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Diss ETH Nr. 13658
Heterologe Expression und Charakterisierung von Subtilasen
aus Lycopersicon esculentum
ABHANDLUNG
zur Erlangung des Titels
DOKTORIN DER NATURWISSENSCHAFTEN
der
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE
ZÜRICH
Vorgelegt von
Ingar Janzik
Diplombiologin Ruhr-Universität Bochum, Deutschland
geboren am 19. Oktober 1970 in Bochum
Angenommen auf Antrag von:
Prof. Dr. N. Amrhein, Referent Prof. Dr. K. Apel, Korreferent Dr. A. Schaller, Korreferent
Zürich, 2000
I
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................................V
Zusammenfassung ........................................................................................................ VI
Abstract ........................................................................................................................VII
1. Einleitung ............................................................................................................... 1
2. Material und Methoden ........................................................................................ 7
2.1 Chemikalien, Proteine und Enzyme.......................................................... 7
2.1.1 Chemikalien .............................................................................................. 7
2.1.2 Proteine, Enzyme .......................................................................................7
2.2 Nukleinsäuren ........................................................................................... 7
2.2.1 Vektoren.................................................................................................... 7
2.2.2 Synthetische Oligonukleotide ................................................................... 8
2.3 Biologisches Material ............................................................................... 8
2.3.1 Bakterienstämme....................................................................................... 8
2.3.2 Insektenzellen ........................................................................................... 8
2.3.3 Pflanzen..................................................................................................... 9
2.4 Anzucht des biologischen Materials ......................................................... 9
2.4.1 Bakterien ................................................................................................... 9
2.4.2 Insektenzellen ........................................................................................... 9
2.4.3 Pflanzen................................................................................................... 10
2.5 Molekularbiologische Methoden ............................................................ 10
2.5.1 Isolierung von Plasmid-DNA ................................................................. 11
2.5.2 Transformation von E. coli. .................................................................... 11
2.5.3 In vitro-Rekombination von DNA .......................................................... 11
2.5.4 Gelelektrophoretische Trennung von Nukleinsäuren ............................. 11
2.5.5 Isolierung von Nukleinsäuren aus Agarosegelen.................................... 11
2.5.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR).......................................................... 11
2.5.7 DNA-Sequenzierung............................................................................... 12
2.5.8 Konstruktion von Plasmid-Vektoren zur heterologen Expression
von LeSBT1, -2, -3 und -4A in Insektenzellen....................................... 12
II
2.6 Protein-analytische Methoden ................................................................ 14
2.6.1 Methanol/Chloroform-Extraktion von Proteinen.................................... 14
2.6.2 Proteinbestimmung ................................................................................. 14
2.6.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.................................................. 14
2.6.4 Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose
(„Western-Blot“) .................................................................................... 15
2.6.5 Immunologischer Nachweis immobilisierter Proteine............................ 15
2.6.6 Glycosylierungsnachweis immobilisierter Proteine ............................... 16
2.6.7 Aminoterminale Sequenzierung.............................................................. 16
2.6.8 MALDI-TOF-MS-Analyse von Peptidgemischen.................................. 16
2.7 Gewinnung polyklonaler Antiseren gegen LeSBT1 bis 4A.................... 17
2.7.1 Präparation des Antigens zur Immunisierung von Kaninchen ............... 17
2.7.2 Test der Antiseren auf Spezifität bzw. Kreuzreaktivität ......................... 18
2.7.3 Gewinnung der IgG-Fraktion aus Antiseren........................................... 18
2.8 Heterologe Expression in Insektenzellen................................................ 18
2.8.1 Kotransfektion......................................................................................... 19
2.8.2 Virusvereinzelung, „Plaque-Assay“ ....................................................... 20
2.8.3 Analyse der Expression........................................................................... 20
2.8.4 Virusamplifikation .................................................................................. 21
2.8.5 Infektion für Proteinexpression............................................................... 22
2.9 Präparative Methoden ............................................................................. 22
2.9.1 Reinigung von LeSBT1........................................................................... 22
2.9.2 Anreicherung von LeSBT2 ..................................................................... 23
2.10 Aktivitätstests.......................................................................................... 24
2.10.1 Peptidhydrolyse durch LeSBT1 .............................................................. 24
2.10.2 Autokatalytische Hydrolyse von LeSBT1 .............................................. 24
2.10.3 Hydrolyse von fluoreszenzmarkierten Peptidsubstraten......................... 24
2.11 Immunolokalisation ................................................................................ 25
2.11.1 Fixierung des Pflanzenmaterials ............................................................. 25
2.11.2 Einbettung und Schnittpräparation ......................................................... 25
2.11.3 Immunolokalisation ................................................................................ 26
2.11.4 Dokumentation........................................................................................ 26
2.12 Datenauswertung, Arbeiten mit Datenbanken ........................................ 26
III
3. Ergebnisse.............................................................................................................. 28
3.1 Heterologe Expression von LeSBT1, -2 und -3 in Insektenzellen.......... 28
3.1.1. Konstruktion von Plasmid-Vektoren zur heterologen Expression
von LeSBT1, -2, -3 und -4A in Sf21-Zellen ........................................... 28
3.1.2 Erzeugung, Vereinzelung und Amplifikation
rekombinanter Baculoviren .................................................................... 29
3.1.3 Expression von LeSBT1, LeSBT2, LeSBT3 und LeSBT4 A
in Sf21-Zellen ......................................................................................... 30
3.2 Charakterisierung von LeSBT1............................................................... 32
3.2.1 Zeitabhängigkeit der heterologen Expression und Vergleich
der beiden exprimierten Formen von LeSBT1 ....................................... 33
3.2.2 Reinigung des heterolog exprimierten Proteins...................................... 34
3.2.3 Untersuchung der autokatalytischen Prozessierung................................ 36
3.2.3.1 pH-Abhängigkeit..................................................................................... 36
3.2.3.2 Inter- vs. Intramolekulare Prozessierung zur
autokatalytischen Aktivierung................................................................ 37
3.2.3.3 Massenbestimmung der verschiedenen Formen von LeSBT1................ 39
3.2.4 Biochemische Charakterisierung der 68 kD-Form von LeSBT1............ 39
3.2.4.1 Glucagon als Substrat der 68 kD und der 73 kD-Formen
von LeSBT1........................................................................................... 39
3.2.4.2 Zeitabhängigkeit der proteolytischen Spaltung von Glucagon............... 40
3.2.4.3 pH-Abhängigkeit der proteolytischen Spaltung von Glucagon .............. 42
3.2.4.4 Der Einfluß von Proteaseinhibitoren auf die
proteolytische Spaltung von Glucagon................................................... 44
3.2.4.5 Temperaturstabilität der 68 kD-Form von LeSBT1................................ 45
3.2.4.6 Substratspezifität von LeSBT1 ............................................................... 45
3.2.4.7 Hydrolyse AMC-gekoppelter Oligopeptide als Substrate ...................... 47
3.2.4.8 Test auf Glykosylierung.......................................................................... 48
3.2.5 Immunolokalisation von LeSBT1 ........................................................... 49
3.2.5.1 Test der Antiseren auf Kreuzreaktivität .................................................. 49
3.2.5.2 Lokalisation von LeSBT1 in Blüten ....................................................... 50
3.3 Heterologe Expression von LeSBT2....................................................... 53
3.3.1 Zeitabhängigkeit der heterologen Expression und Vergleich
der beiden exprimierten Formen von LeSBT2 ....................................... 54
IV
3.3.2 Anreicherung des exprimierten Proteins................................................. 55
3.4 Analyse der phylogenetischen Verwandtschaft der
aktiven Domänen verschiedener Subtilasen ........................................... 57
4. Diskussion ............................................................................................................ 61
5. Literaturverzeichnis............................................................................................ 78
Danksagung ................................................................................................................... 90
Lebenslauf ..................................................................................................................... 91
V
Abkürzungsverzeichnis
AcNPV Autographa californica nuclear polyhedrosis virus
AMC Amino-4-Methylcoumarin
BAPTA 1,2-Bis-(2-Aminophenoxy)ethan-N,N,N‘,N‘-Tetraessigsäure
bp Basenpaare
cDNA zur Boten-RNA komplementäre DNA (‚complementary DNA‘)
DIG Digoxigenin
DMSO Dimethylsulfoxid
ds doppelsträngig (in bezug auf DNA)
DTT Dithiothreitol
GST Glutathion-S-Transferase
HEPES 2-[4-(2-Hydroxymethyl)-1-Piperazino]-Ethansulfonsäure
kb Kilobasen
MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization – Time of flight
MES 2-(N-Morpholino)-Ethansulfonsäure
MOI ‚multiplicity of infection‘= Viren pro Zelle bei Infektion
mRNA Boten RNA (‚messenger RNA‘)
PC Proprotein-Konvertase
pfu ‚plaque forming unit‘ = Einzelvirus
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PVDF Polyvinyliden-Difluorid
LeSBTx Subtilisin-ähnliche Protease aus Lycopersicon esculentum
SDS Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
SPC Subtilisin-ähnliche Proprotein-Konvertase
TFA Trifluoressigsäure
TLCK Nα-p-Tosyl-L-Lysin-Chloromethylketon
TPCK L-1-Tosylamido-2-Phenylethyl-Chloromethylketon
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Upm Umdrehungen pro Minute
Aminosäuren werden in der Ein- oder Dreibuchstabenschreibweise dargestellt.
VI
Zusammenfassung
Erst vor kurzem ist die Existenz von Subtilisin-ähnlichen Proteasen in Pflanzen gezeigt
worden. Dabei ist die Untersuchung in Tomate (Lycopersicon esculentum) am weitesten
fortgeschritten. In dieser Pflanze konnten bereits 15 Gene identifiziert werden, die für
derartige Enzyme kodieren, deren Funktion in vivo jedoch bisher unklar ist.
Die vollständigen für die respektiven Präproproteine kodierenden, offenen Leserahmen
von vier Mitgliedern der Tomaten-Subtilasefamilie (LeSBTs) wurden im
Baculovirus/Insektenzell-System exprimiert. Dabei wurde für LeSBT1, LeSBT2 und
LeSBT3 eine unlösliche intrazelluläre und eine lösliche sekretierte Form identifiziert.
Im Falle von LeSBT4A konnte keine sekretierte Form detektiert werden. Für LeSBT1
und LeSBT2 ergab die N-terminale Ansequenzierung der intrazellulären Formen, daß es
sich hierbei um das Proprotein, d.h. das Polypeptid ohne das Signalpeptid, handelt. Die
starke Akkumulation dieser unlöslichen Form wird als Artefakt betrachtet, der auf eine
Überlastung des sekretorischen Systems zurückzuführen ist. Während LeSBT2 nur
partiell angereichert werden konnte, konnte die lösliche Form von LeSBT1 bis zur
Homogenität gereinigt werden. Es wurde eine Ausbeute von ca. 1,5 mg homogenen
Proteins pro Liter Insektenzellsuspensionskultur erzielt. Wie durch N-terminale
Ansequenzierung gezeigt, lag LeSBT1 in einer prozessierten Form vor, der neben dem
Signalpeptid auch die Prodomäne fehlte. Die Abspaltung der Prodomäne erwies sich
jedoch als nicht ausreichend für die Aktivierung des Zymogens. Vielmehr ist noch eine
weitere N-terminale Abspaltung von 21 Aminosäuren notwendig, welche in einem
autokatalytischen, vermutlich intermolekularen Prozeß erfolgt. Für diese Prozessierung
konnte, ebenso wie für die Prozessierung von Peptidsubstraten, eine deutliche pH-
Abhängigkeit festgestellt werden. Das Optimum lag im sauren pH-Bereich (pH 4,0 bis
pH 4,5), bei Bedingungen also, wie sie am angenommenen Lokalisationsort von
LeSBT1, dem Apoplasten, vorherrschen. Im Vergleich mit anderen pflanzlichen
Subtilasen, die eine eher breite Substratspezifität aufweisen, konnte für LeSBT1 eine
deutlich eingeschränktere Substratspezifität mit einer Präferenz für Gln bzw. Leu in der
P1-Position nachgewiesen werden. Diese Eigenschaften, in Verbindung mit der
phylogenetischen Verwandtschaft zu tierischen Proprotein-Konvertasen der Pyrolysin-
Familie, machen LeSBT1 zu einem guten Kandidaten für eine pflanzliche Subtilase, die
in der selektiven Proteinprozessierung involviert ist.
VII
Abstract
Very recently subtilisin-like proteases have been discovered in plants. Most data have
been obtained in tomato (Lycopersicon esculentum), where 15 genes encoding
subtilases (LeSBTs) have been identified. But their function in vivo still remains
unclear.
For four tomato subtilases, the entire ORFs encoding the respective preproproteins,
were expressed in the baculovirus/insect cell system. In the case of LeSBT1, LeSBT2
and LeSBT3 two forms of the proteins were identified, an intracellular insoluble and a
secreted soluble form. For LeSBT4A no secreted form was detectable. The intracellular
forms of LeSBT1 and LeSBT2 were lacking their signalpeptides, as shown by N-
terminal sequence analysis. The accumulation of the insoluble form is thought to be an
artifact caused by the limited capacity of the secretory pathway. LeSBT2 was enriched
and LeSBT1 was purified to homogeneity, with a yield of 1.5 mg of pure protein per
liter of insect cell suspension culture. As shown by N-terminal sequence analysis,
LeSBT1 was processed, lacking both the signalpeptide and the prodomain. Cleavage of
the prodomain, however, was not sufficient for the activation of the zymogen. Further
processing of 21 N-terminal amino acids in an autocatalytic, presumably bimolecular
process ist necessary for activation. The autocatalytic processing as well as the
processing, of peptide substrates was strictly pH-dependent The pH-optimum for
activity was in the acidic range (pH 4.0 to pH 4.5), which is consistent with the
presumed localization of LeSBT1 in the apoplast of the plant cell. Compared to other
plant subtilases, lacking a defined substrate specificity, LeSBT1 exhibits a narrower
substrate specificity with preference for Gln or Leu in the P1-position. These features
and the phylogenetic relationship to mammalian proprotein convertases of the
pyrolysin-family support a role for LeSBT1 in selective proprotein processing.
1
1. Einleitung
Proteolyse ist ein elementarer Bestandteil physiologischer Prozesse in allen lebenden
Organismen. Dabei reichen die biochemischen Funktionen der verschiedenen Endo- und
Exoproteasen von der spezifischen Prozessierung von Präproproteinen, über die
spezifische Inaktivierung von Enzymen, bis hin zur völlig unspezifischen Zerlegung
von Proteinen in ihre Grundbausteine, die Aminosäuren, um diese für den Aufbau neuer
Proteine bereitzustellen. Durch diese Bandbreite proteolytischer Prozesse können so
unterschiedliche Abläufe wie Entwicklung, Antwort auf verschiedene Stressfaktoren
und Anpassung an veränderte Umweltbedingungen moduliert werden. Das Prinzip der
proteolytischen Spaltung einer Peptidbindungen ist dennoch bei allen Proteasen das
gleiche: Die Addition von H2O in eine Amidbindung durch einen nukleophilen Angriff
am Kohlenstoffatom der Carbonylgruppe unter Auflösung der entsprechenden Bindung.
Der genaue Mechanismus und die beteiligten Aminosäureseitenketten im aktiven
Zentrum der Proteasen variieren jedoch sehr stark und dienen als Grundlage für die
Klassifizierung in Serin-, Cystein-, Threonin-, Metallo- und Aspartatproteasen
(Übersicht zur Klassifizierung in BARRETT et al., 1998).
Die Serinproteasen sind eine der am besten untersuchten Klassen von Proteasen. Sie
sind charakterisiert durch einen reaktiven Serinrest, der in den meisten Fällen mit einem
Histidin- und einem Aspartatrest eine sogenannte katalytische Triade im aktiven
Zentrum des Enzyms bildet. Vergleiche von Aminosäureresten der katalytischen Triade
und der Kristallstrukturen einzelner Vertreter der Klasse der Serinproteasen haben zu
einer Unterteilung in verschiedene Klans geführt, wie etwa die Chymotrypsine und die
Subtilasen (RAWLINGS und BARRET, 1994). Zwischen verschiedenen Klans
bestehen große Unterschiede in der Aminosäuresequenz, sowie in der Reihenfolge der
Aminosäuren der katalytischen Triade, was eine phylogenetische Verwandtschaft
unwahrscheinlich macht. Vermutlich ist die funktionelle Ähnlichkeit dieser Enzyme
vielmehr auf eine unabhängige, konvergierende Evolution zurückzuführen (SIEZEN et
al., 1991; RAWLINGS und BARRET, 1994).
Von den Subtilasen wurde lange Zeit angenommen, daß sie nur in Prokaryonten
vertreten sind. Die Identifizierung der Subtilisin-ähnlichen Kex2p-Protease der Hefe
Saccharaomyces cerevisiae, die für die Reifung des Pheromons α-Faktor verantwortlich
2
ist (JULIUS et al., 1984), bereitete jedoch den Weg für die Entdeckung von Subtilasen
in nahezu allen eukaryontischen Organismen. Zwischen 1991 und 1997 wurden alleine
100 der bis dahin bekannten 200 Mitglieder dieser Familie identifiziert (SIEZEN et al.,
1991; SIEZEN und LEUNISSEN, 1997). Basierend auf Sequenzvergleichen wurden die
Subtilasen in sechs Familien unterteilt, die in ihrer relativen Verwandschaft in Abb. 1
dargestellt sind.
Subtilisin
Thermitase
Kexin
Pyrolysin
Proteinase K
LantibiotischePeptidasen
Abb. 1: Subtilasefamilien innerhalb des Klans der Subtilisin-ähnlichen Serinproteasen.
Die Verwandschaft zwischen den Familien ist dargestellt durch einen
phylogenetischen Baum, basierend auf einem Sequenzvergleich der katalytischen
Domänen einzelner Proteasen. (Aus SIEZEN und LEUNISSEN; 1997)
Drei dieser Familien, die Thermitase-, die Subtilisin- und die Lantibiotische Peptidasen-
Familie enthalten ausschließlich prokaryontische Vertreter. In der Proteinase K-Familie
finden sich neben Subtilasen aus Prokaryonten auch solche aus Hefen und Pilzen. Die
Pyrolysin-Familie ist eine sehr heterogene Gruppe, mit Vertretern aus den
unterschiedlichsten Organismen, vom Bakterium bis zum Menschen. In der Kexin-
Familie schließlich sind nur noch Subtilasen aus eukaryontischen Organismen,
namentlich aus Hefen und Tieren, vertreten.
Im Hinblick auf die Subtilasen in Pflanzen sollen im folgenden die Kexin- und die
Pyrolysin-Familie detaillierter beschrieben werden. Die Mitglieder der Kexinfamilie,
wozu die meisten tierischen Subtilasen gehören, zeichnen sich durch eine gemeinsame
Substratspezifität mit einer Präferenz für basische Aminosäuren in den Positionen P1
3
und P2 aus. (Nach der Nomenklatur von SCHECHTER und BERGER, 1967, sind das
die erste und zweite Aminosäure amino-terminal der hydrolysierten Bindung im
Substrat.) Außerdem sind für die Substraterkennung in einigen Fällen noch weitere
basische Aminosäuren in den Positionen P4 und/oder P6 notwendig (BARR, 1991;
WATANABE et al., 1992; SEIDAH und CHRÉTIEN, 1997; BEVAN et al., 1998). Die
meisten Subtilasen dieser Gruppe erfüllen spezifische Prozessierungsaufgaben, d.h. sie
sind für die Reifung der Proteinvorstufen von Peptidhormonen, Wachstumsfaktoren und
Neuropeptiden verantwortlich (JULIUS et al., 1984; BARR, 1991; SEIDAH und
CHRÉTIEN, 1997; CREEMERS et al., 1998). Interessant ist in diesem Zusammenhang,
daß die Existenz von Proteasen mit dieser Spezifität bereits gefordert wurde, bevor sie
tatsächlich nachgewiesen werden konnten. In einer großen Anzahl tierischer Proproteine
und Prohormone sind die Übergänge zwischen Prodomäne und aktivem Peptid durch
Paare basischer Aminosäuren definiert (siehe in SEIDAH und CHRÉTIEN, 1997, sowie
die darin enthaltenen Literaturhinweise). Die oben bereits erwähnte Entdeckung, daß die
Protease Kex2p aus Hefe genau diese Spezifität aufweist (FULLER et al., 1989a),
brachte bei der Suche nach vergleichbaren Enzymen im tierischen System den
Durchbruch. Datenbanksuchen mit der Sequenz des kex2-Gens führten zur
Identifizierung des tierischen fur-Gens, das die erste bekannte Proproteinkonvertase -
Furin - kodiert (FULLER et al., 1989b). Inzwischen sind sieben verschiedene
Proproteinkonvertasen charakterisiert worden (Übersicht u.a. in SEIDAH et al., 1994;
SEIDAH und CHRÉTIEN, 1997; ZHOU et al., 1999).
Die Subtilasen der Pyrolysin-Familie dagegen, weisen keine gemeinsame
Substratspezifität auf, vielmehr ist diese Gruppe durch ihre große Heterogenität, sowohl
in bezug auf die Herkunft der hier vertretenen Enzyme (Prokaryonten, Pflanzen, Tiere)
als auch in bezug auf die Substratspezifität, gekennzeichnet. Die grössere
Verwandschaft der Pyrolysine zu den Subtilisinen im Vergleich zu den Kexinen
(SIEZEN und LEUNISSEN, 1997) hatte zunächst vermuten lassen, daß diese auch die
geringe Substratspezfität der Subtilisine teilen, weswegen eher eine degradative als eine
prozessierende Funktion wahrscheinlich schien.
In jüngster Zeit konnten jedoch vier tierische Pyrolysine identifiziert werden, die sich
durch eine hohe Substratspezifität, welche sich deutlich von derjenigen der Kexine
unterscheidet, und durch eine definierte, Proprotein prozessierende Funktion
4
auszeichnen: Die „Site-1“-Protease (S1P) aus Hamster (DUNCAN et al., 1997; SAKAI
et al., 1998), das Subtilisin/Kexin-Isozym 1 (SKI1) aus Ratte, Maus und Mensch
(SEIDAH et al. 1999) und die PfSUB1- und -2-Proteasen aus Plasmodium falciparum
(BLACKMAN et al., 1998; BARALE et al., 1999). Ebenfalls in die Gruppe der
Pyrolysine werden alle bisher bekannten Subtilasen höherer Pflanzen eingeordnet.
Die Existenz von Kexin-ähnlichen Subtilasen in Pflanzen wird, ähnlich wie zu Beginn
für die Prohormonkonvertasen, zunächst nur aufgrund indirekter Hinweise postuliert. In
transgenen Tabakpflanzen wurde etwa der Vorläufer des Killertoxins KP6 exprimiert,
korrekt prozessiert und sekretiert (KINAL et al., 1995; PARK et al., 1996). Dieses
Toxin wird von einem Doppelstrang-RNA Virus kodiert, der in einigen Stämmen des
für Mais pathogenen Pilzes Ustilago maydis vorkommt. Die korrekte Prozessierung und
Sekretion des Toxins in U. maydis erfordert aber eine Kex2p-ähnliche Proteaseaktivität
im sekretorischen System (TAO et al., 1990). Daher wurde angenommen, daß auch in
Tabakpflanzen eine solche Proteaseaktivität existieren muß. GU et al. (1996) konnten
zeigen, daß die Proform der Leucinaminopeptidase A (LAP-A) aus Tomate nahe der
Spaltstelle des Propeptids zwei dibasische Aminosäuremotive aufweist. Die Autoren
diskutieren daher die Spaltung durch eine Kex2-ähnliche Protease an dieser Stelle und
die anschließende autokatalytische Verkürzung des N-Terminus bis zur reifen LAP-A.
Ein weiterer indirekter Hinweis auf die Existenz von Subtilasen in Pflanzen war die
Identifizierung von SBP50, einem Protein, das spezifisch mit dem Wundsignalpeptid
Systemin der Tomate interagiert (SCHALLER und RYAN, 1994). Systemin weist ein
typisches dibasisches Spaltmotiv (Lys9-Arg10) für Subtilasen der Kexin-Familie auf.
Desweiteren war eine Immunodekorierung von SBP50 mit einem Antikörper gegen eine
Prohormonkonvertase aus Drosophila möglich. Diese Daten führten zu der Annahme,
daß SBP50 möglicherweise eine Prohormonkonvertase-ähnliche Protease ist. Später
konnte gezeigt werden, daß Systemin in vivo tatsächlich C-terminal der beiden
basischen Aminosäuren prozessiert wird (SCHALLER, 1998).
Neben Systemin sind in letzter Zeit noch einige weitere pflanzliche Peptide, wie etwa
die Phytosulfokine und Enod40 identifiziert worden, die spezifische zelluläre Antworten
hervorrufen und somit in ihrer Funktion den tierischen Peptidhormonen vergleichbar
sind. Für die Phytosulfokine, die für die Zellteilung in Pflanzensuspensionskulturen
verantwortlich sind (MATSUBAYASHI und SAKAGAMI, 1996), konnte gezeigt
5
werden, daß ihr Gen ein Präproprotein kodiert (YANG et al., 1999). Dies macht eine
proteolytische Aktivierung nötig, wie sie für Peptidhormone in Tieren durch die
Proproteinkonvertasen geleistet wird.
Es ist jedoch bis heute nicht gelungen, eine pflanzliche Subtilase der Kexin-Familie mit
einer Substratspezifität für dibasische Motive zu identifizieren. Alle bisher
charakterisierten pflanzlichen Subtilasen werden aufgrund ihrer Sequenz nicht in die
Kexin- sondern in die Pyrolysin-Familie eingeordnet. Die erste identifizierte und
klonierte pflanzliche Subtilase ist Cucumisin, eine extrazelluläre Protease, die in großen
Mengen in Früchten von Cucumis melo vorkommt (KANEDA und TOMINAGA, 1975;
YAMAGATA et al., 1994; YAMAGATA et al., 1994; KANEDA et al., 1995).
Inzwischen ist jedoch auch in Pflanzen die Anzahl identifizierter Subtilasen erheblich
gestiegen. (RUDENSKAYA et al., 1995 und 1998; RIBEIRO et al., 1995; TAYLOR et
al., 1997; SABALA et al., 1997; UCHIKOBA et al., 1998; JIANG und ROGERS,
1999; MEICHTRY et al., 1999; NEUTEBOOM et al., 1999). Viele von ihnen, wie z.B.
Cucumisin (UCHIKOBA et al., 1995; KANEDA et al., 1995), Taraxalisin
(RUDENSKAYA et al., 1998) und Macluralisin (RUDENSKAYA et al., 1995),
scheinen eine breite Substratspezifität zu besitzen und erfüllen daher wahrscheinlich
degradative Funktionen in Fruchtreifung oder Blattseneszenz. Die wenigen
Anhaltspunkte für spezifische Aufgaben von Subtilasen in physiologischen Abläufen
der Pflanze, basieren im wesentlichen auf Expressionsstudien. Für LIM9, eine
extrazelluläre Protease aus Lilium longiflorum, konnte zum Beispiel eine differentielle
Expression in Tapetumzellen während der späten Phase der Microsporenentwicklung in
Antheren gezeigt werden. Dies deutet auf eine Funktion in der Pollenentwicklung hin
(TAYLOR et al., 1997). Das ag12-Gen aus Alnus glutinosa, welches für eine Subtilase
kodiert, wird in der frühen Phase der Knöllchenentwicklung im Rahmen der Symbiose
mit Actinomyzeten exprimiert und hat eventuell eine Funktion in der Interaktion mit
dem Symbionten (RIBEIRO et al. 1995).
Ausführliche Expressionsstudien wurden auch an Subtilasen (SBTs) der Tomate
(Lycopersicon esculentum, Le) unternommen. In dieser Pflanze sind bisher 15
Subtilisin-ähnliche Proteasen identifiziert worden (VERA und CONEJERO, 1988;
TORNERO et al., 1996 und 1997; JORDÁ et al., 1999; JORDÁ et al., 2000;
MEICHTRY et al., 1999). Für die meisten von ihnen liegen auf DNA und RNA-Ebene
6
sehr detallierte Daten vor. Aufgrund von Sequenzähnlichkeiten läßt sich die
Subtilasefamilie in Tomate in fünf Unterfamilien unterteilen (P69, LeSBT1, LeSBT2,
LeSBT3/4, TMP). Den Tomatenproteasen P69A und P69D wird eine Rolle in der
Pflanzenentwicklung zugesprochen, da sich in deren Verlauf das Expressionsprofil
dieser beiden Subtilasen stark verändert (JORDÁ et al., 1999). Für die zwei sehr nahe
verwandten Tomatensubtilasen P69E und P69F wird eine mögliche Rolle in der
primären Verteidigung gegen Pathogenbefall diskutiert, da sie eine sehr restriktive
Expression in Wurzeln bzw. Hydathoden aufweisen, also an optimalen Eintrittsorten für
Pathogene (JORDÁ et al., 2000). P69B und P69C werden nach bereits erfolgtem
Pathogenbefall, sowie nach Behandlung mit Salicylsäure oder dem pilzlichen Toxin
Fusicoccin exprimiert und spielen daher eventuell eine Rolle in der Pathogenantwort der
Tomatenpflanze (JORDÁ et al., 1999; SCHALLER et al., 2000).
Die Tomatensubtilasen der LeSBT-Unterfamilien werden konstitutiv exprimiert. Dabei
weisen LeSBT1, LeSBT2 und LeSBT4A eine Gewebespezifität auf, während die mRNA
von LeSBT3, wenn auch in unterschiedlichen Mengen, in allen untersuchten Geweben
vorhanden ist. Auffällig ist, daß die Subtilasen LeSBT1 und LeSBT2 in keinem Gewebe
gemeinsam exprimiert werden (MEICHTRY et al., 1999).
Für keine der LeSBTs ist jedoch die in vivo-Funktion bekannt. Ein möglicher Ansatz zu
deren Aufklärung ist die biochemische Charakterisierung dieser Subtilasen. Die
Komplexität der Subtilasefamilie in Tomate läßt die Reinigung einer einzelnen Protease
ex planta jedoch als recht schwierig erscheinen und daher schien eine heterologe
Expression angezeigt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Baculovirus/Insektenzell-
Expressionssystem etabliert werden, das für korrekte posttranskriptionelle und
posttranslationelle Modifikationen bei der Expression von eukaryontischen Proteinen
bekannt ist. Weiteres Ziel war die Entwicklung von Reinigungsprotokollen für die
heterolog in diesem System exprimierten Proteasen sowie ihre grundlegende
biochemische Charakterisierung. Hierbei sollten insbesondere die Prozessierung der als
Präproproteine kodierten Subtilasen sowie ihre Substratspezifität untersucht werden.
7
2. Material und Methoden
2.1 Chemikalien, Proteine und Enzyme
2.1.1 Chemikalien
Für Arbeiten mit dem Insektenzell/Baculovirus-Expressionssystem:
Niedrigschmelzende Agarose, ultra pure von Gibco BRL (Basel, Schweiz), Pluronic F-
68 von Sigma (Buchs, Schweiz), Streptomycin/Penicillin von Seromed (Berlin,
Deutschland).
Für die Immunolokalisation:
Paraffin Paraplatt Plus von Sigma; Formaldehyd, 16% (v/v), ultrapure EM grade, von
Polyscience (Warrington, USA); „Blocking“-Pulver, Blotting grade, von BioRad
(Glattbrugg, Schweiz), Xylol, Isomerengemisch von Fluka (Buchs, Schweiz)
Alle nicht gesondert aufgeführten Chemikalien wurden von Fluka, Aldrich, Sigma
(Buchs, Schweiz), ICN (Meckenheim, Deutschland), Gibco BRL oder BioRad bezogen.
2.1.2 Proteine, Enzyme
Proteine: BSA als Eichprotein von Pierce/Socochim (Lausanne, Schweiz); Glucagon,
Insulin, Mellitin und oxidierte Insulin-B-Kette von Sigma; AMC-gekoppelte Peptide
von Bachem (Bubendorf, Schweiz)
Enzyme: Stoffelfragment der Taq DNA-Polymerase von Perkin Elmer (Paul Bucher,
Rotkreuz, Schweiz); Pwo-Polymerase von Roche Diagnostics (Rotkreuz, Schweiz);
Subtilisin Carlsberg [EC 3.4.21.62] aus Bacillus licheniformis von Sigma;
Restriktionsenzyme von MBI Fermentas (Basel, Schweiz) oder Roche Diagnostics.
2.2 Nukleinsäuren
2.2.1 Vektoren
Der Vektor BacPAK8 (Clontech, Palo Alto, USA) wurde für die Kotransfektion mit
viraler AcNPV-DNA zur Gewinnung rekombinanter Baculoviren eingesetzt. Die
Vektoren pGEX-2T, pGEX-3X (Amersham Pharmacia Biotech, Zürich, Schweiz)
dienten der Überexpression von Glutathion-S-Transferase(GST)-Fusionsproteinen.
8
2.2.2 Synthetische Oligonukleotide
Die folgenden synthetischen Oligonukleotide wurden durch die Firma Microsynth
(Balgach, Schweiz) hergestellt und dienten der Einfügung von Restriktionsschnittstellen
mittels PCR bzw. der Sequenzierung.
Tab. 1: Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide.
Einzufügende Schnittstellen sind unterstrichen, Start- bzw. Stopp-Codons sind fett
dargestellt.
Oligo Sequenz Spezifität,
eingefügte Schnittstelle
2BP5 5‘GGGGATCCCATAAAGATGGAAAGACTCAGG 5‘Bereich LeSBT1, BamHI
2BP3 5‘GGTCTAGAAGAATCATGTCCAGCTGAAAGC 3‘Bereich LeSBT1, XbaI
11BP5 5‘GGAGATCTAAAATGGCTGGAATGCTACTG 5‘Bereich LeSBT2, BglII
11BP3 5‘GGGAATTCTGAACTATACTGATGCTAGCC 3‘Bereich LeSBT2, EcoRI
3BP5 5‘GAGCTGCAGAATGGAGTTACTTCATCTTC 5‘Bereich LeSBT3, PstI
3BP3 5‘ATCCCCGGGTTATTACCAGACCTCAATAA 3‘Bereich LeSBT3, SmaI
4BP5 5‘CGGGATCCAATGGGATCAAGAAACATTTG 5‘Bereich LeSBT4, BamHI
4BP3 5‘GCTCTAGACTTAATCTTCTGCACCCCAC 3‘Bereich LeSBT4, XbaI
2.3 Biologisches Material
2.3.1 Bakterienstämme
Subklonierungen wurden unter Verwendung der E.coli-Stämme DH5α (Gibco BRL)
oder XL1 Blue (Stratagene, Zürich, Schweiz) durchgeführt.
2.3.2 Insektenzellen
Die heterologe Expression erfolgte in der Zelllinie IPLB-Sf21 (Clontech), einer
Zelllinie, welche ursprünglich aus den Mitteldarmzellen der Larven von Spodoptera
frugiperda gewonnen wurde.
9
2.3.3 Pflanzen
Für die Immunolokalisationsexperimente wurden Tomatenpflanzen (Lycopersicon
esculentum Mill.) der Varietät Moneymaker verwendet.
2.4 Anzucht des biologischen Materials
2.4.1 Bakterien
Die Anzucht von E.coli erfolgte, wenn möglich unter Selektionsdruck, auf Fest- oder
Flüssigvollmedien nach AUSUBEL et al. (1994) über Nacht bei 37°C.
2.4.2 Insektenzellen
Die Anzucht der Insektenzellen erfolgte unter zwei verschiedenen Kulturbedingungen,
der Monolayer- und der Suspensionskultur. Beide Kulturen wurden bei einer konstanten
Temperatur von 28°C unter sterilen Bedingungen angezogen. Die Monolayer wurden in
Gewebekulturflaschen oder 6-Kammer-Gewebekulturschalen (vgl. Kap. 2.4.2.1) in
Brutschränken inkubiert. Die Suspensionszellen wurden in sterilen Glas-
Erlenmeyerkolben mit Baumwollstopfen, in Schüttelwasserbädern bei einer
Rotationsgeschwindigkeit von 140 Upm angezogen.
Kulturen beider Kulturarten wurden zur Erhaltung wöchentlich passagiert. Für die
Monolayer wurden dazu die den Boden vollständig bedeckenden Zellen einer Typ I-
Kulturflasche (siehe Kap. 2.4.2.1), mittels eines Zellschabers in 10 ml frischem Medium
resuspendiert. Mit 2 x 106 Zellen dieser Zellsuspension wurden dann 15 ml frisches
Medium in einer Typ I-Kulturflasche inokuliert und wiederum für ca. eine Woche
inkubiert. Für die Erhaltung der Suspensionskulturen wurden jeweils 100 ml frisches
Medium in einem 250 ml Erlenmeyerkolben mit 4 x 107 Zellen einer 7 Tage alten
Suspensionskultur inokuliert. Die Bestimmung der Lebendzelldichte erfolgte dabei
unter Verwendung eines Hämocytometers nach Trypanblaufärbung der toten Zellen.
10
Medien: Serumhaltiges Medium: Grace’s Insektenmedium (Gibco BRL) supplementiert mit 10%
fötalem Kälberserum („insect qualified“, Gibco BRL), 50 µg/ml Streptomycin und 50
U/ml Penicillin.
Serumfreies Medium: Sf-900 Basal Powdered Medium (GibcoBRL) nach Hersteller-
angaben aufbereitet, supplementiert mit 12,5 µg/ml Streptomycin, 12,5 U/ml Penicillin.
Für den Einsatz in Suspensionskulturen wurden die Medien jeweils mit 0,1% (w/v)
Pluronic F-68 supplementiert. Die Sterilisation aller Medien bzw. der Einzel-
komponenten erfolgte ausschliesslich durch Sterilfiltration.
Gewebekulturmaterialien:
Alle hier aufgeführten Materialien wurden von der Firma Falcon (Vertretung Schweiz)
bezogen.
- 6-Kammer-Polystyren-Gewebekulturplatte, flacher Boden, Deckel für schwache
Verdunstung, Bodenfläche pro Kammer ca. 9,6 cm2
- 250 ml-Zellkulturflasche, Polypyrene, Schräghals, Bodenfläche 75 cm2 , Typ I
- 750 ml-Zellkulturflasche, Polypyrene, Gradhals, Bodenfläche 175 cm2, Typ II
2.4.3 Pflanzen
Tomatenpflanzen Lycopersicon esculentum wurden im Gewächshaus oder in
Klimakonstantkammern bei einer Tagestemperatur von 25°C und einer Nachttemperatur
von 18°C angezogen. Die Tageslänge betrug 16,5 Stunden bei einer Lichtintensität von
≥ 140 µMol Photonen m-2s-1.
2.5 Molekularbiologische Methoden
Alle grundlegenden molekularbiologischen Methoden wurden den Protokollen von
AUSUBEL et al. (1994) und SAMBROOK et al. (1989) entnommen.
11
2.5.1 Isolierung von Plasmid-DNA
Die Isolierung von Plasmid-DNA in kleinem Maßstab aus E. coli erfolgte mittels
alkalischer Lyse nach BIRNBOIM u. DOLY (1979) aus 1,5 ml einer über Nacht
angezogenen 2 ml Kultur. Die Isolierung von Plasmiden im großen Maßstab erfolgte
mit dem Wizard Plus Midiprep-System von Promega (Madison, USA) nach den
Angaben des Herstellers.
2.5.2 Transformation von E. coli.
Die Transformation kompetenter Zellen mit zirkulärer Plasmid-DNA erfolgte nach der
Methode von INOUE et al. (1990).
2.5.3 In vitro-Rekombination von DNA
DNA wurde mit Typ II-Restriktionsendonukleasen (MBI Fermentas) nach
Herstellerempfehlung restringiert und durch Agarosegelelektrophorese (Kap. 2.5.4)
aufgetrennt. Die Ligation von DNA-Fragmenten in entsprechend restringierte Plasmid-
Vektoren erfolgte nach AUSUBEL et al. (1994).
2.5.4 Gelelektrophoretische Trennung von Nukleinsäuren
Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten wurden 0,8 bis 1,2 %ige (w/v) Agarosegele in
TAE-Puffer (40 mM Tris/Acetat, 1 mM EDTA, pH 8,0) unter Verwendung horizontaler
Eleketrophorese-Apparaturen genutzt. Als Größenvergleich diente die 1 kb-DNA-Leiter
(Gibco BRL).
2.5.5 Isolierung von Nukleinsäuren aus Agarosegelen
Zur Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde das Prep-A-Gene-
System von BioRad (Glattbrugg, Schweiz) gemäß den Herstellerangaben verwendet.
2.5.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Polymerase Kettenreaktionen (SAIKI et al., 1988) wurden nach den Vorschriften des
Herstellers der verwendeten Polymerasen in einem DNA Thermal Cycler (Perkin
12
Elmer) durchgeführt. Abweichungen von den Standardvorschriften sind unter den
jeweiligen Methodenkapiteln spezifiziert.
2.5.7 DNA-Sequenzierung
Die Sequenzierung von doppelsträngiger DNA erfolgte nach der Didesoxy-
Kettenabbruchmethode (SANGER et al. 1977) unter Verwendung des ABI PRISMTM
Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Systems (Perkin Elmer) nach
Anleitung des Herstellers. Die Auftrennung der Produkte der Sequenzierreaktionen
erfolgte über 5 %ige (w/v) Polyacrylamid-Harnstoffgele im Applied Biosystems Model
373 DNA Sequenator (Perkin Elmer), ebenfalls nach Herstellerangaben.
2.5.8 Konstruktion von Plasmid-Vektoren zur heterologen Expression von
LeSBT1, -2, -3 und 4A in Insektenzellen
Bei allen im folgenden beschriebenen Klonierungen war das Ziel die Einfügung der
offenen Leserahmen (ORFs) der Subtilasen hinter den viralen Polyhedrin-Promotor im
Klonierungs- und Transfektionsvektor BacPAK8, um später, mittels einer
Kotransfektion mit viraler DNA, ein rekombinantes Virus zu erzeugen (s. Kap. 2.8). Für
alle hier klonierten Lycopersicon esculentum-Subtilasen lagen die cDNAs mit den
entsprechenden ORFs im Vektor pSK- (Stratagene) bereits vor (MEICHTRY et al.,
1999).
Klonierung des ORF von LeSBT1 in den Vektor BacPAK8:
Ein PCR-Fragment, das die das Start- und Stopp-Kodon einschliessende Sequenz von
LeSBT1 enthielt, wurde mit den Oligonukleotiden 2BP5 und 2BP3 vom cDNA-
Fragment in pSK- amplifiziert. Für die Reaktion wurden 2,5 U Taq-DNA-Polymerase
(Stoffelfragment, Perkin Elmer), 120 ng Matrizen-DNA, 800 nM der beiden
Oligonukleotide, 200 µM der einzelnen Desoxynukleotide und 2,5 mM MgCl2 in dem
entsprechenden Polymerase-Puffer des Herstellers eingesetzt. Die PCR-Bedingungen
waren: 45 s 95°C, 45 s 60°C, 5 min 74°C, 30 Zyklen. Das Produkt dieser Reaktion
wurde mit BamHI und XbaI restringiert und in den ebenfalls mit BamHI und XbaI
restringierten Vektor BacPAK8 ligiert. Die Sequenzierung des PCR-Produkts im
entstandenen Plasmid zeigte zwei fehlerhaft eingebaute Nukleotide, welche eine
13
Veränderung des translatierten Polypeptids nach sich ziehen würden. Da sich beide
fehlerhaften Nukleotide auf einem PmlI/XbaI-Fragment befanden, war es möglich
dieses auszuschneiden und durch das korrespondierende PmlI/SpeI-Fragment der
ursprünglichen cDNA zu ersetzen. Dabei wurde der Umstand ausgenutzt, daß bei der
Restriktion mit XbaI bzw. SpeI kompatible Enden generiert werden.
Klonierung des ORF von LeSBT2 in den Vektor BacPAK8:
Analog zu der oben beschriebenen PCR, welche bereits zur Amplifikation des ORF von
LeSBT1 genutzt wurde, wurde mit den Oligonukleotiden 11BP5 und 11BP3 ein PCR-
Fragment gewonnen. Nach der Restriktion mit BglII und EcoRI wurde das Produkt der
PCR-Reaktion in den entsprechend restringierten BacPAK8-Vektor ligiert. Die
Sequenzierung des entstandenen Plasmids ergab auch in diesem Fall drei fehlerhaft
eingebaute Nukleotide. Um diese zu eliminieren, wurde ein alle Fehlerbereiche
enthaltendes SpeI/NheI-Fragment gegen das korrespondierende cDNA-Fragment
ausgetauscht.
Klonierung des ORF von LeSBT3 in den Vektor BacPAK8:
Für die Amplifikation eines PCR-Fragments, das den vollständigen ORF von LeSBT3
beinhaltet, wurden in diesem Fall 2,5 U Pwo-DNA-Polymerase (Roche Diagnostics)
eingesetzt. Diese Polymerase verfügt über eine 3‘-5‘-Exonucleaseaktivität und arbeitet
daher im Vergleich zur TaqPolymerase mit einer erheblich reduzierten Fehlerrate. Der
Reaktionsansatz enthielt weiterhin 250 ng Matrizen-DNA (Volllängen-cDNA-Fragment
in pSK-), 800 nM der beiden Oligonukleotide 3BP5 bzw. 3BP3, 200 µM der einzelnen
Desoxynukleotide und den entsprechenden Polymerase-Puffer mit MgSO4 des
Herstellers. Die PCR-Bedingungen waren: 30 s 95°C, 40 s 52°C, 2 min 72°C für 10
Zyklen gefolgt von 15 Zyklen, in denen jeweils der 72°C-Schritt pro Zyklus um 20 s
verlängert wurde. Das Produkt dieser Reaktion wurde mit PstI und SmaI restringiert und
in den, ebenfalls mit PstI und SmaI restringierten Vektor BacPAK8 ligiert. Die
anschliessende Doppelstrang-Sequenzierung des enstandenen Plasmids zeigte, daß die
Sequenz des einklonierten Fragments fehlerfrei war.
Klonierung des ORF von LeSBT4A in den Vektor BacPAK8:
14
Die Amplifikation des PCR-Fragments, mit dem vollständigen ORF von LeSBT4A, zur
Klonierung in BacPAK8 erfolgte unter den gleichen Bedingungen, wie für LeSBT3
unter Kap. 2.5.8.3 beschrieben. Dabei wurden die Oligonukleotide 4BP5 und 4BP3 als
Primer verwendet. Das enstandene PCR-Produkt wurde mit BamHI und XbaI
restringiert und in den ebenfalls mit BamHI und XbaI restringierten Vektor einligiert.
Die anschliessende Doppelstrang-Sequenzierung bestätigte die fehlerfreie Amplifikation
und Insertion.
2.6 Protein-analytische Methoden
2.6.1 Methanol/Chloroform-Extraktion von Proteinen
Zur Präzipitation von Proteinen für die anschliessende Analyse auf SDS-PAGE-Gelen
wurde die Methanol/Chloroform-Extraktion nach WESSEL und FLÜGGE (1984)
eingesetzt.
2.6.2 Proteinbestimmung
Gesamtprotein wurde nach BRADFORD (1976) bestimmt. Ein Teil der zu
bestimmenden Lösung wurde mit 9 Teilen des Bradford Reagens (Pierce/Socochim)
gemischt. Die Extinktion wurde bei 595 nm gegen den entsprechenden Lösungspuffer
mit Reagens (1:10) in einem 2-Strahl Spektrophotometer (UVIKON 933 von Kontron,
Zürich, Schweiz) gemessen. Als Proteinstandard diente Rinderserumalbumin.
Alternativ wurde die Intensität einer Proteinbande auf Coomassie Brillant Blue R 250-
gefärbten SDS-PAGE-Gelen (siehe Kap. 2.6.3) mit der Intensität einer Bande einer
definierten Menge Rinderserumalbumins verglichen.
2.6.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Auftrennung von Proteingemischen erfolgte durch SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese (SDS-PAGE) in diskontinuierlichen Gelsystemen nach LAEMMLI
(1970) mit 8 oder 10%igen (w/v) Trenngelen in Mini Protean II Apparaturen von
BioRad. Als Molekulargewichtsmarker wurden Standardproteine von BioRad
15
verwendet. Die Gele wurden zum Proteinnachweis mit Coomassie Brillant Blue R 250
gefärbt.
2.6.4 Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose
(„Western-Blot“)
Der Transfer gelelektrophoretisch getrennter Proteine (Kap. 2.6.3) aus SDS-PAGE-
Gelen auf Nitrocellulosemembranen (Protran BA85, Porenweite 0,45 µm, Schleicher &
Schuell (Riehen, Schweiz)) wurde nach der Methode von TOWBIN et al. (1979)
durchgeführt. Die elektrophoretische Übertragung erfolgte dabei in 20 mM Tris, 150
mM Glycin und 20% Methanol für 2 h bei 200 mA in MiniProteanII „Western-Blot“-
Modulen der Firma BioRad. Zur reversiblen Anfärbung der Proteine wurde eine 1%ige
(w/v) Ponceau S-Lösung in 2% (v/v) Essigsäure verwendet.
2.6.5 Immunologischer Nachweis immobilisierter Proteine
Zur Immundetektion bestimmter Proteine nach Immobilisierung auf Nitrocellulose
(Kap. 2.6.4) wurden zunächst unspezifische Bindestellen durch eine mindestens 30
minütige Inkubation in TBS (20 mM Tris, pH 7,4, 135 mM NaCl) mit 5% (w/v)
Magermilchpulver abgesättigt. Die Inkubation der Membran mit den Antiseren (Kap.
2.7) erfolgte für mindestens eine Stunde im gleichen Puffer, die Verdünnung der Seren
betrug dabei im Regelfall 1:1000. Unspezifisch gebundene Antikörper wurden durch
Waschen in TBS mit 0,05% (v/v) Tween 20 entfernt (4 x 5 min). Die Markierung der
spezifisch gebundenen, polyklonalen Antikörper erfolgte durch 1-stündige Inkubation
mit einem alkalische Phosphatase gekoppelten Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin
(BioRad; Verdünnung 1:3000 in TBS mit 5% (w/v) Magermilchpulver). Nach
Entfernung unspezifisch gebundener Anikörper (s. oben) wurde die Aktivität der
alkalischen Phosphatase mit 100 µl p-Nitroblautetrazoliumchlorid (50 mg/ml in 70%
(v/v) Dimethylformamid) und 50 µl 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat p-Toluidinsalz
(50 mg/ml in Dimethylformamid) in 15 ml 100 mM Tris, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM
MgCl2 nachgewiesen.
16
2.6.6 Glycosylierungsnachweis immobilisierter Proteine
Die Detektion von Zuckerseitenketten an Proteinen, welche mittels „Western-Blot“ (s.
Kap. 2.6.4) auf Nitrocellulose immobilisiert wurden, erfolgte mit Hilfe des DIG-
Glycan-Nachweis-Kits entsprechend den Angaben des Herstellers (Roche Diagnostics).
Dabei werden zunächst die OH-Gruppen der Zucker durch eine Perjodatbehandlung zu
Aldehydgruppen oxidiert und dann über eine Hydrazid-Gruppe kovalent an einen
Digoxigenin (DIG) tragenden Spacer gebunden. Der Nachweis des DIG erfolgt
anschliessend über alkalische Phosphatase gekoppeltes anti-DIG-Immunglobulin (s.
Kap. 2.6.5)
2.6.7 Aminoterminale Sequenzierung
Die Amino-terminale Sequenzierung von gereinigten Proteinen wurde durch Dr. P.
James (Institut für Biochemie der ETH Zürich) oder Dr. R. Brunisholz (Institut für
Molekularbiologie und Biophysik der ETH Zürich) durchgeführt. Die Proben wurden
dazu nach 10minütiger Denaturierung bei 50°C auf ein SDS-PAGE-Gel aufgetragen
und anschliessend durch „Western-Blotting“ auf eine Polyvinyliden-Difluorid-(PVDF)-
Membran (Immobilon P, Porenweite 0,45 µm, von Millipore (Volketswil, Schweiz))
transferiert. Nach Färbung mit Ponceau S, wurde das entsprechende Protein-tragende
Membranstück zur Seqenzierung gegeben.
2.6.8 MALDI-TOF-MS-Analyse von Peptidgemischen
Zur Bestimmung der Massen einzelner Peptide in Peptidgemischen wurde die Matrix-
Assisted Laser Desorption/Ionization – Time of flight (MALDI-TOF)-Massenspektrum-
Analyse eingesetzt. Dazu wurde ein 1 µl Aliquot der zu analysierenden Probe auf die
MALDI-Probenplatte gegeben und dort durch Zugabe von 0,5 µl 0,5% (w/v) TFA
angesäuert. Durch Vermischen mit 3 µl einer Kristallisationsmatrix (eine gesättigte
Lösung von α-Cyano-4-hydroxy-trans-Zimtsäure in 1 Teil Acetonitril und 2 Teilen
0,1% (v/v) TFA) kommt es zu einer Co-Kristallisation von Matrix und Peptiden auf der
Probenplatte (BEAVIS et al., 1992). Von den so präparierten Proben wurde, unter
Einsatz eines Reflektrons für erhöhte Massengenauigkeit, ein Massenspektrum
aufgenommen (Massenspektrometer: Voyager Elite Biospectrometry Research Station
von PerSeptive Biosystems, Framingham, MA, USA).
17
2.7 Gewinnung polyklonaler Antiseren gegen LeSBT1 bis 4A
Alle in dieser Arbeit genutzten Antiseren lagen bereits zu Beginn vor.
2.7.1 Präparation des Antigens zur Immunisierung von Kaninchen
Die Antiseren wurden nur gegen Teilbereiche der einzelnen Subtilasen generiert
(A. SCHALLER, persönliche Mitteilung). Dazu wurden zunächst geeignete
Restriktionsfragmente der verschiedenen cDNAs ausgewählt (s. Tab.2 ) und in die
bakteriellen Expressionsvektoren pGEX-2T oder pGEX-3X (Amersham Pharmacia
Biotech) kloniert. Nach der Transformation der jeweils entstandenen Plasmide in den
E.coli-Stamm DH5α, wurde das auf den Plasmiden kodierte Fusionsprotein aus
Glutathion-S-Transferase (GST) und dem jeweiligen Protease-Fragment überexprimiert.
In allen Fällen war das Fusionsprotein unlöslich und akkumulierte in Einschluß-
körperchen. Nach Vorreinigung der Einschlusskörperchen entsprechend HARLOW &
LANE (1988) wurden diese auf 10%ige SDS-PAGE-Gele aufgetragen und nach der
Elektrophorese die Gelstücke mit dem Fusionsprotein ausgeschnitten. Diese Gelstücke
wurden an die Firma Eurogentec (Seraing, Belgien) zur Immunisierung von Kaninchen
gesandt. Nach mehrfacher Injektion des Antigens (1. Injektion: ca. 100 µg; 2. bis 4.
Injektion: ca. 50 µg) wurde 2 Wochen nach der 4. Injektion das Serum gewonnen.
Tab. 2: Darstellung der Teilbereiche von LeSBT1 bis -4A, gegen die die jeweiligen Antiseren
gerichtet sind.
Die Schnittstellen und die Länge der klonierten Restriktionsfragmente, sowie die
relativen Aminosäurepositionen des Peptids, in bezug auf die Aminosäuresequenz von
LeSBT1 bis LeSBT4A, sind dargestellt.
Protease 5‘ flankierende
Schnittstelle
3‘ flankierende
Schnittstelle
Länge des
DNA-
Fragments
Aminosäure-
position des
Peptids
Expressionsvektor und
Klonierungsschnittstelle
LeSBT1 MunI MunI 870 bp 471 - 760 pGEX-2T; EcoRI
LeSBT2 MunI MunI 705 bp 308-542 pGEX-2T; EcoRI
LeSBT3 EcoRI MunI 1287 bp 207-635 pGEX-3X; EcoRI
LeSBT4A EcoRI EcoRI (1) 1701 bp 215-779(1) pGEX-3X; EcoRI
(1) Die cDNA wurde zunächst mittels PCR amplifiziert. Dabei wurde hinter dem Stoppkodon die EcoRI-Schnittstelle eingefügt, welche für die Klonierung genutzt wurde.
18
2.7.2 Test der Antiseren auf Spezifität bzw. Kreuzreaktivität
Zur Analyse der einzelnen Seren bezüglich ihrer Spezifität für die jeweiligen Proteasen
wurden Proteinfraktionen, welche die in Insektenzellen überexprimierten Proteine
LeSBT1 bis 4 enthielten, mittels ‘Western-Blot‘ auf Nitrocellulose übertragen. Jede
Probe enthielt ca. 2 µg zellulären Proteins von in serumhaltigen Monolayerkulturen
angezogenen Zellen, 96 h nach Infektion mit dem entsprechenden Virus (s. Kap. 2.8).
Im weiteren wurden die immobilisierten Proteine, entsprechend dem Protokoll aus Kap.
2.6.5, mit den Seren (Verdünnung 1:1000) über Nacht inkubiert und die gebundenen
Antikörper nachgewiesen.
2.7.3 Gewinnung der IgG-Fraktion aus Antiseren
Die Reinigung der IgG-Fraktion aus polyklonalen Antiseren erfolgte nach der in
HARLOW & LANE (1988) beschriebenen Methode chromatographisch über eine
Protein A-Sepharose-Säule (Sigma).
2.8 Heterologe Expression in Insektenzellen
In dieser Arbeit wurde ein eukaryontisches Expressionssystem eingesetzt, welches auf
der Infektion von Insektenzellen (IPLB Sf21) mit einem rekombinanten Baculovirus
(Autographa californica nuclear polyhedrosis Virus (AcNPV), ds DNA-Virus, 134 kb)
basiert. Dieses System bietet den Vorteil korrekter posttranskriptioneller und
posttranslationaler Modifikationen bei der heterologen Expression eukaryontischer
Proteine. Dabei wird zunächst der zu exprimierende ORF in einen Klonierungs- und
Transfektionsvektor (BacPAK8) hinter einen starken viralen Promotor kloniert (s. Kap.
2.5.8). Dieser Promotor gehört zum Polyhedrin-Gen, welches für ein Matrixprotein der
Polyhedra kodiert, das erst in der späten Phase des Infektionszyklus exprimiert wird.
Für Replikation und Infektion ist es nicht essentiell und kann daher durch Fremd-DNA
ersetzt werden. Wird der rekombinante BacPAK8-Vektor durch eine Kotransfektion mit
viraler DNA in Sf21-Zellen transfiziert, entsteht durch homologe Rekombination ein
rekombinantes Virus, welches bei erneuter Infektion die Sf21-Zellen zu einer starken
Expression des Fremdproteins veranlasst.
19
Um bei einer Kotransfektion die Wahrscheinlichkeit der Bildung eines rekombinanten
Virus zu erhöhen, wird nicht die vollständige virale DNA, sondern die durch Restriktion
mit Bsu36I linearisierte Virus-DNA (BacPAK6 von Clontech) eingesetzt. Bei dieser
Linearisierung wird gleichzeitig ein Fragment entfernt, welches Teile eines für die
Virusreplikation essentiellen Gens (ORF 1629) enthält. Der Transfektionsvektor
BacPAK8 enthält neben dem zu exprimierenden Gen auch noch große Teile des ORF
1629. Erfolgt nun eine Kotransfektion, so führt nur diejenige virale DNA, welche durch
homologe Rekombination mit dem Vektor wieder den vollständigen ORF 1629 sowie
das Fremdgen enthält, zu replikationsfähigen Viruspartikeln (s. Abb. 2).
Abb. 2: Homologe Rekombination zwischen rekombinantem Plasmid BacPAK8 und
linearisierter AcNPV-DNA. Das LeSBTx-Gen wird im BacPAK8-Vektor von viraler
DNA flankiert ( ) , welche u.a. den für die Virusreplikation essentiellen ORF 1629
enthält. Durch homologe Rekombination wird die deletierte virale (AcNPV) DNA
wieder komplettiert und um das Fremdgen unter Kontrolle des starken viralen
Polyhedrinpromotors ( ) ergänzt.
2.8.1 Kotransfektion
Für die Transfektion wurde am Vortag eine Kammer einer Gewebekulturplatte mit 106
Sf21-Zellen in serumhaltigem Medium beimpft und über Nacht bei 28°C inkubiert. Am
LeSBTx ORF 1629
ORF 1629
ori
BacPAK8 ( 7.7 kb)
Bsu36I restringierte AcNPV-DNA (132 kb)
amp r
Rekombination
20
Transfektionstag wurde der Zellmonolayer mehrfach mit unsupplementiertem Grace’s
Insektenmedium gewaschen (letzter Waschschritt ca. 30 min) und mit 1,5 ml desselben
Mediums überschichtet. In diese Kammer wurde dann vorsichtig der vorbereitete
Transfektionsansatz (500 ng Plasmid-DNA, 500 ng BacPAK6/Bsu36I in 50 µl H2O mit
50 µl des Transfektionsreagens versetzt und in Polystyren-Röhrchen 15 min bei RT
inkubiert) eingetropft. Nach einer Inkubationszeit von 5 h (28°C) wurde das Medium in
der Kammer um 1,5 ml vollständiges, serumhaltiges Medium ergänzt und für weitere 80
h bei 28°C inkubiert.
2.8.2 Virusvereinzelung, „Plaque-Assay“
Die hier beschriebene Methode diente einerseits der Vereinzelung rekombinanter Viren
aus Transfektionsüberständen (s. Kap. 2.8.1), andererseits konnte mit ihr aber auch der
Titer (pfu/ml) einer Virus-haltigen Lösung (Hochtiter-Virusstocks, s. Kap. 2.8.4)
bestimmt werden.
Am Vortag wurden die Kammern zweier Gewebekulturschalen (je 6 Kammern) mit je
106 Sf21-Zellen in serumhaltigem Medium beimpft und über Nacht bei 28°C inkubiert.
Je zwei Kammern wurden, nach Entfernen des Mediums, für 1 h (RT) mit 100 µl
verschiedener Verdünnungen der zu untersuchenden, virushaltigen Lösung beschickt.
Anschließend können die Zelllayer, nach Abpipettieren des Virusinokulums, mit 2 ml
37°C warmer, niedrigschmelzender Agarose (1 % (w/v) in 1 Teil Wasser, 1 Teil
serumhaltigen Mediums) überschichtet. Pro Kammer wurden nach dem Erstarren der
Agarose 2 ml serumhaltiges Medium zugegeben und die Kulturplatten dann für 5 Tage
bei 28°C inkubiert. Durch die Anfärbung der lebenden Zellen mit Neutralrot (pro
Kammer 1ml 0.03% (w/v) Neutralrot in PBS (140 mM NaCl, 27 mM KCl, 8 mM
Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, pH 7,3)) für 3 h bei 28°C wurden die Plaquebereiche mit
den lysierten Zellen sichtbar gemacht, ausgezählt und der Virustiter errechnet.
Gegebenenfalls wurden Plaques, nach Entfernen der flüssigen Überstände aus den
Kammern und Inkubation der Platten bei 28°C über Nacht, mittels einer sterilen
Pasteurpipette ausgestochen, in 500 µl serumhaltiges Medium überführt und über Nacht
bei 4°C eluiert.
2.8.3 Analyse der Expression
Sf21-Zellen (Monolayer, angezogen in serumhaltigem oder serumfreiem Medium, 106
Zellen pro Kammer in Kulturplatten) wurden nach Entfernen des Mediums für 1 h (RT)
21
mit 100 µl virushaltiger Lösung inkubiert (durchschnittliche MOI („multiplicity of
infection“ = Anzahl Viren pro Zelle) = 3). Nach Abpipettieren des Virusinokulums
wurden 3 ml des entsprechenden Mediums zugegeben und die Zellen für 72 bis 96 h bei
28°C inkubiert. Für die Analyse der Expression wurden die Zellen in den
entsprechenden Überständen resuspendiert und anschliessend für 5 min bei 1000g
zentrifugiert. Für die Aufarbeitung intrazellulärer Proteine wurden die sedimentierten
Zellen zweimal mit PBS gewaschen, in 180 µl H20 resuspendiert, 10 min auf Eis
gehalten, in flüssigem Stickstoff schockgefroren, während des Auftauvorgangs für 5
min in einem Ultraschallbad weiter aufgeschlossen und mit 20 µl 10 x PBS versetzt. Für
die Aufarbeitung der sekretierten, löslichen Proteine wurde der Kulturüberstand für 1 h
bei 100.000 x g zentrifugiert. Bei der anschliessenden Analyse mittels SDS-PAGE und
„Western-Blotting“ wurden, falls nicht anders angegeben, pro Gel 1/40 der Fraktion
intrazellulärer Proteine, 1/50 der Fraktion löslicher Proteine in serumfreiem Medium
und 1/400 der Fraktion löslicher Proteine in serumhaltigem Medium untersucht.
2.8.4 Virusamplifikation
Für die Vermehrung des rekombinanten Virus wurden mehrere aufeinanderfolgende
Infektionen von Sf21-Zellen unter sukzessiver Erhöhung der Inkubationsvolumina und
der entsprechenden Zellzahlen durchgeführt. Dabei betrug die Inkubationszeit nach der
jeweiligen Infektion ca. 5 Tage bei 28°C. War die Infektion noch nicht weit genug
fortgeschritten (Beurteilung der Zellkonstitution in einem Durchlichtmikroskop), wurde
die Dauer um 1 bis 2 Tage verlängert. Alle Infektionsüberstände wurden anschliessend
für 10 min bei 8000 x g zentrifugiert und sterilfiltriert.
Amplifikation in Sf21-Zell-Monolayern (stets serumhaltiges Medium): (1) 106 Sf21-
Zellen wurden in der Kammer einer Kulturplatte mit 100 µl des Plaque-Eluats eines
einzelnen rekombinanten Virus (s. Kap.2.8.2) infiziert. Nach 1 h bei RT wurde das
Inkubationsvolumen um 3 ml Medium erweitert. Nach entsprechender Inkubationsdauer
wurde der Kulturüberstand geerntet und mit Hochtiter-Virusstock 1 = HTV1 bezeichnet.
(2) 4 x 106 Zellen wurden in einer Kulturflasche Typ I (s. Kap. 2.4.2) mit 1 ml HTV1
infiziert. (Vorinkubation für 1 h bei RT, dann Zugabe von 15 ml Medium). Der
Kulturüberstand wurde mit HTV2 bezeichnet. (3) 8 x 106 Zellen werden in einer
Kulturflasche Typ II mit 2 ml HTV2 infiziert. (Vorinkubation für 1 h bei RT, dann
Zugabe von 30 ml Medium). Kulturüberstand = HTV3.
22
Amplifikation in Sf21-Suspensionszellkulturen (stets serumfreies Medium): (4) In
einem 250 ml Erlenmeyerkolben wurden 5 x 107 Zellen mit 15 ml HTV3 in einem
Gesamtvolumen von 50 ml infiziert. Kulturüberstand = HTV4. (5) 1 x 108 Zellen
wurden in einem 250 ml Erlenmeyerkolben mit 20 ml HTV4 in einem Gesamtvolumen
von 100 ml infiziert. Kulturüberstand = HTV5. (6) 4 x 108 Zellen wurden in einem 1000
ml Erlenmeyerkolben in einem Gesamtvolumen von 400 ml mit 45 ml HTV5 infiziert.
Kulturüberstand = HTV6. Der Kulturüberstand HTV6 wurde nach Bestimmung des
Virustiters für die Infektion zur Proteinexpression eingesetzt.
2.8.5 Infektion für Proteinexpression
In einem Gesamtvolumen von 350 ml serumfreien Mediums wurden 3,5 x 108 Sf21-
Zellen in ihrer logarithmischen Wachstumsphase mit einer MOI von 1 bis 5 infiziert.
72 bis 96 h nach der Infektion wurde dann der Kulturüberstand geerntet und
entsprechend Kapitel 2.9 weiterverarbeitet.
2.9 Präparative Methoden
2.9.1 Reinigung von LeSBT1
Die Kulturüberstände von zwei Infektionsansätzen mit je 3,5 x 108 Sf21-
Suspensionszellen in 350 ml serumfreien Mediums, wurden 72 Stunden nach der
Infektion mit rekombinantem Virus (MOI = 3, s. Kap. 2.8.5) durch Zentrifugation
gewonnen und vereinigt. Die Trennung der im Kulturüberstand vorhandenen, löslichen
Proteine von Zellen und Zelltrümmern erfolgte mittels einer Zentrifugation bei 100.000
x g (4°C, 1 h, L7-65-Ultrazentrifuge, Ti45-Rotor, Beckmann, Zürich, Schweiz). Der
gewonnene Überstand wurde für eine fraktionierte Ammoniumsulfat-Präzipitation
eingesetzt. Dazu wurden zunächst die bei 50% Sättigung ausfallenden Proteine
präzipitiert (Zentrifugation bei 20.000 x g, 45 min, 4°C) und in einem weiteren
Zentrifugationsschritt die Proteinfraktion gewonnen, welche bei 90% Sättigung
präzipitierte. Das Sediment des letzten Fällungsschrittes wurde in 10 ml Puffer Akation
(25 mM MES, 25 mM Natriumacetat, pH 5,8) resuspendiert. Die sich ergebende
Proteinlösung (Volumen ca. 15 ml) wurde in 500 µl-Portionen mittels einer HighTrap
Entsalzungssäule am Chromatographiesystem ÄKTAexplorer (beides von Amersham
Pharmacia Biotech, Dübendorf, Schweiz) vollständig in den Puffer Akation umgepuffert
23
und gleichzeitig entsalzt. Alle folgenden Chromatographieschritte wurden am selben
Chromatographiegerät bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Proteinfraktion wurde
zunächst auf eine mit Puffer Akation äquilibrierte Kationentauscher-Säule (Resource S, 1
ml Säulenvolumen, Pharmacia) appliziert und anschliessend mittels eines linearen
Salzgradienten (0 bis 75 mM NaCl in Puffer Akation über 10 Säulenvolumen) eluiert.
Fraktionen, die immunonachweisbares (s. Kap. 2.6.5) LeSBT1 enthielten, wurden
vereinigt und auf eine Anionentauscher-Säule (Mono Q, 1 ml Säulenvolumen,
Pharmacia) appliziert, welche zuvor in Puffer Aanion (25 mM Tris, 25 mM Bis-Tris, pH
7,0) äquilibriert worden war. Die Elution erfolgte mittels eines linearen Salzgradienten
(0 bis 300 mM NaCl in Puffer Aanion über 24 Säulenvolumen). Die LeSBT1
enthaltenden Fraktionen wurden wiederum durch Immunodetektion identifiziert.
2.9.2 Anreicherung von LeSBT2
Für die Anreicherung von heterolog exprimierter LeSBT2 wurde in den ersten Schritten
analog zur Reinigung von LeSBT1 verfahren. Der Kulturüberstand infizierter Sf21-
Zellsuspensionen wurde gewonnen und anschließend einer fraktionierten
Ammoniumsulfat-Präzipitation unterzogen. LeSBT2 fand sich dabei, wie auch LeSBT1,
in der Fraktion von 50 bis 90% Sättigung. Das Sediment wurde dann jedoch in 10 ml
Puffer Bkation (25 mM PIPES/NaOH, pH 6,8) resuspendiert und mittels einer HighTrap
Entsalzungssäule am ÄKTAexplorer entsalzt. Die Proteinlösung wurde dann auf eine
mit Puffer Bkation äquilibrierte Kationentauscher-Säule (Uno S, 1,3 ml Säulenvolumen,
BioRad) appliziert. Die Elution der gebundenen Proteine erfolgte mittels eines linearen
Salzgradienten (0 bis 600 mM NaCl in Puffer Bkation über 20 Säulenvolumen).
Fraktionen, die immunonachweisbare (s. Kap. 2.6.5) LeSBT2 enthielten, wurden
vereinigt.
24
2.10 Aktivitätstests
2.10.1 Peptidhydrolyse durch LeSBT1
Die Aktivität von LeSBT1 wurde durch Hydrolyse von Glucagon als Substrat und die
anschliessende Analyse der entstandenen Produkte mittels MALDI-TOF durchgeführt.
Dazu wurde das Substrat (50 µM) bei pH 5,0 oder 6,0 (50 mM MES/Acetat) in einem
200-fachen molaren Überschuß gegenüber der Protease (250 nM) inkubiert. Da
verschiedene Subtilasen, wie etwa einige tierische PCs, eine strenge Ca2+-Abhängigkeit
aufweisen, wurde in den Tests routinemäßig eine Ca2+-Konzentration von 2 mM
eingesetzt. Es wurden zwei verschiedene Verfahren eingesetzt: Der „on-plate“ und der
„Standardtest“. Beim „on-plate“-Test erfolgte die Reaktion direkt auf der MALDI-TOF-
Probenplatte. Dazu wurden 1 µl Substratlösung und 1 µl Proteaselösung (beide im
entsprechenden Testpuffer) auf der Platte zusammenpipettiert. Das Abstoppen der
Reaktion erfolgte durch Zugabe von 0,5 µl 0,5% (v/v) TFA und 3 µl Matrixlösung (vgl.
Kap. 2.6.8). Beim Standardtest wurden Substrat und Protease in einem Volumen von
50 µl in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß inkubiert. Zu den entsprechenden Zeit-
punkten wurde ein 1 µl-Aliquot entnommen und die Reaktion wurde auf der MALDI-
TOF-Probenplatte durch Zugabe von TFA und Matrix (s.o.) abgestoppt. Der Standard-
test wurde dann gewählt, wenn der Einfluss von Zusatzstoffen (z. B. Hemmstoffen)
oder die Reaktion über längere Zeiträume (> 15 min) untersucht werden sollte.
2.10.2 Autokatalytische Hydrolyse von LeSBT1
Die aktive Form von LeSBT1 wurde durch autokatalytische Spaltung generiert. Dazu
wurde LeSBT1 nach der Reinigung durch Dialyse (30 kD „cut-off“ Visking-
Dialyseschlauch, Serva, Wallisellen, Schweiz) in 50 mM MES/Acetat pH 6,0, 2 mM
CaCl2 umgepuffert und anschliessend für 5 Tage bei 4°C inkubiert.
2.10.3 Hydrolyse von fluoreszenzmarkierten Peptidsubstraten
Dieser Test beruht auf der Fluoreszenz von AMC (Amino-4-methylcoumarin), welches
in freier Form und in Amid-Konjugaten mit Oligopeptiden (meist Di- oder Tripeptide)
unterschiedliche Emissionsmaxima aufweist. Kommt es durch die Aktivität einer
25
Protease zur hydrolytischen Freisetzung von AMC aus den Peptidkonjugaten, kann
diese in einem Fluorimeter (Spektrofluorimeter SFM 25, Kontron, Zürich, Schweiz)
quantifiziert werden.
In einem 1 ml Testansatz (Puffer: 50 mM MES/Acetat, pH 6,0, 2 mM CaCl2 oder 50
mM Acetat, pH 5,0, 2 mM CaCl2 oder 50 mM Bis-Tris/Tris, pH 7,0, 2 mM CaCl2)
wurden 100 µM AMC-Substrat und 100 nM LeSBT1 bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Messung der Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 380 nm und einer
Emissonswellenlänge von 460 nm erfolgte nach Start der Reaktion durch Zugabe der
Protease über einen Zeitraum von 5 min. Als Positivkontrolle wurden 100 µM AMC-
Substrat mit 35 nM Subtilisin Carlsberg [EC 3.4.21.62] hydrolysiert (Puffer: 50 mM
MES/HEPES, pH 8,9, 2 mM CaCl2).
2.11 Immunolokalisation
2.11.1 Fixierung des Pflanzenmaterials
Mit einem Skalpell wurden Gewebestücke des Stengels, der Blüte sowie der Blätter von
etwa 5 x 5 mm2 Größe, direkt in eine Glaspetrischale mit ca. 10 ml Fixierungslösung
(3,7 % (v/v) Formaldehyd, 5 % (v/v) Essigsäure, 50 % (v/v) Ethanol) geschnitten. Nach
der Ernte werden jeweils ca. 10 Gewebestücke in ein Glasszintillationsgefäß mit 10 ml
Fixierungslösung überführt, für ca. 3 Stunden in einem Exsikkator unter Wasserstrahl-
Vakuum gehalten und anschließend über Nacht (4°C) inkubiert. Zur Überführung des
Materials in Ethanol wurde die Fixierungslösung abgesaugt und schrittweise durch
Ethanol/Wasser-Lösungen mit steigender Ethanol-Konzentration ausgetauscht. Die
Inkubationsdauer in den einzelnen Lösungen (50 % (v/v) Ethanol, 60 %, 70 %, 80 %, 90
%, 98 % und 3 x 100 %) betrug jeweils 30 min. In diesem Zustand (100 % (v/v)
Ethanol) konnte das Material bis zur Einbettung bei 4°C gelagert werden.
2.11.2 Einbettung und Schnittpräparation
Die Einbettung der Proben in Paraffin und die anschließende Schnittpräparation mit
dem Mikrotom erfolgte nach dem Protokoll von FLEMING (1995). Ausgewählte
Schnitte (Dicke 10 µm) wurden auf zwei Tropfen von je ca. 100 µl entgasten Wassers
auf Superfrost-Objektträger (Menzel-Gläser, Deutschland) plaziert und über Nacht bei
26
42°C auf den Objektträgern fixiert. Sie konnten so stabil über längere Zeiträume bei
Raumtemperatur gelagert werden. Zur Entfernung des Paraffins vor der
Immunolokalisation wurden die Objektträger folgenden Waschschritten unterzogen: 2 x
15 min Xylol, 5 min 50% (v/v) Xylol in Ethanol, 2 x 5 min Ethanol. Dann wurden die
Präparate bei Raumtemperatur luftgetrocknet.
2.11.3 Immunolokalisation
Die Immunolokalisation erfolgte nach WEISS et al. (1993) mit kleinen Modifikationen.
Abweichend von WEISS et al. Wurden freie Bindestellen nach der Rehydratation der
Schnitte für 30 min in Blockierungslösung (10 % (w/v)‚ „Blotting grade blocker“,
BioRad, in TBS-T) abgeblockt. Die polyklonalen Antiseren bzw. IgG-Fraktionen
wurden in einer Gesamtverdünnung von 1:15 eingesetzt. Dabei wurden auf demselben
Objekträger eine Gruppe von Schnitten mit dem Antiserum und eine zweite Gruppe mit
dem Präimmunserum behandelt. Der Nachweis der gebundenen Immunglobuline
erfolgte durch alkalische Phosphatase gekoppelte Ziege-anti-Maus-Antikörper in einer
Verdünnung von 1:1000 unter Einsatz von p-Nitroblautetrazoliumchlorid und 5-Brom-
4-chlor-3-indolylphosphat p-Toluidinsalz als Substrat der alkalische Phosphatase.
2.11.4 Dokumentation
Die Dokumentation der Schnittpräparationen erfolgt mit Hilfe eines digitalen
Kamerasystems, welches an ein Stereomikroskop Leica MZ12 (Leica, Glattbrugg,
Schweiz) angeschlossen wurde. Das Kamerasystem, bestehend aus einer Farbkamera
(Typ: 3CCD Kamera C5810, der Firma Hamamatsu, Japan) und dem dazugehörigen
Kontrollgerät („3CCD C5810 controller“, Hamamatsu) war an einen Computer
gekoppelt. Auf diese Weise konnten die Abbildungen direkt in das
Bildbearbeitungsprogramm Adobe Photosphop, Version 5.0.2 übertragen und dort
bearbeitet werden.
2.12 Datenauswertung, Arbeiten mit Datenbanken
Sequenzierdaten wurden mittels der ABI PRISMTM DNA Analysis Software (Version
2.1.1., Perkin Elmer) ausgewertet. Die Analyse von Peptidmassen in MALDI-TOF-
Massenspektren erfolgte mit dem Programm PAWS Version 8.1.1 (Freeware für MacOs
27
7.5, Urheberrechte bei ProteoMetrics, 1997), oder mit dem Programm SeqEdit (Version
1 von M. PIOTROWSKI, 1999, Ruhr-Universität Bochum, Deutschland). Sequenzdaten
wurden mit dem GCG Sequenzanalyse Programmpaket (GENETICS COMPUTER
GROUP, 1994) der Universität von Wisconsin oder dem Programm SignalP (Version
1.1) analysiert.
Die Aminosäuresequenzen der verschiedenen Subtilasen wurden aus den Datenbanken
unter Benutzung der ExPASy- und NCBI-Internetseiten (http://www.expasy.ch) bzw.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ermittelt. Die so ermittelten Aminosäuresequenzen
wurden unter Nutzung des Programmes ClustalW (Version 1.6, THOMPSON et al.,
1994) für eine vergleichende Gegenüberstellung eingesetzt. Auf der Grundlage dieser
Gegenüberstellung wurde ein ursprungsloser Phylogeniebaum mit Hilfe des Programms
SplitsTree2.4 (HUSON, 1998), basierend auf einer Methode von BANDELT und
DRESS (1992), erstellt.
28
3. Ergebnisse
In Lycopersicon esculentum konnten bisher 15 Subtilasen identifiziert werden
(TORNERO et al. (1996 und 1997); JORDA et al. (1999); MEICHTRY et al. (1999);
JORDA et al. (2000)). Sie sind bislang lediglich auf Gen- bzw. RNA-Ebene
charakterisiert worden. Um eine grundlegende Charakterisierung der Subtilasen auf
Proteinebene zu ermöglichen, ist es notwendig ausreichende Mengen des zu
untersuchenden Proteins zur Verfügung zu haben. Daher war es Ziel dieser Arbeit, ein
heterologes Expressionssystem für die Subtilasen aus Lycopersicon esculentum zu
etablieren, die exprimierten Proteine zu reinigen und ihre enzymatischen Eigenschaften
zu charakterisieren.
3.1 Heterologe Expression von LeSBT1, 2- und 3 in Insektenzellen
Vorversuche zur Expression der Subtilasen LeSBT1, LeSBT2, LeSBT3 und LeSBT4A
(MEICHTRY et al., 1999) aus Lycopersicon esculentum in E. coli als heterologem
System führten ausschließlich zu unlöslichem Protein in Einschlußkörperchen
(A. Schaller, persönliche Mitteilung). Zur Gewinnung löslicher Proteine sollte daher ein
eukaryontisches System eingesetzt werden, namentlich das Insektenzell/Baculovirus-
Expressionssystem. Zur Expression der vier Proteasen in Sf21-Zellen wurde der
Klonierungs- und Transfektionsvektor BacPAK8 verwendet. Die Selektion während der
Klonierungsphase erfolgte in E. coli aufgrund der auf dem Plasmid kodierten
Ampicillin-Resistenz. Die Selektion auf rekombinante, das Fremdgen tragende,
replikationsfähige Baculoviren erfolgte durch eine Komplementation deletierter viraler
DNA durch homologe Rekombination mit dem das Fremdgen tragenden BacPAK8 in
Sf21-Zellen.
3.1.1. Konstruktion von Plasmid-Vektoren zur heterologen Expression von
LeSBT1, -2, -3 und -4A in Sf21-Zellen
Die ORFs der LeSBT-cDNAs wurden 3‘-terminal des viralen Polyhedrinpromotors in
den Vektor BacPAK8 kloniert. Dazu wurden zunächst mittels PCR, 5‘-flankierend zum
Start- und 3‘-flankierend zum Stoppkodon, geeignete Restriktionsschnittstellen
29
eingefügt. Die jeweiligen PCR-Produkte wurden nach entsprechender Restriktion in den
Vektor BacPAK8 kloniert und durch Doppelstrangsequenzierung auf Insertion und
Identität hin überprüft. In Tab. 3 sind die für die Klonierung genutzten
Restriktionsschnittstellen zusammengefaßt.
Tab. 3: Zusammenfassung der Klonierungsschnittstellen für die Insertion der translatierten
Bereiche der cDNAs in den Vektor BacPAK8 sowie Angabe der Länge der klonierten
ORFs und der jeweils kodierten Aminosäuresequenz. (aa = Aminosäuren):
Klonierungsschnittstellen Protease
5‘-flankierend 3‘-flankierendLänge des ORF
Länge des kodierten Proteins
LeSBT1 BamHI XbaI 2298 bp 766 aa
LeSBT2 BglII EcoRI 2325 bp 775 aa
LeSBT3 PstI SmaI 2283 bp 761 aa
LeSBT4A BamHI XbaI 2337 bp 779 aa
3.1.2 Erzeugung, Vereinzelung und Amplifikation rekombinanter
Baculoviren
Nach Erhalt der rekombinanten BacPAK8-Derivate erfolgte die Kotransfektion mit
deletierter viraler AcNPV-DNA in Sf21-Zellen. Zur Untersuchung der Überstände von
transfizierten Insektenzellen auf rekombinante Baculoviren wurden Verdünnungen von
10-1, 10-2 und 10-3 für einen „Plaque-Assay“ (s. Kap. 2.8.2) eingesetzt. Pro
Transfektionsereignis wurden 10 bis 20 Einzelplaques isoliert. Virale Klone aus jeweils
5 bis 10 Plaque-Eluaten, wurden amplifiziert (HTV1, s. Kap. 2.8.4) Die intrazelluläre
Proteinfraktion infizierter Zellen wurde immunologisch auf die Expression der Proteine
LeSBT1 bis LeSBT4A hin untersucht. Für alle vier Proteasen konnten rekombinante
Viren identifiziert werden, welche nach Infektion von Sf21-Zellen zur Expression der
kodierten Proteine führten. Die Ergebnisse sind in Tab. 4 zusammengefaßt.
30
Tab. 4: Auflistung der isolierten, analysierten und als rekombinant identifizierten
Einzelplaques aus den jeweiligen Transfektionsereignissen:
analysierte Einzelplaques
Davon rekombinante Einzelplaques
LeSBT1 5 3
LeSBT2 5 5
LeSBT3 5 5
LeSBT4A 10 10
3.1.3 Expression von LeSBT1, LeSBT2, LeSBT3 und LeSBT4 A in Sf21-
Zellen
Die Analyse der von den cDNA-Sequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit dem
Programm SignalP (Version 1.1) führte bei allen 4 Proteasen zur Identifizierung eines
putativen Signalpeptids, für welches angenommen wird, daß es für die Einschleusung
der Proteine in den sekretorischen Expressionsweg verantwortlich ist. Dies führte zu der
Annahme, daß die LeSBT-Proteasen möglicherweise in vivo in den Apoplasten, d.h. in
dem hier gewählten heterologen Expressionssystem in den Kulturüberstand sekretiert
werden. Um die Identifizierung sekretierter Proteine zu vereinfachen, wurden die Sf21-
Zellen zunächst an serumfreies Medium adaptiert. Dieses Medium gewährleistet
optimale Wachstumsbedingungen ohne Zusatz von fötalem Kälberserum, d.h. ohne
Zusatz von Fremdprotein.
An serumfreies Medium adaptierte Sf21-Zellen wurden mit den rekombinanten, die
LeSBT-cDNAs tragenden, Viren infiziert (s. Kap. 2.8.3). Anschließend wurden jeweils
die intrazelluläre Proteinfraktion sowie die löslichen Proteine des Zellkulturüberstandes
auf das Vorhandensein des jeweiligen LeSBT-Proteins hin immunologisch untersucht.
Die Ergebnisse sind für LeSBT1, -2 und –3 in Abb. 3 gezeigt. In Sf21-Zellen, die mit
den Plaque-Eluaten rekombinanter, für LeSBT4A-kodierender Viren zur Gewinnung
des HTV1 infiziert worden waren, konnte immunologisch die Expression von LeSBT4A
nachgewiesen werden. In nachfolgenden Infektionen mit diesem HTV1 konnte jedoch
keine Expression von LeSBT4A mehr erzielt werden. Die genaue Ursache hierfür
konnte nicht ermittelt werden. Aus diesem Grund sind in Abb. 3 keine Daten für
31
LeSBT4A gezeigt. Im Falle von LeSBT1, LeSBT2 und LeSBT3 liessen sich jeweils
intrazelluläre Proteine nachweisen, die spezifisch mit dem jeweiligen Antiserum
interagierten. Diese Proteine waren jedoch in allen drei Fällen unlöslich und
akkumulierten in Einschlußkörperchen. Auch im Kulturüberstand konnte rekombinantes
Protein nachgewiesen werden. Auffällig ist die Größendifferenz zwischen den jeweils
intrazellulär und extrazellulär detektierten rekombinanten Proteinen (Abb. 3).
Abb. 3: Expressionsprofil von heterolog in Sf21-Zellen exprimierten LeSBT-Proteasen, 96 h
nach Infektion mit rekombinanten Baculoviren.
In den Teilabbildungen A, B und C ist rechts jeweils ein Coomassie-gefärbtes SDS-
Polyacrylamidgel (10%) und links der entsprechende Immunoblot dargestellt. Je 20 µg
der intrazellulären Proteinfraktion (Spur 1) und je 4 µg der löslichen Proteine des
Zellkulturüberstandes (Spur 3) wurden aufgetragen. Als Kontrolle dienten jeweils die
entsprechenden Proteinfraktionen von nicht-infizierten Sf21-Zellen (Spur 2:
intrazelluläre Proteine; Spur 4: lösliche Proteine). A: LeSBT1. B: LeSBT2. C:
LeSBT3. In der mit M bezeichneten Spur wurde jeweils ein Molekulargewichts-
marker geladen.
M 1 2 3 4
M 1 2 3 4M 1 2 3 4
M 1 2 3 4
M 1 2 3 4 1 2 3 4 M
97
97
97
66
66
66
45
45
45
kD
kD
kD
A
C
B
32
3.2 Charakterisierung von LeSBT1
Ein Vergleich der von der cDNA abgeleiteten Aminosäuresequenz von LeSBT1 mit
derjenigen anderer Subtilasen (MEICHTRY et al., 1999) ließ die Existenz dreier
Domänen vermuten: Ein Signalpeptid am Aminoterminus, flankiert von einer
Prodomäne und schließlich die aktive Domäne des reifen Proteins (Abb. 4).
1 MERLRLMFLL ILMVVLFHVF VDARQNQKKT YIIHMDKFNM PADFDDHTQW 51 YDSSLKSVSK SANMLYTYNS VIHGYSTQLT ADEAKALAQQ PGILLVHEEV 101 IYELHTTRSP TFLGLEGRES RSFFPQTEAR SEVIIGVLDT GVWPESKSFD 151 DTGLGQVPAS WKGKCQTGKN FDASSCNRKL IGARFFSQGY EAAFGAIDET 201 IESKSPRDDE GHGTHTATTA AGSVVTGASL LGYATGTARG MASHARVAAY 251 KVCWTGGCFS SDILAGMDQA VIDGVNVLSL SLGGTISDYH RDIVAIGAFS 301 AASQGIFVSC SAGNGGPSSG TLSNVAPWIT TVGAGTMDRE FPAYIGIGNG 351 KKLNGVSLYS GKALPSSVMP LVYAGNVSQS SNGNLCTSGS LIPEKVAGKI 401 VVCDRGMNAR AQKGLVVKDA GGIGMILANT DTYGDELVAD AHLIPTAAVG 451 QTAGNLIKQY IASNSNPTAT IAFGGTKLGV QPSPVVAAFS SRGPNPITPD 501 VLKPDLIAPG VNILAGWTGK VGPTGLQEDT RNVGFNIISG TSMSCPHVSG 551 LAALLKAAHP EWSPAAIRSA LMTTSYSTYK NGKTIEDVAT GMSSTPFDYG 601 AGHVNPTAAV SPGLVYDLTV DDYINFLCAL DYSPSMIKVI AKRDISCDEN 651 KEYRVADLNY PSFSIPMETA WGEHADSSTP TVTRYTRTLT NVGNPATYKA 701 SVSSETQDVK ILVEPQTLTF SRKNEKKTYT VTFTATSKPS GTTSFARLEW 751 SDGQHVVASP IAFSWT*
Abb. 4: Primärstruktur von LeSBT1: Dargestellt ist die von der cDNA abgeleitete
Aminosäuresequenz. Schwarz unterlegt ist die vermutliche Signalsequenz, hellgrau
unterlegt die vermutliche Prodomäne. In der vermutlichen aktiven Domäne (nicht
unterlegt) sind durch die hochkonservierten Aminosäuren der katalytischen Triade
(Asp139, His212 und Ser542) sowie das stabilisierende Asn314 markiert. bezeichnet eine
putative Glycosylierungsstelle, * markiert die Position des Stoppkodons.
33
Die drei charakteristischen Aminosäuren Asp139, His212 und Ser542 der katalytischen
Triade von Serinproteasen sowie das zur Stabilisierung des tetraedrischen
Übergangszustand der Reaktion notwendige Asn314 konnten in derAminosäuresequenz
der putaiv reifen Form des Proteins identifiziert werden (s. Abb. 4). Zur Bestätigung der
Existenz der zunächst nur vermuteten Domänen sollte die im heterologen System
exprimierte Protease LeSBT1 in bezug auf ihre Lokalisation, Prozessierung und
Aktivität analysiert werden.
3.2.1 Zeitabhängigkeit der heterologen Expression und Vergleich der beiden
exprimierten Formen von LeSBT1
Zur Bestimmung der optimalen Inkubationsdauer für die Expression von LeSBT1 in
Sf21-Zellen, wurde zunächst die Zeitabhängigkeit der Expression untersucht. Dazu
wurden für jeden Zeitpunkt 106 Sf21-Monolayerzellen in serumfreiem Medium mit
einem Aliquot des HTV2 infiziert. Zu den angegebenen Zeitpunkten (vgl. Abb. 5)
wurden die Kulturüberstände aufgearbeitet (s. Kap. 2.8.3) und durch SDS-PAGE und
„Western-Blot“ immunologisch analysiert. Das Ergebnis ist in Abbildung 5 dargestellt.
In der extrazellulären Fraktion konnte bereits nach 36 h ein Protein mit der apparenten
molekularen Masse von 73 kD detektiert werden. Nach 72 h war die Expression
maximal. In der intrazellulären Fraktion konnte erst nach 48 h ein Protein mit der
apparenten molekularen Masse von ca. 84 kD nachgewiesen werden. Für dieses Protein
war die Expression nach 96 h maximal.
Beide Proteinformen konnten aminoterminal ansequenziert werden. Der N-Terminus
des intrazellulären Proteins wurde als RQNQKKTY bestimmt. Dies entspricht der
Sequenz von Pro-LeSBT1, dem die als Signalpeptid angenommenen 23 N-terminalen
Aminosäuren fehlen. Der N-Terminus der sekretierten Form wurde als TTRSPTFL
bestimmt. Dies entsprach der für den N-Term des reifen Enzyms angenommenen
Sequenz (s. Abb. 4). Die beiden Threoninreste scheinen dabei ein in allen pflanzlichen
Serinproteasen stark konserviertes Motiv zu sein (MEICHTRY et al., 1999).
34
Abb. 5: Zeitabhängigkeit der Expression von LeSBT1 in Sf21-Zell-Kulturen:
In sieben Ansätzen wurden je 106 Sf21-Zellen mit 100 µl HTV2 infiziert. Zu den
angegebenen Zeiten (Stunden) wurden die Zellen aus je einem Ansatz durch
Resuspension in den Kulturüberstand geerntet, durch Zentrifugation (1000 x g, 3 min)
vom Medium getrennt und durch Gefrieren und Ultraschall aufgeschlossen. Die
intrazelluläre, unlösliche Proteinfraktion wurde durch Zentrifugation (1000 x g, 3 min)
gewonnen und 1/50 des entsprechenden Sediments wurde durch SDS-PAGE
aufgetrennt, mittels „Western-Blot“ auf Nitrocellulose immobilisiert und mit einem
Anti-LeSBT1-Serum immunodekoriert (linke Bildhälfte). In gleicher Weise wurden
die löslichen Proteinbestandteile des Kulturüberstandes nach Ultrazentrifugation
(100.000 x g, 60 min) untersucht. Hierzu wurde jeweils 1/20 der einzelnen
Proteinfraktionen aufgetragen (rechte Bildhälfte).
3.2.2 Reinigung des heterolog exprimierten Proteins
Wie in Kapitel 3.2.1 beschrieben, konnte das Protein LeSBT1 in Sf21-Zellen heterolog
exprimiert werden. Dabei wurde die sekretierte 73 kD-Form als die aktive Form
angenommen. Im folgenden war es für eine Charakterisierung des Proteins notwendig,
dieses aus dem Kulturüberstand zu reinigen und ein entsprechendes
Reinigungsprotokoll zu entwickeln:
Der Suspensionskulturüberstand von zwei Infektionsansätzen (s. Kap. 2.8.5) wurde 72 h
nach Infektion durch Ultrazentrifugation von Zellen und Zelltrümmern separiert. Im
nächsten Schritt sollte eine Aufkonzentrierung der Proteinlösung erreicht werden. Hier
erwies sich eine fraktionierte Ammoniumsulfat-Präzipitation als geeignet. Es zeigte
sich, daß große Teile der sich in der Lösung befindlichen Proteine bereits bei einer
9766
45
0 24 36 48 60 72 96 0 24 36 48 60 72 96
kD
35
Ammoniumsulfatsättigung von 50% präzipitieren. LeSBT1 präzipitiert jedoch erst bei
einer Sättigung von 90%. Mit diesem Schritt wird also nicht nur eine Aufkonzentrierung
des LeSBT1-Proteins, sondern auch eine erste Anreicherung erzielt (s. Abb. 6). Die sich
üblicherweise einer Ammoniumsulfat-Präzipitation anschließende hydrophobe
Interaktions-Chromatographie (Probenauftrag in Hochsalzpuffern möglich) erwies sich
für die Reinigung von LeSBT1 als ineffizient (Daten nicht gezeigt). Daher wurden die
Proben zunächst durch Gelfiltrations-Chromatographie (HighTrap-Desalting-Säule,
Amersham Pharmacia BioTech) entsalzt und anschliessend für die Kationentauscher-
Chromatographie (Resource S, Amersham Pharmacia BioTech) eingesetzt. Die
abschliessende Anionentauscher-Chromatographie (Mono Q, Amersham Pharmacia
BioTech) resultierte in Homogenität von LeSBT1. Die Ausbeute der Reinigung lag
zwischen 1,3 und 1,7 mg an reinem LeSBT1 pro Liter Zellkulturüberstand.
Abb. 6: Reinigung der 73 kD-Form von LeSBT1 aus dem Zellkulturüberstand von Sf21-
Zellen. Dargestellt ist ein Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel (8%). Der
Kulturüberstand (700 ml) von Sf21-Zellen wurde 72 h nach Infektion mit
rekombinanten Baculoviren (MOI = 3) geerntet. Nach einer Ultrazentrifugation bei
100.000 x g wurden die löslichen Proteine im Überstand [60 mg gesamt, davon in
Spur 1 = 20 µg] einer fraktionierten Ammoniumsulfat-Präzipitation unterzogen [50-
90%-Sättigung; 24 mg gesamt, davon in Spur 2 = 20 µg]. Das Präzipitat wurde
resuspendiert, entsalzt und mittels Kationentauscher-Chromatographie (Resource S)
weiter aufgereinigt [1,5 mg gesamt, davon in Spur 3 = 1 µg]. In einem letzten
Anionentauscher-Chromatographie-Schritt (Mono Q) wurde LeSBT1 bis zur
Homogenität gereinigt [1 mg gesamt, davon in Spur 4 = 1 µg). In Spur 5 ist ein
Molekulargewichtsmarker (BioRad) aufgetragen [pro Bande ca. 1 µg Protein].
9766
45
31
kD1 2 3 4 5
36
3.2.3 Untersuchung der autokatalytischen Prozessierung
Die in Sf21-Zellen exprimierte und sekretierte 73 kD-Form von LeSBT1 wurde als die
aktive Form angenommen. Daher wurde das gereinigte Protein für verschiedene
Aktivitätstests eingesetzt (siehe dazu Kapitel 3.2.4.1). Es zeigte sich jedoch, daß eine
Aktivität, falls überhaupt, erst nach Inkubationszeiten von mehr als 20 min und länger
nachweisbar war. Dies führte zu der These, daß möglicherweise erst eine Aktivierung
des Proteins stattfinden mußte. Diese These wurde gestützt durch die Tatsache, daß eine
LeSBT1-Proteinfraktion, welche über drei Tage bei pH 6,0 (4°C) gelagert worden war,
wesentlich höhere Aktivität aufwies als eine frisch präparierte Proteinfraktion. Die
Auftrennung der beiden getesteten Proteinfraktionen über ein SDS-PAGE-Gel zeigte,
daß die ältere Fraktion nicht nur die 73 kD-Form von LeSBT1, sondern auch noch ein
zweites, etwas kleineres, ca. 68 kD-Protein enthielt. Auch das kleinere Protein
interagierte in einem Immunoblot mit dem Antiserum gegen LeSBT1. Der N-Terminus
des 68 kD-Proteins wurde als TEARSEVI bestimmt. Diese Aminosäurensequenz
entspricht derjenigen von LeSBT1 nach Abspaltung von 21 Aminosäuren am N-
Terminus der sekretierten 73 kD-Form. Diese Beobachtungen führten zu der Annahme,
daß die Aktivierung von LeSBT1 möglicherweise auf einer autokatalytischen
Prozessierung beruht, welche in den folgenden Experimenten näher untersucht werden
sollte.
3.2.3.1 pH-Abhängigkeit
Zur Untersuchung der pH-Abhängigkeit der autokatalytischen Aktivierung der
gereinigten 73 kD-Form von LeSBT1, wurde diese in einer Konzentration von 0,2 µg/µl
(2,5 µM) in vier verschiedenen Puffern (pH 7,0, pH 6,0, pH 5,0, pH 4,0) über einen
Zeitraum von fünf Tagen (4°C) inkubiert. Zu definierten Zeitpunkten [2 h, 6 h, 24 h,
48 h, 72 h, 96 h und 120 h] wurde je ein Aliquot entnommen. Die Proteine der so
gewonnenen Proben (jeweils ca. 800 ng) wurden am Ende der Zeitreihe durch SDS-
PAGE aufgetrennt und mit Coomassie Brillant Blue angefärbt.
Bei pH 7,0 war die 73 kD-Form von LeSBT1 über die gesamte Versuchsdauer von
120 h stabil. Eine Inkubation von LeSBT1 bei pH 6,0 dagegen, führte bereits nach 6 h
zum Auftreten einer zusätzlichen Bande mit einer apparenten Masse von 68 kD. Nach
vier Tagen war nur noch die kleinere Form von LeSBT1 detektierbar. Eine Inkubation
37
bei pH 5,0 führte ebenfalls bereits nach 6 h zur Generierung einer Proteinbande von
etwa 68 kD. Hier konnte aber während des gesamten untersuchten Zeitraums auch die
73 kD-Form nachgewiesen werden, wenn auch in abnehmender Konzentration.
Weiterhin trat nach ca. 24 h noch eine weitere Proteinbande von etwa 60 kD auf. Die
Inkubation von LeSBT1 bei pH 4,0 führte zum sukzessiven Verschwinden der 73 kD-
Form, ohne daß ein Auftreten der 68 kD-Form beobachtet werden konnte. Nach 120 h
war auf dem SDS-PAGE-Gel, im erfaßten Bereich von ca. 45 bis 100 kD, kein Protein
mehr nachweisbar.
Abb. 7: pH-abhängige Prozessierung der 73 kD-Form von LeSBT1:
Die 73 kD-Form von LeSBT1 wurde in einer Konzentration von 0,2 µg/µl in vier
verschiedenen Puffern [Dialyse gegen 1) 25 mM Acetat/Essigsäure, pH 4,0, 2) 25 mM
Acetat/Essigsäure, pH 5,0, 3) 25 mM MES/Acetat pH 6,0, 4) 25 mM Tris/Bis-Tris, pH
7,0, alle mit 2 mM CaCl2] bei 4°C inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten (in
Stunden, h) wurden Aliquots entnommen, in Flüssigstickstoff schockgefroren und bei
–80°C gelagert. Je 4 µl (entsprechend 800 ng Protein) wurden auf einem Coomassie
Brillant Blue gefärbten SDS-PAGE-Gel analysiert. Im linken Teil der Abbildung sind
die pH-Werte angegeben. Rechts wurde die jeweilige Lage der 73 bzw. 68 kD-Form
markiert.
3.2.3.2 Inter- vs. Intramolekulare Prozessierung zur autokatalytischen Aktivierung
Die autokatalytische Prozessierung von LeSBT1 kann sowohl ein inter- als auch ein
intramolekularer Prozeß sein. Um zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu
pH 7.0
pH 6.0
pH 5.0
pH 4.0
0 2 6 24 48 72 96 120
73 kD
73 kD
73 kD
73 kD
68 kD
68 kD
38
unterscheiden, wurden verschiedene Konzentrationen von LeSBT1 (2,5 µM, 250 nM,
25 nM) bei pH 6,0 über einen Zeitraum von 72 h inkubiert und zu definierten
Zeitpunkten ein Aliquot entsprechend 2 µg entnommen. Da die Volumina der Aliquots
bei den kleineren Konzentrationen (100 µl bei 250 nM und 1000 µl bei 25 nM) für eine
direkte Analyse auf einem SDS-PAGE-Gel zu groß waren, wurden diese zuvor mittels
Methanol/Chloroform-Extraktion (Kap. 2.6.1) aufkonzentriert.
Abb. 8: Autokatalytische Prozessierung in Abhängigkeit der Konzentration von LeSBT1:
LeSBT1 in verschiedenen Konzentrationen wurde für die angegebene Zeitdauer (in
Stunden) inkubiert. Aliquots des Reaktionsansatzes (entsprechend 2 µg des
eingesetzen Enzyms LeSBT1) wurden dann auf einem SDS-PAGE-Gel, das mit
Coomassie Brillant Bluegefärbt wurde, analysiert. Links sind die jeweiligen
Konzentrationen von LeSBT1 angezeigt. Die 73 bzw. 68 kD-Form von LeSBT1 sind
rechts markiert.
Bei einer Konzentration von 2,5 µM war bereits nach 24 h ein hoher Anteil (ca. 50%)
der 73 kD-Form durch Autokatalyse in die 68 kD-Form umgewandelt. Bei einer
Konzentration von 250 nM war eine Bande der kleineren Form erst nach 48 h
nachweisbar. Bei einer Konzentration von 25 nM konnte keine Umwandlung der 73 kD-
Form von LeSBT1 in die 68 kD-Form beobachtet werden. Die Rate der
autokatalytischen Prozessierung von LeSBT1 ist also deutlich konzentrationsabhängig,
was auf einen intermolekularen Prozeß hindeutet.
73 kD
68 kD
73 kD
73 kD
68 kD
0 12 24 48 72
2,5 µM
250 nM
25 nM
39
3.2.3.3 Massenbestimmung der verschiedenen Formen von LeSBT1
Da die N-Termini der verschiedenen Formen von LeSBT1 ermittelt worden waren, war
eine erste Massenbestimmung aufgrund der bekannten Aminosäuresequenz der beiden
Formen rein rechnerisch möglich. Dabei ergab sich für die sekretierte nicht
autoprozessierte Form ein Mr von 69.065 und für die autoprozessierte Form ein Mr von
66.672. Diese Werte entsprechen annähernd den durch SDS-PAGE ermittelten
apparenten Massen von 73 bzw. 68 kD. Die Masse der kleineren Form wurde außerdem
mittels Massenspektrometrie (MS) bestimmt. ESI (Electron Spray Ionisation)-MS ergab
eine Masse von 67.909, MALDI-TOF-MS eine Masse von 67.201. Die Werte liegen um
529 bzw. 1237 Masseneinheiten über der für die prozessierte Form errechneten Masse
von 66.672. Dieser Befund deutet auf eine mögliche posttranslationelle Modifizierung,
etwa durch Glykosylierung, hin. Diese Möglichkeit wird weiter unten (Kap. 3.2.4.8)
untersucht.
Im folgenden werden die beiden Formen von LeSBT1 durch die apparenten Massen
während der SDS-PAGE bezeichnet.
3.2.4 Biochemische Charakterisierung der 68 kD-Form von LeSBT1
3.2.4.1 Glucagon als Substrat der 68 kD- und der 73 kD-Formen von LeSBT1
Die hydrolytische Spaltung von Glucagon durch LeSBT1 und die
massenspektrometrische Identifizierung der Spaltprodukte diente als Testsystem zur
Bestimmung der proteolytischen Aktivität. In Abhängigkeit von Inkubationsdauer, pH
und Temperatur (s.u.) konnten bei Einsatz der 68 kD-Form von LeSBT1 drei
verschiedene Spaltprodukte von Glucagon mit den Massen 1748,78, 2347,08 und
2836,23 nachgewiesen werden. Die Abb. 9 zeigt ein typisches Massenspektrum der
Reaktionsprodukte der Umsetzung von Glucagon durch 68 kD-LeSBT1. Im Gegensatz
zu 68 kD-LeSBT1 zeigte die 73 kD-Form erst bei sehr starker Verlängerung der
Inkubationsdauer (nach ca. 120 min, pH 6,0) proteolytische Aktivität gegenüber
Glucagon als Substrat. Dadurch wird die Annahme bestätigt, daß erst die pH-abhängige
autokatalytische Prozessierung zur Aktivierung von LeSBT1 führt.
40
Abb. 9: Typisches MALDI-TOF-Massenspektrum der Reaktionsprodukte von Glucagon mit
LeSBT1: 50 µM Glucagon (Masse 3482,79) wurden mit 250 nM 68 kD LeSBT1 für 5
min bei pH 6,0 [50 mM Acetat, pH 6,0, 2 mM CaCl2] in einem „on-plate“-Test
inkubiert (Kap. 2.10.1) und analysiert (Kap. 2.6.8). Es konnten drei proteolytische
Fragmente mit den Massen 1748,78, 2347,08 und 2836,23 nachgewiesen werden.
Diese Massen entsprechen den für die Glucagonfragmente 1-15, 1-20, 1-24
errechneten monoisotopischen Massen, welche im oberen Bildabschnitt angegeben
sind. Die Pfeile unterhalb der Aminosäuresequenz von Glucagon markieren die
entsprechenden Schnittstellen.
3.2.4.2 Zeitabhängigkeit der proteolytischen Spaltung von Glucagon
Die Hydrolyse des Peptids Glucagon sollte in Abhängigkeit von der Inkubationszeit mit
LeSBT1 untersucht werden. Dazu wurde Glucagon in mehreren „on-plate“-Tests (s.
Kap. 2.10.1) mit LeSBT1 verdaut und einzelne Reaktionen zu definierten Zeitpunkten
abgestoppt. Die entsprechenden Produkte wurden dann mittels MALDI-TOF-
Massenspektrometrie analysiert (Abb. 10).
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT1 5 10 15 20 25
Masse (m/z)
1748.78 1 - 15
2347.08 1 - 20
2836.23 1 - 24 3482.7
glucagon
1500 2000 2500 3000 3500
10000
8000
6000
4000
2000
Rela
tive H
äufig
keit
Masse 2836.33
Masse 1748.78
Masse 2347.11
41
3482,7Glucagon
2346,9 1-20
2347,3 1-20
1748,7 1-15
1749,0 1-15
1748,9 1-15
2836.2 1-24
15.000
0R
elat
ive
Häu
figke
itR
elat
ive
Häu
figke
itR
elat
ive
Häu
figke
itR
elat
ive
Häu
figke
it
10.000
15.000
8.000
0
0
0
0 min
3 min
6 min
12 min
Masse (m/z)
1500 2000 2500 3000 3500
42
Abb. 10: Massenspektren der Reaktionsprodukte von Glucagon mit LeSBT1 in Abhängigkeit
von der Zeit:
Glucagon (25 µM) wurde in mehreren Ansätzen in einem 200-fachen molaren
Überschuß mit LeSBT1 inkubiert (Raumtemperatur, 50 mM Acetat/Essigsäure, pH
6,0, 2 mM CaCl2). Zu definierten Zeiten (0 min, 3 min, 6 min, 12 min) wurden
einzelne Reaktionen abgestoppt und mittels MALDI-TOF-MS analysiert. Dargestellt
sind die Massenspektren der zu den verschiedenen Zeitpunkten (linker Rand)
vorliegenden Peptide unter Angabe der entsprechenden Massen. Außerdem sind die
Aminosäurepositionen der Produkte, bezogen auf die Sequenz von Glucagon, unter
den Massen angegeben.
Es zeigte sich, daß zunächst alle drei Spaltprodukte nachweisbar waren. Mit
zunehmender Inkubationsdauer und damit Abnahme des eigentlichen Substrats
Glucagon, wurde zunächst das Peptid mit der Masse 2836,23 weiter hydrolysiert, so daß
nur noch die beiden Produkte der Massen 1748,78 und 2347,08 nachweisbar waren.
Nach 12 min, bzw. bei Inkubationsdauern von bis zu 60 min (Daten nicht gezeigt),
konnte nur noch das kleinste Spaltprodukt mit der Masse 1748.78 nachgewiesen
werden.
3.2.4.3 pH-Abhängigkeit der proteolytischen Spaltung von Glucagon
Die beobachtete pH-Abhängigkeit der autokatalytischen Prozessierung von LeSBT1
legte nahe, daß auch für die substratspaltende Aktivität von LeSBT1 eine solche
Abhängigkeit existiert. Die unter Kapitel 3.2.4.1 beschriebenen Daten hatten gezeigt,
daß nur die 68 kD-Form unter den bis anhin untersuchten Bedingungen Aktivität
aufwies. Dennoch sollte hier auch noch mal die 73 kD-Form untersucht werden, da in
den Autoprozessierungsversuchen, bei sehr niedrigen pH-Werten (pH 4,0),
Proteinabbau in Abwesenheit der 68 kD-Form beobachtet werden konnte (Abb. 7). Die
beiden Formen von LeSBT1 wurden dazu in einem „on-plate“-Test mit Glucagon bei
den verschiedenen pH-Werten für 5 min inkubiert und die proteolytischen
Abbauprodukte mit MALDI-TOF-MS analysiert. Parallele Kontrollansätze ohne Einsatz
von Protease belegten die Stabilität des Substrates unter allen pH-Bedingungen (Daten
nicht gezeigt).
43
Abb. 11: pH-Abhängigkeit der Spaltung von Glucagon durch die 73 bzw. 68 kD-Form von
LeSBT1.
Die 68 kD- (Abb. A) und die 73 kD-Form (Abb. B) wurden für 5 min bei
Raumtemperatur mit Glucagon in einem „on-plate“-Test inkubiert. Die pH-Werte
variierten dabei von pH 4,0 bis pH 9,0 (50 mM Acetat/Essigsäure für pH 4,0 bis pH
6,0; 50 mM Bis-Tris/Tris für pH 7,0, 50 mM Tris/HCl für pH 8,0 bis 9,0).
Proteolytische Abbauprodukte (1 bis 24: Mr = 2836,33 , 1 bis 20: Mr = 2347,11 , 1 bis
15: Mr = 1747,78 ) des Glucagons (Mr = 3482,79 ) wurden dann mittels MALDI-TOF-
MS analysiert. Die in den einzelnen Spektren ermittelte relative Häufigkeit des
Hauptproduktes wurde jeweils gleich 1 gesetzt. Die relative Häufigkeit der anderen
Produkte wurde dazu in Bezug gesetzt.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
rela
tive
Häu
figke
it
9 8 7 6 5.5 5 4.5 4
Glucagon1 bis 24
1 bis 201 bis 15
pH
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
rela
tive
Häu
figke
it
9 8 7 6 5 4
Glucagon
1 bis 24
1 bis 20
1 bis 15
pH
A
B
44
Um einen direkten Vergleich der einzelnen Spektren in einer anschaulichen Form zu
ermöglichen, wurde in jedem Spektrum die relative Häufigkeit des prominentesten
proteolytischen Produktes gleich 1 gesetzt und ins Verhältnis gesetzt zur relativen
Häufigkeit der anderen Produkte. Die so gewonnen Werte konnten dann in einem
Diagramm vergleichend dargestellt werden (s. Abb. 11).
Wie die Autoprozessierung zeigte auch die proteolytische Spaltung von Glucagon pH-
Abhängigkeit (Abb. 11, Teil A). Bei pH-Bedingungen von pH 7,0 bis 9,0 konnte keine
Aktivität nachgewiesen werden. Erst bei pH-Werten von pH 6,0 und darunter war die
Protease aktiv. Dabei konnte ein deutlicher Anstieg der Aktivität mit sinkendem pH
beobachtet werden, mit maximaler Aktivität bei pH 4,0 bis 4,5. Wie erwartet war die 73
kD-Form unter fast allen getesteten pH-Bedingungen inaktiv. Proteolytische Aktivität
gegenüber Glucagon wurde lediglich bei pH 4,0 beobachtet (Abb. 11, Teil B). Bei
längeren Inkubationszeiten (≥ 20 min, Daten nicht gezeigt), konnte auch bei pH 5,0 eine
leichte proteolytische Aktivität nachgewiesen werden. Bei solch ausgedehnten
Inkubationszeiten, im optimalen pH-Bereich für die autokatalytische Prozessierung,
scheint es jedoch wahrscheinlich, daß die gemessene Aktivität auf die bereits gebildete
68 kD-Form zurückzuführen ist.
3.2.4.4 Der Einfluß von Proteaseinhibitoren auf die proteolytische Spaltung von
Glucagon
Für Serinproteasen sind die unterschiedlichsten Hemmstoffe bekannt. Einige von ihnen
sollten auf die Fähigkeit getestet werden, die Aktivität von LeSBT1 zu inhibieren. In
diesem Zusammenhang sollte auch untersucht werden, inwieweit der Entzug von Ca2+
aus dem Reaktionsgemisch Einfluß auf die Aktivität von LeSBT1 hat. Dazu wurde
zunächst LeSBT1 in einem Standardtest mit den Inhibitoren (s. Tab. 5) für 5 min bei
Raumtemperatur vorinkubiert und die Reaktion durch die Zugabe von Glucagon
gestartet. Nach 5 bzw. 20 min wurden Aliquots entnommen und später mit MALDI-
TOF-MS analysiert. Aprotinin bewirkte eine schwache Hemmung der LeSBT1-
Aktivität, da auch nach 20 min Inkubation noch das Spaltprodukt der Masse 2347,08
nachweisbar war. Bei allen anderen Inhibitoren ließ sich nach 20 min nur noch das
Endprodukt der Masse 1748,78 detektieren. Keiner der anderen Inhibitoren (in der
getesteten Konzentration) war also in der Lage, die Aktivität von LeSBT1 signifikant zu
hemmen. Erwähnenswert ist hier, daß auch der Einsatz von Ca2+-Chelatoren keinen
45
meßbaren Einfluß auf die Aktivität von LeSBT1 hatte. Ein Umstand, der vermuten läßt,
daß die Aktivität von LeSBT1 nicht Ca2+-abhängig ist. Eine geringfügige Hemmung
mag in dem qualitativen MALDI-TOF-MS-Testsystem übersehen worden sein. Um eine
solche geringfügige Hemmung erfassen zu können, wird ein anderes, quantitatives
Testsystem entwickelt werden müssen.
Tab. 5: Verwendete Proteaseinhibitoren, eingesetzte Konzentration und Wirkspezifität:
Inhibitor Konzentration Hemmung von:
Aprotinin 0.3 µM Plasmin, Kallikrein, Trypsin, Chymotrypsin
BAPTA 5 mM Ca2+-abhängige Proteasen
DTT 5 mM Enzyme mit essentiellen Disulfidbrücken
TLCK 150 µM Trypsin und andere Serin- und Cysteinproteasen
TPCK 300 µM Chymotrypsin und andere Serin- und Cysteinproteasen
PMSF 1 mM Serin- und Cysteinproteasen
ZnCl2 2 mM Ca2+-abhängige Proteasen
3.2.4.5 Temperaturstabilität der 68 kD-Form von LeSBT1
Zur Überprüfung der Temperaturstabilität der 68 kD-Form von LeSBT1 wurden
einzelne Aliquots (Konzentration 500 nM, pH 5,0) für 10 min bei verschiedenen
Temperaturen inkubiert, abgekühlt und anschließend bei Raumtemperatur für einen „on-
plate“-Test mit Glucagon eingesetzt (s. Kap.2.10.1). Es zeigte sich, daß LeSBT1 ohne
jeglichen Aktivitätsverlust bei Temperaturen ≤ 50°C inkubiert werden konnte. Eine
Hitzebehandlung bei 60°C führte zu einer deutlichen Verringerung der Aktivität.
Inkubationen bei Temperaturen ≥ 70°C hatten den vollständigen Verlust der Aktivität
zur Folge.
3.2.4.6 Substratspezifität von LeSBT1
Neben Glucagon sollten auch noch weitere Peptide als mögliche Substrate von LeSBT1
getestet werden. Dazu wurden Mellitin, Insulin B-Kette und Systemin unter den
Standardbedingungen, d.h. in einem 200-fach molaren Überschuß mit LeSBT1 bei pH
5,0 für 2 bzw. 5 min in einem „on-plate“-Test inkubiert und die Spaltprodukte mit
MALDI-TOF-MS analysiert. Die Auswertung der so gewonnen Daten führte zu der
Identifizierung der in Abb. 12 dargestellten Spaltstellen.
46
Glucagon HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT
Oxidierte Insulin B-Kette FVNQHLC[SO3H]GSHLVEALYLVC[SO3H]GERGFFYTPKA
Mellitin GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ
Systemin AVQSKPPSKRDPPKMQTD
Abb. 12: Aminosäuresequenzen der Peptide, die als Substrat für LeSBT1 eingesetzt wurden.
Pfeile markieren die identifizierten Spaltstellen.
Tab. 6: Darstellung der Spaltstellen entsprechend der Nomenklatur nach SCHECHTER &
BERGER (1967). Die Spaltstelle ist durch einen Doppelstrich markiert. Die
Aminosäureteilsequenzen der Substrate wurden in der Einbuchstaben-Schreibweise
dargestellt. In der abgeleiteten Konsensussequenz steht X für das Fehlen einer
ausgeprägten Aminosäurepräferenz in der entsprechenden Position und Aliph für eine
Präferenz für aliphatische Aminosäuren (G, A, V, L, I). Die Buchstaben A und B am
linken Rand bezeichnen die zwei Gruppen für die Bestimmung der
Konsensussequenzen. ( 1) Hier wird der Übergang zwischen Prodomäne und N-
Terminus von 73 kD-LeSBT1 dem Konsensus gegenübergestellt.)
Substrat P5 P4 P3 P2 P1 P‘1 P‘2
Glucagon Q D F V Q W L
Glucagon S R R A Q D F
Glucagon S K Y L D S R
73 kD LeSBT1 S F F P Q T L
A
Konsensus S X X Aliph Q X X
Insulin B-Kette L V E A L Y L
Mellitin V L K V L T T
Konsensus Aliph Aliph X Aliph L X X
B
84 kD LeSBT1 1) I Y E L H T T
47
In Tabelle 6 sind die Spaltstellen entsprechend der Nomenklatur nach SCHECHTER &
BERGER (1967) untereinander angeordnet. Ein Vergleich der identifizierten
Spaltstellen erlaubte die Ableitung zweier Konsensusmotive für die Substratspezifität
von LeSBT1. Das erste Motiv (Tab. 6, Teil A) ist charakterisiert durch Gln in der P1-,
eine aliphatische Aminosäure in der P2- und ein Ser in der P5-Position. Im zweiten
Motiv (Tab. 6, Teil 2) findet sich Leucin in der P1-Position. Ausserdem fallen die
aliphatischen Aminosäuren in den Positionen P2, P4 und P5 auf. Welche von den beiden
hier beobachteten Konsensussequenzen bevorzugt gespalten wird, konnte wegen des
Fehlens eines quantitativen Testsystems nicht ermittelt werden. Der Übergang zwischen
Prodomäne und der 73 kD-Form von LeSBT1 weist gewisse Ähnlichkeit mit dem
zweiten Motiv (Tab. 6, Teil B) auf. Insbesondere fallen die beiden Thr-Reste auf, die
den N-Terminus der 73 kD-Form darstellen und die sich auch in der Spaltstelle des
Substrates Mellitin finden. Autokatalytische Spaltung an dieser Stelle scheint in
Anbetracht der beobachteten Prozessierung im heterologen Insektenzellsystem möglich,
wurde aber experimentell nicht erhärtet.
3.2.4.7 Hydrolyse AMC-gekoppelter Oligopeptide als Substrate
Im Bemühen, ein quantitatives Testsystem zu entwickeln, wurden auch verschiedene
AMC-gekoppelte Oligopeptide als Substrat für LeSBT1 getestet. Die bei Spaltung
dieser Substrate auftretende Fluoreszenz lässt sich quantitativ erfassen und ermöglicht
so eine quantitative Bestimmung der Proteaseaktivität unter den verschiedensten
Bedingungen.
Zu Beginn wurden für den Test die Substrate LeuLysArg-AMC und ArgValArgArg-
AMC eingesetzt. Die Wahl dieser Oligopeptide beruhte auf der anfänglichen Annahme,
daß LeSBT1 aufgrund seiner Zugehörigkeit zu den Subtilisin-ähnlichen Proteasen auch
nach dibasischen Aminosäuremotiven spalten könnte. Nach der Ermittlung des
Konsensusmotives für die Substratspezifität von LeSBT1 wurde das entsprechende
Oligopeptid GlyAlaGln-AMC eingesetzt. Alle Substrate wurden in einem jeweils 1000-
fach molaren Überschuß mit LeSBT1 unter verschiedenen pH-Bedingungen (pH 5,0,
6,0 und 7,0) inkubiert und gleichzeitig die Fluoreszenz des entsprechenden Ansatzes
analysiert (Eex = 380 nm; Eem = 460 nm). Unter keinen der getesteten Bedingungen
konnte ein Anstieg der Fluoreszenz, d.h. Spaltung der Substrate durch LeSBT1,
beobachtet werden. Die getesteten Peptid-AMC-Konjugate sind also nicht Substrate von
48
LeSBT1. Subtilisin Carlsberg [EC 3.4.21.62] dagegen setzte jedes der drei Konjugate
um. Um einen quantitativen Test für LeSBT1 zu entwickeln, wird es also nötig sein,
Peptid-AMC-Konjugate zu synthetisieren, deren Aminosäuresequenz in höherem Masse
mit dem oben beschriebenen Konsensusmotiv der Substraterkennung übereinstimmen.
3.2.4.8 Test auf Glykosylierung.
Eine Analyse der von der LeSBT1-cDNA abgeleiteten Aminosäuresequenz führte zur
Identifizierung einer putativen Glykosylierungsstelle in Position Asn376. Außerdem
deuteten die für die 68 kD-LeSBT1-Form durch ESI-MS und MALDI-TOF-MS
erhaltenen Massen (vgl. Kap. 3.2.3.3) auf eine mögliche posttranslationelle
Modifizierung hin. Es sollte daher überprüft werden, ob eine eventuelle Glykosylierung
ursächlich für diesen Massenunterschied sein könnte. Dazu wurden beide Formen von
LeSBT1 mit einem DIG-Glycan-Nachweis-Kit immunologisch auf gebundene
Zuckerseitenketten hin untersucht. Das Ergebnis ist in Abb. 13 dargestellt. Bei beiden
Formen konnten keinerlei Zuckerreste nachgewiesen werden.
Abb. 13: Immunologischer Test auf Glykosylierung von LeSBT1:
Je 2 µg der 68 kD-Form von LeSBT1 (Spur 1), der 73 kD-Form von LeSBT1 (Spur 2)
sowie des stark glykosylierten Proteins Transferrin (Positivkontrolle in Spur 3)
wurden auf einem SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und auf Nitrocellulose immobilisiert.
Nach der chemischen Kopplung von Digoxigenin an die Zuckerseitenketten, wurde
dieses immunologisch mit anti-DIG-Immunglobulin maskiert, welches mit einer
alkalischen Phosphatase gekoppelt war. Der Nachweis der Phosphatase erfolgte über
die unter Kap. 2.6.5 beschriebene Farbreaktion.
73 kD
68 kD
1 2 3
49
3.2.5 Immunolokalisation von LeSBT1
Die Immunolokalisation soll Aufschluß über die genauen Expressionsorte des Proteins
LeSBT1 in Lycopersicon esculentum geben. Dabei werden die Ergebnisse, die bei der
Analyse der Expression auf mRNA-Ebene gewonnen werden konnten (MEICHTRY et
al. (1999) und A. SCHALLER, persönliche Mitteilung) zugrunde gelegt. Die dort
erzielten Daten zeigten hohe mRNA-Level für LeSBT1 in Blüten, Stengeln und
Wurzeln. In Kotyledonen, Blättern und Zellkulturen von Lycopersicon esculentum
konnte dagegen keine mRNA von LeSBT1 nachgewiesen werden. Durch die
Immunolokalisation kann dieses zunächst nur für bestimmte Gewebe ermittelte
Expressionsmuster auf zellulärer Ebene untersucht werden.
3.2.5.1 Test der Antiseren auf Kreuzreaktivität
Für die eindeutige Identifizierung eines Proteins durch Immunglobuline ist es
notwendig, zunächst das verwendete Serum auf eventuelle Kreuzreaktivität mit anderen,
verwandten Proteinen hin zu untersuchen.
Die hier zu untersuchenden Antiseren gegen die Proteasen LeSBT1, -2, -3 und –4A
waren jeweils gegen bakteriell überexprimierte GST-Fusionsproteine, die nur
Teilbereiche der entsprechenden Proteasen repräsentierten, gerichtet (Kap. 2.7.1). Ihre
Spezifität sollte jedoch in bezug auf die vollständigen Proenzyme aller vier Proteasen
hin analysiert werden. Dazu wurden die heterolog in Insektenzellen überexprimierten,
intrazellulären Proteine, 96 h nach Infektion mit rekombinanten Baculoviren,
gewonnen, mittels SDS-PAGE aufgetrennt, durch „Western-Blot“ auf Nitrocellulose
immoblisiert und mit den vier Antiseren inkubiert. Die gebundenen Immunglobuline
wurden wie unter Kapitel 2.6.5 beschrieben, über Zweitantikörper und Farbreaktion
nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 14 dargestellt. Es konnte gezeigt
werden, daß keines der vier Antiseren für eine der Proteasen spezifisch war. Das
Antiserum gegen LeSBT1 erkannte nicht nur LeSBT1 sondern auch die Proteine
LeSBT3 und LeSBT4A. Das Antiserum gegen LeSBT2 erkannte neben LeSBT2 auch
das Protein LeSBT1. Die beiden Antiseren gegen LeSBT3 und LeSBT4A reagierten mit
jeweils beiden Proteinen, allerdings war die Interaktion zwischen Anti-LeSBT3-
Antiserum mit LeSBT4A nur sehr schwach, während Anti-LeSBT4A mit beiden
Proteinen etwa gleich stark interagierte (Abb. 14).
50
Abb. 14: Kreuzreaktivität der polyklonalen Antiseren gegen LeSBT1 bis LeSBT4A:
Je 2 µg der intrazellulären, unlöslichen Proteinfraktion von in serumhaltigem Medium
angezogenen Sf21-Zellen, 96 h nach Infektion mit dem entsprechenden rekombinanten
Virus, wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Dabei wurden die Proteinproben wie
folgt aufgetragen: Spur 1 = LeSBT1; Spur 2 = LeSBT2; Spur 3 = LeSBT3; Spur 4 =
LeSBT4A. Nach erfolgter Elektrophorese wurden die Proteine entweder mit
Coomassie-Brillant Blue gefärbt (A) oder mittels „Western-Blot“ auf Nitrocellulose
immobilisert und mit den einzelnen Antiseren (Verdünnung 1:1000) immunodekoriert
(B = Anti-LeSBT1; C = Anti-LeSBT2; D = Anti-LeSBT3; E = Anti-LeSBT4A).
3.2.5.2 Lokalisation von LeSBT1 in Blüten
Die Untersuchung der Kreuzreaktivität des polyklonalen Antiserums gegen LeSBT1
hatte gezeigt, daß von diesem auch andere Subtilasen erkannt werden. Dennoch sollten
mit diesem Antiserum erste Immunolokalisationen von LeSBT1 in der Blüte versucht
werden. Dabei wurde zum einen berücksichtigt, daß LeSBT1 auf mRNA-Ebene von
allen untersuchten Tomatensubtilasen in Blüten die stärkste Expression aufwies, und
somit die Wahrscheinlichkeit, mit dem Antiserum das Protein LeSBT1 statt einer
anderen Subtilase zu identifizieren, am größten war. Zum anderen konnte getestet
werden, ob mit diesem Serum prinzipiell eine signifikante Immunoreaktion mit
Blütenproteinen erzielt werden kann. Um die unspezifischen Reaktionen der
Immunglobuline der IgM-Klasse im Serum zu eliminieren, wurden aus dem Serum die
97 kD
66 kD
97 kD
97 kD
66 kD
66 kD
A
B C
D E
1 2 3 4 1 2 3 4
1 2 3 4
1 2 3 4 1 2 3 4
51
spezifischen Immunglobuline der IgG-Klasse mittels Affinitätschromatographie (s. Kap.
2.7.3) gereinigt und nur diese für die Immunolokalisation nach WEISS et al. (1993;
Kap. 2.11.3) eingesetzt. Dazu wurden jeweils unter gleichen Bedingungen
Blütenquerschnitte mit der IgG-Fraktion des Antiserums sowie der IgG-Fraktion des
entsprechenden Präimmunserums für 2,5 Stunden inkubiert. Die Markierung der
gebundenen Immunglobuline erfolgte mit durch alkalische Phosphatase gekoppelte
Ziege-anti-Maus-Antikörper in Form einer lokalen Farbreaktion, unter Einsatz von p-
Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat p-
Toluidinsalz (BCIP) als Substrate für die alkalische Phosphatase. Die Ergebnisse sind in
Abb. 15 dargestellt.
In den untersuchten Blütenquerschnitten konnte jeweils eine klare Immunodekorierung
von Proteinen im Tapetum der Antheren sowohl von sehr jungen noch geschlossenen
Blüten, als auch in älteren sich bereits öffnenden Blüten festgestellt werden. Die starke
Färbung der Pollen ist, besonders im Hinblick auf die auch durch das Präimmunserum
erzielte deutliche Färbung, eher auf eine unspezifische Immunoreaktion als Folge der
sehr rauhen Oberflächenbeschaffenheit der Pollen zurückzuführen. Weiterhin konnte
mit dem LeSBT1-Antiserum jeweils eine deutlich stärkere Färbung der Samenanlagen
im Fruchtknotenbereich als mit dem Präimmunserum erzielt werden. Ob es sich bei den
markierten Proteinen tatsächlich um LeSBT1 handelt, kann erst durch Einsatz eines
spezifischen Immunserums für LeSBT1, ohne Kreuzreaktivitäten mit anderen
Subtilasen, geklärt werden.
Abb. 15: Immunodekorierung von Blütenproteinen mit dem LeSBT1-Antiserum. Blütenquerschnitte wurden entsprechend einer Methode nach WEISS et al. (1993) mit den IgG-Antikörpern des Anti-LeSBT1-Serums bzw. des entsprechenden Präimmunserums inkubiert. Die Markierung der gebundenen Immunglobuline erfolgte mit durch alkalische Phosphatase gekoppelte Ziege-anti-Maus-Antikörper in Form einer lokalen Farbreaktion, unter Einsatz von BCIP und NBT als Substrate für die alkalische Phosphatase. A, B, C: Querschnitt einer jungen Blüte, Antheren
A: Gesamtquerschnitt, Anti-LeSBT1-Serum; B: Teilausschnitt von A, entsprechend Markierung; C: zu B vergleichbarer Teilausschnitt, Präimmunserum.
D, E, F: Querschnitt einer älteren Blüte, Antheren D: Gesamtquerschnitt, Anti-LeSBT1-Serum; E: Teilausschnitt von D, entsprechend Markierung; F: zu E vergleichbarer Teilausschnitt, Präimmunserum.
G, H, I: Querschnitt einer älteren Blüte, Fruchtknoten G: Gesamtquerschnitt, Anti-LeSBT1-Serum; H: Teilausschnitt von G, entsprechend Markierung; I: zu H vergleichbarer Teilausschnitt, Präimmunserum.
52
A
C
I
G
H
E
D
B
F
0,5 mm
0,5 mm
0,5 mm
53
3.3 Heterologe Expression von LeSBT2
Wie für LeSBT1 wurde auch für LeSBT2 ein Vergleich der von der cDNA abgeleiteten
Aminosäuresequenz mit denen anderer Subtilasen durchgeführt. Das Ergebnis deutete
auch hier auf die Existenz dreier Domänen hin, nämlich derjenigen des Signalpeptids,
der Prodomäne und der aktiven Domäne des reifen Proteins (Abb. 16).
1 MAGMLLKCMF FFVSVCLAIN LAKCSPNTKK TYIIQMDKWA KPDVFVDHVQ 51 WYSSLVKSVL PSTTEVEKTG DGEERILYSY QTAFHGVAAQ LSEEEVKKLQ 101 ERNGVLAVFP EIKYQLHTTR SPLFLGLDRE DSSKLWADRL SDHNVIVGVL 151 DTGIWPESPS FNDSGMTSVP SHWKGVCETG RGFEKHHCSK KIVGARVFFR 201 GYEAASGKIN ERGEFKSARD QDGHGTHTAG TVAGSVVRGA NLLGYAYGTA 251 RGMAPGARVA AYKVCWVGGC FSSDILSAVD QAVADGVNIL SISLGGGVSS 301 YNRDSLSIAA FGAMEKGVFV SCSAGNGGPD PISLTNVSPW ITTVGASTMD 351 RDFPATVELG TGKIVTGASL YKGRMNLSTQ KQYPLIYLGS NSSNLMPSSL 401 CLDGTLDKAS VAGKIVICDR GISPRVQKGQ VVKEAGGVGM ILTNTAANGE 451 ELVADSHLLP AVAVGEREGR AIKLYAAGRS ATATLRFLGT KLGIRPSPVV 501 AAFSSRGPNF LSLEILKPDM VAPGVNILAG WTGALGPSSL PIDQRRTNFN 551 ILSGTSMSCP HVSGIAALLK ARHPDWSPAA IKSALMTTAY VHDNTYKSLK 601 DASSVTPSTP YDHGAGHVNP RKAVDPGLIY DIGAQDYFEF LCTQELSPSQ 651 LMVFGKFSNR TCHHSLANPG DLNYPAISAV FPEKTKLSML TLHRTVTNVG 701 SPISNYHVVV SAFKGAVVKV EPERLNFTSK NQKLSYKVTF KTVSRQKAPE 751 FGSLIWKDGT HKVRSPIAIT WLASV*
Abb. 16: Primärstruktur von LeSBT2: Dargestellt ist die von der cDNA abgeleitete
Aminosäuresequenz. Schwarz unterlegt ist die vermutliche Signalsequenz, hellgrau
unterlegt die vermutliche Prodomäne. In der vermutlichen aktiven Domäne (nicht
unterlegt) sind durch die Aminosäuren der katalytischen Triade (Asp151, His224 und
Ser556) sowie das stabilisierende Asn326 markiert. bezeichnet putative
Glycosylierungsstellen, * markiert die Position des Stoppkodons.
54
In der Aminosäuresequenz der putativen reifen Form des Proteins konnten eindeutig die
drei charakteristischen Aminosäuren Asp151, His224 und Ser556 der katalytischen Triade
von Serinproteasen sowie das zur Stabilisierung einer Oxyanionentasche für die
tetraedrische Reaktionszwischenstufe notwendige Asn326 identifiziert werden.
Außerdem enthielt die Sequenz fünf Motive für putative Glykosylierungsstellen.
Zur Bestätigung der Existenz der zunächst nur vermuteten Domänen wurde die Protease
LeSBT2 im heterologen Insektenzell/Baculovirus-System exprimiert und im Hinblick
auf Expressionsformen, Prozessierung und Aktivität analysiert.
3.3.1 Zeitabhängigkeit der heterologen Expression und Vergleich der beiden
exprimierten Formen von LeSBT2
In Kapitel 3.1.3 wurde bereits dargestellt, daß LeSBT2 – ähnlich wie LeSBT1 – in Form
einer größeren intrazellulären, unlöslichen Form und einer kleineren, in den
Kulturüberstand sekretierten Form exprimiert wird. Um auch für LeSBT2 im Hinblick
auf eine Reinigung und Charakterisierung die optimale Infektionsdauer von Sf21-Zellen
zu bestimmen, wurde zunächst die Zeitabhängigkeit der Expression analysiert. Dazu
wurden für jeden Zeitpunkt je 106 Sf21-Monolayerzellen in serumfreiem Medium mit
einem Aliquot des HTV2 infiziert und zu den entsprechenden Erntezeitpunkten nach der
unter Kapitel 2.8.3 beschriebenen Methode aufgearbeitet. Die Analyse der
Proteinfraktionen erfolgte immunologisch nach der Auftrennung über SDS-PAGE-Gele
und anschließendem „Western-Blot“. Das Ergebnis ist in Abbildung 17 dargestellt.
In der extrazellulären Fraktion konnte bereits nach 36 h ein etwa 75 kD großes Protein
detektiert werden. Nach 72 h war die Expression maximal. In der intrazellulären
Fraktion konnte erst nach 48 h ein Protein von ca. 88 kD Größe nachgewiesen werden.
Für dieses Protein war die Expression nach 96 h maximal.
Die intrazelluläre Form konnte aminoterminal ansequenziert werden und der N-
Terminus wurde als SPNTKKTY bestimmt. Diese Sequenz weist eine hohe Ähnlichkeit
zum N-Terminus von Pro-LeSBT1 (RQNQKKTY) auf. Offenbar ist das Signalpeptid
von LeSBT2 mit einer Länge von 24 Aminosäuren deutlich länger als durch das
Programm SignalP vorausgesagt (18 Aminosäuren). Eine Bestimmung des N-Terminus
der sekretierten Form war bislang nicht möglich. Es kann jedoch angenommen werden,
daß der N-Terminus dieser Form wie bei LeSBT1 mit den beiden bei den pflanzlichen
Subtilasen hochkonservierten Thr-Resten beginnt (MEICHTRY et al., 1999).
55
Abb. 17: Zeitabhängigkeit der Expression von LeSBT2 in Sf21-Zell-Kulturen:
Pro Zeitwert (Stunden) wurden 106 Sf21-Zellen mit 100 µl HTV2 infiziert. Die Zellen
eines Zeitpunktes wurden in den Kulturüberstand resuspendiert, durch Zentrifugation
(1000 x g, 3 min) vom Medium getrennt und durch Gefrieren und Ultraschall
aufgeschlossen. Je 1/50 der intrazellulären, unlöslichen Proteinfraktionen wurde auf
einem SDS-PAGE-Gel aufgetrennt, mittels Western-Blot auf Nitrocellulose
immobilisiert und mit einem LeSBT2-Antiserum immunodetektiert (linke Bildhälfte).
In gleicher Weise wurde je 1/20 der löslichen Proteinbestandteile des
Kulturüberstandes nach Ultrazentrifugation (100.000 x g, 60 min) untersucht (rechte
Bildhälfte).
Ähnlich wie bei LeSBT1 wich auch für LeSBT2 die apparente Masse während SDS-
PAGE von der berechneten Masse ab. Die Form ohne Signalpeptid hat eine apparente
Masse von ca. 88 kD, die berechnete dagegen liegt bei 81.193 D. Für die sekretierte
Form ist die apparente Masse 75 kD, die berechnete dagegen – ausgehend von den
beiden Thr-Resten als N-terminale Aminosäuren – liegt bei 69.797 D.
3.3.2 Anreicherung des exprimierten Proteins
LeSBT2 konnte, wie in Kapitel 3.3.1 dargestellt, heterolog in Sf21-Zellen exprimiert
werden. Um das sekretierte 75 kD-Protein genauer charakterisieren zu können, war es
zunächst nötig, dieses aus dem Kulturüberstand zu reinigen und ein entsprechendes
Reinigungsprotokoll zu entwickeln:
Es zeigte sich, daß für die ersten Schritte das für LeSBT1 entwickelte
Reinigungsprotokoll (Kapitel 2.9.1 bzw. Kapitel 3.2.2) übernommen werden konnte.
Dazu wurde der Suspensionskulturüberstand von zwei Infektionsansätzen 72 h nach
Infektion durch Ultrazentrifugation von Zellen und Zelltrümmern separiert und in einer
9766
45
kD
0 24 36 48 60 72 96 0 24 36 48 60 72 96
56
fraktionierten Ammoniumsulfat-Präzipitation aufkonzentriert und angereichert
(Ausfällung von LeSBT2 in der Fraktion von 50 bis 90% Sättigung). Auch für LeSBT2
erwies sich eine anschließende hydrophobe Interaktions-Chromatographie als
ineffizient.
Als Folgeschritt sollte daher auch für LeSBT2 die Ionentauscher-Chromatopraphie
getestet werden. Dazu wurde die aufzutragende Proteinfraktion zunächst am
ÄKTAexplorer Chromatographiesystem, das auch für alle weiteren
Chromatographieschritte Anwendung fand, durch Gelfiltration (HighTrap-Desalting-
Säule, Amersham Pharmacia BioTech) entsalzt und in einen entsprechenden
Auftragspuffer umgepuffert. Die Analyse unterschiedlicher pH-Bedingungen an
Kationen- (UnoS, BioRad) und Anionentauschersäulen (UnoQ, BioRad) zeigte, daß sich
LeSBT1 und LeSBT2 in bezug auf ihre Bindung an Ionentauschersäulen deutlich
unterscheiden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine starke Anreicherung von LeSBT2
mittels Kationenaustausch-Chromatographie erzielt. Wie jedoch in Abb. 18 dargestellt,
ist die resultierende Proteinfraktion noch nicht homogen, so daß sich noch weitere
Reinigungsschritte werden anschliessen müssen.
Abb. 18: Reinigung der 75 kD-Form von LeSBT2 aus dem Zellkulturüberstand von Sf21-Zellen. Dargestellt ist ein Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel (8%). Der Kulturüberstand (700 ml) von Sf21-Zellen wurde 72 h nach Infektion mit rekombinanten Baculoviren (MOI = 1) durch Ultrazentrifugation bei 100.000 x g gewonnen. Die löslichen Proteine im Überstand [60 mg gesamt, davon in Spur 1 = 20µg] wurden einer fraktionierten Ammoniumsulfat-Präzipitation unterzogen [50-90%-Sättigung; 26 mg gesamt, davon in Spur 2 = 20 µg]. Das Präzipitat wurde resuspendiert, entsalzt und mittels Kationentauscher-Chromatographie (UnoS) weiter aufgereinigt. [5 mg gesamt, davon in Spur 3 = 2 µg]. In Spur 4 ist ein Protein-Molekulergewichtsmarker aufgetragen [BioRad, pro Bande ca. 1 µg].
97
66
45
kD1 2 3 4
57
3.4 Analyse der phylogenetischen Verwandtschaft der aktiven Domänen
verschiedener Subtilasen
Bakterielle Subtilisine verfügen über keine ausgesprochene Substratspezifität. Auch alle
bisher untersuchten pflanzlichen Subtilasen, wie Cucumisin (UCHIKOBA et al., 1995),
Taraxalisin (RUDENSKAYA et al., 1998) und Macluralisin (RUDENSKAYA et al.,
1995), spalten in vitro als Substrat angebotene Proteine eher unspezifisch. Tierische
Subtilasen dagegen weisen eine sehr hohe Substratspezifität auf. So spalten die
tierischen Proproteinkonvertasen (PC) der Kexin-Familie (Übersicht in STEINER,
1998) und die Hefe-Protease Kex2 (FULLER et al., 1989a) jeweils nach dibasischen
Aminosäuremotiven (R-X-K/R-R↓X, dabei markiert ↓ die Spaltstelle). Auch in der
Pyrolysin-Familie, in die auch die pflanzlichen Subtilasen eingeordnet werden, sind
inzwischen Proproteinkonvertasen mit hoher Substratspezifität identifiziert worden,
nämlich die Proteasen S1P (DUNCAN et al., 1997), SKI-1 (SEIDAH et al., 1999) und
PfSUB-1 (SAJID et al., 2000), welche nach Leu-, Thr-, bzw. Asp-Resten spalten.
Im Hinblick auf eine mögliche Funktion als Proproteinkonvertasen wurde die
phylogenetische Verwandschaft pflanzlicher Subtilasen mit den tierischen PCs der
Pyrolysin- und Kexinfamilie untersucht. Hierbei wurden das namengebende Subtilisin
(BPN‘, MARKLAND und SMITH, 1967), sowie Vertreter der Kexin- (SPC1 bis 7 und
Kex2) und Pyrolysin-Familie (SKI-1, S1P, PfSUB-1 und 14 Tomaten-Subtilasen
(MEICHTRY et al., 1999)) berücksichtigt. Bei den Tomaten-Subtilasen fand LeSBT4D
aufgrund einer Transposon-Insertion in der aktiven Domäne keine Berücksichtigung.
Weiterhin ist anzumerken, daß die katalytischen Domänen der pflanzlichen Subtilasen
alle eine ca. 150 Aminosäuren lange Insertion im Bereich zwischen den beiden
hochkonservierten Aminosäuren His und Ser der katalytischen Triade aufweisen. Diese
Insertion hat keine Entsprechung in den Aminosäuresequenzen der tierischen
Subtilasen, wurde aber für die Erstellung des Phylogeniebaumes berücksichtigt.
Die katalytischen Domänen der in Tabelle 7 aufgelisteten Proteasen wurden nach
SIEZEN & LEUNISSEN (1997) ermittelt und unter Nutzung des Programmes ClustalW
(Version 1.6, THOMPSON et al., 1994) vergleichend gegenübergestellt.
58
Tab. 7: Liste der Proteasen, die im Phylogeniebaum (Abb. 19) untersucht wurden, unter
Angabe der Aminosäureposition der aktiven Domäne sowie der Registriernummern in
den verschiedenen Datenbanken. (SPC = Subtilisin-ähnliche Proproteinkonvertasen,
Gruppeneinteilung nach STEINER (1998); die in Klammern angegebenen
Bezeichnungen entsprechen den jeweiligen Bezeichnungen in der Originalliteratur):
Protease Organismus Aminosäurepos.- aktive Domäne - Registriernr.
BPN‘ Bacillus amyloliquefaciens 108 - 382 P00782 Kex2 Saccharomyces cerevisiae 114 - 456 P13134 P69A Lycopersicon esculentum 115 - 602 Y17275 P69B Lycopersicon esculentum 115 - 601 Y17276 P69C Lycopersicon esculentum 115 - 602 AJ005171 P69D Lycopersicon esculentum 115 - 602 AJ006786 P69E Lycopersicon esculentum 115 - 602 AJ005172 P69F Lycopersicon esculentum 115 - 602 AJ005173 SBT1 Lycopersicon esculentum 106 - 613 AJ006378 SBT2 Lycopersicon esculentum 118 - 627 AJ006379 SBT3 Lycopersicon esculentum 113 - 609 AJ006380 SBT4A Lycopersicon esculentum 121 - 620 AJ006377 SBT4B Lycopersicon esculentum 118 - 618 AJ006480 SBT4C Lycopersicon esculentum 121 - 621 AJ006481 SBT4E Lycopersicon esculentum 118 - 618 AJ006483 Tmp Lycopersicon esculentum 115 - 656 U80583 PfSUB-1 Plasmodium falciparum 329 - 689 AJ002233 S1P Cricetulus griseus 185 - 475 Q9Z2A8 SKI-1 (hskiaa) Homo sapiens 185 - 475 D42053 SPC1 (Furin) Homo sapiens 108 - 438 P09958 SPC2 (PC2) Homo sapiens 110 - 456 P16519 SPC3 (PC1) Homo sapiens 111 - 453 P29120 SPC4 (PACE4) Homo sapiens 150 - 490 P29122 SPC5 (PC 4) Mus musculus 111 - 440 P29121 SPC6 (PC6) Homo sapiens 117 - 458 Q92824 SPC7 (PC8) Homo sapiens 142 - 476 Q16549
Unter Zugrundelegung dieser Gegenüberstellung wurde ein ursprungsloser
Phylogeniebaum mit Hilfe des Programms SplitsTree2.4 (HUSON, 1998), basierend auf
einer Methode nach BANDELT und DRESS (1992) errechnet. Das Ergebnis ist in
Abbildung 19 dargestellt. Die abgebildete Hamming-Distanz ist dabei ein Maß für den
Verwandschaftsgrad zweier Sequenzen, d.h. je länger die Strecke zwischen zwei
Elementen im Phylogeniebaum ist, desto unterschiedlicher sind ihre Sequenzen, desto
weiter sind sie also phylogenetisch voneinander entfernt.
59
SPC6
P69C
LeSBT4E
S1P
KEX2
LeSBT2
TMP
P69F
SPC7
LeSBT3
LeSBT4A
LeSBT4B
LeSBT4C
SPC5
p69B
P69E
P69A
SPC1SPC3
PfSUB-1
LeSBT1
BPN'
P69D
SPC2 SPC4
SKI-1
Abb. 19: Ursprungsloser phylogenetischer Stammbaum der aktiven Domänen verschiedener
Subtilisin-ähnlicher Serinproteasen (vgl. Tab. 7) Das Dendrogramm wurde nach der
Methode von BANDELT und DRESS (1992) erstellt. Die Entfernung zwischen je
zwei Proteinsequenzen entspricht der Hamming-Distanz, welche ein Maß für
phylogenetische Verwandschaft darstellt. Uneindeutige Verzweigungen werden durch
Netzstrukturen dargestellt.
60
Die Tomatensubtilasen wurden aufgrund des so errechneten Phylogeniebaumes in fünf
Gruppen eingeteilt (SBT1, -2, -3/4, P69 und TMP), wie sie bereits durch MEICHTRY
et al. (1999) bestimmt worden waren. Deutlich ist die nähere Verwandtschaft aller
Tomatensubtilasen zum bakteriellen BPN‘ als zu Kex2 bzw. den anderen Vertretern der
Kexine (SPCs) zu erkennen. Die tierischen Subtilasen PfSUB1 sowie SKI und S1P
fallen durch ihre verhältnismäßig isolierte Stellung sowie ihre vergleichsweise nähere
Verwandtschaft zu BPN‘ als zu den anderen tierischen SPCs auf. Ein Umstand der
bereits SIEZEN und LEUNISSEN (1997) und BARALE (1999) veranlasste, diese
Subtilasen in die Familie der Pyrolysine und nicht in die Familie der Kexine
einzuordnen.
Dies zeigt deutlich, daß auch Enzyme mit einer höheren Verwandschaft zu BPN‘ als zu
den hochspezifisch spaltenden SPCs, durchaus dennoch hoch spezifisch spaltende
Enzyme sein können.
61
4. Diskussion
Der Klan der Subtilasen wird in sechs verschiedene Familien eingeteilt (s. Abb. 1), von
denen nur drei, die Proteinase K-Familie, die Kexine und die Pyrolysine, eukaryontische
Vertreter beinhalten (SIEZEN und LEUNISSEN, 1997). Alle bisher bekannten
pflanzlichen Subtilasen sind der Familie der Pyrolysine zugeordnet worden. Die meisten
von ihnen wurden erst in den letzten Jahren identifiziert und bis zu einem gewissen
Grade charakterisiert (KANEDA et al., 1975 und 1995; RUDENSKAYA et al., 1995
und 1998; YAMAGATA et al., 1994; RIBEIRO et al., 1995; TAYLOR et al., 1997;
SABALA et al., 1997; UCHIKOBA et al., 1998; NEUTEBOOM et al., 1999;
MEICHTRY et al., 1999). Die wenigen biochemisch charakterisierten pflanzlichen
Subtilasen, Cucumisin (KANEDA et al., 1995; UCHIKOBA et al. 1995), Taraxalisin
(RUDENSKAYA et al., 1998), Macluralisin (RUDENSKAYA et al., 1995) sowie die
in Helianthus annuus (RUDENSKAYA et al., 1987) und in Benincasa hispida var.
Ryukyu (UCHIKOBA et al., 1998) identifizierten Subtilasen, scheinen eine breite
Substratspezifität zu besitzen und erfüllen daher wahrscheinlich unspezifisch
degradative Funktionen in Fruchtreifung oder Blattseneszenz.
Dennoch gibt es verschiedene indirekte Hinweise auf die Existenz von pflanzlichen
Subtilasen, die spezifische Proprotein prozessierende Aufgaben in physiologischen
Abläufen der Pflanze übernehmen. Einerseits wurde die Prozessierung von heterolog in
Pflanzen exprimierten Proteinen nach dibasischen Aminosäuremotiven beobachtet, was
die Existenz von Proteasen voraussetzt, welche eine den tierischen
Proproteinkonvertasen ähnliche Substratspezifität besitzen (TAO et al., 1990; KINAL et
al., 1995; PARK et al., 1996; JIANG und ROGERS, 1999; GU et al., 1996).
Andererseits wurden verschiedene pflanzliche Subtilasen identifiziert, die ein sehr
komplexes und zeitlich und/oder gewebespezifisch sehr beschränktes
Expressionsmuster aufweisen. Für diese werden Aufgaben in der Entwicklung bzw. in
den Feindabwehrmechanismen der Pflanze angenommen (JORDÁ et al., 1999 und
2000; MEICHRTY et al. 1999; RIBEIRO et al. 1995; TAYLOR et al., 1997).
Trotz dieser Hinweise steht der Nachweis pflanzlicher Subtilasen mit einer den
tierischen Proproteinkonvertasen vergleichbaren spezifischen Funktion noch aus.
62
Ziel dieser Arbeit war es daher, durch die biochemische Charakterisierung von
Subtilasen aus Tomate einen weiteren Schritt in diese Richtung zu tun.
Alle bisher durchgeführten biochemischen Charakterisierungen pflanzlicher Subtilasen
wurden an Enzymen durchgeführt, die in großen Mengen in vivo exprimiert werden und
daher relativ leicht aus der Pflanze gereinigt werden konnten (u.a. RUDENSKAYA et
al., 1987, 1995, 1998; UCHIKOBA et al. 1995). Dieser Ansatz schien hier ungeeignet,
weil (i) wenigstens 15 verschiedene Subtilasen in Tomatenpflanzen existieren
(MEICHTRY et al., 1999), die unter Umständen schwer voneinander zu trennen sein
würden, und (ii) weil für keines dieser Enzyme ein geeignetes Testsystem zur
Verfügung stand. Da jedoch bereits zu Beginn dieser Arbeit die cDNAs und Gene
etlicher Subtilasen aus Tomate vorlagen, erschien es sinnvoll, die Enzyme in
heterologen Systemen zu exprimieren und anschließend die rekombinanten Enzyme zu
reinigen und zu charakterisieren. Erste Versuche zur Expression in E. coli. führten
lediglich zur Akkumulation kleiner Mengen unlöslichen Proteins. Der Versuch einer
Denaturierung und anschließenden Renaturierung erschien wenig sinnvoll, da über die
biochemischen Eigenschaften der hier zu untersuchenden Subtilasen nichts bekannt war
und somit die Grundlage für die Überprüfung einer erfolgreichen Renaturierung fehlten.
Daher sollte die Expression in einem eukaryontischen Expressionssystem versucht
werden.
Es wurde das Baculovirus/Insektenzellsystem gewählt, welches den Vorteil korrekter
posttranskriptioneller und posttranslationeller Modifikationen des rekombinanten
Proteins bietet und welches bereits erfolgreich zur Expression pflanzlicher Proteine
eingesetzt worden war. Alle diese Proteine wurden in der gleichen Art und Weise wie in
Pflanzen prozessiert und korrekt glykosyliert, und die enzymatisch aktiven Formen der
rekombinanten Proteine konnten in vergleichsweise großen Mengen gewonnen werden
(MACDONALD et al., 1994; STAPLETON et al., 1994; DIRCKS et al., 1996, GU et
al., 1996).
Zu Beginn dieser Arbeit lagen die cDNAs der Tomatensubtilasen LeSBT1, LeSBT2,
LeSBT3 und LeSBT4A, die Gegenstand dieser Arbeit sind, bereits vor (MEICHTRY et
al. 1999). Alle vier scheinen Präproproteine zu kodieren. Die abgeleiteten
Aminosäuresequenzen weisen am N-Terminus einen kurzen Bereich hydrophober
63
Aminosäuren auf, der typisch für Signalpeptide ist, die zur Einschleusung von Proteinen
in das sekretorische System führen (Übersicht in MARTOGLIO und DOBBERSTEIN,
1998). An das Signalpeptid schließt sich eine für Subtilasen typische
Aminosäuresequenz, die Prodomäne, an. Dieser wird zum einen die Funktion eines
essentiellen, intramolekularen Chaperons (BAKER et al., 1993, VOLKOV und
JORDAN, 1996) und zum anderen die Funktion eines regulativen, intramolekularen
Inhibitors der enzymatischen Aktivität zugesprochen (ANDERSON et al., 1997;
BOUDREAULT et al. 1998a; ZHONG et al., 1999). Weiterhin konnten für alle
Subtilasen die charakteristischen Aminosäuren Asp, His und Ser der katalytischen
Triade in der vermuteten katalytischen Domäne, sowie das die Oxyaniontasche
stabilisierende Asn identifiziert werden (MEICHTRY et al., 1999, und diese Arbeit).
Die vollständigen ORFs der Subtilasen LeSBT1, LeSBT2, LeSBT3 und LeSBT4A
wurden in die DNA der Baculoviren inseriert und unter Kontrolle eines starken viralen
Promotors gestellt (s. Kapitel 3.1.1). Mit den rekombinanten Baculoviren konnte eine
Expression der Subtilasen in Sf21-Insektenzellen erzielt werden (Kapitel 3.1.3). Für
LeSBT4A konnten nur intrazelluläre Formen beobachtet werden. Dies ist eventuell auf
das nur im C-Terminus von LeSBT4A vorhandene RGD-Motiv zurückzuführen,
welches den Interaktionspunkt für Integrine definiert und in den tierischen PCs ein
konserviertes Motiv darstellt (SEIDAH und CHRÉTIEN, 1997). Im Falle von PC1
konnte gezeigt werden, daß es für den korrekten Transport durch das sekretorische
System sowie für die Stabilität von PC1 im endoplasmatischen Retikulum kritisch ist
(LUSSON et al., 1997). Von LeSBT1, LeSBT2 und LeSBT3 wurden jeweils sowohl
große Mengen unlöslichen, intrazellulären Proteins als auch kleinere Mengen von
löslichen, sekretierten Formen exprimiert. Dabei wiesen die intrazellulären Formen
deutlich größere apparente Massen als die sekretierten Formen auf. Eine solche
Akkumulation von unlöslichen intrazellulären Formen war auch von BOUDREAULT et
al. (1998b) bei der Expression der Proproteinkonvertase-1/3 der Maus in Insektenzellen
beobachtet worden. Für LeSBT1 und LeSBT2 ergab eine N-terminale Sequenzierung,
daß die intrazellulär akkumulierte Form dem Propolypeptid ohne Signalpeptid
entspricht. Dies legt die Vermutung nahe, daß die intrazellulären Formen co-
translationell ins endoplasmatische Retikulum eingeschleust worden waren, wo die
Prozessierung des Signalpeptids stattfand. Da die Expression der Proteasen in den
Insektenzellen unter der Kontrolle des sehr starken Polyhedrinpromotors erfolgt, der
64
erst in der späten Infektionsphase aktiviert wird, ist es wahrscheinlich, daß die
intrazellulären, unlöslichen Formen einen Artefakt darstellen, der auf die Überlastung
des sekretorischen Systems zurückzuführen ist und in der Akkumulation in
Einschlußkörperchen resultiert. Diese Sichtweise wird durch den Befund unterstützt,
daß die intrazellulären Formen erst ca. 24 Stunden nach der sekretierten Form auftreten
(Kap. 3.2.1 und Kap. 3.3.1).
Legt man zugrunde, daß für LeSBT1, LeSBT2 und LeSBT3 die intrazellulären Formen
die Proenzyme ohne Signalpeptid, und die sekretierten Formen die reifen Enzyme
darstellen (s.u.), so ist auffällig, daß die apparenten Massen der in Insektenzellen
exprimierten Formen von allen vier Proteasen nach oben von den aus der
Aminosäuresequenz berechneten Massen abweichen. So liegen etwa die apparenten
Massen von LeSBT1 für die intrazelluläre Form ohne Signalpeptid um ca. 6 kD und für
die sekretierte Form um ca. 4 kD über den errechneten. Für LeSBT2 weicht der Wert für
die intrazelluläre Form um ca. 7 kD und für die sekretierte Form um ca. 5 kD nach oben
ab. Dieser Befund deutet auf eine mögliche posttranslationelle Modifizierung, etwa
durch Glykosylierung, hin. Glykosylierungen wurde bereits für verschiedene in
Insektenzellen überexprimierte Proteine beschrieben. So haben MACDONALD et al.
(1994) bei der Expression des Auxinbindeproteins ABP1 in Insektenzellen die gleiche
Glykosylierung wie in der Ursprungspflanze Mais festgestellt. ULLMAN et al. (1998)
konnten zeigen, daß bei der Expression von Komplement-Faktor I des Menschen in
Insektenzellen dieser zwar Glykosylierungen an den richtigen Positionen aufwies, die
Zusammensetzung der Zuckerseitenketten jedoch nicht der des menschlichen Proteins
entsprach. In allen vier hier untersuchten Tomatensubtilasen konnten putative
Glykosylierungsstellen identifiziert werden (LeSBT1: Eine; LeSBT2: Fünf; LeSBT3:
acht ; LeSBT4A: sieben). Für die sekretierte 73 kD-Form von LeSBT1 konnte jedoch
das Fehlen von Zuckerseitenketten nachgewiesen werden (Kap. 3.2.4.8). Inwieweit aber
die anderen exprimierten Tomatensubtilasen glykosyliert sind, oder andere
posttranslationelle Modifikationen erfahren haben, konnte noch nicht geklärt werden.
Wie durch N-terminale Sequenzierung gezeigt, entspricht die 73 kD-Form von LeSBT1
dem putativen reifen Enzym ohne Prodomäne und beginnt mit zwei Thr-Resten. Dieses
Thr-Motiv wurde nicht nur auch am N-Terminus der reifen, aktiven Proteasen
Cucumisin (YAMAGATA et al., 1994), LIM9 (TAYLOR et al., 1997), der Protease aus
65
Benincasa hispida var. Ryukyu (UCHIKOBA et al., 1998) und P69 (TORNERO et al.,
1996) identifiziert, sondern ist ebenfalls in allen abgeleiteten Aminosäuresequenzen der
bisher klonierten pflanzlichen Subtilasen vorhanden (MEICHTRY et al., 1999;
NEUTEBOOM et al., 1999; RIBEIRO et al., 1995; RIGGS und HORSCH, 1995;
SIEZEN und LEUNISSEN, 1997). Ein vergleichbares, charakteristisches Motiv,
welches den Übergang zwischen Pro- und katalytischer Domäne darstellt, findet sich
auch in den Mitgliedern der Kexin-Familie und ist durch mehrere basische
Aminosäuren definiert. Dies deutet darauf hin, daß es sich bei dem Doppel-Thr-Motiv
um ein unter pflanzlichen Subtilasen konserviertes Prozessierungsmotiv handelt. Die
identische Prozessierung von ProLeSBT1 in Insektenzellen, und von Procucumisin,
ProLIM9 und ProP69 im pflanzlichen System an den beiden charakteristischen Thr-
Resten, läßt zwei Möglichkeiten zu: Zum einen die Existenz einer Protease, mit der hier
geforderten Substratspezifität, im endoplasmatischen Retikulum sowohl des tierischen
als auch des pflanzlichen Systems. Zum anderen besteht aber auch die Möglichkeit
einer autokatalytischen Prozessierung von der Proform zur reifen Form. Eine solche
autokatalytische Aktivierung von Subtilasen findet sich in Bakterien (IKEMURA und
INOUYE, 1988), in Hefen (WILCOX und FULLER; 1991) und - am besten untersucht
- bei den tierischen PCs (LEDUC et al. 1992; MATTHEWS et al. 1994; VAN DE LOO
et al. 1997; NAGAHAMA et al. 1998; Übersicht in ZHOU et al. 1999). An der
Spaltstelle zwischen Pro- und aktiver Domäne weisen die PCs ein Motiv mit basischen
Aminosäuren in der Anordnung (Arg/Lys)-Xn-(Lys/Arg) mit n = 0, 2, 4 oder 6 auf; eine
Anordnung, die die Substratspezifitäten der einzelnen Enzyme widerspiegelt. Im
Verlauf ihrer Prozessierung im sekretorischen System wird die Prodomäne
autokatalytisch prozessiert. Bei den bisher dahingehend untersuchten tierischen
Proproteinkonvertasen Furin, PC2, PACE4 und LPC (LEDUC et al., 1992; LAMANGO
et al., 1999; NAGAHAMA et al., 1998; VAN DEN LOO et al., 1997), sowie bei
Subtilisin (VOLKOV und JORDAN, 1996) erwies sich die autokatalytische Abspaltung
der Prodomäne als intramolekularer Prozeß. Ob ein solches Prinzip der
autokatalytischen Aktivierung durch die Abspaltung der Prodomäne auch im
pflanzlichen System realisiert ist, kann an dieser Stelle noch nicht beantwortet werden.
Für LeSBT1 kann das Spaltmotiv zwischen Pro- und aktiver Domäne jedoch - mit
gewissen Abweichungen - mit dem Konsensusmotiv einer der in vitro ermittelten
Substratspezifitäten von LeSBT1 (detaillierte Diskussion s.u.) zur Deckung gebracht
66
werden (Tab. 6, Teil B). Somit scheint zumindest eine autokatalytische Prozessierung
an dieser Stelle nicht von vornherein auszuscheiden.
Welcher dieser beiden Mechanismen bei LeSBT1 realisiert ist, muß also durch weitere
Untersuchungen geklärt werden. Denkbar wäre hier zum Beispiel die Mutation einer
Aminosäure der aktiven Domäne von LeSBT1. Wird dennoch eine Abspaltung der
Prodomäne bei der Überexpression in Insektenzellen beobachtet, so ist diese mit
Sicherheit auf eine Prozessierung in trans durch eine Insektenprotease zurückzuführen.
Weiterhin denkbar wäre auch der Versuch, die unlösliche Form von LeSBT1 aus
Insektenzellen, welche dem Proprotein entspricht, durch Denaturierung und
anschließende Renaturierung wieder in eine lösliche Form zu bringen und zu testen, ob
eine autokatalytische Überführung in die 73 kD-Form von LeSBT1 stattfindet.
Wie auch immer die Abspaltung der Prodomäne von LeSBT1 katalysiert wird, sie führt
nicht, wie bei den meisten anderen Subtilasen (Pflanzen: YAMAGATA et al., 1994;
TAYLOR et al., 1997; TORNERO et al., 1996; Tiere: LEDUC et al. 1992;
MATTHEWS et al. 1994; VAN DE LOO et al. 1997; NAGAHAMA et al. 1998), zur
Aktivierung des Zymogens. Vielmehr ist für die Aktivierung die Abspaltung weiterer 21
N-terminaler Aminosäuren notwendig. Die aktiven Formen der beiden pflanzlichen
Subtilasen Taraxalisin und Macluralisin (RUDENSKAYA et al., 1995 und 1998)
beginnen ebenfalls nicht mit den zwei Thr-Resten, die den Übergang der Pro- in die
aktive Form bei den anderen pflanzlichen Subtilasen markieren (s.o.). Weil die Gene für
diese beiden Proteasen jedoch noch nicht identifiziert worden sind, kann in diesem Fall
nicht unbedingt geschlossen werden, daß die abweichende N-terminale Sequenz wie bei
LeSBT1 auf die Prozessierung der zunächst „vollständige“ Form zurückzuführen ist.
Die Abspaltung der N-terminalen 21 Aminosäuren bei LeSBT1 konnte in einer
homogenen Präparation der 73 kD-Form beobachtet werden, daher handelt es sich hier
offenbar um eine autokatalytische Prozessierung. Solche stufenweisen autokatalytischen
Aktivierungen sind schon mehrfach in der Literatur beschrieben worden. Herpesviren
kodieren zum Beispiel u.a. für Serinproteasen, die zwei autokatalytische
Prozessierungsstellen aufweisen. Spaltung der ersten führt zur Freisetzung der
Prodomäne, Spaltung der zweiten zur Aktivierung (TIGUE et al. 1996, O‘BOYLE et al.
1997). Bei der Subtilisin-ähnlichen Protease PfSUB-1, die ebenfalls nach der
Abspaltung der Prodomäne noch eine zweite N-terminale Prozessierung durchläuft,
67
handelt es sich bei beiden proteolytischen Spaltungen um einen intramolekularen
Prozeß (BLACKMAN et al., 1998; SAJID et al., 2000). Die beobachtete
Konzentrationsabhängigkeit der autokatalytischen Spaltung von LeSBT1 (Kap. 3.2.3.2)
macht für diese Prozessierung aber eher einen intermolekularen Prozeß wahrscheinlich.
Solche intermolekularen Mechanismen der Proteinaktivierung sind ebenfalls, wenn
auch nicht für Subtilisin-ähnliche Proteasen, beschrieben worden. Zum Beispiel konnte
für eine Cystein-Protease aus Streptococcus pyrogenes ein sigmoidaler Anstieg der
Aktivität als Folge fortschreitender intermolekularer, autokatalytischer Prozessierung
gezeigt werden (DORAN et al., 1999). Ebenso erfolgt die Aktivierung des humanen
Procathepsin D zur aktiven Form durch eine Abspaltung der Prodomäne in trans
(WITTLIN et al., 1999; ROZMAN et al., 1999).
Zusammengenommen sprechen diese Daten daher für eine zweistufige Aktivierung von
LeSBT1, bei der zumindest der letzte Schritt, die Überführung der 73-kD-Form in die
68-kD-Form, eine autokatalytische Prozessierung in trans darstellt.
Die autokatalytische Prozessierung der 73 kD-Form zur 68 kD-Form von LeSBT1
unterliegt einer strengen pH-Abhängigkeit. Während die 73 kD-Form bei pH-
Bedingungen von 7 und höher stabil war, konnte bei pH-Bedingungen von 6,0 und
niedriger die Bildung der 68 kD-Form beobachtet werden (Kap. 3.2.3.1). Das Auftreten
dieser Form korrelierte mit dem Auftreten der proteolytischen Aktivität. Diese
Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Reifung von LeSBT1 in vivo ein pH-abhängiger
Prozeß ist. Solche pH-abhängigen Reifungsmechanismen sind z.B. für einige tierische
Proproteinkonvertasen beschrieben. ProPC2 etwa ist in vitro bei neutralen pH-Werten
recht stabil. Eine Inkubation bei pH 4,0 bis 5,0 führt dagegen zu einer schnellen
autokatalytischen Umsetzung zu PC2. Die notwendigen pH-Bedingungen finden sich in
vivo in einem „späten“ Kompartiment des sekretorischen Systems, so daß für die
Reifung von PC2 eine Regulation durch den abfallenden pH-Gradienten im
sekretorischen System angenommen wird (SHENNAN et al., 1995; LAMANGO et al.,
1999). Ein anderes, ebenfalls pH-abhängiges Reifungsprinzip ist bei Furin zu finden
und wird ähnlich auch für die Reifung der Subtilisin-ähnlichen Protease 1 aus
Plasmodium falciparum (PfSUB1) diskutiert (SAJID et al., 2000). Die autokatalytische
Spaltung der Prodomäne von der katalytisch aktiven Domäne des Furins findet bereits
im endoplasmatischen Retikulum bei neutralem pH-Wert statt. Beide Domänen bleiben
68
bei diesem pH-Wert aber über nicht-kovalente Bindungen miteinander assoziiert, wobei
die Prodomäne die Funktion eines regulativen Inhibitors der Protease übernimmt. Erst
die leicht sauren pH-Bedingungen (um pH 6,0) des folgenden Kompartiments des
sekretorischen Systems führen zu einer internen Spaltung der Prodomäne und
nachfolgend zur Dissoziation des aktiven Furins (VEY et al., 1994; ANDERSON et al.,
1997). Für PfSUB1 wird ebenfalls angenommen, daß die Prodomäne bis in die späten
Bereiche des sekretorischen Systems assoziiert bleibt, dort jedoch dissoziiert und
PfSUB1 anschließend noch eine weitere autokatalytische Prozessierung bis zum reifen
Protein durchmacht (SAJID et al., 2000). Ebenfalls bei sauren pH-Werten erfolgt die
endgültige Reifung der Proprotein-Konvertase 1/3 der Maus. Während die Abspaltung
der Prodomäne bereits bei neutralen pH-Werten erfolgt und das resultierende Enzym
nur bei diesen pH-Werten aktiv ist, führt die Prozessierung des C-Terminus in einem
sauren Milieu zur Bildung eines Proteins mit Aktivität nur im sauren pH-Bereich
(BOUDREAULT et al. 1998b).
Diese Beispiele zeigen, daß der Reifung der verschiedenen Subtilasen sehr komplexe
Mechanismen zugrunde liegen, die gewährleisten, daß die Proteasen erst an ihrem
Wirkort aktiviert werden. Die in dieser Arbeit für LeSBT1 ermittelten Daten lassen
vermuten, daß die pH-abhängige Reifung dieser pflanzlichen Subtilase eine neue
Variation zu diesem Thema darstellt.
Nicht nur die Reifung von LeSBT1 ist pH-abhängig, sondern auch für die Aktivität in
trans konnte in dieser Arbeit eine deutliche pH-Abhängigkeit gezeigt werden. Die 68
kD-Form von LeSBT1 zeigte bei pH-Werten von 7,0 und höher in bezug auf
Oligopeptidsubstrate keine Aktivität. Mit abfallenden pH-Werten von 6,0 bis 4,0 konnte
dagegen ein deutlicher Anstieg der Aktivität beobachtet werden. Die hier geforderten
niedrigen pH-Werte für maximale Aktivität liegen in der Pflanze nur in einigen
Vesikeln, der Vakuole und dem Apoplasten vor. Das Fehlen von typischen Motiven für
den Transport in die Vakuole (NEUHAUS und ROGERS, 1998) sowie die Sekretion
von LeSBT1 in Insektenzellen und in Suspensionskulturen von Lycopersicon
peruvianum (Daten nicht gezeigt), macht dabei eine Lokalisation der Protease im
Apoplasten am wahrscheinlichsten. Das beobachtete pH-Optimum im sauren Bereich
steht desweiteren im direkten Gegensatz zu den basischen pH-Optima, die für die
anderen bisher biochemisch untersuchten pflanzlichen Subtilasen ermittelt werden
69
konnten (Übersicht in BOGACHEVA, 1999). Diese scheinen im allgemeinen eher
degradative Funktionen zu erfüllen.
Interessant ist in diesem Zusammenhang die Beobachtung, daß die 73 kD-Form von
LeSBT1, wie erwartet, bei pH-Werten bis hinunter zu pH 5,0 keine Aktivität zeigte, bei
pH 4,0 aber sehr wohl in der Lage war, das Peptidsubstrat Glucagon zu spalten (Kap.
3.2.4.3). Die einfachste Erklärung wäre eine sehr schnelle autokatalytische Aktivierung
der 73 kD-Form bei pH 4,0, so daß die hier gemessene Aktivität bereits auf die 68 kD-
Form zurückzuführen ist. Möglicherweise ist aber auch bei so niedrigen pH-Werten die
Abspaltung der 21 N-terminalen Aminosäuren für die Aktivierung nicht notwendig.
Diese Annahme wird durch den Befund gestützt, daß bei den Untersuchungen zur
autokatalytischen Prozessierung beim pH-Wert 4,0 trotz deutlich vorhandener
proteolytischer Aktivität, die letzten Endes sogar zur völligen Autolyse führte, das
Auftreten der 68 kD-Form nicht beobachtet werden konnte (Kap. 3.2.3.1). Eine
mögliche Erklärung dieser Ergebnisse wäre die Blockierung des aktiven Zentrums der
73-kD-Form durch den N-Terminus als autoinhibitorischen Mechanismus. So ist es
denkbar, daß normalerweise erst die Abspaltung des autoinhibitorischen Peptids und
seine Dissoziation in einem leicht sauren Milieu (pH 5,0 bis 6,0) das aktive Zentrum der
resultierenden 68 kD-Form für Substrate zugänglich macht. Unter extrem sauren
Bedingungen (pH 4,0) dagegen, könnte es zu einer Konformationsänderung kommen, in
Folge derer der N-Terminus auch ohne vorherige Abspaltung das katalytische Zentrum
freigibt und für Substrate zugänglich macht.
Die Regulation der Aktivität durch Konformationsänderung als Folge eines veränderten
Milieus, wie etwa Veränderung des pH-Wertes, ist z.B. für humanes Cathepsin D
beschrieben (LEE et al., 1998). Diese Aspartatprotease ist einerseits im Katabolismus
von Proteinen, andererseits aber auch in der spezifischen Prozessierung von Hormonen
und Wachstumsfaktoren involviert. Reifes Cathepsin D ist bei neutralen pH-Werten
inaktiv, erlangt bei Überführung in saure pH-Bedingungen jedoch seine volle Aktivität.
Ein Vergleich der Kristallstrukturen des Proteins bei pH 5,1 und pH 7,5 führte zur
Entdeckung zweier unterschiedlicher Konformationen des Proteins (LEE et al., 1998).
Bei hohen pH-Werten sind die 16 N-terminalen Aminosäuren in die Tasche für die
Substratbindung geklappt und blockieren damit die Interaktion zwischen Enzym und
Substrat. Bei niedrigen pH-Werten erfolgt jedoch eine Konformationsänderung, die zur
Freisetzung des N-Terminus führt und somit die Substratbindung und -spaltung wieder
70
ermöglicht. Im Bereich des pH-Optimums für die katalysierte Reaktion bei pH 3,0
konnte aber auch eine deutliche Instabilität des Enzyms festgestellt werden, die
vermutlich auf Autolyse zurückzuführen ist. Eine solche Instabilität im Bereich des pH-
Optimums der Reaktion von ca. pH 4,0 konnte auch für die 73-kD-Form von LeSBT1
beobachtet werden. Ein weiteres Beispiel für regulative Konformationsänderungen ist
durch die pflanzliche Aspartatprotease Prophytepsin gegeben. Es konnte gezeigt
werden, daß an deren autoinhibitorischer Blockierung des aktiven Zentrums nicht nur
die Prodomäne, sondern auch 13 Aminosäuren des N-Terminus des reifen Proteins
beteiligt sind (KERVINEN et al., 1999). Die Sekretion des Proenzyms in eine saure
Umgebung führt zur Abspaltung der Prodomäne und damit verbunden, zu einer
Konformatiosnänderung der bisher blockierend wirkenden ersten Aminosäuren des
neuen N-Terminus. Dabei halten KERVINEN et al. (1999) eine die Aktivität
regulierende Funktion des neuen N-Terminus in Abhängigkeit vom pH für durchaus
möglich.
Der Aktivierung von LeSBT1 nach der Abspaltung der Prodomäne können also zwei
Mechanismen zugrunde liegen: Eine pH-abhängige autoproteolytische Aktivierung, wie
sie etwa auch für PfSUB1 (SAJID et al., 2000) angenommen wird, oder eine pH-
bedingte Aktivierung über eine Konformationsänderung, wie sie für Cathepsin D (LEE
et al., 1998) und Phytepsin (KERVINEN et al., 1999) angenommen wird. Inwieweit
beide Mechanismen in vivo realisiert sind bzw. physiologische Relevanz besitzen, kann
an dieser Stelle noch nicht beantwortet werden. Möglicherweise werden die
Kristallstrukturen der beiden Formen von LeSBT1, die in Zukunft analysiert werden
sollen, zur Aufklärung dieser Frage beitragen.
Untersuchungen zur Substratspezifität von LeSBT1 in trans (Kap. 3.2.4.6) führten zur
Identifizierung von zwei Präferenzen in den eingesetzten Oligopeptidsubstraten. Die
erste ist charakterisiert durch Gln in der P1-, eine aliphatische Aminosäure in der P2-
und ein Ser in der P5-Position. Die zweite scheint in der P1-Position ein Leu zu
erfordern. Außerdem fallen die aliphatischen Aminosäuren in den Positionen P2, P4 und
P5 auf. Weiterhin zeigte sich, daß LeSBT1 vermutlich zur Substraterkennung mehr als
vier N-terminale Aminosäuren benötigt. Dieser Annahme liegen zwei Beobachtungen
zugrunde. Erstens wurde nach Gln-Resten, die weniger als vier Aminosäuren vom N-
Terminus der Oligopeptide entfernt lagen, nicht gespalten (in Glucagon, in der Insulin
71
B-Kette und in Systemin, vgl. Abb. 12). Zweitens wurde das Fluorophor-gekoppelte
Substrat Gly-Ala-Gln-AMC von LeSBT1 nicht umgesetzt. Offensichtlich wird die
Substraterkennung von LeSBT1 also nicht nur durch die Aminosäure in der P1-Position,
sondern auch noch durch andere, die Spaltstelle umgebende Aminosäuren definiert.
Eine vergleichbare Beobachtung machten auch SEIDAH et al. (1999). Die von ihnen
untersuchte Protease SKI-1 spaltete in vitro längere Peptide (20 Aminosäuren), die die
Sequenz ihres physiologischen Substrats, eines neurotrophen Faktors aus dem
Vorderhirn (pBDNF), enthielten. SKI-1 war aber nicht in der Lage, kleine (vier
Aminosäuren) AMC-gekoppelte Substrate, die dieses Motiv ebenfalls enthielten, zu
spalten.
Bis vor kurzem ist man davon ausgegangen, daß eukaryontische Subtilasen entweder in
Erfüllung einer degradativen Funktion ohne große Spezifität an den unterschiedlichsten
Stellen spalten, wie etwa die pflanzlichen Subtilasen Cucumisin (KANEDA et al., 1995;
UCHIKOBA et al. 1995), Taraxalisin (RUDENSKAYA et al., 1998) und Macluralisin
(RUDENSKAYA et al., 1995). Oder aber sie spalten spezifisch nach Gruppen von
basischen Aminosäuren, wie die Mitglieder der Kexin-Familie (BARR, 1991;
WATANABE et al., 1992; SEIDAH und CHRÉTIEN, 1997; BEVAN et al., 1998), die
alle eine wohl definierte Rolle in der Reifung von Peptidhormonen, Wachstumsfaktoren
und Neuropeptiden spielen. Die kürzliche Entdeckung der „Site-1“-Protease (S1P)
(DUNCAN et al., 1997; SAKAI et al., 1998; CHENG et al., 1999), des
Subtilisin/Kexin-Isozyms 1 (SKI1) (SEIDAH et al. 1999) und der PfSUB1- und -2-
Proteasen (BLACKMAN et al., 1998; BARALE et al., 1999; SAJID et al., 2000) in
tierischen Systemen zeigte jedoch, daß auch Proprotein-Konvertasen existieren, welche
sich in ihrer Spezifität deutlich von denen der Kexin-Familie unterscheidet. So spalten
diese Proteasen C-terminal von Leu-, Thr-, oder Asp-Resten. Vor diesem Hintergrund
scheint die Präferenz von LeSBT1 für entweder Gln oder Leu in der P1-Position eine
neue Variante für Subtilasen mit ungewöhnlicher Spezifität zu sein und unterscheidet
LeSBT1 deutlich von allen anderen bisher untersuchten pflanzlichen Subtilasen. Wird
etwa den Proteasen Cucumisin und Macluralisin die Insulin B-Kette als Substrat in vitro
angeboten, so spalten sie an acht verschiedenen Positionen, ohne erkennbare Präferenz
für ein bestimmtes Motiv (KANEDA et al., 1975; RUDENSKAYA et al., 1995).
Taraxalisin spaltet sogar neun der 29 Peptidbindungen (RUDENSKAYA et al., 1998).
Für LeSBT1 konnte jedoch nur eine einzige Spaltstelle in der Insulin B-Kette
72
identifiziert werden, C-terminal von Leu15. Auch im Testsubstrat Mellitin wurde nur
eine Peptidbindung gespalten, ebenfalls C-terminal eines Leu (Leu9). Besonders
interessant an dieser Spaltstelle sind jedoch die beiden Thr-Reste, die die P1‘ und P2‘-
Position dieses Substratmotivs definieren. Ein solches Doppel-Thr-Motiv findet sich in
gleicher Position in der Prozessierungsstelle von LeSBT1 zwischen Pro- und aktiver
Domäne.
Wie bereits erwähnt, spiegeln die Sequenzen, welche die autokatalytischen
Prozessierungstellen flankieren, oft die Substratspezifität in trans der bisher
untersuchten Subtilasen wider. So läßt sich auch die autokatalytische
Prozessierungsstelle, die für die Überführung der 73 kD-Form in die 68 kD-Form von
LeSBT1 relevant ist, gut mit der ermittelten Substratspezifität, die ein Gln in der P1-
Position verlangt, zur Deckung bringen. Es ist bemerkenswert, daß von LeSBT1 in vitro
aber auch ein Substrat gespalten wird, welches ein der Prodomänen-Prozessierungsstelle
ähnliches Motiv enthält. Dies könnte dafür sprechen, daß auch der erste Schritt der
Reifung von LeSBT1 ein autokatalytischer Prozeß ist. Problematisch ist in diesem
Zusammenhang die Tatsache, daß diese Spaltung durch die 68 kD-Form, d.h. die bereits
prozessierte Form, erfolgte und nicht durch die 73 kD-Form. Möglicherweise beeinflußt
die noch gebundene Prodomäne die Konformation des Enzyms dahingehend, daß die
Proform fähig ist zur autokatalytischen Spaltung, die freigesetzte 73 kD-Form dagegen
diese Aktivität nicht mehr besitzt. Es ist bislang auch unklar, inwieweit die beiden
identifizierten Substratpräferenzen von LeSBT1 gleichberechtigt vorliegen, oder sich in
Abhängigkeit der Reifung oder des Mileus verändern. Denkbar wäre hier z. B. eine
durch verschiedene Faktoren wie etwa pH modulierte Veränderung der
Substratspezifität, die zunächst eine autokatalytische Abspaltung der Prodomäne
ermöglicht. Als Folge dieser Abspaltung könnte sich die Konformation dahingehend
verändern, daß der neue N-Terminus die aktive Domäne blockiert. Die Sekretion von
LeSBT1 schließlich, verbunden mit der Senkung des pH-Wertes, könnte zur Ausbildung
einer veränderten Substratspezifität führen, die die Abspaltung des N-Terminus
ermöglicht und das Enzym endgültig aktiviert.
Ein vergleichbarer Fall liegt für Furin vor, für das gezeigt wurde, daß unterschiedliche
Substrate bei verschiedenen pH-Werten in vivo optimal prozessiert werden (BRENNAN
und NAKAYAMA, 1994; CHIRON et al., 1997). Bei PfSUB1 ist der erste
73
Autoprozessierungsschritt, im Gegensatz zum zweiten, nicht Ca2+-abhängig (SAJID et
al., 2000). Und für die Proprotein-Konvertase PC1/3 konnte nachgewiesen werden, daß
eine C-terminal gekürzte Form des reifen Proteins eine völlig andere pH-Abhängigkeit
aufwies. Während die vollständige 85 kD-Form bei neutralen pH-Werten aktiv war, ist
die prozessierte 71 kD-Form nur bei sauren pH-Werten aktiv. BOUDREAULT et al.
(1998b) erklären diesen Effekt und seine physiologische Relevanz folgendermaßen: Die
71 kD-Form ist, im Gegensatz zu der 85 kD-Form, bei pH-Werten, wie sie in frühen
Kompartimenten des sekretorischen System herrschen, sehr instabil. Umgekehrt ist die
85 kD-Form bei sauren pH-Werten, wie sie etwa in den späten Bereichen des Golgi-
Komplexes herrschen, nicht stabil. Es wird daher angenommen, daß die 85 kD-Form
durch ihren C-Terminus stabilisiert wird. Überführung in leicht saure Umgebung
während des Sekretionsprozesses führt dann zur vollständigen Aktivierung durch
Abspaltung des zur Stabilisierung nicht mehr notwendigen C-Terminus.
Die oben diskutierten Daten zeigen, daß der Reifung und Spezifität von LeSBT1 sehr
komplexe Mechanismen zugrunde liegen, wie sie auch für die humanen PCs oder
andere Proprotein prozessierende Proteasen beschrieben sind. Die Frage, welchem
Zweck diese Mechanismen dienen, und die sich daran anschliessenden Fragen nach der
physiologischen Funktion und den in vivo Substraten von LeSBT1 ist bislang
unbeantwortet.
Ein erster möglicher Ansatz, diesen Fragen zu begegnen beruht auf dem Versuch, die in
vitro-Spezifität von LeSBT1 noch genauer zu spezifizieren und mit dieser in den
verschiedenen existierenden Datenbanken nach Proteinen zu suchen, welche diese
Sequenzen beinhalten. Mit den bisherigen, noch recht indifferenten Daten ist ein solcher
Vergleich nicht möglich. Hilfreich könnte in diesem Zusammenhang zum Beispiel die
von MATTHEWS und WELLS (1993) beschriebene Methode zur Identifizierung von
Proteasesubstraten mittels „Phage-Display“ sein, die es ermöglicht, ca. 107 verschiedene
Aminosäuresequenzen darauf hin zu analysieren, ob sie durch die zu untersuchende
Protease gespalten werden oder nicht. Unter Anwendung dieser Methode ist es z.B.
gelungen, die in vivo-Substrate der Protease Granzym B zu identifizieren, die in der
Immunreaktion des Menschen involviert ist (HARRIS et al., 1998). Für die humane,
neutrophile Serinprotease Elastase konnte sogar gezeigt werden, daß eine Mutation des
für die Katalyse essentiellen His57, durch einige His-enthaltende Substrate
74
komplementiert werden konnte (DALL’ACQUA et al., 1999). Man spricht in einem
solchen Fall von einer Substrat-assistierten Katalyse. Dies zeigt, wie vielfältig die
Interaktionen zwischen Enzym und Substrat sein können und daß die „Phage-Display“-
Methode ein gutes Werkzeug darstellt, um solche Interaktionen zu untersuchen. So wäre
es im Falle von LeSBT1 z. B. möglich, eingehendere Untersuchungen durchzuführen,
ob sich die Spezifität von LeSBT1 bei Variation des pH-Wertes oder der Ca2+-
Konzentration ändert, um zu klären, inwieweit die identifizierten Substratspezifitäten
durch solche Faktoren reguliert bzw. beeinflußt werden.
Ein zweiter Ansatz zur Identifizierung des physiologischen Substrates von LeSBT1
beruht auf einer wesentlich genaueren Determination der Expression. So ist für einige
tierische Proproteinkonvertasen bekannt, daß sie in vitro viele Konsensussubstrate mit
dibasischen Motiven spalten. In vivo spalten sie jedoch hochspezifisch nur bestimmte
Substrate (MOLLOY et al., 1999; VAN DE LOO et al., 1997). Ein Mechanismus, der
dieser Spezifität in vivo zugrundeliegen kann, ist die sehr restriktive Expression der
PCs, zeitlich oder räumlich beschränkt und durch verschiedene äußere Faktoren
moduliert. So ist für PC2 und PC1/3 bekannt, daß die Transkription und Translation
ihrer mRNA durch die Glucose-Konzentration, den Transkriptionsfaktor EGR-1 und im
Falle von PC1/3 durch die cAMP-Kozentration reguliert wird (ZHOU et al., 1999 und
darin enthaltenen Referenzen). PC4 wird nur in bestimmten Zelltypen eines bestimmten
Gewebes exprimiert und PC5 verändert sein Expressionsprofil im Laufe der
Entwicklung des Menschen (SEIDAH und CHRÉTIEN, 1997).
Für LeSBT1 ist auf RNA-Ebene eine gewebespezifische Expression gezeigt worden, die
sich deutlich von der aller anderen Subtilasen der Tomate unterscheidet (MEICHTRY et
al., 1999) und die auf bestimmte Organe, namentlich die Blüte, den Stengel und die
Wurzel, beschränkt war. Dabei war besonders die starke Expression in der Blüte
bemerkenswert, da LeSBT1 von allen untersuchten Tomatensubtilasen hier die höchste
Expressionsrate aufwies. In dieser Arbeit wurde durch Immunolokalisationen mit dem
Anti-LeSBT1-Serum in Blüten eine starke Markierung von Proteinen im Tapetum und
in den Samenanlagen erzielt (Abb. 15). Problematisch ist hier jedoch die fehlende
Spezifität des Antiserums für LeSBT1. Das Serum erkannte auch die heterolog in
Insektenzellen exprimierten LeSBT3 und LeSBT4A-Proteine (Abb. 14). Betrachtet man
aber die Verhältnisse der Expression von LeSBT1 und LeSBT3 bzw. LeSBT4A auf
75
mRNA-Ebene (MEICHTRY et al., 1999), ist es eher unwahrscheinlich, daß es sich bei
den markierten Proteinen um LeSBT3 oder LeSBT4A handelt. Ein vergleichbares
Expressionsmuster ist für LIM 9, eine Subtilase aus der Lilie, die mit einer späten Phase
der Entwicklung von Mikrosporen assoziiert ist gezeigt worden (TAYLOR et al., 1997).
Es kann daher nicht ausgeschlossen werden, daß die Markierung von Tapetumproteinen
durch Anti-LeSBT1-Serum auf eine mögliche Kreuzreaktion mit TMP - dem LIM9-
Homolog der Tomate (RIGGS und HORSCH, 1995) - zurückzuführen ist. Die
Immunodekorierung im Bereich der Samenanlagen ist allerdings am wahrscheinlichsten
auf Interaktion mit dem Protein LeSBT1 zurückzuführen. Um diese Zweideutigkeiten
zu klären, wird es nötig sein das LeSBT1-Antiserum einer Affinitätsreinigung zu
unterziehen, um Kreuzreaktionen mit anderen Subtilasen auszuschließen. In diesem
Zusammenhang könnte auch der Nachweis der Transkripte in situ sehr hilfreich sein.
Festzuhalten bleibt jedoch, daß die Expression von LeSBT1 gewebespezifisch reguliert
ist.
Mit dieser Arbeit ist es zum ersten Mal gelungen, eine pflanzliche Subtilase zu
charakterisieren, die mit hoher Wahrscheinlichkeit eine den Proprotein-Konvertasen in
Tieren ähnliche, spezifische Funktion besitzt. Verschiedene Phylogenievergleiche
tierischer, pflanzlicher und bakterieller Subtilasen (SIEZEN und LEUNISSEN, 1997;
BARALE et al., 1999; MEICHTRY et al., 1999; diese Arbeit) führten zu einer
Einordnung aller bisher bekannten pflanzlichen Subtilasen in die Gruppe der
Pyrolysine, die außerdem einige tierische Proprotein-Konvertasen sowie einige
bakterielle Subtilasen enthält. Es ist bisher nicht gelungen, pflanzliche Subtilasen der
Kexingruppe zu identifizieren. Auch im Rahmen des Arabidopsis Genomprojektes,
welches kurz vor seiner Vollendung steht, sind bislang keine für Kexine kodierenden
Sequenzen identifiziert worden. Die Tatsache, daß auch bei der PCR-gestützten Suche
nach Subtilase-Sequenzen in Tomate nur Pyrolysine, nicht jedoch Kexine identifiziert
werden konnten, obwohl die verwendeten Oligonukleotide von in Kexinen
konservierten Bereichen abgeleitet worden waren (MEICHTRY et al., 1999), deutet
ebenfalls auf das Fehlen von Kexinen in Pflanzen hin. Dies ließe sich mit den Daten, die
die Existenz von Proteasen mit Kexin-ähnlicher Spezifität in Pflanzen fordern
(SCHALLER und RYAN, 1994; SCHALLER, 1998; KINAL et al., 1995; PARK et al.,
1996, GU et al., 1996) nur dann in Einklang bringen, wenn pflanzliche Pyrolysine diese
Aufgabe übernehmen könnten. Die Klonierung der von JIANG und ROGERS (1999)
76
identifizierten Protease im Golgi-System von Tabak-Suspensionzellen, die eindeutig die
Spezifität von Kexinen aufweist, wird zur Beantwortung dieser Frage entscheidend
beitragen. Die Verbreitung von Pyrolysinen über das gesamte Spektrum lebender
Organismen, im Gegensatz zu einer Beschränkung der Kexine auf Hefen und Tiere,
lassen vermuten, daß die Pyrolysine das evolutiv ältere System darstellen.
Möglicherweise hat sich in Tieren mit den Kexinen eine Gruppe von Proteasen
entwickelt, die besser die spezifischen Anforderungen der Peptidhormon-Regulation
erfüllt haben. Daß aber auch im tierischen System Pyrolysine spezifisch Proproteine
spalten können, ist spätestens seit der Charakterisierung von S1P, SKI-1 und PfSUB-1
und -2 (DUNCAN et al., 1997; SAKAI et al., 1998; CHENG et al., 1999; SEIDAH et
al. 1999; BLACKMAN et al., 1998; BARALE et al., 1999; SAJID et al., 2000)
gesichert. Die Charakterisierung von LeSBT1 hat nun gezeigt, daß auch einige
pflanzliche Pyrolysine die dazu notwendigen Eigenschaften besitzen. Dies läßt die
Vermutung zu, daß gewisse physiologische Regulations- bzw. Signalmechanismen in
Tieren und Pflanzen gleichermaßen über Proteinprozessierung gesteuert werden
können.
77
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90
Danksagung
Herrn Prof. Dr. N. Amrhein danke ich sehr herzlich dafür, daß er mir die Möglichkeit
gegeben hat, meine Dissertation in seiner Gruppe durchzuführen.
Herrn Dr. A. Schaller möchte ich meinen Dank aussprechen für die Aufnahme in seine
Arbeitsgruppe, seine hervorragende Betreuung, seine Fähigkeit mich immer wieder
davon zu überzeugen, daß die Arbeit ein gutes Ende nehmen wird, und nicht zuletzt für
die mir entgegen gebrachte Freundschaft.
Herrn Dr. P. Macheroux danke ich für seine Hilfe bei der Entwicklung der MS-
Methoden, der Erstellung von Phylogeniebäumen und nicht zuletzt für seinen
unvergleichlichen Humor.
Herrn Dr. A. Fleming und Joanna Wyrzykowska danke ich sehr für ihre Unterstützung
bei der Immunolokalisation.
Herrn Prof. Dr. K. Apel gilt mein Dank für die Übernahme des Korreferats.
Mein Dank persönlicher Dank gilt weiterhin:
- David Frasson dafür, daß er die Seele des Labors war, und für seine ständige
Hilfsbereitschaft und Unterstützung.
- Den D36ern Jochen Straßner, Roger Kuhn, Werner Schmidt, Yoann Huet, Michael
Vetsch und den anderen Diplomanden, mit denen das Arbeiten und das „Freizeiten“
soviel Spaß gemacht hat.
- Florian Krekel und Markus Bischoff dafür, daß sie mir den Einstieg in das Leben in
Zürich so leicht gemacht und mir ihre Freundschaft geschenkt haben.
- Allen anderen Mitgliedern des Lehrstuhls für das gute Arbeitsklima und ihre stete
Hilfsbereitschaft.
Mein abschliessender und ganz besonderer Dank gebührt meiner Familie und meinem
Freund Markus Piotrowski, die mich immer und in allem unterstützt haben. Danke.
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Lebenslauf
Name: Ingar Janzik Geburtsdatum: 19.10.1970 Geburtsort: Bochum Familienstand: ledig Schulausbildung: 1977 - 1981 Gemeinschaftsgrundschule
Natorpstraße, Bochum 1981 – 1990 Gymnasium Graf-Engelbert-
Schule, Bochum Erlangung der Hochschulreife: Mai 1990 Studium der Biologie: Oktober 1990 – August 1996
an der Ruhr-Universität Bochum, Diplomarbeit am Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie mit dem Thema: „Identifizierung und Charakterisierung des nit4-Strukturgens aus Arabidopsis thaliana [L.] HEYNH.“ unter der Betreuung von Prof. Dr. E. W. Weiler
seit November 1996
Doktorandin an der ETH Zürich, Institut für Pflanzenwissenschaften, Abteilung Biochemie und Physiologie der Pflanzen (Prof. Dr. N. Amrhein)
![TThheeoorreettiiccaall aanndd PPrraaccttiiccaall ...€¦ · June 2010 . Table of Contents ... and flexible communication capabilities [43]. The 3G networks have been standardized](https://img.pdfslide.org/doc/110x75/5f8f56cb7b69f50428509e84/tthheeoorreettiiccaall-aanndd-pprraaccttiiccaall-june-2010-table-of-contents.jpg)
