31 8 I. ZIEGLER UND M. FERON

Q uantitative Bestimmung der hydrierten Pterine und des Xanthom matins in den Augen von Ceratitis capitata WIED (Dipt. Trypetidae)

I r m g a r d Z i e g l e r und M. F e r o n

Botanisches Institut der Technischen Hochschule Darmstadt und Station de ZoologieAgricole Monfavet

(Z. N a tu rfo rsd ig . 20 b , 318— 322 [1965] ; e ingegangen am 25. Dezem ber 1964)

Herrn Prof. Dr. A l f r e d K ü h n z u seinem 80. G eburtstag gew idm et

In the eyes of male and female flies a quantitative determination of the tetrahydropterin, the corresponding dihydro-compound (Sepiapterin) and of xanthommatin from 0 — 5 days after hatching was made. The increase of xanthommatin almost stops 24 hours after hatching; about 13 fig are present after that time. The tetrahydropterin, after a drastic increase during the first 24 hours, remains at a level of about 1,1 —1,2 [xg. In contrast the dihydrocompound which is nearly absent at the time of hatching is deposited on the eye-granules between the third and fifth day. At that time, especially in the male the dihydropterin/tetrahydropterin ratio is increased. Starvation during the first 24 hours has essentially no effect on the amount of xanthommation whereas the amount of pterins is markedly reduced.

Pterine und Ommochrome w urden bei Amphibien und Insekten in der H aut bzw. im Auge mehrfach quantitativ bestim m t. Es w urde deren Menge im Laufe der Entwicklung 1-6, unter dem Einfluß von Genen (vgl. I . e . 7) und von U m w eltfak toren8’9 er­mittelt. Die erw ähnten Untersuchungen weisen alle den Nachteil auf, daß sie zum großen Teil nu r die bei der A ufarbeitung entstandenen A bbauprodukte (2-A m ino-4-hydroxypteridin, P terincarbonsäure (6 ), B iopterin und X anthopterin) der in vivo vorliegen­den hydrierten P terine erfassen. Zu den letzteren ge­hören die nichtfluoreszierende, dem B iopterin nahe­stehende T etrahydro-V erbindung und die gelb fluo­reszierende D ihydrostufe; letztere w ird meist Sepia­pterin genannt (vgl. 1. c . 10) . Die erw ähnten Arbeiten registrieren somit nu r die V eränderungen im Gehalt an G esam t-Pterin und berücksichtigen nicht die mög­lichen V eränderungen innerhalb des Gleichgewichtes D ihydro ^ T etrahydrop terin ; dies geschah bisher n u r im Falle von C alliphora erythrocephala n . Das Gen w m anifestiert sich dort nicht durch V erm ehrung bzw. V erm inderung des P teringehaltes im Auge, sondern durch eine Verschiebung des Verhältnisses Tetrahydropterin ^ D ihydropterin zugunsten des letzteren.

1 I . Z i e g l e r - G ü n d e r , Z . Naturforsdig. 10 b, 173 [1955].2 E. H a d o r n u . I. Z i e g l e r , Z . Vererbl. 89, 221 [1958].3 I. Z i e g l e r . Biochem. Z . 334, 425 [1961].4 A. K ü h n , Z . Naturforsdig. 18 b, 252 [1963].5 B. L i n z e n , Hoppe-Seyler’s Z . physiol. Chem. 333. 145

[1963].6 R. H a r m s e n , Diss., Cambridge 1963.7 I. Z i e g l e r , Advances Genetics 10, 349 [1961].

C eratitis capitata, die als geeignete Quelle für die Isolierung des Tetrahydropterins d ien t12, erwies sich als gutes Objekt für die Untersuchung der Frage, ob solche Verschiebungen auch während der Entwick­lung auftreten. Diese Diptere bildet nicht — wie die Drosophiliden — rote Drosopterine und weist somit in ihren Augen nur das Tetrahydrobiopterin-Derivat sowie die gelbe Dihydrostufe — das Sepiapterin — auf. Vorversuche hatten ergeben, daß deren Haupt­menge erst nach den Schlüpfen in den Augen er­scheint. Ihre quantitativen Veränderungen sollten daher — bei 6 6 und $ $ getrennt — zusammen mit der der Ommochrome von diesem Zeitpunkt ab ver­folgt werden.

Material und M ethoden

1. Zucht von Ceratitis capitata

Die Einzelheiten der Zuchtbedingungen sind bei F eron 13 beschrieben.

2. Die quantitative Bestimmung der Pterine

Jeweils 6 Köpfe wurden in 0,2 ml einer Mischung von 99 Tin. H20 , 1 Tl. 33-proz. NH4OH und 0,2 Tin. Thioglykol in einem kleinen P o t t e r - E l v e h j e m -

8 I. Z ie g ler , E xp erien tia [B a sel] X V , 429 [1959].9 J. H. Dustmann, Z. vergl. P h y sio l. 49, 28 [1964].

10 I. Z ieg ler , Erg. der P h y sio l. 56 [1965], im Druck.11 I. Z ieg ler . Z. V ererbl. 92. 239 [1961] .12 I. Z ieg ler , B iochim . b iop h ysica A cta [A m sterdam ] 7 8 ,

219 [1963].13 M. F eron, Rev. P a th o l, veg . d ’E ntom ol. agr. de F rance

X L I, 1 [1962].

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BESTIM M UNG VON HYDRIERTEN PTER IN EN UND XANTHOM M ATIN 3 1 9

Homogenisator homogenisiert und bei ca. 1600 g ab­zentrifugiert. Vom Überstand wurden 0,01 ml auf Whatman I aufgetragen. Das Chromatogramm wurde in einer Mischung von Methanol/H20/33-proz. NH4OH/ Thioglykol (70 : 29 : 1 : 0,2) absteigend 3^2 Stdn. chromatographiert. Während dieser Zeit sind das Se­piapterin und das Tetrahydropterin mit einem 7?/-Wert von 0,32 bzw. 0,43 gut getrennt. Alle Arbeiten wurden bei Rotlicht ausgeführt.

Das papierchromatographisch abgetrennte, nicht fluoreszierende Tetrahydropterin wurde (bei abgedeck­tem Sepiapterin) durch 3 — 4 Min. lange Belichtung mit einer UV-Stablampe (365 m/^) in die blau fluores­zierende Pterincarbonsäure (6) um gewandelt12. Die Fluoreszenz-Intensität der Chromatogramm-Flecken wurde mit Hilfe des Fluoreszenzzusatzes und des Zu­satzes zur Auswertung von Papierchromatogrammen zum Zeiss-Spektralphotometer gemessen 1>14. Die Menge der gebildeten Pterincarbonsäure (6) konnte mit Hilfe der Eichkurve (Abb. 1) direkt bestimmt werden, die des Sepiapterins kann nur relativ in Fluoreszenzeinhei­ten wiedergegeben werden.

0,05 0.1 0,2 0,3 Oft 0J5 jug Pterincarbonsäure (6) — *~

Abb. 1. Eichkurve der Pterincarbonsäure (6).

3. Identifizierung und quantitative Bestimmung des Ommochroms

Der Extrakt (Methanol mit 1-proz. HCl) aus Cera- Zifis-Köpfen wurde zusammen mit solchem aus Köpfen von Drosophila melanogaster (sep/a-Mutante) und Musca domestica mit Kollidin/0,5-m. K-dihydrogen- phosphat 2 : 3 (obere Phase)15 durchlaufend chromato­graphiert. Das Papier wurde anschließend mit 2-proz. Na-dithionit-Lösung besprüht.

Die quantitative Bestimmung des Xanthommatins er­folgte nach B u t e n a n d t und M itarbb .15. Acht Köpfe, homogenisiert in 0,3 ml 2-n. HCl, ergaben nach Aus­

15 A. B u t e n a n d t , E. B ie k e r t , H. K ü b l e r u . B . L in z e n , Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem. 319, 238 [I960].

14 A. E g e l h a a f , Z. Vererbl. 87, 769 [1956].

schütteln des Homogenates in 2 ml Butanol bei einer Schichtdicke von 1 cm günstige Werte (E zwischen0,240 und 0,410) zur Messung der vollständig in die Dihydroform überführten Verbindung bei 492 m/u.

4. Proteinbestimmung

Nach Homogenisieren von jeweils 3 Köpfen in0,2 ml 0,3-m. Na-phosphatpuffer pn 7,1 und Zentrifu­gieren bei 1600 g wurde die relative Proteinmenge von6 6 und $ 9 durch Zusatz von Trichloressigsäure18 turbidimetrisch bestimmt.

E rg eb n isse

1. D ie Entwicklung der P terine

Die bereits beim Schlüpfen vorhandene Menge an T etrahydropterin — ausgedrückt in Äquivalenten an P terincarbonsäure (6) — steigt von 0,4 jug rasch auf0,95 —1,05 jug an und nim m t nach 24 Stdn. n u r noch geringfügig zu (Abb. 2 ) . Zwischen den W erten

Tage nach dem Schlüpfen

Abb. 2. Quantitative Bestimmung des Tetrahydropterins im Auge von C eratitis capitata, in Äquivalenten an Pterincar­bonsäure (6). — 0 ---------0 - — <3 6 , x —x —x = $ 9 •

fü r 6 (5 und ? ? konnten keine signifikanten U nter­schiede gefunden werden. Sepiapterin ist im Gegen­satz zur Tetrahydro-V erbindung beim Schlüpfen noch kaum vorhanden. Bis zum 3. Tag erreicht es die

16 S. P. C o l o w ic k u. N. K a p l a n , Methods in Enzymology, Vol. I ll, Academic Press, New York 1955.

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7- bzw. 10-fadie K onzentration gegenüber dem A us­gangsw ert und nim m t auch dann noch schwach zu (Abb. 3 ) . Bereits beim Betrachten der Chrom ato­gram m e erkennt man, daß zwischen den frisch ge­schlüpften bzw. den 24 Stdn. alten Fliegen einerseits und den 3 bzw. 5 Tage alten andererseits eine wesent­liche Verschiebung im V erhältnis D ihydropterin :

Tage nach dem Schlüpfen

Abb. 3. Bestimmung des relativen Gehaltes an Sepiapterin im Auge von C eratitis capitata, dargestellt in Fluoreszenz-

Einheiten. o ---------© — = <3c3> x — x — x = 9 9 .

Abb. 4. Mengenverhältnis Sepiapterin/Tetrahydropterin im Auge von C eratitis capitata, ausgedrückt durch den Quotien­ten der Fluorometer-Meßwerte. © --------0 -------- 0 =

X - X - X = $ 9 .

T etrahydropterin zugunsten der D ihydroverbindung stattgefunden hat. Dies w ird bestätigt, wenn man aus den Fluoreszenzwerten der beiden, jeweils auf einem C hrom atogram m zusam m engehörenden Flecken den Quotienten bildet und diesen in A bhängigkeit von der Zeit au fträg t (Abb. 4 ) .

E in w eiterer Unterschied zur T etrahydroverbin­dung zeigt sich darin , daß nach dem 1. Tag 6 6 und

eine verschieden starke Zuwachsrate zeigen: Das Sepiapterin steigt bei den <5 S wesentlich stärker an. Der höhere W ert für die c5 6 am 3. und 5. Tag nach dem Schlüpfen ist statistisch gut gesichert (xp = 180 ,1 ; sxd = 39 ,976 ; n = 9 ; t = 4 ,33 ; P = < 0 ,0 1 ) .

2. Identifizierung und quantitative Messung der Ommochrome

Das Redoxverhalten (Farbum schlag von der roten reduzierten zur gelben oxydierten Stufe) wies bereits darauf hin, daß bei Ceratitis capitata X anthom m atin vorliegt. D er papierchrom atographische Vergleich m it Musca domestica und Drosophila melanogaster, bei denen X anthom m atin als einziges Ommochrom festgestellt w orden war 15, zeigte, daß dies auch hier der Fall ist.

W ie bei den übrigen D ip te ren 5 (vgl. 1. c. 7’ 10) setzt die B ildung der Ommochrome früher ein als die der P terine. Ih re Zuwachsrate nach dem Schlüpfen ist somit geringer als die der P terine (Abb. 5 ) . Wie

Tage nach dem Schlüpfen

Abb. 5. Quantitative Bestimmung des Xanthommatins im Auge von C eratitis capitata. © 0 0 = (5 (5> X X X = 99*

Tage nach dem Schlüpfen

BESTIM M UNG VON HYDRIERTEN PTERINEN UND XANTHOM M ATIN 321

beim T etrahydropterin zeigen (5 6 und in der Menge pro Kopf keinen Unterschied, obwohl sowohl der Vergleich des Trockengewichtes als auch die Be­stimmung des relativen Proteingehaltes für (5 (5 : 99 ein Verhältnis von 1 0 0 : 120 bis 100 : 130 ergibt.

3. E influß des H ungerns

Es wurden gefütterte T iere m it solchen verglichen, die nach dem Schlüpfen 24 Stdn. ohne N ahrung ge­blieben und dann getötet worden waren. W ährend der Unterschied im Ommochrom gehalt (Durchschnitts­wert ungefüttert 10,7 jug, gefüttert 11,4 jug) gering war, ist der P teringehalt bei Tieren, welche ohne N ahrung geblieben waren, stark verm indert. Dieser Befund ist statistisch gut gesichert. F ür das Sepia­pterin beträgt xd 81,4 ( s 5 d = 2 3 ,797 ; n = 9 ; t = 3 ,42 ; P = < 0 ,0 1 ) . F ür das T etrahydropterin ist xd 154,5 (siD = 28 ,487 ; n = 9 ; t = 5 ,2 4 2 ; P - < 0 ,0 0 1 ) .

Besprechung der Ergebnisse

Versuche zur Biosynthese des P terinringes weisen darauf hin, daß als erstes P roduk t ein T etrahydro­pterin mit einer T rihydroxypropyl-Seitenkette an C (6) en ts teh t1'. Physiologische und genetische Be­funde (vgl. 1. c. 10) führen zu dem Schluß, daß diese V erbindung mit der H äm olym phe zugeführt und an den A ugengranula schrittweise dehydriert wird. Die vorliegenden M essungen, welche nicht nur die Zunahme an fluoreszierenden P terinen im Insek­tenauge, sondern deren ursprüngliche H ydrierungs­stufe berücksichtigen, stimmen m it diesen V orstellun­gen überein: In den Augen ist zuerst ein T etrahydro­pterin nachweisbar; dieses steht — wie aus dem V er­halten beim Crithidia-Test und dem Erscheinen von Biopterin bei schonender O xydation zu schließen (vgl. 1. c. 10) — von allen A ugenpterinen der ein­gangs erwähnten V erbindung am nächsten. W ährend dieser ersten Phase der P terinab lagerung w ird nur wenig zum Sepiapterin dehydriert. E rst nach E r­reichen eines bestimm ten Spiegels an Tetrahydro- V erbindung — 24 Stdn. nach dem Schlüpfen — wird die zusätzlich herangeführte Menge dieser Substanz fast vollständig umgewandelt.

Bei D rosophila m elanogaster wurden ein „X antho- pterin-Kom plex“ , „H B -Pterine“ sowie Sepiapterin quantitativ während der Entwicklung bestim m t 2. Da

17 A. K ü h n u . A. E g e l h a a f , N atu rw issen sch aften 42, 634[1955].

w ir heute wissen, daß der „X anthopterin-K om plex“ durch Abbau von Sepiapterin, die „H B -Pterine“ durch Oxydation des Tetrahydropterins (vgl. 1. c. 10) entstehen, können wir die Entwicklung bei D roso­phila melanogaster in das gleiche Schema ein o rd n en : Zuerst erscheint auch dort die Tetrahydrostufe, ge­folgt vom Sepiapterin und erst zuletzt werden die für viele Drosophiliden charakteristischen roten Droso- p terine, welche die am weitestgehend dehydrierten V erbindungen darstellen (vgl. I . e . 10) , abgelagert. Ih re N eubildung dauert dementsprechend nach dem Schlüpfen noch am längsten fort.

Von den bisher untersuchten D ipteren, Drosophila m elanogaster2 und Calliphora erythrocephalau , unterscheidet sich C. capitata jedoch dadurch, daß der Gehalt an C ( 6 ) -substituierten P terinen in den (5(5 und 99 nicht der Augengröße — ausdrückbar in dem relativen Proteinverhältnis — entspricht. Der M ehr­gehalt der S <3 an Sepiapterin ist — wie der an Iso- xanthopterin bei den (5 (5 von D. melanogaster 2 — bei C. capitata somit ein fü r die (5(5 spezifisches Merkmal.

In den vorliegenden Messungen konnte nur das T etrahydropterin in Absolutwerten gemessen werden. Da es eine dem Biopterin entsprechende Seitenkette aufweist, entspricht die Menge von 0,95 — 1,05 jug des Photolyseproduktes P terincarbonsäure (6) im Auge des adulten Tieres einer Menge von ca. 1,1 bis 1,2 jug. Der auf diese Weise erm ittelte W ert stimmt som it sehr gut überein mit dem, welcher bei der Isolierung durch Sephadex aus einer großen Anzahl von Köpfen mit Hilfe der spektrophotom etrischen Bestim m ung erhalten worden war 12.

Die Entwicklung des Sepiapterins konnte nur in relativen Fluoreszenzwerten verfolgt werden. F rüher durchgeführte Vergleichsmessungen von Fluoreszenz- Intensität und Crithidia-Aktivität ( Z i e g l e r unveröff.) sowie die Berücksichtigung der Tatsache, daß gelbe Fluoreszenz im Vergleich zur blauen um ca. i /'Z stä r­ker reg istriert w ird, lassen den Schluß zu, daß neben1,1 — 1,2 («g Tetrahydropterin ungefähr die gleiche M enge an Sepiapterin pro Kopf vorliegt. Die ge­sam te P terinm enge beträgt bei C. capitata somit nu r etwa 1/ö der Xanthom matin-M enge.

Die bei den D ipteren im Vergleich zu den Ommo- chromen später einsetzende P terinablagerung spie­gelt sich auch in der verschiedenen Reaktion auf fehlende N ahrungsaufnahm e w ider: D er bereits weit­gehend während der Verpuppungszeit abgeschlossene V organg der Ommochrom-Ablagerung wird dadurch

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nur wenig beeinflußt, während das Erscheinen der P terine an den A ugengranula noch weitgehend von den Prozessen abhängig ist, welche erst nach dem Schlüpfen ablaufen.

Auffallend ist, daß der „W endepunkt“ in der P terinentw icklung — rasche Zunahme des Q uotien­ten D ihydropterin /T etrahydropterin — zusam m en­fällt m it dem Zeitpunkt, zu welchem die Ommochrom- bildung an den A ugengranula im wesentlichen ab­geschlossen ist. Genetische Befunde bei E phestia

kühniella 17 weisen auf einen engen Zusam m enhang in der A blagerung der beiden Pigm ente h in ; das Fehlen der Ommochrome bei der M utante w von C alliphora eryth rocephala zeigte eine charakteri­stische Verschiebung im V erhältnis D ihydro-/Tetra- hydropterin n . W eitere U ntersuchungen müssen zei­gen, ob auch die w ährend der Entwicklung von C. capita ta zu beobachtende M engen-Korrelation eine kausale V erknüpfung — evtl. über den Redox- C harakter der beiden V erbindungen — bedeutet.

Experimentelle Beeinflussung der Drosopterinsynthese in den Drosophila-M utanten rosy und maroon-like1

I l s e S c h w i n c k

Department of Genetics, The University of Connecticut, Storrs, Connecticut, U.S.A.

M einem verehrten Lehrer Herrn Prof. Dr. A lfr e d Kühn zum 80. G eburtstag gew idm et

(Z. N aturforschg. 20 b, 322— 326 [1965] ; e in g eg an g en am 30. N ovem ber 1964)

In a comparative study of the mutants rosy and m aroon-like it is demonstrated that both mutants respond to pupal case dissection and incubation in R i n g e r’s solution with an increased drosopterin formation. Such induced phenocopy of eye color is enhanced further by addition of phenylalanine to the incubation solution. In contrast, the other pteridines, as well as the Malpighian tubes show the mutant phenotype. The possible interaction of drosopterin synthesis and phenyl­alanine oxidation is discussed.

Das sehr ähnliche pleiotrope W irkungsm uster der beiden D rosophila-M utanten rosy (ry , 3 — 52,35) und m aroon-like (m a-l, 1 — 64,8) ist in den letzten Jahren Gegenstand einer Reihe von genphysiologi­schen und biochemischen Untersuchungen gewesen. Die Analyse der Zusam m enhänge der Reaktionskette Gen — E nzym — m orphologische Phäne und die ex­perim entelle M odifizierbarkeit dieser Reaktions­abläufe verspricht zum V erständnis der die Gen­aktivität regulierenden K ontrollvorgänge in höheren O rganism en beizutragen. Die Kom plexität und P la­stizität des pleiotropen M usters kommt in der in Tab. 1 aufgeführten Zusam menstellung der wichtig­sten Phäne zum Ausdrude. Bei reziproken Augen- scheiben-Transplantationen und bei Im plantation von M a l p i g h i sehen Gefäßen wurde keine in vivo Kom plem entierung von diffusiblem ma-l- und ry-Fak-

1 Die Untersuchungen wurden mit Unterstützung des Grant Nr. G M-10256, U. S . P u b l i c H e a l t h S e r v i c e , N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h , durchgeführt.

toren in Bezug auf die D rosopterinbildung gefun­den n . Da Transplantations-Experim ente methodisch auf bestim m te O rgane und eine gewisse Im plantat­größe begrenzt sind, w urde kürzlich versucht, in Parabiose-Versuchen eine nicht-autonome D roso­pterinb ildung und die mögliche Komplementation von ry- und ma-Z-Faktoren zu analysieren. Ü ber­raschenderweise ergab sich in einem Teil der Homo- P arab iosen (r y m it ry als Kontrollen) eine gestei­gerte D rosopterinbildung bis zur V ollausfärbung; h ierm it war natürlich die Auswertung der Hetero- Parabiosen zwischen genotypisch verschiedenen P a rt­nern hinfällig. Die P räparationsprotokolle ließen eine Beziehung der A ugenfarbphänokopie zur Stärke der M elaninbildung an der O perationsw unde verm u­ten. Die weitere experim entelle Untersuchung dieses Phänom ens, die an anderer Stelle beschrieben wird, ergab für die rosy-M utante eine Beziehung von Phe­nylalanin-O xydation und gesteigerter Drosopterin-