M. Rudert · F. Hirschmann · C. J. Wirth · Orthopädische Klinik,Medizinische Hochschule Hannover

Wachstumsverhaltenvon Chondrozytenauf unterschiedlichenTrägersubstanzen

Zusammenfassung

Chondrozyten lassen sich auf unterschiedli-chen dreidimensionalen Systemen kultivie-ren. Dieses System aus Trägermaterial, Zellenund extrazellulärer Matrix soll die Heilungvon lokalen Knorpeldefekten verbessern.Knorpelzellen wurden aus den Kniegelenkenvon erwachsenen Kaninchen sowie aus denMetakarpophalangealgelenken von Rinder-kälbern isoliert und in einer zweidimensio-nalen (2D-)Kultur vermehrt. Nach der Ver-mehrung der Zellzahl wurden die Chondro-zyten auf unterschiedliche biokompatibleMaterialien geimpft. Wir untersuchten 2 re-sorbierbare Vliese (ein Kompositvlies aus Po-lydioxanon und Polyglactin sowie ein Vliesaus Poly-L-Lactid) und lyophilisierte Dura alsvergleichbaren biologischen Träger. Auf allendrei Trägermaterialien konnte der Phänotypund die Morphologie von Chondrozyten inder Kultur erhalten werden. Die Produktionvon Glykosaminoglykanen lieû sich mit derAlzianblau-Färbung histologisch und mitAntikörpern gegen Chondroitin-4- und6-Sulfat immunhistochemisch nachweisen.Die Materialeigenschaften der Trägersub-stanzen erlauben die Transplantation derknorpelähnlichen Gewebeprodukte in tiefeKnorpeldefekte. Eine Verbesserung derschlechten intrinsischen Heilungskapazitätvon verletztem Knorpel ist durch diese Tech-niken damit denkbar. Bioartifizieller Knorpelwird in der Zukunft der Orthopädischen undder Plastischen Chirurgie sicher zunehmendeine Rolle spielen.

Schlüsselwörter

Knorpel · Chondrozyten · Tissue engineering ·Transplantation

Knorpelgewebe besitzt im Gegensatzzu den meisten anderen Geweben desmenschlichen Körpers kaum eine Po-tenz zur Reparation nach seiner Schädi-gung [14]. Im besonderen trifft dies fürden hyalinen Knorpel der Diarthrosenzu. Die komplexe Gewebeorganisationmuû hohen mechanischen Einwirkun-gen ein ganzes Leben lang standhalten.Fortschritte in der Gewebe- und Zell-kultivierung scheinen die Heilung vonKnorpelverletzungen in der Zukunft er-reichbar zu machen. Prinzipiell lassensich dabei unterschiedliche Wege be-schreiten:

w Die Produktion von Knorpel oderknorpelähnlichem Gewebe in vitrozur späteren Transplantation in einenGelenkflächendefekt (Abb. 1).

w Die Transplantation und Immobili-sierung von isolierten Chondrozytenin einen Gelenkflächendefekt, in demdie Zellen dann erst ihre knorpelspe-zifische Matrix in vivo produzierensollen (Abb. 2).

Die zuletzt genannte Technik wird be-reits klinisch in einigen wenigen Zen-tren angewandt. Die bisher von den In-auguratoren des Verfahrens veröffent-lichten klinischen Ergebnisse sind viel-versprechend [4], auf ihre kritischeBewertung wurde allerdings bereits hin-gewiesen [20].

Chondrozyten werden dem Patien-ten bei einer Arthroskopie entnommen,in vitro vermehrt und in einer Zellsus-pension unter einen auf den Knorpelde-fekt genähten Periostlappen gespritzt.Die wissenschaftliche Überprüfung des

Verfahrens im Tiermodell konnte keineVerbesserung der Defektheilung durchdie Verwendung von Chondrozyten ge-genüber der Anwendung von Periost-lappen allein nachweisen [3]. Die Indi-kation für diese Technik beschränktsich zusätzlich auf rein chondrale De-fekte, bei denen eine Verletzung dersubchondralen Grenzlamelle ausge-schlossen sein soll.

Ein weit gröûeres Potential sehenwir deshalb für die Verwendung von invitro hergestelltem knorpelartigem Ge-webe, dem bioartifiziellen Knorpel. DieDifferenzierung des Gewebes und somitauch seine Qualität kann in vitro beein-fluût werden, eine Matrixproduktionhat bereits stattgefunden. Zusätzlich istdie Behandlung von osteochondralenDefekten durchaus denkbar, da die Er-öffnung der subchondralen Zone nichtunbedingt einen negativen Effekt aufdas Regenerat haben muû [20]. Bevorein derartiges Therapiekonzept beimPatienten angewendet wird, muû seinePraktikabilität jedoch erst experimen-tell nachgewiesen werden. Bisher istnoch unklar, unter welchen Bedingun-gen ein optimales Ersatzgewebe herge-stellt werden kann. Dies betrifft nichtnur die Optimierung der verwendetenKulturbedingungen (Kulturmedien,pH-Wert, Temperatur, Sauerstoffpar-tialdruck), sondern auch die geeignetenTrägersubstanzen. Die räumliche An-

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Orthopäde1999 ´ 28: 68±75 � Springer-Verlag 1999 Zum Thema: Knorpelläsionen/Knorpelersatzoperationen

Dr. M. RudertOrthopädische Klinik,Medizinische Hochschule Hannover,Heimchenstraûe 1±7, D-30 625 Hannover

ordnung der Zellen ist notwendig, da siemit einer Differenzierung der Zellen engverknüpft ist. Erst eine Differenzierungder Zellen führt zur Produktion einerknorpelspezifischen Matrix. Chondro-zyten in einer Monolayerzellkultur ver-lieren ihre spezifischen Eigenschaften,charakterisiert durch ihre runde Zell-morphologie [25], ihre Fähigkeit Typ-II-Kollagen [11] sowie die gewebespezi-fischen Proteoglykane zu produzieren[19]. Verschiedene Materialien lasseneine dreidimensionale (3D-)Anordnungder Zellen zu und sind ebenso als Mate-rialien zur Anwendung im Gelenk denk-bar. Hierzu zählen Kollagengele [26], Fi-brinmatrix [13, 15], synthetische, resor-bierbare Polymervliese [24] und lyophi-lisierte Dura [7].

Um eine homogene Verteilung derZellen zu erreichen, ist eine gelartigeSubstanz von Vorteil. Im bezug auf diegeplante Transplantation und Fixierungder in vitro hergestellten bioartifiziellenProdukte in gröûere Defekte erscheintdie Verwendung von Vliesen oder feste-ren Substanzen sinnvoller. In der vorlie-genden Untersuchung wurde ein Ver-gleich der in vitro Kultur von Chondro-zyten auf resorbierbaren Polymervlie-sen und lyophilisierter Dura angestellt.

Material und Methoden

Biochemikalien und Lösungen wurden,soweit nicht anders erwähnt, von derFa. Gibco BRL, bezogen. Sämtliche Zell-kulturgefäûe sind von der Fa. Nunc,Marke Nunclon.

Die Experimente wurden mitDMEM durchgeführt. Folgende Zusätzesind in allen Medien enthalten: 2 mg/lGlutamin (100 ´ ); 0,1 ml/l nichtessenti-elle Aminosäuren (100 ´ ); 50 mg/l As-corbinsäure (Sigma); 1 ml/l Antibioti-ka-/Antimykotikalösung; 2,5 mg/l Am-photericin B (Seromed) und 50 mg/lGentamycin. Für die Zellkultivierungwurden dem Medium 10 % hitzeinakti-viertes fetales Kälberserum zugesetzt.Zum Verdauen der extrazellulären Ma-trix des Knorpelgewebes wird eine En-zymlösung, bestehend aus 0,1 mg/mlHyaluronidase (Sigma) und 2 mg/mlKollagenase P (Boehringer Mannheim)im Medium suspendiert, verwendet.Die Kultivierung der Zellen erfolgt bei37 �C und 5 % CO2 in wassergesättigterAtmosphäre (Cellstar Brutschrank, Se-rie 300, Nunc).

Der Knorpel wurde aus den Kniege-lenken von erwachsenen Kaninchen(New Zealand white rabbits) direktnach der Opferung der Tiere bzw. ausden Metakarpophalangealgelenken vonRinderkälbern (etwa 6 Monate alt) in-nerhalb von 24 h nach der Tierschlach-tung unter sterilen Bedingungen ent-

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M. Rudert · F. Hirschmann · C. J. Wirth

Growth of chondrocytes on differentbiomaterials

Summary

Chondrocytes can be cultured on differentthree-dimensional culture systems suitablefor transplantation to enhance the repair oflocalized cartilage defects. Articular cartilagechondrocytes from adult rabbit knees andfrom bovine calf metacarpophalangeal jointswere isolated by enzymatic digestion andcultured in a monolayer system to amplifycell count. After amplification the cells wereseeded on different biocompatible materials.We investigated two types of bioresorbablepolymer fleece matrices (a composite fleeceof polydioxanon and polyglactin and a re-sorbable poly-L-lactic acid fleece) and ly-ophilized dura as a biological carrier. On allthree types of transport media the pheno-typic and morphological appearance of cul-tured chondrocytes could be observed. Theproduction of glycosaminoglycans was re-vealed by Alcian blue staining and immuno-histochemical detection of Chondroitin-4and 6-sulfate in the created constructs. Thematerial properties of the carriers allow fortransplantation of the artificial cartilage-likeproducts into full thickness articular cartilagedefects and could therefore improve the mi-nor intrinsic healing capacity of cartilage tis-sue. Bioartificial cartilage may become a fu-ture perspective in the treatment options oforthopaedic and plastic surgery.

Key words

Cartilage · Chondrocytes · Tissue engineering· Transplantation

Orthopäde1999 ´ 28: 68±75 � Springer-Verlag 1999

1 2

Abb. 1 ! Schematische Darstellung der Therapie von Knorpeldefekten durch die Herstellung vonbioartifiziellem Knorpelgewebe in vitro. Hier am Beispiel der Verwendung eines Vlieses als Träger-material in der 3D-Kultur

Abb. 2 ! Schematische Darstellung der Therapie von Knorpeldefekten durch die Verwendung von invitro vermehrten Zellen. Eine Matrixproduktion hat hier noch nicht stattgefunden. Die Zellen werdenin den mit einem Periostlappen abgedeckten Defekt injiziert

nommen, gewaschen und 12±16 h beidoppelter Konzentration von Antibioti-ka und Antimykotika kultiviert.

Nach dem Waschen und Zerklei-nern erfolgt der enzymatische Verdau

(12±16 h). Die Kulturgefäûe werden mitMagnetrührstäbchen bei etwa 80 Um-drehungen pro Minute (Upm) durch-mischt (Variomag Compact, Vario-mag). Die Zellsuspension wird durch

40 und 100 mm Nylonsiebe (Falcon) fil-triert. Als Vor-, Zwischen- und Nach-schritt erfolgt eine Zentrifugation(EBA 12, Hettich) bei 250 g für 10 min.Die Konzentration an vitalen Zellenwird mittels einer Trypanblaufärbung[50 ml Zellsuspension in 450 ml Färbelö-sung; 0,5 % Trypanblau (Sigma), 0,9 %Natriumchlorid] bestimmt. Anschlie-ûend werden die Zellen in 25- (Kanin-chenchondrozyten) bzw. 80-cm2-Kul-turflaschen (Rinderchondrozyten) biszur Konfluenz inkubiert. Danach wer-den sie in Suspension gebracht (Tryp-sin-EDTA, einmal), zentrifugiert unddie Konzentration an vitalen Zellen be-stimmt.

Mit dieser Zellsuspension werdendie verschiedenen Trägermaterialienbeimpft. Als resorbierbare Vliese wer-den ein Kompositvlies aus Polydioxa-non und Polyglactin [ETHISORB 210(Ethicon, Norderstedt), Abb. 3a] sowieein Polylactidvlies [PLLA V19±1 (Insti-tut für Textil- und Verfahrenstechnik,Denkendorf), Abb. 3b] verwendet. Alsnatürliches Vergleichsmaterial wirdlyophilisierte Dura (Lyodura, B.Braun-Dexon, Spangenberg, Abb. 3 c)eingesetzt.

Die Materialien werden in 3 ´3-mm-Stücke geschnitten und 2 h in Mi-krotiterplatten mit Medium im Brut-schrank vorinkubiert. Die beiden Dura-blätter lassen sich danach gut trennen.Die nach innen gewandten Flächen wei-sen eine aufgelockerte, geflechtartigeStruktur auf. Diese ähnelt der der resor-bierbaren Vliese. Das Anfangsvolumen(Zellsuspension und Medium) liegt bei100 ml. Nach 2 Tagen wird auf 200 mlaufgefüllt. Alle 2±3 Tage erfolgt ein Me-diumwechsel. Nach dem 1. Medium-wechsel wird mit 300 ml Kulturmediumgearbeitet. Während der Kultivierungerfolgt eine regelmäûige, mikroskopi-sche Beurteilung der Kulturen (Axiovert25, Carl Zeiss Jena).

Zur Bestimmung des Naûgewichteswerden die Vliese 2 h im Brutschrankinkubiert. Sowohl das Naûgewicht alsauch das Trockengewicht wird mit einerPräzisionswaage (BP 211D-OCE, Sarto-rius) gemessen. Sterile Arbeiten werdenmit sterilisierten 1,5-ml-Reaktionsgefä-ûen (Greiner) durchgeführt. Das Aus-messen der Vliese erfolgt mit einen ste-rilisierten Lineal.

Vor der Zellzahlbestimmung wer-den die knorpelartigen Gewebe enzy-

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Zum Thema: Knorpelläsionen/Knorpelersatzoperationen

a

b

c

Abb. 3 a±c ~ Rasterelektronenmikroskopische Darstellung der verwendeten Trägermateriali-en. a Resorbierbares Polymervlies aus Polydioxanon und Polyglactin (Ethisorb). Vergr. 50:1(Balken = 1 mm); b Resorbierbares Polymervlies aus PLLA (PLLA V19±1). Vergr. 50:1(Balken = 1 mm); c Lyophilisierte Dura in der Schrägansicht. Die unterschiedliche Orientierung derbeiden Durablätter ist in der rechten Bildhälfte im Anschnitt gut zu erkennen. Vergr. 120:1(Balken = 0,1 mm)

matisch verdaut (Enzymlösung sieheoben, 12±16 h, 37 �C). Der Verdau wirddurch Zugabe von 0,5 ml Kristallviolett-lösung [2,1 % Zitronensäuremonohy-drat (Fluka), 0,05 % Kristallviolett(Fluka), 0,2 % Triton X-100 (Fluka)] ge-stoppt. Eine Durchmischung erfolgtmittels Pipette und 2 min bei 1400Upm (Minishaker, IKA). Zur Kontrollewerden die Vliesreste in 0,5 ml Kristall-violettlösung überführt und der glei-chen Durchmischungsprozedur wieoben ausgesetzt. Die Zellkerne werdenin einer Zählkammer (Fuchs-Rosen-thal) bei einer 200 fachen Vergröûerungausgezählt.

Die Vorbereitung der Konstruktezur rasterelektronenmikroskopischenUntersuchung erfolgte wie bereits be-schrieben [21]. Für die immunhistoche-mischen Nachweise werden 8- bis12-mm-Gefrierschnitte hergestellt. Fürdie histologische Untersuchung werdendie Konstrukte in 4 % Paraformaldehydfixiert und in Paraffin eingebettet;5-mm-Schnitte werden mit Mayers Hä-matoxilin-Eosinlösung (H & E), Tolui-

dinblau- und Alzianblaulösung (pH1,0) gefärbt, um sulfatierte Glycosami-noglycane nachzuweisen.

Chondroitin-4-Sulfat und Chon-droitin-6-Sulfat-Antikörper (Chemi-con, Temecula, USA) werden für die im-munhistochemischen Nachweise ver-wendet. Dazu werden die Kryostat-schnitte in gepufferter PBS-Lösunggewaschen (PBS, pH 7,2±7,4). Nach derInkubation mit dem Antikörper (Ver-dünnung 1:20, 45 min bei Raumtempe-ratur in einer feuchten Kammer) wer-den die Schnitte dreimal in PBS-Puffergewaschen für 30 min mit Fluoreszin-Isothiozyanat (FITC)-konjugiertemAnti-Maus-IgG-Antikörper inkubiert(1:30, in Humanserum verdünnt 1:20),erneut gespült und mit PBS/Glyzerin(9:1) eingedeckelt. Schnitte, die nur mitdem FITC-konjugierten Antikörper in-kubiert wurden dienten als Kontrolle,um Artefakte und eine unspezifischeBindung des Antikörpers auszuschlie-ûen. Zum Vergleich der Anfärbungdurch Chondroitin-4/6-Sulfat wurdenimmunhistochemische Untersuchun-

gen ebenfalls an artikulärem Knorpeldurchgeführt.

Ergebnisse

Die In-vitro-Kultivierung von Chon-drozyten in 3D-Systemen erfordert eineCharakterisierung der Trägersubstan-zen. Eine der wichtigsten Parameter,insbesondere als Bezugsgröûe, stelltdas Naûgewicht dar. Mittels Eichkurven(Abb. 4) sind Abschätzungen des Naû-gewichts durch eine Bestimmung desTrockengewichts bzw. der räumlichenAusmaûe der Trägersubstanzen mög-lich. Die letztere Methode kann sowohldirekt durch Ausmessen der Vliese alsauch indirekt über eine fotographischeDokumentation realisiert werden. DieErgebnisse basierend auf Fotographiensind genauer (nicht abgebildet).

Mittels linearer Näherung könnendie Graphen in Abb. 4 beschrieben wer-den. Folgende Gleichungen drückendies aus:

w für lyophilisierte Dura:Trockengewicht =390 ´ Volumen + 0,25Naûgewicht = 2252 ´ Volumen + 2

w für PLLA:Trockengewicht =127 ´ Volumen±0,34Naûgewicht = 1595 ´ Volumen ±4,79

w für Ethisorb 210:Trockengewicht =153 ´ Volumen + 0,3Naûgewicht = 1222 ´ Volumen + 4,94

Diese Funktionen sind nur für den an-gegebenen Geltungsbereich (Abb. 4)nachgewiesen. Der Wert für das Volu-men wird in cm3 eingesetzt.

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Abb. 4 a±c ~ Bestimmung des Naû- und Trockengewichtes der verwendeten Trägermaterialien:a für Ethisorb; b für PLLA; c für Dura

a b

c

Die Charakterisierung der einzel-nen Durablätter erweist sich als schwie-rig, da die Trennung in 2 gleiche Teilenicht möglich ist. Eine Volumenbestim-mung wurde daher nur an der intaktenDura vorgenommen. Die zur Besiede-lung durch Zellen zur Verfügung ste-hende Querschnittsfläche ist bei beidenBlättern gleich und stimmt mit der derungeteilten Dura überein. Die Dickeder drei unterschiedlichen Trägermate-rialien wird als konstant angenommen.

Die mit Hilfe der Kristallviolettlö-sung jeweils bestimmte Zellkonzentra-tionen bezieht sich auf ein Kulturgefäû.Beim Verdau der in vitro gebildeten ex-trazellulären Matrix wird die Duraebenfalls verdaut. Die synthetischenTrägermaterialien wurden nicht durchdie Enzyme abgebaut. Nach der Fär-bung und Durchmischung konntenBrüche in den Polymerfasern beimEthisorb beobachtet werden. KleineBruchstücke können als Zellkerne ange-sehen werden und damit die Zellzahlverfälschen.

Bei Startzellkonzentrationen über105 Zellen pro Kulturgefäû wurden star-ke Verknorpelungen und Zellpelletbil-dung beobachtet. Eine Möglichkeitdem entgegen zu wirken, ist die Verkür-zung der Kulturdauer.

Die Abb. 5 zeigt ein 2D- bzw. 3D-Kultursystem mit PLLA als Trägersub-stanz. Eine Charakterisierung der gebil-deten extrazellulären Matrix wäre zu-sätzlich notwendig, um die beiden Kul-tursysteme genauer vergleichen zu kön-nen. Während der ersten 3 Wochentreten keine groûen Unterschiede in derZellzahl auf. PLLA zeigte keine nach-

weisbaren Abbauerscheinungen wäh-rend der 3wöchigen Kultivierung sowieder anschlieûenden Aufarbeitung. Zu-sammen mit der langsamen Adsorptionvon Kristallviolett sind das Eigenschaf-ten, die diese Trägersubstanz für Vor-versuche besonders geeignet erscheinenlassen. Die Auswertung der Zellzahl imKultursystem in Kombination mit derjeweiligen Trägersubstanz lieû keinedeutlichen Unterschiede erkennen(Abb. 6).

Bei der makroskopischen Beurtei-lung der Zell-Transportmedien-Kon-strukte wiesen die resorbierbaren Vlie-se (Ethisorb und PLLA) mit den kulti-vierten Zellen eine knorpelähnliche,wenngleich noch weichere Struktur auf.Die grobe Materialbeschaffenheit derlyophilisierten Dura war durch die dar-auf kultivierten Zellen nicht wesentlichgeändert. Insgesamt konnten keine ne-gativen Effekte der Transportmedienauf die verwendeten Chondrozyten be-obachtet werden. Rasterelektronenmi-kroskopisch lieû sich nachweisen, daûdie Zellen ihre runde, chondrozytenar-tige Form behalten. Auf der lyophilisier-ten Dura kam es zu einer engen Verbin-dung der Zellen mit der Oberfläche desTrägermaterials. Die Integration derproduzierten Matrix in die oberflächli-chen Schichten des Gewebes lieû sichgut erkennen. Eine gleichmäûige Vertei-lung des Zell-Matrix-Verbunds über diegesamte Oberfläche der Dura wurde je-doch nicht erreicht. Entsprechend lieûsich bei der lyophilisierten Dura auchkein Nachweis von Chondroitin-4- oder6-Sulfat über die gesamte Oberfläche,sondern nur in Teilbereichen immunhi-

stochemisch erbringen. Im Gegensatzdazu lieû sich die Verteilung der Glycos-aminoglycane in den resorbierbarenVliesen als durchaus homogen be-schreiben (Abb. 7). Diese Beobachtungkonnte in den histologischen Untersu-chungen mit Safranin-O und Alzianblaubestätigt werden (Abb. 8).

Diskussion

Die Produktion von bioartifiziellemKnorpel hat sowohl für die Orthopädieund Traumatologie als auch für die Pla-stische Chirurgie weite potentielle An-wendungsgebiete. In Verbindung mitbiokompatiblen Trägersubstanzen kön-nen dreidimensionale Zell-Material-Konstrukte mit knorpelähnlichen Ei-genschaften hergestellt werden [1, 5, 8,10, 21, 22, 24]. Bei der Verwendung die-ser Konstrukte zur Therapie von osteo-chondralen Defekten im Tierversuchlieû sich eine Verbesserung der Heilungim Vergleich zum natürlichen Verlaufder körpereigenen Reparation beobach-ten. Die Ergebnisse erbrachten jedochkeine Heilung des Defektes ohne Resi-duum. Der Vergleich solcher Studien istaus verschiedenen Gründen problema-tisch. Neben unterschiedlichen Kultur-bedingungen werden unterschiedlicheMaterialien als Trägersubstanzen ver-wendet. Unterschiedliche Defektgröûenund -lokalisationen erschweren zusätz-lich die Beurteilung. Uns erscheint des-halb der Vergleich von verschiedenenMaterialien notwendig.

Für die Planung eines Zell-Materi-al-Konstrukts mit entsprechenden Ei-genschaften für die Deckung von osteo-chondralen Defekten unterschiedlicherGröûe ist es wichtig, eine Korrelationzwischen den verwendeten Materialienund deren Einfluû auf das Wachstum

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Zum Thema: Knorpelläsionen/Knorpelersatzoperationen

a b

Abb. 5 a,b ~ Einfluû der Anfangskonzentration auf die Zellproliferation im a 2D-System;b 3D-System (Trägermaterial PLLA)

der verwendeten Zellen herzustellen.Wir haben deshalb Eichkurven erstellt,die eine Bestimmung des Naûgewichtsaufgrund der Ausmaûe der Trägermate-rialien erlauben. Diese Funktion läûtsich mathematisch in Form einer linea-ren Näherung beschreiben. Die Abwei-chungen der erstellten Gleichungen vonder Idealfunktion y = ax können ihreUrsache in Materialinhomogenitäten,Meûfehlern bzw. beim Naûgewicht, inder eingeschränkter Korrelationsmög-lichkeit der Flüssigkeitsaufnahme mitden äuûeren Abmaûen des Vlieses ha-ben.

Ein weiteres Problem stellt die ge-naue Bestimmung der Zellzahl auf dendreidimensionalen Trägersubstanzendar. Eine optische Bestimmung durcheinfache Zellzählung ist wegen der sichüberlagernden Strukturen nicht mög-lich. Um trotzdem eine Vorstellungüber die Zellzahl pro Vlies oder Dura-scheibe zu erhalten, war die vollständigeAblösung der Zellen bzw. Verdauungdes Trägermaterials notwendig. Bei derZählung der Zellkerne mit der Kristall-violettlösung handelt es sich um eine in-

direkte Methode zur Zellzahlbestim-mung. Soweit noch keine Desintegrati-on des Zellkerns bei toten Zellen stattge-funden hat, werden diese mitgezählt.Die Hinzugabe des Detergenz Triton-X-100 wirkt sich zudem positiv auf dieAuflösung von Zellpellets aus. Ein Ver-gleich der 3 Trägermaterialien bezüglichder Zellzahl (Abb. 6) erbrachte keine

eindeutige Klärung, welches Vlies dasgeeignetste Material zur Chondrozyten-kultivierung ist.

Eine Vielzahl von Einfluûfaktorenkönnte die Ursache hierfür sein. So füh-ren Zellpellets im Inocculum zu Abwei-chungen von der theoretischen Start-zellkonzentration. Zellpellets führenebenfalls zur verstärkten Verknorpe-lung. Dies könnte zu einen unvollstän-digen Verdau der extrazellulären Matrixführen. Zellkernpellets wären die Folge.In den Versuchen konnte nachgewiesenwerden, daû mit 40.000 Zellen/Kultur-system eine ausreichende Anfangskon-zentration zur Verfügung steht, umnach 3 Wochen eine konstante Endzell-konzentration zu erreichen. Eine höhe-re Startzellkonzentration führt nicht zueiner wesentlichen Steigerung der Zell-zahl pro Kultursystem nach der angege-benen Zeitdauer. Ob dies auch für eineausreichende Matrixproduktion zu-trifft, muû noch untersucht werden.

Der Orthopäde 1´99 73

Abb. 6 a±c ~ Einfluû der Trägermaterialien und der Anfangskonzentration auf dieZellproliferation im 3D-Kultursystem. Trägermaterial: a Ethisorb 210, b PLLA, c Dura

a b

c

Abb. 7 ~ Immunhistochemischer Nachweis von Chondroitin-6-Sulfat [Kaninchenchondrozytenin der In-vitro-Kultur 3 Wochen auf Ethisorb als Trägermaterial (Vergr. 300:1)]

Die spezifische Zellkonzentration(Zellzahl im Vlies/Naûgewicht) zeigtestarke Schwankungen im Kurvenverlauf(nicht dargestellt). Eine Optimierungder Kultursysteme mit einer homoge-nen Verteilung der Zellen pro Vlies soll-te deshalb erreicht werden. Der Durch-messer der Kulturgefäûe beträgt etwa0,65 cm während die Vliese etwa 0,3 cmbemessen. Geringe Turbulenzen in derflüssigen Phase des Kultursystems füh-ren zu Vliesbewegungen. Während derInocculation bzw. der ersten Medienzu-gabe kann es zum Aufwirbeln der Vlieseund Wegspülen der Zellen kommen.Vliesscheiben mit etwas geringerenDurchmesser als die Kulturgefäûe wür-den dies minimieren. Gröûere Gefäûewürden gröûere Vliese bedingen, dieein höheres Gewicht hätten und damitden Einfluû der Flüssigkeitsbewegungauf die Vliese herabsetzen würden. Ins-gesamt stellt das homogene Beimpfender Trägersubstanzen und der Verbleibder Zellen auf ihnen bei kleinen Kultur-systemen ein Problem dar.

Um die Qualität des entstandenenGewebes zu beurteilen eignet sich derNachweis von knorpelspezifischer Ma-trix. Neben der dargestellten Produkti-on von Proteoglykanen ist ein guter In-dikator für die Entwicklung von Knor-pelgewebe der Gehalt an Typ-II-Kolla-gen. Bei der körpereigenen Reparationeines osteochondralen Defekts entstehtFaserknorpel, der fast die gleiche Mengean Typ-I-Kollagen wie an Typ-II-Kolla-gen besitzt [9]. Der Nachweis von Typ-II-Kollagen alleine, wie er häufig ange-

führt wird, hat deshalb nur eine einge-schränkte Bedeutung zur Beurteilungder Qualität des Gewebes.

Schlieûlich bleibt neben seinerbiochemischen Zusammensetzung die3D-Architektur des Knorpels mit sei-nen unterschiedlichen Zonen ein weite-res Problem beim Knorpelersatz [20].Knorpel ist als Bestandteil der Stützge-webe von seiner mechanischen Bean-spruchung abhängig. Dies kann mansich zunutze machen, wenn man be-reits in vitro eine Anpassung des sichentwickelnden Knorpels an seine Funk-tion durch mechanische Belastung er-reicht. Beispiele hierfür sind die Nut-zung von Scherkräften durch Strömung[17], zyklische Belastung und Redukti-on des Sauerstoffpartialdruckes [12]oder die intermittierende zyklische Be-lastung der Chondrozyten [2, 16, 23].Eine weitere Möglichkeit der Einfluû-nahme, die zu ähnlichen Effekten führt,ist durch die Verwendung von Zytoki-nen denkbar [6, 18]. Auch hier ergebensich interessante Aspekte bezüglichder richtigen Konzentration der Sub-stanzen, Applikationsform, Proteinbin-dung, Antagonisierung durch andereSubstanzen und Anwendungsdauer.Eine Überprüfung der bioartifiziellenKnorpelkonstrukte im Tierversuchscheint gerade deshalb unumgänglich,bevor eine Anwendung im klinischenBereich denkbar ist.

Wir danken Frau Andrea Kofink für ihre tat-kräftige Unterstützung. Die Untersuchungenwurden von der Deutschen Forschungsge-meinschaft (DFG Wi 494/14±1) und derDeutschen Arthrosehilfe gefördert.

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74 Der Orthopäde 1´99

Zum Thema: Knorpelläsionen/Knorpelersatzoperationen

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E. Deutsch, H.-D. Lippert

Ethik-Kommission und klinischePrüfung. Vom Prüfplan zum Prüfvertrag

Berlin, Heidelberg, New York: Springer, 1998. 140 S.,(ISBN 3-540-64244-7), brosch., Vertrag auf Diskette,DM 49,90

Die Autoren geben indem vorgelegten Bandeine klare und über-sichtliche Beschrei-bung der Entwicklung,Struktur und Funkti-onsweise der Ethik-Kommissionen inDeutschland.

Dieses hand-liche Buch kannallen Mitgliedernvon Ethik-Kommis-sionen und allen,die an der Arbeit dieserKommissionen interessiert sind, in hohem Maûeempfohlen werden: Es gibt eine Übersicht über dieRechtsgrundlagen, die Aufgaben und die Funktionender Ethik-Kommissionen wie sie sich heute nachFestlegung der wichtigsten Rechtsgrundlagen dar-stellen und in unserem Land eingespielt haben, bzw.sich einzuspielen im Begriffe sind. Die Darlegungenstellen juristische Aspekte ganz in den Vordergrund.Dies ist auch für das Verständnis der Grundlagen,ebenso wie für dasjenige der praktischen Arbeit die-ser Kommissionen von groûer Bedeutung und mag inder Vergangenheit etwas unterschätzt worden sein.Die Autoren beschreiben auch den derzeitigen Standdes Vorgehens bei multizentrischen und multinatio-nalen Studien. Auf diesem Gebiet besteht zur Zeitnoch eine anhaltende Diskussion um die Zuständig-keit örtlicher Ethik-Kommissionen, wie um dierechtlichen Grundlagen bei multinationalen Projek-ten. Erfreulicher- und vernünftigerweise machen dieAutoren deutlich, daû eine örtliche Prüfung einesTeilprojektes im Rahmen multizentrischer Studienunentbehrlich ist und bleiben wird.

Von besonderem Nutzen sind die in dem Buchvorgelegten Entwürfe für ein Antragsformular,Schluûberichte, Statuten von Ethik-Kommissionenund einen Prüfvertrag. Das Buch wird sehr vorteilhaftergänzt durch Auszüge aus den entsprechenden Ge-setzen und Rechtsvorschriften unter Einschluû derRichtlinien des Europäischen Parlaments über dieAnwendung der ¹Guten klinischen Praxisª bei klini-schen Prüfungen.

Der Rezensent begrüût es besonders, daû dieAutoren die Notwendigkeit zur Zusammenarbeit derEthik-Kommissionen in Deutschland betonen. Nurhierdurch können übereinstimmende Verfahrens-weisen und eine wirksame und reibungslose Ab-wicklung von groûen multizentrischen und multina-tionalen Studien erreicht werden, die ja heute dieGrundlage für die Entwicklung neuer Pharmaka undMethoden in der Medizin darstellen.

H. Just (Freiburg)

R. Braunschweig, S. Kruft, M. Herrmann

Atlas der SchnittbilddiagnostikHand und Unterarm

München, Wien, Baltimore: Urban & Schwarzenberg,1998. 368 S., 773 Abb., (ISBN 3-541-15991-X), geb.,DM 398,±

Die Zielsetzung des Buches, moderne radiologischeSchnittbildverfahren anatomischen Präparaten undZeichnungen direkt gegenüber zu stellen, um Klini-kern die Topographie der Hart- und Weichteilgewebeam Unterarm und der Hand zu verdeutlichen, ist lo-benswert und wird alle operativ tätigen Kollegenverschiedenster Fachrichtungen positiv ansprechen.

Dem speziellen Teil sind grundsätzliche Be-merkungen zu den modernen Schnittbildverfahrenselbst, dem Stellenwert dieser Verfahren im Rahmender Handchirurgie, Ausführungen zu gutachterlichenund forensischen Fragen sowie eine umfassendeDarstellung der anatomischen Verhältnisse dieserbeiden Regionen vorangestellt.

Der spezielle Teil des Buches umfaût 300 an-sprechend gestaltete Seiten. Hand und Unterarmwerden systematisch in Schnittebenen zerlegt, wo-bei besonderes Gewicht auf die Kernspintomogra-phie gelegt wird. Da alle Doppelseiten systematischdurchstrukturiert wurden, ergibt sich für den Lesereine einprägsame Übersichtlichkeit.

Bei der insgesamt sehr aufwendigen und ge-lungenen Aufmachung des Buches bleibt lediglich zubemängeln, daû vereinzelt CT- und MRT-Abbildun-gen unscharf erscheinen und nicht immer der dar-gestellte klinische Befund in seiner Pathologie über-zeugt.

Das Buch ist operativen Kollegen aus Chirurgie,Handchirurgie und Orthopädie ebenso zu empfehlenwie dem radiologischen Diagnostiker, dem die ana-tomischen Präparate bei der Auswertung seinerSchnittbildverfahren äuûerst hilfreich sein werden.

L. Kinzl (Ulm)

Der Orthopäde 1´99 75

Buchbesprechungen