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Expression und Verteilung von VIP, Substanz P, CGRP und Bombesin im Larynx und der oberen Trachea
Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Medizin genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Simone Schön geb. Kaußen
aus
Stolberg (Rheinland)
Berichter: Herr Professor Dr. med. Ercole Francois Nikolaus Di Martino Herr Universitätsprofessor Dr. med. Martin Westhofen Tag der mündlichen Prüfung: 20. April 2007 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG .......................................................................................................1
1.1 Larynx und Trachea .........................................................................................................2 1.1.1 Anatomie ....................................................................................................................2 1.1.2 Histologie....................................................................................................................4 1.1.3 Innervation..................................................................................................................6 1.1.4 Funktion......................................................................................................................7 1.1.5 Erkrankungen von Larynx und Trachea .....................................................................7
1.2 Neuropeptide .................................................................................................................11 1.2.1 Vasoaktives intestinales Polypeptid .........................................................................12 1.2.2 Substanz P ...............................................................................................................13 1.2.3 Calcitonin gene-related peptide................................................................................14 1.2.4 Bombesin .................................................................................................................16
2 MATERIAL ........................................................................................................17
2.1 Erstellung der Paraffinschnitte .......................................................................................17
2.2 Immunhistochemie an den Paraffinschnitten nach der Avidin-Biotin-Methode..............17
2.3 Fotodokumentation ........................................................................................................18
3 METHODEN ......................................................................................................19
3.1 Auswahl der Präparate ..................................................................................................19
3.2 Fixierung und Einbettung ...............................................................................................20
3.3 Erstellung der Paraffinschnitte .......................................................................................20
3.4 Immunhistochemie an den Paraffinschnitten nach der Avidin-Biotin-Methode..............20
3.5 Positivkontrollen / Negativkontrollen ..............................................................................23
3.6 Bewertungskriterien .......................................................................................................24
4 ERGEBNISSE ...................................................................................................26
4.1 Patientendaten...............................................................................................................26 4.1.1 Altersverteilung und Geschlecht der Patienten – Larynx..........................................26 4.1.2 Altersverteilung und Geschlecht der Patienten – Trachea .......................................27
4.2 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung der Larynxpräparate.........................28 4.2.1 Vasoaktives intestinales Polypeptid .........................................................................28 4.2.2 Substanz P ...............................................................................................................30 4.2.3 Calcitonin gene-related peptide................................................................................31 4.2.4 Bombesin .................................................................................................................32
Inhaltsverzeichnis II
4.3 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung der Tracheapräparate ......................33 4.3.1 Vasoaktives intestinales Polypeptid .........................................................................33 4.3.2 Substanz P ...............................................................................................................34 4.3.3 Calcitonin gene-related peptide................................................................................35 4.3.4 Bombesin .................................................................................................................36
4.4 Ergebnis der Positivkontrollen .......................................................................................38
4.5 Ergebnis der Negativkontrollen......................................................................................39
4.6 Tabellarische Ergebnisübersicht....................................................................................40 4.6.1 Larynx.......................................................................................................................40 4.6.2 Trachea ....................................................................................................................42
5 DISKUSSION.....................................................................................................44
6 ZUSAMMENFASSUNG.....................................................................................49
7 ANHANG ...........................................................................................................50
8 LITERATURVERZEICHNIS...............................................................................51
9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .........................................................................58
10 DANKSAGUNG.................................................................................................60
11 LEBENSLAUF...................................................................................................61
Abbildungsverzeichnis III
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1: Makroskopische Ansicht eines Larynx. Blick von dorsal und lateral auf
die Epiglottis.................................................................................................3
Abbildung 1.2: Makroskopische Ansicht von Larynx und Trachea einschließlich ihrer
Bifurkation von dorsal...................................................................................4
Abbildung 1.3: Larynx; histologisches Präparat; Vergrößerung 400fach; Färbung:
Azan. 1: Zilien; 2: basale Zellen; 3: intermediäre Zellen; 4:
Becherzellen; 5: Lamina propria. [aus: „Taschenatlas der Zytologie,
Histologie und mikroskopischen Anatomie“, Wolfgang Kühnel, Georg
Thieme Verlag 1995; S. 83, Abb. 111]. ........................................................5
Abbildung 1.4: Trachea; histologisches Präparat; Vergrößerung 400fach; Färbung:
Azan. 1: Basalknötchenreihe; 2: Gefäß; 3: Kinozilien; 4: Kern einer
Becherzelle. [aus: „Taschenatlas der Zytologie, Histologie und
mikroskopischen Anatomie“, Wolfgang Kühnel, Georg Thieme Verlag
1995; S. 83, Abb. 110]. ................................................................................6
Abbildung 3.1: Immunhistochemie nach der ABC-Methode. Der Avidin-Biotin-Enzym-
Komplex bindet über einen biotinylierten Sekundärantikörper an den
Primärantikörper.........................................................................................23
Abbildung 3.2: Protein S-100; Stimmlippe; Vergrößerung: 500fach; Färbung:
Diaminobenzidin-Hämalaun. Nervenfaszikel (Pfeilmarkierung) im
Stroma des Stimmlippengewebes..............................................................24
Abbildung 4.1: Altersverteilung – Larynx ............................................................................26
Abbildung 4.2: Altersverteilung – Trachea..........................................................................27
Abbildung 4.3: VIP; Stimmlippe; Vergrößerung 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-
Hämalaun. VIP-haltige seröse Drüsen (Pfeilmarkierung) im Verband
mit mukösen Drüsen, die VIP-negativ sind. Im Stroma Fibrozyten mit
geringer Neuropeptidexpression. ...............................................................28
Abbildung 4.4: Substanz P; Stimmlippe; Vergrößerung 500fach, Färbung:
Diaminobenzidin-Hämalaun. Mit Pfeilen dargestellt die serösen
Drüsen eines Ausführungsganges, die in mäßiger Konzentration
Abbildungsverzeichnis IV
Substanz P exprimierten. Unten eine muköse Drüse ohne Substanz
P. Das Cytoplasma mit mäßiger Neuropeptidexpression. .........................30
Abbildung 4.5: CGRP; Stimmlippe; Vergrößerung 500fach; Färbung:
Diaminobenzidin-Hämalaun. Oben ein nicht braun angefärbtes und
somit nicht CGRP-haltiges Feld muköser Drüsen, unten ein mäßig
braun gefärbtes seröses Drüsenfeld. Dazwischen Fibrozyten mit
hohem Gehalt an CGRP. ...........................................................................31
Abbildung 4.6: Bombesin; Stimmlippe; Vergrößerung 500fach; Färbung:
Diaminobenzidin-Hämalaun. Dargestellt sind muköse Drüsenfelder
ohne Bombesingehalt. Rechts ein Ausführungsgang mit stark
angefärbten serösen Drüsen. In den Fibrozyten wurde Bombesin
sehr stark exprimiert...................................................................................32
Abbildung 4.7: VIP; Trachea; Vergrößerung 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-
Hämalaun. Mit Pfeilen dargestellt sind seröse Drüsen, die im
Gegensatz zu den abgebildeten mukösen Drüsen eine deutliche
Braunfärbung im Sinne einer mäßigen VIP-Expression aufzeigen. ...........33
Abbildung 4.8: Substanz P; Trachea; Vergrößerung 500fach; Färbung:
Diaminobenzidin-Hämalaun. Nicht angefärbte muköse Drüsenanteile
neben Fibrozyten mit mäßiger Substanz-P-Expression (Pfeile).
Ebenso gelang ein mäßiger Nachweis in Blutgefäßen. .............................34
Abbildung 4.9: CGRP; Trachea; Vergrößerung 500fach. Färbung: Diaminobenzidin-
Hämalaun. Dargestellt sind Nervenfaszikel mit sehr hoher Expression
von CGRP (Pfeile), sowie Anteile von mukösen Drüsen, die einen
mäßigen Gehalt an CGRP aufweisen. Rechts oben eine Arteriole mit
mäßiger CGRP-Expression........................................................................35
Abbildung 4.10: Bombesin; Trachea; Vergrößerung 500fach; Färbung:
Diaminobenzidin-Hämalaun. Die Pfeile deuten auf Nervenfaszikel mit
hoher Bombesin-Expression. Das muköse Drüsenfeld enthält kein
Bombesin. Die Fibrozyten zeigen einen hohen Transmittergehalt.............36
Abbildung 4.11: Bombesin; Trachea; Vergrößerung 500fach; Färbung:
Diaminobenzidin-Hämalaun: Die Pfeile zeigen auf die intensiv braun
angefärbte Lamina propria; ein Zeichen für eine sehr starke
Expression von Bombesin innerhalb der Basalmembran. .........................37
Abbildungsverzeichnis V
Abbildung 4.12: Positivkontrolle mit VIP; Duodenalschleimhaut; Vergrößerung
500fach; Färbung: Diaminobenzidin-Hämalaun. Braungefärbte
Epithelzellen und Fibrozyten (Pfeile) als Zeichen einer VIP-
Expression in der Duodenalschleimhaut....................................................38
Abbildung 4.13: Negativkontrolle ohne Substanz P; Trachea; Vergrößerung 500fach,
Färbung: Diaminobenzidin-Hämalaun. Keine Braunfärbung im Sinne
eine Substanz-P-Expression sichtbar. .......................................................39
Tabelle 4.1: Intensität der Immunreaktionen der Neuropeptide an
unterschiedlichen histologischen Strukturen des Larynx. Drüsen
waren nur in Einzelfällen nachweisbar. n = 10 Stimmlippenpräparate. .....40
Tabelle 4.2: Intensität der Immunreaktionen der Neuropeptide an
unterschiedlichen histologischen Strukturen der Trachea. n = 25
Tracheapräparate.......................................................................................42
Einleitung 1
1 Einleitung
Für die Aufrechterhaltung einer optimalen Organfunktion ist u.a. das
Zusammenwirken unterschiedlichster Enzyme, Hormone sowie verschiedener
Transportsysteme von Bedeutung. Dies trifft auch für die Gruppe der Neuropeptide
zu, deren Relevanz für den oberen Respirationstrakt in der Vergangenheit sowohl an
Tierpräparaten als auch am Menschen nachgewiesen werden konnte [Basterra et al.,
1989; Hisa et al., 1992; Hauser-Kronberger et al., 1992, 1993, 1994].
Neuropeptide, wie das Vasoaktive intestinale Polypeptid (VIP), Substanz P (SP),
Calcitonin gene-related peptide (CGRP) und Bombesin (BN), setzen sich aus
Aminosäuren zusammen und erreichen, nach ihrer Synthese in Nervenzellen,
entweder über Diffusion durch den synaptischen Spalt oder aber als Neurohormone
über die Blutbahn ihr Zielorgan. Sie üben eine modulierende Wirkung auf die
klassischen Transmitter Noradrenalin und Acetylcholin aus, ohne eigenständig
adrenerge oder cholinerge Effekte hervorrufen zu können. Aus diesem Grund
bezeichnet man sie auch als non-adrenerges, non-cholinerges (NANC-) System.
Einige Neuropeptide vermindern oder verstärken Effekte wie Vasodilatation,
Ödembildung und Hypersekretion an Drüsen [Richardson & Webber, 1987; Lundberg
et al., 1991], andere führen zur Kontraktion glatter Muskulatur [Said, 1987]. Die
Peptide Bombesin und Substanz P sollen an Reparaturmechanismen beteiligt sein
[Yule et al., 1999; Lunn et al., 2000]. Durch derartige Effekte erhält das gesamte
neuronale System eine höhere Präsizion und mehr Komplexität.
Im Kopf-Hals-Bereich gehen eine Vielzahl von entzündlichen, aber auch malignen
Erkrankungen von Larynx und Trachea unter anderem mit Ödembildung, Alteration
der Durchblutung, vermehrter Schleimsekretion und narbigen Stenosen einher. In
diese Prozesse sind Neuropeptide in vielfältiger Weise involviert. Ziel der Arbeit war
es, die Expression und Verteilung der Neuropeptide VIP, SP, CGRP und BN in den
einzelnen histologischen Substrukturen von Kehlkopf und Luftröhre zu untersuchen.
Da über die Präsenz von Neuropeptiden insbesondere in der menschlichen Trachea
nur wenige Studien vorliegen [u.a. Berisha et al., 2002], war nicht nur die
Untersuchung von erkranktem Gewebe von Interesse.
Einleitung 2
1.1 Larynx und Trachea
1.1.1 Anatomie
Das Kehlkopfskelett setzt sich aus dem Schildknorpel (Cartilago thyroidea), dem
Ringknorpel (Cartilago cricoidea), den beiden Stellknorpeln (Cartilago arytenoidea)
und dem Kehldeckel (Epiglottis) zusammen. Diese knorpeligen Komponenten des
Larynx, der nach kranial vom Zungenbein und nach kaudal von der Trachea begrenzt
wird, stehen sowohl über Gelenke als auch über Bänder miteinander in Verbindung.
Aufgrund der sagital gestellten, paarig angelegten Taschen- und Stimmfalte wird der
Kehlkopf in drei Etagen unterteilt:
Die Supraglottis erstreckt sich vom Larynxeingang bis zur Höhe der Taschenfalten.
Die Glottis reicht von den Taschenfalten bis zu den Stimmlippen.
Der Bereich unterhalb der Stimmlippen bis zum Unterrand des Ringknorpels wird als
Subglottis bezeichnet.
Die unmittelbare Nachbarschaft der Stimmlippen stellt den sogenannten
Reinke´schen Raum dar.
Die Kehlkopfmuskeln, die in äußere und innere Muskeln weiter untergliedert werden
können, regeln durch Lageveränderungen der Knorpel zueinander die Stellung der
Stimmritze. Einziger Öffner der Stimmritze ist dabei der M. cricoarytenoideus
(„Postikus“).
Arteriell wird der Kehlkopf durch die A. laryngea superior (aus der A. thyroidea
superior) und aus der A. laryngea inferior (aus der A. thyroidea inferior) versorgt. Das
venöse Blut des oberen Larynxanteils gelangt über die V. laryngea superior in die V.
thyroidea superior, während aus dem unteren Anteil Blut von der V. laryngea inferior
in den Plexus thyroideus impar abgegeben wird.
Der Lymphabfluss erfolgt im sehr dichten Lymphkapillarnetz der Supraglottis in die
vertikalen zervikalen Lymphabflussketten und insbesondere in die Lymphknoten im
Bereich des jugulofazialen Venenwinkels. Die Drainage kann dabei ipsilateral,
kontralateral oder bilateral erfolgen. Die prälaryngealen Lymphknoten, die aufgrund
ihrer prognostischen Bedeutung bei Larynxmalignomen eine übergeordnete Stellung
einnehmen, werden auch als „Delphi-Lymphknoten“ bezeichnet.
Einleitung 3
Da die Glottis nur spärlich über Lymphkapillaren verfügt, erfolgt hier die Drainage
hauptsächlich nach kranial in das supraglottische Kapillarnetz sowie in das
präepiglottische Fett [Westhofen M., 2001].
Identisch erfolgt der Lymphabfluss im Bereich der Subglottis. Zusätzlich bestehen
Verbindungen zu den peritrachealen und mediastinalen Lymphknoten.
bbildung 1.1: Makroskopische Ansicht eines Larynx. Blick von dorsal und lateral auf die
Die Trachea stellt die Verbindung zwischen Kehlkopf und Lunge her. Das 10 bis 12
A
Epiglottis.
cm lange und 13 bis 20 cm breite Rohr gabelt sich vor dem 4. und 5.
Brustwirbelkörper in die beiden Hauptbronchien auf. In die Wand der Trachea sind 12
bis 16 hufeisenförmige, hyaline Knorpelspangen eingelassen, die nach dorsal
geöffnet sind. Diese Knorpelspangen, die für Stabilität sorgen und das
Tracheallumen offen halten, sind über starke elastische Bänder miteinander
verbunden. Die Rückseite der Trachea wird von einer Bindegewebs-Muskel-
Membran (Paries membranaceus) gebildet. Die in dieser Hinterwand
querverlaufende, glatte Muskulatur bewirkt durch Kontraktion eine Lumenverengung
der Trachea – die Schleimhaut legt sich daraufhin in Längsfalten. Weiterhin
ermöglichen elastische Fasernetze eine Verlängerung des Organs.
Einleitung 4
Die Blutversorgung der Trachea erfolgt überwiegend über Rami tracheales aus der
A. thyroidea inferior, zu einem kleinen Teil auch aus der A. thyroidea superior. Das
venöse Blut gelangt in den Plexus thyroideus impar.
Die Lymphe fließt über den Truncus bronchomediastinalis ab.
Abbildung 1.2: Makroskopische Ansicht von Larynx und Trachea einschließlich ihrer Bifurkation
von dorsal.
1.1.2 Histologie
Histologisch ist der Larynx von mehrreihigem Flimmerepithel mit Becher-, Basal- und
Flimmerepithelzellen ausgekleidet und weist eine kollagen-elastische Tunica propria
mit gemischten tubulo-alveolären Drüsen auf. Eine Ausnahme bildet die Stimmlippe:
im Bereich der Plica vocalis ist die Schleimhaut unverschieblich mit der Unterlage
Einleitung 5
verwachsen und besteht aus einem mehrschichtigen, stellenweise verhornten
Abbildung 1.3: Larynx; histologisches Präparat; Vergrößerung 400fach; Färbung: Azan.
Plattenepithel, welches keine Drüsen enthält.
1:
Zilien; 2: basale Zellen; 3: intermediäre Zellen; 4: Becherzellen; 5: Lamina
Die Trachea beste ina
epithelialis und Lamina propria -, einer Tunica fibromusculocartilaginea und einer
tracheales besonders im Bereich der Pars membranacea. Anschließend an die
propria. [aus: „Taschenatlas der Zytologie, Histologie und mikroskopischen
Anatomie“, Wolfgang Kühnel, Georg Thieme Verlag 1995; S. 83, Abb. 111].
ht histologisch aus einer Tunica mucosa – aufgeteilt in Lam
Tunica adventitia. Das respiratorische Epithel ist mit Schleim aus Becherzellen und
Glandulae tracheales bedeckt, der durch den Kinozilienschlag auf der Oberfläche
zum Einfangen des Staubes verteilt und dann rachenwärts abtransportiert wird, um
von dort in den Verdauungstrakt zu gelangen. In der Lamina propria, einem
kollagenfaserigen Bindegewebsbereich, sitzen die seromukösen Glandulae
Tunica fibromusculocartilaginea, die sich dem Namen nach aus Bindegewebe,
Muskulatur und Knorpel zusammensetzt, stellt die aus lockerem Bindegewebe
bestehende Adventitia die Verbindung zum Mediastinum her.
Einleitung 6
Abbildung 1.4: Trachea; histologisches Präparat; Vergrößerung 400fach; Färbung: Azan. 1:
Basalknötchenreihe; 2: Gefäß; 3: Kinozilien; 4: Kern einer Becherzelle. [aus:
„Taschenatlas der Zytologie, Histologie und mikroskopischen Anatomie“,
Wolfgang Kühnel, Georg Thieme Verlag 1995; S. 83, Abb. 110].
1.1.3 Innervation
Die nervale Innervation des Larynx wird vom Nervus vagus übernommen, der neben
dem motorischen Anteil auch sensible und sekretorische Fasern führt. Motorisch
innerviert der N. laryngeus superior aus dem N. vagus über einen Ramus externus
lediglich den M. cricothyroideus. Alle anderen Muskeln werden über den N. laryngeus
inferior versorgt. Die sensiblen Fasern des Ramus externus aus dem N. laryngeus
superior innervieren den vorderen Teil der Stimmlippe, wohingegen die restliche
Stimmlippenschleimhaut über den Ramus internus versorgt wird. Alle
Larynxabschnitte, die sich unterhalb der Stimmritze befinden, erhalten ihre sensible
Innervation über den N. laryngeus inferior. Sowohl der N. laryngeus superior als auch
der N. laryngeus inferior führen sympathische Fasern des Grenzstranges und
versorgen auf diesem Weg die Drüsen und Gefäße der Schleimhaut.
Die nervale Innervation der Trachea wird sowohl über Rami tracheales aus dem N.
laryngeus inferior als auch über den Brustgrenzstrang gewährleistet.
Einleitung 7
1.1.4 Funktion
Zu den Funktionen des Larynx gehören Atmung, Verhinderung der Aspiration bei der
Nahrungsaufnahme, Stabilisierung des Thorax sowie die Phonation, bei der es zu
Schwingungen der Stimmlippe kommt. Für alle Funktionen des Kehlkopfes ist der
Öffnungszustand der Stimmritze sowie die Stimmlippenspannung von erheblicher
Bedeutung. Bei der Phonation wird mit Hilfe des von den Drüsen produzierten
Schleims ein Flüssigkeitspolster bereitgestellt, welches Faltenbildungen des Epithels
ermöglicht und damit die aerodynamischen Abläufe bei der Tonerzeugung
gewährleistet.
Die Trachea gehört zusammen mit den Bronchi zu den luftleitenden Abschnitten der
Atmungsorgane. Damit nimmt sie nicht am aktiven Gasaustausch teil, sondern stellt
im Hinblick auf die Atmung einen Totraum dar. Zu ihren Aufgaben gehören
hauptsächlich die Kontrolle, Anfeuchtung, Aufwärmung und Reinigung der Atemluft.
Dabei spielt ein oberflächlicher, dem Epithel aufgelagerter Schleimfilm eine große
Rolle, der von seromukösen Drüsen ständig produziert wird. Darin abgelagerte
Partikel gelangen durch die Aktivität der Kinozilien mit einer Geschwindigkeit von 15
mm pro Minute Richtung Larynx. Weiterhin besteht eine der Hauptfunktionen der
Trachea in der Aufrechterhaltung eines ausreichend großen Lumens, um die
ungehinderte Passage der Atemluft zu gewährleisten.
1.1.5 Erkrankungen von Larynx und Trachea
Krankheitsprozesse im Larynx lassen sich nach ätiologischen Gesichtspunkten in
entzündliche und traumatische Geschehen sowie in benigne und maligne Tumoren
unterteilen. Wichtige Unterschiede liegen neben den auslösenden Faktoren vor allem
in den klinischen Untersuchungsbefunden.
Entzündungen
Akute Laryngitis:
Die akute Laryngitis wird durch virale oder bakterielle Infekte, durch
Stimmüberlastungen, inhalative Noxen oder durch absteigende Entzündungen
hervorgerufen [Werda, 1994]. Vorherrschende Symptome sind Heiserkeit,
Schmerzen und ein Druckgefühl im Hals. Bei der Laryngoskopie ist eine
Einleitung 8
Gefäßinjektion im Stimmlippenbereich sowie ein symmetrisch ausgeprägtes Ödem
der Larynxschleimhaut erkennbar [Westhofen M., 2001].
Laryngitis subglottica acuta („Pseudokrupp“):
Betroffen sind vorwiegend Säuglinge und Kleinkinder zwischen dem 6. Lebensmonat
und dem 4. Lebensjahr männlichen Geschlechts mit Virusinfekt [Beck, 1997]. Ein
plötzlich auftretender bellender Husten mit Dyspnoe, inspiratorischem Stridor und
hohem Fieber sind die typischen Symptome. Bei der Kehlkopfspiegelung sind
gerötete, polsterartige Schwellungen mit ebenfalls geröteten subglottischen
Stimmbändern erkennbar [Werda, 1994].
Akute Epiglottitis:
Die akute Epiglottitis wird bei Kindern durch eine Infektion mit Haemophilus
influenzae Typ B hervorgerufen. Bei Erwachsenen kann sie aufgrund von Zysten am
Zungengrund oder der Epiglottis, Verletzungen, radiogenen Ödemen, postoperativen
Abflusstörungen oder Abszessen auftreten. Kennzeichnend sind Dyspnoe mit in- und
exspiratorischem Stridor, Schluckschmerzen sowie eine kloßige Sprache. Bei der
Spiegeluntersuchung fallen starke Schwellungen und Rötungen der Epiglottis und
der Aryregion auf [Werda, 1994; Beck, 1997].
Perichondritis:
Die Perichondritis des Kehlkopfes wird vornehmlich durch Verletzung oder zu hohe
Tracheotomie hervorgerufen. Weitere Faktoren sind Entzündungen, vor allem nach
Bestrahlungen. Die Symptome sind Heiserkeit sowie ein zunehmender Stridor. Bei
der Laryngoskopie sind Rötungen, schmierige Beläge und ggf. auch
Knorpelnekrosen zu sehen [Werda, 1994].
Laryngitis chronica:
Die chronische Laryngitis, von der häufiger Männer als Frauen betroffen sind, hat
vielfältige Ursachen. Dazu gehören die akute Laryngitis, chronische Noxen wie
Nikotin, Arbeitsbelastungen durch Staub oder Hitze, chronische
Nasennebenhöhlenentzündungen, Stimmüberlastungen oder Bronchitiden.
Kennzeichnende Symptome sind Reizhusten sowie Globusgefühl mit ständigem
Räusperzwang. Die gesamte Larynxschleimhaut zeigt sich gerötet mit erweiterten
Gefäßen. Ebenfalls sind in einigen Fällen Schleim oder Eiter erkennbar. Die
Larynxmukosa ist ödematös oder atrophisch verändert [Werda, 1994].
Einleitung 9
Larynxtuberkulose:
Der Befall des Kehlkopfes bei der meldepflichtigen Tuberkulose macht sich durch
chronische Heiserkeit bemerkbar. Oft imponieren einseitig rötlichbraune Knoten,
Granulationen oder Ulzerationen an den Stimmbändern.
Ein Beispiel für eine traumatische Erkrankung ist die Kehlkopfsynechie. Als Folge
von Verätzungen durch Säuren und Laugen, durch Verbrühungen oder Operationen
entstehen Vernarbungen, die meist im vorderen Drittel der Stimmlippen lokalisiert
sind.
Benigne Tumoren
Polypen:
Die histologisch als Fibrome, Angiofibrome oder Intubationsgranulome
imponierenden Polypen werden überwiegend durch chronische Stimmbelastungen
und chronische Laryngitiden hervorgerufen. Je nach Größe und Lokalisation kommt
es zu mehr oder weniger ausgeprägter Heiserkeit. Bei der Spiegelung sieht man
gestielt oder breitbasig aufsitzende Tumoren mit bevorzugtem Sitz am freien
Stimmbandrand [Werda, 1994].
Reinke-Ödem:
Das Reinke-Ödem ist vorwiegend auf chronische Noxen, vor allem Nikotinabusus,
sowie unsachgemäßen Stimmeinsatz zurückzuführen und äußert sich durch
Heiserkeit. Bei der Untersuchung erkennt man ein subepitheliales Ödem der
Stimmbänder [Werda, 1994].
Sängerknötchen:
Sie sind meist beidseitig vorhanden und entstehen durch chronische
Überbeanspruchung der Stimme. Bei der Diagnostik ist eine Hyperkeratose im
Übergang vom vorderen zum mittleren Drittel der Stimmbänder vorhanden [Werda,
1994].
Papillome:
Papillome entstehen auf dem Boden einer Virusinfektion. Die blumenkohlartigen
Auflagerungen, die einzeln oder multipel auftreten können, führen zu Heiserkeit bis
hin zu Aphonie [Werda, 1994].
Einleitung 10
Laryngozele:
Unter einer Laryngozele versteht man eine Aussackung des Sinus Morgagni, die
angeboren oder – vor allem bei Glasbläsern und Trompetern – erworben sein kann
und sich durch Heiserkeit bemerkbar macht [Werda, 1994].
Retentionszyste:
Durch einen Einschluss von Schleim entstehen an der Epiglottis und im
Taschenband rundliche, glasige Tumoren, die bei Schmerzen und
Funktionseinschränkungen des Larynx reseziert werden [Werda, 1994].
Die wichtigste maligne Veränderung im Kehlkopf stellt das Larynxkarzinom dar. Die
Erkrankung ist multifaktoriell bedingt, wobei ein Kontakt mit chronischen Noxen wie
Nikotin oder Alkohol, eine berufliche Exposition gegenüber Asbest [Westhofen M.,
2001] aber auch präkanzeröse Veränderungen wie die Leukoplakie die Ausbildung
eines Kehlkopfkarzinoms begünstigen. Histologisch handelt es sich in der Mehrzahl
der Fälle um verhornende Plattenepithelkarzinome. Das wesentliche Symptom ist
eine anhaltende Heiserkeit, die über Wochen besteht. Daneben kommt es zu Husten,
Globusgefühl und in späteren Stadien zu Schluckbeschwerden. Aufgrund der
Lokalisation werden supraglottische, glottische, subglottische und
Hypopharynxkarzinome unterschieden. Wird ein Larynxkarzinom nicht behandelt,
führt es meist innerhalb von 12 bis 16 Monaten zum Tod [Werda, 1994].
Bei der Trachea unterscheidet man zwischen entzündlichen, traumatischen und
tumorösen Erkrankungen.
Entzündungen
Chronische Tracheobronchitis:
Bei der chronischen Tracheobronchitis ist häufig eine gemeinsame Beteiligung von
Larynx und Tracheobronchialsystem zu beobachten. In diesem Fall stellt Heiserkeit
das Hauptsymptom dar. Ist nur die Trachea betroffen, kommt es zu Reizhusten sowie
zum Auswurf eines schleimigen und meist farblosen Sekrets [Naumann & Scherer,
1998].
Einleitung 11
Tracheitis:
Die durch virale oder bakterielle Infektionen hervorgerufene Entzündung der
Luftröhrenschleimhaut ist durch weiße bis rötliche Schleimbeläge sowie eventuell
durch Eiter gekennzeichnet.
Als traumatische Erkrankung der Trachea ist die Trachealstenose anzusehen. Dabei
kommt es zu Vernarbungen der Luftröhrenwände, die angeboren oder erworben sein
können. Die Tracheomalazie kann – angeboren durch eine Erweichung der
Knorpelringe oder aber auch erworben durch Druck von außen, z.B. bei einer großen
Struma oder nach Tracheotomie – zu einer weichen Trachealstenose führen. Durch
Verletzungen oder nach Langzeitbeatmung entsteht meist eine starre
Trachealstenose. Die Atemnot entwickelt sich in der Mehrzahl der Fälle langsam,
kann aber auch akut lebensbedrohlich werden [Beck, 1997].
Bei den tumorösen Erkrankungen der Trachea unterscheidet man zwischen denen,
die als Primärtumor in der Trachea selber entstehen – dazu gehören Adenome,
Fibrome, Lipome und Karzinome – und denen, die von umliegenden
Gewebestrukturen in die Trachea einwachsen. Dies können Tumoren des
Ösophagus, der Schilddrüse oder des Mediastinums sein. Neben zunehmender
Atemnot findet man gelegentlich blutiges Sputum [Beck, 1997].
1.2 Neuropeptide
Neuropeptide sind Botenstoffe, die funktionell eine Zwischenstellung unter reinen
Hormonen und Neurotransmittern einnehmen. Ihre Wirkung ist durch die Vermittlung
langsamer, aber lang anhaltender endo- und parakriner Effekte gekennzeichnet. Da
sie jedoch lediglich einen unterstützenden oder hemmenden Einfluss auf andere
Transmitter ausüben, ohne eine eigenständige Reaktion hervorzurufen, werden sie
auch als Neuromodulatoren bezeichnet. Mehrere Neuropeptide können gleichzeitig
im selben Axonterminal kolokalisiert sein, zum Beispiel Substanz P und Calcitonin
gene-related peptide. Alle Neurotransmitter mit Ausnahme von Acetylcholin setzen
sich aus Aminosäuren, Derivaten von Aminosäuren oder Polypeptiden zusammen.
Nach der Biosynthese im Cytosol von Nervenzellen werden sie mit Hilfe eigener
Transportsysteme in spezifische, synaptische Vesikel aufgenommen. Der Transport
verläuft im Sinne eines sekundär aktiven Transmitter-Protonen-Antiportes, dessen
benötigter Protonengradient durch ATPasen aufgebaut wird. Nach Freisetzung der
Einleitung 12
Substanzen erfolgt an der postsynaptischen Membran die Bindung an bestimmte
Rezeptoren. Diese stellen überwiegend ligandenregulierte Ionenkanäle dar. Sobald
der Transmitter an den Rezeptor gebunden hat, wird er inaktiviert und danach
entweder auf enzymatischem Weg abgebaut oder mit Hilfe eines natriumabhängigen
Transportes in den präsynaptischen Bereich recycled. Neuropeptide kommen nicht
nur im Zentralnervensystem sondern auch im peripheren autonomen Nervensystem
vor. Dieses System wurde in einen extrinsischen und einen intrinsischen Teil
untergliedert, die beide den Gastrointestinaltrakt innervieren. Das extrinsische
System ist dadurch gekennzeichnet, dass die Neurone außerhalb des
Gastrointestinaltraktes lokalisiert sind: parasympathische Fasern erreichen entweder
auf direktem Weg oder über die prävertebralen Ganglien ihren Wirkungsort.
Sympathische Fasern ziehen zu den paravertebralen Ganglien oder verlassen als
Nervi splanchnici das Rückenmark. Beim intrinsic System liegen die Ganglien in
Form des Plexus myentericus und Plexus submucosus zwischen den
Muskelschichten beziehungsweise in der Submukosa, also innerhalb des
Verdauungstraktes. Beide Anteile des peripheren Nervensystems enthalten
peptiderge Überträgerstoffe, so dass von einem eigenständigen peptidergen
Nervensystem gesprochen werden kann. Während das intrinsische System VIP, SP,
CGRP und Bombesin enthält, konnten im extrinsischen System VIP und SP im
parasympathischen und sympathischen Anteil, Bombesin nur im sympathischen
Anteil und CGRP gar nicht nachgewiesen werden [Schusdziarra, 1985]. Zur
Freisetzung von Neuropeptiden kommt es vor allem bei hohen
Entladungsfrequenzen und bei gruppierten Entladungen der Neurone. Ihre Aufgabe
besteht in der Verstärkung oder Verminderung der Wirkung klassischer Transmitter
und der Aufrechterhaltung tonischer Effektorantworten bei langanhaltender
neuronaler Aktivierung. So spielen sie unter anderem eine Rolle bei der Nozizeption,
kardiovaskulärer Regulation, Drüsensekretion, Inflammation und bei der
neuroendokrinen Steuerung.
1.2.1 Vasoaktives intestinales Polypeptid
Das vasoaktive intestinale Polypeptid (VIP) wurde erstmals als vasodilatativ
wirkendes Peptid aus dem Darm isoliert. Es besteht aus 28 Aminosäuren mit
folgender Sequenz: His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Thy-Thr-Arg-Leu-Glu-Lys-
Glu-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn.
Einleitung 13
Obwohl ursprünglich als typisches „gastrointestinales Hormon“ kategorisiert, ist sein
Vorkommen mittlerweile sowohl im peripheren als auch im zentralen Nervensystem
gesichert. Gemeinsam mit Sekretin, Glukagon, GIP (gastric inhibitory peptide) und
PACAP (pituitary adenylate cyclase activating peptide) gehört es zur Sekretin-
Gruppe, die durch eine identische Aminosäuresequenz innerhalb der jeweiligen
Peptidketten gekennzeichnet ist. Nach der Synthese in Nervenendigungen und der
Freisetzung aus den synaptischen Vesikeln erfolgt die intrazelluläre
Wirkungsvermittlung über die Stimulation des Adenylatcyclasesystems [Said, 1987]
und der nachfolgenden Aktivierung einer cAMP-abhängigen Proteinkinase.
Zu den Hauptwirkungen von VIP gehört die Modulation der Magen-Darm-Motorik:
zusammen mit Stickstoffmonoxid (NO) führt VIP zu einer Hemmung der glatten
Muskulatur und damit insbesondere zu einer Relaxation des Magens und zur
Erschlaffung der Circulärmuskulatur des Darms. Auf die peristaltische Welle übt VIP
ebenso wie NO und ATP einen hemmenden Einfluss aus.
Während es in Darm, Pankreas und Leber unter VIP zu einer Stimulation der
Sekretion kommt, wird die HCl-Sekretion im Magen inhibiert.
Weiterhin stellt VIP einen starken Vasodilatator dar, was bezogen auf den
Verdauungstrakt mit einer Erhöhung der Darmdurchblutung verbunden ist.
In den synaptischen Vesikeln findet man das Neuropeptid häufig kolokalisiert mit
Acetylcholin, zum Beispiel in den cholinergen Neuronen zu Schweißdrüsen, zu
Speicheldrüsen und zu den Rankenarterien des erektilen Gewebes der
Genitalorgane.
Im menschlichen Kehlkopf konnte das vasoaktive intestinale Polypeptid bereits
nachgewiesen werden [Basterra et al., 1989; Hauser-Kronberger et al., 1993].
1.2.2 Substanz P
1931 entdeckten Euler und Gaddum eine Substanz in Extrakten von Gehirn und
Eingeweiden von Pferden, die nach i.v.-Applikation bei Kaninchen eine transiente
Hypotension hervorrief. Später testete man diese Substanz an isolierten
Eingeweiden und stellte fest, dass sie Acetylcholin-ähnliche Kontraktionen
verursachte, die durch ACh-Antagonisten nicht blockierbar waren. Den aktiven Teil
dieses Extraktes nannte man Substanz P, ein Neuropeptid aus 11 Aminosäuren
(Sequenz: Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met; [Chang et al., 1971]).
Einleitung 14
Substanz P entsteht nach enzymatischer Abspaltung aus inaktiven Vorstufen – den
Preprotachykininen – im Soma der Zelle [Nawa et al., 1983] und wird über
axoplasmatische Mechanismen zu den Nervenendigungen transportiert [Keen et al.,
1982]. Zusammen mit Neurokinin A und Neurokinin B stellt es die Gruppe der
Tachykinine dar, die durch eine identische Aminosäuresequenz am Carboxy-
terminalen Ende definiert sind und an Neurokinin-Rezeptoren binden. Die
intrazelluläre Wirkungsvermittlung erfolgt über eine Phospholipase-C-Aktivierung.
Neben der Verbreitung in den sensiblen C-Fasern des ZNS und PNS konnte
Substanz P auch im Gastrointestinaltrakt, in Endothelzellen sowie in Eosinophilen
nachgewiesen werden [Hua et al., 1985; Lundberg & Saria, 1987; Loesch et al.,
1993; Stones et al., 1995; Cioni et al., 1998].
Die Freisetzung des Transmitters aus den Nervenendigungen erfolgt als Reaktion auf
exzitatorische, mechanische, chemische und entzündliche Reize. Wie viele andere
Neuropeptide spielt Substanz P bei der Schmerzleitung über sensible Fasern eine
Rolle und begünstigt zudem entzündungsfördernde Gefäßreaktionen wie
Plasmaextravasation oder Histaminfreisetzung mit anschließender Vasodilatation
[Goetzl et al., 1985; Maggi & Meli, 1987; Holzer, 1988].
Im Intestinaltrakt führt Substanz P zu einer Zunahme der intestinalen Motilität.
Im ZNS beeinflusst der Neurotransmitter inhibitorische Neurone. Im Gegensatz zu
dem dort dominierenden Transmitter GABA tritt die Wirkung der Neuropeptide
langsamer ein und ist überdies abhängig von der Frequenz eintreffender
Aktionspotentiale. Substanz P übernimmt neben nozizeptiven auch barorezeptive
und chemorezeptive Funktionen [von Euler & Pernow, 1954; Nagashima et al., 1989;
Chen et al., 1990].
Weitere Studien zeigen, dass SP wesentlich die Sekretion unterschiedlichster
Substanzen fördert: so stimuliert es beispielsweise die Sekretion von TNF-α, IL-1
und IL-6 aus peripheren Monozyten [Lotz et al., 1988]. In der Trachea trägt Substanz
P zur Sekretion des Trachealschleims bei, indem es sowohl die Sekretion seröser
Zellen steigert als auch an den Ausführungsgängen der Drüsen zur Kontraktion
myoepithelialer Zellen führt [Richardson & Webber, 1987].
1.2.3 Calcitonin gene-related peptide
Calcitonin gene-related peptide (CGRP) ist ein Neuropeptid, bestehend aus 37
Aminosäuren (Sequenz: Arg-Ala-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Val-Thr-His-Arg-Leu-Ala-
Einleitung 15
Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Met-Val-Lys-Ser-Asn-Phe-Val-Pro-Thr-Asn-Val-
Gly-Ser-Lys-Ala), welches im Hypothalamus durch alternierendes Spleißen der
Calcitoningen-mRNA entsteht [Rosenfeld et al., 1981; Amara et al., 1982; Dockray,
1987].
Die Wirkung von CGRP wird über G-Protein gekoppelte Rezeptoren vermittelt.
Obwohl es auch in der Schilddrüse existiert, konnte nachgewiesen werden, dass
CGRP in wesentlich höheren Konzentrationen im ZNS vorhanden ist. Dort vor allem
im Hypothalamus, dem limbischen System, der Hypophyse, in den Perikarya des
Ganglion trigeminale, in den Axonen der C- und Aδ-Fasern und in den
Hirnnervenkernen [Gibson et al., 1984; Unger et al., 1991; Levine et al., 1993; van
Rossum et al., 1997].
Daneben tritt dieses Neuropeptid auch in Herz, Lungen, Gastrointestinaltrakt sowie
im peripheren Nervensystem – oft im Verbund mit der glatten Muskulatur von
Blutgefäßen – auf.
Durch Akkumulation von cAMP wirkt CGRP als starker, lang anhaltender peripherer
und zerebraler Vasodilatator [Brain et al., 1985; Edwards et al., 1991]. So bewirkt es
im peripheren Nervensystem eine Tachykardie mit Senkung des Blutdrucks [Sigrist et
al., 1986].
Injiziert man CGRP jedoch in das Ventrikelsystem, kommt es sowohl zu einem
Anstieg des Noradrenalinspiegels im Plasma als auch zu einer Tachykardie mit
Blutdruckzunahme.
Überdies kann man unter CGRP-Einfluss einen Abfall der Magensäure- und
Pepsinsekretion beobachten. Weiterhin spielt der Transmitter eine Rolle bei der
Hunger-Sättigungs-Regulation sowie bei der Regulation von Hormonen der
Thalamus-Hypophysen-Achse [Tannenbaum & Goltzman, 1985; Molina et al., 1990].
Im Hinblick auf die Kolokalisation mit anderen peptidergen Überträgerstoffen konnte
nachgewiesen werden, dass CGRP zusammen mit Tachykininen zu finden ist und
besonders auf Substanz P wirkungsverstärkende Effekte ausübt [Domeij et al., 1991;
Hauser-Kronberger et al., 1993; Luts et al., 1993; Smet et al., 1997; Nishi et al.,
2000]. So beeinflusst es bei Entzündungsmechanismen die Ödembildung in der Haut
von Ratten, indem es die permeable Wirkung von Substanz P verstärkt [Newbold &
Brain, 1993].
Einleitung 16
1.2.4 Bombesin
Im menschlichen Organismus konnte das Gastrin-releasing-peptide (GRP) als
humanes Äquivalent zum Peptid Bombesin nachgewiesen werden, welches in der
Haut von Amphibien der Familie Discoglossidae, Bombina Bombina und Bombina
variegata variegata zu finden ist [Anastasi et al., 1971; Dockray, 1987]. Es handelt
sich dabei um ein Peptid aus 14 Aminosäuren mit folgender Sequenz: Pyr-Gln-Arg-
Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met.
Hauptsyntheseorte dieses Peptids sind die im Antrum des Magens sowie in den
oberen Dünndarmabschnitten vorhandenen G-Zellen. Strukturell besteht eine enge
Verwandtschaft zum Cholezystokinin (CCK) mit Wirkungsvermittlung über den CCK-
B-Rezeptor. Die Kontrolle der Synthese und Sekretion von Bombesin erfolgt
hauptsächlich über Aminosäuren und Proteine im Magenlumen. So erfolgt eine
Stimulierung durch Nährstoffe, Magendehnung und Vagusreiz, wohingegen ein
luminaler pH<3, VIP sowie Somatostatin aus benachbarten Zellen zu einer
Synthesehemmung führen.
Bereits 1971 zeigten Anastasi et al. in Tierexperimenten eine große Anzahl
pharmakologischer Effekte, die durch Bombesin an verschiedenen Spezies
hervorgerufen wurden: Hypertension, Uterus-, Colon- und Ileumstimulation, erhöhte
Sekretion der Belegzellen im Magen, gesteigerter Transport von Chloridionen von
der serösen zur mukösen Seite der Magenmukosa, Gallenblasenkontraktion,
hyperglykämische Reaktionen sowie erhöhte Insulinspiegel im peripheren Blut.
Nach Aktivierung der Phospolipase C stimuliert Bombesin besonders im
Pankreasgewebe die Enzymsekretion von Acinuszellen über eine Mobilisierung
intrazellulärer Calciumspeicher. Im Jahre 1973 schrieben Impicciatore und Bertaccini
dem Neuropeptid eine hochpotente spasmogene Wirkung zu, die nicht durch
Antagonisten gegen bekannte Bronchokonstriktoren blockierbar ist. Daraus
schlossen sie, dass Bombesin entweder auf direktem Weg die Atemmuskulatur
beeinflusst oder die Freisetzung anderer spasmogener Substanzen fördert.
In den letzten Jahren zeigte sich, dass Bombesin überdies an Reparaturvorgängen
beteiligt ist, indem es die Proliferation und Chemotaxis von Wachstumsfaktoren wie
3T3- und IMR-90-Fibroblasten sowie EGF fördert [Yule & White, 1999; Lunn et al.,
2000].
Material 17
2 Material
2.1 Erstellung der Paraffinschnitte
Schnitte von 4 µm Dicke mit dem Mikrotom von LEICA „RM 2145“ mit Hilfe des
Messers „Shandon Mikrotome Blades MB35 by Kai 35°/80mm“.
Silanisieren der Objektträger: 5-10 Minuten in 70%igen Alkohol
trocknen lassen
5 Minuten in Aceton-Silan Mischung (9:1)
3 x 3 Minuten in Aceton
3 x 3 Minuten in Aqua dest.
24 Stunden im Brutschrank bei 37°C
2.2 Immunhistochemie an den Paraffinschnitten nach der Avidin-Biotin-Methode
Xylol
absteigende Alkoholreihe: 100%, 96%, 70%
116 ml Methanol + 4 ml H2O2
PBS: 9,55 g PBS auf 1000 ml Aqua
BSA: 1 ml 10%iges BSA auf 9 ml PBS
Primärantikörper:
VIP: polyklonal, Rabbit Anti VIP, von Serotec, BatchNo: 210498, PEPA 41
Substanz P: polyklonal, Rabbit Anti Human Substance P, von Serotec, BatchNo:
060298, PEPA 40
CGRP: polyklonal, Rabbit Anti CGRP, von Serotec, BatchNo: 251198, PEPA 27
Bombesin: polyklonal, Rabbit Anti Bombesin, von Serotec, BatchNo: 181298,
PEPA 23
Protein S-100: polyklonal, Rabbit Anti Cow S-100, von DAKO A/S, Denmark,
CodeNo: Z 0311, Lot/Ch.-B.: 017(201)
Material 18
Sekundärantikörper:
Goat Anti-Rabbit Immunglobulin Biotin, polyklonal, von DAKO A/S, Denmark,
CodeNo: E 0432
Tertiärantikörper:
Streptavidin-Biotin-Complex, “Victor” Laboratories, “Elite”, Vectastain ABC
Färbelösung: 0,6 g Trishydroxymethylaminomethan
+ 100 ml Aqua dest.
mit 1 N HCl auf pH 7,6
+ 6 Tabletten 3,3´-Diaminobenzidin, DAB von Sigma, Lot 119 H
8202
+ 48 µl H2O2
Hämalaun
aufsteigende Alkoholreihe: 70%, 96%, 100%
Xylol
Vitro-Clud
Deckgläser
Geräte zur Immunhistochemie:
Objektträgerhalter
Küvetten
Eppendorf-Pipetten
Immunhistokammern
2.3 Fotodokumentation
Kamera: Olympus BH2, Olympus-Mikrofotographie-System
Film: Epy 64T von Kodak
Vergrößerung: x 500
Methoden 19
3 Methoden
3.1 Auswahl der Präparate
Insgesamt wurden 25 Trachea- und 10 Stimmlippenpräparate untersucht. Alle 25
Gewebeproben aus der Trachea sowie 6 Proben der Stimmlippen wurden von
Patienten gewonnen, die sich aufgrund eines Larynxkarzinoms in der Hals-, Nasen-,
Ohrenklinik der RWTH Aachen einer Laryngektomie unterzogen. Die Entnahme
eines geringen Teils der proximalen Trachea diente bei diesen Operationen der
Exzision im Gesunden und stellte somit den unteren Absetzungsrand des
entnommenen Gewebes dar; der Larynx wurde komplett entfernt. Sowohl durch die
makroskopische Beurteilung als auch durch die histologische Befundkontrolle konnte
in allen Fällen gesichert werden, dass die verwerteten Stimmlippen- und
Tracheaanteile vollständig frei von Tumorzellen waren.
Die vier anderen Proben wurden im Rahmen klinischer Sektionen in der Pathologie
der RWTH Aachen zur Verfügung gestellt. In diesen vier Fällen wurde den jeweiligen
Leichen, die nachweislich nicht an einer Erkrankung des Kehlkopfes gestorben sind,
eine Probe der gesunden Stimmlippe entnommen.
Von den insgesamt 25 Tracheapräparaten konnte im Nachhinein anhand der
vorliegenden schriftlichen Befunde erhoben werden, dass es sich in 11 Fällen (44%)
um Gewebeproben von Patienten handelte, die eine positive Raucheranamnese
aufwiesen. 2 Patienten (8%) waren Nichtraucher; bei den restlichen 12 Patienten
(48%) fehlten jegliche Angaben bezüglich eines Nikotinkonsums.
Von den 10 Stimmlippenpräparaten konnten 3 Gewebeproben (30%) zu Rauchern
zurückverfolgt werden. Bei den anderen 7 Patienten (70%) lag keine schriftliche
Dokumentation hierüber vor.
Da 4 Neuropeptide hinsichtlich ihrer Expression und Verteilung in 35 verschiedenen
Präparaten untersucht wurden, sind insgesamt 140 Schnitte angefertigt worden.
Dabei wurden folgende Ausschlusskriterien berücksichtigt:
1. tumoröses Gewebe
2. zu kleine Gewebeanteile, die aus histologischer Sicht nicht zur Beurteilung
ausreichten
Methoden 20
3. floride Entzündungen
4. Dysplasien
3.2 Fixierung und Einbettung
Nach der Gewebeentnahme wurden die Präparate für 12 bis 24 Stunden in 4%ig
gepuffertes Formaldehyd gegeben, welches das Gewebe mit einer Geschwindigkeit
von 1 mm/h penetriert. Die Pufferung verhindert die Entstehung eines sauren Milieus,
das sich aufgrund der langsamen Oxidation von Formaldehyd zu Ameisensäure
einstellen würde. Das Fixativ dient dazu, die Gewebebestandteile zu immobilisieren
sowie eine ausreichende Gewebefestigkeit für den Schneidevorgang zu
gewährleisten. Diese Eigenschaften resultieren aus der von Formaldehyd
hervorgerufenen Quervernetzungen, die auf einer Reaktion mit Aminogruppen von
Proteinen basieren. Anschließend erfolgte in speziell dafür vorgesehenen Kapseln
die Einbettung in Paraffin, einem komplexen Kohlenwasserstoff, der das Herstellen
größerer Schnittserien ermöglichte. Da das Paraffingemisch bei 56°C bis 58°C
schmilzt, wurden die Proben in flüssigem Paraffin inkubiert und damit übergossen,
um das Eindringen des Paraffins auch in der Tiefe des Gewebes zu gewährleisten.
Bei Raumtemperatur lag nach dem Abkühlen ein relativ fester Block vor, der mit Hilfe
des Mikrotoms weiter bearbeitet werden konnte.
3.3 Erstellung der Paraffinschnitte
Von jedem Paraffinblock wurden am Mikrotom Schnitte von 4 µm Dicke erstellt, von
denen je nach Größe des Präparates ein bis drei Schnitte auf einen silanisierten
Objektträger im Wasserbad aufgezogen wurden. Anschließend verblieben die
Objektträger für mindestens 24 Stunden in einem Brutschrank bei 37°C.
3.4 Immunhistochemie an den Paraffinschnitten nach der Avidin-Biotin-Methode
Zu Beginn der Untersuchung wurde der mattierte Rand der Objektträger sowohl mit
der Herkunft des Gewebes als auch mit dem Typ des darauf zu inkubierenden
Primärantikörpers beschriftet und, je nach Primärantikörper sortiert, in die dafür
vorgesehenen Objektträgerhalter geordnet. Zum Entparaffinieren der Objektträger
Methoden 21
wurden diese nun für 10 Minuten in Xylol getaucht. Die sich daran anschließende
absteigende Alkoholreihe mit 100%igem, 96%igem und 70%igem Alkohol – jeweils 5
Minuten – diente der Xylolentfernung und wurde nach der ersten Alkoholstufe
lediglich für 5 Minuten von einem Aqua-H2O2-Gemisch zur Hemmung der endogenen
Peroxidase unterbrochen. Dann wurden die Objektträger zweimal mit Aqua dest.
gespült und anschließend in eine Küvette mit phospate-buffered-saline (= PBS; pH
7,5) gestellt.
Zum Auftragen der Antikörper wurden maximal 60 Objektträger in sogenannten
Immunhistokammern untergebracht.
Nun erfolgte die Inkubation mit den Primärantikörpern, deren jeweilige Verdünnung
mit Hilfe von 1%igem Bovinen-Serum-Albumin (= BSA) vorher hergestellt werden
musste. Das BSA diente der Hemmung des Hintergrundgewebes. Es wurde mit
folgenden Verdünnungen gearbeitet:
VIP 1:100 (Neuropeptid)
Substanz P 1:100 (Neuropeptid)
CGRP 1:100 (Neuropeptid)
Bombesin 1:100 (Neuropeptid)
Protein S-100 1:500 (Marker zur Sichtbarmachung von Nervenfaszikeln
und Ganglienzellen)
Mit einer Eppendorf-Pipette wurden jeweils 0,1 ml der Primärantikörperlösung auf die
Objektträger aufgebracht, wobei auch die Positivkontrollen (Material aus der
Duodenalschleimhaut), nicht jedoch die Negativkontrollen benetzt wurden. Die
Inkubation erfolgte nun bei geschlossener Immunhistokammer für eine Stunde.
Danach wurde zweimal mit PBS gespült.
Der polyklonale Sekundärantikörper Goat Anti-Rabbit-Immunglobulin Biotin (Fa.
DAKO, Denmark) wurde mit BSA auf eine Verdünnung von 1:500 gebracht. 0,1 ml
der Sekundärantikörperlösung wurde auf alle Objektträger – inklusive der
Negativkontrollen – pipettiert, diese bei geschlossener Kammer für 30 Minuten ruhen
gelassen und dann wieder zweimal mit PBS gespült.
Methoden 22
Während dieser Zeit wurde der Tertiärantikörper in einer Konzentration von 1:50
hergestellt. Dazu verwendeten wir den Avidin-Biotin-Enzym-Komplex (ABC-
Methode). Es handelte sich dabei um eine sensitive, indirekte Nachweismethode, die
auf der hohen Bindungsaffinität von Avidin, einem Hühnereiweiß-Glykoprotein, zum
Biotin (Vitamin H) beruhte. Der Komplex wurde über den biotinylierten
Sekundärantikörper an den Primärantikörper gekoppelt. Nach Aufbringen des
Tertiärantikörpers und einer 30- minütigen Inkubation mit anschließender zweimaliger
PBS-Spülung wurden die Objektträger wieder in den Objektträgerhalter geordnet und
in eine mit PBS gefüllte Küvette gestellt.
Die Antigen-Antikörper-Komplexe konnten mit Hilfe einer Färbung sichtbar gemacht
werden. Dazu wurden 0,6 g TRIS-Puffer in 100 ml Aqua dest. auf einen pH-Wert von
7,6 gebracht und mit 3,3´- Diaminobenzidin gut vermischt. Nach Zusatz von 48 µl
H2O2 zur Hemmung der unspezifischen Peroxidase wurde das PBS aus den
Küvetten abgegossen und diese mit der Diaminobenzidinlösung gefüllt. Die
Objektträger wurden nun für 2 Minuten in Lösung gebracht und anschließend mit
Aqua dest. gespült. Danach erfolgte für ca. 15 Sekunden die Gegenfärbung mit
Hämalaun, gefolgt von einer Spülung mit Aqua dest..
Zur Entwässerung der gefärbten Schnitte wurden die Objektträger nun in eine
aufsteigende Alkoholreihe gebracht: 2 Minuten in 70%igem, 2 Minuten in 96%igem
und 4 Minuten in 100%igem Alkohol. Abschließend wurden die Objektträger kurz in
Xylol gestellt und mit Hilfe von Vitro-Clud eingedeckelt.
Die fertigen Präparate wurden mit einem Lichtmikroskop in 500facher Vergrößerung
untersucht und dann zur Dokumentation mit einem Farbfilm (Epy 64T von Kodak)
umgehend fotografiert (Olympus BH2, Olympus-Mikrofotographie-System).
Methoden 23
Abbildung 3.1: Immunhistochemie nach der ABC-Methode. Der Avidin-Biotin-Enzym-Komplex
bindet über einen biotinylierten Sekundärantikörper an den Primärantikörper.
Primärantikörper
Biotinylierter Sekundärantikörper
Primärantikörper
Biotinylierter Sekundärantikörper
Primärantikörper
Biotinylierter Sekundärantikörper
Avidin-Biotin-Enzym-KomplexAvidin-Biotin-Enzym-KomplexAvidin-Biotin-Enzym-Komplex
3.5 Positivkontrollen / Negativkontrollen
Als Positivkontrolle diente Dünndarmgewebe, welches mit Antikörpern gegen die
erwähnten Transmitter immunhistochemisch gefärbt wurde.
Die negative Kontrolle führten wir mit Proben aus der Trachea durch.
Zur Sichtbarmachung von nervalen Strukturen innerhalb der jeweiligen Gewebe
benutzten wir den Marker Protein S-100 (DAKO, Denmark).
Methoden 24
Abbildung 3.2: Protein S-100; Stimmlippe; Vergrößerung: 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-
Hämalaun. Nervenfaszikel (Pfeilmarkierung) im Stroma des
Stimmlippengewebes.
3.6 Bewertungskriterien
Die lichtmikroskopische Auswertung von Expression und Verteilung der einzelnen
Antikörperfärbungen erfolgte im Hinblick auf die folgenden histologischen Strukturen:
Epithel; ggf. Flimmersaum; ggf. Basalmembran
Stroma und Blutgefäße
seröse Drüsen
muköse Drüsen
ggf. angeschnittene Ausführungsgänge
Nervenfaszikel
Um dabei eine einheitliche Beurteilung zu erzielen, wurde ein semiquantitatives
Bewertungsschema herangezogen, welches die unterschiedliche Intensität der
Methoden 25
Braunfärbung der untersuchten Gewebestrukturen in Form einer Plus-
/Minusabstufung darstellt. Somit wurde ein direkter Vergleich der Ergebnisse
zwischen Trachea- und Larynxgewebe möglich.
Definition der Plus-/Minusabstufung:
- keine Expression, d.h. keine braungefärbten Strukturen
+/- Expression in weniger als 50% des Gewebes
+ geringe Expression
++ mäßige Expression
+++ starke Expression
++++ sehr starke Expression
Ergebnisse 26
4 Ergebnisse
4.1 Patientendaten
4.1.1 Altersverteilung und Geschlecht der Patienten – Larynx
on den 10 entnommenen Stimmlippenpräparaten handelte es sich in 8 Fällen um
die Gewebeproben männlicher, in 2 Fällen um Proben weiblicher Patienten. Das
2 2
4
2
0
1
2
3
4
Anzahl der Patienten
40-49 50-59 60-69 70-79Alter der Patienten
Abbildung 4.1: Altersverteilung – Larynx
V
Alter variierte zwischen 40 und 77 Jahren und betrug im Mittel 60,6 Jahre.
Ergebnisse 27
4.1.2 Altersverteilung und Geschlecht der Patienten – Trachea
ie 25 Tracheapräparate stammten von Patienten, die zwischen 40 und 76 Jahren
alt waren; der Altersdurchschnitt betrug 60,08 Jahre. Es handelte sich in 23 Fällen
2
10 10
3
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Anzahl der Patienten
40 - 49 50 - 59 60 - 69 70 - 79
Alter der Patienten
Abbildung 4.2: Altersverteilung – Trachea
D
um Gewebeproben männlicher und in 2 Fällen um Proben weiblicher Patienten.
Ergebnisse 28
4.2 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung der Larynxpräparate
4.2.1 Vasoaktives intestinales Polypeptid
00fach; Färbung: Diaminobenzidin-Hämalaun.
VIP-haltige seröse Drüsen (Pfeilmarkierung) im Verband mit mukösen Drüsen,
Sowohl innerhalb der Epithelzellen als auch in der Basalmembran wurde das
Neuropeptid Vasoaktives intestinales Polypeptid nur gering exprimiert (+). Der
inem Verband von Drüsenzellnestern liegen und
n nach
llen 10 untersuchten Gewebeproben aus Stimmlippen einheitlich zu einem
Muköse Drüse
Seröse Drüse
Fibrozyt
Muköse Drüse
Seröse Drüse
Fibrozyt
Abbildung 4.3: VIP; Stimmlippe; Vergrößerung 5
die VIP-negativ sind. Im Stroma Fibrozyten mit geringer Neuropeptidexpression.
Flimmersaum enthielt kein VIP (-).
Die Neuropeptidexpression in Fibrozyten und Blutgefäßen fiel gering aus (+).
Die serösen Drüsen, die meist in e
immer gemeinsam mit mukösen Drüsenanteilen vorhanden sind, zeigte
immunhistochemischer Färbung eine mäßige Expression von Vasoaktivem
intestinalen Polypeptid (++). Dagegen enthielten die mukösen Drüsenanteile kein VIP
(-).
Die Untersuchungen bezüglich der Exprimierung von VIP in Nervenfaszikeln führten
in a
Ergebnisse 29
negativen Ergebnis. Weder die zwischen der Muskulatur gelegenen Nervenfasern
noch diejenigen entlang der Blutgefäße oder innerhalb der Drüsenzellnester
demonstrierten einen Gehalt an VIP (-).
Ergebnisse 30
4.2.2 Substanz P
bstanz P; Stimmlippe; Vergrößerung 500fach, Färbung: Diaminobenzidin-
Hämalaun. Mit Pfeilen dargestellt die serösen Drüsen eines
Substanz P wurde im Epithel in einer mäßigen Konzentration exprimiert (++). Der
Flimmersaum und die Basalmembran zeigten einen geringen Gehalt an Substanz P
en durch den Neurotransmitter ebenfalls mäßig angefärbt (++).
Muköse Drüse
Seröse Drüse
AusführungsgangCytoplasma
Muköse Drüse
Seröse Drüse
AusführungsgangCytoplasma
Abbildung 4.4: Su
Ausführungsganges, die in mäßiger Konzentration Substanz P exprimierten.
Unten eine muköse Drüse ohne Substanz P. Das Cytoplasma mit mäßiger
Neuropeptidexpression.
(+).
Die im Stroma des Stimmlippengewebes liegenden Fibrozyten und Blutgefässe
wurd
Die serösen Drüsen zeigten einen mäßigen Gehalt an Substanz P (++); muköse
Drüsenanteile enthielten kein Substanz P (-).
Die Nervenfaszikel im Stimmlippengewebe, die auf Substanz P untersucht wurden,
zeigten keinerlei Reaktionen (-).
Ergebnisse 31
4.2.3 Calcitonin gene-related peptide
Abbildung 4.5: CGRP; Stimmlippe; Vergrößerung 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-
braun angefärbtes und somit nicht CGRP-haltiges
Feld muköser Drüsen, unten ein mäßig braun gefärbtes seröses Drüsenfeld.
Nach immunhisto
Neuropeptids Cal n des Epithels (++)
nachgewiesen werden. Etwas geringer (+) wurde es im Flimmersaum und in der
Basalmembran exprimiert.
Der Gehalt an CGRP in den Fibrozyten war stark (+++), derjenige in den Blutgefäßen
mäßig (++).
Während die mukösen Drüsenanteile einheitlich kein CGRP enthielten (-), konnte in
mäßiger Expression (++) dieses Neuropeptid in den serösen Drüsen nachgewiesen
werden.
Die im Präparat enthaltenen Nervenfaszikel wurden durch die Färbung mit CGRP
gering dargestellt (+).
Muköses Drüsenfeld
Seröses Drüsenfeld
Fibrozyten
Muköses Drüsenfeld
Seröses Drüsenfeld
Fibrozyten
Hämalaun. Oben ein nicht
Dazwischen Fibrozyten mit hohem Gehalt an CGRP.
chemischer Färbung konnte eine mäßige Expression des
citonin gene-related peptide in den Zelle
Ergebnisse 32
4.2.4 Bombesin
Abbildung 4.6: Bombesin; Stimmlippe; Vergrößerung 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-
Hämalaun. Dargestellt sind muköse Drüsenfelder ohne Bombesingehalt. Rechts
ein Ausführungsgang mit stark angefärbten serösen Drüsen. In den Fibrozyten
wurde Bombesin sehr stark exprimiert.
Innerhalb des Epithels wurde Bombesin mäßig (++) exprimiert. Der Flimmersaum
enthielt wenig Bombesin (+). Eine sehr starke Expression des Neuropeptids (++++)
konnte in der Basalmembran nachgewiesen werden.
Innerhalb des umgebenden Stromas zeigten die Fibrozyten einen sehr hohen
Bombesingehalt an (++++), in den Blutgefäßen wurde eine starke Expression
festgestellt (+++).
Während die serösen Drüsen Bombesin in mäßiger Konzentration enthielten (++),
zeigten die mukösen Drüsen keinerlei Gehalt an (-).
Die angeschnittenen Nervenfaszikel exprimierten den Transmitter gering (+).
Ausführungsgang
Muköses Drüsenfeld
Fibrozyten
Ausführungsgang
Muköses Drüsenfeld
Fibrozyten
Ergebnisse 33
4.3 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung der Tracheapräparate
4.3.1 Vasoaktives intestinales Polypeptid
Abbildung 4.7:
Pfeilen dargestellt sind seröse Drüsen, die im Gegensatz zu den abgebildeten
färbung im Sinne einer mäßigen VIP-
Expression aufzeigen.
Im Epithel wurde das Neuropeptid VIP sowohl im Cytoplasma der Zellen als auch in
der Basalmembran gering exprimiert (+). Der Flimmersaum enthielt kein VIP (-).
Im Stroma konnte der Transmitter gering in den Fibrozyten gefunden werden (+); die
Blutgefäße enthielten mäßig VIP (++).
Eine mäßige VIP-Expression zeigte sich in den serösen Anteilen der Drüsen (++).
Die mukösen Drüsen führten beim Antikörpernachweis zu einem negativen Ergebnis
(-).
Nervenfaszikel enthielten kein VIP (-).
VIP; Trachea; Vergrößerung 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-Hämalaun. Mit
mukösen Drüsen eine deutliche Braun
Ergebnisse 34
4.3.2 Substanz P
Abbildung 4.8: Substanz P; Trachea; Vergrößerung 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-
Hämalaun. Nicht angefärbte muköse Drüsenanteile neben Fibrozyten mit
mäßiger Substanz-P-Expression (Pfeile). Ebenso gelang ein mäßiger Nachweis
Arteriole
Muköse Drüse
Arteriole
Muköse Drüse
in Blutgefäßen.
Die Untersuchung zur Expression von Substanz P in der Trachea führte im
Ergebnis (+). Der F
Die Fibrozyten und Blutgefäße wiesen ebenfalls eine mäßige Expression auf (++).
In allen untersuchten Präparaten gelang ein geringer Nachweis von Substanz P in
rten
ion auf den Transmitter (-).
Cytoplasma der Epithelzellen und in der Basalmembran zu einem gering positiven
limmersaum zeigte eine mäßige Expression (++).
den serösen Drüsen nur in weniger als 50% der Fälle (+/-), d.h. mehr als die Hälfte
der Drüsen zeigten ein negatives Ergebnis. Die mukösen Drüsenanteile exprimie
einheitlich kein Substanz P (-).
Die Nervenfaszikel zeigten keine Reakt
Ergebnisse 35
4.3.3 Calcitonin gene-related peptide
RP; Trachea; Vergrößerung 500fach. Färbung: Diaminobenzidin-Hämalaun.
Dargestellt sind Nervenfaszikel mit sehr hoher Expression von CGRP (Pfeile),
sowie Anteile von mukösen Drüsen, die einen mäßigen Gehalt an CGRP
Im Hinblick auf da
Basalmembran zu Expression (+) von Calcitonin gene-related peptide.
ng
Arteriole
Muköse Drüse
Arteriole
Muköse Drüse
Abbildung 4.9: CG
aufweisen. Rechts oben eine Arteriole mit mäßiger CGRP-Expression.
s Tracheaepithel kam es innerhalb des Cytoplasmas und in der
einer geringen
Im Flimmersaum gelang ein mäßiger Nachweis des Neurotransmitters (++).
Starke Expressionen von CGRP konnten in den Fibrozyten festgestellt werden (+++),
mäßige Expressionen innerhalb von Blutgefäßen (++).
Während seröse Drüsen in weniger als 50% der Fälle CGRP aufwiesen (+/-), gela
der Nachweis einer zumindest mäßigen Expression in den mukösen Anteilen der
Drüsen (++).
Die Nervenfaszikel in den jeweiligen Präparaten enthielten sehr starke Anteile von
CGRP (++++).
Ergebnisse 36
4.3.4 Bombesin
Abbildung 4.10: Bombesin; Trachea; Vergrößerung 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-
Hämalaun. Die Pfeile deuten auf Nervenfaszikel mit hoher Bombesin-
Drüsenfeld enthält kein Bombesin. Die Fibrozyten
zeigen einen hohen Transmittergehalt.
Innerhalb des Epithels kam es zu einer unterschiedlichen Bombesinexpression: das
Cytoplasma enth
Transmitter nur in ession
konnte in der Basalmembran festgestellt werden (++++).
Die Expression von Bombesin in den Fibrozyten war stark (+++), diejenige in
Blutgefäßen mäßig (++) ausgeprägt.
Im Hinblick auf die in den Präparaten befindlichen Drüsenzellnester zeigten die
serösen Drüsen einen mäßigen Gehalt an Bombesin (++). Die mukösen Drüsen
reagierten nicht auf die Antikörperfärbung (-).
Die Untersuchung wies innerhalb der Nervenfaszikel eine starke Expression von
Bombesin (+++) nach.
Muköses Drüsenfeld
Ausführungsgang
Fibrozyten
Muköses Drüsenfeld
Ausführungsgang
Fibrozyten
Expression. Das muköse
ielt wenig Bombesin (+); der Flimmersaum exprimierte den
weniger als 50% der Fälle (+/-); eine sehr starke Expr
Ergebnisse 37
Abbildung 4.11: Bombesin; Trachea; Vergrößerung 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-
Hämalaun: Die Pfeile zeigen auf die intensiv braun angefärbte Lamina propria;
in Zeichen für eine sehr starke Expression von Bombesin innerhalb der
Basalmembran.
Flimmersaum
Lamina propria
Flimmersaum
Lamina propria
e
Ergebnisse 38
4.4 Ergebnis der Positivkontrollen
Abbildung 4.12:
eile) als Zeichen einer VIP-Expression in der
Duodenalschleimhaut.
Die Positivkontrollen mit Gewebe aus der Duodenalschleimhaut reagierten auf die
Neuropeptide Vasoaktives intestinales Polypeptid, Substanz P, Calcitonin gene-
related peptide und Bombesin positiv. Stellvertretend für alle Positivkontrollen ist in
der vorliegenden Abbildung das Färbeergebnis mit dem Primärantikörper VIP
dargestellt.
Becherzelle
Dünndarmkrypte
Becherzelle
Dünndarmkrypte
Positivkontrolle mit VIP; Duodenalschleimhaut; Vergrößerung 500fach;
Färbung: Diaminobenzidin-Hämalaun. Braungefärbte Epithelzellen und
Fibrozyten (Pf
Ergebnisse 39
4.5 Ergebnis der Negativkontrollen
P; Trachea; Vergrößerung 500fach, Färbung:
Diaminobenzidin-Hämalaun. Keine Braunfärbung im Sinne eine Substanz-P-
Die Tracheaprä
immunhistochemischen Färbevorgang ohne das Auftragen des Primärantikörpers –
hier Substanz P – unterzogen wurden, zeigten einheitlich eine reine Gegenfärbung
Abbildung 4.13: Negativkontrolle ohne Substanz
Seröses Drüsenfeld
Muköses Drüsenfeld
Seröses Drüsenfeld
Muköses Drüsenfeld
Expression sichtbar.
parate, die im Rahmen der Negativkontrolle dem
mit Hämalaun.
Ergebnisse 40
4.6 Tabellarische Ergebnisübersicht
4.6.1 Larynx
der Neuropeptide an unterschiedlichen
histologischen Strukturen des Larynx. Drüsen waren nur in Einzelfällen
nachweisbar. n = 10 Stimmlippenpräparate.
Die vier untersuch
Larynx nachgewiesen werden, jedoch mit unterschiedlichen Intensitäten bezogen auf
Der Flimmersaum enthielt kein VIP, jedoch in geringem Maße Substanz P, CGRP
und Bombesin.
Die Expressionen in der Basalmembran waren bei Bombesin sehr stark, bei den
restlichen Transmittern gering.
Fibrozyten und Blutgefäße reagierten auf die Neuropeptide in folgender
aufsteigender Intensität: VIP < Substanz P < CGRP < Bombesin.
Alle vier Transmitter wurden in den serösen Drüsen mäßig exprimiert.
Tabelle 4.1: Intensität der Immunreaktionen
Legende:Cytopl.: CytoplasmaFs.: FlimmersaumBs.: Basalmembran
NervCytopl. Fs. Bs. Fibrocyt. Blg. Serös Mukös
VIP + - + + + ++ - -
SP ++ + + ++ ++ ++ - -
CGRP ++ + + +++ ++ ++ - +
BN ++ + ++++ ++++ +++ ++ - +
Epithelzellen Stroma Drüsen
Fibrocyt.: FibrozytenBlg.: Blutgefäße
Legende:Cytopl.: CytoplasmaFs.: FlimmersaumBs.: Basalmembran
NervCytopl. Fs. Bs. Fibrocyt. Blg. Serös Mukös
VIP + - + + + ++ - -
SP ++ + + ++ ++ ++ - -
CGRP ++ + + +++ ++ ++ - +
BN ++ + ++++ ++++ +++ ++ - +
Epithelzellen Stroma Drüsen
Fibrocyt.: FibrozytenBlg.: Blutgefäße
ten Transmitter VIP, Substanz P, CGRP und Bombesin konnten im
die einzelnen histologischen Strukturen:
Im Cytoplasma der Epithelzellen wurden geringe Expressionen durch VIP, mäßige
Expressionen durch die drei anderen Peptide erzielt.
Ergebnisse 41
Die mukösen Drüsen reagierten nicht auf die immunhistochemischen Färbungen.
Nervenfaszikel exprimierten nur CGRP und Bombesin.
Ergebnisse 42
4.6.2 Trachea
Tabelle 4.2: Intensität der Immunreaktionen der Neuropeptide an unterschiedlichen
histologischen Strukturen der Trachea. n = 25 Tracheapräparate.
In der Trachea wurden VIP, Substanz P, CGRP und Bombesin von den jeweiligen
histologischen Strukturen in unterschiedlichem Maße exprimiert:
Alle untersuchten Transmitter wurden vom Cytoplasma der Epithelzellen in geringer
Menge exprimiert.
Während im Flimmersaum VIP überhaupt nicht und Bombesin nur in weniger als
50% der Fälle gefunden werden konnte, gelang ein mäßiger Nachweis von Substanz
P und CGRP.
Die Basalmembran enthielt auffällig viel Bombesin (sehr starke Expression),
hingegen nur gering VIP, Substanz P und CGRP.
Legende:Cytopl.: CytoplasmaFs.: FlimmersaumBs.: Basalmembran
Fibrocyt.: FibrozytenBlg.: Blutgefäße
NervCytopl. Fs. Bs. Fibrocyt. Blg. Serös Mukös
VIP + - + + ++ ++ - -
SP + ++ + ++ ++ +/- - -
CGRP + ++ + +++ ++ +/- ++ +++
BN + +/- ++++ +++ ++ ++ - ++++
DrüsenEpithelzellen StromaEpithelzellen Stroma
Legende:Cytopl.: CytoplasmaFs.: FlimmersaumBs.: Basalmembran
Fibrocyt.: FibrozytenBlg.: Blutgefäße
NervCytopl. Fs. Bs. Fibrocyt. Blg. Serös Mukös
VIP + - + + ++ ++ - -
SP + ++ + ++ ++ +/- - -
CGRP + ++ + +++ ++ +/- ++ +++
BN + +/- ++++ +++ ++ ++ - ++++
Drüsen
Von den Fibrozyten wurden die Neuropeptide in folgender Intensitätszunahme
exprimiert: VIP < Substanz P < CGRP = Bombesin.
Alle in den Präparaten befindlichen Blutgefäße enthielten die vier Peptide in mäßiger
Konzentration.
Ergebnisse 43
Während bezogen auf die serösen Drüsen bei Substanz P und CGRP nur ein
Nachweis in 50% der Fälle gelang, kam es bei VIP und Bombesin zu mäßigen
Reaktionen.
Bis auf CGRP, welches von den mukösen Drüsen mäßig exprimiert wurde, führten
die Untersuchungen der drei anderen Neuropeptide an dieser histologischen Struktur
zu negativen Ergebnissen.
Während VIP und Substanz P in Nervenfaszikeln nicht gefunden werden konnten,
kam es dort zu starken CGRP- und sehr starken Bombesinexpressionen.
Diskussion 44
5 Diskussion
der Vergangenheit zahlreiche Studien zur Untersuchung von
1983; Hisa et al., 1992; Hauser-Kronberger et al., 1992,
1993, 1994, 1997], gibt es bis heute nur ganz wenige Untersuchungen zur
Dies kann
unter anderem damit zusammenhängen, dass seltener Eingriffe an der Trachea
vorgenommen werden. So wurden auch in der vorliegenden Untersuchung die
Proben der Trachea vorwiegend im Rahmen von Larynxresektionen bei
diagnostiziertem Larynxkarzinom gewonnen. Obwohl die trachealen
Absetzungsränder in allen Fällen histologisch unauffällig waren, können
Veränderungen auf molekularer Ebene nicht sicher ausgeschlossen werden. Ob
derartige, mögliche Veränderungen die vorliegenden Untersuchungsergebnisse
beeinflusst haben, bleibt daher offen.
Sowohl in den 10 Stimmlippen- als auch in den 25 Tracheapräparaten konnten die
vier untersuchten Neuropeptide Vasoaktives intestinales Polypeptid (VIP), Substanz
P (SP), Calcitonin gene-related peptide (CGRP) und Bombesin (BN) nachgewiesen
werden. In diesem Punkt stimmen die erzielten Ergebnisse mit den vorhandenen
Mitteilungen überein [Albegger et al., 1991; Domeij et al, 1991; Hauser-Kronberger et
al., 1993; Luts et al., 1993; Nishi et al., 2000].
Die vorliegende Untersuchung zeigte, dass nicht alle Peptide gleich stark in den
untersuchten Geweben exprimiert wurden. Die Ergebnisse der Stimmlippen- und
Tracheapräparate zeigten übereinstimmend, dass die Expressionsintensität von VIP
am schwächsten war, gefolgt von Substanz P über CGRP bis hin zu Bombesin als
dem am stärksten vertretenen Neuropeptid. Hauser-Kronberger et al., 1994, wiesen
im Gegensatz dazu bei VIP die höchsten Gewebskonzentrationen und bei SP und
CGRP wesentlich geringere Konzentrationen nach. Ghatei et al., 1983, untersuchten
das Vorhandensein von VIP und Bombesin in der fetalen Lunge und kamen zu
eindeutig höheren Gewebskonzentrationen von Bombesin als VIP, was mit den
vorliegenden Ergebnissen übereinstimmt. Diese zunächst widersprüchlich
erscheinenden Ergebnisse können darauf zurückzuführen sein, das frühere Studien
Während in
Neuropeptiden in unterschiedlichen Regionen des respiratorischen Systems
verschiedener Tierarten als auch des Menschen durchgeführt wurden [u.a. Anastasi
et al., 1971; Ghatei et al.,
Neuropeptidsituation in der menschlichen Trachea [Uddman & Sundler, 1979; Ghatei
et al., 1983; Yeger et al., 1996; Berisha et al., 2002; Yang et al., 2002].
Diskussion 45
fast ausschließlich mit der Immunogold-Silver-Staining-Technik oder mit
radioimmunologischen Techniken durchgeführt wurden. Im Gegensatz dazu wurde in
die konzentrierte, meist 35%ige Lösung dieser
die Entparaffinierung mit Xylol sowie
der vorliegenden Untersuchung mit der Avidin-Biotin-Methode gearbeitet. Diese
sensitive, indirekte Nachweismethode basiert auf der Bindung des Avidins zum
Biotin. Da einige Organe des menschlichen Körpers eigenes, endogenes Biotin
synthetisieren, kann durch die Bindung des Avidins an dieses endogene Biotin eine
Kreuzreaktion im Sinne einer unspezifischen Färbung hervorgerufen werden. Trotz
dieser Gefahr liegt der Vorteil der ABC-Methode im Vergleich zu einer direkten
Nachweismethode – beispielsweise über Fluorochrome – in der höheren Sensitivität.
Außerdem müssen weitere Voraussetzungen erfüllt sein, um Antigene – im
vorliegenden Fall die untersuchten Neuropeptide – mit Hilfe immunhistochemischer
Nachweisverfahren sichtbar zu machen: Der antigene Bereich muss erhalten bleiben;
die antigene Determinante für Antikörper muss gut zugänglich sein; die strukturellen
Details dürfen nicht zerstört sein. Diese drei Bedingungen konnten durch hier
angewandte Faktoren positiv beeinflusst werden. Zum einen wurde zur
Durchführbarkeit der Paraffinschnitttechnik das Gewebe mit Formaldehyd fixiert.
Dabei musste bedacht werden, dass
Substanz zu Ameisensäure oxidiert und somit in kurzer Zeit das
Untersuchungsgewebe zerstören kann. Dementsprechend wurde mit einer
säurefreien Formalinlösung gearbeitet, indem die Ursprungssubstanz mit
Pufferlösungen auf eine 4%ige Verdünnung gebracht wurde. Beeinträchtigungen der
Antigenität im untersuchten Gewebe können darüber hinaus durch die Einbettung mit
flüssigem und daher heißem Paraffin, durch
durch die Entwässerung bei der aufsteigenden Alkoholreihe ausgelöst werden.
Verfälschte Ergebnisse können auch durch unspezifische Hintergrundfärbungen
hervorgerufen werden, die im Verlauf des immunhistochemischen Vorgangs durch
verschiedene Substanzen bedingt sein können. Dies kann durch die bereits
erwähnte Avidin-Biotin-Methode geschehen, aber auch durch Zellen, die die
endogene Peroxidase enthalten, wie zum Beispiel rote und weiße Blutzellen,
Nervenzellen und einige Dünndarmzellen. Um eine unspezifische Färbung zu
vermeiden, werden die Paraffinschnitte vor der Inkubation mit den Primärantikörpern
daher mit einer H2O2-Lösung behandelt. Zusätzlich wurden zur weiteren Sicherung
der Nachweismethode Positiv- und Negativkontrollen durchgeführt. Dabei sollte als
Positivkontrolle ein Gewebe dienen, welches VIP, SP, CGRP und BN gesichert
Diskussion 46
enthält. Da alle vier Peptide nachgewiesene Überträgerstoffe im Gastrointestinaltrakt
darstellen, wurde ein Präparat aus der Duodenalschleimhaut als positives
Kontrollgewebe ausgewählt. Mit Hilfe der ausgelösten positiven Immunantworten
konnten Fehler beim Primärantikörper oder im Nachweissystem in allen Fällen
ausgeschlossen werden. Als Negativkontrolle diente ein Präparat aus der Trachea,
welches anstelle des Primärantikörpers mit Puffer inkubiert wurde und anschließend
dem gleichen immunhistochemischen Verfahren unterlag wie die
Untersuchungsproben. Da dieses Tracheapräparat eine reine Hämalaunfärbung
aufwies, wurde sichergestellt, dass das angewandte Nachweisverfahren nur auf
zuvor aufgetragene Primärantikörper reagiert. Es konnte aber dennoch festgestellt
werden, dass jegliche Störung im Färbeablauf zu Änderungen der Farbintensität und
damit zu Änderungen der Ergebnisse im Präparat führen konnten. Aus diesem Grund
war eine reibungslose Abfolge der immunhistochemischen Untersuchung von größter
Bedeutung.
Abgesehen von der Frage, ob die untersuchten Neuropeptide überhaupt in der
Trachea und im Larynx nachweisbar waren, interessierte auch die jeweilige
Expressionsverteilung im Hinblick auf die einzelnen histologischen Strukturen. Dabei
lag ein besonderes Augenmerk auf dem Epithel mit Epithelzellen, Flimmersaum und
Basalmembran, auf die im Stroma eingebetteten Fibrozyten und Blutgefäße, auf die
Drüsenzellnester mit ihren serösen und mukösen Anteilen sowie natürlich auf die im
Präparat vorhandenen Nervenfaszikel. Es konnten alle vier Peptide im Epithel
nachgewiesen werden, VIP jedoch als einziges nicht im Flimmersaum. Es ist daher
davon auszugehen, dass insbesondere SP, CGRP und Bombesin für eine normale
Beweglichkeit des Flimmerepithels mitverantworlich sind und so den Transport von
Abfallpartikeln aus dem luftleitenden System in Richtung Pharynx unterstützen.
Daraus kann geschlossen werden, dass Erkrankungen wie die chronische Bronchitis
oder Asthma, bei denen es unter anderem zu Verklebungen des Flimmersaums und
damit zur Anhäufung von Fremdkörpern oder Schmutzpartikeln in Larynx und
Trachea kommt, auch durch eine verminderte Expression der erwähnten
Neuropeptide in ihrer Entstehung begünstigt werden können. Bei der Beurteilung der
Epithelfärbung fiel zudem besonders ins Auge, dass Bombesin sowohl im Larynx als
auch in der Trachea vorwiegend in der Basalmembran vorgefunden wurde. Damit
war es erstmalig gelungen, Bombesin in der menschlichen Trachea nachzuweisen.
Aus anderen Studien ist bekannt, dass Bombesin eine Rolle bei der Proliferation und
Diskussion 47
Chemotaxis einiger Wachstumsfaktoren spielt [Yule et al., 1999; Lunn et al., 2000].
Überdies trägt es zur Regeneration von Gewebestrukturen bei [Ghatei et al., 1983;
Said, 1987]. Da in der vorliegenden Untersuchung mit gesundem Stimmlippen- und
Tracheamaterial gearbeitet wurde, kann aufgrund der auffallenden Expression dieses
Transmitters von einem intakten Reparaturmechanismus in den jeweiligen
Präparaten ausgegangen werden. Andere Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe
an chronisch hyperplastischem Stimmlippengewebe hatten in der Basalmembran
eine geringere Expression von Bombesin vorgefunden, was die krankhaften
Veränderungen erklären könnte. In diesem Sinne wäre es denkbar, dass proliferative
Erkrankungen, sowohl benigner als auch maligner Art, durch eine alterierte
Expression von Bombesin beeinflusst werden könnten.
Ebenso wie im Epithel konnte auch im Stroma eine Dominanz von SP, CGRP und
Bombesin im Gegensatz zu VIP beobachtet werden. Hier interessierte vor allem die
intra- und perivaskuläre Expression, da alle vier Neuropeptide eine Vasodilatation
verursachen [Widdicombe, 1991]. Durch diese Vasodilatation könnten entzündliche
Krankheitsprozesse oder aber über eine Durchblutungszunahme hervorgerufene
Ödembildungen – wie es zum Beispiel beim Asthma, beim Reinke-Ödem oder der
chronischen Laryngitis der Fall ist – in ihrer Entstehung weiter unterhalten werden.
Überdies könnten wie bei Knipping et al., 2003, besonders die im periglandulären
Gewebe lokalisierten Blutgefäße über eine Durchblutungssteigerung die
Sekretproduktion der seromukösen Drüsen verstärken.
In den serösen Drüsen konnten im Larynx alle untersuchten Neuropeptide, in der
Trachea jedoch vor allem VIP und Bombesin in hoher Konzentration gefunden
werden. Ein Nachweis in mukösen Drüsenanteilen gelang in der Trachea lediglich für
das Neuropeptid CGRP, im Larynx hingegen überhaupt nicht. Aus früheren Studien
ist bekannt, dass VIP, SP, CGRP und Bombesin an Drüsen zu einer Steigerung der
Sekretion führen, SP überdies sogar zu einer myoepithelialen Kontraktion der
Drüsenausführungsgänge [Richardson&Webber, 1987]. Aus den Ergebnissen kann
geschlossen werden, dass die untersuchten Neuropeptide mit Ausnahme von CGRP
einen höheren Einfluss auf die Produktion eines serösen Schleims zu haben
scheinen und damit die Gesamtviskosität des Mukus zwar herabsetzen, letztendlich
dessen Menge aber steigern. Im Hinblick auf Erkrankungen des oberen
Respirationstraktes, die auf einer gesteigerten Schleimproduktion basieren, wie es
Diskussion 48
beispielsweise bei Asthma, chronischer Bronchitis oder Schleimzystenbildungen der
Fall ist, könnten diese Ergebnisse von Bedeutung sein.
Obwohl in vielen früheren Untersuchungen zu Neuropeptiden ein Nachweis von VIP,
Substanz P, CGRP und Bombesin innerhalb von Nervenfaszikeln gelungen ist
[Albegger et al., 1991; Widdicombe, 1991; Hauser-Kronberger et al., 1994; Knipping
et al., 2003], ist dies in der vorliegenden Untersuchung nur bei den Neuropeptiden
CGRP und Bombesin der Fall gewesen. Diese Kontroverse könnte eine Erklärung in
der von uns angewandten ABC-Technik im Gegensatz zu den damals angewandten
IGSS- oder RIA-Techniken finden. Unter Berücksichtigung der ausgesprochen hohen
Neuropeptidexpression in Drüsengebieten, die von Nervenfaszikeln durchzogen
werden, könnte angenommen werden, dass Neuropeptide auch anders als über den
h bei 14 der insgesamt 25
in der Literatur beschriebenen axonalen Weg ihre Zielorgane erreichen. So kann es
sich um das Vorliegen eines autokrinen Loops handeln, der es den Drüsen
ermöglicht, unabhängig von nervalen Transportmechanismen die aktuell benötigte
Menge und Koexistenz von peptidergen Transmittern selber zu produzieren [Wu et
al., 2001; Pernasetti et al., 2001, Benini et al., 2001; Uetani et al., 2001].
Die in der Literatur vielfach beschriebene Kolokalisation von Substanz P und CGRP
konnte bestätigt werden. Somit scheint CGRP die Effekte von Substanz P in
synergistischer Weise zu beeinflussen, so dass cholinerge Wirkungen verstärkt
werden [Luts et al., 1993; Smet et al., 1997; Nishi et al., 2000].
Wie bereits im Methodenteil erwähnt, handelte es sic
untersuchten Präparate um Gewebeproben von Rauchern. Jedoch waren im Hinblick
auf die Expression und Verteilung der Neuropeptide VIP, SP, CGRP und Bombesin
keine Unterschiede erkennbar. Sowohl der Gesamtgehalt der einzelnen
Neuropeptide als auch deren Verteilung in den einzelnen histologischen Strukturen
wich nicht von den Ergebnissen von Nichtrauchern ab. Dennoch wurde in einigen
Mitteilungen ein Einfluss von Nikotin auf die Neuropeptidaktivität beschrieben
[Lundberg et al., 1983; Joos et al., 1986; Lundberg et al., 1991; Kuo et al., 1995]. Da
nahezu alle Patienten zum Zeitpunkt der Datenerhebung verstorben waren, war es
nicht mehr möglich, eine genaue Raucheranamnese zu erheben, die Aufschluss über
die Dauer und das Ausmaß des Nikotinkonsums gegeben hätte. Überdies wäre für
eine bessere Beurteilung dieses Aspektes wahrscheinlich eine höhere Fallzahl nötig
gewesen.
Zusammenfassung 49
6 Zusammenfassung
ene-related
In der vorliegenden Untersuchung wurden die Expression und Verteilung der
Neuropeptide Vasoaktives intestinales Polypeptid, Substanz P, Calcitonin gene-
related peptide und Bombesin in insgesamt 25 menschlichen, gesunden
Gewebeproben der Trachea sowie in 10 Gewebeproben aus der Stimmlippe
untersucht.
Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl im Kehlkopf als auch in der Trachea die vier
untersuchten Neuropeptide vorhanden sind und, dass sich ihre Expression in fast
identischer Weise auf die einzelnen histologischen Gewebestrukturen verteilt.
Demnach finden sich hohe Konzentrationen in den seromukösen Drüsenfeldern, an
Blutgefäßen, sowie im Epithel, niedrige bis keine Konzentrationen dagegen innerhalb
von Nervenfaszikeln, was auf das Vorliegen eines autokrinen
Regulationsmechanismus schließen lässt. Während VIP insgesamt die schwächsten
Gewebekonzentrationen aufwies, waren Substanz P und Calcitonin g
peptide stark und Bombesin sehr stark enthalten.
Klinisch scheinen die vasodilatierenden und hypersekretorischen Effekte der
Transmitter einen Einfluss auf die Entstehung unterschiedlichster inflammatorischer
und allergischer Erkrankungen auszuüben.
Das erstmalig in der gesunden menschlichen Trachea nachgewiesene Neuropeptid
Bombesin hatte einen hohen Expressionsanteil innerhalb der Basalmembran. Da es
unter anderem Regulationsvorgänge im Gewebe sowie Wachstumsfaktoren
beeinflusst, könnte das Ausmaß der Bombesinexpression über eine Modulation der
Reparaturvorgänge vor allem in geschädigter Trachealschleimhaut bedeutsam für
Narbenbildungen und Stenosierungen der Trachea sein. Weiterhin könnte es eine
Rolle bei der Entstehung sowohl benigner als auch maligner Veränderungen in
Larynx und Trachea spielen.
Zur Untermauerung der aufgestellten Thesen bedarf es weiterer Studien an einem
größeren Kollektiv und insbesondere der Untersuchung von Neuropeptiden an
erkranktem Gewebe.
Anhang 50
7 Anhang
Alle untersuchten Präparate wurden entweder im Rahmen von Karzinomresektionen
in der Klinik für Hals-, Nasen- und Ohrenheilkunde der RWTH Aachen oder bei
klinischen Sektionen in der Pathologie der RWTH Aachen gewonnen.
Somit gelangten sie als Routinegut in die Materialannahme der pathologischen
Abteilung.
Aus diesem Grund war es in keinem der 35 Fälle nötig, einen eigenen Ethikantrag zu
stellen.
Literaturverzeichnis 51
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Abkürzungsverzeichnis 58
9 Abkürzungsverzeichnis
Destilliertes Wasser
ATP Adenosintriphosphat
Bovines-Serum-Albumin
Cholezystokinin
CGRP Calcitonin gene-related peptide
ggf. gegebenenfalls
H2O2 Wasserstoffperoxid
travenös
µl Mikroliter
m Millimeter
mm/h Millimeter pro Stunde
µm Mikrometer
mRNA mikrosomale Ribonukleinsäure
N. Nervus
NANC nonadrenergic noncholinergic
NO Stickstoffmonoxid
A. Arteria
ABC Avidin-Biotin-Komplex
Aqua dest.
BSA
cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat
CCK
EGF epidermal growth factor
g Gramm
GABA Gammaaminobuttersäure
GIP gastric inhibitory peptide
HCl Salzsäure
IGSS Immuno-Gold-Silver-Staining
i.v. in
M. Musculus
ml Milliliter
m
Abkürzungsverzeichnis 59
PACAP pituitary adenylate cyclase activating peptide
PBS phosphate-buffered-saline
ervensystem
he Technische Hochschule
u.a. unter anderem
V. Vena
PNS Peripheres N
RIA Radioimmunoassay
RWTH Rheinisch-Westfälisc
VIP Vasoaktives intestinales Polypeptid
ZNS Zentrales Nervensystem
Danksagung 60
10 Danksagung
Sowohl Herrn Privatdozent Dr. med. E. Di Martino aus der Klinik für Hals-, Nasen-
ilkund nd Halschirurgie der RWTH Aachen als
europathologie
achen eundliche Überlassung des Themas danken.
Sie haben mich nicht nur bei der praktischen Durchführung der Untersuchungen
bei ng der Dissertationsschrift mit wertvollen Hinweisen
Zusätzlich haben sie mir ermöglicht, einen Teil meiner Dissertation beim Deutsch-
Österreichischen Kongress für Hals-, Nasen- und Ohrenheilkunde 2002 in Baden-
aden zu präsentieren.
Herrn Univ.-Prof. Dr. med. Ch. Mittermayer sowie Herrn Univ.-Prof. Dr. med. M.
Westhofen danke ich dafür, dass sie mir für den Zeitraum der Laborarbeiten Zutritt zu
den Arbeitsräumen ihrer jeweiligen Klinik gewährt haben.
Herrn Leon Muys danke ich ganz besonders für die Betreuung im Labor beim
Erlernen der Paraffinschnitt- und immunhistochemischen Färbetechnik.
Frau Dr. med. Cotarello sowie Frau Astrid Knischewsky haben mir bei
verschiedensten Vorgängen in der Pathologie hilfreich zur Seite gestanden.
Mein größter Dank gilt meiner Familie, ohne deren finanzielle und vor allem seelische
Unterstützung sich der Traum vom Medizinstudium und der Dissertation nie erfüllt
hätte. Durch Liebe und Geduld haben sie in schwierigen Phasen immer wieder
erneut meinen Ehrgeiz geweckt, das gesteckte Ziel weiterzuverfolgen. Ich freue mich
sehr, meinen Eltern mit der Erlangung des Doktortitels einen großen Wunsch erfüllt
zu haben.
In großer Liebe bedanke ich mich auch bei meinem Mann Stefan für seine
unermüdliche Motivation und die vielen investierten Stunden, wenn es beim
Abfassen der Arbeit Probleme gab. Besonders in den letzten zwei Jahren habe ich
aus seiner Zuneigung die Kraft geschöpft weiterzumachen.
und Ohrenhe e und Plastische Kopf- u
auch Herrn Oberarzt Dr. med. Bernd Sellhaus aus dem Institut für N
der RWTH A möchte ich für die fr
sondern auch der Abfassu
und konstruktiver Kritik unterstützt.
B
Lebenslauf 61
11 Lebenslauf
Persönliche Angaben: Name: Simone Schön, geb. Kaußen
Geburtsort: Stolberg (Rheinland)
Gemeinschaftsgrundschule Weisweiler
Medizinische Ausbildung:
2. Staatsexamen: 04 / 2002
3. Staatsexamen
ng für Anästhesie und
operative Intensivmedizin, Paracelsus-Krankenhaus Ruit
Geburtsdatum: 28. Dezember 1976
Familienstand: verheiratet, keine Kinder
Konfession: römisch-katholisch
Schulbildung: 1983 – 1987
1987 – 1996 Bischöfliche Liebfrauenschule Eschweiler,
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
10 / 1996 – 04 / 2002 Studium an der Rheinisch-Westfälischen Technischen
Hochschule, Aachen
Ärztliche Vorprüfung: 08 / 1998
1. Staatsexamen: 08 / 1999
04 / 2002 – 03 / 2003 Praktisches Jahr
1. Tertial: Wahlfach Anästhesie, Luisenhospital Aachen
2. Tertial: Chirurgie, Luisenhospital Aachen
3. Tertial: Innere Medizin, Spital Limmattal in Zürich
05 / 2003
07 / 2003 – 08 / 2004 Ärztin im Praktikum in der Abteilung für Anästhesie und
operative Intensivmedizin, Luisenhospital Aachen
09 / 2004 Ärztin im Praktikum in der Abteilu
Lebenslauf 62
Seit 10 / 2004 Assistenzärztin in der Abteilung für Anästhesie und
operative Intensivmedizin, Paracelsus-Krankenhaus Ruit