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Wilhelm Roux' Arehiv 163, 184--196 (1969) Hemmung der Reaggregation dissoziierter Amphibienzellen durch Inhibitoren der RNS- und Proteinsynthese HOIST G~LrNZ Physiologisch-Chemisches Institut der Freien Universit~t Berlin Eingegangen am 10. Februar 1969 Inhibition o/Aggregation o/Dissociated Embryonic Amphibian Cells by Inhibitors o/ Protein and RNA Synthesis Summary. 1. Aggregation of embryonic Amphibian cells dissociated by Trypsin or EDTA is suprcssed reversibly by actidion (cycloheximid 0.5--2 9g/ml), an inhibitor of protein syn- thesis. Protein synthesis is inhibited more than 90% at these concentrations. The inhibition by aetidion was still reversible after 48 hours, when the cells were transferred to normal medium. Actidion added to cells, cultured in Flickinger solution for 3 h, was no longer able to stop further aggregation. 2. Puromycin reversibly suppresses aggregation at a concentration of 20 ~zg/inl, when pro- tein synthesis is inhibited to 66%. 3. After EDTA-dissociation the formation of initial small clusters of 5--10 cells (primary aggregation) occurred even in the presence of inhibitors of protein synthesis. The primary aggregation is however suppressed if actidion or puromycin are already added during the dissociation procedure. 4. In the presence of actinomycin-D (1--2 f~g/ml) the cells continue to aggregate like the controls. After 30 h further aggregation is stopped and the aggrega~s loose single cells. 5. :Differences in the aggregation of cells after EDTA and Trypsin treatment are discussed. Zusammen/assung. 1. Actidion (Cycloheximid), Hemmer der RNS-abh~ngigen Protein- synthese, verhindert reversibel in einer Konzentration yon 0,5--2 ~g/ml die Reaggregation EDTA- oder Trypsin-dissoziierter Zellen. Bei dieser Konzentration ist die Proteinsynthese zu fiber 90 % gehemmt. Nach Uberffihren der Zellen in Kulturmedium ohne Inhibitor setzt selbst nach 48stfindiger Actidionbehandlung die Aggregatbildung wieder ein. Werden die Zellen erst 3 Std nach der Dissoziation mit Actidion behandelt, so ist keine Hemmung der Reaggrega- tion zu beobachten. 2. Puromycin unterbindet in einer Konzentration yon 20 ~zg/ml reversibel die Reaggrega- tion der Zellen. Die Proteinsynthese ist bei dicser Konzentration zu 66 % gehemmt. 3. Auch bei Anwesenheit yon Proteinsynthesehemmern ist nach EDTA-Dissoziation eine initiale Bildung yon kleinen Reaggregaten mit jewcils 5--10 Zellen (Prim~raggregation) zu beobachten. Diese Prim~raggregation kann jedoch verhindert werdcn, wcnn bereits w~hrcnd der Dissoziation eine Behandlung der Zellen mit Actidion erfolgt. 4. Nach Zugabe yon Actinomycin-D (1--2 tzg/m]) findet wie in den Kontrollen einc Rcaggre- gation start. Erst nach 30 Std kommt es zu einem zunehmenden Zerfall der Reaggregate. 5. Das unterschiedllche Verhalten der Zellen nach EDTA- und Trypsin-Behandlung wird diskutiert. Einleitung Fragen des Zellkontaktes und der Spezifit/~t der Zelladh/~sion sind fiir das Ver- st~ndnis morphogenetischer Vorg/~nge von grol3em Interesse. HOLTF~,TE~ (1939 a, 1939b, 1944) und Towns und HOLTF~]~T~ (1955) hatten gezeigt, dul~ zwischcn den Zellen der einzelnon Keimbl/~tter bestimmte Affinit/~ten bestehen, wodurch ein Kontakt gleicher Zellen untereinander und eine selektive Adh/~sion zu Zellen anderer Keimbl/~tter ermSglicht wird.

Hemmung der Reaggregation dissoziierter Amphibienzellen durch Inhibitoren der RNS- und Proteinsynthese

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Page 1: Hemmung der Reaggregation dissoziierter Amphibienzellen durch Inhibitoren der RNS- und Proteinsynthese

Wilhelm Roux' Arehiv 163, 184--196 (1969)

Hemmung der Reaggregation dissoziierter Amphibienzellen durch Inhibitoren der RNS- und Proteinsynthese

HOIST G~LrNZ

Physiologisch-Chemisches Institut der Freien Universit~t Berlin

Eingegangen am 10. Februar 1969

Inhibition o/Aggregation o/Dissociated Embryonic Amphibian Cells by Inhibitors o/ Protein and RNA Synthesis

Summary. 1. Aggregation of embryonic Amphibian cells dissociated by Trypsin or EDTA is suprcssed reversibly by actidion (cycloheximid 0.5--2 9g/ml), an inhibitor of protein syn- thesis. Protein synthesis is inhibited more than 90% at these concentrations. The inhibition by aetidion was still reversible after 48 hours, when the cells were transferred to normal medium. Actidion added to cells, cultured in Flickinger solution for 3 h, was no longer able to stop further aggregation.

2. Puromycin reversibly suppresses aggregation at a concentration of 20 ~zg/inl, when pro- tein synthesis is inhibited to 66%.

3. After EDTA-dissociation the formation of initial small clusters of 5--10 cells (primary aggregation) occurred even in the presence of inhibitors of protein synthesis. The primary aggregation is however suppressed if actidion or puromycin are already added during the dissociation procedure.

4. In the presence of actinomycin-D (1--2 f~g/ml) the cells continue to aggregate like the controls. After 30 h further aggregation is stopped and the aggrega~s loose single cells.

5. :Differences in the aggregation of cells after EDTA and Trypsin treatment are discussed.

Zusammen/assung. 1. Actidion (Cycloheximid), Hemmer der RNS-abh~ngigen Protein- synthese, verhindert reversibel in einer Konzentration yon 0,5--2 ~g/ml die Reaggregation EDTA- oder Trypsin-dissoziierter Zellen. Bei dieser Konzentration ist die Proteinsynthese zu fiber 90 % gehemmt. Nach Uberffihren der Zellen in Kulturmedium ohne Inhibitor setzt selbst nach 48stfindiger Actidionbehandlung die Aggregatbildung wieder ein. Werden die Zellen erst 3 Std nach der Dissoziation mit Actidion behandelt, so ist keine Hemmung der Reaggrega- tion zu beobachten.

2. Puromycin unterbindet in einer Konzentration yon 20 ~zg/ml reversibel die Reaggrega- tion der Zellen. Die Proteinsynthese ist bei dicser Konzentration zu 66 % gehemmt.

3. Auch bei Anwesenheit yon Proteinsynthesehemmern ist nach EDTA-Dissoziation eine initiale Bildung yon kleinen Reaggregaten mit jewcils 5--10 Zellen (Prim~raggregation) zu beobachten. Diese Prim~raggregation kann jedoch verhindert werdcn, wcnn bereits w~hrcnd der Dissoziation eine Behandlung der Zellen mit Actidion erfolgt.

4. Nach Zugabe yon Actinomycin-D (1--2 tzg/m]) findet wie in den Kontrollen einc Rcaggre- gation start. Erst nach 30 Std kommt es zu einem zunehmenden Zerfall der Reaggregate.

5. Das unterschiedllche Verhalten der Zellen nach EDTA- und Trypsin-Behandlung wird diskutiert.

Einlei tung

Fragen des Zel lkontaktes und der Spezifit/~t der Zelladh/~sion sind fiir das Ver-

st~ndnis morphogenet ischer Vorg/~nge von grol3em Interesse. HOLTF~,TE~ (1939 a,

1939b, 1944) und T o w n s und HOLTF~]~T~ (1955) h a t t e n gezeigt, dul~ zwischcn den Zellen der einzelnon Keimbl/~tter bes t immte Affinit/~ten bestehen, wodurch ein K o n t a k t gleicher Zellen un te re inander und eine selekt ive Adh/~sion zu Zellen anderer Keimbl/~tter ermSglicht wird.

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Hemmung der Reaggregation dissoziierter Amphibienzellen 185

Naeh Behandlung mi t hochgereinigtem mesodermalisierendem Fak to r i indert sieh die Affinit~t des Ek toderm der Amphibiengas t ru la ( K o c ~ g - B ~ c K ~ R , TI]~D:E- MAN~ u n d TI]~DEMA~N, 1965). Ver~nderungen der Zellatf init~ten geh6ren also zu den ersten Effekten, die naeh I n d u k t i o n beobachtet werden kSnnen. I n diesem Znsammenhang haben wir mi t Unte rsuchungen fiber den Meehanismus der Zell- adhi~sion bei Amphib ienembryonen begonnen. I n der vorl iegenden Arbei t werden Unte rsuehungen fiber die H e m m u n g der Reaggregat ion dureh Inh ib i to ren der Protein- u n d Nueleins~uresynthese mitgeteflt. Die Disaggregation erfolgte dabei entweder durch E D T A oder durch Trypsin.

Material und Methode Ffir die Untersuchungen wurde Keimmaterial yon Triturus alpestris und Ambystoma

mexicanum verwendet. Disaggregation des Zellmaterials. Je 5 Gastrulae (Dotterpfropfs~adium, Harrison 12b)

wurden nach Entfernung der Keimhfillen in calcinmffeie KulturlSsung mit EDTA-Zusatz (0,001 M) fiberffihrt. Die ersten Versuehe mit Actidion wurden mit Holtfreter-, allc weiteren Experimente mit Flickinger-L6sungen durchgeffihrt. Dabei zeigte sich, daft die Reaggregation yon den Kulturl6sungen abh~ngig ist. So erfolgte die Aggrega~bildung der Zellen in Flickinger- LSsung deutlieh schneller als in Holtffeter-LSsung. Neben den in der Holtfreter-L6sung ent- haltenen Salzen NaC1 (5,9 • 10 -2 M), KCI (6,7 • 10 4 M) und CaC12 (9 • 10 -4 IV[, Fliekinger- L6sung 3,4X 10 -4 M) sind in der Flickinger-LSsung noch MgSO 4 (7,4• 10 -41VI), Na2I.IPO 4 (6,2 • 10 -4 M), KHHH~PO 4 (1,5 • 10 -4 M) und NaHHCO 3 (2,4 • 10 -4 M) enthalten.

W~hrend der lstfindigen Behandlungszeit wurden die mit Agar ausgegossenen Sehalen des 6fteren leicht geschiittelt, um eine bessere nnd sehnellere Disaggregation zu erreichen. An- sehlieBend wurden die Einzelzellen innerhalb yon 30 rain mehrmals mit Kultm'16sung ge- wasehen, die die 10fache Menge Calcium enthielt. Hierbei sowie dem ansehlieBenden Spiilen in normaler Kulturl5sung wurden zerst5rte Zellen entfernt. In einer weiteren Versuchsreihe wurden die Keime mit Calcium- und Magnesium-ffeier Flickinger-LSsung, die 0,5 % Trypsin (2 • krist., Worthington) enthielt, bei einem pH yon 7,8 dissoziiert. Anschlieflend wurde das Trypsin durch mehrmaliges Waschcn entfernt. Einer Z/2stiindigen Inkubation mit 0,05 % Tryp- sin-Inhibitor (Worthington) in Fliekinger-LSsung folgte ein mehrmaliges Waschen mit normaler Flickinger-LSsung, in der auch die weitere Kultivierung der Zellen erfolgte. Die Zellen wurden durch leiehte Rotation nach jeder Beobachtung in der Mitte der Schale zusammengesehfittelt. Einc dauernde Rotation erwies sich Ms ungfinstig, da die empfindlichen dotterreichen Amphi- bienzellen geschEdigt wurden und abstarben. Der pH-Wert win'de mit 0,1 N HCI auf 7,3 adjustiert. Die Experimente wurden unter sterilen Bedingungen durchgefiihrt. Alle LSstmgen enthielten auBerdem 300 mg/1 Cibazol. Die Kultivier~mg der Zellen erfolgte bei 18 ~ C. Als Inhibitoren wurden Aetidion ( : Cycloheximid), Aetinomycin D (Serva, Heidelberg) sowie Puromyein (Nutritional Biochemieals Corporation, Cleveland, Ohio) verwendet.

Herstellung der BlausgureISsungen. Eine 0,1 N HCN-StammlSsung (pH 7,3) wurde dureh Misehung yon KCN-haltiger Flickinger-LSsung mit SalzsEure erhalten. Ffir die Versuche wurde diese frisch bereitete I.iCN-Stamml5sung auf 0,5 • 10 -4 bzw. 1 • 10 -2 M mit :Fliekinger- LSsung verdiinnt.

Einbauversuche. Naeh der Disaggregation von 5 (Triturus alpestris) bzw. 3 Keimen (Ambystoma mexieanum) mit EDTA bzw. Trypsin und ansehlicl3endem Wasehen der Zellen in normaler KulturlSsung wurden diese in Sehalen fiberfiihrt, die in steigender Konzentration Aetidion bzw. Puromycin, gelSst in Holtffeter- bzw. Flickinger-LSsung, enthielten. Gleichzeitig wurde 1-14C-Leuein (3,19 • 10 -4 mc/ml) zugegeben. Nach 4 Std Inkubation wurden die Zellen in kleine Reagenzgli~ser fiberffihrt und der ~berstand nach Zen~rifugation bei 1O00 rpm abpipettiert. AnsehlieBend wurden die Zellen in 1 ml 5% TCA homogenisiert und bei 3000 rpm zentrifugiert. Es folgte eine Behandlung mit 1 ml heii]er 5 % TCA (95 ~ C, 5 rain). Der Rfiek- stand wurde 3mal mit je 2 ml Alkohol-J~ther (3:1) gewaschen, in 80 ~l 1% KOH aufgenommen, auf Chromatographiepapier (Macherey & Nagel, Nr. 212) aufgetragen und fiber KOH ge- trocknet. Die Aktivit~t wurde im Szintillationsz~hler gemessen.

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186 g. GRv~z:

Atmungsmessungen. Die Atmung der Zellen yon je 30 dissoziierten Ambystomakeimen (Dotterpfropfstadium, Harrison 12b) wurde manometriseh im Warburg-Apparat ermittelt. Jeweils 2 ml Zellsuspension wurde in die ca. 6 cm s grol]en Gef/il]e eingefiillt und die Atmungs- grSl]en fiir Zellen in normaler Flickinger-LSsung (Kontrollen) und in Flickinger-LSsung mit Actidionzusatz (0,5 ~g/ml) bestimm~. Die Messung erfolgte fiber 6 Std bei stfindlicher Ablesung.

Ergebnisse Dissoziation mit E1)TA

a) Kontrollen

Bei der Dissoziation mit EDTA zerfielen die Gewebeverb~nde vollst/~ndig in Einzelzellen (Abb. 1). Unmit telbar nach Austausch der EDTA-L6sung gegen Flickinger-L6sung mit 10facher Calciumchlorid-Konzentration war eine Aggregat- bildung yon wenigen (ca. 5) Zellen zu beobachten (Prim/s Abb. 2). Schon nach 5 Std (Abb. 3, Abb. 8, Ib ) hat ten sich vielzellige Aggregate gebildet. In den n/iehsten Tagen konnte eine weitere Reaggregation beobachtet werden (Abb. 4, 5 u. 8, I c~f ) , bis etwa 80% der disaggregierten Ze]len in kompakte Gebilde eingebaut waren (Abb. 6). Durch wiederholtes l~otieren der Schale wurden zun/ichst noch einzeln liegende Zellen in die Aggregate aufgenommen (vgl. Uber- sicht Tabelle 1).

Einzeln ]iegende Zellen verlieren innerhMb von 24 Std die F/~higkeit zur Aggregatbildung nicht. Durch Versuche mit dispers verteilten Zellen konnte ge- zeigt werden, dab sie nach 2 Tagen noch in der Lage sind, nach Zusammenschfitteln Aggregate zu bilden.

b) Wirkung yon Inhibitoren der Proteinsynthese auf die l~eaggregation

Nach Dissoziation mit EDTA wurden die Zellen mit Holtfreter-LSsung be- handelt, die 0,5 ~g/ml Actidion, einen Hemmstoff der Proteinbiosynthese enthielt. Schon nach 17stfindiger Einwirkungszeit yon Actidion auf die disaggregierten Zellen ergab sich ein deutlicher Unterschied zur Kontrolle (Abb. 8, I Ic) . Nach einer kurzen Phase initialer Aggregation (Prim/iraggregation) wnrde die weitere Re- aggregation der Zellen vollst&ndig unterbunden (Abb. 8, I I a - - c ) . Eine v6llige I t emmung der Aggregatbildung konnte dadurch erreicht werden, dab bereits w/~hrend der Dissoziation der Keime Actidion zugegeben wurde. Die t t emmung der Aggregation durch Actidion ist reversibel. Wird nach 24stiindiger Behandlung die Actidion-haltige gegen eine Actidion-freie L6sung ausgetauscht (Abb. 8, I I d - - f ) , so findet eine vollst/~ndige Reaggregation start. Auch nach 48 stfindiger Behandlung mit Actidion sind die Zellen noeh in der Lage, Reaggregate zu bilden.

Abb. 1. Kontrollversuch. Dissoziation yon Amphibiengastrulae in Einzelzellen. Die Zellen befinden sich noch im Dissozia~ionsmedium (CMcium- und Magnesium-freie Kultur16sung mit

EDTA-Zusatz. Vergr. ca. 30 x

Abb. 2. Kontrollversuch. InitiMe Aggregation (Primi~raggregation). Die 5--10zelligen Aggre- gate haben sich sofort nach Auswaschen des Dissoziationsmediums gebilde~. Vergr. ca. 30 x

Abb. 3. Kontrollversuch. Separate Aggregate yon 10--30 Zellen (5 Std nach Versuchsbeginn) Vergr. ca. 30 x

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ttemmung der Reaggreg~tion dissoziierter Amphibionzollen 187

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188 H. G~v~z:

Tabelle 1. Ubersicht iiber die Kontrollserie

Behandlung Zeitpunkt der Beobachtung in Std nach dem Dissoziations- Beginn

Art der Zellformationen Abb.

Disaggregation in Ca- und iVIg-freier KulturlSsung mit EDTA-Zusatz

Wasehen in Kulturl6sung mit l0 • CaC12 und anschlie~end mit normaler Ku]turlSsung

Normale KulturlSsung

Normale KulturlSsung

5

17

Normale Kulturl6sung 24

Normale Kulturl6sung 40

1/2

3/~

Normale Kulturl6sung 120

Einzelzellen 1

Primiiraggregation 2, 8 Ia

Zellverbi~nde yon 3, 8 Ib 10- -30 Zellen

Zellen haben sich zu 4, 8 I c grSl3eren separaten Zellkomplexen vereinigt (50 und mehr Zellen)

flacher zusammenhgngender 5, 8 I d Zellverband

Kompaktes kugeliges 8 Ie Gebilde, an seiner Oberfl~che locker angeordnete Zellen

kompaktes kugeliges 6, 8 If Gebilde mit glatter Oberfl~che, ca. 80% der disaggregierten Zellen sind eingebaut

Versuche mi t Ganzkeimen best~tigten, dab die Ac t id ionhemmung reversibel ist. Dutch 2 ~g/ml Actidion wird die En twick lung yon friihen Gast ru las tadien gestoppt. Die Embryona len twick lung k o m m t jedoch nach 24stfindiger Behand- lungszeit wieder in Gang, welm die Keime in normale Holtfreter-LSsung gebracht

werden. U m die H e m m u n g der Prote insynthese zu messen, wurde gleichzeitig mi t

Act idion l-~4C-Leucin zugegeben. Die prozentuale H e m m u n g der Pro te insynthese bei steigender Konzen t r a t i on yon Actidion ist in Tabelle 2 wiedergegeben. Bei einer Konzen t r a t i on yon 0,5 ~g/ml ist die Prote insynthese zu 93% gehemmt.

Abb. 4. Kontrollversuch nach 17 Std. GrSBere, kompakte Zellverbande. Vergr. ca. 30 •

Abb. 5. Kontrollversuch nach 24 Std. Viele separate Zellkomplexe h~ben sich zu einem flachen zusammenhangenden Verband vereinigt. Vergr. ca. 30 •

Abb. 6. Kontrollversuch nach 120 Std. Kompaktes Gebilde, das sich aus 80% der dissoziierten Zellen gebildet hat. Vergr. ca. 30 •

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Hemmung der Reaggregation dissoziierter Amphibienzellen 189

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190 H. G~v~z:

Wei te re E rh6hung der Ac t id ionkonzen t ra t ion vers t / i rk t die H e m m u n g der P ro te insyn these nur geringftigig.

W u r d e n die K e i m e in F l ick inger -L6sung aufgezogen, so war die t t e m m u n g der Prote insyn~hese durch Act id ion e twas geringer. Bei einer K o n z e n t r a t i o n von 0,5 ~zg/ml Act id ion be t rug die H e m m u n g e twa 80%.

Abb. 7. Versuchsreihe mit Actinomycin-Behandlung (1 fzg/ml) nach 120 Std Kultivierung. Nach 24 Std war die Testsubstanz ausgewaschen und durch norm~le KulturlSsung ersetzt

worden. Der Zellverband geht bereits in einen allgemeinen Zerfall fiber. Vergr. ca. 30 •

Tabelle 2. Einbau von 1-14C-Leucin nach Dissoziation mit E D T A und anschlie[3ender Actidion- behandlung ( Kulturmedium : Holt/reter-L6sung )

Actidion- Imp./rain Hemmung der konzen~ration Proteinsynthese ~g/ml in %

Kontrolle: - - 12 092 - - Versuche: I 0,015 7 945 34 I I 0,03 2541 79 I I I 0,06 2865 76 IV 0,125 3684 70 V 0,25 1507 88 VI 0,5 793 93 VII 1,0 575 95 VIII 2,0 505 96

Bemerkenswer t is t der Befund, dab aul~er der P ro te insyn these auch die A tmung der d isaggregier ten Zellen du tch Act id ion gehemmt wird. Bei einer Kon- zen t ra t ion yon 0,5 ~g/ml Act id ion betr~tgt die H e m m u n g ca. 35%. E t w a gleich s t a rk war die I-Iemmung bei ha lb ie r t en Ganzke imen (39 %). U m zu prfifen, ob die H e m m u n g der A t m u n g bei der l~eaggregat ion eine l~olle spielt , wurde die

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Hemmung der Reaggregation dissoziierter Amphibienzellen 191

Reaggregation in Gegenwart yon HCN untersucht. Dabei zcigte sich, dab die Reaggregation bei einer tIemmung der Atmung um 30% (IICN-Konzentration 0,5 • 10 -4 M) nicht nnterbunden wird. Erst bei einer tICN-Konzentration yon 1 • 10 -a M, v o n d e r bekannt ist, dab sie die Nucleinsguresynthese zu fiber 99% und die Proteinsynthese zu etwa 98% hemmt (TIsD~MA~N U. B O ~ , 1960), zeigt sich ein Verlust der t{eaggregationsfghigkeit der Zellen.

Untersuehungen mit Puromyein, welches ebenfalls die Proteinsynthese hemmt, wurden an Ambystoma mexieanum durchgeffihrt. Bei einer Konzentration yon 20 ~zg/ml und einer Behandlungsdauer yon 24 Std hemmt Puromyein die l~e- aggregation der Zellen reversibel. Einbauversuche mit 1-1aC-Leucin zeigten, dal3 Puromyein in dieser Konzentration die Proteinsynthese zu etwa 66% hemmt. Eine t temmung der Proteinsynthese um 19 % (Puromycinkonzentration 10 ~tg/ml) hemmt zwar die Reaggregation der Zellen, verhindert sie jedoch nieht voll- standig.

Dissoziation mit Trypsin

a) Kontrollen

NachDissoziation der Keime mit Trypsin setzt die l~eaggrcgation der Zellen im Vergleich zu den mit EDTA dissoziierten Geweben etwas sp~ter ein. Eine ,,Primiir- aggregation" t ra t bei den mit Trypsin behandelten Zellen nicht auf. Nach 24 Std haben sich kugelige Aggregate gebildet. Wurde die Disaggregation l/tnger als 1 Std ausgedehnt and hohc Trypsinkonzentrationen (0,5--1%) angewandt, um auch die recht stabilen ektodermalen Zellverb~inde in Einzelzellen fiberzufiihren, so wurde tin Verz6gerung der anschlieGenden I~eaggregation beobachtet. Um das Ektoderm vollsti~ndig zu dissoziieren, ist im Gegensatz zur EI)TA-Disaggregation auGerdem ein st~rkere mechanische Behandlung der Zellen mit Hilfe einer Pipette notwendig. Nach 1/ingerer Trypsinierung (l~nger als 2 Std) ist die l~eaggregation auch bei Anwendung geringer Trypsinkonzentrationen ( 0 , 1 0 4 , 2 5 % ) stark ver- z6gert. Die Verz6gerung der l~eaggregation nach Trypsinbehandlung ist nicht auf eine Schiidigung der Proteinsynthese zurfickzuffihren. Die Einbaurate yon 1-14C - Leucin ist etwa ebenso hoch wie nach I)issoziation mit EDTA.

b) Wirkung von Actidion auf die Reaggregation

Ebenso wie die l~eaggregation der EDTA-dissoziierten Zellen wird auch die Reaggregation der Trypsin-dissoziierten Zel]en dureh Actidion gehemmt. Ein unterschiedlichcs Verhalten zeigten die Zellen, wenn Actidion erst 3 Std nach der Disaggregation zugegeben wurde. Die Reaggregation EDTA-dissoziierter Zellen kann nach 3stiindiger Kultur in normaler Flickinger-LSsung durch Actidion (2 ~g/ml) nieht mehr verhindert warden, trotzdem die Proteinsynthese zu etwa 90 % gehemmt war. Die l~eaggregation Trypsin-behandelter Zellen wird dagegen aueh dann nobh gehemmt, wenn Aetidion erst 6 Std naeh der Dissoziation zuge- ffigt wnrde. Die naeh dieser Zeit zu beobaehtenden Aggregatbildungen yon ca. 20 Zellen verlieren naeh mehrstiindiger Aetidionbehandlung sogar wieder ihren Zusammenhalt. Die Hemmung der Proteinsynthese Trypsin-dissoziierter Zellen nach Actidionbehandlung ist in Tabelle 3 angegeben.

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Abb. 8. ~3bersich* fiber die einzelnen Versuohsreihen. I Kon~rolle, I I Aotidionbehandlung, 24 Std (0,5 tzg/ml), I I I Aotidion-Dauerbehandlung (0,5 v~g/ml), IV Aotinomyoin-Behandlung

(1 ~zg/ml). Vorgr. ca. 6 X

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a 3/d Std, b 5 Std, c 17 Std, d 24 Std, e 40 Std, f 120 Std. Nach 24 Std wurden in den Serien I I und IV die Inhibitoren ~usgewaschen und dutch normale KulturlSsung (ab Reihe d) ersetzb

13 Wilhelm Roux' Arch., Bd. 163

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194 H. GR~z :

Tabelle 3. Einbau yon 1-i4C-Leucin nach Dissoziation mit Trypsin und anschlieflender Actidion.Behandlung (Kulturmedium: Fliclcinger-L6sung)

Actidion- Imp./min I-Iemmung der konzentration Proteinsynthese ~g/ml in %

Kontrolle: - - 10400 - - Versuche: I 0,25 3 902 62,5 II 0,5 3299 68,3 III 1 1867 82,0 IV 2 858 91,8

Hemmung der Reaggregation durch Actinomycin D

In dieser Serie wurden die disaggregierten Zellen mit 1- -2 ~g/ml Actinomy- cin D, welches die DNS-abhiingige I%NS- Synthese hemmt, behandelt. Die Behand- lung setzte g]eich nach der Disaggregation ein. Gegeniiber den Actidionversuchen ergaben sich wesentliche Unterschiede. W/~hrend der Behandlung mit Actino- mycin-D ist eine Reaggregation zu beobachtcn, die zun~chst wie bei den Kontrollen verli~tfft (Abb. 8, IVa--d) . Erst nach 40 Std macht sich der EinfiuB des Actino- mycin D bemerkbar. Das Aggrega~ gibt Einzelzellen ab, um nach 120 Std schlieg- lich ganz zu zerfallen (Abb. 7). Dieser Zerfall t ra t auch ein, wenn die Aggregate nach 24 Std in Actinomycin-freie Holtfreter-L6sung umgesetzt wurden (Abb. 8, IVd I). Die Wirkung yon Actinomycin D setzt also spi ter ein Ms die Wirkung der Inhibitoren der Proteinsynthese, ist dann aber nicht reversibel.

Diskussion

Durch die vorliegenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dab die Reaggregation dissoziierter Amphibienzellen durch Inhibitoren dcr Proteinsynthese (Actidion und Puromycin) schnell und reversibel, durch Actinomycin-D, einen Hemmer der DNS-abh~ngigen RNS-Synthese, aber langsam und irreversibel gehemmt wird. lJber/~hnliche Befunde beriehtete Mosco~A (Mosco~a und Mos- comA, 1963, 1966) an I~etinazellen von It/ihnerembryonen. Der yon CURTIS (CURTIS, 1963; CURTIS und G~Agv~s, 1965) vorgebraehte Einwand, dag dutch Proteinsynthesehemmer ein im Serum vorhandener Inhibitorstoff (Protein) nieht abgebaut werden kann und deshMb die I~eaggregation gehemmt wird, kann fiir unsere Versuehe nicht zutreffen, da wir nur serumfreie L6sungen verwendet haben.

In den Kontroll- und Versuchsserien, bei denen die Dissoziation in Einzel- zellen mit EI)TA-haltiger, Calcium- und Magnesinm-freier Itoltfreter- oder Flickin- ger-L6sung erfolgte, wurde nach dem Austausch gegen normale KulturlSstmgen eine initiale l~eaggregation (Prim~raggregation) beobachget. MILLO~IC und GIU- DIC~ (1967) haben dutch elektronenoptische Untersuchungen an disaggregierten Seeigelkeimen gezeigt, dab bereits 3 min nach iJberffihrung in Seewasser grSfiere Bereiche der Zelloberfl/iche wieder miteinander in Kontakt getreten waren. Die Prim/~raggregation wurde bei Amphibienzellen auch beobaehtet, wenn sofort naeh der EDTA-Dissoziation der Zellen Actidion zugegeben wurde. Sie t ra t jedoch

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Hemmung der Reaggregation dissoziierter Amphibienzellen 195

nicht auf, wenn bereits wi~hrend der Dissoziation Actidion zugeffigt wurde oder die Disaggregation mit Trypsin erfolgte.

Naeh Zugabe yon ] - - 2 ~g/ml Actinomycin D, das in diesen Konzentrationen die RNS-Synthese in Amphibiengewebe weitgehend hemmt (TIE~)EMA~, BOt~I und TIEDEMANN, 1967), lttuft die l~eaggregation zuni~ehst normal ab. Offenbar hat die in den Ze]len bereits vorhandene m-RNS, die ffir die Neusynthese der Mem- branstrukturen benStigt wird, eine relativ lange Lebensdauer. Erst nach 40 Std begirmen die Reaggregate zu zerfallen.

Bei unseren Versuchen mit der Amphibiengastrula erwies sich die Disaggre- gation mit EDTA gegentibcr der Trypsindissoziation als die schonendere Methode. Mosco~A und MOSCONA (1967) zeigten dagegen, daft sich Retina aus Hiihner- embryonen dureh EDTA sehleehter dissoziieren ]~ftt und die EDTA-dissoziierten Zellen gegenfiber den Trypsin=dissoziierten Zellen starker gesch~digt waren. Diese Differenzen weisen darauf bin, daft in versehiedenen Entwicklungsstadien und bei verschiedenen Geweben Unterschiede in der Zelladh~sion bestehen.

IIinsichtlich des Mechanismus der Zelladhiision ergeben sieh aus den Versuehen folgende DeutungsmSgliehkeiten: Bei der Dissoziation von Geweben durch Tryp- sin werden wahrscheinlieh bestimmte Komponenten, die der Cytoplasmamembran aul~en angelagert und ffir die l~eaggregation notwendig sind, abgespalten. Die Zellen sind nur bei ungestSrter Proteinsynthese in der Lage, diese Komponenten neu zu synthetisieren. Die chemische Natur der Komponenten ist noeh nicht genau bekannt. Es kSnnte sich um Peptide oder Glykopeptide handeln.

Die Vorgi~nge bei der Dissoziation durch EDTA sind schwieriger zu erkls Nimmt man an, daI3 nur Calcium und Magnesium aus den Cytop]asmamembranen wi~hrend der Disaggregation herausgelSst werden, so ist nieht einzusehen, warum nach Wiederzugabe yon Calcium und Magnesium nicht eine sofortige Reaggrega- tion eintritt und andererseits bei frfihzeitiger Zugabe yon Aetidion (s. o.) auch die Primi~raggregation gehemmt ist. Wahrscheinlich werden nach Entzug yon zwei- wertigen Kationen auch noeh andere Konstituenten aus der ~ufteren Cytoplasma- membran abgelSst. Inwieweit diese Konsti tuenten mi t den bei der Trypsin- dissoziation abgespaltenen Konsti tuenten identiseh sind, ist nicht bekannt. Andere Erld~rungsmSglichkeiten sind jedoch nieht auszuschlieften. So kSnnte sieh der Konformationszustand der Membranen (C~A~GEVX et al., 1967) nach Entzug yon Calcium mad Magnesium irreversibel in der Weise i~ndern, daft die Affinitgt zu benachbarten Membranstrukturen stark herabgesetzt wird.

Weiterhin wi~re daran zu denken, daft die an der Zellaggregation beteiligten Membranbestandteile einem relativ sehnellen Abbau unterliegen. Bei gehemmter Proteinsynthese wiirden in dem Zeitraum, der ffir die Reaggregation benStigt wird, die Membranbestandteile zu einem mehr oder weniger groften Tell abgebaut, ohne daft eine Neusynthese stattfinden kann. Gegen diese Erkl~rung sprieht aber, daf3 es, wie schon friiher erwiihnt, mSglich ist, mit Actidion auch die Primer- aggregation EDTA-dissoziierter Zellen zu hemmen.

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