HLA-Typisierung für die Knochenmarktransplantation.

Guido Heymann

Verlauf der KM-Tx-Anzahl

Standardtypisierungsmethoden

HLA Klasse Iserologische Typisierung oderlow-resolution molekulargenetische Typisierung

HLA Klasse IImolekulargenetische Typisierung

Empfehlungen zur immungenetischen Spenderauswahl für die allogene Transplantation von Knochenmark und peripheren Blutstammzellen (1999)

Verwandte SpenderHLA-A KFS,EFS

HLA-B KFS,EFS

HLA-DRB1 KFS,(EFS)

HLA-DQB1 KFS,(EFS)

optional:HLA-CHLA-DPB1HLA-DRB3-5

Unverwandte SpenderHLA-AHLA-BHLA-DRB1HLA-DQB1HLA-C (CML)

optional:HLA-DPB1HLA-DRB3-5

Empfehlungen zur immungenetischen Spenderauswahl für die allogene Transplantation von Knochenmark und peripheren Blutstammzellen (1999)

HLA-A,B-Testung:

verwandt und unverwandt i.d.R. low-resolutionbei Festlegung auf Homozygotie muß high-resolution oder Familientestung folgen

HLA-DRB1,DQB1-Testung:

KFS,EFS: i.d.R. low-resolution (Homozygotie !)RSS : high-resolution (auch CT)

Klasse I Antigene, die erfaßt werden müssen

HLA-AA1 A2A3 A11A23 A24A25 A26A28 A29A30 A31A32 A33A34 (A36)A43 A66A68 A69A74 (A80)

HLA-BB7 B8B13 B14B18 B27B35 B37B38 B39B41 B42B44 B45B46 B47B48 B49B50 B51B52 B53B54 B55B56 B57B58 B59B60(40) B61(40)B62(15) B63(15)B67 B70(15)B73 B75(15)B76(15) B77(15)B78 (B81)(B82) (B83)

Fettgedruckte Antigene können serologischnicht verläßlich erfaßt werden und sollten durchmolekulargenetische Methoden bestätigt werden.

Antigene in Klammern sind unter Kaukasiern sehr selten.

Klasse II Antigene, die erfaßt werden müssen

HLA-DRB1DRB1*01 (*0101-*0106)DRB1*0103DRB1*03 (*0301-*0317)DRB1*04 (*0401-*0434)DRB1*07(*0701,0703,0704)DRB1*08 (*0801-0821)DRB1*09 (*0901)DRB1*10 (*1001)DRB1*11 (*1101-*1137)DRB1*12 (*1201-*1206)DRB1*13 (*1301-*1340)DRB1*14 (*1401-*1436)DRB1*15 (*1501-*1509)DRB1*16 (*1601,1602,(1603) *1604-1608)

HLA-DQB1DQB1*02 (*0201-*0203)DQB1*03 (*0301-*0310)DQB1*04 (*0401,0402)DQB1*05 (*0501-*0505)DQB1*06 (*0601-*0617)

Klasse I HLA-C*01,*02,*03,*04,*05,*06,*07,*08,*12,*13,*14,*15,*16,*17,*18

Wenn mehrere A,B,DRB und DQBidentische Spender zur Auswahlstehen.

2.Deutsche Konsensusempfehlungen für die immungenetische Spendersuche(1996)

alt akzeptierte HLA-mismatches bei Verwandten maligne Vorerkrankung

In GvH Richtung: bis zu einem Mismatch In HvG Richtung: bis zu drei Mismatches

schwere aplastische Anämie Erst-Tx: keine HLA-Unterschiede Folge-Tx: ein Mismatch in GvH und / oder HvG Richtung

SCID und andere genetische Erkrankungen Bis zu drei Mismatches in GvH und HvG Richtung T-Zell-Depletion wünschenswert, wenn >1Mismatch in GvH-Richtung

akzeptierte HLA-mismatches bei Unverwandten maligne Vorerkrankung

In GvH und HvG Richtung: bis zu einem Mismatch, wenn: low-risk Patient serologische Splitantigene

schwere aplastische Anämie keine Mismatches (Dringlichkeitsfälle !?)

SCID und andere genetische Erkrankungen ein verwandter Spender ist i.d.R. verfügbar

Empfehlungen zur immungenetischen Spenderauswahl für die allogene Transplantation von Knochenmark und peripheren Blutstammzellen (1999)

Patienten mit malignen hämatologischen ErkrankungenEin partiell HLA-kompatibler verwandter Spender soll nur herangezogen werden, wenn ein HLA-kompatibler unverwandter Spender nicht rechtzeitig verfügbar ist.Verwandt: Eine HLA-Differenz in GvH- und/oder HvG-Richtung (individuelle Abweichung möglich)Unverwandt: Eine HLA-Differenz in GvH- und/oder HvG-Richtung, wobei die Merkmale eine ausgeprägte Aminosäure-Sequenzhomologie zeigen sollen.

Patienten mit schwerem kombiniertem Immundefekt (SCID)HLA-Differenzen in HvG-Richtung stellen kein Ausschlußkriterium dar.GvH-Risiko sehr hoch, prinzipiell sind jedoch auch HLA-haploidentische verwandte Spender (Eltern) akzeptabel (T-Zelldepletion des KM)

Patienten mit nicht-malignen Grunderkrankungen (SAA,FA,PNH...)Abstoßungsrisiko erhöht, GvL nicht notwendig, Tx mit anderen als HLA-identischen Familienmitgliedern nur im Rahmen von kontrollierten Studien

GVHD Rate bei MMPetersdorf et al. ; Blood Vol92,pp3515-3520

Überlebenskurven Sasazuki et al. , NEJM 339,1177

Probleme der Serologie

Probleme der Serologie

83 HLA-A und 186 HLA-B Allele werden in 28 HLA-A und 59 HLA-B Serotypen aufgelöst.Ratio 3:1

Homozygotenfrequenz:49,6 % Serologie21 % DNAMiddleton, EFI-Kreta 1999

Comparison of HLA-AB typings by serology and PCR-SSPin 108 kidney donors

increased resolution71,3%

incorrect assignment

6,5%no discrepancy

15,7%

missed allele6,5%

Probleme der serologischen Klasse I Typisierung(S. Goldmann ; EFI Kreta April 1999)

A2,A28 60% der Individuen sind A2 homozygot

A23,24,68,69 CREG 2b, Unterscheidung A 30,31 A19 Unterscheidung B 62,63,71,72,75,76,77 B15 Unterscheidung (?!) B 45 beinhaltet B*5002 B*2704,2712 Bw6, nicht Bw4

Die Mismatchfrequenz ist serotypabhängig(Scott et al.; Blood Vol 92, pp4864-4871)

HLA-SerotypA2 A3 A30 B35 B39 B44 B51

Spender /EmpfängerPaar 56 24 4 15 8 25 4aufged. MM 1 2 1 6 3 4 2Subtypen 2 3 3 4 2 2 3

Prozente 1,8 8,3 25 40 37,5 16 50MM zu Typisierungen

Frequenz von HLA-A Serotypen und Allelen in 128 Patienten Serotyp Allele Prozent (n)

A1 A*0101 100% (19)A11 A*1101 87,5% (7)

A*1102 12,5% (1)A2 A*0201 87,5% (49)

A*0202 5,4% (3)A*0205 8,9% (5)A*0206 3,6% (2)A*0203,4,7,17 je 1,8% (1)

A23(9) A*2301 100% (5)A24(9) A*2402 72,5% (29)

A*2403 5% (2)A25(10) A*2501 80% (4)A26(10) A*2601 100% (13)A29(19) A*2901 33% (4)

A*2902 67% (8)A3 A*0301 100% (25)A30(19) A*3001 58,8% (10)

A*3002 29% (5)A*3004 11,8% (2)

A31(19) A*3101 100% (4)A32(19) A*3201 100% (7)A33(19) A*3301 55,6% (5)

A*3303 44,4% (4)A68(28) A*6801 46,2% (6)

A*6802 53,8% (7)

Prasad et al.Blood Vol 93pp399-409

Level der genotypischen Unterschiede im HLA-A

Frequenz von HLA-B Serotypen und Allelen in 128 Patienten Serotyp Allele Prozent (n)

B7 B*0702 85,7% (24)B*0705 14,3% (4)

B44(12) B*4402 61,9% (13)B*4403 38,1% (8)

B8 B*0801 100%(11)B35 B*3501 52,9% (18)

B*3502 8,8% (3)B*3503 17,6% (6)B*3504 5,9% (2)B*3505 2,9% (1)B*3508 8,8% (3)B*3511 2,9% (1)

B15(62,63,75,76,70) B*1501 29,7 (11)B*1502 3,7% (1)B*1503 11,1% (3)B*1510 3,7% (1)B*1516 11,1% (3)B*1517 7,4% (2)B*1518 3,7% (1)

B40(60,61) B*4001 31,3% (5)B*4002 43,8% (7)B*4004 6,3% (1)B*4006 18,8% (3)

B51(5) B*5101 78,6% (11)B18 B*1801 93% (14)

Prasad et alBlood Vol 93pp399-409

Level der genotypischen Unterschiede im HLA-B

Vergleich DNA- Serologie

(Scott et al.; Blood Vol92, pp4864-4871)

Der Wert serologischer Typisierung in der DNA-Ära

EFI-Kreta April 1999

Wann kann die Serologie helfen?

Ist ein Allel exprimiert oder nicht?

DNA Serologie ErgebnisA*0101/0104N A1 A*0101A*24 „blank“ A*2409,2411N,

A*2402L (low)

splice defectB*1526 Null-Allel

Probleme mit neuen Allelen 1

Thüringischer Nierenempfänger 1. Serologie: A 11,19;B 27,56;Cw 2,-;DRB1

0101,1502; DQB1 0501,0601 2. Serologie: A 11,- ;B 27,56; Cw 2,- PCR-SSP : unklare Reaktionsmuster

Sequenzierung:Exon1-Intron1-½Exon2/½Exon2-Intron2-Exon3-Intron3....HLA-A*3101 HLA-A9 (23,24)

Nomenklaturkommission vergibt Namen: A*2416

Probleme mit neuen Allelen 2

Der phylogenetische Stammbaum zeigt: A*2416 gehört eindeutig zur

A 19-Linie (A 29,30,31,32,74)

wahrscheinlich Genkonversion zwischen A31 und einem A9-Genanteil

serologisch keine A9-Reaktivitäteine Bw4 positive A*31 Variantebei KMT-Entscheidung wäre A*2416 ähnlich zu

A*3105

Wann kann die Serologie helfen?Eine Spezifität aber unterschiedliche Allele.

Serologie DNAB45 B*4501

B*5002 B*50 mit B12 EpitopB*4409 B*44 mit Bw6 Epitop

B35 B*35B*1522 falscher NameB*78 „B5“ mit Bw6

B21 B*4005B*1303 B21 artig mit Bw4B*1304 B21 artig mit Bw4

B48 B*4008 nur B(40+48)Seren pos.B*4010 B60/48 artigB*4012 B60/48 artig

B50 B*4005 (more like B50)B*1546

A19 A*2419A36 A*0102

Wann kann die Serologie helfen?

Allelbasierte Nomenklatur nicht benutzt:

Allel WHO-Name geb.NameA*0203 A203 A2A*0210 A210 A2A*80 A80 A36/A1B*4005 B4005 B50/B21B*5102 B5102 B5/B53B*78 B78 B35

Wann kann die Serologie helfen?

Chimäre Moleküle:

DRB1*1122 DR 4/11DRB1*1415 DR 8/14A*2419 A19(31,32)

Wann kann die Serologie helfen?

Zusammenfassung

Zelloberflächenantigene erlauben eine Information über die Verteilung von Epitopen zu erlangen.

Epitope können in einer Gruppe von Allelen unterschiedlich sein

Epitope können bei verschiedenen Allelen die gleichen sein.

Spendersuche, Crossmatch, Transfusion...

Probleme der Molekulargenetik

Kosten der HLA-Typisierung

(Goldmann, EFI-Kreta 1999)

Personal Hardware Material

HLA-Serologie + + +

SSO-PCR ++ + - (+) ++

SSP-PCR ++++ + (+) + (+)

SBT ++++++ ++++++ +++++

Jährlicher Zuwachs an bekannten neuen HLA-Allelen

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

-1994 1995 1996 1997 1998

Class IIClass I

-50

0

50

100

150

200

250

300

A B C DRB1 DRB3 DRB4 DRB5 DQA1 DBQ1 DPA1 DPB1

Sequenz definierte HLA-Allele bis Dezember 1998

deleted

1998

1997

1996

1995

-1994

Probleme der Molekulargenetik

Serologische Splits nicht immer eindeutig Laufend neue Allele sequenziert, die Primermenge in den

einzelnen Sets wird immer größer notwendige Doppelansätze verteuern Typisierung

übermäßig

Der Wert der molekulargenetischen

Typisierung

Wert der molekulargenetischen Typisierung

Cytotoxischer Antikörper gegen A*3002, nicht gegen A*3001 G.B.Ferrara, Tissue Antigenes Vol 46, pp 327-329

KM-Transplantat B*3502 auf B*3501 schwere GvHDG.B. Ferrara, EFI Kreta 1999

BMT-Rejektion durch T-Lymphocyten gegen einen Einzel-Aminosäurenunterschied im HLA-B44Fleischhauer et al. NEJM 323, pp1818ff & Keever et al. Bone Marrow Transplant 14:137

Knochenmarkspenderund -empfänger

Wie wahrscheinlich kann ein Spender gefunden werden?

Vorschlag 1

Keine neuen KM-Spender typisierenDafür alle vorhandenen Class II typisieren

alternativ:A,B,C,DRB1,DQB1 bei allen Neuen

Goldmann, EFI-Kreta 1999

GVHD-RatenFerrara, EFI Kreta1999

40% GVHD bei vollidentischen Geschwistern70% GVHD bei gematchten UnverwandtenClass II ident. A , B ident UV:

70% ÜberlebensrateClass II ident. A , B different UV:

50% ÜberlebensrateClass II ident. A , B differenter Verwandter:

75% Überlebensrate

Minor-Histokompatibilitätsantigene bei KMT-Paaren 1

Nach allogener KMT/PBSCT beobachtet man bei Patienten mit HLA-identischen Familienspendern in 30-40% eine GvH-Reaktion. Bei geno-typischer HLA-Identität bleiben somit als allogene Differenz die Aminosäuresequenz-Unterschiede in den durch HLA-Klasse I Molekülen präsentierten Peptiden. Diese bilden also die minor-Histokompatibilitäts-Antigene (mHag).

Minor-Histokompatibilitäts-antigene bei KMT-Paaren 2

HLA-Klasse I Moleküle präsentieren cytosolische Antigenbruchstücke (Virusantigen, degradierte körpereigene Proteine...)

Für mHag CD 31 und HA-1 gesicherte Hinweise: HA-1 : diallelisches System CD 31: in japanischer Bevölkerung 5 Allele

beschrieben

Vorschlag 2

Effekt des Allelmatching für DRB1 nachgewiesen Petersdorf et al., Blood 86,1606

Allelmatching bei HLA-A und -B Serotypen, die häufige Allelmis-matches zeigen:A 68,33,2,24B 35,44,57,61,27,58,40,(15)

ENDE