IF2005 TD Cover - Scalewayadrien.six.online.fr/IF/Documents/IF2005_TD.pdf · Distribution de la plaquette de prØsentation de l™UE - Responsables de l™UE - Equipe enseignante

Master de Sciences et Technologies Mention Biologie Moléculaire et Cellulaire

Université Pierre et Marie Curie (Paris 6)

UE BMC423 Immunologie Fondamentale (IF2005)

14 février au 12 mars 2005

Travaux Dirigés

BMC 423 � Immunologie Fondamentale 2005 Travaux Dirigés

Université Pierre et Marie Curie

Travaux Dirigés

IF2005 TD-IF 1 : Introduction, Distribution de documents

IF2005 TD-IF 2 : Hématopoïèse

IF2005 TD-IF 3 : Immunité naturelle

IF2005 TD-IF 4 : Structure des Immunoglobulines et TCR

IF2005 TD-IF 5 : Développement lymphocytaire, Réarrangements TCR/Ig

IF2005 TD-IF 6 : Présentation antigénique, CPA/CMH

IF2005 TD-IF 7 : Sélection & Tolérance

IF2005 TD-IF 8 : Cytokines & Chimiokines

IF2005 TD-IF 9 : Activation, Fonctions effectrices

IF2005 TD-IF 10 : Correction d�un sujet d�examen � IF2004 septembre

IF2005 TD-IF 11 : Réponse aux questions � Questionnaire d�évaluation



IF2005 TD-IF 1 : Introduction,

Distribution de documents

BMC 423 � Immunologie Fondamentale 2005 Travaux Dirigés IF01

Université Pierre et Marie Curie 1

Introduction ; Distribution de documents

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- Responsables de l�UE

- Equipe enseignante et secrétariat pédagogique

- Calendrier

- Objectif du module

- Programme du cours

- Programme des Travaux Dirigés

- Analyse d�article (oral)

- Questionnaire d�évaluation

! Distribution et explication du planning

! Notification des modalités de contrôle des connaissances

! Inscription en binôme et choix des articles pour l�étude bibliographique



IF2005 TD-IF 2 : Hématopoïèse

BMC 423 – Immunologie Fondamentale 2005 Travaux Dirigés IF02


Hématopoïèse

1. La production continue des cellules des différentes lignées sanguines est assurée par une seule population cellulaire, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) qui sont capables d’auto-renouvellement et de différenciation. La différenciation des cellules souches hématopoïétiques est essentiellement gouvernée par des facteurs intervenant à des stades précis de leur différenciation en différentes cellules du sang. Des expériences de manipulations génétiques, en particulier de perte de fonction, ont permis d’ordonner l’intervention de ces différentes molécules.

Nous vous proposons d’étudier un de ces facteurs de transcription appelé Ikaros et de déterminer son rôle dans la différenciation des CSH et dans la mise en place du système immunitaire. Il existe 6 isoformes Ikaros (Ik1 à Ik6) produites par épissage alternatif du même gène. Ces isoformes sont représentées sur la figure ci-dessous. L’isoforme la plus longue (Ik1) possède 4 motifs à doigts de zinc en position N terminale permettant la liaison à l'ADN et 2 doigts de zinc en position C-terminale impliqués dans les propriétés de dimérisation des différents facteurs Ikaros.

Figure 1 : Représentation schématique des différentes isoformes de la protéine Ikaros

Les limites des exons sont indiquées. Les domaines codant pour les doigts de zinc sont numérotés de 1 à 6. Les doigts F1 à F4 sont responsables de la capacité de liaison à l’ADN. Les doigts F5 à F6 permettent l’association avec les différents membres de la famille Ikaros. La fonction des différents domaines protéiques produits est indiquée.

Par manipulation génétique, des souris mutantes synthétisant des molécules Ikaros délétées au niveau des motifs à doigts de zinc nécessaires à leur liaison à l’ADN ont été obtenues. La majorité des souris mutantes meurent entre la première et la troisième semaine de leur vie ; ces souris sont dépourvues de ganglions lymphatiques.

Dans un premier temps, les thymus des souris homozygotes pour la mutation sont analysés. Contrairement aux souris sauvages, les thymus des animaux mutants apparaissent rudimentaires. Bien que les structures épithéliales soient identiques à celles des souris sauvages, le nombre des thymocytes est cependant très réduit (105 cellules/108 cellules). Une analyse par cytométrie en flux est réalisée à l’aide d’anticorps spécifiques de sous-populations thymiques.

Question 1. Interprétez les résultats obtenus à la Figure 2.



Figure 2 : Flow cytometric analysis of cells in the rudimentary Thymus of Ikaros mutant mice

(A) The cell composition of the thymus in wild-type controls (+/+; 2x108 cells recovered per thymus) and in Ikaros mutant mice (-/-; B and C) was determined. A maximum of 1x105 cells were recovered per thymus in 62 out of 65 mutant animals (irrespective of age); a group of three 2-week-old mutant mice is shown in (B). In 3 out of 65 mutant animals, 0.5x106 to 1x106 cells were recovered per thymus. From this group of three, the thymus with the most definitive T cell phenotype is shown in (C). Cells were double stained with: a pool of FITC- and PE-conjugated isotype controls, anti-CD4PE/anti-CD8FITC, anti-CD3PE/anti-TCRαβFITC, anti-Thy1.2PE/anti-CD25FITC, and anti-CD4PE/anti-HSAFITC. Positive populations are boxed and percentages are indicated. Animals whose cell analysis is shown were 2 weeks of age.

La même étude par cytométrie en flux est réalisée sur les cellules de la moelle osseuse de souris mutantes à l’aide d’anticorps dirigés contre des marqueurs de différenciation des cellules hématopoïétiques.

Figure 3 : Hematopoietic populations in the bone marrow of Ikaros mutant mice

Bone marrow cells recovered from the two femurs of 2-week old Ikaros mutant mice (-/-; 0.5x106 to 1.5x106 cells) and of wild-type littermates (+/+; 1x107 to 2x107 cells) were analyzed with the following combinations of Mabs: anti-CD45PE/anti-CD43FITC (A); anti-CD45PE/anti-IgMFITC (B); anti-CD3PE/anti-Thy1.2FITC (C); anti-Thy1.2PE/anti-SCA-1FITC (D); anti-TER-119PE/anti-CD61FITC (E); and anti-Mac-1PE/anti-Gr-1FITC (F). Positive populations are boxed and percentages are shown.

Question 2. Interprétez les résultats obtenus à la Figure 3.

En l'absence de ganglions lymphatiques, la rate reste le seul véritable organe lymphoïde secondaire chez les souris mutantes. Les proportions des différentes populations hématopoïétiques sont analysées par cytométrie en flux.

Question 3. Interprétez les résultats de la Figure 4.



Figure 4 : Hematopoietic populations in the spleen of Ikaros mutant mice

After red blood were lysed with NH4Cl, cells from the spleen of 2-week-olf Ikaros mutant mice (-/-; 3x107 to 10x107 cells per animal) and wild-type littermates (+/+; 4x107 to 10x107 cells per animal) were examined with the following combinations of Mabs: anti-CD4PE/anti-CD8FITC (A); anti-CD3PE/anti-Thy1.2FITC (B); anti-Thy1.2PE/anti-SCA-1FITC (C); anti-CD45PE/anti-IgMFITC (D); anti-CD45PE/anti-CD43FITC (E); anti-TER-119PE/anti-CD61FITC (F); and anti-Mac-1PE/anti-Gr-1FITC (G). Positive populations are boxed and percentages are indicated.

Le nombre de cellules NK présentes dans la rate reste faible même chez les souris sauvages (2-5%). Afin d'identifier la présence de ces cellules chez les souris mutantes, des tests de cytotoxicité sont réalisés. Des dilutions de cellules spléniques de souris sauvages ou mutantes sont cultivées en présence d'IL2 pendant 48 à 72 h. Ces conditions de culture permettent de générer des cellules NK activées prêtes à lyser leurs cellules cibles (cellules YAC-1). Les résultats des expériences sont indiqués dans le tableau ci-dessous.

Question 4. Interprétez les résultats. D’après les résultats obtenus, que pouvez-vous déduire du rôle d'Ikaros dans la mise en place des lignages hématopoïétiques ?

Un nouveau lot de souris mutantes est obtenu par manipulation génétique. Ces souris mutantes synthétisent des molécules Ikaros délétées du domaine C-terminal codé par l'exon 7 du gène Ikaros. Ce domaine contient les motifs à doigts de zinc nécessaires à la dimérisation des molécules Ikaros et des motifs essentiels à l'activation de la transcription. Contrairement aux premières souris mutantes, les souris homozygotes pour cette nouvelle mutation peuvent vivre jusqu’à l’âge de 4 mois

La présence des lymphocytes B et de leur précurseur est analysée dans les tissus lymphoïdes de fœtus et de souris adultes âgées de 4 mois par double immunofluorescence en cytométrie de flux.



Figure 5 : Fetal and adult B cell development in Ikaros C -/- mice

Cells obtained from the embryonic day 16 (E16) fetal liver (A) and peritoneum (B), bone marrow (C), and spleen (D) of 4-week-old Ikaros C -/- mice and wild-type littermates were analysed with the following combinations of Mabs: anti-CD45PE/anti-CD43FITC (A); anti-CD5PE/anti-CD45RFITC (B); anti-CD45PE/anti-CD43FITC (C); anti-CD45PE/anti-IgMFITC (D). Positive stained populations are boxed and percentages are shown. Fetal liver pre-B cell precursors (CD45R+) and their progeny, peritoneal B-1a B cells (CD5+/CD45R+), were absent in Ikaros C -/- mice. Bone marrow pro-B cells and splenic B cells were also missing from all C -/- mice tested.

Question 5. Analysez et interprétez les résultats obtenus à la Figure 5.

Les sous-populations thymiques sont analysées par double immunofluorescence en cytométrie de flux à l'aide d'anticorps anti-CD4 et anti-CD8. Ces mêmes anticorps sont utilisés sur des cellules spléniques de souris âgées de 3 semaines.

Figure 6

Cytofluorometric analyses of 5-day-old and 3-week old animals is shown (G and H). At 5 days after birth, Ikaros C -/- thymi contain 100- to 300-fold fewer thymocytes than age-matched wild-type thymi. An increase in the proportion of CD4 single positive thymocytes is detected even at this early stage in thymocyte development (G). The increase in the proportion of CD4 single positive thymocytes persists in the adult C -/- thymus in which the total number of thymocytes has reached nearly normal levels (H). Single positive CD4 and CD8 thymocytes are exported to the spleen (I). Thymocytes and splenic populations were stained with FITC- and PE-conjugated isotype control antibodies (data not shown) or anti-CD4-PE and anti-CD8-FITC. Positively stained populations are boxed and percentages are indicated.

Question 6. Analysez et interprétez les résultats présentés à la Figure 6.

La proportion des lymphocytes Tγδ dans différents tissus est également analysée par cytométrie en flux.



Figure 7 Thymocyte (C) and splenic populations (D) depleted of CD4+ and CD8+ cells and lineage cells, respectively, were analysed for their γδ T cell content. γδ T cells were detected in the thymus of mutant mice but at significantly reduced levels. They were not present in the spleen in any appreciable number. Intestinal intraepithelial lymphocytes (E) were analysed for their αβ and γδ composition. The great majority of Ikaros C -/- IELs were αβ T cells. No appreciable numbers of γδ T cells were present.

Question 7. Interprétez les résultats présentés à la Figure 7.

Les pourcentages des cellules dendritiques thymiques et des cellules NK spléniques sont déterminés par cytométrie en flux chez les souris mutantes et sauvages.

Figure 8


De la même façon, les pourcentages des cellules des lignées érythroïdes et myéloïdes sont analysés dans le foie fœtal ainsi que dans la rate et la moelle osseuse des souris âgées de trois semaines.


Un anticorps polyclonal dirigé contre le domaine N-terminal des protéines Ikaros est utilisé en Western-blotting sur des extraits nucléaires provenant de cellules thymiques de souris mutantes ou sauvages âgées de 2 à 4 semaines.



Figure 9

Figure 10

Western blot analysis of nuclear extracts prepared from the thymus of 2- to 4-weekd-old mice revealed that C -/- mice (lane2) lack wild-type Ikaros isoforms (Ik-1 and Ik-2) and have a truncated Ikaros protein (Ik-M) that is present in a >100-fold lower concentration than the wild-type Ikaros isoforms (Ik-1 and Ik-2) produced in +/+ mice (lane 1). The antibody used was raised to the N-terminal domain of Ikaros proteins.

Question 10. Analysez les résultats obtenus à la Figure 10. A quoi peuvent correspondre les deux bandes (Aio) persistant sur le Western blot des souris mutantes C -/- ?

Question 11. Ces expériences confirment-elles l’hypothèse émise sur le rôle d’Ikaros lors de l’étude des premières souris mutantes ? Comment expliquez-vous la présence d'une différenciation T chez le deuxième lot de souris mutantes ?

Question 12. Indiquez sur le schéma de différenciation des lignées hématopoïétiques ci-dessous, où se situe l’intervention des gènes et des protéines Ikaros.





IF2005 TD-IF 3 : Immunité naturelle



Immunité naturelle

I. (D�après Lund, J. M., et al. (2004) PNAS 101:5598)

Les infections virales chez les mammifères mettent en jeu les voies d�activation de l�immunité innée impliquant notamment les TLR (Toll-like receptors).

Question 1. Rappelez les caractéristiques fonctionnelles des TLR. (5 lignes maximum)

La présente étude s�intéresse à la voie d�activation mise en jeu en réponse à l�infection par des virus à ARN simple-brin comme le VSV (vesicular stomatitis virus) et le virus de la grippe (influenza). Dans une première expérience, les auteurs mesurent par ELISA la production d�IFN-α par des cellules de moelle osseuse de souris de type sauvage (WT) ou invalidées pour le gène MyD88 (MyD88-/-) cultivées en présence de VSV ou de PolyI:C, un ARN double-brin synthétique. Dans un deuxième temps, une expérience similaire est réalisée à partir de populations de moelle osseuse triées comme indiqué. Les résultats sont montrés sur la Figure 1. Par ailleurs, des cellules de moelle osseuse incubées en présence d�ARN simple brin synthétique produisent des quantités comparables d�IFN-α à celles observées pour VSV chez les souris WT et MyD88-/-.

Figure 1 A : Des cellules de moelle osseuse de souris de type sauvage (WT) ou invalidées pour le gène MyD88 (MyD88-/-) ont été cultivées en présence de VSV ou de PolyI:C, un ARN double-brin synthétique, ou sans stimulus (Media). Après 18h de culture, l�IFN-α produit a été mesuré dans les surnageants de culture par ELISA.

B : La même expérience est réalisée à partir de populations triées de moelle osseuse (Total ; CD11c+B220- ; CD11c-B220+ ; CD11c-B220-).

N.B : La faible production d�IFN-α observée en réponse à polyI:C est néanmoins significative.

Question 2. A l�aide d�un tableau comparatif, rappelez le principe de l�ELISA et d�une autre technique permettant de mesurer la production de cytokines.

Question 3. Analysez ces résultats en comparant les voies d�activation mises en jeu par les ARN double-brin et simple-brin. (5 lignes maximum)

Question 4. Quelle population pensez-vous être activée par le VSV ? (5 lignes maximum)

De nombreux TLR sont exprimés par les cellules dendritiques. Etant donné que le mode d�infection du VSV implique un mécanisme d�endocytose, les auteurs ont porté leur attention sur TLR7 et TLR9 qu�on retrouve au niveau des endosomes. La réponse de cellules dendritiques de moelle osseuse ou de macrophages à différents stimulus a été étudiée chez des souris de type sauvage, Myd88-/-, ou invalidées pour TLR7 (TLR7-/-) ou TLR9 (TLR9-/-) (Figure 2).



Question 5. Analysez et commentez ces résultats. (5 lignes maximum)

Figure 2 A : Des cellules de moelle osseuse de souris de type sauvage (WT) ou invalidées pour TLR7 (TLR7-/-) ont été cultivées en présence de R848 (un ligand synthétique de TLR7), d�ADN CpG ou de HSV2 (un virus à ADN) ou sans stimulus (Media). Après 18h de culture, l�IL-12 et l�IL-6 produites ont été mesurées dans les surnageants de culture par ELISA.

B : Des cellules dendritiques de moelle osseuse (BM DC) ou des macrophages de souris de type sauvage (WT), TLR7-/-, invalidées pour le gène TLR9 (TLR9-/-), ou MyD88-/- ont été cultivées en présence de R848. Après 48h de culture, l�IL-6, l�IL-12 et le TNF-α produits ont été mesurés dans les surnageants de culture par ELISA.

Les auteurs étudient ensuite le rôle de TLR7 pour la production d�IFN-α en réponse aux virus VSV et influenza. La réponse de cellules dendritiques de moelle osseuse a été étudiée chez des souris de type sauvage, TLR7-/-, TLR9-/-, TLR3-/- ou Myd88-/- (Figure 3).



Figure 3 A : Des cellules dendritiques de moelle osseuse de souris de type sauvage (WT), TLR7-/-, TLR9-/- ou MyD88-/- ont été infectées par le virus VSV. Après 18h, l�IFN-α et l�IL-12 produits ont été mesurés dans les surnageants de culture par ELISA.

B : Des cellules de moelle osseuse de souris de type sauvage (WT), TLR3-/- (invalidées pour le gène TLR3), TLR7-/- ou MyD88-/- ont été cultivées en présence de virus influenza. Après 18h, l�IFN-α et l�IL-12 produits ont été mesurés dans les surnageants de culture par ELISA.

C : Des splénocytes de souris de type sauvage (WT), TLR7-/-, TLR3-/- ou MyD88-/- ont été cultivés en présence de R848, de virus VSV ou de PolyI:C. Après 18h de culture, les cellules sont analysées par cytométrie de flux avec un anticorps anti-CD69. Les histogrammes montrent le profil d�expression des cellules B220+. Les profils ombrés correspondent au témoin sans stimulus.

Question 6. Qu�apportent ces nouveaux résultats ? (10 lignes maximum)

Après liaison sur son récepteur membranaire, la particule virale VSV pénètre par endocytose ; après fusion avec un lysosome, l�environnement acide entraîne la fusion de la membrane virale avec la membrane du lysosome et la nucléocapside virale est libérée dans le cytosol. Afin de préciser la localisation cellulaire où a lieu l�activation de TLR7 par VSV, les auteurs étudient l�activation de cellules dendritiques de souris de type sauvage par VSV en présence de chloroquine, un inhibiteur de l�acidification des lysosomes (Figure 4).



Figure 4 A : Des cellules de moelle osseuse de souris de type sauvage ont été prétraitées pendant 2h en présence de milieu seul (Media) ou de concentrations croissantes de chloroquine comme indiqué. Les cellules ont alors été infectées par le virus VSV. Après 18h, l�IFN-α produit a été mesuré dans les surnageants de culture par ELISA.

B : Des cellules de moelle osseuse de souris de type sauvage prétraitées pendant 2h en présence de milieu seul (Media) ou de chloroquine (0,1 mM) ont été stimulées par les virus VSV, VSV-RSV-F, Influenza ou Sendai. Après 18h, l�IFN-α produit a été mesuré dans les surnageants de culture par ELISA. VSV-RSV-F est un virus VSV recombinant exprimant la protéine F du virus RSV (respiratory syncitial virus) qui permet la pénétration du virus par fusion avec la membrane plasmique de manière indépendante du pH ; VSV-RSV-F exprime toujours la protéine G de VSV impliquée dans la pénétration du virus par la voie lysosomale dépendante du pH. Le virus Sendai est un autre virus à ARN simple-brin qui pénètre exclusivement par fusion avec la membrane plasmique.

Question 7. Analysez soigneusement ces résultats. (5 lignes maximum)

Question 8. A l�aide d�un schéma récapitulatif, résumez la voie TLR activée par les virus à ARN simple-brin.

II. Le système du complément, qui peut être considéré comme un système immunitaire primitif sans spécificité fine pour un antigène particulier, comprend une trentaine de composés protéiques. Ces protéines interviennent dans deux voies de cascades enzymatiques : la voie classique et la voie alternative. Ces deux voies partagent les mêmes étapes terminales (cf. Figure 5). Les rôles et fonctions principaux de ce système sont :

1. Production d�anaphylatoxines (C3a et C5a) responsables de l�induction d�une réaction inflammatoire (par recrutement chimiotactique et activation des macrophages et des polynucléaires), de la contraction des muscles lisses, de l�augmentation de la perméabilité vasculaire ;

2. Fixation sur les micro-organismes de molécules (opsonines C3b, C4b) reconnues par les cellules phagocytaires ;

3. Formation du complexe de destruction membranaire (MAC) qui conduit à la lyse des micro-organismes.

Les molécules du complément appartiennent à plusieurs familles distinctes. Les molécules C3, C4 et C5 appartiennent à une même famille. Le clivage des molécules C3a et C4a à partir de C3 et C4 révèle une fonction thioester très réactive conduisant à la fixation sur le micro-organisme (opsonisation). La molécule C5 ne comporte pas cette fonction thioester. La molécule précurseur C4 comporte deux sites de clivage (β-α, α-γ) permettant la libération de trois sous-unités α, β et γ, alors que les molécules précurseurs C3 et C5 ne comportent qu�un site de clivage (β-α) conduisant à la libération de deux sous-unités seulement (Figure 6).



Figure 5 : Représentation schématique des voies classique et alternative et de l�étape terminale de la cascade du complément. Les étapes ne faisant pas intervenir les molécules C3, C4 et C5 ne sont pas représentées.

Figure 6 : Représentation schématique de la structure des molécules précurseurs des composants du complément C3, C4 et C5. La région hachurée représente la fonction thioester conservée entre les molécules C3 et C4.

La protéine α2-macroglobuline (α2M), appartient à la même famille que C3, C4 et C5. Elle est organisée en deux sous-unités et comporte la fonction thioester caractérisée sur C3 et C4.

La lamproie appartient au phylum des vertébrés sans mâchoire (Agnathes) dont la divergence d�avec les autres vertébrés (Gnathostomes) a eu lieu, il y a environ 450 millions d�années, très tôt après l�apparition des premiers vertébrés et avant l�embranchement des poissons cartilagineux et des poissons osseux.

Question 1. Tracez un arbre phylogénétique des vertébrés.

Dans cet exercice, on s�intéresse aux travaux d�une équipe qui a cloné et caractérisé des gènes de la lamproie appartenant à la famille C3/C4/C5/α2M et replacé ces gènes dans le contexte de l�évolution par duplication/divergence.

Question 2. Comment vous y prendriez-vous pour identifier le composant C3 du complément chez la lamproie sachant que les composants C3, C4, C5 et α2M de mammifères sont connus ?

Des amorces dégénérées sens (5�) et antisens (3�), consensus de la région thioester des molécules C3, C4 et α2M de mammifère, ont été dessinées. De l�ADNc de foie de lamproie a été amplifié par PCR à l�aide de ces amorces. Après clonage et séquençage des produits d�amplification, deux séquences ont été caractérisées, La1 et La2 (Figure 7) :



Figure 7 : Caractérisation de deux séquences de lamproie après amplification, clonage et séquençage d�ADNc de foie de lamproie avec des amorces consensus sens (5�) et antisens (3�) de la région thioester conservée sur les molécules C3, C4 et α2M.

L�analyse de la séquence La1 révèle 42%, 33% et 30% d�identité avec la région correspondante de C3, C4 et α2M alors que la séquence La2 présente 24%, 27% et 49% d�identité avec la région correspondante de C3, C4 et α2M.

Question 3. Comment l�amplification des séquences de lamproie s�effectue-t-elle alors que les amorces ont été dessinées à partir de séquences de mammifères ?

Ensuite, la séquence La1 sert de sonde ADN pour cribler une banque d�ADNc de lamproie afin de caractériser le gène entier correspondant à La1. Un clone d�ADNc est caractérisé. La séquence protéique prédite de 1660 acides aminés présente 31%, 22%, 23% et 16% d�identité avec les séquences protéiques C3, C4, C5 et α2M de mammifères. On note également que la distribution des résidus cystéine le long de la protéine est fortement conservée avec la protéine C3 de mammifère.

Question 4. Quelle(s) hypothèse(s) pouvez-vous faire quant à l�identité des séquences La1 et La2 caractérisées chez la lamproie ?

On note enfin que la protéine de lamproie identifiée par criblage présente des sites de coupures β-α et α-γ identiques à ceux de la protéine C4 de mammifère.

Question 5. Vos hypothèses sont-elles confirmées par cette dernière observation ?

Question 6. D�après vous, lequel des arbres phylogénétiques proposés ci-dessous est-il le plus vraisemblable pour rendre compte de l�évolution des gènes codant les molécules C3, C4 et C5 ?



IF2005 TD-IF 4 : Structure des Immunoglobulines et TCR



Structure des immunoglobulines et TCR

I. L'hybridome S1 a été obtenu en fusionnant les cellules d'un myélome non sécréteur avec les cellules spléniques d'une souris immunisée contre la phosphorylcholine (PC) couplé à de l'hémocyanine. S1 synthétise un anticorps d'isotype µ,κ. Après un nouveau clonage de l'hybridome S1, 30000 clones sont obtenus, l'un d'eux (U4) est particulièrement étudié.

Les cellules S1 ou U4 sont cultivées en présence de méthionine 35S. Les immunoglobulines sécrétées sont précipitées par un sérum de lapin anti-κ, puis réduites et déposées sur un gel SDS de polyacrylamide. L'autoradiographie de ce gel est présentée sur la Figure 1 :

Figure 1

Question 1. Proposer au moins deux hypothèses pour expliquer ces résultats.

La spécificité des immunoglobulines sécrétées par U4 est analysée par des tests d'hémagglutination. Une éventuelle activité anti-PC est recherchée vis-à-vis de la phosphorylcholine couplée aux globules rouges de mouton (PC-GRM). Les titres agglutinants obtenus sont présentés dans le Tableau 1 :

Tableau 1

Question 2. Ces nouvelles données permettent-elles d'étayer l'une des hypothèses formulées précédemment ?

Les cellules U4 sont cultivées en présence de méthionine 35S, puis lysées. Les immunoglobulines ainsi synthétisées sont précipitées par un anti-κ, réduites et déposées sur un gel SDS de polyacrylamide. La Figure 2 ci-dessous présente l'autoradiographie obtenue.

Question 3. Comment expliquer la présence des deux chaînes lourdes ? Est-ce compatible avec le caractère monoclonal des hybridomes ?



Figure 2

N.B. : La séquence partielle NH2-terminale des deux chaînes lourdes est identique au VH de S1.

II. Une protéine de myélome, de souris BALB/c, appelée TEPC15, et qui possède une spécificité anti-phosphorylcholine (PC), est injectée à une souris de souche A/He. Les splénocytes immuns sont fusionnés aux cellules d�un myélome non sécréteur de souris BALB/c. La spécificité des anticorps monoclonaux anti-T15 est analysée en inhibant l�interaction T15 radioactif/anticorps monoclonaux par d�autres anticorps monoclonaux ou des protéines de myélomes tous d�origine BALB/c (Tableau 2). Tableau 2

Question 1. Quelle peut être la spécificité de chaque anticorps monoclonal?

L�interaction T15 radioactif/anticorps 2E8 ou anticorps F6 est étudiée en présence de l�antigène PC ou de ce dernier couplé à la sérum albumine bovine (PC20-SAB). La Figure 3 résume les caractéristiques de ces inhibitions.

Question 2. Interpréter ces résultats.



Figure 3

Les quatre anticorps monoclonaux ont été utilisés pour tenter d�inhiber des plages d�hémolyses locales (PFC) obtenues en mélangeant in vitro des cellules de souris BALB/c anti-PC, de la PC couplée à des globules rouges de mouton et du complément. Les résultats sont présenté dans le Tableau 3.

Tableau 3 Anticorps inhibiteurs Nombre de PFC anti-PC/rate

- 120 000

S1 60 115 000

S1 04 117 000

2E8 800

F6 950

Question 3. Ces résultats sont-ils en accord avec la spécificité supposée de chaque hybridome ?

III. Des cellules de poulet, issues du sang, sont injectées à des souris. Après plusieurs jours, les cellules spléniques de ces souris sont fusionnées avec un myélome non-sécréteur afin d'obtenir des hybridomes. Deux anticorps monoclonaux (A1 et A2) sont particulièrement étudiés. Les lymphocytes périphériques du poulet sont étudiés, grâce à un analyseur de cellules (FACS), avec les anticorps couplés à des fluorochromes (Figure 1) :



Les lymphocytes périphériques sont radiomarqués à leur surface. Les cellules sont ensuite lysées en présence de détergent afin de solubiliser les membranes. Des expériences d'immunoprécipitation sont réalisées avec les anticorps monoclonaux insolubilisés et les produits immunoprécipités sont traités ou non avec du dithiothréitol (DTT) puis analysés en SDS-PAGE (Figure 2) :

La même expérience est réalisée avec un détergent doux (Figure 3) :

La capacité des anticorps A1 et A2 à stimuler les lymphocytes périphériques est analysée (Tableau 1) :

Agent stimulant

Incorporation 3H-thymidine (cpm)

A1 30 000

A2 25 000

ConA 200

Question 1. Quelle est la spécificité des anticorps A1 et A2 ?



IF2005 TD-IF 5 : Développement lymphocytaire,

Réarrangements TCR/Ig



Développement lymphocytaire ; Réarrangements TCR/Ig

I. (d�après Papavasiliou, F. et al. (1996) J.Exp.Med. 184:2025)

Les auteurs de cette étude ont examiné le rôle de différents composants du récepteur pré-BCR dans le développement des cellules B. Ils ont introduit plusieurs transgènes d�immunoglobuline (Ig) dans des souris RAG-/-, λ5-/- et double mutantes (RAG-/- λ5-/-). Tous les transgènes sont des gènes réarrangés sous contrôle du promoteur VH et de l�enhancer IgH. Les résultats sont présentés sur les figures suivantes :

Figure 1 : Analyse par FACS des cellules de la moelle osseuse de souris âgées de 6 à 8 semaines. A. Souris sauvages (WT) et mutantes (RAG-/-, λ5-/- et

double mutantes RAG-/- λ5-/-). B. Souris chez lesquelles on a introduit un transgène

codant la forme membranaire de la chaîne µ humaine (Igµ).

Les cellules ont été marquées par des anticorps anti-B220, anti-CD43 et anti-IgM humain (ne reconnaît que IgM humaine). Le pourcentage de lymphocytes présents dans chaque cadran est inscrit en haut et à droite pour les marquages B220/CD43.

Question 1. Quel est l�effet de l�introduction du transgène Igµ dans les mutants RAG-/-, λ5-/- et

RAG-/- λ5-/- ?

Question 2. Que suggèrent ces expériences quant aux éléments nécessaires à l�expression de la chaîne µ à la surface et quant à son effet sur le développement des cellules B ?

Question 3. Donner les raisons qui ont conduit à l�utilisation des souris mutantes RAG-/-, λ5-/- et double mutantes RAG-/- λ5-/-.

Question 4. D�après les résultats présentés aux Figure 3 et Figure 4 que peut-on conclure quant au rôle des chaînes légères dans l�assemblage, le transport et la fonction du récepteur pré-B ?



Figure 2 : Analyse de l�expression intracellulaire du transgène Igµ humain dans les cellules B220+CD43+ de la moelle. Après marquage avec les anticorps anti-B220 et anti-CD43, les cellules des souris utilisées à la Figure 1 ont été fixées, perméabilisées et marquées avec l�anticorps anti-IgM humain.

Figure 3 : Analyse du complexe pré-BCR par des expériences d�immunoprécipitation. Des lignées de précurseurs B immortalisées par le virus d�Abelson ont été obtenues à partir de la moelle de souris de type sauvage (WT), mutantes (RAG-/-), (λ5-/-) et (RAG-/- λ5-/-) ainsi que de souris mutantes exprimant le transgène Igµ humain : (mµRAG-/-), (mµλ5-/-) et (mµRAG-/- λ5-/-). Les complexes Ig ont été immunoprécipités avec un immunsérum anti-IgM humain et analysés par la technique de Westen blot. Les protéines ont été révélées avec des anticorps anti-IgM humain (hIgM) ; anti-Igα (Igα) et anti-Igβ (Igβ). s.f. : forme membranaire ; c.f. : forme cytoplasmique. Après surexposition, on voit apparaître sur un blot une bande correspondant à la forme membranaire (s.f.) de la protéine Igβ dans la 1ère piste (mµλ5-/-).

Figure 4 : Analyse par FACS des cellules de la moelle provenant de souris mutantes dans lesquelles on a introduit soit le transgène Igµ comme précédemment, soit un transgène YS:VV Igµ:Igβ codant pour une protéine chimérique Igµ-Igβ, soit un transgène IgM codant pour une immunoglobuline complète (Igµ/Igκ). Voir la légende de la figure 1 pour les détails expérimentaux. N.B. : après introduction des transgènes YS:VV Igµ:Igβ et IgM, on observe la présence de chaîne µ transgénique dans le cytoplasme des précurseurs de la moelle.

Question 5. Donner un titre qui résume les points essentiels de ces expériences



II. Rôle de Notch1 dans le développement T (d�après Wolfer, A. et al. (2002) Immunity 16:869)

Les protéines Notch sont des récepteurs transmembranaires intervenant dans les choix de différenciation cellulaire chez plusieurs organismes. Leurs domaines extracellulaires contiennent des motifs de type EGF (epidermal growth factor) impliqués dans des interactions avec leurs ligands. Le domaine intracellulaire est clivé lors de la reconnaissance du ligand et transféré dans le noyau où son hétérodimérisation avec RBP-Jκ (recombinaison signal sequence binding protein pour Jκ) convertit RBP-Jκ de sa forme répresseur en activateur de transcription ; ceci conduit à la transcription des gènes cibles.

Notch1, Notch2 et Notch3, comme les ligands Jagged1, Jagged2 et δ-like-4, sont exprimés sur les thymocytes et l'épithélium thymique. Pendant le développement lymphoïde, la signalisation par Notch1 est essentielle pour le choix de différenciation d�un précurseur bipotent T/B vers le lignage T ; son rôle dans les étapes postérieures du développement T (αβ vs. γδ ; CD4 vs. CD8) reste controversé. Les expériences présentées ci-dessous apportent des précisions quant au rôle de Notch1 aux différentes étapes du développement thymique.

Une souris Notch1lox/lox, obtenue précédemment a été croisée avec des souris trangéniques pour la recombinase Cre sous le contrôle des promoteurs de CD4 ou de p56lck. Les constructions utilisées sont schématisées sur la Figure 5. L�inactivation de Notch1 chez ces souris est étudiée par PCR dans différentes sous-populations thymiques comme montré sur la Figure 6.

Figure 5 : Constructions utilisées pour obtenir l�inactivation conditionnelle de Notch1 Des souris Notch1lox/lox ont été croisées avec des souris transgéniques exprimant la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur de CD4 (CD4-Cre) ou de p56lck (lck-Cre) (à droite). L�organisation génomique schématique du locus Notch1lox/lox est montré à gauche ; l�exon codant pour le peptide leader (rectangle noir) est flanqué de deux séquences loxP (triangles gris) suivies des exons codant pour les motifs EGF (rectangle gris). Les flèches indiquent la position des amorces utilisées pour détecter la délétion de la région de 3.5 kb contenue entre les deux sites loxP.

Question 1. Expliquer pour quelle(s) raison(s) ces différentes constructions ont été utilisées.

Question 2. Analyser et interpréter les résultats présentés à la Figure 6.



Figure 6 : Inactivation conditionnelle de Notch1 au cours du développement thymique La délétion de la région de 3.5 kb contenue entre les deux sites loxP a été déterminée par PCR (cf. position des amorces sur la Figure 5) pour les sous-populations thymiques indiquées (DN1�DN4 et DP), isolées chez des souris Notch1lox/lox (control), Notch1lox/lox x CD4-Cre (CD4-Cre), ou Notch1lox/lox x lck-Cre (Lck-Cre) souris. L'amplification de l�allèle Notch1lox/lox aboutit à un fragment de 350 bp (lox), tandis que l�allèle délété donne une bande de 470 bp (ko). Les thymocytes DN3 ont été triés en deux sous-populations précoces et tardives selon l�expression cytoplasmique pour la chaîne TCRβ (icTCRβ- ou icTCRβ+).

L�influence de Notch1 sur la différenciation thymique est ensuite étudiée chez les souris Notch1lox/lox x lck-Cre (dénommée Notch1-/- dans la suite de l�exercice) par comparaison aux souris Notch1lox/lox (control). Les résultats de l�analyse des sous-populations thymiques par cytométrie de flux chez ces souris sont présentés à la Figure 7.


Question 4. Quelle(s) sous-population(s) sont-elles affectées par l�invalidation de Notch1 chez les souris Notch1-/- ?

Figure 7 : Sous-populations thymiques chez les souris Notch1-/- et control (A) Une analyse de cytométrie de flux des thymocytes des souris Control (à gauche) ou Notch1-/- (à droite) est présentée pour les marqueurs CD4 et CD8. Les pourcentages de cellules CD4 SP, CD4+CD8+ (DP), CD8 SP, et CD4-CD8- (DN) sont indiqués dans chaque cadran. (B) Les nombres absolus de cellules ont été déterminés pour les thymocytes totaux et les différentes sous-populations de thymocytes décrites en (A), en plus des cellules ISP (CD4-CD8+CD3-) et les cellules Tγδ matures. Les écarts-types sont indiqués (n=20 pour chaque groupe).

Afin de préciser le point de blocage du développement thymique observé chez les souris Notch1-/-, la sous-population CD4-CD8- (DN) est plus particulièrement étudiée chez ces souris par comparaison aux souris Control et à des souris déficientes pour pTα (pTα-/-) ou TCRβ (TCRβ-/-). Les résultats sont présentés à la Figure 8 :



Figure 8 : Analyse phénotypique des cellules CD4-CD8- (DN) chez les souris Notch1-/- (A) Analyse en cytométrie de flux des thymocytes DN pour les marqueurs CD44 et CD25 chez les souris Control, Notch1-/-, pTα-/- et TCRβ-/-. La fenêtre dessinée met en évidence l�accumulation de thymocytes DN3 CD44intCD25bright. (B) Histogrammes des profils d�expression de CD25 pour la sous-population de thymocytes DN totale chez les souris Control (ligne pleine), Notch1-/- (en grisé), et pTα-/- (pointillé). (C) Nombres absolus de thymocytes CD44int

CD25bright chez les souris Control (gris clair) et Notch1-/- (gris foncé). Les écarts-types sont indiqués pour les souris Control (n=10) et Notch1-/- (n=13).


Question 6. A quel stade le blocage de la différenciation des thymocytes a-t-il lieu ?

La fréquence des réarrangements au niveau du locus TCRβ est étudiée au niveau de l�ADN génomique. Les résultats sont présentés sur la Figure 9 :

Figure 9 : Analyse des réarrangements TCRβ (A) L�ADN génomique de thymocytes DN3 triés de souris Control (C.) ou Notch1-/- (N1-/-) a été analysé par PCR pour la présence de réarrangements Dβ-Jβ, Vβ5.1-Jβ et Vβ8.2-Jβ. Les produits d�amplification ont été révélés par la technique de Southern blot à l�aide d�une sonde Dβ2-Jβ2.6. Le gène témoin Thy1 est révélé après PCR et hybridation avec une sonde Thy1. (B) Les thymocytes DN4 de souris Control ou Notch1-/- ont été triés pour l�expression cytoplasmique de la chaîne TCRβ (icTCRβ). Les réarrangements TCRβ ont été analysés comme précédemment pour les cellules DN4 des souris Control icTCRβ+ (C.TCRβ+), Notch1-/- icTCRβ+ (N1-/-TCRβ+) ou Notch1-/- icTCRβ- (N1-/-TCRβ-).


Question 8. Quel serait l�effet de l�introduction d�un transgène codant une chaîne TCRβ réarrangée chez les souris Notch1-/- ?



IF2005 TD-IF 6 : Présentation antigénique,

CPA/CMH



Présentation antigénique; CPA/CMH

I. Une série de transfections est réalisée à l'aide de différentes constructions dérivées du gène Kd de classe I dans des fibroblastes (H2k). La Figure 1 présente les différentes molécules pouvant être exprimées.

Figure 1

x = substitution en acide aminé

On se propose d'analyser la capacité de trois clones cytotoxiques (Cw1, Cw2, Cw3) à reconnaître les peptides A ou B présentés par les cellules transfectées. Ces deux peptides ne diffèrent que par un seul acide aminé. 2x103 cellules cibles marquées au 51Cr sont incubées avec différentes concentrations de peptide puis 2x104 cellules effectrices sont ajoutées. Après 6 heures d'incubation, les cellules sont centrifugées et la radioactivité contenue dans le surnageant est déterminée. La Figure 2 montre le pourcentage de lyse spécifique en fonction de la concentration de peptide utilisée :

Figure 2

Concentration des peptides A (!) ou B (") [log M]

Question 1. Quelle est la spécificité de chaque clone ? Peut-on déterminer la zone d'interaction de l'antigène de classe I avec le peptide ? Expliquer comment la spécificité de reconnaissance du clone Cw3 est modifiée quand la molécule transfectée est Kd2 ?

Question 2. Si l�on transfecte le gène codant pour la molécule Kd dans des cellules de fibroblastes H-2- (c�est-à-dire n'exprimant pas de molécule du CMH) aucune cytotoxicité n�est décelable. Pourquoi ?



II. Un clone "auxiliaire" de lymphocyte T (7B7), issu d'une souris BALB/c (H-2d), est obtenu contre le répresseur du bactériophage lambda. L'activation de ce clone est étudiée à l'aide de peptides dérivés du répresseur dans le test suivant : 5x104 cellules 7B7 sont mélangées à 5x104 cellules présentatrices d'antigènes en présence de différentes concentrations de peptide. Après 24h d'incubation, 50 µl de surnageant sont ajoutés à 104 cellules d'un clone T cytotoxique dépendant de l�IL2. L'incorporation de thymidine tritiée est ensuite déterminée. Les résultats sont présentés sur la Figure 3.

Figure 3

D�autre part, l'activation observée avec le peptide p15-26 est inhibée par un anticorps spécifique de I-Ad mais pas par un anticorps spécifique de I-Ed.

Dans une autre expérience, l'activation par le peptide p15-26 est effectuée en présence du peptide p12-24. Les résultats sont présentés sur la Figure 4.

Figure 4

Question 1. Interpréter ces résultats en précisant comment le peptide p12-24 peut inhiber l'activation du clone 7B7 ?

La capacité inhibitrice du peptide p12-24 est testée dans différents systèmes antigéniques de façon analogue à celle décrite ci-dessus. La compilation des résultats est présentée dans le Tableau 1. La fixation directe du peptide p12-24 sur les molécules de classe II est déterminée par dialyse à l'équilibre comme présentée sur le Tableau 2.

Question 2. Analyser l�ensemble de ces résultats



Tableau 1

Tableau 2

III. A partir d'une souris F1 (H-2d/k) infectée par le virus de l'influenza, divers clones T cytotoxiques, capables de lyser des cellules spléniques H-2d/k en présence de l'hémagglutinine (HA) du virus de l'influenza, sont obtenus. La spécificité de ces clones est analysée par des expériences de cytotoxicité à l'aide de deux peptides dérivés de l'hémagglutinine (HA252-271 et HA240-259) en présence ou non d'anticorps anti-Kk ou anti-I-Ad. Les cellules spléniques H-2d/k marquées au 51Cr en présence de concentrations variables de peptides sont mélangées aux différents clones T. Après 4 heures d'incubation à 37°C, le pourcentage de lyse spécifique est calculé. Les clones T peuvent être répartis en trois groupes (K, U et G) en fonction de leur spécificité comme illustré dans la Figure 5.

Question 1. Sachant que les clones K1 à K4 sont CD8+ et les clones U4, U5 et G1 sont CD4+, commenter les résultats présentés en précisant les éléments de restriction des clones T.

Afin d'analyser la capacité de présentation du peptide HA252-271 par les molécules du CMH, la lignée LK35.1 (I-Ad+ et Kk+) subit certains traitements exposés dans la légende du tableau suivant. Après traitement, les cellules LK35.1 sont utilisées comme cellules cible vis-à-vis des différents clones T dans des expériences de cytotoxicité similaires à celles décrites dans la Figure 5 ; les résultats sont présentés dans le Tableau ci-dessous.

Question 2. Interpréter les résultats du tableau. Proposer un schéma de présentation du peptide HA252-271 dérivé de l'hémagglutinine par la cellule LK35.1.



Figure 5

IV. Une lignée de souris mutantes est obtenue à partir de souris de la lignée consanguine B10.BR (H-2k). L'impact de cette mutation sur le système immunitaire est recherché.

Les souris B10.BR et mutantes sont immunisées contre l'ovalbumine (OVA). La production d'anticorps contre l'antigène est recherchée. Les résultats sont présentés dans le Tableau ci-dessous.

Souris B10.BR Souris mutante

Anticorps anti-OVA ++++ +

Question 1. Commenter.



Les cellules spléniques sont isolées à partir des deux types de souris. Grâce à un trieur de cellules, les cellules marquées avec un anticorps anti-IgM fluorescent sont séparées et utilisées dans les trois expériences décrites ci-dessous.

Expérience n°1 : Les cellules sont marquées à l'aide des anticorps monoclonaux anti-I-Ak ou anti-I-Ek couplés à un fluorochrome et analysées par cytofluorométrie.

Les résultats sont présentés sur la Figure 6. Figure 6 : Fluorescence des cellules spléniques IgM+. Les courbes présentées en trait fin correspondent à l'autofluorescence des cellules.

Expérience n°2 : Les cellules sont cultivées in vitro en présence de cystéine et de méthionine 35S puis lysées. Le lysat est incubé en présence de l'anticorps monoclonal anti-I-Ak insolubilisé. Les produits immunoprécipités sont ensuite chauffés à 95°C puis déposés sur un gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE). Après migration électrophorétique, le gel est séché et autoradiographié. Les résultats sont présentés sur la Figure 7. Figure 7 : Analyse par SDS-PAGE des protéines immunoprécipitées par anti-I-Ak.

Expérience n°3 : Les cellules sont marquées à leur surface à l'aide de l'iode 125 puis lysées. La même expérience d'immunoprécipitation que ci-dessus est réalisée. Cependant, les échantillons immunoprécipités sont ou non chauffés à 95°C avant d'être déposés sur le gel. Les résultats sont présentés sur la Figure 8.



Figure 8 : Analyse par SDS-PAGE des protéines immunoprécipitées par anti-I-Ak.

Question 2. Interpréter ces expériences en indiquant notamment pourquoi les cellules IgM+ ont été sélectionnées.

Deux hybridomes T (T1 et T2) obtenus contre le lysozyme de poulet sont testés pour leur capacité à produire de l'interleukine 2 (IL-2) en réponse à l'antigène. Celui-ci est présenté par des cellules spléniques provenant des deux types de souris. Les hybridomes T1 et T2 reconnaissent respectivement les peptides L46-61 et L112-129 présentés dans un contexte I-Ak. Les résultats sont résumés sur la Figure 9. Figure 9 : IL-2 produite après stimulation des hybridomes T1 et T2 par des cellules spléniques de souris B10.BR (!) ou mutantes (") en présence de lysozyme (en haut) ou du peptide correspondant (en bas).

Question 3. Décrire succinctement un test permettant de mesurer la production d�IL-2.

Afin de mieux comprendre l'observation ci-dessus, les expériences suivantes sont réalisées (Figure 10) :

# Dans une première expérience, les cellules spléniques des souris B10.BR ou mutantes sont marquées à leur surface à l'iode 125 et lysées. Avant immunoprécipitation à l'aide de l'anticorps monoclonal anti-I-Ak insolubilisé, les lysats sont incubés en présence du peptide L46-61. Les échantillons sont ensuite chauffés ou non comme précédemment et déposés sur gel de polyacrylamide.

# Dans la seconde expérience, les cellules spléniques des souris B10.BR ou mutantes sont incubées en présence du peptide L46-61 marqué à l'iode 125 puis lysées. Une immunoprécipitation à l'aide



de l'anticorps monoclonal anti-I-Ak est effectuée. L'échantillon immunoprécipité est déposé sur le gel de polyacrylamide sans chauffage.

Figure 10 : Analyse en SDS-PAGE des échantillons immunoprécipités par l'anticorps anti-I-Ak.

Question 4. Interpréter ces résultats en les corrélant avec ceux des expériences précédentes.

Question 5. Proposer un schéma simple rendant compte du défaut de présentation de l'antigène par les cellules de la souris mutante.

V. (Exercice II, Examen d�Immunologie Fondamentale - juin 2002. D�après MacDonald, A. S. et al. (2002) J. Immunol., 168:537 ; Dabbagh, K. et al. (2002) J. Immunol. 168:4524)

Les cellules dendritiques sont indispensables pour initier la réponse immunitaire adaptative en raison de leur grande capacité à phagocyter et dégrader les antigènes, et à présenter les peptides antigéniques sur des molécules de classe I ou II du CMH aux lymphocytes T naïfs.

Question 1. Pourquoi les cellules dendritiques sont-elles très efficaces pour activer des lymphocytes T naïfs ?

Les cellules dendritiques peuvent orienter la différenciation des lymphocytes T naïfs en lymphocytes T effecteurs ou mémoires de type Th1 ou Th2. Dans une première série d�expériences, les auteurs ont différencié des cellules dendritiques à partir de cellules de moelle osseuse de souris de type sauvage (WT) ou déficientes en CD40 (CD40-/-). Ces cellules dendritiques ont été soit non stimulées (DC) soit stimulées in vitro, pendant 18h avec des antigènes solubles d��ufs du parasite Schistosoma mansoni (SEA) ou avec la bactérie Propionibacterium acnes (PA) avant d�être caractérisées phénotypiquement (Figure 11).

Question 2. A quoi correspondent les 2 populations cellulaires retrouvées dans la Figure 11A, en absence de stimulation ?

Question 3. Que pouvez-vous conclure de ces résultats ?



Figure 11 : A : Expression du CMH de classe II et de CD11c à la surface des cellules B : Expression de CD80, CD86 et CD40 La courbe C correspond au contrôle isotypique, la courbe D aux cellules dendritiques non stimulées, et les courbes S et P aux cellules stimulées par SEA ou PA respectivement. C : Production d�IL-12 mesurée par ELISA

Les auteurs ont ensuite différencié in vitro des cellules dendritiques à partir de cellules de moelle osseuse des souris WT ou CD40-/- ayant reçu des injections de SEA ou de PA. Ces cellules dendritiques ont été injectées par voie intra-péritonéale à des souris de type sauvage. Après 7 jours, les lymphocytes de ces souris ont été mis en culture, pendant 3 jours, en absence ( ), ou en présence de SEA ( ) ou PA ( ). Les productions de cytokines ont été mesurées dans les surnageants de culture, par un test ELISA (Figure 12). Figure 12 : Pour chaque série sont figurées les concentrations d�interleukines produites en absence ( ), ou en présence de SEA ( ) ou PA ( ).

Question 4. Quel est le rôle respectif des différents pathogènes dans l�induction des réponses T auxiliaires chez les souris WT? Quel est le rôle de CD40 ? Quelles hypothèses permettent d�expliquer les résultats ?

Dans une deuxième série d�expériences, les auteurs ont immunisé par voie intrapéritonéale aux jours 1 et 14, des souris WT ou déficientes en TLR4 (« Toll-like receptor 4 ») (TLR4-Def) avec de



l�ovalbumine (OVA) en présence d�adjuvant. Comme expérience contrôle (Control), l�adjuvant seul a été injecté. On précise que la préparation d�adjuvant est dépourvue de LPS.

Les souris ont été ensuite re-stimulées par 3 administrations intra-nasales d�OVA, et les fluides broncho-alvéolaires (BAL), le plasma et les ganglions drainant les poumons ont été collectés. Différents tests ont été effectués sur ces prélèvements (Figure 13). Figure 13 : A. Nombre total de phagocytes (Mac), d�éosinophiles (Eos), de lymphocytes (Lym) et de polynucléaires (PMN) dans le BAL des souris WT et TLR4-Def. B. Taux plasmatiques d�IgE et d�IgG1 anti-OVA C. Productions d�IL-4, d�IL-5 et d�IFN-γ par les cellules des ganglions N. B. : Les astérisques indiquent des différences statistiquement significatives entre les souris WT et Def, pour un même paramètre.

Question 5. Analysez soigneusement ces résultats et émettez une ou plusieurs hypothèses quant au rôle de TLR4.

Question 6. A quoi peut-on attribuer le défaut de production d�IgE chez les souris TLR4-Def immunisées avec OVA ?

L�expérience suivante a consisté à étudier in vitro la capacité des cellules dendritiques des souris WT ou TLR4-Def stimulées avec la protéine cytochrome C de pigeon (PCC) à activer des lymphocytes T CD4+ naïfs. Des cellules T CD4+ exprimant un TCR-αβ transgénique spécifique d�un complexe CMH-peptide PCC ont été incubées pendant 10 jours en présence de cellules dendritiques de souris WT ou TLR4-Def préalablement stimulées avec PCC.

Les lymphocytes T ont ensuite été re-stimulés avec la protéine PCC (PCC) ou non (No antigen) en présence de splénocytes irradiés de souris WT de même haplotype, pendant 48h. La prolifération et la production des cytokines IL-4, IL-5 et IFN-γ des lymphocytes ont été mesurées (Figure 14).



Figure 14 : A. Prolifération des lymphocytes mesurée par incorporation de thymidine 3H

B. Productions de cytokines mesurées par ELISA

Les astérisques indiquent des différences statistiquement significatives entre les souris WT et TLR4-Def, pour un même paramètre.

A.

B.

Question 7. Sous la forme d�un schéma récapitulatif, indiquez pour chaque étape de l�expérience les événements cellulaires mis en jeu.

Question 8. Quelle information supplémentaire vous apporte la comparaison des expériences présentées à la Figure 14 ?



IF2005 TD-IF 7 : Sélection & Tolérance



Sélection ; Tolérance

I. Problème n°1 du sujet d�examen de juin 1997 1) Les souris de la lignée C57BL/6 (B6) sont d'haplotype CMH H-2b et sont I-E- à cause d'un défaut dans le gène I-Eα qui n'est pas exprimé dans cette lignée de souris. A partir de la lignée B6, on construit deux lignées de souris transgéniques : la lignée B6.Eαd exprime le transgène I-Eαd sous le contrôle d'un élément du promoteur des molécules du CMH de classe II ; la lignée B6.CD11cEαd exprime le transgène I-Eαd sous le contrôle du promoteur de la molécule CD11c qui s'exprime normalement dans toutes les cellules dendritiques chez la souris. A l'aide d'anticorps anti-CD11c et anti-I-Ed couplés à des fluorochromes, on réalise un marquage sur des coupes de thymus de ces différentes souris. Les résultats de ces marquages vous sont présentés dans les Tableau 1 et Tableau 2.

Tableau 1 : Marquage des coupes de thymus avec anti-CD11c

Tableau 2 : Marquage des coupes de thymus avec anti-I-E

Question 1. Quelles sont les molécules de classe II du CMH exprimées dans ces différentes souris ? Commentez ces résultats.

2) Dans certaines lignées de souris qui expriment la molécule I-E, les cellules T qui utilisent les segments Vβ5 ou Vβ11 pour produire leur chaîne β de TCR sont éliminées dans le thymus ; ceci correspond à un phénomène de sélection négative. On analyse les cellules spléniques des différentes souris avec des anticorps anti-Vβ5, anti-Vβ11, anti-CD4 et anti-CD8 couplés à des fluorochromes. Les résultats de ces marquages vous sont présentés dans le Tableau 3.



Tableau 3 : Pourcentage de cellules T spléniques exprimant Vβ5 et Vβ11 dans les souris

C57BL/6, B6.Eαd et B6.CD11cEβd.

Question 2. A quoi l�élimination des cellules T Vβ5+ et Vβ11+ est-elle liée ?

Question 3. Expliquez ces résultats. Que pouvez-vous en conclure quant aux cellules capables de réaliser la sélection négative dans le thymus ?

3) Les souris C57BL/6, B6.Eαd et B6.CD11cEαd ont été croisées avec des souris B6.I-A-/-. On obtient ainsi des souris B6.I-A-/-, B6.Eαd I-A-/- et B6.CD11cEαd I-A-/- qui n'expriment pas la molécule du CMH de classe II I-A. On réalise une expérience de marquage en cytométrie de flux sur les splénocytes et les thymocytes de ces souris à l'aide d'anticorps anti-CD4 et anti-CD8 couplés à des fluorochromes. Les résultats sont présentés en Figure 1.

Figure 1 : Marquage des splénocytes et les thymocytes des souris C57BL/6 (B6), B6 I-A-/-, B6.Eαd I-A-/- et B6.CD11cEαd I-A-/- avec anti-CD4 et anti-CD8.



Question 4. Analysez ces résultats en commentant l'influence des transgènes sur la proportion de cellules T CD4+ dans la rate et le thymus des différentes souris.

Question 5. Quelles informations concernant la sélection thymique pouvez-vous déduire de l'ensemble de ces expériences?

II. Problème n°2 du sujet d�examen de juin 1997 1) On introduit dans des ovocytes fécondés de souris C57BL/6 d'haplotype H-2b deux transgènes contenant les gènes réarrangés codant respectivement pour la chaîne α et la chaîne β du TcR d'un clone T spécifique du peptide 257-264 de l'ovalbumine (pOVA 257-264) présenté par H-2 Kb. Ce TcR utilise les segments de gènes Vα2 et Vβ5. Les souris transgéniques ainsi obtenues sont croisées avec des souris de même haplotype, déficientes en β2 microglobuline (β2m-/-). On obtient ainsi des souris TcRtg β2m+/- et des souris TcRtg β2m-/-. On réalise une expérience de marquage en cytométrie de flux avec des anticorps anti-CD4, anti-CD8, anti-Vα2 et anti-Vβ5 couplés à des fluorochromes sur les thymocytes des différentes souris non transgéniques et transgéniques. Le résultat de cette expérience vous est présenté sur la Figure 2 :

Figure 2 : Marquage des thymocytes de souris non transgéniques β2m+/- (non tg), TcRtg β2m+/- et TcRtg β2m-/- avec des anticorps anti-CD4, anti-CD8, anti-Vα2 et anti-Vβ5.

Question 1. Analysez ces résultats en comparant et en expliquant les proportions de cellules simple-positives CD8+ dans les thymus des différentes souris.



2) On peut cultiver in vitro des lobes thymiques f�taux. Ces cultures organotypiques de thymus f�tal (FTOC) permettent d'observer et de manipuler in vitro la maturation et la sélection des thymocytes. On réalise des cultures organotypiques de lobes thymiques f�taux de souris TcRtg β2m+/- et de souris TcRtg β2m-/-, en ajoutant ou non à ces cultures le peptide pOVA. Après 7 jours de culture, les lobes sont récupérés et broyés pour en extraire les thymocytes. Un marquage en cytométrie de flux avec des anticorps anti-CD4, anti-CD8 est réalisé sur les thymocytes extraits de ces cultures organotypiques (Figure 3).

Les mêmes cultures sont réalisées en présence de concentrations différentes du peptide pOVA. On mesure les nombres de thymocytes CD4+CD8+ récupérés à l'issue des 7 jours de culture en fixant arbitrairement à 1 les nombres de cellules observés dans les cultures en absence de peptide ajouté (Figure 4).

Question 2. Analysez l'ensemble de ces résultats. A quel processus est due la diminution du nombre de cellules DP ? Explicitez en particulier ce qui se produit dans les lobes TcRtg β2m-/-.

Figure 3 :

Marquage des thymocytes extraits des FTOC de souris TcRtg β2m+/- (+/- lobes) et de souris TcRtg β2m-/- (-/- lobes) avec des anticorps anti-CD4 et anti-CD8.

Figure 4 :

Nombre de cellules DP (CD4+CD8+) dans les lobes thymiques de souris TcRtg β2m+/- (β2m+/- lobes) et de souris TcRtg β2m-/- (β2m-/- lobes) cultivés en présence de concentrations croissantes de pOVA.



3) On réalise des expériences similaires en ajoutant, au lieu de pOVA, aux cultures organotypiques, deux autres peptides tous deux capables de se fixer sur Kb avec la même affinité que le peptide pOVA :

P-SER (S S Y S Y S S L) n'est jamais reconnu par le TcR transgénique.

E1 (E I I N F E K L) est un variant du peptide pOVA (S I I N F E K L).

Le résultat du marquage des thymocytes extraits des cultures organotypiques est montré à la Figure 5 :

Figure 5 :

Marquage des thymocytes extraits des FTOC de souris TcRtg β2m+/- (β2M +/-) et de souris TcRtg β2m-/- (β2M -/-) cultivés en absence ou en présence de 20 µM de P-SER ou E1 avec des anticorps anti-CD4, anti-CD8 et anti-Vα2.

Question 3. Quels rôles jouent les peptides P-SER et E1 sur la sélection des cellules T exprimant le TcR transgénique dans les lobes des souris TcRtg β2m+/- et TcRtg β2m-/- ?

4) Les cellules extraites des cultures organotypiques sont mises en culture in vitro en présence de cellules EL4 (qui expriment Kb) irradiées en absence (NONE) ou en présence de 10 nM du peptide pOVA (+ OVAp). Après 48h, on ajoute de la thymidine tritiée aux cultures et on évalue l'incorporation de thymidine tritiée 8 heures après. Les résultats sont présentés à la Figure 6 :

Figure 6 :

Réponse des thymocytes extraits des FTOC au peptide antigénique pOVA.

Question 4. Que pouvez-vous en conclure sur les aptitudes fonctionnelles des cellules T extraites des différents types de FTOC, et pourquoi ?

5) A partir des souris TcRtg β2m+, on dérive un clone T cytotoxique spécifique du peptide pOVA présenté par H-2 Kb. Ce clone T est mis en culture en présence de cellules EL4 préalablement marquées



au 51Cr, et des peptides pOVA, P-SER ou E1. La lyse des cellules EL4 est évaluée par mesure du 51Cr relargué dans le surnageant après 4 heures de culture. Le résultat de cette expérience est présenté en Figure 7.

Le même clone T est mis en culture en présence de cellules EL4 préalablement marquées au 51Cr et préalablement chargées avec 2 pM de pOVA, et les peptides P-SER ou E1. La Figure 8 montre le pourcentage d'inhibition de la lyse des cellules EL4 chargées en pOVA par les différents peptides.

Figure 7 Figure 8

Question 5. Que peut-on en conclure sur les propriétés des peptides pOVA, P-SER et E1 ?

Question 6. Que suggèrent l'ensemble de ces résultats quant à la nature des peptides impliqués dans le processus de sélection positive dans le thymus ?

III. (D�après Goodnow, C.C., et al. (1998) Nature 334:676 ; Adams, E., et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5687).

Trois types de souris transgéniques sont obtenues avec les transgènes présentés sur la Figure 9 :

Figure 9

Lysozyme

Chaîne légère

L VJ Cκ

Chaîne lourde

LVDJ Cµ µM Cδ δM

Les souris Lys-Tg possèdent le transgène lysozyme qui s'exprime de façon ubiquitaire dès le stade embryonnaire. Les souris Ig-Tg possèdent les transgènes codant les chaînes lourde et légère d�un anticorps anti-lysozyme. Les souris double-transgéniques (Dbl-Tg) possèdent l'ensemble des transgènes.

La réponse contre le lysozyme est étudiée dans des souris Lys-Tg, dans les lignées C57BL/6 (B6) ou C57BL/6 x CBA. Les souris sont immunisées avec le lysozyme seul ou le lysozyme couplé à des globules rouges de cheval (GRC). Après immunisation, le titre anticorps anti-lysozyme est déterminé



ainsi que la capacité des lymphocytes ganglionnaires à proliférer en présence de cellules présentatrices d'antigène et de lysozyme (Tableau 4).

Question 1. Expliquer la différence de comportement entre les souris B6 et B6 x CBA ainsi que l'effet du transgène dans ces souris.

L'expression des transgènes d�immunoglobuline est étudiée dans les souris Ig-Tg ou Dbl-Tg par immunofluorescence sachant que les transgènes proviennent d'un hybridome issu de BALB/c (Igha) et que les souris B6 sont d'haplotype Ighb.

Souris immunisées

Antigène immunisant

Titre anticorps en µg/ml

Incorporation thymidine (cpm)

B6 Lysozyme <1 2 000 Lysozyme-GRC 1 000 4 000 B6 Lys-Tg Lysozyme <1 2 200 Lysozyme-GRC <1 1 800 B6 x CBA Lysozyme 1 200 40 000 Lysozyme-GRC 1 500 48 000 B6 x CBA Lys-Tg Lysozyme <1 1 800 Lysozyme-GRC <1 1 900

Tableau 4

Figure 10

Question 2. Analyser les résultats présentés sur la Figure 10 qui illustre les analyses de fluorescence des cellules spléniques provenant de souris B6, transgéniques ou non.

La sécrétion spontanée d'IgMa ainsi que le nombre de plages de lyse anti-lysozyme sont évalués dans les souris Ig-Tg et Dbl-Tg (Tableau 5).



Souris

IgMa (µg/ml)

Nombre de plages de lyse anti-lysozyme par rate

B6 Ig-Tg 40 9 450 B6 Dbl-Tg 2 <100

Tableau 5

Question 3. Ces résultats sont-ils en accord avec l'analyse d'immunofluorescence présentée à la Question 2 ? Expliquer.

Des expériences de transfert de cellules sont effectuées dans des souris receveurs B6 irradiés. 105 cellules spléniques de souris non-immunisées normales ou transgéniques sont transférées avec 5.106 cellules spléniques de souris B6 ayant été immunisées contre des globules rouges de cheval. Après immunisation avec du lysozyme-GRC, le titre sérique anti-lysozyme est déterminé dans les souris receveurs (Tableau 6).

Cellules transférées 105 cellules

5.106 cellules �sensibilisées aux GRC�

Antigène lysozyme-GRC

Titres anticorps anti-lysozyme

B6 B6 - <1 B6 Ig-Tg B6 - <1 B6 Dbl-Tg B6 - <1 B6 B6 + <1 B6 Ig-Tg B6 + 40 B6 Dbl-Tg B6 + <1

Tableau 6

Question 4. Quelle est la nature des cellules lymphocytaires impliquées dans la non-réponse au lysozyme des souris double-transgéniques ?



IF2005 TD-IF 8 : Cytokines & Chimiokines



Cytokines ; Chimiokines

I. (D'après Förster, R. et al. (1999) Cell, 99:23)

Dans le but d�étudier la régulation de la circulation des leucocytes dans l'organisme, des souris déficientes pour le récepteur CCR7 de chimiokine ont été générées par recombinaison homologue. Dans tous les cas, les animaux mutés sont viables et fertiles. On se propose d�étudier les conséquences de la non fonctionnalité du gène codant pour CCR7 en établissant un phénotype précis des souris mutées, d'attribuer à CCR7 une(des) fonction(s) et d�établir un modèle de régulation des mouvements leucocytaires en particulier au niveau des organes lymphoïdes secondaires.

Chez les souris CCR7-/-, la dissection des principaux organes lymphoïdes secondaires montre des ganglions lymphatiques et des plaques de Peyer de petites tailles alors que les rates sont généralement très volumineuses. Pour étudier la distribution tissulaire des lymphocytes T au sein de ces organes, des expériences de double marquage sont réalisées à l'aide d'anticorps (AC) anti-CD4/anti-CD8 ou anti-CD3/anti-CD62L couplés à des fluorochromes. Les lymphocytes sont isolés à partir du sang ou des organes lymphoïdes de souris sauvages (+/+) ou déficientes en CCR7 (-/-). La Figure 1 montre les résultats des analyses de cytométrie en flux (FACS).

Figure 1 PBL : lymphocyte du sang péri-phérique ; SPL : rate ; BM : moelle osseuse ; MLN : ganglions lymphatiques mésentériques ; PLN : ganglions lymphatiques périphériques Il est précisé que seules les cel-lules CD3+ sont analysées sur la Figure 1b et que les cellules CD62L+ expriment la L-sélectine et sont majoritairement des lym-phocytes T naïfs.

Question 1. Commentez l�ensemble des résultats.

Afin de compléter cette analyse, les cellules extraites des ganglions lymphatiques de souris sauvages (+/+) ou déficientes en CCR7 (-/-) sont marquées avec des AC couplés à des fluorochromes et spécifiques des lymphocytes B. L'analyse par FACS du double marquage anti-IgD/anti-IgM de la population cellulaire B220+ est montrée sur la Figure 2.



Figure 2

Lorsque l'expérience décrite ci-dessus est renouvelée à partir de cellules extraites de la rate ou du sang, aucune différence significative de marquage n'est observée entre souris sauvages ou mutantes CCR7-/-.

Question 2. Interprétez les résultats obtenus. Que se produit-il dans les ganglions lymphatiques des souris mutantes CCR7-/-? Proposez une (des) expériences(s) qui permettrait(ent) de confirmer ces résultats.

De l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) est appliquée à forte concentration sur des portions de l�épiderme du thorax et de l'abdomen de souris sauvages (+/+) ou mutantes CCR7 (-/-). Après 24 heures de traitement, les ganglions lymphatiques de drainage sont prélevés (ganglions lymphatiques inguinaux, axillaires et brachiaux) et les cellules extraites des organes sont analysées par FACS. Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 3 ; les pourcentages moyens des cellules contenues dans le contour d'intérêt de la Figure 3a sont établis avec précision sur la Figure 3b.

Figure 3

Question 3. D�après les propriétés morphologiques des cellules contenues dans le contour

d�intérêt de la Figure 3a quel est le type cellulaire concerné par l�analyse ? Proposez une expérience permettant de vérifier votre interprétation. Que se passe-t-il chez les souris mutantes CCR7 ?

Les lymphocytes T (Thy-1+) et B naïfs (IgD+) fluorescents, issus de souris sauvages ou mutantes CCR7-/- sont injectés à des animaux sauvages (Figure 4a et b) ou mutants CCR7-/- (Figure 4c et d). Cinq heures après le transfert cellulaire, les animaux receveurs sont sacrifiés, saignés et leurs principaux organes lymphoïdes secondaires sont prélevés. Les proportions de lymphocytes T et B fluorescents provenant des animaux donneurs sont déterminées par FACS et les résultats de l�analyse sont montrés sur la Figure 4.

Question 4. Dans quel but réalise-t-on ces expériences de transfert ? Interprétez les résultats des Figure 4a et b.



Question 5. Pourquoi réalise-t-on les expériences inverses de transfert décrites sur les Figure 4c et d ? Quelle conclusion peut-on émettre ?

Figure 4

PBL: lymphocytes du sang péri-phérique ; SPL : rate ; SLN : ganglions lymphatiques subman-dibullaires ; ALN : ganglions lymphatiques axillaires ; ILN: ganglions lymphatiques ingui-naux ; MLN : ganglions lymphati-ques mésentériques ; PP : pla-ques de Peyer.

L�application cutanée d'une forte dose de FITC au niveau du thorax et de l�abdomen de souris sauvages (+/+) ou mutantes CCR7 (-/-) est réalisée (expérience a). L�induction d'une réaction d�hypersensibilité retardée (HR) est d'autre part étudiée en injectant de l�hémocyanine (KLH) par voie sous-cutanée aux animaux sauvages ou mutants CCR7-/- (expérience b). Après 4 jours, la réaction est révélée par application d�une faible quantité de FITC (expérience a) ou par l�injection sous-cutanée de KLH (expérience b) dans un territoire cutané différent de celui utilisé lors de l�étape de sensibilisation. On mesure à 24 heures le diamètre de l�érythème et de l�induration. Les résultats obtenus sont décrits sur la Figure 5.

Figure 5

D/A: Dibutylphtalate/Acétone

Question 6. Rappelez brièvement les différentes étapes provoquant l�inflammation locale d�un tissu. Pourquoi réalise-t-on ces expériences ? Que permettent-elles de confirmer ?

Les souris sauvages (+/+) ou mutantes CCR7 (-/-) sont immunisées avec 100 µg de DNP-KLH, puis rappelées au bout de 3 semaines avec le même antigène administré en quantité équivalente. La cinétique de la réponse anti-DNP est établie en quantifiant par ELISA les différents isotypes produits dans le sérum des animaux sauvages (symboles noirs) ou mutants CCR7-/- (symboles clairs). La Figure 6 montre le résultat de cette analyse.

Question 7. Interprétez les résultats obtenus. Que peut-on en conclure quant aux rôles attribués au récepteur CCR7 ?



Figure 6

II. (Examen d�Immunologie Fondamentale - septembre 2002. D�après Sallusto, F. et al. (1997) Science 277:2005 ; Lloyd, C.M. et al. (2000) J.Exp.Med. 191:265.)

La régulation de la migration des leucocytes est un processus complexe qui implique la participation de molécules d�adhésion comme les sélectines et les intégrines, ainsi que des chimiokines et leurs récepteurs.

L�action combinée des molécules d�adhésion et des chimiokines gouverne la migration des cellules du système immunitaire vers différents sites anatomiques (moelle osseuse, thymus, sang, peau, lymphe, organes lymphoïdes secondaires�).

Il existe deux catégories de lymphocytes T effecteurs, les lymphocytes de type « Th1 » et les lymphocytes de type « Th2 ».

Question 1. Rappelez, à l�aide d�un tableau comparatif synthétique, les caractéristiques principales de ces deux sous-populations de lymphocytes T.

Les cellules « Th1 » et « Th2 » ne migrent pas vers les mêmes tissus. On constate que les sites où ont lieu les réactions allergiques contiennent des cellules « Th2 » en plus de polynucléaires éosinophiles (PNE) et basophiles (PNB).

On sait par ailleurs que la chimiokine Eotaxine est produite par les cellules épithéliales et les phagocytes. Elle est un chimio-attractant pour les PNE et les PNB qui expriment CCR3, le récepteur de l�Eotaxine.

L�objectif des expériences suivantes est de comprendre par quel mécanisme les lymphocytes « Th2 » sont attirés dans les sites de réactions allergiques cutanées.

Expérience 1 : Des expériences préliminaires ont permis de démontrer que dans le sang adulte, environ 1% des lymphocytes T expriment CCR3 (ceci n�est pas vrai dans le sang de cordon ombilical)

- A l�aide d�anticorps monoclonaux anti-CCR3 et anti-CD3 couplés à un fluorochrome, on marque les cellules du sang adulte ou des lignées dérivées de ces cellules, et on analyse par cytométrie de flux quelles cellules sont marquées par ces anticorps. Les résultats sont présentés sur la Figure 7 (cadrans A, B et E).



- On utilise deux méthodes pour mesurer les cytokines produites par ces cellules : on dose les cytokines IL-4, IL-5 et IFN-γ dans les surnageants cellulaires par un test ELISA, et la production d�IL-4 et d�IFN-γ par un marquage intracellulaire des cellules des fenêtres R1 et R2 (Figure 7A). Les résultats sont présentés sur la Figure 7 (cadrans C, F, G, D et H).

Figure 7 A. Expression de CD3 et CCR3 par les cellules du sang B. Expression de CCR3 par la lignée polyclonale issue des

cellules de la fenêtre R1 (lignée R1) E. Expression de CCR3 par la lignée polyclonale issue des

cellules de la fenêtre R2 (lignée R2) C. Production d�IL-4, d�IL-5 et d�IFN-γ (mesurée par test

ELISA) par les cellules de la lignée R1 F. Production d�IL-4, d�IL-5 et d�IFN-γ (mesurée par test

ELISA) par les cellules de la lignée R2 D. Production des cytokines (IL-4 et IFN-γ) intracellulaires par

les cellules de la lignée R1 G. Production des cytokines (IL-4 et IFN-γ) intracellulaires par

les cellules de la lignée R2 H. Production des cytokines (IL-4 et IFN-γ) intracellulaires par

des cellules triées sur la lignée R2 qui expriment CCR3

N.B. : Sur les cadrans B et E, la ligne pointillée correspond au marquage avec un anticorps contrôle de même isotype que l�anticorps anti-CCR3 (ligne grisée). Sur le cadran E, la ligne noire correspond au marquage avec l�anticorps anti-CCR3 pour les cellules étudiées dans le cadran H.

Question 2. Comment les marquages membranaires et intracellulaires sont-ils effectués ?

Question 3. Quelles sont les cellules qui expriment le récepteur CCR3 ?

Question 4. Quelles conclusions pouvez-vous tirer de l�ensemble de ces expériences ?

Expérience 2 : On cherche à déterminer les facteurs qui induisent l�expression de CCR3. Pour cela, des lymphocytes T naïfs, provenant de sang de cordon ombilical, n�exprimant pas CCR3, sont mis en culture avec de la PHA, un activateur polyclonal des lymphocytes T :

- soit en présence d�IL-12 et d�anticorps anti-IL-4 ce qui permet aux lymphocytes de se différencier en cellules « Th1 »



- soit en présence d�IL-4 et d�anticorps anti-IL-12 ce qui permet aux lymphocytes de se différencier en cellules « Th2 »

Les résultats sont présentés sur la Figure 8 :

Figure 8 A. Détection des cytokines intracellulaires IL-4 et IFN-γ par

les cellules cultivées dans des conditions de polarisation Th2

B. Expression de CCR3 par les cellules cultivées dans des conditions induisant des Th2.

E. Détection des cytokines intracellulaires IL-4 et IFN-γ par les cellules cultivées dans des conditions induisant des Th1

F. Expression de CCR3 par les cellules cultivées dans des conditions de polarisation Th1

N.B. : Sur les cadrans B et F, la ligne pointillée correspond au marquage avec un anticorps contrôle de même isotype que l�anticorps anti-CCR3 (ligné grisée).

Question 5. Quels éléments nouveaux ces expériences apportent-elles ?

Expérience 3 :

On sait que les cytokines IFN-α et TGF-β peuvent interférer avec la différenciation Th2. On cherche à savoir si ces cytokines vont également interférer avec l�acquisition de l�expression de CCR3.

Des lymphocytes T de sang de cordon ombilical ont été cultivés en présence d�IL-4 et d�anti-IL-12, avec de l�IFN-α ou du TGF-β. Les résultats sont présentés sur la Figure 9.

Question 6. Quels sont les effets respectifs de l�IFN-α et du TGF-β sur l�induction de la polarisation Th1 et Th2, et sur l�acquisition de CCR3 ?

Question 7. Quelle(s) hypothèse(s) pouvez-vous émettre sachant que l�Eotaxine est sur-exprimée dans les sites de réactions allergiques ?

Figure 9 A. Détection des cytokines intracellulaires IL-4 et IFN-γ par

les cellules cultivées avec IL-4 et anti-IL12 B. Détection des cytokines intracellulaires IL-4 et IFN-γ par

les cellules cultivées avec IL-4, anti-IL12 et IFN-γ C. Détection des cytokines intracellulaires IL-4 et IFN-γ par

les cellules cultivées avec IL-4, anti-IL12 et TGF-β D. Expression de CCR3 par les cellules cultivées avec IL-4 et

anti-IL12 E. Expression de CCR3 par les cellules cultivées avec IL-4,

anti-IL12 et IFN-γ F. Expression de CCR3 par les cellules cultivées avec IL-4,

anti-IL12 et TGF-β

B. : Sur les cadrans B et F, la ligne pointillée correspond au marquage avec un anticorps contrôle de même isotype que l�anticorps anti-CCR3 (ligné grisée).



Expérience 4 : Il a également été montré que CCR4, le récepteur de la chimiokine MDC, produite par les macrophages, était exprimé par les lymphocytes Th2 et non pas Th1. On s�intéresse ici aux rôles fonctionnels respectifs des couples Eotaxine/CCR3 et MDC/CCR4 dans le recrutement des lymphocytes Th2 sur les sites de réactions allergiques dans un modèle de maladie respiratoire allergique :

- Les lymphocytes T d�une souris transgénique pour le TCR-α/β DO11.10 spécifique du peptide 323�339 de l�ovalbumine de poulet (OVA) présenté par I-Ad, sont cultivés en présence d�IL-12 et d�anticorps anti-IL-4 pour obtenir des cellules polarisées de type Th1, ou en présence d�IL-4 et d�anticorps anti-IL-12 pour obtenir des cellules polarisées de type Th2 ;

- 2.106 cellules polarisées Th1 ou Th2 sont injectées par voie intraveineuse à des souris BALB/c (H-2d) ;

- Les souris BALB/c reçoivent alors une injection quotidienne de l�antigène OVA (ou du PBS pour les souris contrôles) par voie aérienne ;

- Les souris sont sacrifiées aux jours 4 ou 7 après le transfert cellulaire et l�intensité de l�inflammation est déterminée dans les lavages broncho-alvéolaires (BAL) et les tissus pulmonaires (cf. Figure 10) ;

- Les résultats sont présentés sur les Figure 11 et Figure 12.

Figure 10

Figure 11

i. Numération des éosinophiles (barres noires) et basophiles (barres blanches) récupérés dans les BAL des souris BALB/c ayant reçu une injection de cellules effectrices transgéniques polarisées Th1 ou Th2, suivie d�injections quotidiennes par voie aérienne de l�antigène OVA. Les résultats sont donnés aux jours 4 et 7 après l�injection des cellules effectrices.

ii. Pourcentage d�éosinophiles (barres noires) et basophiles (barres blanches) dans les infiltrats cellulaires observés au niveau des tissus pulmonaires pour les mêmes conditions que ci-dessus (i).

Figure 12 esure par ELISA de la production de

cytokines dans les BAL des souris ayant reçu des cellules polarisées Th1 (cadrans grisés) ou Th2 (cadrans blancs), et ayant subi un challenge avec l�antigène OVA (barres grisées) ou du PBS (barres blanches).

B. : Chaque résultat correspond à la moyenne (± écart-type) des mesures faites pour un groupe de cinq souris au jour 4 après l�injection des cellules effectrices..



Question 1. A l�aide d�un tableau comparatif, analysez soigneusement ces résultats ; en particulier, mettez en évidence les différences observées chez les souris ayant reçu des cellules polarisées Th1 ou Th2.

Expérience 5 : Chez les souris ayant reçu des cellules polarisées Th1 ou Th2, on mesure, au niveau des infiltrats pulmonaires, l�expression des chimiokines Eotaxine et MDC, ainsi que celle de leur récepteur CCR3 et CCR4 (Figure 13C). Par ailleurs, les proportions de cellules Th2 exprimant CCR3 ou CCR4 au niveau des tissus pulmonaires présentant une réaction allergique sont déterminées (Figure 13D).

Figure 13 C. L�expression des récepteurs CCR3 et CCR4, et de leur ligand respectif, Eotaxine et MDC, a été déterminée par PCR

sur l�ADNc synthétisé à partir de l�ARN de poumons de trois souris ayant reçu des cellules polarisées Th1 ou Th2. Les niveaux d�expression sont normalisés par rapport à l�expression du gène domestique GAPDH.

D. Les proportions de cellules Th2 exprimant CCR3 (cercles pleins) ou CCR4 (cercles vides) au niveau des tissus pulmonaires présentant une réaction allergique ont été déterminées par comptage des cellules présentes aux niveau des infiltrats pulmonaires marquées par l�anticorps anti-clonotypique KJ126 dirigé contre le TCR DO10-11 et exprimant CCR3 ou CCR4.

Question 2. Analysez ces résultats.

Question 3. Quelle(s) hypothèse(s) pouvez-vous émettre quant au rôle respectif des chimiokines Eotaxine et MDC ?

Expérience 6 : Dans une dernière série d�expériences, des souris ayant reçu une injection de cellules polarisées Th2 ou Th1 reçoivent, 30 minutes avant chaque injection quotidienne d�antigène OVA, une injection d�anticorps anti-Eotaxine ou anti-MDC ou d�anticorps témoin :

- Le pourcentage de cellules CD4+ reconnues par l�anticorps KJ126+ est évalué aux jours 4 et 7. On notera que le nombre de cellules CD4+ total dans les infiltrats reste constant. Les résultats sont présentés sur la Figure 14 A et B.

- Chez les souris ayant reçu une injection de cellules polarisées Th2, le nombre d�éosinophiles au niveau des infiltrats pulmonaires ainsi que les niveaux de production d�IL-4 et IL-5 dans les BAL sont mesurés



A.

B.

C.

D.

Figure 14 A-B. Pourcentage de cellules CD4+ spécifiques de l�antigène OVA présentes dans les infiltrats pulmonaires de souris traitées

avec un anticorps anti-Eotaxine ou anti-MDC (barres hachurées) ou un anticorps contrôle (barres blanches) après transfert de cellules polarisées Th2 (A) ou Th1 (B).

C-D. Nombre d�éosinophiles par champ histologique (hpf) dans les infiltrats pulmonaires (C) et production de cytokines dans les BAL (D) de souris traitées avec un anticorps anti-Eotaxine, au jour 4, ou avec un anticorps anti-MDC, au jour 7 après transfert de cellules polarisées Th2 (barres hachurées). Les barres blanches correspondent au traitement avec l�anticorps contrôle.

Question 4. Analysez ces résultats.

Question 5. Ces derniers résultats vous permettent-ils de préciser vos hypothèses ?

III. (D'après Stein, J. V. et al. (2000) J. Exp. Med, 191:61)

Les lymphocytes T naïfs expriment le récepteur CCR7 dont un des ligands SLC (secondary lymphoid organ chemokine) est produit de façon constitutive au niveau des organes lymphoïdes secondaires. Récemment, des expériences réalisées chez les mutants plt/plt (paucity of lymph node T cells) suggèrent fortement l'implication de la chimiokine SLC dans la migration des cellules T.

Dans le but de démontrer le rôle in vivo de SLC, des cellules TGFP sont injectées à des animaux receveurs sauvages ou mutants plt/plt. Les cellules TGFP proviennent de souris transgéniques dont tous les lymphocytes T naïfs sont colorés par la GFP (green fluorescence protein). Deux heures après le transfert, les lymphocytes des animaux receveurs sont recueillis, analysés par FACS et les résultats obtenus sont montrés sur la Figure 15.



Figure 15

Question 1. Interprétez l�ensemble des résultats. Que permettent-ils de vérifier ?

Les conditions expérimentales décrites ci-dessus sont reproduites. Deux heures après le transfert, les cellules TGFP sont détectées chez les animaux receveurs sauvages (+/+) ou mutants plt/plt par microscopie intravitale à épifluorescence. Les images analysées permettent de déterminer les fractions et les fréquences de lymphocytes roulant le long de la paroi endothéliale des veinules post capillaires (HEV : high endothelial venule) (Figure 16A et B) ou de lymphocytes adhérant à la paroi des HEV (Figure 16C et D).

Figure 16

Question 2. Interprétez l�ensemble des résultats. Que peut-on en conclure ?

Les cellules TGFP, traitées avec de fortes concentrations de chimiokines SLC ou SDF-1α (stroma cell derived factor ; ligand du récepteur CXCR4), sont injectées aux animaux receveurs sauvages. Deux



heures après le transfert, les fractions et les fréquences de cellules TGFP roulant ou adhérant à la paroi des HEV sont déterminées par microscopie intravitale. Les résultats obtenus sont décrits sur la Figure 17.

Figure 17

Question 3. Quel est l�effet du traitement des cellules TGFP par les chimiokines ? Que démontre-t-on à travers cette expérience ?

Les souris plt/plt reçoivent des injections sous-cutanées de SLC ou de SDF-1α. Trente minutes après l�injection, les ganglions lymphatiques drainant le point d'injection sont préparés chirurgicalement pour l�observation en microscopie intravitale. Les cellules TGFP sont détectées dans les ganglions 90 minutes après leur transfert dans les animaux plt/plt receveurs non injectés (+), injectés par SLC (!) ou par SDF-1α (!). Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 18.

Figure 18

Question 4. Interprétez l�ensemble des résultats. Quel rôle peut-on attribuer à SLC ?



IF2005 TD-IF 9 : Activation, Fonctions effectrices



Activation ; Fonctions effectrices

I. (D�après K. Tamada et al. (2000). J. Immunol. 164 :4105-4110 ; Y. Zhai et al. (1998). J. Clin. Invest. 102 :1142-1151; I. A. Rooney et al. (2000). J. Biol. Chem. 275 :14307-14315; J. Wang et al. (2001). J. Immunol. 167 :5099-5105; K. Tamada et al. (2002). J. Immunol. 168 :4832-4835)

Les membres de la famille du TNF et du récepteur du TNF sont des molécules impliquées dans la prolifération, la différenciation, la survie cellulaire ou l�apoptose et jouent un rôle très important dans la régulation de certaines fonctions du système immunitaire.

Parmi ces molécules, la protéine LIGHT (famille du TNF) a récemment été identifiée et son expression a été observée surtout dans les tissus lymphoïdes (thymus et rate). Des analyses par cytométrie de flux ont montré que LIGHT est exprimée par les cellules dendritiques immatures et par les lymphocytes T activés. Cette protéine peut se fixer sur 3 récepteurs : HVEM, LTβR et TR6.

On se propose d�étudier le rôle de la molécule LIGHT au sein du système immunitaire.

1ère partie - Dans une 1ère expérience, des cellules T humaines purifiées ont été cultivées avec des cellules dendritiques allogéniques irradiées, en présence de doses croissantes des récepteurs solubles HVEM-Ig, LTβR-Ig, m4-1BB-Ig (protéine contrôle) ou hCTLA4-Ig. La prolifération des lymphocytes T a été mesurée après 3 jours, par incorporation de thymidine 3H (Figure 1A).

- Ensuite, des lymphocytes T ont été cultivés en présence d�anticorps anti-CD3, puis ont été lavés et incubés avec la protéine hLIGHT-Ig, en présence ou en absence des récepteurs solubles hVEM-Ig, hLTβR-Ig ou control hIg. La prolifération des lymphocytes T a été mesurée après 3 jours par incorporation de thymidine 3H (Figure 1B).

- Enfin, des lymphocytes T ont été cultivés en présence d�anticorps anti-CD3 et de la protéine hLIGHT-Ig pendant 2 jours. La production des cytokines IFN-γ et IL-4 a été mesurée dans les surnageants de culture par ELISA (Figure 1C).

Question 1. Expliquez pourquoi on a utilisé les récepteurs solubles hHVEM-Ig, hLTβR-Ig et hCTLA4-Ig dans l�expérience représentée dans la figure 1A ?

Question 2. Que pouvez-vous conclure du(des) rôle(s) de la molécule LIGHTdans cette expérience ? (10 lignes maximum). Illustrez vos conclusions par un schéma.



Figure 1

2ème partie - Des cellules de la lignée HT-29 (cellules humaines de cancer du colon, qui expriment les récepteurs LTβ-R et HVEM) ont été incubées pendant 3 jours en absence (control), ou en présence de la protéine LIGHT seule ou en combinaison avec de l�IFN-γ. Les cellules ont ensuite été marquées avec l�annexine V et l�iodure de propidium et analysées au cytomètre (Figure 2A).

- Les cellules HT-29 ont été transduites par un vecteur rétroviral contrôle (pBABE) ou par un vecteur permettant aux cellules d�exprimer en excès une forme inactive de la molécule TRAF3 (TRAF3 ∆1-339) (dominant négatif). Les cellules transduites ont été incubées en présence de 80 unités/ml d�IFN-γ et de concentrations croissantes de LIGHT et leur viabilité a été mesurée (Figure 2B).

Figure 2



Question 3. Quelles sont les fonctions des molécules de la famille TRAF ? (5 lignes maximum)

Question 4. Que pouvez-vous déduire de ces expériences ? (10 lignes maximum)

- Des souris DBA/2 ont été inoculées par voie sous-cutanée avec des cellules tumorales P815 (mastocytome murin). Après une semaine, ces souris qui ont développé des tumeurs (palpables sous la peau), ont reçu des injections intra-tumorales de PBS, de vecteur permettant l�expression de LIGHT (vecteur LIGHT), ou d�un vecteur contrôle. Après 7 jours, les splénocytes des souris ont été re-stimulés in vitro avec des cellules P815 irradiées. L�activité cytotoxique de ces splénocytes a été mesurée (par un test de relargage du chrome 51) en utilisant comme cellules cibles des cellules P815 ou L1210 (lymphome murin) (Figure 3A). Parallèlement, le pourcentage de souris ayant développé des tumeurs a été déterminé (Figure 3B).

- La même expérience a été réalisée avec des souris dont on a déplété au préalable les cellules CD4+ -ou CD8+- avant d�injecter le vecteur LIGHT dans les tumeurs. Le diamètre des tumeurs a été mesuré après 21 jours (Figure 3C).

- Les souris présentant une régression tumorale suite à l�injection du vecteur LIGHT ont reçu 30 jours après, une seconde injection de cellules P815 ou L1210. Des souris DBA/2 naïves ont été utilisées comme souris contrôles (Figure 3D).

Figure 3

Question 5. Expliquez sous forme d�un schéma le principe d�un test de cytotoxicité et précisez l�importance des contrôles.

Question 6. Interprétez les résultats présentés dans la Figure 3. Quelle est la fonction de LIGHT mise ici en évidence ? (10 lignes maximum)

Question 7. Question 7 : A la lumière des résultats présentés dans les Figures 2 et 3, quels peuvent être les mécanismes d�action de LIGHT ? (10 lignes maximum)

3ème partie Des souris transgéniques, exprimant la protéine LIGHT sous le contrôle d�un promoteur lck et d�un enhancer CD2 (permettant une forte expression de LIGHT dans les thymocytes) ont été établies. Les poids et taille des thymus des souris transgéniques (Tg) ont été comparés à ceux des souris de type sauvage (WT) (Figure 4A).



Ayant observé chez les souris Tg une diminution de 50% du nombre de thymocytes CD4+CD8+ (par comparaison avec les souris WT), on a réalisé une expérience de marquage avec l�annexine V et l�iodure de propidium (PI), sur les thymocytes CD4+CD8+ des souris WT et Tg (Figure 4B).

Figure 4

Question 8. Que concluez vous de ces expériences ?

4ème partie Afin d�étudier les fonctions in vivo de la protéine LIGHT, des souris déficientes pour LIGHT (LIGHT-/-) ont été établies. Chez ces souris déficientes, on a constaté que :

1) Les tissus lymphoïdes sont normaux (thymus, rate, ganglions et plaques de Peyer)

2) La micro-architecture des organes lymphoïdes secondaires est normale

3) La capacité des cellules dendritiques à stimuler la prolifération des lymphocytes T est normale et la production d�IFN-γ par ces lymphocytes T est comparable à celle des souris WT

- Le superantigène SEB (entérotoxine B de Staphylococcus aureus) induit une forte expansion puis une déplétion des cellules T-Vβ8+ CD4+ et CD8+ de façon dépendante du CMH de classe II. Le superantigène SEB a été injecté à des souris de type sauvage (LIGHT+/+) ou déficientes (LIGHT-/-). Après 3 jours, les nombres de cellules totales et les pourcentages de cellules Vβ8+ ont été déterminés dans les rates (spleen) (Figure 5A) et les ganglions (LN) (Figure 5B).

- Le peptide E7 (dérivé de la protéine E7 du papillomavirus-16 et présenté par la molécule H-2Db) a été injecté par voie sous cutanée en présence d�adjuvant, à des souris LIGHT+/+ ou LIGHT-/-. Après 7 jours, les cellules des ganglions drainants ont été incubées in vitro avec des cellules irradiées de la lignée EL4E7 (cellules de lymphome EL4 exprimant E7) pendant 5 jours. Les activités cytotoxiques ont alors été mesurées en utilisant comme cellules cibles, les cellules EL4E7 ou les cellules EL4 (Figure 5C). La production d�IFN-γ dans les surnageants de culture a été quantifiée au cours du temps (Figure 5D).



Figure 5

Question 9. Quelles conclusions pouvez-vous tirer de ces expériences ?

Question 10. A votre avis, pourquoi n�obtient-on pas les mêmes résultats in vitro et chez les souris LIGHT-/- ? Emettez des hypothèses permettant d�expliquer ces différences.

II. (D�après A. S. MacDonald et al. (2002) J. Immunol., 168 :537-540 ; K. Dabbagh et al. (2002) J. Immunol. 168 : 4524-4530) Les cellules dendritiques sont indispensables pour initier la réponse immunitaire adaptative en raison de leur grande capacité à phagocyter et dégrader les antigènes, et à présenter les peptides antigéniques sur des molécules de classe I ou II du CMH aux lymphocytes T naïfs.

Question 1. Pourquoi les cellules dendritiques sont-elles très efficaces pour activer des lymphocytes T naïfs ? (5 lignes maximum)

Les cellules dendritiques peuvent orienter la différenciation des lymphocytes T naïfs en lymphocytes T effecteurs ou mémoires de type Th1 ou Th2. Dans une première série d�expériences, les auteurs ont différencié des cellules dendritiques à partir de cellules de moelle osseuse de souris de type sauvage (WT) ou déficientes en CD40 (CD40-/-). Ces cellules dendritiques ont été soit non stimulées (DC) soit stimulées in vitro, pendant 18h avec des antigènes solubles d��ufs du parasite Schistosoma mansoni (SEA) ou avec la bactérie Propionibacterium acnes (PA) avant d�être caractérisées phénotypiquement (Figure 1).



Non stimulé

PS

S

P

PS

PS

Figure 1 A : Expression du CMH de classe II et de CD11c à la surface des cellules B : Expression de CD80, CD86 et CD40 La courbe C correspond au contrôle isotypique, la courbe D aux cellules dendritiques non stimulées, et les courbes S et P aux cellules stimulées par SEA ou PA respectivement. C : Production d�IL-12 mesurée par ELISA

Question 2. A quoi correspondent les 2 populations cellulaires retrouvées dans la figure 1A, en absence de stimulation ? (5 lignes maximum)

Question 3. Que pouvez-vous conclure de ces résultats ? (10 lignes maximum)

Les auteurs ont ensuite différencié in vitro des cellules dendritiques à partir de cellules de moelle osseuse des souris WT ou CD40-/- ayant reçu des injections de SEA ou de PA. Ces cellules dendritiques ont été injectées par voie intra-péritonéale à des souris de type sauvage. Après 7 jours, les lymphocytes de ces souris ont été mis en culture, pendant 3 jours, en absence ( ), ou en présence de SEA ( ) ou PA ( ). Les productions de cytokines ont été mesurées dans les surnageants de culture, par un test ELISA (Figure 2).

Question 4. Quel est le rôle respectif des différents pathogènes dans l�induction des réponses T auxiliaires chez les souris WT? Quel est le rôle de CD40 ? Quelles hypothèses permettent d�expliquer les résultats ? (15 lignes maximum)



Figure 2 Pour chaque série sont figurées les concentrations d�interleukines produites en absence ( ), ou en présence de SEA ( ) ou PA ( ).

Dans une deuxième série d�expériences, les auteurs ont immunisé par voie intrapéritonéale aux jours 1 et 14, des souris WT ou déficientes en TLR4 (« Toll-like receptor 4 ») (TLR4-Def) avec de l�ovalbumine (OVA) en présence d�adjuvant. Comme expérience contrôle (Control), l�adjuvant seul a été injecté. On précise que la préparation d�adjuvant est dépourvue de LPS.

Les souris ont été ensuite re-stimulées par 3 administrations intra-nasales d�OVA, et les fluides broncho-alvéolaires (BAL), le plasma et les ganglions drainant les poumons ont été collectés. Différents tests ont été effectués sur ces prélèvements (Figure 3).

Question 5. Analysez soigneusement ces résultats et émettez une ou plusieurs hypothèses quant au rôle de TLR4. (15 lignes maximum)

Question 6. A quoi peut-on attribuer le défaut de production d�IgE chez les souris TLR4-Def immunisées avec OVA ? (5 lignes maximum)



Figure 3 A. Nombre total de phagocytes (Mac), d�éosinophiles (Eos), de lymphocytes (Lym) et de polynucléaires (PMN) dans le BAL des souris WT et TLR4-Def. B. Taux plasmatiques d�IgE et d�IgG1 anti-OVA

C. Productions d�IL-4, d�IL-5 et d�IFN-γ par les cellules des ganglions

N. B. : Les astérisques indiquent des différences statistiquement significatives entre les souris WT et Def, pour un même paramètre.

L�expérience suivante a consisté à étudier in vitro la capacité des cellules dendritiques des souris WT ou TLR4-Def stimulées avec la protéine cytochrome C de pigeon (PCC) à activer des lymphocytes T CD4+ naïfs. Des cellules T CD4+ exprimant un TCR-αβ transgénique spécifique d�un complexe CMH-peptide PCC ont été incubées pendant 10 jours en présence de cellules dendritiques de souris WT ou TLR4-Def préalablement stimulées avec PCC. Les lymphocytes T ont ensuite été re-stimulés avec la protéine PCC (PCC) ou non (No antigen) en présence de splénocytes irradiés de souris WT de même haplotype, pendant 48h. La prolifération et la production des cytokines IL-4, IL-5 et IFN-γ des lymphocytes ont été mesurées (Figure 4).



Figure 4

A. Prolifération des lymphocytes mesurée par incorporation de thymidine 3H

B. Productions de cytokines mesurées par ELISA

Les astérisques indiquent des différences statistiquement significatives entre les souris WT et TLR4-Def, pour un même paramètre.

Question 7. Sous la forme d�un schéma récapitulatif, indiquez pour chaque étape de l�expérience les événements cellulaires mis en jeu.

Question 8. Quelle information supplémentaire vous apporte la comparaison des expériences présentées en Figure 4A et 4B ? (5 lignes maximum)



IF2005 TD-IF 10 : Correction d�un sujet d�examen � IF2004 septembre



Epreuve d�Immunologie Fondamentale � septembre 2004

Exercice I (noté sur 10 points) (D�après Berg, R. E. et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32:2807)

Les auteurs de la présente étude s�intéressent à l�induction de la sécrétion d�IFNγ par les cellules T CD8+ en réponse à l�infection par Listeria monocytogenes, une bactérie intracellulaire infectant les macrophages.

Dans une première expérience, par la technique de marquage intracellulaire et analyse en cytométrie de flux, on étudie la production d�IFNγ par des cellules T CD8+ provenant de souris C57BL/6, infectées ou non par L. monocytogenes, mises en culture avec des cellules de la lignée de macrophage J774 infectées ou non par L. monocytogenes (Figure 1).

Figure 1 : Sécrétion d�IFNγ par des cellules T CD8+ naïves ou immunes vis-à-vis de L. monocytogenes Des souris C57BL/6 ont été infectées par L. monocytogenes. 5 jours plus tard, la rate de souris infectées (LM-infected B6 ; c & d) et de souris contrôles non infectées (Naive B6 ; a & b) a été prélevée. Les splénocytes ont été mis en culture pendant une nuit en présence de cellules J774 infectées par L. monocytogenes (w/ LM infected J774 ; a & c) ou non infectées (w/ J774 ; b & d). Les cellules ainsi cultivées ont été marquées, en surface par l�anticorps anti-CD8 et dans le cytoplasme par l�anticorps anti-IFNγ et analysées par cytométrie de flux. Le pourcentage de cellules CD8+ produisant de l�IFNγ est indiqué dans chaque graphe.

Question 1. A l�aide d�un tableau comparatif synthétique, expliquez le principe de la technique de détection de la production d�IFNγ mise en �uvre pour obtenir les résultats présentés à la Figure 1 ainsi qu�une autre technique de détection de la production d�IFNγ, en précisant les avantages ou inconvénients relatifs de ces techniques.

Question 2. Analyser les résultats présentés à la Figure 1. (5 lignes maximum)

Dans une deuxième expérience, on étudie la production d�IFNγ par les cellules T CD8+ de différentes lignées de souris : C57BL/6, C10.4, une lignée transgénique pour un TCR spécifique d�un peptide f-MIVTLF présenté par la molécule de CMH de classe I non classique M3, et OT-1, une lignée transgénique pour un TCR spécifique du peptide SIINFEKL présenté par Kb. Les résultats sont présentés à la Figure 2.



Figure 2 : Sécrétion d�IFNγ par les cellules T CD8+ de différentes lignées de souris Les splénocytes de souris C57BL/6, C10.4 et OT-1 ont été mis en culture pendant une nuit en présence de cellules J774 infectées par L. monocytogenes. Les cellules ainsi cultivées ont été marquées, en surface par l�anticorps anti-CD8 et dans le cytoplasme par l�anticorps anti-IFNγ puis analysées par cytométrie de flux. Les résultats présentés indiquent le pourcentage de cellules T CD8+ produisant de l�IFNγ.

N.B. : on précise que moins de 1% des cellules T CD8+ produisent de l�IFNγ après culture avec des cellules J774 non infectées.

Question 3. Analysez ces résultats. (5 lignes maximum)

Question 4. Quelle information ces deux expériences donnent-elles quant à la nature du signal conduisant à la production d�IFNγ par les cellules CD8+ ? (5 lignes maximum)

Dans la troisième expérience, les auteurs cherchent à caractériser les facteurs responsables de la production d�IFNγ par les cellules CD8+. Les résultats sont présentés à la Figure 3.

Figure 3 : Rôle des cytokines dans la production d�IFNγ par les cellules T CD8+ (a) Des splénocytes de souris C57BL/6 ont été cultivés pendant une nuit en présence de cellules J774 infectées

par L. monocytogenes (LM infected J774) ou non (J774), ou en présence de surnageant de culture de cellules J774 infectées par (LM inf. J774 S/N) ou non (J774 S/N).

(b) Des splénocytes de souris C57BL/6 ont été cultivés pendant une nuit en présence de 5 ng/ml d�IL-12, de 10 ng/ml d�IL-18, ou d�une combinaison de ces deux cytokines, chaque fois en présence d�IL-2.

(c) Des splénocytes de souris C57BL/6 ont été cultivés pendant une nuit en présence des différentes combinaisons de cytokines suivantes : 100 ng/ml d�IL-2, 100 ng/ml d�IL-15, 5 ng/ml d�IL-12, et/ou 10 ng/ml d�IL-18.

(d) Des splénocytes de souris C57BL/6 ont été cultivés pendant une nuit en présence de 5 ng/ml d�IL-12 et 10 ng/ml d�IL-18, et de concentrations croissantes d�IL-2 ou d�IL-15.

(e) Des splénocytes de souris C57BL/6 ont été cultivés pendant une nuit en présence de cellules J774 non infectées (J774), de cellules J774 infectées par L. monocytogenes (LM inf. J774), en présence ou non de combinaisons d�anticorps bloquants anti-IL-12 et/ou anti-IL-18 comme indiqué.

Les graphes a-e indiquent, pour chacune des conditions expérimentales décrites, le pourcentage de cellules T CD8+ produisant de l�IFNγ.



Question 5. Analysez soigneusement chacun des graphes présentés à la Figure 3. (15 lignes maximum)

Question 6. Comment pouvez-vous préciser l�interprétation faite à la Question 2 ? (5 lignes maximum)

Dans l�expérience suivante, on cherche à comparer la production d�IFNγ par différentes populations de cellules de la rate soit in vitro en présence d�une combinaison de cytokines, soit ex vivo chez des souris infectées par L. monocytogenes. Les résultats sont présentés sur la Figure 4.

Figure 4 : Capacité de production d�IFNγ de différentes populations de la rate (a) Des splénocytes de C57BL/6 ont été cultivés pendant

une nuit en présence de 10 ng/ml d�IL-2, 5 ng/ml d�IL-12 et 10 ng/ml d�IL-18. Le pourcentage de cellules produisant de l�IFNγ a été mesuré par cytométrie de flux pour différentes populations de cellules : lymphocytes NK (NK cells), NK T (NK-T cells), CD4+ (CD4+ T cells), CD8+ (CD8+ T cells) et γδ (γδ T cells). Des résultats similaires ont été obtenus en remplaçant la combinaison de cytokines par des cellules J774 infectées par L. monocytogenes.

(b) Des souris C57BL/6 ont été infectées par L. monocytogenes. 16 heures après l�infection, les splénocytes ont été isolés et cultivés pendant 3 heures en présence de brefeldin A, une drogue qui bloque le transport des protéines, avant le marquage intracellulaire anti-IFNγ. Les résultats indiquent le pourcentage de cellules produisant de l�IFNγ dans différentes populations.

Question 7. Analysez les résultats présentés à la Figure 4. (5 lignes maximum)

Question 8. En estimant qu�une rate compte 100 millions de lymphocytes dont environ 3% sont des cellules NK et 15% sont des cellules T CD8+, calculez les valeurs suivantes : - proportion de cellules CD8+ produisant de l�IFNγ parmi les lymphocytes - proportion de cellules NK produisant de l�IFNγ parmi les lymphocytes - nombre de cellules CD8+ produisant de l�IFNγ par rate - nombre de cellules NK produisant de l�IFNγ par rate

Question 9. Qu�apportent ces nouvelles observations ? (5 lignes maximum)



Exercice II (noté sur 10 points) (D�après Tyznik, A. J. et al. (2004) J. Exp. Med. 199:559)

De nombreuses équipes utilisent des lignées de souris déficientes en molécules de classe II du CMH ou en molécules CD4 comme modèles pour étudier la contribution de la réponse T auxiliaire à la réponse cytotoxique CD8 face à différentes épreuves antigéniques. Dans les expériences ci-dessous, les auteurs, s�intéressant au rôle des lymphocytes T CD4 dans l�établissement d�une réponse immunitaire protectrice contre la bactérie intracellulaire L. monocytogenes, font une observation originale chez des souris CD4-/-

.

Des souris de type sauvage (Wild-type) ou déficientes en molécules CD4 (CD4-/-) sont infectées avec la bactérie L. monocytogenes recombinante, rLmOva, qui exprime le peptide Ova257-264 présenté par la molécule H-2 Kb, ainsi que le peptide endogène LLO190-201 présenté par la molécule H-2 I-Ab. Après infection, la réponse des splénocytes des souris est étudiée parmi les cellules T CD4+ ou CD8+ en réponse aux peptides LLO190-201 et Ova257-264. Les résultats sont présentés sur la Figure 5.

Figure 5 : Réponse primaire de souris de type sauvage et de souris CD4-/- à des épitopes restreints par les molécules de CMH de classes I et II après infection par rLmOva 7 jours après infection, les splénocytes de souris de type sauvage (Wild-type) et CD4-/- ont été stimulés in vitro avec les peptides LLO190�201, Ova257�264, ou pas de peptide (No peptide), puis analysés pour l�expression d�IFNγ intracellulaire par les cellules T CD4+ (A) ou CD8+ (B). Les nombres indiquent le pourcentage de cellules produisant de l�IFNγ parmi les cellules T CD4+ ou CD8+. (C) Lyse spécifique (% Release) de cellules cibles LB27.4 marquées par le 51Cr et chargées avec les peptides LLO190�201, Ova257�264, ou sans peptide, par les cellules de rate de souris de type sauvage (!) ou CD4-/- ("). (D) Pourcentage des cellules T CD8+ produisant de l�IFNγ en réponse au peptide Ova257�264 chez des souris de type sauvage ou CD4-/-.

Dans une deuxième expérience, les auteurs étudient, après infection par le virus LCMV, la réponse de souris de type sauvage ou CD4-/- aux peptides de la glycoprotéine de LCMV GP61-80, restreint par I-Ab, et GP33-41, restreint par Db. Les résultats sont présentés sur la Figure 6.



Figure 6 : Réponse primaire de souris de type sauvage et de souris CD4-/- à des épitopes restreints par les molécules de CMH de classes I et II après infection par le LCMV La réponse des cellules T CD8+ de souris de type sauvage (Wild-type) ou CD4-/- a été étudiée 8 jours après infection par le LCMV. (A) Analyse, par marquage intracellulaire, de la production d�IFNγ par les cellules T CD8+ après restimulation in vitro en présence des peptides GP61-80, GP33-41, ou sans peptide (No peptide). (B) Lyse spécifique (% Release) de cellules cibles LB27.4 marquées par le 51Cr et chargées avec les peptides GP61�80, GP33�41, ou sans peptide, par les cellules de rate de souris de type sauvage (!) ou CD4-/- ("). (C) Pourcentage des cellules T CD8+ produisant de l�IFNγ en réponse au peptide GP33�41 chez des souris de type sauvage ou CD4-/-.

Question 10. A l�aide d�un schéma synthétique, rappelez les grandes lignes du développement lymphocytaire T, en particulier l�importance des molécules de CMH de classes I et II pour la différenciation des cellules T CD4+ et CD8+.

Question 11. Analyser soigneusement les résultats présentés sur les Figure 5 et Figure 6. (15 lignes maximum)

Question 12. En quoi ces résultats sont-ils en contradiction avec votre réponse donnée à la Question 10. (5 lignes maximum)

Afin de préciser le mode de présentation du peptide LLO190-201 aux cellules T CD8+, les auteurs étudient la production d�IFNγ par ces cellules, après stimulation par des cellules n�exprimant par de molécules du CMH de classe I ou II. Les résultats sont présentés sur la Figure 7.



Figure 7 : Réponse des cellules T CD8+ au peptide LLO190�201 chez les souris de type sauvage ou CD4-/-

7 jours après l�infection par rLmOva, les splénocytes des souris de type sauvage (Wild-type) ou CD4-/- ont été restimulés par des cellules présentatrices déficientes en β2m (β2m-/- LPS Blasts) ou en molécules du CMH de classe II (Class II-/- LPS Blasts), activées par le LPS et chargées avec le peptide LLO190�201. Un marquage intracellulaire anti-IFNγ a été effectué pour déterminer le pourcentage de cellules spécifiques du peptide LLO190�201 parmi les cellules T CD8+.

Question 13. Analyser les résultats présentés sur la Figure 7. (5 lignes maximum)

Question 14. Ces résultats expliquent-ils la contradiction, relevée à la Question 12, relativement à la différenciation des cellules T chez les souris CD4-/- par rapport à la situation décrite chez les souris de type sauvage ? (8 lignes maximum)



IF2005 TD-IF 11 : Réponse aux questions � Questionnaire d�évaluation