Nachweismethoden, Bewertungskriterien,Qualitätssicherung, Normen

Herausgegeben vonIrmgard Feuerpfeil und Konrad Botzenhart

Hygienisch-mikrobiologischeWasseruntersuchung in der Praxis

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Herausgegeben vonIrmgard Feuerpfeilund Konrad Botzenhart

Hygienisch-mikrobiologischeWasseruntersuchung in derPraxis

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Nachweismethoden, Bewertungskriterien,Qualitätssicherung, Normen

Herausgegeben vonIrmgard Feuerpfeil und Konrad Botzenhart

Hygienisch-mikrobiologischeWasseruntersuchung in der Praxis

Herausgeber

Dr. Irmgard FeuerpfeilUmweltbundesamtFachgebiet II 3.5Heinrich-Heine-Str. 1208645 Bad Elster

Prof. Dr. Konrad BotzenhartUniversität TübingenInst. für Med. MikrobiologieWilhelmstr. 3172074 Tübingen

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© 2008 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA,Weinheim

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Printed in the Federal Republic of Germany

Gedruckt auf säurefreiem Papier

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ISBN 978-3-527-31569-7

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Geleitwort XV

Autorenverzeichnis XVII

1 Allgemeines 1Konrad Botzenhart und Irmgard Feuerpfeil

1.1 Zielsetzungen 1

2 Methodische Grundlagen 5Benedikt Schaefer 5

2.1 Reinigen und Sterilisieren der Labormaterialien 5Benedikt Schaefer

2.1.1 Reinigung 62.1.2 Heißluftsterilisation 62.1.3 Lagerung von sterilen Labormaterialien 72.2 Herstellung und Aufbewahrung von Nährböden 7

Benedikt Schaefer2.2.1 Fertignährböden 82.2.2 Zubereitung 82.2.3 Sterilisation 92.2.4 Lagerung der gebrauchsfertigen Nährböden 92.2.5 Konfektionierung 102.3 Entsorgung 10

Benedikt SchaeferLiteratur zu Kapitel 2 bis 2.3 11

2.4 Entnahme und Transport von Proben 12Peter Schindler

2.4.1 Allgemeines 122.4.2 Probenahmegefäße und Zubehör 132.4.3 Probenahmebegleitschein 132.4.4 Entnahme von Trinkwasser 142.4.5 Entnahme von sonstigen Wasserproben 172.4.6 Probentransport 18

Literatur 19

V

Inhaltsverzeichnis

2.5 Mikrobiologisches Messen 19Steffen Uhlig

2.5.1 Einführung 192.5.2 Modellierung des Messfehlers 202.5.3 Gussplattenverfahren 232.5.4 Membranfilterverfahren 242.5.5 Most Probable Number-Methode (MPN-Verfahren) 262.5.6 Titer-Methode 30

Literatur 302.6 Vergleichbarkeit mikrobiologischer Messmethoden 30

Steffen UhligLiteratur 32

2.7 Nationale/internationale Normung 32Regine Szewzyk

2.7.1 Nationale Normung 322.7.2 Internationale Normung 33

Literatur 37

3 Qualitätssicherung 39Benedikt Schaefer 39Literatur 41

3.1 LaborakkreditierungHaribert Schickling und Jürgen-M. Schulz 41

3.1.1 Ablauf der Akkreditierung 473.1.1.1 Antragsverfahren 483.1.1.2 Begutachtungsverfahren 493.1.1.3 Akkreditierung 493.1.1.4 Überwachungsverfahren 503.1.2 Anforderungen nach ISO/IEC 17025 503.1.3 Schwerpunkte der Begutachtung 543.1.3.1 Interne Audits und Managementbewertungen 543.1.3.2 Zuverlässiger Umgang mit Referenzstämmen 543.1.3.3 Methodenvalidierung 553.1.3.4 Eignungsprüfung 563.1.3.5 Probenahme 563.1.3.6 Unparteilichkeit 573.1.3.7 Unterauftrag 583.1.4 Hinweis 583.2 Mikrobiologische Ringversuche zur externen Qualitätskontrolle

im Rahmen der Trinkwasserverordnung 2001 59Ernst-August Heinemeyer und Katrin Luden

3.2.1 Einleitung 593.2.2 Qualität der Präparation im Vergleich 613.2.3 Präparation der Proben, Versendung, Auswertung 633.2.4 Ergebnisse der teilnehmenden Labore 64

InhaltsverzeichnisVI

3.2.5 Probleme 653.2.6 Coliforme Bakterien und E. coli 653.2.7 Clostridium perfringens 673.2.8 Legionella 693.2.9 Diskussion 703.2.10 Ringversuche und Messunsicherheit 713.2.11 Top-down-Ansatz (Beispiel: Nachweis von Legionella) 723.2.12 Bottom-up Ansatz – Messunsicherheit nach VAM 743.2.13 Messunsicherheit nach EUROLAB 753.2.14 Folgerungen 76

Literatur 77

4 Bakteriologische Wasseruntersuchung 794.1 Koloniezahl 79

Irmgard Feuerpfeil4.1.1 Begriffsbestimmung 794.1.2 Anwendungsbereich 794.1.3 Nährböden 814.1.3.1 Nähragar 824.1.3.2 Hefeextraktagar (nach DIN EN ISO 6222, 1999) 824.1.4 Untersuchungsgang 824.1.5 Störungsquellen 834.1.6 Auswertung 844.1.7 Angabe der Ergebnisse 84

Literatur 854.2 E. coli-coliforme Bakterien (einschließlich pathogener Varianten) 85

Peter Schindler4.2.1 Begriffsbestimmung 854.2.2 Anwendungsbereich 874.2.3 Nährböden und Reagenzien 884.2.3.1 Nährböden und Reagenzien für Trinkwasser 884.2.3.2 Nährböden und Reagenzien zur Untersuchung von Mineral-,

Quell- und Tafelwasser 904.2.3.3 Nährböden und Reagenzien für Schwimmbeckenwasser 924.2.3.4 Nährböden und Reagenzien für Oberflächenwasser 934.2.3.5 Nährböden und Reagenzien für sonstige Untersuchungen 934.2.4 Untersuchungsgang 934.2.4.1 Untersuchung von Trinkwasser nach TrinkwV 2001 mit dem

Referenzverfahren mit Lactose-TTC-Agar durchMembranfiltration (nach DIN EN ISO 9308-1, 2001) 93

4.2.4.2 Untersuchung von Trinkwasser (TrinkwV 2001) mit demanerkannten Alternativverfahren Colilert®-18/Quanti-Tray®

mittels MPN-Flüssiganreicherung 994.2.4.3 Untersuchung von Mineral-, Quell- und Tafelwasser 103

Inhaltsverzeichnis VII

4.2.4.4 Untersuchung von Schwimmbeckenwasser(nach DIN 19643, 1997) 106

4.2.4.5 Untersuchung von Badegewässern auf E. colinach der EG-Richtlinie 2006/7/EG 106

4.2.4.6 Untersuchung von Oberflächengewässern auf Coliforme 1084.2.4.7 Weitere Untersuchungsverfahren 1094.2.4.8 Untersuchung sonstiger Proben 1124.2.5 Störungsquellen 1124.2.6 Auswertung 1134.2.7 Angabe der Ergebnisse 1134.2.8 Künftige Methoden 114

Literatur 1144.3 Weitere Enterobakterien 116

Peter Schindler4.3.1 Salmonellen 116

4.3.1.1 Begriffsbestimmung 1164.3.1.2 Anwendungsbereich 1174.3.1.3 Nährmedien und Reagenzien 1174.3.1.4 Untersuchungsgang 1234.3.1.5 Weitere Methoden 1294.3.1.6 Störungsquellen 1294.3.1.7 Auswertung 1304.3.1.8 Angabe der Ergebnisse 130

Literatur 1314.3.2 Yersinia 132

Irmgard Feuerpfeil4.3.2.1 Begriffsbestimmung 1324.3.2.2 Anwendungsbereich 1324.3.2.3 Nährböden und Reagenzien 1334.3.2.4 Untersuchungsgang 1364.3.2.5 Störungsquellen 1394.3.2.6 Auswertung 1404.3.2.7 Angabe der Ergebnisse 140

Literatur 1414.4 Enterokokken 142

Irmgard Feuerpfeil4.4.1 Begriffsbestimmung 1424.4.2 Anwendungsbereich 1424.4.3 Nährböden 1434.4.4 Untersuchungsgang 1464.4.4.1 Nachweisverfahren nach Mineral- und Tafelwasserverordnung 1474.4.4.2 Membranfiltration (Untersuchung von Trinkwasser) 1494.4.5 Störungsquellen 1534.4.6 Auswertung 154

InhaltsverzeichnisVIII

4.4.7 Angabe der Ergebnisse 154Literatur 155

4.5 Clostridien 156Annette Hummel

4.5.1 Begriffsbestimmung 1564.5.2 Anwendungsbereich 1564.5.3 Nährmedien und Reagenzien 1584.5.4 Nachweismethode 1614.5.4.1 Nachweisverfahren für sulfitreduzierende sporenbildende

Anaerobier: Flüssigkeitsanreicherung und Membranfiltration 1614.5.4.2 Nachweisverfahren für C. perfringens nach Trinkwasserverordnung

2001 (m-CP-Agar) 164Literatur 167

4.6 Pseudomonas aeruginosa 168Konrad Botzenhart

4.6.1 Begriffsbestimmung 1684.6.2 Anwendungsbereich 1704.6.3 Nachweisverfahren nach DIN EN 12780 (2002) 1714.6.3.1 Grundlagen 1714.6.3.2 Nährmedien und Reagenzien 1724.6.3.3 Untersuchungsgang 1744.6.3.4 Zählung 1764.6.3.5 Angabe der Ergebnisse und Untersuchungsbericht 1764.6.4 Nachweisverfahren nach Mineral- und Tafelwasserverordnung 1774.6.4.1 Grundlagen 1774.6.4.2 Nährböden und Reagenzien 1784.6.4.3 Untersuchungsgang 1794.6.5 Störungsquellen, zusätzliche Hinweise 179

Literatur 1814.7 Aeromonas 182

Irmgard Feuerpfeil4.7.1 Begriffsbestimmung 1824.7.2 Anwendungsbereich 1824.7.3 Nährböden und Reagenzien 1834.7.4 Untersuchungsgang 1854.7.4.1 Flüssigkeitsanreicherungsverfahren 1854.7.4.2 Membranfiltrationsverfahren 1874.7.5 Störungsquellen 1874.7.6 Auswertung 1884.7.7 Angabe der Ergebnisse 189

Literatur 1894.8 Campylobacter 190

Annette Hummel4.8.1 Begriffsbestimmung 1904.8.2 Anwendungsbereich 191

Inhaltsverzeichnis IX

4.8.3 Nährmedien und Reagenzien 1924.8.4 Untersuchungsgang 1954.8.5 Störungsquellen 2004.8.6 Auswertung und Angabe der Ergebnisse 200

Literatur 2024.9 Legionellen 203

Benedikt Schaefer4.9.1 Begriffsbestimmung 2034.9.2 Anwendungsbereich 2034.9.3 Nährböden und Reagenzien 2054.9.4 Untersuchungsgang 2064.9.4.1 Probenahme 2084.9.4.2 Direktausstrich 2104.9.4.3 Membranfiltrationsverfahren 2114.9.4.4 Inkubation und Auswertung 2114.9.4.5 Zentrifugationsverfahren 2124.9.5 Störungsquellen 2124.9.6 Auswertung und Angabe der Ergebnisse 213

Literatur 2134.10 Atypische Mykobakterien 214

Roland Schulze-Röbbecke4.10.1 Begriffsbestimmung 2144.10.2 Anwendungsbereich 2154.10.3 Nährböden und Reagenzien 2154.10.3.1 Reagenzien für die Dekontamination 2154.10.3.2 Löwenstein-Jensen-Medium (LJ) 2154.10.3.3 Middlebrook-7H10-Agar mit OADC-Anreicherung und Glycerin

(7H10) 2164.10.3.4 Reagenzien für die Ziehl-Neelsen-Färbung 2164.10.4 Untersuchungsgang 2164.10.4.1 Dekontamination des Probenmaterials 2184.10.4.2 Anreicherung des Probenmaterials durch Filtration 2184.10.4.3 Kulturelle Anzüchtung 2204.10.4.4 Abgrenzung von anderen Bakteriengattungen und Differenzie-

rung 2214.10.5 Störungsquellen 2224.10.6 Auswertung 2234.10.7 Angabe der Ergebnisse 223

Literatur 2234.11 Nachweis von Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus

und anderen Vibrio-Arten 224Martin Exner, Gerhard Hauk und Andrea Rechenburg

4.11.1 Begriffsbestimmung 2244.11.2 Anwendungsbereich 2254.11.3 Geräte, Nährmedien und Reagenzien 225

InhaltsverzeichnisX

4.11.3.1 Benötigte Geräte 2254.11.3.2 Nährböden und Reagenzien 2254.11.3.3 Weitere Medien 2264.11.4 Untersuchungsgang 2264.11.4.1 Probenansatz zum Nachweis von V. cholerae 2274.11.4.2 Probenansatz zum Nachweis von V. vulnificus 2274.11.5 Auswertung 2294.11.6 Differenzierung 2304.11.6.1 Nachweis von V. cholerae 2304.11.6.2 Nachweis von V. vulnificus 2304.11.6.3 Biochemische Reaktionen 2324.11.7 Angabe der Ergebnisse 2324.11.8 Qualitätssicherung 232

Literatur 232

5 Virologische und protozoologische Wasseruntersuchungen 2335.1 Bakteriophagen 233

Stefanie Huber5.1.1 Begriffsbestimmung 2335.1.2 Anwendungsbereich 2335.1.3 Nährmedien und Reagenzien 2355.1.3.1 Medien für den Nachweis von FRNA-Phagen 2365.1.3.2 Medien für den Nachweis somatischer Coliphagen 2375.1.4 Untersuchungsgang 2385.1.4.1 Nachweis von FRNA-Bakteriophagen 2395.1.4.2 Nachweis von somatischen Coliphagen 2415.1.4.3 Proben mit sehr geringen Phagenzahlen 2425.1.5 Störungsquellen 2435.1.6 Auswertung und Angabe der Ergebnisse 244

Literatur 2445.2 Enterale oder enteropathogene Viren 246

Jens Fleischer

5.2.1 Begriffsbestimmung 2465.2.2 Anwendungsbereich 2475.2.2.1 Viruskonzentrationen im Abwasser 2475.2.3 Anreicherung von Viren aus Wasserproben 2485.2.3.1 Filtration durch elektropositive Filter (Virosorb-1 MDS) 2495.2.3.2 Filtration über Glaswolle-gepackte Säulen 2505.2.4 Quantifizierungsmethoden auf Zellkultur 2535.2.4.1 Plaque-Forming-Units (PFU)-Test für den direkten Nachweis

von Enteroviren oder anderen enteropathogenen Virenauf Zell-Monolayern 255

5.2.4.2 Quantifizierung nach dem Most-Probable-Number (MPN)Verfahren 257

5.2.4.3 Quantifizierung nach Tissue Culture Infective Dose 50 (TCID50) 258

Inhaltsverzeichnis XI

5.2.5 Nukleinsäure-Extraktion mittels Silicapartikeln 2585.2.5.1 Nukleinsäure-Extraktion mittels Silicapartikeln 2585.2.5.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 2595.2.5.3 PCR-Beispiele 2615.2.5.4 Agarose-Gel-Elektrophorese 2685.2.6 3-stufiges Untersuchungsschema Wasservirologie 2705.2.7 Störungsquellen 2705.2.8 Angabe der Ergebnisse 270

Literatur 2705.3 Cryptosporidien und Giardien 274

Albrecht Wiedenmann5.3.1 Begriffsbestimmung 2745.3.2 Anwendungsbereich 2765.3.3 Auswahl einer geeigneten Methode 2765.3.4 Prüfung der Sinnhaftigkeit einer Untersuchung auf Cryptosporidien

und Giardien 2785.3.5 Prinzipielle Verfahrensschritte 2785.3.6 Spezielle Geräte und Reagenzien 2795.3.6.1 Ermittlung der Wiederfindungsrate 2795.3.6.2 Probennahme 2795.3.6.3 Filtration 2795.3.6.4 Transport 2815.3.6.5 Filterelution 2815.3.6.6 Eluatkonzentrierung 2815.3.6.7 Separation 2815.3.6.8 Detektion 2825.3.6.9 Reinigung und Desinfektion der Geräte 2825.3.7 Untersuchungsgang 2825.3.7.1 Ermittlung der Wiederfindungsrate 2825.3.7.2 Probengewinnung und Transport 2835.3.7.3 Filterelution 2855.3.7.4 Eluatkonzentrierung 2855.3.7.5 Immunomagnetische Separation 2855.3.7.6 FITC-MAB Markierung und mikroskopischer Nachweis 2865.3.7.7 Desinfektion und Reinigung der Geräte 2865.3.7.8 Auswertung 2875.3.8 Störungsquellen 2895.3.9 Angabe der Ergebnisse 2915.3.10 Interne Qualitätskontrolle 2915.3.11 Externe Qualitätskontrolle 2915.3.12 Laborakkreditierung 2925.3.13 Alternativ-Verfahren, weitergehende Diagnostik

und Methoden-Entwicklungen 292Literatur 293

InhaltsverzeichnisXII

6 Molekularbiologische Methoden 297Konrad Botzenhart

6.1 Molekularbiologische Verfahren mit praktischer Bedeutung(nach Köster et al. 2003) 298

6.1.1 Nachweis von Antigenen der gesuchten Mikroorganismen durch spe-zifische Antikörper 298

6.1.2 Immunfluoreszenzmikroskopie 2986.1.3 Durchflusszytometrie, Fluorescent Activated Cell Sorting

(FACS) 2996.1.4 Immunomagnetische Separation (IMS) 2996.1.5 Molekulare Hybridisierung (MH) 2996.1.6 Restriktionsfragmentkartierung, Restriktionsfragmentlängenpolymor-

phismus (RFLP) 3006.1.7 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 3006.1.8 DNA Chip Array, Biochips 3026.1.9 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) 3026.2 Praktische Bedeutung 304

Literatur 304

7 Spezifische Kriterien 3057.1 Untersuchung des Einflusses von Werkstoffen auf die Vermehrung

von Mikroorganismen im Trink- und Badewasserbereichin der Praxis und im Laborversuch 305Dirk Schoenen

7.1.1 Einleitung 3057.1.2 Untersuchungen der Besiedlung bzw. Bewuchsbildung in der Pra-

xis 3077.1.3 Exposition von Testkörpern und Untersuchung der Bewuchsbildung

unter Laborbedingungen 3087.1.4 Beurteilung nach dem DVGW Arbeitsblatt W270 3107.1.5 Andere Beurteilungsverfahren 3127.1.6 Ausblick 313

Literatur 3137.2 Bakterienvermehrungspotential 315

Beate Hambsch und Peter Werner7.2.1 Begriffsbestimmung 3157.2.2 Anwendungsbereich 3167.2.3 Geräte und Chemikalien 3167.2.3.1 Geräte 3167.2.3.2 Chemikalien 3177.2.4 Untersuchungsgang 3187.2.4.1 Allgemeines 3187.2.4.2 Vorbereitung der Wasserproben 3187.2.4.3 Herstellung des Inokulums und Animpfung der vorbereiteten Was-

serprobe 320

Inhaltsverzeichnis XIII

7.2.4.4 Registrierung der Wachstumskurven 3207.2.4.5 Zusätzliche Analysen 3217.2.5 Störungsquellen 3217.2.6 Auswertung 3227.2.7 Angabe der Ergebnisse 322

Literatur 323

8 Bewertung 325Konrad Botzenhart und Irmgard Feuerpfeil

8.1 Trinkwasser 3258.1.1 Indikatorbakterien 3278.1.2 Koloniezahl 3288.1.3 E. coli 3298.1.4 Coliforme Bakterien 3318.1.5 Enterokokken 3328.1.6 Clostridien 3338.1.7 Pathogene Bakterien 3348.1.8 Salmonellen 3358.1.9 Shigellen 3368.1.10 Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus und weitere Vibrionen 3378.1.11 Campylobacter 3388.1.12 Yersinien 3398.1.13 Pseudomonas aeruginosa 3408.1.14 Aeromonaden 3418.1.15 Legionellen 3428.1.16 Atypische Mykobakterien 3438.2 Enterale Viren, Coliphagen 3448.3 Cryptosporidium und Giardia 3458.4 Mikrobieller Bewuchs/Biofilme 3478.5 Qualitätssicherung 3478.6 Badewasser 3488.6.1 Badegewässer 3498.6.2 Kleinbadeteiche 3508.6.3 Wasser in Beckenbädern 3528.7 Mineral-, Quell- und Tafelwasser 3528.8 Rohwasse 353

Literatur 355

9 Anhang 359Irmgard Feuerpfeil

Sachregister 367

InhaltsverzeichnisXIV

Trinkwasser muss frei sein von KrankheitserregernSo streng diese grundsätzliche Forderung der Hygiene ist, so schwierig sie inletzter Konsequenz in der Praxis der Trinkwasserversorgung in voller Konse-quenz umzusetzen ist, so profitiert die Praxis doch von der Tatsache, dassKrankheitserreger im Trinkwasser fast immer die Folge einer Kontaminationmit tierischen oder menschlichen Abgängen sind.

Im Vergleich zur chemischen Analyse hat die Mikrobiologie den unschätz-baren Vorteil, über einen Indikator zu verfügen, um nicht auf alle erdenklichenKrankheitserreger prüfen zu müssen: E. coli. Eine Differenzierung war von un-tergeordnetem Interesse, solange enteropathogene E. coli (z.B. EHEC) keine be-sondere Aufmerksamkeit erforderten.

Für den Praktiker wäre es natürlich erfreulich, wenn es dabei bliebe. DieserStandpunkt wurde viele Jahrzehnte in der Praxis vertreten und so konnten sichFachbücher wie das von Karl Höll auf einige wenige Bestimmungsmethodenbeschränken, einschließlich der Koloniezahl auf Nährböden bei verschiedenenTemperaturen und dem Nachweis der so genannten Coliformen, was immer da-runter zu verstehen sein mag. Nun haben sich die wissenschaftlichen Erkennt-nisse weiterentwickelt und neben den Indikatoren haben eine große Zahl vonPathogenen zunächst ein wissenschaftliches und darüber hinaus auch ein prak-tisches Interesse gefunden. Oder umgekehrt: so lange keine praktikablen Nach-weismethoden vorlagen, mussten mit überdehnten Vermutungen, um nicht zusagen Spekulationen, Schlussfolgerungen aus den Befunden von Indikatororga-nismen hilfsweise abgeleitet werden.

Die Weiterentwicklung von mikrobiologischen Nachweismethoden ist alsonicht nur wissenschaftlichem Interesse sondern auch praktischer Notwendigkeitgeschuldet. Die Methodik hat inzwischen einen solchen Umfang erreicht, dasssie schon seit einiger Zeit nicht mehr in Wasserlehrbüchern abgehandelt wer-den kann, sondern eine eigenständige Sammlung erfordert. Diesem Ziel dientdas vorliegende Buch. Es ist die Fortentwicklung einer ersten umfassenden Me-thodensammlung für das Wasserfach des vormaligen Instituts für Hygiene undMikrobiologie in Bad Elster, der jetzigen Dienststelle des Umweltbundesamtesund Teil seiner Trinkwasserabteilung.

XV

Geleitwort

Auf eine Besonderheit sei noch hingewiesen: Grundsätzlich ist neben demtatsächlichen Nachweis von Krankheitserregern auch und besonders die Indika-tion der Reinheit, also der Abwesenheit von Indikatororganismen, das Ziel dermikrobiologischen Untersuchung zur seuchenhygienischen Bewertung der Was-serqualität. Unter diesem Aspekt kommt es nicht so sehr auf wissenschaftlicheGenauigkeit bei der Erfassung einer Gruppe von Bakterien an, als auf die Zu-verlässigkeit und Einfachheit der Bestimmung. Gemeint sind die Coliformen.Hierüber besteht eine wissenschaftliche Meinungsvielfalt, der die Praxis etwasverständnislos gegenübersteht. Einen Ausweg aus einer solchen Vielfalt, diedurchaus ihre Berechtigung haben kann und die im vorliegenden Buch reflek-tiert wird, kann nur ein normativer Konsens bieten, der entweder in internatio-nalen Standards oder in besonderen Fällen als Legaldefinition in einer Rechts-norm, also in der Trinkwasserverordnung, eingebracht wird. Die Entwicklungunterschiedlicher kommerzieller Methoden für den mikrobiologischen Nach-weis wird zwar die Vergleichbarkeit der Ergebnisse erschweren. Das ist aber fürdie Eigenkontrolle des Trinkwassers hinnehmbar, wenn dafür die immer nochviel zu lange Zeit zwischen dem Ansatz der mikrobiologischen Probe und demVorliegen eines Ergebnisses abgekürzt werden kann, wenn keine falsch negati-ven Ergebnisse erzielt werden und wenn im Zweifel eine Legaldefinition des-sen, was als maßgeblicher Befund zu werten ist, herangezogen werden kann.

Hygiene des Trinkwassers ist ein weltweites Problem und die mikrobiologi-sche Überwachung überall erforderlich. Eine entsprechend weite Verbreitungwird dem vorliegenden Buch gewünscht.

Berlin, November 2007Prof. Dr. Andreas Grohmann

GeleitwortXVI

XVII

Autorenverzeichnis

Konrad BotzenhartEberhard-Karls-Universität TübingenInstitut für MedizinischeMikrobiologie und HygieneWilhelmstraße 3172074 Tübingen

Martin ExnerHygiene Institut der Universität BonnSigmund-Freud-Straße 2553105 Bonn

Irmgard FeuerpfeilUmweltbundesamtFachgebiet II 3.5„Mikrobiologie des Trink-und Badebeckenwassers“Heinrich-Heine-Straße 1208645 Bad Elster

Jens FleischerRegierungspräsidium StuttgartLandesgesundheitsamtReferat 93 – WasserhygieneNordbahnhofstraße 13570191 Stuttgart

Andreas GrohmannHolbeinstr. 1712203 Berlin

Beate HambschDVGW – Technologiezentrum Wasser(TZW) Abteilung MikrobiologieKarlsruher Straße 8476139 Karlsruhe

Gerhard HaukFacharzt für Hygieneund UmweltmedizinLandesamt für Gesundheitund Soziales MVAbteilung 3Gertrudenstraße 1118057 Rostock

Ernst-August HeinemeyerNiedersächsischesLandesgesundheitsamtAußenstelle AurichLüchtenburger Weg 2426603 Aurich

Stefanie HuberBayerisches Landesamt für Gesundheitund LebensmittelsicherheitSachgebiet Umweltmikrobiologie (S5)Veterinärstraße 285764 Oberschleißheim

AutorenverzeichnisXVIII

Annette HummelUmweltbundesamtFachgebiet II 3.5„Mikrobiologie des Trink-und Badebeckenwassers“Heinrich-Heine-Straße 1208645 Bad Elster

Katrin LudenNiedersächsischesLandesgesundheitsamtAußenstelle AurichLüchtenburger Weg 2426603 Aurich

Andrea RechenburgHygiene Institut der Universität BonnSigmund-Freud-Str. 2553105 Bonn

Roland Schulze RöbbeckeUniversitätsklinikum DüsseldorfInstitut für Medizinische Mikrobiologieund KrankenhaushygieneUniversitätsstr. 140225 Düsseldorf

Benedikt SchaeferUmweltbundesamtDienstgebäude Bad ElsterFG II 3.5Heinrich-Heine-Straße 1208645 Bad Elster

Haribert SchicklingAKS Staatliche AkkreditierungsstelleHannoverCalenberger Straße 230169 Hannover

Peter SchindlerLandesuntersuchungsamtfür das Gesundheitswesen SüdbayernVeterinärstraße 285764 Oberschleißheim

Oliver SchneiderRegierungspräsidium StuttgartLandesgesundheitsamtReferat 93 – WasserhygieneNordbahnhofstraße 13570191 Stuttgart

Dirk SchoenenHygiene-Institut der UniversitätSigmund-Freud-Straße 2553127 Bonn

Jürgen-M. SchulzAKS Staatliche AkkreditierungsstelleHannoverCalenberger Straße 230169 Hannover

Regine SzewzykUmweltbundesamtFG II 1.4Corrensplatz 114195 Berlin

Steffen Uhligquo data Gesellschaft für Qualitäts-management und Statistik mbHKaitzer Straße 13501187 Dresden

Peter WernerInstitut für Abfallwirtschaftund AltlastenTechnische Universität DresdenPratzschwitzerstr. 1501796 Pirna

Albrecht WiedenmannGesundheitsamt desLandkreises EsslingenSachgebiet Infektionsschutzund UmwelthygieneBeblinger Str. 273728 Esslingen

Konrad Botzenhart und Irmgard Feuerpfeil

Zum Schutz der menschlichen Gesundheit kommt der Sicherung der Trinkwas-serversorgung eine hohe Bedeutung zu. Krankheitserreger können über dasTrinkwasser wie durch kein anderes Medium in großen Teilen der Bevölkerungverteilt werden. Durch die Schaffung großer, zentraler Wasserversorgungenkönnen gleichzeitig viele Menschen erkranken, wenn ein mit Krankheitserre-gern belastetes Trinkwasser verteilt wird. Um derartige Gesundheitsgefährdun-gen auszuschließen, sind strenge Anforderungen an das Trinkwasser festgelegt.

Bereits am 16. Juni 1906 veröffentlichte das Kaiserliche Gesundheitsamt die„Anleitung für die Errichtung, den Bau und die Überwachung öffentlicher Was-serversorgungsanlagen, welche nicht ausschließlich technischen Zwecken die-nen“. Damit wurde vor 100 Jahren ein Ordnungsrahmen für die Trinkwasser-hygiene in Deutschland geschaffen, der nicht an Aktualität eingebüßt hat. Inder dazu entwickelten Strategie spielten bereits die bakteriologische Unter-suchung des Trinkwassers und das Indikatorprinzip eine hervorragende Rolle.

Das Erkennen der Zusammenhänge zwischen Seuchenausbrüchen und Was-serqualität war eng verbunden mit der Entwicklung der bakteriologischen Un-tersuchungsverfahren für Trinkwasser.

Neuere Entwicklungen seit Bekanntmachung der EG-Richtlinie zur „Qualitätdes Wassers für den menschlichen Gebrauch“ (98/83/EG, 1998) wurden in derTrinkwV 2001 in nationales Recht umgesetzt.

Mit der Bezeichnung „Wasser für den menschlichen Gebrauch“ wurde durchdie EG-Richtlinie und die TrinkwV 2001 der Geltungsbereich dahingehend er-weitert, dass nicht nur das Wasser zum Trinken hohen Anforderungen im hy-gienischen Sinn gerecht werden muss, sondern die gleichen Anforderungen andas Wasser zur Körperreinigung, zur Zubereitung von Speisen und zum Wä-schewaschen eingehalten werden müssen.

Um in der EG und auch in Deutschland vergleichbare Untersuchungsergeb-nisse zu erhalten, wurden in der EG-Richtlinie und in der TrinkwV 2001 für diemikrobiologischen Parameter die Untersuchungsverfahren, die Untersuchungs-volumina, die Untersuchungshäufigkeit und die Stelle der Einhaltung der Para-meterwerte verbindlich vorgeschrieben.

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1Allgemeines

Die Untersuchungsverfahren sind in den meisten Fällen genormt. Die in denletzten Jahrzehnten zur Untersuchung der Trink- und Badewasserproben einge-setzten Verfahren waren sog. „presence-absence“ Tests und wiesen die Mikroor-ganismen nur qualitativ nach. Die neuen Anforderungen an die Überwachungmit konzentrationsabhängiger Bewertung erfordern Untersuchungsverfahren,die eine quantitative Bestimmung der Parameter ermöglichen.

Durch die Einführung generell neuer Referenzmethoden zum Nachweis dermikrobiologischen Überwachungsparameter gibt es auch in dieser Hinsicht fürDeutschland Neuerungen.

Im Falle der Bestimmung von E. coli werden z. B. durch Änderung des Nach-weisprinzips jetzt auch anaerogene E. coli mit erfasst.

Das neue Nachweisverfahren für Enterokokken grenzt die nach TrinkwV 1990bestimmte physiologische Gruppe der Fäkalstreptokokken auf den Nachweisvon 4 typisch „fäkalen“ Enterokokkenarten ein.

Ebenso wird mit der Bestimmung von C. perfringens der „fäkale“ Vertreter derClostridien anstatt der physiologischen Gruppe „sulfitreduzierende sporenbil-dende Anaerobier“ erfasst.

Neu ist auch, dass nach § 15 Abs. 1 TrinkwV 2001 die Anwendung anderer, al-ternativer Methoden ermöglicht wird, sofern sie gleichwertige Ergebnisse zumReferenzverfahren (nach DIN EN ISO 17994) liefern.

Die Entwicklung führt neuerdings zu Methoden, mit denen typische Enzym-wirkungen durch chromogene oder fluorogene Substrate nachgewiesen werden.

Die Trinkwasserinstallation von öffentlichen Gebäuden wurde verstärkt in dieÜberwachung der Trinkwasserqualität einbezogen, um neu erkannte Gefährdun-gen durch Biofilme und Wiederverkeimungen nach der Verteilung des Trinkwassersunter den Bedingungen der Hausinstallation erkennen und wirkungsvoll bekämp-fen zu können. Hier kommt der Trinkwasserinstallation in medizinischen Einrich-tungen, wie Krankenhäusern und Pflegeheimen, insbesondere Kontaminationenmit Legionellen und P. aeruginosa, besondere Bedeutung zu. Diese nicht fäkal be-dingten Krankheitserreger werden durch das Indikatorprinzip nicht erfasst undmüssen innerhalb der Überwachung direkt untersucht werden. Im Falle der Legio-nellen wurde erstmals die direkte Bestimmung eines Krankheitserregers in derTrinkwV 2001 gefordert. Legionellen und P. aeruginosa sind aber auch in die Über-wachung von nach DIN 19643 betriebenen Beckenbädern einbezogen worden.

Im Falle weiterer Krankheitserreger, wie wasserübertragbarer Viren oder Para-sitendauerformen, ist eine sog. „Endproduktkontrolle“ des Trinkwassers zurÜberwachung aus methodischen Gründen nicht sinnvoll, zu aufwendig und zukostenintensiv.

Hier sollten zur Risikoabschätzung vor möglichen Kontaminationen desTrinkwassers sog. „water safety plans“, die durch die WHO vorgeschlagen wur-den, eingesetzt werden.

Die „Endproduktkontrolle“ des Trinkwassers wird hier ersetzt bzw. ergänztdurch die „Prozesskontrolle“ mit Ermittlung der Rohwasserbelastung durch sog.Indexpathogene (z. B. Campylobacter) und Bestimmung der Reduktionsratendurch die Trinkwasseraufbereitungsverfahren mittels Indikatoren.

1 Allgemeines2

Auch für die Badegewässer gibt es seit 2006 eine neue EG-Richtlinie(2006/7/EG, 2006), deren Vorgaben in deutsches Recht umgesetzt werdenmüssen. Hier sind ebenfalls wesentliche Neuerungen zu beachten, die auf denverbesserten Gesundheitsschutz der Badenden gerichtet sind. Unter anderemwerden ebenfalls neue mikrobiologische Überwachungsparameter und Nach-weisverfahren vorgegeben.

Die mikrobiologischen Untersuchungen zur Überwachung der Trink- und Ba-dewasserqualität erfordern von den Untersuchungsstellen auch die Einhaltungneuer Qualitätskriterien – sie müssen eine Akkreditierung nachweisen. Damitsoll sichergestellt werden, dass die Labore mit hoher Zuverlässigkeit und Sach-kenntnis die Untersuchung der Wasserproben, einschließlich der Probenahme,nach den vorgeschriebenen Nachweisverfahren und Normen durchführen.

Die fachlich kompetente Untersuchung der Wasserproben, die Befundinter-pretation durch den Amtsarzt oder in speziellen Fällen gemeinsam mit einemdafür geeigneten Hygieneinstitut stellen sicher, dass den Verbrauchern ein denAnforderungen der TrinkwV 2001 und weiterer technischer Regeln entsprechen-des Trinkwasser zur Verfügung gestellt werden kann. Dies gilt in gleichem Ma-ße für die Qualität des Badewassers.

Zu Fragen der hygienisch-mikrobiologischen Untersuchung der Wasserpro-ben und zur Befundbewertung sollen die Beiträge in diesem Buch Antwortenund Unterstützung geben.

1 Allgemeines 3

Benedikt Schaefer

Die gesetzlichen Rahmenbestimmungen zum Betrieb eines Labors für mikro-biologische Wasseruntersuchungen umfassen neben den Arbeitsschutzbestim-mungen auch seuchenrechtliche Aspekte. Da bei der Anzucht von Mikroorga-nismen aus Umweltproben nicht ausgeschlossen werden kann, dass auch pa-thogene Erreger angereichert werden, sind die Bestimmungen des Infektions-schutzgesetztes (IfSG) zu beachten. Eine Ausnahme kann man für Laboratorienannehmen, in denen nur Koloniezahlbestimmungen, Untersuchungen auf dasVorkommen von E. coli und coliforme Keime und auf intestinale Enterokokkendurchgeführt werden. Bei allen anderen Untersuchungen ist davon auszugehen,dass im Labor mit Krankheitserregern umgegangen werden muss, beispielswei-se im Rahmen der Qualitätssicherung (Positivkontrollen, Ringversuchsproben).Die wichtigste Voraussetzung für den Umgang mit Krankheitserregern ist eineentsprechende Erlaubnis für den Laborleiter gemäß § 44 Infektionsschutzgesetz(IfSG). Die geplante Aufnahme von Tätigkeiten mit Krankheitserregern ist ge-mäß § 49 IfSG anzeigepflichtig.

Laboratorien, die Untersuchungen gemäß Trinkwasserverordnung (TrinkwV)durchführen, müssen gemäß § 15 Abs. 4 von der zuständigen Behörde des je-weiligen Bundeslandes dafür zugelassen sein. Voraussetzung für die Zulassungist eine Akkreditierung (s. a. Kapitel 3.1).

2.1Reinigen und Sterilisieren der LabormaterialienBenedikt Schaefer

Vor der Beschaffung von Labormaterialien ist die grundsätzliche Frage zu klä-ren, ob Einwegmaterial oder wieder verwendbare Artikel verwendet werden sol-len. Einwegmaterial ist in der Regel gebrauchsfertig und wird nach Gebrauchentsorgt. Das führt zu großen Mengen Müll. Die Kosten für die Müllentsor-gung müssen bei der Wirtschaftlichkeitsbetrachtung berücksichtigt werden. Das

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2Methodische Grundlagen

Waschen der wieder verwendbaren Materialien erfordert den Einsatz von Ar-beitszeit, Waschwasser und Reinigungsmitteln.

Petrischalen sind aus Kunststoff oder aus Glas. Glaspetrischalen werden vorBefüllen mit Nährboden durch Heißluft sterilisiert, Kunststoffpetrischalengenügen bei üblichen Verwendungszwecken ohne weitere Sterilisation den An-forderungen. Bei längeren Inkubationszeiten wie zum Beispiel bei der Unter-suchung auf Legionellen sollte strahlensterilisierten Petrischalen der Vorzug ge-geben werden.

2.1.1Reinigung

Glasgeräte und wieder verwendbare Kunststoffartikel werden grundsätzlich vor je-dem Gebrauch, auch vor dem Erstgebrauch, mit handelsüblichen Spülmittelnheiß gewaschen. Vorteilhaft ist die Verwendung von Laborglas-Waschautomatenmit den dazugehörigen Spezialwaschmitteln. Für die verschiedenartigen Glasge-fäße und Geräte gibt es Wascheinsätze. Besonders für die Innenreinigung von en-gen Röhren wie Glaspipetten sind dafür konstruierte Wascheinsätze unverzicht-bar. Bei manuellem Waschen ist unter Waschmittelzugabe ebenfalls heiß zu wa-schen. Hier empfiehlt sich mehrmaliges Nachspülen mit heißem Wasser. Wichtigfür die Sauberkeit des Glases ist ein abschließendes Klarspülen mit Wasser vonhoher Reinheit. Für mikrobiologische Untersuchungen reicht in der Regel dasSpülen mit destilliertem Wasser oder vollentsalztem Wasser (VE-Wasser) aus.

2.1.2Heißluftsterilisation

Nach dem Waschen wird das Glas im Trockenschrank getrocknet und anschlie-ßend in Heißluftsterilisatoren sterilisiert. Öffnungen bei Flaschen, Kolben u. ä.werden vor der Sterilisation mit Verschlüssen oder mit Aluminiumfolie abge-deckt. Verschlüsse müssen dabei locker sitzen, um ein Platzen der Gefäße zuvermeiden (Ausnahme: Autoklav mit Stützdruck). Bei Verwendung von Glasfla-schen mit Schliffstopfen ist zwischen Flaschenschliff und Stopfen ein schmalerStreifen Aluminiumfolie oder Papier anzubringen. Das Ende des Streifens wirddazu umgeknickt und vor Einsetzen des Stopfens in die Flaschenöffnung ge-hängt. Den danach eingesetzten Stopfen deckt man mit Aluminiumfolie ab, sodass Verschluss und Flaschenhals bedeckt sind. Geräte, wie Pinzetten oder Spa-tel, werden in ein Becherglas gegeben, und der Behälter wird mit Alumini-umfolie abgedeckt. Bei geringem Verbrauch können Kleingeräte auch in größe-ren Petrischalen oder einzeln in Aluminiumfolie gewickelt sterilisiert werden.

Beim Beschicken eines Heißluftsterilisators ist darauf zu achten, ob das Mate-rial die erforderlichen hohen Temperaturen verträgt. Probleme bereiten dabeiinsbesondere Kunststoffartikel und Stopfen aus Zellstoff. Materialien, die nichtmindesten 160 �C vertragen, sollten durch Autoklavieren sterilisiert werden (s. a.Abschnitt 2.2.3). Bei Kunststoffteilen, die Erhitzung vertragen, ist häufig die

2 Methodische Grundlagen6

maximal zulässige Temperatur eingeprägt oder aufgedruckt. Die gebräuchlichenLaborflaschen mit blauen Schraubverschlüssen und Ausgießringen können nurbis 140 �C autoklaviert werden; gleiche Flaschen mit etwas teueren roten Ver-schlüssen und Ausgießringen können bis 200 �C erhitzt werden. Wenn Kunst-stoffartikel nicht mit der Angabe der maximal zulässigen Temperatur gekenn-zeichnet sind, helfen Nachfragen bei der Bezugsquelle weiter.

Die Hitzesterilisation kann durch Einwirkzeiten von mindestens zwei Stun-den bei 160 �C, einer Stunde bei 170 �C oder einer halben Stunde bei 180 �C er-folgen. Siehe hierzu auch die Hinweise in der DIN EN ISO 19458 (2006) oderim Deutsches Arzneibuch (DAB, 2006). Besonders bei großen Heißluftsterilisa-toren ist die Aufheizzeit zu berücksichtigen. Auch ist darauf zu achten, dass dieLuftumwälzung im Heißluftsterilisator nicht zu sehr durch dichte Beschickungbehindert wird. An allen Wänden muss entsprechender Abstand eingehaltenwerden, bei großen Geräten sollte auch in der Mitte eine Schneise für Luft-umwälzung freigelassen werden. Der Erfolg der Heißluftsterilisation ist mit In-dikatoren regelmäßig zu überprüfen.

2.1.3Lagerung von sterilen Labormaterialien

Es ist darauf zu achten, dass einmal sterilisierte Artikel nicht unbegrenzt langesteril bleiben. Glaspetrischalen müssen spätestens nach einer Woche Lagerungerneut sterilisiert werden, andere Laborartikel in der Regel nach einem Monat.Bereits sterilisierte Labormaterialien sind so zu lagern, dass immer die Artikelmit der längsten Lagerzeit zum Gebrauch entnommen werden. Es soll verhin-dert werden, dass nur ein Teil der Materialien umgeschlagen wird und dernicht umgeschlagene Rest überlagert wird. Als Merksatz hierzu hat sich der Be-griff „LILO“ (Last In Last Out) etabliert. Die Länge der Lagerzeit ist für die ver-schiedenen Materialien durch Sterilkontrollen zu evaluieren und zu dokumen-tieren.

2.2Herstellung und Aufbewahrung von NährbödenBenedikt Schaefer

Die Herstellung der Nährböden ist in den einzelnen Kapiteln im Zusammen-hang mit der Beschreibung des Untersuchungsverfahrens detailliert beschrie-ben. Hier sollen einige grundlegende Bemerkungen genügen. Hinweise findensich auch in den Normen ISO/TS 11133-1 sowie dem Entwurf ISO 11133-2. Bei-de Normen gelten für Nährmedien aus der Lebensmittelmikrobiologie. Derzeitwird daran gearbeitet, die beiden Teile zu einer neuen einteiligen ISO 11133mit Geltungsbereich für Lebensmittelmikrobiologie und Wassermikrobiologiefortzuentwickeln. Diese Norm wird Hinweise zu Qualitätskontrollen beim Her-steller sowie beim Verbraucher von Nährmedien enthalten. Dazu wird eine Liste

2.2 Herstellung und Aufbewahrung von Nährböden 7

mit Referenzstämmen aufgenommen, die für qualitative oder quantitative Qua-litätskontrollen einzusetzen sind.

Nährmedien sind hitzeempfindlich. Sie sollten daher so schonend wiemöglich erwärmt und autoklaviert werden. Die Gefäße für die Zubereitung vonNährmedien sollten so groß gewählt werden, dass der Inhalt auf einmal ver-braucht wird.

2.2.1Fertignährböden

Die Vorschrift zur Verwendung von Fertignährböden ist normalerweise auf denBehältern zu finden, in denen sie gekauft werden. Hersteller von mikrobiologi-schen Medien oder einzelnen Bestandteilen bieten häufig ein Buch über dieVerwendung, Zubereitung und Zusammensetzung der Medien an. Da Angabenzur Charge und zum Haltbarkeitsdatum auf der Handelspackung zu findensind, sollten die Medien nicht umgefüllt werden. Die Größe der Packungsein-heiten und die jeweils bestellte Menge müssen sich am Verbrauch orientieren.Die Lagerung erfolgt trocken und dunkel bei Raumtemperatur in den dicht ver-schlossenen Behältern. Nach Überschreiten des Mindesthaltbarkeitsdatumsdürfen Medien und ihre Bestandteile nicht mehr verwendet werden. Verklump-te Pulver und Granulate sind zu verwerfen. Es werden gebrauchsfertige Petri-schalen, Kolben, Flaschen oder Nährkartonscheiben mit verschiedenen Nähr-medien angeboten. Bei allen Produkten dieser Art wird die Verwendung vomHersteller genau beschrieben. Trotz großer Anstrengungen der Hersteller zurChargenkontrolle ist eine Eingangskontrolle der Fertignährböden beim Kundenunverzichtbar. Sinnvoll ist in diesem Zusammenhang die Verwendung von Re-gelkarten zur Überprüfung des möglichen Einflusses von Chargenwechseln aufdas Untersuchungsergebnis (s. Kapitel 3). Dabei sollten die Nährböden soüberprüft werden, wie es dem späteren Einsatz bei Untersuchungsaufträgenentspricht. So muss zum Beispiel bei Medien, die für Membranfiltrationen ein-gesetzt werden, auch die Chargenkontrolle mit Membranfiltrationsansätzendurchgeführt werden.

2.2.2Zubereitung

Die meisten Nährmedien werden in Pulver- oder Granulatform angeboten. Diesewerden gegebenenfalls mit den weiteren Bestandteilen des Mediums in eingenügend großes Gefäß eingewogen und durch Zugabe von entsalztem oder frischdestilliertem Wasser aufgeschlämmt. Die Bestandteile werden durch Umschüttelnund bei agarhaltigen Medien nach ca. 20-minütigem Quellenlassen durch Erhit-zen im Dampftopf gelöst. Erst wenn die Lösung homogen ist, kann der pH-Wertmittels Indikatorpapier oder hitzebeständiger Elektrode kontrolliert und gegebe-nenfalls korrigiert werden. Dabei ist die Abhängigkeit des pH-Wertes von der Tem-peratur zu beachten. Nach Einstellen des pH-Wertes wird mit Aqua dest. zum End-

2 Methodische Grundlagen8

volumen aufgefüllt. Als Gefäße für die Zubereitung von Nährmedien haben sichneben Glaskolben und „Nährbodenflaschen“, die mit Kappen oder Stopfen ver-schlossen werden, auch Laborglasflaschen mit Schraubverschluss durchgesetzt.

2.2.3Sterilisation

Sie ist im Anschluss an die Bereitung des Nährbodens erforderlich, weil Peptonebzw. Trockennährboden immer in geringem Maße keimhaltig oder sporenhaltigsind. Die Sterilisation erfolgt im Autoklav bei 121 �C in 15–20 min. Die Zeitspan-ne vom Erreichen der Sterilisationstemperatur am Thermometer des Autoklavenbis zum Erreichen der Sterilisationstemperatur im Nährboden, die sog. Aus-gleichszeit, beträgt bei kleinen Volumina (bis 50 ml) etwa 3 min. Dies fällt kaumins Gewicht. Die Ausgleichszeit beträgt jedoch bei einem Liter etwa 20 min. Daherist von dem Ansatz größerer Volumina als einem Liter abzusehen. Wenn ein Au-toklav ohne Stützdruck verwendet wird, empfiehlt es sich, ein Volumen Nähr-boden in einem doppelt so großen Gefäß zu autoklavieren, also z.B. 1 l in einer2 l-Flasche. Bei flüssigem Beschickungsgut ist eine Deckelverriegelung vor-geschrieben, die ein Öffnen des Gerätes erst erlaubt, wenn das Beschickungsgutauf Temperaturen unter 80 �C abgekühlt ist. Das soll verhindern, dass es zum Sie-deverzug und damit zur Gefährdung des Personals kommen kann. Die Kontrolleder Temperatur des Beschickungsgutes muss dabei mit einem Messfühler in ei-nem Referenzgefäß erfolgen. Wenn diese direkte Kontrolle der Flüssigkeitstem-peratur nicht möglich ist (z. B. bei alten Autoklaven oder Autoklaven mit einemgeringen Kammervolumen), muss die Kammertemperatur auf 50–60 �C gefallensein, bevor der Deckel geöffnet werden darf. Der Erfolg des Autoklavierens istwie bei der Heißluftsterilisation durch geeignete Indikatoren zu überprüfen.

Empfindliche Nährböden, besonders zuckerhaltige, werden für 30 min beimaximal 110 �C oder fraktioniert an drei aufeinanderfolgenden Tagen für30 min bei 100 �C im strömenden Wasserdampf sterilisiert. Für Sterilisation beiAtmosphärendruck kann auch ein Dampftopf eingesetzt werden. Zur Herstel-lung von Agarplatten ist der Nährboden nach dem Autoklavieren in einem Was-serbad auf 48–50 �C abzukühlen und dann in sterile Petrischalen auszugießen.Wird zu heiß gegossen, bildet sich sehr viel Kondenswasser. Müssen nach derSterilisation dem Nährboden hitzeunverträgliche Substanzen oder deren steril-filtrierte Lösungen zugegeben werden, so sind sterile Arbeitsbedingungen unddie in der Gebrauchsanweisung vorgeschriebene Temperatur einzuhalten.

2.2.4Lagerung der gebrauchsfertigen Nährböden

Nährböden sollten nach der Herstellung nicht unnötig gelagert, sondern be-darfsgerecht jeweils frisch zubereitet werden. Wenn eine Lagerung notwendigerscheint, sollten die sterilen Flüssignährmedien in dicht verschlossenen Gefä-ßen bei 4–8 �C dunkel aufbewahrt werden.

2.2 Herstellung und Aufbewahrung von Nährböden 9

Vor der Verwendung ist das Medium auf Anzeichen einer Kontamination wiezum Beispiel Trübung oder Kahmhautbildung zu kontrollieren. AgarhaltigeNährböden sollten in Petrischalen gegossen und ebenfalls bei 4 – 8 �C auf-bewahrt werden. Die Petrischalen müssen bei längerer Lagerung vor Austrock-nung geschützt werden, z.B. in einem Plastikbeutel.

Wie bei anderen sterilen Labormaterialien ist die maximale Lagerzeit derNährmedien in Petrischalen oder anderen Gefäßen festzulegen und zu doku-mentieren. Auch für die Lagerung gebrauchsfertiger Nährböden muss sicher-gestellt sein, dass keine überlagerten Materialien verwendet werden (s. Ab-schnitt 2.1.3).

Vor der Verwendung müssen Petrischalen auf Raumtemperatur erwärmt underforderlichenfalls getrocknet werden. Die Schalen werden dazu mit dem De-ckel nach unten für einige Minuten bis zu einer halben Stunde in einen Brut-schrank gelegt und die Unterteile etwas seitlich schräg auf die Deckel gesetzt.

2.2.5Konfektionierung

Im mikrobiologischen Wasserlabor werden üblicherweise Petrischalen mit ca.90 mm Durchmesser eingesetzt. Diese Petrischalen werden mit ca. 15 – 20 mlagarhaltigem Nährmedium befüllt. Eine zu geringe Füllmenge kann erheblicheAuswirkungen auf das Wachstum von Bakterien haben. Eventuell sich an derOberfläche des Mediums bildende Luftblasen können durch Fächeln mit derBunsenbrennerflamme entfernt werden. Hierbei ist besonders bei der Verwen-dung von Kunststoffschalen Vorsicht angebracht. Zur Herstellung vonRöhrchen mit Flüssigmedium für die Untersuchung auf Gasbildung durch Bak-terien, müssen diese Röhrchen vor oder nach Füllung mit Flüssigmedium somit den Gärröhrchen (sog. Durham-Röhrchen) versehen werden, dass die Öff-nung der Gärröhrchen nach unten zeigt. Um die Sterilität zu gewährleistenund gleichzeitig die Luft aus den Röhrchen zu treiben, müssen die so gefülltenRöhrchen autoklaviert werden. Wenn aus Gründen der Nährbodenstabilität einDampftopf benutzt wird, ist mehrfach zu erhitzen und anschließend zu kon-trollieren, ob die Luft vollständig aus den Gärröhrchen verdrängt worden ist.

2.3EntsorgungBenedikt Schaefer

Alle bei mikrobiologischen Wasseruntersuchungen verwendeten Materialiensind nach Benutzung ordnungsgemäß zu entsorgen. Dabei ist davon auszuge-hen, dass alle Gegenstände mit Krankheitserregern kontaminiert sein können.Aus Gründen der Arbeitssicherheit und auch zur Vereinfachung der Arbeits-organisation werden ausnahmslos alle Abfälle und alle verwendeten Laborgeräteund Gefäße autoklaviert. Eine chemische Desinfektion ist nicht mehr Stand der

2 Methodische Grundlagen10