Acta histochem. 68, 238-247 (1981)

Elektronenmikroskopisches Zentrum der Wilhelm-Pieck-Universitat Rostock

(Leiter: Prof. Dr. sc. med. H.-P. PUTZKE)

Histochemischer Nachweis von Carboanhydrase in den Flaschenzellen der Nieren vom Krallenfrosch

(Xenopus laevis DAUDIN)

Histochemical localization of carbonic anhydrase in flask cells of the clawfrog mesonephros (Xenopus laevis DAUDIN)

Von LUDWIG JONAS

:\iit 3 Abbildungen

(Eingegangcn am II. August 1980)

Summary

Carbonic anhydrase activity was demonstrated in the flask cells of intermediate segments

lind collecting tubules of the clawfrog-mesonephros with the cobalt-bicarbonate method of HAUS­

LER (1958) and HANSSON (1967). Additional the luminal surface of proximal and distal convoluted

tubules reacted positively. By electron microscopy the enzyme activity in the flask cells was

localized mainly on the surface of microvilli like cytoplasmic processes which lined the lumen of

intracellular secretion capillaries. The existence of carbonic anhydrase in the flask cells is related

to a possible physiological function of these cells.

Einleitung

In der Urniere vom Krallenfrosch (Xanopus laevis DAUDIN) wurden von BARG­MANN (1937) lichtmikroskopisch aufgeblahte Epithelzellen beschrieben, die er auf Grund ihres Aussehens als Flaschenzellen bezeichnete. Sie kommen in den Ver­bindungsstiicken und Sammelrohren der Nephrone sehr zahlreich vor und geben diesen Kanalabschnitten ein charakteristisches warziges Aussehen.

Neben ihrer typischen flaschenformigen Gestalt sind die Flaschenzellen durch das Vorhandensein eines intrazellularen Kanalsystems ausgezeichnet, das groBe Mengen eines sauren Schleims enthalt. In diesem Schleim wurden histochemisch saure Glykos­aminoglykane nachgewiesen (BARGMANN et al. 1955, SPANNHOF 1956). Autoradio­graphisch lieB sich mit 35S-Na2S04 zeigen, daf3 diese reich an Sulfonsauregruppen sind (JONAS und SPANNHOF 1971 a, b, JONAS et al. 1973). Durch histochemische Untersuchungen mit kolloidalem Eisen, Phosphorwolframsaure und Ruthemiumrot konnten diese Glykosaminoglykane selektiv dargestellt werden (SPANNHOF und JONAS 1969, JONAS und ROHLICH 1970, JONAS und SPANNHOF 1971 b).

Histochemischer Nachweis von Carboanhydrase 239

Die Funktion der Flasehenzellen ist noeh nieht vollig geklart. Sieher ist, daB ihr

saurer Sehleim in das Lumen des Nephrons abgegeben wird und hier auf der lumi­

nalen Oberflaehe der Epithelzellen einen dieken Belag bildet (JONAS und ROHLICH

1970), der moglieherweise eine Rolle bei der Osmoregulation spielt (SCHLISIO et al. 1973, aber STETSON 1978).

Elektronenmikroskopisch sind die Flasehenzellen dureh ihr intrazellulares Kanal­system leieht zu erkennen, das von lamellenartigen Cytoplasmafortsatzen ausge­

kleidet ist. Die MembrGmen dieser Mikrovilli-ahnliehen Cytoplasmaausstlilpungen zeigen naeh Gefrieratzung eine sehr hohe Diehte an intramembranosen Partikeln, die auf Grund ihrer langliehen Gestalt als "rod-shaped" Partikel bezeiehnet werden (BROWN 1978).

Die Flasehenzellen stellen extreme Bildungen der Xenopusniere dar, doeh es gibt verwandte, morphologiseh und funktionell ahnliehe Zellen in den N ephronen anderer Wirbeltiere (WIGERT und EKBERG 1903a, b, GERARD und CODIER 1937, YOSHIMURA und NEMOTO 1953, RIIODIN 1958, BARGMANN und WELSCH 1972, Zu­FAROV und GONTMAKHER 1976). Sie ahneln dureh ihr intrazellulares Kanalsystem und dureh ihren Mitochondrienreiehtum den Belegzellen der Magensehleimhaut.

Die Ahnliehkeit beider Zelltypen scheint aber nieht nur morphologiseh zu sein. In dieser Arbeit soIl liber das histochemisch naehweisbare Vorkommen des Enzyms Carboanhydrase in den Flasehenzellen beriehtet werden, das weitere Rlieksehllisse

auf die Funktion dieses Zelltyps zulaBt.

Material und Methode

10 Krallenfr6sche (Xenopug laevis DAUDIN)l) beiderlei Geschlechts und unterschiedlichen

Alters wurden in Brunmnwasser gehalten und mit Schabefleisch gefiittert. Die Tiere wurden durch Dekapitation get6tet un:! Nieren, Magen, Harnblase sowie Haut zur Untersuchung entnom­men.

Fur die lichtmikroskopisch3 DtLrstellung der Carboanhydraseaktivitat wurden Organe im

Kryostaten auf Objekthaltern eingafroren und 10 flID dicke Nativschnitte angefertigt, die 2 h

lang in kaltem Aceton fixiert wurden. Die fixierten Kryostatschnitte wurden dann auf das In­

kubationsmedium nach HAUSLER (1958) un:l HANSSON [(1967); (siehe auch PEARSE (1972))] uber­

fuhrt, wo sie fiir 30, 60 un:l 90 min bei Zimmertemperatur an del' Oberflache schwimmend ge­

halten wurden. Es folgLe eing Ub?rfuhrung der S~hnitte auf Aqua dEBt. unci danach fUr 1 min

nuf 1% Ammoniumsulfid. Nach kurzer Splilung in Wa'Her warden die Schnitte teilweise mit

Alcianblau zur Dttrstellung der sauren Glykosaminoglykane (ARNOLD 1968) geiarbt, auf Objekt­

trager aufgczogen und mit Glyceringelatin" einga::leekt. Als Kontrollen wllrden Sehnitte in einem

InkubaLionsmsdium ohn'" N,ttriurubiearb:Jn!tt oder in einem Me::lium mit Zusatz von 10-4 M Daimox (Diamox pMontseal Na-Salz, L3derle) inkubiert oler mit 10-4 .7\I Diamox prainkubiert.

Fur die elektronen:nikr03kopis~he Untersuchung wmden einerseits in Aceton fixierte oder in

2%igem Glutaraldehyd (0,1 M Phc:>sphatpuffer pH = 7,4) 10 min lang fixierte Kryostatschnitte

naeh 40- bis 60minutigC'r Inkubation auf dem Medium nach HAUSLER (1958) untersueht (CROSS

[1970], siehe auch GEYER [1973]).

') Die Frosche waren ein freun:lliches Geschenk von Dr. reI'. nat. K. JURSS, Sektion Biologie, Arbeitsgruppe Marill9 Tierphysiologie der Wilhelm-Pieek- Universitat Rostock, dem ich dafiir ganz herzlich danke.

240 L. JONAS

Nach der Inkubation und der Ammoniumsulfidprazipitation wurden die Schnitte in Aqua

dest. gesptilt, mit 0,5 % OsO, in Phosphat puffer 2 min nachfixiert, in aufsteigender Alkoholreihe

entwassert und in Durcupan ACM eingebettet.

Ultradiinnsehnitte wurden ohne odeI' nach leichter KontraBtierung im Elektronenmikroskop

BS 613 (Tesla, Brno) ausgewertet.

Ergebnisse

1. Lichtmikroskopische Untersuchungen

In der Niere yom Krallenfrosch ist bereits nach 15mintitiger Inkubationszeit eine erste positive Reaktion zu verzeichnen. Nach 60 min ist in verschiedenen Nephron­abschnitten eine starke Carboanhydraseaktivitat nachweisbar. Langere Inkubations­zeit en erwiesen sich als uberoptimal. Die starkste Aktivitat boten die distalen Ne­phronabschnitte, die sog. Verbindungsstucke (Abb. 1) und die Sammelrohre (Abb. 2), die durch das Vorhandensein von ]'lascbenzellen ihr charakteristisches Aussehen er­

halten. Die Flaschenzellen wolben sich aus dem Epithelverband basal warts hera us,

so daB besonders die Verbindungsstucke einen buckligen, warzigen oder hockrigen UmriB aufweisen und nicht, wie die anderen Nephronabschnitte als glatte Kanale erscheinen.

Die Verbindungsstucke und Sammelrohre sind auBerdem leicht nach Alcianblau­gegenfarbung zu identifizieren, wobei die Flaschenzellen auf Grund ihres Sekrets aus sauren Glukosaminoglykanen spezifisch angefarbt sind. Die Flaschenzellen wei sen eine massive Carboanhydraseaktivitat auf, die an Starke etwa vergleichbar ist mit der der Belegzellen der Magenschleimhaut. Teilweise ist das intrazellulare Kanal­system der Flaschenzellen durch massive Kobaltsulfidablagerungen in seinem Lumen deutlich sichtbar und erscheint dann tiefbraunschwarz gegenuber dem helleren Cyto­plasma (Abb. 2).

In den proximal en und distalen HauptstUcken weist die luminale OberfJiiche, die den Btirstensaum triigt, eine positive Reaktion auf (Abb. 1). Die Glomeruli erscheinen negativ (Abb. 2).

Die durchgefUhrten Kontrollreaktionen zeigten die Spezifitiit der Reaktionen an. Nach Inkubation mit 10-4 M Diamox im Medium, nach Prainkubation mit 10-4 M Diamox oder nach Inkubation ohne Bikarbonat, traten selbst nach langen Inkuba­tionszeiten von 90 min keine Kobaltsulfidprazipitate auf.

2. Elektronenmikroskopische Untersuchungen

Zur genaueren Bestimmung der Lokalisation der Carboanhydraseaktivitiit in den ]'laschenzellen wurden Cryostatschnitte sowohl nach Aceton- als auch nach Glutar­aldehydfixierung untersucht. Dabei zeigte sich, daB zwar nach Acetonfixierung die Enzymaktivitat sHirker zur Darstellung kam, doch war die Ultrastruktur der Zellen schlecht erhalten. Insgesamt erwies sich die Glutaraldehydfixierung als geeigneter, entsprechend wurde fUr diese Untersuchung hauptsachlich Schnittmaterial nach kurzer Glutaraldehydfixierung verwendet.

Die von CROSS (1970) angegebene simultane Fixierung in 0,5 % Glutaraldehyd und 4 % Formaldehyd hat sich bei uns nicht bewiihrt.

Histochemischer Nachweis von Carbo anhydrase 241

Abb. 1. Hauptstlleke (H) illl LangsHchnit t m.it positiveI' Ca rboanhydrase·Iteaktion auf der lu­

minalen Oberflache, Quersrhnitte und Ans<"lmitte einige r Sammell'ohl'e mit starker R eaktion.

Vergl'. 192 X .

Abb.2. L i1ngs- und QllC ,·schnitte von V(' rbindungsstiicken mit Flaschenzellen. Teilweise si nd

die intrazellularen Kanalsysteme C7') dpr Flasehenzellen zu erkennen, die besondet"S r eiehlich Reaktionsprodnkt enth"lten. 2 GIOlllcl'Uli (G) ohne Reakt io n. Vel'gr. 192 X .

242 L. JONAS

Abb.3. Elektl'onenmikl'oskopischer Naehweis des Heaktionsproduktes einer Flaschenzelle. Teil

des intmzellula ren K a nalsyst ems (K) und des Lamellensaums (L) des Protoplasmas. Ein grab­

korniges Prazipitat liegt hauptsachlich auf dem Lamellensaum und im Lumen des intrazellularen K a nalchens. 1m Cytoplasma findet sich ein mehr feinkornigeres Prazipitat. Einige Mitochondrien C>' ) sind im Cytoplasm a gerade noch zu identifizieren. Vergr. 56000 X .

Histochemischer Nachweis von Carbo anhydrase 243

In den Flaschenzellen findet sich ein grobkorniges Prazipitat im ganzen intra­

zellularen Kanalsystem, besonders aber auf der Oberflache des Lamellensaums (Ab b. 3). Auch in den Mikrovilli-artigen Cytoplasmafortsatzen, also zwischen den Membranen der in das Flaschenzellkanalsystem hineinreichenden Lamellen, liegen groBere elektronendichte Granula. Feingranulare Prazipitate treten im gesamten Cytoplasma und in den Mitochondrien der Flaschenzellen diffus auf.

Diskussion

Die Flaschenzellen del' Xenopus-Niel'e ahneln in ihrer Ultrastruktur stark den Belegzellen

del' Magenmukosa. Sie sind, wie die HCl-bildenden Zellen des Magens durch einen betrachtlichen

Mitochondrienreichtum und durch den Besitz eines intracellulal'en Kanalsystems (Canaliculus)

ausgezeichnet, welches "ine starke Oberflachenvergrohlerung darstellt. Dariibel' hinaus scheinen

beide Zelltypen auch funktionellc Ahnlichkeiten zu besitzen. So konnte STETSON (1978) zeigen,

daI3 die Flaschenzellen del' Xenopusniel'e nach experimenteller Azidose - erzeugt durch sub­

cutane Injektion von Salzsaul'e - alle morphologischen Kriterien von verstarkter Zellaktivitat

zeigen. ZrFARov et a1. (1974) und ZUFAROV und GONT;;TAKHER (1976) beschrieben kanalisierte

Zellen im Nephron del' Ratte nach experimenteller Azidose, die den kanalisierten Zellen del' Niere

von Rana esculenta (VVIGERT und EKBERG 1903) sehr ahnlich sehen und moglicherweise dies en

entsprechen. RHoDIN (1958) beschl'eibt im distalen Teil des Saugetiernephrons "dark cells"

(intercalated cells), die strukturelle Ahnlichkeiten mit den genannten Zelltypen besitzen.

Es lag nahe, zu iiberpriifen, ob die Flaschenzellen del' Xenopusniel'e wie die Belegzellen del'

Magenschleimhaut das Enzym Carboanhydrase besitzen.

Zur Darstellung del' Carbo anhydrase in verschiedenen Zelltypen und Organen wurden bisher

mehrere methodische Moglichkeiten benutzt. Die am haufigsten verwendete Technik ist die

Kobalt-bicarbonat-Methode nach HAUSLER (1958) und HANssoN (1967), die aus del' Mangan·

Methode von KURATA (1953) hervorgegangen ist. Eine autoradiographische Methode mit radio­

aktiv markiertem Inhibitor wurde von GAY und MUELLER (1973, 1974) benutzt. DE SnlONE

et al. (1971) setzten cine Zellimmunodiffusion zur semiquantitativen Bestimmung von Carbo­anhydrase in ErythI'ozyten ein. Ein immunhistochemischer Nachweis dieses Enzyms wurde von

DELAUNOY et a1. (1977), GAY et a1. (1974), HANSSON (1965), Hsu and TASHIAN (1977), PANERO

et a1. (1974) und SPICER et a1. (1979) benutzt. Mit einem fluoreszierenden Sulfonamid versuchten

POCHHA;\TMER et a1. (1979) die Carboanhydl'ase nachzuweisen.

Die Cobalt-Bicarbonat-Methode nach HAUSLER (1958) und HANSON (1967) hat den Vorteil,

dahl sie auch zum ultrahistochemischen Carboanhydrasenachweis verwendet werden kann (CROSS

1970, YOKOTA 1969). Allerdings wurden Zweifel an del' Spezifitat del' histochemischen Cobalt­

Bicarbonat-Methocle unter anderem von CHURG (1972, 1973) unci von MUTHER (1972, 1977) ge­

auhlert, wahrend sie von ROREN unci MUSSER (1972) und LONNERHOLM (1974) befUrwortet wird.

In jiingster Zeit haben SPICER et a1. (1979) die Diskussion "libel' die Spezifitat clel' Methoden fUr

den Nachweis der Carbo anhydrase weiteI'gpfiihI't. Sie habAn sphr iiberzeugencl immunhistochemisch

mit peroxidasemarkierten Antikorpern gegE'n zwei Isoenzyme cler Carboanhyclrase das Enzym

u. a. in del' Niel'e und in del' Magenschleimhaut von Ratten unci Mausen dargestellt. Die Verteilung

von spezifischen Carboanhyclrase-l'eichen Zellen im clistalen 1'eil cles Nephrons cler Maus ahnelt

stark clem Vorkommen del' von ZUFAROV und GONTMAKHER (1976) beschriebenen clunklen, mito­

chondrienreichen Zellen mit intrazellularen Kanalchen im distalen Teil des Nephrons cler Ratte

nach experimenteller Azidose.

Die Methode clel' immunhistochemischen Darstellung cler Cal'boanhydrase (SPICER et al. 1979, Kl:MPL:LAINEN 1979) scheint zur Zeit die spezifischste zu sein, cloch meinen wir, dahl die Haussler­

sehe Technik, wenn kein reines, hochspezifisches Carboanhyclraseserum zur Verfiigung steht, aueh

16 Acta histochem. Ed. 68

244 L. JONAS

verla131iche Resultate geben kann, zumal, wenn Kontrollreaktionen parallel dazu durchgefiihrt

werden.

1m Falle del' von uns nachgewiesenen starken Carboanhydraseaktivitat in den Flaschenzellen

del' Xenopusniere mochten wir unterstellen, da13 die Cobaltsulfidpracipitate spezifisch fur die

nachzuweisende Fjnzymaktivitiit sind und kein Artefakt darstellen, da die Reaktion ohne Bikar·

bonat und bei Diamoxvorbehandlung bzw. gleichzeitiger Anwesenheit von Diamox im Inkuba·

tionSllledium ausblied. Au13el'delll war die Starke del' Reaktion eindeutig abhangig von del' In·

kubationszeit unll ·te:llpel'atur. Tl'otzdem wiLre e, wLinschenswert, die gefundene Enzym·

aktivitiit am gleichen Objekt mit einer immunhistochemischen Methode zu kontl'ollieren.

Die Cal'boanhydrase wul'de mit verschiedenen Methoden in sehr unterschiedlichen Zelltypen

wie z. B. den Belegzellen del' Magenmukosa (HAXSLER 1958, KURATA 1953, SCHIEBLER und

VOLLRATH 1959, HANSSON 1968, VOLLRATH 1959, CROSS 19iO, PETERMANN et a1. 1972, VVINBORN

et a1• 1974, KUJlIPULAINEN 1979, SPICER et a1. 1979), in don Erythrozyten (LINDSKOG et a1. 1971,

HANSSON 1965, SPICER et a1. 1979) in den Leberzellen (TAKEUCHI 1952, SCHMIDT 1961, YOKOTA

1969) in den Gliazollen des Gehirns (siehe SPICER et a1. 1979) u. a. nachgewiesen. In del' Niere

wurde das Enzym in verschiedenen Abschnitten des Nephrons beschl'ieben (SPICER et a1. 1979,

HAUSLER 1958, HANSSON 1967, LONNERHOLM 1971, Horser et a1. 1966). 1m proximalen Kon·

volut des Nephrons scheinen alIe Zellen das Enzym homogen an del' luminalen, Mikrovilli auf·

weisenden Oberflache zu tragen, wahrend es im distalen Konvolut und in den Sammelrohren an

bestimmte distinkte (mitochondrienreiche dark cells, intercalated cells) Zelltypen gebunden ist

und dann das ges'llnte Cytoplasma diesel' Zelle positiv reagiert (LONNERHOLM 1971, 1973, SPICER

et a1. 1979). In den Salzdrusen del' Silbermowe konnte von SPANNHOF und JURSS (1966, 1967)

eine starke Cal'boanhydraseaktivitat nachgewiesen werden. Eine Ubersicht uber das Vorkommen,

die Verteilung und die funktionelle Bedeutung del' Carbo anhydrase gibt CARTER (1972).

Es scheint, da13 Zellen, die bei del' Bildung und Sekretion von Salzsiiure bzw. bei der Chlorid­

ausscheidung beteiligt sind, wie z. B. die Belegzellen del' Magenschleimhaut und die Salzdrusen

del' Vogel, charakterisiert sind durch den Besitz an Carbo anhydrase. Das Enzym ist am Bikarbo·

natmechanismus del' Niere beteiligt (SCHMIDT und THEWS 1976, ORLOFF und BERLINGER 1973).

Bei den Flaschenzellen del' Xenopusniere und den kanalisierten Zellen del' Rananiere sowio

den mitochondrienreichen dunklen Zellen del' Ratten· und menschlichen Niere konnte das Enzym in die Sekretion von \Vasserstoff· und Chloridionen einbezogen sein, zumal bei experimenteller Azidose nach Injektion von Sa1zsaure eine Aktivitats· bzw. Vo1umenzunahme diesel' Zellen beob· achtet wurde (RTETSON 1978, ZUFAROV 1974, ZUFAROV und GONTMAKHER 1976, LONNERHOLM

1973). Das Vorkommen von sog. "rod·shaped" Partikeln in den apikalen Zellmembranen del'

SchaltzelIen von Ramrnelrohren del' Saugetiere und in den Zellmembranen del' Lamellensaume

del' Flaschenzellumen nach Gefrieriitzung wird mit einer spezifischen Ionenpenneabilitiit in Vel" bindung gebracht (BROW:'> 1978).

Elektronenrnikroskopisch sieht es so aus, als ob die Enzymaktivitat del' Flaschenzellen VOl'

allem auf dem Lamellensaum liegt, (iPI' das intrazellulare Kanalsystem del' Flaschenzellen begrenzt.

Die Carboanhydrase wiire danach also als ein Plasmamembran·gebundenes Enzym zu betrachten.

vVie bej den Belegzellen del' Magensehleimhaut (CROSS 1970), so finden wir, wenn auch in gerin·

gem Ma13e, Kobaltsulfidprazipitate auf del' basalen uncI latemlen Oberflache der Flaschenzellen,

so da13 das Enzym in del' gesamt,"n Plasmamembnm vorhanden zu sein scheint. Mit biochemischen

und lichtmikroskopisch·immunhistochemischen Unter'suchungen konnte im Gegensatz zur

Kobaltbikarbonat·Methode keine so stark bevorzugte Zellmembranlokalisation der Carbo an·

hydrase nachgewiesen werden. Feingranulare Niederschlage von Kobaltsulfid im Cytoplasma del'

Flaschenzellen sind teilweise diffus im Gnmdplasma, teilweise in den Mitochondrion lokalisiert. Sie konnten Diffusionsartefakte darstellen.

Es scheint uns dringend notwenciig, die mit del' Methode nach HAUSLER (1958) und HA","SRON (1967) erhaltenen Ergebnisse mit immunhistochemischen Techniken zu uberprUfen.

Histochemischer Nachweis von Carbo anhydrase 245

STETSON (1978) konnte in den Flaschenzellen von Xenopu8 Aktivitiit von Phosphat-abhangiger

Glutaminase naehweisen und fand, daLl das Enzym bei experimentell erzeugtel' metabolischer

Azidose verstiirkt aktiv ist. Somit erscheint die Flaschenzelle sowohl in den Bikarbonat- als auch

in den Ammonium-Mechanismns eingesehaltet zu sein (SCHMIDT und THEWS 1976, ORLOFF und

BERLINGER 1973).

Welche Rolle die in den Flaschenzellen del' Xenopus-Niere nachgewiesenen sauren Glykos­

aminoglykane (BARmIANN et al. 1955, SPANNHOF 1956) besitzen, bleibt weitel'hin ungcwiLl. Wie

wir autoradiographisch mit 35S-Sulfat zeigen konnten, handelt es sich urn schwefelhaltige Kohlen­

hydrate, die in den Flaschenzellen selbst synthetisiert werden. Dureh radiologische Messungen

an Nierenhomogenaten konnten wir feststellen, daLl del' turn-over diesel' sauren Glykosamino­

glykane in den Flaschenzellen nieht hoeh ist, was fUr eine weniger intensive Sekretion sprechen

konnte (.JONAS, unveJolfentlicht). Naeh osmotischer Belastung del' Tiere nimmt del' Gehalt an

saurem Schleim in diesen Zellen stark ab (SPANNHOF und DITTRICH 1967, SCHLISIO et al. 1975).

Elektl'onenmikroskopisch-histochemisch konnten wir einen dicken Belag von sauren Glykos­

aminoglykanen auf del' luminalen Oberflache del' Verbindungsstlickepithelzellen nachweisen

(JOXAS und ROHLICH 1970). Moglichel'weise besitzt das Flaschenzellsekret cine Schutzfunktion

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Anschrift des Verfassers: Dr. reI'. nat. L. .JONAS, Elektronenmikroskopisches Zentrum del'

Wilhelm-Pieck-Universitat Rostock, DDR - 2500 Rostock, Strempelstral3e 14.