selektive

Vektoren wurden durch die Deletion von am Nukleotid-Metabolismus beteiligten Enzymen

wie der viralen Thymidin-Kinase [106] oder Ribonukleotid-Reduktase [107-109] generiert.

Durch die Deletion weiterer Gene wurden die Vektoren weiterentwickelt, um ihre Neurotoxi-

zität zu reduzieren und ihre Effektivität zu erhöhen; um die Sicherheit der Vektoren zu ge-

währleisten, wird die virale Thymidin-Kinase aus modernen Vektoren nicht mehr deletiert

[110-114]. Im Gegensatz zu den onkolytischen Vektoren werden als Gentransfervektoren

replikationsdefekte rekombinante Viren oder sogenannte Amplikonvektoren verwendet. Die

replikationsdefekten rekombinanten Viren enthalten Deletionen in essentiellen Genen und zu-

a b U b’ a’ c’ U cL S

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sätzliche Transgenkassetten [115-117]. Amplikonvektoren hingegen enthalten keine viralen

Sequenzen außer der Verpackungssequenz, einem Replikationsursprung und einem immediate

early-Promotor, unter dessen Kontrolle das Transgen gesetzt werden kann [118]. Sie vereinen

somit die Vorteile einer DNA-Plasmidimmunisierung und des effizienten viralen Gentransfers

in sich. Auf Grund des Fehlens weiterer viraler Sequenzen haben diese Vektoren eine Trans-

genkapazität von bis zu 150 kb. Die Herstellung von Amplikonvektoren in großen Mengen

und in hohen Titern bereitet aber Schwierigkeiten. Amplikonvektoren sind sowohl für Gen-

transfer- als auch für Vakzinierungs-Experimente eingesetzt worden, unter anderem für Tu-

morvakzinierungen oder Vakzinierungen gegen HIV [119-121], wo sie sowohl zelluläre als

auch humorale Immunantwort vermittelten.

1.4 Immunisierungsstrategien

Die meisten der heute erfolgreich zur Impfung gegen Infektionskrankheiten eingesetzten

Vakzine induzieren neutralisierende Antikörper, welche die systemische Ausbreitung des Pa-

thogens verhindern. Starke humorale Immunantworten können durch die Impfung mit Protei-

nen, Proteinuntereinheiten oder inaktivierten Pathogenen induziert werden. Internalisierte

Proteine werden in der Zelle prozessiert und hauptsächlich auf MHC II-Molekülen präsen-

tiert. Da nur sehr geringe Mengen auf MHC I-Molekülen präsentiert werden, ist die Induktion

von CD8+ T-Zellen durch Protein-Vakzine äußerst gering.

Attenuierte Viren sind durch Mutationen in ihrer Replikation stark eingeschränkt, diese Impf-

stoffe können sehr effektiv sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten induzieren

[122]. Auf Grund der Möglichkeit der Bildung von Revertanten und der Wiederherstellung

der Virulenz durch Mutationen oder Rekombinationen bieten diese Impfstoffe jedoch keine

ausreichende Sicherheit [123].

Genetische Impfstoffe hingegen sind DNA-Vakzine oder rekombinante virale Vektoren, wel-

che die für ein immunogenes Protein kodierende DNA-Sequenz tragen. Das Protein wird nach

Transduktion der Zielzelle in der Zelle selbst produziert und kann nach Degradation auf

MHC I-Molekülen präsentiert werden. Zahlreiche Studien konnten zeigen, dass genetische

Vakzinierungen sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten induzieren [53;124-

126].

Seit langem werden die Möglichkeiten untersucht, die Immunantwort auf Antigene zu erhö-

hen, sei es, um einen verbesserten Impfschutz zu erzielen, bei einer Impfung die notwendige

Menge an Antigen zu reduzieren oder um experimentell Antikörper zu produzieren. Eine

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Einleitung

13

Standard-Methode zur Steigerung der Immunität und zur gezielten Ausbildung von Gedächt-

nis-Immunität ist die wiederholte Applikation einer Vakzine als sog. Prime-Boost-

Immunisierung. Hierbei kann es sich um die wiederholte Applikation desselben Impfstoffes

oder von verschiedenen Vektoren handeln [48;51;53].

Eine weitere Methode ist der Einsatz von Adjuvantien. Bekannte Adjuvantien wie zum Bei-

spiel komplettes Freund’sches Adjuvans (Mineralöl-Wasser-Emulsion mit Mycobakterie-

nextrakt) [127] oder Alum (Aluminium-hydroxidgel) können die Immunogenität eines Anti-

gens erhöhen, indem sie eine verlangsamte Freisetzung des Antigens sowie eine erhöhte Auf-

nahme durch Makrophagen und die Expression von kostimulatorischen Molekülen durch Im-

munzellen bewirken. Der Einsatz dieser Adjuvantien ist aber mit teils heftigen Entzündungs-

reaktionen und Gewebezerstörung verbunden, daher sollte ihr Einsatz möglichst vermieden

werden.

Gezieltere Methoden zur Steigerung der Immunogenität einer Vakzine sind die Koexpression

bzw. Koapplikation von Zytokinen oder Toll-like-Rezeptor- (TLR-) Liganden. Für eine Reihe

von Zytokinen konnte bislang für DNA- und Protein-Vakzine eine Steigerung der Immun-

antwort gezeigt werden [128-131]. Toll-like-Rezeptoren sind Rezeptoren des angeborenen

Immunsystems, die Pathogen-assoziierte molekulare Strukturen erkennen und die Aktivierung

des angeborenen Immunsystems und die Expression von Immunmodulatoren wie Zytokinen,

Chemokinen sowie kostimulatorischen Molekülen vermitteln können [132]. Doppelsträngige

RNA als Virus-assoziierte Struktur ist ein Ligand für TLR3, die synthetische RNA Polyriboi-

nosin-Polyribocytidinsäure (poly(I:C)) wurde in verschiedenen Studien als Adjuvans für anti-

virale und anti-tumorale Vakzinierungen evaluiert, wo sie einen positiven Effekt auf den Vak-

zinierungserfolg zeigte [133-136]. Spezifische unmethylierte CpG-enthaltende DNA-

Sequenzen als Bakterien-assoziierte Strukturen sind Liganden für TLR9, synthetische CpG-

Oligodeoxynukleotide wurden ebenfalls erfolgreich als Adjuvantien für Vakzinierungen ein-

gesetzt [137-139].

Eine weitere Methode zur Steigerung der Immunogenität eines Antigens kann eine genetische

Fusionierung mit stimulatorischen Molekülen bzw. hoch-immunogenen Molekülen darstellen.

Es konnte beispielsweise gezeigt werden, dass die Fusion des Tumorantigens HER2/neu mit

dem an der Reifung dendritischer Zellen beteiligten Wachstumsfaktor GM-CSF (granulocyte-

macrophage colony stimulating factor) zu der Induktion einer potenten Immunantwort gegen

das an sich schwach immunogene HER2/neu führt [140]. Die Fusionierung mit Molekülen

wie CTLA-4 oder einem anti-DC-SIGN-Antikörper, welche an Moleküle auf der Oberfläche

von professionellen Antigen-präsentierenden Zellen binden, kann die Immunogenität eines

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Einleitung

14

Antigens steigern, indem dieses gezielt an die Antigen-präsentierende Zelle herangeführt und

dort dann aufgenommen und effektiver prozessiert werden kann [141;142]. Durch einen ähn-

lichen Mechanismus konnte durch die Fusion verschiedener Antigene mit mehreren C3d-

Molekülen, einem Fragment der Komplement-Komponente C3, durch die Bindung von C3d

an seinen auf B-Zellen exprimierten Rezeptor CD21 eine deutliche Verstärkung der Antikör-

perantwort erreicht werden [143-145]. Eine weitere Möglichkeit zur Steigerung der Immuno-

genität eines schwach immunogenen Antigens ist die Fusion mit einem stark immunogenen

Antigen. Die Immunogenität eines Onkoproteins des Humanen Papillomavirus Typ 16 konnte

durch die Fusion mit HBsAg, dem Oberflächenprotein des Hepatitis-B-Virus, deutlich erhöht

und die Antikörper- und CTL-Antworten verbessert werden [146].

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Zielsetzung

15

2. Zielsetzung

Ziel dieser Arbeit war es, verschiedene genetische Immunisierungen mittels AdV- und HSV-

basierender Vektoren in anti-retroviralen Vakzinierungsstrategien zu vergleichen. Zunächst

sollte ermittelt werden, ob sich die Friend-Virus-Infektion als Modellinfektion für die Ent-

wicklung verbesserter viral vektorisierter anti-retroviraler Impfstrategien eignet. Für Vakzi-

nierungen gegen FV stehen verschiedene Maus-Stämme zur Verfügung, die sich in ihrer FV-

Suszeptibilität unterscheiden und somit unterschiedliche Stringenzen zur Testung der Impf-

vektoren anbieten. Es sollten also zunächst die Vakzinierung verschiedener Mausstämme so-

wie verschiedene Applikationsformen evaluiert werden. Für die Vakzinierung mit adenovira-

len Vektoren sollten F-MuLV-Env- und -Gag-exprimierende Ad5-basierende Vektoren herge-

stellt und evaluiert werden. Neben Ad5-basierenden Vektoren sollten Fiber-chimäre Vektoren

hergestellt werden, in denen die Kopf- und Schaft-Domänen des Fiberproteins durch die des

Typs 35 ersetzt wurden. Diese Vektoren besitzen einen anderen Tropismus als die Ad5-

basierten Vektoren und können zumindest teilweise eine gegen Ad5 gerichtete humorale Im-

munantwort umgehen. Es sollte ein Vergleich des durch diese Fiber-chimären Vektoren und

durch Ad5-basierende Vektoren vermittelten Schutzes sowie zwischen homologen und hete-

rologen Prime-Boost-Immunisierungen angestellt werden. Zur Verbesserung der Immunoge-

nität des Impfstoffes sollten verschiedene Strategien verfolgt werden, zum einen die

Koexpression von verschiedenen Zytokinen oder fusogenen Membranproteinen, die Koappli-

kation eines TLR-Liganden oder von Cardiotoxin, sowie die Herstellung genetischer Fusionen

des Env-Proteins mit einer PEST-Sequenz, mit dem mittelgroßen Oberflächenprotein des He-

patitis B-Virus, der extrazellulären Domäne des T-Zell-Korezeptors CTLA4 oder dem adeno-

viralen Kapsid-Protein pIX. Letzteres sollte zur Präsentation des Env auf dem adenoviralen

Kapsid führen.

Da sich für viele Vakzine eine Überlegenheit replizierender Vektoren gegenüber abgetöteten

oder attenuierten Pathogenen gezeigt hat, sollten replikations-kompetente und –defekte Vek-

toren für die anti-retrovirale Vakzinierung verglichen werden. Hierzu sollten HSV-1-

basierende Vektoren, die in murinen Zellen replizieren können, hergestellt werden. Zunächst

sollte das HSVQuik-System modifiziert werden, um die Herstellung replikations-defekter

HSV-Vektoren zu ermöglichen. Die im Rahmen der Arbeit hergestellten F-MuLV-Env- und –

Gag-kodierendenVektoren sollten dann im FV-Modell getestet werden.

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Zielsetzung

16

Der Impferfolg sollte zunächst über die Analyse der Viruslast und des Krankheitsverlaufs ver-

folgt werden. Bei deutlichen Impferfolgen sollte außerdem die humorale und zelluläre Im-

munantwort genauer charakterisiert werden.

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Material und Methoden

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3. Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Geräte

Brutschrank HS12 Heraeus Instruments (Osterode)

Dampfsterilisatoren H+P Labortechnik (Oberschleißheim)

Durchflusszytometer FACS Calibur Becton Dickinson (Heidelberg)

Elektrophoresesystem PEQLAB Biotechnologie (Erlangen)

Elektroporator Gene Pulser Excell BioRad (München)

Geldokumentationskammer Biozym (Oldendorf)

Labor-pH-Meter Greisinger electronic (Regenstauf)

Lichtmikroskop CK40 Olympus (Hamburg)

Luminometer Hamamatsu Photonics (Herrsching am Ammersee)

pH-Meter GHPR 1400A Greisinger electronic (Regenstauf)

Photometer Eppendorf BioPhotometer Eppendorf (Hamburg)

Pipetten Eppendorf (Hamburg)

Pipettierhilfe Repeater Plus Hirschmann Laborgeräte, Eppendorf (Hamburg)

Peltier Thermal Cycler PTC 200 MJ Research (Ramsey, USA)

Real Time-PCR-System Lightcycler Roche Diagnostics (Mannheim)

Schüttelapparat Certomat SII B. Braun Biotech International (Melsungen)

Schüttelwasserbad 1086 GFL (Großburgwedel)

Thermoschüttler Thermomixer compact Eppendorf (Hamburg)

Tiefkühlschrank -86C ULT Freezer Thermo Forma (Braunschweig)

Ultraschallbad MERCK eurolab (Darmstadt)

Ultrazentrifugenrotoren:

Festwinkelrotor NVT100 Beckman Coulter (Krefeld)

Ausschwingrotor SW28, SW41 Beckman Coulter (Krefeld)

Vortexer K-550-GE BENDER & HOBEIN AG (Bruchsal)

Waagen

Analysewaage SCALTEC SPB64 Scaltec (Göttingen)

Präzisionswaage SCALTEC SBH31 Scaltec (Göttingen)

Wasserbad E100 LAUDA (Lauda-Königshofen)

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Material und Methoden

18

Zentrifugen:

Mikrofuge 18 Zentrifuge Beckman Coulter (Krefeld)

6-15K Laboratory Zentrifuge Sigma (Osterode am Harz)

Optima L-70K Ultrazentrifuge Beckman Coulter (Krefeld)

Zentrifuge 5810 Eppendorf (Hamburg)

3.1.2 Verbrauchsmaterialien

96-, 24-, 6-Loch-Platte Nunc (Wiesbaden), Sarstedt (Nümbrecht)

96-Loch-Platte Maxisorp Nunc (Wiesbaden)

Filter Papier 288 Sartorius (Göttingen)

Nitrocellulose Schleicher & Schuell (Einbeck)

Pipettenspitzen Starlab (Ahrensburg)

Petrischalen Sarstedt (Nümbrecht)

PE-Röhrchen Sarstedt (Nümbrecht)

Reaktionsgefäße Greiner (Frickenhausen), Sarstedt (Nümbrecht)

Sterilfilter Roth (Karlsruhe), Sarstedt (Nümbrecht)

Ultrazentrifugenröhrchen Beckmann Coulter (Krefeld)

Whatman-Papier Schleicher & Schuell (Einbeck)

Zellkulturflaschen (25 cm2, 75 cm2, 175 cm2) Nunc (Wiesbaden), Sarstedt (Nümbrecht)

Zellkulturflaschen (300 cm2) TPP (Trasadingen, Schweiz)

3.1.3 Chemikalien

Aciclovir-ratiopharm 500 mg Ratiopharm (Ulm)

Acrylamid Merck (Darmstadt)

Agar AppliChem (Darmstadt)

Agarose Invitrogen (Karlsruhe)

Aminoethylcarbazol Sigma (München)

Ammoniumpersulfat Roth (Karlsruhe)

Ampicillin AppliChem (Darmstadt)

Aqua bidest. Braun (Melsungen)

β-Mercaptoethanol Sigma (München)

Bovines Serum-Albumin Applichem (Darmstadt)

Bromphenolblau Sigma (München)

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Material und Methoden

19

2-Butanol J.T.Baker (Deventer, Niederlande)

Carboxyfluoresceindiacetat-N-succinimidylester Sigma (München)

Cardiotoxin Latoxan (Valence, Frankreich)

Calciumchlorid J.T.Baker (Deventer, Niederlande)

Cäsiumchlorid Applichem (Darmstadt)

Chloramphenicol Applichem (Darmstadt)

Cpg ODN 1826 InvivoGen (San Diego, USA)

Dimethylformamid (DMFA) Sigma (München)

Dimethylsulfoxid (DMSO) AppliChem (Darmstadt)

dNTP-Mix Pharmacia (Freiburg)

Essigsäure J.T.Baker (Deventer, Niederlande)

Ethanol J.T.Baker (Deventer, Niederlande)

Ethidiumbromid 1 % AppliChem (Darmstadt)

Ethylen-Diamin-Tetraacetat VWR (Darmstadt)

FACS-Flow BD Bioscience (Heidelberg)

FACS-Rinse BD Bioscience (Heidelberg)

FACS-Clean BD Bioscience (Heidelberg)

fetales Kälberserum Biochrom AG (Berlin)

Formaldehyd J.T.Baker (Deventer, Niederlande)

Formamid (deionisiert) Sigma (München)

Geneticindisulfat (G418) AppliChem (Darmstadt)

Gentamycinsulfat AppliChem (Darmstadt)

Glucose Applichem (Darmstadt)

Glycerin J.T.Baker (Deventer, Niederlande)

Glycin Biomol (Hamburg)

Hefeextrakt AppliChem (Darmstadt)

Heparin Applichem (Darmstadt)

4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazin-Ethansulfonsäure Biomol (Hamburg)

Isofluran Baxter (Unterschleißheim)

Isopropanol J.T.Baker (Deventer, Niederlande)

Kaliumacetat J.T.Baker (Deventer, Niederlande)

Kaliumchlorid J.T.Baker (Deventer, Niederlande)

Kanamycinsulfat AppliChem (Darmstadt)

Lipofectamine 2000 Invitrogen (Karlsruhe)

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Material und Methoden

20

Magermilchpulver Neuform (Zarrentin)

Magnesiumchlorid J.T.Baker (Deventer, Niederlande)

Meerschweinchen-Komplement Sigma (München)

Methanol J.T.Baker (Deventer, Niederlande)

Natriumacetat J.T.Baker (Deventer, Niederlande)

Natriumazid J.T.Baker (Deventer, Niederlande)

Natriumchlorid J.T.Baker (Deventer, Niederlande)

Natriumcitrat J.T.Baker (Deventer, Niederlande)

Natriumdihydrogenphosphat VWR (Darmstadt)

Natriumdodecylsulfat AppliChem (Darmstadt)

Natriumhydroxid J.T.Baker (Deventer, Niederlande)

NycoPrep Universal (60 % Nycodenz) Greiner Bio-One (Frickenhausen)

poly(I:C) InvivoGen (San Diego, USA)

Proteinase K Roche (Mannheim)

RNaseA AppliChem (Darmstadt)

Sucrose Applichem (Darmstadt)

Tetracyclin Applichem (Darmstadt)

N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin Sigma (München)

TMB+ Dako (Hamburg)

Tris-(hydroxymethyl)aminomethan AppliChem (Darmstadt)

Tris-(hydroxymethyl)aminomethan-HCl Biomol (Hamburg)

TriZol Invitrogen (Karlsruhe)

Trypsin/EDTA Biochrom (Berlin)

Trypton AppliChem (Darmstadt)

Tween 20 AppliChem (Darmstadt)

5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galaktopyranosid AppliChem (Darmstadt)

3.1.4 Enzyme

Calf Intestinal Phosphatase MBI Fermentas (St. Leon-Rot)

Klenow DNA-Polymerase New England BioLabs (Frankfurt a. M.)

T4 DNA-Ligase New England BioLabs (Frankfurt a. M.)

Taq-Polymerase Amersham Pharmacia Biotech Inc. (München)

Restriktionsendonukleasen New England BioLabs (Frankfurt a. M.)

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Material und Methoden

21

3.1.5 Reagenzsysteme

Adenopack 20/100 Vivascience/Sartorius (Göttingen)

Combizyme DNA-Polymerase-Mix Invitek (Berlin)

ECL Chemiglow Alpha Innotech (San Leandro, USA)

Jetsorb Gel Extraction Genomed (Löhne)

Luciferase Detection Kit Promega (Mannheim)

NucleoSpin Extract Macherey-Nagel (Düren)

NucleoSpin Plasmid Macherey-Nagel (Düren)

QuantiTect Probe RT-PCR Kit Qiagen (Hilden)

TA-Cloning-Kit Invitrogen (Karlsruhe)

3.1.6 Puffer und Lösungen

AEC-Gebrauchslsg. 1 % AEC-Stammlsg. in 0,05 M Natriumacetat

AEC-Stammlsg. 20 mg/ml in DMFA

Ampicillin-Stammlsg. (1000x) 100 mg/ml Ampicillin

Blockpuffer 5 % (w/v) Magermilchpulver in PBS-T

Chloramphenicol-Stammlsg. (1000x) 68 mg/ml Chloramphenicol (in Ethanol)

DNA-Ladepuffer 0,25 % (w/v) Bromphenolblau

0,25 % (w/v) Xylencyanol FF

30 % (v/v) Glycerin

autoklavieren

ELISA-Coating-Puffer 200 mM NaC2O3

pH 9,6

Ethidiumbromid-Stammlsg. 1 % (w/v) Ethidiumbromid

FACS-Puffer 1 % BSA

0,02 % Natriumazid

in PBS

FSB 100 mM KCl

44 mM MnCl2

10 mM CaCl2

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Material und Methoden

22

FSB (fortges.) 3 mM HACoCl3

10 % (v/v) Glycerol

10 mM Kaliumacetat

pH 6,4 mit 0,1 M HCl

Kanamycin-Stammlsg. (1000x) 50 mg/ml Kanamycin

10x Laufpuffer 0,25 M Tris-Base

1,9 M Glycin

1x Laufpuffer 10 % (v/v) 10x Laufpuffer

0,1 % (w/v) SDS

OD-Lyse-Puffer 0,1 % (w/v) SDS

1 mM EDTA

10 mM Tris-HCL

P1 6,06 g/l Tris-Base

3,72 g/l Na2EDTA*H2O

pH 8,0 mit HCl

100 mg/l RNAse

P2 8,0 g/l NaOH

10 g/l SDS

P3 294,5 g/l Kaliumacetat

150 ml Eisessig

PBBS 0,2 g/l KH2PO4

1,15 g/l Na2HPO4

0,14 g/l CaCl2

0,32 g/l KCl

7,2 g/l NaCl

0,2 g/l MgCl2 x 6H2O

0,2 g/l MgSO4 x 7 H2O

1,0 g/l Glucose

0,001 % Phenolrot

pH 7,3

PBS 8 g/l NaCl

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Material und Methoden

23

PBS (fortges.) 0,2 g/l KCl

2,68 g/l Na2HPO4*7 H2O

0,24 g/l KH2PO4

pH 7,4

autoklavieren

PBS-T 0,1 % (v/v) Tween 20

in PBS

SDS-PAGE-Probenpuffer 150 mM TrisHCl

30 % (v/v) Glycerin

1,2 % (w/v) SDS

0,0018 % (w/v) Bromphenolblau

15 % (v/v) β-Mercaptoethanol

TAE 40 mM Tris

5 mM NaOAc

1 mM EDTA

TE 1 % (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0

1 mM EDTA

Tetracyclin-Stammlsg. (300x) 6,5 mg/ml Tetracyclin (in Ethanol)

Transferpuffer 8 % (v/v) 10x Laufpuffer

20 % (v/v) Methanol

10x Trypsin/EDTA 0,5 % (w/v) Trypsin

0,1 % (w/v) EDTA

in 10x PBS

3.1.7 Medien

3.1.7.1 Medien für die Kultur eukaryontischer Zellen

DMEM (4,5 g/l D-Glucose) Gibco, Invitrogen (Karlsruhe)

RPMI1640 Gibco, Invitrogen (Karlsruhe)

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Material und Methoden

24

3.1.7.2 Medien für die Bakterienkultur

Alle Medien werden nach dem Ansetzen autoklaviert. Die entsprechenden Platten werden

durch Zusatz von 2 % (w/v) Agar zum Medium hergestellt.

LB 1 % (w/v) Hefe-Extrakt

1 % (w/v) Bacto-Peptone

0,5 % (w/v) NaCl

SOB 2 % (w/v) Tryptone

0,5 % (w/v) Hefe-Extrakt

10 mM NaCl

2,5 mM KCl

autoklavieren

10 mM MgCl2 (sterilfiltriert)

pH 6,8-7,0

SOC 2 % (w/v) Bacto-Peptone

1 % (w/v) Hefe-Extrakt

0,1 % (w/v) NaCl

20 mM Glucose

TB 1,2 % Bacto-Peptone

2,4 % Hefe-Extrakt

0,4 % Glycerol

0,17 M KH2PO4

0,72 M K2HPO4

3.1.8 Plasmide

fHSVQuik1 bakterielles artifizielles Chromosom (BAC), enthält das gesamte Ge-

nom des Herpes Simplex Virus (Stamm F) mit Deletionen beider Ko-

pien des Gens γ34,5 sowie einer Insertion der BAC-Sequenzen im

nicht-essentiellen Gen ICP6 [147]

pAdEasy-1 Rekombinationsplasmid, enthält das Genom des Adenovirus Typ 5

mit Deletionen der E1- und E3-Region, durch homologe Rekombina-

tion mit pShuttle bzw. pAdTrack können rekombinante Adenoviren

erhalten werden [148]

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Material und Methoden

25

pAdEasyF35 Rekombinationsplasmid, wie pAdEasy-1, jedoch wurden hier die

Kopf- und Schaft-Domänen des Fiber-Proteins durch die des Adeno-

virus Typ 35 ersetzt [149]

pAdTrack-CMV Klonierungsvektor für die Herstellung rekombinanter Adenoviren mit

Hilfe des AdEasy-Systems, erlaubt die Klonierung eines Transgens

unter CMV-Promotor-Kontrolle, enthält eine zusätzliche GFP-

Expressionskassette [148]

pBluescript Klonierungsvektor, der in hoher Kopienzahl in Bakterien vorliegt

pBR322 Klonierungsvektor, der in niedriger Kopienzahl in Bakterien vorliegt

pcn-Cre Cre-Rekombinase-Expressions-Vektor [147]

pCG-env kodiert F-MuLV Env (erhalten von Prof. Dr. Ulf Dittmer, Universi-

tätsklinikum Essen)

pCG-leadergag kodiert F-MuLV Gag (erhalten von Prof. Dr. Ulf Dittmer, Universi-

tätsklinikum Essen)

pCR2.1-TA TA-Klonierungsvektor, zur direkten Klonierung von PCR-Produkten

mit Adenosin-Überhängen (Invitrogen, Karlsruhe)

pCR3.1-IL18 enthält die cDNA des murinen IL18 (erhalten von Camille Locht, In-

stitut Pasteur, Lille, Frankreich)

pEBHICP27 enthält die HSV-Gene icp27 und icp4

pFTP-T Flp-Rekombinase-Expressions-Vektor [147]

pGT60mIL2 enthält die cDNA des murinen IL2 (InvivoGen, San Diego, USA)

pGT60mGM-CSF enthält die cDNA des murinen GM-CSF (InvivoGen, San Diego,

USA)

pORF9-mIL15 enthält die cDNA des murinen IL15 (InvivoGen, San Diego, USA)

pORF9-mIL21 enthält die cDNA des murinen IL21 (InvivoGen, San Diego, USA)

pShuttle-CMV Klonierungsvektor für die Herstellung rekombinanter Adenoviren mit

Hilfe des AdEasy-Systems, erlaubt die Klonierung eines Transgens

unter CMV-Promotor-Kontrolle [148]

pTransfer Klonierungsvektor für die Herstellung rekombinanter Herpesviren

mit Hife des HSVQuik-Systems, enthält loxP- und FRT-Sequenzen,

erlaubt die Klonierung eines Transgens unter CMV-Promotor-

Kontrolle sowie einen R6Kγ-Replikationsursprung [147]

pUC9-CTLA4 enthält die cDNA des murinen CTLA4 (erhalten von von Abdul M.

Jabbar, Emory University, Atlanta, USA)

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Material und Methoden

26

pUMVC3-mIL12 enthält die cDNA des murinen IL12 (erhalten von Alexander Rakh-

milevich, University of Wisconsin-Madison, Madison, USA)

3.1.9 Oligonukleotide

Die verwendeten Oligonukleotide wurden bei biomers (Ulm) bezogen.

CMVMCSpAantisense CGCGTTAAGATACATTGATGA

CMVMCSpAsense TAATAGTAATCAATTACGGGGTCA

CTLA4EcoRI GAATTCATGGAAGCCATACAGGTG

CTLA4SalI GTCGACGTCAGAATCCGGGCA

env-stopNotI GCGGCCGCATGGCGTGTTCAACGCTCTCAAAA

env-stopSalI GTCGACTTGTGGCTCGTATTCTAGTG

env-tmHindIII AAGCTTTTATCTTTTATGTCTATGGGATT

env-tmNotI GCGGCCGCATGGCGTGTTCAACGCTCTCAAAA

env-tmstopEcoRI GAATTCATGGCGTGTTCAACGCTCTC

env-tmstopSalI GTCGACTCTTTTATGTCTATGGGATT

envHindIII AAGCTTGTCTAGAACCCCGCTGGAAA

envNotIBstZ17Ias AAGAGGAGGGCTTCCAGTATAC

envNotIBstZ17Is GATCGCGGCCGCCCCGTTACATAACTTACGGTA

envSalI GTCGACAAAGATCAGCTTGCATGCCT

FVdown AGTGCCTGGTAAGCTCCCTGT

FVSonde 6-Fam-ACTCCCACATTGATTTCCCCGTCC-Tamra

FVup AAGTCTCCCCCCGCCTCTA

gagNotIAflIIas TTGTGGGCTGTCCGTTCGACATCCT

gagNotIAflIIs GATCGCGGCCGCCCCGTTACATAACTTACGGTA

HBsAgpreS2S-stopEcoRI GAATTCATGCAGTGGAACTCCACAAC

HBsAgpreS2s-stopSalI GTCGACAATGTATACCCAAAGACAAAA

illinkerantisense CCTCGAGGCTAGCTCTAGACTGCAGGCGGCCGC

GATATCCCATGGGTCGACGTGCACAGATCTGTT

AACGGTAC

illinkersense CGTTAACAGATCTGTGCACGTCGACCCATGGGA

TATCGCGGCCGCCTGCAGTCTAGAGCTAGCCTC

GAGGAGCT

leadergagHindIII AAGCTTGGATCCGTGGTGACCATGAC

leadergagXbaI TCTAGAAGATCAGCTTGCATGCCTGC

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Material und Methoden

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linkerBRsense TATGAGATCTGTGCACAAGCTTA

linkerBRantisense ATATGAGATCTGTGCACAAGCTTACTA

linkerdpIXsense CCAATTGGTGCACAGATCTC

linkerdpIXantisense TCGAGAGATCTGTGCACCAATTGGGTAC

mIL15SalKpnNotas GATCGCGGCCGCGGTACCCTAGCAATAACAGA

AACACGG

mIl15SalKpnNots GATCGTCGACACCTGAGATCACCGGTAGGA

pestlinkersense CAGATCTCCGCGGCCGCGTGCACGTCGACCA

CGGCTTCCCCCCCGAGGTGGAGGAGCAGGAC

GACGGCACCCTGCCCATGTCCTGCGCCCAGGA

GTCCGGCATGGACCGGTAAAAAGCTTGAGCT

pestlinkerantisense CAAGCTTTTTACCGGTCCATGCCGGACTCCTGG

GCGCAGGACATGGGCAGGGTGCCGTCGTCCTGC

TCCTCCACCTCGGGGGGGAAGCCGTGGTCGACG

TGCACGCGGCCGCGGAGATCTGGTAC

pIXEcoRI GAATTCATGAGCACCAACTCGTT

pIXSalI GTCGACAACCGCATTGGGAGG

sftpdlinkersense CAGATCTGAATTCGTGCACGTCGACCAATTGC

AGCTGGGATTGAAGGGGGACAAAGGCATTCCTG

GAGACAAAGGAGCAAAGGGAGA-

AAGTGGGCTTCCAGATGTTGCTTCTCTGAGG-

CAGCAGGTTGAGGCCTTACAGGGACAAGTA-

CAGCACCTCCAGGCTGCTTTCTCTCAGTATAA-

GAAAGTTGAACTCTTCCCAAATGGCCAATTGGG-

GATCCGCGGCCGCACTAGTAAGCTTGAGCT

sftpdlinkerantisense CAAGCTTACTAGTGCGGCCGCGGATCCCCAATT

GGCCATTTGGGAAGAGTTCAACTTTCTTATACT-

GAGAGAAAGCAGCCTGGAGGTGCTG-

TACTTGTCCCTGTAAGGCCTCAACCTGCTGCCT-

CAGAGAAGCAACATCTGGAAGCC-

CACTTTCTCCCTTTGCTCCTTTGTCTCCAG-

GAATGCCTTTGTCCCCCTTCAATCCCAGCTG-

CAATTGGTCGACGTGCACGAATTCAGATCTGG-

TAC

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Material und Methoden

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TLsense AATTCGCTAGCGCGGCCGCCCATGGCTTAA

GACCGGTGTATACGTGCACCTCGAGG

TLantisense GATCCCTCGAGGTGCACGTATACACCGGTC

TTAAGCCATGGGCGGCCGCGCTAGCG

3.1.10 Standards

DNA 1kb-Leiter Invitrogen (Karlsruhe)

DNA 100bp-Leiter Invitrogen (Karlsruhe)

Prestained Precision Protein-Standard Biorad (München)

3.1.11 Peptide

AbuAbuLAbuLTVFL CTL-Epitop aus der Leader-Region des Gag-Proteins, die

in der Originalsequenz vorhandenen Cysteine wurden

durch α-Aminobuttersäure ersetzt (PANATecs, Tübingen)

EPLTSLTPRCNTAWNRLKL Th-Epitop aus dem Env-Protein (PANATecs, Tübingen)

3.1.12 Antikörper und Tetramere

Kaninchen-α-Maus Ig-HRP Dako (Hamburg)

Ziege-α-Maus Ig-RPE Dako (Hamburg)

Maus-α-F-MuLV env (AK720) Zellkulturüberstand der Hybridoma-Zelllinie H720

Maus-α-F-MuLV env (AK48) Zellkulturüberstand der Hybridoma-Zelllinie H48

Maus-α-F-MuLV leader-gag (AK34) Zellkulturüberstand der Hybridoma-Zelllinie H34

Fluoreszenzmarkierte Antikörper: Allophycocyanin- (APC)-α-CD4, APC-α-C-D8, Fluores-

ceinisothiocyanat- (FITC)-α-CD11b, FITC-α-CD43 (alle BD Bioscience, Heidelberg)

Phycoerythrin (PE)-MHC-I-AbuAbuLAbuLTVFL-Tetramer BD Bioscience (Heidelberg)

PE-MHC-II- EPLTSLTPRCNTAWNRLKL-Tetramer erhalten von Ton Schumacher,

Nederlands Kanker Instituut, Amsterdam, Niederlande

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Material und Methoden

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3.1.13 Bakterien

Alle Bakterien wurden von Invitrogen (Karlsruhe) bezogen.

Escherichia coli BJ5183 endA1 sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR (StrR)

Escherichia coli DH10B F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 re-

cA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG

Escherichia coli DH5α supE44 ΔlacU169 (Φ80lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gy-

rA96 thi-1 relA1

Escherichia coli PIR2 F- Δlac169 rpoS(Am) robA1 creC510 hsdR514 endA recA1 ui-

dA(ΔMluI)::pir

3.1.14 Zelllinien

HEK-293 Humane Nierenepithelzellen, welche die Ad5 E1-Genregion expri-

mieren, Microbix (Toronto, Kanada)

293T Humane Nierenepithelzellen, welche die Ad5 E1-Genregion und

das große T-Antigen des Simian Virus 40 exprimieren, ATCC#

CRL-11268, LGC Standards (Wesel)

3T6 Murine Fibroblastenzellen, ATCC# CCL-96, LGC Standards (We-

sel)

H34 Hybridoma-Zelllinie, die einen Antikörper gegen das F-MuLV-

Gag-Vorläuferprotein auf infizierten Zellen produziert (erhalten

von Prof. Dr. Ulf Dittmer, Universitätsklinikum Essen)

H48 Hybridoma-Zelllinie, die einen neutralisierenden Antikörper gegen

F-MuLV-Env produziert (erhalten von Prof. Dr. Ulf Dittmer, Uni-

versitätsklinikum Essen)

H720 Hybridoma-Zelllinie, die einen Antikörper gegen F-MuLV-Env

produziert (erhalten von Prof. Dr. Ulf Dittmer, Universitätsklini-

kum Essen)

Vero2-2 Affen-Nierenzellen, die HSV-1 ICP0, ICP4 und ICP27 exprimie-

ren, erhalten von Rozanne Sandri-Goldin (University of California,

Irvine, USA)

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Material und Methoden

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3.1.15 Viren

FV-B Der FV-Komplex wurde als 10%iges (w/v) Homogenat von Milzen

infizierter BALB/c-Mäuse 14 d p.i. hergestellt (erhalten von Prof.

Dr. Ulf Dittmer, Universitätsklinikum Essen)

F-MuLV von Prof. Dr. Ulf Dittmer, Universitätsklinikum Essen, zur Verfü-

gung gestellt

Ad5MVFH von Dr. Dennis Hoffmann, AG PD Dr. O. Wildner, erhalten

Ad5RSVFG von Dr. Thomas Grunwald, AG Prof. Dr. Überla, erhalten

3.1.16 Versuchstiere

Es wurden weibliche Mäuse verwendet, die bei Beginn der Vakzinierungen acht Wochen alt

waren.

BALB/c (H2b/b Fv1d/d Fv2s/s Rfv3s/s) Élevage Janvier (Le Genest St Isle, Frankreich)

CB6F1 (H2b/b Fv1b/d Fv2r/s Rfv3r/s) Charles River WIGA GmbH, Sulzfeld

C57BL/6 (H2b/b Fv1b/b Fv2r/r Rfv3r/r) Élevage Janvier (Le Genest St Isle, Frankreich)

3.2 Methoden

3.2.1 Molekularbiologische Arbeitsmethoden

3.2.1.1 PCR

Für präparative PCRs wurde das Proofreading-Polymerase-Kit von Combizyme nach Herstel-

lerangaben angewendet.

Für Standard-PCRs wurden folgende Temperatur-Zyklen eingesetzt:

1. Denaturierung 95 °C 4:00 min

2. Denaturierung 95 °C 0:30 min

3. Annealing 52 °C 0:30 min

4. Elongation 72 °C 1:00 min

30 Wiederholungen der Schritte 2-4

5. Elongation 72 °C 10:00 min

Die Wahl der Annealing-Temperatur wurde an die Schmelztemperatur der verwendeten Pri-

mer angelehnt, die sich nach folgender Formel ermitteln lässt:

Tm = 69,3 °C + 0,41·(% G+C) °C bei pH 7,0, 165 mM NaCl

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Material und Methoden

31

Je nach Größe der erwarteten Fragmente wurde die Elongationszeit auf bis zu 3 min erhöht.

3.2.1.2 Agarose-Gelelektrophorese von DNA

DNA-Fragmente wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese nach ihrer Größe aufgetrennt.

Die verwendeten 1%igen Gele wurden durch Aufkochen der Agarose in TAE-Puffer, Zusatz

von 0,01 % Ethidiumbromid-Lösung und Erstarren in der Elektrophoresekammer hergestellt.

Die DNA-Proben wurden mit etwa 1/6 Ladepuffer versetzt und in die Taschen des mit TAE-

Puffer überschichteten Gels geladen.

Als Größenstandard wurden 10 µl der DNA 1kb-Leiter von Invitrogen aufgetragen.

3.2.1.3 Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen

Die Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit dem NucleoSpin

Extract-Kit von Macherey-Nagel oder dem Jetsorb Gel Extraction Kit von Genomed nach

Herstellerangaben.

3.2.1.4 TA-Klonierung

3.2.1.4.1 Anhängen eines überhängenden Adenosin

Die durch PCR mit einer Proofreading-Polymerase erhaltenen PCR-Produkte wurden vor der

TA-Klonierung mit einem überhängenden Adenosinrest versehen, hierzu wurden die PCR-

Fragmente in Anwesenheit von Taq-Polymerase und 10 mM ATP 15 min bei 72 °C inkubiert.

3.2.1.4.2 TA-Klonierung

Die TA-Klonierungen wurden mit dem TA-Cloning-Kit von Invitrogen nach Herstelleranga-

ben durchgeführt.

3.2.1.5 Ligation von DNA-Fragmenten

Ligationen wurden mit der T4-DNA-Ligase in dem zugehörigen Puffer durchgeführt. Für

Standard-Ligationen wurden 20 µl-Ansätze verwendet. Hierzu wurden 1 µl Backbone-DNA,

5 µl Insert-DNA, 2 µl Ligase-Puffer, 1 µl T4-Ligase und 11 µl Wasser in einem Reaktions-

gefäß zusammen gegeben und für 1-2 h bei RT oder für längere Zeit bei 16 °C inkubiert.

3.2.1.6 Transformation von Bakterien

3.2.1.6.1 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien

Bakterien einer Übernachtkultur wurden in 2 l SOB-Medium verdünnt und bei 30 °C inku-

biert bis eine OD600 von 0,5 +/- 0,2 erreicht war. Die Bakterien wurden 1 h auf Eis geschüttelt

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Material und Methoden

32

und dann bei 3 200 g und 4 °C für 12 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 1/3 des ur-

sprünglichen Kulturvolumens FSB-Puffer resuspendiert und nach 15 min Inkubation auf Eis

erneut bei 3 200 g und 4 °C für 10 min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1/12,5 des ursprüng-

lichen Volumens FSB resuspendiert und mit 3,5 % des aktuellen Volumens DMSO versetzt.

Nach vorsichtigem Schwenken wurde 5 min auf Eis inkubiert und nach Zusatz weiterer 3,5 %

DMSO nochmals für weitere 10 min. Nach dieser Inkubationszeit wurden die Bakterien porti-

oniert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.

3.2.1.6.2 Transformation chemisch kompetenter Bakterien

50 µl der Bakteriensuspension wurden in einem 13 ml-Röhrchen auf Eis vorgelegt und mit

der zu transformierenden DNA versetzt. Von Ligationsansätzen wurden hierbei 3 µl verwen-

det, die DNA-Menge musste unter 1 µg liegen. Nach Inkubation auf Eis für 30 min erfolgte

der Hitzeschock für 30 s bei 42,2 °C, es wurden 500 µl SOC zugegeben. Nach einer Inkubati-

on bei 37 °C für 1 h wurden die Bakterien auf Selektionsmedium ausplattiert.

3.2.1.6.3 Herstellung elektrokompetenter Bakterien

Bakterien einer Übernachtkultur wurden verwendet, um eine 300 ml-Kultur anzuimpfen. Es

wurde bis zu einer OD600 von ~0,8 bei 32 °C oder 37 °C geschüttelt. Die Zellen wurden in ei-

nem Zentrifugationsbecher gesammelt und 10-60 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden

bei 2 600 g und 4 °C für 10 min pelletiert, dann mit demselben Volumen eiskalten Wassers

(+ 15 % Glycerol) gewaschen und für 30 min pelletiert. Nach Wiederholen des Waschschrit-

tes wurden die Zellen in 20 ml Restvolumen resuspendiert, in ein 50 ml-Gefäß überführt und

nach erneutem 10-minütigen Pelletieren in 5 ml Restvolumen resuspendiert. Die Zellen wur-

den portioniert und in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.

3.2.1.6.4 Transformation elektrokompetenter Bakterien

In einer 2 mm-Küvette wurden 50 µl Bakterien auf Eis vorgelegt und zwischen 0,1 und 1,0 µg

DNA dazu pipettiert. Die Elektroporation erfolgte bei einer Spannung von 2,5 kV. Nach Zu-

satz von 200 µl SOC-Medium wurden die Bakterien auf LB-Platten ausplattiert.

3.2.1.7 Plasmid-Isolation im analytischen Maßstab (Mini-Prep)

Die DNA-Präparation wurde mit dem NucleoSpin Plasmid-Kit nach Herstellerangaben

durchgeführt.

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Material und Methoden

33

3.2.1.8 Plasmid-Isolation im präparativen Maßstab (Maxi-Prep)

300 ml LB- oder TB-Medium wurden mit einer Kolonie oder 200 µl einer Übernachtkultur

angeimpft und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden bei 5 000 g und 4 °C für

10 min pelletiert und anschließend in 10 ml P1 resuspendiert. Nach Zusatz von 10 ml P2 und

sechsmaligem Invertieren wurde für 10 min bei RT inkubiert. Es wurden 10 ml P3 zugesetzt,

erneut sechsmal invertiert und durch einen Faltenfilter filtriert. Dem Filtrat wurden

0,7 Volumen Isopropanol zugesetzt und dann für 30 min bei 4 °C und 12 500 g zentrifugiert.

Das erhaltene Pellet wurde in 4 ml P1 resuspendiert, mit 4,6 g CsCl und 40 µl Ethidiumbro-

midlösung versetzt und in ein Ultrazentrifugationsröhrchen überführt. Die Zentrifugation er-

folgte im Rotor NVT100 bei 20 °C entweder bei 70 000 rpm für 4,5 h, bei 90.000 rpm für

2,5 h oder bei 50 000 rpm über Nacht. Die erhaltenen Banden wurden abgesaugt, das Volu-

men auf etwa 4 ml erweitert und mit TE-gesättigtem 2-Butanol zweimal ausgeschüttelt. Das

Volumen wurde anschließend auf 5 ml eingestellt, mit 0,7 Volumen Isopropanol versetzt und

bei 20 °C und 12 500 g für 30 min zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde mit 70%igem E-

thanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert.

3.2.1.9 Restriktion

Die DNA-Restriktion wurde in 50 µl-Ansätzen durchgeführt. 10 µg Plasmid-DNA einer Ma-

xi-Prep oder 20 µl einer Mini-Prep wurden mit 5 µl des entsprechenden 10x-Puffers, 1 µl je-

des verwendeten Enzyms und der zum Erreichen des Endvolumens benötigten Menge Wasser

versetzt und für 1-3 h bzw. über Nacht inkubiert. Die optimale Pufferzusammensetzung sowie

die erforderliche Inkubationstemperatur wurden den Herstellerangaben entnommen.

3.2.1.10 DNA-Fällung

Die DNA-Lösung wurde mit 0,1 Volumen 3 M NaAc und 3 Volumen Ethanol versetzt und

30 min bei 18 000 g zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde mit 70 % Ethanol gewaschen

und nach erneuter Zentrifugation getrocknet und in Wasser resuspendiert.

3.2.1.11 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) von Proteinen

Für eine 10%ige SDS-PAGE wurden die Gele in der nachstehenden Zusammensetzung ge-

gossen, wobei TEMED und APS als radikale Kettenstarter für die Polymerisierung dienten.

Die Proben wurden vor der SDS-PAGE für 15 min bei 95 °C in Probenpuffer denaturiert.

Als Standard wurden 5 µl des Prestained Precision Protein-Markers aufgetragen. Es wurde ei-

ne konstante Spannung von 150 V für einen Zeitraum von etwa 2 h angelegt, bis die Lauffront

aus dem Gel ausgetreten war.

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Material und Methoden

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Sammelgel Trenngel

Protogel (30 %) 560 μl 4 ml

0,5 M Tris pH 6,8 2 ml -

2 M Tris pH 8,8 - 6 ml

H2O 1,4 ml 1,8 ml

SDS (10 %) 40 μl 120 µl

APS (4 °C) 40 µl 120 µl

TEMED 6 µl 10 µl

3.2.1.12 Western Blot

In einer Blotapparatur wurden die in der SDS-PAGE aufgetrennten Proteine von dem Acryl-

amid-Gel auf Nitrocellulose übertragen. Der Transfer erfolgte bei einer Spannung von 100 V

in einem Zeitraum von einer Stunde.

Anschließend wurde die Membran in Blockpuffer inkubiert (30 min-12 h), um unspezifische

Bindungen der Antikörper an freie Bindestellen zu verhindern.

Nun erfolgte die Inkubation mit dem in Blockpuffer verdünnten Primär-Antikörper für 5-12 h.

Bevor man den sekundären Antikörper hinzugeben konnte, musste der Blot mit PBS-T gewa-

schen werden (4 x 10 min). Der HRP-gekoppelte Zweitantikörper wurde ebenfalls für 1-2 h

auf der Membran inkubiert.

Bevor die Detektion erfolgte, wurde die Membran erneut, wie oben beschrieben, gewaschen.

Die Detektion erfolgte mit dem ECL Chemiglow-Kit. Die Chemilumineszenz wurde im Ha-

mamatsu-Luminometer sichtbar gemacht.

3.2.2 Zytologische Methoden

3.2.2.1 Kultivierung von Zelllinien

Alle verwendeten Zelllinien wurden, je nach Flaschengröße, in 5 ml, 20 ml oder 50 ml des

entsprechenden Mediums bei 37 °C, 5 % CO2 und 90 % Luftfeuchtigkeit kultiviert.

Im Abstand von 3-4 Tagen wurden die Zellen passagiert. Hierzu wurden die Zellen zunächst

mit 1x PBS gewaschen, dann mit Trypsin/EDTA-Lösung inkubiert und schließlich in Medium

resuspendiert. Danach wurde ein Teil dieser Suspension (1/3 – 1/10) in eine neue Kulturfla-

sche mit Medium gegeben.

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Material und Methoden

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3.2.2.2 Zellen einfrieren und auftauen

Um Zellen einzufrieren, wurden diese zunächst mit Trypsin/EDTA-Lösung abgelöst und se-

dimentiert (1 000 g, 10 min, 4 °C). Dann erfolgte eine Aufnahme in 10 % DMSO-haltigem

Zellkulturmedium. Die Zellen konnten in Aliquots bei -193 °C gelagert werden.

Für weitere Verwendungen wurden die Zellen bei 37 °C aufgetaut und in frischem Medium

aufgenommen. Um das DMSO, welches toxisch für die Zellen ist, zu entfernen, wurden die

Zellen zuvor sedimentiert.

3.2.2.3 DNA-Transfektion von Zellen mittels Calcium-Phosphat-Methode

Für die Transfektion von Zellen wurden diese subkonfluent in 25 cm2-Kulturflaschen ausplat-

tiert. Ein Mediumwechsel fand 2 h vor der Transfektion statt. Die Transfektion wurde nach

der Calcium-Phosphat-Methode durchgeführt [150]: Zuerst wurden 31 µl 2 M CaCl2, 5–10 µg

DNA und bidest. Wasser vermischt, so dass ein Ansatz mit dem Endvolumen von 250 µl ent-

stand. Dieser wurde gemischt und tropfenweise mit 250 µl 2x HBS versetzt. Nach einer 10-

minütigen Inkubation bei Raumtemperatur konnte der Transfektionsansatz zu den ausplattier-

ten Zellen gegeben werden. Das Medium wurde nach 5-12 h gewechselt.

3.2.2.4 DNA-Transfektion von Zellen mittels Lipofektion

Die Lipofektion von DNA in Zellen erfolgte mit Lipofectamine 2000 (Gibco) nach Herstel-

lerangaben.

3.2.2.5 Luciferase-Assay

Der Nachweis von Luciferase-Expression erfolgte mit dem Luciferase Detection-Kit (Prome-

ga). Nach Abnehmen des Mediums und Waschen der Zellen mit 1x PBS wurden die Zellen

direkt mit 100 µl Lysepuffer (für eine Vertiefung einer 96-Loch-Platte) überschichtet. Nach

einer Inkubation von 15 min bei Raumtemperatur und 10 min bei -80 °C wurden die abgelös-

ten Zellen in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt und anschließend 15 Sekunden bei

14 000 g zentrifugiert. 50 µl des Überstandes wurden mit 50 µl Luciferase-Substrat gemischt

und die Luciferase-Aktivität über 5 s im Luminometer bestimmt.

3.2.2.6 Virus-Aufreinigung

3.2.2.6.1 Aufreinigung von Adenoviren

Adenoviren wurden in HEK-293-Zellen expandiert, die Überstände von zwei bzw. fünf

300 cm2-Flaschen wurden mit Hilfe des AdenoPack 20- bzw. AdenoPack 100-Kits nach Her-

stellerangaben aufgereinigt.

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Material und Methoden

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3.2.2.6.2 Aufreinigung von Herpesviren

Herpesviren wurden in Vero2-2-Zellen expandiert. Die Überstände von sechs 300 cm2-

Flaschen wurden vereinigt und aufgereinigt. Hierzu wurden die Überstände dreimal eingefro-

ren und aufgetaut, anschließend wurden die Zellreste abzentrifugiert. In Zentrifugenröhrchen

wurden 7 ml 40 % Sucrose-Lösung vorgelegt und mit 30 ml Virus-Überstand überschichtet.

Die Viren wurden durch Zentrifugation bei 25 000 rpm im Rotor SW28 für 2,5 h pelletiert

und anschließend in 500 µl 30 % Nycodenz resuspendiert. In Zentrifugenröhrchen wurden

3 ml 40 % Nycodenz vorgelegt, mit der Virussuspension und weiteren 2 ml 10 % Nycodenz-

Lösung überschichtet. Nach erneuter Zentrifugation bei 25 000 rpm im Rotor SW40 für 2,5 h

wurde die Virus-Bande abgesaugt, portioniert und bei –80 °C gelagert.

3.2.2.7 Titerbestimmung

3.2.2.7.1 TCID50

Die Titerbestimmung wurde nach der TCID50-Methode durch Infektionen von Zellen in

96-Loch-Platten mit Verdünnungen des Virus durchgeführt. In den Vertiefungen einer neuen

Platte wurden zunächst 100 µl Medium vorgelegt, in die erste Vertiefung jeder Reihe wurden

je 10 µl des Virus-Stocks zugesetzt. 10 µl dieser ersten Verdünnung wurden in die nächste

Vertiefung der Reihe überführt und mit dem vorgelegten Medium vermischt. Durch sukzessi-

ves Überführen der Verdünnungen in die folgenden Vertiefungen erhielt man so eine Verdün-

nungsreihe. Das Medium der Zellen wurde entfernt und durch jeweils 100 µl des virushaltigen

Mediums der Verdünnungsreihe ersetzt. Nach 3 Tagen wurde der zytopathische Effekt bzw.

die GFP-Expression beurteilt. Es wurde für jede Verdünnung der Quotient der Vertiefungen

bestimmt, in denen die Zellen einen zytopathischen Effekt zeigten, und die TCID50 nach fol-

gender Formel berechnet:

T = 101+d(S-0,5) mit d = log10 der Verdünnung

S = Summe der Quotienten

Das Ergebnis gibt den Titer des Virus-Stocks in TCID50 für das eingesetzte Volumen an.

3.2.2.7.2 Titerbestimmung über optische Dichte

Die Virusstocks wurden in OD-Lyse-Puffer verdünnt und für 15 min bei 56 °C unter Schüt-

teln inkubiert. Von diesem Ansatz wurde die optische Dichte bei 260 nm bestimmt und die

optischen Partikeleinheiten nach folgender Formel berechnet:

virale Partikel/ml = OD260·Verdünnungsfaktor·1,1·1012

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Material und Methoden

37

3.2.3 Immunologische Methoden

3.2.3.1 Vakzinierungen

Die Vakzinierungen wurden

nach einem Prime-Boost-

Schema mit einem Abstand

von drei Wochen durchge-

führt (Abb. 3.1). Hierzu wur-

den die Env- und Gag-

exprimierenden Viren in ei-

nem 1:1-Verhältnis gemischt

und eine Konzentration von

1010 viralen Partikeln

(vp)/100 µl in PBS ein-

gestellt. Die Viren wurden entweder intramuskulär in beide M. gastrocnemii (jeweils 50 µl),

intradermal (100 µl) im Bereich der Flanke oder in die Plantarseite beider Hinterpfoten (je-

weils 50 µl) gespritzt.

3.2.3.2 Belastungsinfektion

Die Belastungsinfektion wurde drei Wochen nach der Boost-Immunisierung intravenös verab-

reicht (Abb. 3.1). C57BL/6-Mäuse wurden mit 3 000 Milz-Fokus-bildenden Einheiten (spleen

focus forming units, SSFU) FV in 100 µl PBS belastet, CB6F1-Mäuse mit 500 SFFU FV.

3.2.3.3 Palpation der Milz

Nach der Belastungsinfektion wurde mindestens einmal pro Woche die Milz palpiert, um den

Krankheitsverlauf zu verfolgen (Abb. 3.1). Die Palpation erfolgte unter Inhalations-Isofluran-

Narkose, die Milzgrößen wurden Kategorien von 1 (nicht vergrößert) bis 4 (sehr stark vergrö-

ßert) zugeordnet, diese entsprechen den folgenden Milzgewichten: 1: bis 0,5 g; 1,5: 0,5-0,6 g;

2: 0,6-0,8 g; 2,5: 0,8-1,2 g; 3: 1,2-1,7 g; 4: ab 1,7 g.

3.2.3.4 Blutentnahme

Zur Bestimmung der Antikörperantwort wurden den vakzinierten Mäusen eine Woche nach

der Boost-Immunisierung unter Inhalations-Isofluran-Narkose etwa 200 µl Blut retroorbital

entnommen. Zur Serum-Gewinnung wurde das geronnene Blut 10 min bei 1 000 g zentrifu-

giert und das Serum abgenommen. Zur Bestimmung der Viruslast wurde den belasteten Mäu-

21 601 42 52

Prime-Immunisierung FV-Infektion

Tage

Boost-Immunisierung

Bestimmung der Viruslast

in Milz

Palpation der Milz

Bestimmung von Virämie und neutralisierenden

Antikörpern Abb. 3.1 Immunisierungsschema Die Immunisierung erfolgte zweimal im Abstand von 21 d. Die Belas-tungsinfektion erfolgte 21 d nach der zweiten Immunisierung. Der In-fektionsverlauf wurde duch Palpation der Milz verfolgt, die Virämiewurde 10 d p.i., die Viruslast in der Milz 18-21 d p.i. bestimmt.

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Material und Methoden

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sen 10 d nach Belastungsinfektion 5 Tropfen Blut entnommen und in Eppendorf-Gefäßen

aufgefangen, in denen 2,5 µl Heparin vorgelegt wurden. Das Plasma wurde durch Zentrifuga-

tion von den Blutzellen getrennt und bei –80 °C gelagert.

3.2.3.5 Bestimmung der Viruslast

3.2.3.5.1 Bestimmung der Plasma-Virämie

Zur Bestimmung der Virämie wurde den Mäusen 10 d nach Belastungsinfektion eine geringe

Menge Blut abgenommen und hieraus das Plasma gewonnen (Abb. 3.1). In einer 96-Loch-

Platte wurden 100 µl PBS in der ersten Vertiefung bzw. 80 µl PBS in den fünf folgenden Ver-

tiefungen vorgelegt. In die erste Vertiefung wurden 10 µl Plasma zugegeben, durch Überfüh-

ren von je 40 µl in die nächsten Vertiefungen wurde eine Verdünnungsreihe hergestellt. In das

Medium von am Vortag in 24-Loch-Platten ausplattierten 3T6-Zellen

(7,5·103 Zellen/Vertiefung) wurden zunächst 10 µl Polybren (800 µg/ml) und anschließend

50 µl der Plasma-Verdünnungen zugesetzt. Die Zellen wurden 3-4 d bis zur Konfluenz inku-

biert und anschließend mit Ethanol fixiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS+0,1 % BSA

wurden die Zellen mit AK720 (200 µl/Vertiefung) für 30 min bei RT inkubiert. Nach erneu-

tem Waschen folgte die Inkubation mit dem Zweitantikörper Ziege-α-Maus-HRP (1:300 ver-

dünnt) für 30 min bei RT. Nach erneutem Waschen wurden die Zellen 15 min mit

2 ml/Vertiefung der AEC-Gebrauchslösung inkubiert. Anhand der erkennbaren Foki wurde

die Anzahl Fokus-bildender Einheiten (focus forming units; FFU)/ml Plasma berechnet.

3.2.3.5.2 Immuncytochemische Bestimmung der Viruslast in der Milz im infectious cen-

ter- (IC-) Assay

18-21 d nach der Belastungsinfektion wurden die infizierten Mäuse durch cervikale Disloka-

tion getötet und die Milzen entnommen (Abb. 3.1). Die Milzen wurden zunächst gewogen

und dann in 5 ml PBBS auf kleinen Metallsieben zerrieben, die Zellsuspension wurde in

15 ml-Gefäße überführt und auf 10 ml mit PBBS aufgefüllt. Die Zellkonzentration wurde be-

stimmt und auf 1·108 Zellen/ml in PBBS eingestellt. In einer 24-Loch-Platte wurden je Vertie-

fung 1,8 ml DMEM vorgelegt, in die erste Vertiefung wurden 200 µl der Milzzellsuspension

zugegeben und durch Weiterpipettieren von je 200 µl Verdünnungsreihen hergestellt. 1 ml

dieser Milzzellverdünnungen wurde am Vortag in 6-Loch-Platten ausplattierten 3T6-Zellen

(2·104 Zellen/Vertiefung) zugesetzt. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz inkubiert und an-

schließend fixiert und inkubiert wie für den Virämie-Assay beschrieben. Anhand der Zahl der

angefärbten Foki wurde die Viruslast als infektiöse Zentren (IC)/Milz berechnet.

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Material und Methoden

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3.2.3.5.3 Bestimmung der Viruslast in der Milz durch quantitative PCR

Aus 2·107 wie im vorigen Abschnitt beschrieben isolierten Milzzellen wurde die Gesamt-

RNA isoliert, hierzu wurden die Milzzellen bei 1 000 g für 10 min pelletiert und in 400 µl

TriZol aufgenommen. Die RNA-Präparation erfolgte nach Herstellerangaben. Vor der quanti-

tativen PCR wurde zunächst eine reverse Transkription durchgeführt, es wurde das Quantitect

Probe RT-PCR Kit von Qiagen verwendet. Hierzu wurden 5 µl der zu untersuchenden RNA,

1 µl des Primers FVdown, 1 µl der 6-Fam/Tamra-markierten Sonde, 2,8 µl Wasser, 10 µl Puf-

fer und 0,2 µl Enzym-Mix zusammenpipettiert, für die reverse Transkription wurden die Pro-

ben 20 min bei 50 °C inkubiert, danach folgte eine Inkubation bei 95 °C für 5 min zur Inakti-

vierung der Reversen Transkiptase. In Lightcycler-Kapillaren wurde je 1 µl des Primers FVup

vorgelegt und der RT-Ansatz hinzugefügt, die Kapillaren wurden bei 1 000 g 1 min zentrifu-

giert. Die quantitative PCR wurde als Zwei-Schritt-PCR durchgeführt, Annealing und Elonga-

tion fanden bei 60 °C statt.

Die zur Quantifizierung verwendeten Standards waren Verdünnungen bekannter Konzentrati-

on des Produkts einer in vitro-Transkription mit den Primern FVup und FVdown mit einem

Volllänge-F-MuLV-Plasmid als Template, sie wurden von Nicole Gerlach (Universitätsklini-

kum Essen) zur Verfügung gestellt.

3.2.3.6 Bestimmung der humoralen Immunantwort

3.2.3.6.1 Bindende Antikörper

96-Loch-Maxisorp-Platten wurden mit 0,5 µg Gesamtvirusantigen in 100 µl Coatingpuffer

pro Vertiefung über Nacht inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS+0,5 % Tween

wurden die Vertiefungen mit PBS+10 % FCS für 30 min bei RT geblockt. Mit PBS+10 %

FCS wurden serielle Verdünnungen der Serumproben hergestellt, je 100 µl wurden in eine

Vertiefung der mit Virusantigen beschichteten Platte gegeben und für 1 h bei 4 °C inkubiert.

Nach mehrmaligem Waschen wurden je Vertiefung 100 µl einer 1:10 000-Verdünnung des

Antikörpers Kaninchen-α-Maus-Ig-HRP zugesetzt und für 1 h bei RT inkubiert. Nach erneu-

tem Waschen wurden je Vertiefung 100 µl des Substrats TMB+ zugegeben und für 15 min bei

RT im Dunkeln inkubiert, die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µl 2 N Schwefelsäure

abgestoppt und die Absorption bei 450 nm bestimmt. Das Dreifache des mit Serum von nai-

ven Mäusen erhaltenen Wertes wurde als Grenzwert angenommen.

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Material und Methoden

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3.2.3.6.2 Neutralisierende Antikörper

Mäusen wurde 7 d nach Boost-Immunisierung bzw. 10 d nach Belastungsinfektion Blut abge-

nommen und das Serum bzw. Plasma isoliert. Das Plasma wurde 30 min bei 56 °C inaktiviert,

danach wurden in PBS Verdünnungen, beginnend mit 1:4 und dann mit 1:2 weitergehend,

hergestellt. In einer 96-Loch-Platte wurden 15 µl einer F-MuLV-Verdünnung, die so gewählt

wurde, dass man in Abwesenheit von neutralisierenden Antikörpern etwa 30 Foki in der ab-

schließenden Färbung erhielt, und 10 µl einer 1:2-Verdünnung von Meerschweinchen-

Komplement gemischt und zu 15 µl der Plasma-Verdünnungen gegeben. Als Positivkontrolle

wurden 15 µl des AK48, als Negativkontrolle 15 µl PBS an Stelle der Plasmaverdünnung ein-

gesetzt. Die Ansätze wurden 1 h bei 37 °C inkubiert und anschließend mit 120 µl kaltem PBS

versetzt. 50 µl dieser Ansätze wurden zu am Vortag in 24-Loch-Platten ausplattierten 3T6-

Zellen (7,5·103 Zellen/Vertiefung), die zuvor mit 10 µl Polybren (800 µg/ml) versetzt worden

waren, gegeben, welche dann 3-4 d bis zur Konfluenz inkubiert und anschließend wie für den

Virämie-Assay beschrieben fixiert und gefärbt wurden. Die Verdünnungen, die eine Redukti-

on der Anzahl der Foki um mindestens 50 % bewirkten, wurden als positiv gewertet.

3.2.3.7 Bestimmung der zellulären Immunantwort

3.2.3.7.1 Tetramerfärbung

Zur Analyse von Antigen-spezifischen T-Zellen

wurde die Tetramer-Technologie angewendet. Diese

basiert darauf, dass an Fluorochrom-gekoppeltes

Streptavidin gebundene MHC-Peptid-Komplexe

(Abb. 3.2; [151]) an Antigen-spezifische T-Zell-

Rezeptoren binden. Die so markierten T-Zellen kön-

nen durchfluss-zytometrisch quantifiziert werden.

Die Milzzellen infizierter Mäuse wurden 3 d nach

der Belastungsinfektion gewonnen wie in 3.2.3.5.2

beschrieben. Etwa 106 Zellen wurden in eine 96-

Loch-Platte überführt und mit 200 µl FACS-Puffer gewaschen. Anschließend wurden die Zel-

len in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit 1 µl PE-MHC-I-AbuAbuLAbuLTVFL-

Tetramer, 0,3 µl APC-α-CD8 und 0,3 µl FITC-α-CD43 für 30 min bei RT bzw. mit 1 µl PE-

MHC-II- EPLTSLTPRCNTAWNRLKL-Tetramer für 2 h bei 37 °C und anschließend mit

0,3 µl APC-α-CD4 und 0,3 µl FITC-α-CD11b für 30 min bei RT gefärbt. Nach der Färbung

Abb. 3.2 MHC I- und –II-Tetramere MHC I- (A) und MHC II-Tetramere (B)bestehen aus an Fluorochrom-gekoppeltesStreptavidin gebundenen, Peptid-beladenenMHC I- bwz. MHC II-Molekülen undkönnen zur Quantifizierung Antigen-spezifischer T-Zellen genutzt werden.[151]

A B

MHC-Molekül

Fluorochrom- gekoppeltes Streptavidin

Peptid

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Material und Methoden

41

wurden die Zellen mit FACS-Puffer gewaschen, in FACS-Flow aufgenommen, mit 3 µl

7-AAD versetzt und durchfluss-zytometrisch analysiert.

3.2.3.7.2 Proliferationstest

Die Milzzellen vakzinierter Mäuse wurden 14 d nach der Boostimmunisierung gewonnen wie

in 3.2.3.5.2 beschrieben und mit PBS auf eine Konzentration von 1·108 Zellen/ml eingestellt.

1 ml der Zellsuspension wurden mit 1 ml einer 6 µM CFSE-Lösung gemischt und 3 min in-

kubiert. Anschließend wurden 13 ml PBS zugegeben und die Zellen zweimal mit PBS gewa-

schen und anschließend in RPMI-Medium aufgenommen. 107 Milzzellen wurden anschlie-

ßend in eine Vertiefung einer 24-Loch-Platte überführt und mit 106 dendritischen Zellen, die

aus dem Knochenmark naiver CB6F1-Mäuse gewonnen, 7 d in Gegenwart von GM-CSF

(5 ng/ml) und IL-4 (1 ng/ml) kultiviert [152] und vor dem Test mit den Peptiden AbuAbuLA-

buLTVFL und EPLTSLTPRCNTAWNRLKL beladen worden waren, gemischt. Die Zellen

wurden 7 d inkubiert und anschließend wie im vorigen Abschnitt beschrieben mit den Anti-

körpern APC-α-CD4 und PE-α-CD8 gefärbt und durchfluss-zytometrisch analysiert.

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Ergebnisse

42

4. Ergebnisse

4.1 Herstellung der Impfvektoren

4.1.1 Herstellung der adenoviralen Impfvektoren

Für die Vakzinierungen wurden rekombinante, replikations-defekte Adenoviren mit Hilfe des

AdEasy-Systems hergestellt (Abb. 4.1). Hierzu wurden zunächst die Transgene in das Trans-

ferplasmid pAdTrack-CMV bzw. pShuttle-CMV [148] kloniert. Durch homologe Rekombina-

tion mit pAdEasy-1 in E. coli BJ5183 [148] und anschließende Transfektion der Adenovirus-

Plasmidvektoren in HEK-293-Zellen wurden die infektiösen rekombinanten AdV hergestellt.

Zur Herstellung der Fiber-Chimären, in denen die Fiber-Kopf- und -Schaft-Domänen durch

die des Typ 35 ersetzt sind (Ad5F35), erfolgte die Rekombination mit dem modifizierten

AdEasy-Plasmid pAdEasyF35 [149].

Abb. 4.1 AdEasy-System Das Transgen X wird zunächst in das Plasmid pAdTrack-CMV kloniert und dann durch homologe Rekombinati-on in E. coli BJ5138 mit pAdEasy in das AdV-Genom (ΔE1 ΔE3) eingebracht. Nach der Linearisierung wird das Plasmid pAd5X zur Virus-Produktion in HEK-293-Zellen transfiziert [148].

linkerhomologerArm

ori

Kanr

pAdTrack-CMV

rechter homologerArm

LITR

Verpackungs-sequenz

Transgen-kassetteRITR

CMV-Promotor

CMV-PromotorGFP

Transgen X

pA

pA

rechter homologerArm

linker homologerArm

ori Kanr

pAd5X

RITR

rechter homologerArm

linkerhomologerArm

ori Ampr

pAdEasy-1

RITR

LITRVerpackungs-sequenz

Transgenkassette

homologeRekombination

CMV-

Prom

otor

CM

V-Pr

omot

orG

FP

Tran

sgen

X

pA pALITR

Verp

acku

ngss

eque

nz

RITR

Ad5 E1 E3Δ Δ

Linearisierung (PacI)

ΔE3

Ad5X

PacIPacI

PmeI

Linearisierung(PmeI)

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Ergebnisse

43

Es wurden zunächst rekombinante Ad5 und Ad5F35 hergestellt, welche die F-MuLV-Proteine

Env und Gag kodieren. Die Klonierungsstrategien sind in Tab. 4.1 zusammengefasst, eine

schematische Darstellung der Vakzinierungsvektoren findet sich in Abb. 4.2.

Tabelle 4.1 Klonierungsstrategien zur Herstellung der Env- und Gag-kodierenden adenoviralen Impfvek-toren Plasmid Klonierungsstrategie

pAdTrack-env PCR-Produkt envHindIIISalI (Template pCG-env; HindIII, SalI) aus pGem-envHindIIISalI in pAdTrack-CMV (HindIII, SalI)

pAdTrack-leadergag PCR-Produkt leadergag (Template pCG-leadergag; HindIII, XbaI) aus pGem-leadergagHindIIIXbaI in pAdTrack-CMV (HindIII, XbaI)

Abb. 4.2 Env-und Gag-kodierende AdV Mit Hilfe des AdEasy-Systems wurden rekombinante AdV hergestellt, welche die F-MuLV-Proteine Env und Gag kodieren. Die Transgene ersetzen die AdV E1-Region, die E3-Region des AdV ist deletiert. Des Weiteren wurden rekombinante Ad5 hergestellt, welche die murinen Zytokine IL2, IL12,

IL15, IL18, IL21 und GM-CSF kodieren. Die Klonierungsstrategien sind in Tab. 4.2 zusam-

mengefasst, eine schematische Darstellung des Virusgenoms findet sich in Abb. 4.3.

Ebenfalls in Ad5- und Ad5F35-Vektoren wurden genetische Fusionen des Env-Proteins kon-

struiert; durch das Anhängen einer PEST-Sequenz sollte die Degradation des Env-Proteins

und damit die Präsentation von Env-Epitopen auf MHC I-Komplexen erhöht werden. Durch

die Fusion der extrazellulären Domäne des Env-Proteins mit dem mittelgroßen Hepatitis B-

Virus-Oberlächenprotein M-HBsAg, der extrazellulären Domäne des murinen T-Zell-

Korezeptors CTLA4 oder dem adenoviralen Kapsid-Protein pIX sollte die Immunogenität des

Env-Proteins und die humorale Immunantwort erhöht werden.

GFP pACM

V-Pr

omot

or

CM

V-Pr

omot

orpALI

T RVe

rpac

kung

sseq

uenz

RITR

ΔE3

Ad5envenv

Ad5gaggag

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Ergebnisse

44

Tabelle 4.2 Klonierungsstrategien zur Herstellung der Zytokin-kodierenden adenoviralen Impfvektoren

Plasmid Klonierungsstrategie

pILlinker synthetischer Linker illinker in pBluescript (SacI, KpnI)

pILlinkermIL2 mIL2 (SalI, NheI) aus pGT60-mIL2 in pILlinker (SalI, XbaI)

pILlinkermIL18 mIL18 (NcoI, PstI) aus pCR3.1-mIL18 in pILlinker (NcoI, PstI)

pILlinkermIL21 mIL21 (NcoI, NheI) aus pORF9-mIL21 in pILlinker (NcoI, XbaI)

pAdTrackmIL2 mIL2 (KpnI, XhoI) aus pILlinkermIL2 in pAdTrack-CMV (KpnI, XhoI)

pAdTrackmIL12 mIL12 (NdeI (blunt), NotI) aus pUMVC3-mIL12 in pAdTrack-CMV (BglII (blunt), NotI)

pAdTrackmIL15 PCR-Produkt mIL15SalIKpnINotI (Template pORF9-mIL15; SalI, NotI) in pAdTrack-CMV (SalI, NotI)

pAdTrackmIL18 mIL18 (BglII, XhoI) aus pILlinkermIL18 in pAdTrack-CMV (BglII, XhoI)

pAdTrackmIL21 mIL21 (BglII, XhoI) aus pILlinkermIL21 in pAdTrack-CMV (BglII, XhoI)

pAdTrackmGM-CSF mGM-CSF (SalI, NheI (blunt)) aus pGT60-mGM-CSF in pAdTrack-CMV (SalI, EcoRV)

Abb. 4.3 Zytokin-kodierende AdV Mit Hilfe des AdEasy-Systems wurden rekombinante AdV hergestellt, welche die murinen Zytokine IL2, IL12, IL15, IL18, IL21 und GM-CSF kodieren. Tabelle 4.3 Klonierungsstrategien zur Herstellung der Env-Fusionsprotein-kodierenden adenoviralen Impfvektoren

Plasmid Klonierungsstrategie

Env-PEST-Sequenz-Fusion

pSexpestlinker synthetischer Linker pestlinker in pSex (SmaI)

GFP pACM

V-Pr

omot

or

CM

V-Pr

omot

orpALI

T RVe

rpac

kung

sseq

uenz

RITR

ΔE3

Ad5ILxILx

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Ergebnisse

45

Env-PEST-Sequenz-Fusion (fortges.)

pSexenvpest PRC-Produkt env-stopNotISalI (Template pCG-env; NotI, SalI) in pSexpestlinker (NotI, SalI)

pAdTrackenvpest envpest aus pSexenvpest (BglII, HindIII) in pAdTrack-CMV (BglII, HindIII)

Env-CTLA4-Fusion

pSexsftpdlinker synthetischer Linker sftpdlinker in pSex (SmaI)

pSex-trimlinker Religat aus MfeI-restringiertem pSexsftpdlinker

pSexCTLA4-trim PCR-Produkt CTLA4EcoRISalI (Template pUC9-CTLA4; EcoRI, SalI) in pSex-trimlinker (EcoRI, SalI)

pBRlinkerBR synthetischer Linker linkerBR in pBROW12 (SpeI, NdeI)

pBRCTLA4-trim CTLA4-trim (BglII, HindIII) aus pSexCTLA4-trim in pBRlinkerBR (BglII, HindIII)

pBRCTLA4-trimenv PCR-Produkt env-stoptmNotIHindIII (Template pCG-env; NotI, HindIII) in pBRCTLA4-trim (NotI, HindIII)

pAdTrackCTLA4env CTLA4-trimenv (BglII, HindIII) aus pBRCTLA4-trimenv in pAdTrack-CMV (BglII, HindIII)

Env-pIX-Fusion

pShuttledpIX Religat aus MfeI-, BglII-, Mung Bean-Nuclease-restringiertem pShuttle

pShuttledpIXlinker synthetischer Linker linkerdpIX in pShuttledpIX (KpnI, XhoI)

pShuttledpIXCMV CMVpA (EcoRI, BamHI) aus pTLCMVpA in pShuttledpIXlinker (MfeI, BglII)

pSexpIX-trim PCR-Produkt pIXEcoRISalI (Template pShuttle; EcoRI, SalI) in pSex-trimlinker (EcoRI, SalI)

pBRpIX-trim pIX-trim (BglII, HindIII) aus pSexpIX-trim in pBRlinkerBR (BglII, HindIII)

pBRpIX-trimenv PCR-Produkt env-stoptmNotIHindIII (Template pCG-env; NotI, HindIII) in pBRpIX-trim (NotI, HindIII)

pShuttlepIXenv pIX-trimenv (BglII, HindIII) aus pBRpIX-trimenv in pShuttle-dpIXCMV (BglII, HindIII)

Env-HBsAg-Fusion mit Trimerisierungssequenz

pSexHBsAgpreS2Ssftpd PCR-Produkt HBsAgpreS2S-stopEcoRISalI (Template HBV-positives Patientenserum; EcoRI, SalI) in pSexsftpdlinker (EcoRI, SalI)

pBRHBsAgpreS2Ssftpd HBsAgpreS2Ssftpd (BglII, HindIII) aus pSexHBsAgpreS2Ssftpd in pBRlinkerBR (BglII, HindIII)

pBRHBsAgpreS2Ssftpdenv PCR-Produkt env-stoptmNotIHindIII (Template pCG-env; NotI, HindIII) in pBRHBsAgpreS2Ssftpd (NotI, HindIII)

pAdTrackHBsAgpreS2ssftpdenv HBsAgpreS2Ssftpdenv (BglII, HindIII) aus pBRHBsAgpreS2Ssftpdenv in pAdTrack-CMV (BglII, HindIII)

Env-HBsAg-Fusion ohne Trimerisierungssequenz

pSexHBsAgpreS2S-trim PCR-Produkt HBsAgpreS2S-stopEcoRISalI (Template HBV-positives Patientenserum; EcoRI, SalI) in pSex-trimlinker (EcoRI, SalI)

pBRHBsAgpreS2S-trim HBsAgpreS2S-trim (BglII, HindIII) aus pSexHBsAgpreS2S-trim in pBRlinkerBR (BglII, HindIII)

pBRHBsAgpreS2S-trimenv PCR-Produkt env-stoptmNotIHindIII (Template pCG-env; NotI, HindIII) in pBRHBsAgpreS2S-trim (NotI, HindIII)

pAdTrackHBsAgpreS2S-trimenv HBsAgpreS2S-trimenv (BglII, HindIII) aus pBRHBsAgpreS2S-trimenv in pAdTrack-CMV (BglII, HindIII)

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Ergebnisse

46

GFP pACM

V-Pr

omot

or

CM

V-Pr

omot

orpALI

TRVe

rpac

kung

sseq

uenz

RITR

ΔE3

Ad5envpest

env PEST-Sequenz

Ad5CTLA4env

env (ohne TM)CTLA 4

(extrazelluläre Domäne)

Ad5HBsAgsftpdenv

HBsAgpreS2S Trimerisierungs-sequenz env (ohne TM)

pIXenv

pIX env (ohne TM)

CMV-

Prom

otor

pALITR

Verp

acku

ngss

eque

nz

RITR

ΔE3

Ad5HBsAg-trimenv

env (ohne TM)HBsAgpreS2S

Abb. 4.4 Env-Fusionsprotein-kodierende AdV Mit Hilfe des AdEasy-Systems wurden rekombinante adenovirale Vektoren hergestellt, welche Fusionsproteine des F-MuLV-Env mit einer PEST-Sequenz, bzw. der extrazellulären Domäne des F-MuLV-Env mit der extrazel-lulären Domäne von CTLA4, dem HBV-Oberflächenprotein M-HBsAg bzw. dem adenoviralen Kapsid-Protein pIX exprimieren.

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Ergebnisse

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Das HBsAg-Env-Fusionsprotein wurde in zwei Varianten konstruiert, in einem Konstrukt

sind die beiden Proteine durch einen acht Aminosäuren langen Linker verbunden (HBsAg-

trimenv). In dem anderen Konstrukt befindet sich zwischen HBsAg und Env die neck region

genannte Trimerisierungssequenz des Surfactant-Protein D (HBsAgsftpdenv) [153]. Die Klo-

nierungsstrategien sind in Tab. 4.3 zusammengefasst, eine schematische Darstellung der Ge-

nome der Vakzinierungsvektoren findet sich in Abb. 4.4.

Die Integrität der klonierten Plasmide wurde durch Restriktions-, Sequenzierungs- sowie

durch Western Blot-Analysen kontrolliert (Daten nicht gezeigt).

4.1.2 Herstellung der herpesviralen Impfvektoren

Die Herstellung der rekombinanten HSV-Vektoren erfolgte mit Hilfe des HSVQuik-Systems

(Abb. 4.5). Die Vektoren besitzen Deletionen beider Kopien des γ34.5, die Insertion des

Transgens erfolgt in die ICP6-Region.

Abb. 4.5 HSVQuik-System Die das Transgen X enthaltende Expressionskassette wird zunächst in das Plasmid pTransfer kloniert, durch Flp-Rekombination in Bakterien wird die gesamte Sequenz des pTransfer-X in das BAC fHSVQuik-1 eingebracht. Durch Cre-loxP-Rekombination werden die BAC-Rückgratsequenzen in Vero-Zellen aus dem HSV-Genom ent-fernt, es entsteht das rekombinante Virus HSV-X [147]. Durch eine Flp-Rekombinase-vermittelte Rekombination wird zunächst der pTransfer-Vektor

in das BAC fHSVQuik-1 integriert, das rekombinierte BAC wird in Vero2-2-Zellen transfi-

ziert, in denen durch eine Cre-loxP-Rekombination die BAC-Sequenzen aus dem Virusgenom

entfernt werden. Durch Insertion einer Kanamycin-Resistenz-Kassette in die für ICP27 kodie-

rende Sequenz wurde das System um die Möglichkeit, replikations-defekte Viren herzustel-

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Ergebnisse

48

len, erweitert. Tabelle 4.4 gibt eine Übersicht über die Klonierungsstrategien zur Herstellung

der Transfervektoren und des veränderten HSV-BAC. Es wurden auf diese Weise die replika-

tions-kompetenten Vektoren HSVenv und HSVgag sowie die replikations-defekten Vektoren

HSVΔ27env und HSVΔ27gag hergestellt (Abb. 4.6).

Tabelle 4.4 Klonierungsstrategien zur Herstellung der herpesviralen Impfvektoren

Plasmid Klonierungsstrategie

pTL synthetischer Linker TL aus TLsense und TLantisense in pTransfer (EcoRI, BamHI)

pTLCMVpA PCR-Produkt CMVMCSpA (BamHI, EcoRI) in pTL (BamHI, EcoRI)

pTLenv PCR-Produkt envNotIBstZ17I (Template pCG-env; NotI, BstZ17I) aus pGem-envNotIBstZ17I in pTLCMVpA (NotI, BstZ17I)

pTLgag PCR-Produkt leadergagNotIAflII (Template pCG-leadergag; NotI, AflII) aus pGem-leadergagNotIAflII in pTLCMVpA (NotI, AflII)

pEBHICP27Kan Kan (HindIII, AflII, Mung Bean Exonuklease) aus pBROW12-2Kan in pEBHICP27 (SalI, Mung Bean Exonuklease)

fHSVΔ27 homologe Rekombination des NdeI, AvrII-Kan-Fragments aus pEBH-ICP27Kan mit fHSVQuik-1

a bx x

Δγ34.5jΔγ34.5

GFP env / gag

x x

Δγ34.5jΔγ34.5

GFP env / gag

CMV-IE-Promotor

CMV-IE-Promotor

UL ΔICP6 ICP27 b’a’c’ US c

a b UL Δ ICP6 Δ ICP27 b’a’c’ US c

HSVenv /HSVgag

HSVΔ27env /HSVΔ27gag x

Abb. 4.6 Herpesvirale Impfvektoren Mit Hilfe des HSVQuik-Systems wurden replikations-kompetente (oben) und replikations-defekte (unten) HSV-Vektoren hergestellt, welche die F-MuLV-Proteine Env bzw. Gag exprimieren.

Die Integrität der klonierten Plasmide wurde durch Restriktions-, Sequenzierungs- sowie

durch Western Blot-Analysen kontrolliert (Daten nicht gezeigt).

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Ergebnisse

49

4.2 Impfungen mit Env- und Gag-kodierenden adenoviralen Vektoren

4.2.1 Ermittlung der geeigneten Route der Vektor-Applikation

Zunächst sollte festgestellt werden, welche Route der Vektor-Applikation die beste Immun-

antwort erzielt. Hierzu wurden C57BL/6-Mäuse zweimal im Abstand von drei Wochen mit

1010 vp Ad5eg (5·109 vp Ad5env und 5·109 vp Ad5gag) entweder intradermal in die Flanke,

intramuskulär in beide Musculi gastrocnemii oder in die Plantarseite beider Hinterpfoten inji-

ziert. Drei Wochen nach der Belastungsinfektion wurden die Milzen entnommen und in einem

IC-Assay die Viruslast bestimmt. Wie in Abb. 4.7 gezeigt wird, lag die mediane Viruslast

nach der Belastungsinfektion bei den unvakzinierten Kontrolltieren bei 1 660 infektiösen

Zentren (IC)/Milz. Die mediane Viruslast der plantar, intramuskulär und intradermal immuni-

sierten Mäuse betrug 0, 430 bzw. 260 IC/Milz. Die Viruslast in plantar immunisierten Mäusen

war somit signifikant niedriger als die der Kontrolltiere (P=0,002; Mann-Whitney-

Rangsummen-Test), während die anderen Vakzinierungsgruppen keine statistische Signifi-

kanz erreichten. Für die folgenden Vakzinierungsexperimente wurde daher die Immunisie-

rung in die Plantarseite der Hinterpfoten gewählt.

4.2.2 Einfluss von Zytokin-Koexpression auf den Impferfolg

Als weitere Strategie zur Verbesserung des Impferfolges wurde die Koexpression von Zytoki-

nen von adenoviralen Vektoren untersucht. Für Protein- und DNA-Immunisierungen wird von

einer verbessertern Immunantwort nach Koapplikation von Zytokinen bei der Vakzinierung

Abb. 4.7 Ermittlung der geeigneten Routeder Vektor-Applikation C57BL/6-Mäuse wurden plantar, intramuskuläroder intradermal mit Ad5env und -gag immuni-siert, 3 Wochen nach der Belastungsinfektionwurde die Viruslast im IC-Assay bestimmt. DieVakzinierung mit adenoviralen Vektoren führtezu einer niedrigeren Viruslast nach der Belas-tungsinfektion, wobei die Immunisierung in dieHinterpfoten den besten Immunschutz und einesignifikante Reduktion der Viruslast bewirkte.

0

2000

4000

6000

8000

plantar

intramusk

ulär

intraderm

al

Kontrolle

IC /

Milz

P=0,002

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Ergebnisse

50

berichtet, da die Zytokine die Immunogenität dieser Vakzine erhöhte und immunstimulato-

risch wirkte [128-131]. Um den Effekt auf eine AdV-basierte Vakzine zu testen, wurden

Mäuse mit Ad5-basierten Vektoren geimpft, und sowohl bei der Prime- als auch bei der

Kontrolle

Ad5GFP

Ad5IL2

Ad5IL12

Ad5IL15

Ad5IL18

Ad5IL21

Ad5GM-C

SF0

1,0×10 3

2,0×10 3

3,0×10 3

4,0×10 3

5,0×10 3

6,0×10 3

7,0×10 3

IC /

Milz

Ad5GFP

Ad5IL2

Ad5IL12

Ad5IL15

Ad5IL18

Ad5IL21

Ad5GM-C

SF

Ad5GFP

Ad5IL2

Ad5IL12

Ad5IL15

Ad5IL18

Ad5IL21

Ad5GM-C

SF

plantar Ad5eg + i.m. Ad5eg + i.d. Ad5eg +

*

**

* * **

*

*

*

**

**

* **

Abb. 4.8 Einfluss von Zytokin-Koexpression auf den Impferfolg in C57BL/6-Mäusen C57BL/6-Mäuse wurden über verschiedene Routen mit Env- und Gag-exprimierenden Ad5-basierenden Vekto-ren geimpft, zusätzlich wurden IL2-, IL12-, IL15-, IL18-, IL21-, GM-CSF- oder als Kontrolle GFP-exprimierende Ad5-Vektoren appliziert. Die Koexpression führte nicht zu einem verbesserten Impferfolg. n = 6; * = signifikant niedriger als die unvakzinierten Kontrollmäuse

Abb. 4.9 Einfluss von Zytokin-Koexpressionauf den Impferfolg in CB6F1-Mäusen CB6F1-Mäuse wurden mit Ad5eg und Zytokin-exprimierenden Ad5-Vektoren durch plantareApplikation immunisiert. Der durch Ad5eg alleinvermittelte Impfschutz konnte durch Koexpres-sion von Zytokinen nicht verbessert werden.

FFU

/ m

l pla

sma

P ≤0,006

Ad5GFP

Kontrolle

Ad5eg +

2,0x10

4,0x10

6,0x10

Ad5GM-C

SF

Ad5IL21

Ad5IL18

Ad5IL12

Ad5IL2

4

4

4

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Ergebnisse

51

Boost-Immunisierung wurden IL2-, IL12-, IL15-, IL18-, IL21- bzw. GM-CSF-exprimierende

Ad5-Vektoren koappliziert.

Dieses Vakzinierungsexperiment wurde zunächst in C57BL/6-Mäusen durchgeführt, wobei

die plantare, intramuskuläre (i.m.) und intradermale (i.d.) Applikationsrouten verglichen wur-

den. Um jeder vakzinierten Maus die gleiche Menge Virus zu applizieren, wurde ohne Zyto-

kine immunisierten Mäusen ein GFP-exprimierendes Adenovirus koappliziert. Die unvakzi-

nierten Mäuse hatten 21 d p.i. eine mediane Viruslast von 1 660 IC/Milz (Abb. 4.8). Die in

die Hinterpfoten, i.m. bzw. i.d. mit Ad5eg vakzinierten Mäuse hatten Virusbeladungen von 0,

435 und 259 IC/Milz und waren somit signifikant niedriger als die unvakzinierten Kontroll-

mäuse (P<0,05; Student-Newman-Keuls-Test). Die mit Zytokin-exprimierenden Vektoren

koimmunisierten Mäuse wiesen keine niedrigeren Virusbeladungen auf als die nur mit Ad5eg

geimpften Tiere (P>0,05; Student-Newman-Keuls-Test). In CB6F1-Mäusen wurde das Expe-

riment wiederholt, jedoch wurde hier nur die plantare Injektion durchgeführt (Abb. 4.9). Ge-

genüber den unvakzinierten Kontrollmäusen (mediane Viruslast 45 127 FFU/ml) wiesen alle

immunisierten Mäuse eine niedrigere Viruslast im Plasma auf (P<0,006; Mann-Whitney-

Rangsummen-Test). Im Vergleich mit den mit Ad5eg immunisierten Mäusen (7 920 FFU/ml)

war die Viruslast der mit IL2-, IL12-, IL18-, IL21- und GM-CSF-exprimierenden Ad5-

Vektoren koimmunisierten Mäuse nicht signifikant erniedrigt (7 590, 18 480, 14 865, 7 260

bzw. 9 900 FFU/ml; P>0,05; Mann-Whitney-Rangsummen-Test).

4.2.3 Vergleich homologer und heterologer Impfstrategien

4.2.3.1 Bestimmung der Immunprotektion durch homologe und heterologe Vakzinie-

rungen

Als nächstes sollte untersucht werden, ob durch eine Kombination unterschiedlicher adenovi-

raler Vektoren in einer heterologen Prime-Boost-Immunisierung eine Verbesserung der Im-

munprotektion gegenüber der homologen Prime-Boost-Immunisierung erreicht werden kann.

Die Impfung mit viralen Vektoren induziert nicht nur eine Immunantwort gegen das Transgen

sondern auch gegen den Vektor selbst. Daher wird häufig eine DNA-Immunisierung mit einer

viralen Boost-Immunisierung kombiniert [95]. Um homologe und heterologe Impfungen

miteinander zu vergleichen wurden einerseits Ad5-basierende Vektoren verwendet und

anderseits Fiber-chimäre Vektoren, in denen die Fiber-Kopf- und –Schaft-Domänen durch die

des Adenovirus Typ 35 ersetzt wurden.

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Ergebnisse

52

Die beiden Impfstrategien wurden zunächst in den FV-resistenten C57BL/6-Mäusen charakte-

risiert, hierzu wurden die Mäuse nach homologem oder heterologem Prime-Boost-Protokoll

mit den Vektoren Ad5eg und Ad5F35eg immunisiert. Drei Wochen nach der Belastungsinfek-

tion wurde die Viruslast in den Milzen der infizierten Mäuse im IC-Assay bestimmt. Wie in

Abb. 4.10A gezeigt ist, war die mediane Viruslast aller immunisierten Mäuse mit <10 IC/Milz

gegenüber 1 840 IC/Milz bei den unvakzinierten Mäusen signifikant reduziert (P=0,003;

Mann-Whitney-Rangsummen-Test), wobei in etwa der Hälfte der Tiere die Viruslast unter der

Nachweisgrenze lag. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den homologen und

der heterologen Prime-Boost-Immunisierungs-Gruppe (P>0,05; Mann-Whitney-

Rangsummen-Test).

Kontrolle

Ad5/Ad5

Ad5F35

/Ad5F

35

Ad5/Ad5F

350

20406080

1001500

2000

2500

3000

IC/M

ilz

P=0,003

P=0,026

P=0,002

FFU

/ ml P

lasm

a

Kontrolle

Ad5eg/A

d5F35

eg

Ad5F35

eg/Ad5F

35eg

Ad5eg/Ad5e

g0

500

1000

1500

4000

9000

14000

19000

A B

Abb. 4.10 Vergleich homologer und heterologer Prime-Boost-Vakzinierungen von C57BL/6- und CB6F1-Mäusen C57BL/6- und CB6F1-Mäuse wurden zweimal mit Ad5env und –gag (Ad5eg/Ad5eg), Ad5F35env und –gag (Ad5F35eg/Ad5F35eg) oder einer Kombination beider Vektortypen (Ad5eg/Ad5F35eg) vakziniert und drei Wo-chen nach der Boost-Immunisierung mit 3 000 bzw. 500 SFFU FV belastet. (A) Drei Wochen nach der Belas-tungsinfektion von C57BL/6-Mäusen wurde die Viruslast in der Milz bestimmt. In etwa der Hälfte der vakzinier-ten Mäuse lag die Viruslast unter der Nachweisgrenze des IC-Assays (B) Zehn Tage nach der Belastungsinfekti-on von CB6F1-Mäusen wurden Blutproben entnommen und die Viruslast im Plasma bestimmt. Alle vakzinierten Mäuse zeigten eine signifikant niedrigere Viruslast als die unvakzinierten Kontrollmäuse, die mit der heterolo-gen Prime-Boost-Kombination vakzinierten Mäuse hatten eine signifikant niedrigere Viruslast als die mit den homologen Kombinationen vakzinierten.

Da die Viruslast in den FV-resistenten C57BL/6-Mäusen sehr niedrig war, wurden die Vakzi-

nierungsstrategien als nächstes für die Vakzinierung der hoch FV-suszeptiblen CB6F1-Mäuse

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Ergebnisse

53

eingesetzt. Nach der homologen bzw. heterologen Immunisierung der Mäuse erfolgte die Be-

lastungsinfektion mit 500 SFFU FV, danach wurde der Krankheitsverlauf durch wöchentliche

Palpation der Milzen sowie durch die Bestimmung der Viruslast 10 Tage und 18-22 Tage

nach der Belastungsinfektion bestimmt. Wie in Abb. 4.10B gezeigt wird, war die Viruslast im

Plasma 10 d p.i. bei allen vakzinierten Mäusen signifikant niedriger als bei den unvakzinierten

Kontrollmäusen (P=0,002; Mann-Whitney-Rangsummen-Test), wo sie 13 850 FFU/ml be-

trug. Des Weiteren war die Viruslast in den mit der heterologen Prime-Boost-Kombination

vakzinierten Mäusen mit 110 FFU/ml signifikant niedriger als in den mit den homologen

Kombinationen vakzinierten Mäusen (Ad5eg/Ad5eg: 550 FFU/ml; Ad5F35eg/Ad5F35eg:

1 250 FFU/ml; P=0,026; Mann-Whitney-Rangsummen-Test).

Wie in Abb. 4.11 gezeigt, lässt sich anhand der Milzgrößen der infizierten Mäuse zeigen, dass

die Vakzinierung mit adenoviralen Vektoren zu einer Verzögerung der FV-induzierten

Krankheit führt. Die Milzen der vakzinierten Mäuse waren 5 d p.i. etwas kleiner als die der

unvakzinierten Kontrollmäuse, von 10 bis 20 d p.i. waren die Milzen der vakzinierten Mäuse

signifikant kleiner als die der Kontrollmäuse (Ad5eg/Ad5eg: P=0.009; Ad5F35eg/Ad5F35eg:

P=0.026; Ad5eg/Ad5F35eg: P=0.001; Mann-Whitney-Rangsummen-Test). 25 d p.i. waren

die Milzen der mit der heterologen Kombination vakzinierten Mäuse noch kleiner als die der

Kontrollmäuse, allerdings war der Unterschied nicht mehr signifikant.

Zum Abschluss des Experimentes wurde die Viruslast in den Milzen der infizierten Mäuse

18-22 d p.i. bestimmt (Abb. 4.12). Die Viruslast der mit Ad5eg/Ad5eg, Ad5F35eg/Ad5F35eg

und Ad5eg/Ad5F35eg vakzinierten Mäuse war zu diesem Zeitpunkt mit 1,671·107, 1,323·107

und 1,244·107 IC/Milz noch signifikant niedriger als die der unvakzinierten Kontrollmäuse

(5,49·107 IC/Milz; P<0,05, Mann-Whitney-Rangsummen-Test), jedoch fanden sich keine sig-

0

1

2

3

4

5 10 20 25

Tage nach Belastungsinfektion

KontrolleAd5eg/Ad5F35egAd5F35eg/Ad5F35egAd5eg/Ad5eg

med

iane

Milz

größ

e Abb. 4.11 Einfluss der Vakzinie-rung auf den FV-induziertenKrankheitsverlauf Nach der Belastungsinfektion wurdedurch wöchentliche Palpation derMilzen der Krankheitsverlauf ver-folgt, die Milzgrößen wurden in Ka-tegorien von 1 bis 4 eingeordnet.Aufgetragen wurden die Median-Werte für die Milzgrößen. Die FV-induzierte Milzvergrößerung setztebei den vakzinierten Mäusen signi-fikant später ein als bei den unvak-zinierten Kontrollmäusen. n = 6

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Ergebnisse

54

nifikanten Unterschiede zwischen den mit homologen bzw. heterologen Vektor-

Kombinationen vakzinierten Mäusen.

4.2.3.2 Charakterisierung der Immunantwort auf homologe und heterologe adenovirale

Vakzinierungen

Um die protektive Determinante zu ermitteln, die für den verbesserten Immunschutz nach he-

terologer Prime-Boost-Vakzinierung verantworlich ist, wurden die humorale und zelluläre

Immunantwort charakterisiert.

Zur Bestimmung der zellulären Immunantwort wurden ein Proliferationstest sowie Tetramer-

färbungen durchgeführt. Für den Proliferationstest wurden CFSE-markierte Milzzellen vakzi-

nierter Mäuse für 7 d mit Peptid-beladenen DCs kokultiviert, anschließend mit anti-CD4- und

anti-CD8-Antikörpern gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Wie in Abb. 4.13 ge-

zeigt wird, wurde für die Milzzellen aller Vakzinierungsgruppen eine signifikante Abnahme

der CFSE-Fluoreszenz festgestellt (CD4+: P=0,001; CD8+: P<0,001; Student-Newman-Keuls-

Test), was die erhöhte Proliferation dieser Zellen anzeigt.

Für die Tetramerfärbungen wurden die vakzinierten Mäuse belastungsinfiziert und 3 d p.i.

wurden die Milzzellen isoliert und in den Tetramerfärbungen eingesetzt. Für alle Vakzinie-

rungsgruppen wurden mit den MHC II-Tetrameren signifikant höhere Zahlen Epitop-

spezifischer CD4+ T-Zellen nachgewiesen als in unvakzinierten Kontrolltieren (P=0,001; Stu-

dent-Newman-Keuls-Test; Abb. 4.14). Mit den MHC I-Tetrameren konnten keine spezifi-

schen CD8+ T-Zellen nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).

Abb. 4.12 Einfluss der Vakzinierung aufdie späte Phase der Infektion 18 bis 22 Tage nach der Belastungsinfekti-on wurde die Viruslast in den Milzen derinfizierten Mäuse bestimmt. Alle vakzi-nierten Mäuse zeigten eine niedrigere Vi-ruslast als die unvakzinierten Mäuse.n = 180

5,0×107

1,0×108

1,5×108

2,0×108

2,5×108

Ad5/Ad5

Ad5F35

/Ad5F35

Ad5/Ad5F

35

Kontrolle

IC/M

ilz

P <0,05

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Ergebnisse

55

A BP = 0,001

P ≤ 0,001

0

500

1000

1500

Ad5eg/A

d5eg

Ad5F35

eg/A

d5F35

eg

Ad5eg/A

d5F35

eg

Kontrolle

mitt

lere

Flu

ores

zenz

inte

nsitä

t CD

4+

0

500

1000

1500

2000

Kontrolle

mitt

lere

Flu

ores

zenz

inte

nsitä

t CD

8+

Ad5eg/A

d5eg

Ad5F35

eg/A

d5F35

eg

Ad5eg/A

d5F35

eg

Abb. 4.13 Nachweis FV-spezifischer CD4+ und CD8+ T-Zellen im Proliferationstest Zwei Wochen nach der Boost-Immunisierung wurden die Milzzellen von immunisierten und von nicht immuni-sierten Mäusen gewonnen und in einen in vitro-Proliferationstest eingesetzt. Für alle immunisierten Mäuse ließ sich eine signifikant höhere Proliferationsrate der CD4+ und CD8+ T-Zellen nach Stimulation mit Peptid-beladenen DCs feststellen.

Um die humorale Immunantwort zu charakterisieren wurden 7 d nach der Boost-

Immunisierung Blutproben entnommen und bindende sowie neutralisierende Antikörper ge-

gen F-MuLV bestimmt, die neutralisierenden Antikörper-Titer wurden außerdem auch

Abb. 4.14 Nachweis Epitop-spezifischer CD4+ T-Zellen durch MHC II-Tetramer-färbung Die Milzzellen vakzinierter und belastungsinfi-zierter Mäuse wurden 3 d p.i. gewonnen und mit MHC II-Tetrameren gefärbt. In allen Vak-zinierungsgruppen ließ sich ein signifikant hö-herer Anteil Epitop-spezifischer CD4+ T-Zellen nachweisen als bei den unvakzinierten Kon-trollmäusen. n = 6

Kontrolle Ad5eg/Ad5eg

Ad5eg/Ad5F35eg

0,38 ± 0,11 %

0,05 ± 0,03 % 0,31 ± 0,14 %

0,34 ± 0,14 %

100 101 102 103 104 100 101 102 103 104100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

CD

4

MHC II-Tetramer

Ad5F35eg/Ad5F35eg

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Ergebnisse

56

Ad5eg/Ad5eg

Ad5F35eg/Ad5F35eg

Ad5eg/Ad5F35eg

bindende Antikörper-Titer

1/12501/2501/501/10<1/10

<448

163264

128

Ad5eg/A

d5eg

Ad5eg/A

d5F35

eg

Kontrolle

neut

ralis

iere

nde

AK

-Tite

r P<0,05

P<0,05

-1

A B

Abb. 4.15 Nachweis bindender und neutralisierender Antikörper (A) Sieben Tage nach der Boost-Immunisierung wurden die bindenden Antikörper-Titer im Blut der immunisier-ten Mäuse nachgewiesen. Die Titer der Ad5eg/Ad5eg- und Ad5eg/Ad5F35eg-vakzinierten Mäuse waren signifi-kant höher als die der Ad5F35/Ad5F35-vakzinierten Mäuse. n = 13 (B) In 10 d p.i. gewonnenen Plasmaproben wurden die neutralisierenden Antikörper bestimmt. Sowohl die mit der homologen als auch die mit der heterolo-gen Prime-Boost-Kombination geimpften Mäuse hatten signifikant höhere neutralisierende Antikörper-Titer als die unvakzinierten Mäuse. Die Titer der mit der heterologen Vakzine geimpften Mäuse waren signifikant höher als die der mit der homologen Vakzine geimpften Mäuse.

10 d p.i.bestimmt. Die Vakzinierung mit Ad5eg/Ad5eg und Ad5eg/Ad5F35eg führte zu bin-

dende Antikörper-Titern (Abb. 4.15A) zwischen 1:50 und 1:1 250 (median 1:250 bzw. 1:50),

die Titer der Ad5F35eg/Ad5F35eg-vakzinierten Mäuse lagen zwischen <1:10 und 1:250 (me-

dian 1:50) und waren somit signifikant niedriger als die der anderen Gruppen

(P≤0,033;Mann-Whitney-Rangsummen-Test). Vor der Belastungsinfektion waren keine neut-

ralisierenden Antikörper in den immunisierten Mäusen nachweisbar (Daten nicht gezeigt).

Zehn Tage nach der Belastungsinfektion lag der neutralisierende Antikörper-Titer der unvak-

zinierten Mäuse bei <1:4 bis 1:4 (Abb. 4.15B). Sowohl nach homologer als auch nach hetero-

loger Immunisierung wiesen die Mäuse signifikant höhere neutralisierende Antikörper-Titer

auf (P<0,05; Kruskal-Wallis-Analyse, Student-Newman-Keuls-Test). Mit einem medianen

Titer von 1:32 zeigten die mit heterologer Vakzine geimpften Mäuse einen signifikant höhe-

ren neutralisierende Antikörper-Titer als die mit homologer Kombination geimpften Mäuse

(1:8; P<0,05).

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Ergebnisse

57

4.2.4 Einfluss der Vorbehandlung des zu injizierenden Muskels mit Cardio-

toxin auf den Impferfolg

Im Zusammenhang mit i.m.-verabreichten DNA-Vakzinen wird häufig der zu injizierende

Muskel mit Cardiotoxin vorbehandelt. Hierbei handelt es sich um eine Substanz des Kobra-

Giftes, das durch eine irreversible Membrandepolarisierung zur Gewebenekrose führt. Das

nach der Nekrose regenerierende Gewebe ist aufnahmefähiger für die applizierte DNA. Es

sollte untersucht werden, ob sich ein positiver Effekt auch für AdV-basierende Vakzine be-

obachten lässt.

Hierzu wurden zwei Gruppen mit der heterologen Prime-Boost-Kombination aus Ad5eg und

Ad5F35eg immunisiert, einer Gruppe wurden jeweils 4 d vor Immunisierung je 50 µl 10µM

Cardiotoxin-Lösung in beide M. gastrocnemii injiziert. Der Impferfolg wurde 10 d p.i. durch

Bestimmung der Plasma-Virämie kontrolliert (Abb. 4.16). Die mediane Viruslast der unvak-

zinierten Kontrollmäuse betrug 13 850 FFU/ml, mit 975 FFU/ml und 525 FFU/ml war die Vi-

rusbeladung der Ad5eg/Ad5F35eg- bzw. Ad5eg/Ad5F35eg+Cardiotoxin-geimpften Mäuse

signifikant niedriger als die der unvakzinierten Kontrollmäuse (P<0,05; Mann-Whitney-

Rangsummen-Test), jedoch wurde der Impferfolg durch die Cardiotoxin-Behandlung nicht

signifikant verbessert (P>0,05; Mann-Whitney-Rangsummen-Test).

Kontrolle

Ad5eg/A

d5F35

eg

Ad5eg/A

d5F35

eg

+ Card

iotoxin

0

500

1000

150010000

15000

20000

25000

FFU

/mlP

lasm

a

P <0,05

Abb. 4.16 Einfluss der Vorbehandlungdes injizierten Muskels mit Cardiotoxin CB6F1-Mäuse wurden durch i.m.-Injektionin die M. gastrocnemii immunisiert. DenTieren einer Gruppe wurde 4 d vor der Im-munisierung zur Vorbehandlung Cardioto-xin auf dieselbe Art injiziert. Drei Wochennach der Belastungsinfektion wurde die Vi-ruslast im Plasma bestimmt. Beide Vakzi-nierungsgruppen zeigten niedrigere Virusbe-ladungen als die unvakzinierten Kontroll-mäuse.

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Ergebnisse

58

4.2.5 Einfluss der Koexpression von viralen fusogenen Membranproteinen

auf den Impferfolg

Im Kontext der Tumorvakzinierung haben sich virale fusogene Membranproteine in der Ver-

gangenheit durch ihre Fähigkeit herausgestellt, potente anti-tumorale Immunantworten zu in-

duzieren. Auf Grund der Xenogenisierung transduzierter Tumorzellen und der durch die fuso-

genen Membranproteine induzierten Freisetzung von Syncitiosomen genannten Exosomen

wird die durch einen viralen Vektor vermittelte Tumorimmunisierung signifikant verbessert

[154-157]. Es sollte in diesem Projekt untersucht werden, ob die fusogenen Membranproteine

auch die Immunantwort auf eine anti-retrovirale Vakzinierung steigern.

CB6F1-Mäuse wurden mit der heterologen Kombination aus Ad5eg und Ad5F35eg geimpft.

Zusätzlich wurden den Mäusen adenovirale Vektoren koinjiziert, die die fusogenen Memb-

ranproteine F und H des Masernvirus (MV-F/H) bzw. das Fusionsprotein F und das Glycopro-

tein G des Respiratorischen Synzytialvirus (RSV-F/G) exprimieren. Zehn Tage nach der Be-

lastungsinfektion wurde die Virusbeladung im Plasma ermittelt. Die Koimmunisierung mit

MV-F/H-exprimierenden AdV führte wie die Vakzinierung mit Ad5eg/Ad5F35eg allein zu

Kontrolle

Ad5eg/A

d5F35

eg

Ad5eg/A

d5F35

eg

Ad5MVFH/A

d5F35

MVFH

0

FFU

/m

lPla

sma

P<0,05

1,0×104

1,5×104

2,0×104

2,5×104

5,0×103

0

2,0×104

4,0×104

6,0×104

8,0×104

FFU

/mlP

lasm

a

P<0,05A B

Kontrolle

Ad5eg/A

d5F35

eg

Ad5eg/A

d5F35

eg

Ad5RSVFG/A

d5F35

RSVFG

Abb. 4.17 Einfluss der Koexpression von viralen fusogenen Membranproteinen auf den Impferfolg CB6F1-Mäuse wurden mit der heterologen Kombination aus Ad5eg und Ad5F35eg und mit MV-F/H- (A) bzw. RSV-F/G-exprimierenden Ad5- und Ad5F35-Vektoren immunisiert (B). Die mit Ad5eg/Ad5F35eg bzw. mit Ad5eg/Ad5F35eg und Ad5MVFH/Ad5F35MVFH immunisierten Mäuse hatten eine niedrigere Viruslast als die unvakzinierten Mäuse. Die Koexpression von MV-F/H führte nicht zu einem verbesserten Immunschutz, die Koexpression von RSV-F/G führte zu einer Verschlechterung des Impfergebnisses.

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Ergebnisse

59

einer signifikant niedrigeren Viruslast als in unvakzinierten Kontrollmäusen (P<0,05; Mann-

Whitney-Rangsummen-Test; Abb. 4.17), allerdings war die Viruslast nicht signifikant niedri-

ger als nach Vakzinierung mit Ad5eg/Ad5F35eg allein (P>0,05; Mann-Whitney-

Rangsummen-Test). Die Koimmunisierung mit RSV-F/G-kodierenden AdV führte zu einer

Verschlechterung des Impfschutzes, die Viruslast war nicht signifikant niedriger als die der

unvakzinierten Kontrollmäuse (P>0,05; Kruskal-Wallis-Analyse, Student-Newman-Keuls-

Test).

4.2.6 Einfluss der Koapplikation von TLR-Liganden auf den Impferfolg

Als weitere Strategie zur Steigerung des Impferfolges wurde die Koapplikation von TLR-

Liganden untersucht. TLR-Liganden sind Pathogen-assoziierte Strukturen, die von Toll-like-

Rezeptoren auf Zellen des angeborenen Immunsystems erkannt werden und die Aktivierung

des angeborenen Immunsystems und die Expression immunmodulatorischer und kostimulato-

rischer Moleküle induzieren. TLR-Liganden wurden bereits als Adjuvantien für einige Vakzi-

nierungen erfolgreich eingesetzt [133;135;137;138]. In diesem Projekt sollte der Effekt von

poly(I:C) und CpG-ODN auf den durch AdV-Vektoren vermittelten Immunschutz untersucht

werden. Hierzu wurden CB6F1-Mäuse mit Ad5eg/Ad5F35eg vakziniert und es wurden po-

ly(I:C) oder poly(I:C) und CpG-ODN koappliziert oder 7 d nach der Immunisierung appli-

ziert. Zehn Tage nach der Belastungsinfektion wurde die Viruslast im Plasma ermittelt.

Wie in Abb. 4.18 gezeigt, betrug die mediane Viruslast nach Koapplikation von poly(I:C)

1 592 FFU/ml und war nicht signifikant niedriger im Vergleich mit den mit Ad5eg/Ad5F35eg

allein immunisierten Mäusen (3 620 FFU/ml; P>0,05; Mann-Whitney-Rangsummen-Test).

Die Applikation von poly(I:C) und CpG-ODN am Tag der Immunisierung oder 7 d nach der

Immunisierung resultierte ebenfalls nicht in einer Verbesserung des Immunschutzes, die me-

diane Viruslast war mit 8 387 FFU/ml bzw. 3 630 FFU/ml sogar signifikant höher als bei den

mit Ad5eg/Ad5F35eg allein immunisierten Mäusen (2 887 FFU/ml; P<0,05; Kruskal-Wallis-

Analyse, Student-Newman-Keuls-Test) und die Viruslast der am Tag der Immunisierung mit

poly(I:C) und CpG-ODN behandelten Mäuse war nicht signifikant niedriger als die der un-

vakzinierten Kontrollmäuse (P>0,05).

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Ergebnisse

60

Kontrolle

Ad5eg/A

d5F35

eg

Ad5eg/A

d5F35

eg

+poly(

I:C)

0

5,0×103

1,0×104

1,5×104

2,0×104

2,5×104

FFU

/mlP

lasm

aP<0,05A B

Kontrolle

Ad5eg/A

d5F35

eg

Ad5eg/A

d5F35

eg

+poly(

I:C)/C

pG d0

Ad5eg/A

d5F35

eg

+poly(

I:C)/C

pG d70

2,0×104

4,0×104

6,0×104

8,0×104

FFU

/mlP

lasm

a

P<0,05

P<0,05

Abb. 4.18 Einfluss der Koapplikation von TLR-Liganden auf den Impferfolg CB6F1-Mäuse wurden mit Ad5eg/Ad5F35eg immunisiert. Zusätzlich wurden poly(I:C) (A) oder poly(I:C) und CpG-ODN gleichzeitig oder 7 d später injiziert (B). Der Impferfolg wurde 10 d p.i. durch Bestimmung der Plasma-Virämie kontrolliert. Die Koapplikation von poly(I:C) führte zu keiner signifikanten Änderung der Vi-ruslast im Vergleich zu Ad5eg/Ad5F35eg immunisierten Mäusen. Bei Koapplikation von poly(I:C) und CpG-ODN bzw. bei um 7 d verzögerter Applikation von poly(I:C) und CpG-ODN war die Viruslast signifikant höher als bei den nur mit Ad5eg/Ad5F35eg vakzinierten Kontrollmäusen.

4.2.7 Beurteilung von Env-Fusionsproteinen für die Vakzinierung

In einem weiteren Experiment sollte untersucht werden, ob durch die genetische Fusion des

Env-Proteins mit einer PEST-Sequenz (envpest), mit dem mittelgroßen Hüllprotein des Hepa-

titis B-Virus (HBsAgsftpdenv (mit Trimerisierungssequenz) bzw. HBsAg-trimenv (ohne Tri-

merisierungssequenz)), mit der extrazellulären Domäne des kostimulatorischen Proteins

CTLA4 (CTLA4env) oder dem adenoviralen Kapsid-Protein pIX (pIXenv) und damit der Prä-

sentation des Env-Proteins auf dem AdV-Kapsid die Immunogentität und somit der durch die

Vakzine vermittelte Schutz gesteigert werden kann. Bei einer PEST-Sequenz handelt es sich

um eine Peptid-Sequenz, die reich an Prolin, Glutamat, Serin und Threonin ist. Die Sequenz

vermittelt den Abbau des Proteins durch zelluläre Proteasomen, und die entstandenen Peptide

können auf MHC I-Molekülen präsentiert werden [158]. Durch das Anhängen einer PEST-

Sequenz könnte also möglicherweise die Verfügbarkeit von Env-Epitopen auf MHC I-

Molekülen und die zelluläre Immunantwort erhöht werden. Durch die Fusion mit CTLA4,

welches an B7-Moleküle auf dendritischen Zellen bindet, sollte das Env-Protein gezielt an die

dendritischen Zellen herangeführt werden [141]. HBsAg-exprimierende Zellen setzen mit

HBsAg besetzte Vesikel frei, durch die Fusion von Env an HBsAg könnte die Verfügbarkeit

von Env-Proteinen für die Ausbildung von neutralisierenden Antikörpern erhöht werden

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Ergebnisse

61

[146]. Auch die Präsentation des Env-Proteins auf dem adenoviralen Kapsid sollte zur ver-

stärkten Ausbildung von neutralisierenden Antikörpern führen.

CB6F1-Mäuse wurden mit heterologen Kombinationen Env-Fusionsprotein- und Gag-

exprimierender Ad5- und Ad5F35-Vektoren (Ad5efusg bzw. Ad5F35efusg; efus = envpest,

CTLA4env, HBsAgsftpdenv, HBsAg-trimenv bzw. pIXenv) immunisiert. Der Impferfolg

wurde durch Bestimmung der Viruslast 10 d p.i. analysiert. Die mediane Viruslast der unvak-

zinierten Kontrollmäuse betrug 51 480 FFU/ml und war signifikant höher als die Viruslast al-

ler vakzinierten Mäuse (P<0,05; Kruskal-Wallis-Analyse, Student-Newman-Keuls-Test; Abb.

4.19). Die Viruslast der mit Env-PEST-, CTLA4-Env- und HBsAg-trim-Env-kodierenden

AdV vakzinierten Mäuse betrug 4 042, 4 372 bzw. 4 180 FFU/ml und war somit nicht signifi-

kant niedriger als die Viruslast der mit Ad5eg/Ad5F35eg vakzinierten Mäuse (2 887; P>0,05).

Die Viruslast der mit HBsAgsftpd-Env-kodierenden AdV vakzinierten Mäuse war mit 2 392

FFU/ml etwas niedriger als die Viruslast der mit Ad5eg/Ad5F35eg vakzinierten Mäuse

(P>0,05). Die Viruslast der mit pIX-Env-exprimierenden AdV vakzinierten Mäuse betrug 660

FFU/ml und war somit signifikant niedriger als die der anderen Vakzinierungsgruppen

(P<0,05).

Um zu ermitteln, ob die verbesserte Immunprotektion auf eine verstärkte humorale Immun-

antwort zurückzuführen ist, wurden die neutralisierende Antikörper-Titer 10 d p.i. bestimmt

(Abb. 4.20). Der mediane Antikörper-Titer der unvakzinierten Mäuse war mit <1:4 signifikant

Abb. 4.19 Env-Fusionsproteine für die Vakzi-nierung Zur Steigerung der Immunogenität wurden gene-tische Fusionen des Env-Proteins hergestellt undvon Ad5- und Ad5F35-Vektoren exprimiert.CB6F1-Mäuse wurden mit Ad5eg/Ad5F35egbzw. den Fusionsproteine exprimierenden Vek-toren Ad5efusg/Ad5F35efusg (efus = envpest,CTLA4env, HBsAgsftpdenv, HBsAg-trimenvbzw. pIXenv) vakziniert. Die Viruslast im Plas-ma wurde 10 d p.i. bestimmt. Alle vakziniertenMäuse hatten eine niedrigere Viruslast als dieunvakzinierten Kontrollmäuse, die mit pIX-Env-exprimierenden AdV vakzinierten Mäuse hatteneine niedrigere Viruslast als alle anderen vakzi-nierten Mäuse.Kontro

lle env

envp

est

CTLA4env

HBsAgsft

pdenv

HBsAg-tr

imen

v0

4,0×103

8,0×103

2,0×1044,0×1046,0×1048,0×104

FFU

/mlP

lasm

a

P<0,05

pIXenv

P<0,05

Ad5efusg/Ad5F35efusg

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Ergebnisse

62

niedriger als die Titer der mit Ad5eg/Ad5F35eg und Ad5pIXeg/Ad5F35pIXeg vakzinierten

Mäuse (P<0,05; Kruskal-Wallis-Analyse, Student-Newman-Keuls-Test). Der mediane neutra-

lisierende Antikörper-Titer der mit Ad5IXeg/Ad5F35pIXeg vakzinierten Mäuse betrug 1:128

und war damit signifikant höher als bei den Ad5eg/Ad5F35eg geimpften Mäusen (1:32;

P=0.009; Mann-Whitney-Rangsumment-Test).

4.3 Impfungen mit Env- und Gag-kodierenden Herpes simplex-Viren

4.3.1 Vergleich replikations-kompetenter und –defekter HSV-Vektoren

Humane AdV können auf Grund ihrer Wirtsspezifität nicht in murinem Gewebe replizieren.

Um replikations-kompetente und –defekte Impfvektoren vergleichen zu können, wurden

HSV-1-basierende Vektoren hergestellt. Durch die Deletion des essentiellen immediate early-

Gens icp27 wurden replikations-defekte Vektoren erhalten.

Die replikations-kompetenten bzw. –defekten HSV-1-Vektoren HSVenv und –gag bzw.

HSVΔ27env und –gag wurden zur Impfung von CB6F1-Mäusen verwendet. Zehn Tage p.i.

wurde die Viruslast im Plasma festgestellt. Die unvakzinierten Kontrollmäuse zeigten eine

mediane Virusbeladung von 70 950 FFU/ml Plasma (Abb. 4.21A). Mit 37 455 bzw. 37 537

FFU/ml war die Viruslast der HSV- bzw. HSVΔ27-vakzinierten Mäuse signifikant niedriger

als die der Kontrollmäuse (P<0,05; Kruskal-Wallis-Analyse, Studen-Newman-Keuls-Test),

jedoch ließ sich kein Unterschied zwischen den HSV- und HSVΔ27-vakzinierten Mäusen

Abb. 4.20 Neutralisierende Antikörper-Antwort auf pIX-Env-Fusionsprotein-exprimierende AdV In 10 d p.i. gewonnenen Plasmaproben vonAd5eg/Ad5F35eg- bzw. mitAd5pIXeg/Ad5F35pIXeg-geimpften bzw.unvakzinierten Mäusen wurden die neutrali-sierende Antikörper-Titer bestimmt. Dieneutralisierende Antikörper-Titer der vakzi-nierten Mäuse waren signifikant höher alsbei unvakzinierten Mäusen. Die mitAd5pIXeg/Ad5F35pIXeg vakzinierten Mäu-se hatten signifikant höhere Antikörper-Titerals die mit Ad5eg/Ad5F35eg vakziniertenMäuse.

Kontrolle

envg

ag

pIXenvg

ag

<448

163264

128256

neut

ralis

iere

nde

AK

-Tite

r

P<0,05

P=0,009

-1

Page 72: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Ergebnisse

63

Kontrolle

HSV

HSVd270

1,0×105

2,0×105

3,0×105

4,0×105

5,0×105

FFU

/mlP

lasm

aP <0,05

unvakz

iniert

HSV

HSVd270,0

5,0×1007

1,0×1008

1,5×1008

2,0×1008

2,5×1008

IC/M

ilz

P <0,05

A B

Abb. 4.21 Vergleich des durch replikations-kompetente und –defekte HSV-Vektoren vermittelten Schut-zes CB6F1-Mäuse wurden mit HSV- bzw. HSVΔ27-Vektoren vakziniert. (A) 10 d p.i. wurde die Virusbeladung im Plasma festgestellt. Beide Vakzinierungsgruppen hatten signifikant niedrigere Virusbeladungen im Plasma als die unvakzinierten Kontrollmäuse. n = 28 (B) 18-21 d p.i. wurden die Milzen der infizierten Mäuse entnommen und ihre Virusbeladung bestimmt. Die vakzinierten Mäuse hatten keine niedrigere Viruslast als die unvakzinier-ten Kontrollmäuse. n = 16

feststellen (P>0,05).

Um den Effekt der Vakzinierung auf die späte Phase der Infektion zu untersuchen, wurden

18-21 d p.i. die Milzen der infizierten Mäuse entnommen und in einem IC-Assay die Virus-

lastbestimmt (Abb. 4.21B). Zu diesem Zeitpunkt war die Viruslast der HSV- bzw. HSVΔ27-

vakzinierten Mäuse nicht signifikant niedriger als die der unvakzinierten Kontrollmäuse

(P>0,05; Student-Newman-Keuls-Test), allerdings war die Viruslast der HSV-vakzinierten

Mäuse höher als die der HSVΔ27-vakzinierten Mäuse (P<0,05).

Um den Krankheitsverlauf über längere Zeit zu verfolgen wurden wöchentlich die Milzen der

infizierten Mäuse palpiert. Tiere mit deutlich vergrößerten Milzen (ab 2) wurden als krank

gewertet. Wie in Abb. 4.22 gezeigt wird, waren ab 11 d p.i. 100 % der unvakzinierten bzw.

mit HSV-Vektoren vakzinierten Mäuse krank oder tot, bei den HSVΔ27-vakzinierten Mäusen

hingegen waren 16,6 % bzw. 33,3 % der Mäuse nach Tag 11 bzw. 20 p.i. nicht krank. Nach

90 Tagen wurden die Milzen dieser Tiere entnommen, und 1·106 Milzzellen wurden in

BALB/c-Mäuse injiziert. Diese Mäuse wurden über einen Zeitraum von 6 Monaten beobach-

tet; sie entwickelten keine FV-induzierte Krankheit, was auf eine sterile Immunität der vakzi-

nierten CB6F1-Mäuse schließen lässt.

Page 73: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Ergebnisse

64

4.3.2 Vergleich des Immunschutzes nach Vakzinierung mit replikations-

defekten HSV-Vektoren und mit replikations-kompetenten HSV-

Vektoren unter gleichzeitiger Aciclovir-Behandlung Da mit den replikations-kompetenten Vektoren weniger gute Ergebnisse erzielt wurden als

mit den replikations-defekten, sollte untersucht werden, ob dies durch die Replikation an sich

oder durch ein verändertes Genexpressionsprofil durch die Deletion des immediate early-

Gens icp27 in den replikations-defekten HSVΔ27-Vektoren bedingt ist. Hierzu wurden

CB6F1-Mäuse entweder mit HSVΔ27- oder HSV-Vektoren immunisiert, ein Teil der mit

HSV-Vektoren immunisierten Mäuse wurde gleichzeitig 14 Tage lang, beginnend einen Tag

vor der Immunisierung, zweimal täglich mit Aciclovir (10 mg/kg Körpergewicht) behandelt.

Aciclovir wirkt virostatisch, ohne die Genexpression zu beeinflussen oder die infizierte Zelle

zu zerstören .

Zehn Tage nach der Belastungsinfektion wurde die Plasma-Virämie bestimmt (Abb. 4.23A).

Die unvakzinierten Kontrollmäuse hatten eine mediane Viruslast von 2,67·105 FFU/ml Plas-

ma. Die mediane Viruslast der HSV- bzw. HSVΔ27-vakzinierten Mäuse war mit 1,005·105

bzw. 1,325·105 FFU/ml signifikant niedriger als die der unvakzinierten Kontrollmäuse

(P=0,009 bzw. P=0,003; Mann-Whitey-Rangsummen-Test). Die Viruslast der HSV-

vakzinierten und Aciclovir-behandelten Mäuse war mit 3,32·105 FFU/ml höher als die der un-

vakzinierten Kontrollmäuse (P>0,05; Mann-Whitney-Rangsummen-Test). Die Viruslast wur-

de außerdem in der Milz 18 d p.i. quantifiziert (Abb. 4.23B). Wie im vorhergegangenen Expe-

riment lässt sich zu diesem Zeitpunkt keine signifikant niedrigere Viruslast für die vakzinier-

ten Mäuse mehr feststellen (P>0,05; Mann-Whitney-Rangsummen-Test). Die Viruslast der

während der Immunisierung mit Aciclovir behandelten Mäuse war auch zu diesem Zeitpunkt

Abb. 4.22 Überleben nach Vakzi-nierung mit replikations-kompe-tenten oder –defekten HSV-Vek-toren Nach der Belastungsinfektion wur-de durch wöchentliche Palpationder Milz der Krankheitsverlauf ver-folgt. Tiere mit deutlich vergrößer-ten Milzen (ab Milzgröße 2) wur-den als krank betrachtet. n = 6

0 5 11 20 27 34 41 900

50

100HSVegHSVd27egKontrolle

%kr

ank

oder

ges

torb

en

d p.i.

Page 74: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Ergebnisse

65

höher als die der anderen Vakzinierungsgruppen und signifikant höher als die der unvakzi-

nierten bzw. mit HSVΔ27 vakzinierten Mäuse (P<0,05; Mann-Whitney-Rangsummen-Test).

Kontrolle HSV

HSV+Acic

lovir

HSVd270

2,0×105

4,0×105

6,0×105

8,0×105

FFU

/mlP

lasm

a P =0,009

P =0,003

Kontrolle

HSV

HSV+Acic

lovir

HSVd270,0

1,0×1008

2,0×1008

3,0×1008

4,0×1008

IC /

Milz

P <0,05P <0,05A B

Abb. 4.23 Einfluss von Aciclovir-Behandlung auf den durch HSV-Vektoren vermittelten Immunschutz in

der frühen und späten Infektionsphase CB6F1-Mäuse wurden mit HSV- oder HSVΔ27-Vektoren immunisiert, während der Vakzinierung mit den HSV-Vektoren wurde ein Teil der Mäuse mit Aciclovir behandelt. n = 10 (A) 10 d p.i. wurde die Viruslast im Plasma ermittelt. Die ohne Aciclovir-Behandlung vakzinierten Mäuse hatten signifikant niedrigere Virusbeladungen als die unvakzinierten Kontrollmäuse. (B) 18 d p.i. hatten die mit Aciclovir behandelten Mäuse signifikant höhere Virusbeladungen als die unvakzinierten bzw. HSVΔ27-vakzinierten Mäuse.

Page 75: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Diskussion

66

5. Diskussion

Adenovirale Vektoren wurden bereits in zahlreichen Tierversuchen und einigen klinischen

Studien als Vektoren für die Vakzinierung gegen HIV evaluiert. Hier lieferten sie viel ver-

sprechende Resultate, da sie in der Lage waren, humorale und zelluläre Immunantworten zu

induzieren [51;53]. Allerdings hat die kürzliche vorzeitige Beendigung der STEP-Studie, bei

der sich eine Ad5-basierende HIV-Vakzine als unwirksam herausgestellt hat [52], verdeut-

licht, dass noch ein großer Verbesserungsbedarf der anti-retroviralen Vakzinierungsstrategien

besteht. Probleme bei der Entwicklung einer effizienten Vakzine liegen häufig in der Schwie-

rigkeit, umfassend neutralisierende Antikörper zu induzieren, die für eine effektive präventive

Vakzine essentiell sind [29]. Die Beurteilung neuer Vakzinierungsstrategien wird des Weite-

ren dadurch erschwert, dass es kein geeignetes Kleintiermodell für HIV/AIDS gibt. Studien

der SIV-Infektion in Schimpansen oder Makaken ermöglichen auf Grund limitierter Tierzah-

len, der genetischen Heterogenität der Versuchstiere sowie der unterschiedlichen Infektions-

verläufe einen Vergleich verschiedener Vakzinierungen sowie die Übertragung auf die klini-

sche Situation von HIV/AIDS im Menschen nur eingeschränkt [29].

In dieser Arbeit wurde das FV-Modell genutzt, um verschiedene AdV- und HSV-basierende

anti-retrovirale Vakzinierungsstrategien zu evaluieren. Das FV-Modell bietet den Vorteil,

dass verschiedene Vektoren und Strategien direkt miteinander vergleichbar sind, da die Expe-

rimente in einer ausreichend großen Zahl genetisch identischer Tiere durchgeführt werden

können. Die unterschiedliche Suszeptibilität verschiedener Mausstämme für FV erlaubt die

Evaluierung von Vakzinierungen unter verschiedenen Stringenzen [46].

Die Vakzinierung von FV-resistenten C57BL/6-Mäusen mit F-MuLV-Env- und –Gag-

kodierenden AdV führte zu einer signifikant niedrigeren Viruslast nach der Belastungsinfek-

tion, der Vakzinierungserfolg hing aber von der Vakzinierungsroute ab. Die Applikation in

die Hinterpfoten führte zum besten Immunschutz, die Viruslast war sehr niedrig und lag für

einige Tiere unterhalb der Nachweisgrenze. Dies ist möglicherweise auf den hohen intersti-

tiellen Druck im Pfotenballen nach Vakzin-Injektion und damit eine erhöhte Transduktionsef-

fizienz oder auf die Nähe ableitender Lymphknoten und damit eine verbesserte Immunpräsen-

tation zurückzuführen.

Die Koapplikation von Zytokin-exprimierenden AdV wurde in C57BL/6-Mäusen für mehrere

Applikationsrouten und in den hoch-suszeptiblen CB6F1-Mäusen evaluiert. Es ließ sich in al-

len Fällen keine Verbesserung des Impferfolges beobachten. Frühere Vakzinierungsstudien

hatten im Kontext von DNA-Vakzinen bzw. von Tumor-Vakzinierungen einen positiven Ef-

Page 76: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Diskussion

67

fekt für die Koexpression von Zytokinen zeigen können [23;128;129;155-157]. Jedoch ist im

Gegensatz zu Adenoviren die Immunogenität einer DNA-Vakzine gering, und Tumore sind

meist für das Immunsystem nicht erkennbar, daher profitieren solche Vakzinierungen von ei-

nem zusätzlichen Immunstimulus. AdV hingegen sind hoch immunogen [159;160], die Infek-

tion mit AdV löst eine akute Entzündungsreaktion im infizierten Gewebe und das Einwandern

von Immunzellen aus.

Die heterologe Kombination von zwei AdV-Typen in einer Prime-Boost-Immunisierung wur-

de ebenfalls sowohl in C57BL/6-Mäusen als auch in CB6F1-Mäusen evaluiert. Während in

C57BL/6-Mäusen kein Unterschied erkennbar war, führte die Vakzinierung von CB6F1-

Mäusen mit der heterologen Prime-Boost-Kombination zu einer signifikant niedrigeren Virus-

last als mit den homologen Impfungen. Dieser Unterschied wurde erst auf Grund der höheren

Stringenz der Belastungsinfektion der CB6F1-Mäuse erkennbar. Die verbesserte Immunpro-

tektion nach heterologer Vakzinierung ist im Einklang mit Publikationen, die für DNA-Virus-

Kombinationen bzw. die heterologe Prime-Boost-Kombination verschiedener Viren oder Se-

rotypen einen verbesserten Vakzinierungserfolg berichteten, was vermutlich auf die Umge-

hung von gegen den Vektor gerichteten Immunantworten zurückzuführen ist [91-93;95;119].

Mit Hilfe von MHC II-Tetramer-Färbung und Proliferationstest war es möglich, F-MuLV-

spezifische CD4+ und CD8+ T-Zellen nachzuweisen. Hier ließ sich kein Unterschied zwischen

homologer und heterologer Prime-Boost-Immunisierung feststellen. Mit MHC I-Tetrameren

ließen sich keine F-MuLV-spezifischen CD8+ T-Zellen nachweisen, dies liegt vermutlich an

dem auf den Tetrameren präsentierten Peptid. Dieses stammt aus der Leader-Region des Gag-

Proteins, welche vermutlich nicht korrekt prozessiert wird, wenn das Gag-Protein von einem

Vakzinierungsvektor exprimiert wird. Daher erkennen nur wenige CD8+ T-Zellen dieses Epi-

top, im Gegensatz zur natürlichen Infektion [61]. Diese Annahme wird dadurch unterstützt,

dass spezifische CD8+ T-Zellen im in vitro-Proliferationstest nachweisbar waren. In einigen

Mäusen ließ sich mit dem angewandten Assay keine Virämie nachweisen, allerdings zeigten

alle Tiere ein, im Vergleich mit nicht immunisierten Tieren verzögertes, Einsetzen FV-

induzierter Krankheit. Daher ist zu schließen, dass die CD8+ T-Zell-Antwort, obwohl nach-

weisbar, nicht ausreichend war, um den Krankheitsausbruch zu verhindern.

Die neutralisierende Antikörper-Antwort hingegen war signifikant höher nach heterologer als

nach homologer Prime-Boost-Immunisierung, was darauf schließen lässt, dass die neutralisie-

renden Antikörper ein entscheidender Faktor für den Schutz vor FV-Infektion und den ver-

besserten Impferfolg nach heterologer Vakzinierung sind. Da die T-Zell-Antworten nicht un-

terschiedlich waren, ist der höhere neutralisierende Antikörper-Titer wahrscheinlich auf das

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Diskussion

68

Umgehen Vektor-neutralisierender Antikörper und eine effizientere B-Zell-Induktion zurück-

zuführen. Die wichtige Rolle neutralisierender Antikörper für einen effektiven Immunschutz

wurde bereits für die FV-Infektion [161] gezeigt. Die enttäuschenden Ergebnisse einer Phase

II-Studie, in der eine adenovirale Vakzine getestet wurde, die ausschließlich eine CTL-

Antwort hervorrufen sollte [52], unterstreicht auch die Bedeutung von HIV-neutralisierenden

Antikörpern für eine effektive AIDS-Vakzine. Die neutralisierende Antikörper-Titer sind in

der Größenordnung wie sie zuvor für die Vakzinierung mit rekombinanten Vakzinia-Viren

[65;66], attenuiertem F-MuLV [66] und Peptiden [162;163] beschrieben wurde, dies bestätigt

die Eignung adenoviraler Vektoren für die anti-retrovirale Vakzinierung. Weiterhin ist die

Größenordnung ähnlich wie für HIV- und SIV-Vakzinierungsstudien beschrieben [164-166],

was die Relevanz der FV-Infektion für die Evaluation anti-retroviraler Impfstoffe unter-

streicht.

Der Vergleich mit anderen Vakzinen wird etwas dadurch erschwert, dass häufig unterschied-

liche Mausstämme verwendet werden. Die rekombinanten Vakzinia-Vektoren wurden in den

FV-suszeptiblen (B10.A × A.BY)F1-Mäusen evaluiert, welche vor FV-induzierter Krankheit

geschützt waren, obwohl sie persistierend infiziert blieben. Diese Mäuse sind aber auf Grund

ihres genetischen Hintergrundes (H2a/b) geringer suszeptibel als die in dieser Arbeit verwen-

deten CB6F1-Mäuse (H2b/d), weshalb nur schwer eine Aussage getroffen werden kann, ob re-

kombinante AdV einen schlechteren Impfschutz vermitteln als rekombinante Vakzinia-Viren.

Die Vorbehandlung des zu injizierenden Muskels mit Cardiotoxin führte zu keiner signifikan-

ten Verbesserung des Immunschutzes. Die Behandlung eines Muskels mit Cardiotoxin führt

zur Degeneration von Muskelzellen, der anschließend regenerierende Muskel lässt sich mit

höherer Effizienz mit DNA-Impfstoffen transduzieren [167;168], und einwandernde Immun-

zellen erhöhen die Immunogenität einer DNA-Vakzine [169]. Die Effektivität der AdV-

Vakzine wurde durch die Vorbehandlung des zu injizierenden Muskels nicht verbessert, dies

ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass die Transduktionseffizienz murinen Gewebes mit

AdV im Vergleich zu DNA ohnehin recht hoch ist [170], und die hohe Immunogenität des

AdV [159;160], wie auch bei der Koexpression von Zytokinen, eine immunstimulatorische

Wirkung des Cardiotoxin überdeckt.

Die Koexpression von fusogenen Membranproteinen von Masernvirus und Respiratorischem

Syncytialvirus führte zu keiner Verbesserung des Impferfolges. In Tumortherapie-

experimenten konnte gezeigt werden, dass die intratumorale Expression von fusogenen

Membranproteinen zu einer verbesserten Tumorvakzinierung führte [155-157]. Der Mecha-

nismus bei der Tumorvakzinierung ist aber anders als bei der hier eingesetzten Vakzine, da

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Diskussion

69

bei der Tumorvakzinierung die Antigene aus der infizierten Zelle selbst stammen, und ihre

Immunogenität und Verfügbarkeit für das Immunsystem auf Grund der Xenogenisation der

Tumorzelle durch die Expression viraler Proteine bzw. durch die Bildung von Syncytiosomen

durch die Expression fusogener Membranproteine erhöht wird [154;171;172].

Die Applikation von TLR-Liganden bei der Vakzinierung bzw. eine Woche nach der Vakzi-

nierung führte zu keiner Verbesserung der Immunantwort, vielmehr zeigten die mit der Kom-

bination von poly(I:C) und CpG-ODN koimmunisierten Mäuse höhere Virusbeladungen als

die nur mit Env- und Gag-kodierenden Vektoren immunisierten Mäuse. Die Erhöhung der Vi-

ruslast war stärker ausgeprägt, wenn poly(I:C) und CpG-ODN mit der AdV-Vakzine koappli-

ziert wurden. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass die Kombination von poly(I:C)

und CpG-ODN mit einer adenoviralen Vakzine eine Reduktion der CTL-Antwort hervorruft

[173;174]. Eine Studie zeigte eine verbesserte Tumor-Immunität bei Koapplikation von CpG-

ODN trotz erniedrigter CTL-Antwort [173]. Dieses Ergebnis konnte jedoch im FV-Modell

nicht bestätigt werden.

In dieser Arbeit wurden verschiedene gentische Modifikationen des Env-Proteins durchge-

führt. Neben dem Anhängen einer PEST-Sequenz wurden Fusionen der extrazellulären Do-

mäne des Env-Proteins mit dem mittelgroßen Hepatitis-B-Virus-Oberflächenprotein M-

HBsAg, mit der extrazellulären Domäne des T-Zell-Oberflächenproteins CTLA4 und dem a-

denoviralen Kapsid-Protein pIX hergestellt. Die Vakzinierung mit den pIX-Env-

Fusionsprotein-exprimierenden AdV führte zu einer signifikanten Verbesserung des Immun-

schutzes gegenüber der Vakzinierung mit Env-kodierenden AdV, während die Vakzinierung

mit den Trimerisierungssequenz-enthaltenden HBsAg-Fusionsprotein-kodierenden AdV nur

in einer geringen und mit den übrigen Fusionsprotein-kodierenden AdV in keiner Verbesse-

rung des Immunschutzes resultierte. In den mit pIX-Env-Fusionsprotein-exprimierenden AdV

vakzinierten Mäusen ließen sich signifikant höhere neutralisierende Antikörper-Titer nach-

weisen als in den mit Env-kodierenden AdV immunisierten Mäusen, diese verbesserte neutra-

lisierende Antikörper-Antwort ist wahrscheinlich verantwortlich für die verbesserte Immun-

protektion. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Trimerisierung des Env-Proteins eine wich-

tige Rolle für die Vermittlung eines Immunschutzes spielt. In der Literatur wird die Oligome-

risierung des F-MuLV-Env beschrieben, es scheint im natürlichen Infektionsverlauf Dimere,

Trimere und Tetramere zu bilden [175;176]. Das adenovirale Kapsid-Protein pIX liegt im

Kapsid zwischen den Hexon-Kapsomeren und fungiert als molekularer Zement [177]. Struk-

turanalysen haben gezeigt, dass pIX als Trimer im Kapsid vorliegt [178]. Somit ist es wahr-

scheinlich, dass das an pIX fusionierte Env-Protein ebenfalls in einer trimerisierten Form auf

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Diskussion

70

dem modifizierten AdV-Kapsid vorliegt und die Bildung von Monomer-übergreifenden neut-

ralisierenden Antikörpern ermöglicht bzw. immunologisch relevante Eptiope exponiert. Auch

das eine Trimerisierungssequenz enthaltende HBsAg-Env-Fusionsprotein vermittelte einen

etwas besseren Schutz als das Fusionsprotein ohne Trimerisierungssequenz, was die Annahme

unterstützt, dass trimerisierte Env-Proteine eine verbesserte Immunprotektion vermitteln.

Auch die Hüllproteine von HIV und SIV liegen im Virion als Trimere vor [179-181] und es

finden sich Hinweise darauf, dass funktionelle trimerisierte Env-Proteine durch die Exposition

relevanter Epitope einen effektiveren Immunschutz vermitteln können [182-185].

Das Anhängen einer PEST-Sequenz sowie die Fusionierung der extrazellulären Domäne des

Env-Proteins mit M-HBsAg und der extrazellulären Domäne von CTLA4 führte zu keiner

signifikanten Verbesserung des Immunschutzes. Mehrere Publikationen berichten von einer

verbesserten Immunantwort auf ein Antigen nach Fusion mit löslichem CTLA4 durch Zufüh-

rung des Antigens zu Antigen-präsentierenden Zellen [141;186;187], allerdings wurden die

Fusionsproteine in diesen Versuchen von DNA-Vakzinen exprimiert. Auch hier dürfte die

fehlende Steigerung darauf zurückzuführen sein, dass auf Grund der hohen Immunogenität

der AdV-Vektoren die Präsentation des Antigens für das Immunsystem, im Gegensatz zu ei-

ner DNA-Vakzine, ohnehin recht effektiv ist. Für die Vakzinierung gegen das Humane Papil-

loma-Virus (HPV) wurde eine Steigerung der Immunogenität und des Immunschutzes nach

Anhängen einer PEST-Sequenz an das HPV-Onkoprotein E7 bzw. nach Fusion mit dem

HBV-Oberflächenprotein HBsAg berichtet [146;188]. In dem hier durchgeführten Experiment

konnte jedoch nur für das Trimerisierungssequenz-enthaltende Fusionsprotein mit HBsAg ei-

ne leichte Verbesserung des Immunschutzes festgestellt werden. Dies liegt vermutlich in den

unterschiedlichen Eigenschaften der beiden Proteine begründet. Während das Env-Protein ein

Membran-ständiges Protein ist, ist das HPV-E7 intrazellulär lokalisiert und daher weniger zu-

gänglich für das Immunsystem. Durch Anhängen einer PEST-Sequenz konnte die Degradati-

on des Proteins und die folgende Präsentation auf MHC I-Molekülen erhöht werden [188], die

Fusion mit HBsAg führte zur Präsentation des gesamten Moleküls außerhalb der Zelle auf

durch HBsAg gebildeten Vesikeln und damit zu verbesserten Antikörper-Antworten

[146;189].

Im Gegensatz zu AdV kann HSV in murinem Gewebe replizieren, daher bieten diese Vekto-

ren die Möglichkeit, replikations-kompetente und –defekte Impfvektoren miteinander zu ver-

gleichen. Zur Herstellung eines replikations-defekten HSV wurde das essentielle immediate

early-Gen icp27 deletiert. Bei der Vakzinierung gegen FV ließ sich überraschenderweise fest-

stellen, dass in Bezug auf Virämie 10 d p.i. und Viruslast in der Milz 18-21 d p.i. kein Unter-

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Diskussion

71

schied für die Impfung mit replikations-kompetenten und –defekten Vektoren besteht. Im Ü-

berlebensexperiment zeigte sich, dass mit replikations-defekten Viren geimpfte Mäuse signi-

fikant besser geschützt waren. Dies ist überraschend, da auf Grund der Ausbreitung der Impf-

vektoren und damit der verstärkten Antigenexpression der replizierenden Vektoren eine stär-

kere Immunantwort zu erwarten wäre. So gilt auch in der Literatur die Annahme, dass Le-

bendimpfstoffe als immunogener und effektiver als lebend-attenuierte oder tote Impfstoffe

sind [190]. Um zu klären, ob die Replikation des Virus an sich einen negativen Effekt auf den

Impferfolg hat, wurde die Vakzinierung mit replikations-kompetenten HSV-Vektoren unter

gleichzeitiger Behandlung der Mäuse mit Aciclovir durchgeführt. Aciclovir ist ein Nukleoti-

danalogon, dass durch die herpesvirale Thymidinkinase phosphoryliert wird und anschließend

bei der DNA-Synthese zu einem Kettenabbruch führt [191]. Durch Aciclovir wird daher die

Replikation des Virusgenoms verhindert, die Genexpression des HSV hingegen wird nicht

beeinflusst. Die Vakzinierung der Mäuse bei gleichzeitiger Aciclovir-Behandlung führte zu

einem deutlich schlechteren Impfschutz im Vergleich zu den anderen vakzinierten Mäusen.

Daraus ist zu schließen, dass nicht die Replikationskompetenz an sich das schlechtere Vakzi-

nierungsergebnis bedingt, vielmehr scheint es sich um einen Effekt der veränderten Ge-

nexpression der replikations-defekten Vektoren zu handeln. In dem replikations-defekten Vi-

rus wurde mit dem icp27 ein essentielles immediate early-Gen deletiert, diese Deletion hebt

die Replikations-Kompetenz des Vektors auf [192], bewirkt aber auch eine fehlende Expres-

sion der in der Expressionskaskade nachgeschalteten Gene [70;193]. Herpesviren besitzen ei-

ne Vielzahl von Proteinen, die ein Umgehen der Immunantwort bewirken, durch die Deletion

des ICP27 könnte auch die Expression dieser Proteine verändert sein, was den besseren Impf-

erfolg der ICP27-deletierten Vektoren erklären würde. Um einen besseren Vergleich replika-

tions-kompetenter und –defekter HSV-Vektoren zu ermöglichen, würde sich die Deletion ei-

nes essentiellen Strukturproteins, zum Beispiel eines Glykoproteins [117] anbieten. Diese De-

letion würde ebenfalls die Replikations-Kompetenz des Vektors aufheben, aber kein veränder-

tes Genexpressionsprofil verursachen.

Das Ergebnis ist dennoch im Einklang mit einigen anderen Publikationen, die ebenfalls be-

richten, dass replikations-defekte Vektoren ähnliche Impferfolge erzielten wie replikations-

kompetente. Murphy et al. haben ebenfalls ein ICP27-deletiertes HSV mit einem replikations-

kompetenten HSV-Vektor für die Vakzinierung von Rhesusaffen gegen SIV verglichen und

konnten keine Unterschiede in Bezug auf die Immunantwort und die Immunprotektion fest-

stellen [194]. Allerdings war die Aussagekraft dieses Experiments begrenzt, da die Gruppen

nur fünf bzw. zwei Tiere umfassten. Vergleiche von MVA-Vakzinen mit konventionellen

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Diskussion

72

Vakzinia-Vektoren für Vakzinierungen gegen Influenza [195] und SIV [196] zeigten eben-

falls, dass das sehr stark attenuierte MVA Immunantworten erzeugte, die mit denen auf den

konventionellen, replizierenden Vakzinia-Vektor vergleichbar waren.

Der direkte Vergleich von adenoviralen und herpesviralen Vektoren zeigt deutlich einen bes-

seren Impfschutz nach Vakzinierung mit rekombinanten Adenoviren. Dies ist wahrscheinlich

auf das Design der herpesviralen Vektoren zurückzuführen. HSV kodiert für zahlreiche Prote-

ine, die an der Immunevasion des Virus beteiligt sind, z.B. durch Blockierung der MHC I-

und –II-Beladung [101;197], durch Suppression der Expression inflammatorischer Zytokine

[103], durch Bindung von Komplement-Faktoren oder Immunglobulinen [98;99] und durch

die Inhibition von Signaltransduktionswegen in Immunzellen [102;104]. Bei den in dieser Ar-

beit verwendeten HSV-Vektoren wurden nur wenige Deletionen eingefügt, nämlich in beiden

Kopien des γ34.5 zur Reduktion der Neurotoxizität und in der für die Ribonukleotid-

Reduktase kodierenden Sequenz. Es wurden aber keine der bekannten immunsuppressiven

Proteine deletiert. Beim humanen Ad5 hingegen hat nur die E3-Region immunmodulatorische

Funktion, so verhindert das E3/19K-Protein den Transport neu-synthetisierter MHC-Moleküle

und bindet an TAP- (transporter associated with antigen processing-) Moleküle [198-200]

um die Beladung von MHC I-Molekülen zu verhindern. Die E3-Region ist in den verwende-

ten adenoviralen Vektoren deletiert. Somit ist der genetische Hintergrund geeigneter für Vak-

zinierungsexperimente, wo eine Immunantwort gegen ein viral kodiertes Transgen erwünscht

ist. Um die Effektivität der HSV-vektorisierten Vakzine zu verbessern, sollten weitere Deleti-

onen in die Vektoren eingebracht werden, um die Immunevasion zu reduzieren. Ein ICP47-

deletiertes onkolytisches HSV ist beschrieben worden, das im Tiermodell auf Grund der ver-

stärkten MHC I-Präsentation eine verbesserte Tumorvakzinierung erreichte [111]. Ein ähnli-

cher positiver Effekt durch die Deletion immunsuppressiver Proteine sollte für die antiretrovi-

rale Vakzinierung angenommen werden.

Die FV-Infektion hat sich als geeignetes Modell für die Entwicklung verbesserter viral vekto-

risierter Impfstrategien erwiesen. Während die geringe Suszeptibilität und daraus resultieren-

de niedrige Viruslast resistenter Mäuse einen Vergleich verschiedener Vakzine erschwert, bie-

tet die Infektion von FV-suszeptiblen Hybridmäusen ein ausreichend stringentes Modell, um

einen Impfschutz erreichen und verschiedene Vakzinierungsstrategien vergleichen zu können.

Zwar lassen sich die Ergebnisse nicht direkt auf die HIV-Infektion übertragen, da die Patho-

genese der FV-induzierten Krankheit sowie deren Kinetik und die Struktur der viralen Protei-

ne sich von HIV/AIDS unterscheiden, doch bietet die FV-Infektion ein stringentes Modell für

die Evaluation anti-retroviraler Impfstoffe.

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Zusammenfassung

73

6. Zusammenfassung

Im FV-Modell wurden verschiedene Adenovirus- und Herpesvirus-basierende Impfstrategien

evaluiert. Es zeigte sich, dass die Route der Vektorapplikation einen entscheidenden Einfluss

auf den Impferfolg hatte, welcher bei Applikation in die Hinterpfoten am besten war und zu

einer deutlich niedrigeren Viruslast in sowohl FV-resistenten als auch -suszeptiblen Mäusen

führte. Der Impferfolg konnte durch die Koapplikation von TLR-Liganden oder von Zytokin-

exprimierenden Adenoviren nicht verbessert werden, was vermutlich auf die hohe Immuno-

genität der Adenoviren selbst zurückzuführen ist. Der durch die Impfung vermittelte Schutz

konnte hingegen durch die Kombination zweier AdV-Typen in einer heterologen Prime-

Boost-Kombination signifikant verbessert werden. Der verbesserte Schutz korrelierte mit ei-

ner Erhöhung der neutralisierende Antikörper-Titer nach heterologer Immunisierung. Bei

i.m.-Injektion wurde der Impferfolg nicht durch die Vorbehandlung des zu injizierenden

Muskels mit Cardiotoxin verbessert, was vermutlich durch eine ohnehin hohe Transduktions-

effizienz der AdV zu begründen ist. Die Koexpression von viralen fusogenen Membranprote-

inen führte zu keiner Verbesserung des Impferfolges, ebenso wie die genetische Fusionierung

des Env-Proteins mit HBsAg, CTLA-4 und einer PEST-Sequenz. Die Vakzinierung mit pIX-

Env-Fusionsprotein-kodierenden AdV führte zu einer signifikant niedrigeren Viruslast als die

Vakzinierung mit Env-kodierenden AdV, der verbesserte Schutz korrelierte mit erhöhten

neutralisierende Antikörper-Titern und ist vermutlich auf die bessere Exposition immunolo-

gisch relevanter Epitope des auf dem AdV-Kapsid präsentierten Env-Proteins zurückzufüh-

ren. Der Vergleich replikations-kompetenter und –defekter HSV-Vektoren zeigte, dass die

Replikations-Kompetenz des Impfvektors nicht zu einem verbesserten Impferfolg führt. Dies

kann an dem Vektor-Design liegen, der Vergleich ist allerdings schwierig, da in dem replika-

tions-defekten Vektor ein möglicherweise immunologisch relevantes Gen deletiert wurde. Der

Vergleich von AdV- und HSV-Vektoren zeigte einen besseren Impferfolg für die Vakzinie-

rung mit AdV-Vektoren, dies ist vermutlich auf die Anwesenheit einiger immunsupprimie-

render Gene in den HSV-Vektoren zurückzuführen. Die FV-Infektion hat sich als geeignetes

Modell für die Entwicklung verbesserter anti-retroviraler Impfstrategien bewiesen.

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Referenzen

74

7. Referenzen

[1] Rous P. A transmissible avian neoplasm. (Sarcoma of the common fowl) by Peyton Rous, M.D., Experimental Medicine for Sept. 1, 1910, vol. 12, pp.696-705. J Exp Med 1979 Oct 1;150(4):738-53.

[2] Enders JF, Peebles TC. Propagation in tissue cultures of cytopathogenic agents from patients with measles. Proc Soc Exp Biol Med 1954 Jun;86(2):277-86.

[3] Friend C. Cell-free transmission in adult Swiss mice of a disease having the charac-ter of a leukemia. J Exp Med 1957 Apr 1;105(4):307-18.

[4] Jarrett WF, Crawford EM, Martin WB, Davie F. A Virus-like Particles Associated with Leukemia (Lymphosarcoma). Nature 1964 May 9;202:567-9.

[5] Poiesz BJ, Ruscetti FW, Gazdar AF, Bunn PA, Minna JD, Gallo RC. Detection and isolation of type C retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a pa-tient with cutaneous T-cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A 1980 Dec;77(12):7415-9.

[6] Yasunaga J, Matsuoka M. Human T-cell leukemia virus type I induces adult T-cell leukemia: from clinical aspects to molecular mechanisms. Cancer Control 2007 Apr;14(2):133-40.

[7] Modrow S, Falke D, Truyen U. Molekulare Virologie. 2. ed. Spektrum Akademi-scher Verlag, 2002.

[8] Markham PD, Sarngadharan MG, Salahuddin SZ, Popovic M, Gallo RC. Correlation between exposure to human T-cell leukemia-lymphoma virus-III and the develop-ment of AIDS. Ann N Y Acad Sci 1984;437:106-9.

[9] Joint United Nations Programme on HIV/AIDS (UNAIDS). AIDS epidemic update, December 2007. 2007. Ref Type: Internet Communication

[10] Joint United Nations Programme on HIV/AIDS (UNAIDS). 2006 report on the global AIDS epidemic. 2006. Ref Type: Generic

[11] Keele BF, Van HF, Li Y, et al. Chimpanzee reservoirs of pandemic and nonpan-demic HIV-1. Science 2006 Jul 28;313(5786):523-6.

[12] Santiago ML, Range F, Keele BF, et al. Simian immunodeficiency virus infection in free-ranging sooty mangabeys (Cercocebus atys atys) from the Tai Forest, Cote d'Ivoire: implications for the origin of epidemic human immunodeficiency virus type 2. J Virol 2005 Oct;79(19):12515-27.

[13] Ayouba A, Souquieres S, Njinku B, et al. HIV-1 group N among HIV-1-seropositive individuals in Cameroon. AIDS 2000 Nov 10;14(16):2623-5.

[14] Ayouba A, Mauclere P, Martin PM, et al. HIV-1 group O infection in Cameroon, 1986 to 1998. Emerg Infect Dis 2001 May;7(3):466-7.

Page 84: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Referenzen

75

[15] Peeters M, Toure-Kane C, Nkengasong JN. Genetic diversity of HIV in Africa: im-pact on diagnosis, treatment, vaccine development and trials. AIDS 2003 Dec 5;17(18):2547-60.

[16] Perrin L, Kaiser L, Yerly S. Travel and the spread of HIV-1 genetic variants. Lancet Infect Dis 2003 Jan;3(1):22-7.

[17] Ishikawa K, Janssens W, Banor JS, et al. Genetic analysis of HIV type 2 from Ghana and Guinea-Bissau, West Africa. AIDS Res Hum Retroviruses 2001 Nov 20;17(17):1661-3.

[18] Pieniazek D, Ellenberger D, Janini LM, et al. Predominance of human immunodefi-ciency virus type 2 subtype B in Abidjan, Ivory Coast. AIDS Res Hum Retroviruses 1999 Apr 10;15(6):603-8.

[19] Nahmias AJ, Weiss J, Yao X, et al. Evidence for human infection with an HTLV III/LAV-like virus in Central Africa, 1959. Lancet 1986 May 31;1(8492):1279-80.

[20] Korber B, Muldoon M, Theiler J, et al. Timing the ancestor of the HIV-1 pandemic strains. Science 2000 Jun 9;288(5472):1789-96.

[21] Dalgleish AG, Beverley PC, Clapham PR, Crawford DH, Greaves MF, Weiss RA. The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retro-virus. Nature 1984 Dec 20;312(5996):763-7.

[22] McDougal JS, Nicholson JK, Cross GD, Cort SP, Kennedy MS, Mawle AC. Binding of the human retrovirus HTLV-III/LAV/ARV/HIV to the CD4 (T4) molecule: con-formation dependence, epitope mapping, antibody inhibition, and potential for idio-typic mimicry. J Immunol 1986 Nov 1;137(9):2937-44.

[23] Alkhatib G, Combadiere C, Broder CC, et al. CC CKR5: a RANTES, MIP-1alpha, MIP-1beta receptor as a fusion cofactor for macrophage-tropic HIV-1. Science 1996 Jun 28;272(5270):1955-8.

[24] Zhang LQ, MacKenzie P, Cleland A, Holmes EC, Brown AJ, Simmonds P. Selec-tion for specific sequences in the external envelope protein of human immunodefi-ciency virus type 1 upon primary infection. J Virol 1993 Jun;67(6):3345-56.

[25] de Roda Husman AM, Blaak H, Brouwer M, Schuitemaker H. CC chemokine recep-tor 5 cell-surface expression in relation to CC chemokine receptor 5 genotype and the clinical course of HIV-1 infection. J Immunol 1999 Oct 15;163(8):4597-603.

[26] Feng Y, Broder CC, Kennedy PE, Berger EA. HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven-transmembrane, G protein-coupled receptor. Science 1996 May 10;272(5263):872-7.

[27] Kozak SL, Platt EJ, Madani N, Ferro FE, Jr., Peden K, Kabat D. CD4, CXCR-4, and CCR-5 dependencies for infections by primary patient and laboratory-adapted iso-lates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol 1997 Feb;71(2):873-82.

[28] Schwartlander B, Stover J, Walker N, et al. AIDS. Resource needs for HIV/AIDS. Science 2001 Jun 29;292(5526):2434-6.

Page 85: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Referenzen

76

[29] International AIDS Vaccine Initiative IAVI. AIDS Vaccine Blueprint 2006. 2006.

[30] Hahn BH, Shaw GM, Taylor ME, et al. Genetic variation in HTLV-III/LAV over time in patients with AIDS or at risk for AIDS. Science 1986 Jun 20;232(4757):1548-53.

[31] Novembre FJ, de RJ, Nidtha S, et al. Rapid CD4(+) T-cell loss induced by human immunodeficiency virus type 1(NC) in uninfected and previously infected chimpan-zees. J Virol 2001 Feb;75(3):1533-9.

[32] Novembre FJ, Saucier M, Anderson DC, et al. Development of AIDS in a chimpan-zee infected with human immunodeficiency virus type 1. J Virol 1997 May;71(5):4086-91.

[33] Giri M, Ugen KE, Weiner DB. DNA vaccines against human immunodeficiency vi-rus type 1 in the past decade. Clin Microbiol Rev 2004 Apr;17(2):370-89.

[34] Mosier DE, Gulizia RJ, Baird SM, Wilson DB, Spector DH, Spector SA. Human immunodeficiency virus infection of human-PBL-SCID mice. Science 1991 Feb 15;251(4995):791-4.

[35] Gorantla S, Santos K, Meyer V, et al. Human dendritic cells transduced with herpes simplex virus amplicons encoding human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) gp120 elicit adaptive immune responses from human cells engrafted into NOD/SCID mice and confer partial protection against HIV-1 challenge. J Virol 2005 Feb;79(4):2124-32.

[36] Hirsch VM, Johnson PR. Pathogenic diversity of simian immunodeficiency viruses. Virus Res 1994 May;32(2):183-203.

[37] Putkonen P, Warstedt K, Thorstensson R, et al. Experimental infection of cynomol-gus monkeys (Macaca fascicularis) with simian immunodeficiency virus (SIVsm). J Acquir Immune Defic Syndr 1989;2(4):359-65.

[38] Harouse JM, Gettie A, Tan RC, Blanchard J, Cheng-Mayer C. Distinct pathogenic sequela in rhesus macaques infected with CCR5 or CXCR4 utilizing SHIVs. Science 1999 Apr 30;284(5415):816-9.

[39] Igarashi T, Shibata R, Hasebe F, et al. Persistent infection with SIVmac chimeric vi-rus having tat, rev, vpu, env and nef of HIV type 1 in macaque monkeys. AIDS Res Hum Retroviruses 1994 Aug;10(8):1021-9.

[40] Li J, Lord CI, Haseltine W, Letvin NL, Sodroski J. Infection of cynomolgus mon-keys with a chimeric HIV-1/SIVmac virus that expresses the HIV-1 envelope glyco-proteins. J Acquir Immune Defic Syndr 1992;5(7):639-46.

[41] Li JT, Halloran M, Lord CI, et al. Persistent infection of macaques with simian-human immunodeficiency viruses. J Virol 1995 Nov;69(11):7061-7.

[42] Luciw PA, Pratt-Lowe E, Shaw KE, Levy JA, Cheng-Mayer C. Persistent infection of rhesus macaques with T-cell-line-tropic and macrophage-tropic clones of sim-ian/human immunodeficiency viruses (SHIV). Proc Natl Acad Sci U S A 1995 Aug 1;92(16):7490-4.

Page 86: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Referenzen

77

[43] Reimann KA, Li JT, Veazey R, et al. A chimeric simian/human immunodeficiency virus expressing a primary patient human immunodeficiency virus type 1 isolate env causes an AIDS-like disease after in vivo passage in rhesus monkeys. J Virol 1996 Oct;70(10):6922-8.

[44] Dittmer U, Brooks DM, Hasenkrug KJ. Characterization of a live-attenuated retrovi-ral vaccine demonstrates protection via immune mechanisms. J Virol 1998 Aug;72(8):6554-8.

[45] Dittmer U, Hasenkrug KJ. Cellular and molecular mechanisms of vaccine-induced protection against retroviral infections. Curr Mol Med 2001 Sep;1(4):431-6.

[46] Hasenkrug KJ, Chesebro B. Immunity to retroviral infection: the Friend virus model. Proc Natl Acad Sci U S A 1997 Jul 22;94(15):7811-6.

[47] Cohen J. Public health. AIDS vaccine trial produces disappointment and confusion. Science 2003 Feb 28;299(5611):1290-1.

[48] Graham BS, Koup RA, Roederer M, et al. Phase 1 safety and immunogenicity evaluation of a multiclade HIV-1 DNA candidate vaccine. J Infect Dis 2006 Dec 15;194(12):1650-60.

[49] MacGregor RR, Ginsberg R, Ugen KE, et al. T-cell responses induced in normal volunteers immunized with a DNA-based vaccine containing HIV-1 env and rev. AIDS 2002 Nov 8;16(16):2137-43.

[50] Peters BS, Jaoko W, Vardas E, et al. Studies of a prophylactic HIV-1 vaccine candi-date based on modified vaccinia virus Ankara (MVA) with and without DNA prim-ing: effects of dosage and route on safety and immunogenicity. Vaccine 2007 Mar 1;25(11):2120-7.

[51] Catanzaro AT, Koup RA, Roederer M, et al. Phase 1 safety and immunogenicity evaluation of a multiclade HIV-1 candidate vaccine delivered by a replication-defective recombinant adenovirus vector. J Infect Dis 2006 Dec 15;194(12):1638-49.

[52] Cohen J. AIDS research. Promising AIDS vaccine's failure leaves field reeling. Sci-ence 2007 Oct 5;318(5847):28-9.

[53] Shiver JW, Fu TM, Chen L, et al. Replication-incompetent adenoviral vaccine vec-tor elicits effective anti-immunodeficiency-virus immunity. Nature 2002 Jan 17;415(6869):331-5.

[54] Partnership for AIDS Vaccine Evaluation (PAVE). PAVE 100 Trial Information. 2007. Ref Type: Internet Communication

[55] Clark SP, Mak TW. Complete nucleotide sequence of an infectious clone of Friend spleen focus-forming provirus: gp55 is an envelope fusion glycoprotein. Proc Natl Acad Sci U S A 1983 Aug;80(16):5037-41.

Page 87: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Referenzen

78

[56] Hasenkrug KJ, Brooks DM, Robertson MN, Srinivas RV, Chesebro B. Immunopro-tective determinants in friend murine leukemia virus envelope protein. Virology 1998 Aug 15;248(1):66-73.

[57] Chesebro B, Wehrly K, Stimpfling J. Host genetic control of recovery from Friend leukemia virus-induced splenomegaly: mapping of a gene within the major histo-compatability complex. J Exp Med 1974 Dec 1;140(6):1457-67.

[58] Hasenkrug KJ, Valenzuela A, Letts VA, Nishio J, Chesebro B, Frankel WN. Chro-mosome mapping of Rfv3, a host resistance gene to Friend murine retrovirus. J Virol 1995 Apr;69(4):2617-20.

[59] Hoatlin ME, Kabat D. Host-range control of a retroviral disease: Friend erythroleu-kemia. Trends Microbiol 1995 Feb;3(2):51-7.

[60] Persons DA, Paulson RF, Loyd MR, et al. Fv2 encodes a truncated form of the Stk receptor tyrosine kinase. Nat Genet 1999 Oct;23(2):159-65.

[61] Dittmer U, He H, Messer RJ, et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity 2004 Mar;20(3):293-303.

[62] Hunsmann G, Schneider J, Schulz A. Immunoprevention of Friend virus-induced erythroleukemia by vaccination with viral envelope glycoprotein complexes. Virol-ogy 1981 Sep;113(2):602-12.

[63] Iwanami N, Niwa A, Yasutomi Y, Tabata N, Miyazawa M. Role of natural killer cells in resistance against friend retrovirus-induced leukemia. J Virol 2001 Apr;75(7):3152-63.

[64] Kleiser C, Schneider J, Bayer H, Hunsmann G. Immunoprevention of Friend leu-kaemia virus-induced erythroleukaemia by vaccination with aggregated gp70. J Gen Virol 1986 Sep;67 ( Pt 9):1901-7.

[65] Miyazawa M, Nishio J, Chesebro B. Protection against Friend retrovirus-induced leukemia by recombinant vaccinia viruses expressing the gag gene. J Virol 1992 Jul;66(7):4497-507.

[66] Earl PL, Moss B, Morrison RP, Wehrly K, Nishio J, Chesebro B. T-lymphocyte priming and protection against Friend leukemia by vaccinia-retrovirus env gene re-combinant. Science 1986 Nov 7;234(4777):728-31.

[67] Dittmer U, Brooks DM, Hasenkrug KJ. Protection against establishment of retroviral persistence by vaccination with a live attenuated virus. J Virol 1999 May;73(5):3753-7.

[68] Ruan KS, Lilly F. Approach to a retrovirus vaccine: immunization of mice against Friend virus disease with a replication-defective Friend murine leukemia virus. Proc Natl Acad Sci U S A 1992 Dec 15;89(24):12202-6.

[69] Rowe WP, Huebner RJ, Gilmore LK, Parrott RH, Ward TG. Isolation of a cytopa-thogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proc Soc Exp Biol Med 1953 Dec;84(3):570-3.

Page 88: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Referenzen

79

[70] Knipe DM, Howley PM, Griffin DE, et al. Fields Virology. 5th ed. Lippincott Wil-limas & Wilkins, 2007.

[71] Bergelson JM. Receptors mediating adenovirus attachment and internalization. Bio-chem Pharmacol 1999 May 1;57(9):975-9.

[72] Wilson JM. Adenoviruses as gene-delivery vehicles. N Engl J Med 1996 May 2;334(18):1185-7.

[73] Danthinne X, Imperiale MJ. Production of first generation adenovirus vectors: a re-view. Gene Ther 2000 Oct;7(20):1707-14.

[74] Russell WC. Update on adenovirus and its vectors. J Gen Virol 2000 Nov;81(Pt 11):2573-604.

[75] Kochanek S, Clemens PR, Mitani K, Chen HH, Chan S, Caskey CT. A new adeno-viral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA inde-pendently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proc Natl Acad Sci U S A 1996 Jun 11;93(12):5731-6.

[76] Hoffmann D, Wildner O. Comparison of herpes simplex virus- and conditionally replicative adenovirus-based vectors for glioblastoma treatment. Cancer Gene Ther 2007 Jul;14(7):627-39.

[77] Morris JC, Wildner O. Therapy of head and neck squamous cell carcinoma with an oncolytic adenovirus expressing HSV-tk. Mol Ther 2000 Jan;1(1):56-62.

[78] Wildner O, Morris JC, Vahanian NN, Ford H, Jr., Ramsey WJ, Blaese RM. Adeno-viral vectors capable of replication improve the efficacy of HSVtk/GCV suicide gene therapy of cancer. Gene Ther 1999 Jan;6(1):57-62.

[79] Wildner O, Morris JC. The role of the E1B 55 kDa gene product in oncolytic adeno-viral vectors expressing herpes simplex virus-tk: assessment of antitumor efficacy and toxicity. Cancer Res 2000 Aug 1;60(15):4167-74.

[80] Wildner O, Hoffmann D, Jogler C, Uberla K. Comparison of HSV-1 thymidine kinase-dependent and -independent inhibition of replication-competent adenoviral vectors by a panel of drugs. Cancer Gene Ther 2003 Oct;10(10):791-802.

[81] Gao W, Soloff AC, Lu X, et al. Protection of mice and poultry from lethal H5N1 avian influenza virus through adenovirus-based immunization. J Virol 2006 Feb;80(4):1959-64.

[82] Santosuosso M, McCormick S, Zhang X, Zganiacz A, Xing Z. Intranasal boosting with an adenovirus-vectored vaccine markedly enhances protection by parenteral Mycobacterium bovis BCG immunization against pulmonary tuberculosis. Infect Immun 2006 Aug;74(8):4634-43.

[83] Sullivan NJ, Geisbert TW, Geisbert JB, et al. Immune protection of nonhuman pri-mates against Ebola virus with single low-dose adenovirus vectors encoding modi-fied GPs. PLoS Med 2006 Jun;3(6):e177.

Page 89: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Referenzen

80

[84] Douglas JT. Adenoviral vectors for gene therapy. Mol Biotechnol 2007 May;36(1):71-80.

[85] Vanniasinkam T, Ertl HC. Adenoviral gene delivery for HIV-1 vaccination. Curr Gene Ther 2005 Apr;5(2):203-12.

[86] Holterman L, Vogels R, van d, V, et al. Novel replication-incompetent vector de-rived from adenovirus type 11 (Ad11) for vaccination and gene therapy: low sero-prevalence and non-cross-reactivity with Ad5. J Virol 2004 Dec;78(23):13207-15.

[87] Kostense S, Koudstaal W, Sprangers M, et al. Adenovirus types 5 and 35 seropreva-lence in AIDS risk groups supports type 35 as a vaccine vector. AIDS 2004 May 21;18(8):1213-6.

[88] Lemckert AA, Grimbergen J, Smits S, et al. Generation of a novel replication-incompetent adenoviral vector derived from human adenovirus type 49: manufacture on PER.C6 cells, tropism and immunogenicity. J Gen Virol 2006 Oct;87(Pt 10):2891-9.

[89] Barouch DH, Pau MG, Custers JH, et al. Immunogenicity of recombinant adenovi-rus serotype 35 vaccine in the presence of pre-existing anti-Ad5 immunity. J Immu-nol 2004 May 15;172(10):6290-7.

[90] Hoffmann D, Bayer W, Heim A, Potthoff A, Nettelbeck DM, Wildner O. Evaluation of Twenty-One Human Adenovirus Types and One Infectivity-Enhanced Adenovi-rus for the Treatment of Malignant Melanoma. J Invest Dermatol 2007 Oct 25.

[91] Barratt-Boyes SM, Soloff AC, Gao W, et al. Broad cellular immunity with robust memory responses to simian immunodeficiency virus following serial vaccination with adenovirus 5- and 35-based vectors. J Gen Virol 2006 Jan;87(Pt 1):139-49.

[92] Lemckert AA, Sumida SM, Holterman L, et al. Immunogenicity of heterologous prime-boost regimens involving recombinant adenovirus serotype 11 (Ad11) and Ad35 vaccine vectors in the presence of anti-ad5 immunity. J Virol 2005 Aug;79(15):9694-701.

[93] Thorner AR, Lemckert AA, Goudsmit J, et al. Immunogenicity of heterologous re-combinant adenovirus prime-boost vaccine regimens is enhanced by circumventing vector cross-reactivity. J Virol 2006 Dec;80(24):12009-16.

[94] Santra S, Seaman MS, Xu L, et al. Replication-defective adenovirus serotype 5 vec-tors elicit durable cellular and humoral immune responses in nonhuman primates. J Virol 2005 May;79(10):6516-22.

[95] Yang ZY, Wyatt LS, Kong WP, Moodie Z, Moss B, Nabel GJ. Overcoming immu-nity to a viral vaccine by DNA priming before vector boosting. J Virol 2003 Jan;77(1):799-803.

[96] Roizman B, Borman GS, Rousta MK. Macromolecular synthesis in cells infected with herpes simplex virus. Nature 1965 Jun 26;206(991):1374-5.

Page 90: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Referenzen

81

[97] Everett RD, Fenwick ML. Comparative DNA sequence analysis of the host shutoff genes of different strains of herpes simplex virus: type 2 strain HG52 encodes a truncated UL41 product. J Gen Virol 1990 Jun;71 ( Pt 6):1387-90.

[98] Lubinski JM, Jiang M, Hook L, et al. Herpes simplex virus type 1 evades the effects of antibody and complement in vivo. J Virol 2002 Sep;76(18):9232-41.

[99] Lin X, Lubinski JM, Friedman HM. Immunization strategies to block the herpes simplex virus type 1 immunoglobulin G Fc receptor. J Virol 2004 Mar;78(5):2562-71.

[100] Neumann J, Eis-Hubinger AM, Koch N. Herpes simplex virus type 1 targets the MHC class II processing pathway for immune evasion. J Immunol 2003 Sep 15;171(6):3075-83.

[101] Orr MT, Edelmann KH, Vieira J, Corey L, Raulet DH, Wilson CB. Inhibition of MHC class I is a virulence factor in herpes simplex virus infection of mice. PLoS Pathog 2005 Sep;1(1):e7.

[102] La S, Kim J, Kwon BS, Kwon B. Herpes simplex virus type 1 glycoprotein D inhib-its T-cell proliferation. Mol Cells 2002 Dec 31;14(3):398-403.

[103] Mogensen TH, Melchjorsen J, Malmgaard L, Casola A, Paludan SR. Suppression of proinflammatory cytokine expression by herpes simplex virus type 1. J Virol 2004 Jun;78(11):5883-90.

[104] Samady L, Costigliola E, MacCormac L, et al. Deletion of the virion host shutoff protein (vhs) from herpes simplex virus (HSV) relieves the viral block to dendritic cell activation: potential of vhs- HSV vectors for dendritic cell-mediated immuno-therapy. J Virol 2003 Mar;77(6):3768-76.

[105] Epstein AL, Marconi P, Argnani R, Manservigi R. HSV-1-derived recombinant and amplicon vectors for gene transfer and gene therapy. Curr Gene Ther 2005 Oct;5(5):445-58.

[106] Martuza RL, Malick A, Markert JM, Ruffner KL, Coen DM. Experimental therapy of human glioma by means of a genetically engineered virus mutant. Science 1991 May 10;252(5007):854-6.

[107] Goldstein DJ, Weller SK. Herpes simplex virus type 1-induced ribonucleotide reduc-tase activity is dispensable for virus growth and DNA synthesis: isolation and char-acterization of an ICP6 lacZ insertion mutant. J Virol 1988 Jan;62(1):196-205.

[108] Cameron JM, McDougall I, Marsden HS, Preston VG, Ryan DM, Subak-Sharpe JH. Ribonucleotide reductase encoded by herpes simplex virus is a determinant of the pathogenicity of the virus in mice and a valid antiviral target. J Gen Virol 1988 Oct;69 ( Pt 10):2607-12.

[109] Spector T, Averett DR, Nelson DJ, et al. Potentiation of antiherpetic activity of acy-clovir by ribonucleotide reductase inhibition. Proc Natl Acad Sci U S A 1985 Jun;82(12):4254-7.

Page 91: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Referenzen

82

[110] Mineta T, Rabkin SD, Yazaki T, Hunter WD, Martuza RL. Attenuated multi-mutated herpes simplex virus-1 for the treatment of malignant gliomas. Nat Med 1995 Sep;1(9):938-43.

[111] Todo T, Martuza RL, Rabkin SD, Johnson PA. Oncolytic herpes simplex virus vec-tor with enhanced MHC class I presentation and tumor cell killing. Proc Natl Acad Sci U S A 2001 May 22;98(11):6396-401.

[112] Miyatake S, Iyer A, Martuza RL, Rabkin SD. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. J Virol 1997 Jul;71(7):5124-32.

[113] Chung RY, Saeki Y, Chiocca EA. B-myb promoter retargeting of herpes simplex vi-rus gamma34.5 gene-mediated virulence toward tumor and cycling cells. J Virol 1999 Sep;73(9):7556-64.

[114] Yamamura H, Hashio M, Noguchi M, et al. Identification of the transcriptional regu-latory sequences of human calponin promoter and their use in targeting a condition-ally replicating herpes vector to malignant human soft tissue and bone tumors. Can-cer Res 2001 May 15;61(10):3969-77.

[115] Krisky DM, Marconi PC, Oligino TJ, et al. Development of herpes simplex virus replication-defective multigene vectors for combination gene therapy applications. Gene Ther 1998 Nov;5(11):1517-30.

[116] Krisky DM, Wolfe D, Goins WF, et al. Deletion of multiple immediate-early genes from herpes simplex virus reduces cytotoxicity and permits long-term gene expres-sion in neurons. Gene Ther 1998 Dec;5(12):1593-603.

[117] Speck PG, Efstathiou S, Minson AC. In vivo complementation studies of a glycoprotein H-deleted herpes simplex virus-based vector. J Gen Virol 1996 Oct;77 ( Pt 10):2563-8.

[118] Fraefel C, Song S, Lim F, et al. Helper virus-free transfer of herpes simplex virus type 1 plasmid vectors into neural cells. J Virol 1996 Oct;70(10):7190-7.

[119] Duke CM, Maguire CA, Keefer MC, Federoff HJ, Bowers WJ, Dewhurst S. HSV-1 amplicon vectors elicit polyfunctional T cell responses to HIV-1 Env, and strongly boost responses to an adenovirus prime. Vaccine 2007 Oct 16;25(42):7410-21.

[120] Hocknell PK, Wiley RD, Wang X, et al. Expression of human immunodeficiency vi-rus type 1 gp120 from herpes simplex virus type 1-derived amplicons results in po-tent, specific, and durable cellular and humoral immune responses. J Virol 2002 Jun;76(11):5565-80.

[121] Wang X, Wiley RD, Evans TG, Bowers WJ, Federoff HJ, Dewhurst S. Cellular im-mune responses to helper-free HSV-1 amplicon particles encoding HIV-1 gp120 are enhanced by DNA priming. Vaccine 2003 Jun 2;21(19-20):2288-97.

[122] Marthas ML, Miller CJ, Sutjipto S, et al. Efficacy of live-attenuated and whole-inactivated simian immunodeficiency virus vaccines against vaginal challenge with virulent SIV. J Med Primatol 1992 Feb;21(2-3):99-107.

Page 92: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Referenzen

83

[123] Whitney JB, Ruprecht RM. Live attenuated HIV vaccines: pitfalls and prospects. Curr Opin Infect Dis 2004 Feb;17(1):17-26.

[124] Gurunathan S, Klinman DM, Seder RA. DNA vaccines: immunology, application, and optimization*. Annu Rev Immunol 2000;18:927-74.

[125] Tang DC, DeVit M, Johnston SA. Genetic immunization is a simple method for elic-iting an immune response. Nature 1992 Mar 12;356(6365):152-4.

[126] Ulmer JB, Donnelly JJ, Parker SE, et al. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science 1993 Mar 19;259(5102):1745-9.

[127] Freund J, McDermott D. Sensitization to horse serum by means of adjuvants. Proc Soc Exp Biol Med 1942;49:548-53.

[128] Ahlers JD, Dunlop N, Alling DW, Nara PL, Berzofsky JA. Cytokine-in-adjuvant steering of the immune response phenotype to HIV-1 vaccine constructs: granulo-cyte-macrophage colony-stimulating factor and TNF-alpha synergize with IL-12 to enhance induction of cytotoxic T lymphocytes. J Immunol 1997 Apr 15;158(8):3947-58.

[129] Ahlers JD, Belyakov IM, Matsui S, Berzofsky JA. Mechanisms of cytokine synergy essential for vaccine protection against viral challenge. Int Immunol 2001 Jul;13(7):897-908.

[130] Bolesta E, Kowalczyk A, Wierzbicki A, et al. Increased level and longevity of pro-tective immune responses induced by DNA vaccine expressing the HIV-1 Env gly-coprotein when combined with IL-21 and IL-15 gene delivery. J Immunol 2006 Jul 1;177(1):177-91.

[131] Song R, Liu S, Adams RJ, Leong KW. Enhancing efficacy of HIV gag DNA vaccine by local delivery of GM-CSF in murine and macaque models. J Interferon Cytokine Res 2006 Jun;26(6):380-9.

[132] Janeway CA, Travers P, Walport M, Shlomchik M. Immunobiology. 5. ed. Garland Science, 2001.

[133] Ichinohe T, Watanabe I, Ito S, et al. Synthetic double-stranded RNA poly(I:C) com-bined with mucosal vaccine protects against influenza virus infection. J Virol 2005 Mar;79(5):2910-9.

[134] Llopiz D, Dotor J, Zabaleta A, et al. Combined immunization with adjuvant mole-cules poly(I:C) and anti-CD40 plus a tumor antigen has potent prophylactic and therapeutic antitumor effects. Cancer Immunol Immunother 2008 Jan;57(1):19-29.

[135] Zabaleta A, Arribillaga L, Llopiz D, et al. Induction of potent and long-lasting CD4 and CD8 T-cell responses against hepatitis C virus by immunization with viral anti-gens plus poly(I:C) and anti-CD40. Antiviral Res 2007 Apr;74(1):25-35.

[136] Zhu X, Nishimura F, Sasaki K, et al. Toll like receptor-3 ligand poly-ICLC promotes the efficacy of peripheral vaccinations with tumor antigen-derived peptide epitopes in murine CNS tumor models. J Transl Med 2007;5:10.

Page 93: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Referenzen

84

[137] Cong Y, Jupelli M, Guentzel MN, Zhong G, Murthy AK, Arulanandam BP. Intrana-sal immunization with chlamydial protease-like activity factor and CpG deoxynu-cleotides enhances protective immunity against genital Chlamydia muridarum infec-tion. Vaccine 2007 May 10;25(19):3773-80.

[138] Klinman DM. CpG oligonucleotides accelerate and boost the immune response elic-ited by AVA, the licensed anthrax vaccine. Expert Rev Vaccines 2006 Jun;5(3):365-9.

[139] Zimmermann S, Dalpke A, Heeg K. CpG oligonucleotides as adjuvant in therapeutic vaccines against parasitic infections. Int J Med Microbiol 2007 Aug 21.

[140] la Cruz JS, Lau SY, Ramirez EM, et al. Protein vaccination with the HER2/neu ex-tracellular domain plus anti-HER2/neu antibody-cytokine fusion proteins induces a protective anti-HER2/neu immune response in mice. Vaccine 2003 Mar 28;21(13-14):1317-26.

[141] Nayak BP, Sailaja G, Jabbar AM. Enhancement of gp120-specific immune re-sponses by genetic vaccination with the human immunodeficiency virus type 1 enve-lope gene fused to the gene coding for soluble CTLA4. J Virol 2003 Oct;77(20):10850-61.

[142] Tacken PJ, de V, I, Gijzen K, et al. Effective induction of naive and recall T-cell re-sponses by targeting antigen to human dendritic cells via a humanized anti-DC-SIGN antibody. Blood 2005 Aug 15;106(4):1278-85.

[143] Bower JF, Green TD, Ross TM. DNA vaccines expressing soluble CD4-envelope proteins fused to C3d elicit cross-reactive neutralizing antibodies to HIV-1. Virology 2004 Oct 25;328(2):292-300.

[144] Dempsey PW, Allison ME, Akkaraju S, Goodnow CC, Fearon DT. C3d of comple-ment as a molecular adjuvant: bridging innate and acquired immunity. Science 1996 Jan 19;271(5247):348-50.

[145] Li DJ, Wang HM, Li L, et al. Gene fusion of molecular adjuvant C3d to hCGbeta enhances the anti-hCGbeta antibody response in DNA immunization. J Reprod Im-munol 2003 Dec;60(2):129-41.

[146] Baez-Astua A, Herraez-Hernandez E, Garbi N, et al. Low-dose adenovirus vaccine encoding chimeric hepatitis B virus surface antigen-human papillomavirus type 16 E7 proteins induces enhanced E7-specific antibody and cytotoxic T-cell responses. J Virol 2005 Oct;79(20):12807-17.

[147] Terada K, Wakimoto H, Tyminski E, Chiocca EA, Saeki Y. Development of a rapid method to generate multiple oncolytic HSV vectors and their in vivo evaluation us-ing syngeneic mouse tumor models. Gene Ther 2006 Apr;13(8):705-14.

[148] He TC, Zhou S, da Costa LT, Yu J, Kinzler KW, Vogelstein B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A 1998 Mar 3;95(5):2509-14.

Page 94: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Referenzen

85

[149] Nilsson M, Ljungberg J, Richter J, et al. Development of an adenoviral vector sys-tem with adenovirus serotype 35 tropism; efficient transient gene transfer into pri-mary malignant hematopoietic cells. J Gene Med 2004 Jun;6(6):631-41.

[150] Graham FL, van der Eb AJ. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 1973 Apr;52(2):456-67.

[151] Schumacher TN. MHC Tetramers. 2007. Ref Type: Internet Communication

[152] Lutz MB, Kukutsch N, Ogilvie AL, et al. An advanced culture method for generat-ing large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Im-munol Methods 1999 Feb 1;223(1):77-92.

[153] Kovacs H, O'Ddonoghue SI, Hoppe HJ, et al. Solution structure of the coiled-coil trimerization domain from lung surfactant protein D. J Biomol NMR 2002 Oct;24(2):89-102.

[154] Bateman AR, Harrington KJ, Kottke T, et al. Viral fusogenic membrane glycopro-teins kill solid tumor cells by nonapoptotic mechanisms that promote cross presenta-tion of tumor antigens by dendritic cells. Cancer Res 2002 Nov 15;62(22):6566-78.

[155] Hoffmann D, Bayer W, Grunwald T, Wildner O. Intratumoral expression of respira-tory syncytial virus fusion protein in combination with cytokines encoded by adeno-viral vectors as in situ tumor vaccine for colorectal cancer. Mol Cancer Ther 2007 Jul;6(7):1942-50.

[156] Hoffmann D, Bayer W, Wildner O. In situ tumor vaccination with adenovirus vec-tors encoding measles virus fusogenic membrane proteins and cytokines. World J Gastroenterol 2007 Jun 14;13(22):3063-70.

[157] Hoffmann D, Bayer W, Wildner O. Therapeutic immune response induced by intra-tumoral expression of the fusogenic membrane protein of vesicular stomatitis virus and cytokines encoded by adenoviral vectors. Int J Mol Med 2007 Nov;20(5):673-81.

[158] Rechsteiner M, Rogers SW. PEST sequences and regulation by proteolysis. Trends Biochem Sci 1996 Jul;21(7):267-71.

[159] Higginbotham JN, Seth P, Blaese RM, Ramsey WJ. The release of inflammatory cy-tokines from human peripheral blood mononuclear cells in vitro following exposure to adenovirus variants and capsid. Hum Gene Ther 2002 Jan 1;13(1):129-41.

[160] Muruve DA, Barnes MJ, Stillman IE, Libermann TA. Adenoviral gene therapy leads to rapid induction of multiple chemokines and acute neutrophil-dependent hepatic injury in vivo. Hum Gene Ther 1999 Apr 10;10(6):965-76.

[161] Messer RJ, Dittmer U, Peterson KE, Hasenkrug KJ. Essential role for virus-neutralizing antibodies in sterilizing immunity against Friend retrovirus infection. Proc Natl Acad Sci U S A 2004 Aug 17;101(33):12260-5.

Page 95: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Referenzen

86

[162] Kawabata H, Niwa A, Tsuji-Kawahara S, et al. Peptide-induced immune protection of CD8+ T cell-deficient mice against Friend retrovirus-induced disease. Int Immu-nol 2006 Jan;18(1):183-98.

[163] Sugahara D, Tsuji-Kawahara S, Miyazawa M. Identification of a protective CD4+ T-cell epitope in p15gag of Friend murine leukemia virus and role of the MA protein targeting the plasma membrane in immunogenicity. J Virol 2004 Jun;78(12):6322-34.

[164] Buge SL, Murty L, Arora K, et al. Factors associated with slow disease progression in macaques immunized with an adenovirus-simian immunodeficiency virus (SIV) envelope priming-gp120 boosting regimen and challenged vaginally with SIVmac251. J Virol 1999 Sep;73(9):7430-40.

[165] Rasmussen RA, Ong H, Song R, et al. Efficacy of a multigenic protein vaccine con-taining multimeric HIV gp160 against heterologous SHIV clade C challenges. AIDS 2007 Sep;21(14):1841-8.

[166] Zhang PF, Cham F, Dong M, et al. Extensively cross-reactive anti-HIV-1 neutraliz-ing antibodies induced by gp140 immunization. Proc Natl Acad Sci U S A 2007 Jun 12;104(24):10193-8.

[167] Fomsgaard A, Nielsen HV, Nielsen C, et al. Comparisons of DNA-mediated immu-nization procedures directed against surface glycoproteins of human immunodefi-ciency virus type-1 and hepatitis B virus. APMIS 1998 Jun;106(6):636-46.

[168] Davis HL, Michel ML, Whalen RG. DNA-based immunization induces continuous secretion of hepatitis B surface antigen and high levels of circulating antibody. Hum Mol Genet 1993 Nov;2(11):1847-51.

[169] Rosato A, Zoso A, Milan G, et al. Individual analysis of mice vaccinated against a weakly immunogenic self tumor-specific antigen reveals a correlation between CD8 T cell response and antitumor efficacy. J Immunol 2003 Nov 15;171(10):5172-9.

[170] Quantin B, Perricaudet LD, Tajbakhsh S, Mandel JL. Adenovirus as an expression vector in muscle cells in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 1992 Apr 1;89(7):2581-4.

[171] Reiss-Gutfreund RJ, Nowotny NR, Dostal V, Wrba H. Augmented immunogenicity of Lewis lung carcinoma by infection with herpes simplex virus type 2. Eur J Cancer Clin Oncol 1982 Jun;18(6):523-31.

[172] Toda M, Rabkin SD, Kojima H, Martuza RL. Herpes simplex virus as an in situ can-cer vaccine for the induction of specific anti-tumor immunity. Hum Gene Ther 1999 Feb 10;10(3):385-93.

[173] Karan D, Krieg AM, Lubaroff DM. Paradoxical enhancement of CD8 T cell-dependent anti-tumor protection despite reduced CD8 T cell responses with addition of a TLR9 agonist to a tumor vaccine. Int J Cancer 2007 Oct 1;121(7):1520-8.

[174] Salucci V, Mennuni C, Calvaruso F, et al. CD8+ T-cell tolerance can be broken by an adenoviral vaccine while CD4+ T-cell tolerance is broken by additional co-administration of a Toll-like receptor ligand. Scand J Immunol 2006 Jan;63(1):35-41.

Page 96: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Referenzen

87

[175] Tucker SP, Srinivas RV, Compans RW. Molecular domains involved in oligomeri-zation of the Friend murine leukemia virus envelope glycoprotein. Virology 1991 Dec;185(2):710-20.

[176] Yang YY, Tojo A, Watanabe N, Amanuma H. Oligomerization of Friend spleen fo-cus-forming virus (SFFV) env glycoproteins. Virology 1990 Jul;177(1):312-6.

[177] Furcinitti PS, van OJ, Burnett RM. Adenovirus polypeptide IX revealed as capsid cement by difference images from electron microscopy and crystallography. EMBO J 1989 Dec 1;8(12):3563-70.

[178] Stewart PL, Fuller SD, Burnett RM. Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. EMBO J 1993 Jul;12(7):2589-99.

[179] Blacklow SC, Lu M, Kim PS. A trimeric subdomain of the simian immunodefi-ciency virus envelope glycoprotein. Biochemistry 1995 Nov 21;34(46):14955-62.

[180] Lu M, Blacklow SC, Kim PS. A trimeric structural domain of the HIV-1 transmem-brane glycoprotein. Nat Struct Biol 1995 Dec;2(12):1075-82.

[181] Staropoli I, Chanel C, Girard M, Altmeyer R. Processing, stability, and receptor binding properties of oligomeric envelope glycoprotein from a primary HIV-1 iso-late. J Biol Chem 2000 Nov 10;275(45):35137-45.

[182] Farzan M, Choe H, Desjardins E, et al. Stabilization of human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein trimers by disulfide bonds introduced into the gp41 glycoprotein ectodomain. J Virol 1998 Sep;72(9):7620-5.

[183] Earl PL, Sugiura W, Montefiori DC, et al. Immunogenicity and protective efficacy of oligomeric human immunodeficiency virus type 1 gp140. J Virol 2001 Jan;75(2):645-53.

[184] Earl PL, Broder CC, Long D, et al. Native oligomeric human immunodeficiency vi-rus type 1 envelope glycoprotein elicits diverse monoclonal antibody reactivities. J Virol 1994 May;68(5):3015-26.

[185] Forsell MN, Li Y, Sundback M, et al. Biochemical and immunogenic characteriza-tion of soluble human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein trimers expressed by semliki forest virus. J Virol 2005 Sep;79(17):10902-14.

[186] Boyle JS, Brady JL, Lew AM. Enhanced responses to a DNA vaccine encoding a fu-sion antigen that is directed to sites of immune induction. Nature 1998 Mar 26;392(6674):408-11.

[187] Deliyannis G, Boyle JS, Brady JL, Brown LE, Lew AM. A fusion DNA vaccine that targets antigen-presenting cells increases protection from viral challenge. Proc Natl Acad Sci U S A 2000 Jun 6;97(12):6676-80.

[188] Sewell DA, Shahabi V, Gunn GR, III, Pan ZK, Dominiecki ME, Paterson Y. Re-combinant Listeria vaccines containing PEST sequences are potent immune adju-vants for the tumor-associated antigen human papillomavirus-16 E7. Cancer Res 2004 Dec 15;64(24):8821-5.

Page 97: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Referenzen

88

[189] Dubois MF, Pourcel C, Rousset S, Chany C, Tiollais P. Excretion of hepatitis B sur-face antigen particles from mouse cells transformed with cloned viral DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 1980 Aug;77(8):4549-53.

[190] Letvin NL. Progress in the development of an HIV-1 vaccine. Science 1998 Jun 19;280(5371):1875-80.

[191] Elion GB. Mechanism of action and selectivity of acyclovir. Am J Med 1982 Jul 20;73(1A):7-13.

[192] Morrison LA, Knipe DM. Immunization with replication-defective mutants of her-pes simplex virus type 1: sites of immune intervention in pathogenesis of challenge virus infection. J Virol 1994 Feb;68(2):689-96.

[193] Brehm M, Samaniego LA, Bonneau RH, DeLuca NA, Tevethia SS. Immunogenicity of herpes simplex virus type 1 mutants containing deletions in one or more alpha-genes: ICP4, ICP27, ICP22, and ICP0. Virology 1999 Apr 10;256(2):258-69.

[194] Murphy CG, Lucas WT, Means RE, et al. Vaccine protection against simian immu-nodeficiency virus by recombinant strains of herpes simplex virus. J Virol 2000 Sep;74(17):7745-54.

[195] Sutter G, Wyatt LS, Foley PL, Bennink JR, Moss B. A recombinant vector derived from the host range-restricted and highly attenuated MVA strain of vaccinia virus stimulates protective immunity in mice to influenza virus. Vaccine 1994 Aug;12(11):1032-40.

[196] Hirsch VM, Fuerst TR, Sutter G, et al. Patterns of viral replication correlate with outcome in simian immunodeficiency virus (SIV)-infected macaques: effect of prior immunization with a trivalent SIV vaccine in modified vaccinia virus Ankara. J Vi-rol 1996 Jun;70(6):3741-52.

[197] Sievers E, Neumann J, Raftery M, SchOnrich G, Eis-Hubinger AM, Koch N. Glyco-protein B from strain 17 of herpes simplex virus type I contains an invariant chain homologous sequence that binds to MHC class II molecules. Immunology 2002 Sep;107(1):129-35.

[198] Bennett EM, Bennink JR, Yewdell JW, Brodsky FM. Cutting edge: adenovirus E19 has two mechanisms for affecting class I MHC expression. J Immunol 1999 May 1;162(9):5049-52.

[199] Andersson M, Paabo S, Nilsson T, Peterson PA. Impaired intracellular transport of class I MHC antigens as a possible means for adenoviruses to evade immune surveillance. Cell 1985 Nov;43(1):215-22.

[200] Tanaka Y, Tevethia SS. Differential effect of adenovirus 2 E3/19K glycoprotein on the expression of H-2Kb and H-2Db class I antigens and H-2Kb- and H-2Db-restricted SV40-specific CTL-mediated lysis. Virology 1988 Aug;165(2):357-66.

Page 98: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Dissertationsbezogene bibliografische Daten

89

8. Dissertationsbezogene bibliografische Daten

Publikationen

Hoffmann D, Bangen JM, Bayer W, Wildner O

Synergy between expression of fusogenic membrane proteins, chemotherapy and facultative

virotherapy in colorectal cancer

Gene Ther. 2006 Nov;13(21):1534-44

Hoffmann D, Bayer W, Wildner O

Local and distant immune-mediated control of colon cancer growth with fusogenic membrane

glycoproteins in combination with viral oncolysis

Hum Gene Ther. 2007 May;18(5):435-50

Hoffmann D, Bayer W, Wildner O

In situ tumor vaccination with adenovirus vectors encoding measles virus fusogenic mem-

brane proteins and cytokines

World J Gastroenterol. 2007 Jun 14;13(22):3063-70

Hoffmann D, Bayer W, Grunwald T, Wildner O

Intratumoral expression of respiratory syncytial virus fusion protein in combination with cy-

tokines encoded by adenoviral vectors as in situ tumor vaccine for colorectal cancer

Mol Cancer Ther. 2007 Jul;6(7):1942-50

Hoffmann D, Bayer W, Wildner O

Therapeutic immune response induced by intratumoral expression of the fusogenic membrane

protein of vesicular stomatitis virus and cytokines encoded by adenoviral vectors

Int J Mol Med. 2007 Nov;20(5):673-81

Hoffmann D, Bayer W, Heim A, Potthoff A, Nettelbeck DM, Wildner O

Evaluation of Twenty-One Human Adenovirus Types and One Infectivity-Enhanced Adeno-

virus for the Treatment of Malignant Melanoma

J Invest Dermatol. 2007 Oct 25; [Epub ahead of print]

Page 99: Evaluierung adenoviraler und herpesviraler Vektoren zur ... · 1983 das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) aus an AIDS (aquired immunodeficiency syndrome ) Erkrankten isoliert, das

Dissertationsbezogene bibliografische Daten

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Bayer W, Schimmer S, Hoffmann D, Dittmer U, Wildner O

Evaluation of the Friend Virus model for the development of improved adenovirus-vectored

anti-retroviral vaccination strategies

Vaccine (zur Publikation akzeptiert)

Präsentationen

Use of Different Adenovirus Serotypes in Prime-Boost Vaccination Enhances Immune Pro-

tection against Friend Virus

Third European Congress of Virology, Nürnberg, 1.-5. September 2007

Use of Different Adenovirus Serotypes in Prime-Boost Vaccination Enhances Immune Pro-

tection against Friend Virus

37. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Immunologie, Heidelberg, 5.-8. September

2007

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Lebenslauf

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9. Lebenslauf

Persönliche Daten

Name: Wibke Bayer

Geburtstag: 03.03.1981

Geburtsort: Hagen

Nationalität: Deutsch

Schulische Ausbildung

1987-1991 Grundschule in Hamm-Werries und Hamm-Rhynern

1991-2000 Gymnasium Hammonense, Hamm

Studium und Promotion

WS 2000/01 - WS 2004/05 Studium der Biochemie an der Ruhr-Universität Bochum

Oktober 2004 Diplomarbeit in der Abteilung für Molekulare und Medizini-

sche Virologie, AG Dr. med. O. Wildner: „Identifikation und

Charakterisierung zellulärer und viraler Interaktionspartner der

humanen Adenovirus E4-Genprodukte mittels Hefe Two-

Hybrid-Screening“

seit November 2004 Promotion in der Abteilung für Molekulare und Medizinische

Virologie, AG PD Dr. med. O. Wildner

Stipendium

11/2004 –08/2007 DFG-Doktoranden-Stipendium im Rahmen des Graduiertenkol-

legs 1045/1 „Modulation von Wirtszellfunktionen für die Be-

handlung viraler und bakterieller Infektionen“

Preise

07.12.2005 Förderpreis der Sophia & Fritz Heinemann-Stifung zur Förde-

rung der Entwicklung rekombinanter Herpesviren zur Behand-

lung des malignen Melanoms

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Danksagung

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10. Danksagung

Ich danke Herrn PD Dr. med. Oliver Wildner für die Überlassung des Themas, sein Interesse

am Fortgang der Forschungsarbeiten, seine Unterstützung bei der Umsetzung des Projekts

und die ständige Ermunterung, eigene Ideen einzubringen.

Herrn Prof. Dr. rer. nat. Michael Hollmann danke ich für die Übernahme des Zweitgutach-

tens.

Bei Prof. Dr. rer. nat. Ulf Dittmer möchte ich mich für die sehr gute Kooperation während

dieser Arbeit sowie seine guten Ratschläge und hilfreiche Diskussionen bedanken. Den Mit-

gliedern seiner Arbeitsgruppe, besonders Simone Schimmer, möchte ich für die zahlreichen

praktischen Ratschläge und die Hilfestellung bei einigen Experimenten danken.

Ich möchte mich bei allen Mitarbeitern der Abteilung für Molekulare und Medizinische Viro-

logie für das freundschaftliche Arbeitsklima und ihre Hilfsbereitschaft bedanken. Einen be-

sonderen Dank möchte ich an meinen langjährigen Labornachbarn Dr. Dennis Hoffmann rich-

ten, für die gute Zusammenarbeit, gemeinsame Projekte und Publikationen, seine Hilfsbereit-

schaft, geteilte Freud und geteiltes Leid und die Hilfe bei zahllosen Vakzinierungen. Ebenfalls

einen besonderen Dank an Dr. Matthias Tenbusch für viele hilfreiche Diskussionen und

Ratschläge und aufmunternde Gespräche. Claudius Großmann danke ich für die Hilfe bei den

Vakzinierungen. Klaus Sure möchte ich für seine ständige Hilfsbereitschaft, die Einführung in

quantitative PCRs und die Rettung bei vielen Computer-Problemen danken.

Ich danke allen Mitgliedern des Graduiertenkolleg 1045/1 für die tolle Gemeinschaft, das

große Engagement, lehrreiche Vorträge und hilfreiche Diskussionen.

Meiner Familie danke ich für ihre Unterstützung während meines Studiums und meiner Pro-

motion, die mir diese Ausbildung ermöglicht hat.

Ich danke besonders meinem Freund Uwe Schmidt, der mir immer den Rücken gestärkt und

mich unterstützt hat.