Funktionsanalyse des Transkriptionsfaktors

GAL4

Gliederung

1) Wie funktioniert der Mechanismus der Transkriptionsaktivierung bei GAL4?

2) Welche Regionen des Transkriptionsfaktors sind essentiell für dessen Funktion?

3) Inwiefern finden die Ergebnisse in der Bioanalytik ihre Anwendung?

GAL4• Transkriptionsfaktor der Hefe• Aktiviert Gene des

Galactosemetabolismus in Abhängigkeit von Glucose und Galactose

• Bindestelle UASG (upstream activation sites)

Aufbau des GAL1-Gens und Regulationabschnittes

Wie funktioniert der Mechanismus der

Transkriptionsaktivierung bei GAL4?

Mögliche Mechanismen: 1) Bindung des Transkriptionsfaktors

führt zur DNA-Konformationsänderung

2) Aktivierung durch Protein-Protein-Wechselwirkungen

Neues Konstrukt: LexA-GAL4

- Potentielle

Aktivierungsdomäne von GAL4

- DNA-Bindungsdomäne von prokaryotischen Repressor LexA

Zusammenfassung• LexA-GAL4 erkennt LexA-Operator in

E.coli• Transkription in der Hefe wird nur

aktiviert, falls LexA-Operator vorhanden • LexA-GAL4 aktiviert Transkription auch,

wenn lexA-Operator downstream gelegen• Mögliche Wechselwirkungen von LexA-

GAL4 mit GAL80

Aktivierung der Transkription durch Protein-Protein-

Wechselwirkung!

Welche Regionen des Transkriptionsfaktors sind

essentiell für dessen Funktion?

Struktur von GAL4 bis dahin noch ungeklärt

Erzeugung von GAL4–Deletionsmutanten zur Bestimmung der relevanten Proteinregionen!

GAL4 - Plasmid

Zusammenfassung

• Zwei entscheidende Regionen für die Proteinaktivität identifiziert

N-Terminus: 1-147 bzw. 1-74 C-Terminus: 851-881 • Bis zu 80% des Proteins können

fehlen, ohne gravierenden Funktionsverlust

Aktuelles GAL4 - Modell

Dimerisierung

Inwiefern finden die Ergebnisse in der Bioanalytik ihre

Anwendung?

Ergebnisse:• Spezifität der Aktivierung der

Transkription wird durch die DNA-Bindung reguliert

• Kopplung der DNA-Bindungsdomäne und Aktivator-Domäne über zusätzliche Proteinanteile Analyse von Protein-Protein-Interaktionen

Das Konzept des Two-Hybrid-Systems

Konstruktion des Köderproteins für das Two-Hybrid-System und Analyse

seiner biologischen Aktivität

Kriterien des Köderproteins

•„Volle Länge“-Expression des LexA-Fusionsproteins:Western Blotting

•Transport des Fusionsproteins in den Zellkern des Akzeptorstamms und Bindung an die LexA-bindenden DNA –Elemente in der

Promotorregion der Reportergene;

•Das Fusionsprotein selbst darf die Transkription des Reportergens nicht auslösen.

„Titration“ des Aktivierungskomplexes

Fazit

Die gewonnenen Erkenntnisse der Struktur und Funktion des GAL4-

Systems sind von grundlegender Bedeutung für die Proteomik!

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !