Zeitschrift fur Allgemeine Mikrobiologie I 20 I 8 1 1980 I 523-526 I

Kurze Originalrnitteilungen

(Institut fiir Mikrobiologie der Maria-Curie-fikl.odowska-Universit;it Lublin)

Gewinnung pektinolytisch aktiver Mutanten von Aspergillus niger

Z. ILCZUK und J. FIEDUREK

(Eingegangen am 25. 11.1979, revidiert eingegangen am 26. 2. 1980)

Die Mutagenisierung von Mikroorganismen zur Gewinnung hoch aktiver Produk- tionsstamme wird in vielen Zweigen der Garungsindustrie angewandt. So lassen sich andere geeignete Mutanten von Aspergillus niger fur die Pektinasensynthese gewinnen (DIAXOVA et al. 1970, SILISZCZENSKA et al. 1970, ILCZUK 1973, 1974, ILCZUK u. WOLEK 1973, FIEDUREK u. ILCZUK 1978). Bisher ist es jedoch immer noch schwierig, aus einer grofien Menge von Mutanten Hochleistungsstamme zu selektieren. Eine Ver- besserung dieser Methode erreichte man durch eine verkiirzte, der Orientierung die- nende Vorselektion pektinolytisch aktiver Mutanten von A . niger (ILCZUK u. FIEDU- REK 1977). Die vorliegende Arbeit beschaftigt sich mit der Entwicklung effektiver Induktions- und vor allem Selektionsverfahren zur Gewinnung solcher Mutanten. Dabei wird die pektinolytische Aktivitiit von A. niger-Mutanten, die auf Minimal- nahrmedium schwacher wachsen und Cycloheximid-resistent sind, sowie von proto- trophen Revertanten auxotropher Mutanten untersucht.

Konidien von Aspergillus niger Stamm 71 (ILCZUK 1974), A . niger Stamm 19 (hic-) und A. niger Stamm 22 (thi-) wurden fur die Mutagenisierungsversuche verwendet.

Gewinnung schwach wachsender Mutanten auf Minimalmedium: Eine wiiBrige Konidiensus- pension (1,8 x 106 Konidien/ml) von A. niger 71 wurde mit einer l%igen Losung von N-Methyl-N- Nitrosoharnstoff (NMU) 2 Std. behandelt und mit UV (4,s x lo3 Erg/mm2) bestrahlt. 15 ml Mini- malmedium nach CZAPEK wurden rnit 5 ml der behandelten Konidiensuspension beimpft und auf einer Schiittelmaschine (200 U/min) bei 30 "C wahrend 48 St. inkubiert. Das entstandene Mycel wurde iiber einen G 2-Filter von der Kulturlosung getrennt, das lOfach verdiinnte Filtrat mit dem ungekeimten Konidien auf Bierwiirzeagar ausgespatelt, bei 30 "C 3 -4 Tage inkubiert (Keimungs- rate der Konidien etwa 0,006%) und die pektinolytische Aktivitiit der Kolonien bestimmt.

Gewinnung Cycloheximid-resistenter Mutanten : Die mit NMU und UV behandelten Konidien von A . niger 71 wurden auf Bierwiirzeagar, der Cycloheximid in den Konzentrationen 200 pg/ml bzw. 500 pg/ml enthielt, ausgespatelt, 3-4 Tage bei 30 "C inkubiert und die pektinolytische Akti- vit i t der Kolonien bestimmt.

Gewinnung prototropher Revertanten : Konidiensuspension (1,8 x los Konidien/ml) von A . ni- ger 19 (nic-) und A . niger 22 (thi-) wurden nach NMU- und UV-Behandlung auf Minimalagarme- dium nach CZAPEK ausgespstelt, 3-4 Tage bei 30 "C inkubiert und die pektinolytische Aktivitiit der prototrophen Revertanten bestimmt.

Selektion pektinolytisch aktiver Mutanten: Fur diese Untersuchungen wurde folgende Niihr- losung verwendet : 4% eines lO%igen wlBrigen Auszuges von Zuckerriibenschnitzeln oder 4% Zuckerriibenschnitzel (bei Kultivierung der Mutanten in 500-ml-Kolben), 0,7% (NH,),HPO,, 0,05% MgSO, . 7 H,O, O , l % K,HP04, FeSO,, pH 5,O. a) Selektionsetappe I: Die Mutanten wurden in ReagenzglPsern mit je 5 ml Niihrlosung station&

bei 30 "C 5 Tage kultiviert (Oberfllichenkultur) und danach die pektinolytische Aktivitiit des Kulturfiltrates bestimmt.

b) Selektionsetappe 11: Die pektinolytisch aktiven Mutanten von Selektionsetappe I wurden in ReagenzglBsern mit je 5 ml Niihrlosung 4 Tage als Schuttelkultur (220 U/min) bei 30 "C inku- biert und die pektinolytische Aktivitiit der Kulturfiltrate bestimmt.

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Die Leistung der durch Selektionsetappe I1 ausgewiihlten pektinolytisch aktivsten Mutanten wurden durch Kultivierung in 500-ml-Glaskolben mit 100 ml Nahrlosung als Schiittelkultur bei 30 "C gepruft.

Bestimmung der pektinolytischen Aktivitiit : Die pektinolytische Aktivitiit von Kulturfiltra- ten wurde mit Hilfe von Pektinagar-Diffusionsgelen nach der Methode von DINaLE et al. (1953), modifiziert von ILCZUK u. FIEDUREK (1977) oder viskosimetrisch in konventionellen Einheiten (RA/ml Kulturlosung) bestimmt. Die Einheiten wurden aus dem Produkt von 100 x Reziprozitiit der Zeit (in min), die zur bO%igen Reduktion der Viskositat des Substrates benotigt wird, berech- net.

Die Ergebnisse der Selektionsversuche sind in Tabelle 1 zusammengestellt worden. Von 115 schwach wachsenden Mutanten von A . niger 71 zeigten 101 (87,8y0) in der Selektionsetappe I eine hohere pektinolytische Aktivitat als der Ausgangsstamm. Von 33 der aktivsten Stiimme aus Selektionsetappe I hatten 11 in Selektionsetappe I1 eine hohere pektinolytische Aktivitiit als der Ausgangsstamm (Tab. 1, A.). Ahnliche Ergebnisse wurden bei den Cycloheximid-resistenten Mutanten gefunden (Tab. 1, B.). Ein gro13erer Stimmulierungseffekt lie13 sich bei den prototrophen Revertanten in Selektionsetappe I erzielen (Tab. 1, C und D). Von 90 Revertanten wiesen nur 4 eine geringere pektinolytische Aktivitiit im Vergleich zum Ausgangsstamm auf. Allerdings waren nur 43,8% der ausgewiihlten Revertanten aus Selektionsetappe I aktiver in Selektionsetappe 11.

Die pektinolytische Leistung der in Selektionsetappe I1 ausgewiihlten Mutanten bestiitigte sich bei submerser Kultivierung im 500-ml-Kolben als Schuttelkultur. Die pektinolytische Aktivitiit aller Mutanten war bedeutend hoher (zwischen 8,l bis 73,8y0) im VergIeich zu den Ausgangsstiimmen (Tab. 2, 3 und 4).

Tabelle 1 Pektinolytische Aktivitiit der Kulturfiltrate von A. niger-Mutanten bei Kultivierung in Reagenz-

gliisern als Oberflachenkultur (Selektionsetappe I) bzw. Schiittelkultur (Selektionsetappe 11) -

A. Schwach wachsende Mu- tant,en von A. niger 71 l)

Selektionsetappe I Selektionsetappe I1

B. Cycloheximid-resistente Mutanten von A. niger 71 l) Selektionsetappe I Selektionsetappe I1

C. Prototrophe Revertanten von A. niger 22 ( thi-) ?)

Selektionsetappe I Selektionsetappe I1

D. Prototrophe Revertanten von A. niger 19 (nic-) 3) Selektionsetappe I Selektionsetappe I1

Anzahl der gepriiften Mut.anten

_____

115 33

81 13

64 20

26 12

Anzahl der Mutanten mit einem Lysehof- durchmesser (in mm) von:

19 -

5 0

2 0

2 1

0 0

20 -

3 8

17 1

0 2

0 1

21 -

2 14

2 3

1 10

0 4

22 -

4 8

2 6

1 6

0 6

23 ___

13 3

12 3

0 1

1 1

24

33 0

33 0

40 0

13 0

25 -

22 0

13 0

18 0

9 0

26 -

24 0

0 0

2 0

3 0

27

l) Lysehofdurchmesser fur A. niger 71: Selektionsetappe I = 22 mm, Selektionsetappe I1 =

2, Lysehofdurchmesser fur A. niger 22 (thi-): Selektionsetappe I = 23 mm, Selektionsetappe

Lysehofdurchmesser fur A. niger 19 (nic-): Selektionsetappe I = 18 mm, Selektionsetappe

= 21mm

I1 = 21 mm

I1 = 16mm

Pektinolytisch aktive A. niger-Mutanten

71 21 22

11 23 25 15 22 25 17 22 25 20 23 25 25 22 25 33 22 25 47 23 25 55 22 25 61 22 25

(Kontrolle)

625

448 (0)

66,4 (50,9) 59,s (35,9) 53.4 (21,4) 69,8 (58,6) 58,8 (33,6) 60,6 (37,7) 70,7 (60,6) 68,4 (55,4) 63,2 (43,6)

Tabelle 2 Pektinolytische Aktivitiit der Kulturfiltrate schwach wachsender Mutanten von A. niger 71, die nach Selektionsetappe I1 ausge- wiihlt wurden, bei Kultivierung in Reagenzgliisern und 500-ml-

Kolben

Mutant e Nr .

71 (Kontrolle)

10 15 21 26 29 57 66 74 78 84 89

Lysehofdurchmesser (in mm) bei Kultivierung in Rea-

genzgliisern als Schuttel-

kultur

21

22 22 22 23 22 22 22 22 23 23 22

Oberfllchen- kultur

22

26 27 27 27 26 27 26 26 26 26 26

Pektinolytische Aktivitiit l) (RA/ml) bei Kultivierung in 500-ml-Kolben

44,o (0)

67,7 (53,s) 58,8 (33,6) 74,9 (70,2) 76,5 (73,s) 59,6 (35,4) 61,6 (40,O) 66,9 (52,O) 70,6 (60,4) 69,s (58,6) 75,l (70,7) 67,5 (53,4)

1) Prozentuale Aktivitiitsleistung im Vergleich zur Kontrolle in Klammern stehend

Tabelle 3 Pektinolytische Aktivitat der Kulturfiltrate Cycloheximid-resi- stenter Mutanten von A. niger 71, die nach Selektionsetappe I1 ausgewiihlt wurden, bei Kultivierung in Reagenzgliisern und

500-ml-Kolben

Mut ante Nr.

Lysehofdurchmesser (in mm) bei Kultivierung in Rea-

genzgliisern als Pektinolytische

Aktivitlt l) (RA/ml) bei Kultivierung in

Oberfliichen- I 500-ml-Kolb& I kultur

Wie die Untersuchungsergebnisse zeigen, ermoglicht die hier dargestellte Methode eine hohere Ausbeute an pektinolytisch aktiveren Mutanten von A. niger. Durch die schnelle Erfassung der Pektinasesyntheseleistung von Mutanten in Reagenzglasern als Mikrokultur lafit sich die Selektion von Hochleistungsstammen rationalisieren. 35 Zeitsehrift f . Allg. Yikrobiologie, Bd. 20, H. 8

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Tabelle 4 Pektinolytische Aktivitat der Kulturfiltrate prototropher Rever- tanten der auxotrophen Mutanten A . niger 19 und 22 bei Kulti-

vierung in Reagenzgliisern und 500-ml-Kolben

Mutante Nr .

22 (thi-) (Kontrol le)

5 21 28 31 38 56 61

19 (nic-) (Kontrolle)

3 4

13 19 23 24 26

Lysehofdurchmesser (in mm) bei Kultivierung in Rea-

genzgliisern als Oberfliichen-

kultur

23

25 25 25 25 25 25 25

18

26 26 25 25 25 25 25

Schuttel- knltur

21

22 22 22 22 22 22 23

16

22 22 22 23 22 22 22

Pektinolytische Aktivitiit l) (RA/ml) bei Kultivierung In

500-ml-Kolben

55,o (0)

69,8 (26,9)

73,l (32,9) 6 6 3 (21,4) 68,9 (25,3) 76,5 (39,O) 75,6 (37,4)

48,4 (-12,O)

18,4 (O),,

47,6 (158,B) 58,5 (217,9) 65,2 (254,3) 71,6 (289,l) 59,s (225,O) 64,s (252,7) 57,4 (211,9)

1) Prozentuale Aktivitiitserhohung im Vergleich zur Kontrolle in Klammern stehend

L i t e r a t u r

DIANOVA, O., MARTAKOV, A., BANKOZITENPO, R., NOVIKOVA, A., 1970. Selekciya producentov pek- toliticeskih fermentov s ispolzovaniem mutagennyh faktorov. Trudy Inst. Mikr. Virusol. Kaz. AN, 16, 149.

DINQLE, J., REID, W. and SOLOMONS, G., 1953. The enzymic degradation of pectin and other poli- sacharides. J. Sci. Food Agric., 4, 149.

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Anschrift : Doz. Dr. habil. Z. ILCZUZ Institut fur Mikrobiologie der MCS-Universitat 20-033 Lublin, Polen