Flüssigchromatographische Bestimmung aliphatischer und aromatischer Amine

Nicole Jachmann

Flssigchromatographische Bestimmung aliphatischer undaromatischer Amine mit 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol

-2001-

Analytische Chemie

Flssigchromatographische Bestimmung aliphatischer undaromatischer Amine mit 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol

Inaugural-Dissertationzur Erlangung des Doktorgrades

der Naturwissenschaften im Fachbereich Chemie und Pharmazieder Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultt

der Westflischen Wilhelms-Universitt Mnster

vorgelegt vonNicole Jachmann

aus Senden

-2001-

__________________________________________________________

Dekan: Prof. Dr. Wulfhard LangeErster Gutachter: Prof. Dr. Uwe KarstZweiter Gutachter: Prof. Dr. Karl CammannTag der mndlichen Prfung: ___________________________Tag der Promotion: ___________________________

Inhaltsverzeichnis

Abkrzungen

1 Einleitung 1

2 Ziel der Arbeit 2

3 Allgemeiner Teil 3

3.1 Amine 33.1.1 Definition, allgemeine Eigenschaften, Darstellungsmethoden 33.1.2 Vorkommen und Bedeutung von Aminen 53.1.3 Toxizitt von Aminen 7

3.2 Probenahmetechniken 83.2.1 Probenahme mit Impingern (Waschflaschen) 83.2.2 Probenahmerhrchen 9

3.3 Analytische Bestimmungsverfahren fr Amine 103.3.1 Grundstzliches zu Derivatisierungsverfahren 103.3.2 Derivatisierung von Aminen in Lsung 113.3.3 Derivatisierung von Aminen in der Gasphase 14

3.4 Detektion und Quantifizierung in der Flssigchromatographie 173.4.1 UV/vis-Detektion 173.4.2 Fluoreszenzdetektion 183.4.3 Massenspektrometrische Detektion 20

3.5 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDCl) 233.5.1 Darstellung 233.5.2 Eigenschaften und Anwendung 24

4 Experimenteller Teil 26

4.1 Chemikalien 26

4.2 Gerte 26

4.3 Synthese und Charakterisierung der 4-Amino-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBDAmine) 31

4.4 Flssigchromatographische Trennung und Detektion 604.4.1 UV/vis-spektroskopische Eigenschaften 604.4.2 Flssigchromatographische Trennung mit anschlieender

UV/vis-Detektion 634.4.3 Fluoreszenzspektroskopische Eigenschaften der NBDAmine 654.4.4 Flssigchromatographische Trennung mit anschlieender

UV/vis- und fluoreszenzspektroskopischer Detektion 684.4.5 Bestimmung der apparativen Nachweisgrenzen fr die

UV/vis- und Fluoreszenzdetektion 70

4.5 Vergleich mit bestehenden Methoden 73

4.6 Flssigchromatographische Trennung mitmassenspektrometrischer Detektion 75

4.6.1 Allgemeines 754.6.2 Apparative Nachweisgrenzen der HPLC-MS-Methode 85

4.7 Bestimmung von Aminen in der Luft 884.7.1 Grundstzliches 884.7.2 Luftprobenahme mit Impingern 894.7.3 Luftprobenahme mit Probenahmerhrchen 97

4.8 Untersuchung von Realproben mit der NBDCl-Methode 101

5 Zusammenfassung 105

6 Literatur 107

Abkrzungsverzeichnis

A AmmoniakAbb. AbbildungAcNi AcetonitrilAn AnilinAPCI Chemische Ionisation bei Atmosphrendruck (Atmospheric Pressure

Chemical Ionization)bA biogene AmineBA ButylaminBFO 5,7-DinitrobenzofuroxanBFZ 4,6-DinitrobenzofurazanBzA BenzylaminCad CadaverinCE Kapillarelektrophorese (Capillary Electrophoresis)d DublettDBA DibutylaminDC DnnschichtchromatographieDEA DiethylaminDMA DimethylaminDMF DimethylformamidDMSO DimethylsulfoxidDP DeprotonierungsmechanismusDPA DipropylaminDNFBz 2,4-DinitrofluorbenzolDNClBz 3,5-DinitrochlorbenzolEA Ethylamin2-EAn 2-Ethylanilin3-EAn 3-Ethylanilin4-EAn 4-EthylanilinEE ElektroneneinfangmechanismusEI-MS Elektronenstoionisations-MassenspektrumESI Electrospray-IonisationeV Elektronenvolt

Fa. FirmaFT-IR Fourier-Transformations-InfrarotspektroskopieGC GaschromatographieHim HistaminHMDA HexamethylendiaminHPLC Hochleistungsflssigkeitschromatographie (High Performance Liquid

Chromatography)I IntensittIR Infrarot3 J Kopplungskonstante einer vicinalen Kopplung (Kopplung ber drei

Bindungen)LC Flssigchromatographie (Liquid Chromatography)LIF Laserinduzierte Fluoreszenz (Laser Induced Fluorescence)m mittel, middle; MultiplettMAK Maximale Arbeitsplatzkonzentration2-MBzA 2-Methylbenzylamin3-MBzA 3-Methylbenzylamin4-MBzA 4-MethylbenzylaminMeOH MethanolMHz MegahertzMA MethylaminMO Moleklorbitalm/z Masse-zu-Ladungs-VerhltnisNBD 7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazolNBDCl 4-Chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazolNMAn N-MethylanilinNMR Kernmagnetische Resonanz (Nuclear Magnetic Resonance)NOCl 2-NaphthyloxycarbonylchloridNWG NachweisgrenzeOSHA Occupational Safety & Health Administration, U.S. Department of LaborPA PropylaminPE PolyethylenPeA Pentylamin (Amylamin)PNZCl p-Nitrobenzyloxycarbonylchlorid

PP Polypropylenppm parts per millionPut Putrescinq Quartettrel. relativR.F.I relative FluoreszenzintensittRP Umkehrphase (Reversed Phase)RT RaumtemperaturSIM Single Ion MonitoringSpd SpermidinSPE Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction)Spm Spermint TriplettTIC Totalionenstrom (Total Ion Current)s stark (strong); SingulettUV/vis Ultravioletter/sichtbarer Bereich des elektromagnetischen Spektrumsv/v Volumenanteil einer Substanz am GesamtvolumenVDI Verein Deutscher Ingenieurew weak (schwach)WFR Wiederfindungsrate chemische Verschiebung molarer Extinktionskoeffizient

Wellenlngeem Emissionswellenlngeex Excitationswellenlngemax Wellenlnge des AbsorptionsmaximumsZNS Zentrales Nervensystem

1Einleitung 1

1 Einleitung

Die Bestimmung kurzkettiger aliphatischer Amine und flchtiger aromatischer Aminein der Luft am Arbeitsplatz ist eine wichtige Aufgabe der Arbeitsplatzberwachung,denn Amine treten in bedeutenden Mengen bei industriellen Groprozessen wiebeispielsweise in der Farbstoff- und Polymerherstellung auf und besitzen sowohl akutals auch chronisch toxische Eigenschaften. Die Identifizierung und Quantifizierungmittels direkt-spektroskopischer Verfahren ist allerdings wegen der hohen Reaktivittdieser Verbindungsklasse nur sehr bedingt mglich, da diese hufig schon whrendder Probenahme zu stabileren Verbindungen abreagieren und sich so derBestimmung entziehen.

Die Identifizierung und Quantifizierung reaktiver Amine erfolgt deshalb mitDerivatisierungsreagenzien, die den Analyten stabilisieren und dessenchromatographische und spektroskopische Eigenschaften verbessern. AlsDerivatisierungsreagenzien werden hufig halogenierte aromatische Verbindungeneingesetzt, die mit den Analyten in einer nucleophilen aromatischenSubstitutionsreaktion zu einem stabilen Produkt reagieren.

Die bestehenden Methoden erlauben ausschlielich die Identifizierung undQuantifizierung primrer und sekundrer aliphatischer Amine, whrend dieBestimmung von flchtigen aromatischen Verbindungen nicht mglich ist. Aufgrundder Probenahmetechniken und Kalibrationsmethoden werden bei diesen Methodennur unzureichende Nachweisgrenzen erreicht.

Eine mgliche Lsung dieses analytischen Problems ist die in dieser Arbeitvorgestellte Methode auf der Basis des 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazols alsDerivatisierungsreagenz zur flssigchromatographischen Bestimmung aliphatischerund aromatischer Amine mit anschlieender UV/vis- und fluoreszenz-spektroskopischer Detektion sowie massenspektrometrischer Detektion.

2 Ziel der Arbeit 2

2 Ziel der Arbeit

Das Ziel dieser Arbeit besteht in der Beantwortung der folgenden Fragestellungen:

1. Ist es mglich, die Derivate kurzkettiger aliphatischer und flchtigeraromatischer Amine des 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazols zusynthetisieren und in hoher Reinheit zu isolieren?

2. Welche UV/vis- und fluoreszenzspektroskopischen Eigenschaften zeigen dieAminderivate? Ist es mglich, anhand der UV/vis- und fluoreszenz-spektroskopischen Eigenschaften der Derivate auf verschiedene Gruppen vonAminen zu schlieen?

3. Welche flssigchromatographischen Eigenschaften zeigen die verschiedenenAminderivate bei der Trennung auf Umkehrphasensulen?

4. Ist es mglich, die Identifizierung von Aminderivaten durch den Einsatz dermassenspektrometrischen Detektion zu erleichtern? WelcheIonisierungstechnik fhrt hierbei zu den besten Ergebnissen?

5. Welche Probenahmetechniken knnen bei der Luftprobenahme von AminenAnwendung finden?

6. Worin liegen die Vor- und Nachteile der neuen Methode im Vergleich zubereits bestehenden Methoden?


3 Allgemeiner Teil

3.1 Amine

3.1.1 Definition, allgemeine Eigenschaften und Darstellungsmethoden

Amine sind stickstoffhaltige organische Verbindungen, die man vom Ammoniakderart ableiten kann, da mindestens ein Wasserstoffatom des Ammoniaks durcheinen Alkyl- oder Arylrest substituiert ist. Da das Stickstoffatom sp3-hybridisiert ist, istdie Moleklgeometrie wie im Ammoniak tetraedrisch.

NR HR

I

--

NR HH

ein primres Amin ein sekundres Amin Ammoniak

NH HH

-

Abb. 3.1.1: Struktur und Moleklgeometrie des Ammoniak-Molekls und vonAminen (R, RI = Alkyl, Aryl).

Man unterscheidet je nach H-Substitutionsgrad zwischen primren (ein Rest, R-NH2),sekundren (zwei Reste, RRINH) und tertiren Aminen (drei Reste, RRIRIIN). DieReste knnen gleich oder verschieden sein. Auerdem kann man je nach Rest Rzwischen aliphatischen, aromatischen und gemischt aliphatisch-aromatischenAminen unterscheiden.1

Ein Amin kann auch mehr als eine Aminfunktion besitzten. Bei zwei Aminfunktionenspricht man von einem Diamin, bei drei Aminfunktionen von einem Triamin, bei vierAminfunktionen von einem Tetraamin und bei mehr als vier Aminfunktionen voneinem Polyamin.2

Wie beim Ammoniak besitzt der Stickstoff auch in den Aminen ein freiesElektronenpaar. In Gegenwart von Suren bilden sich daher Alkylammoniumsalze,die durch Zugabe einer Base wieder das Amin generieren. Auerdem sind die Aminedurch das freie Elektronenpaar zu nucleophilen Reaktionen befhigt.


In wriger Lsung reagieren die Amine wie Ammoniak alkalisch. Die Basenstrkeder Amine hngt von der Art und Anzahl der Alkyl- bzw. Arylreste ab. Verglichen mitAmmoniak ist die Basizitt der Amino-Gruppe durch den +I-Effekt der Alkylgruppegrer. Eine deutlich grere Basizitt zeigen die aromatischen Amine. Ursachedafr ist die Einbeziehung des freien Elektronenpaares des Stickstoffatoms in das pi-Elektronensystem der Aromaten.3

Die Lslichkeit in Wasser nimmt mit der Lnge und der Anzahl der Alkylreste ab. Biszum n-Butylamin sind die primren Amine mit Wasser unbeschrnkt mischbar. n-Hexylamin ist bereits nur noch wenig wasserlslich. Ebenso sind Trimethyl- undTriethylamin mit Wasser noch sehr gut mischbar, whrend Tripropylamin nur nochwenig hydrophil ist. Cyclische Amine sind dagegen aufgrund ihres gerichtetenDipolmomentes besser in Wasser lslich. Beispielsweise sind Pyrrolidin undPiperidin mit Wasser unbeschrnkt mischbar. In Suren sind dagegen alle Amine alsAmmoniumsalze gut lslich.

Die Siedepunkte der Amine nehmen erwartungsgem mit steigender Kettenlngedes Alkylrestes zu. Ursache fr dieses Verhalten ist die Zunahme derWechselwirkungskrfte (van-der-Waalssche Bindungskrfte) zwischen denAlkylresten.

Die gasfrmigen (C1-C2) und flssigen Amine haben meistens einenunangenehmen, charakteristischen Geruch. Methylamin und Ethylamin riechen nochammoniakartig, whrend die folgenden aliphatischen Amine einen fischartigen oderseifigen Geruch haben. Die hheren Homologen sind feste, geruchlose Stoffe.

NH3 MeNH2 Me2NH NMe3MeOH/Al2O3

TMeOH/Al2O3

T

MeOH/Al2O3T

Abb. 3.1.2: Grotechnische Darstellung der Methylamine aus Ammoniak undMethanol.

Die wichtigsten grotechnischen Darstellungsmethoden fr aliphatische Amine sinddie Alkylierung von Ammoniak mit Alkylhalogeniden oder Alkoholen in Gegenwart


eines Katalysators, die Reduktion von Nitrilen durch katalytische Hydrierung, sowiedie Reduktion von Carbonsureamiden mit Lithiumaluminiumhyrid. Die aromatischenAmine lassen sich leicht durch Reduktion der Nitroverbindungen in geschmolzenemParaffin gewinnen.1

3.1.2 Vorkommen und Bedeutung von Aminen

Aliphatische und aromatische Amine sind wichtige Ausgangsmaterialien fr diechemische und pharmazeutische Industrie. Sie dienen zur Herstellung vonLsungsmitteln, Polymeren, Detergentien, Farbstoffen, Pflanzenschutzmitteln undPharmazeutika. Beispielsweise sind Methylamin und Dimethylamin wichtigeGrundstoffe fr die Herstellung von N-Methylpyrrolidon und Dimethylformamid(DMF), die als organische Lsungsmittel Anwendung finden. Hexamethylendiamin(HMDA) ist ein wichtiges Ausgangsprodukt fr die Herstellung von Polyamid 6.6 (z.B.Nylon 6.6). Aus Anilin werden ebenso Isocyanate hergestellt, die der Gewinnung vonPolyurethanen dienen.1

NH3C

O

OH

OH

NH

HCH2CH2CH3

Morphin Coniin

N

NH

HOOC CH3H

Lysergsure

Abb. 3.1.3: Strukturformeln ausgewhlter Alkaloide.

Amine kommen als Naturstoffe in Pflanzen vor. Stickstoffhaltige Naturstoffe, diealkalisch reagieren, bezeichnet man als Alkaloide. Dazu gehren u. a. Nicotin (ausTabak, Nicotiana tabacum), Coniin (im gefleckten Schierling, Conium maculatum),Atropin (in der Tollkirsche, Atropa belladonna), Cocain (aus den Blttern desKokastrauches, Erythroxylon coca), Morphin und Codein (aus Schlafmohn, Papaversomniferum) und Lysergsure (im Mutterkorn, Secale cornutum).1,3,4


Im menschlichen und tierischen Organismus gehen primre Mono- und Diaminemeistens aus Decarboxylierungsreaktionen von Aminosuren hervor (biogeneAmine, bA). Sie spielen als Hormone und Neurotransmitter eine groe Rolle. Amine,die wichtige Neurotransmitter darstellen, sind z.B. Serotonin und Noradrenalin. Alswichtige Hormone sind insbesondere Histamin und Adrenalin zu nennen.5

Spm

N

NH

CH2CH2NH2

Him

HO CH2CH2NH2

Tym

Put

H2N NH2H2N NH2

Cad

NH

NH2H2N

NH

NH2NH2NH

Spd

Abb. 3.1.4: bersicht ber eine Auswahl der wichtigsten biogenen Amine Histamin(Him), Tyramin (Tym), Putrescin oder 1,4-Diaminobutan (Put),Cadaverin oder 1,5-Diaminopentan (Cad), Spermidin (Spd), Spermin(Spm).

Nicht nur im lebenden Organismus treten Amine als Decarboxylierungsprodukte vonAminosuren auf, sie sind auch die Abbauprodukte von Proteinen im totenOrganismus. In Gegenwart spezieller Decarboxylasen entstehen beispielsweise ausL-Lysin Cadaverin, aus L-Histidin Histamin und aus L-Ornithin Putrescin.6


3.1.3 Toxizitt von Aminen

Die gasfrmigen aliphatischen Amine zeigen akute Toxizitt. Sie reizen dieSchleimhute der Augen und Atemwege. Die Einwirkung hherer Konzentrationenauf die Augenschleimhute kann vorbergehende oder dauernde Erblindungbewirken. Die Inhalation grerer Mengen kann bis zum Lungendem und damitzum Tode fhren. Bei Benetzung der Haut mit flssigen Alkylaminen kommt es zustarken Vertzungserscheinungen. Tabelle 3.1.1 zeigt die Siedepunkte und MAK-Werte ausgewhlter toxischer Amine.7,8

Tab. 3.1.1: Siedepunkte und MAK-Werte ausgewhlter toxischer Amine.

Verbindung Siedepunkt [C] MAK-Wert [mg/m3] MAK-Liste

Methylamin -7,5 12 -

Dimethylamin 6,9 4 -

Ethylamin 16,6 18 -

Anilin 184,4 8 IIIB

2-Naphthylamin 306 - IIIA1

Benzidin 400 - IIIA1

Aromatische Amine sind sowohl akut als auch chronisch toxisch. Der einfachsteVertreter der aromatischen Amine ist das Anilin. Es ist ein starkes Blut- undNervengift, das in erster Linie durch Inhalation und infolge der Hautresorption vonDmpfen oder Flssigkeit zur Aufnahme gelangt. Als akute Wirkung steht zunchstdie Methmoglobin-Bildung (Met-Hb) im Vordergrund. Das Met-Hb unterscheidet sichvom Hmoglobin durch die 3-Wertigkeit des Eisens (Oxy-Form) und die Unfhigkeit,den Sauerstoff zu binden, so da schwere Vergiftungen bis zum Tode durch inneresErsticken auftreten knnen. Auerdem entwickelt sich bei hherer Dosis durch dielhmende Wirkung auf das zentrale Nervensystem (ZNS) ein tiefes Koma.9


Bereits Ende des 19. Jahrhunderts wurde erstmals auf den Zusammenhangzwischen dem Auftreten von Blasenkrebs beim Menschen und der Anilin-Expositionin der Farbstoffindustrie hingewiesen (Anilinkrebs). Ein direkter Kausal-zusammenhang zwischen der Anilinexposition und dem Auftreten maligner Tumorekonnte aber bis heute nicht besttigt werden. Man geht davon aus, da diebeobachteten Blasenkarzinome vermutlich durch 2-Naphthylamin oder Benzidinverursacht wurden, die als Verunreinigungen whrend der Anilinsynthese auftreten.10

3.2 Probenahmetechniken

3.2.1 Probenahme mit Impingern (Waschflaschen)

Fr die quantitative Bestimmung gasfrmiger Analyten bedient man sich hufig derImpinger-Technik.11,12 Als Impinger werden spezielle Gaswaschflaschen bezeichnet,die mit der Lsung des Derivatisierungsreagenzes gefllt sind und die man direktnach der Probenahme als Mekolben verwenden kann. Nach dem Befllen derImpinger saugt man mit Hilfe einer Pumpe ein definiertes Luftvolumen durch dieLsung. Dabei sollte der Analyt vollstndig mit dem Reagenz reagieren. ZurDetektion von Analytdurchbrchen schaltet man hinter den Impinger mit derSammellsung noch einen weiteren Impinger mit einer Kontrollsung.

Luftprobe Pumpe

Sammellsung Kontrollsung

Abb. 3.2.1: Schema fr den Aufbau der Probenahmeeinrichtung mit Impingern.

Nach der Probenahme wird der Impinger auf ein definiertes Volumen aufgefllt, undes wird sowohl eine Probe der Sammel- als auch der Kontrollsung direkt in daschromatographische System injiziert. Durchbrche in die Kontrollsung fhren zu


einer falschen Bestimmung des Analyten in dieser Luftprobe (Minderbefunde).Grundstzlich knnen Durchbrche zwei Ursachen haben:

Die Analytkonzentration ist fr die Kapazitt des Sammellsung zu hoch.

Die Derivatisierungsreaktion verluft zu langsam, so da der Analyt nichtquantitativ mit dem Reagenz reagiert.

Mit der Impinger-Technik steht dem Analytiker eine schnelle Methode zurGasphasenbestimmung zur Verfgung. Ein Nachteil ist allerdings der Umgang mitden z. T. toxischen Lsungsmitteln, die whrend der Probenahme verdampfenknnen.

3.2.2 Probenahmerhrchen

Eine weitere Mglichkeit zur quantitativen Bestimmung gasfrmiger Analyten ist dieVerwendung von Probenahmerhrchen.13,14 Das Probenahmerhrchen wird hierbeimit einem Adsorptionsmaterial gefllt, das je nach Arbeitstechnik schon vor demBefllen der Rhrchen mit einem Derivatisierungsreagenz belegt ist oder erst nachdem Fllen des Rhrchens belegt wird. Mit Hilfe einer Pumpe saugt man eindefiniertes Luftvolumen durch das Rhrchen. Um Durchbrche zu detektieren, wirdentweder hinter das Sammelrhrchen ein Kontrollrhrchen geschaltet, oder in einemeinzigen Rhrchen wird hinter der Sammelphase noch eine Kontrollphaseeingebracht.

Kontrollrhrchen Sammelrhrchen

LuftprobeMassen-flu-regler

Pumpe

Abb. 3.2.2: Schema fr den Aufbau der Probenahme mit Probenahmerhrchen.

Nach der Probenahme werden Sammel- und Kontrollrhrchen bzw. Sammel- undKontrollphase getrennt voneinander eluiert und die Eluate in daschromatographische Trennsystem injiziert.


3.3 Analytische Bestimmungsverfahren fr Amine

3.3.1 Grundstzliches zu Derivatisierungsverfahren

Die Derivatisierung eines Analyten ist besonders hilfreich, wenn dieser eine sehrhohe Reaktivitt aufweist oder nur unzureichende Detektionseigenschaften besitzt,so da man ihn nicht direkt bestimmen kann.15,16,17,18

Ein leistungsfhiges Derivatisierungsreagenz sollte im Idealfall die folgendenBedingungen erfllen:

Die Reaktionsgeschwindigkeit der Derivatisierungsreaktion sollte ausreichendhoch sein.

Die Reaktion sollte zur Bildung eines definierten und stabilen Produktesfhren.

Das verwendete Reagenz sollte hinreichend selektiv sein, umNebenreaktionen mit Matrixkomponenten zu vermeiden.

Die Detektionseigenschaften der Analyten sollten sich durch den Einsatz desReagenzes entscheidend verbessern.

Die Umsetzung saurer und basischer Gruppen des Analyten zuunproblematischen Derivaten sollte zur Verbesserung der Trenneigenschaftenfhren.

Mit der Derivatisierung sollte idealerweise eine Anreicherung der Analyteneinhergehen knnen.

Kein Reagenz erfllt smtliche Anforderungen an ein ideales Derivatisierungs-reagenz. Deshalb stehen fr viele Analyten eine Reihe von Reagenzien zurVerfgung, deren Verwendung von der jeweiligen analytischen Fragestellungabhngig gemacht werden mu.


3.3.2 Derivatisierung von Aminen in Lsung

Die Lebensmittelchemie stellt einen groen Anwendungsbereich fr die Analytik vonAminen in Lsung dar. Von besonderem Interesse sind hier die sogenanntenbiogenen Amine (bA), die sich als Stoffwechselprodukte von Tieren, Pflanzen undMikroorganismen6,20 in den unterschiedlichen Nahrungsmitteln befinden. Whrendder Fermentation21,22,23 von Lebensmitteln oder bei Verderbnisprozessen24,25

entstehen grere Mengen bA durch Decarboxylierung der entsprechenden freienAminosuren, weshalb sie unter anderem wichtige Indikatoren fr den Verderb vonLebensmitteln und damit fr deren Qualitt sind.26,27,28

Lebensmittel stellen an die Analysenmethode sehr hohe Ansprche, da es sich in derRegel um Proben mit einer komplexen Matrix handelt.26 Aus diesem Grund mu dasReagenz mglichst selektiv mit den Analyten reagieren. Soll eine ganze Gruppe vonAnalyten, in diesem Fall verschiedene Amine, simultan mit einemDerivatisierungsreagenz bestimmt werden, so ist eine anschlieende Trennung derDerivate sinnvoll. Die Trennung erfolgt in der Regel mittels Gaschromatographie(GC),29 Dnnschichtchromatographie (DC)30 oder Flssigchromatographie (LC).Wegen der hohen Selektivitt und Empfindlichkeit fr bA wird in der Vielzahl derFlle die Hochleistungsflssigkeitschromatographie (HPLC) mit anschlieenderUV/vis31,32- oder fluoreszenspektroskopischer Detektion eingesetzt.33,34,35

a) Derivatisierungsverfahren mit flssigchromatographischer Trennung undanschlieender UV/vis-spektroskopischer Detektion

3,5-Dinitrochlorbenzol (DNClBz)

Dieses Verfahren beruht auf einer Vorsulenderivatisierung der bA mit DNClBz alsDerivatisierungsreagenz.36 Nach der flssigchromatographischen Trennung mittelseines ternren Gradienten und einer Umkehrphasensule werden die entstandenenDerivate UV/vis-spektroskopisch bei 260 nm detektiert und quantifiziert. DieKalibration erfolgt ber die Reaktion mit 1,6-Diaminohexan als internem Standard.


Cl

O2N

O2N

NH

RRI

I+- HCl

N

O2N

O2NR

RI

DNClBz Amin DNBzAmin

Abb. 3.3.1: Reaktion von 3,5-Dinitrochlorbenzol (DNClBz) mit Monoaminen alsBeispiel (R = H, Alkyl; RI = Alkyl, Aryl).

Die DNClBz-Methode erlaubt die simultane Bestimmung der fnf wichtigsten in Fischvorkommenden biogenen Amine: Histamin, Putrescin, Cadaverin, Spermidin undSpermin. Allerdings fhrt die Detektion bei 260 nm zu Strungen durchMatrixbestandteile, die bei diesen Wellenlngen absorbieren.

p-Nitrobenzyloxycarbonylchlorid (PNZCl)

Diese Methode beruht auf der Derivatisierung von biogenen Amine mit PNZCl alsDerivatisierungsreagenz.37 Nach der flssigchromatographischen Trennung mittelseines ternren Gradienten und einer Umkehrphasensule werden die entstandenenDerivate UV/vis-spektroskopisch bei 265 nm detektiert und quantifiziert. DieKalibration erfolgt ber die Reaktion mit 1,6-Diaminohexan als internem Standard.

CH2O2N O C ClO

NH

RRI

+- HCl RI

CH2O2N O C NO R

PNZCl Amin Carbamat

I

Abb. 3.3.2: Reaktion von p-Nitrobenzyloxycarbonylchorid (PNZCl) mit Monoaminenals Beispiel (R = H, Alkyl; RI = Alkyl, Aryl).

Auch die PNZCl-Methode erlaubt eine simultane Bestimmung der fnf wichtigsten inFisch vorkommenden biogenen Amine. Die Detektion bei 265 nm kann allerdings zuStrungen durch Matrixbestandteile fhren, die bei diesen Wellenlngenabsorbieren.


b) Derivatisierungsverfahren mit flssigchromatographischer Trennung undanschlieender fluorimetrischer Detektion.

2-Naphthyloxycarbonylchlorid (NOCCl)

Bei dieser Methode wird NOCCl als fluorogenes Reagenz fr die Derivatisierungbiogener Amine eingesetzt.38 Nach der flssigchromatographischen Trennung mittelseines binren Gradienten und einer Umkehrphasensule werden die gebildetenDerivate fluorimetrisch bei einer Anregungswellenlnge von 274 nm und einerEmissionswellenlnge von 335 nm detektiert und quantifiziert.

OC

Cl

O2 + H2N (CH2)4 NH2 2 HCl-

OC

N

O

(CH2)4 N CO

OH H

NOCCl Put

Abb. 3.3.3: Reaktion von 2-Naphthyloxycarbonylchlorid (NOCCl) mit Putrescin (Put)als Beispiel fr ein biogenes Amin.

Analog zur DNBzCl-und PNZCl-Methode erlaubt die NOCCl-Methode eine simultaneBestimmung der fnf wichtigsten in Fisch vorkommenden biogenen Amine. Aufgrundder Fluoreszenzdetektion ist sie jedoch wesentlich strungsunanflliger als diebeiden anderen Methoden.


3.3.3 Derivatisierung von Aminen in der Gasphase

Flchtige Amine treten nicht nur bei industriellen Prozessen in der Farbstoff- undPolymerherstellung, sondern auch bei der Verarbeitung und Zersetzung vonStickstoffverbindungen vorwiegend tierischen Ursprungs auf. Aufgrund der Toxizittvieler flchtiger Amine ist es sinnvoll, die Arbeitsplatzluft solcher Betriebe zuberwachen, in denen derartige Verbindungen emittiert werden. Hierunter fallenbeispielsweise kunststoffverarbeitende, Pflanzenschutzmittel produzierende sowieFisch und Fleisch verarbeitende Betriebe.

Aufgrund der komplexen Matrix, die in derartigen Luftproben zu erwarten ist, ist essinnvoll, mglichst selektive Derivatisierungsreagenzien fr Amine einzusetzen unddie verschiedenen Derivate nach erfolgter Probenahme voneinander zu trennen, umsie mglichst simultan bestimmen zu knnen. Die meisten bestehenden Methodenberuhen auf einer flssigchromatographischen Trennung mit anschlieender UV/vis-oder fluoreszenzspektroskopischer Detektion und Quantifizierung.

b) Derivatisierungverfahren mit flssigchromatographischer Trennung undanschlieender UV/vis-spektroskopischer Detektion.

2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFBz)

In Deutschland erfolgt die Bestimmung primrer und sekundrer aliphatischer Aminenach den Richtlinien des Vereins Deutscher Ingenieure (VDI).39 DieseBestimmungsmethode beruht auf der Derivatisierung aliphatischer Amine mit DNFBzals Derivatisierungsreagenz. Nach der Impingerprobenahme erfolgt die flssig-chromatographische Trennung. Die gebildeten Derivate werden UV/vis-spektroskopisch bei 370 nm detektiert und quantifiziert. Die Kalibration erfolgt berexterne Standards.


FNO2

NO2

+ NH

RRI

I- HF

NNO2

NO2

R RI

DNFBz Amin DNBzAmin

Abb. 3.3.4: Nucleophile aromatische Substitutionsreaktion von 2,4-Dinitrofluor-benzol (DNFBz) mit einem Amin (R, RI = H, Alkyl).

Bei der DNFBz-Methode handelt es sich aufgrund der externen Kalibration um einesehr robuste Methode. Ein entscheidender Nachteil ist hier allerdings, daausschlielich die Bestimmung aliphatischer Amine mglich ist.

5,7-Dinitrobenzofurazan (BFZ) und 4,6-Dinitrobenzofuroxan (BFO)

Bei diesen Methoden werden BFZ und BFO als Derivatisierungsreagenzienverwendet.40,41 Nach der Probenahme mittels Probenahmerhrchen erfolgt dieflssigchromatographische Trennung. Die Quantifizierung erfolgt fr beideReagenzien UV/vis-spektroskopisch bei 510 nm.

NO

N

NO2

O2NCl

NO

N

NO2

O2NCl O

BFZ BFO

Abb. 3.3.5: Strukturformel des 5,7-Dinitrobenzofurazan (BFZ) und des 4,6-Dinitrobenzofuroxan (BFO).


b) Derivatisierungverfahren mit flssigchromatographischer Trennung undanschlieender fluorimetrischer Detektion.

4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDCl)

In den Vereinigten Staaten erfolgt die Bestimmung von primren und sekundrenaliphatischen Aminen nach der Methode der Behrde fr Arbeitssicherheit undGesundheit (OSHA, Occupational Safety & Health Administration, U.S. Departmentof Labor). Diese Methode beruht auf der Derivatisierung aliphatischer Amine mitNBDCl als Derivatisierungsreagenz.42 Nach der Probenahme mittelsProbenahmerhrchen (Adsorbens: XAD-7, Normalphasenkieselgel) erfolgt dieflssigchromatographische Trennung mit einem binren Gradienten und einerCyanopropyl-Sule. Die gebildeten Derivate werden UV/vis-spektroskopischund/oder fluorimetrisch bei einer Anregungswellenlnge von 465 nm und einerEmissionswellenlnge von 525 nm detektiert und quantifiziert. Die Kalibration erfolgtber die Reaktion der entsprechenden Amine mit NBDCl, d.h. es wird nicht berexterne Standards kalibriert.

NO

N

NO2

Cl

NH

RRI

+N

ON

NO2

NR RI

- HCl

NBDCl Amin NBDAmin

I

Abb. 3.3.6: Derivatisierungsreaktion von 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol(NBDCl) mit Aminen (R, RI = H, Alkyl).

Ein Vorteil der OSHA-Methode ist die Verwendung von Probenahmerhrchen. Sieerlauben eine Probenahme ohne den Einsatz toxischer Lsungsmittel. Ein groerNachteil dieser Methode ist, da ausschlielich die Quantifizierung aliphatischerAmine mglich ist. Desweiteren kann die Kalibration ber die Reaktion in Lsung zu


schlechteren Nachweisgrenzen fhren, da die Reaktion mglicherweise nichtquantitativ verluft und Nebenprodukte gebildet werden.

3.4 Detektion und Quantifizierung in der Flssigchromatographie

3.4.1 UV/vis-Detektion

Die Absorption elektromagnetischer Strahlung im ultravioletten (200-400 nm) undsichtbaren Bereich (400-800 nm) fhrt zur Anregung von Valenzelektronen in einemMolekl. Das Molekl nimmt bei diesem Vorgang Energie in Form eines Photons aufund wird vom elektronischen Grundzustand in einen elektronisch angeregtenZustand berfhrt. Die verschiedenen elektronischen Zustnde haben im Gegensatzzu Atomen durch berlagerte Schwingungs- und Rotationsniveaus relativ breiteEnergiebereiche. Aus diesem Grund erhlt man bei Moleklen kein Linien- sondernein Bandenspektrum.

Eine Klassifizierung der Elektronenbergnge (Absorptionsbanden) lt sich mit Hilfeder beteiligten Moleklorbitale (MO) treffen. Aus bindenden - oder pi-Orbitalen oderaus den nichtbindenden n-Orbitalen (einsame Elektronenpaare) kann ein Elektron indie leeren antibindenden pi*- oder *-Orbitale angehoben werden. Entsprechend kannman zwischen vier verschiedenen Arten von bergngen unterscheiden: *,n*, npi* und pipi*. 3,16,43,44

Fr die praktische Anwendung der UV/vis-Detektion in der HPLC sind nur diejenigenbergnge interessant, die charakteristisch fr das zu detektierende Molekl sind;dies sind fr gewhnlich npi* und pipi*-bergnge.45 Sie entsprechen derAnregung von freien Elektronenpaaren und pi-Elektronen und finden in einemWellenlngenbereich von 200-800 nm statt

Quantitative Aussagen der UV/vis-Spektroskopie werden durch die Gltigkeit desLambert-Beerschen-Gesetzes (Gl. 3.4.1) ermglicht:

EII T c x= = = log log ( )0 (Gl. 3.4.1)


E: Extinktion,I0: Intensitt des eingestrahlten Mestrahls,I: Intensitt des die Probelsung verlassenden Mestrahls,T: Transmission,(): Extinktionskoeffizient bei der Wellenlnge ,c: Konzentration des Analyten,x: Schichtdicke.

Fr die UV/vis-Detektion werden in der HPLC heute drei verschiedene Detektortypeneingesetzt.17

Festwellenlngendetektoren mit einer Quecksilber-Niederdrucklampe, die nurdie Detektion bei 254 nm erlauben.

Detektoren, die eine Lichtquelle mit kontinuierlichem Spektrum imultravioletten (Deuteriumlampe, 190- 370 nm) und im sichtbaren (Wolfram-Halogenlampe, 370-800 nm) Bereich des elektromagnetischen Spektrumsbesitzen. Durch einen Monochromator kann die Mewellenlnge demAbsorptionsmaximum der Analyten angepat werden.

Diodenarray-Detektoren, die die Aufnahme eines vollstndigen Spektrums zujedem Zeitpunkt des chromatographischen Laufes erlauben. DieserDetektortyp kann neben der Quantifizierung wichtige Informationen bei derIdentifizierung unbekannter Verbindungen liefern.

3.4.2 Fluoreszenzdetektion

In Analogie zur UV/vis-Spektroskopie bildet die Absorption eines Photons auch dieBasis fr die Fluoreszenzspektroskopie. Das Molekl wird dabei in einen elektronischangeregten Zustand berfhrt. Die Emission der Strahlung, bei der das Molekl inden Grundzustand zurckkehrt, hat entweder die gleiche Energie(Resonanzfluoreszenz) oder eine geringere Energie als die einfallende Strahlung.Den Unterschied zwischen Anregungswellenlnge und Emissionswellenlngebezeichnet man nach ihrem Entdecker als Stokes Shift. Ursache hierfr ist, da


whrend der Absorption nicht nur eine elektronische Anregung, sondern auch eineSchwingungsanregung erfolgt (Franck-Condon-Prinzip). Die Schwingungsenergiewird durch Relaxation sehr viel schneller abgebaut als das Licht emittiert werdenkann, so da die Rckkehr in den elektronischen Grundzustand immer aus demSchwingungsgrundzustand des elektronisch angeregten Zustandes erfolgt.3,16,43,44,46

Fluoreszenzerscheinungen finden sich hufig bei aromatischen Verbindungen.Benzol selbst zeigt starke ultraviolette Fluoreszenz, d.h. es absorbiert kurzwelligeultraviolette Strahlung (230270 nm) und emittiert lngerwelliges, aber immer nochunsichtbares ultraviolettes Licht (260300 nm). Sind mehrere Benzolkernekondensiert, so kann das emittierte Fluoreszenzlicht aufgrund des groenkonjugierten pi-Systems in den sichtbaren Bereich des Spektrums rcken. AufSubstitutionen am Benzol reagiert das Fluoreszenz-Spektrum hinsichtlich Lage undIntensitt der Linien hnlich empfindlich wie das Absorptionsspektrum. Fhrt maneine Nitro-Gruppe (Nitrobenzol, Nitrotoluol) in den Benzol-Kern ein, so verschwindetdie Fluoreszenz vllig; dagegen wird sie durch Einfhrung von Alkyl-Gruppenverstrkt; hier tritt eine sogenannte bathochrome Verschiebung (in denlngerwelligen Bereich) ein. hnliche Effekte zeigen die CN- oder H2C=CH-Gruppe,whrend Halogene im Benzol-Molekl nur eine geringe Verschiebung derFluoreszenz unter gleichzeitiger Schwchung der Intensitt bewirken.2

Fr die quantitative Fluoreszenzspektroskopie gilt die in Gl. 3.4.2 beschriebeneNherung:

I I c xf = 2 303 0, (Gl. 3.4.2)


If: Intensitt des Fluoreszenzlichts,: Quantenausbeute,I0: Intensitt des eingestrahlten Lichts,: Extinktionskoeffizient,c: Konzentration des Analyten,x: optische Weglnge.

Im Gegensatz zur UV/vis-Absorptionsspektroskopie ist die Fluoreszenzdetektiondurch signifikant niedrigere Nachweisgrenzen gekennzeichnet. Dies ist vor allemdarauf zurckzufhren, da fr niedrige Analytkonzentrationen bei derphotometrischen Absorptionsmessung ein kaum geschwchtes Signal (I) vomAusgangssignal (I0) subtrahiert werden mu. Im Gegensatz dazu findet dieFluoreszenzmessung nahezu ohne Hintergrundsignal statt. KlassischeFluoreszenzdetektoren fr die HPLC nutzen in der Regel lichtstarke Xenonlampenals Anregungsquelle. Das emittierte Licht wird hierbei senkrecht zur Einstrahlrichtunggemessen. Besonders hohe Anregungsenergien werden durch Laserquellen erreicht.Diese sogenannte laserinduzierte Fluoreszenz (LIF) ist besonders fr die Mikro-HPLC oder die Kapillarelektrophorese (CE) geeignet.

3.4.3 Massenspektrometrische Detektion

Eine hervorragende Ergnzung zur UV/vis- und fluoreszenzspektroskopischenDetektion in der Flssigchromatographie bietet die massenspektrometrischeDetektion. Im Gegensatz zu den optischen Detektionstechniken ist mit dermassenspektrometrischen Detektion eine Identifizierung von unbekanntenVerbindungen nicht nur aufgrund spektroskopischer Eigenschaften (UV/vis-Eigenschaften, Fluoreszenzeigenschaften, Retentionszeiten), sondern auch mit Hilfeder Masse-zu-Ladungs-Verhltnisse der untersuchten Molekle mglich. Es bestehtso die Mglichkeit, die Ergebnisse der spektroskopischen Methoden zu besttigenoder zu widerlegen.

Ein fundamentales Problem bei der Kopplung der Flssigchromatographie mit derMassenspektrometrie war lange Zeit die erhebliche Diskrepanz zwischen dem relativgroen Lsungsmittelvolumen, das die Trennsule verlt, und den bei der


Massenspektrometrie erforderlichen Vakuumbedingungen. In modernen Interfaceswurde dieses Problem durch die Entwicklung der inzwischen weit verbreitetenElectrospray-Ionisation (ESI) und der chemischen Ionisation bei Atmosphrendruck(APCI) gelst.

Chemische Ionisation bei Atmosphrendruck (APCI)

Im APCI-Modus werden Ionen in der Gasphase bei Atmosphrendruck generiert.Hierzu wird der aus dem chromatographischen Trennsystem ankommendeEluensstrom durch ein Nebulizer-Gas fein zerstubt und in einer beheizbarenKammer auf ungefhr 400 C erhitzt. Hierbei verdampfen das HPLC-Eluens und derAnalyt schlagartig.

Quadrupol

Vorvakuum Hochvakuum Coronar-Entladung

HPLC-Eluens

geheizteKapillare

Nebulizergas

Vorhanggas

Abb. 3.4.1: Schematischer Aufbau eines APCI-Interfaces.

Die wegen der nur kurzen Verweilzeit in diesem Teil des Probenkopfes nochweitgehend unzersetzten Analytmolekle werden mit dem Trgergasstrom in denHochvakuumbereich des Gertes transportiert. Auf ihrem Weg dorthin werden siedurch eine Metallnadel, an der wahlweise eine positive oder negative Spannungangelegt werden kann, ionisiert. Hierbei wird die Ionisation der Probenmolekledurch die aus den Trgergasmoleklen aufgrund von Coronarentladungengenerierten Ionen induziert. Durch Zusammenste dieser ionisierten Gasmoleklemit den Analyten werden Ladungen bertragen. Anschlieend gelangen diegeladenen Analytmolekle in den Massenanalysator.47,48


Electrospray-Ionisation (ESI)

Ebenso wie die Ionisierung im APCI-Modus erzeugt der Electrospray-Proze Ionenin der Gasphase bei Atmosphrendruck. Hierzu wird das von der HPLC kommendeEluens durch eine Hohlnadel, an der ein hohes elektrisches Potential anliegt, in eineKammer gesprht. Diesem Sprhnebelstrahl ist, hnlich wie bei der APCI-Technik,oftmals ein Gasstrom entgegengerichtet. Vielfach verluft dieser Gasstrom jedochauch parallel zum Sprhnebelstrahl. Hierbei entstehen geladene Tropfen, die unterVerdampfung des Lsungsmittels und durch die daraus resultierenden Coulomb-Explosionen, die wegen des stetig steigenden Ladung/Masse-Verhltnissesauftreten, immer mehr an Gre verlieren.

Quadrupol

Vorvakuum Hochvakuum

HPLC-Eluens

Kapillare mitHochspannung

Nebulizergas

Vorhanggas

Abb. 3.4.2: Schematischer Aufbau der ESI-Einheit.

Unter dem Einflu des elektrischen Feldes gelangen die geladenen Trpfchen durcheine Kapillare in den Vorraum des Massenanalysators, wo sie durch elektrostatischeLinsensysteme fokussiert werden. Anschlieend gelangen die ionisierten Analyten inden Detektorbereich.48,49

Insbesondere fr komplexe Naturstoffe wie Proteine ermglicht die Elektrospray-Technik die Erzeugung mehrfach geladener Spezies und erlaubt so den Zugangauch zu hohen Massenbereichen.48,50,51


Der Quadrupol-Analysator

Ein Quadrupol-Massendetektor besteht aus vier parallel im Quadrat angeordnetenMetallstben, von denen kreuzweise jeweils zwei miteinander leitend verbundensind. Die Trennung der Ionen erfolgt durch Ablenkung mit Hilfe elektrischer Felder.An jeweils zwei gegenberliegenden Stben liegt eine Wechselspannung an, die voneiner positiven oder negativen Gleichspannnung berlagert wird. Die angelegteWechselspannung baut alternierend positive und negative elektrische Felder auf, soda die Ionen einmal zur Mittelachse und einmal zu den Stben beschleunigtwerden. Wie weit sie dabei aus ihrer geradlinigen Bahn seitlich abgelenkt werden,hngt von der angelegten Spannung, der Frequenz und der Masse der Ionen ab. Dienegativ bzw. positiv berlagerte Gleichspannung sorgt dafr, da Ionen ab einerbestimmten Masse zu den Stben hin abgelenkt oder zur Mittelachse fokussiertwerden. Durch geeignete Abstimmung der Gleich- und Wechselspannung lt sicherreichen, da jeweils nur Ionen eines bestimmten Masse-zu-Ladungs-Verhltnissesdas Stabsystem passieren knnnen. Die Quadrupol-Einheit kann deshalb auch alsMassenfilter bezeichnet werden.52

3.5 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDCl)

3.5.1 Darstellung

Die Synthese des 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazols (NBDCl, 4-Chloro-7-nitrobenzofurazan) ist erstmals 1967 von Ghosh und Whitehouse53,54 beschriebenworden. Ausgehend von 2,6-Dichloronitrosobenzol wird in einer nucleophilenaromatischen Substitutionsreaktion ein o-Nitrosophenylazid erhalten (a), welchesnach Pyrolyse das 4-Chlorobenzo-2-oxa-1,3-diazol liefert (b). Die Nitrierung des 4-Chlorobenzo-2-oxa-1,3-diazols ergibt das gewnschte Produkt, 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (c).


Cl

Cl

NONaN3(a)

ClNO

N3

+

NO

N

Cl

NO

N

Cl

NO2

-N2

(b)

HNO3/H2SO4

(c)

NO-

NN N

Abb. 3.5.1: Darstellung des 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDCl)ausgehend von 2,6-Dichloronitrosobenzol.

3.5.2 Eigenschaften und Anwendung

Benzo-2-oxa-1,3-diazole haben aufgrund ihrer attraktiven spektroskopischenEigenschaften einen weiten Einsatz in der Analytische Chemie gefunden.55,56

NO

N

RII

RI

aH

bH 1

2

34

5

67

Abb. 3.5.2: Strukturformel des Benzo-2-oxa-1,3-diazol-Grundgerstes (RI, RII =Substituenten).

In der Literatur sind die spektroskopischen Eigenschaften von sehr vielenVerbindungsklassen mit den Resten RI und RII diskutiert worden57. Whrend alleBenzo-2-oxa-1,3-diazole hervorragende UV/vis-spektroskopische Eigenschaftenzeigen, sind jedoch nur einige Verbindungen auch gleichzeitig gute Fluorophore.57


NO

N

SO2NH2

NH3C H

NO

N

SO2N(CH3)2

NH3C H

NO

N

NO2

NH3C H

R.F.I. = 2,0 R.F.I. = 5,9 R.F.I. = 62,7

Abb.3.5.3: Strukturformel ausgewhlter Aminderivate der Benzo-2-oxa-1,3-diazole(R.F.I. = relative Fluoreszenzintensitt; bezogen auf SO2N(CH3)2/NH2als Referenzverbindung mit R.F.I. = 1; die R.F.I. beziehen sich aufMessungen von Imai et al.57).

So zeigen beispielsweise die Aminderivate der Benzo-2-oxa-1,3-diazole mitSulfonamid-Gruppe (RII = SO2NH2, SO2(CH3)2) nur sehr schwache Fluoreszenzverglichen mit den Aminderivaten der Benzo-2-oxa-1,3-diazole mit Nitrogruppe (RII =NO2). Abbildung 3.5.3 zeigt ausgewhlte Vertreter dieser Verbindungen.

Fr die Bestimmung von Thiolen,58 Phenolen,59,60 Aminosuren,53,61,62,63,64,65,66

Aminen,42,53,67 Aldehyden und Ketonen,68,69,70 werden aufgrund ihrer gutenFluoreszenzeigenschaften hufig Derivatisierungsreagenzien auf der Basis des 7-Nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol-Grundgerstes (RII= NO2) eingesetzt.

In dieser Arbeit sollen nicht nur die UV/vis- und fluoreszenzspektroskopischenEigenschaften der Aminderivate des 4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazols,sondern auch die massenspektrometrischen Eigenschaften untersucht werden.


4 Experimenteller Teil

4.1 Chemikalien

Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Chemikalien wurden von den folgendenFirmen bezogen:

Aldrich (Steinheim), Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Sigma (Deisenhofen), Supelco (Deisenhofen).

Die Lsungsmittel fr die prparativen Arbeiten und spektroskopische Messungenwurden von Grssing (Filsum) bezogen.

Als Laufmittel fr die HPLC dienten Acetonitril elution grade von Merck eurolab(Fontenau S, Bois/Frankreich) und Wasser fr die Chromatographie von Merckeurolab (Briare le Canal/Frankreich).

4.2 Gerte

4.2.1 Elementaranalyse

Die Elementaranalysen wurden im Institut fr Anorganische und Analytische Chemieder Westflischen Wilhelms-Universitt Mnster mit einem vario EL III CHNOS-Analysator (Gerte-Version H) der Fa. Elementar Analysensysteme GmbH (Hanau)bestimmt.

4.2.2 FT-IR

Die Infrarotspektren wurden im Institut fr Anorganische und Analytische Chemie derWWU Mnster mit dem Gert IFS 48 der Fa. Bruker (Bremen) aufgenommen. DieInfrarotspektren wurden im Bereich von 4000 cm-1 bis 400 cm-1 aufgenommen. Die


Lage der Banden wird in Wellenzahlen (cm-1) und ihre Intensitt mit s (strong, stark),m (middle, mittel), w (weak, schwach) angegeben. Die synthetisierten Verbindungenwurden als Kaliumbromid-Prelinge vermessen.

4.2.3 Massenspektren

Die Schubstangen-Massenspektrometrie mit Elektronensto-Ionisation bei 70 eVwurde an einem MAT 212 der Fa. Varian (Darmstadt) im Institut fr Anorganischeund Analytische Chemie der WWU Mnster durchgefhrt.

4.2.4 1H-NMR-Spektren

Die 1H-NMR-Spektren wurden im Institut fr Anorganische und Analytische Chemieder WWU Mnster unter Verwendung des Gertes AC 200 der Fa. Bruker (Bremen)aufgenommen. Die Proben wurden in DMSO-d6 als Lsungsmittel vermessen Diechemischen Verschiebungen werden in parts per million (ppm) angegeben undbeziehen sich auf Tetramethylsilan (TMS, Si(CH3)4) als Referenzverbindung. Fr dieSignalmultiplizitten wurden die Abkrzungen s (Singulett), d (Dublett), t (Triplett), q(Quartett) und m (Multiplett) verwendet.

4.2.5 Photometrie

Die photometrischen Messungen wurden mit einem Diodenarray-Photometer HP8453 mit der Software UV/visible HP Chem-Station 845x der Fa. Hewlett-Packard(Waldbronn) durchgefhrt.

4.2.6 Fluoreszenzspektren

Die Fluoreszenzspektren wurden mit einem Fluoreszenzspektrometer Modell RF-5301 und der Software Version 1.10 der Fa. Shimadzu (Duisburg) aufgenommen.


4.2.7 HPLC

Die flssigchromatographischen Trennungen wurden mit folgendem HPLC-Systemder Fa. Shimadzu (Duisburg) durchgefhrt:

Pumpen: zwei LC-10AS, Diodenarray-Detektor: SPD-10AVp, Fluoreszenz-Detektor: RF-10AXL, Software: Class LC 10 Version 1.6, Kontrolleinheit: CBM 10A, Entgaser: GT-154, Autosampler: SIL-10A.

Als stationre Phase wurde folgendes System verwendet: Umkehrphasensule: Discovery C18 der Fa. Supelco (Deisenhofen),

HPLC-Column, 15 cm x 3 mm, 5 m, Vorsule: Discovery C18 der Fa. Supelco (Deisenhofen), HPLC-Precolumn,

2 cm x 3 mm, 5 m.

Als mobile Phase kam folgender binrer Gradient aus Acetonitril und Wasser zumEinsatz:

Zeit[min] 0 1,5 8,5 10,5 13,5 14,5 16,0 19,5

c(AcNi)[%] 30 30 50 50 100 100 30 30

Injektionsvolumen: 10 L, Flu: 0,62 mL/min.


4.2.8 LC-MS

Die flssigchromatographischen Trennungen wurden mit folgendem HPLC-Systemder Fa. Shimadzu (Duisburg) durchgefhrt:

Pumpen: zwei LC-10AD vp, UV/vis-Detektor: SPD-10A, Software: Class 8000 Version 1.11, Kontrolleinheit: SCL-10Avp, Entgaser: DGU-14A, Autosampler: SIL-10A, Massenspektrometer: LCMS QP8000.

Als stationre Phase wurde folgendes System verwendet: Umkehrphasensule: Discovery C18 der Fa. Supelco (Deisenhofen),

HPLC-Column, 15 cm x 3 mm, 5 m, Vorsule: Discovery C18 der Fa. Supelco (Deisenhofen), HPLC-Precolumn,

2 cm x 3 mm, 5 m.

Als mobile Phase kam folgender binrer Gradient aus Methanol und Wasser zumEinsatz:

Zeit [min] 0 0,5 7 11 13 14 18c(MeOH)

[%]35 35 50 100 100 35 35

Injektionsvolumen: 10 L, Flu: 0,6 mL/min.


4.2.9 Aktivprobenahme

Fr die Aktivprobenahme ist folgendes System zur Anwendung gekommen: Pumpe: Als Pumpe kam ein Zweikanal-Air-Sampler Modell 1067 der Fa.

Supelco (Deisenhofen) zur Anwendung. Die Flurate der Zweikanal-Pumpewurde mit Hilfe eines 1000mL-Bubble-Flowmeters der Fa. Supelco(Deisenhofen) bestimmt.

Gepackte Rhrchen: Die Herstellung reagenzbeschichteterProbenahmerhrchen erfolgte mit den SPE-Kartuschen Supelclean LC-8,Supelclean LC-8 TS, Supelclean LC-18 und Discovery DPA-6S-Material(Polypropylen-Filtrationskartuschen mit Polyethylenfritten, Fllmenge 500 mg,Partikelgre 45 m, Porendurchmesser 60 , Kartuschen-Volumen 6 mL)der Fa. Supelco (Deisenhofen)

Ungepackte Rhrchen: Die Herstellung selbst gepackterProbenahmerhrchen erfolgte unter Verwendung von 6mL-Glaskartuschen mitTeflon-Fritte der Fa. Supelco (Deisenhofen) und dem PackungsmaterialDiscovery DPA-6S-Material (Partikelgrenverteilung 50-160 m,unregelmige Partikelform, Lot: SP2388) der Fa. Supelco (Deisenhofen).


4.3 Synthese und Charakterisierung der 4-Amino-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBDamine)

4.3.1 4-(Amino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDA)

NO

N

NO2

N

aH

bH

HH

1

2

34

5

67

Die Synthese des reinen NBDA-Standards ist sehr aufwendig, da das Ammoniak-Molekl nur ein sehr schwaches Nucleophil darstellt. Die schwache Nucleophilie desAmmoniak-Molekls fhrt zu sehr langsamen Reaktionsgeschwindigkeiten und damitzur Bevorzugung aller Konkurrenzreaktionen mit strkeren Nucleophilen.

NO

N

NO2

Cl NO

N

NO2

NR RI

NO

N

NO2

OH

+ HNRRI

+ OH-NBDCl

NBDAmin

NBDOH

SN2Ar

SN2Ar

Abb. 4.3.1: Bildung des NBDAmins und des Hydrolyseproduktes NBDOH (R, RI =H, Alkyl, Aryl; SN2Ar = Nucleophile aromatische Substitution).


Beim Arbeiten mit ammoniakalischen Lsungen sind aufgrund der basischenEigenschaften des Ammoniaks immer Hydroxyl-Anionen anwesend, die strkereNucleophile als das Ammoniak-Molekls sind, so da als Konkurrenzreaktionbevorzugt die Hydrolyse auftritt. Bei der Aufarbeitung des Standards ist also dasHydrolyse-Produkt zu entfernen.

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-(Amino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolsIn einem 100mL-Dreihalskolben werden 500 mg NBDCl (2,5 mmol) in 20 mLAcetonitril gelst. Zu dieser Lsung tropft man sehr langsam eine Mischung aus 8,5mL einer 28%igen Ammoniumhydroxid-Lsung (125 mmol) gelst in 10 mLAcetonitril und lt 48 Stunden bei Raumtemperatur rhren. Zur Reaktionsmischunggibt man 50 mL DMSO und extrahiert dieses Gemisch dreimal mit je 50 mLDiethylether (destilliert). Um das Hydrolyseprodukt aus der organischen Phase zuentfernen, extrahiert man dreimal mit je 20 mL einer 10%igenNatriumhydrogencarbonat-Lsung, wscht einmal mit 20 mL Wasser und trocknetdie organische Phase ber Natriumsulfat. Dann entfernt man das Lsungsmittel imVakuum und erhlt ein schwarzbraunes Pulver.

Ausbeute: schwarzbraune Kristalle; 14% (63 mg, 0,35 mmol)

Charakterisierung:

1H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]: 8,46 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 6,24 (d, 1H, Hb, 3Jab=8,5 Hz)

EA berechnet fr: C6H4N4O3 C: 40,00%; H: 2,22%;gefunden: C: 40,29%; H: 2,24%

Die Elementaranalyse lieferte fr den Stickstoff-Gehalt des NBDA keinenakzeptablen Wert, obwohl die Kontrolle mittels HPLC sowie die andereneingesetzten Methoden keine Hinweise auf eventuelle Verunreinigungen zeigten.

IR [cm-1]: 3430 (m), 3340 (s), 3230 (m), 3085 (w), 2965 (w), 1645 (s), 1560(s),1530 (w), 1495 (m), 1445 (m),1420 (m),1385 (w), 1310(s), 1285 (w)


EI-MS [m/z]: 180 (M+, 100%), 150 (M+-NO, 27%), 104 (31%), 77 (39%), 52 (15%),30 (15%)

APCI(-)-MS [m/z]: 179 ([M-H]-)

UV (CH3CN): max [nm]: 448(max) [L.mol-1.cm-1]: 11400

Fluoreszenz (CH3CN): em [nm]: 524ex [nm]: 470

4.3.2 4-N-(Methylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDMA)

NO

N

NO2

N

aH

bH

CH3H

1

2

34

5

67

Die Synthese des NBDMA-Standards erfolgt nicht direkt durch die Reaktion desNBDCl mit Methylamin als Nucleophil, da es sich beim Methylamin um ein beiRaumtemperatur flchtiges Amin (Kp. 6,3 C) handelt. Das Methylamin wird indirektaus dem Hydrochlorid freigesetzt, indem man die Reaktion in einem schwachbasischem Puffer durchfhrt. In Gegenwart des Puffers ist es zudem mglich, dieHydrolyse als unerwnschte Nebenreaktion vollstndig zu unterdrcken.


Arbeitsvorschrift (1) fr die Synthese des 4-N-(Methylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolsIn einem 250mL-Rundkolben werden ca. 0,85 g (12,5 mmol) Methylaminhydrochloridin 100 mL eines 2%igen Natriumhydrogencarbonat-Puffers (pH 9-10) gelst. Zudieser Lsung tropft man schnell 500 mg (2,5 mmol) NBDCl gelst in 20 mLAcetonitril hinzu. Die Reaktionsmischung lt man 48 Stunden bei Raumtemperaturrhren. Das rotbraune Derivat fllt aus der Mischung aus und wird ber einemBchnertrichter abgesaugt, anschlieend mit Wasser und wenig Acetonitrilgewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: rotbraune Kristalle; 48% (233 mg, 1,2 mmol)

Ein alternativer Weg zur Darstellung des 4-N-(Methylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazols ist von Bldt et al. in der Literatur71 beschrieben.

NO

N

NO2

NH3C NH2

NO

N

NO2

NH3C H

NO2-/H+

MNBDH NBDMA

Abb. 4.3.2: Reaktion des MNBDH mit Nitrit in saurer Lsung.

Hierbei wird das NBDMA nicht ber eine nucleophile aromatische Substitutionhergestellt, sondern ber die Oxidation von 4-N-Methylhydrazino-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (MNBDH) mit Natriumnitrit als Oxidationsmittel.


Arbeitsvorschrift (2) fr die Synthese des 4-N-(Methylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazols aus MNBDH und Nitrit0,2 g ( 0,9 mmol) MNBDH werden in 30 mL Ethanol und 5 mL konzentrierterSalzsure gelst und unter Eiskhlung mit einer Lsung von 70 mg (1 mmol)Natriumnitrit in 5 mL destilliertem Wasser versetzt. Nach halbstndigem Stehen derLsung bei Raumtemperatur werden 50 mL Wasser hinzugegeben. Anschlieendlt man noch eine Stunde bei Raumtemperatur stehen, wobei ein rotbraunerNiederschlag ausfllt. Dieser wird abfiltriert und mit Eiswasser gewaschen.

Ausbeute: rotbraune Kristalle; 67% (122 mg, 0,63 mmol)

Die Darstellung des NBDMA ber den zweiten Reaktionsweg hat zweientscheidende Vorteile gegenber dem ersten Reaktionsweg. Die Oxidation desMNBDH verluft viel schneller als die nucleophile aromatische Substitution desNBDCl und die Bildung des Hydrolyseproduktes tritt nicht als Nebenreaktion auf.Deshalb ist die Darstellung ber den zweiten Reaktionsweg wesentlichunproblematischer als ber den ersten Reaktionsweg.

Charakterisierung:

1H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]: 8,45 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 6,08 (d, 1H, Hb, 3Jab=8,5 Hz), 3,24 (d, 3H, N-CH3)

EA berechnet fr: C7H6N4O3 C: 43,29%; H: 3,09%; N: 28,87%;gefunden: C: 42,83%; H: 2,87%; N: 28,72%

IR [cm-1]: 3315 (s), 3085 (w), 2970 (w), 1620 (s), 1600(s), 1530 (w), 1480 (m),1430 (w),1400 (w),1375 (w), 1350(w), 1320 (s), 1270 (s)

EI-MS [m/z]: 194 (M+, 100%), 164 (M+-NO, 5%), 148 (5%), 103 (9%), 91 (15%),52 (15%)

APCI(-)-MS [m/z]: 193 ([M-H]-)



Fluoreszenz (CH3CN): em [nm]: 529ex [nm]: 344, 468

4.3.3 4-N,N-(Dimethylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDDMA)

NO

N

NO2

N

aH

bH

CH3H3C

1

2

34

5

67

Analog zur Darstellung des NDBMA wird auch das NBDDMA aus NBDCl undDimethylaminhydrochlorid in Gegenwart eines basischen Puffers dargestellt, da dasDimethylamin bei Raumtemperatur leicht flchtig ist (Kp. 7 C).

Arbeitsvorschrift (1) fr die Synthese des 4-N,N-(Dimethylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolsIn einem 250mL-Rundkolben werden ca. 1 g (12,5 mmol) Dimethylaminhydrochloridin 100 mL eines 2%igen Natriumhydrogencarbonat-Puffers (pH 9-10) gelst. Zudieser Lsung tropft man schnell 500 mg (2,5 mmol) NBDCl gelst in 20 mLAcetonitril hinzu. Die Reaktionsmischung lt man 30 Stunden bei Raumtemperaturrhren. Das orangefarbene Derivat fllt aus der Mischung aus und wird ber einemBchnertrichter abgesaugt; anschlieend mit Wasser und wenig Acetonitrilgewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: orangfarbene Nadeln; 58% (302 mg, 1,45 mmol)

Ein alternativer Weg zur Darstellung des 4-N,N-(Dimethylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazols ist die Freisetzung des Dimethylamins als Nucleophil durch die Zugabevon verdnnter Natronlauge. Die sekundren Aminderivate haben im Gegensatz zu


den primren Aminderivaten die Eigenschaft, besser aus Reaktionslsungenauszukristallisieren, so da man sie mhelos vom in der Lsung befindlichenHydrolyseprodukt abtrennen kann.

Arbeitsvorschrift (2) fr die Synthese des 4-N,N-(Dimethylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolsIn einem 100mL-Rundkolben werden 1 g (12,5 mmol) Dimethylaminhydrochlorid in20 mL Wasser gelst. Zu dieser Lsung gibt man schnell 500 mg (2,5 mmol) NBDClgelst in 20 mL Acetonitril hinzu. Unter stndigem Rhren bei Raumtemperatur tropftman sehr langsam mit einer Pasteurpipette 15 mL einer 1 M Natriumhydroxid-Lsungzu dieser Mischung und lt noch etwa eine Stunde weiterrhren, bevor man denentstandenen orangen Niederschlag ber einem Bchnertrichter absaugt, mit wenigWasser und Acetonitril wscht und im Vakuumexsikkator trocknet.

Ausbeute: orange Nadeln; 60% (312 mg, 1, 5 mmol)

Charakterisierung:

1H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]: 8,53 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 6,18 (d, 1H, Hb, 3Jab=8,5 Hz), 3,23 (s, 6H, 2N-CH3,)


IR [cm-1]: 3450 (m), 3100 (w), 2920 (w), 1610 (s), 1560(s), 1540 (m), 1500 (m),1470 (m), 1430 (w), 1370 (w), 1320 (s), 1300 (s)

EI-MS [m/z]: 208 (M+, 100%), 162 (17%), 131 (48%), 117 (23%), 92 (12%),

APCI(-)-MS [m/z]: 208 ([M]-)



Fluoreszenz (CH3CN): em [nm]: 540ex [nm]: 359, 439, 510

4.3.4 4-N-(Ethylamino)-7- nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDEA)

NO

N

NO2

N

aH

bH

C2H5H

1

2

34

5

67

Auch das Ethylamin ist ein bei Raumtemperatur flchtiges Amin (Kp. 16,6 C),weshalb die Synthese auch hier indirekt aus dem Hydrochlorid in Gegenwart einesbasischen Puffers durchgefhrt wird.

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(Ethylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolsIn einem 250mL-Rundkolben werden ca. 1 g (12,5 mmol) Ethylaminhydrochlorid in100 mL eines 2%igen Natriumhydrogencarbonat-Puffers (pH 9-10) gelst. Zu dieserLsung tropft man schnell 500 mg (2,5 mmol) NBDCl gelst in 20 mL Acetonitril. DieReaktionsmischung lt man 36 Stunden bei Raumtemperatur rhren. Das brauneDerivat fllt aus der Mischung aus und wird ber einem Bchnertrichter abgesaugt,anschlieend mit Wasser und wenig Acetonitril gewaschen und im Exsikkatorgetrocknet.

Ausbeute: braune Kristalle; 53% (276 mg, 1,33 mmol)

Charakterisierung:

1H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]: 8,51 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 6,18 (d, 1H, Hb, 3Jab=8,5 Hz), 3,57 (q, 2H, N-CH2), 1,40 (t, 3H, CH3)



IR [cm-1]: 3270 (s), 3170 (w), 3080 (w), 2980 (w), 1610 (s), 1595(s), 1530 (m),1480 (m), 1450 (w),1405 (w),1360 (w), 1250 (s)

EI-MS [m/z]: 208 (M+, 100%), 163 (3%), 131 (5%), 117 (15%), 76 (15%),52 (2%)

APCI(-)-MS [m/z]: 207 ([M-H]-)



4.3.5 4-N,N-(Diethylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDDEA)

NO

N

NO2

N

aH

bH

C2H5H5C2

1

2

34

5

67

Auch das NBDDEA wurde indirekt durch die Freisetzung des Diethylamins inGegenwart eines basischen Puffers dargestellt, obwohl das Diethylamin ein beiRaumtemperatur flssiges Amin ist (Kp. 56,3 C). Die direkte Synthese aus demfreien Amin mit NBDCl fhrte zu groen Mengen des Hydrolyseproduktes alsVerunreinigung.


Arbeitsvorschrift (1) fr die Synthese des 4-N,N-(Diethylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolsIn einem 250mL-Rundkolben werden ca. 1,4 g (12,5 mmol) Diethylaminhydrochloridin 100 mL eines 2%igen Natriumhydrogencarbonat-Puffers (pH 9-10) gelst. Zudieser Lsung tropft man schnell 500 mg (2,5 mmol) NBDCl gelst in 20 mLAcetonitril hinzu. Die Reaktionsmischung lt man 24 Stunden bei Raumtemperaturrhren. Das orange-rote Derivat fllt aus der Mischung aus und wird ber einemBchnertrichter abgesaugt, anschlieend mit Wasser und wenig Acetonitrilgewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: orange-rote Kristalle; 67% (395 mg, 1,68 mmol)

Analog zur Arbeitsvorschrift (2) fr das NBDDMA lt sich auch das NBDDEAdarstellen. Als sekundres Aminderivat fllt das NBDDEA spontan aus derReaktionslsung aus.

Arbeitsvorschrift (2) fr die Synthese des 4-N,N-(Diethylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolsIn einem 100 mL-Rundkolben werden 1,4 g (12,5 mmol) Diethylaminhydrochlorid in20 mL Wasser gelst. Zu dieser Lsung gibt man schnell 500 mg (2,5 mmol) NBDClgelst in 20 mL Acetonitril hinzu. Unter stndigem Rhren bei Raumtemperatur tropftman sehr langsam mit einer Pasteurpipette 15 mL einer 1 M Natriumhydroxid-Lsungzu dieser Mischung und lt noch etwa eine Stunde weiterrhren, bevor man denentstandenen orange-roten Niederschlag ber einem Bchnertrichter absaugt, mitwenig Wasser und Acetonitril wscht und im Vakuumexsikkator trocknet.

Ausbeute: orange-rote Kristalle; 49% (289 mg, 1,23 mmol)

Charakterisierung:

1H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]: 8,43 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 6,13 (d, 1H, Hb, 3Jab=8,5 Hz), 3,97 (q, 4H, 2N-CH2), 1,41 (t, 6H, 2CH3)



IR [cm-1]: 3440 (m), 3120 (w), 2990 (w), 2940 (w), 1605 (s), 1560(s), 1530 (m),1490 (m), 1450 (m), 1390 (w), 1360 (w), 1340 (s), 1310 (s)

EI-MS [m/z]: 236 (M+, 93%), 221 (100%), 159 (18%), 145 (74%), 103 (10%), 64 (5%)

APCI(-)-MS [m/z]: 236 ([M]-)



4.3.6 4-N-(n-Propylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDnPA)

NO

N

NO2

N

aH

bH

C3H7H

1

2

34

5

67

Obwohl das n-Propylamin ein bei Raumtemperatur flssiges Amin ist (Kp. 48 C), istauch hier der indirekte Syntheseweg ber das Hydrochlorid gewhlt worden. Dieprimren Aminderivate zeigen sehr schlechte Kristallisationseigenschaften, fallenaber unter den gegebenen Reaktionsbedingungen aus und lassen sich ohneVerunreinigungen isolieren.


Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(n-Propylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolsIn einem 250mL-Rundkolben werden ca. 1,2 g (12,5 mmol) Propylaminhydrochloridin 100 mL eines 2%igen Natriumhydrogencarbonat-Puffers (pH 9-10) gelst. Zudieser Lsung tropft man schnell 500 mg (2,5 mmol) NBDCl gelst in 20 mLAcetonitril hinzu. Die Reaktionsmischung lt man 20 Stunden bei Raumtemperaturrhren. Das braune Derivat fllt aus der Mischung aus und wird auf einemBchnertrichter abgesaugt, anschlieend mit Wasser und wenig Acetonitrilgewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: braune Nadeln; 64% (355 mg, 1,6 mmol)

Charakterisierung:

1H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]: 8,50 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 6,19 (d, 1H, Hb, 3Jab=8,5 Hz), 3,47 (t, 2H, N-CH2), 1,82 (m, 2H, CH2),1,02 (t, 3H, CH3)

Wiederholte Elementaranalysen lieferten keine akzeptablen Kohlenstoff-,Wasserstoff- und Stickstoffwerte, obwohl die Kontrolle mittels HPLC sowie dieanderen angebenen Methoden keinen Hinweis auf vorhandene Verunreinigungenergaben.

IR [cm-1]: 3350 (s), 3310 (w), 3100 (w), 2960 (w), 1620 (s), 1590(s), 1525 (m),1450 (w),1405 (w),1370 (w), 1270 (s)

EI-MS [m/z]: 222 (M+, 100%), 193 (55%), 163 (2%), 145 (2%), 117 (26%), 76 (4%)

APCI(-)-MS [m/z]: 221 ([M-H]-)




4.3.7 4-N,N-(Di-n-Propylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDDnPA)

NO

N

NO2

N

aH

bH

C3H7H7C3

1

2

34

5

67

Die direkte Synthese aus NBDCl und Dipropylamin zum NBDDPA war nicht mglich,da das reine NBDDPA wegen der Verunreinigung mit dem Hydrolyseprodukt nichtaus der Reaktionslsung isoliert werden konnte. Im folgenden wurde zunchst dasHydrochlorid des Dipropylamins hergestellt und dann die schon bekannte Reaktiondurchgefhrt.

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N,N-(Di-n-Propylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolIn einem 250mL-Rundkolben werden 1,76 mL (1,3 g, 12,5 mmol) Dipropylamingegeben. Unter Eiskhlung gibt man ganz langsam 1 mL konzentrierte Salzsurehinzu und lt die Mischung ca. eine halbe Stunde rhren. Zu dieser Lsung gibtman zunchst 100 mL eines 2%igen Natriumhydrogencarbonat-Puffers (pH 9-10)und dann eine Lsung aus 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 20 mL Acetonitril. DieMischung lt man ca. 6 Stunden bei Raumtemperatur rhren, saugt dasausgefallene orangefarbene Derivat auf einem Bchnertrichter ab, wscht es mitwenig Wasser und Acetonitril und trocknet es im Vakuumexsikkator.

Ausbeute: orangefarbene Nadeln; 82% (541 mg, 2,05 mmol)


Charakterisierung:

1H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]: 8,42 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 6,10 (d, 1H, Hb, 3Jab=8,5 Hz), 3,74 (t, 4H, 2N-CH2), 1,83 (m, 4H, 2CH2),1,10 (t, 6H, CH3)


IR [cm-1]: 3440 (m), 3120 (w), 2990 (w), 2940 (w), 1610 (s), 1560(s), 1530 (m),1490 (m), 1450 (m), 1390 (w), 1360 (w), 1340 (s), 1310 (s)

EI-MS [m/z]: 264 (M+, 31%), 235 (100%), 193 (21%), 159 (15%), 117 (18%), 41 (7%)

APCI(-)-MS [m/z]: 264 ([M]-)



4.3.8 4-N-(n-Butylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDnBA) und4-N,N-(Di-n-Butylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDDnBA)

NO

N

NO2

N

aH

bH

C4H9H

1

2

34

5

67

NO

N

NO2

N

aH

bH

C4H9H9C4

1

2

34

5

67

Fr die meisten bei Raumtemperatur nichtflchtigen Amine ist es mglich, eineDerivatisierung schnell und einfach in einem Probenglschen ohne Anwesenheiteines Puffers durchzufhren. Je nach Reaktivitt des Amins und


Kristallisationsneigung des Derivates findet eine heftige Reaktion mit sofortigerKristallisation statt oder eine langsame Reaktion bei der das NBDamin erst nachlngerer Khlung ausfllt. Bei den NBD-Derivaten des n-Butylamins und des n-Dibutylamins finden sehr heftige Reaktionen ohne Kristallisation der Derivate statt.Selbst durch tagelange Khlung im Eisfach (-18 C) sind diese Derivate nicht zurKristallisation zu bringen, so da eine Isolierung und damit Charakterisierung nichtmglich ist. Auch der indirekte Weg ber die Hydrochloride des n-Butylamins unddes n-Dibutylamins fhrte nicht zum Ziel. Die Derivate lieen sich nicht isolieren. Einmglicher Grund fr dieses Verhalten knnte sein, da es fr die NBDamine miteiner Alkylkettenlnge von vier C-Atomen nicht mglich ist, ein Kristallgitteraufzubauen. Die Kontrolle der Reaktionslsung durch HPLC mit UV/vis- undfluoreszenspektroskopischer Detektion zeigte anhand der Retentionszeiten undspektroskopischen Eigenschaften der detektierten Verbindungen, da es sich um dieensprechenden Derivate handelte. Die durch LC-MS gewonnenen Massenspektrenkonnten dies besttigen.

4.3.9 4-N-(n-Pentylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDPeA)

NO

N

NO2

N

aH

bH

C5H11H

1

2

34

5

67

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(n-Pentylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolsIn einem 15mL-Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mLAcetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 580 L (436 mg, 5 mmol) Amylaminzur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen sofort. Die Mischung wird etwa4 Stunden auf dem Magnetrhrer gerhrt. Der Feststoff wird abfiltriert, mit wenigAcetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: orangebraune Kgelchen, 79% (494 mg, 1,98 mmol)


Charakterisierung:

1H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]: 8,47 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 6,19 (d, 1H, Hb, 3Jab=8,5 Hz), 3,73 (t, 2H, N-CH2), 1,79 (m, 6H, 3CH2),1,05 (t, 6H, CH3)


IR [cm-1]: 3250 (s), 3170 (w), 3080 (w), 2975 (w), 1610 (s), 1595(s), 1530 (m),1470 (m), 1450 (w),1410 (w),1360 (w), 1250 (s)

EI-MS [m/z]: 250 (M+, 100%), 163 (2%), 117 (21%),104 (31%), 76 (5%),

APCI(-)-MS [m/z]: 249 ([M-H]-)



4.3.10 4-N-(Benzylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDBzA)

1

2

34

5

67

NO

N

NO2

N

aH

bH

H CH2


Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(Benzylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolsIn einem 15mL-Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mLAcetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 546 L Benzylamin (536 mg, 5mmol) zur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen sofort. Man beobachteteine heftige Reaktion mit Wrmeentwicklung. Die Mischung wird etwa 2 Stunden aufdem Magnetrhrer gerhrt. Der Feststoff wird in etwa 1 mL 10%igerNatriumhydrogencarbonat-Lsung suspendiert, abfiltriert, mit wenig Acetonitrilgewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: rostbraune Kristalle, 74% (499 mg, 1,85 mmol)

Charakterisierung:

1H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]: 8,47 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 7,37-7,46 (m, 5H,Aryl-H), 6,20 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 4,69 (d, 2H,Aryl-CH2)


IR [cm-1]: 3260 (m), 3070 (w), 1620 (m), 1580 (s), 1530 (w), 1480 (s), 1450 (m),1420 (w),1400 (w), 1360(w), 1290 (w)

EI-MS [m/z]: 270 (M+, 27%), 236 (3%), 193 (3%), 167 (2%), 91 (100%)

APCI(-)-MS [m/z]: 269 ([M-H]-)

UV (CH3CN): max [nm]: 458(max)/[L.mol-1.cm-1]: 23400



4.3.11 4-N-(o-Methylbenzylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-2-MBzA)

1

2

34

5

67

NO

N

NO2

N

aH

bH

H CH2

CH3

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(o-Methylbenzylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolsIn einem 15mL-Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mLAcetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 1292 L (1262 mg, 10 mmol) 2-Methylbenzylamin zur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen sofort. Nachzweistndigem Rhren auf dem Magnetrhrer stellt man die Lsung fr 3 Tage insGefrierfach (-18 C). Der Feststoff wird abfiltriert, mit wenig Acetonitril gewaschenund im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: dunkelbraune Kristalle, 31% (220 mg, 0,78 mmol)

Charakterisierung:

1H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]: 8,46 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 7,24-7.30 (m, 4H,Aryl-H), 6,20 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 4,64 (d, 2H,Aryl-CH2), 2,37 (s, 3H, CH3)


Die Elementaranalyse lieferte keinen akzeptablen Stickstoff-Gehalt, obwohl dieKontrolle mittels HPLC sowie die anderen eingesezten Methoden keinen Hinweis aufvorhandene Verunreinigungen ergaben.


IR [cm-1]: 3470 (m), 3280 (m), 3070 (m), 2980 (m), 2880 (m), 1620 (s), 1590 (s),1520 (w), 1480 (m), 1445 (m),1400 (w), 1360 (w), 1290(s), 1230 (s)

EI-MS [m/z]: 284 (M+, 16%), 233 (2%), 207 (1%), 105 (100%), 77 (10%), 30 (2%)

APCI(-)-MS [m/z]: 283 ([M-H]-)



4.3.12 4-N-(m-Methylbenzylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-3-MBzA)

1

2

34

5

67

NO

N

NO2

N

aH

bH

H CH2

CH3

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(m-Methylbenzylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolsIn einem 15mL-Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mLAcetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 640 L (618 mg, 5 mmol) desAmins zur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen sofort, da eine heftigeReaktion stattfindet. Der Feststoff fllt sofort aus, wird auf einem Bchnertrichterabgesaugt, mit wenig Acetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: dunkelbraune Kristalle, 76% (539 mg, 1,9 mmol)


Charakterisierung:

1H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]: 8,43 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 7,20-7,28 (m, 4H,Aryl-H), 6,23 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 4,65 (d, 2H,CH2), 2,41 (s, 3H, CH3)


Die Elementaranalyse lieferte keinen akzeptablen Stickstoff-Gehalt, obwohl dieKontrolle mittels HPLC sowie der anderen eingesezten Methoden keinen Hinweis aufvorhandene Verunreinigungen ergaben.

IR [cm-1]: 3470 (w), 2990 (s), 2915 (s), 2700 (w), 2610 (w), 2025 (w), 1610 (m),1510 (w), 1490 (w), 1460 (m), 1400 (w),1390 (w), 1290 (w)

EI-MS [m/z]: 284 (M+, 19%), 207 (2%), 105 (100%), 77 (5%), 30 (3%)

APCI(-)-MS [m/z]: 283 ([M-H]-)




4.3.13 4-N-(p-Methylbenzylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-4-MBzA)

1

2

34

5

67

NO

N

NO2

N

aH

bH

H CH2

CH3

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(p-Methylbenzylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolsIn einem 15mL-Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mLAcetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 656 L 4-Methylbenzylamin (625mg, 5 mmol) zur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen sofort. Nachdemdie Mischung 24 Stunden auf dem Magnetrhrer gerhrt wurde, wird sie fr weitere24 Stunden tiefgefroren (-18 C). Der ausgefallene Feststoff wird in etwa 1 mL10%iger Natriumhydrogencarbonat-Lsung suspendiert, abfiltriert, mit wenigAcetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: dunkelbraune Kristalle, 28% (198 mg, 0,7mmol)

Charakterisierung:

1H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]: 8,47 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 7,22-7,28 (m, 4H,Aryl-H), 6,22 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 4,63 (d, 2H,CH2), 2,38 (s, 3H, CH3)



Die Elementaranalyse lieferte keinen akzeptablen Stickstoff-Gehalt, obwohl dieKontrolle mittels HPLC und der anderen eingesetzten Methoden keinen Hinweis aufvorhandene Verunreinigungen ergaben.

IR [cm-1]: 3365 (s), 3270 (m), 3070 (w), 2950 (w), 1620 (s), 1580 (s), 1530 (m),1490 (s), 1440 (w),1400 (m),1380 (w), 1360(s), 1290 (w)

EI-MS [m/z]: 284 (M+, 25%), 250 (2%), 207 (2%), 105 (100%), 79 (4%)

APCI(-)-MS [m/z]: 283 ([M-H]-)



4.3.14 4-N-(Phenylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-oxa-1,3-diazol (NBDAn)

NO

N

NO2

N

aH

bH

H

1

2

34

5

67


Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(Phenylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolsIn einem 15mL Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mLAcetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 456 L Anilin (466 mg, 5 mmol) zurNBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen. Der rote Feststoff fllt sofort aus.Nachdem das Derivat auf einem Bchnertrichter abgesaugt worden ist, wird es mitwenig Acetonitril gewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: rote Kristalle, 90% (576 mg, 2,25 mmol)

Charakterisierung:

1H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]: 8,48 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 7,36-7,55 (m, 5H,Aryl-H), 6,18 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz)


IR [cm-1]: 3285 (m), 1630 (w), 1595(m), 1565 (s), 1490 (s), 1445 (m),1405(m),1370 (w), 1350(m), 1310 (s)

EI-MS [m/z]: 256 (M+, 100%), 193 (31%), 180 (63%), 140 (9%), 77 (38%), 51 (20%)

APCI(-)-MS [m/z]: 255 ((M-H)-)



4.3.15 4-N-(Methy-N-phenylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBDNMAn)

NO

N

NO2

N

aH

bH

H3C

1

2

34

5

67

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(Methyl-N-phenylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolsIn einem 15mL-Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mLAcetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 1084 L N-Methylanilin (1072 mg,10 mmol) zur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen sofort. Die Mischungwird etwa 2 Stunden auf dem Magnetrhrer gerhrt, bevor man sie fr 24 Stundenins Tiefkhlfach stellt. Der Feststoff wird abfiltriert, mit wenig Acetonitril gewaschenund im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: dunkelrote Kristalle, 33% (223 mg, 0,83mmol)

Charakterisierung:

1H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]: 8,53 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 7,32-7,50 (m, 5H,Aryl-H), 6,18 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 3,33 (s, 3H,N-CH3)


IR [cm-1]: 3430 (w), 3100 (w), 2930 (w), 1610 (m), 1540(s), 1490 (m), 1450(w),1420 (w),1360 (w), 1320 (s), 1300 (s), 1240 (m)

EI-MS [m/z]: 270 (M+, 27%), 236 (3%), 193 (3%), 167 (2%), 91 (100%)


APCI(-)-MS [m/z]: 270 ([M]-)


4.3.16 4-N-(o-Ethylphenylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-2-EAn)

NO

N

NO2

N

aH

bH

H

H5C2

1

2

34

5

67

Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(o-Ethylphenylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolIn einem 15mL-Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mLAcetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 1243 L 2-Ethylanilin (1212 mg, 10mmol) zur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen sofort. Die Mischungwird etwa 2 Stunden auf dem Magnetrhrer gerhrt, bevor man sie fr 24 Stundenins Tiefkhlfach stellt. Der Feststoff wird abfiltriert, mit wenig Acetonitril gewaschenund im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: orangerote Kristalle, 37% (263 mg, 0,93 mmol)

Charakterisierung:

1H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]: 8,48 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 7,32-7,40 (m, 4H,Aryl-H), 6,18 (d, 1H, Hb, 3Jab= 8,5 Hz), 4,66 (q, 2H,CH2), 2,37 (t, 3H, CH3)


Die gefundenen Elementaranalysen weichen stark von den berechnetenElementaranalysen ab, obwohl eine Kontrolle mittels HPLC sowie die anderen zurKontrolle eingesetzten Methoden keinen Anhaltspunkt fr eventuelleVerunreinigungen ergaben.

IR [cm-1]: 3430 (w), 2970 (m), 2830 (s), 2590 (m), 1960 (w), 1620 (w), 1600(m),1560 (m), 1520 (m), 1490 (s),1450 (m),1380 (w), 1310(m)

EI-MS [m/z]: 284 (M+, 100%), 255 (51%), 179 (32%), 103 (7%), 77 (19%)

APCI(-)-MS [m/z]: 283 ([M-H]-)


4.3.17 4-N-(m-Ethylphenylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-3-EAn)

NO

N

NO2

N

aH

bH

H

C2H5

1

2

34

5

67


Arbeitsvorschrift fr die Synthese des 4-N-(m-Ethylphenylamino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolsIn einem 15mL-Probenglschen werden 500 mg (2,5 mmol) NBDCl in 1,5 mLAcetonitril gelst. Anschlieend gibt man schnell 621 L 3-Ethylanilin (606 mg, 5mmol) zur NBDCl-Lsung und schliet das Probenglschen sofort. Man beobachteteine heftige Reaktion. Die Mischung wird noch etwa 2 Stunden auf demMagnetrhrer gerhrt. Der ausgefallene Feststoff wird in etwa 1 mL 10%igerNatriumhydrogencarbonat-Lsung suspendiert, abfiltriert, mit wenig Acetonitrilgewaschen und im Exsikkator getrocknet.

Ausbeute: rote Kristalle, 79% (561 mg, 1,98 mmol)

Charakterisierung:

1H-NMR (DMSO-d6)/[ppm]: 8,46 (d, 1H, Ha, 3Jab= 8,5 Hz), 7,34-7,40 (m, 4H,Aryl-H), 6,19

Documents

Flüssigchromatographische Bestimmung aliphatischer und aromatischer Amine