Gruppe 3

Michèle Scherrer

Andreas Früh

Thema 1 : Burst Kinetik

Aufbau eines Stopped-Flow System und Anwedungsmöglichkeiten

Der Konzentrationsverlauf der

Burst Kinetik anhand des Ersatzmechanismus Ersatzmechanismus:

Das experimentelle Konzept zur Bestimmung von

c0E via Burst-Kinetik Ausgehend von Gleichung 6.3 vom Skript:

Zu Beachten ist aber,

• Bei der Spektroskopie wird nicht direkt eine Konzentration-Zeit-Kurve aufgenommen, sonder mit Absorbence gearbeitet

• Das verwendete Substrat (para-Nitrophenylacetat) besitzt eine Autohydrolyse, welche 0.Ordnung ist.

BlindtestAttA 0P )(cd)(

Das experimentelle Konzept zur Bestimmung von

c0E via Burst-Kinetik

Konzentration Absorbence [A]

1.00E-08 0.0005

1.00E-07 0.0019

1.00E-06 0.0093

1.00E-05 0.1476

1.00E-04 1.4135

1.00E-03 2.8491

Kalibrationsreihe:

ε = 14136 l/mol*cm

Kalibration (linearer Bereich)

0

0.5

1

1.5

0.00E+00

2.00E-05

4.00E-05

6.00E-05

8.00E-05

1.00E-04

1.20E-04

Konzentration in mol/L

Ab

sorb

enc

[A]

Reihe2

Das experimentelle Konzept zur Bestimmung von

c0E via Burst-Kinetik

Autohydrolyse y = 5E-05x

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0 1000 2000 3000 4000

Zeit in sec

Ab

so

rbe

nc

e [

A]

Absorbence [A]

A-A0

Linear (A-A0)

Autohydrolyse:

Das experimentelle Konzept zur Bestimmung von

c0E via Burst-Kinetik

BlindtestAttA 0P )(cd)(

0P )(cd)( AttA

0221

1

21

1,0

211)( Atkekk

k

kk

kAtA tkk

E

Die direkte Ermittlung der Reaktionsparameter aus

der Absorbanz-Zeit-Kurve

Absorbtionskurve

0.35

0.4

0.45

0.5

0.55

0.6

0.65

0 2 4 6 8 10 12

Zeit [s]

Abs

orbe

nce

[A]

[E] mittelAbsorbtionskure

0.705

0.71

0.715

0.72

0.725

0.73

0 2 4 6 8 10 12

Zeit [s]

Abs

orbe

nce

[A]

[E] wenig

Absorbtionskurve

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 2 4 6 8 10 12

Zeit [s]

Abs

orbe

nce

[A]

[E] mehr

Auswertungen (Datenanalyse mit Sigma Plot und

Berkeley Madonna) und Resultate

Eingesetzte Enzymkonzentration 2E-05 mol/L

Enzymkonzentration aus SigmaPlot k1 aus SigmaPlot k2 aus SigmaPlotMittelwert 1.347E-05 1077.1 0.01517Standardabw. 1.130E-06 17.5 0.00109rel. Standardabw. 8.39 1.63 7.17

Enzymkonzentration aus BM k1 aus BM k2 aus BMMittelwert 1.368E-05 1102.4 0.01620Standardabweichung 1.153E-06 31.4 0.00144rel. Standardabw. 8.43 2.85 8.87

Eingesetzte Enzymkonzentration 2E-06 mol/L

Enzymkonzentration aus SigmaPlot k1 aus SigmaPlot k2 aus SigmaPlotMittelwert 1.16E-06 1273.01 0.03373Standardabw. 2.20E-07 222.57 0.0050rel. Standardabw. 19.04 17.48 14.77

Enzymkonzentration aus BM k1 aus BM k2 aus BMMittelwert 1.15E-06 1118.46 0.03234Standardabweichung 1.94E-07 159.35 0.0069rel. Standardabw. 16.92 14.25 21.28

Eingesetzte Enzymkonzentration 2E-04 mol/L

Enzymkonzentration aus SigmaPlot k1 aus SigmaPlot k2 aus SigmaPlotMittelwert 1.048E-04 1014.2 0.01053Standardabw. 1.057E-05 17.9 0.00122rel. Standardabw. 10.08 1.76 11.54

Enzymkonzentration aus BM k1 aus BM k2 aus BMMittelwert 1.054E-04 1075.4 0.01127Standardabweichung 1.083E-05 39.0 0.00218rel. Standardabw. 10.27 3.63 19.35

Thema 2 : Active Site Titration

Bestimmung der molaren Enzymkonzentration

Grundlagen der active site Titration

X

Grundlagen der active site Titration

XX

Experimentelles Konzept zur Bestimmung der aktiven molaren Enzymkonzentration

Experimentelles Konzept zur Bestimmung der aktiven molaren Enzymkonzentration

7.27932 AA

N

142 969.0 AAA

Auswertung und Resultate

Auswertung und ResultateA1 0.96444

A4_1 0.0144 A2_1 0.949A4_2 0.0201 A2_2 0.955A4_3 0.0092 A2_3 0.944A4_4 0.0157 A2_4 0.950A4_5 0.0195 A2_5 0.954

A3_1 0.529 N_1 0.00150A3_2 0.497 N_2 0.00164A3_3 0.487 N_3 0.00163A3_4 0.497 N_4 0.00162A3_5 0.620 N_5 0.00119

N_Ø 0.00152STABW 0.000189

EINWAAGE 53.358PUFFER 1M_r 24800 N_Probe 0.705N_100% 0.00215 STABW 0.0878

Unterschiede zwischen der active site Titration und der Aktivitätsbestimmung eines

Enzymes

• Normalität statt Units/g

• Molarität u. Gehalt mit Anzahl Acitve Sites

• Unabhängig von Temperatur, Ionenstärke, pH, Cofaktoren, Inhibitoren, Aktivtoren usw.

»All-or-none assay

Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit