Grundlagen der ImmunologieGrundlagen der Immunologie

Inge Vonnieda 22

Geschichtliche EntwicklungGeschichtliche Entwicklung• Antike: Überstandene Pesterkrankung schützt vor Pest• Mittelalter: … für Pocken gilt das gleiche

– Erste Immunisierungsversuche mit Eiter aus Pocken brachten nicht den gewünschten Erfolg.

– 1798: Edward Jenner erkennt, dass überstandene Kuhpocken vor „echten“ Pocken schützen. => erste erfolgreiche „Impfung“

• 1889: Louis Pasteur entdeckt die Entstehung avirulenter Bakterienstämme.

– Impfungen mit abgeschwächten Erregern gegen Tollwut, Milzbrand (Vakzination)

• Ende 19. Jahrhundert: – Entdeckung der Antikörper (humorale Immunität)– Entdeckung beweglicher Zellen, die Fremdkörper beseitigen (zelluläre

Immunität)• 20. Jahrhundert:

– Struktur und Wirkungsweise der Antikörper– Komplementsystem ………....

Inge Vonnieda 33

Angeborene ImmunitätAngeborene Immunität• Unspezifische Immunität

– Granulozyten, Monozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, NK-Zellen (Leukozyten) erkennen Mikroorganismen, phagozytieren und zerstören sie.

– Komplement (ca. 20 Proteine) kann auf verschiedenen Wegen aktiviert werden. Dies führt zur Markierung oder Lyse der Zelle.

Inge Vonnieda 44

GranulozytenGranulozyten• Neutrophile: Phagozytose in intrazelluläre

Vesikel, Abtötung der Erreger durch Sekretion von Sauerstoffradikalen u.a. toxische Substanzen

• Eosinophile: Abwehr von Parasiten durch toxische Substanzen, Beteiligung bei Allergien

• Basophile: Sekretion von Histamin, Heparin und Serotonin und Zytokinen nach Aktivierung - Anlocken weiterer Leukozyten, Entzündngsreaktion

Inge Vonnieda 55

Makrophagen, NK-ZellenMakrophagen, NK-Zellen• Makrophagen, Dendritische Zellen

– Phagozytose und Zerlegung der aufgenommene Substanzen in kleine Proteine (Antigene)

– Einwanderung in das Lymphsystem und die Lymphknoten

– Präsentation der Antigene über MHC-Moleküle – Induktion der spezifischen Immunantwort

• NK-Zellen– Spezielle Lymphozyten, die durch direkte Zell-

zu-Zell-Interaktion Tumorzellen und virusinfizierte Zellen abtöten

Inge Vonnieda 66

KomplementsystemKomplementsystem

• Aktivierung– Klassischer Weg: Antigen-Antikörper-

Komplexe– MB-Lektin-Weg: mannanbindendes

Lektin (normaler Bestandteil im Serum) bindet an eingekapselte Bakterien

– Alternativer Weg: direkte Aktivierung an Oberflächen von Mikroorganismen

Inge Vonnieda 77

KomplementsystemKomplementsystem

Inge Vonnieda 88

Komplement - AktivierungKomplement - Aktivierung

Inge Vonnieda 99

Komplement – terminale LyseKomplement – terminale Lyse

Inge Vonnieda 1010

Komplement – SpaltprodukteKomplement – Spaltprodukte• Spaltprodukte wirken als Anaphylatoxine

Inge Vonnieda 1111

Erworbene ImmunitätErworbene Immunität• Spezifische Immunität

– Lymphozyten• B-Lymphozyten (Antikörperproduktion)• T-Lymphozyten (Zytokinproduktion)

– Kontrolle der Antikörperproduktion– Immunität gegen virusbefallene Zellen – Regulierung der Immunantwort– Interaktion mit Phagozyten

– Phagozyten (Monozyten, Makrophagen)• Phagozytose von „Eindringlingen“ und Präsentation

der Antigene– Antikörper

Inge Vonnieda 1212

Lymphatische OrganeLymphatische Organe• Primäre lymphatische

Organe– Knochenmark– Thymus

• Sekundäre lymphatische Organe– Lymphknoten– Milz– Knochenmark

Inge Vonnieda 1313

Primäre lymphatische OrganePrimäre lymphatische Organe

• Knochenmark– Aus Stammzellen entwickeln sich

Vorläuferzellen der Lymphozyten– Reifung und Prägung der B-Lymphozyten

(lebenslang)• Thymus

– Aus dem Knochenmark eingewanderte Vorläuferzellen entwickeln sich zu unreifen T-Lymphozyten

– Reifung und Prägung der T-Lymphozyten, Absterben autoaggressiver Lymphozyten (vor allem bis zur Pubertät, danach abnehmend)

Inge Vonnieda 1414

Sekundäre lymphatische OrganeSekundäre lymphatische Organe

• B-Lymphozyten– Kontakt mit Antigen– Produktion von Antikörpern– Gedächtniszellen

• T-Lymphozyten– Nach Antigenkontakt Produktion von

Zytokinen zur Unterstützung der B-Zell-Proliferation

Inge Vonnieda 1515

Sekundäre lymphatische OrganeSekundäre lymphatische Organe

Inge Vonnieda 1616

AntikörperAntikörper

• Proteine der γ-Globulinfraktion => Immunglobuline (Ig)

• Mindestens zwei spezifische Bindungsstellen für Antigene

• 5 Antikörperklassen (IgG, IgM, IgA, IgE, IgD)

• Bildung durch B-Lymphozyten bzw. Plasmazellen

Inge Vonnieda 1717

Grundstruktur der AntikörperGrundstruktur der Antikörper• Zwei identische schwere

Ketten (H)• Zwei identische leichte Ketten

(L)• Disulfidbrücken, die für die

Entstehung von Peptidschleifen (Domänen) verantwortlich sind

• Konstante Domänen• Variable Domänen (=

Antigenbindungsstelle)• Hinge-Region (nicht bei jeder

Immunglobulinklasse)• Komplementbindungsstellen

(nicht überall)

Konstant

Fc-Teil

Variabel

Fab-Teil

Hinge-Region

Inge Vonnieda 1818

Struktur der AntikörperStruktur der Antikörper• Schwere Ketten (Anzahl konstanter

Domänen)– IgG: γ-Kette (3)– IgM: μ-Kette (4)– IgA: α-Kette (3)– IgE: ε-Kette (4)– IgD: δ-Kette (3)

• Leichte Ketten– κ-Kette– λ -Kette

Inge Vonnieda 1919

Immunglobulinklassen – IgG Immunglobulinklassen – IgG • 80 % aller Immunglobuline• 8 – 18 g/l im Serum, die gleiche Menge im extravasalen

Raum• 4 Subklassen (IgG1 – 4)• Komplementbindungsstelle am CH2 bei IgG1, 2, 3• Bindung an die Fc-Rezeptoren der Makrophagen (IgG1, 3)• Erscheint bei einer primären Immunreaktion nach einigen

Tagen

IgG1: 65 – 70% IgG2: 20 – 28% IgG3: 4 – 8% IgG4: 2 – 4%

Inge Vonnieda 2020

Immunglobulinklassen – IgM Immunglobulinklassen – IgM • Pentamer aus 5

Untereinheiten (manchmal auch Hexamer)

• 4 konstante Domänen• J-Kette (joining), die für die

Bildung des Pentamers zuständig ist. (ohne J-Kette entstehen Hexamere)

• Komplementbindungsstelle • Zuerst produziertes

Immunglobulin nach Antigenkontakt

Inge Vonnieda 2121

Immunglobulinklassen – IgA Immunglobulinklassen – IgA • Dimer oder Monomer• J-Kette bei Dimeren• Sekretorische Komponente, die erst sekundär an

das dimere Molekül bindet und in Sekreten den Transport begünstigt und vor Proteolyse schützt.

• Zwei Subklassen: IgA1(Serum) und IgA2 (Sekret)

Sekretorische Komponente

Inge Vonnieda 2222

Immunglobulinklassen – IgD Immunglobulinklassen – IgD • Im Serum nur in Spuren vorhanden (< 1%)• Rezeptormolekül auf nicht aktivierten B-

Lymphozyten• Funktion unbekannt

Inge Vonnieda 2323

Immunglobulinklassen – IgE Immunglobulinklassen – IgE • Monomer mit 4 konstanten

Domänen• Im Plasma nur in geringer

Konzentration • Bindung mit dem Fc-Teil an

Rezeptoren von basophilen Granulozyten und Mastzellen

• Bei Allergikern erhöhte IgE-Spiegel

Inge Vonnieda 2424

Entstehung der DiversitätEntstehung der Diversität• Ein Gen – ein Antikörper?

– Sehr viele Gene notwendig (mehr als im Genom vorhanden sind) (108 – 109 verschiedene AK)

• Große Teile der AK-Moleküle sind in einer Klasse konstant– Zusammensetzen des Moleküls aus verschiedenen

Genabschnitten ???– Zusammenfügen des Gens im Laufe der Reifung der

antikörperproduzierenden B-Lymphozyten !!!

Inge Vonnieda 2525

Entstehung der DiversitätEntstehung der Diversität• Beispiel: Leichte Kette (Maus)

– Während der Reifung werden aus der Keimbahn-DNA V- und J-Segment gekoppelt. C- und L-Segment bleiben noch abgetrennt.

– Bildung langer m-RNA und Ausspleißen der nicht benötigten Teile

– Abtrennung von L und Translation (Proteinbildung)

Inge Vonnieda 2626

Entstehung der DiversitätEntstehung der Diversität• Kombinationsmöglichkeiten beim Mensch

(H-Kette, Chromosom 14)– Ca. 50 V-Gene (AA 1 – 95)– Ca. 10 – 30 D-Gene (AA 96 – 101)– 6 J-Gene (AA 102 – 110)– 9 C-Gene für den konstanten Teil (μ, γ1, γ2, γ3,

γ4, ε, δ, α1, α2)– L-Gene (leader) vor jedem V-Segment– Zusätzliche Variabilität durch Punktmutation

vor allem der V-Gene

Inge Vonnieda 2727

Entstehung der DiversitätEntstehung der Diversität• Kombinationsmöglichkeiten beim Mensch

(κ-Kette, Chromosom 2)– Ca. 35 - 40 V-Gene (AA 1 – 95)– 5 J-Gene (AA 96 – 110)– Cκ-Gen für den konstanten Teil – Zusätzliche Variabilität durch Punktmutation

• Kombinationsmöglichkeiten beim Mensch (λ-Kette, Chromosom 22)– Verschiedene V-Gene– J-Gene liegen direkt vor den C-Genen– Mehrere Gene für den konstanten Teil – Zusätzliche Variabilität durch Punktmutation

Inge Vonnieda 2828

Klassen-SwitchKlassen-Switch• Reifende B-Lymphozyten produzieren zuerst IgM,

später IgG– S-(switch)-Sequenzen steuern die Umlagerung der C-

Gene der mRNA– Antigenbindungsstelle (variable Region) bleibt beim

Klassen-Switch erhalten

Inge Vonnieda 2929

AntigenbindungsstelleAntigenbindungsstelle• Bestimmt die Spezifität• Zusammengesetzt aus den variablen

Regionen der H- und L-Ketten• Hypervariable Regionen bei: (CDR =

komplementaritäts determinierende Regionen)– Leichtkette:

• AA 26 – 32• AA 49 – 55• AA 90 – 95

– Schwere Kette• AA 30 – 35• AA 49 – 64• AA 95 - 101

Inge Vonnieda 3030

Antigen Antigen (aus http://de.wikipedia.org/wiki/Antigen)

• Antigene (kurz für Antisomatogene) sind Moleküle, die vom Immunsystem bekämpft werden, weil sie vom Körper als körperfremd erkannt werden. Sie lösen eine Immunreaktion oder Immunantwort aus. Sie heißen Antigene, weil sie die Bildung von spezifisch gegen sie gerichteten Antikörpern hervorrufen können. (Sie haben nichts mit Genen zu tun).

• Antigene können aus ganz verschiedenen Molekülen bestehen: Die meisten sind Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und Komplexe aus diesen Molekülklassen.

• Auch körpereigene Strukturen können als Antigene wirken, wenn sie fälschlicherweise als fremd angesehen werden. Dadurch wird eine Autoimmunreaktion ausgelöst.

• Kleine Moleküle wie einzelne Kohlenhydrate, Amino- oder Fettsäuren können keine Immunreaktion bewirken.

• Verschiedene niedermolekulare Stoffe, die alleine keine Antikörperreaktion hervorrufen können, sondern nur, wenn sie an ein Trägerprotein gebunden sind, heißen Haptene.

Inge Vonnieda 3131

Antigen – Antikörper – Bindung Antigen – Antikörper – Bindung

• Ausbildung nicht kovalenter Bindungen zwischen Antigen und Aminosäuren der hypervariablen Regionen des Antikörpers

– Wasserstoffbrücken– Elektrostatische Anziehung– Van-der-Waals-Bindung– Hydrophobe Bindung

• In der Summe beachtliche Bindungsenergie– Abhängig vom Abstand zwischen den reagierenden

Gruppen

Inge Vonnieda 3232

Antigen – Antikörper – Bindung Antigen – Antikörper – Bindung

• Überlappende Elektronenwolken nicht genau passender Antigene erhöhen sehr stark die Abstoßung zwischen Antigen und Antikörper

• Schlechte Passform des Antigens vermindert die Anziehungskräfte

Inge Vonnieda 3333

AntikörperaffinitätAntikörperaffinität• Affinität = Kraft einer einzelnen (monovalenten)

Antigen-Antikörper-Bindung (Summe aller anziehenden und abstoßenden Kräfte)– Hohe Affinität = hohe Passform– Niedrige Affinität = schlechte Passform

Inge Vonnieda 3434

Avidität (=funktionelle Affinität)Avidität (=funktionelle Affinität)• Multivalente Bindung (mind. 2 Bindungsstellen)

erhöht die Stabilität der Bindung

– Antigene besitzen i.d.R. viele Bindungsstellen => multivalente Bindung auch mit IgG

– Haptene besitzen nur eine antigene Determinante => monovalente Bindung

Inge Vonnieda 3535

KreuzreaktivitätKreuzreaktivität• Ein Antigen kann verschiedene Determinanten haben.• Verschiedene Antigene können gleiche Determinanten

haben.• Ein Antiserum enthält eine Antikörpergemisch aus

Antikörpern gegen alle Determinanten eines Antigens.• Ein Antiserum, das durch Immunisierung mit Antigen A

gebildet wurde, kann mit Antigen B kreuzreagieren.

Inge Vonnieda 3636

AntikörperbildungAntikörperbildung• Bakterium oder Virus o.ä. gelangt in den

Körper• Makrophagen nehmen es auf, lysieren es

und präsentieren Antigene.• Passende T-Lymphozyten werden aktiviert.• Proliferation passender B-Lymphoyzten zu

Plasmazellklonen• Antikörperbildung in Plasmazellen• Gleichzeitig Bildung von Gedächtniszellen

Inge Vonnieda 3737

Polyklonale AntikörperPolyklonale Antikörper• Antiserum stammt aus Mensch oder Tier• Werden nach Immunisierung aus

verschiedenen Plasmazellklonen gebildet• Verschiedene Antikörper (Mischung)

– gegen verschiedene Determinanten des Antigens

– mit unterschiedlicher Affinität zum Antigen– Kreuzreaktionen möglich

Inge Vonnieda 3838

Monoklonale AntikörperMonoklonale Antikörper• Nach Immunisierung werden

Plasmazellen eines Versuchstiers (Maus) mit Myelomzellen fusioniert.

• Anlegen von Zellkulturen (Zellklone) einzelner Hybridzellen, die die gewünschten Antikörper produzieren.

• Trennung und weitere Zellkultur der gewünschten Hybridzellen => Zellklone, die monoklonale Antikörper produzieren

• Groß angelegte Produktion monoklonaler Antikörper möglich

Inge Vonnieda 3939

Monoklonale AntikörperMonoklonale Antikörper

• Alle Antikörper haben – gleiche Spezifität.– gleiche Affinität– gleiche Avidität

• Chimärenbildung möglich• Einsatzgebiete in Diagnostik und

Therapie

Inge Vonnieda 4040

Designer-Antikörper Designer-Antikörper • Chimäre Maus-Mensch-Antikörper

– Murine V-Domänen und human C-Domänen => geringere Antigenität beim Mensch, Anwendung in vivo möglich

Aus: http://www.i-s-b.org/wissen/broschuere/produkt/monoklon.htm

• Übertragung der hypervariablen Domänen von einer Spezies in die Grundgerüst-Regionen der V-Domänen einer anderen Spezies

• Änderunge einzelner Aminosäuren der Bindungsstelle zur Erhöhung der Affinität

Grundlagen der ImmunologieGrundlagen der Immunologie

MethodenMethoden

Inge Vonnieda 4242

Heidelberger KurveHeidelberger Kurve• AG-Überschuss

– lösliche Immunkomplexe– proportional zur AK-

Konzentration

• Äquivalenzbereich– unlösliche Immunkomplexe– Immunkomplexe können

sichtbar gemacht werden

• AK-Überschuss– lösliche Immunkomplexe– proportional zur AG-

Konzentration

Inge Vonnieda 4343

Präzipitation, AgglutinationPräzipitation, Agglutination• Präzipitation

– Ein molekulares AG wird bei bekannter AK-Konzentration durch Diffusion (meist Gel) so verdünnt, dass sich Präzipitate bilden (Äquivalenzbereich).

• Agglutination– Großes Antigen (Erythrozyten,

Bakterien, Latexpartikel)– Sichtbare Agglutination– Mit Antigen oder Antikörper

beschichtete Latexpartikel möglich. (z.B. Tinaquant®)

Inge Vonnieda 4444

Turbidimetrie, NephelometrieTurbidimetrie, Nephelometrie• Turbidimetrie

– Die Trübungsänderung einer Lösung, die durch Immunkomplexbildung entsteht, wird photometrisch gemessen.

• Nephelometrie– Das Streulicht, das durch Immunkomplexbildung

entsteht, wird gemessen.

Inge Vonnieda 4545

ImmunelektrophoreseImmunelektrophorese• Eiweiß-Elektrophorese • Antiserum mit AK

gegen alle Eiweißfraktionen diffundiert senkrecht zur Trennrichtung

• Bildung scharfer Präzipitationslinien im Äquivalenzbereich

Inge Vonnieda 4646

Durchflusszytometrie (FACS)Durchflusszytometrie (FACS)

• Die Zellen werden in einer Durchflusszelle (Kapillare) von einem Laser erfasst.

• Fotodetektoren erfassen Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht und Fluoreszenz.

• Fluoreszenzmarkierte Antikörper werden an Zellen (z.B. Lymphozyten) gebunden.

Inge Vonnieda 4747

Durchflusszytometrie (FACS)Durchflusszytometrie (FACS)• Durch verschiedene

Fluoreszenzfarbstoffe sind parallel mehrere Antigene (Zellpopulationen) nachweisbar.

Inge Vonnieda 4848

Anti-Immunglobulin-AntikörperAnti-Immunglobulin-Antikörper

• Immunglobuline sind für andere Spezies immunogen

• Die gebildeten Antikörper erkennen konservierte Merkmale der Immunglobuline (z.B. Fc-Teil des IgG)

• Verschiedene Einsatzmöglichkeiten– Coombstest in der Blutgruppenserologie

(direkt, indirekt)– Westernblot– Immunoassay (z.B. ELISA)

Inge Vonnieda 4949

CoombstestCoombstest• Direkt

– Antikörper der Mutter gehen durch die Plazenta und binden an kindliche Erythrozyten. (direkte Agglutination nicht möglich)

– Durch Zugabe eines Anti-Human-Globulins werden die Erythrozyten agglutiniert.

• Indirekt– Im Serum der Mutter sind

Antikörper, die mit Rhesus-positiven Erythrozyten inkubiert werden – Beladung der Erys mit AK

– Zugabe von AHG – Agglutination

Inge Vonnieda 5050

Western BlotWestern Blot• Zerlegung der Proteine, z.B.

Viren durch SDS-PAGE SDS = Natriumdodecylsulfat

PAGE = Polyacrylamidelektrophorese • Übertragen der Proteine auf

Nitrocellulose und Markierung der gewünschten Proteine durch Antikörper

• Nachweis der AK-Bindung durch enzymgekoppelte Antikörper

Inge Vonnieda 5151

ImmunoassayImmunoassay• Nachweis von AG oder AK mit Hilfe

des markierten Reaktionspartners.– Enzyme (die meisten klinisch-

chemischen immunologischen Untersuchungen) (ELISA)

– Fluoreszenz (z.B. an Gewebeschnitten, Durchflusszytometrie) (

– Radioaktivität (nur noch selten angewandt)

– Licht (bei Elecsys)

Inge Vonnieda 5252

ImmunoassayImmunoassay• Homogen

– AG-AK-Reaktion und Messung läuft in flüssiger Phase ab.

– Keine Waschschritte notwendig

– Marker meist Einzym– Antikörperbindung

inhibiert oder stimuliert die Enzymaktivität

Inge Vonnieda 5353

ImmunoassayImmunoassay• Heterogen

– Ein Reaktionspartner ist an eine Festphase gebunden (Röhrchen, Mikrotiterplatten, Mikropartikel)

– Unterschiedliche Marker möglich:• Radioaktive Isotope: Radio-Immunoassay RIA• Enzyme: Enzym linked immunosorbent assay ELISA• Fluorogene: Fluoreszenz Immunoassay FIA• Luminogene: Lumineszenz Immunoassay LIA

Inge Vonnieda 5454

ImmunoassayImmunoassay• Heterogen

– Sandwichtest• Bindung eines hochmolekularen

Moleküls an die Festphase und den markierten Reaktionspartner

• Auswaschen der nicht gebundenen, markierten Moleküle

• Nachweis des gebundenen Labels • Sehr hohe Sensitivität

Inge Vonnieda 5555

ImmunoassayImmunoassay• Heterogen

– Kompetitiv • Geeignet für kleine

Moleküle (AG), die nur einen AK binden können.

• Die AG aus der Probe konkurrieren mit zugegebenen AG (evtl. markiert) um den AK (evtl. markiert)

• Nach Waschen Nachweis des gebundenen Labels

• Hohe Sensitivität

Inge Vonnieda 5656

ECL-TechnologieECL-Technologie• Elektro-Chemi-Lumineszenz

– Universelle Festphase: paramagnetischer, mit Streptavidin beschichteter Mikropartikel

– Je nach Test können Biotin-beschichtete Antigene oder Antikörper verwendet werden, die über Biotin an Streptavidin binden.

– Zum Nachweis dienen Ruthenium-Komplex-markierte Antigene oder Antikörper.

Inge Vonnieda 5757

ECL-TechnologieECL-Technologie• Nachweis eines Antigens

– Bindung von Biotin-markiertem AK und Ruthenium-markiertem AK an das AG

– Bindung an Streptavidin auf Mikropartikeln– Messung

Inge Vonnieda 5858

ECL-TechnologieECL-Technologie• Nachweis eines Antikörpers

– Bindung von Biotin-markiertem AG und Ruthenium-markiertem AG an den AK

– Bindung an Streptavidin auf Mikropartikeln– Messung

Inge Vonnieda 5959

ECL-TechnologieECL-Technologie• Nachweis von IgM-AK

– IgG_AK aus der probe werden durch Fab-Fragment (AG-Bindungsstellen) gegen γ–Ketten blockiert.

– Ruthenium-markiertes Antigen regiert mit dem IgM-AK.– Biotin-markiertes Anti-IgM bindet an Streptavidin– Anti-IgM ´bindet an IgM, das das markierte AG

gebunden hat.– Messung