G. Ecker Universität Wien Institut für Pharmazeutische Chemie Das Resistenzproblem Ursachen, Mechanismen, mögliche Auswege Ao.Univ.-Prof. Dr. Gerhard Ecker

G. EckerUniversität WienInstitut für Pharmazeutische Chemie

Das ResistenzproblemUrsachen, Mechanismen, mögliche Auswege

Ao.Univ.-Prof. Dr. Gerhard EckerInstitut für Pharmazeutische Chemie

Universität Wien

Universität WienInstitut für Pharmazeutische Chemie


Das Resistenzproblem

• Intrinsische Resistenz

• Erworbene Resistenz

Unter Resistenz versteht man eine Insensitivität oder verringerte Sensitivität gegenüber Arzneistoffen, die das Zellwachstum verringern oder zum Zelltod führen


Daten Methicillin-resistente S. aureus Penicillin-resistente S. pneumoniae


Das Resistenzproblem - Ursachen

• Verwendung im Humanbereich

• Gentransfer

• Verwendung von Antibiotika in der Tierfütterung


Verwendung im Humanbereich

• Verschreibung auch wenn nicht nötigIn Ländern mit hoher Verschreibungsrate ist auch die Resistenzrate hoch

• Schlechte Compliance der PatientenZu frühes Absetzen, Aufheben, ...

• Oft wird sofort das neueste Arzneimittel verschriebenFördert rasche Resistenzentwicklung


Gentransfer

• Transformation: lösliche DNA-Stücke

• Transduktion: Plasmidtransfer über Phagen

• Konjugation: direkter Plasmidtransfer

Die häufigste Ursache für Antibiotikaresistenz in der Klinik ist der Transfer von DNA-Segmenten. Dies erfolgt durch:


Gentransfer

• Transformation: lösliche DNA-Stücke werden aufgenommen; eher unbedeutend

• Transduktion: Plasmide werden mittels Phagen von einem Bakterium zum anderen übertragen; z.B. Penicillin-resistente Staphylococcen

• Konjugation: Plasmide werden durch direkten Kontakt übertragen; vorwiegend bei gram-negativen Bakterien (Enterobacteriae)


Plasmide

Plasmide sind kleine zirkuläre DNA-Moleküle, die unabhängig vom Genom vermehrt werden. Sie werden vielfach als Vektoren für die Klonierung von DNA verwendet;

Resistenzplasmid R100:Tetracyclin, Sulfanilamid, Streptomycin, Chloramphenicol


PlasmidePlasmide enthalten meist mehrere Resistenzgene

Antibiotikaresistenz in Shigellae (Japan):Jahr Anzahl Sm Tc Cm Sm,Cm,Tc1953 4900 5 2 0 01956 4399 8 4 0 01958 6563 18 20 0 1931960 3396 29 36 0 308

Streptomycin (Sm), Tetracyclin (Tc) und Chloramphenicol (Cm)

Plasmidtransfer von multidrug-resistenten E. coli


Plasmide• Penicillin G-Resistenz in S. aureus durch

Selektion von S. aureus Stämmen mit R-Plasmid mit -Laktamase Gen (85% innerhalb von 20 Jahren)

• Ampicillin Resistenz bei Haemophilus influenca• Penicillin Resistenz bei Neisseria gonorrhoeae• Carbenicillin Resistenz bei P. aeruginosa

Bedeutung der coliformen Bakterien beachten


PlasmideAntibiotika-Resistenz von coliformen Bakterien in Abwasserkanälen:

%Sm %Cm %TcKrankenhaus 48.8 0.4 24.3Wohngegend 0.6 0.007 0.1Psych. Klinik 9.5 0.03 0.4Sm: Streptomycin; Cm: Chloramphenicol; Tc: Tetracyclin

trotzdem 95% der gesamten R-Plasmide der Stadt nicht von Krankenhäusern


Tierfütterung

• Etwa die Hälfte der in den USA verwendeten Antibiotika wird in der Tiermast verwendet

• Antibiotika im Tierfutter erhöhen die Performance, stabilisieren die Darmflora und verbessern das Wachstum (z.B. Flavomycin)

• Antibiotika im Tierfutter erhöhen Auftreten resistenter coliformer Bakterien

• Übertragung auf Darmflora der Bauern ist möglich


Tierfütterung

• Multidrug-resistente Salmonella Stämme von Tieren verursachen schwere Erkrankungen beim Menschen

• Verwendung von Fluorochinolonen in Hühnern zur Verhinderung von E. coli Infektionen (USA ab 1996) führt zum Auftreten von resistenten Champylobacter Stämmen (1999: C. jejuni 17.6% und C. coli 30%)

• Anteil der Verwendung von Antibiotika in der

Tiermast am Auftreten resistenter Keime nicht geklärt


Das Resistenzproblem - Mechanismen

• Intrinsische Resistenz

Mikroorganismen sind von Beginn an resistent gegen die Chemotherapeutika

• Erworbene Resistenz

Mikroorganismen erwerben Resistenz während der Behandlung


Intrinsische Resistenz

• Rezeptor fehlt– Fehlen von Sterolen in der Zellmembran von

Bakterien führt zu Resistenz gegen antifungale Polyene (Amphotericin B, Nystatin).

– Isoniazid hemmt Synthese von Mycolsäure, das nur in Zellwänden von Mycobakterien vorkommt


Intrinsische Resistenz

• Konzentration am Rezeptor zu gering

gram-negative Bakterien besitzen eine wesentlich komplexere Zellwand, sodaß Penicillin G nicht zum Wirkort (Penicillin-bindendes Protein) gelangt


Intrinsische Resistenz• Konzentration am Rezeptor zu gering

– Rifampin hemmt die DNA-abhängige RNA-Polymerase. Wirkt jedoch nicht bei Pilzen, da es Zellwand nicht permeieren kann; zusätzliche Gabe niedriger Dosen von Polyenen führt zur Hemmung fungaler RNA-Synthese.

– Aufnahme von Aminoglycosiden benötigt Energie vom Membranpotential, das über ein bakterielles Elektron-Transportsystem aufrechterhalten wird. Hemmung des Transportsystems (CN, Anaerobia) führt zu Resistenz gegen Aminoglycoside


Erworbene Resistenz

• Verringerte Aufnahme oder Erhöhter Efflux

In Analogie zur Multidrug-Resistenz bei Tumoren (P-Glycoprotein) werden auch bei Bakterien in verstärktem Ausmaß aktive Effluxsysteme identifiziert


Aktiver Efflux

In der Tumortherapie ist der aktive Efflux von Zytostatika aus der Tumorzelle einer der Hauptmechansimen für das Auftreten von Multidrug Resistenz.

Vorwiegend 2 Proteine beteiligt:– P-Glycoprotein (PGP)– Multidrug Resistance Related Protein (MRP)


Substrate für P-Glycoprotein

Vinca Alkaloide EpipodophyllotoxineVincristin EtoposidVinblastin Teniposid

Anthracycline TaxaneDoxorubicin

Daunorubicin Actinomycin D

C.R. Leveille-Webster, I.M. Arias, J. Membrane Biol. 143, 89-102 (1995)


Effluxsysteme in Bakterien und PilzenPGP Cluster pfMDR1 Plasmodium falciparum

Cdr1p Candida albicansPdr5p Saccharomyces cerevisiaeSnq2p Saccharomyces cerevisiaeLmrA Lactococcus lactis

MRP ClusterYcf1 Saccharomyces cerevisiaeYor1 Saccharomyces cerevisiaeltPgpA Leishmania tarentolaeceMRP1 Caenorhabditis elegansBCECF Lactococcus lactis

H.W. van Veen, W.N. Konings, Sem. Cancer Biol. 8: 183-191 (1997)


Effluxsysteme in Bakterien und Pilzen MFS FamiliecaMDR1 Candida albicans

LmrP Lactococcus lactisNorA Staphylococcus aureus

RND Familie AcrB Escherichia coliMexB Pseudomonas aeruginosaMtrD Neisseria gonorrhoea

SMR Familie EmrE Escherichia coliQacC Staphylococcus aureusQacE Klebsiella aerogenes

H.W. van Veen, W.N. Konings, Sem. Cancer Biol. 8: 183-191 (1997)


Effluxsysteme in Bakterien

Spezies Resistenz

Escherichia coli Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin

Pseudomonas aeruginosa Tetracyclin, Chloramphenicol, Norfloxazin

Salmonella typhi Chloramphenicol

Mycobacterium tuberculosis Isoniazid, (Azidothymidin)


Erworbene Resistenz• Enzymatische Inaktivierung

Grundlegender Mechanismus der Resistenz gegen:

– Penicilline: -Laktamasen

– Aminoglykoside: • N-Acetyltransferase, O-Phosphotransferase, O-Adenylyltransferase

– Chloramphenicol:• Chloramphencol-acetyltransferase


Enzymatische Inaktivierung

• Aminoglycoside– N-Acetyltransferase (AAC)

Acetyl-CoA + AG CoASH + N-Acetyl-AG

– O-Phosphotransferase (APH)ATP + AG ADP + Phospho-AG

– O-Adenylyltransferase (ANT)ATP + AG Ppi + AMP-AG

O

O

O

O

OH

NH2

NH2

OH

OH

NH2

NH2

OH NH2

OH

OH

ANT(4')

ANT(2')APH(2")

AAC(2')

AAC(6')

AAC(3)

AAC(1)

APH(3')

Kanamycin B


Enzymatische Inaktivierung

• Chloramphenicol– Chloramphenicol-Acetyltransferase acetyliert CM an 3-OH

– 3O-Acetyl-CM bindet nicht mehr an die 50S Untereinheit des bakteriellen Ribosoms

– CM-Acetyltransferase wird durch R-Plasmid übertragen

– R-Plasmid kann von S. typhi od. H. influenza auf E. coli und von diesen auf Salmonella übertragen werden (Tiermast!)

OH

NH

ClCl

OH

O2NO

O

NH

ClCl

OH

O2NO

CH3

O


Erworbene Resistenz• Verringerte Affinität des Rezeptors

– durch zufällige single-point Mutation wird Zielprotein so verändert, dass es den Arzneistoff nicht mehr bindet, aber trotzdem seine biologische Funktion erfüllt:

• ribosomales Protein - Streptomycin

• Penicillin bindendes Protein - Penicillin G

– Affinität nur verringert, zusätzliche Mutationen


Mögliche Auswege• Entwicklung neuer Antibiotika

– Linezolid (Zyvox™)– Dalfopristin/Quinupristin (Synercid®)– Daptomycin

• Verwendung von Resistenzmodulatoren– Effluxinhibitoren– selbstregenerierende Aminoglycoside

• Verringerung der Antibiotika in der Umwelt– lichtsensitive -Laktame


Antiinfektiva - Neuzulassungen

90 92 94 96 980

10

20

30

40

50

Antiinfektiva

Gesamt

Neuzulassungen

Jahr

Neu 1999 (7)MoxifloxacinGatifloxacinQuinupristin/DalfopristinZanamivirOseltamivirAbacavirAmprenavir


Neue Antibiotika

• Linezolid:

– Vertreter der neuen Klasse der Oxazolidinone– aktiv gegen gram-positive Keime

– bindet an das bakterielle Ribosom und verhindert Proteinsynthese

– Resistenz durch Mutationen am Ribosom

O

N

NO

FNH CH3

O

O


Neue Antibiotika• Dalfopristin/Quinupristin

– Streptogramin

– hemmen Proteinsynthese über Interaktion mit der Peptidyltransferase-Domäne der ribosomalen 50S Untereinheit

– jede Substanz für sich bakteriostatisch, Kombination ist bakterizid


Neue Antibiotika

• Daptomycin– cyclisches Lipopeptid– aktiv gegen

• Vancomycin resistente Enterococci

• Methicillin resistente Staphylococci

• Vancomycin resistente S. aureus


Resistenzmodulatoren

• Effluxinhibitoren - P-Glycoprotein– Verapamil, Dexverapamil

– Dexniguldipin

– Cyclosporin

– Valspodar (SDZ-PSC 833)

Allerdings:• Notwendige Konzentrationen in vivo oft nicht erreicht• Blut-Hirn Schranke geöffnet



• Effluxinhibitoren

MC-207,110 (Microcide Pharm.)

blockiert Effluxpumpen in P. aeruginosa

hebt Resistenz gegen Fluorochinolone (Levofloxacin) wieder auf

NH2

NH

NH

O

NH

NH2

NHO



• selbstregenerierende 3´-Ketoaminoglycoside

O

O

O

O

OH

NH2

OHO

NH2

OH

NH2

OH

NH2

OH

OHSebstregeneration nach enzymatischerDesaktivierung

S. Mobashery et al., J. Am. Chem. Soc. 121, 11922 (1999)


Selbstregenerierende 3´-Ketoaminoglycoside

O

O

O

O

OH

NH2

OHO

NH2

OH

NH2

OH

NH2

OH

OH

O

O

O

O

OH

NH2

OHNH2

OH

NH2

OH

NH2

OH

OH

OHOH

O

O

O

O

OH

NH2

OHNH2

OH

NH2

OH

NH2

OH

OH

OH

O

P

O

OO

H2O

APH(3')

- HPO42-


Verringerung in der Umwelt

• lichtsensitive -Laktame

N

SNH

O

NHNH

OO

OO CH3

O

NO2

O OH

Selbstzerstörung durch UV-Licht

S. Mobashery et al., J. Med. Chem. 43, 128 (2000)


Überwachung - Dokumentation


Überwachung - Dokumentation• European Antimicrobial Resistance Surveillance

System (EARSS)– Reduktion der Antibiotikaresistenz in der EU

• Sammeln von Daten

• Analyse regionaler Unterschiede

• Korrelation der Unterschiede mit Risikofaktoren

• Neue Richtlinien für Verwendung von Antibiotika

– S. pneumoniae & S. aureus (E. faecium/faecalis, E. coli)


EARSS


World Antibiotic Resistance Network

Globales Informationssystem über den gegenwärtigen Resistenzstatus in bestimmten Regionen

Dateneingabe und Datenabfrage möglich


Das Resistenzproblem - Vorschläge

• Verschreibung von Antibiotika nur bei klarer Indikation (Südamerika, Osteuropa, ...)

• Zuerst „klassische“ Antibiotika verwenden• Bei Therapieversagen Resistenzprofil bestimmen

Finnland: Ansteigen der Resistenzen gegen Erythromycin Anfang 1990Richtlinien zur sparsameren Verwendung - Verschreibungen sanken von 2.4 tägl. Dosen/1000 Einwohner auf 1.4 tägl. Dosen/1000 Einwohner

Resistenz von Streptococcen sank von 16.5% (1992) auf 8.6% (1996)


Das Resistenzproblem - Vorschläge

• Auch im Veterinärbereich Verwendung von Antibiotika nur bei klarer Indikationsstellung

• Antibiotika zur Wachstumsperformance?– seit 1.1.2000 sind in der EU nur noch Flavophospholipol,

Salinomycin, Monensin und Avilamycin zugelassen

Using the same antibiotics in people and animals is a bad ideaStanley Falkow & Donald Kennedy, Science 291, 19.1.2001

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