Funktionelle und strukturelle FT-IR spektroskopische ... · Funktionelle und strukturelle FT-IR spektroskopische Untersuchungen an der Ubichinol Oxidase Cytochrom bo 3 von Escherichia

Funktionelle und strukturelle FT-IR spektroskopische

Untersuchungen an der Ubichinol Oxidase Cytochrom bo3 von

Escherichia coli

Dissertation zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt im

Lehrstuhl für Biophysik/

Projektgruppe Cytochrom Oxidasen

vorgelegt von:

Alexander Prutsch

aus Mannheim

Bochum

(2002)

Danksagung

Ganz besonderer Dank gilt meinem Betreuer Herrn PD Dr. Mathias Lübben für sein Interesse an

meiner Arbeit und seine ständige Diskussionsbereitschaft.

Herrn Prof. Dr. W. Hengstenberg danke ich für die bereitwillige Übernahme des Korreferats.

Bei Herrn Prof. Dr. Klaus Gerwert bedanke ich mich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes an

seinem Lehrstuhl.

Großer Dank gilt Herrn Dr. Benedikt Heßling für die Einweisung in die Methodik der FT-IR

Messung an Proteinen, seinen vielen guten Tipps und Anregungen, sowie für die Korrektur des

FT-IR-spektroskopischen Teils dieser Arbeit.

Weiterhin danke ich den Mitarbeitern der Feinmechanischen Werkstatt des Lehrstuhls für Bio-

physik, insbesondere Herrn H. Lehky, der mir mit seinen Lehrlingen bei der Verwirklichung

von Gerätschaften immer mit Rat und Tat zur Seite stand. Bei Herrn J. Rotzing von der Glasblä-

serei der Fakultät für Chemie möchte ich mich für die guten Lösungsvorschläge und die schnelle

Realisierung dieser Vorschläge bedanken.

Allen Mitarbeitern des Lehrstuhls danke ich für die gute und wissenschaftlich fruchtbare Zu-

sammenarbeit, sowie die sehr angenehme Arbeitsatmosphäre. Den technischen Mitarbeitern des

Lehrstuhls gilt ebenfalls mein Dank, ohne die eine Arbeit im Labor kaum möglich gewesen wä-

re. Bei Herrn Axel Martin möchte ich mich für seine Geduld und seine guten Ratschlägen bei

Fragen „rund um den Computer“ bedanken.

Ganz speziell möchte ich mich bei den Mitarbeitern der Projektgruppe „Cytochrom Oxidase“

bedanken, die einen großen Anteil am Gelingen dieser Arbeit hatten. Besonders sei Iris Schön-

haar erwähnt, die immer ein freundliches Wort übrig hatte und von deren technischen Erfahrun-

gen ich im Laboralltag viel profitieren konnte. Herrn Dipl. Biochem. Karsten Vogtt möchte ich

für seine Diskussionsbereitschaft und für die Übernahme der Korrektur dieser Arbeit danken.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Jürgen Kurzeck, der mich seit Studienbeginn an der RUB

freundschaftlich begleitete und mit mir viele Jahre zu Mittag die abwechslungsreiche und deli-

kate Mensakost genoß. Zudem hat er bei der Durchsicht dieser Arbeit viele hilfreiche Anreg-

ungen gegeben.

Meinem Vater Friedrich Prutsch danke ich für den Rückhalt und seine liebevolle Unterstützung,

die erst mein Studium und meine Dissertation ermöglicht haben.

Abkürzungen und Schreibweisen

Schreibweisen

In der Regel werden Deutsche Wörter im Text dieser Arbeit bevorzugt und Ausdrücke aus ande-

ren Sprachen, wie z.B. aus dem Englischen nur verwendet, wenn es sich um feststehende Fach-

begriffe handelt oder keine treffende Übersetzung möglich ist. Im Text sind diese Ausdrücke

durch Kursivschrift hervorgehoben. Der Text berücksichtigt weiterhin die Regeln der z-, k- und

c-Schreibweise, ohne diese Regeln zwangsläufig auf die aus dem Lateinischen und Englischen

übernommenen termini technici anzuwenden. Die „neuen Rechtschreibregeln“ werden als Or-

thografiegrundlage benutzt. Bei der Bezeichnung von (bio-)chemischen Substanzen wird meist

eine Abkürzung verwendet und organische Säuren werden meist in ihrer dissozierten Form ab-

gebildet und bezeichnet. Die im Periodensystem verwendeten Elementsymbole werden bei

Atomen und den Summenformeln von chemischen Verbindungen benutzt und sind hier nicht

aufgelistet.

Abkürzungen 1. Aminosäuren Im Text werden die Aminosäuren in der Regel mit ihrer Dreibuchstabenbezeichnung abgekürzt, in den Graphiken und bei Mutantenproteinen wird gewöhnlich ihre Einbuchstabenbezeichnung verwendet. Ala A Alanin Arg R Arginin Asn N Asparagin Asp D Aspartat Cys C Cystein Gln Q Glutamin Glu E Glutamat Gly G Glycin His H Histidin Ile I Isoleucin

Leu L Leucin Lys K Lysin Met M Methionin Phe F Phenylalanin Pro P Prolin Ser S Serin Thr T Threonin Trp W Tryptophan Tyr Y Tyrosin Val V Valin

2. Bezeichnungen der Spektren Absolutspektrum Extinktionsspektrum der Probe minus Pufferreferenz APR-Differenzspektrum Auto-photoreduktions-induziertes FT-IR Redox-Differenz-

spektrum von Cyt bo3 COFR-Absolutspektrum Absolutspektrum des Kohlenmonoxid gebundenen, voll-

ständig reduzierten Cyt bo3 CO-Differenzspektrum Differenzspektrum des reduzierten Kohlenmonoxid ge-

bundenen minus reduzierten Cyt bo3 CO-Rekombinationsspektrum Photolysespektrum des COFR- Komplexes des Cyt bo3

Abkürzungen und Schreibweisen ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Differenzspektrum Die aus dem reduzierten Absolutspektrum minus oxidier-ten Absolutspektrum von Cyt bo3 resultierende Differenz

Einkanalspektrum FT-IR Emissionsspektrum der Infrarotquelle, nach Licht-durchgang durch die Cyt bo3 IR-Probe

FT-IR Spektrum Fourier-transformiertes Spektrum im mittleren Infrarot 77 K-Differenzspektrum Reduziertes minus oxidiertes Cyt bo3 Differenzspektrum

bei 77 K PR-Differenzspektrum Mit caged electrons photoreduktions-induziertes FT-IR

Differenzspektrum von Cyt bo3 Redox-Differenzspektren Reduziertes minus oxidiertes Cyt bo3 Differenzspektrum

bei Raumtemperatur VIS-Spektrum Extinktionsspektrum im sichtbaren Spektralbereich 3. Sonstige Abkürzungen (alphabetisch geordnet) Å Ångström Abb. Abbildung A.d. Aqua dest ADP Adenosindiphosphat ALV δ-Aminolävulinat Amp. Ampicillin ATP Adenosintriphosphat BCA Bicinchoninsäure bp Basenpaare bzw. beziehungsweise °C Temperatur in Grad Celsius ca. zirka CO Kohlenmonoxid COFR CO gebundenes, vollständig

reduziertes Cyt bo3 COMV mixed-valence CO gebunde-

nes Cyt bo3 cm-1 Wellenzahl CoA Coenzym A C-Terminus Carboxy-Terminus Cyt Cytochrom ∆ Differenz 3d Dreidimensional d.h. das heißt DNA Desoxyribonukleinsäure DQ/DQH2 Durochinon/Durochinol E Energie oder Extinktion E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure FMN Flavinmononukleotid FT-IR Fourier-Transform Infrarot His-tag Oligohistidinmodifikation IR Infrarot K Temperatur in Kelvin kDa Kilodalton kJ Kilojoule

KPi K2HPO4 / KH2PO4 M Molar mA Milliamper mg Milligramm µg Mikrogramm mL Milliliter µL Mikroliter mM Millimolar ms Millisekunde N-Terminus Amino-Terminus nm Nanometer ν? Wellenzahl OD Optische Dichte PCR Polymerase chain reaction QL Low-affinity-quinol oxidation

site QH High-affinity-quinone bind-

ing site RSA Rinder Serum Albumin RT Raumtemperatur s. siehe SDS Natriumdodecylsulfat SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgel-

elektrophorese Tab. Tabelle TEMED N, N, N, N´-Tetramethyl-

ethylendiamin Tris Tris(hydroxymethylamino-

methan) ü.N. über Nacht UpM Umdrehungen pro Minute V Volt vgl. vergleiche v/v Volumen pro Volumen v/w Volumen pro Gewicht VIS sichtbarer Spektralbereich

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung Seite

1.1 Aerobe Atmungskette.................................................................................................... 1

1.2 Cytochrom Oxidasen..................................................................................................... 2 1.2.1 Reaktionsmechanismus 5 1.2.2 Häm-Kofaktoren 6

1.3 Cytochrom bo3 von Escherichia coli............................................................................. 8

1.4 VIS-Spektroskopie......................................................................................................... 10

1.5 Infrarotspektroskopie................................................................................................... 11 1.5.1 Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie 12 1.5.2 Reaktionsinduzierte Redox-FT-IR-Differenzspektroskopie 14 1.5.3 Allgemeine Hinweise zur FT-IR Spektroskopie an Cytochrom bo3 17

1.6 Zielsetzung...................................................................................................................... 19

2. Material und Methoden

2.1 Biologisches Material..................................................................................................... 20 2.1.1 Antikörper 20 2.1.2 Bakterienstämme 20 2.1.3 Plasmide 20 2.1.4 Oxidasen und Mutanten 21

2.2 Chemikalien................................................................................................................... 22

2.3 Geräte............................................................................................................................. 23

2.4 Computersoftware ......................................................................................................... 23

2.5 Nährmedien.................................................................................................................... 24

2.6 Arbeiten mit Bakterien................................................................................................. 24 2.6.1 Antibiotika 24 2.6.2 Stammkulturen 24

2.6.3 DNA-Transformation 24 2.6.3.1 Kompetente Zellen 24 2.6.3.2 Elektroporation 25

2.6.4 Bakterienanzucht 25 2.6.4.1 Nährboden 25 2.6.4.2 Flüssigkultur 25 2.6.4.3 Aerobe Bakterienfermentation des E. coli Stamms BL21 ∆cyo recA- 25 2.6.4.4 Aerobe Bakterienfermentation des E. coli Stamms S730 26

2.7 Präparation von Proteinen........................................................................................... 26 2.7.1 Bakterienfermentation 27 2.7.2 Präparation der cytoplasmatischen Membranen 27 2.7.3 Solubilisierung der Oxidase 27 2.7.4 Immobilisierte Metallaffinitätschromatographie 28 2.7.5 Ultrafiltration der Oxidase 28

Inhaltsverzeichnis ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Seite

2.8 Proteinchemische Methoden......................................................................................... 28 2.8.1 Proteinfällung mit Trichloressigsäure 28 2.8.2 Proteinbestimmung mit Bicinchoninsäure 29 2.8.3 Proteinbestimmung mit SDS-Lowry 29 2.8.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 29

2.8.5 Elektrotransfer und Nachweis von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen 31 2.8.5.1 Nachweis der Oligohistidinmodifikation 31 2.8.5.2 Immunoblot 31

2.8.6 Durochinol-Oxidase-Aktivität 32

2.8.7 Häm-Analyse 32 2.8.7.1 Häm-Extraktion 32 2.8.7.2 HPLC-Analyse 33

2.9 VIS-Spektroskopie......................................................................................................... 33

2.9.1 Absolutspektren 33 2.9.2 Kohlenmonoxid-Rekombinationsspektren 34 2.9.3 Reduziertes minus oxidiertes Cyt bo3 Raumtemperatur (RT)-Differenzspektrum 34 2.9.4 Reduziertes minus oxidiertes Cyt bo3 Tieftemperatur-Differenzspektrum 35

2.10 FT-IR Spektroskopie 35 2.10.1 Probenpräparation 36 2.10.2 Messparameter 37

2.10.3 Probenmessung 38 2.10.3.1 Vorarbeiten 38 2.10.3.2 Einkanalspektren 39 2.10.3.3 Differenzspektren 40 2.10.3.4 Datenauswertung 40

3. Ergebnisse

3.1 Erstellung eines C-terminal von Untereinheit II nicht prozessierten Wildtyps von Cyt bo3..................................................................................................... 41 3.1.1 C-terminale Proteolyse 41

3.1.2 Fermentation, Proteinreinigung und biochemische Charakterisierung 44 3.1.2.1 Fermentation und Reinigung 44 3.1.2.2 VIS-spektroskopische Charakterisierung und Häm-Analytik 47 3.1.2.3 Aktivitäten 55

3.1.3 Anwendungsbeispiele 56

3.2 Biochemische und VIS-spektroskopische Charakterisierung von Cyt bo3 und dessen Mutanten............................................................................................................ 58 3.2.1 Absolutspektren 58 3.2.2 Raumtemperatur-Differenzspektren 61 3.2.3 Kohlenmonoxid-Rekombinationsspektren 64 3.2.4 Aktivitäten 66

Inhaltsverzeichnis ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Seite

3.3 FT-IR Probenpräparation und der Lösungsmittelaustausch von H2O zu D2O....... 67 3.3.1 Gasaustauschzelle 67 3.3.2 H2O/D2O-Austausch 69 3.3.3 Anwendungsbeispiele 73

3.4 Auto-photoreduktions-induzierte FT-IR Differenz-Spektroskopie am Cyt bo3....................................................................................................................... 75 3.4.1 Vorbedingungen zur Reproduzierbarkeit der auto-photoreduktions-induzierten FT-IR Redox-Differenzspektren 76 3.4.2 Spektrale Änderungen des Wildtyps in Abhängigkeit vom pH-Wert 81 3.4.3 Carbonylschwingungen der Hämpropionate 86 3.4.4 Auto-photoreduktions-induzierte FT-IR Redox-Differenzspektren von ortsspezifischen Cyt bo3-Mutanten 95

4. Diskussion

4.1 Erstellung eines C-terminal von Untereinheit II nicht prozessierten Wildtyps von Cyt bo3..................................................................................................... 99 4.1.1 Motivation zur Erstellung eines neuen, mit verbesserten Reinigungs- eigenschaften versehenen Cyt bo3 Wildtyps 99

4.1.2 Untereinheit II der Ubichinol Oxidase Cyt bo3 101 4.1.3 Biochemische und VIS-spektroskopische Charakterisierung des pIN-Wildtyps 106

4.2 IR-Probenerstellung mit der Gasaustauschzelle......................................................... 108 4.2.1 Redox-induzierter konformativer Wechsel des Glutamat-286 von Cyt bo3 in Abhängigkeit vom H2O/D2O-Lösungsmittelaustausch 108 4.2.2 Der konformative Wechsel der Seitenkette des Glutamat-286 von Cyt bo3 ist an die Reduktion des Häm B gekoppelt 111

4.3 Auto-photoreduktions-induzierte FT-IR Differenz-Spektroskopie an Cyt bo3........................................................................................................................ 113 4.3.1 Allgemeine Hinweise zur auto-photoreduktions-induzierten FT-IR Redox- Differenzspektroskopie 113 4.3.2 Spektrale Änderungen von ortsspezifischen Cyt bo3 Mutanten 115

4.3.3 Carbonylschwingungen der Hämpropionsäuren des Cyt bo3 117 4.3.3.1 Carbonyl- und Carboxylatschwingungen des low-spin Häms 123 4.3.3.2 Carbonyl- und Carboxylatschwingungen des high-spin Häms 125 4.3.3.3 Modell der Protonenleitung an den Hämpropionaten 128

5. Zusammenfassung........................................................................................................ 131

6. Literaturverzeichnis.....................................................................................................134

1

1. Einleitung Alle Lebewesen sind auf Energie zur Erhaltung ihrer Lebensfunktionen angewiesen. Nach ihrer

Ernährungsweise können Organismen in autotrophe und heterotrophe Lebensformen eingeteilt

werden. Zur Energieerzeugung tragen u.a. drei Hauptprozesse bei: Die Glykolyse, die Atmung

und die Photosynthese.

Der Prozess der Photosynthese wandelt Sonnenlicht in chemische Energie um. Bei Pflanzen

und Cyanobakterien fällt dabei molekularer Sauerstoff als „Abfallprodukt“ an.

Die Glykolyse wird in fast allen biologischen Systemen beschritten. Sie ist eine Folge von

chemischen Reaktionen, in denen Kohlenhydrate zu Pyruvat oxidiert werden unter gleichzeitiger

Bildung von ATP und Reduktionsäquivalenten. Sie findet im Cytoplasma von Pro- und Eukary-

onten, sowohl unter anaeroben, als auch aeroben Bedingungen statt.

Unter aeroben Bedingungen schließt sich an die Glykolyse der Citratzyklus in der Matrix der

Mitochondrien bzw. dem Cytoplasma der aeroben Prokaryonten an. Die dabei freigesetzten Re-

duktionsäquivalente werden in der Atmungskette verbraucht. Die übertragenen Elektronen wer-

den letztlich, unter Bildung von Wasser, auf molekularen Sauerstoff transferiert.

1.1 Aerobe Atmungskette Die Hauptfunktion der aeroben Atmungskette ist die Erzeugung eines elektrochemischen Proto-

nengradienten. Dieser Gradient kann nach der chemiosmotischen Theorie von Mitchell zur

Energiegewinnung der Zelle genutzt werden [1]. Er treibt z.B. die ATP Synthese aus ADP und

Phosphat an oder kann direkt für Transportprozesse oder die Bewegung der Flagellen bei Bakte-

rien verwendet werden.

In der Atmungskette werden die Elektronen, die ursprüglich von z.B. Kohlenhydraten oder

Fettsäuren stammen über eine Elektronentransferkette auf Sauerstoff übertragen. Der molekula-

re Sauerstoff wird dabei zu Wasser reduziert. Die daran beteiligten Multienzymkomplexe sind

bei Eukaryonten in der inneren Mitochondrienmembran, bei Prokaryonten in der Cytoplasma-

membran lokalisiert. Die Protonen werden von den transmembranen Komplexen von der Cyto-

plasma- bzw. Matrixseite der Membran auf die gegenüberliegende Seite transloziert, die u.a. bei

der Synthese von ATP wieder zurückfließen. In Abb. 1.1.1 ist die Cytochrom c (Cyt c)-

abhängige oxidative Phosphorylierung von Pro- und Eukaryonten gezeigt. Die Oxidation der

Substrate, z.B. NADH + H+, ist an die Phosphorylierung des ADP gekoppelt. Cyt c überträgt

Elektronen auf die danach benannten Cytochrom c Oxidasen (Cyt c Oxidasen). Cytochrom Oxi-

dasen stellen die terminalen Enzymen der Atmungskette dar.

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2

Abb. 1.1.1: Schematisches Modell der an der oxidativen Phosphorylierung beteiligten Enzymkomplexe. Die membrandurchspannenden Enzyme der Atmungskette (blau), wie sie z.B. in Mitochondrien der Eukaryonten oder beim Cyt c abhängigen Zweig der Atmungskette bei Prokaryonten vorkommen, erzeugen einen elektrochemischen Protonengradienten über der Membran. Dieser kann die ATP-Synthese vermittelt durch die FO/F1-ATP-Synthase (violett) antreiben. Zeichenerklärung: QH2 = Chinolpool. Hier soll die bakterielle Atmungskette von Escherichia coli (E. coli) etwas genauer betrachtet

werden. Diesem Bakterium stehen verschiedene Dehydrogenasen (z.B. NADH Dehydrogenase,

Succinat-Dehydrogenase) zur Verfügung (zur Übersicht s. z.B. [2; 3]), die organische Substrate

oxidieren und Ubichinon-8 reduzieren. E. coli besitzt keinen Cyt c abhängigen Zweig der At-

mungskette, folglich auch keinen b/c1 Komplex [4]. Ubichinol-8 wird direkt von den Ubichinol

Oxidasen Cytochrom bo3 (Cyt bo3) oder Cytochrom bd (Cyt bd) oxidiert. Die dabei freigesetz-

ten Protonen werden ans Periplasma abgegeben und die zwei Elektronen an die Ubichinol Oxi-

dasen transferiert. Im katalytischen Zentrum der Oxidasen, dem sogenannten binuklearen Zent-

rum, wird molekularer Sauerstoff gebunden. Dieser wird unter Verbrauch von vier Elektronen

und 4 Protonen zu Wasser reduziert (skalare H+; H+s) [5; 6]. Während dieser Reaktion werden

Protonen über die Membran transloziert (vektorielle H+; H+v).

1.2 Cytochrom Oxidasen Für 90% der gesamten biologischen Sauerstoffreduktion und für fast die Hälfte der in der zellu-

lären Atmung umgesetzten Redoxenergie sind Oxidasen vom Häm-Kupfer-Typ verantwortlich

[7; 5]. Häm-Kupfer-Oxidasen bilden eine genetische Superfamilie [8-10], die in zwei substrat-

spezifische Gruppen unterschieden wird, den Cyt c- und den Chinoloxidasen (Abb. 1.2.1). Sie

weisen vornehmlich in Untereinheit I einen hohen Grad an Aminosäure-Sequenzidentität zuein-

ander auf (zur Übersicht s. z.B. [11]). Definiert ist die Superfamilie durch den Besitz eines

sechsfach koordinierten low-spin Häms und das binukleare Zentrum, das aus einem fünffach

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3

koordinierten high-spin Häm und einem Kupfer Ion, CuB besteht. Das low-spin Häm stellt den

intermediären Elektronendonor zum binuklearen Zentrum dar, an dem die Sauerstoffanbindung

und -reduktion stattfindet. Generell scheinen alle Mitglieder dieser Superfamilie Protonen über

die Membran zu pumpen [5; 12; 13]. Die Anzahl der am Aufbau des Multienzymkomplexes

beteiligten Untereinheiten variiert bei verschiedenen Organismen von drei bei Rhodobacter

sphaeroides [14], bis dreizehn bei der mitochondriellen Cyt c Oxidase aus Rinderherzen [15].

Alle Häm-Kupfer Oxidasen bestehen mindestens aus drei Untereinheiten, wobei für die Sub-

stratbindung, den Elektronentransfer, die Sauerstoffreduktion und die translozierten Protonen

nur Untereinheit I und II essentiell wichtig zu sein scheinen [16].

Abb. 1.2.1: Schematische Modelle der Topologien bei Ubichinol Oxidasen (links) und Cyt c Oxidasen (rechts) von Prokaryonten. Die Elektronen der Donorsubstrate werden über redoxaktive Zentren (hellblau) in das binukleare Zentrum (grün) geleitet. Die bei den Redoxreaktionen verbrauchten Protonen (H+

s) bzw. über die Membran translo-zierten Protonen (H+

v) werden durch Kanäle (dunkelbau) transportiert. Zeichenerklärung: H+s = skalare Protonen;

H+v = vektorielle Protonen; QH2 = Chinolpool; Q = Chinonpool; UE = Untereinheit. Die Abb. wurde nach M. Lüb-

ben modifiziert. Die Nomenklatur der Oxidasen richtet sich nach den im Apoprotein eingebauten Häm-

Kofaktoren (z. B. Häm A, B oder O). Zuerst wird das low-spin Häm genannt, dann das high-

spin Häm, dem der Index „3“ hinzugefügt wird (z. B. Cyt aa3 oder Cyt bo3). An der Substrat-

bindung (Chinol oder Cyt c) ist Untereinheit II beteiligt. Diese Untereinheit besteht aus einer

N-terminalen transmembranen Domäne, die aus ein bis zwei α-Helices besteht und einer C-ter-

minalen zur periplasmatischen Seite hin orientierten, globulären Domäne [8]. In dieser Domäne

befindet sich in Cyt c Oxidasen ein weiteres redoxaktives Zentrum (CuA), das aus zwei Cu-

Atomen besteht. Es stellt den primären Akzeptor für das Elektron des Cyt c dar [17]. Bei der

Ubichinol Oxidase Cyt bo3 fehlt dieses redoxaktive Zentrum und es werden stattdessen bis zu

zwei Chinolbindestellen in Untereinheit II postuliert. Es handelt sich dabei um die sogenannte

low-affinity quinol oxidation site (QL) und die high affinity quinone binding site (QH), die ver-

mutlich am Elektronentransport beteiligt sind [18-21]. In anderen Untersuchungen wird für das

Cyt bo3 die Ubichinonbindestelle alternativ in Untereinheit I postuliert [22].

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4

Seit der 3d-Röntgenkristallstruktur-Aufklärung der Cyt c Oxidasen aus Paracoccus denitrifi-

cans [23; 24] und der mitochondrialen Rinderherz-Oxidase [15] ist das Wissen um die moleku-

laren Vorgänge innerhalb der Oxidase-Komplexe stark angestiegen. Die bovine Oxidasestruktur

konnte in neueren Arbeiten mit 2,3 Å im oxidierten- und mit 2,35 Å im reduzierten Zustand

aufgelöst werden [25]. Eine im oxidierten Zustand vorliegende Cyt bo3-Struktur mit 3,5 Å Auf-

lösung ist seit Ende 2000 vorhanden [22]. Untereinheit I aus Cyt bo3 weist 40% Sequenzidenti-

tät mit der Cyt c Oxidase aus Rinderherzmitochondrien auf [26]. Somit können die 3d-

Strukturen dieser Cyt c Oxidase auch als Grundlage zum Aufbau eines Strukturmodells des Cyt

bo3 herangezogen werden [5; 9].

In Anlehnung an die 3d-Strukturen von der Rinderherz Oxidase und der P. denitrificans Oxi-

dase wurden zwei Protonenkanäle postuliert. Über diese gelangen einerseits die skalaren Proto-

nen zum binuklearen Zentrum zur Bildung von Wasser und andererseits werden die vektoriellen

Protonen über die Membran transloziert. Die Kanäle werden nach einem hochkonserviertem

Lysin- bzw. Aspartatrest als K- und D-Kanal bezeichnet. Man nimmt an, dass die Protonen über

ein Netzwerk (proton wire) [27] von protonierbaren Aminosäureresten und/oder fest gebunde-

nen Wassermolekülen transportiert werden [28; 29].

Abb. 1.2.2: Anordnung vom low-spin Häm B, dem binuklearem Reaktionszentrum und Aminosäuren des D- und K-Kanals in der Membran. Die Darstellung wurde ausgehend von der Röntgenkristallstrukur des oxidierten Cyt bo3 erstellt. Die Abb. wurde nach M. Lübben modifiziert. Abb. 1.2.2 zeigt die auf der Kristallstruktur von Cyt bo3 basierenden wesentlichen funktiona-

len Elemente der katalytischen Untereinheit I. Am Protonentransfer im K-Kanal scheint außer-

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5

dem Glu-89 aus Untereinheit II beteiligt zu sein [30]: Das high- und low-spin Häm befinden sich

im membrandurchspannenden Teil von Untereinheit I. Die Elektronen gelangen vermutlich vom

„schwach“ gebundenen Chinol über das „fest“ gebundene Chinon der Untereinheit II (beide

nicht dargestellt) zum low-spin Häm [21]. Dieses leitet sie zum binuklearen Zentrum weiter.

Dort wird der gebundene molekulare Sauerstoff aktiviert und über eine Reihe von Zwischenzu-

ständen zu Wasser reduziert (Abb. 1.2.3).

Die Protonen gelangen von der cytoplasmatischen Seite über die Kanäle zum binuklearen

Zentrum [31; 32]. Eine Verbindung vom binuklearen Zentrum zur gegenüberliegenden Seite der

Membran in Form eines „starren“ Kanals aus definierten Aminosäureresten konnte bei Cyt c

Oxidasen nicht nachgewiesen werden [28]. Man geht davon aus, dass vom binuklearen Zentrum

ein ausgedehntes Netz von Wasserstoffbrücken zum Periplasma führt.

1.2.1 Reaktionsmechanismus

Abb. 1.2.3 zeigt ein vereinfachtes Schema des Reaktionszyklus am Beispiel von Cyt c Oxidasen.

Wurde zunächst angenommen, daß die vektoriellen Protonen über den D-, die skalaren Protonen

dagegen über den K-Kanal transloziert werden [23], geht man nunmehr davon aus, dass die Ka-

näle zu unterschiedlichen Phasen des Reaktionszyklus aktiv sind [28]: Molekularer Sauerstoff

bindet an das voll reduzierte Enzym R, wodurch das Intermediat A entsteht. Die Übertragung

von Elektronen vom low- und high-spin Häm auf den Sauerstoff führt zur Aktivierung des Sau-

erstoffs und Bildung des Peroxy-Intermediats P. An den bisherigen Reaktionen ist kein Trans-

port von Protonen gekoppelt. Erst mit der Spaltung der Sauerstoffbindung geht der Transport

eines vektoriellen Protons und die Aufnahme eines skalaren Protons über den D-Kanal einher.

Es entsteht das Ferryl-Intermediat F, welches durch Umsatz je eines weiteren skalaren und vek-

toriellen Protons zum vollständig oxidierten Komplex O reagiert. Durch Aufnahme von vier

Elektronen und zwei Protonen durch den K-Kanal kann der oxidierte Komplex wieder in den

vollständig reduzierten Zustand überführt werden. Bei diesem Mechanismus der Sauerstoffre-

duktion sind Elektronentransfer und skalarer und vektorieller Protonentransport aneinander ge-

koppelt [6; 33; 34].

Die Formulierung des Reaktionsschemas basiert im Wesentlichen auf Daten, die an der Cyt c-

Oxidase aus Rinderherzmitochondrien gewonnen wurden [28]. Für das Cyt bo3 wurde ein ähn-

licher Mechanismus aufgestellt [35], der sich nur im Detail von dem hier dargestellten unter-

scheidet.

Während des Zyklus werden vier Protonen und vier Elektronen auf molekularen Sauerstoff

übertragen und zwei Protonen über die Membran gepumpt. Netto werden also unter Oxidation

von vier Molekülen Cyt c sechs Protonen aus dem Cytoplasma bzw. der Mitochondrienmatrix

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

6

entfernt, von denen zwei in den periplasmatischen Raum bzw. in das Lumen der Mitochondrien

gepumpt werden.

Abb. 1.2.3: Vereinfachter Mechanismus der Sauerstoffreduktion bei Cyt c Oxidasen. Zeichenerklärung: „R“ = vollständig reduzierte Form; „A“ = ferro-oxy Form; „“P“ = peroxy Form; „F“ = ferryl- und „O“ = vollständig oxi-dierte Form; „H+

s“ = skalare Protonen; „H+v“ = vektorielle Protonen. Die Abbildung wurde nach Brzezinski &

Ädelroth, 1998 erstellt [28].

1.2.2 Häm-Kofaktoren

Cytochrome sind elektronenübertragende Proteine, die Häme als prosthetische Gruppen oder

Kofaktoren enthalten. Im Cyt c liegt das Häm kovalent am Apoprotein gebunden vor. In den

Cytochrom Oxidasen sind die Häme hingegen nicht kovalent gebunden. In Abb. 1.2.4 sind die

Strukturformeln einiger Häme gezeigt.

Ein Häm setzt sich aus einem Tetrapyrrolsystem und einem Eisenatom zusammen (Abb.

1.2.4). In biologischen Systemen leiten sich alle Häme vom Eisen-Protoporphyrin IX ab. Das

Zentralatom ist durch vier Stickstoffe des Porphyrins gebunden. Es kann darüber hinaus zwei

weitere Bindungen eingehen (fünfte und sechste Koordinationstelle), die beidseitig senkrecht

zur Hämebene stehen. Je nachdem, ob diese Koordinationsstellen besetzt sind, ergeben sich in

der Electron-Spin-Resonance- (ESR) Spektroskopie unterschiedliche ESR-Signale, wodurch die

Bezeichnung der Häme als low-spin bzw. high-spin Häm herrührt. Das low-spin Häm in Cyto-

chrom Oxidasen liegt sechsfach koordiniert mit zwei Histidinen als axialen Liganden vor. Das

high-spin Häm ist an der fünften Koordinationsstelle mit einem Histidin ligandiert, die sechste,

freie Koordinationsstelle stellt u.a. den Bindungsort für molekularen Sauerstoff und andere ex-

terne Liganden, wie z.B. Cyanid und Kohlenmonoxid dar. Die Eisenatome der Häme können in

der Oxidationsstufe +2 (Ferroform) und +3 (Ferriform) vorliegen. In der Spektroskopie im

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

7

sichtbaren Bereich (VIS-Spektroskopie) lässt sich dieser Redoxwechsel der beiden Häme bei

Cytochrom Oxidasen gut voneinander unterscheiden (1.4).

Abb. 1.2.4: Strukturformeln von Hämen. Oben ist die Struktur des Eisen-Tetrapyrrolsystems unter Angabe der Ringbezeichnung der Heterocyclen (A, B, C und D) wiedergegeben. Zusätzlich sind in rot einige Atome markiert, um einige wichtige IR-aktive Schwingungen der Häme hervorzuheben. Die Propionsäuren können im Protein so-wohl protoniert als auch deprotoniert vorliegen. Unten sind die Modifikationen für die Reste R1 und R2 wiederge-geben. Je nach Modifikation ergibt sich dann die Bezeichnung des vorliegenden Häm-Typs. Das Häm O des Cyt bo3 unterscheidet sich hierbei durch die Hydroxyethylfarnesylgruppe vom

Häm B. Diese Modifikation wird durch eine Protohäm IX-Farnesyltransferase (CyoE) kataly-

siert (Abb. 1.2.5) [36].

Abb. 1.2.5: Hämbiosyntheseweg in E. coli. Die beteiligten Gene und deren Genprodukte sind links bzw. rechts vom Biosytheseweg angegeben. Die Hämpropionate sind in rot, die Modifikationen in denen sich Häm B und Häm O unterscheiden sind in blau dargestellt. Sonstige Erklärungen s. Text. Die Abb. wurde nach Mogi et al., 1994 [36] und Verderber et al., 1997 modifiziert [37].

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

8

In Abb. 1.2.5 ist der Häm-Biosyntheseweg von E. coli für Häm B und Häm O dargestellt. Die

wichtige Vorstufe δ-Aminolävulinat (ALV) kann auf zwei unterschiedlichen Wegen syntheti-

siert werden. In vielen Eu- und Prokaryonten, z.B. bei Mammalia und Rhodospirillacaen, wird

ALV durch Kondensation von Glycin und Succinyl-CoA erhalten (grauer Kasten in Abb. 1.2.5).

Diese einzelne enzymatische Reaktion (C4-Weg) wird von der ALV-Synthase katalysiert [38].

Bei E. coli wird ein alternativer Biosyntheseweg beschritten. ALV wird hierbei in drei Reak-

tionsschritten ausgehend vom fünf Kohlenstoffatom-Gerüst des Glutamats (C5-Weg) erhalten

[39; 40]. Bei Inaktivierung des hemA-Gens (die GTR-Reduktase wird von hemA und hemB ko-

diert) kann kein ALV in E. coli synthetisiert werden. Diese Auxotrophie lässt sich durch externe

Zugabe von ALV zum Fermentationsmedium kompensieren (roter Kasten in Abb. 1.2.5). Da

ALV käuflich auch in der [1-13C]-markierten Form erhältlich ist, ist eine spezifische Isotopen-

markierung der C1-Atome der Hämpropionate möglich. Diese Markierung stellt eine wichtige

IR-spektroskopische Identifikationsmöglichkeit von Carbonyl- und Carboxylatschwingungen

der Hämpropionate dar (1.5.3).

1.3 Cytochrom bo3 von Escherichia coli E. coli besitzt mindestens zwei alternative Ubichinol Oxidasen Cyt bo3 und Cyt bd. Sie oxidie-

ren und reduzieren die gleichen Substrate, unterscheiden sich jedoch grundlegend in ihrem Auf-

bau.

Cyt bd ist ein Heterodimer [4; 41], dessen Untereinheiten I und II vom cyd-Operon kodiert

werden [42]. Dieses Enzym wird bei niedrigen Sauerstoffpartialdrücken von E. coli exprimiert

[43] und stellt keine Protonenpumpe dar [6]. Es weist ein low-spin Häm B558 und ein binuklea-

res Zentrum auf, das aus zwei Hämen, Häm B595 und Häm D, besteht [44]. Die Untereinheiten

des Cyt bd weisen weder Sequenzhomologien zu Cyt bo3 noch zu anderen Häm-Kupfer Oxid-

asen auf. Somit gehört es nicht in die Superfamilie der Häm-Kupfer Oxidasen und soll in dieser

Arbeit nicht weiter beschrieben werden. Eine dritte Chinoloxidase, die sogenannte Ubichinol

Oxidase III (Cyx) die von appBC- (cyxAB) kodiert werden könnte, kann aus der E. coli Daten-

bank (EcoMap7 und EcoSeq7, ncbi.nlm.nih.gov/repository/Eco/EcoMap7) entnommen werden.

Sie soll hier ebenfalls nicht weiter vorgestellt werden.

Cyt bo3 hingegen gehört zur Superfamilie der Häm-Kupfer-Oxidasen [9; 12]. Das cyo-Operon

dieser Ubichinol Oxidase weist fünf offene Leserahmen, cyoABCDE, auf [26]. Die ersten vier

kodieren für die Untereinheiten II, I, III und IV [45], der fünfte für die Protohäm IX-Farnesyl-

transferase (Häm O Synthase) [46-48]. Die Expression dominiert bei hohen Sauerstoffpartial-

drücken [4; 43]. Die vier Untereinheiten bestehen aus ca. 1250 Aminosäuren, weisen ein Mole-

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

9

kulargewicht von ca. 142 kDa auf [49] und besitzen alle transmembrane α-Helices [50]. Dabei

werden Untereinheit I fünfzehn, Untereinheit II zwei, Untereinheit III fünf und Untereinheit IV

drei membrandurchspannende α-Helices zugeschrieben. Das Enzym ist durch KCN [51] und

andere Inhibitoren hemmbar (zur Übersicht s. [52]). Cyt bo3 katalysiert die zwei Elektronen

Oxidation des Ubichinol-8 und die vier Elektronen Reduktion des molekularen Sauerstoffs zu

Wasser [4]. Diese Redox-Reaktionen sind an der Erzeugung eines elektrochemischen Protonen-

gradienten über der cytoplasmatischen Membran beteiligt, einerseits durch die skalare protolyti-

sche Reaktion und andererseits durch den redoxgekoppelten Protonenpump Mechanismus [53;

54].

In Untereinheit I ist das low-spin Häm B, das high-spin Häm O und das Kupfer Atom (CuB)

lokalisiert (Abb. 1.2.2). An der Komplexbildung der drei Metallatome sind ein oder mehrere

Histidine beteiligt [55-57]. Substitution eines dieser Metalliganden führt zu inaktiven, jedoch

meist in der Membran assemblierten Enzymen. Häm O und CuB bilden das binukleare Reakti-

onszentrum, den Ort der Sauerstoffaktivierung und -reduktion [58]. Häm B ist am Elektronen-

transfer in das Reaktionszentrum beteiligt. Am Elektronentransfer ist vermutlich auch ein fest-

gebundenes Ubichinon-8 in QH beteiligt, das in unmittelbarer Nähe zu Häm B liegt [19; 20].

Dieses „fest“-gebundene Chinon geht jedoch bei Detergenzsolubilisierung mit Triton-X 100

[59] bzw. n-Octyl-β-D-Glucosid [22] verloren. In Abramson et al., 2000 [22] wird aus der Elek-

tronendichtekarte abgeleitet, dass für dieses Chinon an der postulierten Bindestelle kein Platz

vorhanden ist. Stattdessen wird eine Chinonbindestelle in Untereinheit I postuliert. Hierbei ist

jedoch anzumerken, dass die zur Strukturaufklärung benutzten Cyt bo3-Kristalle aufgrund der

Kristallisationsbedingungen mit n-Octyl-β-D-Glucosid kein festgebundenes Chinon aufweisen.

Untereinheit II weist neben den zwei N-terminal gelegenen, durch eine kurze cytoplasmatische

Schleife verbundenen transmembraneren Helices eine große, hydrophile, periplasmatische

C-terminale Domäne auf [50]. Es ist kein CuA vorhanden und Cyt c kann nicht gebunden wer-

den. Stattdessen bindet und oxidiert Untereinheit II das Substrat Ubichinol-8 an der sog. low

affinity quinol oxidation site (QL) und transferiert die Elektronen über QH und Häm B an das

binukleare Reaktionszentrum [20; 21; 35].

Untereinheit III und -IV des Cyt bo3 sind für die Assemblierung des binuklearen Zentrums in

Untereinheit I notwendig [48], aber nicht in die katalytischen Funktion involviert [51].

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

10

1.4 VIS-Spektroskopie Bei der Absorption von elektromagnetischer Strahlung im sichtbaren Wellenlängenbereich

(VIS; ca. 400-800 nm, ∆E ≈ 400 kJ/mol) werden elektronische Übergänge des angeregten Mo-

leküls beobachtet. Die Häm-Gruppen der Cytochrome bestimmen die Absorptionseigenschaften

in diesem Spektralbereich und geben dieser Proteinklasse ihre charakteristische Farbe. Die

spektralen Eigenschaften der Cytochrome sind einerseits vom Häm-Typ abhängig (z.B. Häm B,

Häm O) und andererseits von der sie umgebenden Polypeptidkette, d.h. chemisch identische

Häme können unterschiedliche Absorptionsmaxima im Cytochrom aufweisen. Die Nomenklatur

folgt dann ihren Absoptionseigenschaften, z.B. Häm B562 bzw. Cyt b562.

Durch Einstrahlung von Licht der geeigneten Wellenlänge können bei Cytochromen vier ver-

schiedene elektronische Übergänge angeregt werden [60]. Man unterscheidet:

a) Elektronische Anregungen innerhalb der Eisen-d-Orbitale. Diese Übergänge sind in der Re-

gel im Spektrum nicht sichtbar.

b) π−π* Übergänge der aromatischen Aminosäuren.

c) Charged Transfer Übergänge. Sie finden zwischen Orbitalen des Porphyrins und Eisenorbita-

len bzw. zwischen den Orbitalen axialer Liganden und Eisenorbitalen statt. Für das high-spin

Häm werden sie in der Regel im Bereich von 600-650 nm gefunden.

d) π−π* Übergänge des Häms. Diese Übergänge können mit einem Vier-Orbital-Modell be-

schrieben werden, das den Grundzustand S0 und die drei angeregten Zustände S1, S2 und S3 um-

fasst. Die Übergangsdipolmomente liegen in der Ebene des Moleküls entlang der beiden Mole-

küldiagonalen durch die N-Atome. Der energetisch höchste Übergang S0 ? S3 liegt zwischen

390 und 450 nm und wird als Soret-Bande bezeichnet, auch γ-Bande genannt. Bei Reduktion

verschiebt sie zum Längerwelligen (bathochrome Verschiebung). Zwischen 500 und 600 nm

liegt im oxidierten Zustand eine breite Absorptionsbande vor. Reduziertes Cyt bo3 zeigt um 530

nm die β-Bande (S0 ? S2) und bei 560 nm die α-Bande (S0 ? S1), die zur Charakterisierung

der Cytochrome herangezogen wird [61] und als vibronische Übergänge bezeichnet werden.

Elektronenziehende Substituenden oder eine höhere Polarität der Umgebung bewirken eine Ver-

schiebung zum Kürzerwelligen (hypsochrome Verschiebung).

In Abb. 1.4.1 sind die oxidierten und reduzierten VIS-Absolutspektren des Cyt bo3 dargestellt

(links) [51]. Aus messtechnischen Gründen wird zumeist das reduzierte minus oxidierte Diffe-

renzspektrum (Redox-Differenzspektrum) gezeigt (rechts). Die Redox-Änderungen der α-Bande

werden im Wesentlichen vom sechsfach koordinierten low-spin Häm bestimmt [62-64]. An der

Soret-Bande sind low-spin und high-spin Häm etwa gleichermaßen beteiligt [62; 63; 65]. Tief-

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

11

temperatur-Redoxdifferenzspektren bei 77 K (77 K-Differenzspektrum) führen zu einer

α-Bande mit zwei Maxima bei 555 nm und 562 nm (Vergrößerung innerhalb der rechten Spekt-

rendarstellung) [58; 66]. Diese Signalaufspaltung kann zur präzisen Einordnung der Häm-

Spezies, die in der low-spin Hämbindetasche eingebaut ist, benutzt werden.

Abb. 1.4.1: Oxidierte und reduzierte VIS-Absolutspektren (links) und reduziertes minus oxidiertes Redox-Differenzspektrum (rechts) von Cyt bo3 bei Raumtemperatur. Zusätzlich ist das Tieftemperatur-Differenzspektrum bei 77 K im Bereich der β- und α-Bande dargestellt. Die Abb. wurde nach Kita et al., 1984 modifiziert [51].

1.5 Infrarotspektroskopie Bei der Absorption von elektromagnetischer Strahlung im mittleren Infrarot (mittleres IR; 4000

cm-1-100 cm-1, ∆E ≈ 40 kJ/mol) werden Molekülschwingungen und -rotationen angeregt. Für

niedrige Schwingungsniveaus kann das Modell des harmonischen Oszillators herangezogen

werden, bei dem sich die Energien der Schwingungszustände En und die Schwingungsfrequenz

ν ergeben als (Gleichung 1.1):

En = hν (n + ½) n = 0,1,2,3,... (1.1)

Hierbei ist n die Schwingungsquantenzahl. Ein solcher Oszillator schwingt harmonisch mit der

Frequenz (Gleichung 1.2):

µk

p21

=ν mit 21

21

m mmm

+∗

=µ (1.2)

Hierin ist k die Kraftkonstante des harmonischen Oszillators und µ die reduzierte Masse. Ge-

nauer werden Molekülschwingungen durch anharmonische Morse-Potentiale beschrieben, die

den Bruch der schwingenden Bindung bei großen Energien wiedergeben. Ein nicht-lineares Mo-

lekül aus N Atomen hat 3N minus 6 Schwingungsfreiheitsgrade, die als Normalmoden bezeich-

net werden. Sie ergeben sich aus der Bewegungsgleichung als voneinander unabhängige

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

12

Schwingungen bei der Behandlung in massengewichteten kartesischen Auslenkungskoordina-

ten. Ihre Frequenzen können bei Kenntnis des Schwingungs-Kraftfelds und der Geometrie des

Moleküls berechnet werden.

Eine Normalschwingung kann IR-Strahlung absorbieren, wenn sich während der Schwingung

mindestens eine Komponente des Dipolmoments ändert. Sie wird dann als „IR-aktiv“ bezeich-

net. Die Größe der Dipolmomentsänderung bestimmt den Extintionskoeffizienten der Absorp-

tion. Für die Darstellung von IR-Spektren wird meist auf der Abszisse nicht die Wellenlänge (λ,

nm), sondern von rechts nach links steigend deren Reziprokwert, die Wellenzahl (ν?, cm-1)

aufgetragen. Der Vorteil besteht darin, dass die Angabe somit proportional zur Energie der

absorbierten IR-Strahlung ist.

1.5.1 Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie

Für die Absorptionsspektroskopie im mittleren-IR werden drei verschiedene Techniken genutzt.

In dispersiven Spektrometern wird das Licht mit einem Prisma oder Gitter in seine Wellenlän-

gen aufgespalten und diese einzeln detektiert. In der Laser-IR-Spektroskopie ist die Lichtquelle

von sich aus monochromatisch und keine Auflösung in ein Lichtspektrum notwendig. Bei der

Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FT-IR Spektroskopie) wird die spektrale Information

polychromatischer Strahlung über die Modulation der Intensität unter Erhalt der Frequenzinfor-

mation in ein Interferogramm umgewandelt. Dazu verwendet man in der Regel ein Michelson-

Interferometer (Abb. 1.5.1).

Abb. 1.5.1: Schema eines Michelson-Interferometers. Zeichenerklärung: „x“ bezeichnet die Auslenkung des be-weglichen Spiegels. Dies ist das entscheidene Element in einem FT-IR-Spektrometer: Ein halbdurchlässiger Strahl-

teiler spaltet die polychromatische Strahlung in zwei Teilstrahlen auf. Ein Teil wird am festen

Spiegel, der andere am beweglichen Spiegel reflektiert, so dass sie am Strahlteiler wieder auf-

einander treffen und interferieren. Ein Teil der interferierenden Strahlen fällt auf den Detektor.

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

13

Die interferierenden Teilstrahlen haben einen unterschiedlich langen Weg zurückgelegt, wobei

der Gangunterschied von der variablen Position des beweglichen Spiegels abhängt. Es wird ein

Interferogramm erhalten.

Gegenüber einem dispersiven Spektrometer hat ein FT-IR-Spektrometer drei Vorteile [67; 68]: a) Multiplexvorteil: Der gesamte Spektralbereich wird gleichzeitig detektiert. Dies führt zu deut-

lich verkürzten Spektrenaufnahmezeiten. Das Interferogramm enthält das spektrale Rauschen

vom Detektor nur einmal. Dadurch erhöht sich das Signal-Rausch-Verhältnis.

b) Jaquinotvorteil: Da ein Interferometer im Gegensatz zu einem Monochromator keinen Ein-

tritts- und Austrittsspalt benötigt, besitzen FT-Spektrometer einen erheblich höheren Licht-

durchsatz. Dies führt zu einem verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis.

c) Connesvorteil: Zur internen Kontrolle der Spiegelbewegung wird ein Helium-Neon-Laser

eingesetzt und damit eine hohe Wellenzahlengenauigkeit erreicht. Dies ermöglicht die präzise

Spektrenaddition und somit ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis.

Mit der Fourier-Transformation wird aus dem Interferogramm das Spektrum berechnet. Das

Interferogramm beschreibt die Abhängigkeit der Intensität von der Wegdifferenz x der Teil-

strahlen. Für eine monochromatische Lichtquelle wird es als eine Cosinusfunktion beschrieben,

wobei I0 die Teilintensität bezeichnet (Gleichung 1.3).

I(x) = I0[1+cos(2πν?x)] (1.3)

Für eine nicht monochromatische Strahlungsquelle ergibt sich das Interferogramm als Integral

über alle Einzelbeiträge (Gleichung 1.4).

I(x) ~ ∫∞

0

S(ν?) e-2iπν?x dν? (1.4)

Aus diesem Interferogramm kann das Spektrum S(ν?), auch Einkanal- oder Absolutspektrum

genannt, durch Fourier-Rücktransformation berechnet werden (Gleichung 1.5).

S(ν?) ~ ∫∞

∞−

I(x) e-2iπν?x dx (1.5)

Das FT-IR Spektrometer misst die Interferogramme nicht kontinuierlich, sondern an diskreten

Punkten n∆x mit dem maximalen Wegunterschied der Teilstrahlen N∆x. Das Interferogramm

besteht daher aus N diskreten Punkten mit dem Abstand ∆x. Die spektrale Auflösung ∆ν? ist der

Kehrwert des Produkts aus dem Punktabstand ∆x und der Punktanzahl N (Gleichung 1.6).

∆ν? = x)(N

1∆

(1.6)

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

14

Zur Berechnung des Spektrums aus dem Interferogramm wird dann die diskrete Fourier-

transformation verwendet (Gleichung 1.7).

S(k ∆ν?) ~ ∑−

=

1

0

N

n

I(n∆x) e(2iπNnk

) (1.7)

Die Verwendung der diskreten Fourier-Transformation kann zu Artefakten im Spektrum führen.

Eine genaue Beschreibung dieser Effekte ist bei Gronholz und Herres, 1984 [69-71] oder Grif-

fith und deHaseth, 1986 [67] aufgeführt.

1.5.2 Reaktionsinduzierte Redox-FT-IR-Differenzspektroskopie

Die IR-Spektroskopie kann sowohl Informationen mit hoher Zeitauflösung von beispielweise

den Peptidrückgrad-Änderungen während der Proteinreaktion geben als auch Änderungen der

Konformation und Umgebung von Seitenketten auf der Ebene von individuellen chemischen

Gruppen liefern [72-76].

Um Proteinreaktionen mit hoher Zeitauflösung und hohem Signal-Rausch-Verhältnis IR-

spektroskopisch verfolgen zu können, muss diese Reaktion jedoch mindestens einige Dutzend

bis Hundertmal ausgelöst werden können. Dies erfordert in der Regel zyklisch-arbeitende, durch

Licht immer wieder anregbare Proteine, wie z.B. die lichtgetriebene Protonenpumpe Bakter-

iorhodopsin aus Halobacterium salinarum. Um statische Informationen über individuelle che-

mische Gruppen zu erhalten, die an der Proteinreaktion beteiligt sind, kann ein einmaliges Aus-

lösen der Proteinreaktion genügen. In dieser Arbeit werden die Methoden der statischen photo-

reduktions-induzierten Redox-FT-IR-Differenzspektroskopie (PR-Differenzspektroskopie) mit

caged electrons und der statischen auto-photoreduktions-induzierten Redox-FT-IR-Differenz-

spektroskopie (APR-Differenzspektroskopie) ohne caged compound an Cyt bo3 verwendet.

Die photo-induzierte Differenzspektroskopie [74] mit caged compounds ist in Abb. 1.5.2 am

Beispiel des Cyt bo3 gezeigt:

Das oxidierte Cyt bo3 wird mit einer photolabilen Substanz versetzt (caged electrons), die bei

Einstrahlung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge (< 450 nm) photolysiert und dabei ein

Substrat (Elektronen in Form des Flavinsemichinon-Radikals, F*) freisetzt, das zur Bildung des

vollständig reduzierten Cyt bo3 führt. Wählt man das Spektrum der Probe vor dem Belichten als

Referenzspektrum (vollständig oxidiert), so erhält man durch Messung des Spektrums nach Be-

lichtung (vollständig reduziert) und Berechnung der Extinktion nach dem Lambert-Beer´schen-

Gesetz direkt das entsprechende Differenzspektrum (reduziert minus oxidiert). Das Differenz-

spektrum beinhaltet nur die aus dem Redoxübergang resultierenden Änderungen. Banden, wel-

che in beiden Spektren unverändert vorhanden sind, heben sich bei der Subtraktion gegenseitig

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

15

auf und nur das Hintergrundrauschen der Probe und des Detektors sind im Differenzspektrum

untergelagert.

Abb. 1.5.2: Prinzip der PR- bzw. APR-Differenzspektroskopie am Beispiel von Cyt bo3. Zeichenerklärung: „hν“ = Licht geeigneter Energie, das die Reaktion auslöst. Für weiterführende Erklärungen s. Text. In dem in Abb. 1.5.2 dargestellten Differenzspektrum entsprechen positive Banden (rot) dem

reduzierten, negative Banden (blau) dem oxidierten Zustand des Cyt bo3. Die photolabilen Sub-

stanzen nennt man caged Verbindungen. Beispielsweise redet man von caged phosphate, wenn

durch die Lichtbestrahlung Phosphat freigesetzt wird [77]. Ein vereinfachtes Reaktionsschema

für die Photoreduktion an Cyt bo3 mit caged electrons ist in Abb. 1.5.3 dargestellt (links) [78].

Die APR-Differenzspektroskopie an Cyt bo3 benötigt keine caged-Verbindung, da in diesem

Falle die Elektronen zur Reduktion vermutlich vom Protein selbst oder von Wasser stammen.

Ansonsten läuft diese Meßmethode nach demselben Prinzip ab. Ein hypothetisches Reaktions-

schema der Auto-Photoreduktion für Cyt bo3 ist in Abb. 1.5.3 dargestellt (rechts).

Bei der PR bzw. APR-Differenzspektroskopie sind die Extinktionsänderungen sehr klein und

können in den Absolutspektren visuell nicht wahrgenommen werden (Abb. 1.5.2). Sie können

erst bei Bildung des Differenzspektrums identifiziert werden. Im Falle des Cyt bo3 müssen die

größten Differenzextinktionen um ca. das 250-500fache gegenüber den größten Extinktionen der

Absolutspektren vergrößert werden. Dies macht eine hohe Probenstabilität und Probenreprodu-

zierbarkeit, sowie ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis (1.5.1) unabdingbar. Bei beiden Metho-

den wird in dieser Arbeit nur der vollständig oxidierte und vollständig reduzierte Zustand des

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

16

Cyt bo3 im Reaktionszyklus (Abb. 1.2.3) betrachtet. Banden von am Reaktionszyklus beteiligten

funktionellen Gruppen des Proteins können nur dann im Differenzspektrum erscheinen, wenn

sie eine Dipolmomentsänderung zwischen der vollständig reduzierten und oxidierten Form der

Oxidase erfahren, d.h. am Zyklus beteiligte chemische Gruppen von Aminosäuren oder Kofak-

toren müssen nicht zwangsläufig als Bande im Differenzspektrum vorhanden sein.

Abb. 1.5.3: Vereinfachtes Modell zum Mechanismus der Photoreduktion mit caged electrons (links) und dem hypothetischen Reaktionsschema bei der Auto-Photoreduktion (rechts). Zeichenerklärung: „F“ = FMN, „F*“ stellt die entsprechende photoaktivierte Spezies dar; „F-“ = Ein-Elektron reduzierte Form des FMN. Die Abb. für den Photoreduktionsmechanismus wurde nach Lübben & Gerwert, 1996 [81] erstellt. Für weiterführende Erklärungen s. Text. Bei IR-Proben, die mit der PR-Differenzspektroskopie vermessen werden sollen, werden caged

electrons (FMN-EDTA-Lösung) zugesetzt. Details zum Mechanismus sind [78; 79] zu entneh-

men. Dabei kann das FMN (F) bei Lichtabsorption in den aktivierten Zustand (F*) übergehen

und in Anwesenheit von EDTA kann das Flavinsemichinon (F*), ein starker Reduktant, gebildet

werden. Das F* kann letztlich Proteinkofaktoren, wie z.B. die Häme der Cytochrom Oxidasen

reduzieren. Der sogenannte „opfernde“ Elektronendonor EDTA wird bei diesem Prozess irre-

versibel oxidiert und dessen Redoxprodukte überlagern die Differenzbanden des Cyt bo3 in ei-

nem großen Wellenzahlenbereich (< ca. 1630 cm-1).

Als weitere caged Verbindung steht caged dioxygen in Ergänzung zu den caged electrons zur

Verfügung, mit dem reduziertes Cyt bo3 sauerstoffabhängig oxidiert werden kann [80].

Auto-Photoreduktion in Abwesenheit externer Elektronendonoren wurde bereits an den ver-

schiedensten Hämproteinen beschrieben [82-84]. Das Phänomen beschreibt die Reduktion der

redoxaktiven Kofaktoren im Protein als Folge von Lichteinstrahlung aus dem nahen UV-

Bereich. Bei geeigneter Lichtintensität kommt es zur vollständigen Reduktion des Cyt bo3, das

nach (Re-)Oxidation nahezu unveränderte Durochinol-Oxidaseaktivität zeigt [85]. Bei hoher

Lichtintensität kommt es neben dem Prozess der Auto-Photoreduktion auch zur Degradation und

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

17

Inaktivierung des Proteins unter gleichzeitiger CO-Freisetzung. Der genaue Mechanismus dieser

Prozesse ist unbekannt. In Abb. 1.5.3 (rechts) ist das hypothetische Reaktionsschema angege-

ben. Es wird angenommen, dass sich als Intermediat ein Porphyrylradikal (Redoxpotential E0 =

+1,2-1,4 V; [86; 87]) bildet, während das Elektronen das Häm-Eisen reduziert [83; 84]. Die Re-

aktion ist prinzipiell reversibel. Die (Re-)Oxidation kann jedoch unter Sauerstoffausschluss

weitgehend unterbunden werden [82], wie z.B. in gasdicht-verschlossenen IR-Küvetten. Das

Cyt bo3 kann praktisch vollständig reduziert werden [85]. Hierfür sind drei Elektronen nötig, die

somit einen „opfernden“ Elektronendonor bedingen. Es kommen beispielsweise aromatische

Aminosäuren aus den Protonenkanälen der Oxidase, wie z.B Trp und Tyr (E0 = +1,05 V bzw.

+0,94 V) oder Wasser, das eine Reaktion über Wasserstoffperoxid eingeht (E0 (H2O/H2O2) =

1,35 V) in Frage.

Die einzige Möglichkeit, um IR-Spektren ohne Überlagerungsbanden eines externen Elektro-

nendonors zu erstellen, bestand bisher darin, eine elektrochemische Zelle [88] zu verwenden.

Die APR-Differenzspektroskopie eröffnet erstmalig die Möglichkeit auch in diese spektralen

Bereiche unter Verwendung von IR-Küvetten vorzudringen.

1.5.3 Allgemeine Hinweise zur FT-IR Spektroskopie an Cytochrom bo3

Proteine bereiten als makromolekulare Substanzen, welche zur vollen Funktionalität eine Hyd-

rathülle benötigen, bei IR-spektroskopischen Untersuchungen in dreifacher Hinsicht Probleme:

(I) Die große Anzahl IR-aktiver Gruppen, deren Moden untereinander koppeln und deren Ban-

den überlappen, lassen ein komplexes Spektrum entstehen, deren Signale nur schwer zu separie-

ren und zuzuordnen sind. (II) Die Peptidbindung als repetitives Motiv der Proteine dominiert

das Spektrum mit der sogenannten Amid I- (um 1650 cm-1, vornehmlich C=O-Streckschwin-

gung) und Amid II-Bande (um 1550 cm-1, N-H Beugeschwingung und C-N Streckschwingung),

neben denen schwächere Signale kaum noch aufzulösen sind. (III) Das Wasser besitzt breite und

starke Banden um 1650 cm-1 und 3400 cm-1. Proteinproben, die IR-spektroskopisch untersucht

werden sollen, müssen daher hochkonzentriert sein, einen geringen Wasseranteil und eine ge-

ringe Schichtdicke besitzen.

Um Banden von individuellen Proteingruppen dennoch zuordnen zu können werden in der

Regel drei, auch untereinander kombinierbare Methoden angewendet: (I) Erstellung von nicht

invasiven ortsspezifischen Mutanten. (II) Erstellung von spezifisch isotopenmarkierten chemi-

schen Gruppen. (III) Austausch des Lösungsmittels H2O zu D2O (H/D-Austausch).

In allen drei Fällen können die veränderten individuellen Proteingruppen zur Verschiebung

von Banden führen, die somit der chemischen Gruppe selbst oder deren Umgebungsänderungen

zugeordnet werden können.

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

18

Abschließend werden zwei Tabellen aufgezeigt, die einige für diese Arbeit wichtige Gruppen-

schwingungsarten und deren typische Spektralbereiche, in denen sie zu finden sind beinhalten.

Tab. 1.5.1 gibt typische in Hämen gefundene Gruppenschwingungen wieder [89; 90]. Die be-

zeichneten C-Atome können Abb. 1.2.4 entnommen werden.

Tab. 1.5.1: Häm-Schwingungena

Schwingung gekoppelte Schwingung typischer Spektralbereich / cm-1 ν(C=O) ? 1700-1665

νas(COO-) ? 1620-1540 νs(COO-) ? 1420-1300 ν(CaCm) δ(CaCmH), δ(CmX) 1560-1625 ν(CbCb) ν(CaCm), ν(CaN), ν(CbX), δ(CbX) 1535-1570 νs(CaCm) ν(CaN), ν(CbCb), ν(CaCm) 1450-1490 ν(CaCb) δ(CbX), ν(CaN), δ(CaCbCb) 1435-1450 ν(CaN) ν(CaCb), δ(CbX), δ(CaCbCb) 1360-1395 δ(CmH) δ(CbX), ν(CaN), ν(CaCb) 1220-1270

a Der genaue spektrale Bereich in dem die Häm-Moden zu finden sind, hängt stark vom Häm-Typ, dem Redox-zustand und der Umgebung ab. Die Bezeichnungen der Häm-Moden folgt Spiro & Li, 1988 [91].

In Tab. 1.5.2 sind neben den Schwingungen der Amid Banden, auch Gruppenschwingungen

von einigen ausgewählten Aminosäuren aufgeführt.

Tab. 1.5.2: Einige Amid- und Aminosäure-Schwingungsbandena Zuordnung (Name) Bandenposition/cm-1;

(ε/M-1cm-1) in H2O Bandenposition/cm-1; (ε/M-1cm-1) in D2O

Referenz

Amid A 3250-3300 3250-3300 [92] Asp, ν(C=O) 1716-1788 (280) 1713-1775 (290) [93] Glu, ν(C=O) 1712-1788 (220) 1706-1775 (280) [93] Amid I ν(C=O) 1600-1700 [92]

β-Faltblatt 1620-1640 [92] ungeordnete Strukturen 1640-1650 [92]

α-Helix 1650-1658 [92] Schleifen 1660-1690 [92]

β-Faltblatt 1670-1680 [92] Amid II δ(N-H), ν(C-N) 1480-1575 <1100, 1490-1460 [92] Asp νas(COO-) 1574-1579 (290-380) 1584 (820) [93] Glu νas(COO-) 1556-1560 (450-470) 1567 (830) [93] Asp νs(COO-) 1402 (256) 1404 (~450) [93] Glu νs(COO-) 1404 (316) 1406 (~450) [93] Glu δ(COH) 1264-1450 955-1058 [93] Glu ν(C-O) 1120-1253 (100-200) 1270-1322 [93] Amid III δ(N-H), ν(C-N) 1230-1330 [92] a Der genaue spektrale Bereich in dem die angegebenen Moden zu finden sind, hängt stark vom Redoxzustand des Cyt bo3 und der Umgebung ab.

Einleitung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

19

1.6 Zielsetzung Cytochrom Oxidasen sind die terminalen Enzyme der aeroben Atmungskette. Die membran-

gebundene Ubichinoloxidase Cytochrom bo3 von Escherichia coli ist Thema dieser Arbeit. Sie

katalysiert die Oxidation von Ubichinol-8 und die Reduktion von molekularem Sauerstoff zu

Wasser. Bei den dabei induzierten Redoxübergängen der beteiligten Kofaktoren werden Proto-

nen über die Cytoplasmamembran transloziert. Die Redoxreaktionen des Enzyms sind an die

Erzeugung eines elektrochemischen Protonengradienten gekoppelt. Ziel dieser Arbeit ist es die

an dieser Kopplung beteiligten atomaren Gruppen des Cytochrom bo3 zu untersuchen. Im Rah-

men dieser Arbeit sollen folgende Punkte ausgearbeitet werden:

? Es soll eine neue Cyt bo3 Wildtypvariante kloniert, homolog in E. coli überexprimiert und

gereinigt werden, die keine C-terminale Proteolyse an Untereinheit II und somit keinen Verlust

der zur Proteinreinigung genutzten Oligohistidinmodifikation aufweist. Anschließend soll diese

Wildtypvariante auf ihre biochemischen, VIS- und IR-spektroskopischen Eigenschaften unter-

sucht werden. Weiterhin soll die Tauglichkeit dieses Wildtypkonstrukts zur Cyt bo3-

Mutantenerstellung mittels ortsspezifischer Mutagenese getestet werden.

? Um reproduzierbare Cyt bo3 IR-Spektren zu erhalten, ist eine IR-Probenpräparation unter de-

finierten Bedingungen die Grundvoraussetzung. Zu diesem Zweck soll eine Probenpräpara-

tionskammer, die sogenannte Gasaustauschzelle, angefertigt werden. An diesen IR-Proben soll

der Lösungsmittelaustausch von H2O zu D2O auf Vollständigkeit geprüft werden, um die postu-

lierte Schalterfunktion an der hydrophoben Barriere der Aminosäure Glutamat-286 bei vollstän-

digem H/D-Austausch zu untersuchen. Weiterhin sollen grundlegende Untersuchungen für eine

Korrelation zwischen dem konformativen Wechsel des Glu-286 und dem Redoxübergang des

Häm B aus den FT-IR-Differenzspektren abgeleitet werden.

? Mit dem Einsatz der APR-Differenzspektroskopie, die keine caged-Verbindung zum Initiieren

der Proteinreaktion benötigt, sollen Cyt bo3 Wildtyp- und Mutanten-Differenzspektren erstmalig

auch mit IR-Proben zwischen Calciumfluorid-Fenstern unterhalb der Amid-Regionen ausgewer-

tet werden. Dazu sollen Kriterien erarbeitet werden, die reproduzierbare APR-Differenzspektren

über einen großen Wellenzahlenbereich ermöglichen. Anschließend sollen die Carbonyl- und

Carboxylatschwingungen der Hämpropionate dem APR-Differenzspektrum zugeordnet werden.

Hierzu soll eine spezifische [1-13C]-Markierung der Hämpropionate durchgeführt werden, deren

Differenzsignale im Vergleich zum ∆cyoE-Mutanten APR-Differenzspektrum dem low-spin

bzw. high-spin Häm zugeordnet werden sollen.

20

2. Material und Methoden

2.1 Biologisches Material

2.1.1 Antikörper

Als primärer Antikörper für den Immunoblot wird ein polyklonales Kaninchen-Antiserum gegen

CyoA (Untereinheit II) verwendet [49]. Dieses wurde von Saraste und Lappalainen, EMBL,

Heidelberg zur Verfügung gestellt.

Als sekundärer Antikörper kommt ein mit Alkalischer Phosphatase konjungiertes Ziege-anti-

Kaninchen-Immunglobulin (Sigma Chemie, München) zum Einsatz.

2.1.2 Bakterienstämme

Eine Übersicht der verwendeten Escherichia coli-Stämme gibt Tab. 2.1.1. BL21 ∆cyo recA-,

JM107 ∆cyo recA- und JM107 ∆cyo ∆cyd wurden von C. Ludovici, RUB, Bochum mittels P1-

Transduktion, ausgehend von BL21(DE3) (New England Biolabs, UK) und JM107 (New Eng-

land Biolabs, UK) hergestellt. S730 wurde vom E. coli Genetic Stock Center, New Haven

(USA) bezogen.

Tab. 2.1.1: Die zur Plasmidpräparation bzw. Expression von Cyt bo3 verwendeten E. coli Stämme. Stamm Genotyp Referenz

BL21 ∆cyo recA- F-, ompT, gal [dcm] [lon] hsdSB (rB- mB

-; ein E. coli B Stamm) mit DE3, ein λ Prophage trägt das T7 RNA Polymerase Gen; ∆cyoBCD::kanR, recA-

[29; 94]

JM107 ∆cyo recA- F´ traD36, lacIq, ∆(lacZ)M15, proA+B+ /e14-(McrA-), ∆(lac-proAB), thi, gyrA96, (Nalr) endA1 hsdR17(r-

K m+

K), relA1, supE44, ∆cyoBCD::kanR ; recA-

[29; 95]

JM107 ∆cyo ∆cyd wie JM107 ∆cyo recA- jedoch: recA+ ; cydAB::cmR [29; 95] S730 fhuA2, lacY1, tsx-70, glnV44(AS), gal-6, λ-, purB51,

hemA30, trpC45, pabB5, his-68, rfbD1, tyrA2, galP63, rspL125 (strR), malT1(λR), xylA7, mtlA2, thi-1, pyr65

[96; 97]

2.1.3 Plasmide

Die zur Überexpression von Cyt bo3 verwendeten Plasmide, Derivate des Vektors pBR322, ba-

sieren auf dem Plasmid pMC39, das von R. Gennis, Urbana (USA), bezogen wurde. Dieses

Plasmid weist eine Größe von ca. 10 kb auf, trägt ein Ampicillin-Resistenzgen und beinhaltet

das cyo-Operon, welches cyoA (Untereinheit II), cyoB (Untereinheit I), cyoC (Untereinheit III),

cyoD (Untereinheit IV) und cyoE (Protohäm IX Farnesyltransferase) exprimiert (Abb. 2.1.1).

Material & Methoden ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

21

Die Addition von sieben Histidinen am C-Terminus von Untereinheit IV der Oxidase wurde

von M. Lübben, RUB, Bochum durch overlap extension PCR erreicht [98; 99]. Dieses Kon-

strukt wurde als pHTAG bezeichnet.

Das Plasmid pHCL exprimiert ein Cyt bo3, das C-terminal an Untereinheit II um neun Histidi-

ne und ein Arginin verlängert ist. Es wurde von A. Puustinen, Helsinki (Finnland) bezogen.

Abb. 2.1.1: Genkarte des cyo-Operons und dessen Plasmidderivate. Es ist nur die DNA-Region des pBR322-Plasmids gezeigt, die die Strukturgene des Cyt bo3 beinhaltet. Kurze Pfeile weisen auf Restriktionsschnittstellen, lange auf die zu überexprimierenden Genprodukte hin. „His -tag“ = Oligohistidinmodifikation, „*“ = modifizierte Untereinheit; Weiterführende Erklärungen im Text. Die Abbildung wurde nach Prutsch et al., 2000 [49] modifi-ziert. Das Plasmid pIN exprimiert ebenfalls eine am C-Terminus von Untereinheit II mit Histidinen

modifizierte Oxidase. In diesem Falle handelt es sich jedoch um sechs Histidine, die bei gleich-

zeitiger Deletion der drei C-terminal gelegenen Aminosäuren Met, Glu und Met mittels Unique-

Site-Elimination (U.S.E. Mutagenesis Kit, Pharmacia, Freiburg) eingefügt wurden.

2.1.4 Oxidasen und Mutanten

Eine Übersicht der verwendeten Konstrukte, die Cyt bo3 überexprimieren, vermittelt Tab. 2.1.2.

Die ortsspezifischen Mutanten wurden durch U.S.E. Mutagenese von I. Schönhaar bzw. B. Ma-

mat, LS für Biophysik, RUB erstellt. Bei den aufgeführten Mutanten handelt es sich, wenn nicht

anders vermerkt, um Mutationen in Untereinheit I und II.


22

Tab. 2.1.2: Übersicht über die untersuchten Wildtyp-Konstrukte und ortsspezifischen Mutanten des Cyt bo3.

Mutation Plasmid Expressions- stamm

Position Referenz

Wildtyp pMC39 1 keine Modifikation [55] ∅ Wildtyp pHCL 1 UE II His-tag [29; 59] ∅ Wildtyp pHTAG 1 UE IV His-tag [49] ∅ Wildtyp pIN 1, 2 UE II His-tag diese Arbeit ∆Bgl II pSTAG 1, 2 Deletion des Bgl II-Fragments

in UE I [49]

∆cyoE pHCL 1 Deletion von UE V; Häm O defizient

[100]

II E89C pHCL 1 UE II diese Arbeit II E89D pHCL 1 UE II [30] II E89Q pHCL 1 UE II [30] II H310A pHCL 1 UE II diese Arbeit II S309A pHCL 1 UE II diese Arbeit II S309/H310A pHCL 1 UE II diese Arbeit E286D pHCL 1 H+-Leitung; D-Kanal [29; 101] E286Q pHCL 1 H+-Leitung; D-Kanal [29; 101] F391Q pHCL 1 K-Kanal [102] T352S pIN 1 K-Kanal [103]; diese Arbeit T359S pIN 1 H+-Leitung; K-Kanal [103]; diese Arbeit Y288F pHCL 1 CuB-Ligand [104] Y288F/ E286D pHCL 1 CuB-Ligand [105] Zeichenerklärung: ∅ = keine „echte“ Mutation, jedoch eine Oligohistidinmodifikation; 1 = BL21 ∆cyo recA-; 2 = S730, „UE“ = Untereinheit, „His -tag“ = Oligohistidinmodifikation, Komplementation = die vom Expressionsvektor kodierte Oxidase wird in dem doppelt respiratorisch defizienten E. coli Stamm JM107 ∆cyo ∆cyd auf ihre physio-logische in vivo Aktivität untersucht.

2.2 Chemikalien Allgemeine Laborchemikalien, wenn nicht anders vermerkt, werden von den Firmen Baker

Chemikalien (Groß-Gerau), Fluka Chemie (Neu-Ulm), Merck AG (Darmstadt), Riedel-de Haen

AG (Seelze), Serva Feinbiochemika (Heidelberg) und Sigma Chemie (München,) bezogen. Be-

findet sich der Hersteller bzw. eine Filiale in Deutschland, so wurde auf eine Landesangabe ver-

zichtet.

δ-Aminolävulinat (12C) Sigma Chemie, München [1-13C]-δ-Aminolävulinat CDN-Isotopes, Point-Claire, Kanada Asolectin (α-Phosphatidylcholin) Sigma Chemie, München BCIP (30 mg*mL in 70% (w/v) DMF) La Roche, Mannheim Casein-Hydrolysat (Pepton Nr. 140) Gibco BRL, Eggenstein β-D-Decyl-Maltosid Biomol Feinchemikalien, Hamburg Hefeextrakt Gibco BRL, Eggenstein Magermilchpulver Glücksklee (Nestle), Frankfurt a. M. NBT (75 mg*mL in 70% (w/v) DMF) La Roche, Mannheim SDS-PAGE Standards BioRad, München


23

2.3 Geräte

Es werden nur häufig verwendete Geräte genannt. Spezielle Laborgeräte werden bei den Be-

schreibungen der einzelnen Methoden erwähnt.

Autoklav Modell C, Webeco, Bad Schwartau Brucheisbereiter Af-10, Scotsman Brutschrank kelvitron t, Heraeus Instruments, Bad Oeynhausen Elektrophoresegeräte Powersupply PPS200-1D, MWG-Biotech, Ebersberg Elec. Power Supply-EPS 600, Pharmacia, Freibug Inkubationsschüttler Scientific Model G25, New Brunswick, USA Inkubationstaumler Heidolph-Instruments, Schwabach Magnetrührgeräte Assistent RM5, Heidolph-Instruments, Schwabach IKA Combimag RCT; IKA-Labortechnik, Staufen pH-Meter 761 Calimatic, Knick, Berlin Rotoren SS34, SLA1000, SLA3000, SLA12, Sorvall, Bad Homburg

v.d.H. 45 Ti, 70 Ti, Beckmann, München Sterilbank NoNu-425-400-E, Nuaire, Plymouth, UK UV/VIS Spektrometer DW-2aTM UV-VIS, Aminco, USA Uvikon 810, Biotek-Kontron, Neufahrn Einstrahlphotometer, Eppendorf, Köln

Photodiodenarray, Eigenbau von Dipl. Ing. H. Chorogiewski (LS für Biophysik, RUB)

Ultraschall-Sonifier Branson Sonifier-250, Heinemann, Schwäbisch-Gmünd Vakuumpumpe Membranpumpe CVC2, MZ2, Vakuubrand, Wertheim, Vortexer REAX 2000, Heidolph-Instruments, Schwabach Wasseraufbereitung Milli-Q Plus, Millipore, Eschborn Zentrifugen RC-5B Plus, Sorvall, Bad Homburg v.d.H. Ultrazentrifuge XL-70, Beckmann, München Biofuge pico, Heraeus-Christ, Bad Oeynhausen

2.4 Computersoftware

Adobe Photoshop 5.0 Adobe, San Jose, USA Corel Draw 9.0 Corel Corporation Corel OCR-Trace 9.0 Corel Corporation Origin 6.0 Microcal Software, Northampton, USA Word 2000 Microsoft OPUS 3.0 Bruker, Karlsruhe


24

2.5 Nährmedien

Luria-Bertani-Medium (LB) [106]:

10 g NaCl, 10 g Pepton Nr. 140 und 5 g Hefeextrakt wird in 1 L VE-Wasser gelöst und mit 1 M

NaOH auf pH 7,5 titriert. Anschließend wird bei 121°C, 1 bar Überdruck und 20 Minuten auto-

klaviert.

LB-Agarplatten

1,5% (w/v) Agar-Agar (GibcoBRL, Eggenstein) werden in LB-Medium gegeben und bei 121°C,

1 bar Überdruck und 20 Minuten autoklaviert. Nach Zugabe der jeweiligen Antibiotika (ab ca.

50°C) wird der noch flüssige Nährboden in die Petrischalen gegossen.

2.6 Arbeiten mit Bakterien

Es werden nur keimfreie Arbeitsgeräte und Materialien verwendet, die je nach Beschaffenheit

zuvor autoklaviert (121°C, 20 Minuten, 1 bar Überdruck), sterilisiert (trockene Hitze 180°C,

4 Stunden) oder im Falle der Elektroporationsküvetten durch 0,3%ige (v/v) H2O2- Behandlung

und UV-Licht keimfrei gemacht werden.

2.6.1 Antibiotika

Die Antibiotika Ampicillin (Amp.), Kanamycin (Kan.) und Streptomycin (Strep.) werden je

nach vorhandenen Resistenzen zu 100 mg/L (Amp.) und 50 mg/L eingesetzt.

2.6.2 Stammkulturen

Übernacht-Flüssigkulturen (2.6.4.2) von E. coli-Stämmen werden im Verhältnis 1:1 mit Glyce-

rinstock (65% (w/v) Glycerin, 0,1 M MgSO4, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0) gemischt, in flüssigem

Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.

2.6.3 DNA-Transformation

2.6.3.1 Kompetente Zellen

Alle Arbeitsschritte nach dem Zellwachstum finden unter Kühlung statt. Die Zentrifugationsbe-

dingungen sind bei jedem Schritt gleich.

Von einer frischen LB-Agarplatte wird eine Kolonie des plasmidfreien E. coli-Stamms in LB-

Medium überführt und eine Flüssigkultur aerob herangezogen (2.6.4.2). Diese wird zu gleichen

Teilen auf je 500 mL LB-Medium in zwei 2L Erlenmeyerkolben verteilt und bis zu einer OD578

von 0,4-0,5 inkubiert.


25

Die Zellen werden bei 4°C, 5000 UpM, 12 Minuten im SLA1000-Rotor sedimentiert, sofort in

eiskaltem A.d. (ca. 200 mL) resuspendiert und erneut zentrifugiert.

Anschließend wird mit A.d. zweimal gewaschen, zentrifugiert und das Sediment in 30 mL

20% (v/v) Glycerin resuspendiert. Nach der Zentrifugation im SS34-Rotor werden die Zellen in

2 mL 10% Glycerin aufgenommen, in Aliquote von je 50 µL in Eppendorfgefäße verteilt und in

flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung erfolgt bei -80°C. Die kompetenten Zellen

sind ca. 6 Monate haltbar.

2.6.3.2 Elektroporation

1-2 µg Plasmid-DNA (Midipräparation) werden mit 10 µL 10% (v/v) Glycerin versetzt, mit

50 µL kompetenten Zellen vermischt und in die Elektroporationsküvette pipettiert.

Die DNA-Transformation mittels Elektroporation findet mit einem Gene Pulser II (BioRad,

München) bei 2,5 kV, 600 Ω und 25 µFarad statt.

Anschließend werden die Zellen mit 1 mL auf RT vorgewärmten LB-Medium versetzt und

1 Stunde bei 37°C im Inkubationsschüttler (250 UpM) inkubiert. Danach werden 50-100 µl Ali-

quote auf LB-Agarplatten ausgestrichen und bei 37°C ü.N. inkubiert.

2.6.4 Bakterienanzucht

2.6.4.1 Nährboden

Es werden LB-Agarplatten (2.5) verwendet. Ausgehend von einer Stammkultur, bzw. einem

Transformationsansatz wird ein Abstrich oder Aliquot auf dem Nährboden verteilt und ü.N. bei

37°C im Brutschrank inkubiert.

2.6.4.2 Flüssigkultur

Eine Einzelkolonie von einer Agarplatte wird mit der Impföse auf ca. 10 mL LB-Medium in

einem 100 mL Erlenmeyerkolben überimpft und ü.N. im Inkubationsschüttler bei 37°C, 250

UpM inkubiert.

Diese Zellkultur dient als Vorkultur für die weitere Bakterienanzucht.

2.6.4.3 Aerobe Bakterienfermentation des E. coli Stamms BL21 ∆cyo recA-

Ein dem Versuchsansatz entsprechendes Volumen LB-Medium wird mit der Flüssigkultur ver-

setzt und ü.N. bei 30°C, 250 UpM (100 UpM für Schikane-Kolben) im Inkubationsschüttler

inkubiert.


26

2.6.4.4 Aerobe Bakterienfermentation des E. coli Stamms S730

Der Stamm S730 ist u.a. bezüglich der Hämbiosynthese defizient; supplementiert wird diese

Auxotrophie durch den Zusatz von δ-Aminolävulinat. Dieses ist neben seiner unmarkierten 12C-

Form, ebenfalls als spezifisch 13C-markiertes [1-13C]- δ-Aminolävulinat erhältlich. Hierdurch

wird es möglich, spezifisch die Carboxylat-Kohlenstoffatome der Hämpropionate zu markieren.

Der Stamm S730 ist plasmidinstabil, d. h. Cyt bo3 wird nur überexprimiert, wenn von stets

frisch transformierten Zellen ausgegangen wird. Bei der Zellanzucht auf LB-Nährboden sollten

alle vorhandenen Auxotrophien zusätzlich supplementiert werden. Bei der Zellanzucht in LB-

Medium genügt es jedoch, neben den Antibiotika, δ-Aminolävulinat, Thiamin, Adenosin, sowie

Uridin zuzugeben.

Ein 100 µL Aliquot des Transformationsansatzes (2.6.3.2) wird auf dem LB-Nährboden (2.5)

ausplattiert. Der Nährboden enthält neben Strep. und Amp., zusätzlich δ-Aminolävulinat (17

µg/mL), Thiamin (100 µg/mL), die Aminosäuren Tyrosin (200 µg/mL), Phenylalanin (130

µg/mL) und Trypthophan (25 µg/mL). Außerdem werden Uridin (100 µg/mL) und Adenosin

(100 µg/mL) zugesetzt. Die Platte wird für mindestens 36 Stunden bei 37°C im Brutschrank

inkubiert. Danach ist sie für 3-4 Tage bei RT haltbar. Soll 13C-markiertes Häm in der Oxidase

eingebaut werden, wird [1-13C]- δ-Aminolävulinat in die Flüssigkultur zugesetzt.

Von einer Einzelkolonie ausgehend wird eine 50 mL LB-Flüssigkultur im 500 mL Kolben

(2.6.4.2) angesetzt und bei 37°C, 250 UpM ü.N. inkubiert. Anschließend werden 10 ml dieser

Kultur im SE12 Rotor bei 7000 UpM, 5 Minuten, 4°C sedimentiert und auf ihre Farbe hin unter-

sucht. Als Negativkontrolle (weißlich/gräuliche Zellen ohne überexrimiertes Cyt bo3) dient

BL21 ∆cyo recA- pSTAG, als Positivkontrolle BL21 ∆cyo recA- pIN. Nur wenn das Zellsedi-

ment rötlich erscheint, wurde Cyt bo3 überexprimiert.

Die restliche Vorkultur wird gleichmäßig auf zwei 5L Kolben mit Schikanen, in denen sich je

1L LB-Medium befindet verteilt und bei 30°C, 100 UpM für ca. 36 Stunden bis zu einer OD578

von ca. 1,8 inkubiert. Die Konzentration an δ-Aminolävulinat beträgt bei der 2L-Kultur jedoch

nur 12,5 µg/mL. Die Reinigung des Cyt bo3 wird wie unter 2.7 beschrieben durchgeführt.

2.7 Präparation von Proteinen

Proteine können durch Immobilisierte-Metallaffinitätschromatographie (IMAC) gereinigt wer-

den [107]. Das hier verwendete Verfahren, die Cyt bo3 Oxidase mittels Nickel-nitrilotriacetic

acid (NTA)-Agarose (Ni2+-NTA Agarose, Qiagen, Hilden) zu reinigen, ist nach Rumbley et al.,

1995 [59] modifiziert.

Das nachfolgende Protokoll ist für eine vier Liter Kolben-Flüssigkultur geschrieben.


27

2.7.1 Bakterienfermentation

Von dem betreffenden E. coli-Stamm mit Expressionsvektor wird eine 300 mL Vorkultur im 2L

Erlenmeyerkolben aerob angezogen. Die Vorkultur wird auf 4 sterile 5L Erlenmeyerkolben, in

denen sich je 1 L LB-Medium befindet, gleichmäßig verteilt und ü.N. bei 30°C und 100 UpM

aerob bis zu einer OD578 von ca. 4,0 inkubiert.

2.7.2 Präparation der cytoplasmatischen Membranen

Alle Arbeitsschritte erfolgen unter Kühlung.

Die Zellen werden direkt nach dem Wachstum im SLA3000-Rotor bei 5000 UpM für 15 Minu-

ten bei 4°C zentrifugiert. Anschließend wird der Überstand dekantiert, erneut mit Bakteriensus-

pension aufgefüllt und die Sedimentationsschritte so lange wiederholt, bis die gesamte Zellkul-

tur aufgearbeitet ist.

Die Zellsedimente werden mit je 5 mL eiskaltem TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA,

pH 8,0) resuspendiert, mit ca. 500 mL TE-Puffer gewaschen und erneut sedimentiert. Nach wie-

derholter Resuspension erfolgt der Zellaufbruch mit Ultraschall. Hierzu wird die Zellsuspension

in ca. 300 mL TE-Puffer aufgenommen und im Eisbad für ca 1 Stunde 30 Minuten bei output

level 8, 50% duty cycle mit dem Ultraschall-Sonifier beschallt. Die zweimalige Zentrifugation

des Zellysats bei 11.500 UpM, 4°C und 10 Minuten wird mit jeweils frischen Zentrifugenbe-

chern im SS34-Rotor durchgeführt.

Die Überstände werden auf 4-6 Ti 45-Zentrifugenbecher verteilt, falls notwendig mit TE-

Puffer aufgefüllt und bei 40.000 UpM, 4°C für 1 1/2 Stunden in der Ultrazentrifuge zentrifu-

giert. Das rotbraune Membranlipidsediment wird mit 20 mL TE-Puffer im Glashomogenisator

homogenisiert und anschließend in sechs Ti 45-Zentrifugenbecher einer weiteren Ultrazentrifu-

gation für 40 Minuten unterzogen.

Das Lipidsediment wird abschließend in 4-6 mL 10 mM Tris-Cl, pH 8,0 homogenisiert und

bei -20°C eingefroren.

2.7.3 Solubilisierung der Oxidase

50 mg Gesamtmembranprotein (ca. 1 mL der Membranlipidsuspension; nach BCA-

Proteinbestimmung (2.8.2)) werden mit dem Solubilisierungsansatz (1,0 mL 0,5 M KPi, pH 8,0,

1,0 mL 10% Triton-X 100, 2.5 mL 10% n-Octyl-β−D-Glucosid (Bachem Biochemika, Heidel-

berg), 0,75 mL 4 M NaCl, 2,75 mL A.d.) im Ti 70-Zentrifugenbechern vermischt und für 30

Minuten bei RT auf dem Inkubationstaumler inkubiert. Die Zentrifugation findet bei 40.000

UpM bei 4°C für 30 Minuten statt. Die solubilisierte Oxidase befindet sich im Überstand.


28

2.7.4 Immobilisierte Metallaffinitätschromatographie

Pro Solubilisierungsansatz werden 3 mL Ni2+-NTA-Agarose aus dem Vorratsbehälter entnom-

men, mit ca. 30 mL Waschpuffer (50 mM KPi, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (w/v) Natriumcholat)

versetzt und ü.N. bei 4°C äquilibriert. Anschließend wird mit der gleichen Mengen W-Puffer

zweimal gewaschen und die Säule gefüllt.

Der oxidasehaltige Überstand wird bei einer sehr niedrigen Durchflußrate auf die Säule aufge-

tragen (bei 10 mL Überstand ca. 20 Minuten) und mit 6 mL W-Puffer pro aufgetragenem Solu-

bilisierungsansatz gewaschen. Die Proteine, die keine Oligohistidinmodifikation tragen, werden

mit einem Imidazolstufengradienten (6 mL 10 mM Imidazol in W-Puffer; 3 mL 20 mM Imida-

zol in W-Puffer pro Solubilisierungsansatz; im Falle der Reinigung von pIN-Konstrukten erfolgt

ein weiterer Waschritt mit 6 mL 40 mM Imidazol in W-Puffer pro Solubilisierungsansatz) von

der Säule verdrängt. Anschließend wird mit 50 mL 0,3% (w/v) β-DM in W-Puffer das Deter-

genz von Cholat auf ß-DM gewechselt. Die Elution der Oxidase erfolgt mit einer 100 mM Imi-

dazollösung in β-DM-haltigem W-Puffer bzw. bei Oxidasen, die auf pIN basieren mit 150 mM

Imidazol.

2.7.5 Ultrafiltration der Oxidase

Die Elutionsfraktion wird in 2,5-5 mL Portionen in Microsep 30 (Pall Filtron, Dreieich) bei

6000 UpM, 4°C im SS34-Rotor für ca. 2 h konzentriert (Restvolumen ca. 50 µL), dann mit

1 mL 20 mM Tris-Cl, 50 mM NaCl, 0.3% (w/v) β-DM, pH 8.0 (Lagerungspuffer) 1:20 verdünnt

und den gleichen Zentrifugationsbedingungen für etwa 2 ½ Stunden ausgesetzt. Um Messungen

bei unterschiedlichen pH-Werten zu ermöglichen kann der Verdünnungsschritt zweimal mit je

1 mL für den gewünschten pH-Bereich geeigneten Puffersubstanzen durchgeführt werden. Hier-

bei kommen für pH 4-5 Natriumcitrat, pH 5,5-6,5 MES, pH 7-7,5 NaPi und pH 8-9 Tris-Cl zum

Einsatz.

Die Konzentration der Oxidase wird durch ein reduziertes minus oxidiertes Cyt bo3 Differenz-

spektrum bestimmt (2.9.3). Anschließend wird die Konzentration mit Lagerungspuffer, der den

gewünschten pH-Wert aufweist, auf 15 µg/mL oder 30 µg/mL eingestellt. Die Oxidase wird bei

–20°C gelagert.

2.8 Proteinchemische Methoden

2.8.1 Proteinfällung mit Trichloressigsäure

Die zu fällenden Proteinproben werden im Verhältnis 1:10 mit 10% (w/v) TCA vermischt,

1 Minute „gevortext“ und 5 Minuten auf Eis gefällt. Nach Zentrifugation in der Tischzentrifuge


29

(10 Minuten, 13000 UpM) wird der Überstand vollständig abgenommen, so dass keine Restflüs-

sigkeit mehr im Reaktionsgefäß erkennbar ist.

2.8.2 Proteinbestimmung mit Bicinchoninsäure

Die BCA-Lösung stammt von Sigma Chemie, München. Es handelt sich um ein modifiziertes

Protokoll nach Smith et al., 1985 [108].

Für die Proteinbestimmung werden maximal 50 µg TCA (2.8.1) gefälltes Protein pro Ansatz

mit A.d. auf 50 µL Gesamtvolumen gebracht. Nach Zugabe von 20 µL 4% (w/v) Kup-

fer(II)sulfat-Lösung wird 1 mL BCA-Lösung zupipettiert, gemischt und 30 Minuten bei 37°C

unter mehrmaligem Schütteln der Reaktionsgefäße inkubiert.

Aus den Extinktionen bei 562 nm wird im Vergleich zu einer RSA-Eichreihe (0 µg, 10 µg, 20

µg, 30 µg, 40 µg und 50 µg Protein) der Proteingehalt ermittelt.

2.8.3 Proteinbestimmung mit SDS-Lowry

Das Protokoll ist nach Peterson, 1977 [109] modifiziert.

Für die Proteinbestimmung werden 2,5-20 µg Protein pro Ansatz mit A.d. auf 1 mL Gesamtvo-

lumen gebracht. Dann werden 0,1 mL 0,15% (w/v) Natriumdeoxycholat zugegeben, geschüttelt

und 10 Minuten, unter gelegentlichem kippen inkubiert. Es werden 0,1 mL 72%ige (w/v) TCA

zum Ansatz zupipettiert, geschüttelt und das gefällte Protein wird 10 Minuten bei 13.000 UpM

in der Tischzentrifuge sedimentiert. Der Überstand wird entfernt, das Eppendorfreaktionsgefäß

kurz anzentrifugiert und die Restflüssigkeit vollständig entfernt.

Der Niederschlag wird in 0,5 mL A.d. und 0,5 mL Reagenz A aufgenommen und 10 Minuten

unter gelegentlichem Vortexen inkubiert. Anschließend wird 0,1 mL Reagenz B zugesetzt, so-

fort geschüttelt und 30 Minuten bei RT inkubiert.

Aus den Extinktionen bei 750 nm wird im Vergleich zu einer RSA-Eichreihe (0, 2,5 µg, 5,0

µg, 7,5 µg, 10,0 µg, 15,0 µg, 20,0 µg Protein) der Proteingehalt der Proben ermittelt.

Reagenz A:

1 Teil CTC (0,1% (w/v) CuSO4x5H2O, 0,2% (w/v) K+Na+-Tatrat, 10% (w/v) NaCO3) werden

mit 1 Teil 0,8 N NaOH, 1 Teil 10% (w/v) SDS und 1Teil A.d. frisch angesetzt.

Reagenz B:

1 Teil Folin-Ciocalteus-Phenol-Reagenz wird in 1 Teil A.d. aufgenommen.

2.8.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgt in 15%igen diskontinuierlichen,

reduzierenden SDS-Polyacrylamidgelen nach der Methode von Laemmli [110]. Es wird in ei-

nem Probengesamtvolumen von 10-20 µL gearbeitet. Die Proteinprobe wird, falls notwendig


30

mit 10%iger SDS-Lösung auf 5-10 µL aufgefüllt und mit dem selben Volumen Laemmli-

Probenpuffer versetzt. Abgesehen vom low-range Marker entfiel eine 5 minütige Hitzedenatu-

rierung bei 95°C (65°C beim prestained Marker), da die Oxidase im hitzedenaturierten Zustand

nicht mehr ins Trenngel eindringt. Die Gelelektrophorese wird in einem von der Feinmechani-

ker-Werkstatt (Lehrstuhl für Biophysik, RUB) hergestellten Elektrophoresestand bei 80 V

(Sammelgel), 100 V (Trenngel) und 200 mA für ca. 3 ½ Stunden durchgeführt.

Wenn ganze Bakterienzellen mittels SDS-PAGE analysiert werden sollen, wird die Bakterien-

kultur wie unter 2.6.3.2 angezogen, die OD bei 578nm bestimmt und soviel Kulturvolumen ent-

nommen, dass eine Bakterienmenge resultiert, die einer OD578 von 3,0 entspricht. Nach Sedi-

mentation in der Tischzentrifuge (13.000 UpM, 1 Minute) werden die Zellen in 50 µL A.d. re-

suspendiert, mit 50 µL 20% (w/v) SDS lysiert und für 15 Minuten gevortext. Ein 10 µL Aliquot

wird für die weitere Analyse entnommen.

Geldimensionen: Sammelgel: 7 x 3 x 0,12 cm, Trenngel: 7 x 7 x 0,12 cm

Gelzusammensetzung:

Sammelgel: 3,1 mL A.d. 1,25 mL 0,5 M Tris-Cl pH 6,8 25 µL 20% SDS 0,65 mL 30% Acryl/-acrylamid-Stock 25*µL 10% Ammonium-Persulfat (APS) 5* µL TEMED * erst unmittelbar vor dem Gießen zugeben Trenngel: 2,4 mL A.d. 2,5 mL 1,5 M Tris-Cl pH 8,8 50 µL 20% SDS 5,0 mL 30% Acryl/-acrylamid-Stock 25*µL 10% Ammonium-Persulfat (APS) 5* µL TEMED * erst unmittelbar vor dem Gießen zugeben Acrylamid/-acrylamid-Stock: 30 g Acrylamid, 0,8 g N, N-Methylenacrylamid (ad 100 mL A.d.).

Laemmli-Probenpuffer: 20 mL Glycerin, 10 mL 20% SDS, 12,5 mL 0,5 M Tris-Cl pH 6,8,

0,2 mL 0,5% (w/v) Bromphenolblau, 5 mL β−Mercaptoethanol (ad 100 mL A.d.).

Elektrophorese-Puffer 10x: 144 g Glycin (MW 75,07), 30 g Tris, 10 g SDS (ad 1,0 L A.d.), mit

1 M HCl auf pH 8,8.

Nach erfolgter Elektrophorese wird das Trenngel mit einer Coomassie-Färbelösung für 45

Minuten gefärbt und anschließend der Hintergrund mit Entfärbelösung entfärbt.

Coomassie-Färbelösung: 0,25% (w/v) Coomassie Brillant Blau G 250, 50% (v/v) Methanol,

10% (v/v) Essigsäure

Entfärbelösung: 10% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Essigsäure


31

Die Gele werden zur Dokumentation auf Whatmanpapier (3MM Chr) mit dem Geltrockner

(Biometra, , Göttingen; Minidry) bei 85°C und bei einem Unterdruck von ca. 60 mbar für ca.

1 Stunde getrocknet.

2.8.5 Elektrotransfer und Nachweis von Proteinen auf Nitrozellulosemembranen

Die Proteine werden wie unter 2.8.4 beschrieben aufgetrennt. Als Größenstandard wird pre-

stained Marker verwendet. Vom ungefärbten Trenngel werden die Proteine mit einer fast blot-

Apparatur (Biometra, Göttingen) im sogenannten semi-dry-Verfahren [111], bei einer Strom-

stärke von 4,0 mA/cm2 und 600 V über einen Zeitraum von 30 Minuten auf Nitrozellulose-

membran (Schleicher & Schuell, Dassel) übertragen. Hierzu werden alle verwendeten Bestand-

teile (drei Lagen Whatmanpapier (3MM Chr), Nitrozellulosemembran, Gel, drei Lagen What-

manpapier) in Transfer-Puffer (25 mM Tris/HCl pH 8,5, 150 mM Glycin, 10% (v/v) Methanol)

getränkt.

2.8.5.1 Nachweis der Oligohistidinmodifikation

Zum Nachweis der Oligohistidinmodifikation wird ein Ni2+-NTA-Meerrettich-Peroxydase-

Konjugat eingesetzt (Ni2+-NTA-HRP, Qiagen, Hilden). Die Durchführung des Protokolls erfolgt

nach Herstellerangaben.

Die Nitrozellulosemembran wird nach Durchführung des His-tag Nachweises, in digitalisierter

Form dokumentiert und kann unmittelbar danach für den Immunoblot gegen CyoA eingesetzt

werden, wobei eine Blockierzeit von 1 Stunde ausreicht (vergleiche hierzu 2.8.5.2).

2.8.5.2 Immunoblot

Die Nitrocellulosemembran wird nach dem Transfer ü.N. in 40 mL Blocking (BP-) Puffer (10

mM KPi, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,2% (w/v) Triton-X 100, 5,0% (w/v) Magermilchpulver,

0,02% (w/v) NaN3) blockiert. Anschließend erfolgt die immunochemische Identifizierung.

Der primäre Antikörper wird in einer Verdünnung von 1:10.000 in 10 mL BP-Puffer für

1 Stunde zugegeben. Nach viermaligem Waschen mit ca. 30 mL BP-Puffer für je 5 Minuten

erfolgt die Zugabe des sekundären Antikörpers (1:20.000 in 10 mL BP-Puffer) für 45 Minuten.

Der Waschschritt mit BP-Puffer wird zweimal wiederholt und anschließend zweimal für 2 Mi-

nuten mit Alkalische Phosphatase (AP-) Puffer (0,1 M Tris/HCl, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 0,05 M

MgCl2) wiederholt.

Nun folgt die Zugabe des Farbreaktionsgemisches (30 µL BCIP, 45 µL NBT pro 5 mL AP-

Puffer). Sobald die Banden deutlich erkennbar sind, wird die Farbreaktion wird mit A.d. ge-

stoppt.


32

2.8.6 Durochinol-Oxidase-Aktivität

Das Durochinol (2, 3, 5, 6-Tetramethyl-Benzochinol; DQH2) wird modifiziert nach Rothery et

al., 1998 [112] hergestellt. Für die 20 mM DQH2-Stocklösung wird die entsprechende Masse

Durochinon eingewogen und mit dem entsprechenden Volumen 100 mM HCl in EtOH versetzt.

Durch Zugabe einer Spatelspitze gepulvertem, elementarem Zink wird das Durochinon zu

DQH2 reduziert. Nachdem die schwach gelbliche Lösung vollständig farblos ist (ca. 2 Minuten),

wird bei 13.000 UpM für 1 Minute bei RT in der Tischzentrifuge das verbliebene Zinkpulver

sedimentiert und der Überstand lichtgeschützt auf Eis verwahrt.

Die Aktivitätsmessungen werden im Photometer der Fa. Aminco bei RT im Zwei-

Wellenlängen-Modus in Quarzküvetten durchgeführt. Die eingestellten unveränderten Parame-

ter sind: 3,0 nm Bandbreite, eine Zeitkonstante von 50 s*inch-1, Monochromator 1 = 270 nm,

Monochromator 2 = 285 nm und response = medium.

Der Oxidationsprozess des DQH2 wird als Extinktionsänderung bei 270 nm minus 285 nm

(oxidiert minus reduziert) verfolgt. Zur Datenauswertung wird der differenzielle Extinktions-

koeffizient ∆ε270-285 = 19,4 mM-1 zugrunde gelegt [113].

Das Cyt bo3 wird hierbei aus der oxidierten Referenzprobe, deren Konzentration über das Re-

dox-Differenzspektrum (2.9.3) bestimmt ist entnommen. Die Endkonzentrationen in der zur

Aktivitätsbestimmung eingesetzten Substanzen betragen: 0,25 µg/mL Oxidase, 200 µg/mL

α-Phosphatidylcholin und 200 µM DQH2. Als Puffer wird 50 mM KPi, 1 mM EDTA und 0.3%

(w/v) β-DM, pH 7,0 verwendet.

2.8.7 Häm-Analyse

Durch die Häm-Analyse soll qualitativ das Verhältnis von Häm B zu Häm O in den verschiede-

nen Wildtypkonstrukten und deren Mutanten nachgewiesen werden.

2.8.7.1 Häm-Extraktion

Die Häm-Extraktion wird nach Lübben & Morand, 1994 [114] durchgeführt. Hierzu werden

2,5-5 µL der gereinigten Oxidase (2.7.5) in einem 1.5 mL Eppendorfreaktionsgefäß mit 450 µl

95% (v/v) Aceton/konz. HCl versetzt und für 20 Minuten gevortext. Das denaturierte Protein

wird durch Zentrifugation in der Tischzentrifuge (13.000 UpM, RT, 5 Minuten) abgetrennt und

der chromophorhaltige Überstand in ein 2 mL Eppendorfreaktionsgefäß überführt. Nach Zugabe

von 1 ml eiskaltem A.d. und 300 µL Ethylacetat, wird gut durchmischt und erneut unter glei-

chen Bedingungen zentrifugiert. Die Ethylacetatphase wird vorsichtig, ohne wässrigen Anteil


33

abgenommen und eingetrocknet. Die Häme werden anschließend in 1:1 (v/v) Ethylace-

tat/Acetonitril gelöst und können in dieser Form auf die HPLC-Säule aufgetragen werden.

2.8.7.2 HPLC-Analyse

Zur Analyse wird eine HPLC-Anlage (Beckmann, München, System-Gold) mit einer Hypersil-

Säule (Millipore-Waters, Eschborn; Delta Pack 18, 5 µm, 100 Å, 3.9*150 mm) verwendet. Die

Elution der Häme wird bei einer Wellenlänge von 406 nm detektiert. Es wird bei RT und einer

Durchflussrate von 0,3 mL/Minute gearbeitet. Das Absorptionsverhalten wird mit einem Schrei-

ber über 50 Minuten nach Probenauftragung aufgezeichnet. Der zur Analyse verwendete Gra-

dient ist wie folgt programmiert:

Gradient von 0% bis 30% Acetonitril 10 Minuten Gradient von 30% bis 70% Acetonitril 10 Minuten Gradient von 70% bis 100% Acetonitril 25 Minuten 100% Acetonitril 5 Minuten Gradient von 100% bis 0% Acetonitril 10 Minuten 0% Acetonitril 5 Minuten

2.9 VIS-Spektroskopie 2.9.1 Absolutspektren

Die Aufnahme der Absolutspektren dient einerseits zur Ermittlung des Absorptionsverhaltens

von Cyt bo3-Proben für die VIS-spektroskopische Charakterisierung und wird hierbei am Pho-

tometer der Fa. Aminco durchgeführt. Andererseits wird sie zur Verifizierung der vollständigen

Reduktion der Oxidasenprobe nach abgeschlossener FT-IR Messung benötigt und wird in die-

sem Falle am Diodenarray ermittelt.

Die Spektrenaufzeichnung am Doppelstrahl-Photometer der Fa. Aminco findet im Ein-

Wellenlängen-Modus statt. Die am Photometer eingestellten unveränderten Parameter sind: 3,0

nm Bandbreite, 1 nm/Sekunde Schreibervorschub und response = medium.

Die Messungen erfolgen bei RT. Der gewählte Wellenlängenbereich liegt zwischen 400-650

nm. Etwa 150 µg oxidierte und gereinigte Oxidase (2.7.5) wird mit Puffer (50 mM KPi, pH 7,0,

1 mM EDTA, 0,3% (w/v) β-DM) auf 1,0 mL Gesamtvolumen gebracht und in eine Quarzküvet-

te pipettiert. Als Referenz wird eine Quarzküvette mit Puffer gefüllt. Anschließend beginnt die

Spektrenaufnahme der oxidierten Probe. Danach werden einige Körnchen Natriumdithionit zur

Probe gegeben. Das reduzierte Cyt bo3 Absolutspektrum wird nach 10 Minuten aufgezeichnet.

Zur Aufnahme des CO-Absolutspektrums wird die reduzierte Probe, wie unter 2.9.2 beschrieben

mit CO begast und anschließend ein Spektrum erstellt.


34

Die Messungen der Absolutspektren der FT-IR Proben erfolgen am Diodenarray (EG&G-

Reticon, Olching). Die Datenaufzeichnung und -auswertung wird mit Hilfe des von H. Cho-

rogniewski geschriebenen Programm „Spektro“ ermöglicht. Es können Spektren zeitgleich im

Bereich von 380-1000 nm mit einer Auflösung von ca. 2,5 nm und im Abstand von maximal

1 ms aufgenommen werden. Als Lichtquelle dient eine Halogenlampe (Farnell Electronic Com-

ponents GmbH, Deisendorf).


nm. Die Probe wird, wie unter 2.10.1 beschrieben präpariert und ein Absolutspektrum sowohl

vor (oxidiert), als auch nach (reduziert) der FT-IR Messung aufgenommen. Als Referenz wird

ein Spektrum der IR-Küvette ohne Proteinprobe aufgezeichnet. Zur Spektrenaufnahme werden

100 Spektren im Abstand von 100 ms aufgenommen und gemittelt. Darüber hinaus wird ein

CO-Rekombinationsspektrum angefertigt (2.9.2), um eine etwaige, ungewünschte CO-

Freisetzung während der (Auto-) Photoreduktions-reaktion zu dokumentieren.

2.9.2 Kohlenmonoxid-Rekombinationsspektren

Ca. 150 µg gereinigte Oxidase (2.7.5) wird mit Puffer (50 mM KPi, pH 7,0, 1 mM EDTA, 0,3%

(w/v) β-DM) auf 1,0 mL Gesamtvolumen gebracht, einige Körnchen Natriumdithionit zugege-

ben und für 10 Minuten reduziert. Die Probe wird in einer gasdicht verschließbaren Quarzküvet-

te mit Kohlenmonoxid für 2,5 Minuten begast. Anschließend beginnt die Spektrenaufnahme.

Die Messungen erfolgen am Diodenarray (2.9.1). Zur Photolyse des Kohlenmonoxids wird ein

intensiver Lichtblitz einer Blitzlichtlampe (Farnell Electronic Components GmbH, Deisendorf)

verwendet. Bei den CO-Relaxationsspektren werden 100 Spektren nach einem intensiven Licht-

blitz im Abstand von einer 1 ms aufgenommen. Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern

wird diese Messung im zeitlichen Abstand von ca. 2 Sekunden 100fach wiederholt und gemit-

telt. Der erste Datensatz (vor dem Lichtblitz) dient als Referenz, der von den übrigen Datensät-

zen abgezogen wird. Das erste resultierende gemittelte Differenzspektrum kann nicht ausgewer-

tet werden, da die Dioden des Diodenarrays durch die intensive Lichteinstrahlung des Blitzes

noch übersättigt sind.

2.9.3 Reduziertes minus oxidiertes Cyt bo3 Raumtemperatur (RT)-Differenzspektrum

Die Messungen erfolgen im Doppelstrahl-Photometer der Fa. Aminco im Ein-Wellenlängen-

Modus. Die am Photometer eingestellten unveränderten Parameter sind: 3,0 nm Bandbreite,

1 nm*s-1 Schreibervorschub und response = medium.


nm, die Vergrößerung schließt 515-590 nm ein. Die Konzentrationsbestimmung der Oxidase


35

beruht auf dem differenziellen Extinktionskoeffizienten von ∆ε560−580 = 18,7 mM-1 [51]. Das

hierbei zugrunde gelegte Molekulargewicht des Cyt bo3 liegt bei 142.000 Da [49].

Zwei bis fünf µL oxidierte, konzentrierte und gereinigte Oxidase (2.7.5) werden mit Puffer (50

mM KPi, pH 7,0, 1 mM EDTA, 0,3% (w/v) β-DM) auf 2,0 mL Gesamtvolumen gebracht und

auf zwei Quarzküvetten verteilt. Zu der einen Probe werden einige Körnchen Natriumdithionit

gegeben und für 10 Minuten reduziert, die unbehandelte Probe dient als Referenz. Anschließend

beginnt die Spektrenaufnahme.

2.9.4 Reduziertes minus oxidiertes Cyt bo3 Tieftemperatur-Differenzspektrum

Die Messungen erfolgen im Spektrometer der Fa. Aminco bei gleichen Messparametern wie

unter 2.9.3 beschrieben. Im Unterschied zu diesen wird bei 77 Kelvin (K) gemessen. Hierzu

wird eine spezielle Küvette, die in flüssigen Stickstoff getaucht wird verwendet.

Acht µL oxidierte, konzentrierte und gereinigte Oxidase (2.7.5) wird mit Puffer (50 mM KPi,

1 mM EDTA, 0,3% (w/v) β-DM, pH 7,0) auf 1,0 mL Gesamtvolumen gebracht und zu je 500

µL Portionen in die Tieftemperaturküvette gefüllt. Zu der einen Probe werden zuvor einige

Körnchen Natriumdithionit gegeben und für 10 Minuten bei RT reduziert. Anschließend beginnt

die Spektrenaufnahme.

2.10 FT-IR Spektroskopie

Für die FT-IR Spektroskopie wird ein Infrarot-Spektrometer (IFS) (Bruker, Karlsruhe, IFS

66vs) mit stickstoffgekühltem, hochempfindlichem HgCdTe (MCT) Detektor verwendet. Um

den einwandfreien Betrieb, sowie ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit der Probenmessungen

zu gewährleisten, befindet sich der gesamte Spektrometeraufbau im klimatisiertem Raum. Da

die Aufnahme von Differenzspektren sehr erschütterungs-empfindlich ist, ruht das Spektrometer

auf einer Marmorplatte in einem Sandbett. Der tragende Tisch ist speziell von Schwingungen

des Estrichs entkoppelt. Der für die Oxidasemessung besonders interessante Wellenzahlbereich

liegt zwischen 2600-900 cm-1. Um möglichst hohe IR-Intensitäten zu gewährleisten, d. h. mit

weit geöffneter Blende arbeiten zu können wird daher ein dielektrisch beschichteter Kantenfilter

(OCLI) für 2600 cm-1 mit 2 cm-1 Auflösung vor den Detektor gesetzt. Ebenfalls kam ein 1950

cm-1 Kantenfilter mit 2 cm-1 Auflösung zum Einsatz. Die Probenkammer (Eigenanfertigung am

Lehrstuhl) des Spektrometers wird, um Rauschsignale der Wasserdampf-, sowie der CO2-

Banden der Luft zu unterdrücken, mit vorgetrockneter und mit einem CO2-Abscheider aufberei-

teten Luft durchspült. Die gesamte restliche Optik ist durch eine Öldiffusionspumpe bis zu

5 mbar evakuierbar.


36

Ein wassergekühlter Globar aus Siliziumcarbid dient als Strahlungsquelle im mittleren Infra-

rot. Der Strahlteiler besteht aus einem KBr-Kristall. Der bewegliche Spiegel erlaubt Modulati-

onsfrequenzen von 1,6-320 kHz. Bei den Oxidasemessungen wird dieser über die

Modulationsfrequenzen des HeNe-Lasers standardisiert bei 100 kHz betrieben.

Die IR-Proben befinden sich zwischen zwei runden Calciumfluorid-Fenstern mit einem

Durchmesser von 20 mm und einer Dicke von 2 mm (Korth-Kristalle. Kiel), die in einer in der

Lehrstuhlwerkstatt gefertigten IR-Küvette (Messinggehäuse) eingepasst werden. Die IR-Küvette

wird in den Messingprobenhalter des Spektrometers, der über einen Kryostaten R-6 (Lauda,

Königshofen) bis zu –30°C ±0.1°C temperierbar ist, gestellt. Die Temperatur des Probenhalter

kann mittels eines Thermoelements abgegriffen werden.

Zur Photolyse der caged electrons (FMN-EDTA-Lösung) [81] wird das vom IR-Anteil redu-

zierte Licht einer Halogenlampe benutzt. Zur Auto-Photoreduktion der Oxidase wird IR-

reduziertes Licht einer Xenon-Bogenlampe (L21195 super quiet, Fa. Hamamatsu; 66001 Ge-

häuse und 68805 Netzgerät, Fa. Oriel) verwendet.

Die Datenaufnahme und -verarbeitung erfolgt mittels eines PC mit der Spektoskopie-Software

OPUS (Bruker, Karlsruhe). Über den PC wird ebenfalls die Lichtquelle gesteuert, die zur Photo-

lyse bzw. Auto-Photoreduktion benutzt wird.

2.10.1 Probenpräparation

Zur Probenpräparation wird eine in der Glasbläserei und Lehrstuhlwerkstatt der RUB hergestell-

te Gasaustauschzelle verwendet (Abb. 3.3.1).

37,5-75 µg gereinigter Oxidase (2.7.5) werden auf ein am Rand mit Apiezonfett (Bayer, Le-

verkusen) bestrichenes Calciumfluorid-Fenster, zur besseren Probenplatzierung mit zentrischen

Nut (∅ 8 mm), aufgebracht und zu einem Film von 4-5 mm verteilt. Dabei ist darauf zu achten,

dass weniger als 2,5 µL Oxidase kaum ausreichen um diese Fläche zu erreichen. Bei Probenvo-

lumina die größer als 5,0 µL sind kommt es gewöhnlich bei angelegtem Vakuum zur irreversib-

len Blasenbildung, die einen homogenen Probenfilm zerstört. Da bei deuterierten Proben die

zusätzliche Absorption der γ(H2O) Scherschwingung des Wassers (um 1645 cm-1, additiv zur

Amid I-Bande; siehe 2.10.3.2) fehlt, kann ca. 1/3 mehr Protein bei gleichbleibender Transmissi-

on der Amid I-Bande eingesetzt werden. Bei Verwendung von caged electrons als Reduktions-

mittel, wird 0,5 µL 0,5 mM Flavinmononukleotid (FMN), 100 mM EDTA - pH-Wert entspre-

chend der Probe - zum Protein beigemischt. Hierbei sollte, um eine vorzeitige Photolyse des

caged compounds, zu vermeiden unter Rotlicht gearbeitet werden. Im Falle der Auto-

Photoreduktionsproben werden keine caged compounds benötigt [85].


37

Das Calciumfluorid-Fenster wird in den Probenhalter, der zuvor mit entgastem Wasser bzw.

Deuteriumoxid befüllt wurde, eingelegt. Der Deckel der Gasaustauschzelle, in dessen Stempel-

konstruktion sich das zweite Calciumfluorid-Fenster befindet, wird luftdicht verschlossen. Die

Probe wird bei einem Unterdruck von ca. 50 mbar für 3-5 Minuten vollständig eingetrocknet

und zum Rehydrieren, bei geschlossenen Auslasshahn für 1,5-3 Minuten in der Zelle belassen.

Wenn deuterierte Proben erstellt werden, wird diese Prozedur ein weiteres Mal wiederholt.

Nachdem das zweite Calciumfluorid-Fenster aufgebracht ist, ist die Probe gasdicht verschlossen

und kann in die IR-Küvette eingebaut werden. Die zwischen den beiden Fenstern entstandene

homogene Probe ist ca. 5 µm dick [81]. Die Lagerung findet unter Lichtausschluss bei 4°C statt.

Erfahrungsgemäß sollte die Probe mindestens 48 Stunden vor der Messung präpariert werden.

2.10.2 Messparameter

Für die IR-Messungen wird eine Auflösung von 2 cm-1 und eine Scannergeschwindigkeit von 11

(100 kHz) gewählt. Die eingestellte Blende, in Abhängigkeit vom gewählten Kantenfilter und

Probe, liegt zwischen 2-3,5 mm, d. h. die angegebenen Signalintensitäten (ADC-Counts) liegen

zwischen 20.000 und 27.000. Die Probenmessungen erfolgen im Rapid-Scan-Modus, d. h. um

eine hohe Zeitauflösung zu erreichen, werden die Interferogramme zuerst im Paket aufgenom-

men und anschließend berechnet. Zu den Details des FT-IR Messprogramms siehe Tab. 2.10.1.

Tab. 2.10.1: Übersicht der zur (Auto-)Photoreduktion verwendeten FT-IR Messprogramme. Messbefehl Halogenlampe

(Photoreduktion) Xenon-Bogenlampe (Auto-Photoreduktion)

Messen, Puffer #1 1200 scans 1200 scans Schleife 1 beginnen 20 beginnen 20 Schleife 2 beginnen 8 E/A-Bit setzten (1. Impuls: Lampe ein) 3 oben 3 oben Warten 1 ms 1 ms E/A-Bit setzten 3 unten 3 unten Warten 20.000 ms 20.000 ms E/A-Bit setzten (2. Impuls: Lampe aus) 3 oben 3 oben Warten 1 ms 1 ms E/A-Bit setzten 3 unten 3 unten Warten 1000 ms 4000 ms Schleife 2 Beenden Warten (Abkühlen der Lampe) 6000 ms Messen 400 scans 400 scans Schleife 1 beenden beenden

Als Akquisitionsmodus wird Single Sided, Forward-Backward gewählt. Die Phasen-korrektur

wird mit der Mertz-Funktion durchgeführt, wobei die Phasenauflösung 32 cm-1 beträgt. Die

Beckmann-Harris-3-Term-Funktion wird als Apodisationsfunktion verwendet. Faktor zwei wird


38

beim Zerofilling benutzt. Um Rückfaltungen von Intensitäten im Spektrum zu vermeiden, wird

die maximale Faltungsgrenze 15.000-800 cm-1 gewählt.

2.10.3 Probenmessung 2.10.3.1 Vorarbeiten

Der MCT-Detektor wird mit flüssigem Stickstoff befüllt und weist ca. 2 Stunden danach keine

Basisliniendrift mehr auf. Er kann für ca. 18 Stunden, bis zum erneuten Nachfüllen, genutzt

werden. Ist nach ca. einer Woche ununterbrochner Kühlung keine stabile Basislinie mehr zu

erreichen, so muss der Detektor „aufgetaut“ werden (vermutlich wird die Temperaturdrift des

Detektors durch die Diffusion und Anreicherung von O2 im flüssigen Stickstoff ausgelöst).

Nachdem die Probe in den Probenhalter des FT-IR Spektrometers eingebracht ist, wird sie zur

weiteren Äquilibrierung für mindestens 7 Stunden erschütterungsfrei in diesem belassen. Am

Kryostaten wird eine Temperatur von 0,7°C eingestellt. Dies entspricht einer Probenhalter-

Temperatur von 2°C (Thermoelement) und 4°C an den Calciumfluorid-Fenstern der Probe (die

genannten Werte haben sich als erfolgreich erwiesen und sind als Anhaltspunkte zu verstehen).

Um die Halogenlampe (Abstand vom Lichteinlass am Spektrometer 30 cm), als auch die

Blende (Eigenbau am Lehrstuhl für Biophysik) für die Xenon-Bogenlampe entsprechend dem

Messprogramm auszulösen, müssen diese extern durch ein BNC-Kabel mit dem Spektrometer

und damit mit dem PC verbunden werden. Die Halogenlampe und die Blende werden durch

einen Spannungsgeber bei 11 V bzw. 20 V betrieben. Der IR-Anteil des emittierten Lichts der

Halogenlampe wird durch zwei Kaltglasfilter-50 reduziert. Die Xenon-Bogenlampe benötigt

einen Spannungsgeber, der 5 A Stromstärke zur Verfügung stellt. Der Messaufbau zur lichtin-

duzierten Reduktion der Oxidase mittels Xenon-Bogenlampe ist in Abb. 2.10.1 dargestellt.

Abb. 2.10.1: Schematischer Aufbau zur Auto-Photoreduktion mittels Xenon-Bogenlampe. Die Abb. wurde nach K. Bettinger modifiziert.


39

Das emittierte Licht der Xenon-Bogenlampe wird über ein Quarzprisma im 90° Winkel in die

Probenkammer geleitet. Der Lichtstrahl kann direkt an der Lampe fokussiert werden. Er wird

dabei so eingestellt, dass das Quarzprisma vollständig ausgeleuchtet ist. Der IR-Anteil wird

hierbei durch einen in der Lehrstuhlwerkstatt gefertigten Wasserfilter reduziert.

2.10.3.2 Einkanalspektren

Der Durchmesser des vom Globar emittierten IR-Strahls kann über (Loch-) Blenden gewählt

werden und muss kleiner als der Durchmesser der IR-Probe sein, um die tatsächlich absorbierte

Strahlung der Probe zu ermitteln. Hierzu werden unterschiedliche Blenden, deren Signalintensi-

täten unterhalb von 27.000 ADC-Counts liegen, um eine Übersättigung des Detektors zu ver-

meiden, benutzt und Einkanalspektren erstellt. (Das Einkanalspektrum ist nach Abzug des Emis-

sionsspektrum der IR-Quelle auch als Transmissionsspektrum zu interpretieren. Daher kann von

Transmissionsbanden im Einkanalspektrum gesprochen werden.) Diese werden auf eine Signal-

intensität eines der Spektren vergrößert bzw. verkleinert. Nur bei vollständiger Deckung der

Spektren kann die größtmögliche Blende für die weitere Messung verwendet werden. Abwei-

chungen hiervon werden als Inhomogenität der belichteten Probenfläche interpretiert.

Für die Übersichtsspektren werden 100 Interferogramme aufgenommen und gemittelt. Sie

werden bei wässrigen Proben von 2600-800 cm-1, im Falle der deuterierten Proben ohne Filter

im Bereich von 4000-800 cm-1 aufgenommen. Das Verhältnis der ν(H2O) OH-

Streckschwingung der Wasserbande (um 3400 nm-1) zur ν(D2O) OD-Streckschwingung der

Bande des Deuteriumoxids (um 2500 nm-1) dient hierbei als Qualitätskontrolle für den erfolgten

H2O/D2O Austausch (H/D Austausch).

In Abhängigkeit des zu analysierenden Wellenzahlenbereichs, 1900-1680 cm-1 für caged

electron-Proben und 2200-1100 cm-1 für Auto-Photoreduktionsproben, wird als Qualitätskon-

trolle der Probe die Resttransmission (IR-Durchlässigkeit) der Amid I-Bande in Prozent genutzt.

Diese berechnet sich nach der höchsten Transmission (100%, um 1950 cm-1) und der Amid I-

Banden Transmission (um 1650 cm-1). Die hier als Amid I bezeichnete Bande setzt sich bei

wässrigen Proben im Wesentlichen aus der Absorption der C=O Streckschwingung der Peptid-

bindung und der γ(H2O) Scherschwingung des Wassers zusammen. Bei deuterierten Proben liegt

die γ(D2O) Scherschwinung des Deuteriumoxids um 1215 cm-1 und trägt nicht zur Absorption

um 1650 cm-1 bei. Bei den FMN-EDTA-Proben sollte die Resttransmission mindestens zwi-

schen 1% und 2% liegen, im Falle der Auto-Photoreduktionsproben müssen Werte von 4%-8%

erreicht werden.


40

2.10.3.3 Differenzspektren

Da selbst die größten gemessenen Extinktionsänderungen (um 4,5 mOD) in den Differenzspekt-

ren sehr klein -gemessen an den Absolutabsorptionen des Proteins (Abb. 1.5.2)- sind, ist eine

größtmögliche Probenstabilität unabdingbar. Um diese zu überprüfen, werden 6 Basislinien aus

je 400 gemittelten Interferogrammen im Abstand von 5 Minuten aufgenommen. Von diesen

wird jeweils dasselbe Leerkanalspektrum subtrahiert, das sich ebenfalls aus 400 gemittelten In-

terferogrammen zusammensetzt. Bei einer eingestellten Gesamtextinktion von ±0,5 mOD im

Bereich von 1900-1200 cm-1 dürfen nur geringe Basislinienveränderungen erkennbar sein. Diese

aufgezeichneten Basislinien dienen ebenfalls als Referenz für das Hintergrundrauschen der Dif-

ferenzspektren.

Das jeweils zur Spektrenaufnahme benutzte Rapid-Scan-Messprogramm, abhängig von der

zur (Auto-) Photoreduktion verwendeten Lichtquelle, ist in Tab. 2.10.1 unter 2.10.2 dargestellt.

Die Aufnahme der reduzierten minus oxidierten (nach Belichtung minus vor Belichtung) Dif-

ferenzspektren erfolgt zwischen 2600 cm-1 bzw. 1950 cm-1-900 cm-1. Es werden 20 Differenz-

spektren bei allen Proben erstellt und die letzten fünf Spektren gemittelt. In allen Fällen ent-

spricht dies einer vollständigen Reduktion der Oxidase. Diese wurde zusätzlich durch VIS-

Absolutspektren vor und nach der IR-Messung am Diodenarray verifiziert (2.9.1). Ob es eben-

falls zu einer CO-Freisetzung während der Reduktion gekommen ist, wird durch ein CO-

Rekombinationsspektrum (2.9.2) zusätzlich bestimmt.

2.10.3.4 Datenauswertung

Bei den caged electron Proben dauert die Aufnahme des Gesamtdatensatzes ca. 30 Minuten und

stellt kein Problem in Bezug auf Basislinienverschiebungen dar. Die Messung mit der Xenon-

Bogenlampe hingegen benötigt ca. 2 Stunden. Über einen so langen Zeitraum weisen die Spekt-

ren eine unterschiedlich starke Basisliniendrift auf. Da sich diese jedoch nahezu linear verhält,

kann sie durch manuelle Subtraktion einer Ausgleichsgeraden aus den Spektren entfernt werden.

Um diese innerhalb des Spektrums festzulegen werden 3 Datenpunkte bei 2000 cm-1, 1760 cm-1

und 1250 cm-1 gesetzt [85].

Trotz hoher Sorgfalt und akribisch genauer Durchführung der Probenpräparation, ist es nicht

möglich, dass eine FT-IR Probe der anderen aufs Haar gleicht. Hierdurch kommt es zu leichten

Varianzen der Differenz-/Signalintensitäten. Diese müssen, um die Spektren untereinander ver-

gleichen zu können aufeinander skaliert werden. Als Bezugspunkt wird hierbei die Differenz-

bande bei 1696/1691 cm-1 benutzt. Sie wird in der Regel auf eine Gesamtextinktion von 0,75

mOD berechnet.

41

3. Ergebnisse

3.1 Erstellung eines C-terminal von Untereinheit II nicht prozessierten Wild-

typs von Cyt bo3

In diesem Unterpunkt wird die Erstellung einer neuen Cyt bo3 Wildtypvariante vorgestellt. Die

als pIN-Wildtyp bezeichnet Oxidase wird auf ihre biochemischen und VIS-spektroskopischen

Eigenschaften untersucht. Die Neukonstruktion dieser Wildtypvariante ist aus dreierlei Hinsicht

notwendig: (I) Der bisher verwendete Wildtyp (pHCL-Wildtyp) weist am C-Terminus von Un-

tereinheit II eine Oligohistidinmodifikation zur Proteinreinigung auf. Diese wird posttranslatio-

nal mit weiteren C-terminalen Aminosäuren in hohem Ausmaß proteolytisch in E. coli abgespal-

ten. Hierdurch treten Proteinverluste und/oder Fremdproteinverunreinigungen der Oxidase bei

der Reinigung auf. (II) Durch diese Instabilität des C-Terminus kann eine Überexpression vom

Plasmid nur in einem sonst Cyt bo3 defizienten E. coli Stamm vorgenommen werden. Somit ist

beispielsweise eine spezifische [1-13C]-Markierung der Hämpropionate vom Wildtyp bzw. Cyt

bo3-Mutanten ohne vorherige Deletion des genomischen cyo-Operons nicht möglich. (III) Cyt

bo3-Mutanten, die eine niedrige Expressionsrate aufweisen, können in nur sehr begrenzter Aus-

beute bei Verlust der Oligohistidinmodifikation erhalten werden.

3.1.1 C-terminale Proteolyse

Das Cyt bo3 von E. coli wird posttranslational vielfach modifiziert [49; 115]. Bei dem Protein

handelt sich um einen Enzymkomplex, der aus vier Untereinheiten (MW: UE I 74 kDa; UE II 33

kDa; UE III 22.5 kDa; UE IV 13 kDa) besteht. Untereinheit II (CyoA) der Oxidase erscheint bei

der elektrophoretischen Auftrennung in SDS-Gelen zumeist als Doppelbande (z. B. Abb. 3.1.3,

Spur 1 und 3). Es konnte gezeigt werden, dass sich diese beiden Polypeptidketten C-terminal

durch die proteolytische Abspaltung eines Hexapeptids unterscheiden [49].

Zur homologen Überexpression des Cyt bo3 in E. coli wird u.a. ein als pHCL bezeichnetes

Plasmid verwendet1 [59]. Dieses Konstrukt kodiert für ein wildtypisches Cyt bo3, das C-terminal

an Untereinheit II um acht Histidine (His-tag) und ein Arginin verlängert ist. Hierdurch ist es

möglich, die Oxidase mittels Ni2+-NTA-Agarose zu reinigen [59].

Darüber hinaus ist es möglich das Cyt bo3 auch in Abwesenheit des His-tag durch eine Metallaf-

finitätschromatographie zu reinigen [49; 116]. Somit kann sowohl das C-terminal an Unterein- 1 Die zur Überexpression in E. coli benutzten Plasmid-Konstrukte (Derivate des pBR322-Vektors) tragen dieselbe Abkürzung wie die Wildtyp- und Mutantenproteine. Daher wird im Folgenden in „Plasmid“, z. B. pIN-Plasmid und in die vom Plasmid kodierten „Wildtyp-“ bzw. „Mutanten“-Proteine, z.B. pIN-Wildtyp unterschieden.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

42

heit II prozessierte Protein des pHCL-Wildtyps, als auch ein Cyt bo3 ohne His-tag Modifikation

(kodiert vom pMC39-Plasmid) erhalten werden. In diesen Fällen müssen jedoch Fremdprotein-

verunreinigungen und Oxidaseverluste während des 20 mM Imidazol-Waschschritts in Kauf

genommen werden (Abb. 3.1.4 und Abb. 3.1.5).

Das Ausmaß der C-terminalen Proteolyse ist abhängig von den Wachstumsbedingungen und

Alterungsprozessen der Bakterienzellen. Je nach gewählter Temperatur kann der Verlust des

C-Terminus teilweise oder vollständig sein (Abb. 3.1.1). Da die Zellausbeuten bei einer Tempe-

ratur von 42°C drastisch sinken, werden die Bakterien im Weiteren, wenn nicht anders ver-

merkt, bei 30°C, ü.N. bei 100 UpM fermentiert. Durch die lange Inkubationszeit von 15-17

Stunden weist der pHCL-Wildtyp meist keine Oligohistidinmodifikation mehr auf. Um Oxida-

semoleküle zu erhalten, die den His-tag zumindest zum Teil besitzen, werden Inkubationszeiten

von 7-8 Stunden benötigt (vergleiche Abb. 3.1.3 Spur 1 mit Abb. 3.1.5 Spur 4), d.h. die Zellen

befinden sich in der mittleren-logarithmischen Wachstumsphase. Dies führt jedoch zu erniedrig-

ten Zell- und damit zu geringeren Proteinausbeuten. Darüber hinaus kann der C-Terminus wäh-

rend des Zellaufbruchs mit Ultraschall abgespalten werden (Daten nicht gezeigt) [59].

Abb. 3.1.1: Immunoblot gegen CyoA (2.8.5.2) zur temperaturabhängigen C-terminalen Proteolyse von Unterein-heit II. Es wurden ganze Zellen auf das zum Proteintransfer verwendete 15% SDS-Gel aufgetragen. Cyt bo3 wurde ausgehend vom pHCL-Plasmid in BL21 ∆cyo recA- überexprimiert. Die Bakterien wurden bei unterschiedlichen Temperaturen und 100 UpM ü.N. fermentiert. Die dominierenden Banden weisen keine Oligohistidinmodifikation mehr auf. Spur 1: 30°C, Spur 2: 37°C, Spur 3: 42°C. Da die Spaltungsstelle der C-terminalen Proteolyse in Untereinheit II genau bekannt ist, wer-

den die unmittelbar benachbarten Aminosäuren mittels ortsspezifischer Mutagenese ausge-

tauscht und das resultierende Protein untersucht. Als template-DNA für die Mutagenese wird

das pHCL-Plasmid verwendet. In Abb. 3.1.2 sind diese Ergebnisse in Form eines Immunoblots

gegen CyoA (2.8.5.2) dargestellt.

Es stellt sich heraus, dass ein Aminosäureaustausch des Ser-309 zu Ala, des His-310 zu Arg

und die entsprechende Doppelmutante zu einem Abbau der Untereinheit II und damit zu keiner

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

43

Überexpression der Oxidase führen (Abb. 3.1.2, Spur 3, 4 und 5). Durch die proteolytische De-

gradation der II H310N-, II S309A- und II S309A/H310N-Mutanten zeigt sich, dass der Amino-

säuresequenz am C-Terminus von Untereinheit II eine wichtige regulative und physiologische

Bedeutung zukommen könnte.2

Abb. 3.1.2: Immunoblot zur Mutationsanalyse der C-terminalen Proteolyse an Untereinheit II. Es wurden ganze Zellen auf das zum Proteintransfer verwendete 15% SDS-Gel aufgetragen. Spur 1: pIN-Wildtyp, Spur 2: pHCL-Wildtyp, Spur 3: II S309A-Mutante, Spur 4: II H310N-Mutante, Spur 5: II S309A/H310N-Mutante. Bei einem weiteren Mutationsexperiment werden sechs Histidine, bei gleichzeitiger Deletion der

drei zur Spaltungsstelle benachbarten Aminosäuren Met, Asp und Met inseriert. Als template-

DNA für die Mutagenese dient das Plasmid pMC39. Der erhaltene Expressionsvektor wird als

pIN-Plasmid bezeichnet. Nach Transformation vom pIN-Plasmid in E. coli wird Cyt bo3 ohne

C-terminale Proteolyse an Untereinheit II überexprimiert, d.h. es kann eine Oxidase mit His-tag

gereinigt werden (Abb. 3.1.3 Spur 2). Eine Abspaltung des C-Terminus ist im Gegensatz zum

pHCL-Wildtyp beim Zellaufbruch mit Ultraschall nicht zu beobachten.

In der Abbildung ist deutlich zu sehen, dass der pIN-Wildtyp (Spur 2) eine Untereinheit II

aufweist, die nur aus einer Proteinbande besteht. Diese Bande zeigt ebenfalls durch das positive

Signal beim His-tag Nachweis (2.8.5.1, Abb. 3.1.3 rechte Darstellung), dass eine Oligohistidin-

modifikation am Protein vorhanden ist. Der pHCL-Wildtyp (Spur 1) weist im Gegensatz dazu

im SDS-Gel und im Immunoblot eine Doppelbande auf. Beim His-tag Nachweis reagiert jedoch

nur die schwerere Bande mit den Farbreaktionssubstanzen. Somit kann die untere Bande immu-

nochemisch CyoA zugeordnet werden, bei fehlendem His-tag [49]. Im Vergleich zur unteren

Bande der Untereinheit II vom pMC39-Wildtyp (Spur 3) weisen beide die gleiche Laufhöhe auf.

2 Bei ortsspezifischen Mutanten wird die ausgetauschte Aminosäure unter Positionsangabe der Cyt bo3-Aminosäuresequenz bezeichnet, z.B. II H309A (pHCL). Die Ziffer „II“ bezeichnet hierbei die Untereinheit in der die Mutation eingefügt wurde. Die Angabe in Klammern ist auf das zugrundeliegende Plasmid-Konstrukt bezogen und wird nur beim erstmaligen Erwähnen oder wenn eine Unterscheidung notwendig ist, gemacht. Bei Mutanten in der katalytischen Untereinheit I wird auf die Darstellung der Ziffer „I“ verzichtet.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

44

Der unteren Bande vom pHCL-Wildtyp fehlen also zusätzlich die letzten sechs C-terminalen

Aminosäuren von Untereinheit II.

Abb. 3.1.3: Bandenzuordnung von Untereinheit II der verschiedenen Cyt bo3-Wildtypen. Es wurden gereinigte Oxidasen auf das 15% SDS-Gel aufgetragen. Für den Gelteil der Coomassie-gefärbt (SDS-Gel) wurde, wurden je 10 µg gereinigtes Protein, für den anderen (His -tag Nachweis und Immunoblot) je 2.5 µg Enzym aufgetragen. Spur 1: pHCL-Wildtyp (Zellen wurden für 7h fermentiert), Spur 2: pIN-Wildtyp, Spur 3: pMC39-Wildtyp.

Der pMC39-Wildtyp, der keine Oligohistidinmodifikation trägt, erscheint im SDS-Gel und im

Immunoblot ebenfalls als Doppelbande und zeigt kein Signal beim His-tag Nachweis.

3.1.2 Fermentation, Proteinreinigung und biochemische Charakterisierung

Der pHCL-Wildtyp und der Genom-Wildtyp zeigen große Ähnlichkeit bei der biochemischen

und VIS-spektroskopischen Charakterisierung [49; 59]. Der pIN-Wildtyp soll nun damit vergli-

chen werden. Im Folgenden werden das Fermentations- und Reinigungsverhalten der Oxidase,

die VIS-spektroskopischen Eigenschaften des Cyt bo3 und die Zusammensetzung der Häme und

die in vivo und in vitro Aktivitäten betrachtet.

3.1.2.1 Fermentation und Reinigung

Von BL21 ∆cyo recA- pHCL bzw. pIN werden je drei Liter Bakterienkultur parallel angesetzt

und die Oxidase präpariert (2.7). Der pHCL-Wildtyp dient als Referenz. Die Flüssigkulturen

weisen eine OD578 von 4,0 bzw. 3,94 nach dem Zellwachstum auf. Dies entspricht in beiden

Fällen einer Zellausbeute von rund 8 g Bakterienfeuchtgewicht pro Liter Medium. Von den ein-

zelnen Reinigungsschritten wird das Volumen bestimmt, ein Aliquot entnommen und der Ge-

samtprotein- bzw. Cyt b-Gehalt bestimmt. Da der verwendete Expressionsstamm zwar hinsicht-

lich des Cyt bo3 defizient ist, aber das Alternative Cyt bd bilden kann, setzt sich der berechnete

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

45

Cyt b-Gehalt maßgeblich aus beiden zusammen. In Tab. 3.1.1 sind die ermittelten Daten der

Reinigungsschritte und die Anreicherung der Oxidase zusammenfassend dargestellt.

Tab. 3.1.1: Reinigung von Cyt bo3 exprimiert von BL21 ∆cyo recA- pHCL bzw. pIN.

Probe Cyt ba (nmol) Gesamtprotein (mg)b

nmol Cyt b/mg Gesamtprotein

Anreiche-rungs-faktor

pHCL pIN pHCL pIN pHCL pIN pHCL pIN ÜSc nach Zellaufbruch 840 900 4150 4300 0.2 0.2 1.0 1.0 ÜSc nach UZd 280 310 3150 3250 0.1 0.1 0.5 0.5 Membranen nach UZd 462 475 408 512 1.1 0.9 5.5 4.5 nach Solubilisierung 212 208 200 238 1.1 0.9 5.5 4.5 Säulene Duchlauf 63 65 98 117 0.6 0.55 3.0 2.8 Säulene Waschfraktion 29 32 71 77 0.4 0.4 2.0 2.0 Säulene Elution 91 89 15.1 14.8 6.0 6.0 30 30 konz. Cyt bo3

f 46 44 6.76 6.66 6.9 6.7 34.5 33.5 Zeichenerklärung: aDer Cyt b Gehalt wurde nach dem differenziellen Extinktionskoeffizienten von Cyt bo3 (2.9.3) bestimmt; bGesamtproteingehalt nach SDS-Lowry Proteinbestimmung (2.8.3); cÜS = Überstand; dUZ = Ultrazentri-fugation; eNi2+-NTA-Agarose wird als Säulenmaterial verwendet; fProteinbestimmung über die Redox-Differenzspektren (2.9.3). Im Resultat verhält sich sowohl das vom pHCL-, als auch das vom pIN-Plasmid homolog in

E. coli überproduzierte Cyt bo3 hinsichtlich der Fermentation, der Proteinausbeute und der An-

reicherung nahezu gleich.

Um die optimalen Konzentrationen des Imidazolstufengradienten für die Metallaffini-

tätschromatographie zu ermitteln, wird 1/3 der erhaltenen Gesamtmembranen zur Solubilisie-

rung eingesetzt. Abb. 3.1.4 zeigt das Elutionsverhalten bei der Chromatographie des pHCL-

bzw. pIN-Wildtyps in Abhängigkeit von der Imidazolkonzentration.

Abb. 3.1.4: Elutionsverhalten der von BL21 ∆cyo recA- pHCL bzw. pIN überexprimierten Oxidasen auf der Ni2+-NTA-Agarose Säule in Abhängigkeit von der Imidazolkonzentration. Der Cyt bo3 Gehalt wurde VIS-spektrosko-pisch bestimmt (2.9.3). Der hohe Cyt b Anteil beim 0 mM Imidazolwaschschritt ist durch die Proteinreste auf der Säule der Cyt bd Oxidase zu erklären und wird daher schraffiert dargestellt.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

46

Bei diesem Vergleich ist erkennbar, dass der pHCL-Wildtyp bei weit geringeren Imidazolkon-

zentrationen von der Säule verdrängt wird. Diese Oxidase besitzt eine geringere Affinität zum

Säulenmaterial, da die Oligohistidinmodifikation nahezu vollständig fehlt (Abb. 3.1.5). Bei einer

Imidazolkonzentration von 20 mM beginnt das Protein bereits zu eluieren. Somit muss dieser

Reinigungsschritt beim pHCL-Wildtyp zwar durchgeführt werden, um Fremdproteine von der

Säule zu verdrängen, das Volumen des Waschschritts muss jedoch entsprechend klein gehalten

werden. Der pIN-Wildtyp wird bei Imidazolkonzentrationen, die kleiner als 40 mM sind, prak-

tisch nicht von der Säule verdrängt, d.h. eine Abspaltung des C-Terminus während des Zellauf-

bruchs mit Ultraschall hat nicht stattgefunden.

Mit den verbliebenen 2/3 der Membranen werden die Reinigungen der Oxidasen mittels Ni2+-

NTA-Agarose durchgeführt. In Tab. 3.1.1 ist dies berücksichtigt, indem die erhaltenen Werte

entsprechend auf die Masse der Gesamtmembranen bezogen sind. Der pIN-Wildtyp wird im

Unterschied zur Referenz zusätzlich durch einen 40 mM Imidazolschritt gewaschen und mit 150

mM Imidazol eluiert.

Abb. 3.1.5: 15% SDS-Gel zum Reinigungsverlauf des Cyt bo3. Spur 1-4 zeigt die Genprodukte von BL21 ∆cyo recA- pHCL, Spur 5-8 die von BL21 ∆cyo recA- pIN. In allen Spuren wurde 20 µg Gesamtprotein aufgetragen. Spur 1 und 8: Bakterienmembranen, Spur 2 und 7: Überstand der solubilisierten Membranen, Spur 3 und 6: Durch-lauf nach Säulenauftrag, Spur 4 und 5: gereinigte Oxidasen. Das Gel ist auf der rechten Seite beim Trocknen leicht deformiert worden. Der Reinigungsverlauf des Cyt bo3 wird durch ein 15% SDS-Gel, indem die wesentlichen

Reinigungsschritte dargestellt sind, dokumentiert (Abb. 3.1.5). Die aus dem SDS-Gel ermittel-

ten apparenten Molekulargewichte der Referenz bzw. des pIN-Wildtyps (Spur 4 bzw. 5) betra-

gen für Untereinheit I ca. 60 kDa, für Untereinheit II 31 kDa bzw. 32 kDa, für Untereinheit III

20 kDa und für Untereinheit IV ca. 14 kDa. Die gereinigten pHCL- bzw. pIN-Wildtypen sind

zum Vergleich unmittelbar nebeneinander gesetzt. Die beiden Spuren sind mit etwa doppelt so-

viel Protein beladen, als zur Coomassie-Anfärbung der Untereinheiten notwendig ist. Hierdurch

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

47

sind etwaige Unterschiede, wie z. B das nahezu vollständige Fehlen der Proteinbande unterhalb

von Untereinheit II, beim pIN-Wildtyp hervorgehoben. Untereinheit IV ist aufgrund seiner stark

hydrophoben Aminosäurezusammensetzung, wenn überhaupt (z. B. Abb. 3.1.3), nur als diffuse

Bande erkennbar.

3.1.2.2 VIS-spektroskopische Charakterisierung und Häm-Analytik

Um auf eine wiederholte Darstellung von Ergebnissen zu verzichten, sind einige der hier be-

schriebenen Resultate der Wildtypvarianten und der auf ihnen basierenden Mutanten des Cyt

bo3 unter 3.2 tabellarisch und graphisch zusammengefasst. Weiterhin variieren die zur Verdeut-

lichung der Ergebnisse benötigten Referenzen stark innerhalb der Abbildungen. Die Konstruk-

tion des pHCL-Plasmids und das davon kodierte Cyt bo3 wird in Rumbley et al., 1997 [59] be-

schrieben. Da jedoch nicht alle hier durchgeführten Untersuchungen darin enthalten sind, wer-

den diese, soweit in dieser Publikation vorhanden, mit Kita et al. 1984 [51] verglichen.

Ein Hauptproblem bei der Plasmidexpression von Cyt bo3 besteht darin, dass sich im cyo-

Operon neben den Strukturgenen, die für die vier Untereinheiten der Oxidase kodieren, eben-

falls das Gen der Protohäm IX-Farnesyltransferase (Genprodukt von cyoE) befindet (2.1.3, Abb.

2.1.1). Folglich kommt es bei der Transskription und Translation des cyo-Operons ebenfalls zur

Überexpression von CyoE. Die Farnesyltransferase, auch als Häm O-Synthase bezeichnet, ist

verantwortlich für die Häm O-Synthese ausgehend von Häm B (Abb. 1.2.5) [36; 47]. Da das

Häm O jedoch ebenso an die Stelle des low-spin Häm B eingebaut werden kann, kann es neben

der Expression von Cyt bo3, zur Expression des inaktiveren Cyt oo3 kommen [65]. Dies ist nicht

nur bei dem unmodifizierten pMC39-Wildtyp zu beobachten [65], sondern besonders stark beim

pHTAG-Wildtyp ausgeprägt, der eine oligohistidinmodifizierte Untereinheit IV besitzt [49].

Befinden sich der kodierende Bereich des His-tag, wie im Falle vom pHCL-Plasmid, jedoch an

Untereinheit II, so wird aus ungeklärten Gründen nur Cyt bo3 synthetisiert [49; 59].

Um den korrekten Einbau der Häme und das Verhältnis von Häm B zu Häm O innerhalb des

pIN-Wildtyps zu überprüfen, wird einerseits ein reduziertes minus oxidiertes Cyt bo3 Redox-

Tieftemperatur-Spektrum (77 K-Differenzspektrum) von dem gereinigtem Enzym (2.9.4) und

andererseits ein HPLC-Elutionsprofil der extrahierten Häme (2.9) angefertigt. In Abb. 3.1.6 sind

auf der linken Seite die 77 K-Differenzspektren, auf der rechten Seite die HPLC-Elutionsprofile

der Häm-Extrakte der gereinigten Wildtypen und der ∆cyoE- Mutante gezeigt.

Da der ∆cyoE (pHCL)-Mutante das Strukturgen zur Expression der Farnesyltransferase fehlt,

kann in dem E. coli Stamm BL21 ∆cyo recA- kein Häm O synthetisiert werden (unterstes Spekt-

rum bzw. Elutionsprofil in Abb. 3.1.6) [100]. Diese Mutante besitzt anstelle des Häm O ein

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

48

Häm B in der high-spin Hämbindetasche, weist aber gegenüber dem Wildtyp einen vergleichba-

ren CuB-Gehalt auf [100]. Es wird ein physiologisch und bezüglich der Durochinolaktivität inak-

tives Cyt bb3 exprimiert (Tab. 3.2.6), das in seinen VIS-spektroskopischen und kinetischen Ei-

genschaften gegenüber der Referenz stark verändert ist (Abb. 3.2.1, Abb. 3.2.2 und Tab. 3.2.5).

Da diese Mutante als Kofaktor nur Häm B besitzt, kann sie als Referenz für ein reines Cyt bb3

Spektrum bzw. Cyt b (bezüglich der α-Bande) Spektrum herangezogen werden.

Abb. 3.1.6: Analyse der Häm-Zusammensetzung der gereinigten Cyt bo3-Wildtypen bzw. der ∆cyoE-Mutante. Links: 77 K-Differenzspektren der gereinigten Oxidasen (100 µg/mL) im Bereich von 400-700 nm unter Angabe der Extinktionsmaxima und –minima; Rechts: HPLC-Elutionsprofile der extrahierten Häme detektiert bei 406 nm und ganz oben ist das Schema des zur Elution benutzten Acetonitril-Gradienten dargestellt. Die Retentionszeiten sind an den Extinktionsmaxima angegeben. Weitere Erläuterungen siehe Text. Im Gegensatz hierzu resultiert beim pHTAG-Wildtyp ein 77 K-Differenzspektrum bzw. ein

HPLC-Elutionsprofil der Häm-Extrakte, das von Cyt oo3 dominiert wird (erstes Spektrum bzw.

Elutionsprofil von oben in Abb. 3.1.6) und dient als Cyt oo3 überproduzierte Referenz [49].

Die pHCL- bzw. pIN-Wildtypen (zweite bzw. dritte Darstellungen von oben) besitzen in den

77 K-Differenzspektren bezüglich der α-Bande zwei Extinktionsmaxima bei 555,5 nm und

562,5 nm bei nahezu gleicher Signalintensität und weisen somit ein Extintionsverhalten auf, das

dem von Cyt b entspricht. Die β-Bande zeigt ebenfalls ein gespaltenes Signal bei 528 nm und

536 nm. Das Maximum der Soret-Bande liegt bei 427,5 nm. Die ermittelten Extinktionsmaxima

und -intensitäten sind mit den für die 77 K-Differenzspektren beschriebenen vergleichbar (Abb.

1.4.1) [51; 57].

Das Extinktionsspektrum vom Häm B ist gegenüber dem von Häm O leicht zum länger-

welligen Bereich (bathochrom) verschoben [59]. In dieser Publikation konnte gezeigt werden,

dass die Häm-Extrakte vom pHCL-Wildtyp, detektiert bei 402 nm, ein Flächenverhältnis der

Elutionsbanden von Häm B zu Häm O von 60:40 aufweisen. Dies entspricht einem 1:1 Gemisch

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

49

der beiden Häme [59; 62]. Auf die hier durchgeführte Häm-Analyse bezogen, entspricht ein 1:1

Gemisch von Häm B zu Häm O einem Verhältnis der beiden Flächen der Elutionsbanden von

77:23. Die Extinktionen der Häme werden bei 406 nm detektiert, wodurch dieser Unterschied

der ermittelten Verhältnisse verständlich wird.

Die Hämextrakte des pHCL- bzw. pIN-Wildtyps weisen ein Flächenverhältnis der Elutions-

banden von Häm B zu Häm O von 75:25 bzw. 77:23 auf und besitzen somit einen 1:1 Hämge-

halt. Die ermittelten Retentionszeiten liegen bei ca. 29 Minuten für Häm B und ca. 43 Minuten

für Häm O und decken sich nahezu mit den bei Lübben und Morand, 1994 [114] beschriebenen

Werten.

Das Ergebnis der HPLC-Analytik sagt nur etwas über das Verhältnis von Häm B zu Häm O

aus, nicht aber über die korrekte Bindung der Häme innerhalb der Oxidase, d.h. dass Häm B in

der low-spin- und Häm O in der high-spin Hämbindetasche vorliegen. Da sich das Differenz-

signal der α-Bande nahezu nur aus der Absorption des low-spin Häms in den VIS-Spektren zu-

sammensetzt [45; 62], kann aus dem 77 K-Differenzspektrum unmittelbar auf den korrekten

Einbau des Häm B in der Oxidase zurückgeschlossen werden. In Verbindung mit dem ermittel-

ten Verhältnis der beiden Häme aus der HPLC-Analytik, resultiert dann der korrekte bzw. fal-

sche Einbau der Häme innerhalb der untersuchten Oxidasemoleküle.

Als Resultat lässt sich zusammenfassen, dass die vom pIN-Plasmid kodierte Oxidase ein

Häm B in der low-spin Hämbindetasche aufweist und ein Häm B zu Häm O Verhältnis von 1:1

besitzt. Es handelt sich bei der exprimierten Oxidase also um Cyt bo3.

Die im Folgenden dieser Arbeit dargestellten VIS-Spektren sind, wenn nicht anders vermerkt,

auf eine Konzentration von 150 µg/mL Cyt bo3 bezogen (3.2.2). Diese Angabe wird aus den

reduzierten minus oxidierten Raumtemperatur-Redox-Differenzspektren (Redox-Differenz-

spektren) unter Zuhilfenahme des differenziellen Extinktionskoeffizienten ∆ε = 18,700 M-1•cm-1

[51] berechnet (Abb. 3.2.2). Die Original-Extinktionswerte der gemessenen Absolut- und CO-

Rekombinationsspektren werden im Anschluss mit dem sich ergebenden Umrechnungsfaktor

multipliziert. Hierdurch sind die erhaltenen VIS-Spektren nicht nur innerhalb einer Abbildung,

sondern auch von Abbildung zu Abbildung unmittelbar vergleichbar. Erst zum Schluss dieses

Unterpunktes wird eine kurze Zusammenfassung der Ergebnisse vorgenommen.

Zur weiteren Analyse des pIN-Wildtyps werden Absolutspektren vergleichend zum pHCL-

Wildtyp angefertigt. In Abbildung 3.1.7 sind neben den (Luft-) oxidierten und (Natriumdithio-

nit) reduzierten Absolutspektren, auch Spektren im Kohlenmomoxid- (CO) (obere Darstellun-

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

50

gen) und Cyanid-gebundenem Zustand (untere Darstellungen) gezeigt. Die von pHCL überpro-

duzierte Oxidase dient hierbei als Referenz.

Abb. 3.1.7: Absolutspektren der gereinigten pHCL- bzw. pIN-Wildtypen. Die Spektren sind auf 150 µg/mL, be-rechnet aus den Redox-Differenzspektren (3.2.2), bezogen. Die Wellenlängen der Extinktionsmaxima sind als Zah-lenwert angegeben. Oben: (Luft-) oxidierte, (Natriumdithionit-) reduzierte und CO-gebundene reduzierte (COFR-) Absolutspektren im Bereich von 400-650 nm; Unten: (Luft-) oxidierte und Cyanid-gebundene oxidierte Absolut-spektren im Bereich von 400-650 nm. Die 10fache Vergrößerung schließt den Wellenlängenbereich von 500-670 nm ein. Um sicherzustellen, dass ein intaktes binukleares Zentrum im pIN-Wildtyp vorhanden ist,

können verschiedene Liganden an das high-spin Häm bzw. CuB angebunden werden. Da die

Oxidase in einem natriumchloridhaltigen Puffer gereinigt und gelagert wird, liegt das oxidierte

Cyt bo3 bereits Chlorid-gebunden vor. Dieser Zustand wird als Anbindung von Chloridionen an

CuB beschrieben [113; 117] und als sechster Ligand für das Fe(III) des high-spin Häms O wird

Wasser postuliert [118]. Die sechste Koordinationsstelle des high-spin Häm von Cytochrom

Oxidasen ist neben Sauerstoff ebenfalls für andere exogene Liganden wie Kohlenmonoxid [119]

und Cyanid [120] zugänglich. Das CO bindet im reduzierten Zustand der Oxidase an das Fe(II)

des high spin Häm O und ist photolysierbar [63]. Es bildet sich der sogenannte CO-gebundene

fully reduced-Komplex (COFR-Komplex). Cyanid kann eine „Brücke“ zwischen Häm O und

CuB bilden [118; 121]. Die sogenannte charged transfer- (CT-) Bande, die im oxidierten

Absolutspektrum bei intaktem binuklearem Zentrum sichtbar ist, fehlt im oxidierten

Absolutspektrum bei gebundenem Cyanid.

Die Extinktionsmaxima für den oxidierten und reduzierten Zustand, sowie für den COFR-

Komplex der untersuchten Wildtypen und deren Mutanten sind unter 3.2 tabellarisch zusam-

mengefasst (Tab. 3.2.1).

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

51

Bei der Betrachtung von Abb. 3.1.7 weisen die Soret-Banden der oxidierten Absolutspektren

der pHCL- bzw. pIN-Wildtypen Extinktionsmaxima bei 409 nm bzw. 410 nm auf. Im vergrö-

ßerten Wellenlängenbereich von 500-670 nm sind drei weitere Maxima bei 535 nm, 562 nm und

um 630 nm erkennbar. Für den Chlorid-gebunden Zustand des oxidierten Cyt bo3 wird ein Ma-

ximum bei 408,5 nm für die Soret-Bande [113] und eines um 630 nm für das breite Extinktions-

signal der CT-Bande [122] beschrieben.

Bezüglich der Extinktionsmaxima für den vollständig reduzierten Zustand der Oxidasen wer-

den für die Soret-Bande 427 nm, die α-Bande 560,5 nm bzw. 560 nm und die β-Bande 531 nm

bzw. 530,5 nm bestimmt, d.h. es sind nur geringste Unterschiede zwischen pHCL- und pIN-

Wildtyp erkennbar. Im Vergleich zu Kita et al. 1984 (Abb. 1.4.1) [51] ist eine hohe Überein-

stimmung der ermittelten Werte festzustellen.

Im COFR-Komplex tritt am Extinktionsmaximum der Soret-Bande ein deutlicher Unterschied

auf. Das Spektrum der Referenz zeigt ein schmalbandiges Maximum bei 419 nm und weist dar-

über hinaus eine Schulter um 426 nm auf. Die ermittelten Werte sind mit [57] vergleichbar. Das

Spektrum des pIN-Wildtyps zeigt jedoch ein breitbandiges Maximum bei 420 nm, bei gleichzei-

tigem Fehlen der Schulter.

Die Extinktionsmaxima des Cyanid-gebunden Zustands unterscheiden sich nicht bei den ver-

glichenen Oxidasen. Sie liegen bei 415 nm, 535 nm und 562 nm. Die Extinktionen der CT-

Banden sind praktisch nicht vorhanden, d.h. Cyanid „verbrückt“ im hohen Maße die redoxakti-

ven Gruppen des binuklearen Zentrums. Die Soret-Banden sind gegenüber den oxidierten Spekt-

ren um 6 nm bzw. 5 nm bathochrom verschoben. Cyanid bindet an der freien sechsten Koordi-

nationsstelle des high-spin Häm O und an CuB [121]. Dabei induziert es den Wechsel vom high-

spin Zustand zum low-spin Zustand des Häm O [113]. Im Spektrum drückt sich dies durch eine

bathochrome Verschiebung der Soret-Bande (bei gleichzeitiger Extinktionszunahme der Soret-,

β- und α-Bande) und dem Verlust der CT-Bande aus. Die redoxaktiven binuklearen Zentren des

pIN-Wildtyps sind folglich nahezu vollständig für Cyanid zugänglich.

Die Absolutextinktionen der beiden dargestellten Oxidasen unterscheiden sich. Das Referenz-

spektrum weist im Cyanid-gebundenen Zustand eine deutlich höhere Extinktion der Soret-

Bande gegenüber der des oxidierten Spektrums auf. Die Signalintensitäten der Soret-Banden des

pIN-Wildtyps hingegen sind in diesen Spektren nahezu gleich. Die Extinktionen im Bereich der

β- und α-Bande zeigen gegenüber dem pHCL-Wildtypspektrum eine deutlich kleinere Differenz

zwischen oxidiertem und Cyanid-gebundenem Zustand. Die Cyanid-Anbindung findet folglich

an weniger high-spin Häm-Molekülen statt, als zur Gesamtextinktion beitragen.

Betrachtet man unter diesem Aspekt die Gesamtextinktionen der oxidierten und reduzierten

Soret-Banden in den Absolutspektren, so fallen zwei Punkte auf: Erstens der pIN-Wildtyp weist

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

52

eine Extinktion des oxidierten Spektrums bei E410 von 0,217 auf und sie fällt somit höher aus,

als die bei der Referenz (E409 = 0,206) ermittelte Extinktion. Zweitens findet sich ein dazu kont-

räres Verhalten bei den reduzierten Spektren. Hierbei zeigt das Referenzspektrum eine leicht

höhere Extinktion (E427 von 0,263) gegenüber dem pIN-Wildtypspektrum (E427 von 0,260).

Um dieses Verhalten näher zu untersuchen, wird der Reduktionsgrad des pIN-Wildtyps relativ

zur Extinktion des oxidierten Absolutspektrums der Referenz bestimmt. Die Berechnung des

Reduktionsgrades R der Cyt bo3 Probe folgt nachstehenden Formeln (Gleichung 3.1 und 3.2).

(Probe)E*(Probe)E

(Referenz)E)(berechnetE (red)Max

(ox)Max

(ox)Max (red)Max = (3.1)

100% *(Referenz) E-(Referenz) E(Referenz) E-)(berechnet E

R :%in gradReduktions (ox)Max (red)Max

(ox)Max (red)Max

= (3.2)

Dabei wird zuerst die Gesamtextinktion des Maximums der oxidierten Soret-Bande der Probe,

EMax (ox) (Probe), an die Referenz, EMax (ox) (Referenz), angepasst und anschließend das Maximum

der Extinktion des reduzierten Spektrums, EMax (red) (Probe), mit dem sich ergebenden Umrech-

nungsfaktor multipliziert (Gleichung 3.1). Es ergibt sich die berechnete Extinktion, EMax (red)

(berechnet), die somit auf das oxidierte Spektrum des pHCL-Wildtyps bezogen ist. Anschlie-

ßend wird diese berechnete Extinktion in Gleichung (3.2) eingesetzt und der prozentuale Reduk-

tionsgrad im Vergleich zur Referenzoxidase bestimmt. Die nach den Gleichungen (3.1) und

(3.2) ermittelten Ergebnisse sind für die Wildtyp-Proteine und deren Mutanten in Tab. 3.2.2

zusammengefasst. Der errechnete Reduktionsgrad für den pIN-Wildtyp beträgt 72% gegenüber

der Referenz.

Analog zum Reduktionsgrad kann ebenfalls der CO-Anbindungsgrad C aus den COFR-

Absolutspektren im Vergleich zur Referenz des pHCL-Wildtyps berechnet werden. Hierbei wird

die Gesamtextinktion der CO-gebundenen Probe, EMax (COFR) (Probe) anstelle von EMax (red) (Pro-

be) in Gleichung (3.1) eingesetzt. Es ergibt sich EMax (COFR) (berechnet). Dieses wird anschlie-

ßend anstelle von EMax (red) (berechnet) in Gleichung (3.2) eingesetzt. Der Nenner verändert sich

entsprechend zu EMax (COFR) (Referenz) minus EMax (ox) (Referenz). Die sich ergebenden Werte

sind in Tab. 3.2.2 zusammengefasst. Der aus dem COFR-Absolutspektrum berechnete CO-

Anbindungsgrad des pIN-Wildtyps beträgt 77% gegenüber der Referenz.

Aus den in Abb. 3.1.7 dargestellten Proben werden die Redox-Differenz- und die reduzierten,

CO-gebundenen minus reduzierten Cyt bo3 Differenzspektren (CO-Differenzspektren), wie un-

ter 2.9 beschrieben erstellt. In Abb. 3.2.2 sind neben den Wildtypen auch einige Cyt bo3-

Mutanten Differenzspektren gezeigt. Die pHCL- und pIN-Wildtypen unterscheiden sich in den

Redox-Differenzspektren bezüglich ihrer Extinktionsminima nur im Soret-Bereich um 1 nm

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

53

(Tab. 3.2.3). Die Minima bzw. Maxima betragen für die Soret-Bande 408 nm bzw. 409 nm und

428,5 nm, für die β-Bande 531 nm und für die α-Bande 561 nm. In beiden Fällen erscheint die

α-Bande symmetrisch. Für das CO-Differenzspektrum wird ein Maximum bei 416 nm und ein

Minimum bei 430 nm ermittelt. Im Vergleich zu Kita et al., 1984 [51] und Rumbley et al. 1997

[59] decken sich die ermittelten Werte nahezu, mit der Ausnahme, dass das Maximum der So-

ret-Bande bei den Redox-Differenzspektren um 1,5 nm bzw. 2 nm bathochrom verschoben ist.

Die beiden verglichenen Oxidasen unterscheiden sich jedoch im Grad der CO-Anbindung in

den CO-Differenzspektren. Aus der Extinktionsdifferenz E416-430 ergibt sich, dass das vom pIN-

Plasmid kodierte Cyt bo3 nur 70% CO-Anbindung gegenüber der Referenzoxidase zeigt (Tab.

3.2.4).

In weiterführenden Experimenten, die hier nicht graphisch abgebildet werden, wird über die

Natriumdithionit-Reduktionskinetik abgeschätzt, wieviel Prozent der Cyt bo3-Molekülpopu-

lation in der fast- und in der slow-Form vorliegen. Hierbei wird nach Moody et al., 1995 [123]

vorgegangen. Für den pHCL-Wildtyp ergibt sich, dass ca. 65% des Cyt bo3 in der fast-Form

vorliegen. Im Vergleich hierzu weist der pIN-Wildtyp ca. 73% auf. Die Reduktion der gereinig-

ten Proteine ist nach ca. 5 Minuten nahezu abgeschlossen. In der Literaturreferenz stellte sich

für die wildtypische Oxidase heraus, dass sich die als „slow-Form“ bezeichnete Spezies zu ca.

70% aus der fast- und zu ca. 30% aus der slow-Form zusammensetzt [123].

Als letzter Abschnitt zur VIS-spektroskopischen Charakterisierung des pIN-Wildtyps sollen die

CO-Rekombinations-Differenzspektren (CO-Rekombinationsspektren) des Cyt bo3 betrachtet

werden. Die Proben werden entsprechend 2.9.2 vorbereitet und vermessen.

Die CO-Anbindung findet an dem reduzierten binuklearen Zentrum der Oxidase statt und es

bildet sich der COFR-Komplex. Dieser ist photolysierbar. Dabei wird die Fe-CO-Bindung ge-

löst, Kohlenmonoxid dissoziert vom high-spin Häm ab und bindet transient an das CuB. Die CO-

Rekombination, d.h. die Wiederanbindung des Kohlenmonoxids an das high-spin Häm, kann

VIS-spektroskopisch im Soret-Bereich in der Größenordnung von ca. 70-100 Millisekunden bei

Raumtemperatur verfolgt werden (z.B. [124]). Liegt kein CuB im binuklearen Zentrum vor, so

kann CO vom Häm zwar gebunden werden, die CO-Rekombination (CO-Relaxation) findet

jedoch innerhalb von nur wenigen Millisekunden statt [125]. Aus technischen Gründen des hier

verwendeten Aufbaus, kann jedoch erst nach der 2 Millisekunden nach Applikation des Licht-

blitzes ein auswertbares Spektrum erhalten werden. Da nur das Häm des binuklearen Zentrums

an der CO-Relaxation beteiligt ist, gehen die Extinktionsänderungen im Soretbereich praktisch

nur auf das high-spin Häm zurück. Somit liefert der COFR-Komplex im CO-Differenzspektrum

ein Maß für die CO-Anbindung am high-spin Häm.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

54

Abb. 3.2.3 zeigt exemplarisch am pIN-Wildtyp die zeitabhängigen Änderungen im VIS-Spek-

trum bei Photolyse des COFR-Komplexes. Eine weiterführende Beschreibung der Vorgänge

während der Photolyse wird in dem Begleittext zu Abb. 3.2.3 gegeben. Das CO-Rekombina-

tionsspektrum wird von der positiven Extinktionsbande bei 430 nm und der negativen bei 415

nm dominiert. Die Extinktionsänderungen der Bande bei 430 nm werden zur Beschreibung der

CO-Rückbindekinetik am high-spin Häm O herangezogen.

In Abb. 3.1.8 sind die Kinetiken der pHCL- bzw. pIN-Wildtypen vergleichend zur Y288F-

Mutante gezeigt, bei der die CuB Ligandenbindekapazität selektiv entfernt ist [104; 105].

Abb. 3.1.8: CO-Rekombinationskinetik der Extinktionsänderungen bei 430 nm. Zur Photolyse des CO wurden die gereinigten, COFR-Komplex-Oxidasen des pHCL- (g) und pIN-Wildtyps (n) und der Y288F-Mutante (♦) einge-setzt. Die ermittelten Werte (durch Symbole dargestellt) wurden mit einem logarithmischen Zerfall erster Ordnung angepasst (durchgezogene Linie). Zeichenerklärung: A = Amplitude; τ = Zeitkonstante.

Die Geschwindigkeit der CO-Rekombination ist von der Kohlenmonoxidkonzentration im

Außenmedium abhängig [125]. Da bei der Kohlenmonoxidbegasung der Flüssigproben unter

dem Laborabzug die Probe erst nach Entfernen der Kanüle gasdicht verschlossen werden kann,

ist eine definierte Kohlenmonoxid-Konzentration innerhalb der Küvette nicht möglich. Die er-

mittelten Zeitkonstanten variieren daher leicht von Probe zu Probe. Die grundsätzliche Aussage,

ob CuB an der CO-Rekombination beteiligt ist, kann jedoch über diese Zeitkonstanten und den

Verlauf der Rekombinationskinetik gemacht werden. Die Kinetiken können mit einem logarith-

mischen Zerfall erster Ordnung angepasst werden.

Die nach der Anpassung erhaltenen Amplitudenwerte der pHCL- bzw. pIN-Wildtypen weisen

33,4 mOD bzw. 22,4 mOD bei 430 nm auf und die Zeitkonstanten betragen hierbei 12,4 ms

bzw. 11,4 ms. Wenn der pHCL-Wildtyp als Referenz für die CO-Anbindung herangezogen

wird, weist der pIN-Wildtyp nur einen CO-Anbindungsgrad von 67% (Tab. 3.2.5) auf. Dieses

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

55

Ergebnis steht im Einklang mit der 70%igen CO-Anbindung ermittelt aus dem CO-

Differenzspektrum, d.h. dass praktisch das gesamte gebundene CO photolysierbar ist.

Die Cyt bo3-Mutante Y288F weicht von diesen Werten stark ab. Das COFR-Absolutspektrum

(Abb. 3.2.1) und das CO-Differenzspektrum (Abb. 3.2.2) belegen, dass CO am high-spin Häm

dieser Mutante gebunden ist. Dennoch ist die ermittelte Amplitude mit 1,1 mOD gering (Tab.

3.2.5). Die Wiederanbindung an das high-spin Häm läuft folglich schneller ab, als mit dem hier

verwendeten Versuchsaufbau untersucht werden kann. Die ermittelte Zeitkonstante von 29,2 ms

und die aus der Anpassung ermittelte CO-Anbindung am high-spin Häm daher nicht aussage-

kräftig. Aus diesen Gründen kann diese Cyt bo3-Mutante jedoch als Referenz für eine CO-

Rekombination ohne die zwischenzeitliche CO-Anbindung an CuB herangezogen werden [105].

Die CO-Rekombinationskinetik des pIN-Wildtyps läßt kein Verhalten wie bei dem Spektrum

der Y288F-Mutante erkennen, CuB liegt also im binuklearen Zentrum korrekt gebunden vor.

Zusammenfassend lässt sich für den pIN-Wildtyp feststellen: Bezüglich der Lage der Extinkti-

onsminima bzw. –maxima in den VIS-Spektren sind keine oder nur geringe Unterschiede zu

dem pHCL-Wildtyp feststellbar. Aus den Absolutspektren (Abb. 3.1.7) lässt sich ermitteln, dass

nur etwa 72% der vorhandenen Häme der Oxidase mit Natriumdithionit reduziert werden kön-

nen, also redoxaktiv sind. Eine CO-Anbindung gegenüber dem Absolutspektrum der Referenz

findet zu etwa 77% statt. Für den pIN-Wildtyp werden vergleichbare Werte von 70% CO-

Anbindung bei den CO-Differenzspektren und 67% bei der berechneten Amplitude der CO-

Kinetik gefunden. Dies bedeutet, dass das high-spin Häm O nur zu rund 70% redoxaktiv ist. Die

aus den CO-Relaxationen gewonnen Zeitkonstanten der verglichenen Wildtypen sind sehr ähn-

lich, d.h., dass die redoxaktiven binuklearen Zentren beim pIN-Wildtyp intakt sind. Dies wird

ebenfalls durch das Fehlen der CT-Bande im Cyanid-gebundenen Zustand bestätigt.

3.1.2.3 Aktivitäten

Erläuterungen zu den Aktivitätstests sind unter 3.2.4 und in Tab. 3.2.6 gegeben.

Das vom pIN-Plasmid kodierte Cyt bo3 weist vergleichend zur pHCL-Referenz im in vivo

Komplementationstest gleiches Bakterienwachstumsverhalten auf, d.h. die fehlende oxidative

Respiration des E. coli Stamms JM107 ∆cyo ∆cyd kann durch die Plasmidexpression des Cyt

bo3 in E. coli ausgeglichen werden.

Im in vitro Aktivitätstest zeigt sich jedoch ein abweichendes Ergebnis, es werden nur 64%

Durochinol-Oxidase-Aktivität vom pIN-Wildtyp im Vergleich zum pHCL-Wildtyp gemessen.

Dieser Wert weist eine annähernde Übereinstimmung mit den rund 70% redoxaktiven high-spin

Hämen auf.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

56

3.1.3 Anwendungsbeispiele

Es wird untersucht, ob ortsspezifische Mutanten des Cyt bo3 ausgehend vom pIN-Plasmid, er-

halten werden können. Um auf eine wiederholte Darstellung von Abbildungen zu verzichten,

sind die Ergebnisse hier stichpunktartig aufgeführt. Weiterhin soll geklärt werden, ob sich das

Expressions- bzw. Reinigungsverhalten einer auf dem pIN-Plasmid basierenden Mutante ändert,

die ausgehend vom pHCL-Plasmid nicht exprimiert bzw. gereinigt werden konnte.

Basierend auf dem pIN-Plasmid konnten die ortsspezifischen Cyt bo3-Mutanten T352S, T359S

sowie T369S auf DNA-Ebene erstellt werden. Zum Vergleich werden ebenfalls die gleichen

Mutanten mit der template-DNA von pHCL erstellt, wobei auf eine anschließende Proteinreini-

gung verzichtet wird. Der Vergleich der Ergebnisse von den auf dem pIN-Plasmid basierenden

Mutanten erfolgt über die in der Literatur beschriebenen Mutanten.

Die T369S-Mutante konnte in beiden Fällen in E. coli BL21 ∆cyo recA- nicht überexprimiert

werden, da nur proteolytisch degradiertes Protein in den Bakterienzellen zu finden ist. Die bei-

den anderen Mutanten können überexprimiert, gereinigt und biochemisch analysiert werden. In

Abb. 3.1.9 ist ein 15%-SDS Gel gezeigt, dass den Reinigungsverlauf der T352S (pIN)-Mutante

exemplarisch wiederspiegelt. Die Proteinisolierung erfolgt gemäß dem Reinigungsprotokoll, das

für den pIN-Wildtyp erhalten wurde, d.h. es ist ein His-tag an Untereinheit II vorhanden.

Abb. 3.1.9: 15% SDS-Gel zum Proteinreinigungsverlauf der Cyt bo3-Mutante T352S (pIN). Die Bakterienzellen wurden in BL21 ∆cyo recA- angezogen. Spur 1: Bakterienmembranen, Spur 2: Überstand der solubilisierten Memb-ranen, Spur 3: Durchlauf nach Säulenauftrag, Spur 4: gesammelte Waschfraktionen, Spur 5: gereinigte T352S-Mutante (10 µg), Spur 6: gereinigter pIN-Wildtyp (10 µg). Die beiden Mutantenproteine weisen bezüglich der α-Bande in den hier nicht zusätzlich dar-

gestellten 77 K-Differenzspektren ein Extinktionsverhalten auf, das auf einen Häm B Einbau in

der low-spin-Hämbindetasche zurückschließen lässt. Aus der HPLC-Analytik der Hämextrakte

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

57

ergibt sich ein 1:1 Verhältnis von Häm B zu Häm O. Die Cyt bo3 Molekülpopulationen sind

daher homogen zusammengesetzt.

Die Cyt bo3-Mutante T352S weist in den oxidierten und reduzierten Absolutspektren (Abb.

3.2.1 und Tab. 3.2.1), sowie den Redox-Differenzspektren (Abb. 3.2.2) keine wesentlichen Un-

terschiede zur Lage der Extinktionsminima und -maxima gegenüber dem pIN-Wildtyp auf. Der

Reduktionsgrad beträgt 90%. In dem COFR-Absolutspektrum weicht sie jedoch ab. Sie zeigt ein

spitzzulaufendes Extinktionsmaximum in der Soret-Bande bei 418,5 nm. Die Schulter bei 426

nm ist jedoch wiederum nicht vorhanden. Die Maxima der β- und α-Bande liegen bei 532,5 nm

bzw. 562 nm. Diese Mutante besitzt einen hohen CO-Anbindungsgrad von 103%, berechnet aus

dem COFR-Absolutspektrum (Tab. 3.2.2) bzw. 93%, ermittelt aus dem CO-Differenzspektrum

(Tab. 3.2.4). Die aus der Anpassung der CO-Rekombinationskinetik ermittelte Amplitude ist

ebenfalls mit 31,4 mOD vergleichsweise hoch und zeugt von einer nahezu kompletten CO-

Anbindung (Tab. 3.2.5). Die Zeitkonstante von 14,7 ms lässt auf ein intaktes binukleares Zen

trum zurückschließen.

Die Cyt bo3-Mutante T359S weist gegenüber dem pIN-Wildtyp im oxidierten Absolutspekt-

rum ein um 2 nm auf 412 nm verschobenes Extinktionmaximum auf (Abb. 3.2.1). Dies spiegelt

sich ebenfalls im Extinktionsminimum der Soret-Bande des Redox-Differenzspektrums wieder,

das bei 410 nm liegt (Tab. 3.2.3). Der Reduktionsgrad beträgt 96%. Das COFR-

Absolutspektrum zeigt ein Maximum bei 424 nm und weist somit auf eine unvollständige CO-

Anbindung hin. Der hierbei ermittelte CO-Anbindungsgrad von 87% ist folglich nicht aussage-

kräftig. Aus dem CO-Differenzspektrum konnte ein CO-Anbindunggrad von 59% ermittelt wer-

den (Tab 3.2.4). Entsprechend kleiner fällt die Amplitude von 18,4 mOD bei 430 nm der CO-

Rekombinationskinetik aus. Die Zeitkonstante beträgt 11,4 ms (Tab. 3.2.5).

Im Folgenden werden die in vitro und in vivo Aktivitäten dieser beiden Mutanten untersucht,

die Ergebnisse sind in Tabelle 3.2.6 wiedergegeben.

Die T352S-Mutante, basierend auf pIN bzw. pHCL weist eine eingeschränkte Komplementa-

tion im in vivo Aktivitätstest auf. Im in vitro Aktivitätstest lässt sich bei dieser Mutante (T352S

(pIN)) eine Aktivität von 26% im Vergleich mit dem pHCL-Wildtyp feststellen. Die Durochi-

nolaktivität gegenüber dem pIN-Wildtyp liegt entsprechend bei 41%. In Thomas et al. 1993

[103] wurde für diese Mutante eine Ubichinol-Oxidase-Restaktivität von 58% festgestellt.

Die T359S-Mutante, basierend auf pIN bzw. pHCL weist Komplementation im in vivo Aktivi-

tätstest auf. Im in vitro Aktivitätstest konnte bei der auf pIN aufbauenden Mutante ein Substrat-

umsatz von 57% gegenüber dem gereinigtem pHCL-Wildtyp festgestellt werden. Dies entspricht

90% Durochinolaktivität gegenüber dem pIN-Wildtyp. In Thomas et al. 1993 [103] wurde für

diese Mutante eine Ubichinol-Oxidase-Restaktivität von 95% festgestellt.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

58

Die pHCL-Mutante Y288A konnte nicht in BL21 ∆cyo recA- überexprimiert und gereinigt wer-

den. Zu Versuchszwecken wird ausprobiert, ob sich das Expressionsverhalten dieser Mutante,

basierend auf dem pIN-Plasmid ändert bzw. sich das Protein bei geringer Expression durch den

vorhandenen His-tag reinigen lässt. Eine Expression ist in diesem Falle ebenfalls nicht vorhan-

den, es kann kein Cyt bo3 gereinigt werden.

Die Erstellung eines Wildtyp-Konstruktes, das C-Terminal nicht proteolysiert wird und somit

die Oligohistidinmodifikation trägt, ist jedoch für die Reinigung von Cyt bo3 überproduziert im

E. coli-Stamm S730, der zur 13C -Isotopenmarkierung der Häme eingesetzt wird notwendig. Die

Ergebnisse dieser Überexpression sind unter 3.4.3 dargestellt.

Zusammenfassend lässt sich feststellen: Eine Überexpression, Reinigung und die sich anschlie-

ßende biochemische Charakterisierung von Cyt bo3-Mutanten, basierend auf dem pIN-Plasmid,

ist möglich. Ein Mutantenprotein, das auf dem pHCL-Plasmid basierend nicht erhalten werden

konnte, kann ebenfalls nicht mit Hilfe des pIN-Plasmids gereinigt werden.

3.2 Biochemische und VIS-spektroskopische Charakterisierung von Cyt bo3

und dessen Mutanten

Die verwendeten Wildtyp-Konstrukte von Cyt bo3 und die auf ihnen basierenden Mutanten wer-

den in verschiedenen Unterpunkten dieser Arbeit vorgestellt. Um nicht in den einzelnen Ab-

schnitten die biochemischen und VIS-spektroskopischen Eigenschaften dieser Konstrukte dar-

stellen zu müssen, werden sie hier zur besseren Übersicht zusammengefasst. Es handelt sich um

rein empirisch ermittelte Daten, die erst an anderer Stelle, wie z.B. unter 3.1 geschehen, in den

Gesamtkontext eingebettet werden. Die ermittelten Daten der Cyt bo3-Mutanten in den Abbil-

dungen und Tabellen sind in der Regel nur dann gezeigt, wenn ein abweichendes Verhalten zu

den jeweiligen Wildtypen vorliegt, die unter 3.1.2.2 beschrieben sind und zum besseren Ver-

ständnis eine Darstellung notwendig ist.

3.2.1 Absolutspektren

Die Proben werden entsprechend 2.9.1 angefertigt und vermessen. Bei den in Abb. 3.2.1 gezeig-

ten Extinktionsspektren handelt es sich um die oxidierten, reduzierten und COFR-Absolut-

spektren von Cyt bo3-Mutanten, die auf dem pHCL- bzw. pIN-Plasmid basieren (s. Tab. 3.2.6).

Die Absolutspektren der zugrundeliegenden Wildtypen sind in Abb. 3.1.7 wiedergegeben. Tab.

3.2.1 fasst die Lage der Extinktionsmaxima der hier untersuchten Cyt bo3-Wildtypen und -

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

59

Mutanten zusammen. Zusätzlich zu den Maxima der Soret-Banden sind auch die der β- und

α-Banden aufgeführt. Tab. 3.2.2 gibt eine Übersicht zu den aus den Absolutspektren ermittelten

Gesamtextinktionen und des Reduktions- bzw. CO-Anbindungsgrades.

Abb. 3.2.1: VIS-Absolutspektren der gereinigten Cyt bo3-Mutanten, die auf dem pHCL- bzw. pIN-Plasmid (Anga-be in Klammern) basieren. Die Spektren sind, mit Ausnahme des pHTAG-Wildtyps, durch die Position und die Art des Aminosäureaustausches der ortsspezifischen Mutante bezeichnet. Die Signalintensitäten sind auf 150 µg/mL, berechnet aus den Redox-Differenzspektren (3.2.2), bezogen. Die Wellenlängen der Extinktionsmaxima der Soret-Bande sind als Zahlenwert angegeben. Die Spektren sind im Bereich von 400-650 nm dargestellt. Die (Luft-) oxi-dierten Spektren sind durch eine gestrichelte Linie, die (Natriumdithionit-) reduzierten durch eine schwarze durch-gezogene und die COFR-Absolutspektren durch eine rote durchgezogene Linie wiedergegeben. Die F391Q (pHCL)-Mutante zeigt in dem oxidierten Absolutspektrum ein Extinktionmaxi-

mum, das um 4 nm zu höheren Wellenlängen verschoben sind. Die zu großen Teilen überein-

stimmende Form mit dem reduzierten Spektrum, die Lage und das breitbandige Maximum des

COFR-Absolutspektrums weisen auf eine unvollständige CO-Anbindung hin. Somit liefert der

CO-Anbindungsgrad ermittelt durch die unter 3.1.2.2 angegebenen Gleichungen keinen aussa-

gekräftigen Wert (Tab. 3.2.2).

Der ∆cyoE-Mutante fehlt das Gen zur Expression der Farnesyltransferase. Die gemessenen

Extinktionen zeigen folglich Spektren, die auf Cyt bb3 zurückzuführen sind [100]. Das Extinkti-

onsmaximum vom isolierten Häm B ist gegenüber dem von Häm O leicht bathochrom verscho-

ben [59]. Die Maxima der oxidierten und der CO-Absolutspektren befinden sich folglich bei 415

nm bzw. 425 nm. Bei dem reduzierten Spektrum ist eine Verschiebung von 1,5 nm gegenüber

dem Wildtyp festzustellen. Weiterhin ist ein erhöhter CO-Anbindungsgrad um ca. das 1,5fache

gegenüber dem Wildtyp feststellbar (Tab. 3.2.2), der sich durch eine höhere Gesamtextinktion

gegenüber dem reduzierten Absolutspektrum ausdrückt.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

60

Das Expressionsprodukt von pHTAG liefert neben Cyt bo3 ebenfalls Cyt oo3 (Abb. 3.1.6). Die

Lage des Maximums des reduzierten Spektrums ist zu 423 nm verschoben.

Tab. 3.2.1: Wellenlängenangaben der Extinktionsmaxima der Absolutspektren von gereinigtem wildtypischem und mutagenisiertem Cyt bo3.

Plasmida oxidiert / nm Soret-Bande

reduziert / nm Soret-, β-, α-Bande

COFR /nm Soret-, β-, α-Bande

pHCL 409 427 531 560,5 419 532 563 pHTAG 409 423 527,5 555,5 419 529 556,5 pIN 410 427 530,5 560 420 531,5 561,5 pMC39 409 424 529 558 419 531 559,5 ∆cyoE 415 428,5 531 560 425 532,5 563 E286D 409 427 531,5 560,5 419 532 563 E286Q 409 425 531 560 419 532,5 562 F391Q 413 428 532 561 425 533,5 563,5 T352S (pIN) 410 427 530,5 560 418,5 532,5 562 T359S (pIN) 412 427,5 532 560,5 424 533 561,5 Y288F 410,5 426 530 559 419 532 560,5 Zeichenerklärung: aDie vom Plasmid-Konstrukt kodierte Oxidase. Die Punktmutanten in Untereinheit I werden nach der Position und der Art der ausgetauschten Aminosäure bezeichnet, sie beziehen sich alle bis auf T352S und T359S, auf das Plasmid pHCL. Die Mutanten E286Q (pHCL) bzw. Y288F (pHCL) weisen in den hier nicht zusätzlich aufge-

führten 77 K-Differenzspektren ein Häm B in der low-spin Häm-Bindetasche auf. Hierbei ist bei

der Y288F-Mutante die charakteristische Aufspaltung der α-Bande um 563 nm geringer als bei

der Referenz ausgeprägt [104]. Die Auswertung der HPLC-Elutionsprofilen der Häm-Extrakte

zeigen ein 1:1 Verhältnis von Häm B zu Häm O (Daten nicht gezeigt). Die Extinktionsmaxima

der reduzierten Absolutspektren liegen bei 425 nm bzw. 426 nm und sind gegenüber dem Wild-

typ um 2 nm bzw. 1 nm zu kürzeren Wellenlängen (hypsochrom) verschoben. Die Y288F-

Mutante zeigt darüber hinaus ein um 1,5 nm, auf 410,5 nm bathochrom verschobenes Maximum

im oxidierten Absolutspektrum. Die Reduktionsgrade beider Proteine sind deutlich herabgesetzt

(Tab. 3.2.2). Die hypsochrom verschobenen Maxima der reduzierten Spektren deuten darauf

hin, dass die high-spin Häme reduziert vorliegen, die low-spin Häme demnach jedoch nur zum

Teil reduziert sind. Dies wird ebenfalls durch die ca. 1,5-2fach erhöhten Gesamtextinktionen

gegenüber dem pHCL-Wildtyp Spektrum bekräftigt (Tab. 3.2.2). Diese sind auf die Differenz-

signale der α-Bande der Redox-Differenzspektren bezogen und somit praktisch nur auf den Re-

duktionsgrad des low-spin Häms (3.2.2). Darüber hinaus werden überproportional erhöhte Ex-

tinktionen bei den COFR-Absolutspektren gegenüber den reduzierten Spektren erreicht. Da die

CO-Anbindung im binuklearen Zentrum stattfindet, fließen entsprechend stark die Extinktions-

änderungen des high-spin Häms in die Gesamtsignalintensität ein. Der CO-Anbindungsgrad bei

den E286Q- bzw. Y288F-Mutanten beträgt demnach 96% bzw. 196%.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

61

Die Extinktionswerte der Absolutspektren in Tab. 3.2.2, EMax (ox), EMax (red) und EMax (COFR), wer-

den nach Skalierung auf die Redox-Differenzspektren (3.2.2) ermittelt. Die berechneten

Extinktionen und die sich daraus ergebenden Reduktions- bzw. CO-Anbindungsgrade werden

nach den unter 3.1.2.2 beschriebenen Gleichungen (3.1) und (3.2) berechnet.

Tab. 3.2.2: Ermittelte und berechnete Gesamtextinktionen am Maximum der Absolutspektren von gereinigtem wildtypischem und mutagenisiertem Cyt bo3 und der sich ergebende Reduktions- bzw. CO-Anbindungsgrad. Plasmida EMax(ox) EMax(red) EMax(COFR) EMax(red)

(berechnet)

EMax(COFR)

(berechnet) Reduktions-grad R /%

CO-Anbin-dung C /%

pHCL 0,206 0,263 0,254 0,263 0,254 100 100 pHTAG 0,235 0,267 0,285 0,234 0,250 49 92 pIN 0,217 0,260 0,255 0,247 0,242 72 75 pMC39 0,249 0,273 0,287 0,226 0,237 35 65 DcyoE 0,223 0,283 0,304 0,261 0,281 96 156 E286D 0,248 0,298 0,304 0,248 0,253 74 98 E286Q 0,434 0,415 0,531 0,197 0,252 -19 96 F391Q 0,194 0,249 0,229 0,264 0,243 102 (77)b T352S 0,212 0,265 0,263 0,244 0,256 90 103 T359S 0,223 0,282 0,269 0,261 0,248 96 (87)b Y288F 0,440 0,462 0,640 0,216 0,3 18 196 Zeichenerklärung: awie bei Tab. 3.2.1; bder CO-Anbindungsgrad ist nicht aussagekräftig, da das COFR-Absolutspektrum (Abb. 3.2.1) weitestgehend dem reduzierten entspricht.

3.2.2. Raumtemperatur-Differenzspektren

Die Proben werden entsprechend 2.9.3 angefertigt und vermessen. In Abb. 3.2.2 sind neben den

Redox- die dazugehörigen CO-Differenzspektren gezeigt. Die Konzentrationsbestimmung der

Oxidasen und die Normierung der VIS-Spektren zueinander erfolgt über die differenziellen Ex-

tinktionen der α-Bande bei 560 nm minus 580 nm (siehe auch Text zur Abb. 3.2.2) der Redox-

Differenzspektren. Diese Signalintensitäten dienen als Grundlage zur Berechnung des Umrech-

nungsfaktors, mit dem die Extinktionen der Absolutspektren (Abb. 3.1.7 und Abb. 3.2.1, sowie

Tab. 3.2.2), der CO-Differenzspektren (Tab. 3.1.4) und der CO-Rekombinationskinetiken (Abb.

3.1.8 und Tab. 3.2.5) skaliert werden. In Tab. 3.2.3 sind die Wellenlängen der Extinktionsmini-

ma- bzw. maxima der Redox-Differenzspektren der untersuchten Wildtypen und Mutanten wie-

dergegeben. Bei Spektrendeckung mit dem jeweiligen Wildtyp wird auf eine gesonderte Be-

schreibung verzichtet.

Bei dem Redox-Differenzspektrum werden positive Banden dem reduzierten, negative dem

oxidierten Zustand der Oxidase zugeordnet. Zur Extinktion der Soret-Bande, bei ca. 400-450

nm, tragen sowohl das low-spin, als auch das high-spin Häm etwa im Verhältnis 1:1 bei [65].

Das Differenzsignal der α-Bande, bei ca. 540-580 nm, setzt sich hingegen nahezu nur aus der

Absorption des low-spin Häms zusammen [45; 62] (1.4). Die resultierende α-Bande kann auch

als Kriterium zur Bestimmung der Häm-Spezies, die in der low-spin Hämbindetasche eingebaut

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

62

ist, herangezogen werden [59]. Ein nahezu symmetrischer Aufbau dieser Bande deutet auf

Häm B als low-spin Häm hin.

Abb. 3.2.2: Redox-Differenzspektren (schwarz) und CO-Differenzspektren (rot) der Cyt bo3 Wildtypen und Mutan-ten bei Raumtemperatur. Zur Spektrenaufzeichnung wurde gereinigtes wildtypisches und mutagenisiertes Cyt bo3 eingesetzt. Die Punktmutanten sind durch die Position und die Art des Aminosäureaustauschs gekennzeichnet. Die Spektren sind auf 150 µg/mL bezüglich der Signalintensität der α-Bande mittels des differenziellen Extinkti-onskoeffizienten ∆ε = 18.700 M-1*cm-1 [51] bei 560 nm minus 580 nm berechnet. Die Wellenlängen der Extinkti-onsminima und -maxima sind als Zahlenwert angegeben. Die Spektren sind im Bereich von 400-650 nm dargestellt. Die fünffache Vergrößerung schließt 515-590 nm ein. Bei den CO-Differenzspektren werden positive Banden dem reduzierten, mit am high-spin

Häm gebundenem CO, negative dem reduzierten Zustand der Oxidase zugeordnet. Dominiert

werden die Spektren von positiven Banden bei 416 nm und negativen Banden bei 430 nm. Im

Falle von der ∆cyoE-Mutant ist die Differenzbande auf 420/433 nm verschoben.

Das Redox-Differenzspektrum des pHTAG-Wildtyps weist eine asymmetrisch verlaufende

α-Bande auf, die ein Extinktionsmaximum bei 556,5 nm und eine Schulter um 563 nm besitzt,

d.h., dass neben Häm B ebenfalls Häm O in der low-spin-Hämbindetasche eingelagert ist (ver-

gleiche Abb. 3.1.6). Das hier nicht aufgeführte Spektrum vom pMC39-Wildtyp zeigt einen ähn-

lichen Verlauf dieser Bande. Das Maximum kommt hierbei bei 558 nm und die Schulter eben-

falls um 563 nm zu liegen. Demgegenüber zeigen die pIN- und pHCL-Wildtypen bzw. die auf

ihnen basierenden Mutantenproteine einen nahezu symmetrischen Verlauf der α-Bande mit ei-

nem Maximum bei 561 nm, d.h. Häm B liegt in der low-spin Hämbindetasche vor.

Die Extinktionsminima der ∆cyoE-, F391Q-, T359S- und Y288F-Mutanten sind im Soret-

Bereich um 1-3 nm bathochrom verschoben, wie es aus den Absolutspektren (Abb. 3.2.1) zu

erwarten war.

Betrachtet man die Extinktionsdifferenzen der dargestellten Cyt bo3-Proteine zwischen Mini-

mum und Maximum im Soret-Bereich, so fällt auf, dass mehr oder minder große Extinkti-

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

63

onsschwankungen auftreten, d. h. entweder der Reduktionsgrad eines oder beider Häme variiert

oder, wie beispielsweise bei der Mutante ∆cyoE, ein anderes Absorptionsverhalten, bedingt

durch Häm B in der high-spin Häm Position, vorliegt. Diese Unterschiede sind in Tab. 3.2.4 als

Extinktionsänderung bei ∆EMax.red–Min.ox zusammenfassend dargestellt. Auf eine Auswertung

bezüglich des Reduktionsgrads, ähnlich wie unter 3.2.1 beschrieben, wird hierbei verzichtet, da

im Differenzspektrum nicht zwischen einem unterschiedlichen Absorptionsverhalten der Häm-

Spezies und der Häm-Reduktion unterschieden werden kann.

Tab. 3.2.3: Wellenlängenangabe der Extinktionsminima und -maxima der Redox-Differenzspektren von gereinig-tem wildtypischem und mutagenisiertem Cyt bo3.

Plasmida Soret-Bande Minimum Maximum

β -Bande

α -Bande

pHCL 408 428,5 531 561 pHTAG 409 427 528 556,5 pIN 409 428,5 531 561 pMC39 409 427 529 558 ∆cyoE 410,5 428,5 531 561 F391Q 411 428,5 531 561 T359S 410 428,5 531 561 Y288F 410,5 428,5 531 561 Zeichenerklärung: awie bei Tab. 3.2.1 .

Extinktionsschwankungen findet sich ebenfalls im Vergleich zu den aus den CO-

Differenzspektren (Abb. 3.2.2 rote Spektren und Tab. 3.2.4). Da die hier betrachteten Extinktio-

nen bei ∆E416-430 nur auf die Absorptionsänderung des reduzierten high-spin Häms im CO-

gebundenen Zustand zurückgehen, kann unmittelbar auf den CO-Anbindungsgrad geschlossen

werden. Die differenzielle Extinktion des pHCL-Wildtyp Spektrums (∆E416-430 = 0,142) wird

im Vergleich zu den anderen Oxidasen gleich 100% gesetzt. Diese Oxidase liegt jedoch eben-

falls nicht ganz vollständig in der CO-gebundenen Form vor (Tab. 3.2.4 letzte Spalte). Dies er-

gibt sich aus der Berechnung der Oxidasenkonzentration unter Berücksichtigung des differen-

ziellen Extinktionskoeffizienten ∆ε415-430 = 145.000 M-1*cm-1 [51].

Im Vergleich zu dem aus dem COFR-Absolutspektrum ermittelten CO-Anbindungsgrad zei-

gen die Oxidasen mit nicht wildtypischem Häm-Gehalt, z.B. ∆cyoE und pHTAG erwartungs-

gemäß große Schwankungen. Die zur Berechnungsgrundlage benutzten Extinktionskoeffizien-

ten können diese Proteine nur ungenügend beschreiben bzw. ein direkter Vergleich zwischen

Referenz und diesen Mutanten ist durch das veränderte Extinktionsverhalten strenggenommen

nicht möglich.

Die E286Q-Mutante weist ebenfalls eine große Differenz zwischen der CO-Anbindung von

96% ermittelt aus dem COFR-Absolutspektrum und dem entsprechend aus dem CO-

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

64

Differenzspektrum gewonnen Wert von 156% auf. Bei der Auswertung des Absolutspektrums

konnte gezeigt werden, dass das high-spin Häm reduziert, das low-spin Häm jedoch nur teilwei-

se reduziert vorliegt, d.h. im COFR-Komplex trägt das low-spin Häm ebenfalls nur zum Teil zur

Gesamtextinktion bei. Da die bei den CO-Differenzspektren betrachtete Extinktionsänderung

nur auf das CO-gebundene high-spin Häm zurückzuführen ist, wird dieser Unterschied verständ-

lich. Bei der Y288F-Mutante fällt dieser Unterschied nicht so hoch aus, da das low-spin Häm

stärker reduziert vorliegt.

Tab. 3.2.4: Die aus den Redox-Differenzspektren ermittelten differenziellen Extinktionen und die prozentuale CO-Anbindung an das high spin Häm der jeweiligen Oxidase.

Plasmida red minus ox / ∆EMax.red-Min.ox

COFR minus red / ∆E416-430

CO gebunden ermitteltb / %

CO gebunden berechnetc / %

pHCL 0,298 0,142 100 93 pHTAGd 0,234 0,093 65 61 pIN 0,251 0,099 70 65 pMC39d 0,231 0,084 59 55 ∆cyoEd, e 0,221 0,093 65 61 II E89D 0,266 0,145 102 95 II E89Q 0,255 0,150 106 99 E286D 0,256 0,125 88 82 E286Q 0,305 0,207 146 136 F391Q 0,229 0,077 54 51 T352S (pIN) 0,242 0,131 93 87 T359S (pIN) 0,236 0,084 59 55 Y288F 0,226 0,253 179 167 Zeichenerklärung: awie bei Tab. 3.2.1; bDie aus den COFR- minus reduzierten Spektren ermittelten CO-Anbindung an das high spin Häm in Prozent, bezogen auf die von pHCL exprimierte Oxidase. cDie aus dem Literaturwert für die COFR- minus reduzierten Spektren berechnete CO-Anbindungen an das high spin Häm in Prozent, bezogen auf den differenziellen Extinktionskoeffizienten ∆ε415-430 = 145.000 M-1*cm-1 [51]. dIn diesen Oxidasen liegen andere Häm B zu Häm O Verhältnisse als 1:1 vor und die sich daraus ergebenden unterschiedlichen Extinktionkoeffizien-ten werden nicht berücksichtigt. eDas zur Extinktionsdifferenzberechnung benutzte Minimum bzw. Maximum liegt bei 420 nm bzw. 433 nm. Der aus den nur unvollständig CO-gebundenen T359S- bzw. F391Q-Mutanten ermittelte CO-

Anbindungsgrad von 59% bzw. 54% ist jedoch bei den CO-Differenzspektren im Gegensatz zu

den aus den COFR-Absolutspektren ermittelten Werten aussagekräftig, da nur die Extinktion-

sänderungen zwischen reduziert, CO-gebunden minus reduziert betrachtet werden.

3.2.3 Kohlenmonoxid-Rekombinationsspektren

Die Proben des COFR-Komplexes werden entsprechend 2.9.2 angefertigt und vermessen. Abb.

3.2.3 zeigt exemplarisch am pIN-Wildtyp die zeitabhängigen Änderungen im VIS-Spektrum der

COFR-Probe, welche mit der Photolyse des Komplexes bei Raumtemperatur einhergehen. Es

handelt sich um ein Differenzspektrum, das aus der Subtraktion des Spektrums vor Belichtung

minus dem Spektrum nach Belichtung gebildet wird. Positive Banden sind folglich dem belich-

teten, negative dem unbelichteten Zustand zuzuordnen. Das Spektrum ist von einer negativen

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

65

Bande bei 415 nm und einer positiven bei 430 nm dominiert. Die Differenzbanden werden zeit-

abhängig immer kleiner, d.h. CO bindet wieder an das high-spin Häm an. Nach ca. 100 Millise-

kunden ist die Rückbindung nahezu abgeklungen. Da hier die Rückbindung des CO an das

Fe(II) gezeigt ist, kommt es zur Invertierung der positiven und negativen Extinktionsbanden

gegenüber den CO-Differenzspektren. Die Kinetiken der Extinktionsänderungen bei 430 nm

sind bereits in Abb. 3.1.8. für verschiedene Cyt bo3-Proteine gezeigt worden.

Abb. 3.2.3: Differenzspektren des COFR-Komplexes von Cyt bo3, exprimiert von pIN, 2, 10, 30 und 100 Millis e-kunden nach Applikation des Lichtblitzes.

Die CO-Rekombinations-Kinetik kann mit Hilfe eines logarithmischen Zerfalls erster Ord-

nung angepasst werden. Die gewonnen Ergebnisse und die daraus ermittelten CO-

Anbindungsgrade sind in Tab. 3.2.5 aufgeführt. Die ermittelten Werte für die von Y288F und

∆cyoE exprimierten Oxidasen sind nicht aussagekräftig, da beide eine CO-Relaxation aufzeigen,

die mit dem hier verwendeten Versuchsaufbau nicht zeitlich aufgelöst werden können (verglei-

che Begleittext zur Abb. 3.1.8).

Tab. 3.2.5: Wellenlängenangaben der Extinktionsmaxima der Absolutspektren von gereinigtem wildtypischem und mutagenisiertem Cyt bo3.

Plasmida Amplitude / mOD430 Zeitkonstante τ / ms CO-Anbindung / % pHCL 33,4 12,6 100 pHTAG 17,1 11,7 51 pIN 22,4 11,4 67 PMC39 15,5 11,1 46 ∆cyoE 5,2 23,0 16 E286D 31,2 12,9 93 E286Q 10,4 12,7 31 F391Q 8,4 10,5 25 T352S (pIN) 31,4 14,7 94 T359S (pIN) 18,4 11,4 55 Y288F 1,1 29,2 3

Zeichenerklärung: awie bei Tab. 3.2.1 .

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

66

3.2.4 Aktivitäten

Ein in vitro Aktivitätstest mit dem artifiziellen Substrat Durochinol konnte entwickelt werden

[49]. Die Reaktion des Durochinols mit dem Cyt bo3 zum Durochinon kann zeitabhängig durch

Messung der Extinktionsdifferenz bei 270 nm minus 285 nm VIS-spektroskopisch verfolgt wer-

den. Der Aktivitätstest wird entsprechend 2.8.6 durchgeführt. In vivo kann die physiologische

Aktivität des vom Plasmid kodierten Cyt bo3 durch einen Komplementationtest überprüft wer-

den, d.h. das Plasmid wird in den respirationsdefizienten E. coli Stamm JM107 ∆cyo ∆cyd trans-

formiert und anschließend, nach Inkubation, auf vorhandenes, eingeschränktes oder nicht auftre-

tendes aerobes Bakterienwachstum untersucht. In Tab. 3.2.6 sind diese Ergebnisse dargestellt.

Tab 3.2.6: Durochinol-Oxidase-Aktivität und oxidative respiratorische Komplementation von Cyt bo3 Konstrukten.

Plasmida Mutation Komplementationb DQH2 Oxidase Aktivitätc /%

pHCL (pMC39)

kodiert für eine C-terminal an CyoA oligohistidinmodifizierte Oxidase

+ 100

pHTAG (pMC39)

kodiert für eine C-terminal an CyoD oligohistidinmodifizierte Oxidase

+ 48

pIN (pMC39)

kodiert für eine C-terminal an CyoA oligohistidinmodifizierte Oxidase

+ 64 (100)

pMC39 (pBR322)

keine Modifikation + 45

∆cyoE (pHCL)

Deletion von cyoE, kodiert für ein Cyt bb3

- 0

II E89D (pHCL) H+-Eingang; K-Kanal + 69 II E89Q (pHCL) H+-Eingang; K-Kanal - 0 E286D (pHCL) H+-Leitung; D-Kanal + 98 E286Q (pHCL) H+-Leitung; D-Kanal - 16d

F391Q (pHCL) K-Kanal - 0 T352S (pIN) H+-Leitung; K-Kanal ± 26 (41) T359S (pIN) H+-Leitung; K-Kanal + 57 (90) Y288F (pHCL) Kovalente Bindung zu H284; CuB-

Ligand - 0d

pSTAG (pHCL) Teildeletion von cyoB durch BglII Restriktion

- n.b.

Zeichenerklärung: aDas vom Plasmid-Konstukt überexprimierte Cyt bo3 bzw. Cyt bb3/oo3, mit Ausnahme von pSTAG, das keine Oxidase hervorbringt. Angaben in Klammern sind auf das jeweilige Ursprungsplasmid, auf der das Plasmid-Konstrukt basiert, bezogen. bDie Komplementation wurde getestet, indem das jeweilige Plasmid in den respirationsdefizienten E. coli Stamm JM107 ∆cyo ∆cyd transformiert wurde und anschließend auf LB-Agarose Platten, die 100 µg/mL Ampicillin, 50 µg/mL Kanamycin und 50 µg/mL Chloramphenicol enthielten, ausgestri-chen wurde. „+“ bedeutet, dass relativ große, sichtbare Bakterienkolonien ü.N. bei 37°C gewachsen sind. „±“ be-deutet, dass relativ kleine, sichtbare Bakterienkolonien ü.N. bei 37°C gewachsen sind, „-„ steht für nahezu nicht sichtbare Kolonien. cDie Durochinol-Oxidase-Aktivität vom pHCL-Wildtyp wurde als Referenz benutzt. 100 % entspricht 88 ± 2 (n=3) Elektronen pro Sekunde.Die angegebenen Prozentwerte schwanken maximal um ± 7%. Angaben in Klammer sind entsprechend auf den pIN-Wildtyp als Referenz bezogen. dDa das low-spin Häm in die-sen Mutanten nicht vollständig reduziert vorliegt (Abb. 3.2.1), sich die Konzentrationsbestimmung jedoch auf die α-Bande des Redox-Differenzspektrums bezieht, wurde zuviel Oxidase im Aktivitätstest eingesetzt.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

67

3.3 FT-IR Probenpräparation und der Lösungsmittelaustausch von H2O zu

D2O

Um FT-IR-spektroskopisch auswertbare Proben erstellen zu können, ist es notwendig, dass der

Wasseranteil der Proteinprobe gering, die Schichtdicke dünn, der Proteinanteil jedoch hoch sein

muss. Der Austausch des Lösungsmittels von Wasser (H2O) zu Deuteriumoxid (D2O) stellt zu-

sätzlich zu der Erstellung von ortsspezifischen und/oder isotopenmarkierten Mutanten eines

Proteins eine wichtige Methode zur Bandenzuordnung von Aminosäureresten und deren Wech-

selwirkungen mit deren Umgebung innerhalb der FT-IR Spektroskopie dar (1.5.3).

Um die Parameter der Probenpräparation und des Lösungsmittel- (H2O/D2O-) Austauschs

möglichst hochreproduktiv einhalten zu können, wird eine Probenpräparationskammer, im wei-

teren Gasaustauschzelle genannt, benötigt. Die Konstruktion dieser Gasaustauschzelle wurde in

Anlehnung an die von B. Mamat [126] erstellte Kammer verbessert und vielfach modifiziert,

sodass eine erneute Darstellung nötig ist. Die Gasaustauschzelle ist in dieser Form bereits von

K. Vogtt und K. Bettinger während der Erstellung Ihrer Diplomarbeiten verwendet worden [85;

127] und kam ebenfalls bei der IR-Probenerstellung für den konformativen Wechsels des Glu-

286 gekoppelt an den Elektronentransferschritt des low spin Häm B zum Einsatz [105].

3.3.1 Gasaustauschzelle

Die an die Präparation von Cyt bo3-Proben für die FT-IR Spektroskopie gestellten Anforderun-

gen sind vielfältig. Eine Grundvoraussetzung für ein reproduzierbares FT-IR Spektrum ist eine

homogene IR-Probe, die von Probe zu Probe u.a. möglichst geringe Schwankungen bezüglich

ihres H2O- bzw. D2O-Gehalts, der Schichtdicke und der Protein- und Additivkonzentrationen,

wie z.B. caged electrons oder caged dioxygen aufweist. Darüber hinaus werden z.B. Kohlenmo-

noxid-mixed valence (COMV) Proben erstellt, die eine sauerstofffreie CO-Atmosphäre während

der Präparation benötigen [127].

Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, müssen Eigenschaften der verwendeten Sub-

stanzen wie z.B. die Konzentration der Oxidase oder die Pufferzusammensetzung, vor allem

hinsichtlich der Wahl der Detergenzien, genau bekannt sein. Da Wasser einen starken IR-

Absorber darstellt, muss der Feuchtigkeitsanteil der Probe reduziert werden. Dies kann bei-

spielsweise im Exsikkator durch Anlegen von Unterdruck geschehen. Da ein natives, physiolo-

gisch aktives Protein eine Hydrathülle benötigt, darf die Proteinprobe entweder nicht zur Gänze

eingeengt werden oder die Probe muss nach dem Eintrocknen rehydriert werden, z.B. durch

Anhauchen. Sollen jedoch deuterierte Proben erstellt werden, versagen beide Methoden. Die

zuvor mit D2O versetzte und eingeengte Probe kommt beim Druckausgleich bzw. Öffnen des

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

68

Exsikkatordeckels immer mit der wasserdampfdurchsetzten Luft in Berührung und kann in nur

wenigen Sekunden wieder einen H2O-Anteil von bis zu 50% anreichern. Für manche Fragestel-

lungen kann es nötig sein, dass die Oxidase unter einer bestimmten anaeroben Atmosphäre, wie

z. B. Schutzgas (Argon), wie im Falle des bovinen Cyt aa3 oder Kohlenmonoxid präpariert wer-

den muss.

Für all diese Anwendungen wird eine Konstruktion benötigt, die einerseits das Eintrocknen

und das Rehydrieren der Probe unter definierten Bedingungen und andererseits den Austausch

des Gases ermöglicht, das die Probe umgibt. Ein unmittelbarer Kontakt der Probe mit der Au-

ßenluft muss verhindert werden. Die Calciumfluorid-Fenster können durch Apiezonfett gasdicht

verschlossen werden, d. h. die beiden Fenster müssen vor Kontakt mit dem Exsikkatoraußen-

medium bereits abgedichtet vorliegen.

Die Erstellung der Gasaustauschzelle erfüllt diese Anforderungen. In Abb. 3.3.1 ist der sche-

matische Querschnitt (links) und eine Fotografie (rechts) der Gasaustauschzelle gezeigt. Auf die

Darstellung der Zu- und Ableitungen, sowie die Membranpumpe und die Gasflaschen wurde

verzichtet.

Exsikkator

EinlassCOCaF -Fenster

mit Probe 2

Probenhalter

Rinne fürH O / D O2 2

CaF -Fenster2

Deckel

Beweglicher Stempel

Auslass zur Vakuum-

pumpe

A B

Abb. 3.3.1: Schematischer Aufbau (A) und Fotografie (B) der Gasaustauschzelle. Die Querschnittszeichnung wur-de ausgehend von der von K. Vogtt erstellten Abb. leicht modifiziert. Die Probenbereitung erfolgt wie unter 2.10.1 beschrieben. Die Oxidaseprobe sollte sich in

β-Decylmaltosid-haltigem Puffer befinden. Dieses Detergenz zeigt aus Erfahrungen die bisher

besten Eigenschaften während der Probenpräparation. Beim Einengen der Probe durch Unter-

druck entsteht bei entsprechend kleinem Volumen (2,5-5,0 µL) ein homogener blasenfreier Pro-

teinfilm auf dem Calciumfluorid-Fenster. Zum Rehydrieren wird die Rinne des Probenhalters

zuvor mit Wasser gefüllt. Sollen deuterierte Proben erstellt werden, wird sie entsprechend mit

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

69

D2O befüllt. Die Membranpumpe erzeugt einen Unterdruck, der zum vollständigen Eintrocknen

der Probe genutzt wird. Pro Mikroliter Flüssigkeit wird mit einer Minute angelegtem Unter-

druck gerechnet. Nachdem der Auslasshahn geschlossen ist, gehen H2O- bzw. D2O-Moleküle

aus der Rinne des Probenhalter in den gasförmigen Aggregatzustand über, sättigen die Exsikka-

torinnenraum-Atmosphäre ab und befeuchten somit die hygroskopische Probe erneut. Dieser

Befeuchtungssvorgang verläuft in der zeitlichen Größenordnung von Minuten und ist abhängig

von der Konzentration an hygroskopischen Substanzen, wie z.B. der Natriumchlorid-, der Prote-

in- oder auch der Detergenzkonzentration der Probe. Es stellt sich heraus, dass beispielsweise

eine Erhöhung der NaCl-Konzentration um 50 mM, bei gleichem Probenvolumen, die notwen-

dige Verweildauer der Probe in der H2O bzw. D2O gesättigten Atmosphäre um ca. 30-60 Se-

kunden verringert. Nach eineinhalb bis drei Minuten ist dieser Vorgang abgeschlossen und das

zweite Calciumfluorid-Fenster wird mit dem beweglichen Stempel auf das am Rand dünn einge-

fettete Probenfenster gedrückt. Die Gasaustauschzelle wird belüftet, die verschlossenen Calci-

umfluorid-Fenster aus dem Probenhalter entnommen und in die FT-IR Küvette eingelegt. Das

Deckplättchen der Küvette wird mit drei Schrauben so fest verschraubt, dass ein homogener, ca.

5 µm dicker und im Durchmesser ca. 4-5 mm großer Probenfilm entsteht. Es werden somit Cyt

bo3-IR-Proben erhalten, die ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit besitzen.

3.3.2. H2O/D2O Austausch

Bislang war es nicht möglich, alle protonierbaren Gruppen einer Cyt bo3-Probe, die in FT-IR-

Küvetten photochemisch einem Redoxwechsel unterzogen werden sollen, quantitativ zu deute-

rieren. Mit dem Einsatz von IR-Proben, die mittels der Gasaustauschzelle erstellt werden, soll

nun einerseits dieser 1H/2H-Austausch, auch H/D-Austausch genannt, auf Vollständigkeit ge-

prüft werden, andererseits soll die postulierte Schalterfunktion an der hydrophoben Barriere der

Aminosäure Glu-286 [29] bei vollständigem H/D-Austausch untersucht werden.

Bei der photoreduktions-induzierten Redoxdifferenz FT-IR-Spektroskopie (PR Differenz-

spektroskopie) wird ein Redoxwechsel der Oxidase durch Photolyse einer caged Verbindung, in

diesem Falle eine FMN-EDTA Lösung (caged electrons) erzielt [81]. Caged Verbindungen

werden bei biologischen Systemen verwendet, um eine Reaktion zu einem definierten Zeitpunkt

zu initiieren. Zum Mechanismus der Photoreduktion von caged electrons siehe 1.5.2 und Abb.

1.5.3. Bei der IR-Messung wird ein Spektrum vor Belichtung (oxidiert) und eines nach Belich-

tung (reduziert) aufgenommen und anschließend das reduzierte minus oxidierte Cyt bo3-Photo-

reduktions-Differenzspektrum (PR-Differenzspektrum) gebildet, d.h. positive Differenzbanden

entsprechen dem reduzierten-, negative dem oxidierten Zustand des Cyt bo3 (Abb. 1.5.2).

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

70

In der Veröffentlichung Lübben et al., 1999 [29], konnte gezeigt werden, dass das FT-IR-

Redoxdifferenzsignal bei 1745/1735 Wellenzahlen (cm-1) auf Glu-286 zurückgeht. Dieser Ami-

nosäurerest liegt sowohl im reduzierten als auch oxidierten Zustand des Cyt bo3 protoniert an

der Carboxylgruppe der Seitenkette vor.

Die Streckschwingung der C=O-Bindung (ν(C=O)) der Carbonylgruppen von Carboxylresten

der isolierten Aminosäuren Asp und Glu können im Wellenzahlenbereich von 1710-1790 cm-1

beobachtet werden. Die ν(C=O)-Schwingung ist sensitiv gegenüber Wasserstoffbrücken, die bei

starker H-Bindung Verschiebungen von bis zu 50 cm-1 hervorrufen können [93]. Dabei gilt als

generelle Regel, dass H-Brücken die Frequenz dieser Streckschwingung erniedrigen [128].

Die positive Differenzbande des Glu-286 bei 1735 cm-1 wird dem vollständig reduzierten Zu-

stand des Cyt bo3 zugeschrieben, der sich in einer hydrophileren Umgebung gegenüber dem

oxidierten Zustand bei 1745 cm-1 befindet [29]. Nach dem Lösungsmittelaustausch von H2O zu

D2O des Cyt bo3 im Exsikkator wurde in dieser Veröffentlichung eine Bandenverschiebung der

positiven Differenzbande um 8 cm-1 zu kleineren Wellenzahlen auf 1727 cm-1 beobachtet. Das

Minimum des negativen Signals verschob dabei nicht. Dieser Befund wurde so gedeutet, dass

sich die Carbonylgruppe des Glu-286 im Falle der reduzierten Oxidase in einer wasserzugängli-

chen-, im Falle des oxidierten Cyt bo3 in einer wasserunzugänglichen Position innerhalb des

Proteins befindet, d.h. eine H-Brückenbindung konnte nicht direkt nachgewiesen werden. Somit

wird der Aminosäure Glu-286 eine Schalterfunktion beim Protonentransports im D-Kanal in

Form einer hydrophoben Barriere beim Redoxwechsel zugeordnet. Bei vollständigem H/D-

Austausch, ermöglicht durch die Gasaustauschzelle soll diese Zuordnung bestätigt werden.

Bevor die Schalterfunktion von Glu-286 untersucht werden kann, muss eine Technik entwi-

ckelt werden, die einen nahezu vollständigen Austausch des Lösungsmittels H2O zu D2O ermög-

licht. Hierzu werden Cyt bo3-Proben mit caged electron-Lösung auf dem Calciumchloridfenster

vermischt und in der Gasaustauschzelle präpariert. Die Rinne des Probenhalters wird von Probe

zu Probe mit prozentual unterschiedlich zusammengesetzten Lösungen von H2O und D2O be-

füllt. In Abb. 3.3.2 sind die Einkanalspektren dieser Proben gezeigt. Wenn im Folgenden von

der 0% H2O-Probe geschrieben wird, so ist dies auf die Wiederbefeuchtung des Cyt bo3 wäh-

rend der Probenpräparation mit nahezu reinem D2O (99,8%) zu beziehen und nicht auf den tat-

sächlichen H2O-Gehalt der Probe. Dies gilt ebenfalls für die restlichen Proben, mit Ausnahme

der 100% H2O-Probe, die nur den natürlich vorkommenden Isotopengehalt an Deuteriumoxid

(0,015%) aufweist [129].

Das Verhältnis der ν(H2O)-OH-Streckschwingung der Wasserbande (um 3400 cm-1) zur

ν(D2O) OD-Streckschwingung der Bande des Deuteriumoxids (um 2500 cm-1) dient hierbei

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

71

qualitativ als Kontrolle für den erfolgten H/D-Austausch. Deutlich ist bei der nahezu komplett

ausgetauschten D2O-Probe (in Abb. 3.3.2 schwarzes Spektrum) die hervortretende N-H-

Streckschwingung, in Resonanz mit dem Amid II-Oberton, der Amid A Bande (um 3300 cm-1)

zu erkennen. Die Absorption der ν(H2O) OH-Streckschwingung trägt nur noch zu einem sehr

kleinen Teil zur Transmission in diesem Bereich bei. In dem für Proteine besonders interessan-

ten Wellenzahlenbereich von 2600-900 cm-1 dominieren zwei Transmissionsbanden, Amid I und

Amid II genannt, die auf die Rückgratschwingungen der Peptidbindungen zurückzuführen sind

(Tab. 1.5.2). Im Folgenden werden diese Peptid-Schwingungen häufig erwähnt. Um sprachlich

zwischen dem Einkanal- und dem PR-Differenzspektrum zu unterscheiden wird von der „Amid

(I bzw. II)-Transmissionsregion“ und von der „Amid (I bzw. II)-Region“ geschrieben. Ist ganz

allgemein von diesen Schwingungen die Rede, so wird sie als Amid (I bzw. II)-Bande bezeich-

net. Die Amid I Bande setzt sich im Wesentlichen aus der C=O-Streckschwingung der Peptid-

bindung (1600-1700 cm-1) und additiv bei wässrigen Proben aus der breiten γ(H2O)-

Scherschwingung des Wassers (um 1645 cm-1) zusammen. Die Amid II Bande absorbiert im

Bereich von 1480-1575 cm-1 und ist durch die N-H-Biegeschwingung und die C-N-

Streckschwingung der Peptidbindungen geprägt (alle Wellenlängenangaben aus [92]). In den

Einkanalspektren der Cyt bo3-Proben weisen diese Transmissionsbanden Minima um 1657 cm-1

bzw. 1547 cm-1 bei wässrigen Proben auf.

Abb. 3.3.2: FT-IR Einkanalspektren vom gereinigtem pHCL-Wildtyp, präpariert in unterschiedlichen H2O/D2O Verhältnissen des zum Wiederbefeuchten der Probe verwendeten Lösungsmittels. Für die Übersichtsspektren wur-den 100 Interferogramme im Bereich von 4000-800 cm-1 ohne Filter und mit 2cm-1 Auflösung aufgenommen und gemittelt. Sie werden von 4000-1000 cm-1 dargestellt. Die hier vermessenen Cyt bo3-Proben sollen Aufschluss über die Lage der ν(C=O) Streck-

schwingung der Carbonylgruppe des Glu-286 in deuteriertem Milieu geben. Diese Schwingun-

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

72

gen können im Bereich von 1710-1790 cm-1 gefunden werden. Eine Auswertung der Redox-FT-

IR-Spektren unterhalb von 1630 cm-1 ist nicht möglich, da dieser spektrale Bereich stark von

den Banden der Photolyseprodukte der caged Verbindung überlagert ist (Abb. 3.4.1).

In Abb. 3.3.3 sind einerseits die PR-Differenzspektren (oben) der in Abhängigkeit zum

H2O/D2O Verhältnis erstellten Cyt bo3-Proben gezeigt, andererseits die sich daraus ergebenden

PR-Doppeldifferenzspektren (unten), wobei das Differenzspektrum der 100% H2O-Probe als

Minuend dient.

Abb. 3.3.3: PR-Differenzspektren vom pHCL-Wildtyp, präpariert in Abhängigkeit vom H2O/D2O-Verhältnis der zum Wiederbeuchten der Proben verwendeten Lösungsmittels (oben) und die sich daraus ergebenden Doppeldiffe-renzspektren (unten). Beide Darstellungen werden von 1780-1690 cm-1 gezeigt. Die Doppeldifferenzen sind ca. 1,5fach gegenüber den Differenzspektren vergrößert dargestellt. Die Differenzbande bei 1696/1691 cm-1 in der oberen Darstellung bewahrt ihre Lage unab-

hängig vom Reduktionsgrad und dem D2O-Gehalt der Probe. Sie kann daher zur Skalierung der

Einzelspektren zueinander herangezogen werden [29]. Eine genaue Zuordnung dieser Bande auf

eine bzw. mehrere funktionelle Gruppen, auf die das Differenzsignal zurückzuführen ist, ist bis-

her nicht getroffen worden. In der Abb. 3.3.3 sind die Spektren mit einer Gesamtextinktion von

1 mOD auf diese Bande bezogen.

Bei dem 100% H2O-Differenzspektrum ist ein deutliches Signal, mit einer negativen Extinkti-

onsbande bei 1745 cm-1 und einer positiven bei 1735 cm-1 erkennbar. Diese Differenzbande

kann dem Glu-286 des Cyt bo3 zugeordnet werden (Abb. 3.3.4). Eine breite Schulter mit positi-

ver Extinktion kann im Bereich von ca. 1730-1704 cm-1 aufgelöst werden.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

73

Das 75% H2O-Spektrum weist bereits ein zusätzliches Extinktionsmaximum bei 1727 cm-1

auf, das bei weiter sinkendem Wassergehalt an Intensität gewinnt. Die Intensität des Extinkti-

onsmaximums bei 1735 cm-1 nimmt in Korrelation dazu ab, bis es schließlich bei dem Diffe-

renzspektrum der 0% H2O-Probe nicht mehr erkennbar ist. Es handelt sich hierbei um die Car-

bonylgruppen der Glu-286 γ-Carbonsäurefunktion, die in Abhängigkeit zum steigenden D2O-

Gehalt der Probe einen immer weiter sinkenden Anteil an Wasserstoff- bzw. im selben Maße

wachsenden Anteil an Deuteriumbrücken erhalten.

Bei der Betrachtung der negativen Bande bei 1745 cm-1 fällt auf, dass sich die Lage des Ex-

tinktionsminimums, bis zum 50% H2O-Differenzspektrum praktisch nicht ändert und nur die

Signalintensität abnimmt. Erst bei dem 25% H2O-Spektrum ist eine Verschiebung des Mini-

mums zu beobachten, die bei dem 0% H2O-Spektrum bei ca. 1737 cm-1 nahezu abgeschlossen

ist. Das Extinktionsminimum der oxidierten Bande in deuterierter Umgebung fällt also mit dem

Maximum der reduzierten Bande bei wässrigen Proben bei 1735 cm-1 nahezu zusammen. Zwei

isosbestische Punkte bei 1741 cm-1 und 1730 cm-1 sind vorhanden, die bei den Doppeldifferenz-

spektren die Nulldurchgänge charakterisieren.

Im Gegensatz zu [29], zeigen die Doppeldifferenzspektren einen nahezu symmetrischen Auf-

bau im Bereich von 1770-1700 cm-1, d.h. der Austausch von H-Brücken zu D-Brücken findet

sowohl bei der reduzierten, als auch der oxidierten Bande des Glu-286 im selben Maße statt.

Diese Korrelation wird in den Differenzspektren durch das annähernde Zusammenfallen des

Extinktionsmaximums der wässrigen- und des Extinktionsminimums der deuterierten Proben

um 1735 cm-1 überlagert und tritt erst bei hohem H/D-Austausch sichtbar und deutlich hervor.

Als Resultat lässt sich festhalten: Da das negative Signal bei 1745 cm-1 beim gasförmigen Lö-

sungsmittelaustausch von H2O zu D2O nach 1737 cm-1 verschiebt, muss die Carbonylgruppe des

Glu-286 im oxidierten Zustand ebenfalls in Wasserstoffbrückenvernetzung vorliegen.

3.3.3 Anwendungsbeispiele

An einigen ausgewählten Cyt bo3-Mutanten, die auf pHCL basieren, wird der H/D-Austausch

auf annähernde Vollständigkeit überprüft (Abb. 3.3.4). Der konformative Wechsel des Glu-286

ist an die Oxidation bzw. die Reduktion des Cyt bo3 gekoppelt. Die dargestellten Mutantenprote-

ine werden ausgesucht, um nachzuweisen, dass dieser konformative Wechsel des Glu-286 mit

dem Redoxübergang des low-spin Häms einhergeht und nicht an den des high-spin Häms bzw.

des CuB gekoppelt ist.

Die eingesetzten IR-Proben sind mit caged electrons versetzt und weisen 75 µg gereinigte

Oxidase auf. Zur Photoreduktion wird Halogenlicht verwendet. Vor und nach der FT-IR Mes-

sung werden VIS-Spektren zur Kontrolle des Reduktionsgrades der Proben aufgenommen. Sie

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

74

liegen demnach alle nach abgeschlossener Messung vollständig reduziert vor (Daten nicht ge-

zeigt, vergleiche hierzu Abb. 3.4.4). Auf eine zusätzliche Darstellung der Einkanalspektren, die

einen nahezu kompletten H/D-Austausch zeigen, wird verzichtet.

Abb. 3.3.4: PR-Differenzspektren vom gereinigtem pHCL-Wildtyp und Cyt bo3 (pHCL)-Mutanten, präpariert in H2O- (schwarz) bzw. D2O- (rot) Atmosphäre. Die Darstellungen werden von 1780-1690 cm-1 gezeigt und sind auf eine Gesamtextinktion von 0,75 mOD bezüglich der 1696/1691 cm-1-Differenzbande skaliert. Der pHCL-Wiltyp, die ∆cyoE- und Y288F-Mutante weisen in ihren H2O-Spektren in Abb.

3.3.4 alle eine Differenzbande bei 1745/1735 cm-1 auf, die bei H/D-Austausch zu 1737/1727

cm-1 verschiebt, d.h. es handelt sich um einen nahezu kompletten Austausch. Bei der Cyt bo3-

Mutante E286D und der Doppelmutante E286D/Y288F fehlt dieses Signal in den PR-

Differenzspektren. Stattdessen erscheint in den H2O-Spektren eine schwach erkennbare negative

Bande um 1763 cm-1. In den D2O-Spektren befinden sich Differenzbanden bei 1760 cm-1 und

1755 cm-1. In den hier dargestellten Spektren lässt sich die positive Bande bei wässrigen Proben

nur erahnen, sie tritt jedoch bei den APR-Proben bei 1767 cm-1 hervor (Abb. 3.4.12). Diese Dif-

ferenzsignale der E286D- bzw. der Doppelmutante E286D/Y288F sind gegenüber dem Wildtyp-

spektrum invertiert, d.h. die reduzierte Bande ist zu höheren, die oxidierte zu niedrigeren Wel-

lenzahlen verschoben. Die Signalintensitäten der Differenzbanden sind stark erniedrigt, wobei

die Signalstärke bei den D2O-haltigen Proben zunimmt. Auch diese beiden Mutanten lassen ei-

nen Lösungsmittelaustausch durch die Präparation in der Gasaustauschzelle zu.

Die Cyt bo3 Mutante Y288F weist eine eingeschränkte Reduktion mit Natriumdithionit bezüg-

lich des low-spin Häms auf (3.2.1). Dieser Befund ist ebenfalls mit den zur Photoreduktion ein-

gesetzten caged electrons zu beobachten. Da die Reduktion des low-spin Häms mit dem kon-

formativen Wechsel des Glu-286 einhergeht [105], muss etwa die zweifache Menge an Protein

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

75

zur Probenpräparation eingesetzt werden, um ähnliche Signalintensitäten der 1745/1735

cm–1 Differenzbande zu erreichen. Dies führt jedoch bezüglich der Amid I-Transmissionsbande

zu einer für Infrarotlicht nahezu undurchlässigen Probe. Das Signal-zu-Rausch Verhältnis sinkt

entsprechend in diesem Bereich ab. Somit wirken sich bereits kleine Basislinienschwankungen

in den PR-Differenzspektren bis in den ν(C=O)-Streckschwingungsbereich aus. Im Spektrum

der Y288F bzw. E286D/Y288F-Mutante lässt sich dies durch die negative Drift im Bereich un-

terhalb von 1725 cm-1 erkennen.

Ob der konformative Wechsel des Glu-286 durch die Reduktion des low-spin Häms ausgelöst

wird, soll nun überprüft werden. Das Protein der CuB defizienten Mutante Y288F [104; 105]

zeigt bezüglich der Glu-286 Bande bei 1745/1735 cm-1 wildtypisches Verhalten. Zur genaueren

Identifikation der Differenzbande, wird ein Spektrum der Doppelmutante E286D/Y288F aufge-

nommen. Die zugehörige Carbonylextinktion der Glu-286 Bande fehlt und das Spektrum ist in

dem dargestellten Wellenzahlenbereich nahezu gleich mit dem Spektrum der E286D-Mutante.

Hieraus kann abgeleitet werden, dass der konformative Wechsel des Glu-286 auch in Abwesen-

heit von CuB stattfindet.

Die Häm O defiziente Mutante ∆cyoE ist vornehmlich zur Darstellung des erfolgten H/D-

Austauschs gezeigt. Im FT-IR Spektrum ist die dem Glu-286 zugeordnete Bande ebenfalls vor-

handen, d.h. auch bei Austausch von Häm O zu Häm B in der high-spin Häm-Bindetasche, der

bezüglich des in vivo und in vitro Aktivitätstest zu einem inaktiven Cyt bb3 führt, findet der kon-

formative Wechsel des Glu-286 bei Reduktion statt.

Aus hier nicht weiter gezeigten Daten, in denen das high-spin Häm selektiv durch Cyanid blo-

ckiert ist, findet dennoch der konformative Wechsel des Glu-286 bei Reduktion statt [29].

Dies zeigt deutlich, dass der konformative Wechsel des Glu-286 nicht mit dem high-spin Häm

und dem CuB einhergeht. Es deutet also alles darauf hin, dass das low-spin Häm den Wechsel

induziert. Einen direkten Nachweis, dass der konformativen Wechsels des Glu-286 an die Re-

duktion des low-spin Häms gekoppelt ist, konnte durch FT-IR Messungen des Cyt bo3 COMV-

Komplexes in Verbindung mit caged dioxygen und caged electrons erbracht werden [105]. Die

weiterführenden Erläuterungen werden unter 4.2.2 wieder aufgenommen.

3.4 Auto-photoreduktions-induzierte FT-IR Differenz-Spektroskopie am

Cyt bo3

Die PR-Differenzspektroskopie mittels caged electrons (FMN-EDTA Lösung) konnte erfolg-

reich an Cytochrom Oxidasen, wie z. B. der aa3 Oxidase von Rhodobacter sphaeroides und der

bo3-, sowie der bd Oxidase von E. coli durchgeführt werden [29; 81; 130; 131].

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

76

Alle erhaltenen PR-Differenzspektren besitzen eine gemeinsame Grundproblematik. Die Re-

duktion der Cytochrom Oxidasen ist durch die lichtinduzierte Freisetzung von Elektronen (ca-

ged electrons) initiiert (1.5.2). Der sogenannte „opfernde“ Elektronendonor EDTA wird bei

Lichtanregung und Reaktion des FMN irreversibel oxidiert. Hierbei entstehen unterhalb von ca.

1630 cm-1 Redoxbanden, die die Differenzsignale des Proteins überlagern (Abb. 3.4.1). Da in

Abwesenheit des Proteins keine Reaktion mit F* stattfindet, entstehen keine EDTA-

Redoxprodukte [81]. Somit können diese Redoxbanden nicht vom PR-Differenzspektrum der

Cytochrom Oxidasen abgezogen werden. Eine Zuordnung von Redox-Differenzsignalen des

Proteins ist bei dieser Messmethode im Bereich unterhalb von 1630 cm-1 daher nicht möglich.

K. Bettinger konnte in ihrer Diplomarbeit [85] die Grundlagen für eine nicht invasive, APR-

Messmethode an Cytochrom Oxidasen entwickeln, die keinen Einsatz von caged compounds

benötigt. Dabei konnte die als Nebenreaktion auftretende Kohlenmonoxidbildung von der APR-

Reaktion der Oxidase separiert und unterdrückt werden. Die IR-Proben wiesen nach Belichtung

mehr als 90% Gesamtreduktion auf. Die ersten erhaltenen APR-Differenzspektren zeigen nur

noch die Redox-Differenzsignale des Proteins auf, die an dieser Reaktion beteiligt sind.

In diesem Unterpunkt werden nun die Grundlagen und erste Anwendungen an Cyt bo3-

Mutanten erarbeitet, die reproduzierbare APR-Differenzspektren liefern. Die erhaltenen Diffe-

renzspektren sind komplex zusammengesetzt. Daher müssen die Ergebnisse bereits zum Teil

interpretiert werden, um verständlich zu bleiben.

3.4.1 Vorbedingungen zur Reproduzierbarkeit der auto-photoreduktions- induzierten FT-

IR Redox-Differenzspektren

Zunächst werden die Bedingungen ermittelt, die reproduzierbare APR-Differenzspektren ermög-

lichen. Hierzu werden einerseits von den APR-Proben Einkanalspektren zur Qualitätskontrolle

angefertigt und andererseits die erhaltenen, untereinander skalierten APR-Differenzspektren auf

Signaldeckung verglichen. Als zusätzliches Qualitätskriterium werden die APR-Proben vor und

nach erfolgter IR-Messung VIS-spektroskopisch untersucht. Hierbei wird ein Absolutspektrum

vor Belichtung (oxidiert) und eines nach Belichtung (auto-photoreduziert) aufgezeichnet und auf

Reduktionsvollständigkeit überprüft. Darüber hinaus wird ein CO-Rekombinationsspektrum

angefertigt, um eine etwaige ungewünschte CO-Freisetzung zu dokumentieren.

Vor Ausarbeitung der Qualitätskriterien wird zunächst die Grundproblematik verdeutlicht, dass

nur ein sehr begrenzter Wellenzahlenbereich bei den PR-Differenzspektren auswertbar ist. In

Abb. 3.4.1 ist die Entstehung der Differenzspektren in Abhängigkeit von der Belichtungsdauer

(lichtinduzierte Differenzspektren-Entwicklung) der PR- und APR-Proben am Beispiel des pIN-

Wildtyps gezeigt.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

77

Positive Extinktionsbanden entsprechen dem reduzierten, negative dem oxidierten Zustand der

Oxidase. Im Graphen sind die Extinktions-Nullinien dargestellt. Beide Proben liegen nach er-

folgter IR-Messung reduziert vor. Für die APR-Probe bei pH 8,0 ist dies exemplarisch in Abb.

3.4.4 aufgezeigt. Das jeweils zuletzt aufgenommene PR- bzw. APR-Differenzspektrum wird

über die 1696/1691 cm-1 Bande auf 0,75 mOD skaliert. Die kürzer belichteten Spektren der

lichtinduzierten Differenzspektren-Entwicklung werden entsprechend mit dem daraus ermittel-

ten Umrechnungsfaktor multipliziert. Da bei der PR-Probe die doppelte Proteinmenge gegen-

über der APR-Probe eingesetzt wird, ist bei dem PR-Differenzspektrum die Signalintensität ge-

genüber dem Rauschen entsprechend erhöht.

Abb. 3.4.1: PR- und APR-Differenzspektren des pIN-Wildtyps bei pH 8,0. Oben: 75µg Oxidase wurden mit caged electrons vermischt und mit dem Licht einer Halogenlampe bei 4°C photoreduziert. Unten: 37 µg Oxidase wurden ohne caged compound mit dem Licht einer Xenon-Bogenlampe bei 4°C auto-photoreduziert. Bei der lichtinduzier-ten Differenzspektren-Entwicklung ist nur das zweite und ab dann jedes dritte Differenzspektrum der insgesamt 20 aufgezeichneten Spektren gezeigt. Die Skalierung zueinander erfolgt über die 1696/1691 cm-1 (0,75 mOD) Diffe-renzbande. Auf die Beschriftung mit Wellenzahlen der dominierenden Extinktionsminima und –maxima wird hier-bei verzichtet, wobei einige exemplarische Banden hervorgehoben wurden, die in beiden Spektrenverläufen ge-meinsam vorhanden sind. Beide Spektren werden von Differenzsignalen im Bereich von ca. 1700-1520 cm-1 dominiert.

Die größten gemessenen Differenzextinktionen der Originalspektren liegen für die PR-Proben

um 4,5 mOD, für die APR-Proben um 2 mOD. Dies entspricht einer Vergrößerung der Diffe-

renzspektren um etwa das 250-500fache gegenüber den Absolutspektren (1.5.2, Abb. 1.5.2). Die

größten Extinktionsdifferenzen werden im Bereich der Amid I Region (1680-1620 cm-1) und der

Amid II Region (1560-1520 cm-1) gefunden. Diese Differenzen gehen auf konformative Ände-

rungen des Cyt bo3 während des Redoxwechsels zurück [81]. Die Bande bei 1696/1691 cm-1

liegt in einem Bereich, in dem die Häm-Kofaktoren absorbieren können [132].

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

78

Im Bereich unterhalb von ca. 1630 cm-1 weisen die verglichenen Spektren deutliche Unter-

schiede auf. Das PR-Differenzspektrum wird hierbei von den Photolysebanden des caged com-

pounds stark beeinflusst. Trotzdem lassen beide Spektrenverläufe auch gemeinsame Banden

erkennen (gepunktete Linien), d.h. beide Spektrenverläufe weisen auf ein ähnliches bzw. glei-

ches Reduktionsverhalten des Cyt bo3 hin. Da für die PR-Differenzspektren keine Vergleiche

ohne caged compound vorliegen, ist eine Differenzierung zwischen Banden, die auf den Re-

doxwechsel des Proteins bzw. der FMN-EDTA-Lösung zurückgehen, nicht möglich.

Um über einen möglichst großen Wellenzahlenbereich auswertbare Spektren zu erhalten, müs-

sen verschiedene Parameter eingehalten werden. Einige dieser Parameter, wie z.B. der Wasser-

gehalt der Probe wurden bereits unter 3.3.1 vorgestellt. Nun müssen Kriterien entwickelt wer-

den, die möglichst große Redox-Differenzsignale des Proteins bei möglichst geringem Hinter-

grund-Rauschen ermöglichen. Hierbei sind zwei konträr zueinander verlaufende Aspekte zu

beachten. Zum einen weist die Amid I Transmissionsbande in den Einkanalspektren die kleins-

ten Resttransmissionen im Bereich von 2000-1150 cm-1 auf und es besteht die Gefahr, dass im

Amid I Bereich eine für IR-Strahlung nahezu undurchlässige Probe erhalten wird. Zum anderen

sind die Differenzsignale außerhalb der Amid Regionen meist deutlich kleiner, so dass bei einer

zu geringen Proteinkonzentration eine Auswertung der Differenzbanden durch den geringen

Unterschied zum Hintergrund-Rauschen nicht möglich ist.

Um die Qualität der zur IR-Messung eingesetzten APR-Proben zu überprüfen, werden u.a.

Einkanalspektren erstellt. In Abb. 3.4.2 sind die Übersichtsspektren des pIN-Wildtyps in H2O-

bzw. D2O-haltiger Umgebung gezeigt.

Abb. 3.4.2: FT-IR Einkanalspektren des pIN-Wildtyps bei pH 8.0 und pD 8.0. Bei der pH-Probe wurden 37 µg, bei der pD-Probe 50 µg Oxidase eingesetzt. Für die Übersichtsspektren wurden 100 Interferogramme mit 2 cm-1 Auflö-sung aufgenommen und gemittelt. Sie werden von 2000-800 cm-1 dargestellt. Zur leichteren Abschätzung der pro-zentualen Transmission der Banden wurden die Spektren bei ca. 1850 cm-1 auf 1,0 (100%) skaliert. Der grau unter-legte Bereich stellt Transmissionen dar, die kleiner als 10% sind.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

79

Nach dem Lambert-Beer´schen Gesetz entspricht eine Transmission von 10% einer Extinktion

von 1,0. Die Anwendung dieser mathematischen Beziehung ist jedoch auf Extinktionwerte be-

schränkt, die maximal eine Extinktion von 1,0 erreichen. Größere Extinktionswerte können also

nur ungenügend mit dem Gesetz beschrieben werden und quantitative Auswertungen sind dann

nicht mehr möglich. In der Abb. 3.4.2 zeigt der grau unterlegte Bereich Transmissionen die

kleiner als 10% sind. Neben der Amid I Transmissionsbande werden ebenfalls kleinere Trans-

missionen unterhalb von ca. 1100 cm-1 gefunden, wobei ab ca. 950 cm-1 die CaF2-Fenster der

IR-Küvette ebenfalls IR-Strahlung absorbieren. Eine Auswertung der APR-Differenzspektren

unterhalb von ca. 1100 cm-1 ist daher nicht möglich.

Die vier Untereinheiten des Cyt bo3 bestehen aus rund 1250 Aminosäuren. Entsprechend hoch

ist die Anzahl der Peptidbindungen. Zur Transmission der Amid I Bande tragen alle Peptidbin-

dungen eines Proteins bei. Eine Amid I Resttransmission bei Cyt bo3 IR-Proben, die größer als

10% ist, ist bei einem solchen Multienzym-Komplex nicht sinnvoll, da hierbei das Hintergrund-

Rauschen die Differenzsignale außerhalb der Amid Regionen stark beeinflusst. Somit ist eine

unabhängige Skalierung dieser Regionen nicht gewährleistet.

Bei einer Resttransmission unterhalb von 10% sind nur qualitative Zuordnungen innerhalb der

Amid I Region aus dem oben genannten Grund möglich. Auch bei dem Verzicht auf eine

quantitative Auswertung der Amid I Bande kann die IR-Probe nicht beliebig hoch konzentriert

werden. Bei Resttransmissionen unterhalb von ca. 1-2% treten mehr oder minder starke Basis-

Linienverschiebungen im Differenzspektrum flankierend zur Amid I Region (ca 1720-1560

cm-1) auf. Die Extinktionen können hierbei nach „oben“ oder „unten“ verschoben werden, ohne

dass die beobachteten Extinktionsunterschiede auf einer Signal- oder Extinktionskoeffizienten-

Änderung basieren (vergleiche Text zur Abb. 3.3.4). Dennoch ist es möglich einen Kompromiss

zu finden, der auswertbare Differenzspektren über einen Großteil des Wellenzahlenbereichs von

2000-1150 (1100) cm-1 liefert, wenn die APR-Proben Resttransmissionen der Amid I Bande von

4-8% (Extinktion = 1,1-1,4) in den Übersichtsspektren aufweisen (Abb. 3.4.2). Ist dieses Krite-

rium erfüllt, dann können auch jenseits der Amid-Banden Differenzsignale mit einem relativ

guten Signal/Rausch Verhältnis erzielt werden. In Abb. 3.4.3 sind die APR-Differenzspektren

des pHCL- und pIN-Wildtyps, unter Angabe des Hintergrund-Rauschens verglichen.

Bei den beiden dargestellten APR-Differenzspektren der Wildtypen handelt es sich um den

Mittelwert der letzten fünf aufgezeichneten Spektren. Diese sind alle nahezu vollständig redu-

ziert (Abb. 3.4.1). Die Spektren werden mit einer Auflösung von 2 cm-1 angefertigt. Es wird

keine Datenglättung oder Datendekonvolution benötigt. Aufgrund der langen Messzeit zur

Spektrenaufnahme (ca. zwei Stunden), kommt es jedoch zu einer annährend linearen Basisli-

nienverschiebung. Diese muss im Anschluss korrigiert werden. Hierzu werden bei dem gemittel-

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

80

ten APR-Differenzspektrum Korrekturpunkte bei 2000 cm-1, 1760 cm-1 und bei 1250 cm-1 ge-

setzt. Diese Korrektur liefert im Bereich der beiden Amid-Regionen bezüglich der Signalintensi-

täten häufig eine ungenügende Deckung der verglichenen Wildtypen und Mutanten. Daher wird

auf eine detailliertere Darstellung und Erläuterung des Bereichs von ca. 1670-1500 cm-1 verzich-

tet. Hier sollen nur kurz die typischerweise gefundenen Extinktionsminima und -maxima wie-

dergegeben werden. Es sind Differenzbanden (Minimum/Maximum) bei 1668/1662 cm-1,

1657/1553 cm-1, 1648/1635 cm-1, 1621/1613 cm-1 und 1572/1545 cm-1 vorhanden. Weiterhin ist

ein Differenzsignal bei 1260/1243 cm-1 gekennzeichnet. Es liegt im Bereich der Amid III Regi-

on bzw. der δ(CmH) Beugeschwingung von Hämen (Tab. 1.5.1 und Tab. 1.5.2). Eine nahezu

unveränderte Bandenlage kann im Vergleich zu den FT-IR-Daten ermittelt mit der elektroche-

mischen Zelle gefunden werden [90].

Abb. 3.4.3: APR-Differenzspektren der pHCL- bzw. pIN-Wildtypen bei pH 8,0, unter Angabe des Hintergrund-Rauschens. Es wurden je 37 µg Oxidase eingesetzt, die in den Übersichtspektren eine Resttransmission der Amid I-Bande von 6,3% bzw. 6,5% aufwiesen. Zur Skalierung auf die 1696/1691 cm-1 Bande wurden die Originalspektren mit den Faktor 1,6 bzw. 1,75 multipliziert. Die grau unterlegten Vergrößerungen stellen die Wellenzahlbereiche von 1780-1690 cm-1 und 1500-1100 cm-1 dar. Die Differenzextinktionen sind dabei um das Eineinhalb- bzw. Zwei-einhalbfache vergrößert worden. Wenn der Carbonyl-Bereich (1780-1665 cm-1) zweier Differenzspektren untereinander vergli-

chen werden soll, wird eine zusätzliche Basislinienfeinkorrektur vorgenommen. Hierbei werden

Korrekturpunkte bei 1800 cm-1 und 1760 cm-1 gewählt, um die Nulllinie der Differenzspektren

festzulegen. In dieser Region sind keine absorbierenden Proteingruppen vorhanden. Der dritte

Korrekturpunkt bei 1670 cm-1 wird dabei so in Ordinatenrichtung gesetzt, dass sich die Nullli-

nien und die Differenzbanden (Skalierungsbanden) bei 1696/1691 cm-1 mit den verglichenen

Differenzspektren decken.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

81

Das (thermische) Hintergrundrauschen des Detektors kann im Bereich von 1950-1760 cm-1

eingeschätzt werden, da hier keine Signale vom Protein erscheinen. Das Rauschen liegt um 2-4

* 10-5 Extinktionseinheiten. In der Amid I-Region sind die größten Rauschsignale erkennbar. Da

die Redoxsignale des Proteins im Bereich unterhalb von 1500 cm-1 vom Rauschen beeinträchtigt

werden könnten, wird im Folgenden der Mittelwert aus zwei unabhängig voneinander gemesse-

nen APR-Differenzspektren gebildet und in dieser spektralen Region dargestellt.

Abgesehen von der Amid I-Region sind nur geringe Unterschiede zwischen pHCL- und pIN-

Wildtyp in den Spektren erkennbar. Somit können auch Proteinmutanten, die auf pHCL basie-

ren, mit dem pIN-Wildtyp verglichen werden. Dies ist ebenfalls in den hier nicht zusätzlich dar-

gestellten D2O-APR-Differenzspektren der Fall.

3.4.2 Spektrale Änderungen des Wildtyps in Abhängigkeit vom pH-Wert

In diesem Unterpunkt werden die spektralen Änderungen bei den APR-Differenzspektren des

pIN-Wildtyps in Abhängigkeit vom pH-Wert untersucht. Einerseits wird der pH-Bereich getes-

tet, in dem die APR-Differenzspektroskopie zum Einsatz kommen kann und andererseits ist es

im Hinblick auf eine weitere Datenauswertung notwendig, Banden einordnen zu können, die in

Abhängigkeit vom pH- bzw. pD-Wert spektrale Änderungen aufweisen, wie z.B. die Bandenla-

ge oder Intensitätsunterschiede. Hierzu werden Proteinproben erstellt, die einen pH- bzw. pD-

Bereich von 4.0 bis 9.0 umfassen. Zur Darstellung werden jedoch nur die Messungen der Proben

gezeigt, die einen pH- bzw. pD-Wert von 5,0 und 8,0 aufweisen. Bei pH 5,0 ist eine Durochinol-

Oxidase-Restaktivität (2.8.6) von ca. 15% gegenüber dem pH-Optimum (um pH 7,5) festzustel-

len. Bei pH-Werten oberhalb von 8,5 ist keine Messung mit Durochinol möglich [133].

Abb. 3.4.4 zeigt exemplarisch die Absolutspektren vor und nach der Belichtung der APR-

Proben für die pH-Werte 8,0 und 5,0. Über den gesamten pH- bzw. pD-Bereich kann ein hoher

Reduktionsgrad des Cyt bo3 erreicht werden. Die CO-Freisetzung wird bei geeigneter Lichtin-

tensität nahezu vollständig unterdrückt (eingefügter Graph in Abb. 3.4.4). Eine Denaturierung

des Cyt bo3 ist in den VIS-Spektren nicht zu erkennen.

In Abb. 3.4.5 sind die APR-Differenzspektren des pIN-Wildtyps bei pH 8.0 und pH 5.0, sowie

die von pD 8.0 und pD 5.0 miteinander verglichen (pH- bzw. pD-APR-Differenzspektren). In

den grau unterlegten Bereichen sind die Vergrößerungen der Carbonyl-Regionen von 1780-1665

cm-1 bzw. der Bereich unterhalb der Amid-Regionen von 1500-1150 cm-1 gezeigt. Es lässt sich

eine große Anzahl an spektralen Veränderungen finden. Die schwarz gekennzeichneten Extink-

tionsmaxima bzw. -minima beziehen sich auf das pIN-Wildtyp Differenzspektrum bei pH 8,0

bzw. pD 8,0. Ist demgegenüber eine Änderung eines Signals vorhanden, dann wird sie in der

jeweiligen Farbe des Spektrums auf das sie bezogen ist, angegeben. Hierbei ist anzumerken,

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

82

dass bei deuterierten Proben die Basislinienschwankungen im Bereich von 1500-1100 cm-1 un-

terschiedlich ausfallen können. Bei 1460 cm-1 absorbiert die breite Scherwingung γ(HOD) bei

unvollständigem H/D-Austausch und bei 1215 cm-1 die Scherschwingung γ(D2O) des Deuteri-

umoxids. Außerdem kann der H/D-Austausch die Verschiebung der Amid II C-N- und N-H-

Schwingungen verursachen. Sie kommen ungekoppelt bei 1490-1460 cm-1 für die C-N-

Streckschwingungen und unterhalb von 1100 cm-1 für die N-D-Beugeschwingungen zu liegen.

Somit steht dieser Bereich nur begrenzt zur Auswertung zur Verfügung.

Abb. 3.4.4: Absolutspektren vor (oxidiert) und nach (auto-photoreduziert) der IR-Messung des pIN-Wildtyps in Abhängigkeit vom pH-Wert. Der eingefügte Graph zeigt die CO-Rekombinationsspektren 2 Millisekunden nach Applikation des Lichtblitzes. Als Referenz sind die Natriumdithionit-reduzierten, COFR-Rekombinationsspektren (gepunktete Linie; vergleiche 3.2.3) den auto-photoreduzierten Spektren bei pH 5,0 (gestrichelte Linie) und pH 8,0 (durchgezogene Linie) gegenüber gestellt. Die Spektren sind im Wellenlängenbereich von 400-650 nm gezeigt. Der vergrößerte Wellenzahlenbereich von 1500-1150 cm-1 in Abb. 3.4.5 zeigt eine Region, in

der Signale von allen am Redoxwechsel des Cyt bo3 beteiligten Aminosäuren und Kofaktoren

erwartet werden. Dieser Bereich setzt sich daher aus komplex überlagerten Differenzsignalen

des Gesamtproteins zusammen. Veränderungen in diesem Bereich können daher vorerst nur

ohne weiterführende Interpretation beschrieben werden. Eine Signalzuordnung von veränderten

Banden zu funktionellen Gruppen des Cyt bo3 wird erst im anschließenden Diskussionsteil

(4.3.3) vorgenommen. Daher werden nur an einigen exemplarisch gekennzeichneten Banden die

Signaländerungen vorgestellt. Das Extinktionsmaximum bei 1297 cm-1 verschiebt in Abhängig-

keit vom pH-Wert um 13 cm-1 auf 1310 cm-1 und zeigt keine zusätzliche Verschiebung beim

H/D-Austausch. Die Intensität der Differenzbande bei 1260/1243 cm-1 nimmt mit sinkendem

pH- bzw. pD-Wert zu und verändert dabei in den H2O-Differenzspektren ihre Lage nicht. Ein

Extinktionsmaximum bei 1198 cm-1 findet sich bei den pH-APR-Differenzspektren. In den ent-

sprechenden pD-Spektren ist es nicht mehr vorhanden und kann als verschobenes Einzelsignal

in den angrenzenden Spektralbereichen nicht wiedergefunden werden.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

83

Abb. 3.4.5: APR-Differenzspektren des pIN-Wildtyps bei pH 8,0 und pH 5,0 (oben, schwarze und blaue Spektren) bzw. pD 8,0 und pD 5,0 (unten, rote und grüne Spektren). Es wurden je 37 µg Oxidase bei den pH-Proben und 50 µg Oxidase bei den pD-Proben eingesetzt, deren Resttransmissionen der Amid I-Banden zwischen 4,0% und 6,5% lagen. Die grau unterlegten Vergrößerungen stellen die Wellenzahlbereiche von 1780-1665 cm-1 und 1500-1150 cm-1 dar. Der vergrößerte, grau unterlegte Carbonyl-Bereich (1780-1665 cm-1) in Abb. 3.4.5 umfasst die

Regionen, in denen die Carbonylgruppen von den Seitenketten der Aminosäuren Asp und Glu

(1790-1710 cm-1) und die der Häme (1700-1665 cm-1) absorbieren können [89; 132]. Bereiche

unterhalb von ca. 1680 cm-1 liegen bereits im Einflussbereich der Amid I Region. Daher sind die

Differenzsignale dieses Bereichs überlagert. In unabhängig voneinander gemessenen APR-

Differenzspektren eines Proteins können folglich kleine Extinktionsschwankungen auftreten.

Die Redox-Differenzbanden des protonierten Glu-286 (1745/1735 cm-1) und des deuterierten

Glu-286 (1737/1727 cm-1) sind über den gesamten untersuchten pH- bzw. pD-Bereich praktisch

unverändert vorhanden. Dies gilt auch für das Signal bei 1696/1691 cm-1 und es kann wiederum

zur Skalierung der Spektren herangezogen werden. In der bereits bei Abb. 3.3.3 erwähnten brei-

ten, positiven Extinktionsbande im Bereich von ca. 1730-1704 cm-1 treten deutliche Signalände-

rungen auf. Zum einen verschiebt bei sinkendem pH-Wert das Extinktionsmaximum von 1722

cm-1 (pH 8,0) auf 1727 cm-1 (pH 5,0). Zum anderen finden sich diese beiden Maxima nach H/D-

Austausch bei 1714 cm-1 (pD 8,0) bzw. 1718 cm-1 (pD 5,0) wieder. Es handelt sich folglich um

mindestens ein weiteres Cyt bo3-Carbonylsignal.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

84

In Abb. 3.4.6 ist nochmals die Carbonylregion der oben gezeigten APR-Differenzspektren des

pIN-Wildtyps dargestellt. Im Unterschied zu Abb. 3.4.5 sind hierbei jedoch die Spektren von pH

8,0 und pD 8,0 bzw. pH 5.0 und pD 5,0 verglichen (Abb. 3.4.6, oben). Es kann keine Basisli-

nienfeinkorrektur vorgenommen werden, da die H2O Extinktionssignale der Amid I Region bei

den D2O-Spektren fehlen (3.3.2) und sich Extinktionskoeffizienten-Änderungen in Abhängig-

keit vom Lösungsmittel ergeben können. Zusätzlich sind die Doppeldifferenzen von pH 8,0 mi-

nus pD 8,0 bzw. pH 5,0 minus pD 5,0 gezeigt (Abb. 3.4.6, unten). Positive Banden entsprechen

hierbei den wässrigen Proben (schwarze Flächen = pH 8,0; blaue Flächen = pH 5,0), negative

Banden den D2O-haltigen Proben (rote Flächen = pD 8,0; grüne Flächen = pD 5,0).

Abb. 3.4.6: Carbonylbereich der APR-Differenz- und Doppeldifferenzspektren des pIN-Wildtyps bei unterschiedli-chen pH und pD-Werten. Oben: pH 8,0- (schwarz) und pH D 8,0-(rot) bzw. pH 5,0- (blau) und pD 5,0- (grün) Dif-ferenzspektren. Unten: Die resultierenden Doppeldifferenspektren von den pH 8,0- minus pD 8,0- bzw. pH 5,0- minus pD 5,0-Spektren. Diese sind nur bis 1670 cm-1 dargestellt. Die bereits bei Abb. 3.4.5 angesprochenen Änderungen im Bereich von 1730-1704 cm-1 sind

hier wiederzufinden. Das Maximum der positiven Extinktionsbande bei 1722 cm-1 (pH 8,0) ver-

schiebt beim H/D-Austausch nach 1714 cm-1 (pD 8,0). In der entsprechenden Doppeldifferenz

sind beide Signale vorhanden. Das Maximum der positiven Extinktionsbande bei 1727 cm-1 (pH

5,0) verschiebt beim H/D-Austausch nach 1718 cm-1 (pD 5,0). In der entsprechenden Doppeldif-

ferenz findet sich nur das Signal bei 1718 cm-1 wieder, da das Extinkzionsmaximum der Bande

bei 1727 cm-1 mit dem Maximum des deuterierten Carbonylsignals des Glu-286 zusammenfällt.

Im Bereich unterhalb von ca. 1690 cm-1 finden sich weitere spektrale Änderungen in Abhän-

gigkeit vom H/D-Austausch. Es sei nochmals darauf hingewiesen, dass Banden im Bereich un-

terhalb von ca. 1680 cm-1 von Extinktionssignalen der Amid I Region beeinflusst werden kön-

nen. Daher treten mehr oder minder kleine Änderungen bezüglich der Lage der Extinktionsma-

xima bzw. -minima und der Signalintensitäten auf, wie z.B. das verschobene Maximum bei

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

85

1673 cm-1 (pD 8,0)3. Eine quantitative Differenzierung zwischen Signalen der Amid I Region

und der möglichen Häm-Banden kann nicht durchgeführt werden. Dennoch sind die hier aufge-

zeigten Extinktionsänderungen qualitativ reproduzierbar.

Die positive Bande bei 1685 cm-1 zeigt bei den pH-Differenzspektren ein Maximum, dessen

Intensität deutlich höher ist als bei der positiven Bande bei 1691 cm-1. Demgegenüber weist das

Maximum der Bande bei 1675 cm-1 eine relativ geringe Intensität auf. Bei den pD-Spektren ist

die positive Bande um 1685 cm-1 deutlich schwächer ausgeprägt, aber ebenfalls vorhanden. Das

Maximum der pD-Spektren bei 1685 cm-1 ist deutlich niedriger als bei der positiven Bande bei

1691 cm-1. Demgegenüber ist das Maximum der Bande um 1675 cm-1 deutlich und intensiver

ausgeprägt. Der Abstand dieser beiden Maxima beträgt 10 cm-1, d.h. es kann sich um ein oder

mehrere Carbonylsignale von Hämen handeln, die bei Isotopenaustausch von 1HOOC nach 2HOOC zu kürzeren Wellenzahlen verschieben. In den Doppeldifferenzspektren ist entspre-

chend eine positive Bande um 1685 cm-1 vorhanden. Die negative Bande um 1673 cm-1 tritt im

pH 5,0 minus pD 5,0-Doppeldifferenzspektrum deutlich hervor.

Da bei den pD-Spektren ein Maximum bei 1685 cm-1 bestehen bleibt, kann es sich um ein

Carbonylsignal einer Einzelgruppe handeln, die nicht komplett beim H/D-Austausch deuteriert

wird oder es liegt ein Signal einer zweiten, unterlagerten Carbonylschwingung vor, deren Car-

boxylgruppe dem H/D-Austausch vermutlich nicht zugänglich ist und nun hervortritt. Darüber

hinaus kann es ein zweites Differenzsignal einer atomaren Gruppe sein, die nicht protoniert vor-

liegt und entsprechend vom Lösungsmittel unbeeinflusst bleibt.

Allen Spektren gemeinsam sind Minima um 1678 cm-1. Da bei dem hier vorgenommenen Ver-

gleich von pH- und pD-Spektren keine Basislinienfeinkorrektur vorgenommen werden kann, ist

eine Beurteilung, ob sich die Minima ebenfalls nach H/D-Austausch in ihren Signalintensitäten

verändern nicht eindeutig. Das Differenzspektrum bei pD 8,0 weist gegenüber dem pH 8,0-

Spektrum über den Bereich von ca. 1690-1675 cm-1 eine negativere Extinktion auf. Dies bedeu-

tet, dass es sich um ein Differenzsignal einer Carbonylgruppe mit einem positiven Maximum bei

1685 cm-1 und einem Minimum bei 1678 cm-1 handeln kann. Das Minimum müsste demzufolge

bei H/D-Austausch nach ca. 1668 cm-1 verschieben. Es liegt demnach in der stark negativen

Bande um 1668 cm-1 und kann hier nicht als Einzelsignal identifiziert werden.

Als Resultat lässt sich festhalten: Über den gesamten untersuchten pH- bzw. pD-Bereich (pH

bzw. pD 4,0-9,0) können APR-Differenzspektren mit einem hohen (> 90%) Reduktionsgrad

erhalten werden. Der gesamte betrachtete Wellenzahlenbereich weist dabei eine Vielzahl an

spektralen Veränderungen auf. Im Bereich von 1780-1665 cm-1 kann mindestens ein noch nicht 3 Mit Ausnahme des pD 8,0 APR-Differenzspektrums weisen alle anderen pD-Spektren (pD 4,0-9,0) ein Maximum um 1675 cm-1 auf. Daher wird im Folgenden nur noch von der Bande bei 1675 cm-1 geschrieben.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

86

detailliert beschriebenes Carbonylsignal mit einem Maximum bei 1722 cm-1 (pH 8,0) gefunden

werden, das im entsprechenden D2O-Spektrum um 8 cm-1 nach 1714 cm-1 verschiebt. Mit sin-

kendem pH-Wert findet eine Verschiebung des Maximums zu größeren Wellenzahlen um bis zu

5 cm-1 statt. Weitere Änderungen finden sich im Bereich von 1688-1675 cm-1. Das Extinktions-

maximum bei 1685 cm-1 verliert deutlich an Intensität bei H/D-Austausch. Das Maximum bei

1675 cm-1 nimmt bei den pD-Spektren in Korrelation dazu an Intensität gegenüber den pH-

Spektren zu. Jedoch bleibt ein Maximum bei 1685 cm-1 auch in den pD-Spektren erhalten. Die

D2O-abhängige Verschiebung beträgt 10 cm-1 und weist somit einen typischerweise für Carbo-

nylsignale gefundenen Wert auf. Ob es sich hierbei um ein oder mehrere Carbonylsignale von

Hämen handelt, soll im Folgenden untersucht werden.

3.4.3 Carbonylschwingungen der Hämpropionate

In diesem Unterpunkt wird die 13C-Isotopenmarkierung der C1-Atome der Hämpropionate4 vor-

genommen, um ihre Carbonylschwingungen in den APR-Differenzspektren nachzuweisen (Abb.

1.2.4). Diese Spektren werden mit den APR-Differenzspektren der Häm O defizienten Cyt bo3

Mutante ∆cyoE verglichen, um diese Schwingungen dem low- bzw. high-spin Häm zuzuordnen.

Eine spezifische 13C-Isotopenmarkierung der C1-Atome der Hämpropionate der Cyt c Oxidase

(Cyt aa3) aus P. denitrificans wurde bereits erfolgreich durchgeführt und mittels elektroche-

misch induzierter Redoxdifferenz FT-IR-Spektroskopie untersucht [89; 132; 134]. An dem Cyt

bo3 von E. coli sind diese Experimente bisher nicht durchgeführt worden. Die Grundvorausset-

zung für eine solche spezifische Isotopenmarkierung ist ein E. coli Stamm, der bezüglich der δ-

Aminolävulinat-Synthese defizient ist (Abb. 1.2.5). Somit können ohne den Zusatz von ALV

bzw. spezifisch markiertem [1-13C]-ALV keine Häme produziert werden. Die Wahl fiel dabei

auf den E. coli Stamm S730, der zusätzlich in den Aminosäure-Biosynthesewegen von Trp, His

und Tyr defekt ist (Tab. 2.1.1). Somit besteht die Möglichkeit, dass neben 13C-markierten

Hämpropionaten auch isotopenmarkierte Tyrosine in Cyt bo3 eingebaut werden können.

In Vorexperimenten zur Wahl des Fermentationsmediums stellt sich heraus, dass dieser

Stamm trotz Ausgleich der Auxotrophien in Minimalmedien maximal eine OD578 von ca. eins

erreicht, also nur rund ein 1/5 der Zelldichte des sonst eingesetzten Cyt bo3-Expressionsstamms

BL21 ∆cyo recA-. Darüber hinaus weist dieser Stamm Plasmidinstabilität auf.

Bei der Fermentation von S730 pIN in LB-Medium mit ALV kann die Zelldichte auf eine

OD578 von ca. 1,8 gesteigert werden. Es werden nach Zellwachstum und Zellaufbruch Cy-

4 Der Begriff Hämpropionat wird in dieser Arbeit stellvertretend sowohl für die protonierte Carboxyl-Form als auch für die deprotonierte Carboxylat-Form der Hämpropionate verwendet. Nur wenn eine Unterscheidung notwendig ist, wird auch der Bergriff Hämpropionsäure benutzt.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

87

toplasmamembranen erhalten, die einen deutlichen Anteil an Cytochromen aufweisen (Abb.

3.4.7 links). Im Kontrollexperiment ohne den Zusatz an ALV weisen die Zellmembranen nur

rund 11% des Cytochrom Gehalts gegenüber den Zellmembranen mit ALV auf.

Abb. 3.4.7: Redox-Differenzspektren von S730 pIN Cytoplasmamembranen mit und ohne Aminolävulinat-(ALV) Zusatz (links) und der gereinigte pIN-13C-Wildtyp (rechts). Linke Darstellung: Die Bakterien wurden in LB-Medium fermentiert und nach Zellwachstum wurde die OD bei 578 nm bestimmt. Von diesem Wert ausgehend wurden entsprechende Volumina entnommen und die Zellen sedimentiert, d.h. zur Präparation der Cytoplasma-membranen wurden dieselbe Zellmasse eingesetzt. Die Spektren sind im Bereich von 400-700 nm dargestellt. Rechte Darstellung: Der gereinigte pIN-13C-Wildtyp exprimiert in S730 weist dieselben Extinktionsmaxima und –minima wie der gereinigte pIN-Wildtyp exprimiert in BL21 ∆cyo recA- auf (Abb. 3.2.2). Das Spektrum ist im Be-reich von 400-650 nm dargestellt. Die Proteinausbeuten von Cyt bo3 sinken jedoch auch bei der Fermentation in LB-Medium mit

ALV drastisch. Es können nur rund 10% gereinigtes Protein gegenüber der Überexpression in

BL21 ∆cyo recA- erzielt werden. Diese geringe Proteinmenge birgt Schwierigkeiten in der Kon-

zentrierung des Proteins, da während der Anreicherung in Ultrakonzentratoren neben dem Prote-

in ebenfalls das Detergenz angereichert wird (die Micellen des Detergenz werden von der Cellu-

losemembran zum Teil zurückgehalten). Die Gefahr, dass es aufgrund der hohen Detergenzkon-

zentration dabei zu reversiblen Teildenaturierungen des Cyt bo3 kommen kann, ist groß.

Das gereinigte, an den C1-Atomen der Hämpropionate 13C- isotopenmarkierte pIN-Wildtyp-

protein, exprimiert in S730 weist in den oxidierten und reduzierten Absolutspektren (Daten nicht

gezeigt), sowie im Redox-Differenzspektrum keine Unterschiede zum pIN-Wildtyp, exprimiert

in BL21 ∆cyo recA- auf (Abb. 3.4.7 rechts). Im in vitro Aktivitätstest zeigt der isotopenmarkier-

te pIN-Wildtyp gegenüber der unmarkierten Referenz 88% Durochinol-Oxidase-Aktivität. So-

mit sind bei diesen Untersuchungen keine gravierenden Unterschiede beim 12COOH/13COOH-

Isotopenaustausch (12C/13C-Austausch) der C1-Atome der Hämpropionate festzustellen.

Bedingt durch die niedrigen Proteinausbeuten des isotopenmarkierten pIN-Wildtyps können

lediglich APR-Differenzspektren bei pH 8,0 bzw. pD 8,0 erstellt werden. Aufgrund der hohen

Detergenzanreicherung weisen die APR-Differenzspektren innerhalb und unterhalb der Amid-

Regionen zum Teil mehr oder minder große Abweichungen zueinander auf. Daher kann in die-

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

88

sem Bereich nur die grundsätzliche Tendenz der spektralen Änderungen beschrieben werden.

Ein Vergleich der Extinktionsintensitäten ist häufig nicht möglich. Der Carbonylbereich scheint

hiervon nicht betroffen zu sein, da alle markanten nicht auf die Hämpropionsäuren zurückzufüh-

renden Banden bezüglich der Intensität und der Position erhalten bleiben.

In Abb. 3.4.8 sind die APR-Differenzspektren des unmarkierten (exprimiert in BL21 ∆cyo

recA-) und des isotopenmarkierten (exprimiert in S730) pIN-Wildtyps gezeigt. Der unmarkierte

pIN-Wildtyp, exprimiert in S730, zeigt wie der isotopenmarkierte eine unbefriedigende Spekt-

renqualität (Detergenzeinfluss) im Wellenzahlenbereich innerhalb und unterhalb der Amid-

Regionen. Auf die Darstellung dieser Spektren wird daher verzichtet. Im 13C-pIN-Wildtyp-

spektrum weisen die Amid I- (1680-1620 cm-1), die Amid II- (1560-1520 cm-1) und die Amid

III- (1330-1230 cm-1) Regionen zum Teil deutlich verschobene Bandenpositionen zum Refe-

renzspektrum auf. Zur Orientierung sind einige Maxima bzw. Minima exemplarisch gekenn-

zeichnet. Die hohe Detergenzkonzentration wirkt sich folglich leicht auf die Proteinstruktur aus.

Diese Detergenzeinwirkung ist jedoch nach Proteinverdünnung reversibel (VIS-Spektren, Duro-

chinolaktivität). Da jedoch eine große Anzahl an Banden bezüglich ihrer Position unverändert

bleiben, kann das erhaltene Spektrum zum Teil ausgewertet werden.

Abb. 3.4.8: APR-Differenzspektren des pIN-Wildtyps (schwarz), exprimiert in BL21 ∆cyo recA- und des isoto-penmarkierten pIN-Wildtyps (rot), exprimiert in S730. Es wurden je 37 µg Oxidase eingesetzt, die in den Über-sichtspektren eine Resttransmission der Amid I-Bande von 6,3% bzw. 4,8% aufwiesen. Die grau unterlegten Ve r-größerungen stellen die Wellenzahlbereiche von 1780-1665 cm-1 und 1500-1200 cm-1 dar. Zusätzlich sind im Be-reich von 1500-1200 cm-1 die APR-Differenzspektren nach H/D-Austausch gezeigt (ganz oben). In dem vergrößerten, grau unterlegten Wellenzahlenbereich von 1500-1300 cm-1 (Abb. 3.4.8)

sind zusätzlich zu den pH-8,0-Differenzspektren die pD-8,0-Spektren des isotopenmarkierten

Wildtyps mit dem entsprechenden Referenzspektren aufgeführt. Einige veränderte Banden sind

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

89

exemplarisch gekennzeichnet, die erst im entsprechenden Diskussionsteil interpretiert werden

(4.3.3). Typischerweise werden Carboxylatschwingungen von Hämpropionaten im Bereich von

1620-1540 cm-1 für die unsymmetrischen νas(COO-) Streckschwingungen und von 1420-1300

cm-1 für die symmetrischen νs(COO-) Streckschwingungen gefunden [89]. Über den Bereich der

νas(COO-) Streckschwingungen können hier keine Aussagen gemacht werden (3.4.1). Für die

symmetrischen νs(COO-) Streckschwingungen wird aus den berechneten reduzierten Massen

eine Verschiebung zu kürzeren Wellezahlen von ca. 35 cm-1 bei Isotopenaustausch von 12COO-

zu 13COO- erwartet [135]. Nach H/D-Austausch wird eine Verschiebung um maximal 2 cm-1 zu

größeren Wellenzahlen erwartet.

Beim Referenzspektrum sind zwei positive Banden mit Maxima um 1467 cm-1 und 1367 cm-1

gekennzeichnet, die nach H/D-Austausch nahezu nicht verschieben. In den entsprechenden iso-

topenmarkierten Wildtyp-Differenzspektren fehlen diese Signale, sowohl im pH- als auch im

pD-Spektrum. Intensivere Extinktionsbanden finden sich jedoch bei 1443 cm-1 und 1336 cm-1.

Es kann demnach eine Verschiebung zu kleineren Wellenzahlen um 24 cm-1 bzw. 31 cm-1 statt-

gefunden haben. Wenn es sich bei der Bande bei 1467 cm-1 um Signale der symmetrischen

νs(COO-) Streckschwingungen von Hämpropionaten handelt, dann liegt sie etwas außerhalb des

charakteristischerweise für diesen Schwingungstyp gefundenen Spektralbereich. Negative Ban-

den, die gegenüber dem Referenzspektrum verschieben, lassen sich bei dieser Spektrenqualität

nicht eindeutig zuordnen.

In der Vergrößerung der Carbonylregion von Abb. 3.4.8 sind Veränderungen nach 12C/13C-

Austausch feststellbar. Das breite positive ν(12C=O) Signal um 1730-1704 cm-1 mit einem Ma-

ximum bei 1722 cm-1 ist nach Isotopenaustausch (ν(13C=O)) nicht mehr erkennbar. Das Maxi-

mum bei 1685 cm-1 verliert an Intensität und das Minimum bei 1678 cm-1 tritt stärker im Spekt-

rum des isotopenmarkierten Wildtyps hervor, bei nahezu gleichbleibender Intensität des Maxi-

mums um 1675 cm-1. Danach kann es sich um Carbonylsignale von Hämpropionaten handeln.

Für die Carbonylregion wird bei der Berechnung der reduzierten Massen mit einer Verschie-

bung zu kleineren Wellenzahlen von ca. 38 cm-1 bei Austausch von 12COOH nach 13COOH ge-

rechnet [89]. Somit würde das Maximum bei 1722 cm-1 nach 1684 cm-1 verschieben. Die Diffe-

renzbande bei 1685-1678 cm-1 würde entsprechend nach 1647-1640 cm-1, also unmittelbar in die

Amid I Region verschieben und kann hier nicht mehr identifiziert werden. Die Carbonylsignale

bei 1730-1704 cm-1 und 1690-1675 cm-1 sollen nun näher untersucht werden.

In Abb. 3.4.9 sind die pH 8,0- und pD 8,0-APR-Differenzspektren im Carbonylbereich der

verglichenen pIN-Wildtypen gezeigt (oben). Zusätzlich sind die Doppeldifferenzen des pIN-

Wildtyps (pH 8,0) minus des isotopenmarkierten pIN-Wildtyp (pH 8,0) und die entsprechenden

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

90

pD-Spektren dargestellt (Abb. 3.4.9, unten). Es ist deutlich ist zu erkennen, dass in dem isoto-

penmarkierten pH 8,0-Wildtypspektrum Extinktionsbanden im Bereich von ca. 1730-1704 cm-1

und von ca. 1690-1675 cm-1 fehlen. Unter Einbeziehung der Verschiebung durch den H/D-

Austausch lässt sich Entsprechendes ebenfalls für die Spektren deuterierten Wildtyp feststellen.

Die Doppeldifferenzen werden von positiven Banden dominiert, d.h. dem isotopenmarkierten

pIN-Wildtyp fehlen Extinktionsbanden gegenüber dem unmarkierten. Ein Teil der Signale um

1730-1704 cm-1 und 1690-1675 cm-1 gehen folglich auf Carbonylschwingungen von Hämpropi-

onsäuren zurück.

Abb. 3.4.9: Carbonylbereich der APR-Differenz- und Doppeldifferenzspektren des pIN-Wildtyps (schwarz und blau) und des isotopenmarkierten pIN-Wildtyps (rot und grün) bei pH 8,0 und pD 8,0 (oben). Unten: Die resultie-renden Doppeldifferenspektren vom pIN-Wildtyp pH 8,0- minus dem isotopenmarkierten pIN-Wildtyp pH 8,0- bzw. den entsprechenden PD 8,0-Spektren. Sie sind nur bis 1670 cm-1 dargestellt. Unter der Annahme, dass das Maximum der H2O-Spektren bei 1722 cm-1 nach 12C/13C-

Austausch um 38 cm-1 zu 1684 cm-1 und die Differenzbande bei 1685/1678 cm-1 in die Amid I-

Region verschiebt, müsste das Maximum bei 1685 cm-1 einerseits an Intensität zunehmen (1722

cm-1 nach 1684 cm-1) und andererseits an Intensität verlieren (1685 cm-1 nach 1647 cm-1). Das

Minimum bei 1678 cm-1 sollte jedoch nur an Intensität verlieren. Im Spektrum drückt sich dies

dann durch einen asymmetrischen (nicht parallelen) Verlauf zwischen 1685 cm-1 und 1678 cm-1

aus. Dies ist der Fall.

Nach erfolgtem H/D- und 12C/13C-Austausch sollte das Maximum bei 1722 cm-1 nach 1676

cm-1 verschieben (8 cm-1 vom H/D- plus 38 cm-1 vom 12C/13C-Austausch). Die Bande bei

1685/1678 cm-1 sollte entsprechend in die Amid I Region nach 1637-1630 cm-1 (10 cm-1 vom

H/D- plus 38 cm-1 vom 12C/13C-Austausch) verschieben. Das letztgenannte Signal lässt sich in

der Amid I Region nicht wiederfinden. Für das entstehende Spektrum bedeutet dies, dass das

Signal bei 1675 cm-1 an Intensität zunimmt, der sonstige Verlauf des isotopenmarkierten Diffe-

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

91

renzspektrums sich jedoch mit dem unmarkierten pD-Spektrum im Bereich von ca. 1690-1675

cm-1 decken sollte. Die Intensitätszunahme ist erkennbar, jedoch nicht die Spektrendeckung.

Das bereits bei Abb. 3.4.6 beschriebene Maximum bei 1685 cm-1, das in den pD-Spektren er-

niedrigt, aber vorhanden ist, ist nach H/D- und 12C/13C-Austausch nicht mehr zu finden. Es lässt

sich höchstens eine leichte Schulter um 1685 cm-1 erkennen. Die weitergehende Interpretation

dieser Daten wird unter 4.3.3 wieder aufgenommen.

Es wird nun versucht, die neu beschriebenen Carbonylsignale den beiden im Cyt bo3 vorhanden

Hämen zuzuordnen. Da bei dem Isotopenaustausch alle vier vorhandenen Propionate der beiden

Häme am C1-Atom markiert sind, kann bei den erhaltenen Hämcarbonylsignalen keine Diffe-

renzierung zwischen low-spin und high-spin Häm getroffen werden. Die ∆cyoE-Mutante weist

anstelle des Häm O ein Häm B in der high-spin Hämbindetasche auf. Es liegt ein in seinen VIS-

spektroskopischen und kinetischen Eigenschaften stark verändertes binukleares Zentrum vor

(Abb. 3.1.6; Abb. 3.2.1; Abb. 3.2.2; Tab. 3.2.5). Unter der Annahme, dass nur das falsch einge-

baute high-spin Häm B in den VIS-Spektren zur beobachteten Minima- bzw. Maxima-

Verschiebung beiträgt, wird dies als grundsätzliche Überlegung nun auf die IR-Spektroskopie

übertragen. Ändert sich die Lage des Maximums bzw. des Minimums der betrachteten Bande

nicht, so wird sie dem low-spin Häm zugeschrieben (eine Intensitätsveränderung darf eintreten).

Bei Verschiebung wird sie dem high-spin Häm zugeordnet.

In Abb. 3.4.10 ist das pIN-Wildtyp APR-Differenzspektrum mit dem ∆cyoE-Mutanten Spekt-

rum bei pH 8,0 verglichen. Im Unterschied zum isotopenmarkierten Wildtyp lassen sich die er-

haltenen Differenzsignale auch innerhalb und unterhalb der Amid Regionen im hohen Maße

reproduzieren. Dennoch sind die spektralen Änderungen in diesen Regionen sehr vielfältig. Da

bei der Expression dieser Mutante in BL21 ∆cyo recA- kein Häm O synthetisiert werden kann,

wird ein Häm B in der high-spin Häm-Bindetasche eingebaut, das zur physiologischen Inakti-

vierung der Oxidase führt [100]. Dem Häm B fehlt der Hydroxyethylfarnesylrest (Abb. 1.2.4

und Abb. 1.2.5). Dieser ist im Cyt bo3 durch zumeist hydrophobe Aminosäuren in die Protein-

struktur eingebettet. Da die ∆cyoE-Mutante keine Durochinol-Oxidase-Aktivität aufweist (Tab.

3.2.6), kann daraus nicht beurteilt werden, inwieweit sich das Fehlen des Hydroxyethylfarnesyl-

restes auf die Cyt bo3-Struktur auswirkt. Auswirkungen, nicht nur auf Differenzsignale der high-

spin Hämcarboxylate im Bereich von 1500-1100 cm-1 sind daher möglich. Eine Bandenzuord-

nung hinsichtlich der Signalintensitäten kann auch in diesem Falle nicht vorgenommen werden.

Somit können Veränderungen im Bereich von 1500-1150 cm-1 nur abgeschätzt werden.

Im vergrößerten, grau unterlegten Wellenzahlenbereich von 1500-1150 cm-1 (Abb. 3.4.10)

sind neben den verglichenen pH 8,0-Differenzspektren auch die pD 8,0-Differenzspektren ge-

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

92

zeigt (ganz oben). Es sollen die symmetrischen νs(COO-) Streckschwingungen betrachtet wer-

den, die sich typischerweise im Bereich von 1420-1300 cm-1 befinden. Bei dem pH-APR-

Differenzspektrum der ∆cyoE-Mutante lässt sich gegenüber dem pIN-Wildtypspektrum eine

deutliche Extinktionszunahme der positiven Bande um 1467 cm-1 feststellen. Im pD-Spektrum

ist dies ebenfalls vorhanden, jedoch liegt das Maximum etwas zu kleineren Wellenzahlen ver-

schoben vor. Um 1410 cm-1 tritt in den Mutantenspektren eine negative Bande auf, die keine

Verschiebung bei H/D-Austausch zeigt. Weiterhin erscheint eine bei den Wildtypspektren nicht

vorhandene Differenzbande mit einem Minimum bei 1325 cm-1 und einem Maximum bei 1317

cm-1. Demgegenüber fehlen den Mutantenspektren positive Banden bei 1356 cm-1. Entsprechen-

de negative Banden sind nicht erkennbar. Als letzte hervorgehobene Änderungen werden hier

die negativen Banden bei 1262 cm-1 aufgegriffen. Diese Banden weisen gegenüber den Refe-

renzspektren deutlich negativere Extinktionen mit Minima um 1262 cm-1 auf. Die kleinen, posi-

tiven Schultern bei 1253 cm-1 sind ebenfalls vorhanden. Die positiven Banden bei 1243 cm-1

zeigen keine Verschiebung der Maxima. Die Signalintensitäten ändern sich ebenfalls nicht. Die-

se Differenzsignale befinden sich in der Amid III Region.

Abb. 3.4.10: APR-Differenzspektren des pIN-Wildtyps (schwarz) und der ∆cyoE (pHCL)-Mutante (rot). Es wurden je 37 µg Oxidase eingesetzt, die in den Übersichtspektren eine Resttransmission der Amid I-Bande von 6,3% bzw. 3,8% aufwiesen. Die grau unterlegten Vergrößerungen stellen die Wellenzahlbereiche von 1780-1665 cm-1 und 1500-1150 cm-1 dar. Im Bereich von 1500-1150 sind zusätzlich ganz oben die APR-Differenzspektren bei pD 8,0 dargestellt. In der Vergrößerung der Carbonylregion von Abb. 3.4.10 sind ebenfalls Veränderungen im

∆cyoE-Mutanten Differenzspektrum vorhanden. Jedoch treten die markanten Differenzbanden

des Glu-286 und der Skalierungsbande bei 1696/1691 cm-1 unverändert auf. Die Carbonylregion

kann somit ausgewertet werden. Das breite positive ν(C=O) Signal um 1730-1704 cm-1 mit ei-

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

93

nem Maximum bei 1722 cm-1 nimmt deutlich an Intensität gegenüber dem Referenzspektrum

zu. Das Maximum des Referenzspektrum bei 1685 cm-1 verschiebt nach 1680 cm-1 im Mutan-

tenspektrum, wobei eine Schulter bei 1685 cm-1 erhalten bleibt. Die Signalintensität des Maxi-

mums bei 1680 cm-1 ist gegenüber dem Maximum bei 1685 cm-1 des Referenzspektrums etwas

abgeschwächt. Diese Signalveränderungen sollen nun näher untersucht werden.

In Abb. 3.4.11 sind die pH 8,0- und pD 8,0-APR-Differenzspektren im Carbonylbereich des

pIN-Wildtyps und der ∆cyoE-Mutante gezeigt (oben). Zusätzlich sind die Doppeldifferenzen des

pIN-Wildtyps (pH 8,0) minus der ∆cyoE-Mutante (pH 8,0) und die entsprechenden pD-

Doppeldifferenzspektren dargestellt (Abb. 3.4.11, unten).

Abb. 3.4.11: Carbonylbereich der APR-Differenz- und Doppeldifferenzspektren des pIN-Wildtyps (schwarz und blau) und der ∆cyoE (pHCL)-Mutante (rot und grün) bei pH 8,0 und pD 8,0 (oben). Unten: Die resultierenden Dop-peldifferenzspektren von den pH 8,0- minus pD 8,0- bzw. pH 5,0- minus pD 5,0-Spektren. Sie sind nur bis 1670 cm-1 dargestellt. In der Abb. ist deutlich zu erkennen, dass in den verglichenen pH-Spektren eine Extinktionszu-

nahme des Mutantenspektrums im Bereich von ca. 1730-1704 cm-1 erfolgt. Unter Einbeziehung

der Verschiebung, bedingt durch den H/D-Austausch, lässt sich entsprechendes ebenfalls für die

Spektren der deuterierten ∆cyoE-Mutante finden. Im Bereich von 1690-1675 cm-1 lassen sich

Verschiebungen der Extinktionsmaxima erkennen. Wie bereits angesprochen, verschiebt das

Maximum gegenüber dem pH-Referenzspektrum von 1685 cm-1 auf 1680 cm-1. Die Intensität

des Signals bei 1680 cm-1 ist dabei verglichen zum Wildtypspektrum bei 1685 cm-1 erniedrigt.

Eine positive Bande bei 1685 cm-1 bleibt im Mutantenspektrum als Schulter erhalten. Dies

spricht für zwei unabhängige Extintionssignale und kann den beobachteten Intensitätsverlust bei

1680 cm-1 erklären. In den verglichenen pD-Differenzspektren fehlt das Maximum bei 1685

cm-1 im Mutantenspektrum, und es tritt stattdessen ein Minimum an dieser Position auf. Ab die-

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

94

sem Minimum zeigt sich jedoch eine kontinuierliche Extinktionzunahme bis ca. 1674 cm-1. Die-

ses Maximum liegt deutlich oberhalb des Maximums des Referenzspektrums. Eine Verschie-

bung in Abhängigkeit von der Deuterierung findet also statt.

Die Doppeldifferenzen werden von negativen Banden dominiert, d.h. bei dem pIN-Wildtyp-

spektrum sind Extinktionsbanden schwächer ausgeprägt bzw. die Positionen der Maxima sind

gegenüber dem Mutantenspektrum verschoben. Die Lage der Maxima im Bereich von 1730-

1704 cm-1 ändert sich nicht, d.h. diese Signale werden dem low-spin Häm zugeschrieben. Bei

den Positionen der Maxima und Minima im Bereich von 1690-1675 cm-1 finden Verschiebun-

gen statt, sie gehen folglich zum Teil auf das high-spin Häm zurück.

Zusammenfassend lässt sich festhalten: Eine spezifische 13C-Markierung der C1-Atome der

Hämpropionate ist erfolgt (deutliche Änderungen in der Carbonylregion der APR-

Differenzspektren). Dabei sind keine bzw. geringfügige Unterschiede des isotopenmarkierten

pIN-Wildtyps gegenüber der unmarkierten Referenz bei den VIS-Spektren und der Durochinol-

Oxidaseaktivität vorhanden. Aufgrund der stark erniedrigten Cyt bo3-Ausbeuten bei der Über-

expression der Oxidase im E. coli Stamm S730, kommt es im Anschluss bei der Proteinkonzent-

ration ebenfalls zur Anreicherung des Detergenzes. Dies führt zu einer reversiblen Proteindesta-

bilisierung und damit zu einer verminderten Spektrenqualität bei den APR-Differenzspektren

innerhalb und unterhalb der Amid-Regionen. Somit lassen sich in diesem spektralen Bereich

keine umfassenden Zuordnungen der ν(COO-)-Streckschwingungen zu den Hämpropionaten

erreichen. Dennoch sind mindestens zwei deutliche Veränderungen im Bereich von 1500-1300

cm-1 vorhanden. Zwei positive Banden mit Maxima um 1467 cm-1 und 1367 cm-1 fehlen nach 12C/13C-Austausch gegenüber der Referenz. Demgegenüber finden sich Extinktionszunahmen

um 1443 cm-1 und 1367 cm-1. Die beobachteten Signale verschieben nach H/D-Austausch nur

geringfügig. Es könnte sich demnach um νs(COO-) Streckschwingungen von Hämpropionaten

handeln. Verschobene bzw. fehlende negative Banden sind nicht deutlich zuzuordnen.

Für den Bereich innerhalb und unterhalb der Amid-Regionen weicht das ∆cyoE-Mutanten Diffe-

renzspektrum ebenfalls gegenüber dem Referenzspektrum vielfältig ab. Die fehlende Hydroxye-

thylfarnesylgruppe in der high-spin Häm-Bindetasche scheint für die Struktur des Cyt bo3 deut-

liche Auswirkungen im Wellenzahlenbereich von 1500-1150 cm-1 zu besitzen. Eine eindeutige

Signalzuordnung von νs(COO-) Streckschwingungen ist hierbei wiederum nicht möglich. Bei

dem ∆cyoE-Mutantenspektrum, das zur Unterscheidung von Häm-Signalen des low-spin und

high-spin Häms herangezogen wird, ist die Intensität der Bande um 1467 cm-1 erhöht. Weiterhin

lässt sich eine negative Bande mit einem Minimum um 1410 cm-1 erkennen. Ein zusätzliches

Differenzsignal erscheint im Mutantenspektrum im Bereich von 1325-1317 cm-1, das in abge-

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

95

schwächter Form, aber an gleicher Position, ebenfalls im entsprechenden pD-Spektrum vorhan-

den ist. Es kann sich demnach um ein νs(COO-) Streckschwingungssignal eines Hämpropionates

des high-spin Häms handeln.

Die Carbonylregion des isotopenmarkierten-Wildtyp Differenzspektrums scheint vom Deter-

genzeinfluss nicht betroffen zu sein. Das ∆cyoE-Differenzspektrum zeigt ebenfalls die markan-

ten Differenzbanden bei 1745/1735 cm-1 und bei 1696/1691 cm-1 in unveränderter Intensität und

Position. In dieser spektralen Region können in beiden Fällen reproduzierbare, auswertbare Dif-

ferenzspektren erhalten werden. Es sind mindestens zwei weitere auf die Hämpropionsäuren

zurückzuführende Carbonylsignale in der Region von ca. 1730-1675 cm-1 vorhanden.

Die positive Bande mit einem Maximum bei 1722 cm-1 (pH 8,0) verschiebt bei 12C/13C-

Austausch um ca. 38 cm-1 nach ca. 1684 cm-1. Eine zusätzliche Verschiebung um ca. 10 cm-1

nach H/D-Austausch kann anhand des Maximums verfolgt werden, das sich von 1685 cm-1 nach

ca. 1675 cm-1 verlagert. Beim ∆cyoE-Differenzspektrum ist das Maximum bei 1722 cm-1 inten-

siver ausgeprägt, jedoch an der selben Position vorhanden. Es findet nach H/D-Austausch eine

Verschiebung des Maximums um 8 cm-1 nach 1714 cm-1 statt. Es wird daher einem der beiden

Hämpropionate des low-spin Häms zugeordnet.

Das Differenzsignal mit einem Maximum bei 1685 cm-1 und einem Minimum bei 1678 cm-1

verschiebt ebenfalls beim 12C/13C-Austausch. Das vermutlich in die Amid I-Region verschobene

Signal kann dort nicht mehr identifiziert werden. Im Spektrum der ∆cyoE-Mutante findet sich

das Maximum der Differenzbande bei 1680 cm-1 wieder. Eine vom H/D-Austausch abhängige

Verschiebung ist ebenfalls zu beobachten. Somit wird dieses Carbonylsignal einem der beiden

Hämpropionate des high-spin Häms zugeordnet.

3.4.4 Auto-photoreduktions-induzierte FT-IR Redox-Differenzspektren von ortsspezifischen Cyt bo3-Mutanten In diesem Unterpunkt werden nun ortsspezifische Cyt bo3-Mutanten mittels der APR-

Differenzspektroskopie untersucht, um etwaige Unterschiede in den APR-Differenzspektren der

Mutanten gegenüber den pIN-Wildtyp-Referenzspektren aufzuzeigen. Fehlt eine Bande im Mut-

antenspektrum, oder ist sie verschoben, kann die betreffende Bande möglicherweise der ausge-

tauschten Aminosäure zugeordnet werden. Tritt ein deutlicher Intensitätsverlust bzw. Intensi-

tätsanstieg einer Differenzbande auf, so kann es sich um eine mit der ausgetauschten Aminosäu-

re wechselwirkende benachbarte chemische Gruppe handeln.

Die Cyt bo3-Mutanten E286Q und Y288F erfüllen nicht die unter 3.4.1 geforderten Qualitätskri-

terien der APR-Proben. Sie können nicht mit der hier verwendeten Methode ausgewertet wer-

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

96

den. Unter 3.2 (Abb. 3.2.1; Abb. 3.2.2) wurde dargelegt, dass die low-spin Häme dieser Mutan-

tenproteine nur unvollständig reduzierbar sind. Um dennoch vergleichbare Signalintensitäten in

der Carbonylregion zu erreichen, muss daher mindestens das Doppelte an Cyt bo3-

Mutantenprotein zur Probenpräparation eingesetzt werden. Somit liegen die Amid I Resttrans-

missionen jedoch unterhalb von 1% und ein unmittelbarer Vergleich zum Referenzspektrum ist

nicht mehr gewährleistet.

Bei den Differenzspektren der Mutanten II E89D, II E89Q, T352S und T359S konnten nur

geringste Unterschiede gegenüber den Referenzspektren festgestellt werden. Sie werden daher

nicht weiter dargestellt und behandelt.

In Abb. 3.4.12 ist das Differenzspektrum der E286D-Mutante bei pH 8,0 im Vergleich zum pIN-

Wildtyp-Referenzspektrum dargestellt. In den grau unterlegten Bereichen sind zusätzlich die

APR-Differenzspektren bei pD 8,0 verglichen (oberste Spektren).

Abb. 3.4.12: APR-Differenzspektren des pIN-Wildtyps (schwarz) und der E286D (pHCL)-Mutante (rot). Es wur-den je 37 µg Oxidase eingesetzt, die in den Übersichtspektren eine Resttransmission der Amid I-Bande von 4,0%-6,3% aufwiesen. Die grau unterlegten Vergrößerungen stellen die Wellenzahlbereiche von 1780-1690 cm-1 und 1500-1150 cm-1 dar. Zusätzlich sind ganz oben die APR-Differenzspektren bei pD 8,0 gezeigt. Abgesehen von geringen Basislinienschwankungen decken sich die verglichenen Spektren

über große Bereiche. Es sind jedoch auch Unterschiede vorhanden, die vermutlich auf den Aus-

tausch der Aminosäure zurückzuführen sind. Der Carbonylbereich wird hierbei lediglich von

1780-1690 cm-1 dargestellt, da unterhalb von 1690 cm-1 keine nennenswerten Änderungen ge-

genüber dem Wildtypspektrum feststellbar sind. In dieser Region fehlt dem E286D-

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

97

Mutantenspektrum das bereits dem Glu-286 zugeordnete ν(C=O)-Streckschwingungs-Signal bei

1745/1735 cm-1 (3.3) [29]. Stattdessen findet sich ein in seiner Intensität stark erniedrigtes, in-

vertiertes Differenzsignal bei 1767/1762 cm-1, das bei H/D-Austausch nach 1760/1755 cm-1 ver-

schiebt und intensiver hervortritt. Es kann somit der ν(C=O) Streckschwingungssignale vom

Asp-286 zugeordnet werden.

Im Bereich von 1500-1150 cm-1 fehlen zwei weitere positive Banden bei 1367 cm-1 bzw. 1198

cm-1. In der Region von 1450-1264 cm-1 finden sich die δ(COH)-Beugeschwingungen von Glu

und Asp wieder. Diese verschieben bei H/D-Austausch nach 1058-955 cm-1 (Angaben nach

[93]). Im Mutantenspektrum kann die fehlende Bande bei 1367 cm-1 diesem Schwingungstyp

potentiell zugeordnet werden. Da das entsprechende Asp-286 ν(C=O)-Signal in der Carbonylre-

gion deutlich an Intensität verloren hat, lässt sich das δ(COH)-Signal in dieser komplex überla-

gerten Region des Differenzspektrums nicht wiederfinden. Im entsprechenden D2O-Spektrum

lassen sich keine Unterschiede zum Wildtypspektrum feststellen. Es hat folglich eine lösungs-

mittelabhängige Verschiebung stattgefunden. Der Bereich unterhalb von ca. 1100 cm-1 steht

einer Auswertung nicht zur Verfügung (3.4.1). Somit kann das Fehlen der δ(COD)-

Beugeschwingung im E286D-Mutantenspektrum nicht nachgewiesen werden. Im Wellenzah-

lenbereich von 1253-1120 cm-1 finden sich die ν(C-O)-Streckschwingungen von Glu und Asp.

Diese Schwingungen verschieben bei H/D-Austausch um +88 cm-1 und liegen dann zwischen

1322-1270 cm-1 [93]. Die Bande bei 1198 cm-1 kann potentiell den ν(C-O)-Streckschwingungen

des Glu-286 zugeordnet werden. Die entsprechenden Asp-286 Schwingungen können aufgrund

des kleinen zu erwartenden Signals nicht identifiziert werden. In den verglichenen pD-Spektren

ist das positive Signal bei 1198 cm-1 nicht mehr vorhanden. Die verschobene Bande, die um

1286 cm-1 liegen sollte, kann nicht mehr im Spektrum wiedergefunden werden, da diese Region

von einer relativ intensiven negativen Bande mit einem Minimum bei 1283 cm-1 überlagert

wird.

Zuletzt soll das APR-Differenzspektrum der F391Q-Mutante betrachtet werden (Abb. 3.4.13).

Die Ergebnisse werden in dieser Arbeit nur beschrieben, da die Ursachen für den Signalrück-

gang an der Differenzbande bei 1696/1691 cm-1 und die Schwingungstypen von den beteiligten

Atomgruppen an diesen Wellenzahlenpositionen unklar bleiben. Da diese Differenzbande keine

pH- bzw. pD-Wert abhängigen Veränderungen aufweist, konnte sie bisher zur Skalierung der

hier gezeigten FT-IR-Spektren des Cyt bo3 eingesetzt werden und ist somit von großer Bedeu-

tung. Daher werden auch ohne weitergehende Interpretationen diese Ergebnisse vorgestellt, um

Anhaltspunkte für zukünftige Untersuchungen zu liefern.

Ergebnisse ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

98

Die F391Q-Mutante weist weder eine in vivo, noch in vitro Aktivität auf (Tab. 3.2.6). Sie zeigt

eine verlangsamte Auto-Photoreduktion und liegt nach erfolgter IR-Messung nur zu ca. 70-80%

reduziert vor (Daten nicht gezeigt).

Die Differenzbande bei 1696/1691 cm-1 ist nur noch in verminderter Intensität vorhanden.

Daher wird das in Abb. 3.4.13 dargestellte Mutantenspektrum mittels der Amid II Bande des

Referenzspektrums skaliert (aus Ermangelung an Banden gleicher Intensität zwischen pH- und

pD-Spektren wird die Amid II-Bande gewählt). Eine hohe Signaldeckung wird mit Ausnahme

zweier hervorgehobener Banden bei 1696/1691 cm-1 und 1262/1243 cm-1 über den gesamten

Wellenzahlenbereich erzielt. Das Minimum bei 1262 cm-1 ist stark erniedrigt, wie dies bereits

beim Differenzspektrum der ∆cyoE-Mutante der Fall war.

Abb. 3.4.13: APR-Differenzspektren des pIN-Wildtyps (schwarz) und der F391Q (pHCL)-Mutante (rot). Es wur-den je 37 µg Oxidase eingesetzt, die in den Übersichtspektren eine Resttransmission der Amid I-Bande von 6,3% bzw. 4,8% aufwiesen. Die grau unterlegten Vergrößerungen stellen die Wellenzahlbereiche von 1780-1690 cm-1 und 1500-1150 cm-1 dar. Die Signalintensitäten der 1696/1691 cm-1 Differenzbande gehen bei den F391Q-Spektren auf

etwa die Hälfte im pH 8,0-Spektum bis Eindrittel im nicht dargestellten pD 8,0-Spektrum zu-

rück, wobei die Bandenposition erhalten bleibt. Die Differenzsignale des Glu-286 und die posi-

tiven Häm-Carbonylextinktionen des low-spin Häms sind demgegenüber unverändert. Ebenso

wirkt sich der Intensitätsverlust bei 1696/1691 cm-1 nicht auf die Positionen der Maxima und

Minima im Bereich von 1690-1675 cm-1 aus.

99

4. Diskussion 4.1 Erstellung eines C-terminal von Untereinheit II nicht prozessierten

Wildtyps von Cyt bo3

4.1.1 Motivation zur Erstellung eines neuen, mit verbesserten Reinigungseigenschaften

versehenen Cyt bo3 Wildtyps

Einen neuen Cyt bo3 Wildtyp zu erstellen, der weder eine C-terminale Proteolyse noch eine Ab-

spaltung des C-Terminus während des Zellaufbruchs mit Ultraschall an Untereinheit II zeigt, ist

aus mehreren Gründen notwendig:

Proteinreinigung

Der bisher verwendete Cyt bo3 Wildtyp, kodiert vom pHCL-Plasmid zeigt posttranslational eine

Proteolyse des C-Terminus an Untereinheit II und somit den Verlust der Oligohistidin-

modifikation in Abhängigkeit von den Fermentationsbedingungen (Abb. 3.1.1). Der Verlust der

Modifikation wird während des Zellaufbruchs mit Ultraschall noch erhöht [59]. Bisher mussten

zwei unterschiedliche Strategien zur Überexpression und Proteinreinigung verfolgt werden, je

nachdem ob (I) hochreines und bezüglich Untereinheit II homogen zusammengesetztes Cyt bo3

benötigt wurde [59] oder ob (II) die Proteinausbeute hoch sein sollte [49]: Ad (I) - Die E. coli

Zellen werden in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase geerntet und der Zellaufbruch

schonend, d.h. kurz und bei niedrigen Ultraschallenergien durchgeführt, um die Oligohistidin-

modifikation zumindest zum Teil zu erhalten. Durch einen entsprechenden Imidazolwaschschritt

kann unmodifiziertes von modifiziertem Cyt bo3 auf der Säule getrennt werden. Dies führt zu

deutlich verminderten, jedoch hochreinen und bezüglich Untereinheit II homogenen Proteinaus-

beuten. Ad (II) - Die auftretende C-terminale Proteolyse bzw. Abspaltung beim Zellaufbruch an

Untereinheit II wird nicht beachtet und die Fermentations- sowie die Ultraschallbedingungen so

gewählt, dass eine hohe Proteinausbeute zu erwarten ist. Zur Reinigung des im hohen Maße

unmodifizierten Cyt bo3 wird dessen geringere, aber vorhandene „endogene“ Affinität zu Metal-

laffinitätschromatographie-Säulenmaterialien, wie z.B. Ni2+-NTA-Agarose genutzt (Abb. 3.1.4)

[49; 116]. Es resultiert eine deutlich erhöhte Proteinausbeute, die jedoch Fremdproteinverunrei-

nigungen (Abb. 3.1.3 und Abb. 3.1.5) aufweist und Oxidaseverluste während des 20 mM Imida-

zolwaschschritts beinhaltet. Die erhaltene Cyt bo3-Molekülpopulation kann bezüglich Unterein-

heit II heterogen zusammengesetzt sein, da die Stärke des Verlusts des C-Terminus und somit

der Oligohistidinmodifikation hoch variabel ist [59].

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

100

Mit der Erstellung des pIN-Plasmids, der Überexpression in BL21 ∆cyo recA- und der an-

schließenden Proteinreinigung kann ein Cyt bo3 erhalten werden, das keine C-terminale Proteo-

lyse an Untereinheit II und somit keinen Verlust der Oligohistidinmodifikation zeigt (Abb. 3.1.3

und Abb. 3.1.5). Bei dem Protein konnte keine Abspaltung des C-Terminus während des Zell-

aufbruchs beobachtet werden (Abb. 3.1.4). Somit kann ein schnell und einfach durchzuführen-

des Proteinreinigungsprotokoll mit hohen Oxidaseausbeuten realisiert werden (Tab. 3.1.1), das

unabhängig von den verschiedenen bisherigen Fermentations- und Ultraschallbedingungen ist.

Es kann eine bezüglich Untereinheit II homogene Cyt bo3-Molekülpopulation erhalten werden.

Isotopenmarkierung der Hämpropionate

An dieser Stelle soll die Notwendigkeit für den Einsatz des pIN-Wildtyps für die Isotopenmar-

kierung der Hämpropionate im Vordergrund stehen und nicht die Diskussion der Ergebnisse der

Markierung, die unter 4.3.3 durchgeführt wird.

Die low-spin Häm-Bindestelle ist nicht nur für Häm B, sondern auch für Häm O zugänglich

[65]. Es können Oxidase-Molekülpopulationen entstehen, die heterogen in ihren eingebauten

Häm-Kofaktoren zusammengesetzt sind, d.h. es kann nicht nur Cyt bo3, sondern auch das inak-

tivere Cyt oo3 in E. coli überexprimiert werden (Abb. 3.1.6). Die Tendenz, Häm O anstelle des

Häm B zu inkorporieren könnte abhängig von der Kopieanzahl des zur Überexpression benutz-

ten Plasmids und vom eingesetzten Expressionsstamm sein [59; 65]. Die tatsächlichen Gründe

hierfür sind jedoch unklar. Diese Heterogenität führt zu Komplikationen bei der spektroskopi-

schen und kinetischen Charakterisierung des Enzyms [136]. Die Oligohistidinmodifikation an

Untereinheit II ist aus unbekannten Gründen für den korrekten Häm-Einbau notwendig [59]. Der

pIN-Wildtyp weist ein Häm B in der low-spin- bzw. ein Häm O in der high-spin Häm-

Bindetasche und ein 1:1 Verhältnis der beiden Häme auf (3.1.2.2, Abb. 3.1.6). Eine weiterge-

hende Diskussion zum Häm-Fehleinbau bei Cyt bo3 wird im anschließenden Unterpunkt (4.1.2)

wieder aufgenommen.

Zur spezifischen Isotopenmarkierung von z.B. den Hämpropionaten sind E. coli Stämme mit

entsprechenden Defekten in den Biosynthesewegen, wie z.B. E. coli S730 (Abb. 1.2.5 und Tab.

2.1.1) notwendig. In diesem E. coli Stamm ist das genomische cyo-Operon intakt. Das cyoA-

Gen weist entsprechend keine kodierenden Sequenzen für eine Oligohistidinmodifikation auf

und der Genom-Wildtyp kann potentiell bei einem Überangebot an Häm O diesen Häm-Typ in

der low-spin Hämbindetasche einbauen. Nach Transformation eines Expressionsvektors, der das

cyo-Operon beinhaltet (z.B. pIN, Abb. 2.1.1), kommt es neben der Expression der vier Struktur-

gene des Cyt bo3 ebenfalls zur Überexpression der Protohäm IX-Farnesyltransferase (CyoE).

Somit kann der Genom-Wildtyp bezüglich der Häm-Kofaktoren heterogen exprimiert werden.

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

101

Bei dem Redox-Differenzspektrum der S730 pIN-Cytoplasmamebranen unter Zugabe von ALV

(Abb. 3.4.7 links) ist dies deutlich an dem asymmetrischen Verlauf der α-Bande und dem

hypsochrom verschobenen Extinktionsmaximum der Soret-Bande zu erkennen. Um eindeutige

spektrale Zuordnungen machen zu können, muss folglich eine bezüglich der Häm-Kofaktoren

homogene Cyt bo3 Molekülpopulation vorliegen, d.h. bei der Proteinreinigung muss der Genom-

Wildtyp vom pIN-Wildtyp trennbar sein. Dies ist nur bei intakter Oligohistidinmodifikation

möglich. Nach der Reinigung weist der 13C-isotopenmarkierte pIN-Wildtyp im Redox-

Differenzspektrum eine symmetrisch verlaufende α-Bande (Abb. 3.4.7 rechts), also nur vom

Plasmid exprimiertes Enzym auf. Erst mit dem Einsatz des pIN-Plasmids, dessen Expressions-

produkte den His-tag an Untereinheit II tragen, ist eine homogene Cyt bo3 Molekülpopulation

bei der 13C-Isotopenmarkierung im E. coli Stamm S730 zu erreichen.

Reinigung von ortsspezifischen Cyt bo3-Mutanten

Ortsspezifische Cyt bo3 Mutanten können bisher bei hohen Proteinausbeuten nur in einem Ex-

pressionsystem überproduziert werden, das einen E. coli Stamm aufweist, der Inaktivierungen

des genomischen cyo-Operons und des RecA-Proteins, einen Bestandteil der homologen Re-

kombination (z.B. [137]) beinhaltet, wie z.B. BL21 ∆cyo recA-. Da es nunmehr möglich ist, auf

dem pIN-Plasmid basierende Mutanten zu reinigen, die keine Proteolyse bzw. Abspaltung der

Oligohistidinmodifikation zeigen (3.1.3), können E. coli Stämme unabhängig von der Inaktivie-

rung des genomischen cyo-Operons eingesetzt werden. Die Einschränkung, dass der verwendete

E. coli Stamm hierbei nicht zur homologen Rekombination befähigt ist, bleibt erhalten, da an-

sonsten bei einer homologen Expression des Cyt bo3 die eingefügte Mutation im Expressions-

vektor reversibel sein kann. Somit besteht für zukünftige Untersuchungen, wie z.B. die Isoto-

penmarkierung von spezifischen Aminosäuren in entsprechend defizienten E. coli Stämmen die

Möglichkeit diese Experimente zu verwirklichen.

4.1.2 Untereinheit II der Ubichinol Oxidase Cyt bo3

An allen vier Strukturgenen des Cyt bo3 wurden für Oligohistin-Modifikationen kodierende Se-

quenzen C-terminal inseriert [49; 59]. Der His-tag an Untereinheit III führte zu instabilen, nicht

in der cytoplasmatischen Membran assemblierten Enzymen [59]. Sowohl bei dem unmodifizier-

ten pMC39-Wildtyp, als auch bei den Oxidasen, die den His-tag an Untereinheit I und Unter-

einheit IV tragen, werden funktionelle, in der Membran assemblierte Oxidasen erhalten. Diese

weisen jedoch bezüglich der Häm-Inkorporation heterogene Cyt bo3/Cyt oo3 Molekülpopula-

tionen auf [49; 59; 65]. Eine Oligohistidinmodifikation am C-Terminus von Untereinheit II führt

jedoch zu einer homogenen Cyt bo3 Molekülpopulation [49; 59]. Die letzten sechs Aminosäuren

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

102

des C-Terminus können in vivo proteolytisch verschieden stark, in Abhängigkeit von den Fer-

mentationsbedingungen (Abb. 3.1.1) und -zeiten abgespalten werden [49]. Die Proteolyse des

C-Terminus wirkt sich nicht auf die katalytische Funktion des Cyt bo3 aus [59].

In Abb. 4.1.1 sind die Ergebnisse der Mutationsanalysen (Abb. 3.1.2) des C-Terminus von

Untereinheit II nochmals zusammenfassend in einer schematischen Darstellung wiedergegeben.

Abb. 4.1.1: Schematische Darstellung der C-Termini von Untereinheit II der Wildtyp- und Mutantenproteine von Cyt bo3 hinsichtlich ihres C-terminalen Proteolyseverhaltens. Ein Aminosäureaustausch des Ser-309 zu Ala, des His-310 zu Arg und die entsprechende

Doppelmutante führen zu einem Abbau der Untereinheit II und damit zu keiner Assemblierung

des Cyt bo3 in der cytoplasmatischen Membran. Diese Proteindegradationen können darauf

hinweisen, dass der Aminosäuresequenz am C-Terminus von Untereinheit II eine wichtige regu-

lative und physiologische Bedeutung im Hinblick auf die Assemblierung des Cyt bo3 zukommt.

Bei der Inserierung von sechs Histidinen, bei gleichzeitiger Deletion der drei zur Spaltungs-

stelle benachbarten Aminosäuren Met, Asp und Met wird ein funktionelles und in der Membran

assembliertes Cyt bo3 erhalten. Der pIN-Wildtyp zeigt weder eine C-terminale Proteolyse der

letzten sechs Aminosäu noch den Verlust der Oligohistidinmodifikation (Abb. 3.1.3). Eine Ab-

spaltung während des Zellaufbruchs mit Ultraschall ist ebenfalls nicht festzustellen (Abb. 3.1.4).

Es kann ein hochreines Cyt bo3 mittels Ni2+-NTA-Agarose gereinigt werden (Abb. 3.1.5). Die

gereinigte Oxidase weist ein Häm B in der low-spin Hämbindetasche auf und besitzt ein 1:1

Verhältnis von Häm B zu Häm O (Abb. 3.1.6). Ein Cyt oo3 Anteil ist nicht nachweisbar. Es

handelt sich folglich bezüglich der Häm-Inkorporation und bezüglich Untereinheit II um eine

homogen zusammengesetzte Cyt bo3-Molekülpopulation. Diese Ergebnisse deuten darauf hin,

dass der C-Terminus von Untereinheit II an der Häm-Bindung, der Häm-Weiterleitung und so-

mit der korrekten Häm-Inkorporation in Untereinheit I beteiligt sein könnte.

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

103

Neben der katalytischen Untereinheit I ist Untereinheit II essentiell für die Funktion der Häm-

Kupfer Oxidasen [16]. Hier sollen kurz einige wichtige Aspekte zur physiologischen Bedeutung

dieser Untereinheit in Cytochrom Oxidasen im Allgemeinen und Cyt bo3 im Speziellen be-

schrieben werden.

An der Substratbindung (Ubichinol oder Cyt c) bei Häm-Kupfer Oxidasen ist Untereinheit II

beteiligt (1.2). Im Cyt bo3 weist sie bis zu zwei postulierte Chinolbindestellen auf, die am Elekt-

ronentransfer zum binuklearen Zentrum beteiligt sind (1.3). Diese Untereinheit scheint darüber

hinaus für die initiale Assemblierung des Cyt bo3 wichtig zu sein: Intrinsische Proteine der cyto-

plasmatischen Membran werden bei E. coli gewöhnlich nicht als eine Vorstufe mit abspaltbarer

N-terminaler Signalsequenz synthetisiert [115]. CyoA stellt eine Ausnahme dar (Abb. 4.1.2). Es

weist eine 24 Aminosäuren lange Signalsequenz auf, die eine sogenannte „Lipobox“ beinhaltet.

Es gehört somit zu den Lipoproteinen [115; 138; 139]. Die posttranslationalen Modifikationen

am N-Terminus von Untereinheit II werden hier nicht detaillierter beschrieben. Bei Deletion der

Signalsequenzaminosäuren zwei bis neun (∆R2S9) wird eine Inkorporation der Oxidase in der

Membran verhindert [115]. Beim Austausch der vier potentiell positiv geladenen Aminosäuren

zu neutralen Aminosäuren (II R2S, II R4S, II K5N und II K8N) der Signalsequenz ist eine ge-

genüber dem Wildtyp zu ca. 50% verminderte Assemblierung des Cyt bo3 festzustellen [115].

Die für intrinsische Proteine der Cytoplasmamembran ungewöhnliche Signalsequenz des CyoA

könnte einen unmittelbaren Transport von Untereinheit II durch die Membran zur Folge haben

und somit die extrinsische Domäne der Untereinheit II in das Periplasma transferieren. Dabei

würden die beiden transmembranen α-Helices eine vollständige Sekretion des CyoA verhindern

und eine Art „Anker“ in der Cytoplasmamembran darstellen, um den sich die weiteren Unter-

einheiten des Cyt bo3 formieren. Dies würde auf eine frühe Beteiligung von Untereinheit II an

der Assemblierungsreaktion des Cyt bo3 in der cytoplasmatischen Membran hindeuten.

Interessanterweise besitzen einige Cyt c Oxidasen neben dem CuA-Zentrum ein Häm-Zentrum

(Cytochrom Domäne) in ihrem C-Terminus von Untereinheit II. Sie werden entsprechend als

caa3 Oxidasen bezeichnet (zur Übersicht s. z.B. [11; 140]). Diese extrinsische Cytochrom Do-

mäne weist ein Sequenzmotiv -CXXCH- zur Anbindung von Hämen auf [11]. Bei pro- und eu-

karyontischen P-Typ ATPasen findet sich N-terminal ein Sequenzmotiv -GMTCXXC- zur

Schwermetallbindung [141]. Dieses Motiv kann variieren, jedoch beinhaltet es immer die Se-

quenz -CXXC-. Darüber hinaus wird bei den sogenannten „Cpx“-Typ ATPasen ein weiteres

Metallbindemotiv -H/MXXMDHS/GXM- gefunden, das N-terminal ein- bis sechsfach wieder-

holt vorliegt [141-143]. Der C-Terminus des Cyt bo3 von Untereinheit II weist in der Primärse-

quenz ein sehr ähnliches Motiv an den Aminosäurepositionen 303-311 auf -MEGMDMSHA-

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

104

(Abb. 4.1.1 und Abb. 4.1.2), wobei die Aminosäuren Ser und His den Ort der posttranslationa-

len C-terminalen Proteolyse darstellen. Alle sechs im ATPase Motiv beschriebenen konservier-

ten Aminosäuren sind vollständig wiederzufinden, wenn auch zum Teil in leicht variierter Posi-

tion. Eine übereinstimmende Position lässt sich für 2/3 der Aminosäuren finden

(MXXMDMSHX). An den Aminosäurepositionen 281-290 dieser Untereinheit findet sich

nochmals eine Sequenz mit sehr ähnlicher Aminosäurezusammensetzung -MAHGKSMDM-

(Abb. 1.4.2). In diesem Falle finden sich jedoch nicht die beiden Aminosäuren Ser und His in

unmittelbarer Reihenfolge. Eine Proteolyse innerhalb dieser Sequenz ist bisher nicht nachgewie-

sen. Ansonsten sind wiederum alle sechs konservierten Aminosäuren des ATPase-Motivs vor-

handen, wenn auch die Konsensussequenz nicht mehr eindeutig zuzuordnen ist. In beiden Fällen

könnte es sich demnach um Aminosäuresequenzen handeln, die ähnlich wie in caa3 Oxidasen

Häme binden können. Im Unterschied zu den caa3 Oxidasen liegt in Untereinheit II des Cyt bo3

jedoch keine Cytochrom-Domäne vor und stattdessen könnten über diesen C-Terminus die

Häm-Bindung und Häm-Weiterleitung zu Untereinheit I erfolgen.

Abb. 4.1.2: Schematische Darstellung von Untereinheit II des pMC39-Wildtyps und des C-Terminus des pIN-Wildtyps. Die Signalpeptidabspaltung () und die anschließende Palmitoyl-Dipalmitoylglycerid-Modifikation () ist hier nur zur Vollständigkeit gezeigt. Eine genauere Beschreibung der postranslationalen Prozessierungen kann Prutsch et al., 2000 [49] entnommen werden. Die Kristallstrukuren der Cyt c Oxidasen [15; 23-25] und des Cyt bo3 [22] weisen bezüglich

der Lokalisation von Untereinheit II im Enzymkomplex eine vergleichbare Lage auf. Hierbei

liegt die globuläre extrinsische C-terminale Domäne über den Häm-Bindestellen in Unterein-

heit I. Da Untereinheit II sowohl N- als auch C-terminal an der initialen Assemblierung des Cyt

bo3 beteiligt sein könnte, ist eine Häm-Weiterleitung zur Inkorporation in der sich assemblieren-

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

105

den Untereinheit I durchaus denkbar. Ein Sequenzvergleich von diversen Cytochrom Oxidasen

kann z.B. [11] entnommen werden. Die C-terminalen Aminosäuren des Cyt bo3 weisen von ca.

Position 140-315 jedoch nur eine konservierte Aminosäure zu anderen Häm-Kupfer Oxidasen

auf [11]. Da caa3- und aa3-Typ Cyt c Oxidasen nur Häm A inkorporieren, ist eine Unterschei-

dung in die verschiedenen Häm-Spezies nicht erforderlich und demnach ist ein C-Terminus

nicht notwendig wie er in E. coli realisiert ist.

Die Häm B Synthese in E. coli (Abb. 1.2.5) ist unabhängig von der Transkription und Transla-

tion des cyo-Operons und somit auch von der Protohäm IX-Farnesyltransferase. Häm B wird in

unterschiedlichsten Proteinen, wie z.B. dem Cyt bd in E. coli benötigt. Entsprechend könnte die

intrazelluläre Häm B-Konzentration gegenüber der Häm O-Konzentration erhöht sein. Dies

wiederum hat zur Folge, dass die Affinität eines der beiden putativen C-terminalen Häm-

Bindemotive von Untereinheit II zu Häm O erhöht sein müsste, um eine 1:1 Inkorporation der

Häme innerhalb des Cyt bo3 zu gewährleisten. Bei einem Überangebot von Häm O, wie bei der

Überexpression von CyoE vom Plasmid, kehren sich diese Häm-Konzentrationsverhältnisse

jedoch um. Da demnach häufig nur Häm O am C-Terminus gebunden vorliegen müsste, würde

es vermehrt zum Fehleinbau von Häm O in der low-spin Hämbindetasche kommen. Dies würde

eine plausible Erklärung für die heterogenen Cyt bo3/Cyt oo3 Molekülpopulationen liefern, wie

sie z.B. im pMC39-Wildtyp oder den Oxidaseproteinen zu finden sind, die den His-tag an Un-

tereinheit I bzw. Untereinheit IV tragen. Nach der hier vorgestellten Hypothese könnte die Oli-

gohistidinmodifikation an Untereinheit II die Affinität zu Häm O erniedrigen. Ein ähnliches

Postulat wurde bereits in Rumbley et al. 1997 [59] aufgeführt, wobei der Oligohistidinmodifika-

tion am C-Terminus von CyoA nur eine allgemeine Beteiligung am Häm-Einbau in Unterein-

heit I zugeschrieben wurde. Der Stickstoff des Imidazolrings des Histidins weist zu divalenten

Kationen eine hohe Affinität auf. Entsprechend könnte die Affinität des nativen Bindesequenz-

Motivs seine erhöhte Selektivität für Häm O verlieren, da eine unselektive Wechselwirkung der

Eisenzentralatome der Häme mit dem His-tag stattfinden könnte. Häm B würde aufgrund seiner

„Passgenauigkeit“ demnach wieder verstärkt in die low-spin Häm-Bindetasche eingebaut.

Dieser Gedanke kann jedoch noch weiter ausgeführt werden. Betrachtet man unter diesem

Aspekt nochmals Abb. 4.1.2, so fallen neben den postulierten Häm-Bindemotiven (rot darge-

stellt) zwei weitere sich nahezu wiederholende Aminosäuresequenzen mit einem hohen Histidi-

nanteil auf (grün dargestellt), die im Übrigen für die natürliche Affinität des Cyt bo3 für Metal-

laffinitätschromatographie-Säulenmaterialien verantwortlich sein könnten. Die möglichen Häm-

Bindemotive könnten sich entsprechend auf -MAHGKSMDMXXXXXEHSAH- und

-MEGMDMSHAESAH- ausweiten. Dem ganz C-terminal gelegenem Häm-Bindemotiv könnte

eine erhöhte Affinität zu Häm O und damit die initiale Bindung zugeschrieben werden, dem

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

106

zweiten Häm-Bindemotiv die vorübergehende Anbindung eines Häm B oder die gerichtete Wei-

terleitung der Häme zu Untereinheit I. Den zur Spaltungsstelle unmittelbar benachbarten Ami-

nosäuren Ser und His könnte hierbei eine Schlüsselrolle zur Häm bzw. Häm O Bindung zu-

kommen. Dies würde erklären, weshalb ein Aminosäureaustausch an diesen beiden Positionen

zu einer Degradation des Cyt bo3 führt, da die wesentliche Funktion, die Häme zu binden und in

Untereinheit I weiterzuleiten nicht erfolgen kann. Dementsprechend kann sich Untereinheit I

nicht korrekt in der cytoplasmatischen Membran assemblieren und die überexprimierten Poly-

peptidketten sind einem proteolytischen Abbau in E. coli zugänglich. Beim pIN-Wildtyp fehlen

zwar die Aminosäuren Met, Asp und Met im Metallbinde-Motiv, dieser Verlust könnte jedoch

durch den ebenfalls potentiell metallbindenen His-tag kompensiert werden. Die Aminosäuren

Ser und His sind von dieser Deletion und Insertion nicht betroffen.

Weshalb die C-terminale Proteolyse der letzten sechs Aminosäuren stattfindet bzw. im pIN-

Wildtyp ausbleibt, bleibt nach wie vor unklar.

Die hier ermittelten Daten erweitern die These, dass an der Assemblierung des Cyt bo3 nicht nur

der N-Terminus, sondern auch der C-Terminus von Untereinheit II beteiligt sein könnte. Dar-

über hinaus könnte der C-Terminus über Häm-Bindemotive verfügen, die ähnlich dem Metall-

bindemotiv -MXXMDHSXM- sind, das bei Cpx-Typ ATPasen beschrieben ist. Somit könnte

der C-Terminus an der Häm-Bindung und Häm-Weiterleitung in Untereinheit I beteiligt sein.

Für zukünftige Untersuchungen, wie z.B. ortsspezifische Mutantenerstellungen innerhalb der

potentiellen Bindemotive stellt diese Hypothese einen vielversprechenden Ausgangspunkt dar.

Hierbei wären die vordringlichen Ziele: (I) dass es sich bei den beschriebenen Motiven um

Häm-Bindemotive handelt und, (II) dass eine unterschiedliche Affinität der Häm-Bindemotive

zu Häm B und Häm O besteht.

4.1.3 Biochemische und VIS-spektroskopische Charakterisierung des pIN-Wildtyps

Der pIN-Wildtyp zeigt Unterschiede gegenüber dem pHCL-Wildtyp, sowohl in der VIS-

spektroskopischen Charakterisierung (3.1.2.2), als auch in der Durochinol-Oxidaseaktivität

(3.1.2.3). Das Cyt bo3 kann nur zu ca. 72% mit Natriumdithionit reduziert werden (Abb. 3.1.7).

Der externe Ligand Cyanid bindet am oxidierten binuklearen Zentrum des Cyt bo3. Die Bindung

ist also unabhängig von der Reduktion des Enzyms. Dennoch wird, im Vergleich zum pHCL-

Wildtyp, Cyanid vom pIN-Wildtyp in geringerem Ausmaß gebunden (Abb. 3.1.7). Dies deutet

auf eine unvollständige Zugänglichkeit des high-spin Häm O hin, wobei die fehlende CT-Bande

auf ein ansonsten redoxaktives binukleares Zentrum hinweist [118; 121]. Da das reduzierte Cyt

bo3 nach CO-Begasung ebenfalls nur einen CO-Anbindungsgrad von ca. 70% in den Redox-

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

107

Differenzspektren aufweist (Abb. 3.2.2), kann hieraus gefolgert werden, dass nur das high-spin

Häm O unvollständig reduziert wird. Die reduzierten und CO-gebundenen high-spin Häme sind

jedoch vollständig redoxaktiv, bei intaktem binuklearen Zentrum (Abb. 3.1.8). Unabhängig von

den VIS-spektroskopischen Ergebnissen weist der pIN-Wildtyp nur 64% Durochinoloxidase-

Aktivität gegenüber dem Referenzenzym auf (Tab. 3.2.6).

Eine unvollständige Häm-Bindung in den Häm-Bindetaschen beim pIN-Wildtyp kann aus

zwei Gründen nahezu ausgeschlossen werden. (I) Die HPLC-Analytik der Hämextrakte weist

auf ein 1:1 Verhältnis von Häm B zu Häm O hin (Abb. 3.1.6). (II) Das oxidierte Absolutspekt-

rum weist einen höheren Extinktionswert am Soret-Bandenmaximum (410 nm) auf als das

pHCL-Referenzspektrum (Tab. 3.2.2). Im Cyanid- (Abb. 3.1.7) bzw. reduzierten Absolutspekt-

rum werden jedoch niedrigere Extinktionen gegenüber der Referenz erhalten, d.h. dass sowohl

die Cyanid-Anbindung als auch die Reduktion an weniger high-spin Häm-Molekülen stattfindet,

als Häme zur Gesamtextinktion im oxidierten Absolutspektrum beitragen.

Trotz der Vielzahl an durchgeführten Experimenten lässt keine der Untersuchungen einen

plausiblen Rückschluss auf das veränderte Verhalten der high-spin Häme im pIN-Wildtyp zu. Es

kann daher nur spekuliert werden. Der pIN-Wildtyp unterscheidet sich bezüglich der Positionen

von den Extinktionsmaxima bzw. -minima bei allen hier durchgeführten VIS-spektroskopischen

Untersuchungen nicht bzw. nur sehr geringfügig vom pHCL-Wildtyp (Abb. 3.1.7, Tab. 3.2.1,

Tab 3.2.3) -die Unterschiede im CO-gebundenen Zustand sind auf die unvollständige Reduktion

des high-spin Häm O zurückzuführen-. Wenn ein Unterschied der beiden Oxidasen vorhanden

ist, dann könnte das Maximum der Soret-Bande im oxidierten Absolutspektrum einen Hinweis

geben, das von 409 nm auf 410 nm bathochrom verschoben ist. Das Extinktionsminimum im

Redox-Differenzspektrum vom pIN-Wildtyp ist ebenfalls um 1 nm bathochrom verschoben.

Diese Befunde können darauf hindeuten, dass ein externer, „elektronendrückender“ Ligand irre-

versibel am high-spin Häm bzw. am binuklearen Zentrum gebunden ist (1.4) oder ein Wechsel

in der Konformation der Oxidase ausgelöst wird, der auch in Abwesenheit des Liganden erhal-

ten bleibt. Bei der bovinen mitochondrialen Cyt c Oxidase ist ein solcher konformativer Wech-

sel beschrieben, der durch Kohlendioxid (CO2) ausgelöst wird [144; 145]. Dies führt zu einer

Oxidase, die zu einem großen Teil in der slow-form vorliegt und Schwierigkeiten sowohl bei der

Reduktion als auch bei der Ligandenbindung von Cyanid und CO mit sich bringt [146; 147]

Häufiges Einfrieren bzw. Auftauen des Enzyms ohne entsprechende Schutzgasatmosphäre för-

dert die CO2-Anbindung. Für Cyt bo3 ist jedoch eine solche CO2-Ligandierung bislang nicht

beschrieben und im Alltagsgebrauch des pIN-Wildtyps wurden keine entsprechenden Schutz-

massnahmen getroffen. Für eine mögliche CO2-Anbindung am pIN-Wildtyp spricht der höhere

Reduktionsgrad der beiden auf dem pIN-Plasmid basierenden Mutanten T352S und T359S. Sie

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

108

weisen 90% bzw. 96% Reduktion auf (Tab. 3.2.2). Da beiden Mutanten nur für einige wenige

Messungen aufgetaut bzw. eingefroren wurden, könnte dies den erhöhten Reduktionsgrad ge-

genüber dem pIN-Wildtyp erklären. Die beobachtete unvollständige Zugänglichkeit des high-

spin Häms im pIN-Wildtyp ginge somit auf eine Art „Alterungsprozess“ des Proteins zurück.

4.2 IR-Probenerstellung mit der Gasaustauschzelle

Erst die Konstruktion und die Ausarbeitung von Parametern der Probenpräparation mit der Gas-

austauschzelle (Abb. 3.3.1) ermöglicht es Cyt bo3-Proben für die IR-Spektroskopie mit Calci-

umfluorid-Fenstern zu erhalten, die definierte H2O/D2O Lösungsmittelverhältnisse bzw. den

nahezu kompletten H/D-Austausch zulassen (Abb. 3.3.2, Abb. 3.3.3 und Abb. 3.3.4). Darüber

hinaus konnte K. Vogtt mit der Gasaustauschzelle IR-Proben des Cyt bo3 erstellen, die (I) mit

caged dioxygen [80] photooxidiert werden konnten und (II) die im sogenannten mixed-valence

Zustand des Cyt bo3 vorlagen (4.2.2) [105].

4.2.1 Redox-induzierter konformativer Wechsel des Glutamat-286 von Cyt bo3 in Abhäng-

igkeit vom H2O/D2O-Lösungsmittelaustausch

Mit dem Einsatz von IR-Proben, die mittels der Gasaustauschzelle erstellt werden, wird die pos-

tulierte Schalterfunktion an der hydrophoben Barriere der Aminosäure Glu-286 [29] bei voll-

ständigem H/D-Austausch untersucht.

Bevor die postulierte Schalterfunktion des Glu-286 diskutiert wird, sollen an dieser Stelle einige

wichtige Angaben zu dieser Aminosäure und zur FT-IR Messung am Cyt bo3 im Allgemeinen

gemacht werden:

Das in dieser Arbeit benutzte Cyt bo3 wird mit Triton X-100 und n-Octyl-β-D-Glucosid solu-

bilisiert. Hierdurch kommt es -ohne feststellbare Enzym-Denaturierungserscheinungen- zum

Verlust des festgebundenen Ubichinon-8 in der QH-Bindestelle (1.3) [22; 59]. Jedoch hat die

Anwesenheit des Chinons in Oxidasepräparationen, die nur mit Dodecylmaltosid durchgeführt

werden, einen deutlichen Einfluss auf die Einzelumsatz- (single-turnover) Oxidationskinetik der

vollständig reduzierten Oxidase erbracht [148]. Das festgebundene Chinon könnte als „Zwi-

schenspeicher“ für das zweite Elektron, das vom Ubichinol-8 übertragen wird, in Form eines

Semichinon-Radikals dienen [19; 20; 149]. Bei Abwesenheit des Chinons könnten nur drei

Elektronen zur Reduktion des Sauerstoffs zur Verfügung stehen und das Cyt bo3 würde im Zu-

stand des Ferryl-Intermediats des Katalysezyklus stehen bleiben („F“ in Abb. 1.2.3) [148]. Ge-

gen diese Annahme, dass das Cyt bo3 nach der Photo- und Auto-Photoreduktion ebenfalls im

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

109

Zustand des Ferryl-Intermediats vorliegt, sprechen die VIS-spektroskopischen Ergebnisse. Hier-

bei findet eine Reduktion des Cyt bo3 statt, die deutliche Übereinstimmungen zwischen Natri-

umdithionit reduzierten (Abb. 3.1.7), caged electron reduzierten (s. Begleittext zu 3.4.1) [29]

und auto-photoreduzierten VIS-Spektren (Abb. 3.4.4) aufweist. Im Falle der caged electrons

überträgt das Flavinsemichinon (F* in Abb. 1.5.3) solange Elektronen an das Cyt bo3, bis dieses

vollständig reduziert ist. Da das PR- und APR-Differenzspektrum (Abb. 3.4.1) ebenfalls deutli-

che Übereinstimmungen erkennen lässt, kann ebenfalls für die Auto-Photoreduktion, die im

nächsten Unterpunkt (4.3) behandelt wird, von einem vollständig reduzierten Cyt bo3 nach Be-

lichtung ausgegangen werden. Jedoch scheint das fehlende Ubichinon-8 möglicherweise einen

Einfluss auf die Bandenposition der ν(C=O)-Schwingungen des Glu-286 im FT-IR-

Differenzspektrum zu besitzen. In Puustinen et al., 1997 [150] wird für diese Aminosäure eine

Differenzbande bei 1731/1724 cm-1 aus dem CO-Differenzspektrum, bei Hellwig et al., 1999

[90] eine Differenzbande bei 1746/1720 cm-1 aus dem elektrochemisch induzierten Differenz-

spektrum gefunden.

Das Glu-286 bzw. das homologe Gegenstück in verwandten Enzymen ist eine hoch konservierte

Aminosäuren innerhalb der Familie der Häm-Kupfer Oxidasen. Sie befindet sich im D-Kanal

des Cyt bo3 (Abb. 1.2.2) und spielt eine wichtige Rolle im katalytischen Mechanismus des En-

zyms, sowohl bei der Sauerstoffreaktion [151] als auch beim Protonentransport [102]. Das Glu-

286 liegt sowohl im oxidierten als auch im reduzierten Zustand des Cyt bo3 protoniert vor [29;

150]. Der beim Redoxübergang des Cyt bo3 beobachtete konformative Wechsel der Seitenkette

des Glu-286 konnte in den PR-Differenzspektren der Differenzbande mit einem Minimum bei

1745 cm-1 und einem Maximum bei 1735 cm-1 zugeordnet werden [29]. Die positive Bande wird

dem vollständig reduzierten Zustand des Cyt bo3 zugeschrieben, die negative Bande dem voll-

ständig oxidierten Zustand. Dabei befindet sich die Seitenkette im reduzierten Zustand in einer

hydrophileren Umgebung als im oxidierten Zustand [29]. Der Isotopenaustausch an protonierba-

ren Gruppen des Cyt bo3 von 1H nach 2H wurde in dieser Veröffentlichung [29] durch den Aus-

tausch von H2O- auf D2O-haltigen Puffer und anschließender Konzentrierung durch Ultrakon-

zentratoren erreicht. Bei den anschließenden flüssigphasen IR-Probenpräparationen im Exsikka-

tor, wurden die Oxidasenproben nicht zur Gänze eingetrocknet und einmal 5h nach Fertigstel-

lung, im anderen Falle 2 Tage nach Lagerung bei –20°C vermessen. Dabei wurde eine Banden-

verschiebungen der positiven Differenzbande um 8 cm-1 zu kleineren Wellenzahlen auf 1727

cm-1 beobachtet. Weder bei kurzer noch bei langer Lagerung der IR-Proben konnte eine deutli-

che Verschiebung des Minimums bei 1745 cm-1 beobachtet werden. Der Isotopenaustausch nach

längerer Probenlagerung hatte jedoch eine Signalintensivierung bei 1727 cm-1 zur Folge, bei

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

110

gleichzeitigem nahezu vollständigem Signalrückgang der 1735 cm-1 Bande (Abb. 4.2.1, obere

Darstellungen). Das Doppeldifferenzspektrum wies dabei einen asymmetrischen Verlauf auf.

Die fehlende Verschiebung der 1745 cm-1 Bande wurde so interpretiert, dass eine unterschiedli-

che Wasserzugänglichkeit zum Glu-286 im oxidierten und reduzierten Zustand des Cyt bo3 vor-

liegt. Somit könnte dieser Aminosäure beim Redoxwechsel des Cyt bo3 eine Schalterfunktion

beim Protonentransport im D-Kanal in Form einer hydrophoben Barriere zukommen.

Abb. 4.2.1: PR-Differenzspektren vom pHCL-Wildtyp vor und nach Flüssigphasen- (oben, 4 cm-1 Auflösung) bzw. Gasphasen- (unten, 2 cm-1 Auflösung) H/D-Austausch und die daraus resultierenden H2O minus D2O Doppeldiffe-renzspektren (blau). Die Differenzspektren sind von 1780 cm-1 bis 1690 cm-1 dargestellt. Die oben gezeigten Flüs-sigphasen H/D-Austauschspektren sind nach Lübben et al., 1999 ([29]) modifiziert. Mit nahezu vollständig deuterierten IR-Proben (Abb. 3.3.2), die mit der Gasaustauschzelle

hergestellt wurden, konnte das Postulat der unterschiedliche Wasserzugänglichkeit am Glu-286

beim Redoxwechsel des Cyt bo3 nicht bestätigt werden. Das Glu-286 liegt nach dem Gasphasen

H/D-Austausch auch im oxidierten Zustand des Cyt bo3 in Wasserstoffbrücken- bzw. Deuteri-

umbrückenbindung vor, da die negative Bande bei 1745 cm-1 um 8 cm-1 nach 1737 cm-1 ver-

schiebt (Abb. 3.3.3; Abb. 4.2.1, untere Spektren). Das Doppeldifferenzspektrum zeigt hierbei

einen symmetrischen Verlauf, der somit keine unterschiedliche Wasserzugänglichkeit belegt.

Der Gasphasen H/D-Austausch stellt eine gegenüber dem Flüssigphasen H/D-Austausch dras-

tische Probenpräparationsmethode dar, da das Cyt bo3 im Unterdruck vollständig eingetrocknet

wird und erst anschließend die Wiederbefeuchtung mit D2O erfolgt. Ein 1H nach 2H Austausch

wird also förmlich „erzwungen“. Der asymmetrische Bandenverlauf des flüssigphasen PR-

Doppeldifferenzspektrums und die fehlende, wässrige reduzierte Bande bei 1735 cm-1 im D2O-

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

111

Differenzspektrum deuten bei der schonenderen Flüssigphasen H/D-Austauschmethode jedoch

eindeutig auf eine unterschiedliche Wasserzugänglichkeit des Glu-286 im oxidierten und im

reduzierten Zustand des Cyt bo3 hin. Unter nativen Bedingungen, d.h. die Wassermoleküle wer-

den nicht vollständig aus der Cyt bo3 Probe entfernt, lässt sich das Postulat der hydrophoben

Barriere des Glu-286 beim Protonentransport im D-Kanal folglich aufrecht erhalten.

4.2.2 Der konformative Wechsel der Seitenkette des Glutamat-286 von Cyt bo3 ist an die

Reduktion des Häm B gekoppelt

Es wird nun nachgewiesen, dass der konformative Wechsel des Glu-286 mit dem Redoxüber-

gang des low-spin Häms einhergeht und nicht an den Redoxübergang des high-spin Häms bzw.

des CuB gekoppelt ist.

Den Ubichinol Oxidasen, wie z.B. Cyt bo3 fehlt das CuA-Zentrum in Untereinheit II (1.2, 1.3).

Somit kann CuA nicht am konformativen Wechsel des Glu-286 beteiligt sein. Das PR-

Differenzspektrum der CuB defizienten Y288F- Mutante [104; 105] weist die ν(C=O)-Differenz-

bande des Glu-286 bei 1745/1735 cm-1 auf (Abb. 3.3.4). Somit ist ebenfalls CuB nicht am kon-

formativen Wechsel des Glu-286 beteiligt. Das high-spin Häm kann weiterhin als Ursache für

diesen Wechsel ausgeschlossen werden. Wenn Cyanid als externer Ligand für das binukleare

Zentrum zum Cyt bo3 zugesetzt wird, dann ist das high-spin Häm selektiv für einen Redoxüber-

gang blockiert. Dennoch findet sich das Carbonyl-Differenzsignal des Glu-286 im PR-

Differenzspektrum wieder (Daten nicht gezeigt) [29].

Den direkten Nachweis für die Beteiligung des low-spin Häms am konformativen Wechsel des

Glu-286 konnte durch den Einsatz von mixed-valence Cyt bo3-Proben erbracht werden [105].

Unter dem mixed-valence Zustand versteht man einen Redoxzustand bei Cytochrom Oxidasen,

bei dem das binukleare Zentrum reduziert und CO-gebunden, das low-spin Häm jedoch oxidiert

vorliegt. Dieser Zustand ist bei der Probenpräparation durch eine CO-Atmosphäre unter Sauer-

stoffausschluss zu erhalten. Der mixed-valence Redoxzustand liegt folglich zwischen der voll-

ständig oxidierten Form und vollständig reduzierten Form bei Cytochrom Oxidasen. Bei Zugabe

von caged electrons zu einer mixed-valence Probe kann nur noch das low-spin Häm des Cyt bo3

reduziert werden, da das binukleare Zentrum bereits reduziert vorliegt. Wird nun eine solche

Probe belichtet, dann erscheint im PR-Differenzspektrum die Carbonyl-Differenzbande des Glu-

286 in ihrer typischen Signalintensität und Position. Der Redoxübergang des low-spin Häms ist

folglich dierkt für den konformativen Wechsel des Glu-286 verantwortlich.

Die unter 3.3.3 erhaltenen Ergebnisse und die in diesem Unterpunkt gegebenen Interpretationen

werden in einem Modell zusammengefasst (Abb. 4.2.2). Hierbei kommt der konservierten Car-

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

112

bonylgruppe des Glu-286 eine wichtige Rolle beim Protonentransport innerhalb des Cyt bo3 zu.

Anzumerken ist jedoch, dass diese Aminosäure nur in Häm-Kupfer Oxidasen von mesophilen

Bakterien strikt konserviert ist. In einigen Häm-Kupfer Oxidasen von thermophilen Bakterien,

wie z.B. Sulfolobus acidocaldarius (CoxB) und Thermus thermophilus fehlt diese Aminosäure,

dennoch werden Protonen bei der Atmung über die Cytoplasmamembran transloziert [155; 156].

Dies ist qualitativ ebenfalls bei mesophilen ortsspezifischen Oxidasemutanten an dieser Positi-

on, wie z.B. E286Q zu beobachten. Jedoch geht der quantitative Protonentransport drastisch

zurück [157; 158]. In der Regel muss bei dem Protonentransfer eine Aktivierungsbarriere über-

wunden werden, die bei den thermophilen Bakterien aufgrund der hohen Temperatur ihrer Um-

gebung erreicht werden könnte. Bei niedrigeren Temperaturen könnte sich diese thermische

Überwindung der Aktivierungsbarriere als ineffektiv erweisen und würde einen zusätzlichen

„Beschleuniger“ erfordern. Beispielweise wäre eine protonierte Carboxylatgruppe, die einen

konformativen Wechsel beim Redoxübergang des Proteins durchläuft, dazu geeignet.

Abb. 4.2.2: Mögliches schematisches Model, das die Rolle des protonierten Glu-286 beim Protonentransport im D-Kanal des Cyt bo3 erklären könnte. Der Elektronentransfer zur Reduktion des low-spin Häm B leitet die Umorien-tierung der Carboxylatgruppe ein, wodurch die beiden dargestellten Halbkanäle des D-Kanals überbrückt werden. Die Abb. ist nach Lübben et al., 1999 [29] modifiziert. Wenn die Carboxylatgruppe des Glu-286 in den Protonentransport involviert ist, dann müssten

sich hieraus definierte redox-abhängige Umgebungsänderungen ergeben, wie sie hier beobachtet

wurden. Aus molekulardynamischen Berechnungen wurden für Glu-286 zwei strukturell unter-

schiedliche, energetisch jedoch äquivalente Konformationen postuliert [159; 160]. Somit könnte

die Elektronenaufnahme des low-spin Häms die Umorientierung der Seitenkette von Glu-286

steuern und die Energie zur Überwindung der Aktivierungbarriere liefern. Im Cyt bo3 könnte

dem Glu-286 damit eine Schalterfunktion zukommen, die den Protonentransfer beschleunigt.

Dieser Protonentransfer ist an die Elektronenaufnahme des low-spin Häm B gekoppelt.

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

113

4.3 Auto-photoreduktions-induzierte FT-IR Differenz-Spektroskopie an

Cyt bo3

In diesem Unterpunkt werden die Ergebnisse interpretiert, die unter 3.4 beschrieben sind. Da die

erhaltenen APR-Differenzspektren sehr komplex zusammengesetzt sind und sich dadurch für

die einzelnen Banden häufig mehrere Interpretationsmöglichkeiten ergeben, ist es schwierig eine

konkrete und einfache Modellvorstellung der beobachteten spektralen Änderungen zu entwi-

ckeln. Zusätzlich werden diese Modellvorstellungen dadurch erschwert, dass von Extinktions-

banden eines zweidimensionalen Spektrums auf die räumliche Veränderung der betrachteten

individuellen Atomgruppen innerhalb des Proteins zurückgeschlossen werden soll. Daher wer-

den die Ergebnisse im diesem Diskussionsteil in drei weitere Unterpunkte unterteilt: (I) Allge-

meine Hinweise zur auto-photoreduktions-induzierten FT-IR Redox-Differenzspektroskopie

(4.3.1). In diesem Unterpunkt wird zusätzlich auf Problematiken bei der Expression von 13C-

isotopenmarkierten Hämpropionaten des Cyt bo3 im E. coli Stamm S730 eingegangen. (II)

Spektrale Änderungen von ortsspezifischen Cyt bo3 Mutanten (4.3.2). Da sich mit der neu ein-

geführten APR-Differenzspektroskopie im Vergleich zur PR-Differenzspektroskopie umfang-

reichere Wellenzahlenbereiche erschließen, war es zunächst das vorrangige Ziel, eine umfassen-

de Spektrensammlung von den bereits in der Arbeitsgruppe vorhandenen Cyt bo3 Mutanten zu

erstellen. Die beobachteten spektralen Änderungen werden daher, wie z.B. bei der F391Q-

Mutante, relativ isoliert und kurz vorgestellt. (III) Carbonylschwingungen der Hämpropionsäu-

ren des Cyt bo3 (4.3.3).

4.3.1 Allgemeine Hinweise zur auto-photoreduktions-induzierten FT-IR Redox-Differenz-

spektroskopie

Die in diesem Unterpunkt vorgestellte APR-Differenzspektroskopie ist nicht in der Literatur

beschrieben und die erhaltenen APR-Differenzspektren können mit Literaturspektren, die bei

ihrer Erstellung auf caged compounds angewiesen sind (z.B. [29; 81; 130]), nur bedingt vergli-

chen werden (Abb. 3.4.1). Die Cyt bo3 Differenzspektren, die mit der elektrochemischen Zelle

erhalten wurden, zeigen jedoch im Bereich von 1800-1200 cm-1 häufig eine nahezu unveränder-

te Bandenposition zu den hier ermittelten APR-Differenzspektren (Abb. 3.4.3) [90].

Aus den in Abb. 3.4.1 verglichen lichtinduzierten PR- und APR-Differenzspektren-

Entwicklungen können drei Schlussfolgerungen getroffen werden: (I) Die APR-

Differenzspektroskopie ermöglicht es das Cyt bo3 in spektralen Bereichen auch unterhalb von

1630 cm-1 zu untersuchen. (II) Da beide verglichenen Differenzspektren-Entwicklungen auch

eine Vielzahl gemeinsamer Bandenpositionen aufzeigen, liegt ein ähnliches bzw. gleiches Re-

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

114

doxverhalten des Cyt bo3 vor. Die erhaltenen Differenzspektren können unmittelbar in den nicht

von den EDTA-Oxidationsprodukten überlagerten Wellenzahlenbereichen verglichen werden.

(III) Nach den in Abb. 3.4.4 dargestellten Absolutspektren des Cyt bo3 ist die Oxidase nach

Auto-Photoreduktion über einen pH-Bereich von 4,0-9,0 nahezu vollständig reduzierbar und der

Reduktionsprozess bleibt weder in einem Intermediat des Reaktionszyklus stehen (vergleiche

4.2.1), noch ist es dabei zu einer relevanten CO-Freisetzung und damit verbundenen Proteinde-

naturierungen gekommen.

Das primäre Ziel, sowohl Probenpräparations- als auch Messbedingungen zu finden, die re-

produzierbare, über große Wellenzahlenbereiche (2000-1100 cm-1) auswertbare APR-Differenz-

spektren ermöglichen, konnte erfüllt werden (Abb. 3.4.2). Hierbei sind zwischen den pHCL-

und pIN-Differenzspektren nur unwesentliche Unterschiede festzustellen, die es somit erlauben,

die Spektren von Cyt bo3 Mutanten, die auf pHCL basieren, auch mit dem pIN-Wildtyp Diffe-

renzspektrum und umgekehrt zu vergleichen (3.4.3).

Die vier Untereinheiten des Cyt bo3 bestehen aus rund 1250 Aminosäuren und entsprechend

hoch ist die Anzahl der Peptidbindungen. Diese Tatsache führt letztendlich zu IR-Spektren, die

nur eine qualitative Auswertung der Amid I-Region zulassen (s. Begleittext zu Abb. 3.4.2). Eine

quantitative Auswertung, wie z.B. für konformative Wechsel bei Sekundärstrukturmotiven, für

die die Amid I-Region indikativ sein kann, können auch zukünftig nicht getroffen werden. Da in

der PR-Differenzspektroskopie bislang im Wesentlichen nur der Spektralbereich oberhalb von

ca. 1690 cm-1 zur Auswertung zur Verfügung stand, mussten sich die zur APR-Differenz-

spektroskopie erarbeiteten Qualitätskriterien an diesen PR-Spektren orientieren. Da nunmehr die

Anwendbarkeit der APR-Spektroskopie für die Cyt bo3 Wildtypen und deren Mutantenproteine

belegt ist, können für weitere Untersuchungen ebenfalls Qualitätskriterien für die in dieser Ar-

beit ausgeschlossene Amid II-Region ausgearbeitet werden. Dabei sollte darauf geachtet wer-

den, dass der Bereich unterhalb der Amid-Regionen ebenfalls hohe Resttransmissionen aufweist

(Abb. 3.4.2), so dass eine erhöhte Proteinmenge unter Umständen wieder eingesetzt werden

kann. Dies könnte das Signal zu Rausch Verhältnis in diesem Bereich entscheidend verbessern,

wobei eine Auswertung der Carbonylregion dann wieder nur bedingt möglich ist.

Bei der Expression des pIN-Plasmids im E. coli Stamm S730 (Tab. 2.1.1) können bei Zusatz

von [1-13C]-ALV die C1-Atome der Hämpropionate des Cyt bo3 isotopenmarkiert werden. Dabei

zeigen die VIS-Spektren keine, die Durochinolaktivitäten des isotopenmarkierten pIN-Wildtyps

nur geringe Abweichungen im Vergleich zur unmarkierten Referenz (Abb. 3.4.7). Es konnten

bei gleichen Fermentationsbedingungen jedoch nur rund 10% Cyt bo3 im Vergleich zum pIN-

Wildtyp erhalten werden, der in BL21 ∆cyo recA- exprimiert wurde. Da bereits ein Dutzend

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

115

Milligramm des [1-13C]-ALV mehrere hundert Euro kosten, ist jeglicher Verlust von dem spezi-

fisch markiertem Cyt bo3 bedauernswert. E. coli S730 pIN weist nur rund 1/5 der Zellausbeute

und damit eine niedrigere Cyt bo3 Proteinausbeute pro Liter LB-Medium gegenüber BL21 ∆cyo

recA- pIN auf (3.4.3). Die Cyt bo3-Ausbeute wird zusätzlich durch die Plasmidinstabiltät dieses

Bakterienstamms erniedrigt und die vom genomischen cyo-Operon kodierte Oxidase muss bei

der Proteinreinigung ebenfalls verworfen werden (Abb. 3.4.7 und 4.1.1). Ursprünglich sollte mit

diesem E. coli Stamm auch eine 13C-Isotopenmarkierung der Cyt bo3 Tyrosine vorgenommen

werden, die dann beispielsweise mit der ebenso isotopenmarkierten Y288F-Mutante verglichen

werden sollten. Diese Mutante weist, wie bei anderen Cyt bo3-Mutanten ebenfalls zu beobachten

ist, eine geringere Proteinexpressionsrate gegenüber dem Wildtyp auf (Daten nicht gezeigt).

Dies würde wiederum zu einer noch geringeren Proteinausbeute bei gleichem Anzuchtvolumen

führen. Da zusätzlich reversible Teildenaturierungen aufgrund der Detergenzanreicherung wäh-

rend der Proteinreinigung des pIN-Wildtyps auftreten (Abb. 3.4.8), sollte dieser Bakterienstamm

nicht mehr weiter verwendet werden. Stattdessen sollte der bereits zur Cyt bo3 Expression be-

nutzte Stamm BL21 ∆cyo (recA-) weiter gentechnisch verändert werden, z.B. durch Pha-

gentransduktion (P1-Transduktion). Um das hemA30-Gen [37] bzw. die entsprechenden Gene

für die Aminosäurebiosynthesewege von z.B. Tyrosinen (tyrA2) [96] im Genom zu inaktivieren,

muss zwar ein relativ großer Aufwand betrieben werden, dieser wäre jedoch prinzipiell ebenfalls

zur Inaktivierung des recA-Gens im S730 Stamm notwendig gewesen (vergleiche 4.1.1). Der

Vorteil den E. coli Stamm BL21 ∆cyo recA- (mit entsprechenden Defekten in den Biosynthese-

wegen) auch weiterhin als Grundlage zur homologen Expression des Cyt bo3 und dessen Mutan-

ten zu verwenden, liegt darin, dass der anschließende Aufwand zur Charakterisierung des erhal-

tenen Proteins deutlich vermindert würde. Die bereits vorliegenden Daten zur Expression, Prote-

inreinigung, VIS- und FT-IR-spektroskopischen Charakterisierung des Cyt bo3 sowie dessen

Mutantenproteine, könnten prinzipiell mit der im neuen Expressionsstammkonstrukt exprimier-

ten Oxidase verglichen werden und eine erneute Datensammlung, wie sie z.B. bei anderen

E. coli Expressionsstämmen notwendig wäre, müsste nicht durchgeführt werden.

4.3.2 Spektrale Änderungen von ortsspezifischen Cyt bo3 Mutanten

Absorptionsänderungen der E286D-Mutante

Bei der Asp-286 Mutante ist in der Seitenkette die Carboxylfunktion erhalten, jedoch im Ver-

gleich zum wildtypischen Glu-286 um eine CH2-Gruppe verkürzt. Diese Mutante zeigt wildtypi-

sche Durochinol-Oxidaseaktivität (Tab. 3.2.6). Im APR-Differenzspektrum fehlt die dem Glu-

286 zugeordnete Differenzbande der Carbonyl-Streckschwingung bei 1745/1735 cm-1 und statt-

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

116

dessen findet sich ein invertiertes, in seinen Intensitäten stark erniedrigtes Carbonyl-

Streckschwingungssignal bei 1767/1762 cm-1 wieder (Abb. 3.4.12). Diese Differenzbande ver-

schiebt beim H/D-Austausch um 7 cm-1 zu kürzeren Wellenzahlen (1760/1755 cm-1) und kann

somit einer ν(C=O)-Schwingung zugeordnet werden. Dies bedeutet, dass das Mutantenprotein

im Prinzip den gleichen konformativen Wechsel an dieser Aminosäureposition wie der Wildtyp

durchläuft und sich ebenfalls in einer H-Brückenwechselwirkung mit der Umgebung befindet.

Hierbei finden sich jedoch bezüglich der H-Brückenbindung die umgekehrten Verhältnisse ge-

genüber dem Wildtyp, d.h. im oxidierten Zustand (negative Bande bei 1762 cm-1) befindet sich

die Carboxylgruppe in einer hydrophoberen Umgebung als im reduzierten Zustand (positive

Bande bei 1767 cm-1). Dieses Verhalten der Asp-Mutante konnte bereits bei den CO-Dissozia-

tionsspektren beobachtet werden [150]. In dem Strukturmodell des Cyt aa3-Wildtyps aus Rho-

dobacter sphaeroides ist ein Wassermolekül über eine H-Brücke mit Glu-278 (Glu-286 bei Cyt

bo3) verbunden [157]. In der energieminimierten berechneten Struktur der E278A/I104E Dop-

pelmutante des Cyt aa3 ist dieses Wassermolekül in den vormals von der Seitenkette des Glu-

278 besetzten Zwischenraum verschoben [157]. Eine solche Verschiebung eines Wassermole-

küls könnte ebenfalls bei der E286D-Mutante von Cyt bo3 vorliegen und die verkürzte Carbo-

xylgruppe der Asp-Mutante würde nicht direkt an der Protonenleitung beteiligt sein. Dies könnte

sowohl die erniedrigte Intensität als auch die invertierte Differenzbande erklären.

Im Wellenzahlenbereich unterhalb der Amid-Regionen fehlt in dem pH 8,0-APR-

Differenzspektrum der E286D-Mutante eine positive Bande bei 1198 cm-1 und es lassen sich

Veränderungen um 1367 cm-1 finden (Abb. 3.4.12). Diese sind im entsprechenden pD-Spektrum

nicht vorhanden. Demnach könnte es sich um δ(COH)-Beugeschwingungen (1367 cm-1) und

ν(C-O)-Streckschwingungen (1198 cm-1) des Glu-286 handeln. Da die Asp-Mutante nur indirekt

an der Protonenleitung beteiligt ist und sich dementsprechend die Signalintensitäten erniedrigen,

können die verschobene Signale vom E286D nicht wiedergefunden werden.

Absorptionsänderungen der F391Q-Mutante

Es wird nur auf die in ihren Signalintensitäten verstärkte negative Bande bei 1262 cm-1 einge-

gangen (Abb. 3.4.13), da keine plausible Erklärung für den Signalrückgang bei der Skalierungs-

bande um 1696/1691 cm-1 gefunden werden konnte.

Die pIN-Wildtypspektren zeigen in den unterschiedlichen pH-Differenzspektren eine negative

Extinktionsbande bei 1260 cm-1, die nur eine sehr geringe Verschiebung beim H/D-Austausch

zeigt (Abb. 3.4.5). Diese Bande ändert ihre Lage nur geringfügig im F391Q- und im ∆cyoE-

Differenzspektrum, ihre Intensitäten nehmen jedoch deutlich zu (Abb. 3.4.10 und Abb. 3.4.13).

In den isotopenmarkierten Wildtyp-Differenzspektren ist das Signal um 10 cm-1 zu kürzeren

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

117

Wellenzahlen verschoben (Abb. 3.4.8). Diese Verschiebung fällt weniger stark aus als bei einem 13C-Austausch zu erwarten ist und diese Bande liegt in einem für eine νs(COO-)-

Streckschwingung eher untypischen Bereich. Der isotopenmarkierte pIN-Wildtyp, exprimiert in

S730, zeigt eine unbefriedigende Spektrenqualität (Detergenzeinfluss) im Wellenzahlenbereich

innerhalb und unterhalb der Amid-Regionen. Im 13C-pIN-Wildtypspektrum weist die Amid II -

Region (1560-1520 cm-1) deutlich verschobene Bandenpositionen zum Referenzspektrum auf.

Das Extinktionssignal bei 1250 cm-1 liegt im Bereich der Amid III-Region (1330-1230 cm-1)

und es könnte sich somit um eine Amidbande handeln. Dies könnte ebenfalls die Signalintensi-

vierung der negativen Bande bei 1262 cm-1 sowohl im F391Q- als auch ∆cyoE-Differenz-

spektrum erklären, da beide Mutanten eine Veränderung am high-spin Häm an annährend glei-

cher Position in der Cyt bo3-Struktur aufweisen. Das Phe-391 liegt in unmittelbarer Nachbar-

schaft zum Hydroxyethylfarnesylrest und der Methylgruppe des B-Rings des high-spin Häms

(Abb. 1.2.4). Es ist von den hydrophoben Aminosäuren Ile-385, Trp-366, Phe-295 und Ile-283

und der aliphatischen Aminosäure Thr-359 umgeben. Ein Aminosäureaustausch vom Phe zum

hydrophilen Gln könnte in diesem Bereich eine starke Auswirkung auf die Cyt bo3-Struktur be-

sitzen, ähnlich wie die fehlende Hydroxyethylfarnesylgruppe der ∆cyoE-Mutante.

4.3.3 Carbonylschwingungen der Hämpropionsäuren des Cyt bo3

In Abb. 4.3.1 sind die wesentlichen Ergebnisse aus 3.4.2 und 3.4.3 für den Carbonylbereich der

Cyt bo3 APR-Differenzspektren nochmals in einer einzigen Darstellung zusammengefasst.

Abb. 4.3.1: APR-Differenzspektren im Carbonylbereich von 1780-1665 cm-1. Das pD 5,0-Spektrum ist lediglich bis 1670 cm-1 gezeigt. Grau unterlegte Flächen entsprechen Extinktionsdifferenzen zwischen dem pIN-Wildtypspektrum und dem ∆cyoE-Mutantenspektrum bzw. gelb unterlegte Flächen zwischen dem pIN- und dem isotopenmarkiertem pIN-Wildtypspektrum. Zusätzlich sind die Extinktionsnulllinien eingezeichnet.

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

118

Extinktionsänderungen im Wellenzahlenbereich von ca. 1730-1704 cm-1

Im Wellenzahlenbereich von ca. 1730-1704 cm-1 findet sich eine breite, positive Bande, die dem

low-spin Häm B zugeordnet wird (Abb. 3.4.9 und Abb. 3.4.11). Dieses schwach ausgeprägte, in

seinen Intensitäten leicht variable Carbonylsignal weist bei pH 8,0 ein Extinktionsmaximum um

1722 cm-1 auf und wird von den Signalen der Differenzbande des Glu-286 (1745/1735 cm-1) und

der Skalierungsbande bei 1696/1691 cm-1 flankiert (Abb. 3.4.6; Abb. 4.3.1, schwarzes Spekt-

rum). Ein vergleichbares FT-IR Differenzsignal konnte bei der P. denitrificans aa3 Oxidase

nicht gefunden werden [89; 132; 134]. Im gesamten Carbonylbereich der Cyt bo3 APR-

Differenzspektren ist kein entsprechendes negatives Signal einer ν(C=O)-Schwingung zu erken-

nen. Das Minimum bei 1678 cm-1 kommt als korrelierende Carbonylschwingung nicht in Be-

tracht, da insbesondere das Differenzspektrum der ∆cyoE Mutante statt einer negativen

Signalintensivierung an dieser Position eine stark positive, unterlagerte Bande zeigt. Es handelt

sich demnach um keine low-spin Hämpropionat-Bande5. Hieraus kann abgeleitet werden, dass

beim Redoxwechsel des Enzyms eines der beiden Hämpropionate des low-spin Häms zumindest

zum Teil protoniert wird und folglich im oxidierten Zustand des Cyt bo3 in der Carboxylat-Form

(COO-), im reduzierten Zustand in der Carboxyl-Form (COOH) vorliegen müsste. Das Extinkti-

onsmaximum verschiebt in Abhängigkeit vom pH-Wert zu größeren Wellenzahlen auf bis zu

1727 cm-1 bei pH 5,0 (Abb. 3.4.6; Abb. 4.3.1, grünes gestrichelte Spektrum). Diese beiden Ma-

xima verschieben nach dem H/D-Austausch bei entsprechenden pD-Werten um 8-9 cm-1 und

finden sich bei 1714 cm-1 (pD 8,0) bzw. 1718 cm-1 (pD 5,0) wieder. Das low-spin Häm-

Carbonylsignal könnte demnach bei höheren pH-Werten in eine hydrophobere Umgebung

wechseln oder in einer anderen Kopplung zu einer benachbarten funktionellen Gruppe vorlie-

gen. Eine pKs-Wert Änderung kommt ebenfalls in Betracht, wobei für eine höher gelegene Ban-

denposition ein höherer pKs-Wert indikativ ist [161].

Diese breite, positive Bande von ca. 1730-1704 cm-1 verschiebt in den isotopenmarkierten

pIN-Wildtypspektren zu kürzeren Wellenzahlen und das Maximum kommt bei ca. 1684 cm-1 bei

pH 8,0 bzw. vermutlich bei ca. 1676 cm-1 bei pD 8,0 (Abb. 3.4.9; Abb. 4.3.1 rote Spektren) zu

liegen. In den entsprechenden Differenzspektren der ∆cyoE-Mutante lassen sich deutliche Inten-

sitätszunahmen bei dem Hämcarbonylsignal feststellen, ohne dass sich die Position des Maxi-

mums hierbei ändert (Abb. 3.4.11; Abb. 4.3.1 blaue Linien). Dies wird als grundlegender Ge-

5 Die ∆cyoE-Mutante weist anstelle des Häm O ein Häm B in der high-spin Hämbindetasche auf (Abb. 3.1.6) [100]. Es liegt ein in seinen VIS-spektroskopischen und kinetischen Eigenschaften stark verändertes binukleares Zentrum vor (Abb. 3.2.1; Abb. 3.2.2; Tab. 3.2.5). Unter der Annahme, dass nur das falsch eingebaute high-spin Häm B in den VIS-Spektren zur beobachteten Minima- bzw. Maxima-Verschiebung beiträgt wird dies, als grundsätzliche Überlegung auf die IR-Spektroskopie übertragen. Ändert sich die Lage des Maximums bzw. des Minimums der betrachteten Bande nicht, so wird sie dem low-spin Häm zugeschrieben (eine Intensitätsveränderung darf eintreten). Bei Verschiebung wird sie dem high-spin Häm zugeordnet.

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

119

danke benutzt, dieses Signal dem low-spin Häm zuzuordnen. Dieses Hämpropionat liegt dem-

nach stärker protoniert vor. Die Hydroxyethylfarnesylgruppe des Häm O bzw. Häm A bei Cyt c

Oxidasen (Abb. 1.2.4) spielt vermutlich eine spezifische Rolle beim Protonentransport [62; 162-

165]. Falls durch den Fehleinbau eines Häm B in der high-spin Hämbindetasche im Cyt bo3 eine

Protonenleitung über das high-spin Häm verhindert wird, könnte sich dies ebenfalls auf das low-

spin Häm auswirken, dessen Propionate ebenso dem D-Kanal und somit der Protonenleitung

zugerechnet werden (Abb. 1.2.2) können. Eine Weiterführung dieser Gedanken wird wieder

unter 4.3.2.1 aufgenommen.

Extinktionsänderungen im Wellenzahlenbereich von ca. 1690-1670 cm-1

Im Wellenzahlenbereich von ca. 1690-1675 cm-1 findet sich eine Differenzbande, die ein vom

pH-Wert unabhängiges Extinktionsmaximum um 1685 cm-1 und ein Extinktionsminimum um

1678 cm-1 aufzeigt. Die Differenzbande wird von Differenzsignalen der Skalierungsbande bei

1696/1691 cm-1 und Banden der Amid I-Region (ca. 1680-1620 cm-1) flankiert (Abb. 3.4.6;

Abb. 4.3.1, schwarze Spektren). Bei dem Cyt aa3 aus P. denitrificans konnte ein negatives Car-

bonylsignal bei 1676 cm-1 dem A-Ring Hämpropionat zugeordnet werden [89; 134]. Eine posi-

tive Bande war in diesen Spektren nicht zu ermitteln, jedoch befindet sich dieses Signal eben-

falls im Einflussbereich der Amid I-Region und könnte demnach nicht aufgelöst werden. So

wird die negative Extinktionsdrift bei den pH- bzw. pD-5,0 Cyt bo3-Differenzspektren (Abb.

3.4.6; Abb. 4.3.1, grüne Spektren) vermutlich durch pH-abhängige Signaländerungen der Amid

I-Region ausgelöst. Da die Gesamtausprägung des Differenzsignals jedoch vergleichend zum

pH/pD 8,0 Spektrum im Wesentlichen erhalten bleibt, liegt sehr wahrscheinlich keine Protonie-

rungsänderung der Differenzbande vor. Das Extinktionsmaximum bei 1685 cm-1 verliert deut-

lich an Intensität beim H/D-Austausch und das Maximum bei 1675 cm-1 nimmt bei den pD-

Spektren in Korrelation dazu an Intensität gegenüber den pH-Spektren zu. Eine Verschiebung

bei Deuterierung findet demnach um 10 cm-1 statt. Die pD-Spektren zeigen jedoch nach wie vor

eine kleine, positive Bande mit einem Maximum bei 1685 cm-1.

Die Differenzbande bei 1685/1678 cm-1 verschiebt in den isotopenmarkierten pIN-

Wildtypspektren vermutlich in die Amid I-Region und ist dort nicht mehr wiederzufinden (Abb.

3.4.9; Abb. 4.3.1 rote Spektren). Demzufolge handelt es sich um Hämpropionsäure-Signale.

Jedoch ist die in den pD-Spektren deutlich erniedrigte, aber vorhandene Bande mit einem Max-

imum bei 1685 cm-1 nach H/D- und 12C/13C-Austausch ebenfalls nicht mehr zu finden. Es lässt

sich höchstens eine leichte Schulter um 1685 cm-1 erkennen (Abb. 3.4.11; Abb. 4.3.1 blaue

Spektren). Für das Zustandekommen dieses Signals sind mindestens drei Szenarien denkbar.

(I) Bei der Differenzbande bei 1685/1678 cm-1 handelt es sich um ein einziges Carbonylsignal,

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

120

das nicht komplett beim H/D-Austausch deuteriert wird. Es bleibt eine „protonierte Restbande“

erhalten, die erst im Zusammenspiel mit dem 12C/13C-Austausch nahezu vollständig verschiebt.

Gegen diese Annahme sprechen zwei Aspekte, zum einen findet unter den Bedingungen des

gasförmigen H/D-Austausches an der Carboxylgruppe des Glu-286 eine nahezu komplette Deu-

terierung statt (4.2.1), zum anderen zeigt das pH 8,0-Differenzspektrum der ∆cyoE Mutante

ebenfalls eine deutlich ausgeprägte Schulter bei 1685 cm-1 und es wäre demnach eine zweite

unabhängige Bande. (II) Die Carbonylsignale sind aus zwei unterschiedlichen Banden zusam-

mengesetzt, einer Differenzbande bei 1685/1678 cm-1 und einer positiven Bande mit einem Ma-

ximum bei 1685 cm-1. Die Carbonylgruppen, die die Differenzbande bei 1685/1678 cm-1 erzeu-

gen sind für den H/D-Austausch zugänglich, die Carbonylgruppe, die die zweite, unterlagerte

Bande erzeugt jedoch nicht. Es bleibt beim 1H nach 2H-Austausch also eine protonierte zweite

Bande im Spektrum erhalten, die erst nach 13C-Isotopenaustausch verschiebt. (III) Die Extinkti-

onssignale sind aus einem Carbonylsignal und einem stark verschobenen Carboxylatsignal zu-

sammengesetzt. In solchen „Extremfällen“ ist eine Bandenposition der νas(COO-) Schwingun-

gen von z.B. Asp und Glu Seitenkettenresten möglich, die eine ähnliche Lage wie die ν(C=O)

Schwingungen der COOH-Bande aufweisen [166]. Eine Verschiebung des Signals tritt erst bei 13C-Isotopenaustausch auf.

Der tatsächliche Ursprung dieses Extinktionssignals bleibt aus den ermittelten Daten jedoch

unklar und soll hier nicht weiter betrachtet werden.

In dem Differenzspektrum der ∆cyoE-Mutante bei pH 8,0 lässt sich eine deutliche Verschie-

bung des Maximums bei 1685 cm-1 erkennen. Es verschiebt nach 1680 cm-1. Diese positive

Bande kann somit einem der beiden Hämpropionate des high-spin Häm O zugeordnet werden.

Bei der negativen Bande, die im pIN-Wildtypspektrum bei 1678 cm-1 liegt, ist eine solche Zu-

ordnung nicht eindeutig, da sich das Signal in unmittelbarer Nähe und somit noch stärker im

Einflussbereich der Amid I-Region befindet. Eine Verschiebung des Signals, wie sie z.B. beim

H/D-Austausch zu erwarten ist, kann entsprechend nicht nachgewiesen werden. Da jedoch das

Maximum bei 1675 cm-1 deutlich an Intensität gewinnt, scheint die negative Bande bei 1678

cm-1 ebenso zu verschieben und es würde sich demnach um ein weiteres high-spin Hämpropion-

säure-Signal handeln. Beide Signale werden daher im weiteren dem high-spin Häm zugeordnet.

Aus den hier vorgestellten Ergebnissen und Interpretationen können mindestens zwei mögliche

Szenarien für die Protonierungszustände der high-spin Hämpropionate abgeleitet werden:

(I) Die Differenzbande bei 1685/1678 cm-1 geht auf ein und dieselbe Hämpropionsäure zurück,

die sowohl im oxidierten- als auch im reduzierten-Zustand des Cyt bo3 in der Carboxyl-Form

(COOH) vorliegt und ähnlich wie Glu-286 Seitenkette einen konformativen Wechsel während

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

121

des Redoxübergangs des Cyt bo3 erfährt. (II) Beide high-spin Hämpropionate sind am Diffe-

renzsignal beteiligt, wobei das eine im oxidierten Zustand protoniert ist, das andere nicht. Beim

Redoxübergang des Cyt bo3 gibt dann die eine Hämpropionsäure das Proton an die deprotonierte

Carboxylatgruppe des zweiten Hämpropionats ab. Es findet somit ein Protonentransfer statt.

In beiden Fällen könnte eine Differenzbande entstehen, wie sie in Abb. 4.3.1 zu sehen ist. Die

zweite Möglichkeit, dass ein Protonentransfer von einer Hämpropionsäure zu einem benachbar-

ten Hämpropionat erfolgt wird im weiteren bevorzugt, wie unter 4.3.3.2 dargelegt wird.

Es soll nun versucht werden, aus den ermittelten Daten eine Modellvorstellung zur Protonenlei-

tung an den Hämpropionaten während des Redoxübergangs des Cyt bo3 herzuleiten. Hierzu

werden einerseits die möglichen Carbonyl- und Carboxylatschwingungen des low-spin Häms

(4.3.3.1) und andererseits die des high-spin Häms (4.3.3.2) detaillierter betrachtet. In 4.3.3.3

wird dann das resultierende Modell vorgestellt.

Um sich die räumliche Anordnung der Häme innerhalb der Cytochrom Oxidasen besser vor-

stellen zu können, sind in Abb. 4.3.2 die Hämkofaktoren des oxidierten Cyt bo3 und des mito-

chondrialen, oxidierten Cyt aa3 aus Bos taurus aus verschiedenen Blickwinkeln dargestellt. Die

rötlich bzw. blau unterlegten Bereiche stellen Teilansichten des D- bzw. K-Kanals dar, in denen

neben den Hämpropionaten einige dazugehörende Aminosäuren aufzeigt sind. In der Abbildung

ausgesparte Aminosäuren der Protonenkanäle können durch Abb. 1.2.2 gedanklich ergänzt wer-

den. Die Cyt aa3-Struktur der bovinen Oxidase wurde aufgrund der höheren Auflösung von

2,3 Å gegenüber 2,7 Å bei der Cyt aa3-Struktur der P. denitrificans Oxidase bevorzugt. Diese

beiden Oxidasen unterscheiden sich in den dargestellten Aminosäuren lediglich darin, dass sich

anstelle des Tyr-54 (B. taurus) das Trp-87 (P. denitificans) befindet. Die Angaben in Klammern

beziehen sich im Folgenden auf die homologen Aminosäuren des Cyt aa3 aus P. denitrificans.

Im Unterschied zu den Cyt aa3 Oxidasen aus B. taurus und P. denitrificans befindet sich an-

stelle des Asp-369 (Asp-404) das Asn-412 bei Cyt bo3. Dieses befindet sich in unmittelbarer

Nähe zu den Sauerstoffatomen O2A und O1D der high-spin Hämpropionate des A- und

D-Rings. Es könnte somit sowohl eine negative Ladung von den Hämpropionaten als auch ein

übertragenes Proton stabilisieren. Dem Asp-369 (Asp-404) in den Cyt c Oxidasen wird die

Funktion als Mg-Ion-Ligand zugeschrieben (das Mg2+ ist in Abb. 4.3.2 nicht gezeigt) [24; 25].

In der Cyt bo3-Struktur ist ein solches Mg-Ion nicht gefunden worden [22] und das Asn-412

könnte demnach als Ligand für die Hämpropionate dienen.

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

122

Abb. 4.3.2: Räumliche Anordnung der Häme innerhalb der Cytochrom Oxidasen. Die Strukturdarstellungen sind nach den Röntgenkristalldiffraktions-Koordinatendatensätzen von Cyt bo3 (1FFT; 2,8 Å Auflösung) nach Abram-son et al., 2000 [22] und von Cyt aa3 (2OCC; 2,3 Å Auflösung) von Bos taurus nach Yoshikawa et al, 1998 [25] erstellt worden. Rötliche Flächen symbolisieren Teile des D-Kanals, blaue Flächen Teile des K-Kanals. Bei der Seitenansicht des low-spin Häms wurde auf die symbolisierte Darstellung der Protonenkanäle verzichtet. Die oben dargestellten Würfel, geben den ungefähren Blickwinkel auf die Darstellungen wieder. Zusätzlich sind die Ringbe-zeichnungen des Tetrapyrrolsystems und die Sauerstoffbezeichnungen der Hämpropionate eingezeichnet. „Außen“ = Periplasma; „Innen“ = Cytoplasma. Angaben in Klammern beziehen sich auf das Cyt aa3 aus Paracoccus denitri-ficans und sind nur in der Aufsicht angegeben. Das low-spin Hämpropionat des D-Rings (Abb. 4.3.3) und das high-spin Hämpropionat des

A-Rings (Abb. 4.3.4) werden unter anderem in der B. taurus Oxidase von Arg-438 und Arg-439

(Arg-473 und Arg-474) stabilisiert. Bei den Oxidasemutanten R473K und R474K von P. deni-

trificans konnte weder ein Verlust bei der Cyt c-Oxidaseaktivität noch ein Verlust bei der Proto-

nenpump-Leistung festgestellt werden [134]. Demgegenüber werden bei den Cyt bo3-Mutanten

R482-N, -L, -Q und R481-N, -L, -Q bis zu 65% weniger Chinol-Oxidaseaktivität gefunden und

die Mutanten R481-N und -L, sowie die Doppelmutante R481Q/R482Q zeigen darüber hinaus

deutliche Verluste bei der Protonenpump-Leistung [167]. Diese Befunde und die in dieser Dis-

sertation gezeigten zusätzlichen Carbonylschwingungen von den Hämpropionaten deuten darauf

hin, dass im Cyt bo3 von E. coli ein anderer Protonentransferweg vorhanden sein könnte, als er

in den Cyt c Oxidasen verwirklicht ist. Dies soll nun anhand der ermittelten FT-IR Daten ge-

zeigt werden.

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

123

4.3.3.1 Carbonyl- und Carboxylatschwingungen des low-spin Häms

In Abb. 4.3.3 ist das low-spin Häm des Cyt bo3 und des bovinen Cyt aa3 aus drei räumlichen

Perspektiven mit den Aminosäuren, die die Hämpropionate umgeben dargestellt.

Abb. 4.3.3: Räumliche Anordnung der low-spin Häme des Cyt bo3 und der bovinen Cyt c Oxidasen. Zur weiteren Erklärung s. Text von Abb. 4.3.2 . Die Aminosäure-Nummerierung ist, wenn nicht anders angegeben, auf das höher aufgelöste

bovine Cyt aa3 bezogen. Das D-Propionat des low-spin Häms ist für die dargestellten Cytoch-

rom Oxidasen durch Ladungswechselwirkungen mit dem Arg-438 (in Abb. 4.3.3 nicht gezeigt)

und dem Arg-439 stabilisiert [168]. Weiterhin finden sich Wasserstoffbrücken von der εNH-

Gruppe des Arg-439 und der NH-Gruppe der Peptidbindung von Trp-126 [15; 24] zum

D-Propionat. Durch die Verbindung zum Arg-438 könnte das D-Propionat ebenfalls an der

Protonenleitung beteiligt sein [167]. Ein Wassermolekül, dass in H-Brückenbindung mit dem

D-Propionat des low-spin Häms und den Nε- und NH2-Stickstoffen des Arg-438 steht ([24];

Abb.1), könnte somit ebenfalls eine Verbindung zum Protonentransportweg des high-spin Häms

herstellen, da Arg-438 einen Protonendonor für das high-spin Häm darstellt [167].

Das A-Propionat des low-spin Häms ist seinerseits ebenfalls vom Arg-439 durch vermutlich

die NH-Gruppe der Peptidbindung stabilisiert. Diese Aminosäure ist kein Bestandteil einer

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

124

α-Helix und entsprechend könnte sich eine H-Brücke zum Propionat ausbilden. Beim Cyt bo3 ist

anstelle des Leu-41 (Leu 57) das Gln-83 vorhanden. Hierdurch kommt die NH-Gruppe der Sei-

tenkette des Gln-83 in unmittelbare Nähe zu den low-spin Häm-Sauertsoffatomen des A-Pro-

pionats. Bei den Cyt c Oxidasen wird diese Rolle durch das Arg-38 (Arg-54) übernommen, das

bei Cyt bo3, wenn überhaupt, nur eine untergeordnete Funktion ausübt. In den Cyt c Oxidasen

ist das A-Propionat in der Aufsicht rechts und links von den aromatischen Aminosäuren Tyr-54

und Tyr-371 (Trp-87 und Tyr-406) umgeben, und es müsste eine relativ starre Anordung dieses

Propionats resultieren. Ein zusätzliches Proton könnte nur unzureichend stabilisiert werden.

Beim Cyt bo3 hingegen ist das Tyr-371 (Tyr-406) durch Leu-414 ersetzt, und es resultiert ein

Freiraum in der Elektronendichte. Das A-Propionat könnte demnach relativ variabel in seiner

räumlichen Anordnung sein, je nachdem ob es in der Carboxylat- oder Carboxylform vorliegt.

Die Hämpropionate sind beim Cyt bo3 gegenüber den aa3 Oxidasen versetzt (rote gepunktete

Linie in Abb. 4.3.3). Dies könnte ebenso einen Hinweis geben, dass im Cyt bo3 im Vergleich zu

den Cyt c Oxidasen ein andersartiger Protonentransferweg realisiert ist. Das A-Propionat des

Cyt bo3 könnte ein geeigneter Kandidat zur Erklärung der breiten, positiven Carbonylbande bei

1730-1704 cm-1 sein. Die negative Ladung des Carboxylats könnte im oxidierten Zustand durch

Gln-83, Tyr-99 und Arg-482 stabilisiert sein und die Seitenkette wäre „fixiert“. Nachdem die

Protonierung beim Redoxwechsel des Cyt bo3 stattgefunden hat, könnte sich die Carboxylgrup-

pe der Propionsäure in den Freiraum schieben und käme hierbei in der Nähe des unpolaren und

hydrophoben Leu-414 zu liegen. Diese hydrophobe Umgebung würde die relativ hohe Wellen-

zahlpostion für eine Häm-Carbonylstreckschwingung erklären. Durch den Freiraum in der

Elektronendichte wäre die räumliche Lage der Carboxylgruppe nicht starr „fixiert“ und entspre-

chend kann ein breitbandiges Signal entstehen. Das beobachtete Carbonylsignal in den Diffe-

renzspektren könnte ebenfalls in seinen Signalintensitäten leicht variieren, wie es von Spektrum

zu Spektrum immer wieder beobachtet werden kann.

Bestätigungen für eine mögliche Protonierungzustandsänderung am A-Propionat des low-spin

Häms finden sich im Wellenzahlenbereich um 1420-1300 cm-1, in dem typischerweise νs(COO-)

-Streckschwingungen von Hämpropionaten gefunden werden. Die pIN-Wildtypspektren zeigen

in den unterschiedlichen pH-Differenzspektren eine negative, relativ schmalbandige Extinkti-

onsbande um 1410 cm-1, die keine Verschiebung beim H/D-Austausch zeigt (Abb. 3.4.5), jedoch

bei sinkendem pH-Wert eine geringe Verschiebung des Minimums zu größeren Wellenzahlen

zeigt. Dies könnte einer „fixierten“ Carboxylatgruppe des low-spin Häms entsprechen. Diese

Bande ändert ihre Lage im ∆cyoE-Differenzspektrum nahezu nicht, ihre Intensität nimmt jedoch

in Korrelation zur verstärkten Protonierung der Cabonylbande bei 1722 cm-1 deutlich zu (Abb.

3.4.10). In den isotopenmarkierten Wildtyp-Differenzspektren ist ein Signal an dieser Position

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

125

vorhanden, dieses ist im Vergleich zum Wildtyp jedoch in seinen Intensitäten erniedrigt (Abb.

3.4.8). Eine eindeutige Zuordnung des verschobenen Signals ist bei dieser Spektrenqualität im

isotopenmarkierten Wildtyp nicht möglich. Bei der negativen Bande um 1410 cm-1 könnte es

sich um das zur 1730-1704 cm-1-Bande korrelierende Carboxylatsignal handeln.

Interessanterweise findet sich eine positive Extinktionsbande bei 1297 cm-1 im pH 8,0-

Wildtypspektrum, das in Abhängigkeit vom pH-Wert auf 1310 cm-1 verschiebt (Abb. 3.4.5). Es

zeigt eine nur geringfügige Verschiebung zu kürzeren Wellenzahlen bei den entsprechenden pD-

Spektren. Für den Wellenzahlenbereich von 1235-1270 cm-1 sind ν(C-O) und ν(C-C)-

Schwingungen der Hydroxylgruppe von Tyrosinen beschrieben, die ebenfalls Deformations-

schwingungen (δ(COH)) in diesem Bereich aufzeigen. Sie besitzen Extinktionskoeffizienten

von ca. 200 M-1 cm-1 [93]. Eine Verschiebung zu kürzeren Wellenzahlen der Streckschwingun-

gen in D2O ist von 3-11 cm-1 beschrieben und der Extinktionskoeffizient ändert sich nur gering-

fügig (150 M-1 cm-1). Bei dem ∆cyoE-Differenzspektrum findet sich eine negative Bande um

1206 cm-1, die im Vergleich zum Wildtypspektrum deutlich intensiver ausgeprägt ist.

Es könnte sich demnach um Schwingungen des Tyr-99 handeln, das mit dem A-Propionat des

low-spin Häms in Wechselwirkung steht. Im oxidierten Zustand des Cyt bo3 könnte eine

H-Brücke zwischen beiden bestehen, und die daraus resultierenden Schwingungen sind gekop-

pelt (1260 cm-1, νs(COO-) für das A-Propionat; 1206 cm-1, ν(C-O) und δ(COH) für Tyr-99).

Beim Redoxübergang könnte das A-Propionat protoniert werden und somit zur Auflösung der

H-Brückenbindung zum Tyr-99 führen. Das Propionat verlagert sich in den Freiraum zum Leu-

414 (1722 cm-1, ν(C=O)) und es entsteht entsprechend Platz für das Tyr-99, das sich ebenfalls

verlagern könnte. Dabei erfährt es eine Umgebungsänderung (1297 cm-1, ν(C-O) und δ(COH)).

Der pKs-Wert der A-Hämpropionsäure könnte sich in Abhängigkeit vom pH-Wert des Außen-

mediums ändern, wenn die Propionsäure eine Verbindung zum Periplasma in Form des

D-Kanals besitzt. Die pH-Wertänderung könnte ebenfalls das Tyr-99 beeinflussen und beide

positiven Signale könnten eine Verschiebung zu größeren Wellenzahlen bei sinkendem pH-Wert

zeigen. Diese Beschreibung ist spekulativ, kann jedoch durch eine Mutation an der Position des

Tyr-99 zur Verifikation bzw. Falsifikation überprüft werden.

4.3.3.2 Carbonyl- und Carboxylatschwingungen des high-spin Häms

In Abb. 4.3.4 ist das high-spin Häm des Cyt bo3 und des bovinen Cyt aa3 aus drei räumlichen

Perspektiven mit den Aminosäuren dargestellt, die die Hämpropionate umgeben.

Die Aminosäure-Nummerierung ist ebenfalls, wenn nicht anders angegeben, auf das höher

aufgelöste bovine Cyt aa3 bezogen.

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

126

Das A-Propionat des high-spin Häms weist H-Brücken zu His-368, Asp-364 und zu einem

Wassermolekül auf [25]. Im Cyt bo3, das kein Mg2+-Ion aufweist, befindet sich anstelle des

Mg2+-Liganden Asp-369 (Asp-404) das Asn-412 (s. Begleittext zur Abb. 4.3.2).

Abb. 4.3.4: Räumliche Anordnung der high-spin Häme des Cyt bo3 und der bovinen Cyt c Oxidase. Zur weiteren Erklärung s. Text von Abb. 4.3.2 . Das D-Propionat des sauerstoffbindenden high-spin Häms ist durch Ladungswechsel-

wirkungen mit Arg-438 und Arg-439 (in Abb. 4.3.4 nicht gezeigt) stabilisiert und weist

H-Brücken zu Arg-438 und Trp-126 auf [15]; [23]. Weiterhin könnte eine H-Brücke zu einem

H2O-Molekül bestehen, das sich zwischen dem D-Propionat und dem CuB-Liganden His-291

befindet ([24], Abb.1). Dies trifft jedoch auch für das A-Propionat im Cyt bo3 zu (Abb. 4.3.4).

Das A-Propionat des low-spin Häms und das D-Propionat des high-spin Häms besitzen also drei

gemeinsame Liganden (Arg-438, Arg-439, Trp-126) und könnten demnach beide in den Proto-

nentransfer involviert sein.

Aus den in Behr et al., 1998 [89] und in Behr et al., 2000 [134] durchgeführten FT-IR-

spektroskopischen Untersuchungen am Cyt aa3 aus P. denitrificans ergab sich, dass das A-Pro-

pionat des high-spin Häms im oxidierten Zustand der Oxidase protoniert ist. Aus den Muta-

tionsanalysen von Arg-481 und Arg-482 am Cyt bo3 konnte bei Puustinen & Wikström, 1999

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

127

[167] ermittelt werden, dass das Arg-481 an der Protonentransferreaktion der Ubichinol-Oxidase

beteiligt ist. Bei den Untersuchungen von Behr et al., 2000 konnte eine solche Beteiligung des

Arg-473 bisher nicht nachgewiesen werden. Bei den hier durchgeführten FT-IR-Messungen

konnte ebenso eine negative Carbonylschwingung des high-spin Häms bei 1678 cm-1 nachge-

wiesen werden. Sie wird in Anlehnung an Behr et al., 2000 dem A-Propionat zugeordnet. Im

Unterschied zu dieser Veröffentlichung wird jedoch auch ein positives Carbonylsignal des high-

spin Häms bei 1685 cm-1 gefunden. In Anlehnung an Puustinen & Wikström, 1999 wird sie dem

D-Propionat des high-spin Häms zugeordnet. Es findet vermutlich ein Protonentransport vom

A-Propionat zum D-Propionat beim Redoxübergang des Cyt bo3 statt. Für die Beteiligung von

zwei unterschiedlichen Carboxylatgruppen an dem Protonentransfer sprechen Carboxy-

latschwingungen, die im ∆cyoE-Differenzspektrum gefunden werden (Abb. 3.4.10). Es tritt eine

im Wildtypspektrum nicht vorhandene Differenzbande mit einem Minimum bei 1325 cm-1 und

einem Maximum bei 1317 cm-1 auf. Diese Differenzbande liegt in einem Bereich, in dem

νs(COO-)-Schwingungen von Hämpropionaten typischerweise absorbieren können (1420-1300

cm-1) [89]. Sie ist in dem D2O-Spektrum schwächer ausgeprägt aber dennoch vorhanden. Die

Differenzbande bei 1325/1317 cm-1 ist gegenüber der Carbonyl-Differenzbande im Wildtyp-

spektrum bei 1685/1678 cm-1 invertiert. Dies entspricht genau der Erwartung, wenn die proto-

nierte A-Propionsäure im oxidierten Zustand des Cyt bo3 (1678 cm-1, ν(C=O) im Wildtypspekt-

rum) beim Redoxübergang deprotoniert wird. Es müsste sich entsprechend eine positive Bande

im Carboxylatbereich finden lassen (1317 cm-1, νs(COO-) im ∆cyoE-Differenzspektrum). Im

Falle des D-Propionats müssten genau die umgekehrten Verhältnisse vorliegen. Das im oxidier-

ten Zustand der Oxidase als Caboxylat vorliegende Propionat (1325 cm-1, νs(COO-) im ∆cyoE-

Differenzspektrum) liegt im reduzierten Zustand protoniert vor (1685 cm-1, ν(C=O) im Wildtyp-

spektrum). Dies wird als Hinweis betrachtet, dass beide Hämpropionate an dem Differenzsignal

bei 1685/1678 cm-1 beteiligt sind (4.3.3).

Bevor das Modell der Protonenleitung an den Hämpropionaten vorgestellt wird, soll hier noch

ein sehr wichtiger Aspekt eingebracht werden. Bei den bereits unter 4.2.2 erwähnten mixed-

valence PR-Differenzspektren, mit denen der direkte Nachweis der Kopplung zwischen dem

konformativen Wechsel des Glu-286 und der Reduktion des low-spin Häms gelang, findet sich

sowohl die breite, positive Bande bei 1730-1704 cm-1 als auch die Carbonyl-Differenzbande bei

1685/1678 cm-1 wieder. Dies wiederum bedeutet, dass ebenfalls der Protonentransfer an den

Hämpropionaten mit der Reduktion des low-spin Häms einhergeht. Diese Reduktion scheint

somit die initiale Reaktion für vielfältige Veränderungen innerhalb des Cyt bo3 zu sein.

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

128

4.3.3.3 Modell der Protonenleitung an den Hämpropionaten

Aus den hier durchgeführten Untersuchungen wird ein hypothetisches Modell zur vektoriellen

Protonenleitung an den Hämpropionaten im D-Kanal hergeleitet (Abb. 4.3.5). Vom Cyt bo3 liegt

lediglich die Struktur der vollständig oxidierten Oxidase vor. Sie dient sowohl für die rechte als

auch für die linke Darstellung als Grundlage zur Graphikerstellung. Inwieweit und ob sich die

Positionen der dargestellten Moleküle beim Redoxwechsel des low-spin Häm B ändern, kann

der Abbildung nicht entnommen werden. Der gezeigte konformative Wechsel des Glu-286 ist

zwischen der oxidierten und reduzierten Kristallstruktur im bovinen Cyt aa3 nicht erkennbar

[25]. Die veränderte Lage der Carboxylgruppe an dieser Aminosäure wurde in Abb. 3.4.5 von

Hand eingefügt und entspricht somit nicht dem originalen Koordinatendatensatz.

Im oxidierten Zustand des Cyt bo3 liegt das high-spin Häm A-Propionat protoniert vor und

könnte in dieser Form von Asp-407 über eine H-Brückenbindung stabilisiert sein. Die restlichen

Hämpropionate befinden sich in der Carboxylat-Form (Abb. 4.3.5 links).

Abb. 4.3.5: Hypothetisches Modell zum vektoriellen Protonentransfer im Cyt bo3. Die grünen Pfeile geben mögli-che Protonentransferwege zum Periplasma wieder. Der Transport dieser Protonen findet erst nach der erneuten Oxidation des Cyt bo3 statt. Zur weiteren Erklärung s. Text. Bei der Reduktion des low-spin Häms (Fe3+ nach Fe2+) findet ein Protonentransferschritt vom A-

Propionat auf das D-Propionat des high-spin Häms statt (Abb. 4.3.5 rechts). Die in den Cyt c

Oxidasen nicht vorhandene Aminosäure Asn-412 könnte im Zusammenspiel mit His-411 (ver-

gleiche Abb. 4.3.4) an diesem Schritt beteiligt sein und die negative Ladung des Carboxylats am

nunmehr deprotonierten A-Propionat stabilisieren.

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

129

Das A-Propionat des low-spin Häms wird ebenfalls zum Teil bei der Reduktion von Häm B

protoniert6. Demzufolge liegen im Cyt bo3 zwei alternative Protonentransferwege zum Pe-

riplasma vor (grüne Pfeile). Der eine führt vom D-Propionat des high-spin Häms, der andere

vom A-Propionat des low-spin Häms weg. Die Protonenabgabe an das Periplasma findet erst

nach der Reoxidation des Cyt bo3 statt, d.h. es müssen zusätzlich Protonentransferwege zum

A-Propionat des high-spin Häms und zum A-Propionat des low-spin Häms bestehen, um die

abgegebenen Protonen wieder „aufzufüllen“.

Der konformative Wechsel des Glu-286 in eine hydrophilere Umgebung ist ebenfalls an die

Reduktion des low-spin Häm B gekoppelt (4.2). Nach dem Redoxübergang steht es vermutlich

mit einem Protonennetzwerk in Verbindung (angedeutet durch die rote gestrichelte Linie in

Abb. 4.3.5). Man nimmt an, dass die Protonen über dieses Netzwerk [27] von protonierbaren

Aminosäureresten und/oder fest gebundenen Wassermolekülen transportiert werden [28; 29]. Da

sich in unmittelbarer Nähe zum Glu-286 keine protonierbare Aminosäure befindet, ist in der

Abb. 4.3.5 stellvertretend für das Protonennetzwerk ein Wassermolekül gezeigt.

Über His-334 könnte ein möglicher Protonentransfer zum A-Propionat des high-spin Häms

bestehen (4.3.3.2) [167], der im Modell durch den rechten gestrichelten Pfeil angedeutet ist. Da

das Propionat jedoch erst wieder bei der Reoxidation des Cyt bo3 protoniert werden muss, hat

die Oxidase den Reaktionszyklus bereits vollständig durchlaufen. Dabei sind aus der Reduktion

des molekularen Sauerstoffs zwei Wassermoleküle am binuklearen Zentrum und damit in unmit-

telbarer Nachbarschaft zum A-Propionat entstanden. Eines der beiden neu synthetisierten Was-

sermoleküle könnte demnach unmittelbar als Protonendonor für das A-Propionat dienen. Das

entstandene Hydoxid-Ion könnte durch ein Proton aus dem K-Kanal (in Abb. 4.3.5 nicht ge-

zeigt) wieder neutralisiert werden. Dies würde dem K-Kanal eine größere Gewichtung beim

Protonentransport geben und eine sehr effiziente Reprotonierungsreaktion am A-Propionat dar-

stellen.

Für die Protonenleitung zum low-spin Häm könnten sich zwei Möglichkeiten ergeben: (I) Das

D-Propionat des high-spin Häms steht möglicherweise über Arg-481 mit dem D-Propionat des

low-spin Häms in Verbindung (4.3.3.2). Somit könnten zum Teil Protonen vom high-spin Häm

an das A-Propionat des low-spin Häms geleitet werden (waagrechter gestrichelter Pfeil in Abb.

4.3.5). Dieser Möglichkeit widersprechen jedoch die Ergebnisse aus dem ∆cyoE-

Mutantenspektrum. Da bei dieser Mutante das A-Propionat stärker, möglicherweise nahezu

vollständig im Vergleich zum Wildtyp protoniert ist, müsste das zugeordnete positive Extink-

6 Das A-Propionat des low-spin Häms wird vermutlich im Wildtyp nur zum Teil protoniert, da im APR-Differenzspektrum der ∆cyoE-Mutante eine deutliche Intensivierung der positiven Bande bei 1730-1704 cm-1 statt-findet. Die Carboxylatgruppen dieses Propionats liegen entsprechend stärker protoniert vor.

Diskussion ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

130

tionssignal (1680 cm-1) des D-Propionats vom high-spin Häm deutlich an Intensität verlieren

bzw. fehlen (Abb. 4.3.1). Dies ist nicht der Fall. Daher ist eine Protonenleitung über das Was-

serstoffbrücken-Netzwerk des D-Kanals wahrscheinlicher. (II) Durch den konformativen Wech-

sel des Glu-286 ausgelöst, könnten Protonen über Arg-481 an das D-Propionat und somit zum

A-Propionat des Häm B gelangen (breiter gestrichelter Pfeil in Abb. 4.3.5). Dieser Transferweg

ist jedoch nach den hier vorliegenden Ergebnissen nicht nur in Richtung des low-spin Häms

möglich, da das A-Propionat im Wildtyp nicht vollständig protoniert wird. Stattdessen könnte

ebenfalls eine Protonenleitung vom Arg-481 oder dem D-Propionat in Richtung Periplasma er-

folgen (In Abb. 4.3.5 nicht dargestellt).

Dieses hier vorgestellte hypothetische Modell des Protonentransfers im Cyt bo3 müsste in zu-

künftigen Untersuchungen verifiziert werden, es könnte jedoch einige bisher ermittelten Ergeb-

nisse erklären:

? Ein Aminosäureaustausch an hochkonservierten Aminosäuren des D-Kanals, wie z.B.

E286A/I112E [157] und R481N bzw. R481L [167] führt zu einem Cyt bo3, das einen um rund

die Hälfte verminderten Protonentransport zeigt. Bei der Cyt c Oxidase aus R. sphaeroides

konnte ebenfalls nachgewiesen werden, dass Mutationen an Glu-278 (Glu-286 in Cyt bo3) zu

einem Rückgang, aber nicht zum Erliegen des Protonentransports innerhalb der Oxidase führen

[158].

Wenn eine Protonenleitung zum A-Propionat des Häm O über die neusynthetisierten Wassermo-

leküle und damit letztlich über den K-Kanal erfolgt, ist die Protonenleitung im D-Kanal hierfür

nicht erforderlich. Bei protonenpump-inaktiven Mutanten des D-Kanals würden Oxidasen resul-

tieren, die zwar keine Protonen über den zum Cytoplasma hin orientierten Teil des D-Kanal

transportieren, aber dennoch eine Protonenpumpleistung über den K-Kanal erbringen können.

? Eine Protonentranslokation über die Cytoplasmamembran durch den D-Kanal ist sowohl in

den Cyt c- als auch Ubichinol Oxidasen realisiert. Im Cyt bo3 erfolgt die Protonenleitung auch

über das low-spin Häm, dass in den Cyt c Oxidasen nicht involviert scheint. Hierbei spielen die

in den aa3 Oxidasen an diesen Positionen nicht vorhandenen Aminosäuren Gln-83 und Leu-414

eine entscheidende Rolle bei der Protonenstabilisierung (4.3.3.1).

131

5. Zusammenfassung Cytochrom Oxidasen sind nach Schätzungen für rund 90% der molekularen Sauerstoffre-

duktion innerhalb der Biosphäre und für fast die Hälfte der in der zellulären Atmung umge-

setzten Redoxenergie verantwortlich. Sie stellen die terminalen Enzyme der aeroben Atmungs-

kette von Pro- und Eukaryonten dar und katalysieren die Reduktion von molekularem Sauerstoff

zu Wasser. Diese Reaktion ist an eine Translokation von Protonen über die Cytoplasma- bzw.

die innere Mitochondienmembran gekoppelt. Der so erzeugte elektrochemische Protonengra-

dient kann zur Energiegewinnung der Zelle genutzt werden.

Thema dieser Dissertation ist die Ubichinol-8 Oxidase Cytochrom bo3 von Escherichia coli.

Dieses Enzym gehört zur Superfamilie der Häm-Kupfer Oxidasen und besteht aus vier Unter-

einheiten, die ein Molekulargewicht von rund 142 kDa besitzen. Über das low-spin Häm B wer-

den die Elektronen vom Ubichinol-8 an das aus dem high-spin Häm O und CuB bestehende bi-

nukleare Zentrum, den Ort der Sauerstoffaktivierung und Sauerstoffreduktion, transferiert. Die

dabei translozierten Protonen werden über zwei Kanäle zum binuklearen Zentrum bzw. in den

periplasmatischen Raum geleitet. Die Kopplung des Elektonentransfers und die damit einherge-

henden Redoxübergänge der Kofaktoren an den Protonentransport im Cyt bo3 bzw. allgemein in

den Häm-Kupfer Oxidasen ist eine zentrale Frage dieses Forschungsgebiets. Ziel dieser Arbeit

ist es einige, an dieser Kopplung beteiligten atomaren Gruppen zu untersuchen.

Bei der homologen Überexpression des Cyt bo3 in E. coli durch einem Expressionsvektor, der

das cyo-Operon beinhaltet, kommt es bezüglich der Hämkofaktoren zu einer heterogen zusam-

mengesetzten Oxidase-Molekülpopulation, die aus physiologisch aktivem Cyt bo3 und inaktive-

rem Cyt oo3 besteht. Wird jedoch eine Oligohistidinmodifikation am C-Terminus von Unterein-

heit II angefügt, so wird eine homogene Cyt bo3-Molekülpopulation erhalten. Die letzten sechs

C-terminalen Aminosäuren dieser Untereinheit können jedoch in Abhängigkeit von den Fermen-

tationsbedingungen in vivo und während des Zellaufbruchs durch Ultraschall in vitro abgespal-

ten werden. Die Oligohistidinmodifikation geht somit ebenfalls verloren.

Im Rahmen dieser Arbeit wird eine neue Cyt bo3 Wildtypvariante kloniert, homolog in E. coli

überexprimiert und gereinigt. Die DNA-Sequenz, die für eine Hexahistidin-Modifikation ko-

diert, wurde bei gleichzeitiger Deletion der drei zur Spaltungsstelle benachbarten Aminosäuren

Met, Asp und Met im cyoA-Gen des pIN-Expressionsvektors inseriert. Das nach Expression in

E. coli erhaltene Cyt bo3 wird als pIN-Wildtyp bezeichnet und weist eine Oligohistidinmodifika-

tion am C-Terminus von Untereinheit II auf. Das Enzym zeigt erstmalig weder den von den

Zusammenfassung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

132

Fermentationsbedingungen abhängigen, noch den beim Zellaufbruch durch Ultraschall ausgelös-

ten Verlust des C-Terminus von Untereinheit II. Somit ist es mit einer Metallaffinitätschroma-

tographie möglich, eine hochreine Oxidase durch ein einfaches „Ein-Schritt-Proteinreinigungs-

verfahren“ zu erhalten und das vom Genom kodierte unmodifizierte Cyt bo3 vom His-tag-

Protein zu trennen. Folglich können ebenfalls E. coli Stämme zur plasmidkodierten Expression

des Cyt bo3 verwendet werden, die keine Inaktivierung des genomischen cyo-Operons beinhal-

ten, wie sie z.B. für die 13C-Isotopenmarkierungen der Hämpropionate zur Verfügung stehen.

Das pIN-Plasmid kann ebenfalls zur ortsspezifischen Mutantenerstellung und deren Überexpres-

sion in E. coli genutzt werden. Die erhaltenen Cyt bo3 Mutantenproteine weisen ebenfalls den

His-tag auf. Die Cyt bo3-Molekülpopulationen sind bezüglich der Hämkofaktoren homogen

zusammengesetzt. Der pIN-Wildtyp weist bei den Positionen der Extinktionsminima und

-maxima bei der VIS- und IR-spektroskopischen Charakterisierung wildtypisches Verhalten auf.

Somit können die gereinigten Oxidasen und deren Mutanten auch mit den bisher vom sogenann-

ten pHCL-Expressionsvektor erhaltenen Wildtyp- und Mutantenproteinen verglichen werden.

Der pIN-Wildtyp zeigt jedoch aus unbekannten Gründen eine um rund 1/3 erniedrigte Durochi-

nol-Oxidaseaktivität im Vergleich zum pHCL-Wildtyp.

Mit der hier konstruierten Gasaustauschzelle können IR-Proben unter definierten Bedingungen

zwischen zwei Calcium-Fluoridfenstern präpariert werden. Diese Zelle ermöglicht es, u.a. Cyt

bo3 Proben zu erstellen, bei denen ein bislang nicht möglicher, nahezu kompletter Lösungsmit-

telaustausch von H2O zu D2O erreicht wird.

Mit diesen deuterierten Cyt bo3 Proben kann an den photoreduktions-induzierten Cyt bo3 Fou-

rier-Transform-Infrarot-Redox- (= PR-) Differenzspektren nachgewiesen werden, dass sich die

Carboxylgruppe der Seitenkette des am Protonentransports beteiligten Glu-286 sowohl im oxi-

dierten, als auch im reduzierten Zustand der Oxidase in Wasserstoffbrückenbindung befindet.

Beim Redoxübergang des Enzyms erfährt diese Seitenkette einen konformativen Wechsel, ohne

ihren Protonierungszustand dabei zu ändern. Im Vergleich zu den bereits vor dieser Arbeit er-

mittelten PR-Differenzspektren, die an Cyt bo3-Proben durch den Flüssigphasen H/D-Austausch

hergestellt wurden, kann das Postulat der hydrophoben Barriere des Glu-286 aufrecht erhalten

werden. Es kann nachgewiesen werden, dass der konformative Wechsel der Seitenkette des Glu-

286 mit der Reduktion des low-spin Häm B einhergeht.

Mit dem Einsatz der auto-photoreduktions-induzierten Cyt bo3 Fourier-Transform-Infrarot-

Redox- (= APR-) Differenzspektroskopie, die keine caged-Verbindung zum Initiieren der Prote-

inreaktion benötigt, können Cyt bo3 Wildtyp- und Mutanten-APR-Differenzspektren mit IR-

Zusammenfassung ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

133

Proben zwischen Calciumfluorid-Fenstern auch erstmalig unterhalb der Amid-Regionen ausge-

wertet werden. Die hierzu erarbeiteten Qualitätskriterien der IR-Proben ermöglichen es, repro-

duzierbare APR-Differenzspektren über einen großen Wellenzahlenbereich zu erhalten. Hierbei

können jedoch die Amid I- und Amid II-Regionen nicht ausgewertet werden. Da nunmehr die

Anwendbarkeit der APR-Differenzspektroskopie für die Cyt bo3 Wildtypen und deren Mutan-

tenproteine belegt ist, können für zukünftige Untersuchungen ebenfalls Qualitätskriterien für die

Amid II Region ausgearbeitet werden. Die vier Untereinheiten des Cyt bo3 bestehen aus rund

1250 Aminosäuren und entsprechend hoch ist die Anzahl der Peptidbindungen. Diese Tatsache

führt letztendlich zu IR-Spektren, die nur eine qualitative Auswertung der Amid I Region zulas-

sen. Quantitative Auswertungen, wie sie z.B. für konformative Wechsel bei Sekundärstruktur-

motiven notwendig wären, sind auch zukünftig nicht möglich.

Durch den vorhandenen His-tag am pIN-Wildtyp kann ein an den Hämpropionaten spezifisch

[1-13C]-isotopenmarkiertes Cyt bo3 gereinigt werden. In den davon angefertigten APR-

Differenzspektren lassen sich Carbonylschwingungen von Hämpropionaten nachweisen. Im

Vergleich zu den APR-Differenzspektren der ∆cyoE-Mutante können diese Schwingungen dem

low-spin bzw. high-spin Häm zugeordnet werden. Die ermittelten Protonierungsänderungen an

den Hämpropionaten gehen, wie der konformative Wechsel der Glu-286 Seitenkette, mit der

Reduktion des low-spin Häm B einher. Die Carboxylatgruppen eines der beiden Propionate des

Häm B, vermutlich die vom A-Propionat, liegen im oxidierten Zustand deprotoniert vor und

werden bei der Reduktion des Cyt bo3 zum Teil protoniert. Die entsprechenden Atomgruppen-

schwingungen können im IR-Spektrum im Bereich von 1730-1704 cm-1 und vermutlich um

1410 cm-1 gefunden werden. Die high-spin Hämpropionate sind ebenfalls am Protonentransport

innerhalb des Cyt bo3 beteiligt. Es kann eine Differenzbande bei 1690-1675 cm-1 für die Carbo-

nylschwingungen gefunden werden. Vermutlich liegt das A-Propionat des high-spin Häms im

oxidierten Zustand des Cyt bo3 protoniert vor und transferiert ein Proton auf das D-Propionat bei

der Reduktion des low-spin Häm B. Eine wahrscheinlich dazu korrelierende Differenzbande im

∆cyoE-Mutantenspektrum kann im Bereich der symmetrischen Carboxylatschwingungen bei

1325/1317 cm-1 diesem Protonentransferschritt zugeordnet werden.

Im Rahmen dieser Dissertation konnte nachgewiesen werden, dass die Hämpropionate beider im

Cyt bo3 vorhandenen Häme am Protonentransport beteiligt sind und somit zur Erzeugung eines

elektrochemischen Protonengradienten über der Cytoplasmamembran beitragen. Dabei gehen

die Protonierungszustandsänderungen der Häme, wie der konformative Wechsel des Glu-286

mit der Reduktion des low-spin Häm B einher. Diese Prozesse könnten demnach aneinander

gekoppelt sein.

134

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Lebenslauf

Persönliche Daten Name: Alexander Walter Prutsch Geburtstag: 03.11.1969 Geburtsort: Mannheim Staatsangehörigkeit: österreich Familienstand: ledig Schulbildung 1976 bis 1980 Grundschule Johann Peter Hebel, Mannheim 1980 bis 1989 Lessing Gymnasium, Mannheim Mai 1989 Allgemeine Hochschulreife Studium Okt.1989 bis Sept.1991 Studium der Architektur an der Universität Kaiserslautern. Okt.1991 bis Juli 1998 Studium der Biologie an der Ruhr-Universität-Bochum. März 1994 Diplom Vorprüfung. Juli 1997 Mündliche Diplom Hauptprüfung. Aug.1997 bis Juli 1998 Diplomarbeit bei PD Dr. Mathias Lübben im Lehrstuhl für Bio-

physik/Projektgruppe Cytochrom Oxidasen an der Ruhr-Univer-sität Bochum. Thema: „Biochemische und biophysikalische Untersuchungen an ortsspezifischen Mutanten der Ubichinol Cytochrom bo3 Oxidase von Escherichia coli“.

Seit Jan. 1999 Promotion bei PD Dr. Mathias Lübben im Lehrstuhl für Bio-physik/Projektgruppe Cytochrom Oxidasen an der Ruhr-Univer-sität Bochum.

Dortmund im April, 2002 Veröffentlichungen: Lübben, M., Prutsch, A., Mamat, B. and Gerwert, K. (1999). Electron transfer induces side-

chain conformational changes of glutamate-286 from cytochrome bo3. Biochemistry. 38: 2048-2056

Prutsch, A., Lohaus, C., Green, B., Meyer, H.E. and Lübben, M. (2000). Multiple posttransla-

tional modifications at distinct sites contribute heterogeneity of the lipoprotein cytochrome bo3. Biochemistry. 39: 6554-6563

Prutsch, A., Vogtt, K., Ludovici, C. and Lübben, M. (2002). Electron transfer at the low-spin

heme b of cytochrome bo3 induces an environmental change of the catalytic enhancer glu-tamic acid-286. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. im Druck

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